CN110431236A - 肿瘤组织的免疫分析 - Google Patents

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Abstract

利用SRM/MRM试验检测和定量直接参与患者肿瘤组织中启动、抑制、维持和/或以其他方式调节肿瘤免疫应答过程中的蛋白质。该试验提供组织微环境的免疫谱，并且可以用作基于免疫治疗的改进方法的一部分，该基于免疫治疗的改进方法使用与癌症治疗剂一同调节癌症免疫应答的试剂。

Description

肿瘤组织的免疫分析
技术领域
将从癌症患者获得的肿瘤组织进行基于质谱的定量蛋白质组学分析，以提供个性化的患者肿瘤免疫谱。对患者肿瘤组织进行的蛋白质测定可用于检测和定量测量蛋白质水平，即：1)预测最佳的基于免疫的疗法，2)与最佳免疫疗法的阳性反应相关联，和/或3)启动、抑制、维持、促进和/或以其他方式调节患者自身的免疫系统以攻击患者自身的肿瘤细胞。通过这些蛋白质的定量分析提供的癌症患者肿瘤组织免疫谱可用于指示治疗决定，例如将设计用于操纵患者肿瘤免疫应答的癌症治疗剂何时施用于患。
背景技术
许多癌症药物通过抑制驱动肿瘤细胞生长和存活的特定蛋白起作用，但是通常不可能先验地知道哪种蛋白质在给定类型的肿瘤中表达。因此，直接在患者肿瘤组织中检测和定量这些蛋白质可用于指导选择治疗剂或药剂组合，所述治疗剂或药剂组合将抑制肿瘤中的蛋白质活性，并治疗癌症，并对整体患者存活具有积极影响。肿瘤组织中蛋白质(包括组织中存在的分离的肿瘤细胞)的准确和精确检测和定量可以通过质谱分析来进行——使用SRM/MRM分析通过组织显微解剖从患者肿瘤组织中提取的肿瘤细胞中表达的蛋白质来源的特定肽。在检测之前，将蛋白质消化以提供这些特异肽。在肿瘤组织的单个SRM/MRM测定中，量化蛋白质组提供蛋白质表达的“概况”或“特征”，可用于指示肿瘤细胞靶向的癌症治疗剂。用靶向治疗剂指导治疗决定的定量测定的实例是IGF-1R蛋白(参见，例如，美国专利8,728,753)和cMet蛋白(参见，例如，美国专利9,372,195)。
癌症患者对肿瘤的免疫反应涉及许多蛋白质。这些蛋白质在许多不同的细胞类型中正常和异常地表达，例如肿瘤细胞和实体组织中的良性细胞以及淋巴细胞的所有各种谱系。这些蛋白质共同起作用以启动、增强、调节或抑制患者自身对其自身肿瘤细胞的免疫应答。虽然每种蛋白质具有不同的功能，但对免疫系统的影响可取决于哪种细胞正在表达这些蛋白质。在正常情况下，免疫系统通过淋巴细胞依赖性肿瘤细胞杀伤介导的自我与非自我识别的复杂分子信号传导过程来起作用以根除肿瘤细胞。然而，这种复杂的过程可能会被逃避免疫监视的肿瘤细胞扰乱。大量研究已经针对开发小分子和生物治疗剂，其与癌症患者肿瘤免疫应答蛋白相互作用，以试图操纵免疫系统来攻击和杀死肿瘤细胞。靶向免疫调节治疗剂的成功施用将极大地受益于患者免疫系统景观的蛋白质表达“概况”或“特征”，以确定哪些靶蛋白在组织内表达。然后，该免疫谱可以告知哪种治疗剂或药剂组合最有可能提供武装、调节、操纵和/或支持患者免疫系统抵抗肿瘤细胞的最大机会，以获得最佳患者药疗。
被设计用于操纵患者免疫系统的癌症治疗剂的实例包括免疫检查点抑制剂，其把被称为免疫检查点蛋白的蛋白质的收集作为目标。PD-1蛋白是一种免疫检查点蛋白，通常存在于T细胞上，并作为一种“关闭开关”，有助于防止T细胞攻击体内的其他细胞。PD-1通过与PD-L1结合起作用，PD-L1是存在于一些正常(和癌症)细胞表面上的蛋白质。当PD-1与PD-L1结合时，它发信号通知T细胞不攻击表达PD-L1的细胞。一些癌细胞表达大量的PD-L1，对免疫系统掩盖了它们(癌细胞)，并允许它们通过阻止T细胞的攻击来逃避免疫监视。靶向PD-1或PD-L1的单克隆抗体可“揭露”癌细胞并促进针对癌细胞的免疫应答。该癌症治疗策略在治疗某些癌症方面显示出巨大的希望，PD-1抑制剂的实例包括派姆单抗(pembrolizumab(齐内达(Keytruda)))和纳武单抗(nivolumab(欧狄沃(Opdivo)))。这些药物已被证明有助于治疗几种类型的癌症，包括黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌、头颈癌和霍奇金淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)。PD-L1抑制剂的另一个例子是目前用于治疗膀胱癌的阿特珠单抗(atezolizumab(特善奇(Tecentriq)))。这些药物也正在研究用于对抗其他类型的癌症。许多其他针对PD-1或PD-L1的药物目前正在临床试验中进行测试，单独使用或与其他药物联合使用。
CTLA4是某些T细胞上的另一种蛋白质，可作为免疫检查点蛋白，对免疫系统充电或保持免疫系统无效。结合CTLA4的药物的实例是易普利姆玛(ipilimumab(伊匹单抗(Yervoy)))，一种抑制CTLA4并增强身体对肿瘤细胞的免疫应答的单克隆抗体。该药目前用于治疗黑色素瘤，与上述药物一样，也正在研究其他癌症。
这些实例证明了如何将肿瘤细胞和免疫系统细胞的分子状态知识用作有效的靶向免疫癌症治疗策略的一部分。直接从患者肿瘤组织切片获得同源细胞群以进行组织学特定细胞群的分子谱分析的能力是非常有利的，其中，例如，可以研究可能存在于其他类型细胞，包括正常上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞和免疫细胞中的肿瘤细胞。激光捕获显微切割(Laser Capture Microdissection，LCM)技术(参见美国专利6,867,038)允许将肿瘤组织的区室化分子分析精确定义的细胞群。LCM，以及其他商业上可获得的组织显微切割技术，包括DIRECTOR技术(美国专利7,381,440)，通过允许将源自组织样品的细胞的分子概况置于病理相关的背景中，改进了组织样品的分析。
虽然组织显微解剖提供了纯化的肿瘤细胞群，但是当从肿瘤组织不能获得足够的目标细胞以进行可靠的分子分析时，其使用受到限制。许多启动/维持肿瘤免疫反应的蛋白质由少量肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和/或甚至可能不存在于肿瘤组织中的免疫系统细胞表达，因此，在某些情况下，对通过组织显微切割收集的目标细胞的纯细胞群体进行分析可能是不可能的。为了检测肿瘤组织中潜在的免疫调节治疗候选蛋白的存在，可以考虑整个肿瘤微环境，而不仅仅是肿瘤细胞。下述方法提供了生成患者肿瘤组织的分子免疫谱的能力。
