KR20190127732A - 종양 조직의 면역 프로파일링 - Google Patents

종양 조직의 면역 프로파일링 Download PDF

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파비올라 체키
사릿 슈왈츠
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익스프레션 패톨로지, 인크.
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Abstract

SRM/MRM 분석은 환자의 종양 조직에서 직접 종양 면역 반응을 개시, 억제, 유지, 및/또는 다르게는 조절하는 과정에 관여하는 단백질을 검출하고 정량화하는데 사용된다. 이 분석은 조직 미세환경의 면역 프로파일을 제공하고, 암 치료제와 함께 암 면역반응을 조작하는 제제를 사용하는 개선된 면역-기반 치료 방법의 일부로서 사용될 수 있다.

Description

종양 조직의 면역 프로파일링
암 환자로부터 수득된 종양 조직을 질량 분광법-기반 정량적 단백질체 분석에 적용하여 개인맞춤 (personalized) 환자 종양 면역 프로파일을 제공한다. 환자 종양 조직에 대해 수행된 단백질 분석은 1) 최적의 면역-기반 요법을 예측하고, 2) 최적의 면역-기반 요법에 대한 양성 반응과 연관되고/되거나, 3) 환자 자신의 면역계를 개시, 억제, 유지, 촉진 및/또는 다르게는 조절하여 환자 자신의 종양 세포를 공격하는, 단백질의 수준을 검출하고 정량적으로 측정하는데 유용하다. 이들 단백질의 정량적 분석에 의해 제공된 암 환자 종양 조직 면역 프로파일은, 예를 들어, 환자의 종양 면역반응을 조작하도록 설계된 암 치료제가 환자에 투여되는 경우, 치료 결정을 알려주는데 사용될 수 있다.
다수의 암 약물은 종양 세포 성장 및 생존을 유도하는 특정 단백질을 억제함으로써 작용하지만, 선험적으로, 어느 단백질이 주어진 유형의 종양에서 발현되는지를 인지하는 것은 종종 가능하지 않다. 따라서, 환자 종양 조직에서 직접 이러한 단백질을 검출 및 정량화(quantify)하는 것은 종양에서의 단백질 활성을 억제하고 암을 치료하며 전체 환자 생존에 긍정적인 영향을 미치는 치료제 또는 제제 조합의 선택을 안내하는데 사용될 수 있다. 종양 조직에 존재하는 단리된 종양 세포를 포함하는, 종양 조직에서 단백질의 정확하고 정밀한 검출 및 정량화는 조직 미세절제 (microdissection)에 의해 환자 종양 조직으로부터 추출된 종양 세포에서 발현된 단백질로부터 유래한 특정 펩티드의 질량 분광법-SRM/MRM 분석을 통해 수행될 수 있다. 단백질은 검출 전에 이러한 특정 펩티드를 제공하도록 소화된다. 종양 조직의 단일 SRM/MRM 분석에서 단백질의 정량화 그룹은 종양 세포-표적화 암 치료제를 알리는데 사용될 수 있는 단백질 발현의 "프로파일" 또는 "특징 (signiture)"을 제공한다. 표적 치료제를 이용한 치료 결정을 알려주기 위한 정량적 분석의 예시는 IGF-1R 단백질 (예를 들어, 미국특허 제8,728,753호 참조) 및 cMet 단백질 (예를 들어 미국특허 제9,372,195호 참조)이다.
암 환자에서 종양에 대한 면역반응은 다수의 단백질을 포함한다. 이들 단백질은 고형 조직 및 모든 다양한 계통의 림프구에서의 종양 세포 및 양성 세포와 같은, 많은 상이한 세포 유형에서 정상적 및 비정상적으로 발현된다. 이들 단백질은 집단적으로 기능하여 그/그녀 자신의 종양 세포에 대해 환자 자신의 면역반응을 개시, 향상, 조절 또는 억제한다. 각 단백질은 별개의 기능을 갖지만, 면역계에 미치는 효과는 단백질을 발현하는 세포에 따라 달라질 수 있다. 정상적인 환경에서, 면역계는 림프구-의존성 종양 세포 사멸을 통해 매개되는 자기 대 비-자기 인식의 복잡한 분자 신호전달 과정을 통해 종양 세포를 근절시키는 기능을 한다. 그러나 이 복잡한 과정은 면역 감시를 회피하는 종양 세포에 의해 중단될 수 있다. 종양 세포를 공격하고 사멸하도록 면역계를 조작하기 위해 암 환자의 종양 면역반응 단백질과 상호작용하는 소분자 및 생물학적 치료제를 개발하는데 많은 연구가 진행되어 왔다. 표적화된 면역조절 치료제의 성공적인 투여는 조직 내에서 어느 표적 단백질이 발현되는지를 결정하기 위해 환자 면역계 지형의 단백질 발현 "프로파일" 또는 "특징"으로부터 상당한 이점을 얻을 것이다. 그 후에 이 면역 프로파일은 어떤 치료제, 또는 제제의 조합이 최적의 환자 결과를 위해 종양 세포에 대해 환자 면역계를 무장, 조절, 조작, 및/또는 지지할 가장 큰 기회를 제공할 것인지를 알려줄 수 있다.
환자 면역계를 조작하도록 설계된 암 치료제의 예시는 면역 체크포인트 단백질로 알려진 단백질의 집합을 표적하는 면역 체크포인트 억제제를 포함한다. PD-1 단백질은 일반적으로 T 세포에 존재하는 면역 체크포인트 단백질이며, T 세포가 신체의 다른 세포를 공격하지 못하게 하는 "오프 스위치 (off switch)"의 유형으로 작용한다. PD-1은 일부 정상 (및 암) 세포의 표면에 존재하는 단백질인, PD-L1에 결합함으로써 작용한다. PD-1이 PD-L1에 결합하면, 이는 T 세포가 PD-L1을 발현하는 세포를 공격하지 않도록 신호를 보낸다. 일부 암세포는 다량의 PD-L1을 발현하여, 이들을 면역계에 대해 차폐하여 T 세포로부터의 공격을 방지함으로써 면역 감시를 회피하게 한다. PD-1 또는 PD-L1 중 하나를 표적하는 단일클론 항체는 암세포를 "차폐해제 (unmask)"하고 암세포에 대한 면역반응을 강화시킬 수 있다. 이러한 암 치료 전략은 특정 암의 치료에 큰 가능성을 보여주었으며, PD-1 억제제의 예시에는 펨브롤리주맙 (Keytruda) 및 니볼루맙 (Opdivo)이 포함된다. 이들 약물은 흑색종, 비-소세포 폐암, 신장암, 두경부암, 및 호지킨 림프종을 비롯한 다양한 유형의 암을 치료하는데 도움이 되는 것으로 나타났다. PD-L1 억제제의 또 다른 예시는 현재 방광암 치료에 사용되는, 아테졸리무맙 (Tecentriq)이다. 이 약물 역시 다른 유형의 암에 대해 사용하기 위해 연구되고 있다. PD-1 또는 PD-L1 중 하나를 표적하는 많은 다른 약물이 현재 임상 시험에서 단독으로 또는 다른 약물과 함께 시험되고 있다.
CTLA4는 면역계를 충전하거나 면역계를 비활성으로 유지하는데 영향을 미칠 수 있는 면역 체크포인트 단백질로서 작용하는 일부 T 세포상의 또 다른 단백질이다. CTLA4에 결합하는 약물의 예시는 CTLA4를 억제하고 종양 세포에 대한 신체의 면역반응을 증강시키는 단일클론 항체인 이필리무맙 (Yervoy)이다. 이 약물은 현재 흑색종을 치료하는데 사용되고 있으며, 상기에 논의된 약물과 같이, 또한 다른 암에 대해서도 연구되고 있다.
이러한 예시는 종양 세포 및 면역계 세포 둘 다의 분자 상태에 대한 지식이 효과적인 표적화 면역-기반 암 치료 전략의 일부로서 어떻게 사용될 수 있는지를 입증한다. 조직학적으로-특정된 세포 집단의 분자적 프로파일링을 위해 환자 종양 조직 절편으로부터 직접 세포의 균질한 집단을 조달하는 능력은 그에 의해, 예를 들어, 정상 상피세포, 내피세포, 섬유아세포, 및 면역세포를 포함하는 다른 유형의 세포 내에 존재할 수 있는 종양 세포가 연구될 수 있어 매우 유리하다. 레이저 캡쳐 미세절제 (Laser Capture Microdissection, LCM) 기법 (미국특허 제6,867,038호 참조)은 정확하게 정의된 세포 집단에 대한 종양 조직의 구획화된 분자적 분석을 허용한다. DIRECTOR 기법 (미국특허 제7,381,440호)을 비롯한 다른 상업적으로 이용가능한 조직 미세절제 기법뿐만 아니라, LCM은 조직 샘플로부터 유래한 세포의 분자적 프로파일링을 병리학적으로 관련된 맥락에 놓이게 함으로써 조직 샘플의 분석을 개선하였다.
