JP2015505055A - インスリン受容体タンパク質に対するｓｒｍ／ｍｒｍアッセイ - Google Patents

インスリン受容体タンパク質に対するｓｒｍ／ｍｒｍアッセイ Download PDF

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Abstract

選択反応モニタリング（SRM）質量分析、または多重反応モニタリング（MRM）質量分析と呼ばれるものにより、ホルマリン固定した生体試料中で直接、IRタンパク質、IR-Aアイソフォームおよび／またはIR-Bアイソフォームを定量するために特に有利な、インスリン受容体タンパク質（IR）、およびそのアイソフォームIR-AおよびIR-Bからの特異的ペプチド、およびそのペプチドの派生イオン化特性。このような生体試料は化学的に保存・固定され、ホルマリン固定組織／細胞、ホルマリン固定／パラフィン包埋（FFPE）組織／細胞、FFPE組織ブロックおよびこれらのブロックからの細胞、ならびにホルマリン固定および／またはパラフィン包埋された組織培養細胞を含む、ホルムアルデヒド含有薬剤／固定剤で処理された組織および細胞から選択される。タンパク質サンプルは、Liquid TissueTM試薬およびプロトコルを使用して前記生体試料から調製され、IRタンパク質、およびIR-Aおよび／またはIR-Bアイソフォームは、タンパク質サンプル中の記述されたペプチドの少なくとも1つ以上を定量することによって、SRM／MRM質量分析の方法でLiquid TissueTMサンプル中で定量される。これらのペプチドは、それらが修飾型または未修飾型で存在する場合に定量できる。IRペプチドの修飾型の例は、チロシン、トレオニン、セリン、および／またはペプチド配列内のその他のアミノ酸残基のリン酸化である。

Description

関連出願の参照
本明細書は、「インスリン受容体タンパク質に対するSRM／MRMアッセイ」と題する米国仮出願第61/585,202号（2012年1月10日出願）の利益を主張し、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
発明の背景
序論
インスリン様成長因子IおよびII（それぞれIGF-IおよびIGF-II）の増殖作用は、大部分がインスリン様成長因子（IGF-IR）の活性によるものであると考えられている。しかしIGF-IIはまた、多くのがんで見られるインスリン受容体の胎児性アイソフォーム（IR-A）に結合し、これを活性化する。例えば、Denley et al., Endocrinology 147(2):1029-1036（2006）を参照のこと。インスリン様成長因子II（IGF-II）に反応して、IR-Aタンパク質は増殖性の抗アポトーシスシグナルを送る。さらに、IGF-II自体は腫瘍によって分泌されて自己分泌増殖ループを確立し、この中でそれはその受容体（IGF-1R）、また存在する場合はIR-A受容体に結合する。IR-Aを介したIGF-IIシグナル伝達の1つの結果は、現在開発中のものを含む、IGF-IR阻害薬に対するIR-A媒介抵抗性の誘導である。
インスリン受容体タンパク質（IRと呼ばれる）の部分配列に由来し、サンプル中に存在するインスリン受容体アイソフォーム（IR-AおよびIR-B）のレベルとタイプを決定するのに適した特異ペプチドが提供されている。ペプチド配列および各ペプチドの断片化／遷移イオンは、質量分析ベースの選択反応モニタリング（SRM）アッセイで特に有用であり、これは多重反応モニタリング（MRM）アッセイとも呼ばれる。このようなアッセイは本明細書ではSRM／MRMアッセイと呼ばれる。IRタンパク質の定量的SRM／MRM分析、およびIRタンパク質（例えば、IR-AおよびIR-B）の異なるアイソフォームの定量的分析のためのペプチドの使用が記述されている。
このSRM／MRMアッセイは、IRタンパク質からの1つ以上の特異ペプチドの相対的または絶対的定量レベルの測定のために使用できる。これは、質量分析によって、生体試料から取得された所定のタンパク質調製品中の合計IRタンパク質量だけでなく、IR-AおよびIR-Bアイソフォームの量も測定する手段を提供する。
より具体的には、SRM／MRMアッセイは、ホルマリン固定がん患者組織などの患者組織サンプルから入手した細胞から調製された複合タンパク質溶解物サンプル中のこれらのペプチドを直接測定できる。ホルマリン固定組織からタンパク質サンプルを調製する方法は、米国特許第7,473,532号に記述されており、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる。米国特許第7,473,532号に記述されている方法は、Liquid TissueTM試薬およびOncoPlexDx（旧Expression Pathology Inc.、メリーランド州ロックビル）から入手可能なプロトコルを使用して都合よく実施されうる。
最も幅広く有利に入手できるがん患者組織からの組織形態は、ホルマリン固定、パラフィン包埋組織である。外科的に除去された組織のホルムアルデヒド／ホルマリン固定は、がん組織サンプルを保存するための世界でもはるかに最も一般的な方法であり、標準的病理技法の許容された慣習である。ホルムアルデヒドの水溶液はホルマリンと呼ばれる。「100%」ホルマリンは、ホルムアルデヒドの飽和水溶液（これは約40体積%または37質量%）と、少量の安定剤（通常は、酸化および重合の程度を制限するためのメタノール）から成る。組織が保存される最も一般的な方法は、組織全体を長時間（8時間〜48時間）ホルムアルデヒド水溶液（一般的には10%中性緩衝ホルマリンと呼ばれる）に浸し、次に固定された組織全体を、室温での長期保存のためにパラフィンワックス中に包埋することである。このように、ホルマリン固定がん組織を分析するための分子分析法は、がん患者組織の分析のために最も許容され多く利用される方法となるであろう。
SRM／MRMアッセイの結果は、組織（生体試料）が採取・保存された患者または被験者の特定組織サンプル（例えば、がん組織サンプル）中のIR-AおよびIR-Bアイソフォームの正確・精密な定量レベルに加えて、IRタンパク質の正確・精密な定量レベルを関連付けるために使用できる。これは、がんについての診断情報を提供するだけでなく、これにより医師またはその他の医療専門家は患者に対して適切な治療を決定することが可能となる。例えば、このようなアッセイは、がんの病期または程度を診断し、患者が反応する可能性の最も高い治療薬を決定するように設計されうる。罹患組織またはその他の患者サンプルのタンパク質発現レベルについての診断的で治療上重要な情報を提供するこのようなアッセイは、コンパニオン診断アッセイと呼ばれる。
本明細書に記述のアッセイは、IRタンパク質からの未修飾特異ペプチドの相対的または絶対的レベルを測定し、IRタンパク質からの修飾特異ペプチドの絶対的または相対的レベルも測定できる。修飾の例には、ペプチドに存在するリン酸化アミノ酸残基（例えば、ホスホチロシン、ホスホセリンおよびホスホトレオニン）およびグリコシル化アミノ酸残基（例えば、グリコシル化アスパラギン残基）が含まれる。