发明内容
SRM/MRM测定用于检测和定量直接从癌症患者肿瘤组织制备的蛋白质组裂解物中特定蛋白质的水平。这些蛋白质参与预测最佳的基于免疫的疗法，与对最佳的基于免疫的疗法的阳性响应相关联，和/或启动/抑制/维持/调节癌症患者的肿瘤免疫应答以杀死癌症患者自身的肿瘤细胞。SRM/MRM测定可用于开发癌症患者的免疫系统状态的个性化免疫谱。一旦确定了这些蛋白质的表达状态，就可以向患者施用特定的治疗剂，由此这些药剂与这些免疫系统蛋白质相互作用，以抑制或增强其功能，从而操纵癌症患者自身的免疫系统以杀死患者自身的肿瘤细胞，从而提高患者的存活率。此类免疫系统操纵治疗剂包括生物的和/或小分子试剂，其可以与由目前描述的SRM/MRM测定所确定的癌症患者免疫系统谱直接匹配，提供用于免疫癌症治疗的个性化策略。
提供了确定生物样品中的蛋白质表达谱的方法，所述生物样本为从福尔马林固定的肿瘤组织，所述肿瘤组织来自癌症患者，该方法使用质谱法检测和/或定量由所述生物样品制备的蛋白质消化物中一种或多种蛋白质的水平，所述蛋白质起到启动、维持、增强、抑制或以其他方式调节人类免疫系统的作用；并计算所述生物样品中所述蛋白质的水平；其中，所述水平是相对水平或绝对水平，并且其中，所述一种或多种蛋白质选自由B7-1、B7H2、β-连环蛋白、CALR、CCR4、CD133、CD137、CD137L、CD166、CD28、CD38、CD3G、CD40、CD40L、CD47、CD68、CD70、CD73、CD8A、CEACAM5、cMYC、COX-2、CXCR4、CXCR7、DNMT1、EZH2、GBP2、HMGB1、INFGR2、IL13RA2、IRF1、MyD88、NAMPT、NAPRT1、NYESO1、OX40L、PD-1、STAT3、Beclin-1、PHD2、PI3Kβ、PI3Kδ、PI3Kγ、CEACAM1、IFNY、STK11、BTK、ARG1、TDO、TGFβ1、CD16、OX40、IL-2、SLFN11、CD39、CD44、CSF1R、GZMB、PRF1、CD206、GNLY、CD3Z、ATF3、TLR8、CD19和CTLA所组成的组中。
可以在检测和/或定量所述一种或多种片段肽的含量之前对消化物进行分级，并且分级的步骤可以是例如液相色谱、纳米反相液相色谱、高效液相色谱或反相高效液相色谱。可以通过液体组织方案(Liquid Tissue protocol)制备生物样品的蛋白质消化物。蛋白质消化物可包括蛋白酶消化物，例如胰蛋白酶消化物。
质谱法可以是，例如，串联质谱、离子阱质谱、三重四极杆质谱、离子阱/四极杆混合质谱、MALDI-TOF质谱、MALDI质谱和/或飞行时间质谱。所用的质谱模式可以是选择反应监测(SRM)、多重反应监测(MRM)、智能选择反应监测(iSRM)和/或多重选择反应监测(mSRM)。
在这些方法中，片段肽可以选自由SEQ ID NO：1-11的任意肽或所有肽所组成的组中。更具体地，可以从每种蛋白质中选择以下肽：B7-1(SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2)、B7H2(SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4)、β-连环蛋白(SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6)、CALR(SEQ ID NO7、SEQ ID NO 8)、CCR4(SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10)、CD133(SEQ ID NO 11、SEQ ID NO12)、CD137(SEQ ID NO 13)、CD137L(SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15)、CD166(SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17)、CD28(SEQ ID NO 18)、CD38(SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 20))、CD3G(SEQ IDNO 21、SEQ ID NO 22)、CD40(SEQ ID NO 23)、CD40L(SEQ ID NO 24)、CD47(SEQ ID NO 25、SEQ ID NO 26)、CD68(SEQ ID NO 27、SEQ ID NO 28)、CD70(SEQ ID NO 29)、CD73(SEQ IDNO 30、SEQ ID NO 31)、CD8A(SEQ ID NO 32、SEQ ID NO 33)、CEACAM5(SEQ ID NO 34)、cMYC(SEQ ID NO 35、SEQ ID NO 36)、COX-2(SEQ ID NO 37、SEQ ID NO 38)、CXCR4(SEQ IDNO 39)、CXCR7(SEQ ID NO 40、SEQ ID NO 41)、DNMT1(SEQ ID NO 42、SEQ ID NO 43)、EZH2(SEQ ID NO 44、SEQ ID NO 45)、GBP2(SEQ ID NO 46、SEQ ID NO 47)、HMGB1(SEQ ID NO48、SEQ ID NO 49)、INFGR2(SEQ ID NO 50、SEQ ID NO 51)、IL13RA2(SEQ ID NO 52、SEQID NO 53)、IRF1(SEQ ID NO 54、SEQ ID NO 55)、MyD88(SEQ ID NO 56、SEQ ID NO 57)、NAMPT(SEQ ID NO 58、SEQ ID NO 59)、NAPRT1(SEQ ID NO 60、SEQ ID NO 61)、NYESO1(SEQID NO 62、SEQ ID NO 63)、OX40L(SEQ ID NO 64、SEQ ID NO 65)、PD-1(SEQ ID NO 66)、STAT3(SEQ ID NO 67)、Beclin-1(SEQ ID NO 68)、PHD2(SEQ ID NO 69、SEQ ID NO 70)、PI3Kβ(SEQ ID NO 71、SEQ ID NO 72)、PI3Kδ(SEQ ID NO 73、SEQ ID NO 74)、PI3Kγ(SEQID NO 75、SEQ ID NO 76)、CEACAM1(SEQ ID NO 77、SEQ ID NO 78)、IFNΥ(SEQ ID NO 79、SEQ ID NO 80)、STK11(SEQ ID NO 81、SEQ ID NO 82)、BTK(SEQ ID NO 83、SEQ ID NO84)、ARG1(SEQ ID NO 85、SEQ ID NO 86)、TDO(SEQ ID NO 87、SEQ ID NO 88)、TGFβ1(SEQID NO 89、SEQ ID NO 90)、CD16(SEQ ID NO 91、SEQ ID NO 92)、OX40(SEQ ID NO 93)、IL-2(SEQ ID NO 94)、SLFN11(SEQ ID NO 95、SEQ ID NO 96)、CD39(SEQ ID NO 97、SEQ ID NO98)、CD44(SEQ ID NO 99、SEQ ID NO 100)、CSF1R(SEQ ID NO 101、SEQ ID NO 102))、GZMB(SEQ ID NO 103、SEQ ID NO 104)、PRF1(SEQ ID NO 105、SEQ ID NO 106)、CD206(SEQ IDNO 107、SEQ ID NO 108)、GNLY(SEQ ID NO 109、SEQ ID NO 110)、CD3Z(SEQ ID NO 111、SEQ ID NO 112)、ATF3(SEQ ID NO 113、SEQ ID NO 114)、TLR8(SEQ ID NO 115、SEQ ID NO116)、CD19(SEQ ID NO 117、SEQ ID NO 118)和CTLA4(SEQ ID NO 119)。
在上述方法中，组织可以是石蜡包埋的组织。组织可以从肿瘤获得，例如原发性肿瘤或继发性肿瘤。
优选地，定量至少一种片段肽。定量片段肽可以通过例如将一种生物样品中所述片段肽的含量与不同且单独的生物样品中相同片段肽的含量进行比较来实现。在另一种定量方法中，通过与添加的具有相同氨基酸序列的已知量的内标肽进行比较来确定生物样品中片段肽的含量。内标肽可以是同位素标记的肽，例如含有选自18O、17O、34S、15N、13C和2H或其组合中的一种或多种重稳定同位素的肽。
检测和/或定量蛋白质消化物中至少一种片段肽的含量可用于指示受试者中存在相应的蛋白质以及与癌症的关联。检测和/或定量至少一种片段肽的含量的结果或相应蛋白质的水平可以与癌症患者的免疫系统的活化状态相关联。该相关联的步骤可以与检测和/或定量其他蛋白质的来自其他蛋白质肽的含量相组合，以提供关于癌症患者的肿瘤细胞的分子状态的额外信息。
这些方法中的任何一种可以与向获得生物样品的患者或受试者施用治疗有效量的癌症治疗剂相结合，其中，所施用的癌症治疗剂和/或癌症治疗剂的用量基于来自蛋白质列表的SEQ ID NO 1-119的任何一种或多种(多重)片段肽的检测和/或含量，其中，癌症治疗剂是免疫调节癌症治疗剂，其与一种或多种蛋白质相互作用以启动、增强、操纵和/或以其他方式调节癌症患者免疫应答以攻击和杀死患者肿瘤细胞。来自蛋白质列表的SEQ IDNO 1-119中的任何一种或多种(多重)片段肽的检测和/或含量可用于预测用一种或多种免疫调节癌症治疗剂治疗的患者的治疗结果。所述免疫调节癌症治疗剂与一种或多种蛋白质相互作用以启动、增强、操纵和/或以其他方式调节癌症患者免疫应答以攻击和杀死患者肿瘤细胞。
在这些方法中，检测和/或定量来自蛋白质列表的SEQ ID NO 1-119中的任何一种或多种(多重)片段肽可用于检测阳性免疫系统激活状态，凭此，患者免疫系统积极检测、攻击和杀死患者自身的肿瘤细胞。
这些方法可以与驱动患者肿瘤细胞生长的其他癌蛋白的分析相结合，其中，抑制或调节癌蛋白功能以抑制患者肿瘤细胞生长的靶向癌症治疗剂同时施用于患者，并与免疫调节癌症治疗剂组合，所述免疫调节癌症治疗剂与一种或多种蛋白质相互作用以启动、增强、操纵和/或以其他方式调节癌症患者免疫应答以攻击和杀死患者肿瘤细胞。
具体实施方式
提供了用于特定质谱-SRM/MRM测定的方法和组合物，其可用于开发癌症患者的免疫谱。检测来自免疫调节蛋白的特异性蛋白酶消化的肽，并在直接从患者肿瘤组织制备的蛋白质组裂解物中精确定量。该过程和测定可用于分析患者肿瘤的免疫景观，并用最佳癌症治疗剂指导改进的治疗方法，所述癌症治疗剂引发并支持针对患者自身肿瘤细胞的活跃且成功的免疫应答。具体地，该方法包括：从癌症患者获得生物样品，例如，福尔马林固定的石蜡包埋的肿瘤组织；从肿瘤组织收集细胞，任选地使用组织显微切割；从收集的细胞制备用于质谱分析的裂解物(使用，例如，美国专利号7,473,532中描述的液体组织试剂和方案)；使用SRM/MRM测定分析裂解物，其中，所述测定可以单独进行或多重进行；并利用来自SRM/MRM测定的蛋白质检测/定量数据来开发免疫谱。这些方法产生SRM/MRM测定数据，其可用于确定患者的改进的治疗方法，其中，选择直接与一种或多种通过SRM/MRM测定检测和/或定量的蛋白质相互作用来启动、调节、影响、增强和以其他方式操纵患者的免疫系统的治疗剂。
可以对多种源自患者的样品进行所述SRM/MRM测定以确定患者免疫谱，所述样品包括但不限于血液、尿液、痰、胸腔积液、肿瘤周围的炎性液体、正常组织和/或肿瘤组织。虽然可以分析所有这些类型的源自患者的生物样品，但优选地，所述样品是福尔马林固定的石蜡包埋(“FFPE”)的患者肿瘤组织。
手术切除的组织的甲醛/福尔马林固定是迄今为止在全世界保存癌组织样品的最常用方法，并且是标准病理学实践中公认的惯例。甲醛水溶液称为福尔马林。“100％”福尔马林由在水中的饱和甲醛溶液(约40体积％或37质量％)和少量限制氧化和聚合度的稳定剂(通常为甲醇)组成。保存组织的最常见方式是将整个组织在甲醛水溶液(通常称为10％中性缓冲福尔马林)中浸泡一段时间(8小时至48小时)，然后将固定的整个组织包埋在石蜡中，并在室温下长期储存。分析福尔马林固定的癌组织的分子分析方法可能是用于分析癌症患者组织的最被接受和最常用的方法。