조직 미세절제가 정제된 종양 세포 집단을 제공하지만, 이의 사용은 신뢰할 수 있는 분자적 분석을 위해 불충분한 관심 세포가 종양 조직으로부터 조달될 수 있는 경우로 제한된다. 종양 면역반응을 개시/유지하는 다수의 단백질이 심지어 종양 조직에 존재하지 않는 소수의 종양 침윤 림프구 (TILs) 및/또는 면역계 세포에 의해 발현되고, 따라서 조직 미세절제를 통해 수집된 관심 세포의 순수한 집단의 분석은 일부 경우에 가능하지 않을 수 있다. 종양 조직에서 잠재적인 면역조절 치료 후보 단백질의 존재를 검출하기 위해, 단지 종양 세포뿐만 아니라 전체 종양 미세환경이 고려될 수 있다. 하기에 기술된 방법은 환자 종양 조직의 분자 면역 프로파일을 생성하는 능력을 제공한다.
요약
SRM/MRM 분석은 암 환자 종양 조직으로부터 직접 제조된 단백질체 용해물에서 특정 단백질의 수준을 검출하고 정량화하는데 사용된다. 이들 단백질은 최적의 면역-기반 요법을 예측하고, 최적의 면역-기반 요법에 대한 양성 반응과 관련되고/되거나, 암 환자 자신의 종양 세포를 사멸하도록 암 환자의 종양 면역반응을 개시/억제/유지/조절하는데 관여한다. SRM/MRM 분석은 암 환자의 면역계 상태의 개인맞춤 면역 프로파일을 개발하는데 유용하다. 일단 이들 단백질의 발현 상태가 결정되면, 특정 치료제가 환자에게 투여될 수 있고, 그에 의해 이러한 제제는 이들 면역계 단백질과 상호작용하여 암 환자 자신의 면역계를 조작하는 이들의 기능을 억제 또는 증강시켜 환자 자신의 종양 세포를 사멸시키고 그로써 환자의 증가된 생존율을 제공한다. 이러한 면역계 조작 치료제는 현재 기술된 SRM/MRM 분석에 의해 결정되는 바와 같이, 암 환자 면역계 프로파일에 직접 매칭될 수 있는 생물학적 및/또는 소분자 제제를 포함하고, 이는 면역학적 암 치료를 위한 개인맞춤 전략을 제공한다.
질량 분광법을 이용하여 생물학적 샘플로부터 제조된 단백질 소화물(protein digest)에서 인간 면역계를 개시, 유지, 증강, 억제, 또는 다르게는 조절하는 기능을 하는 하나 이상의 단백질의 수준을 검출 및/또는 정량화하고; 생물학적 샘플 내 단백질의 수준을 계산함으로써, 암 환자로부터 수득된 포르말린 고정된 종양 조직의 생물학적 샘플 내 단백질 발현 프로파일을 결정하는 방법이 제공되고, 여기서 수준은 상대적 수준 또는 절대적 수준이고, 하나 이상의 단백질은 B7-1, B7H2, 베타-카테닌, CALR, CCR4, CD133, CD137, CD137L, CD166, CD28, CD38, CD3G, CD40, CD40L, CD47, CD68, CD70, CD73, CD8A, CEACAM5, cMYC, COX-2, CXCR4, CXCR7, DNMT1, EZH2, GBP2, HMGB1, INFGR2, IL13RA2, IRF1, MyD88, NAMPT, NAPRT1, NYESO1, OX40L, PD-1, STAT3, 베클린-1, PHD2, PI3K베타, PI3K델타, PI3K감마, CEACAM1, IFNγ, STK11, BTK, ARG1, TDO, TGFβ1, CD16, OX40, IL-2, SLFN11, CD39, CD44, CSF1R, GZMB, PRF1, CD206, GNLY, CD3Z, ATF3, TLR8, CD19, 및 CTLA로 구성된 군으로부터 선택된다.
소화물은 하나 이상의 단편 펩티드의 양을 검출 및/또는 정량화하기 전에 분획화(fractionating)될 수 있고, 이 분획화 단계는, 예를 들어, 액체 크로마토그래피, 나노-역상 액체 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피, 또는 역상 고성능 액체 크로마토그래피일 수 있다. 생물학적 샘플의 단백질 소화물은 액체 조직 프로토콜(Liquid Tissue protocol)에 의해 제조될 수 있다. 단백질 소화물은 트립신 소화물과 같은 프로테아제 소화물을 포함할 수 있다.
질량 분광 방법은, 예를 들어, 탠덤(tandem) 질량 분광법, 이온 트랩 질량 분광법, 삼중 사중극자(triple quadrupole) 질량 분광법, 하이브리드 이온 트랩/사중극자 질량 분광법, MALDI-TOF 질량 분광법, MALDI 질량 분광법, 및/또는 비행시간 (time of flight) 질량 분광법일 수 있고, 사용된 질량 분광법의 방식은 선택 반응 모니터링 (Selected Reaction Monitoring, SRM), 다중 반응 모니터링 (Multiple Reaction Monitoring, MRM), 지능형 선택 반응 모니터링 (iSRM), 및/또는 다중 선택 반응 모니터링 (mSRM)일 수 있다.
이들 방법에서, 단편 펩티드는 서열번호: 1-11의 임의의 또는 모든 펩티드로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 더욱 구체적으로, 하기 펩티드가 각각의 단백질로부터 선택될 수 있다: B7-1 (서열번호: 1, 서열번호: 2), B7H2 (서열번호: 3, 서열번호: 4), 베타-카테닌 (서열번호: 5, 서열번호: 6), CALR (서열번호: 7, 서열번호: 8), CCR4 (서열번호: 9, 서열번호: 10), CD133 (서열번호: 11, 서열번호: 12), CD137 (서열번호: 13), CD137L (서열번호: 14, 서열번호: 15), CD166 (서열번호: 16, 서열번호: 17), CD28 (서열번호: 18), CD38 (서열번호: 19, 서열번호: 20), CD3G (서열번호: 21, 서열번호: 22), CD40 (서열번호: 23), CD40L (서열번호: 24), CD47 (서열번호: 25, 서열번호: 26), CD68 (서열번호: 27, 서열번호: 28), CD70 (서열번호: 29), CD73 (서열번호: 30, 서열번호: 31), CD8A (서열번호: 32, 서열번호: 33), CEACAM5 (서열번호: 34), cMYC (서열번호: 35, 서열번호: 36), COX-2 (서열번호: 37, 서열번호: 38), CXCR4 (서열번호: 39), CXCR7 (서열번호: 40, 서열번호: 41), DNMT1 (서열번호: 42, 서열번호: 43), EZH2 (서열번호: 44, 서열번호: 45), GBP2 (서열번호: 46, 서열번호: 47), HMGB1 (서열번호: 48, 서열번호: 49), INFGR2 (서열번호: 50, 서열번호: 51), IL13RA2 (서열번호: 52, 서열번호: 53), IRF1 (서열번호: 54, 서열번호: 55), MyD88 (서열번호: 56, 서열번호: 57), NAMPT (서열번호: 58, 서열번호: 59), NAPRT1 (서열번호: 60, 서열번호: 61), NYESO1 (서열번호: 62, 서열번호: 63), OX40L (서열번호: 64, 서열번호: 65), PD-1 (서열번호: 66), STAT3 (서열번호: 67), 베클린-1 (서열번호: 68), PHD2 (서열번호: 69, 서열번호: 70), PI3K베타 (서열번호: 71, 서열번호: 72), PI3K델타 (서열번호: 73, 서열번호: 74), PI3K감마 (서열번호: 75, 서열번호: 76), CEACAM1 (서열번호: 77, 서열번호: 78), IFNγ (서열번호: 79, 서열번호: 80), STK11 (서열번호: 81, 서열번호: 82), BTK (서열번호: 83, 서열번호: 84), ARG1 (서열번호: 85, 서열번호: 86), TDO (서열번호: 87, 서열번호: 88), TGFβ1 (서열번호: 89, 서열번호: 90), CD16 (서열번호: 91, 서열번호: 92), OX40 (서열번호: 93), IL-2 (서열번호: 94), SLFN11 (서열번호: 95, 서열번호: 96), CD39 (서열번호: 97, 서열번호: 98), CD44 (서열번호: 99, 서열번호: 100), CSF1R (서열번호: 101, 서열번호: 102), GZMB (서열번호: 103, 서열번호: 104), PRF1 (서열번호: 105, 서열번호: 106), CD206 (서열번호: 107, 서열번호: 108), GNLY (서열번호: 109, 서열번호: 110), CD3Z (서열번호: 111, 서열번호: 112), ATF3 (서열번호: 113, 서열번호: 114), TLR8 (서열번호: 115, 서열번호: 116), CD19 (서열번호: 117, 서열번호: 118), 및 CTLA4 (서열번호: 119).
상기에 기술된 방법에서, 조직은 파라핀 포매된 조직(paraffin embedded tissue)일 수 있다. 조직은 일차 종양 또는 이차 종양과 같은 종양으로부터 수득될 수 있다.