IRタンパク質、IR-Aアイソフォームおよび／またはIR-Bアイソフォームの相対的定量レベルは、例えば、異なるサンプル（例えば、対照試料および患者または被験者の組織から調製されたサンプル）中の個別IRペプチドのSRM／MRMの特徴ピーク面積（例えば、特徴ピーク面積または積分断片イオン強度）を比較するなど、SRM／MRM手法によって決定される。または、各ペプチドがそれ自身の特異的SRM／MRM特徴ピークを持つ場合、複数のIR特徴ペプチドについて複数のSRM／MRM特徴ピーク面積を比較し、1つ以上の追加的または異なる生体試料中のIRタンパク質、およびIRタンパク質、IR-Aアイソフォームおよび／またはIR-Bアイソフォーム含量に対して、1つの生体試料中の相対的IRタンパク質、IR-Aアイソフォームおよび／またはIR-Bアイソフォーム含量を決定することが可能である。このように、IRタンパク質からの特定のペプチドの量、従ってIRタンパク質、IR-Aおよび／またはIR-Bアイソフォームの量が、同じ実験条件下の2つ以上の生体試料にわたる同じIRタンパク質と比較して決定される。さらに、SRM／MRM手法で、そのペプチドの特徴ピーク面積を、生体試料からの同じタンパク質調製品中の異なるタンパク質からの別の異なるペプチドの特徴ピーク面積と比較することによって、単一サンプル中のIRタンパク質からの所定のペプチドに対して相対的定量を決定することができる。こうして、IRタンパク質からの特定のペプチドの量、従ってIRタンパク質、IR-Aアイソフォームおよび／またはIR-Bアイソフォームの量は、同じサンプル内で互いに対して決定される。これらのアプローチは、サンプル間およびサンプル内の、IRタンパク質からの個別ペプチドの別のペプチド量に対する定量を可能にするが、ここで生体試料からのタンパク質調製品のIRペプチドの容積に対する絶対重量または重量に対する重量に関わらず、ピーク面積によって決定される量は互いに対するものである。異なるサンプル間の個別の特徴ピーク面積についての相対的定量データは、サンプルあたりの分析されたタンパク質量に対して正規化される。相対的定量は、単一サンプルおよび／または多くのサンプルにわたって、複数のタンパク質およびIRタンパク質からの多くのペプチドにわたって同時に実施でき、1つのペプチド／タンパク質のその他のペプチド／タンパク質に対する相対的タンパク質量についての見識を得ることができる。
IRタンパク質、IR-Aアイソフォームおよび／またはIR-Bアイソフォームの絶対的定量レベルは、例えば、1つの生体試料のIRタンパク質からの個別ペプチドのSRM／MRM特徴ピーク面積が、外部から追加された「混入」内部標準の既知量のSRM／MRM特徴ピーク面積と比較されるSRM／MRM手法によって決定される。1つの実施形態では、内部標準は、1つ以上の重同位体で標識された1つ以上のアミノ酸残基を含む全く同一のIRペプチドの合成版である。適切な同位体標識内部標準は、質量分析で分析された時、各標準が天然IRペプチド特徴ピークとは異なりかつ区別できるため対照ピークとして使用できる、予測可能で一貫性のあるSRM／MRM特徴ピークを生成するように合成される。従って、生体試料からのタンパク質またはペプチド調製品に既知量の内部標準が混入され、質量分析で分析される時、そのサンプルからの天然ペプチドのSRM／MRM特徴ピーク面積を、内部標準ペプチドのSRM／MRM特徴ピーク面積と比較することができる。この数的比較によって、生体試料からの最初のタンパク質調製品に存在する天然ペプチドの絶対モル濃度および／または絶対重量のいずれかが提供される。断片ペプチドの絶対的定量データは、サンプルあたりの分析されたタンパク質量に従って示されている。絶対的定量は、多くのペプチド、従ってタンパク質にわたって、単一サンプルおよび／または多くのサンプルにわたって同時に実施でき、個別の生体試料および個別サンプルのコホート全体の絶対的タンパク質量についての見識を得ることができる。
SRM／MRMアッセイ法は、例えば、ホルマリン固定組織などの患者由来または被験者由来組織中のがんの病期を直接診断するのに役立ち、また、その患者または被験者の治療に使用するために最も有利な治療薬の決定の一助として使用できる。腫瘍の部分的または全体の治療的除去などの手術によって、または疑われる疾患の有無を決定するために実施される生検手順によって、患者または被験者から取り出されるがん組織を分析し、特異タンパク質がその患者または被験者の組織に存在するかどうか、またどの形態のタンパク質が存在するかを決定する。さらに、タンパク質または複数のタンパク質の発現レベルを決定し、健常組織に見られる「正常」または参照レベルと比較できる。健常組織に見られるタンパク質の正常または参照レベルは、例えば、がんを持たない1人以上の人の関連組織から由来しうる。または、がんを持つ人の正常または参照レベルは、がんの影響を受けていない関連組織の分析によって得られうる。
タンパク質レベル（例えば、IR、IR-A、またはIR-B）のアッセイも、IRタンパク質、IR-Aアイソフォームおよび／またはIR-Bアイソフォームレベル、またはIR-A／IR-B比の1つ以上（すなわち、1つ、2つ、3つまたは4つ）を用いることにより、がんと診断された患者または被験者のがんの病期を診断するために使用できる。比率が用いられる場合、IR-A／IR-B比は、組織およびがんによっては、0.10、0.05、0.07、0.1、0.2、0.4、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、2.25、2.5、4、5、7.5または10より大きいことがある。
インスリン受容体（IR）の過剰発現はがんでは一般的で、IRタンパク質の胎児性版の発現では、Aアイソフォーム（IR-A、エクソン11を欠く）がBアイソフォーム（エクソン11を持つIR-B）より多い。本明細書に記述されたアッセイは、生体試料に存在するIR-Aアイソフォームの存在と量を決定／検出する能力を持つ。IR-Aの存在の意義は、この特異アイソフォームはIR-Bアイソフォームより高い親和性でインスリン様成長因子IIに結合する能力があり、そのためIGF-1R媒介療法に対して抵抗性を与える。
本明細書に規定される実施形態には、IGF-1Rの拮抗薬に対する抵抗性（または逆に言えば感受性）を決定する方法を含む。このような実施形態は、がん組織のIR、IR-Aの存在またはレベル、またはIR-Bに対するIR-Aの比率を決定することを含み、IR、IRAの存在または対照組織と比較してIR-Bに対するIR-Aの比率が高いことは、IGF-IRの前記拮抗薬に対する前記がんの抵抗性を示す。1つの実施形態は、がん組織のIR-Aの存在またはレベル、またはIR-Bに対するIR-Aの比率を決定することを含み、IRAの存在または対照組織と比較してIR-Bに対するIR-Aの比率が高いことは、IGF-IRの前記拮抗薬に対する前記がんの抵抗性を示す。IR-A／IR-Bの比率が用いられる場合、IGF-1Rに対する抵抗性を示す比率は、組織およびがんによっては、0.10、0.05、0.07、0.1、0.2、0.4、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、2.25、2.5、4、5、7.5または10より大きいことがある。
IGF-1Rの拮抗薬に対するがんの抵抗性（または感受性）を決定する方法は、そのがんを患う患者または被験者の治療に対する療法および／または治療の選択に拡大されうる。がんがIR-AまたはIGF-1R拮抗薬に対する抵抗性を示すのに十分高いIR-A／IR-Bの比率を持つ一部の実施形態では、用いられる療法および／または治療は、IGF-1R拮抗薬の使用を省く。
IGF-1Rの拮抗薬に対するがんの抵抗性（または逆に言えば感受性）を決定する方法では、IGF-1Rの拮抗薬はIGF-1Rを結合するタンパク質またはペプチド（ポリペプチド）である。1つの実施形態では、そのタンパク質またはペプチド（ポリペプチド）は、a. ヒト抗体、b. ヒト化抗体、c. キメラ抗体、d. モノクローナル抗体、e. 単一特異性抗体、f. 組み換え抗体、g. 抗原結合抗体フラグメント、h. 単鎖抗体、i. 二重特異性抗体、j. 三重特異性抗体、k. 四重特異性抗体、l. Fabフラグメント、m. F(ab')2フラグメント、n. ドメイン抗体、o. IgD抗体、p. IgE抗体、q. IgM抗体、r. IgG1抗体、s. IgG2抗体、t. IgG3抗体、またはu. IgG4抗体を含む。またその他の実施形態では、タンパク質は抗体またはモノクローナル抗体である。1つの実施形態では、抗体は、R1507（Roche）、OSI-906（OSI Pharmaceuticals）および／またはフィギツムマブの任意の1つ、または任意の2つの組み合わせ、または3つすべてから選択される。別の実施形態では、IGF-1Rの拮抗薬はチロシンキナーゼ阻害剤である。
