JP2023552440A - アトラクチレノリドｉを用いて癌細胞を免疫攻撃に対して感受性にする方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、癌性細胞をアトラクチレノリドＩ（ＡＴＴ－Ｉ）と接触させることを含む、癌性細胞において免疫原性を誘導するか、または増大させる組成物および方法に関する。一部の実施形態において、方法は、癌性細胞を、ＡＴＴ－Ｉと、癌治療剤と組み合わせて接触させることを含む。【選択図】図４Ｂ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１２月７日出願の米国仮出願第６３／１２２，２３２号の優先権を主張する。この出願の開示は、本明細書中で明示的に組み込まれる。

電子的に提出される資料の参照による組込み
その全体が参照より組み込まれるのは、本出願と同時に提出されて、以下のように特定されるコンピュータ可読ヌクレオチド／アミノ酸配列表である：２０２１年１０月２８日作成の、「３４８３８２＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と命名した１キロバイトのＡＣＩＩ（Ｔｅｘｔ）ファイル。

腫瘍細胞が腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現するため、免疫系は、健康な細胞を腫瘍細胞から区別することができる。ＣＤ８＋Ｔ細胞を介した免疫応答の文脈において、ＴＡＡの認識は、腫瘍細胞上でのＭＨＣ－Ｉを介したＴＡＡの提示、およびＣＤ８＋Ｔ細胞上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）との相互作用により起こる。この事象を損なうことで、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介腫瘍細胞傷害性が最終的に減少または全滅することとなる。しかしながら、抗原提示の減少または喪失は、免疫認識および免疫破壊を逃れるために腫瘍細胞によって用いられる頻繁かつ必須の機構である。逆に言えば、抗原負荷ＭＨＣ－Ｉ複合体の提示を癌細胞上で増大させることで、癌細胞はＴ細胞媒介死に対して感受性となる。

本開示は概して、癌細胞において免疫原性を増大させる方法に関する。より詳細には、本開示は、癌細胞をアトラクチレノリドＩと接触させて、癌細胞によるＭＨＣ－Ｉ産生を促進して、癌細胞を認識かつ攻撃する免疫細胞の能力をもたらす方法に関する。

癌免疫治療技術において、大きな進歩があった一方、癌が自らを偽装して検出を回避する能力は、依然として問題である。本明細書中で記載されるのは、免疫細胞に対して容易に特定可能にする、癌細胞上での抗原プロセシングおよび提示を活性化する方法である。より詳細には、本開示は、癌細胞をアトラクチレノリドＩ（ＡＴＴ－Ｉと称される）と接触させて、癌細胞を認識して攻撃する免疫細胞の能力を増強することを含む方法を提供する。

小分子ＡＴＴ－Ｉの、癌細胞のプロテアソーム２６Ｓサブユニット非ＡＴＰアーゼ４（ＰＳＭＤ４）への結合は、細胞の免疫プロテアソーム複合体の抗原プロセシング活性を増大させて、癌細胞上での主要組織適合性クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）媒介抗原提示を増強する。本質的には、癌細胞をＡＴＴ－Ｉと接触させることによって、癌細胞はその表面上に抗原を発現し始めて、免疫細胞が癌細胞を認識して攻撃するのを可能にする。具体的に、本開示は、ＡＴＴ－Ｉへの癌細胞の曝露の後に癌細胞を認識するＣＤ８＋Ｔ細胞の能力を増強することを記載する。

一部の態様において、本開示は、ＡＴＴ－Ｉを、別の治療分子と組み合わせて用いて、腫瘍浸潤、およびＣＤ８＋Ｔ細胞細胞傷害性に対する感受性を増大させる方法を提供する。一実施形態において、癌細胞をＡＴＴ－Ｉと接触させる方法が提供され、ＡＴＴ－Ｉは、ＣＤ８＋Ｔ細胞細胞傷害性に対する癌細胞の感受性を増大させる。一部の態様において、ＡＴＴ－Ｉは、実質的に純粋、約９８％純粋、約９７％純粋、約９６％、約９５％純粋、または約９０％純粋である。

