KR102703606B1 - 반려견의 췌장염 진단용 바이오마커 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 반려견의 췌장염 진단을 위한 조성물 등에 관한 것으로서, 개의 혈장 단백질에 대한 정성적, 정량적 분석을 통해 높은 정확도와 민감도로 췌장염을 진단할 수 있는 바이오마커를 발굴하여 완성된 것이다. 구체적으로, 본 발명자들은 췌장염을 앓고 있는 개의 혈장 단백질에 대해 고분해능 질량분석기를 이용한 단백체 분석을 수행하였으며, 정상 대조군과 비교하여 유의한 발현 차이를 보이는 바이오마커들을 선별하였다. 선별된 바이오마커를 이용하여 확립한 췌장염 진단 모델은 높은 특이도, 민감도, 및 정확도로 췌장염을 진단할 수 있음이 확인되었다. 따라서 본 발명은 소량의 혈액을 이용한 비침습적 방법으로서 반려견의 췌장염 위험도 예측 및 조기 진단을 가능케하는 바, 반려견의 건강을 보존하고 보호자의 의료비 부담을 절감할 뿐만 아니라, 수의학적 컨설팅의 질적 향상에도 기여할 것으로 기대된다.

Description

반려견의 췌장염 진단용 바이오마커 {Diagnostic biomarkers for use in diagnosis of pancreatitis in companion dogs}
본 발명은 반려견의 췌장염 진단을 위한 바이오마커 및 이를 이용한 개의 췌장염 진단 방법 등에 관한 것이다.
2019년 기준 대한민국의 반려동물 양육 가구 중 6세 이상 노령견을 양육하는 가구는 39.3%, 10세 이상의 노령견을 키우는 가구는 18%를 차지하며, 노령견 수의 증가와 함께 보호자들의 개의 질병에 대한 진단과 치료법에 관한 관심이 급증하고 있다. 특히, 난치성 질병은 질병의 초기 진단이 반려동물의 건강 수명 연장에 중요할 뿐 아니라 보호자의 의료비 지출을 감소시키기 위해서도 필요하다. 또한, 반려동물의 건강 수명 연장을 위해서는 무엇보다 난치성 질병의 치료 또는 진행정도를 완화시키기 위한 기술 개발이 지속적으로 필요하다.
췌장염 (pancreatitis)은 췌장 효소 등에 의해 췌장 분비샘에 파괴되거나, 췌장에 국소적으로 혹은 전체적으로 염증이 발생하는 질환이다. 췌장염은 인간뿐만 아니라 개를 포함한 기타 동물에서도 흔히 관찰되는 질환이다. 췌장염은 급성 및 만성 췌장염으로 나뉘는데, 급성 췌장염은 췌장의 외분비 기능이 손상되어 소화효소가 활성화되고, 이것이 췌장과 주변 조직을 공격해 심한 염증을 유발하여 발생한다. 급성 췌장염을 앓는 개는 구토, 설사, 복통 등을 일으키며 혈변과 같은 심각한 증상을 보이는 중증으로 접어들면 예후가 나쁠 수 있으나, 초기에 발견해 적극적으로 처치하면 생존율을 높일 수 있다. 만성 췌장염은 만성적인 염증으로 인해 외분비 및 내분비 기능 모두에 장애가 생기는 특징이 있다. 경미한 구토 및 설사 등을 동반하는데, 상태가 호전되거나 나빠지는 것을 반복하기도 한다. 개의 췌장염은 치사율이 40% 정도 되어 매우 높을 뿐만 아니라, 당뇨 등의 합병증을 유발할 수 있으므로 적기의 치료가 매우 중요하다.
개의 급성 췌장염 진단 방법으로 혈청 amylase 또는 lipase 농도 측정이 주로 이용되고 있으나, 상기 효소들은 다른 질병에서도 수준이 증가되는 경향을 보이기 때문에, 진단 면에서 부정확한 문제가 있다. 따라서, 반려견의 건강 수명을 연장하고 보호자의 치료비 부담을 절감하기 위해, 보다 간편하고 비침습적인 방법으로 반려견의 췌장염을 진단하거나 위험도를 스크리닝할 수 있는 방법이 필요한 실정이다. 그러나, 높은 정확도로 반려견의 췌장염을 진단할 수 있는 비침습적 방법은 아직까지 개발되지 않고 있다.
대한민국 공개특허공보 제10-2021-0066725호
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 개의 혈장 단백질에 대한 정성적, 정량적 분석을 통해 높은 정확도와 민감도로 개에서의 췌장염을 진단할 수 있는 바이오마커를 발굴하여 완성된 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은 상기 바이오마커들의 단백질 또는 mRNA 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 개의 췌장염 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 바이오마커들의 단백질 또는 mRNA 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 개의 췌장염 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이오마커들의 단백질 또는 mRNA 수준을 측정하여 개의 췌장염을 진단하는 방법에 관한 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 PDE4DIP (phosphodiesterase 4D interacting protein), SERPINA3 (Serpin family A member 3), 및 FGG (Fibrinogen gamma chain)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 mRNA 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 개의 췌장염 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 SERPINA3의 단백질 또는 mRNA 수준은 정상 개체 대비 췌장염 개체에서 증가되어 있을 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 PDE4DIP 또는 FGG의 단백질 또는 mRNA 수준은 정상 개체 대비 췌장염 개체에서 감소되어 있을 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 Pentaxin, Angiotensinogen, Peptidase D, Transferrin (TF), Complement C7, Coagulation factor X, Kallikrein B1, Factor XI, Complement C8 alpha chain, Coagulation factor XIII B chain (F13B), Complement C3 (LOC484960), 및 Complement factor I로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 또는 프로브일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 단백질 또는 mRNA 수준은 혈액, 전혈, 혈장, 혈청, 및 림프액으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에서의 수준일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 제제 또는 조성물을 포함하는, 개의 췌장염 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 개의 췌장염 진단 방법을 제공한다:
(S1) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 PDE4DIP (phosphodiesterase 4D interacting protein), SERPINA3 (Serpin family A member 3), 및 FGG로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및
(S2) 상기 단계 (S1)에서 측정된 SERPINA3의 단백질 또는 mRNA 수준이 대조군에 비해 증가하거나; PDE4DIP 또는 FGG의 단백질 또는 mRNA 수준이 대조군에 비해 감소한 경우, 췌장염으로 진단하거나 췌장염이 발병할 위험이 있는 것으로 판단하는 단계.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 상기 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 Pentaxin, Angiotensinogen, Peptidase D, Transferrin (TF), Complement C7, Coagulation factor X, Kallikrein B1, Factor XI, Complement C8 alpha chain, Coagulation factor XIII B chain (F13B), Complement C3 (LOC484960), 및 Complement factor I로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 mRNA의 수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 전혈, 혈장, 혈청, 및 림프액으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 단백질 수준은 단백질 칩 분석, 면역 측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF (Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역 분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석 (liquid chromatography-Mass Spectrometry; LC-MS), LC-MS/MS (liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅, ELISA (enzyme linked immunosorbentassay), 및 FACS으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법으로 측정되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 mRNA 수준은 PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 (northern blotting), 서던 블랏팅 (southern blotting), In situ 교잡법, DNA 칩, 및 RNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법으로 측정되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 개의 췌장염 진단용 제제 또는 키트를 제조하기 위한, PDE4DIP (phosphodiesterase 4D interacting protein), SERPINA3 (Serpin family A member 3), 및 FGG로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 mRNA 수준을 측정하는 제제의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 개의 췌장염 진단을 위한, PDE4DIP (phosphodiesterase 4D interacting protein), SERPINA3 (Serpin family A member 3), 및 FGG로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 mRNA 수준을 측정하는 제제의 용도를 제공한다.
본 발명은 개의 췌장염 진단을 위한 조성물 등에 관한 것으로서, 개의 혈장 단백질에 대한 정성적, 정량적 분석을 통해 높은 정확도와 민감도로 췌장염을 진단할 수 있는 바이오마커를 발굴하여 완성된 것이다. 구체적으로, 본 발명자들은 췌장염을 앓고 있는 개의 혈장 단백질에 대해 고분해능 질량분석기를 이용한 단백체 분석을 수행하였으며, 정상 대조군과 비교하여 유의한 발현 차이를 보이는 바이오마커들을 선별하였다. 선별된 바이오마커를 이용하여 확립한 췌장염 진단 모델은 높은 특이도, 민감도, 및 정확도로 췌장염을 진단할 수 있음이 확인되었다. 따라서 본 발명은 소량의 혈액을 이용한 비침습적 방법으로서 반려견의 췌장염 위험도 예측 및 조기 진단을 가능케하는 바, 반려견의 건강을 보존하고 보호자의 의료비 부담을 절감할 뿐만 아니라, 수의학적 컨설팅의 질적 향상에도 기여할 것으로 기대된다.
도 1a는 MARS14 컬럼을 이용하여 상위 14개의 풍부한 혈장 단백질을 제거한 원리를 도식화한 도면이다.
도 1b는 상위 14개의 풍부한 혈장 단백질 및 미량 단백질을 전처리하고 UV 스펙트럼을 확인한 결과이다.
도 1c는 Suspension trap 방법으로 혈장 단백질을 펩티드로 제조한 과정을 나타낸 흐름도이다.
도 1d는 SWATCH LC-MS 분석에 사용된 파라미터를 나타낸 그림이다.
도 2는 반려견들의 혈장 시료로부터 분리한 혈장 시료에 대해 Nano drop을 이용하여 정량적 분석을 수행한 결과이다.
도 3은 반려견 혈장 시료에서 정량된 단백질의 수를 나타낸 그래프이다.
도 4는 정상 대조군 대비 췌장염 개체에서 증가 또는 감소한 단백질들을 나타낸 Volcano plot이다.
도 5는 정상 대조군 대비 췌장염 개체에서 증감된 16개 단백질들에 대한 정보를 나타낸 표이다.
도 6a 및 6b는 정상 대조군 대비 췌장염 개체에서 증가된 단백질인 SERPINA3 (도 6a) 및 Angiotensinogen (도 6b)의 Box plot 및 ROC 커브를 나타낸 그림이다.
도 7은 정상 대조군 대비 췌장염 개체에서 차별적인 발현 수준을 보이는 15개 단백질을 이용한 PLS-DA 결과를 나타낸다.
도 8은 Kruskal Wallis test를 이용하여 정상 대조군, 만성 췌장염 그룹, 급성 췌장염 그룹에서 차별적인 발현 수준을 보이는 23개 단백질들을 선별한 결과이다.
도 9는 Angiotensinogen, SERPINA3, 및 PDE4DIP의 정상 대조군, 만성 췌장염 그룹, 급성 췌장염 그룹에서의 발현 수준을 비교한 Box plot이다 (좌측부터 순서대로, 급성 췌장염 그룹, 만성 췌장염 그룹, 및 정상 그룹에서의 발현을 나타냄).
도 10은 PDE4DIP, FGG, 및 SERPINA3의 3종 단백질들을 이용한 Logistic regression 모델에서의 AUC, 특이도, 민감도 분석 결과를 나타낸다.
본 발명은 개의 췌장염 진단을 위한 조성물 등에 관한 것으로서, 개의 혈장 단백질에 대한 정성적, 정량적 분석을 통해 높은 정확도와 민감도로 개에서의 췌장염을 진단할 수 있는 바이오마커를 발굴하여 완성된 것이다. 구체적으로, 본 발명자들은 정상 및 질병을 앓고 있는 개들의 혈장 단백질에 대해 고분해능 질량분석기를 통해 정량적, 정성적 분석을 수행하였으며, 이를 통해 개체간에 유의한 차이를 보이는 바이오마커들을 선별하였다. 또한, 상기 바이오마커들을 조합하여 확립된 진단 모델은 높은 특이도, 민감도, 및 정확도로 질병 개체와 정상 개체를 구별할 수 있음이 확인되었다. 따라서 상기 바이오마커들 및 이들의 조합을 통해 개의 췌장염의 정확한 진단이 가능할 뿐만 아니라, 평상시에도 췌장염의 위험도를 손쉽게 스크리닝할 수 있으므로, 반려견의 췌장염 조기 진단을 통해 수명을 연장시키고, 보호자의 의료비를 절감할 수 있을 것으로 기대된다. 특히, 본 발명에 따른 진단방법은 기존의 침습적인 진단 및 검사방법의 대안으로서, 채혈이라는 비교적 간단하고 경제적인 방법을 통해 질병의 진단이 가능한 이점이 있다.
따라서, 본 발명의 주요 목적은, PDE4DIP (phosphodiesterase 4D interacting protein), SERPINA3 (Serpin family A member 3), 및 FGG로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 mRNA 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 개체의 췌장염 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명에서 "개체"란 질병의 위험도 예측, 진단, 예후 예측, 또는 치료 등을 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미할 수 있으나, 바람직하게는 개 (dogs; 학명, Canis lupus familiaris)를 의미할 수 있다.