유리하게는, 적어도 하나의 단편 펩티드가 정량화된다. 단편 펩티드의 정량화는, 예를 들어, 하나의 생물학적 샘플 내 단편 펩티드의 양을 다른 별개의 생물학적 샘플 내 동일한 단편 펩티드의 양과 비교함으로써 달성될 수 있다. 다른 정량화 방법에서, 생물학적 샘플 내 단편 펩티드의 양은 동일한 아미노산 서열을 갖는 추가된 공지의 양의 내부 표준 펩티드와의 비교에 의해 결정된다. 내부 표준 펩티드는 18O,17O,34S,15N,13C,2H 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 안정한 중 동위원소(heavy isotope)를 함유하는 펩티드와 같이, 동위원소로 표지된 펩티드일 수 있다.
단백질 소화물 내 적어도 하나의 단편 펩티드의 양을 검출 및/또는 정량화하는 것은 대상체에서 상응하는 단백질의 존재 및 암과의 연관성을 나타내기 위해 사용될 수 있다. 적어도 하나의 단편 펩티드의 양, 또는 상응하는 단백질의 수준을 검출 및/또는 정량화한 결과는 암 환자의 면역계의 활성화 상태에 상관될 수 있다. 이 상관 단계는 암 환자의 종양 세포의 분자 상태에 대한 추가적인 정보를 제공하기 위해 다른 단백질 또는 다른 단백질로부터의 펩티드의 양을 검출 및/또는 정량화하는 것과 조합될 수 있다.
이들 중 임의의 방법은 생물학적 샘플이 수득된 환자 또는 대상체에 치료학적 유효량의 암 치료제를 투여하는 것과 조합될 수 있고, 이때 암 치료제 및/또는 투여된 암 치료제의 양은 단백질 목록으로부터 서열번호: 1-119 중 임의의 하나 이상의 (다중으로) 단편 펩티드의 검출 및/또는 양에 기초하고, 그에 의해 암 치료제는 환자의 종양 세포를 공격하고 사멸하도록 암 환자 면역반응을 개시, 향상, 조작, 및/또는 다르게는 조절하는 하나 이상의 단백질과 상호작용하는 면역조절 암 치료제이다. 단백질 목록으로부터 서열번호: 1-119 중 임의의 하나 이상의 (다중으로) 단편 펩티드의 검출 및/또는 양은 환자 종양 세포를 공격하고 사멸하도록 암 환자 면역반응을 개시, 향상, 조작, 및/또는 다르게는 조절하는 하나 이상의 단백질과 상호작용하는 하나 이상의 면역조절 암 치료제로 치료된 환자의 치료 결과를 예측하는데 사용될 수 있다.
이들 방법에서, 단백질 목록으로부터 서열번호: 1-119 중 임의의 하나 이상의 (다중으로) 단편 펩티드의 검출 및/또는 정량화는 그에 의해 환자 면역계가 환자 자신의 종양 세포를 적극적으로 검출, 공격, 및 사멸하는 양성 면역계 활성화 상태를 검출하는데 사용될 수 있다.
이들 방법은 환자 종양 세포의 성장을 유도하는 다른 종양단백질의 분석과 조합될 수 있고, 여기서 환자 종양 세포의 성장을 억제하는 종양단백질의 기능을 억제 또는 조절하는 표적 암 치료제는 환자 종양 세포를 공격하고 사멸하도록 암 환자 면역반응을 개시, 향상, 조작, 및/또는 다르게는 조절하는 하나 이상의 단백질과 상호작용하는 면역조절 암 치료제와 함께 환자에 동시 투여된다.
상세한 설명
암 환자에 대한 면역 프로파일을 개발하는데 사용될 수 있는 특정 질량 분광법-SRM/MRM 분석을 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 면역조절 단백질로부터의 특정 프로테아제-소화된 펩티드가 환자 종양 조직으로부터 직접 제조된 단백질체 소화물에서 검출되고 정확하게 정량화된다. 과정 및 분석은 환자 종양의 면역 지형을 분석하고 환자 자신의 종양 세포에 대한 능동적이고 성공적인 면역반응을 유도하고 지지하는 최적의 암 치료제를 이용한 개선된 치료 방법을 안내하기 위해 사용될 수 있다. 구체적으로, 방법은 다음을 포함한다: 예를 들어, 포르말린 고정 파라핀 포매된 종양 조직과 같이, 암 환자로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 선택적으로 조직 미세절제를 사용하여, 종양 조직으로부터 세포를 수집하는 단계; 수집된 세포로부터 질량 분광 분석을 위해 용해물을 제조하는 단계 (예를 들어, 미국특허 제7,473,532호에 기술된 액체 조직 시약 및 프로토콜 사용); 용해물을 SRM/MRM 분석을 사용하여 분석하는 단계로, 상기 분석이 개별적으로 또는 다중으로 수행될 수 있는 단계; 및 SRM/MRM 분석으로부터의 단백질 검출/정량화 데이터를 사용하여 면역 프로파일을 개발하는 단계. 이들 방법은 SRM/MRM 분석에 의해 검출되고/되거나 정량화된 하나 이상의 단백질과 직접적으로 상호작용함으로써 환자의 면역계를 개시, 조절, 초래, 향상, 및 다르게는 조작하는 치료제가 선택되는 환자에 대한 개선된 치료 방법을 결정하는데 사용될 수 있는 SRM/MRM 분석 데이터를 생성한다.
기술된 SRM/MRM 분석에 의한 환자 면역 프로파일의 결정은, 이로 제한되는 것은 아니지만, 혈액, 소변, 가래, 흉막 삼출액, 종양 주위의 염증액, 정상 조직, 및/또는 종양 조직을 포함하는 다양한 환자-유래 샘플에 대해 수행될 수 있다. 이들 유형의 환자-유래 생물학적 샘플 모두가 분석될 수 있지만, 유리하게는 샘플은 포르말린 고정 파라핀-포매된 ("FFPE") 환자 종양 조직이다.
외과적으로 제거된 조직의 포름알데히드/포르말린 고정은 전 세계적으로 암 조직 샘플을 보존하는 가장 일반적인 방법이고 표준 병리학 실무에서 허용되는 관례이다. 포름알데히드의 수용액을 포르말린이라 지칭한다. "100%" 포르말린은 산화 및 중합도를 제한하기 위해 소량의 안정화제, 일반적으로 만니톨과 함께, 물 중의 포름알데히드의 포화 용액 (약 40 부피% 또는 37 질량%)으로 구성된다. 조직을 보존하는 가장 일반적인 방식은 전체 조직을 수성 포름알데히드 (일반적으로 10% 중성 완충 포르말린이라고 함) 중에 연장된 기간 동안 (8시간 내지 48시간) 담그고, 이어서 실온에서 장기간 저장을 위해 고정된 전체 조직을 파라핀 왁스에 매립하는 것이다. 포르말린 고정된 암 조직을 분석할 수 있는 분자적 분석 방법은 암 환자 조직의 분석을 위해 가장 많이 허용되고 광범위하게 사용되는 방법일 수 있다.
암 환자 조직, 특히 FFPE 조직에서 단백질 발현을 연구하는데 사용되는 가장 널리 사용되는 통상적인 방법론이 면역조직화학 (IHC)이다. IHC 방법론은 항체-기반 검출을 사용한다. IHC 검사의 결과는 대부분 병리학자 또는 조직학자에 의해 자주 해석되는데, 이 해석은 주관적이고 특정 단백질을 표적하는 치료제에 대한 민감도를 예측할 수 있는 정량적 데이터를 제공할 수 없다. 또한, Her2 IHC 검사와 같이, IHC 분석을 포함하는 연구는 이러한 검사로부터 수득된 결과가 잘못되었거나 오도될 수 있음을 시사한다. 이는 다른 실험실이 양성 및 음성 IHC 상태를 분류하기 위해 다른 규칙을 사용하기 때문일 수 있다. 검사를 실시하는 각각의 병리학자는 또한 결과가 양성인지 음성인지를 결정하기 위해 다른 기준을 사용할 수 있다. 대부분의 경우에, 이는 시험 결과가 경계선에 있을 때, 즉 결과가 강하게 양성이지도 않고 강하게 음성이지도 않을 때 발생한다. 다른 경우에, 암 조직 절편의 한 영역에 존재하는 세포는 양성을 검사할 수 있는 반면, 암 조직 절편의 다른 영역에 존재하는 세포는 음성을 검사할 수 있다.
부정확한 IHC 검사 결과는 암 진단을 받은 환자가 최상의 가능한 치료를 받지 못했음을 의미할 수 있다. 만약 종양 조직의 모든 또는 특정 영역/세포가 특정 단백질에 대해 실제로는 양성이지만 검사 결과가 음성으로 분류되는 경우, 의사는 환자에게 정확한 치료적 처치를 투여할 가능성이 낮다. 만약 종양 조직이 특정 단백질의 발현에 대해 실제로는 음성이지만 검사 결과가 양성으로 분류되는 경우, 의사는 환자가 어떠한 혜택도 받을 가능성이 없을 뿐만 아니라 제제의 2차 위험에 노출됨에도 불구하고 특정의 치료적 처치를 사용할 수 있다. 따라서, 불필요한 독성 및 기타 부작용을 줄임과 동시에 환자가 성공적인 면역조절 치료 요법을 받을 가장 큰 가능성을 갖게 하도록 종양 조직에서 특정 면역-기반 단백질의 정량적 수준을 정밀하게 검출하고 정확하게 평가할 수 있는 능력에 큰 임상적 가치가 있다.