タンパク質またはペプチドのレベルまたは量は、SRM／MRMアッセイで決定されたタンパク質またはペプチドの質量または重量である、モルで表される数量として定義される。レベルまたは量は、分析された溶解物中のタンパク質または別の成分の合計レベルまたは量に対して正規化されうる（例えば、タンパク質のマイクロモル／マイクログラムまたはタンパク質のマイクログラムで表される）。さらに、タンパク質またはペプチドのレベルまたは量は容積基準で決定でき、例えばマイクロモルまたはナノグラム／マイクロリットルで表される。SRM／MRMアッセイで決定されるタンパク質またはペプチドのレベルまたは量は、分析される細胞の数に対しても正規化できる。従って、IRタンパク質、およびIR-AまたはIR-Bアイソフォームに関する情報は、IRタンパク質、IR-Aおよび／またはIR-Bアイソフォーム、またはIRタンパク質の断片ペプチドのレベルを正常組織で観察されたレベルと相関させることにより、がんの病期または悪性度の決定に有用である。がんの病期および／または悪性度、および／またはIRタンパク質、IR-Aおよび／またはIR-Bアイソフォームの発現特性が決定されたら、その情報を、例えば、分析されたタンパク質（例えば、IRおよびIR-Aおよび／またはIR-Bアイソフォーム）の異常発現を特徴とするがん組織を特に治療するために開発された治療薬（化学的および生物学的）のリストに適合させることができる。IR、およびIR-Aおよび／またはIR-Bアイソフォームタンパク質アッセイと、例えばIRタンパク質、およびIR-Aおよび／またはIR-BアイソフォームまたはそのIRタンパク質およびIR-Aおよび／またはIR-Bアイソフォームを発現する細胞／組織を特に標的とする治療薬のリストの適合情報は、疾患治療に対するオーダーメイド医療アプローチと呼ばれるものを定義する。本明細書に記述されたアッセイ法は、患者または被験者自身の組織からのタンパク質の分析を、診断および治療決定のソースとして使用することによって、オーダーメイド医療アプローチの基礎を形成する。
生体試料中のインスリン受容体（IR）タンパク質、および／またはそのアイソフォームであるIR-Aおよび／またはIR-Bのレベルを測定する方法が提供されており、この方法は前記生体試料から調製されたタンパク質消化物中の1つ以上の修飾または未修飾IR断片ペプチドを質量分析を使用して検出および／または定量することと、試料中の修飾または未修飾IR、IR-Aアイソフォームおよび／またはIR-Bアイソフォームタンパク質のレベルを計算することを含むが、前記の量は相対的量または絶対的量である。
方法は、1つ以上の修飾または未修飾IR断片ペプチドの量を検出および／または定量する前に、タンパク質消化物を分画するステップをさらに含みうる。分画ステップは、例えばゲル電気泳動、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、または逆相高性能液体クロマトグラフィーでありうる。生体試料のタンパク質消化物は、Liquid TissueTMプロトコルで調製しうる。特定の実施形態では、タンパク質消化物は、プロテアーゼ消化物、例えば、トリプシン消化物を含む。
これらの実施形態では、質量分析は、タンデム質量分析、イオントラップ質量分析、三連四重極質量分析、MALDI-TOF質量分析、MALDI質量分析、および／または飛行時間型質量分析を含みうる。使用される質量分析のモードは、例えば、選択反応モニタリング（SRM）、多重反応モニタリング（MRM）、および／または多重選択反応モニタリング（mSRM）、またはその任意の組み合わせでありうる。
これらの実施形態では、IR断片ペプチドは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、および配列番号5として規定されたアミノ酸配列を含みうる。
これらの実施形態のいずれでも、生体試料は血液サンプル、尿サンプル、血清サンプル、腹水サンプル、喀痰サンプル、リンパ液、唾液サンプル、細胞、または固体組織でありうる。組織は、ホルマリン固定組織および／またはパラフィン包埋組織でありうる。組織は、腫瘍、例えば、原発腫瘍または二次腫瘍から取得されうる。
これらの実施形態のいずれでも、方法は、修飾または未修飾IR断片ペプチドを定量することをさらに含みうる。IR断片ペプチドの定量は、1つの生体試料の配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、または配列番号5に示されるようなIRの約8〜約45のアミノ酸残基のアミノ酸配列を含む1つ以上のIR断片ペプチドの量を、異なる別の生体試料の同じIR断片ペプチドの量と比較することを含みうる。1つ以上のIR断片ペプチドの定量は、既知量の追加内部標準ペプチドと比較することによって、生体試料中のIR断片ペプチドのそれぞれの量を決定することを含む場合があり、生体試料中のIR断片ペプチドのそれぞれは、同じアミノ酸配列を持つ内部標準ペプチドと比較される。内部標準ペプチドは、同位体で標識されたペプチドでありうる。同位体標識内部標準ペプチドは、18O、17O、34S、15N、13C、2Hまたはその任意の組み合わせから選択される1つ以上の安定重同位体を含みうる。
これらの実施形態のいずれでも、タンパク質消化物中の1つ以上の修飾または未修飾IR断片ペプチドの量の検出および／または定量が、修飾または未修飾IRタンパク質、IR-Aおよび／またはIR-Bの存在、および患者または被験者におけるがんとの関連性を示しうる。方法は、1つ以上の修飾または未修飾IR断片ペプチドの量、または前記IRタンパク質、IR-Aアイソフォームおよび／またはIR-Bアイソフォームの量の検出および／または定量の結果を、がんの診断病期／悪性度／状態と関連付けることをさらに含みうる。1つ以上の修飾または未修飾IR断片ペプチドの量、またはIRタンパク質、IR-Aアイソフォームおよび／またはIR-Bアイソフォームの量の検出および／または定量の結果を、がんの診断病期／悪性度／状態と関連付けることは、その他のタンパク質、またはその他のタンパク質からのペプチドの量の検出および／または定量と多重フォーマットで組み合わされて、がんの診断病期／悪性度／状態についての追加情報を提供しうる。
上記実施形態のいずれか1つの方法は、生体試料が取得された患者または被験者に対して、1つ以上のIR断片ペプチドの有無もしくはその量またはIRタンパク質、IR-Aアイソフォームおよび／またはIR-Bアイソフォームの量に基づいて治療を選択することをさらに含みうる。
上記実施形態のいずれか1つの方法は、生体試料が取得された患者に治療有効量の治療薬を投与することをさらに含む場合があり、治療薬および／または投与された治療薬の量は、1つ以上の修飾または未修飾IR断片ペプチドの量またはIRタンパク質、IR-Aアイソフォームおよび／またはIR-Bアイソフォームの量に基づく。治療または治療薬は、IRタンパク質、IR-Aアイソフォームおよび／またはIR-Bアイソフォームを発現するがん細胞を対象としうる。
上記の実施形態のいずれにおいても、生体試料は、Liquid TissueTMプロトコルおよび試薬を用いて、1つ以上の修飾または未修飾IR断片ペプチドの量を定量するために処理されたホルマリン固定腫瘍組織でありうる。
上記の実施形態のいずれの方法でも、1つ以上の修飾または未修飾IR断片ペプチドは、表1のペプチドの1つ以上でありうる。方法は、表2のペプチドの1つ、2つ、3つ、4つまたは5つの量の定量を含みうる。
また、表1のペプチドの1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上および／またはその抗体を含む組成物、および表2のペプチドの1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上またはその抗体を含む組成物が提供されている。
IGF-1Rの拮抗薬に対するがんの抵抗性を決定する方法が提供されており、これには、がん組織のIR-Aの存在またはレベル、またはIR-Bに対するIR-Aの比率を決定することを含み、IRAの存在または対照組織と比較してIR-Bに対するIR-Aの比率が高いことは、[IGF-IR]の前記拮抗薬に対する前記がんの抵抗性を示す。IGF-1Rの拮抗薬は、IGF-1Rに結合するタンパク質またはペプチドを含みうる。そのタンパク質またはペプチドは、例えば抗体、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、組み換え抗体、抗原結合抗体断片、単鎖抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、Fabフラグメント、F(ab')2フラグメント、ドメイン抗体、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、またはIgG4抗体でありうる。抗体は、R1507、OSI-906またはフィギツムマブから選択されうる。