본 발명에 있어서, 췌장염 (pancreatitis)은 췌장 효소 등에 의해 췌장 분비샘에 파괴되거나, 췌장에 국소적으로 혹은 전체적으로 염증이 발생하는 질환이다. 본 발명에 따른 췌장염은 급성 췌장염 및 만성 췌장염을 모두 포함한다. 급성 췌장염은 췌장의 외분비 기능이 손상되어 소화효소가 활성화되고, 이것이 췌장과 주변 조직을 공격해 심한 염증을 유발하여 발생한다. 급성 췌장염을 앓는 개는 구토, 설사, 복통 등을 일으키며 혈변과 같은 심각한 증상을 보이는 중증으로 접어들면 예후가 나쁠 수 있으나, 초기에 발견해 적극적으로 처치하면 생존율을 높일 수 있으므로, 조기진단이 무엇보다 중요하다. 만성 췌장염은 만성적인 염증으로 인해 외분비 및 내분비 기능 모두에 장애가 생기는 특징이 있다. 경미한 구토 및 설사 등을 동반하는데, 상태가 호전되거나 나빠지는 것을 반복하기도 한다. 췌장염은 명확히 밝혀진 원인이 없기 때문에 평상시에 발병 위험도를 스크리닝하거나 조기에 진단하는 것이 중요하다.
본 발명에 있어서, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하며, 췌장염의 존재 여부, 췌장염의 발병 여부, 췌장염의 발병 가능성 여부 (발병 위험도), 췌장염의 예후 등을 확인하는 것을 포함하는 의미일 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명서에서 사용된 용어, "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성 (susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후 (prognosis) (예컨대, 종양 상태의 동정, 종양의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics) (예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)를 포함한다.
PDE4DIP (phosphodiesterase 4D interacting protein)은 포스포디에스터라제 4D를 세포의 골지체/중심체 영역에 고정시키는 역할을 하는 단백질이다. 인간에서, 비정상적인 PDE4DIP은 호산구 증가증 등과 관련된 골수증식장애 (myeloproliferative disorder)를 유도하며, 성체 송과체모세포종 (adult pineoblastoma) 및 성체 송과체실질종양 (adult pineal parenchymal tumor)과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 그러나, 개의 췌장염과 PDE4DIP에 대해서는 현재까지 보고된 바가 없다. 본 발명자들은 개의 혈장 단백체 분석을 통해 정상 그룹 대비 췌장염 그룹에서 PDE4DIP의 수준이 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다. PDE4DIP에 대한 구체적인 정보는 Uniprot과 같은 공공 데이터베이스에서 확인할 수 있다 (Uniprot 등록번호, A0A8C0SUT4).
본 발명에 있어서, SERPINA3 (Serpin family A member 3)는 세린 프로테아제를 억제하는 단백질 그룹인 serpin family 멤버이다. SERPINA3의 다형성은 조직 특이적으로 나타나며, 프로테아제 타겟팅에 영향을 미칠 수 있다. 인간에서, SERPINA3의 이상은 알츠하이머, 간 질환, 파킨슨병 등을 유발할 수 있는 것으로 보고되었는데, 개에서 SERPINA3의 발현 수준과 췌장염의 상관관계에 대해서는 현재까지 알려진 바 없다. 본 발명자들은 개의 혈장 단백체 분석을 통해 정상 그룹 대비 췌장염 그룹에서 증가되어 있음을 확인하였다. SERPINA3에 대한 구체적인 정보는 Uniprot 등에서 확인할 수 있다 (Uniprot 등록번호: A0A8I3MJD4).
본 발명에 있어서, FGG (Fibrinogen gamma chain 또는 fibrinogen gamma gene)은 Fibrinogen alpha (FGA) 및 Fibrinogen beta (FGB)와 함께 중합되어 불용성 피브린 매트릭스 (fibrin matrix)를 형성하는 단백질이다. FGG는 혈전의 주요 성분 중 하나로 지혈에 중요한 역할을 하는데, 상처 복구의 초기 단계에서 기능하여 병변을 안정화시키고 재상피화 동안 세포 이동을 조절한다. 본 발명자들은 개의 혈장 단백체 분석을 통해 정상 그룹 대비 췌장염 그룹에서 감소되어 있음을 확인하였다. FGG에 대한 구체적인 정보는 Uniprot 등에서 확인할 수 있다 (Uniprot 등록번호: P12800).
본 발명의 일 구현예에서, 상기 조성물은 Pentaxin, Angiotensinogen, Peptidase D, Transferrin (TF), Complement C7, Coagulation factor X, Kallikrein B1, Factor XI, Complement C8 alpha chain, Coagulation factor XIII B chain (F13B), Complement C3 (LOC484960), 및 Complement factor I로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 더 포함할 수 있다. 상기 단백질 (유전자)들은 정상 개체 대비 췌장염을 앓는 개에서 통계적으로 유의하게 증가 또는 감소한 것으로 확인된 마커들이다.
이중, “Pentaxin”은 “Pentraxin”으로도 지칭되는 단백질로, 펜트락신 단백질 도메인 (Pentraxin protein domain)을 포함하며 급성 면역학적 반응에 관여하는 것으로 알려져 있다. Pentaxin은 감염이나 염증 부위에서 조직세포, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포 등에 의해 생성되며 균, 박테리아, 바이러스 등의 감염을 억제하는 역할을 한다. 그러나 개의 췌장염과 Pentaxin의 연관성에 대해서는 알려진 바가 없는데, 본 발명자들은 개의 혈장 단백체 분석을 통해 정상 개체 대비 췌장염 개체에서 Pentaxin 수준이 유의하게 증가되어 있음을 확인하였다. Pentaxin에 대한 구체적인 정보는 Uniprot과 같은 공공 데이터베이스에서 확인할 수 있다 (Uniprot 등록번호: A0A8C0T016).
또한, “Angiotensinogen”은 혈압과 체액 균형을 조절하는 호르몬 시스템인 renin-angiotensin system (RAS)의 구성 요소이다. Angiotensinogen은 renin 기질로도 알려져 있으며, serpin family의 비-억제성 멤버이기도 하다. 개의 췌장염과 angiotensinogen의 연관성에 대해서는 알려진 바가 없는데, 본 발명자들은 개의 혈장 단백체 분석을 통해 정상 개체 대비 췌장염 개체에서 angiotensinogen 수준이 유의하게 증가되어 있음을 확인하였다. angiotensinogen에 대한 구체적인 정보는 Uniprot과 같은 공공 데이터베이스에서 확인할 수 있다 (Uniprot 등록번호: A0A8C0PY30).