종양 조직에서 특정 면역-기반 단백질의 정량적 수준의 정밀한 검출 및 정확한 평가는 SRM/MRM 방법론에 의해 질량 분광기에서 매우 효과적으로 결정된다. 이 방법론은 면역-기반 단백질을 포함하는, 특정 단백질로부터의 독특한 단편 펩티드를 검출하고 정량화하는데, 여기서 각 펩티드의 SRM/MRM 특징 크로마토그래프 피크 영역은, 예를 들어, 액체 조직 용해물에 존재하는 복합 펩티드 혼합물 내에서 결정된다 (미국특허 제7,473,532호 참조). 미국특허 제7,473,532호에 기술된 방법은 Expression Pathology Inc. (Rockville, Md.)로부터 이용가능한 액체 조직 시약 및 프로토콜을 사용하여 편리하게 수행될 수 있다. 단백질의 정량적 수준이 SRM/MRM 방법론에 의해 결정되고 그에 의해 생물학적 샘플 내 각 단백질로부터의 개별 특정 펩티드의 SRM/MRM 특징 크로마토그래피 피크 영역은 개별 단편 펩티드 각각에 대해 "스파이크된 (spiked)" 공지의 양의 내부 표준의 SRM/MRM 특징 크로마토그래피 피크 영역과 비교된다.
일 구현예에서, "스파이크된" 내부 표준은 동일한 정확한 단백질-유래 단편 펩티드의 합성 버전이며, 여기서 합성 펩티드는 2H,18O,17O,15N,13C, 또는 이들의 조합과 같은 하나 이상의 중 동위원소로 표지된 하나 이상의 아미노산 잔기를 함유한다. 이렇게 동위원소 표지된 내부 표준은 질량 분광 분석이 천연 단편 펩티드 크로마토그래피 특징 피크와 다르고 구별되며 비교 피크로 사용될 수 있는 예측가능하고 일관된 SRM/MRM 특징 크로마토그래피 피크를 생성하도록 합성된다. 따라서, 내부 표준이 생물학적 샘플로부터의 단백질 또는 펩티드 제제에 공지의 양으로 "스파이크되어" 질량 분광법에 의해 분석되는 경우, 천연 펩티드의 SRM/MRM 특징 크로마토그래피 피크 영역은 내부 표준 펩티드의 SRM/MRM 특징 크로마토그래피 피크 영역과 비교되고, 이러한 수치 비교는 생물학적 샘플로부터의 원래 단백질체 제제에 존재하는 천연 펩티드의 절대 몰농도 및/또는 절대 중량 중 하나를 나타낸다. 단편 펩티드에 대한 정량적 데이터는 샘플 당 분석된 단백질체 용해물의 양에 따라 표시된다.
주어진 단백질에 대해 단편 펩티드에 대한 SRM/MRM 분석을 개발하고 수행하기 위해, 단순히 펩티드 서열 이외의 추가적인 정보가 질량 분광기에 의해 이용될 수 있다. 이 추가적인 정보는 특정 단편 펩티드의 정확하고 집중된 분석을 수행하기 위해 질량 분광기 (예컨대, 삼중 사중극자 질량 분광기)를 지도하고 지시하는데 사용된다. 표적 펩티드에 대한 추가적인 정보는: 각 펩티드의 단일 동위원소 질량; 그의 전구체 전하 상태; 전구체 m/z 값; m/z 전이 이온; 및 각 전이 이온의 이온 유형의 하나 이상을 포함할 수 있다. 이 추가적인 정보는 질량 분광기에 정확한 지시어를 제공하여 매우 복잡한 단백질 용해물 내에서 단리된 단일 표적 펩티드의 분석을 가능케 한다. SRM/MRM 분석은 삼중 사중극자 질량 분광기 또는 이온 트랩/사중극자 하이브리드 기구에서 효과적으로 수행될 수 있다. 이러한 유형의 질량 분광기는 현재 세포 내 함유된 모든 단백질로부터의 수십만 내지 수백만 개의 개별 펩티드로 구성될 수 있는 매우 복잡한 단백질 용해물 내에서 단리된 단일 표적 펩티드를 분석하는데 가장 적합한 기구인 것으로 여겨진다. 그러나 SRM/MRM 분석은 MALDI, 이온 트랩, 이온 트랩/사중극자 하이브리드, 또는 삼중 사중극자 기구를 포함하는, 다른 유형의 질량 분광기에서 개발되고 수행될 수 있다.
생물학적 샘플에서 특정 단백질을 검출하고 정량화하기 위한 단일 SRM/MRM 분석의 기초는 더 큰, 전장 버전의 단백질로부터 유래한 하나 이상의 단편 펩티드의 식별 및 분석이다. 이는 질량 분광기가 단일 단편 펩티드와 같은 매우 작은 분자를 분석하는 경우에는 매우 효율적이고, 능숙하며, 재현가능한 기구이지만, 질량 분광기는 전장의 온전한 단백질을 효율적으로, 능슥하게, 또는 재현가능하게 검출 및 정량화할 수 없기 때문이다. 한 분자의 펩티드가 한 분자의 단백질로부터 유래하고, 따라서 단편 펩티드의 몰량은 상응하는 단백질의 몰량의 직접적인 척도를 제공한다.
개별 단백질에 대해 단일 SRM/MRM 분석이 개발될 수 있는 후보 펩티드는, 이론적으로, 예를 들어 트립신에 의한 소화와 같이, 온전한 전장 단백질의 완전한 프로테아제 소화에 의해 생성된 각각의 모든 개별 펩티드이다. 그러나 주어진 단백질에 대해 SRM/MRM로 분석하기에 가장 유리한 펩티드, 및 각 펩티드에 대해 구체적으로 정의된 분석 특성은 선험적으로 예측할 수 없으며, 경험적으로 발견되고 결정되어야 한다. 또한, 일부 단백질의 경우에는, 상응하는 단백질을 검출하고 재현가능하게 정량화하는데 사용될 수 있는 어떠한 펩티드도 현재 식별되지 않은 것으로 나타났다.
이러한 예측가능성의 결여는 포르말린 고정 파라핀 포매된 조직으로부터의 액체 조직 용해물과 같은 단백질 용해물에서 분석을 위한 최선의 SRM/MRM 펩티드를 식별할 때 특히 그러하다. 현재 기술된 SRM/MRM 분석은 각 단백질에 대해 하나 이상의 프로테아제-소화된 펩티드 (트립신 소화 펩티드)를 지정함으로써 각 펩티드가 포르말린 고정 환자 조직으로부터 제조된 액체 조직 용해물에서 SRM/MRM 분석에 유리한 펩티드인 것으로 결정되었다. 식별된 펩티드 각각은 재현가능하게 검출되고 정량화될 수 있다.
현재 기술된 SRM/MRM 분석은 환자 종양 조직 미세환경의 면역 프로파일을 개발하는데 사용될 수 있는 단백질을 검출하고 정량화한다. 이러한 단백질의 집합은 성공적인 개인맞춤 종양 면역반응을 유도하도록 최적의, 또는 적어도 바람직한 치료제를 개시, 억제, 유지, 조절하고, 그와 연관/이를 예측하는 다양한 기능을 제공한다. 이들 단백질에는 성장 인자, 성장 인자 수용체, 세포외 기질 단백질, 핵 전사 인자, 상피세포 분화 인자, 면역세포 분화 인자, 세포/세포 인식 인자, 자기 대 종양 인식 인자, 면역세포 활성화 인자, 면역세포 억제 인자, 및 면역 체크포인트 단백질이 포함되지만, 이들로 제한되지 않는다. 이러한 단백질 집합 내 이들 개별 단백질 각각은 상피 종양세포, 정상 상피세포, 정상 섬유아세포, 종양-연관 섬유아세포, 정상 내피세포, 종양-연관 내피세포, 정상 중간엽 세포, 종양-연관 중간엽 세포와 같은 모든 종류의 고형 조직세포를 포함하지만 이로 제한되지 않는, 암 환자의 광범위한 세포에 의해 발현될 수 있다. 이들 단백질 각각은 또한 B 세포, T 세포, 대식세포, 수상돌기, 비만세포, 중성 살해세포, 호산구, 호중구, 및 호염기구와 같은 모든 종류의 림프구를 포함하지만 이로 제한되지 않는, 광범위한 혈액-생성 백혈구에 의해 발현될 수 있다.