一実施形態において、癌性細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞細胞傷害性の有効性を増強する方法が提供され、当該方法は、前記癌性細胞をアトラクチレノリド（ＡＴＴ－Ｉ）と接触させることを含む。一実施形態に従えば、癌性細胞は、ＡＴＴ－Ｉを含む医薬組成物の投与によってインビボで接触する。一実施形態において、ＣＤ８＋Ｔ細胞細胞傷害性の有効性を増強する方法は、ＡＴＴ－Ｉを含む医薬組成物を、癌と診断された患者に、場合によってはチェックポイント阻害剤の投与と併せて、そして場合によっては抗癌免疫療法剤の投与と併せて、投与することを含む。一実施形態において、チェックポイント阻害剤は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）またはプログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）の阻害剤であり、癌性細胞は、結腸直腸癌（ＣＲＣ）細胞である。

一実施形態において、癌細胞上での抗原負荷ＭＨＣ－Ｉ複合体の提示を増大させる方法が提供され、当該方法は、前記癌細胞をＡＴＴ－Ｉと接触させることを含み、場合によっては、癌細胞は、結腸直腸癌（ＣＲＣ）細胞である。

一実施形態において、腫瘍を処置する方法が提供され、腫瘍の細胞は、１つまたは複数の追加の治療分子と組み合わせてＡＴＴ－Ｉと接触し、例えば、１つまたは複数のチェックポイント阻害剤の投与を含む。一部の実施形態において、治療分子は、プログラム死－１（ＰＤ－１）阻害剤を含み、場合によっては、阻害剤は、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、およびアベルマブから選択される。一部の実施形態において、治療分子は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）またはプログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）の阻害剤を含む。一部の実施形態において、腫瘍を、ＡＴＴ－Ｉにより、ＣＴＬＡ－４および／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤と組み合わせて処置する方法が提供される。一実施形態において、癌を処置する方法が提供され、当該方法は、アトラクチレノリド（ＡＴＴ－Ｉ）を含む医薬組成物を、癌と診断された患者に投与することを含む。一実施形態において、処置されることとなる癌は、固形腫瘍であり、場合によっては、癌は、結腸直腸癌（ＣＲＣ）である。一実施形態に従えば、アトラクチレノリド（ＡＴＴ－Ｉ）を含む医薬組成物は、抗癌免疫治療を受けている、癌と診断された患者に投与される。更なる実施形態において、ＡＴＴ－Ｉを受ける患者はさらに、ＡＴＴ－Ｉの投与と同時に、またはその前、またはその後に、チェックポイント阻害剤が投与され得、場合によっては、チェックポイント阻害剤は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）またはプログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）の阻害剤である。

一実施形態において、免疫細胞からの攻撃に対する癌細胞の感度を高める方法が提供され、当該方法は、癌細胞をＡＴＴ－Ｉと接触させることを含む。一実施形態において、免疫細胞は、操作されたか、または本来のものであり、一実施形態において、免疫細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。

ＡＴＴ－Ｉが、腫瘍細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の死滅効率を増強することを示すデータを示す図である。従来の医薬草木から精製した合計５９４種の天然の小分子化合物を、ＭＣ３８細胞、およびＣ５７ＢＬ／６マウスからフレッシュに単離したＴ細胞に及ぼす毒性について試験した。データを、３件の独立した実験の平均として示す（図１Ａ）。図１Ｂは、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介細胞傷害性に及ぼす影響について試験したものから、毒性が低い４４６種の薬物の結果を示す。ルシフェラーゼを発現するＭＣ３８－ＯＶＡ細胞を、各薬物（５．０μＭ）の存在下でＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養して、Ｔ細胞媒介細胞傷害性を、ルシフェラーゼアッセイによって測定した。差異（ｌｏｇ２）：（ｌｏｇ２［相対生存能力］＞１；Ｐ＜０．０５）。相対生存能力＝（処理群の腫瘍細胞生存能力）／（対照群の腫瘍細胞生存能力）。データを、３件の独立した実験の平均として示す。統計分析を、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。ＡＴＴ－Ｉの化学構造は、以下の通りである：