用于研究癌症患者组织，特别是FFPE组织中蛋白质表达的最广泛使用的常规方法是免疫组织化学(IHC)。IHC方法使用基于抗体的检测。IHC测试的结果通常由病理学家或组织学家解释，并且这种解释是主观的并且不能提供可以预测对靶向特定蛋白质的治疗剂的敏感性的定量数据。此外，涉及IHC检测的研究，例如Her2 IHC检测，表明从这些检测中获得的结果可能是错误的或误导性的。这很可能是因为不同的实验室使用不同的规则来分类阳性和阴性IHC状态。每个进行测试的病理学家也可以使用不同的标准来确定结果是正面还是负面。在大多数情况下，当测试结果处于临界状态时会发生这种情况，即结果既不是强阳性也不是强阴性。在其他情况下，存在于癌组织切片的一个区域中的细胞可以测试阳性，而癌组织切片的不同区域中的细胞可以测试阴性。
不准确的IHC测试结果可能意味着被诊断患有癌症的患者不能得到最好的护理。如果肿瘤组织的全部或特定区域/细胞对特定蛋白质确实是阳性但测试结果将其归类为阴性，则医生不太可能对患者进行正确的治疗。如果肿瘤组织对于特定蛋白质的表达确实是阴性但测试结果将其归类为阳性，则医生可以使用特定的疗法治疗，即使患者不仅不太可能获得任何益处而且还暴露于该药剂的次要风险。因此，精确检测和正确评估肿瘤组织中特定免疫蛋白的定量水平的能力具有很大的临床价值，这样患者将有最大的机会接受成功的免疫调节治疗方案，同时减少不必要的毒性和其他副作用。
在质谱仪中通过SRM/MRM方法可非常有效地确定肿瘤组织中特定的基于免疫的蛋白质的定量水平的精确检测和正确评估。该方法检测并量化来自特定蛋白质的独特片段肽，包括基于免疫的蛋白质，其中，每种肽的SRM/MRM特征色谱峰面积在存在于例如液体组织裂解物中的复合肽混合物中进行测定(参见美国专利NO.7,473,532)。美国专利No.7,473,532中描述的方法可以使用从Expression Pathology Inc.(Rockville,MD)获得的液体组织试剂(Liquid Tissue reagents)和方案合宜地实施。通过SRM/MRM方法确定蛋白质的定量水平，其中，将来自生物样品中每种蛋白质的单个特定肽的SRM/MRM特征色谱峰面积与已知量的每种单个片段肽的“掺入”内标的SRM/MRM特征色谱峰面积进行比较。
在一种实施方式中，“掺入”内标是相同的精确蛋白质衍生的片段肽的合成版本，其中，所述合成肽含有用一种或多种重同位素标记的一个或多个氨基酸残基，例如2H、18O、17O、15N、13C或其组合。合成这种同位素标记的内标，从而使得质谱分析产生可预测且一致的SRM/MRM特征色谱峰，其与天然片段肽色谱特征峰不同且可区分，并且其可用作比较物峰。因此，当内标物以已知量“掺入”生物样品中的蛋白质或肽制剂并进行质谱分析时，将天然肽的SRM/MRM特征色谱峰面积与内标肽的SRM/MRM特征色谱峰面积进行比较，数值的比较表明来自生物样品的原始蛋白质组制剂中存在的天然肽的绝对摩尔浓度和/或绝对重量。根据每个样品分析的蛋白质组裂解物的含量显示片段肽的定量数据。
为了开发和执行针对给定蛋白质的片段肽的SRM/MRM测定，可以通过质谱仪利用除了单纯的肽序列的额外信息。该额外信息用于指导和指示质谱仪(例如，三重四极杆质谱仪)执行特定片段肽的正确和聚焦分析。关于目标肽的额外信息可包括以下一种或多种：每种肽的单同位素质量；其前体电荷状态；前体m/z值；m/z过渡离子；和每个过渡离子的离子类型。该额外信息为质谱仪提供了正确的指令，以允许分析非常复杂的蛋白质裂解物中的单个分离的目标肽。可以在三重四极杆质谱仪或离子阱/四极杆混合质谱仪上有效地进行SRM/MRM测定。目前，这些类型的质谱仪被认为是用于分析非常复杂的蛋白质裂解物中的单个分离的目标肽的最合适的仪器，所述蛋白质裂解物可以由包括在细胞内的所有蛋白质的数十万至数百万个单个肽组成。然而，SRM/MRM测定可以在其他类型的质谱仪上开发和执行，包括MALDI、离子阱、离子阱/四极杆混合或三重四极杆仪器。
用于检测和定量生物样品中的特定蛋白质的单一SRM/MRM测定的基础是鉴定和分析衍生自更大的全长蛋白质版本的一种或多种片段肽。这是因为质谱仪在分析诸如单个片段肽的非常小的分子时，是高效、熟练和可再现的仪器，而质谱仪不能有效、熟练或可重复地检测和定量全长的完整蛋白质。一个肽分子来自一个蛋白质分子，因此测量片段肽的摩尔量可直接测量相应蛋白质的摩尔量。
可以开发用于单个蛋白质的单个SRM/MRM测定的候选肽，理论上，是通过完整蛋白酶消化完整全长蛋白质产生的每个单独的肽，例如用胰蛋白酶消化。然而，对于给定蛋白质，通过SRM/MRM测定的最优选的肽，以及关于每种肽的专门定义的分析特征，不是先验可预测的，而且必须凭经验发现和确定。还发现对于某些蛋白质，目前尚未鉴定出可用于检测和可重复定量相应蛋白质的肽。
当鉴定用于在蛋白质裂解物(例如来自福尔马林固定石蜡包埋组织的液体组织裂解物)中分析的最佳SRM/MRM肽时，这种缺乏可预测性更是如此。目前描述的SRM/MRM测定法为每种蛋白质指定一种或多种蛋白酶消化的肽(胰蛋白酶消化的肽)，由此已经确定了每种肽是用于从福尔马林固定的患者组织制备的液体组织裂解物中的SRM/MRM测定的优选肽。每种鉴定的肽可以重复地检测和定量。
目前描述的SRM/MRM测定法检测和定量蛋白质可用于生成患者肿瘤组织微环境的免疫谱。该蛋白质集合提供多种功能，其启动、抑制、维持、调节和结合/预测最优选或至少优选的治疗剂以诱导成功的个体化肿瘤免疫应答。这些蛋白质包括但不限于生长因子、生长因子受体、细胞外基质蛋白、核转录因子、上皮细胞分化因子、免疫细胞分化因子、细胞/细胞识别因子、自身对肿瘤识别因子、免疫细胞激活因子、免疫细胞抑制因子和免疫检查点蛋白。这组蛋白质中的这些单独蛋白质中的每一种都可以由癌症患者中的多种细胞表达，包括但不限于所有种类的实体组织细胞，例如上皮肿瘤细胞、正常上皮细胞、正常成纤维细胞、肿瘤相关成纤维细胞、正常内皮细胞、肿瘤相关内皮细胞、正常间充质细胞和肿瘤相关间充质细胞。
这些蛋白质中的每一种也可以由多种血液生成的白细胞表达，包括但不限于所有种类的淋巴细胞，例如B细胞、T细胞、巨噬细胞、树突、肥大细胞、自然杀伤细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和嗜碱性粒细胞。在许多情况下，这些单独的蛋白质中的每一种都可以由实体组织细胞和血液生成的组织细胞表达。
根据个体的健康状况，这些蛋白质中的每一种的细胞表达模式可以非常不同。在正常和通常的健康条件下，这些蛋白质维持健康的免疫系统，其中，自身的细胞识别与非自身的识别平衡，主要通过主要组织相容性复合物(MHC)。MHC是一组细胞表面蛋白，对于免疫系统识别脊椎动物中的外来分子至关重要，这反过来决定了组织相容性。