発明の具体的説明
原則として、IRタンパク質から由来し、例えば既知の特異性のプロテアーゼ（例えば、トリプシンまたはエンドプロテイナーゼLys-C）で消化することによって調製される任意の予測ペプチドは、質量分析ベースのSRM／MRMアッセイを使用してサンプル中のIRタンパク質、およびIRタンパク質のIR-Aおよび／またはIR-Bアイソフォームの存在量を決定するための代理レポーターとして使用できる。同様に、IRタンパク質中で修飾されている可能性のあることが知られている部位にアミノ酸残基を含む任意の予測ペプチド配列も、サンプル中のIRタンパク質、IR-Aおよび／またはIR-Bアイソフォームの修飾の程度を分析するために使用しうる。
IR断片ペプチドは、米国特許第7,473,532号に記述されているLiquid TissueTMプロトコルを使用することを含め、さまざまな方法で生成しうる。Liquid TissueTMプロトコルおよび試薬は、組織／生体試料のタンパク質消化によって、ホルマリン固定パラフィン包埋組織から質量分析に適したペプチドサンプルを生成する。適切な試薬およびプロトコルは、OncoPlexDx（旧Expression Pathology Inc.、メリーランド州ロックビル）からも市販されている。
Liquid TissueTMプロトコルでは、タンパク質架橋結合を逆転または解除するために、組織／生体試料は緩衝液中で長時間加熱される（例えば、約80°C〜約100°Cで約10分〜約4時間、例えば、約60分または約90分〜約4、6、または8時間）。使用される緩衝液は、中性緩衝液（例えば、トリス塩基緩衝液、または洗剤を含む緩衝液）であり、好ましくは質量分析を妨げない緩衝液である。熱処理に続いて、組織／生体試料は、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、およびエンドプロテイナーゼLys-Cを含むがこれに限定されない1つ以上のプロテアーゼで、前記の生体試料の組織および細胞構造を破壊しサンプルを液化するのに十分な時間、処理される。プロテアーゼ処理の模範的条件は、約37°C〜約65°Cの温度で、約30分または約60分〜約6時間、約12時間、または約24時間である。同時または連続的に使用される、エンドプロテアーゼ、特に2つまたは3つのエンドプロテアーゼの組み合わせを、サンプルを液化するために用いることが好ましい。例えば、プロテアーゼの適切な組み合わせは、トリプシンとエンドプロテイナーゼLys-Cなど、トリプシン、エンドプロテイナーゼLys-Cおよびキモトリプシンの組み合わせを含みうるがこれに限定されない。加熱およびタンパク質消化の結果は、液体で可溶性の希釈可能な生体分子溶解物である。有利には、この液体溶解物は、遠心分離で溶解物から分離できる固体または粒子状物質を持たない。
溶解物が調製されたら、サンプル中のペプチドは、質量分析によるその分析および測定を促進するさまざまな技術の対象となりうる。1つの実施形態では、ペプチドは、例えば免疫学に基づく精製（例えば、免疫親和性クロマトグラフィー）、イオン選択性媒体でのクロマトグラフィーなどの親和性技術によって、またはペプチドが修飾されている場合は、炭水化物修飾ペプチドの分離のためのレクチンなど、適切な媒体を使用した分離によって分離されうる。1つの実施形態では、質量分析の前にペプチドの免疫学的分離を用いるSISCAPA法が用いられる。SISCAPA技術は、例えば、米国特許第7,632,686号に記述されている。その他の実施形態では、レクチン親和性法（例えば、親和性精製および／またはクロマトグラフィー）を使用して、質量分析での分析の前に溶解物からペプチドを分離しうる。レクチンベース法を含むペプチドグループの分離方法は、例えば、Geng et al., J. Chromatography B, 752:293-306（2001）に記述されている。免疫親和性クロマトグラフィー技術、レクチン親和性技術および親和性分離のその他の形態および／またはクロマトグラフィー（例えば、逆相、サイズベース分離、イオン交換）は、質量分析によるペプチドの分析を促進するために任意の適切な組み合わせで使用されうる。
驚くべきことに、IRタンパク質からの多くの潜在的ペプチド配列は、理由はすぐには明らかでないが、質量分析ベースのSRM／MRMアッセイでの使用には不適切または無効であることが判明した。特に、IRタンパク質からの多くのトリプシンペプチドは、ホルマリン固定、パラフィン包埋組織からのLiquid Tissue溶解物中では効率的にまたは全く検出できないことがわかった。MRM／SRMアッセイに対して最も適したペプチドを予測することは不可能であったので、実際のLiquid TissueTM溶解物中の修飾および未修飾ペプチドを実験的に特定して、IRタンパク質、およびタンパク質のIR-Aおよび／またはIR-Bアイソフォームに対する確実で正確なSRM／MRMアッセイを開発する必要があった。いかなる理論にも束縛されるものではないが、一部のペプチドは、例えば、うまくイオン化しないか、またはその他のタンパク質から生成されるものと異なる断片を生成しないために、質量分析で検出することが困難な場合があると考えられている。ペプチドは、分離（例えば、液体クロマトグラフィー）でうまく分割できないか、またはガラスもしくはプラスチック容器に接着することもあり、これがアッセイの誤った結果につながる。従って、ホルマリン固定組織サンプルから調製されたLiquid Tissue溶解物（例えば、表1および表2のペプチド）中で検出できるIRタンパク質（およびそのAおよびBアイソフォーム）からのこれらのペプチドは、IRタンパク質SRM／MRMアッセイでSRM／MRMアッセイを用いることができるペプチドである。
1つの実施形態では、単一サンプルのIR-AおよびIR-Bの断片の同時調製に用いられるプロテアーゼは、トリプシンである。別の実施形態では、用いられるプロテアーゼはLys-Cである。またその他の実施形態では、用いられるプロテアーゼはトリプシンとLysCの組み合わせである。
本開示のさまざまな実施形態で見られるIRペプチド（例えば、以下の表1および／または表2）は、ホルマリン固定がん組織から調達された細胞から調製される複合Liquid TissueTM溶解物内のすべてのタンパク質のプロテアーゼ消化によって、IRタンパク質から派生した。特に断りのない限り、各例でのプロテアーゼはトリプシンであった。Liquid TissueTM溶解物は次に質量分析で分析され、質量分析で検出・分析されるIRタンパク質から派生するペプチドを決定した。質量分析のために好ましいペプチドの特定サブセットの特定は、1）タンパク質からのどのペプチドがLiquid TissueTM溶解物の質量分析でイオン化するかの実験的決定、および2）Liquid TissueTM溶解物の調製に使用されるプロトコルおよび実験条件で生き残るためのペプチドの能力に基づく。この後者の特性は、ペプチドのアミノ酸配列だけでなく、サンプル調製中に修飾された形態で生き残るためのペプチド内の修飾アミノ酸残基の能力にも及ぶ。
ホルマリン（ホルムアルデヒド）固定組織から直接調達された細胞からのタンパク質溶解物は、Liquid TissueTM試薬およびプロトコルを使用して調製された。これには、組織の顕微解剖によって試験管に細胞を採取し、その後Liquid TissueTM緩衝液中で細胞を長時間加熱することを伴う。ホルマリン誘導架橋結合が悪影響を受けると、次に組織／細胞は、トリプシンなどのプロテアーゼを使用して予想可能な方法で最後まで消化される。当業者であれば、その他のプロテアーゼ、特にエンドプロテアーゼを、トリプシンの代わりに、またはそれに加えて使用しうることを理解するであろう。