ＭＣ３８－ＯＶＡ細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞死滅に及ぼすＡＴＴ－Ｉ処理の影響を、腫瘍細胞対Ｔ細胞の様々な比率の下で測定して、結果を図１Ｃに示す。データを、３件の独立した実験の平均±ＳＤとして示す。統計分析を、二元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。図１Ｄは、５μＭのＡＴＴ－Ｉ（＋）またはビヒクル対照ＤＭＳＯ（－）により前処理したＭＣ３８－ＷＴ細胞（レーン１および２）またはＭＣ３８－ＯＶＡ細胞（レーン３～６）とのＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞の共培養を用いて行ったＣＤ８＋Ｔ細胞死滅アッセイ由来のデータを示す。データは、３件の独立した実験の平均±ＳＤとして示す。ＡＴＴ－Ｉ（＋）またはＤＭＳＯ対照（－）により前処理したＭＣ３８－ＷＴ細胞（レーン１および２）またはＭＣ３８－ＯＶＡ細胞（レーン３～６）とのＯＴ－Ｉ Ｔ細胞の共培養後の上清におけるＩＦＮ－γ（図１Ｅ）およびＴＮＦ－α（図１Ｆ）のレベルを、ＥＬＩＳＡによって判定した。データを、３件の独立した実験の平均±ＳＤとして示す。統計分析を、二元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 ＡＴＴ－Ｉは、ＭＣ３８腫瘍由来オルガノイドにおける抗原特異的Ｔ細胞応答を増強する。ＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＡＴＴ－Ｉ処置のある、またはないＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＭＣ３８由来腫瘍から生成した腫瘍オルガノイドと共培養した。図２は、３件の並列実験の平均±ＳＤとして示すオルガノイドサイズの定量化を表すグラフである。オルガノイドのサイズを、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いて投影面積（μｍ２）として測定した。統計分析を、二元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 ＡＴＴ－Ｉは、腫瘍細胞上での抗原提示を増強する。図１Ａ～１Ｆは、フローサイトメトリ分析によって判定した、ＡＴＴ－Ｉ（０、５、１０、および３０μＭ）により処理したＭＣ３８－ＯＶＡ細胞（ｓｈＮＴ対照（図３Ａおよび３Ｂ）、ｓｈＰｓｍｄ４（図３Ｃおよび３Ｄ）、およびｓｈＰｓｍｄ７（図３Ｅおよび３Ｆ））上でのＨ－２ＫｂおよびＨ－２Ｋｂ－ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡ）のＭＦＩ値を示すグラフである。データは、平均±ＳＥＭとして示され、２件の独立実験（ｎ＝２）を表す。統計分析を、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。ＨＣＴ１１６細胞およびＳＷ８３７細胞の表面上のＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃを、免疫蛍光の３Ｄ共焦点イメージングによって分析した。細胞核を、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）によって染色した。定量的データを、３～４件の並列実験（ｎ＝３～４）の平均±ＳＤとして（ＨＣＴ１１６細胞について図３Ｇに、そしてＳＷ８３７細胞について図３Ｈに）示す。対応のない両側ｔ検定を、統計分析に用いた。図３Ｉは、ＭＨＣ－Ｉ抗体を用いてＭＨＣ－Ｉ／ＴＣＲ相互作用をブロックした後の、ＭＣ３８ ＯＶＡ＋の細胞傷害性に及ぼすＡＴＴ－Ｉの効果を実証するデータを示す（レーン１および４：ビヒクル対照処理ＭＣ３８ ＯＶＡ＋細胞；レーン２および５：ビヒクル対照処理ＭＣ３８ ＯＶＡ＋細胞プラスＴ細胞；レーン３および６：ＡＴＴ－Ｉ処理ＭＣ３８ ＯＶＡ＋細胞プラスＴ細胞）。