본 발명에 있어서, 상기 Pentaxin, SERPINA3, 및 Angiotensinogen은 정상 대조군 대비 췌장염을 앓고 있는 개체에서 증가되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, Peptidase D, Transferrin (TF), Complement C7, Coagulation factor X, Kallikrein B1, Factor XI, Complement C8 alpha chain, Coagulation factor XIII B chain (F13B), Complement C3 (LOC484960), Complement factor I, 또는 PDE4DIP은 정상 대조군 대비 췌장염을 앓고 있는 개체에서 감소되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 명세서에 있어서, "수준이 증가되어 있다"는 것은, 검출되지 않던 것이 검출된 것, 또는 정상적인 수준보다 상대적으로 검출량이 많아지는 것을 의미한다. 예를 들어, 수준이 "증가"되어 있다는 것은, 실험군의 수준이 대조군의 그것에 비교하여 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10% 또는 그 이상, 예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상 높은, 및/또는 0.5배, 1.1배, 1.2배, 1.4배, 1.6배, 1.8배 또는 그 이상 높은 것을 의미한다. 구체적으로는, 대조군의 그것에 비해 1 내지 1.5배, 1.5 내지 2배, 2 내지 2.5배, 2.5 내지 3배, 3 내지 3.5배, 3.5 내지 4배, 4 내지 4.5배, 4.5 내지 5배, 5 내지 5.5배, 5.5 내지 6배, 6 내지 6.5배, 6.5 내지 7배, 7 내지 7.5배, 7.5 내지 8배, 8 내지 8.5배, 8.5 내지 9배, 9 내지 9.5배, 9.5 내지 10배, 또는 10배 이상 증가한 것을 의미할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 이의 반대적 용어의 의미는 당업자라면 상기 정의에 준하여, 반대 의미를 가지는 것으로 이해 가능하다.
본 명세서에서 사용된 용어, "측정"은 목적하는 물질 (본 발명의 경우 췌장염 바이오마커 유전자의 mRNA 또는 단백질)의 존재 (발현) 여부를 측정 및 확인하는 것, 또는 목적하는 물질의 존재 수준 (발현 수준)의 변화를 측정 및 확인하는 것을 모두 포함하는 의미이다. 즉, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 것은 발현 여부를 측정하는 것 (즉, 발현 유무를 측정하는 것), 또는 상기 단백질의 질적, 양적 변화 수준을 측정하는 것을 의미한다. 상기 측정은 정성적인 방법 (분석)과 정량적인 방법을 모두 포함하여 제한 없이 수행될 수 있다. 단백질 수준의 측정에 있어서 정성적 방법과 정량적 방법의 종류는 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 명세서에서 기술한 실험법들이 이에 포함된다. 각 방법 별로 구체적 단백질 수준 비교 방식은 당업계에 잘 알려져 있다. 따라서 상기 목적 단백질 검출은 콜라겐 단백질의 존재 여부의 검출, 또는 상기 단백질 수준의 증가(상향 조절) 또는 감소(하향 조절)를 확인하는 것을 포함하는 의미이다.
본 명세서에서 사용된 용어, "분석"은 바람직하게는 "측정"을 의미하는 것일 수 있고, 상기 정성분석은 목적하는 물질의 존재 여부를 측정 및 확인하는 것을 의미하는 것일 수 있으며, 상기 정량분석은 목적하는 물질의 존재 수준(발현 수준) 또는 양의 변화를 측정 및 확인하는 것을 의미하는 것일 수 있다. 본 발명에서 분석 또는 측정은 정성적인 방법과 정량적인 방법을 모두 포함하여 제한 없이 수행될 수 있으며, 바람직하게는 정량적인 측정이 수행되는 것일 수 있다.
상기 조성물이 mRNA의 수준을 측정하기 위한 것인 경우, 상기 mRNA의 수준을 측정하는 제제는 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 또는 프로브일 수 있다. 본 발명에 따른 바이오마커 유전자들의 mRNA에 특이적인 프라이머 세트 또는 프로브를 포함하는 본 발명의 조성물은 공지된 RNA를 감지하는 방법에 필요한 제제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물을 이용하여 공지된 RNA를 감지하는 방법을 제한없이 사용함으로써 피검체에서 상기 바이오마커들의 mRNA의 수준을 측정할 수 있다.
본 발명에서 상기 "프라이머"는 표적 유전자 서열을 인지하는 단편으로서, 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료 내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성이 부여될 수 있다.
본 발명에서 상기 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당 업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA (peptide nucleic acid), LNA (locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로, 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 바이오마커 (단백질 또는 유전자)의 정보 (아미노산 서열, 핵산 서열 등)는 공지되어 있으므로, 당업자라면 이를 바탕으로 상기 단백질을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 또는 안티센스 뉴클레오티드를 용이하게 디자인할 수 있을 것이다. 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트 (phosphoramidite) 고체지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있으며, 모든 기능적 등가물을 포함한다. 또한 프라이머 또는 프로브는 mRNA와의 혼성화를 방해하지 않는 범위에서 당해 기술 분야에 공지된 방법에 따라 다양하게 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 그리고 형광 또는 효소를 이용한 표지물질(labeling material)의 결합 등이 있다.
본 발명의 조성물이 단백질의 수준을 측정하기 위한 것인 경우에 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "항체"는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 또한 항원-항체 결합성을 갖는 것이면 전체 항체의 일부도 본 발명의 항체에 포함되며, 본 발명 단백질에 특이적으로 결합하는 모든 종류의 면역글로불린 항체가 포함된다. 예를 들어 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태의 항체뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편, 즉 항원 결합 기능을 갖는 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 나아가 본 발명의 항체에는 본 발명 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 것이라면 인간화 항체, 키메릭 항체 등의 특수 항체와 재조합 항체도 포함된다.
본 명세서에서 사용된 용어, "앱타머 (aptamer)"는 시료 내의 검출하고자 하는 분석물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지는 단일 가닥 핵산(DNA, RNA, 또는 변형 핵산)을 의미하는 것으로, 특이적으로 시료 내의 표적 단백질의 존재를 확인할 수 있다. 앱타머의 제조는 일반적인 앱타머의 제조 방법에 따라, 확인하고자 하는 표적 단백질에 대해 선택적이고 높은 결합력을 가지는 올리고뉴클레오티드의 서열을 결정하여 합성한 후, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단이나 3' 말단을 앱타머 칩의 관능기에 결합할 수 있도록, -SH, -COOH, -OH 또는 NH2로 변형을 시킴으로써 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물은 상기 바이오마커 단백질을 감지하는 방법에 필요한 제제를 추가적으로 포함할 수 있으며, 본 조성물을 이용하여 공지된 단백질을 감지하는 방법을 제한없이 사용하여 피검체 (또는 피검체로부터 수득한 생물학적 시료)에서 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 진단을 필요로 하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료의 분석을 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 있어서 "생물학적 시료"란 췌장염을 진단하거나 이의 발병 위험도 등을 예측하고자 하는 피검체로부터 채취된 것이라면 제한 없이 포함될 수 있다. 예를 들어, 상기 생물학적 시료는 액, 전혈, 혈장, 소변, 타액, 조직, 세포, 기관, 골수, 미세침흡인 검체, 중심부바늘생검(core needle biopsy) 검체, 및 진공흡입생검 검체 등으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 조성물은 비침습적 진단을 위한 것으로서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 전혈, 혈장, 혈청, 및 림프액으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 생물학적 시료는 검출 또는 진단에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 균질화 (homogenization), 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 상기 시료는 단백질 마커의 탐지 감도를 증가시키도록 준비될 수 있는데, 예를 들어 피험체로부터 수득한 시료는 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피 (size exclusion chromatography), 액체 크로마토그래피, 연속추출 (sequential extraction) 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전처리될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 조성물을 포함하는, 개의 췌장염 진단용 키트를 제공할 수 있다.