各タンパク質溶解物は、プロテアーゼを使用した無傷のポリペプチドの消化によって一群のペプチドになる。各Liquid TissueTM溶解物は、ペプチドの複数の全体的プロテオーム調査を実施するために（例えば、イオントラップ質量分析によって）分析され、各タンパク質溶解物中にあるすべての細胞タンパク質の質量分析によって特定できる、可能な限り多くのペプチドの同定としてデータが提示された。イオントラップ質量分析計、または単一の複合タンパク質／ペプチド溶解物からできるだけ多くのペプチドの同定に対する全体的プロファイリングを実施できる別の形態の質量分析計を採用しうる。しかし、イオントラップ質量分析計が、ペプチドの全体的プロファイリングを実行するために、現在利用可能で最適なタイプの質量分析計でありうる。SRM／MRMアッセイは、MALDI、イオントラップ、または三連四重極を含む任意のタイプの質量分析計で開発・実施できるが、SRM／MRMアッセイのために有利な機器プラットフォームは、多くの場合、三連四重極機器プラットフォームであると考えられている。
用いられた条件下での単一溶解物の単一質量分析で、できるだけ多くのペプチドが特定されると、次にペプチドのリストが照合され、その溶解物で検出されたタンパク質を決定するために使用された。そのプロセスは、複数のLiquid TissueTM溶解物に対して反復され、ペプチドの非常に大きなリストが単一のデータセットへと順に並べられた。結果得られたデータセットは、分析されたタイプの生体試料で（プロテアーゼ消化後に）、特に生体試料のLiquid TissueTM溶解物で検出できるペプチドを表し、従って、例えばIRタンパク質などの特異タンパク質に対するペプチドを含む。
1つの実施形態では、IRタンパク質、IR-Aアイソフォームおよび／またはIR-Bアイソフォームの絶対的または相対的な量の決定に有用であると特定されたIRトリプシンペプチドは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、および配列番号5のペプチドの1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、またはすべてを含み、そのそれぞれの配列が表1に示されている。これらのペプチドはそれぞれ、ホルマリン固定、パラフィン包埋組織から調製されたLiquid TissueTM溶解物の質量分析によって検出された。このように、表1のペプチドのそれぞれ、またはそれらのペプチドの任意の組み合わせ（例えば、表1および表2に記載されたペプチドの1つ以上、2つ以上、または3つ以上、4つ以上）は、ホルマリン固定した患者または被験者組織での直接的なものを含む、ヒト生体試料のIRタンパク質、およびIR-Aおよび／またはIR-Bアイソフォームに対する定量的SRM／MRMアッセイで使用するための候補である。表2は、表1に示されるペプチドに関する追加情報を示す。
Figure 2015505055
表1に記載されているIRペプチドには、前立腺、結腸および胸部を含むヒトの異なる臓器の複数の異なるホルマリン固定組織の複数のLiquid TissueTM溶解物から検出されたものを含む。これらのペプチドのそれぞれは、ホルマリン固定組織のIRタンパク質、およびIR-Aおよび／またはIR-Bアイソフォームの定量的SRM／MRMアッセイのために有用である。これらの実験のさらなるデータ分析で、任意の特定臓器部位からのいかなる特異ペプチドに対しても優先傾向がないことが示された。従って、これらのペプチドのそれぞれは、任意の生体試料または身体の任意の臓器部位に由来する任意のホルマリン固定組織のLiquid TissueTM溶解物についてのIRタンパク質、およびIR-Aおよび／またはIR-BアイソフォームのSRM／MRMアッセイの実施に適していると考えられる。
1つの実施形態では、表1のペプチドの1つ以上、またはこれらのペプチドの任意の組み合わせ（例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上、または5つすべて）が、質量分析に依存しない方法によって分析され、これには免疫学的方法（例えば、ウェスタンブロット法またはELISA）が含まれるがこれに限定されない。1つの実施形態では、アッセイはホルマリン固定組織を使用して実施される。ペプチドの量（絶対的または相対的）を対象とする情報はその取得方法に関わらず、患者または被験者におけるがんの存在の示唆（診断）、そのがんの病期／悪性度／状態の決定、予後診断の提供、または患者または被験者に対する治療薬または治療レジメンの決定を含む、本明細書に記載の任意の方法で用いられうる。
本開示の実施形態は、表1および／または表2のペプチドの1つ以上を有する組成物を含み、同位体標識されているがそれ以外には表1および／または表2に見られるペプチドの1つ以上と同一であるペプチドを随意に含みうる。一部の実施形態では、組成物は、表1および／または表2のペプチドの1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、またはすべてを有し、同位体標識されているがそれ以外には表1および／または表2に見られるペプチドの1つ以上と同一であるペプチドを有するペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を随意に含みうる。表1および／または表2のペプチドを有するペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質が用いられる場合、プロテアーゼ処理によって、同位体標識されているがそれ以外には表1および／または表2のペプチドと同一であるペプチドが放出される。同位体標識ペプチドのそれぞれは、18O、17O、34S、15N、13C、2Hまたはその組み合わせから成るグループから独立して選択される1つ以上の同位体で標識されうる。IRタンパク質からのペプチドを含む組成物は、同位体標識されているかどうかに関わらず、そのタンパク質からのペプチドすべて（例えば、トリプシンペプチドの全セット）を含む必要はない。一部の実施形態では、組成物は、IRからのすべてのペプチドの組み合わせ、特に表1および／または表2にあるペプチドのすべてを含まない。ペプチドを含む組成物は、乾燥または凍結乾燥した材料、液体（例えば、水性）溶液もしくは懸濁液、アレイ、またはブロットの形態でありうる。
Figure 2015505055
Figure 2015505055
SRM／MRMアッセイを実施するための1つの考慮事項は、ペプチドの分析に用いられうる機器のタイプである。SRM／MRMアッセイは、MALDI、イオントラップ、または三連四重極を含む任意のタイプの質量分析計で開発・実施できるが、SRM／MRMアッセイのために最も有利な機器プラットフォームは、多くの場合、三連四重極機器プラットフォームであると考えられる。その質量分析計のタイプは、細胞内に含まれるすべてのタンパク質からの何百何千から何百万もの個別ペプチドから成りうる非常に複雑なタンパク質溶解物中の単一単離標的ペプチドを分析するために最も適した機器であると考えられうる。
IRタンパク質に由来する各ペプチドに対してSRM／MRMアッセイを最も効率的に実施するためには、分析のペプチド配列に加えて情報を利用することが望ましい。その追加情報は、質量分析計（例えば、三連四重極質量分析計）に指図・指示し、特異的標的ペプチドの分析を集中的に正しい方法で実施することで、アッセイが効率的に実施されるように使用されうる。
標的ペプチド一般について、および特異IRペプチドについての追加情報には、各ペプチドのモノアイソトピック質量、その前駆体の荷電状態、前駆体のm/z値、m/z遷移イオン、および各遷移イオンのイオン型の1つ以上を含みうる。表1のリストの5つのIRペプチドについて、IRタンパク質、およびIR-Aおよび／またはIR-Bアイソフォームに対するSRM／MRMアッセイを開発するために使用されうるペプチドの追加情報が、表2に示されている。表2に示されるペプチドについて記述された同様の追加情報を準備、取得して、その他のプロテアーゼまたはプロテアーゼの組み合わせの作用によって生成されるものを含むIRタンパク質からのその他のペプチドの分析に適用しうる（例えば、トリプシンおよび／またはLys C）。
1つの実施形態では、特異的IRペプチドについての追加情報は、IR-Aおよび／またはIR-Bアイソフォームのいずれか1つまたは両方を含む、IRタンパク質のLys Cタンパク質分解から生じるペプチドに対する、各ペプチドのモノアイソトピック質量、その前駆体荷電状態、前駆体m/z値、m/z遷移イオン、および各遷移イオンのイオン型の1つ以上、2つ以上、または3つ以上を含む。