具体的には、発明者らは、４８時間の３０μＭ ＡＴＴ－Ｉあり、そしてなしでＭＣ３８ ＯＶＡ＋細胞を処理した。ラットＩｇＧ２ａアイソタイプ対照および抗マウスＭＨＣクラスＩ（Ｈ２）を用いて、細胞を一晩ブロックした。抗原特異的細胞傷害性を、フローサイトメトリによって分析した。データは、平均±ＳＥＭとして示され、２件の独立実験（ｎ＝４）を表す。統計分析を、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ＡＴＴ－Ｉは、腫瘍細胞上での抗原提示を増強する。図１Ａ～１Ｆは、フローサイトメトリ分析によって判定した、ＡＴＴ－Ｉ（０、５、１０、および３０μＭ）により処理したＭＣ３８－ＯＶＡ細胞（ｓｈＮＴ対照（図３Ａおよび３Ｂ）、ｓｈＰｓｍｄ４（図３Ｃおよび３Ｄ）、およびｓｈＰｓｍｄ７（図３Ｅおよび３Ｆ））上でのＨ－２ＫｂおよびＨ－２Ｋｂ－ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡ）のＭＦＩ値を示すグラフである。データは、平均±ＳＥＭとして示され、２件の独立実験（ｎ＝２）を表す。統計分析を、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。ＨＣＴ１１６細胞およびＳＷ８３７細胞の表面上のＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃを、免疫蛍光の３Ｄ共焦点イメージングによって分析した。細胞核を、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）によって染色した。定量的データを、３～４件の並列実験（ｎ＝３～４）の平均±ＳＤとして（ＨＣＴ１１６細胞について図３Ｇに、そしてＳＷ８３７細胞について図３Ｈに）示す。対応のない両側ｔ検定を、統計分析に用いた。図３Ｉは、ＭＨＣ－Ｉ抗体を用いてＭＨＣ－Ｉ／ＴＣＲ相互作用をブロックした後の、ＭＣ３８ ＯＶＡ＋の細胞傷害性に及ぼすＡＴＴ－Ｉの効果を実証するデータを示す（レーン１および４：ビヒクル対照処理ＭＣ３８ ＯＶＡ＋細胞；レーン２および５：ビヒクル対照処理ＭＣ３８ ＯＶＡ＋細胞プラスＴ細胞；レーン３および６：ＡＴＴ－Ｉ処理ＭＣ３８ ＯＶＡ＋細胞プラスＴ細胞）。具体的には、発明者らは、４８時間の３０μＭ ＡＴＴ－Ｉあり、そしてなしでＭＣ３８ ＯＶＡ＋細胞を処理した。ラットＩｇＧ２ａアイソタイプ対照および抗マウスＭＨＣクラスＩ（Ｈ２）を用いて、細胞を一晩ブロックした。抗原特異的細胞傷害性を、フローサイトメトリによって分析した。データは、平均±ＳＥＭとして示され、２件の独立実験（ｎ＝４）を表す。統計分析を、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ＡＴＴ－Ｉは、腫瘍細胞上での抗原提示を増強する。図１Ａ～１Ｆは、フローサイトメトリ分析によって判定した、ＡＴＴ－Ｉ（０、５、１０、および３０μＭ）により処理したＭＣ３８－ＯＶＡ細胞（ｓｈＮＴ対照（図３Ａおよび３Ｂ）、ｓｈＰｓｍｄ４（図３Ｃおよび３Ｄ）、およびｓｈＰｓｍｄ７（図３Ｅおよび３Ｆ））上でのＨ－２ＫｂおよびＨ－２Ｋｂ－ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡ）のＭＦＩ値を示すグラフである。データは、平均±ＳＥＭとして示され、２件の独立実験（ｎ＝２）を表す。統計分析を、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。ＨＣＴ１１６細胞およびＳＷ８３７細胞の表面上のＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃを、免疫蛍光の３Ｄ共焦点イメージングによって分析した。細胞核を、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）によって染色した。定量的データを、３～４件の並列実験（ｎ＝３～４）の平均±ＳＤとして（ＨＣＴ１１６細胞について図３Ｇに、そしてＳＷ８３７細胞について図３Ｈに）示す。対応のない両側ｔ検定を、統計分析に用いた。