MHC分子的主要功能是结合来自病原体的肽片段并将其展示在细胞表面上以供适当的T细胞识别，从而可以针对病原体进行免疫应答。MHC分子介导作为免疫细胞的白细胞与其他白细胞或实体组织体细胞的相互作用。MHC确定对用于器官移植的供体的兼容性，以及通过交叉反应免疫接种对自身免疫疾病的易感性。在人类中，MHC也称为人白细胞抗原(HLA)。在细胞中，宿主自身表型或其他生物实体的蛋白质分子不断合成和降解。细胞表面上的每个MHC分子显示蛋白质的分子碎片，称为表位。提供的抗原可以是自身的或非自身的。如果抗原被识别为自身，那么就会阻止生物体的免疫系统以免疫杀伤应答的方式靶向其自身细胞。
MHC不仅可以保护身体免受病原体侵害，还可以在癌细胞的自然控制中发挥重要作用。癌细胞含有许多突变蛋白和异常表达的蛋白质，可由MHC显示以提醒免疫系统。肿瘤细胞也可以表达正常蛋白质，但是在不寻常的地方、以不寻常的方式和/或以异常的含量提供信号以动员或抑制免疫应答。正常细胞将显示来自其I类MHC的正常细胞蛋白质周转的肽，并且免疫系统细胞(白细胞)将不会被响应，因为中枢和外周耐受机制由白细胞表面正常表达的特定蛋白质介导。当细胞表达外来蛋白质时，例如在病毒感染后或在癌细胞表达异常蛋白质的情况下，I类MHC的一部分将在细胞表面上展示这些肽。因此，那些对MHC：肽复合物特异的白细胞将识别并杀死那些细胞，包括呈现异常肽的癌细胞。或者，I类MHC本身可以作为白细胞群的抑制性配体，称为自然杀伤细胞(NKs)，杀死病毒感染的细胞和癌细胞。表面I类MHC的正常水平的降低，这是一些病毒在免疫逃逸期间或某些肿瘤中使用的机制，将通过灭活NK介导的细胞杀伤来帮助肿瘤细胞逃避免疫介导的杀伤。
癌细胞可以通过其他方式逃避免疫介导的杀伤。利用另一种策略来逃避免疫监视的癌细胞的一个例子是癌细胞异常表达PD-L1检查点蛋白。程序性死亡配体1(PD-L1)是跨膜蛋白，其在特定事件期间(例如妊娠、组织同种异体移植物、自身免疫疾病和其他疾病状态，例如癌症)在抑制免疫系统中起主要作用。通常，免疫系统对外来抗原起反应，其中，该外来抗原在淋巴结或脾中存在一些积累，引发表达PD-1的抗原特异性CD8+T细胞的增殖。PD-L1与PD-1的结合传递抑制信号，降低这些CD8+T细胞的增殖，从而发信号通知免疫系统忽视癌细胞。
癌细胞上调PD-L1的异常表达允许癌细胞逃避宿主免疫系统。对来自肾细胞癌患者的196个肿瘤标本的分析发现，PD-L1的高肿瘤表达与肿瘤侵袭性增加和死亡风险增加4.5倍相关。PD-L1表达较高的卵巢癌患者预后显著低于表达较低的患者。还已知PD-L1表达与上皮内CD8+T淋巴细胞计数反相相关，表明肿瘤细胞上的PD-L1可以抑制抗肿瘤CD8+T细胞。许多PD-L1抑制剂现在用于常规癌症治疗或者作为基于免疫的癌症治疗剂开发，而且这些药物在许多患者中显示出良好的反应率。
基于免疫的癌症治疗策略旨在启动、调节、加强或操纵患者自身的免疫系统，以对抗和杀死患者自身的癌细胞。许多形式的免疫疗法正在成为治疗癌症的强有力的新方法。本文所述的SRM/MRM测定方法提供了提供定量蛋白质表达数据的能力，例如，患者肿瘤细胞中的PD-L1/PD-1免疫检查点蛋白质，以基于免疫的癌症治疗剂为潜在的治疗策略提供信息，所述癌症治疗剂用作启动和/或调节肿瘤激活的免疫应答平衡。在PCT/US2015/010386中描述了针对PD-L1蛋白的免疫检查点蛋白的单一SRM/MRM测定的实例。
目前描述的SRM/MRM测定法检测和定量由许多不同细胞类型表达的独特蛋白质的表达，其中每种蛋白质参与启动和/或调节免疫系统对癌细胞的反应。每种测定描述了至少一种被鉴定用于检测和测量单一蛋白质的最佳肽，由此每种测定可以单独进行或与其他蛋白质多重进行。蛋白质和肽列表如表1所示。这些测定已经开发的蛋白质在表1中通过一个或多个常见和/或替代名称列出：
B7-1(分化群80，CD80)，
B7H2(分化群275，CD275)，
β-连环蛋白，
CALR(钙网蛋白，钙调蛋白)，
CCR4(分化群194，CD194)，
CD133(分化群133)，
CD137(分化群137，TNFRSF9)，
CD137L(分化群137配体)，
CD166(分化群166，CD6L，MEMD)，
CD28(分化群28)，
CD38(分化群38，环状ADP核糖水解酶)，
CD3G(分化群3G)，
CD40(分化群40)，
CD40L(分化群40配体，CD154)，
CD47(分化群47，整合素相关蛋白)，
CD68(分化群68)，
CD70(分化群70，
CD73(分化群73，5'-外侧核苷酸酶(ecto-5'nucleotidas))，
CD8A(分化群8A)，
CEACAM5(癌胚抗原相关细胞粘附分子5，CD66E)，
cMYC(v-原癌基因禽类骨髓细胞瘤病毒致癌基因同源物((v-myc avianmyelocytomatosis viral oncogene homolog))，
COX-2(环加氧酶2)，
CXCR4(分化群184，
CXCR7(C-X-C趋化因子受体7型，GPR159)，
DNMT1(DNA胞嘧啶-5-甲基转移酶1)，
EZH2(组蛋白甲基化转移酶2(enhancer of zeste hornolog 2))，
GBP2(干扰素诱导的鸟苷酸结合蛋白2)，
HMGB1(高迁移率族蛋白1)，
IFNGR2(干扰素γ受体2)，
IL13RA2(白细胞介素-13受体亚基α-2)，
IRF1(干扰素调节因子1)，
MyD88(髓样分化初级应答基因88)，
NAMPT(烟酰胺磷酸核糖转移酶)，
NAPRT1(烟酸磷酸核糖基转移酶)，
NYESO1(纽约食管鳞状细胞癌1)，
OX40L(分化群252)，
PD-1(程序性细胞死亡蛋白-1)，
STAT3(信号转导和转录激活因子3)，
Beclin-1(BECN1)，
PHD2(含有脯氨酰羟化酶结构域的蛋白质2)，
PI3Kβ(磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶-β)，
PI3Kδ(磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶-δ)，