別の実施形態では、特異的IRペプチドについての追加情報は、IR-Aおよび／またはIR-Bアイソフォームのいずれか1つまたは両方を含む、IRタンパク質のトリプシンタンパク質分解から生じるペプチドに対する、各ペプチドのモノアイソトピック質量、その前駆体荷電状態、前駆体m/z値、m/z遷移イオン、および各遷移イオンのイオン型の1つ以上、2つ以上、または3つ以上を含む。
また別の実施形態では、特異的IRペプチドについての追加情報は、IR-Aおよび／またはIR-Bアイソフォームのいずれか1つまたは両方を含む、IRタンパク質のトリプシンおよびLys Cタンパク質分解から生じるペプチドに対する、各ペプチドのモノアイソトピック質量、その前駆体荷電状態、前駆体m/z値、m/z遷移イオン、および各遷移イオンのイオン型の1つ以上、2つ以上、または3つ以上を含む。
下記の方法は、1）IRタンパク質、IR-Aおよび／またはIR-Bアイソフォームの質量分析ベースのSRM／MRMアッセイに使用できるIRタンパク質から候補タンパク質を特定するため、2）IRタンパク質からの標的ペプチドに対する個別SRM／MRMアッセイ、または複数アッセイを開発するため、および3）定量分析をがん診断および／または最適治療の選択に適用するために使用された。
アッセイ方法
1. IRタンパク質に対するSRM／MRM候補断片ペプチドの特定
a. タンパク質を消化するために、プロテアーゼ（トリプシンを含むことも含まないこともある）を使用してホルマリン固定生体試料からLiquid TissueTMタンパク質溶解物を調製する。
b. Liquid TissueTM溶解物のすべてのタンパク質断片をイオントラップタンデム質量分析計で分析し、個別の断片ペプチドがリン酸化またはグリコシル化などのいかなるペプチド修飾も含まない、IRタンパク質からのすべての断片ペプチドを特定する。
c. Liquid TissueTM溶解物のすべてのタンパク質断片をイオントラップタンデム質量分析計で分析し、例えばリン酸化またはグリコシル化残基などのペプチド修飾を持つIRタンパク質からの断片ペプチドをすべて特定する。
d. 全長IRタンパク質の全体から特定の消化方法で生成されたすべてのペプチドを測定できる可能性があるが、SRM／MRMアッセイの開発に使用される好ましいペプチドは、ホルマリン固定生体試料から調製された複合Liquid TissueTMタンパク質溶解物中で直接、質量分析により特定されるものである。
e. 患者または被験者組織で特異的に修飾（リン酸化、グリコシル化など）されてイオン化し、そのためホルマリン固定生体試料からのLiquid TissueTM溶解物を分析する時に質量分析計で検出できるペプチドは、IRタンパク質のペプチド修飾を分析するための候補ペプチドとして特定される。
2. IRタンパク質からの断片ペプチドに対する質量分析
a. Liquid TissueTM溶解物で特定された個別の断片ペプチドに対する三連四重極質量分析計でのSRM／MRMアッセイが、IRタンパク質からのペプチドに適用される。
i. ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、または逆相高性能液体クロマトグラフィーを含むがこれに限定されない最適なクロマトグラフィー条件に対して、断片ペプチドの最適保持時間を決定する。
ii. 各ペプチドに対するSRM／MRMアッセイを開発するために、ペプチドのモノアイソトピック質量、各ペプチドの前駆体の荷電状態、各ペプチドの前駆体のm/z値、各ペプチドのm/z遷移イオン、および各断片ペプチドの各遷移イオンのイオン型を決定する。
iii. 次にSRM／MRMアッセイは、（i）および（ii）からの情報を使用して三連四重極質量分析計で実施できるが、ここで各ペプチドは、三連四重極質量分析計で実施された固有のSRM／MRMアッセイを正確に定義する特徴的および固有のSRM／MRM特徴ピークを持つ。
b. SRM／MRM質量分析からの固有SRM／MRM特徴ピーク面積の関数として検出されるIRタンパク質の断片ペプチドの量が、特定のタンパク質溶解物中のタンパク質の相対的および絶対的な量の両方を示すことができるように、SRM／MRM分析を実施する。
i. 相対的定量は以下によって達成しうる。
1. 1つのホルマリン固定生体試料からのLiquid TissueTM溶解物中で検出される所定のIRペプチドからのSRM／MRM特徴ピーク面積を、少なくとも第二、第三、第四またはそれ以上のホルマリン固定生体試料からの少なくとも第二、第三、第四またはそれ以上のLiquid TissueTM溶解物中の同じIR断片ペプチドの同じSRM／MRM特徴ピーク面積と比較することによって、IRタンパク質の存在の増加または減少を決定する。
2. 1つのホルマリン固定生体試料からのLiquid TissueTM溶解物で検出された所定のIRペプチドからのSRM／MRM特徴ピーク面積を、異なる別の生体起源から由来するその他のサンプルのその他のタンパク質の断片ペプチドから作成されたSRM／MRM特徴ピーク面積と比較することによって、IRタンパク質の存在の増加または減少を決定するが、ここでペプチド断片に対する2つのサンプル間のSRM／MRM特徴ピーク面積の比較は、各サンプルで分析されたタンパク質の量に対して正規化される。
3. さまざまな細胞条件下でも発現レベルが変化しないその他のタンパク質に対してIRタンパク質、IR-Aおよび／またはIR-Bアイソフォームの変化するレベルを正規化するために、所定のIRペプチドに対するSRM／MRM特徴ピーク面積を、ホルマリン固定生体試料の同じLiquid TissueTM溶解物内の異なるタンパク質に由来するその他の断片ペプチドからのSRM／MRM特徴ピーク面積と比較することによって、IRタンパク質、IR-Aおよび／またはIR-Bアイソフォームの存在の増加または減少を決定する。
4. これらのアッセイは、IRタンパク質の未修飾断片ペプチドおよび修飾断片ペプチドの両方に適用でき、修飾には、リン酸化および／またはグリコシル化を含むがこれに限定されず、修飾ペプチドの相対的レベルは、未修飾ペプチドの相対的量を決定するのと同じ方法で決定される。
ii. 所定のペプチドの絶対的定量は、個別の生体試料のIRタンパク質からの所定の断片ペプチドに対するSRM／MRM特徴ピーク面積を、その生体試料からのタンパク質溶解物に添加した断片ペプチド内部標準のSRM／MRM特徴ピーク面積と比較することによって達成されうる。
1. 内部標準は、調査しているIRタンパク質からの断片ペプチドの標識合成版である。この標準は既知量でサンプルに混入され、SRM／MRM特徴ピーク面積は、生体試料中の断片ペプチド内部標準および天然断片ペプチドの両方に対して別々に決定して、その後両方のピーク面積を比較できる。
2. 修飾がリン酸化および／またはグリコシル化を含むがこれに限定されず、未修飾ペプチドの絶対レベルを決定するのと同じ方法で修飾ペプチドの絶対レベルを決定できる場合、これは未修飾断片ペプチドおよび修飾断片ペプチドに適用できる。
3. がん診断および治療への断片ペプチド定量の適用
a. IRタンパク質、IR-Aおよび／またはIR-Bアイソフォームの断片ペプチドレベルの相対的および／または絶対的な定量を実施し、がん分野でよく知られた、IRタンパク質、IR-Aおよび／またはIR-Bアイソフォーム発現と患者または被験者腫瘍組織のがんの病期／悪性度／状態との、以前に決定された関連性が確認されることを実証する。
b. IR、IR-Aおよび／またはIR-Bアイソフォームタンパク質の断片ペプチドレベルの相対的および／または絶対的定量を実施し、異なる治療戦略の臨床転帰との相関関係を実証するが、この相関関係は本分野ですでに実証されているか、または患者または被験者のコホートおよびこれらの患者または被験者からの組織にわたる相関関係研究を通して将来実証できる。以前に確立された相関関係または将来生じる相関関係のいずれかがこのアッセイによって確認されたら、次にこのアッセイ方法を使用して最適な治療戦略を決定できる。
IRタンパク質からの断片ペプチドに対する質量分析