図３Ｉは、ＭＨＣ－Ｉ抗体を用いてＭＨＣ－Ｉ／ＴＣＲ相互作用をブロックした後の、ＭＣ３８ ＯＶＡ＋の細胞傷害性に及ぼすＡＴＴ－Ｉの効果を実証するデータを示す（レーン１および４：ビヒクル対照処理ＭＣ３８ ＯＶＡ＋細胞；レーン２および５：ビヒクル対照処理ＭＣ３８ ＯＶＡ＋細胞プラスＴ細胞；レーン３および６：ＡＴＴ－Ｉ処理ＭＣ３８ ＯＶＡ＋細胞プラスＴ細胞）。具体的には、発明者らは、４８時間の３０μＭ ＡＴＴ－Ｉあり、そしてなしでＭＣ３８ ＯＶＡ＋細胞を処理した。ラットＩｇＧ２ａアイソタイプ対照および抗マウスＭＨＣクラスＩ（Ｈ２）を用いて、細胞を一晩ブロックした。抗原特異的細胞傷害性を、フローサイトメトリによって分析した。データは、平均±ＳＥＭとして示され、２件の独立実験（ｎ＝４）を表す。統計分析を、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ＡＴＴ－Ｉは、腫瘍細胞上での抗原提示を増強する。図１Ａ～１Ｆは、フローサイトメトリ分析によって判定した、ＡＴＴ－Ｉ（０、５、１０、および３０μＭ）により処理したＭＣ３８－ＯＶＡ細胞（ｓｈＮＴ対照（図３Ａおよび３Ｂ）、ｓｈＰｓｍｄ４（図３Ｃおよび３Ｄ）、およびｓｈＰｓｍｄ７（図３Ｅおよび３Ｆ））上でのＨ－２ＫｂおよびＨ－２Ｋｂ－ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡ）のＭＦＩ値を示すグラフである。データは、平均±ＳＥＭとして示され、２件の独立実験（ｎ＝２）を表す。統計分析を、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。ＨＣＴ１１６細胞およびＳＷ８３７細胞の表面上のＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃを、免疫蛍光の３Ｄ共焦点イメージングによって分析した。細胞核を、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）によって染色した。定量的データを、３～４件の並列実験（ｎ＝３～４）の平均±ＳＤとして（ＨＣＴ１１６細胞について図３Ｇに、そしてＳＷ８３７細胞について図３Ｈに）示す。対応のない両側ｔ検定を、統計分析に用いた。図３Ｉは、ＭＨＣ－Ｉ抗体を用いてＭＨＣ－Ｉ／ＴＣＲ相互作用をブロックした後の、ＭＣ３８ ＯＶＡ＋の細胞傷害性に及ぼすＡＴＴ－Ｉの効果を実証するデータを示す（レーン１および４：ビヒクル対照処理ＭＣ３８ ＯＶＡ＋細胞；レーン２および５：ビヒクル対照処理ＭＣ３８ ＯＶＡ＋細胞プラスＴ細胞；レーン３および６：ＡＴＴ－Ｉ処理ＭＣ３８ ＯＶＡ＋細胞プラスＴ細胞）。具体的には、発明者らは、４８時間の３０μＭ ＡＴＴ－Ｉあり、そしてなしでＭＣ３８ ＯＶＡ＋細胞を処理した。ラットＩｇＧ２ａアイソタイプ対照および抗マウスＭＨＣクラスＩ（Ｈ２）を用いて、細胞を一晩ブロックした。抗原特異的細胞傷害性を、フローサイトメトリによって分析した。データは、平均±ＳＥＭとして示され、２件の独立実験（ｎ＝４）を表す。統計分析を、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ＡＴＴ－Ｉは、腫瘍細胞上での抗原提示を増強する。図１Ａ～１Ｆは、フローサイトメトリ分析によって判定した、ＡＴＴ－Ｉ（０、５、１０、および３０μＭ）により処理したＭＣ３８－ＯＶＡ細胞（ｓｈＮＴ対照（図３Ａおよび３Ｂ）、ｓｈＰｓｍｄ４（図３Ｃおよび３Ｄ）、およびｓｈＰｓｍｄ７（図３Ｅおよび３Ｆ））上でのＨ－２ＫｂおよびＨ－２Ｋｂ－ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡ）のＭＦＩ値を示すグラフである。データは、平均±ＳＥＭとして示され、２件の独立実験（ｎ＝２）を表す。統計分析を、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。ＨＣＴ１１６細胞およびＳＷ８３７細胞の表面上のＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃを、免疫蛍光の３Ｄ共焦点イメージングによって分析した。細胞核を、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）によって染色した。定量的データを、３～４件の並列実験（ｎ＝３～４）の平均±ＳＤとして（ＨＣＴ１１６細胞について図３Ｇに、そしてＳＷ８３７細胞について図３Ｈに）示す。