PI3Kγ(磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶-γ)，
CEACAM1(癌胚抗原相关细胞粘附分子1，分化群66a，CD66a)，
IFNγ(干扰素II型)，
STK11(肝激酶B1，LKB1)，
BTK(布鲁顿酪氨酸激酶)，
ARG1(精氨酸酶)，
TDO(色氨酸2,3-双加氧酶)，
TGFβ1(转化生长因子β1)，
CD16(分化群16，FCGR3A)，
OX40(CD134，肿瘤坏死因子受体超家族成员4)，
IL-2(白细胞介素2)，
SLFN11(Schlafen家庭成员11)，
CD39(外侧核苷三磷酸二磷酸氢酶-1(Ectonucleoside triphosphatediphosphohydrolase-1))，
CD44(吞噬糖蛋白-1)，
CSF1R(集落刺激因子1受体)，
GZMB(颗粒酶B)，
PRF1(穿孔蛋白-1)，
CD206(甘露糖受体)，
GNLY(粒溶素)，
CD3Z(T细胞受体T3ζ链)，
ATF3(环AMP依赖性转录因子)，
TLR8(Toll样受体8)，
CD19(B淋巴细胞抗原CD19)和
CTLA4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4)。
令人惊讶的是，发现来自表1中列出的蛋白质的许多潜在肽序列不适合或是无效的在用于基于质谱的SRM/MRM测定时，其原因不是一目了然的。由于无法预测最适合MRM/SRM分析的肽，因此有必要在实际液体组织裂解液中通过实验鉴定可能的、修饰的和未修饰的肽，以便为每种指定蛋白开发可靠、准确的SRM/MRM分析。虽然不希望受任何理论的束缚，但据信一些肽可能例如难以通过质谱法检测，因为它们不能很好地电离或产生不同于其他蛋白质的片段。肽在色谱分离中也可能不能很好地分辨，或者可能粘附在玻璃或塑料制品上。
表1中发现的肽衍生自它们各自的指定蛋白质，通过蛋白酶消化由从福尔马林固定的癌组织获得的细胞制备的复合液体组织裂解物中的所有蛋白质制备。除非另有说明，否则在每种情况下蛋白酶都是胰蛋白酶。然后通过质谱法分析液体组织裂解物，以确定来自通过质谱法检测和分析的指定蛋白质的那些肽。用于质谱分析的特定优选肽子集的鉴定基于在实验条件下的发现的一个或多个肽，其中，该一个或多个肽来自液体组织裂解物的质谱分析中蛋白质的电离，并因此证明在液体组织裂解物制备中使用的该方案和实验条件产生的肽能够用于通过质谱方法的分析。
该蛋白质集合的最优选肽如下所示。使用液体组织试剂和方案制备来自直接从福尔马林(甲醛)固定组织获得的细胞的蛋白质裂解物，所述方法包括：通过组织显微切割将细胞收集到样品管中，然后在液体组织缓冲液中加热细胞一段延长的时间。一旦福尔马林诱导的交联受到负面影响，然后使用蛋白酶以可预测的方式将组织/细胞消化至完成，例如，包括但不限于胰蛋白酶。通过用蛋白酶消化完整多肽，将每种蛋白质裂解物转变成肽集合。分析每种液体组织裂解物(例如，通过离子阱质谱法)以进行肽的多个全局蛋白质组学调查，其中，数据以通过质谱法能够从每种蛋白裂解物中存在的所有细胞蛋白质鉴定尽可能多的肽的鉴定而呈现。通常使用离子阱质谱仪或另一种形式的质谱仪，其能够进行全局分析以从单一复合蛋白质/肽裂解物中鉴定尽可能多的肽。然而，离子阱质谱仪可能是用于进行肽的全局分析的最佳类型的质谱仪。
一旦在所用条件下在单个裂解物的单个MS分析中鉴定出尽可能多的肽，则对该肽列表进行整理并用于确定在该裂解物中检测到的蛋白质。对多个液体组织裂解物重复该过程，并将非常大的肽列表整理成单个数据集。这种类型的数据集可以被认为是代表可以通过质谱法检测的在所分析的生物样品类型中(在蛋白酶消化后)，特别是在生物样品的液体组织裂解物中检测的肽，因此包括肽对于每种指定的蛋白质。
在一种实施方式中，鉴定为可用于测定指定蛋白质的绝对或相对量的胰蛋白酶肽列于表1中。通过质谱法检测在由福尔马林固定，石蜡包埋的组织制备的液体组织裂解物中这些肽中的每一种。因此，每种肽可用于开发人生物样品中指定蛋白质的定量SRM/MRM测定，包括直接在福尔马林固定的患者组织中。
通过分析离子阱和三重四极杆质谱仪上的所有片段肽，开发了来自每种指定蛋白质的特定片段肽的特异性和独特特征。这一信息必须通过实验来确定直接从福尔马林固定样品/组织中提取的液体组织裂解液中的每一个候选SRM/MRM肽；因为，有趣的是，并非使用如本文所述的SRM/MRM在这样的裂解物中均能检测到来自任何指定蛋白质的所有肽，表明未检测到的片段肽不能被认为是用于开发用于定量肽/蛋白质的SRM/MRM测定的候选肽。直接在福尔马林固定样品/组织的液体组织裂解液中。
给定肽的特定转变离子特征不仅可用于检测特定片段肽，而且可用于在福尔马林固定的生物样品中定量测量该片段肽。这些数据表明该片段肽的绝对量是所分析的每微克蛋白质裂解物的肽摩尔量的函数。基于福尔马林固定的患者来源组织的分析评估组织中的相应蛋白质水平可以提供关于每个特定患者的诊断、预后和治疗相关信息。
在一种实施方式中，提供了用于测量生物样品中表1中列出的每种蛋白质的水平的方法，包括使用质谱法检测和/或定量从生物样品制备的蛋白质消化物中的一种或多种片段肽的含量；并计算所述样品中经修饰或未经修饰的蛋白质的水平；其中，所述水平是相对水平或绝对水平。在一种相关的实施方式中，定量一种或多种修饰的或未修饰的片段肽包括通过与添加的已知量的内标肽比较来确定生物样品中每种片段肽的含量，其中，将生物样品中的每种片段肽与具有相同氨基酸序列的内标肽进行比较。在一些实施方式中，内标是同位素标记的内标肽，其包含选自18O、17O、34S、15N、13C、2H或其组合中的一种或多种重稳定同位素。因为一分子的给定肽衍生自一个单独分子的蛋白质，所以肽的摩尔量是存在的蛋白质的摩尔量的直接量度。
用于测量本发明所述的生物样品(或片段肽作为其替代物)指定蛋白质水平的方法，可用作患者或受试者中癌症的诊断指示剂。在一种实施方式中，指定蛋白质水平的测量结果可以用来确定诊断癌症的分期/分级/状态，通过将组织中发现的蛋白质水平与正常和/或癌症或癌前组织中发现的蛋白质水平相关联(例如比较)来确定。在另一种实施方式中，可以使用来自指定蛋白质水平的测量结果来确定治疗癌症患者使用哪种癌症治疗剂，从而确定最佳癌症治疗方案。