본 발명에 있어서, "키트 (kit)"란 특히 시료 내에 포함되어 있는, 본 발명에 따른 바이오마커들의 mRNA 또는 단백질의 양을 측정하여 췌장염을 진단할 수 있는 검진용 기기 또는 세트 등을 의미하며, 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 상기 유전자들의 발현량을 측정할 수 있는 형태라면 제한이 없다. 예컨대, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드 (Rapid) 키트, 질량분석 키트, 마이크로어레이 키트, 또는 MRM (Multiple reaction monitoring) 키트 등 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 따라서, 본 발명의 키트에는 표적 단백질을 마커로 인식하는 항체 또는 mRNA를 마커로 인식하는 프라이머 세트, 프로브뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다. 이때, 상기 유전자, mRNA, 또는 단백질의 발현 수준을 검출하는 물질은 1회 이상 횟수에 제한 없이 작용시킬 수 있으며, 각 물질을 적용하는 선후에는 제한이 없고, 각 물질의 적용은 동시에 진행될 수도 있고 미시에 진행될 수도 있다.
또한, 본 발명에 따른 키트는, 본 발명에 따른 진단방법 등이 기재된 설명서를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 하기 단계를 포함하는, 개체의 췌장염 진단 방법 또는 개의 췌장염 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다:
(S1) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 PDE4DIP (phosphodiesterase 4D interacting protein), SERPINA3 (Serpin family A member 3), 및 FGG로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및
(S2) 상기 단계 (S1)에서 측정된 SERPINA3의 단백질 또는 mRNA 수준이 대조군에 비해 증가하거나; PDE4DIP 또는 FGG의 단백질 또는 mRNA 수준이 대조군에 비해 감소한 경우, 췌장염으로 진단하거나 췌장염이 발병할 위험이 있는 것 (발병할 가능성이 높은 것)으로 판단하는 단계.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 상기 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 Pentaxin, Angiotensinogen, Peptidase D, Transferrin (TF), Complement C7, Coagulation factor X, Kallikrein B1, Factor XI, Complement C8 alpha chain, Coagulation factor XIII B chain (F13B), Complement C3 (LOC484960), 및 Complement factor I로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 mRNA의 수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 방법은, 상기 피검체의 Pentaxin, SERPINA3, 및/또는 Angiotensinogen의 단백질 또는 mRNA 수준이 대조군에 비해 증가한 경우 췌장염으로 진단하거나 췌장염이 발병할 위험이 있는 것 (발병할 가능성이 높은 것)으로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 방법은, 상기 피검체의 Peptidase D, Transferrin (TF), Complement C7, Coagulation factor X, Kallikrein B1, Factor XI, Complement C8 alpha chain, Coagulation factor XIII B chain (F13B), Complement C3 (LOC484960), Complement factor I, 및/또는 PDE4DIP의 수준이 대조군에 비해 감소한 경우 췌장염으로 진단하거나 췌장염이 발병할 위험이 있는 것 (발병할 가능성이 높은 것)으로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 진단방법은 Receiver operating characteristics 분석시 Area under curve가 0.7 이상, 0.75 이상, 0.8 이상, 0.85 이상, 0.9 이상, 0.93 이상, 0.95 이상, 0.96 이상, 0.97 이상, 0.98 이상, 또는 0.99 이상일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 진단방법은 특이도 및/또는 민감도가 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상일 수 있다.
예컨대, 본 발명에 따른 진단방법이 상기 SERPINA3의 단백질 또는 mRNA 수준을 측정하는 단계를 포함하는 경우, 진단 특이도는 70% 이상 또는 75% 이상일 수 있고, 진단 민감도는 70% 이상, 75% 이상, 또는 80% 이상일 수 있으며, ROC AUC는 0.75 이상, 0.8 이상, 또는 0.85 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 진단방법이 상기 Angiotensinogen의 단백질 또는 mRNA 수준을 측정하는 단계를 포함하는 경우, 진단 특이도는 75% 이상, 80% 이상, 또는 85% 이상일 수 있고, 진단 민감도는 70% 이상 또는 75% 이상일 수 있으며, ROC AUC는 0.75 이상 또는 0.8 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
특히, 본 발명에 따른 바이오마커의 조합의 수준을 측정하는 경우, 진단 정확도는 더욱 높아질 수 있다.
예컨대, 본 발명에 따른 진단방법이 PDE4DIP, FGG, 및 SERPINA3의 단백질 또는 mRNA의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 경우, 진단 민감도는 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 또는 95% 이상일 수 있고, 진단 특이도는 0.7 이상, 0.75 이상, 또는 0.8 이상일 수 있으며, ROC AUC는 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 또는 95% 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 따른 진단방법은 췌장염으로 진단된 개체에서, 상기 췌장염의 종류 (만성 또는 급성)를 판단하는데 사용될 수 있다.
에컨대, 본 발명에 따른 진단방법이 SERPINA3의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 단계를 포함하고, 이 때 피검체의 SERPINA3의 mRNA 또는 단백질 수준이 대조군에 비해 증가되어 있는 경우, 상기 피검체는 급성 췌장염으로 진단될 수 있다. 여기서, 상기 대조군은 정상 개체 또는 만성 췌장염을 앓고 있는 개체일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 진단방법이 PDE4DIP의 단백질 또는 mRNA 수준을 측정하는 단계를 포함하고, 이 때 피검체의 PDE4DIP의 단백질 또는 mRNA 수준이 대조군에 비해 감소되어 있는 경우, 상기 피검체는 급성 췌장염으로 진단될 수 있다. 여기서, 상기 대조군은 정상 개체 또는 만성 췌장염을 앓고 있는 개체일 수 있다.
본 발명에 따른 바이오마커, 생물학적 시료, 피검체 등과 관련된 구체적인 설명은 전술하였으므로 생략한다.
본 발명에서 사용된 용어, "정보제공방법(method for providing information)"이란, 질환의 진단에 관한 정보를 제공하는 방법으로서, 개체의 생물학적 시료를 분석하거나, 본 발명에 따른 바이오마커들의 수준의 증감을 확인하여 질환의 발병이나 발병 가능성(위험성)에 대한 정보를 획득하는 방법을 의미한다. 예컨대, 본 발명에 따른 바이오마커의 수준을 측정하고 대조군과 비교하여 개체에서 췌장염이 발병할 가능성이 있는지, 또는 췌장염이 발병할 가능성이 상대적으로 높은지, 또는 췌장염이 이미 발병하였는지에 대한 정보를 제공하는 방법으로서, 상기 방법을 통하여 췌장염 발병 위험성, 즉, 고위험군에 대해서도 예측할 수 있으며, 이를 췌장염의 예방 및 치료에 관한 정보를 제공하는 방법으로서도 사용할 수도 있다.