이들 단백질 각각의 세포 발현 패턴은 개인의 건강 상태에 따라 매우 상이할 수 있다. 정상적이고 일반적인 건강 상태에서, 이들 단백질은 건강한 면역계를 유지함으로써 자기의 세포 인식이 주로 주요 조직복합성 복합체 (MHC)를 통해 비-자기의 인식과 균형을 이룬다. MHC는 척추동물에서 면역계가 외래 분자를 인식하는데 필수적인 한 세트의 세포 표면 단백질이며, 이는 결국 조직적합성을 결정한다.
MHC 분자의 주요 기능은 병원체로부터 유래된 펩티드 단편에 결합하여 적절한 T-세포에 의한 인식을 위해 세포 표면 상에 이들을 표시하고 그로써 면역반응이 병원체에 대해 탑재될 수 있도록 하는 것이다. MHC 분자는 면역세포인 백혈구와 다른 백혈구 또는 고형 조직 체세포와의 상호작용을 매개한다. MHC는 교차-반응 면역화를 통해 자가면역 질환에 대한 자신의 감수성뿐만 아니라, 장기 이식에 대한 공여자의 상용성을 결정한다. 인간에서, MHC는 또한 인간 백혈구 항원 (HLA)이라 불린다. 세포에서, 숙주 자신의 표현형의 단백질 분자 또는 다른 생물학적 실체는 지속적으로 합성되고 분해된다. 세포 표면 상의 각각의 MHC 분자는 에피토프라 불리는 단백질의 분자 분획을 나타낸다. 제시된 항원은 자기 또는 비-자기일 수 있다. 항원이 자기로서 인식되는 경우, 유기체의 면역계는 면역 살해 반응으로 그 자신의 세포를 표적하는 것을 방지한다.
MHC는 병원체로부터 신체를 보호할 뿐만 아니라 암세포의 자연 조절에 중요한 역할을 한다. 암세포는 면역계를 경고하기 위해 MHC에 의해 표현될 수 있는 다수의 변이된 단백질 및 비정상적으로 발현된 단백질을 함유한다. 종양 세포는 또한 정상 단백질을 발현할 수 있지만, 특이한 장소에서, 특이한 방식으로, 및/또는 비정상적 양으로 면역반응을 동원하거나 또는 억제하는 신호를 제공한다. 정상 세포는 그의 클래스 I MHC에 정상 세포 단백질 턴오버 (turnover)로부터의 펩티드를 표시할 것이고 면역계 세포 (백혈구)는 백혈구의 표면에서 정상적으로 발현되는 특정 단백질에 의해 매개되는 중심 및 말초 내성 메커니즘으로 인해 이들에 대한 반응으로 활성화되지 않을 것이다. 예컨대 바이러스 감염 후 또는 암세포에 의한 비정상적 단백질 발현의 경우와 같이, 세포가 외래 단백질을 발현할 때, 클래스 I MHC의 분획은 세포 표면상에 이들 펩티드를 표시할 것이다. 결과적으로, MHC:펩티드 복합체에 특이적인 그러한 백혈구는 비정상 펩티드를 제시하는 암세포를 비롯해, 그러한 세포를 인식하고 사멸시킬 것이다. 대안적으로, 클래스 I MHC 자체는 바이러스-감염 세포 및 암세포를 사멸하는, 자연 살해 세포 (NKs)로 불리는 백혈구 집단에 대한 억제 리간드로서 작용할 수 있다. 면역 회피 동안 또는 특정 종양에서 일부 바이러스에 의해 사용되는 메커니즘인, 표면 클래스 I MHC의 정상 수준의 감소는 NK-매개 세포 사멸을 불활성화시킴으로써 종양 세포가 면역-매개 사멸을 회피하도록 도울 것이다.
암세포는 다른 방식으로 면역-매개 사멸을 회피할 수 있다. 면역 감시의 회피를 위해 다른 전략을 이용하는 암세포의 예시는 PD-L1 체크포인트 단백질을 비정상적으로 발현하는 암세포의 경우에서이다. 프로그램된 사멸-리간드 1 (Programmed death-ligand 1, PD-L1)은 임신, 조직 동종이식, 자가면역 질환 및 암과 같은 다른 질환 상태와 같은 특정 사건 동안에 면역계를 억제하는데 중요한 역할을 하는 막관통 단백질이다. 일반적으로 면역계는 PD-1을 발현하는 항원-특이적 CD8+ T 세포의 증식을 촉발하는 림프절 또는 비장에 약간의 축적이 있는 외래 항원에 반응한다. PD-1에 대한 PD-L1의 결합은 이들 CD8+ T 세포의 증식을 감소시키는 억제 신호를 전달하고 그로써 암세포를 무시하도록 면역계에 신호를 보낸다.
암세포에 의한 PD-L1의 상향조절된 비정상적 발현은 암세포가 숙주 면역계를 회피하게 한다. 신장세포 암종을 갖는 환자로부터의 196개 종양 표본의 분석에 따르면 PD-L1의 높은 종양 발현은 증가된 종양 공격성 및 4.5배 증가된 사망 위험과 관련이 있는 것으로 나타났다. PD-L1의 더 높은 발현을 갖는 난소암 환자는 더 낮은 발현을 갖는 환자보다 현저히 더 나쁜 예후를 나타낸다. 또한, PD-L1 발현은 상피내 CD8+ T-림프구 계수와 역으로 상관되는 것으로 알려져 있는데, 이는 종양 세포에서 PD-L1이 항종양 CD8+ T 세포를 억제할 수 있음을 시사한다. 다수의 PD-L1 억제제가 현재 일상적인 암 요법으로 사용되거나 또는 면역-기반 암 치료제로서 개발되고 있으며 이들 제제는 많은 환자에서 양호한 반응률을 나타낸다.
면역-기반 암 치료 전략은 환자 자신의 암세포와 싸우고 이를 사멸하도록 환자 자신의 면역계를 개시, 조절, 강화 또는 조작하도록 설계된다. 많은 형태의 면역요법이 암 치료를 위한 강력하고 새로운 접근법이 되고 있다. 본원에 기술된 SRM/MRM 분석 방법은, 예를 들어, 종양-활성화 면역반응의 균형을 개시 및/또는 조절하도록 면역-기반 암 치료제를 이용한 잠재적 치료 전략을 알려주기 위해, 환자 종양 세포에서 PD-L1/PD-1 면역 체크포인트 단백질과 같은 정량적 단백질 발현 데이터를 제공하는 능력을 제공한다. 면역 체크포인트 단백질에 대한 단일 SRM/MRM 분석의 예시가 PCT/US2015/010386에서 PD-L1 단백질에 대해 기술된다.
현재 기술된 SRM/MRM 분석은 많은 상이한 세포 유형에 의해 발현된 독특한 단백질의 발현을 검출하고 정량화하는데, 여기서 각 단백질은 암세포에 대한 면역계 반응을 개시 및/또는 조절하는데 관여한다. 각각의 분석은 단일 단백질을 검출하고 측정하기 위해 식별된 적어도 하나의 최적 펩티드를 기술하고, 그에 의해 각각의 분석은 개별적으로 또는 다른 단백질에 대한 다른 펩티드와 함께 다중으로 수행될 수 있다. 단백질 및 펩티드 목록이 표 1에 나타나 있다. 이러한 분석이 개발된 단백질이 하나 이상의 일반적인 명칭 및/또는 대체 명칭으로 표 1에 열거된다:
B7-1 (분화 무리 80 (cluster of differentiation 80), CD80),
B7H2 (분화 무리 275, CD275),
베타-카테닌,
CALR (칼레티쿨린, 칼레굴린),
CCR4 (분화 무리 194, CD194),
CD133 (분화 무리 133),
CD137 (분화 무리 137, TNFRSF9),
CD137L (분화 무리 137 리간드),
CD166 (분화 무리 166, CD6L, MEMD),
CD28 (분화 무리 28),
CD38 (분화 무리 38, 시클릭 ADP 리보스 히드롤라제),
CD3G (분화 무리 3G),
CD40 (분화 무리 40),
CD40L (분화 무리 40 리간드, CD154),
CD47 (분화 무리 47, 인테그린 연관 단백질),
CD68 (분화 무리 68),
CD70 (분화 무리 70,
CD73 (분화 무리 73, 엑토-5'뉴클레오티다제),
CD8A (분화 무리 8A),
CEACAM5 (암배아 항원-관련 세포부착 분자 5, CD66E),
cMYC (v-myc 조류 골수구종증 바이러스 종양유전자 동족체),
COX-2 (시클로옥시게나제 2),
CXCR4 (분화 무리 184,
CXCR7 (C-X-C 케모카인 수용체 타입 7, GPR159),
DNMT1 (DNA 시토신-5-메틸트랜스퍼라제 1),
EZH2 (zeste 동족체의 증강인자 2),
GBP2 (인터페론-유도 구아닐레이트-결합 단백질 2),
HMGB1 (고-이동도 그룹 단백질 1),
IFNGR2 (인터페론 감마 수용체 2),
IL13RA2 (인터류킨-13 수용체 서브유닛 알파-2),
IRF1 (인터페론 조절인자 1),
MyD88 (골수성 분화 일차 반응 유전자 88),
NAMPT (니코틴아미드 포스포리보실트랜스퍼라제),
NAPRT1 (니코티네이트 포스포리보실-트랜스퍼라제),
NYESO1 (뉴욕 식도 편평세포암종 1),
OX40L (분화 무리 252),
PD-1 (세포예정사 단백질-1),
STAT3 (전사의 신호 변환기 및 활성제 3),
베클린-1 (BECN1),
PHD2 (프롤릴 히드록실라제 도메인-함유 단백질 2),
PI3K베타 (포스포타딜이노시톨-4,5-비스포스페이트 3-키나제-베타),
PI3K델타 (포스포타딜이노시톨-4,5-비스포스페이트 3-키나제-델타),
PI3K감마 (포스포타딜이노시톨-4,5-비스포스페이트 3-키나제-감마),
CEACAM1 (암배아 항원-관련 세포 부착 분자 1, 분화 무리 66a, CD66a),
IFNγ(인터페론 타입 II),
STK11 (간 키나제 B1, LKB1),
BTK (브루톤 티로신 키나제),
ARG1 (아르기나제),
TDO (트립토판 2,3-디옥시게나제),
TGFβ1 (전환 성장 인자 베타 1),
CD16 (분화 무리 16, FCGR3A),
OX40 (CD134, 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 멤버 4),
IL-2 (인터류킨 2),
SLFN11 (슐라펜 (Schlafen) 패밀리 멤버 11),
CD39 (엑토뉴클레오시드 트리포스페이트 디포스포히드롤라제-1),
CD44 (식세포 당단백질-1),
CSF1R (콜로니 자극 인자 1 수용체),
GZMB (그랜자임 B),
PRF1 (퍼포린 -1),
CD206 (만노스 수용체),
GNLY (그라눌리신 (Granulysin)),
CD3Z (T-세포 수용체 T3 제타 사슬),
ATF3 (시클릭 AMP-의존성 전사 인자),
TLR8 (Toll-유사 수용체 8),
CD19 (B-림프구 항원 CD19), 및
CTLA4 (세포독성 T-림프구-연관 단백질 4).