组织免疫景观是高度复杂的，其中，需要对由多种类型的实体组织细胞和局部/非定位的免疫细胞表达的多种蛋白质进行多种测定，用于多种治疗剂标志(indication)。可以通过本发明所述的SRM/MRM测定能够分析该蛋白质测定复杂化的水平。这些分析旨在同时检测和定量许多具有多种分子功能的不同蛋白质，包括但不限于可溶性蛋白质、膜结合蛋白、核因子、分化因子、调节细胞与细胞相互作用的蛋白质、分泌蛋白质、免疫检查点蛋白、免疫抑制蛋白、细胞因子和淋巴细胞激活/抑制因子。
组织显微切割优选地用于从患者肿瘤组织获得纯的肿瘤细胞群，用于使用所述SRM/MRM测定进行蛋白质表达分析，以确定特异性定义患者肿瘤细胞状态的免疫谱。可以利用DIRECTOR技术，使用激光诱导的细胞和细胞群的正向转移的过程，进行肿瘤组织的组织显微切割。美国专利NO.7,381,440描述了使用DIRECTOR载玻片通过利用能量转移夹层涂层激光诱导组织向前转移的方法，其内容通过引用整体并入本文。然而，显微切割纯肿瘤细胞群预期杀死肿瘤细胞，即肿瘤浸润淋巴细胞(TILS)，但很可能忽略了所述细胞的蛋白质表达特征/谱。这种限制可以通过如下方式克服：利用组织显微切割获得除了纯肿瘤细胞群之外，还可以获得纯TILs群体，从而可以收集含有大量TIL群体的组织区域，并使用所描述的SRM/MRM分析进行蛋白质表达分析。通过收集和分析两个不同的细胞群，可以确定患者的免疫谱，以告知患者的优选或最优选的治疗方案，由此可以通过特异性免疫调节剂调节免疫系统，以获得最佳的免疫介导的肿瘤细胞杀伤和可以通过靶向治疗剂和/或免疫介导的肿瘤细胞杀伤来靶向肿瘤细胞。
虽然组织显微切割产生来自患者组织的特定细胞群的纯种群，用于SRM/MRM分析，但是大多数肿瘤组织未显示有适当大面积的不同TIL群体用于显微切割。在大多数情况下，TIL稀疏地散布在异质复杂组织微环境中，因此，可以有效地分析相对纯的肿瘤细胞群，但是通常无法有效地分析纯TILs群体。衍生自肿瘤组织的TIL表达许多蛋白质，这些蛋白质对于使用免疫系统调节剂对免疫应答的积极操纵有重要意义，因此应对其进行分析。这种限制可以通过从患者组织内存在的肿瘤微环境的整个区域制备用于所述SRM/MRM测定的可分析蛋白质裂解物来克服。该裂解物含有许多不同细胞类型的整个复杂环境的蛋白质组学的表现，所述细胞类型包括但不限于肿瘤细胞、良性非肿瘤细胞和免疫细胞。以这种方式，捕获患者肿瘤环境的整个免疫景观，可以确定高度复杂的患者特异性免疫谱。此外，对来自相同组织的连续切片的组织显微切割收集的肿瘤细胞的纯化群体的分析，可以与整个肿瘤微环境景观进行比较和对比。该方法在功能上将肿瘤细胞谱与免疫细胞谱分开，以鉴定最可能由组织样品中不存在的定位的TIL和/或免疫细胞表达的免疫应答蛋白，以及这些蛋白可能对肿瘤免疫景观产生的影响。
本发明所述的SRM/MRM测定检测和定量由实体瘤组织制备的裂解物中特定蛋白质的表达；然而，除非收集和分析纯细胞群，否则这些测定不能提供关于哪些细胞表达哪种蛋白质的详细信息。这可能是重要的，因为异常蛋白质表达在肿瘤微环境中是常见的，例如当肿瘤细胞表达通常仅由正常细胞、正常淋巴细胞和/或TIL表达的免疫抑制因子时。因此，当通过所述SRM/MRM测定检测和定量候选治疗性蛋白质靶标的表达时，可能需要后续测定以提供缺失的细胞定位信息。实现细胞表达背景的方法是免疫组织化学。了解哪些蛋白质在肿瘤微环境中表达以及哪些细胞表达这些蛋白质可以有利地通知最佳治疗决策以调节患者自身的免疫应答以寻找并杀死肿瘤细胞。本发明所述的SRM/MRM测定和分析方法提供了直接在患者肿瘤组织中检测和定量免疫调节癌症治疗剂的蛋白质靶标的能力。
用于肿瘤细胞杀伤的优选方法是使用组合疗法，其中，免疫调节剂与肿瘤细胞靶向剂协同使用以获得最佳患者反应。SRM/MRM测定可用于确定已开发出抑制性治疗剂的癌蛋白靶标在患者肿瘤组织中的定量表达状态。使用SRM/MRM测定确定癌蛋白定量状态的实例描述了Met蛋白(参见美国专利9,372,195)和IGF-1R蛋白(参见美国专利8,728,753)。药物克唑替尼(crizotinib)和卡博替尼(cabozantinib)抑制Met蛋白功能，而费给木单抗(figitumumab)和西妥木单抗(cixutumumab)抑制IGF-1R蛋白功能。来自这些测定的信息可以与来自本发明所述的SRM/MRM测定的信息组合以理解肿瘤组织的免疫状态。两个数据集可以一起用于给靶向和基于免疫的组合治疗方法告知治疗方案。因此，例如，如果通过SRM/MRM方法确定患者的肿瘤细胞过量表达PD-L1蛋白和Met蛋白，那么逻辑组合治疗方案可能包括施用纳武单抗(nivolumab)(PD-1抑制剂)或阿特珠单抗(atezolizumab)(PD-L1抑制剂)与克唑替尼(Met抑制剂)组合。这种方法的结果是最佳地利用特异性靶向和杀死肿瘤细胞的治疗剂，同时武装患者免疫系统以攻击和杀死肿瘤细胞。
因为可以从相同的液体组织生物分子制剂分析核酸和蛋白质，所以可以使用本发明所述的SRM/MRM测定，分析相同样品中的核酸，生成关于药物治疗决定的额外信息。通过本发明所述的SRM/MRM测定可以发现某些细胞以增加的水平表达特定蛋白质，同时可以获得关于特定基因和/或它们编码的核酸和蛋白质(例如，mRNA分子及其表达水平或剪接变异)的突变状态的信息。那些核酸可以被检查，例如，通过一种或多种，两种或更多种，或三种或更多种：测序方法，聚合酶链式反应方法，限制性片段多态性分析，缺失、插入和/或存在突变鉴定，包括但不限于单碱基对多态性、转换、颠换或其组合。
表1

Claims (22)

1.一种确定生物样品中的蛋白质表达谱的方法，所述生物样本为从福尔马林固定的肿瘤组织，所述肿瘤组织来自癌症患者，该方法使用质谱法检测和定量由所述生物样品制备的蛋白质消化物中一种或多种蛋白质的水平，所述蛋白质起到启动、维持、增强、抑制或以其他方式调节人类免疫系统的作用；并计算所述生物样品中所述蛋白质的水平；
其中，所述水平是相对水平或绝对水平，并且