対応のない両側ｔ検定を、統計分析に用いた。図３Ｉは、ＭＨＣ－Ｉ抗体を用いてＭＨＣ－Ｉ／ＴＣＲ相互作用をブロックした後の、ＭＣ３８ ＯＶＡ＋の細胞傷害性に及ぼすＡＴＴ－Ｉの効果を実証するデータを示す（レーン１および４：ビヒクル対照処理ＭＣ３８ ＯＶＡ＋細胞；レーン２および５：ビヒクル対照処理ＭＣ３８ ＯＶＡ＋細胞プラスＴ細胞；レーン３および６：ＡＴＴ－Ｉ処理ＭＣ３８ ＯＶＡ＋細胞プラスＴ細胞）。具体的には、発明者らは、４８時間の３０μＭ ＡＴＴ－Ｉあり、そしてなしでＭＣ３８ ＯＶＡ＋細胞を処理した。ラットＩｇＧ２ａアイソタイプ対照および抗マウスＭＨＣクラスＩ（Ｈ２）を用いて、細胞を一晩ブロックした。抗原特異的細胞傷害性を、フローサイトメトリによって分析した。データは、平均±ＳＥＭとして示され、２件の独立実験（ｎ＝４）を表す。統計分析を、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ＡＴＴ－Ｉは、腫瘍細胞上での抗原提示を増強する。図１Ａ～１Ｆは、フローサイトメトリ分析によって判定した、ＡＴＴ－Ｉ（０、５、１０、および３０μＭ）により処理したＭＣ３８－ＯＶＡ細胞（ｓｈＮＴ対照（図３Ａおよび３Ｂ）、ｓｈＰｓｍｄ４（図３Ｃおよび３Ｄ）、およびｓｈＰｓｍｄ７（図３Ｅおよび３Ｆ））上でのＨ－２ＫｂおよびＨ－２Ｋｂ－ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡ）のＭＦＩ値を示すグラフである。データは、平均±ＳＥＭとして示され、２件の独立実験（ｎ＝２）を表す。統計分析を、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。ＨＣＴ１１６細胞およびＳＷ８３７細胞の表面上のＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃを、免疫蛍光の３Ｄ共焦点イメージングによって分析した。細胞核を、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）によって染色した。定量的データを、３～４件の並列実験（ｎ＝３～４）の平均±ＳＤとして（ＨＣＴ１１６細胞について図３Ｇに、そしてＳＷ８３７細胞について図３Ｈに）示す。対応のない両側ｔ検定を、統計分析に用いた。図３Ｉは、ＭＨＣ－Ｉ抗体を用いてＭＨＣ－Ｉ／ＴＣＲ相互作用をブロックした後の、ＭＣ３８ ＯＶＡ＋の細胞傷害性に及ぼすＡＴＴ－Ｉの効果を実証するデータを示す（レーン１および４：ビヒクル対照処理ＭＣ３８ ＯＶＡ＋細胞；レーン２および５：ビヒクル対照処理ＭＣ３８ ＯＶＡ＋細胞プラスＴ細胞；レーン３および６：ＡＴＴ－Ｉ処理ＭＣ３８ ＯＶＡ＋細胞プラスＴ細胞）。具体的には、発明者らは、４８時間の３０μＭ ＡＴＴ－Ｉあり、そしてなしでＭＣ３８ ＯＶＡ＋細胞を処理した。ラットＩｇＧ２ａアイソタイプ対照および抗マウスＭＨＣクラスＩ（Ｈ２）を用いて、細胞を一晩ブロックした。抗原特異的細胞傷害性を、フローサイトメトリによって分析した。データは、平均±ＳＥＭとして示され、２件の独立実験（ｎ＝４）を表す。統計分析を、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ＡＴＴ－Ｉは、腫瘍細胞上での抗原提示を増強する。図１Ａ～１Ｆは、フローサイトメトリ分析によって判定した、ＡＴＴ－Ｉ（０、５、１０、および３０μＭ）により処理したＭＣ３８－ＯＶＡ細胞（ｓｈＮＴ対照（図３Ａおよび３Ｂ）、ｓｈＰｓｍｄ４（図３Ｃおよび３Ｄ）、およびｓｈＰｓｍｄ７（図３Ｅおよび３Ｆ））上でのＨ－２ＫｂおよびＨ－２Ｋｂ－ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡ）のＭＦＩ値を示すグラフである。データは、平均±ＳＥＭとして示され、２件の独立実験（ｎ＝２）を表す。統計分析を、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。ＨＣＴ１１６細胞およびＳＷ８３７細胞の表面上のＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃを、免疫蛍光の３Ｄ共焦点イメージングによって分析した。細胞核を、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）によって染色した。