본 발명에 있어서, "대조군 (control)"은 정상 개체 또는 췌장염을 앓는 개체로부터 분리된 생물학적 시료일 수 있다.
본 발명에 있어서, 단백질 수준을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 단백질 측정 방법에 의한 것이라면 특별한 제한은 없으나, 단백질 칩 분석, 면역 측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF (Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역 분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석 (liquid chromatography-Mass Spectrometry; LC-MS), LC-MS/MS (liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅, ELISA (enzyme linked immunosorbentassay), 및 FACS 등의 방법에 의해 측정할 수 있다.
본 발명에 있어서, mRNA 수준을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 mRNA 측정 방법에 의한 것이라면 특별한 제한은 없으나, PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅(northern blotting), 서던 블랏팅(southern blotting), In situ 교잡법, DNA 칩, 및/또는 RNA 칩 등의 방법에 의해 측정할 수 있다.
또한, 본 발명은 개체 (예컨대, 개)의 췌장염 진단기기를 제공할 수 있다.
본 발명의 상기 진단기기의 측정부는 목적하는 개체로부터 얻어진 생물학적 시료에 대하여 본 발명에 따른 바이오마커, 예컨대, PDE4DIP, SERPINA3, 및 FGG로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 이용하여 단백질 또는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있다. 상기 측정부에서 상기 제제를 이용하여 상기 단백질 또는 유전자의 발현 정도를 확인함으로써 췌장염을 진단하거나, 췌장염의 발병 위험이 높은 것으로 진단할 수 있다.
본 발명의 상기 진단기기는, 상기 측정부에서 얻어진 상기 단백질 또는 유전자의 발현 정도로부터 개체의 췌장염의 유무, 병기, 또는 유형 등을 예측하여 출력하는 검출부를 추가로 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 검출부는, 상기 측정부에서 얻어진 상기 단백질 또는 유전자의 발현 정도의 범주에 따라 췌장염에 관한 정보를 생성하여 분류함으로써 췌장염을 진단할 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 개에서의 췌장염 예방 또는 치료방법을 제공한다:
(S1) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 PDE4DIP (phosphodiesterase 4D interacting protein), SERPINA3 (Serpin family A member 3), 및 FGG로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 mRNA 수준을 측정하는 단계;
(S2) 상기 단계 (S1)에서 측정된 SERPINA3의 단백질 또는 mRNA 수준이 대조군에 비해 증가하거나; PDE4DIP 또는 FGG의 단백질 또는 mRNA 수준이 대조군에 비해 감소한 경우, 상기 피검체를 췌장염을 앓고 있는 것으로 진단하는 단계; 및
(S3) 상기 단계 (S2)에서 췌장염을 앓는 것으로 진단된 피검체에서 췌장염을 치료하는 단계.
또한, 본 발명은 개의 췌장염 치료제에 대한 반응개체 (즉, 개)의 특성화 방법 (즉, 동반진단 방법)으로서, 하기 단계를 포함하고:
(a) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 PDE4DIP (phosphodiesterase 4D interacting protein), SERPINA3 (Serpin family A member 3), 및 FGG로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)에서 측정된 SERPINA3의 단백질 또는 mRNA 수준이 대조군에 비해 증가하거나; PDE4DIP 또는 FGG의 단백질 또는 mRNA 수준이 대조군에 비해 감소한 경우, 상기 피검체를 개의 췌장염 치료제에 대한 반응자로 판단하는 단계,
상기 개의 췌장염 치료제는 maropitant, ondansetron, Panoquell-CA1, 및 metoclopramide로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 개의 췌장염 치료제에 대한 반응개체의 특성화 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 “치료”는 목적하는 질병과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, 화학 요법, 방사선 요법, 외과적 수술, 생물학적 요법, 또는 항생제 투여 등의 방법을 사용할 수 있다. 예컨대, 상기 치료는 수액처치, 약물, 혈장수혈, 및 식이조절 등을 통해 이루어질 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 화학 요법(Chemotherapy)은 특정 질병의 치료를 위해 화학물질을 사용하는 행위와 그때 사용되는 약물 전체를 의미한다. 상기 약물의 예로는 항구토제, 위장 보호 약물, 항생제 등이 있으며, 더 구체적으로는 maropitant, ondansetron, Panoquell-CA1, 및 metoclopramide 등을 예로 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 외과적 수술은 치유, 치료 또는 진단 효과를 얻기 위해 개체의 신체에 대하여 손(hand) 혹은 기기와 함께 손의 방법적 작용을 포함하는 어떠한 치료상 또는 진단 처치를 모두 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 생물학적 요법은 생물체에서 유래된 물질이나 생물체를 이용하여 생성시킨 물질을 함유한 생물학적 제제를 이용하여 직, 간접적으로 인체의 면역체계를 이용하는 치료법을 의미하며, 상기 생물학적 제제는 물리적, 화학적 시험만으로는 그 역가와 안정성을 평가할 수 없는 백신, 알레르겐, 항원, 호르몬, 사이토카인, 효소, 혈액 및 혈장, 면역 혈청, 단클론 항체, 발효 제품, 항독소, 및 실험실 진단제 등을 포함한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 반려견의 혈액 수집
수의사가 각 개체로부터 혈액을 채취하고 혈청분리 후 혈청을 별도의 tube에 채취하여 분석 전까지 -80℃에 보관하였다. 총 114두의 반려견으로부터 혈액 시료를 수집하였다.
실시예 2. 반려견 혈액 시료의 전처리
고성능 액체 크로마토그래피 (High-performance liquid chromatography, HPLC)에 연결한 고농도 혈장 단백질 제거 컬럼 MARS14 컬럼 (100×4.6 mm; Agilent Technology, Palo Alto, CA, USA)을 이용하여 혈장 시료에서 14종의 고농도 (high abundant) 혈장 단백질을 제거하고 저농도 (low abundant) 단백질을 분리하였다. 분리된 저농도 단백질은 자동화된 액체 분주 시스템 (Bravo Automated Liquid Handling Platform; Agilent사)을 이용하여 펩티드를 제조하는 전처리 과정을 수행하였다 (도 1a).