其中，所述一种或多种蛋白质选自由B7-1、B7H2、β-连环蛋白、CALR、CCR4、CD133、CD137、CD137L、CD166、CD28、CD38、CD3G、CD40、CD40L、CD47、CD68、CD70、CD73、CD8A、CEACAM5、cMYC、COX-2、CXCR4、CXCR7、DNMT1、EZH2、GBP2、HMGB1、INFGR2、IL13RA2、IRF1、MyD88、NAMPT、NAPRT1、NYESO1、OX40L、PD-1、STAT3、Beclin-1、PHD2、PI3Kβ、PI3Kδ、PI3Kγ、CEACAM1、IFNY、STK11、BTK、ARG1、TDO、TGFβ1、CD16、OX40、IL-2、SLFN11、CD39、CD44、CSF1R、GZMB、PRF1、CD206、GNLY、CD3Z、ATF3、TLR8、CD19和CTLA4所组成的组中。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括在检测和/或定量所述一种或多种片段肽的含量之前对所述蛋白质消化物进行分级的步骤。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述分级的步骤选自包括凝胶电泳、液相色谱、毛细管电泳、纳米反相液相色谱、高效液相色谱或反相高效液相色谱的组中。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述生物样品的所述蛋白质消化物通过液体组织方案制备。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质消化物包括蛋白酶消化物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述蛋白质消化物包括胰蛋白酶消化物。
7.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述质谱包括串联质谱、离子阱质谱、三重四极杆质谱、离子阱/四极杆混合质谱、MALDI-TOF质谱、MALDI质谱和/或飞行时间质谱。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所用的质谱模式是选择反应监测(SRM)、多重反应监测(MRM)、智能选择反应监测(iSRM)和/或多重选择反应监测(mSRM)。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述片段肽选自由具有SEQ ID NO：1-119序列的肽所组成的组中。
10.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述组织是石蜡包埋的组织。
11.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述组织获自肿瘤。
12.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，定量所述片段肽包括将一个生物样品中所述片段肽的含量与不同且单独的生物样品中相同片段肽的含量进行比较。
13.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，定量所述片段肽包括通过与添加的具有相同氨基酸序列的已知量的内标肽进行比较来确定生物样品中所述片段肽的含量。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述内标肽是同位素标记的肽。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述同位素标记的内标肽含有选自18O、17O、34S、15N、13C、2H或它们的组合中的一种或多种重稳定同位素。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中，检测和定量蛋白质消化物中至少一种片段肽的含量指示受试者中存在相应的蛋白质以及与癌症的关联。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，进一步包括将所述检测和定量所述至少一种片段肽的含量的结果或相应蛋白质的水平与癌症患者的免疫系统的活化状态相关联。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，将检测和/或定量所述至少一种片段肽的含量的结果或所述相应蛋白质的水平与癌症患者的免疫系统的活化状态相关联，并结合检测和/或定量其他蛋白质或来自其他蛋白质的肽的含量，以提供关于所述癌症患者的肿瘤细胞的分子状态的额外信息。
19.根据前述任一项权利要求所述的方法，进一步包括向获得所述生物样品的患者或受试者给药治疗有效量的癌症治疗剂，其中，给药的所述癌症治疗剂和/或癌症治疗剂的用量基于选自具有SEQ ID NO 1-119序列的肽的任何一种或多种片段肽的检测和/或含量，其中，癌症治疗剂是免疫调节癌症治疗剂，其与一种或多种所述蛋白质相互作用以启动、增强、操纵和/或以其他方式调节所述癌症患者的免疫应答以攻击并杀死所述患者的肿瘤细胞。
20.根据权利要求19所述的方法，进一步向所述患者或受试者给药免疫调节癌症治疗剂，所述免疫调节癌症治疗剂与一种或多种所述蛋白质相互作用以启动、增强、操纵和/或以其他方式调节所述癌症患者免疫应答以攻击并杀死所述患者的肿瘤细胞。
21.一种确定患者的免疫系统活化状态的方法，该方法使用质谱法检测和定量从生物样品制备的蛋白质消化物中的一种或多种蛋白质的水平；并计算所述生物样品中所述蛋白质的水平；
其中，所述水平是相对水平或绝对水平，并且
其中，所述一种或多种蛋白质选自由B7-1、B7H2、β-连环蛋白、CALR、CCR4、CD133、CD137、CD137L、CD166、CD28、CD38、CD3G、CD40、CD40L、CD47、CD68、CD70、CD73、CD8A、CEACAM5、cMYC、COX-2、CXCR4、CXCR7、DNMT1、EZH2、GBP2、HMGB1、INFGR2、IL13RA2、IRF1、MyD88、NAMPT、NAPRT1、NYESO1、OX40L、PD-1、STAT3、Beclin-1、PHD2、PI3Kβ、PI3Kδ、PI3Kγ、CEACAM1、IFNY、STK11、BTK、ARG1、TDO、TGFβ1、CD16、OX40、IL-2、SLFN11、CD39、CD44、CSF1R、GZMB、PRF1、CD206、GNLY、CD3Z、ATF3、TLR8、CD19和CTLA4所组成的组中。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述片段肽选自由具有SEQ ID NO：1-119序列的肽所组成的组中。
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