JP6612414B2 - Pd−l1に対するsrmアッセイ - Google Patents
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Description
癌は、増殖および分裂する細胞を殺傷し、様々に機能する一群の治療剤を用いて治療される。一般的な化学療法剤群は、個別または併用のいずれかで数十年にわたって使用されており、この一般的な薬剤群は、臨床腫瘍学の実践における従来的および慣例的な癌治療となっている。そのような従来の化学療法剤は、ほとんどの癌細胞の主な特性の1つである、急速に分裂するすべての細胞を殺傷することにより作用する。しかしながら、これらの薬剤は、増殖する正常細胞も殺傷し、ゆえにこれらの薬剤は、癌細胞を殺傷するための「標的化」手法とは考えられていない。近年では、癌細胞のみを特異的に標的とする多くの癌治療剤が開発されており、該治療剤は、癌細胞においてのみ発現するが、正常細胞においては発現しないタンパク質を特異的に攻撃する。この手法は、癌治療に対する「標的化」手法と考えられる。ごく最近では、「標的化」様式により癌細胞を殺傷する別の手法は、癌細胞を殺傷するように癌患者の免疫系の能力を増強させるように免疫系を特異的に調節するというものである。
原理的には、既知の特異性の任意のタンパク質分解プロセスによって調製される、PD−L1タンパク質由来の任意の予測されるペプチドが、PD−L1タンパク質の存在量を決定するために、代理レポーターとして使用され得る。しかしながら、実際は、ほんのわずかなペプチドのみが本明細書に記載のアッセイにおける使用に好適であることが見出されている。さらには、あるとすれば、PD−L1から誘導することができる膨大な数の可能性のあるペプチドのうちのどのペプチドがアッセイに好適であり得るかを、経験的に予測することは可能でない。
一旦溶解物が調製されると、試料中のペプチドは、それらの分析および測定(定量)を促進する様々な技術に供され得る。分析を質量分析により行う場合、分析を促進するために、1つまたは複数のクロマトグラフ法が採用され得る。
本発明のある特定の実施形態を下記に記載する。
以下に記載される方法は、1)PD−L1タンパク質の質量分析ベースのSRM/MRMアッセイのために使用することのできるPD−L1タンパク質由来の候補ペプチドを同定し、2)PD−L1タンパク質由来の標的ペプチドのための個別のSRM/MRMアッセイ(1つまたは複数)を開発し、3)定量アッセイを癌診断および/または最適治療の選択に適用するために使用された。
a.1つまたは複数のプロテアーゼ(トリプシンを含んでも含まなくてもよい)を使用して、ホルマリン固定生体試料からLiquid Tissue(登録商標)タンパク質溶解物を調製して、タンパク質を消化させる。
b.イオントラップタンデム質量分析計において、Liquid Tissue(登録商標)溶解物中の全タンパク質断片を分析し、PD−L1タンパク質由来の全断片ペプチドを同定し、この場合、個別の断片ペプチドは、リン酸化またはグリコシル化などのいかなるペプチド修飾も含有しない。
c.イオントラップタンデム質量分析計において、Liquid Tissue(登録商標)溶解物中の全タンパク質断片を分析し、例えば、リン酸化またはグリコシル化残基などのペプチド修飾を有するPD−L1タンパク質由来の全断片ペプチドを同定する。
d.完全長PD−L1タンパク質全体から特定の消化方法により生成された全ペプチドを測定することは潜在的に可能であるが、SRM/MRMアッセイの開発に使用される好ましいペプチドは、ホルマリン固定生体試料から調製された複合Liquid Tissue(登録商標)タンパク質溶解物中で直接質量分析により同定されるものである。
e.患者または対象組織中で特異的に修飾され(リン酸化、グリコシル化等)、イオン化され、ゆえに、ホルマリン固定生体試料からのLiquid Tissue(登録商標)溶解物を分析するとき、質量分析計中で検出することができるペプチドは、PD−L1タンパク質のペプチド修飾をアッセイするための候補ペプチドとして同定される
a.Liquid Tissue(登録商標)溶解物中で同定された個別の断片ペプチドについての三連四重極質量分析計におけるSRM/MRMアッセイが、PD−L1タンパク質由来のペプチドに適用される。
i.ゲル電気泳動法、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動法、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、または逆相高速液体クロマトグラフィーが含まれるが、これらに限定されない、最適クロマトグラフィー条件のための断片ペプチドに対する最適保持時間を決定する。
ii.各ペプチドに対するSRM/MRMアッセイを開発するために、ペプチドのモノアイソトピック質量、各ペプチドに対する前駆物質電荷状態、各ペプチドに対する前駆物質m/z値、各ペプチドに対するm/z遷移イオン、およびそれぞれの断片ペプチドに対するそれぞれの遷移イオンのイオン型を決定する。
iii.次いで、(i)および(ii)からの情報を用いて、三連四重極質量分析計においてSRM/MRMアッセイを行うことができ、この場合、各ペプチドは、三連四重極質量分析計で行われる固有のSRM/MRMアッセイを明確に規定する特徴的かつ固有のSRM/MRM特徴的ピークを有する。
b.SRM/MRM質量分析の分析から、固有のSRM/MRM特徴的ピーク面積の関数として、検出されるPD−L1タンパク質の断片ペプチドの量が、特定のタンパク質溶解物中のPD−L1タンパク質の相対および絶対量の両方を示すことができるように、SRM/MRM分析を実施する。
i.相対的定量は、以下により達成され得る:
1.1つのホルマリン固定生体試料からのLiquid Tissue(登録商標)溶解物中で検出された所定のPD−L1ペプチドのSRM/MRM特徴的ピーク面積を、少なくとも第2、第3、第4、またはそれを超えるホルマリン固定生体試料からの少なくとも第2、第3、第4、またはそれを超えるLiquid Tissue(登録商標)溶解物中の同一のPD−L1断片ペプチドの同一のSRM/MRM特徴的ピーク面積と比較することにより、PD−L1タンパク質の存在の増加または減少を決定すること
2.1つのホルマリン固定生体試料からのLiquid Tissue(登録商標)溶解物中で検出された所定のPD−L1ペプチドのSRM/MRM特徴的ピーク面積を、異なる別個の生物学的起源由来の他の試料中の、他のタンパク質由来の断片ペプチドから発生したSRM/MRM特徴的ピーク面積と比較することにより、PD−L1タンパク質の存在の増加または減少を決定し、この場合、ペプチド断片についての2つの試料間のSRM/MRM特徴的ピーク面積の比較は、各試料中で分析されたタンパク質の量に正規化される。
3.PD−L1タンパク質の変化するレベルを、様々な細胞条件下でのそれらの発現レベルを変化させない他のタンパク質のレベルに正規化するために、所定のPD−L1ペプチドのSRM/MRM特徴的ピーク面積を、ホルマリン固定生体試料からの同一のLiquid Tissue(登録商標)溶解物中の異なるタンパク質に由来する他の断片ペプチドのSRM/MRM特徴的ピーク面積と比較することにより、PD−L1タンパク質の存在の増加または減少を決定すること。
4.これらのアッセイを、PD−L1タンパク質の非修飾断片ペプチド、修飾断片ペプチドの両方に適用することができ、この場合、修飾には、リン酸化および/またはグリコシル化が含まれるが、これらに限定されず、修飾ペプチドの相対レベルは、非修飾ペプチドの相対量を決定するのと同じ様式で決定される。
ii.所定のペプチドの絶対定量は、個別の生体試料中のPD−L1タンパク質由来の所定の断片ペプチドについてのSRM/MRM特徴的ピーク面積を、生体試料からのタンパク質溶解物中にスパイクされた内部断片ペプチド標準物のSRM/MRM特徴的ピーク面積と比較することにより、達成され得る。
1.内部標準物は、調べられているPD−L1タンパク質由来の断片ペプチドの標識された合成バージョンである。この標準物は、既知量で試料中にスパイクされ、SRM/MRM特徴的ピーク面積は、生体試料中の内部断片ペプチド標準物および天然断片ペプチドの両方について別々に決定され、その後、両方のピーク面積が比較され得る。
2.これは、非修飾断片ペプチドおよび修飾断片ペプチドに適用可能であり、この場合、修飾には、リン酸化および/またはグリコシル化が含まれるが、これに限定されず、また、修飾ペプチドの絶対レベルは、非修飾ペプチドの絶対的量を決定するのと同一の様式で決定され得る。
a.PD−L1タンパク質の断片ペプチドレベルの相対および/または絶対定量を実施し、癌の分野で十分に理解されている、PD−L1タンパク質発現と患者および対象の腫瘍組織における癌の病期/グレード/状態との以前に決定された関連性が確認されることを実証する。
b.PD−L1タンパク質の断片ペプチドレベルの相対および/または絶対定量を実施し、異なる治療戦略からの臨床転帰との相関を実証し、この場合、この相関は、この分野ですでに実証されているか、または患者または対象のコホート、およびそれらの患者または対象からの組織にわたる相関研究により将来実証することができる。一旦以前に確立された相関関係、または将来得られる相関関係のいずれかがこのアッセイにより確認されると、本アッセイ方法を使用して、最適な治療戦略を決定することができる。
Claims (8)
- ホルマリン固定組織のヒト生体試料中のPD−L1タンパク質の量を測定するための方法であって、前記生体試料から調製されたタンパク質消化物中の1つのPD−L1タンパク質断片ペプチドの量を、質量分析を使用して検出および定量すること;および前記試料中のPD−L1タンパク質の量を算出することを含み、前記PD−L1タンパク質断片ペプチドが配列番号4のペプチドであり、前記量が相対量または絶対量である、方法。
- 1つのPD−L1タンパク質断片ペプチドの量を検出および定量する前に、前記タンパク質消化物を分画する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質消化物が、プロテアーゼ消化物を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記質量分析が、タンデム質量分析、イオントラップ質量分析、三連四重極質量分析、MALDI−TOF質量分析、MALDI質量分析、および/または飛行時間型質量分析を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記PD−L1タンパク質断片ペプチドを定量することが、1つの生体試料中の前記PD−L1タンパク質断片ペプチドの量を、異なる別個の生体試料中の同一のPD−L1タンパク質断片ペプチドの量と比較することを含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記PD−L1タンパク質断片ペプチドを定量することが、生体試料中のPD−L1タンパク質断片ペプチドの量を、既知量の添加内部標準ペプチドとの比較によって決定することを含み、前記生体試料中のPD−L1タンパク質断片ペプチドが、同一のアミノ酸配列を有する内部標準ペプチドと比較される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記内部標準ペプチドが、同位体標識ペプチドである、請求項6に記載の方法。
- 前記タンパク質消化物中のPD−L1タンパク質断片ペプチドの量を検出および定量することが、修飾または非修飾PD−L1タンパク質の存在、および組織サンプルが得られた患者または対象における癌との関連性を示す、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
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