즉, 40 μL의 혈장시료를 MARS14 컬럼에 주입하여 상위 14 개의 풍부한 단백질 (albumin, IgA, IgG, IgM, α1-antitrypsin, α1-acid glycoprotein, apolipoprotein A1, apolipoprotein A2, Complement C3, transferrin, α2-macroglobulin, transthyretin, haptoglobin, 및 fibrinogen)을 제거하였다 (도 1b). 이를 위해, 혼합물을 Agilent사의 buffer A (#5185-5987)로 4배 희석하고 Shimadzu HPLC LC20AT 시스템의 MARS14 컬럼에 로딩하였다. 결합되지 않은 저농도 혈장 단백질의 분획을 동결건조한 후, 재흡수하여 Suspension trap 방법을 이용해 펩티드로 제조했다 (도 1c). 5% SDS (50mM TEAB) 버퍼로 재흡수하여 10 mM이 되도록 1,4-디티오트레이톨 (1,4-Dithiothreitol)을 첨가하고 95℃에서 10분 동안 반응시켜 이황화결합을 환원시켰다. 그 후, 알킬화를 위해 20 mM이 되도록 아이오도아세트아미드 (iodoacetamide)를 첨가하여 암조건하에 실온에서 30분 동안 반응시키고, 6 μg의 트립신/라이스씨 혼합물로 37℃에서 18시간동안 분해시켰다. 용출된 페티드는 콜드 트랩 (CentriVap Cold Traps, LABCONCO)으로 동결 건조하고 사용할 때까지 영하 80℃에서 보관했다.
실시예 3. LC-MS 분석
상기 실시예를 통해 확보된 펩티드들에 대해 SWATCH LC-MS 분석을 수행하였다. 이를 위해, 도 1d에 나타낸 파라미터를 이용하여 LC-MS 분석을 수행하여 스펙트럼을 확보했다.
구체적으로, 제조된 Peptide 시료에 iRT-Kit (Biognosys AG, Schlieren, Switzerland)에서 제공하는 iRT 표준을 1/10 부피로 샘플에 추가하여 공급 업체 지침 (참고논문: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22577012/)에 따라 머무름 시간을 보정하였다. 각 샘플의 총량은 40 μg이며 40 μL의 용액에 용해시켰다.
주입된 4 μL의 샘플은 다음 LC-MS/MS 설정과 함께 SCIEX TripleTOF 5600+ 시스템 질량 분석기를 사용하여 분석하였다. LC 분리를 위해 nanoLC 425 (Eksigent, Dublin, CA, USA)를 Eksigent 마이크로 트랩 C18컬럼 (ChromXP C18CL, 5 μm, 120 Å)과 분석 컬럼으로서 Eksigent 컬럼 (C18-CL, 0.3 × 150 mm, 입자 크기 3 μm, 기공 크기 120 Å)을 함께 컬럼 온도가 40℃로 유지되도록 하고 샘플을 버퍼 A를 사용하여 10 μL/min의 유속으로 트랩 컬럼에 로딩하였다. 10분 후, 펩티드 혼합물은 버퍼 A와 버퍼 B (0.1 % formic acid in HPLC acetonitrile)를 사용하여 57분에 의해 5 μL/분으로 유속으로 농도구배를 통한 분리를 수행하였다. 버퍼 B를 38분 동안 3-25% 변경하고, 5분 동안 25-32% 변경하고, 2분 동안 32-80% 변경하고, 3분 동안, 80%로 유지하고, 3분 동안 80-3% 변경하고, 8분 동안 3%로 유지하였다.
개별 샘플의 경우 모든 질량 분석 실행은 100개의 가변 창을 사용하여 모든 이론적 질량 스펙트럼 (SWATH) 모드의 순차 창 수집에서 작동시켜 수행했다. SWATH 매개 변수는 다음과 같이 설정하였다: Lower m/z limit 400; m/z 상한선 1250; 윈도우 오버랩 (Da) 1.0; CES는 작은 창에 대해 5, 큰 창에 대해 8, 가장 큰 창에 대해 10. MS2 스펙트럼은 고감도 모드에서 2.5ms 동안 100-1500m/z 범위에서 수집되었으며 총 사이클 시간은 2.8초였다. 다른 MS 파라미터는 다음과 같이 설정하였다: 이온 소스 가스 1 (GS1) 15 psi; 이온 소스 가스 2 (GS2) 20 psi; 커튼 가스 (CUR) 30 psi; 온도 (TEM) 250 °C; 이온 스프레이 전압 부동 (ISVF) 5500V.
실시예 4. 통계 분석
상기 실시예를 통해 각 시료에 대해 SWATH LC-MS 분석을 수행하여 스펙트럼 (spectrum) 결과를 획득하고, DIA-NN software와 Pan-human proteome library를 이용하여 상기 스펙트럼들로부터 단백질들에 대한 정량적, 정성적 정보를 추출하였다. 정상대조군과 췌장염군의 시료별로 중간값 기반의 정규화된 단백질들의 양 정보를 로그 스케일 (Log scale)로 분석한 결과 재현성을 보이는 것을 확인하고 단백질들의 정량 정보를 이용하여 통계분석을 수행하였다.
[실험예]
실험예 1. 혈액 시료의 채취
동물병원에서 보호자 동의서를 받은 뒤, 수의사에 의해 혈액을 채취하고 혈청분리 후 혈청을 별도의 tube에 채취하여 분석 전까지 -80℃에 보관하였으며 총 116두의 반려견으로부터 혈액 시료를 수집하였다. 수집된 반려견들의 그룹 정보는 아래 표 1에 나타냈다.
그룹 수
피부질환 1
비만 6
만성췌장염 17
림포마 18
당뇨 4
급성췌장염 19
과체중 2
건강 대조군 33
실험예 2. 혈장 시료로부터 분리한 단백질들의 총량 분석
실시예 2에 따라 S-trap를 기반으로 trypsin/LysC로 116개의 혈장 시료들을 peptide로 제조하고, Nanodrop을 이용하여 펩티드의 양을 정량하였다 (도 2). 그 결과, 최고 1,023 μg에서 최소 214 μg의 펩티드가 수득되었음을 확인하였다. 통상적으로 단백질 분석시 8 μg 정도의 펩티드만 분석하는 것을 감안하면, 연구에 충분한 양의 펩티드가 제조되었음을 알 수 있었다.
실험예 3. 정상 그룹 대비 췌장염 개체에서 차별적인 수준을 보이는 단백질들의 선별
반려견들의 혈장으로부터 분리한 펩티드 시료들에 대해 Sciex사의 Quadupole Time of Flight (Q-TOF) mass spectrometry를 수행하여 Data-independent acquisition (DIA) 방식으로 스펙트럼을 확보하였다. 확보된 스펙트럼은, 기확보된 개의 pooling된 단백질 시료들로부터 Data dependent acqusition (DDA) 방식으로 확보한 스펙트럼 라이브러리를 활용하여 비교분석하였으며, DIA-NN 알고리즘으로 단백질의 정성 및 정량적 정보를 추출하였다.
SWATH LC-MS 분석 결과 116개 시료에서 총 701개의 단백질들을 정량분석할 수 있었으며, 시료별 정량 가능한 단백질들의 수는 도 3에 나타냈다. 정량된 단백질의 수는 그룹별로 차이가 없었으며 missing value가 있는 경우 80%의 frequency를 기준으로 random normal distribution으로 imputation 하여 분석을 진행하였다.