定量的データを、３～４件の並列実験（ｎ＝３～４）の平均±ＳＤとして（ＨＣＴ１１６細胞について図３Ｇに、そしてＳＷ８３７細胞について図３Ｈに）示す。対応のない両側ｔ検定を、統計分析に用いた。図３Ｉは、ＭＨＣ－Ｉ抗体を用いてＭＨＣ－Ｉ／ＴＣＲ相互作用をブロックした後の、ＭＣ３８ ＯＶＡ＋の細胞傷害性に及ぼすＡＴＴ－Ｉの効果を実証するデータを示す（レーン１および４：ビヒクル対照処理ＭＣ３８ ＯＶＡ＋細胞；レーン２および５：ビヒクル対照処理ＭＣ３８ ＯＶＡ＋細胞プラスＴ細胞；レーン３および６：ＡＴＴ－Ｉ処理ＭＣ３８ ＯＶＡ＋細胞プラスＴ細胞）。具体的には、発明者らは、４８時間の３０μＭ ＡＴＴ－Ｉあり、そしてなしでＭＣ３８ ＯＶＡ＋細胞を処理した。ラットＩｇＧ２ａアイソタイプ対照および抗マウスＭＨＣクラスＩ（Ｈ２）を用いて、細胞を一晩ブロックした。抗原特異的細胞傷害性を、フローサイトメトリによって分析した。データは、平均±ＳＥＭとして示され、２件の独立実験（ｎ＝４）を表す。統計分析を、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ＡＴＴ－Ｉは、腫瘍細胞上での抗原提示を増強する。図１Ａ～１Ｆは、フローサイトメトリ分析によって判定した、ＡＴＴ－Ｉ（０、５、１０、および３０μＭ）により処理したＭＣ３８－ＯＶＡ細胞（ｓｈＮＴ対照（図３Ａおよび３Ｂ）、ｓｈＰｓｍｄ４（図３Ｃおよび３Ｄ）、およびｓｈＰｓｍｄ７（図３Ｅおよび３Ｆ））上でのＨ－２ＫｂおよびＨ－２Ｋｂ－ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡ）のＭＦＩ値を示すグラフである。データは、平均±ＳＥＭとして示され、２件の独立実験（ｎ＝２）を表す。統計分析を、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。ＨＣＴ１１６細胞およびＳＷ８３７細胞の表面上のＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃを、免疫蛍光の３Ｄ共焦点イメージングによって分析した。細胞核を、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）によって染色した。定量的データを、３～４件の並列実験（ｎ＝３～４）の平均±ＳＤとして（ＨＣＴ１１６細胞について図３Ｇに、そしてＳＷ８３７細胞について図３Ｈに）示す。対応のない両側ｔ検定を、統計分析に用いた。図３Ｉは、ＭＨＣ－Ｉ抗体を用いてＭＨＣ－Ｉ／ＴＣＲ相互作用をブロックした後の、ＭＣ３８ ＯＶＡ＋の細胞傷害性に及ぼすＡＴＴ－Ｉの効果を実証するデータを示す（レーン１および４：ビヒクル対照処理ＭＣ３８ ＯＶＡ＋細胞；レーン２および５：ビヒクル対照処理ＭＣ３８ ＯＶＡ＋細胞プラスＴ細胞；レーン３および６：ＡＴＴ－Ｉ処理ＭＣ３８ ＯＶＡ＋細胞プラスＴ細胞）。具体的には、発明者らは、４８時間の３０μＭ ＡＴＴ－Ｉあり、そしてなしでＭＣ３８ ＯＶＡ＋細胞を処理した。ラットＩｇＧ２ａアイソタイプ対照および抗マウスＭＨＣクラスＩ（Ｈ２）を用いて、細胞を一晩ブロックした。抗原特異的細胞傷害性を、フローサイトメトリによって分析した。データは、平均±ＳＥＭとして示され、２件の独立実験（ｎ＝４）を表す。統計分析を、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ＡＴＴ－Ｉは、腫瘍細胞上での抗原提示を増強する。図１Ａ～１Ｆは、フローサイトメトリ分析によって判定した、ＡＴＴ－Ｉ（０、５、１０、および３０μＭ）により処理したＭＣ３８－ＯＶＡ細胞（ｓｈＮＴ対照（図３Ａおよび３Ｂ）、ｓｈＰｓｍｄ４（図３Ｃおよび３Ｄ）、およびｓｈＰｓｍｄ７（図３Ｅおよび３Ｆ））上でのＨ－２ＫｂおよびＨ－２Ｋｂ－ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡ）のＭＦＩ値を示すグラフである。データは、平均±ＳＥＭとして示され、２件の独立実験（ｎ＝２）を表す。統計分析を、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。ＨＣＴ１１６細胞およびＳＷ８３７細胞の表面上のＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃを、免疫蛍光の３Ｄ共焦点イメージングによって分析した。