놀랍게도, 표 1에 열거된 단백질로부터의 많은 잠재적 펩티드 서열이 즉시 명백하지 않은 이유로 질량 분광법-기반 SRM/MRM 분석에 사용하기에 부적합하거나 비효율적인 것으로 밝혀졌다. MRM/SRM 분석에 가장 적합한 펩티드를 예측할 수 없었기 때문에, 각각의 지정된 단백질에 대해 신뢰할만하고 정확한 SRM/MRM 분석을 개발하기 위해 실제 액체 조직 용해물에서 변형 및 비변형된 펩티드를 실험적으로 확인할 필요가 있었고, 가능하다. 임의의 이론에 구속되기를 원하지 않지만, 일부 펩티드는, 예를 들어, 이들이 잘 이온화하지 않거나 다른 단백질과 구별되는 단편을 생성하지 않기 때문에 질량 분광법에 의해 검출되기 어려울 수 있는 것으로 여겨진다. 펩티드는 또한 크로마토그래피 분리에서 잘 분해되지 않거나 유리 또는 플라스틱 제품에 부착될 수 있다.
표 1에서 확인되는 펩티드는 포르말린 고정 암 조직으로부터 조달된 세포로부터 제조된 복잡한 액체 조직 용해물 내 모든 단백질의 프로테아제 소화에 의해 이들 각각의 지정된 단백질로부터 유래하였다. 달리 언급하지 않는 한, 각 경우에서 프로테아제는 트립신이다. 그 후에 액체 조직 용해물을 질량 분광법으로 분석하여 질량 분광법에 의해 검출되고 분석된 지정된 단백질로부터 유래한 그러한 펩티드를 결정한다. 질량 분광 분석에 특히 바람직한 펩티드 서브세트의 식별은 액체 조직 용해물의 질량 분광 분석에서 단백질로부터 펩티드 또는 펩티드들이 이온화하는 실험 조건하에서의 발견에 기초하고, 따라서 질량 분광의 방법론에 의해 분석되는 액체 조직 용해물을 제조하는데 사용되는 프로토콜 및 실험 조건으로부터 생성되는 펩티드의 능력을 입증한다.
이러한 단백질 집합에 대한 최적의 펩티드는 다음과 같이 발견되었다. 포르말린 (포름알데히드) 고정 조직으로부터 직접 조달된 세포로부터의 단백질 용해물을 조직 미세절제를 통해 세포를 샘플 튜브에 수집하고 이어서 연장된 기간 동안에 액체 조직 완충제 중에서 세포를 가열하는 것을 포함하는, 액체 조직 시약 및 프로토콜을 사용하여 제조하였다. 포르말린-유도된 가교가 부정적으로 영향을 받으면, 조직/세포는, 예를 들어, 이로 제한되는 것은 아니지만, 프로테아제 트립신을 포함하는, 프로테아제를 사용하여 예측 가능한 방식으로 완전히 소화되었다. 각각의 단백질 용해물은 프로테아제를 이용한 온전한 폴리펩티드의 소화에 의해 펩티드의 집합으로 바뀌었다. 각각의 액체 조직 용해물을 (예컨대, 이온 트랩 질량 분광법에 의해) 분석하여 각각의 단백질 소화물에 존재하는 모든 세포 단백질로부터 질량 분광법에 의해 확인될 수 있는 만큼 많은 펩티드의 식별로서 데이터가 제시된 펩티드의 다중 전체 단백질체 검사 (multiple global proteomic survey)를 수행한다. 단일 복합체 단백질/펩티드 용해물로부터 가능한 만큼 많은 펩티드의 식별을 위해 전체 프로파일링을 수행할 수 있는 이온 트랩 질량 분광기 또는 다른 형태의 질량 분광기가 전형적으로 사용된다. 그러나 이온 트랩 질량 분광기는 펩티드의 전체 프로파일링을 수행하는데 최상의 유형의 질량 분광기일 수 있다.
사용된 조건하에서 단일 용해물의 단일 MS 분석에서 가능한 많은 펩티드가 식별되면, 펩티드의 목록을 대조하여 해당 용해물에서 검출된 단백질을 결정하기 위해 사용하였다. 다수의 액체 조직 용해물에 대해 상기 과정을 반복하였고, 매우 많은 펩티드의 목록을 단일 데이터세트로 대조하였다. 이 유형의 데이터세트는 (프로테아제 소화 후) 분석된 생물학적 샘플의 유형에서, 특히 생물학적 샘플의 액체 조직 용해물에서 질량 분광법에 의해 검출될 수 있는 펩티드를 대표하는 것으로 간주될 수 있고, 따라서 지정된 단백질 각각에 대한 펩티드를 포함한다.
일 구현예에서, 지정된 단백질의 절대적 또는 상대적 양의 결정에 유용한 것으로 확인된 트립신분해 펩티드가 표 1에 열거된다. 이들 펩티드 각각을 포르말린 고정된, 파라핀 포매 조직으로부터 제조된 액체 조직 용해물에서 질량 분광법으로 검출하였다. 따라서, 각각의 펩티드는 직접적으로 포르말린 고정된 환자 조직을 포함하는, 인간 생물학적 샘플에서 직접 지정된 단백질에 대한 정량적 SRM/MRM 분석을 개발하는데 사용될 수 있다.
각각의 지정된 단백질로부터의 특정 단편 펩티드에 대한 특이적이고 독특한 특성을 이온 트랩 및 삼중 사중극자 질량 분광기 둘 다에서 모든 단편 펩티드의 분석에 의해 개발하였다. 이 정보는 포르말린 고정된 샘플/조직으로부터의 액체 조직 용해물에서 직접 각각의 모든 후보 SRM/MRM 펩티드에 대해 실험적으로 결정되어야 하는데; 왜냐하면, 흥미롭게도, 임의의 지정된 단백질로부터의 모든 펩티드가 본원에 기술된 바와 같은 SRM/MRM을 사용하여 그러한 용해물 중에서 검출될 수 있는 것은 아니기 때문이고, 이는 검출되지 않은 단편 펩티드가 포르말린 고정된 샘플/조직으로부터의 액체 조직 용해물에서 직접 펩티드/단백질을 정량화하는데 사용하기 위한 SRM/MRM 분석을 개발하기 위한 후보 펩티드로 간주될 수 없음을 나타낸다.
주어진 펩티드에 대한 특정 전이 이온 특성은 특정 단편 펩티드를 검출할 뿐만 아니라 포르말린 고정된 생물학적 샘플 내 이러한 단편 펩티드를 정량적으로 측정하는데 사용될 수 있다. 이들 데이터는 분석되는 단백질 용해물의 마이크로그램당 펩티드의 몰량의 함수로서 이 단편 펩티드의 절대량을 나타낸다. 포르말린 고정된 환자-유래 조직의 분석에 기초한 조직 내 상응하는 단백질 수준의 평가는 각각의 특정 환자에 대한 진단적, 예후적, 및 치료적으로-관련된 정보를 제공할 수 있다.