정상대조군 대비 췌장염 혈액에서 차별적으로 존재하는 단백질들 (Diffrentially expressed proteins, DEPs)은 총 16개로 나타났으며, 정상 대조군 대비 췌장염 혈액 혈장에서 증가한 단백질들은 총 3개, 감소한 단백질들은 13개로 확인됐다 (도 4). 16개 DEP들에 대한 p value와 fold change는 도 5에 나타냈다. 이 중 Pentaxin은 C-Reactive protein으로, 본 발명자들이 림프종에서도 동일하게 증가하는 바이오마커로 확인한 바 있는 단백질이다. 또한, CRP 및 SERPINA3는 림프종에서의 DEP에서도 확인된 단백질이다. 이외에도, PEPD를 포함한 10개의 단백질들이 질환군에서 공통적으로 감소되어 있는 것으로 확인되었다.
상기 단백질들은 림프종 및 췌장염에서 공통적으로 발현 변화를 보이는 DEP이므로 질환 특이도가 낮을 수 있으나, 고위험 질환군에 대한 범용적 바이오마커로 활용될 수 있는 이점이 있다.
실험예 4. 반려견의 췌장염 진단을 위한 단백질 마커 조합의 선별
정상 그룹 대비 췌장염 그룹에서 차별적인 수준을 보이는 16개 DEP 중 SERPINA3 (Serpin family A member 3) 및 Angiotensinogen은 모두 췌장염에서 증가한 단백질이다. SEPINAA3는 특이도 78.1%, 민감도 81.8%를 나타냈으며 ROC AUC는 0.857로 우수한 변별력을 가지는 것으로 나타났다 (도 6a). 또한 Angiotensinogen은 민감도 78.8%, 특이도 87.5%였으며 ROC AUC는 0.848로, 마찬가지로 질환 변별력이 우수한 것이 확인됐다 (도 6b).
또한, 상기 실험예에서 확인된 15개의 상위 DEP을 이용한 PLS-DA 결과 췌장염 그룹 (급성 및 만성) 과 정상 대조군 그룹은 단백질들의 정량적 특징을 이용하여 서로 구별될 수 있는 개연성을 가지는 것으로 확인되었다 (도 7). 도 7의 우축 그래프에 Angiotensinogen을 의미하는 F1PAL5가 표기되어 있다.
실험예 5. 반려견의 급성 또는 만성 췌장염 진단을 위한 마커 선별
정상대조군과 급성 췌장염, 만성 췌장염을 구분할 수 있는 DEP를 도출하기 위해 Kruskal Wallis test를 수행하였으며, 그 결과 23개의 DEP들을 도출할 수 있었다 (도 8).
도출된 23개 단백질들 중에서 Angiotensinogen은 만성 췌장염 및 급성 췌장염 공통적으로 증가하는 것으로 나타났으며, SERPINA3는 정상, 만성, 및 급성으로 갈수록 수준이 더욱 증가하는 정량적 특성을 나타내었다. 또한 PDE4DIP는 정상 그룹에서 수준이 높고, 만성 및 급성 췌장염 그룹에서 감소하는 특징을 보였다 (도 9). 즉, 상기 단백질들의 정량적 특징을 이용하여 만성 췌장염과 급성 췌장염을 구분하는 panel을 개발할 수 있음을 확인하였다.
Logistic regression을 이용하여 DEP 중 2가지 이상의 단백질들의 조합을 이용하여 진단 정확도를 분석한 결과, PDE4DIP (phosphodiesterase 4D interacting protein), FGG 및 SERPINA3 단백질들이 조합되었을 때 민감도는 97.0%, 특이도는 84.4%로 나타났으며 ROC AUC는 0.951로 매우 우수한 변별력을 가지는 것으로 나타났다 (도 10). 질병을 구분하는 기준인 민감도가 중요하다는 관점에서, 상기 바이오마커의 조합은 기존의 췌장염 진단의 민감도와 특이도인 82%, 59%에 비교하여 매우 우수한 변별력을 가지는 것을 알 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

Claims (13)

  1. PDE4DIP (phosphodiesterase 4D interacting protein), SERPINA3 (Serpin family A member 3), 및 FGG (Fibrinogen gamma chain)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 mRNA 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 개의 췌장염 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 SERPINA3의 단백질 또는 mRNA 수준은 정상 개체 대비 췌장염 개체에서 증가되어 있는 것을 특징으로 하는, 개의 췌장염 진단용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 PDE4DIP 또는 FGG의 단백질 또는 mRNA 수준은 정상 개체 대비 췌장염 개체에서 감소되어 있는 것을 특징으로 하는, 개의 췌장염 진단용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 Pentaxin, Angiotensinogen, Peptidase D, Transferrin (TF), Complement C7, Coagulation factor X, Kallikrein B1, Factor XI, Complement C8 alpha chain, Coagulation factor XIII B chain (F13B), Complement C3 (LOC484960), 및 Complement factor I로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 개의 췌장염 진단용 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머인 것을 특징으로 하는, 개의 췌장염 진단용 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 개의 췌장염 진단용 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 단백질 또는 mRNA 수준은 혈액, 전혈, 혈장, 혈청, 및 림프액으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에서의 수준인, 개의 췌장염 진단용 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 개의 췌장염 진단용 키트.
  9. 하기 단계를 포함하는, 개의 췌장염 진단 방법:
    (S1) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 PDE4DIP (phosphodiesterase 4D interacting protein), SERPINA3 (Serpin family A member 3), 및 FGG로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및
    (S2) 상기 단계 (S1)에서 측정된 SERPINA3의 단백질 또는 mRNA 수준이 대조군에 비해 증가하거나; PDE4DIP 또는 FGG의 단백질 또는 mRNA 수준이 대조군에 비해 감소한 경우, 췌장염으로 진단하거나 췌장염이 발병할 위험이 있는 것으로 판단하는 단계.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 방법은 상기 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 Pentaxin, Angiotensinogen, Peptidase D, Transferrin (TF), Complement C7, Coagulation factor X, Kallikrein B1, Factor XI, Complement C8 alpha chain, Coagulation factor XIII B chain (F13B), Complement C3 (LOC484960), 및 Complement factor I로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 mRNA의 수준을 측정하는 단계를 더 포함하는 것인, 개의 췌장염 진단 방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 혈액, 전혈, 혈장, 혈청, 및 림프액으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 개의 췌장염 진단 방법.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 단백질 수준은 단백질 칩 분석, 면역 측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF (Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역 분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석 (liquid chromatography-Mass Spectrometry; LC-MS), LC-MS/MS (liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅, ELISA (enzyme linked immunosorbentassay), 및 FACS으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법으로 측정되는 것을 특징으로 하는, 개의 췌장염 진단 방법.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 mRNA 수준은 PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 (northern blotting), 서던 블랏팅 (southern blotting), In situ 교잡법, DNA 칩, 및 RNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법으로 측정되는 것을 특징으로 하는, 개의 췌장염 진단 방법.
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