a. タンパク質溶解物中のIR-Aおよび／またはIR-Bタンパク質の相対的および／または絶対的な量を決定するために検出される、IRタンパク質の断片ペプチドの量を決定するためのSRM／MRMアッセイ。
i. 相対的定量は以下によって達成しうる。
1. 1つのホルマリン固定生体試料からのLiquid TissueTM溶解物中で検出される所定のIRペプチドからのSRM／MRM特徴ピーク面積を、少なくとも第二、第三、第四またはそれ以上のホルマリン固定生体試料からの少なくとも第二、第三、第四またはそれ以上のLiquid TissueTM溶解物中の同じIR断片ペプチドの同じSRM／MRM特徴ピーク面積と比較することによって、IRタンパク質の存在の増加または減少を決定する。
2. 1つのホルマリン固定生体試料からのLiquid TissueTM溶解物で検出された所定のIRペプチドからのSRM／MRM特徴ピーク面積を、異なる別の生体起源から由来するその他のサンプルのその他のタンパク質の断片ペプチドから作成されたSRM／MRM特徴ピーク面積と比較することによって、IRタンパク質の存在の増加または減少を決定するが、ここでペプチド断片に対する2つのサンプル間のSRM／MRM特徴ピーク面積の比較は、各サンプルで分析されたタンパク質の量に対して正規化される。
3. さまざまな細胞条件下で発現レベルが変化しないその他のタンパク質に対して、IRタンパク質、IR-Aアイソフォームおよび／またはIR-Bアイソフォームの変化するレベルを正規化するために、所定のIRペプチドに対するSRM／MRM特徴ピーク面積を、ホルマリン固定生体試料の同じLiquid TissueTM溶解物内の異なるタンパク質に由来するその他の断片ペプチドからのSRM／MRM特徴ピーク面積と比較することによって、IRタンパク質、IR-Aアイソフォームおよび／またはIR-Bアイソフォームの存在の増加または減少を決定する。
4. これらのアッセイは、IRタンパク質の未修飾断片ペプチドおよび修飾断片ペプチドの両方に適用でき、修飾には、リン酸化および／またはグリコシル化を含むがこれに限定されず、修飾ペプチドの相対的レベルは、未修飾ペプチドの相対的量を決定するのと同じ方法で決定される。
ii. 所定のペプチドまたはそれが由来するタンパク質の絶対的定量は、個別の生体試料のIRタンパク質からの所定の断片ペプチドに対するSRM／MRM特徴ピーク面積を、その生体試料からのタンパク質溶解物に添加した断片ペプチド内部標準のSRM／MRM特徴ピーク面積と比較することによって達成されうる。
内部標準は、調査対象のIRタンパク質からの断片ペプチドの標識合成版（またはタンパク質分解によって放出される断片ペプチドの標識合成版を含むタンパク質またはポリペプチド）である。標準は既知量でサンプルに混入され、SRM／MRM特徴ピーク面積は、生体試料中の断片ペプチド内部標準および天然断片ペプチドの両方に対して別々に決定して、その後両方のピーク面積を比較できる。
修飾がリン酸化および／またはグリコシル化を含むがこれに限定されず、未修飾ペプチドの絶対レベルを決定するのと同じ方法で修飾ペプチドの絶対レベルを決定できる場合、これは未修飾断片ペプチドおよび修飾断片ペプチドに適用できる。
ホルマリン固定した患者由来または被験者由来組織の分析に基づいた、組織中のIRタンパク質、IR-Aアイソフォームおよび／またはIR-Bアイソフォームのレベルの評価は、各特定患者または被験者についての診断、予後、および治療に関連する情報を提供できる。1つの実施形態で、本開示は、生体試料中のIRタンパク質、IR-Aアイソフォームおよび／またはIR-Bアイソフォームのレベルを測定する方法を記述しており、この方法は前記生体試料から調製されたタンパク質消化物中の1つ以上の修飾または未修飾IR断片ペプチドの量を質量分析を使用して検出および／または定量することと、前記試料中の修飾または未修飾IRタンパク質、IR-Aアイソフォームおよび／またはIR-Bアイソフォームのレベルを計算することを含むが、前記量は相対的レベルまたは絶対的レベルである。関連する実施形態では、1つ以上のIR断片ペプチドの定量化には、既知量の追加内部標準ペプチドと比較することによって、生体試料中のIR断片ペプチドのそれぞれの量を決定することを含むが、ここでは生体試料中のIR断片ペプチドのそれぞれが、同じアミノ酸配列を持つ内部標準ペプチドと比較される。一部の実施形態では、内部標準は、18O、17O、34S、15N、13C、2Hまたはその組み合わせから選択される1つ以上の安定重同位体を含む同位体標識内部標準ペプチドである。
本明細書に記述された生体試料（またはその代理としての断片ペプチド）中のIRタンパク質、および／またはIR-Aおよび／またはIR-Bアイソフォームのレベルの測定方法は、患者または被験者のがんの診断指標として使用しうる。1つの実施形態では、IRタンパク質、および／またはIR-Aおよび／またはIR-Bアイソフォームのレベルの測定結果を用いて、組織で見られたIRタンパク質、および／またはIR-Aおよび／またはIR-Bアイソフォームのレベルと、正常および／またはがん組織もしくは前がん組織で見られたそのタンパク質レベルを関連付ける（例えば、比較する）ことにより、がんの診断病期／悪性度／状態を決定しうる。
核酸およびタンパク質は両方とも同じLiquid Tissue生体分子調製物から分析できるので、疾患診断および薬物治療決定についての追加情報を同じサンプルから生成することが可能である。例えば、IRタンパク質は、特定の細胞シグナルタンパク質経路の活性化によって制御されていない細胞増殖（がん）を刺激することのできるチロシンキナーゼ受容体である。ある細胞によってIRがより高いレベルで発現される場合、SRMで分析された時、データは、細胞の状態についてのデータを提供することができ、その制御されていない成長の可能性、薬物耐性およびがんの発症の可能性を得ることができる。同時に、IR遺伝子および／または核酸ならびにそれがコードするタンパク質の状態についての情報（例えば、mRNA分子およびその発現レベルまたはスプライス変異、特にIR-AおよびIR-Bアイソフォームにつながるもの）を、同じ生物分子調製物に存在する核酸から取得できる。例えば、IRおよび／またはそのアイソフォーム、および／または1つ、2つ、3つ、4つまたはそれ以上の追加的タンパク質を、これらのタンパク質をコードしている核酸を調べることによって評価しうる。これらの核酸は、例えば、シーケンス法、制限断片多型解析の実施、欠失の特定、挿入、および／または単一塩基対多型、遷移および／またはトランスバージョンを含むがこれに限定されない変異の存在の決定の1つ以上、2つ以上、または3つ以上によって調べることができる。
上記の記述および方法ならびに組成物の模範的実施形態は、本開示の範囲の実例となる。しかし、当業者にとって明らかとなる変形のために、本開示を上述の特定の実施形態に限定することは意図していない。

Claims (36)

  1. 生体試料中のインスリン受容体（ＩＲ）タンパク質、および／またはそのアイソフォームであるＩＲ−Ａおよび／またはＩＲ−Ｂのレベルを測定する方法であって、前記生体試料から調製されたタンパク質消化物中の１つ以上の修飾または未修飾ＩＲ断片ペプチドの量を、質量分析を使用して検出および／または定量することと、前記試料中の修飾または未修飾ＩＲ、ＩＲ−Ａアイソフォームおよび／またはＩＲ−Ｂアイソフォームタンパク質のレベルを計算することを含み、
    前記量が相対的量または絶対的量である、方法。
  2. １つ以上の修飾または未修飾ＩＲ断片ペプチドの量を検出および／または定量する前に、前記タンパク質消化物を分画するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記分画ステップが、ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、または逆相高性能液体クロマトグラフィーから成るグループから選択される、請求項２に記載の方法。
  4. 前記生体試料の前記タンパク質消化物がLiquid TissueTMプロトコルによって調製される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記タンパク質消化物がプロテアーゼ消化物を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記タンパク質消化物がトリプシン消化物を含む、請求項５に記載の方法。