일 구현예에서, 생물학적 샘플에서 표 1에 열거된 단백질 각각의 수준을 측정하는 방법이 제공되고, 이 방법은 질량 분광법을 사용하여 생물학적 샘플로부터 제조된 단백질 소화물에서 하나 이상의 단편 펩티드의 양을 검출 및/또는 정량화하는 단계; 및 상기 샘플에서 변형 또는 비변형된 단백질의 수준을 계산하는 단계를 포함하고; 이때 수준은 상대적 수준 또는 절대적 수준이다. 관련 구현예에서, 하나 이상의 변형 또는 비변형된 단편 펩티드를 정량화하는 단계는 첨가된 공지의 양의 내부 표준 펩티드와의 비교에 의해 생물학적 샘플 내 단편 펩티드 각각의 양을 결정하는 것을 포함하고, 이때 생물학적 샘플 내 단편 펩티드 각각은 동일한 아미노산 서열을 갖는 내부 표준 펩티드와 비교된다. 일부 구현예에서, 내부 표준은18O,17O,34S,15N,13C,2H 또는 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 안정한 중 동위원소를 포함하는 동위원소로 표지된 내부 표준 펩티드이다. 주어진 한 분자의 펩티드는 한 분자의 단백질로부터 유래하기 때문에, 상기 펩티드의 몰량은 존재하는 단백질의 몰량의 직접적인 척도이다.
본원에 기술된 생물학적 샘플 내 지정된 단백질 (또는 이의 대리물로서 단편 펩티드)의 수준을 측정하는 방법은 환자 또는 대상체에서 암의 진단 지표로 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 지정된 단백질 수준의 측정 결과는 조직에서 발견된 단백질의 수준을 정상 및/또는 암성 또는 전암성 조직에서 발견된 그 단백질의 수준에 상관시킴으로써 (예컨대, 비교함으로써) 암의 진단 단계/등급/상태를 결정하는데 이용될 수 있다. 다른 구현예에서, 지정된 단백질의 수준 측정 결과는 암 환자를 치료하기 위한 암 치료제를 결정하고 따라서 가장 최적의 암 치료 요법을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
조직 면역 지형은 고도로 복잡하고 그에 의해 다수 유형의 고형 조직 세포에 의해 발현된 다수의 단백질 및 국소/비-국소화된 면역 세포는 다양한 치료제 징후에 대한 다양한 분석을 요구한다. 이러한 단백질 분석의 복잡화 수준은 현재 기술된 SRM/MRM 분석에 의해 분석될 수 있다. 이들 분석은 가용성 단백질, 막-결합 단백질, 핵 인자, 분화 인자, 세포-세포 상호작용을 조절하는 단백질, 분비 단백질, 면역 체크포인트 단백질, 면역 억제 단백질, 사이토카인, 및 림프구-활성화/억제 인자를 포함하지만 이들로 제한되지 않는, 다양한 분자 기능을 갖는 많은 상이한 단백질을 동시에 검출하고 정량화하도록 고안되었다.
조직 미세절제는 환자에 대한 종양 세포 상태를 구체적으로 정의하는 면역 프로파일을 결정하기 위해 기술된 SRM/MRM 분석을 사용하여 단백질 발현 분석을 위한 환자 종양 조직으로부터의 종양 세포의 순수한 집단을 조달하는데 유리하게 사용된다. 종양 조직의 조직 미세절제는 DIRECTOR 기법을 이용하여 세포 및 세포 집단의 레이저 유도된 전방 전달의 과정을 사용하여 수행될 수 있다. 에너지 전달 층간 코팅의 이용을 통한 조직의 레이저 유도된 전방 전달을 위해 DIRECTOR 슬라이드의 사용을 기술하는 방법이 미국특허 제7,381,440호에 기술되어 있고, 이의 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다. 그러나, 순수한 종양 세포 집단의 미세절제는 종양 세포를 사멸할 것으로 기대되는 세포, 즉 종양 침윤 림프구 (TILS)의 단백질 발현 특징/프로파일을 무시할 가능성이 있다. 이러한 한계는 순수한 종양 세포 집단뿐만 아니라, 순수한 TILs 집단을 조달하기 위해 조직 미세절제를 사용함으로써 극복될 수 있으며, 이에 의해 큰 TILs 집단을 함유하는 조직의 영역이 기술된 SRM/MRM 분석을 사용하여 단백질 발현 분석을 위해 수집되고 가공될 수 있다. 2개의 별개의 세포 집단의 수집 및 분석을 통해, 환자 면역 프로파일은 환자에 대한 바람직한 또는 최적의 치료 요법을 알려주도록 결정될 수 있고, 그에 의해 면역계는 최적의 면역-매개 종양 세포 사멸을 위한 특정 면역-조절제에 의해 조절될 수 있고, 종양 세포는 표적 치료제 및/또는 면역-매개 종양 세포 사멸에 의해 표적화될 수 있다.
조직 미세절제는 SRM/MRM 분석을 위해 환자 조직으로부터의 특정 세포 집단의 순수한 조직을 생산하지만, 대부분의 종양 조직은 미세절제되는 TILs의 별개 집단의 적당히 넓은 영역을 나타내지 않는다. 대부분의 경우에, TILs는 이종의 복잡한 조직 미세환경 사이에 드문드문 산재하여 종양 세포의 상대적으로 순수한 집단은 효과적으로 분석될 수 있지만, 순수한 TILs 집단의 분석은 통상적으로 효과적이지 않다. 종양 조직-유래 TILs는 면역계 조절제를 사용하여 면역반응의 양성 조작을 알리는 다수의 중요한 단백질을 발현하고, 따라서 분석되어야 한다. 이러한 한계는 환자 조직 내에 존재하는 종양 미세환경의 전체 영역으로부터 기술된 SRM/MRM 분석을 위한 분석가능한 단백질 용해물을 제조함으로써 극복될 수 있다. 이 용해물은, 종양 세포, 양성 비-종양 세포, 및 면역 세포를 포함하지만 이로 제한되지 않는, 많은 상이한 세포 유형의 전체 복합체 환경의 단백질체 표현을 함유한다. 이러한 방식으로, 매우 복잡한 환자-특이적 면역 프로파일이 환자 종양 환경의 전체 면역 지형을 포착하여, 결정될 수 있다. 또한, 동일한 조직으로부터 일련의 절편의 조직 미세절제에 의해 수집된 바와 같은 종양 세포의 정제된 집단의 분석은 전체 종양 미세환경 지형과 비교 및 대조될 수 있다. 이 접근법은 면역 세포 프로파일로부터 종양 세포 프로파일을 기능적으로 분리하여 조직 샘플에 존재하지 않는 국소화된 TILs 및/또는 면역 세포에 의해 가장 발현될 것 같은 면역반응 단백질을 식별하고, 이들 단백질은 종양 면역 지형에 영향을 미칠 수 있다.
현재 기술된 SRM/MRM 분석은 고형 종양 조직으로부터 제조된 용해물 내 특정 단백질의 발현을 검출하고 정량화하지만; 그러나 순수한 세포 집단이 수집되고 분석되지 않는 한, 이들 분석은 어느 세포가 어느 단백질을 발현하는지에 대한 상세한 정보를 제공할 수 없다. 예를 들어, 종양 세포가 일반적으로 정상 세포, 정상 림프구 세포 및/또는 TILs에 의해 단독으로 발현되는 면역 억제 인자를 발현하는 경우에서와 같이, 비정상적 단백질 발현이 종양 미세환경에서 일반적이기 때문에 이는 중요할 수 있다. 따라서, 후보 치료 단백질 표적의 발현이 기술된 SRM/MRM 분석에 의해 검출되고 정량화되었을 때, 누락된 세포 위치 정보를 제공하는 후속 분석이 필요할 수 있다. 세포 발현 맥락을 달성하기 위한 방법이 면역조직화학이다. 어느 단백질이 종양 미세환경에서 발현되고 어느 세포가 이들 단백질을 발현하는지 이해하는 것은 종양 세포를 찾아내고 사멸하도록 환자 자신의 면역반응을 조절하기 위한 최적의 치료 결정을 유리하게 알려줄 수 있다. 현재 기술된 SRM/MRM 분석 및 분석 과정은 환자 종양 조직에서 직접 면역조절 암 치료제의 단백질 표적을 검출하고 정량화하는 능력을 제공한다.