  7. 前記質量分析が、タンデム質量分析、イオントラップ質量分析、三連四重極質量分析、MALDI-TOF質量分析、MALDI質量分析、および／または飛行時間型質量分析を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  8. 使用される質量分析のモードが、選択反応モニタリング（SRM）、多重反応モニタリング（MRM）、および／または多重選択反応モニタリング（mSRM）、またはその任意の組み合わせである、請求項７に記載の方法。
  9. 前記IR断片ペプチドが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、および配列番号5として規定されたアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記生体試料が血液サンプル、尿サンプル、血清サンプル、腹水サンプル、喀痰サンプル、リンパ液、唾液サンプル、細胞、または固体組織である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記組織がホルマリン固定組織である、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記組織がパラフィン包埋組織である、請求項１０または１１に記載の方法。
  13. 前記組織が腫瘍から取得される、請求項１０に記載の方法。
  14. 前記腫瘍が原発腫瘍である、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記腫瘍が二次腫瘍である、請求項１３に記載の方法。
  16. 修飾または未修飾ＩＲ断片ペプチドを定量することをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記ＩＲ断片ペプチドの定量が、１つの生体試料の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５に示されるようなＩＲの約８〜約４５のアミノ酸残基のアミノ酸配列を含む１つ以上のＩＲ断片ペプチドの量を、異なる別の生体試料の同じＩＲ断片ペプチドの量と比較することを含む、請求項１６に記載の方法。
  18. １つ以上のＩＲ断片ペプチドの定量が、既知量の追加内部標準ペプチドと比較することによって生体試料中の前記ＩＲ断片ペプチドのそれぞれの量を決定することを含み、前記生体試料中の前記ＩＲ断片ペプチドのそれぞれが同じアミノ酸配列を持つ内部標準ペプチドと比較される、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記内部標準ペプチドが同位体標識ペプチドである、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記同位体標識内部標準ペプチドが、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈまたはその任意の組み合わせから選択される１つ以上の安定重同位体を含む、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記タンパク質消化物中の１つ以上の修飾または未修飾ＩＲ断片ペプチドの量の検出および／または定量が、修飾または未修飾ＩＲタンパク質、ＩＲ−Ａおよび／またはＩＲ−Ｂの存在、および患者または被験者におけるがんとの関連性を示す、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  22. １つ以上の修飾または未修飾ＩＲ断片ペプチドの量、または前記ＩＲタンパク質、ＩＲ−Ａアイソフォームおよび／またはＩＲ−Ｂアイソフォームの量の検出および／または定量の結果を、前記がんの前記診断病期／悪性度／状態と関連付けることをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
  23. １つ以上の修飾または未修飾ＩＲ断片ペプチドの量、または前記ＩＲタンパク質、ＩＲ−Ａアイソフォームおよび／またはＩＲ−Ｂアイソフォームの量の検出および／または定量の結果を、前記がんの前記診断病期／悪性度／状態と関連付けることが、その他のタンパク質、またはその他のタンパク質からのペプチドの量の検出および／または定量と多重フォーマットで組み合わされて、前記がんの前記診断病期／悪性度／状態についての追加情報を提供する、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記生体試料が取得された患者または被験者に対して、１つ以上のＩＲ断片ペプチドの有無またはその量、またはＩＲタンパク質、ＩＲ−Ａアイソフォームおよび／またはＩＲ−Ｂアイソフォームの量に基づいて治療を選択することをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記生体試料が取得された患者または被験者に治療有効量の治療薬を投与することをさらに含み、前記治療薬および／または投与された前記治療薬の量が、１つ以上の修飾または未修飾ＩＲ断片ペプチドの量、またはＩＲタンパク質、ＩＲ−Ａアイソフォームおよび／またはＩＲ−Ｂアイソフォームの量に基づく、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記治療または前記治療薬が、ＩＲタンパク質、ＩＲ−Ａアイソフォームおよび／またはＩＲ−Ｂアイソフォームを発現しているがん細胞を対象とする、請求項２４および２５に記載の方法。
  27. 前記生体試料が、Liquid TissueTMプロトコルおよび試薬を用いて、１つ以上の修飾または未修飾ＩＲ断片ペプチドの量を定量するために処理されたホルマリン固定腫瘍組織である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記１つ以上の修飾または未修飾ＩＲ断片ペプチドが表１のペプチドの１つ以上である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  29. 表２の前記ペプチドの量の定量を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  30. 表１の前記ペプチドおよび／またはその抗体の１つ以上、２つ以上、３つ以上、または４つ以上を含む、組成物。
  31. 表２の前記ペプチドまたはその抗体の１つ以上、２つ以上、３つ以上、または４つ以上を含む、請求項３０に記載の組成物。
  32. がん組織中のＩＲ−Ａの存在またはレベル、またはＩＲ−Ｂに対するＩＲ−Ａの比率を決定することを含む、ＩＧＦ−１Ｒの拮抗薬に対するがんの抵抗性を決定する方法であって、ＩＲＡの存在または対照組織と比較してＩＲ−Ｂに対するＩＲ−Ａの比率が高いことが、［ＩＧＦ−ＩＲ］の前記拮抗薬に対する前記がんの抵抗性を示す、方法。
  33. ＩＧＦ−１Ｒの前記拮抗薬がＩＧＦ−１Ｒに結合するタンパク質またはペプチドを含む、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記タンパク質またはペプチドが、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、組み換え抗体、抗原結合抗体断片、単鎖抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ドメイン抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、またはＩｇＧ４抗体である、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記タンパク質またはペプチドが抗体である、請求項３３に記載の方法。
  36. 前記抗体がＲ１５０７、ＯＳＩ−９０６またはフィギツムマブから選択される、請求項３５に記載の方法。
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