종양 세포 사멸에 대한 유리한 접근법은 면역조절제가 최적의 환자 반응을 위해 상승적으로 종양 세포 표적화제와 조합하여 사용되는 병용 요법을 사용하는 것이다. SRM/MRM 분석은 억제 치료제가 개발된 종양단백질 표적의 환자 종양 조직에서 정량적 발현 상태를 결정하는데 사용될 수 있다. 종양단백질의 정량적 상태를 결정하기 위한 SRM/MRM 분석의 예시가 Met 단백질 (미국특허 제9,372,195호 참조) 및 IGF-1R 단백질 (미국특허 제8,728,753호 참조)에 대해 기술된다. 약물 크리조티닙 (crizotinib) 및 카보잔티닙 (cabozantinib)은 Met 단백질 기능을 억제하지만 피지투무맙 (figitumumab) 및 식수투무맙 (cixutumumab)은 IGF-1R 단백질 기능을 억제한다. 이들 분석으로부터의 정보는 종양 조직의 면역 상태를 이해하기 위해 현재 기술된 SRM/MRM 분석으로부터의 정보와 조합될 수 있다. 함께, 두 데이터세트는 표적화된 면역-기반 조합 치료적 접근법을 위한 치료 요법을 알려주기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 환자의 종양 세포가 SRM/MRM 방법론에 의해 PD-L1 단백질 및 Met 단백질 둘 다를 과발현하는 것으로 결정된다면, 논리적 조합 치료 요법은 크리조티닙 (Met 억제제)과 병용하여 니볼루맙 (nivolumab) (PD-1 억제제) 또는 아테졸리무맙 (atezolizumab) (PD-L1 억제제)의 투여를 포함할 수 있다. 이러한 접근법의 결과는 종양 세포를 공격하고 사멸하도록 환자의 면역계를 무장시키면서 종양 세포를 특이적으로 표적하고 사멸하는 치료제를 최적으로 이용하는 것이다.
핵산 및 단백질 둘 다 동일한 액체 조직 생체분자 제제로부터 분석될 수 있기 때문에 현재 기술된 SRM/MRM 분석으로 분석된 동일한 샘플 내 핵산으로부터 약물 치료 결정에 대한 추가적인 정보를 생성하는 것이 가능하다. 특정 단백질이 현재 기술된 SRM/MRM 분석에 의해 특정 세포에 의해 증가된 수준으로 발현되는 것으로 밝혀질 수 있으며, 동시에 특정 유전자 및/또는 이들이 인코딩하는 핵산 및 단백질의 돌연변이 상태에 대한 정보 (예컨대, mRNA 분자 및 이들의 발현 수준 또는 스플라이스 변형)가 수득될 수 있다. 이들 핵산은, 예를 들어, 다음의 하나 이상, 둘 이상, 또는 셋 이상에 의해 검사될 수 있다: 서열분석 방법, 중합효소 연쇄반응 방법, 제한 단편 다형성 분석, 결실의 확인, 삽입, 및/또는 단일 염기쌍 다형성, 전이, 변위 또는 이들의 조합을 포함하나 이로 제한되지 않는 돌연변이의 존재 결정.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003

Claims (22)

  1. 질량 분광법을 사용하여 생물학적 샘플로부터 제조된 단백질 소화물(protein digest)에서 인간 면역계를 개시, 유지, 증강, 억제, 또는 다르게는 조절하는 기능을 하는 하나 이상의 단백질의 수준을 검출 및 정량화(quantify)하고; 및 상기 생물학적 샘플에서 상기 단백질의 수준을 계산함으로써, 암 환자로부터 수득된 포르말린 고정된 종양 조직의 생물학적 샘플에서 단백질 발현 프로파일을 결정하는 방법으로서;
    상기 수준이 상대적 수준 또는 절대적 수준이고,
    상기 하나 이상의 단백질이 B7-1, B7H2, 베타-카테닌, CALR, CCR4, CD133, CD137, CD137L, CD166, CD28, CD38, CD3G, CD40, CD40L, CD47, CD68, CD70, CD73, CD8A, CEACAM5, cMYC, COX-2, CXCR4, CXCR7, DNMT1, EZH2, GBP2, HMGB1, INFGR2, IL13RA2, IRF1, MyD88, NAMPT, NAPRT1, NYESO1, OX40L, PD-1, STAT3, 베클린-1, PHD2, PI3K베타, PI3K델타, PI3K감마, CEACAM1, IFNγ, STK11, BTK, ARG1, TDO, TGFβ1, CD16, OX40, IL-2, SLFN11, CD39, CD44, CSF1R, GZMB, PRF1, CD206, GNLY, CD3Z, ATF3, TLR8, CD19, 및 CTLA4로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 단편 펩티드의 양을 검출 및/또는 정량화하기 전에 상기 단백질 소화물을 분획화(fractionating)하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 분획화 단계가 겔 전기영동, 액체 크로마토그래피, 모세관 전기영동, 나노-역상 액체 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피, 또는 역상 고성능 액체 크로마토그래피를 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플의 상기 단백질 소화물이 액체 조직 프로토콜(Liquid Tissue protocol)에 의해 제조되는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 소화물이 프로테아제 소화물을 포함하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 단백질 소화물이 트립신 소화물을 포함하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질량 분광법이 탠덤(tandem) 질량 분광법, 이온 트랩 질량 분광법, 삼중 사중극자(triple quadrupole) 질량 분광법, 하이브리드 이온 트랩/사중극자 질량 분광법, MALDI-TOF 질량 분광법, MALDI 질량 분광법, 및/또는 비행시간 (time of flight) 질량 분광법을 포함하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 사용되는 질량 분광법의 방식이 선택 반응 모니터링 (SRM), 다중 반응 모니터링 (MRM), 지능형 선택 반응 모니터링 (iSRM), 및/또는 다중 선택 반응 모니터링 (mSRM)인, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단편 펩티드가 서열번호: 1-119의 서열을 갖는 펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 조직이 파라핀 포매된 조직(paraffin embedded tissue)인, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 조직이 종양으로부터 수득되는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단편 펩티드를 정량화하는 것이 하나의 생물학적 샘플 내 상기 단편 펩티드의 양을 다른 별개의 생물학적 샘플 내 동일한 단편 펩티드의 양과 비교하는 것을 포함하는, 방법.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단편 펩티드를 정량화하는 것이 동일한 아미노산 서열을 갖는 공지된 양의 첨가된 내부 표준 펩티드와 비교하여 생물학적 샘플 내 상기 단편 펩티드의 양을 결정하는 것을 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 내부 표준 펩티드가 동위원소로 표지된 펩티드인, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 동위원소로 표지된 내부 표준 펩티드가 18O, 17O, 34S, 15N, 13C, 2H 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 안정한 중 동위원소 (heavy isotope)를 포함하는, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 소화물 내 적어도 하나의 단편 펩티드의 양을 검출 및 정량화하는 것이 대상체에서 상응하는 단백질의 존재 및 암과의 연관성을 나타내는, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 단편 펩티드의 양, 또는 상응하는 단백질의 수준의 상기 검출 및 정량화의 결과를 암 환자의 면역계의 활성화 상태에 상관시키는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 적어도 하나의 단편 펩티드의 양 또는 상응하는 단백질의 수준의 검출 및/또는 정량화의 결과를 암 환자의 면역계의 활성화 상태에 상관시키는 것이 다른 단백질 또는 다른 단백질로부터의 펩티드의 양의 검출 및/또는 정량화와 조합되어 상기 암 환자의 종양 세포의 분자 상태에 대한 추가적인 정보를 제공하는, 방법
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플이 수득된 환자 또는 대상체에 치료학적 유효량의 암 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 투여된 암 치료제 및/또는 암 치료제의 양이 서열번호: 1-119의 서열을 갖는 펩티드로부터 선택되는 임의의 하나 이상의 단편 펩티드의 검출 및/또는 양에 기초하고, 그에 의해 암 치료제가 상기 환자의 종양 세포를 공격하여 사멸하도록 상기 암 환자 면역반응을 개시, 향상, 조작, 및/또는 다르게는 조절하기 위해 상기 단백질의 하나 이상과 상호작용하는 면역조절 암 치료제인, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 환자 또는 대상체에 상기 환자의 종양 세포를 공격하여 사멸하도록 상기 암 환자 면역반응을 개시, 향상, 조작, 및/또는 다르게는 조절하기 위해 상기 단백질의 하나 이상과 상호작용하는 면역조절 암 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  21. 질량 분광법을 이용하여 생물학적 샘플로부터 제조된 단백질 소화물에서 하나 이상의 단백질의 수준을 검출 및 정량화하고; 상기 생물학적 샘플 내 상기 단백질의 수준을 계산함으로써 환자의 면역계 활성화 상태를 결정하는 방법으로서;
    상기 수준이 상대적 수준 또는 절대적 수준이고,
    상기 하나 이상의 단백질이 B7-1, B7H2, 베타-카테닌, CALR, CCR4, CD133, CD137, CD137L, CD166, CD28, CD38, CD3G, CD40, CD40L, CD47, CD68, CD70, CD73, CD8A, CEACAM5, cMYC, COX-2, CXCR4, CXCR7, DNMT1, EZH2, GBP2, HMGB1, INFGR2, IL13RA2, IRF1, MyD88, NAMPT, NAPRT1, NYESO1, OX40L, PD-1, STAT3, 베클린-1, PHD2, PI3K베타, PI3K델타, PI3K감마, CEACAM1, IFNγ, STK11, BTK, ARG1, TDO, TGFβ1, CD16, OX40, IL-2, SLFN11, CD39, CD44, CSF1R, GZMB, PRF1, CD206, GNLY, CD3Z, ATF3, TLR8, CD19, 및 CTLA4로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 단편 펩티드가 서열번호: 1-119의 서열을 갖는 펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
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