細胞核を、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）によって染色した。定量的データを、３～４件の並列実験（ｎ＝３～４）の平均±ＳＤとして（ＨＣＴ１１６細胞について図３Ｇに、そしてＳＷ８３７細胞について図３Ｈに）示す。対応のない両側ｔ検定を、統計分析に用いた。図３Ｉは、ＭＨＣ－Ｉ抗体を用いてＭＨＣ－Ｉ／ＴＣＲ相互作用をブロックした後の、ＭＣ３８ ＯＶＡ＋の細胞傷害性に及ぼすＡＴＴ－Ｉの効果を実証するデータを示す（レーン１および４：ビヒクル対照処理ＭＣ３８ ＯＶＡ＋細胞；レーン２および５：ビヒクル対照処理ＭＣ３８ ＯＶＡ＋細胞プラスＴ細胞；レーン３および６：ＡＴＴ－Ｉ処理ＭＣ３８ ＯＶＡ＋細胞プラスＴ細胞）。具体的には、発明者らは、４８時間の３０μＭ ＡＴＴ－Ｉあり、そしてなしでＭＣ３８ ＯＶＡ＋細胞を処理した。ラットＩｇＧ２ａアイソタイプ対照および抗マウスＭＨＣクラスＩ（Ｈ２）を用いて、細胞を一晩ブロックした。抗原特異的細胞傷害性を、フローサイトメトリによって分析した。データは、平均±ＳＥＭとして示され、２件の独立実験（ｎ＝４）を表す。統計分析を、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ＡＴＴ－Ｉは、免疫性チェックポイント遮断免疫応答を増強する。図４Ａ～４Ｃは、皮下Ｃ５７ＢＬ／６マウスモデルにおけるＭＣ３８由来腫瘍の腫瘍増殖（図４Ａ）および腫瘍容量（図４Ｂ）に及ぼす、ＡＴＴ－Ｉ（毎日）および抗ＰＤ－１（３回／週、合計５回の注射）の効果を実証する。誤差バーは、ＳＥＭ（群あたりｎ＝１０マウス）を表す。示すデータは、２件の独立実験を表す。統計分析を、二元配置ＡＮＯＶＡ（図４Ａ）および一元配置ＡＮＯＶＡ（図４Ｂ）を用いて行った。摘出した腫瘍の写真を、図４Ｃに示す。スケールバー：１ｃｍ。生物発光イメージングを介して測定した、ＡＴＴ－Ｉ（５０ｍｇ／ｋｇ、毎日）および抗ＰＤ－１（２００μｇ／マウス、３回／週、合計５回の注射）の、腫瘍増殖に、そして同所性ＭＣ３８由来腫瘍モデル（ログランク検定）の生存期間、および生存率に及ぼす効果を、図４Ｄに示す。各群は５頭のマウスを含む。ＰＳＭＤ４ノックダウンがある、またはない、そして抗ＰＤ－１のみ、またはＡＴＴ－Ｉとの抗ＰＤ－１（コンボ）により処理したＭＣ３８由来腫瘍の腫瘍増殖曲線を示すグラフを図４Ｅに示す。各群は６頭のマウスを含む。統計分析を、二元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 ＡＴＴ－Ｉは、免疫性チェックポイント遮断免疫応答を増強する。図４Ａ～４Ｃは、皮下Ｃ５７ＢＬ／６マウスモデルにおけるＭＣ３８由来腫瘍の腫瘍増殖（図４Ａ）および腫瘍容量（図４Ｂ）に及ぼす、ＡＴＴ－Ｉ（毎日）および抗ＰＤ－１（３回／週、合計５回の注射）の効果を実証する。誤差バーは、ＳＥＭ（群あたりｎ＝１０マウス）を表す。示すデータは、２件の独立実験を表す。統計分析を、二元配置ＡＮＯＶＡ（図４Ａ）および一元配置ＡＮＯＶＡ（図４Ｂ）を用いて行った。摘出した腫瘍の写真を、図４Ｃに示す。スケールバー：１ｃｍ。生物発光イメージングを介して測定した、ＡＴＴ－Ｉ（５０ｍｇ／ｋｇ、毎日）および抗ＰＤ－１（２００μｇ／マウス、３回／週、合計５回の注射）の、腫瘍増殖に、そして同所性ＭＣ３８由来腫瘍モデル（ログランク検定）の生存期間、および生存率に及ぼす効果を、図４Ｄに示す。各群は５頭のマウスを含む。ＰＳＭＤ４ノックダウンがある、またはない、そして抗ＰＤ－１のみ、またはＡＴＴ－Ｉとの抗ＰＤ－１（コンボ）により処理したＭＣ３８由来腫瘍の腫瘍増殖曲線を示すグラフを図４Ｅに示す。各群は６頭のマウスを含む。統計分析を、二元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 ＡＴＴ－Ｉは、免疫性チェックポイント遮断免疫応答を増強する。図４Ａ～４Ｃは、皮下Ｃ５７ＢＬ／６マウスモデルにおけるＭＣ３８由来腫瘍の腫瘍増殖（図４Ａ）および腫瘍容量（図４Ｂ）に及ぼす、ＡＴＴ－Ｉ（毎日）および抗ＰＤ－１（３回／週、合計５回の注射）の効果を実証する。誤差バーは、ＳＥＭ（群あたりｎ＝１０マウス）を表す。示すデータは、２件の独立実験を表す。統計分析を、二元配置ＡＮＯＶＡ（図４Ａ）および一元配置ＡＮＯＶＡ（図４Ｂ）を用いて行った。摘出した腫瘍の写真を、図４Ｃに示す。スケールバー：１ｃｍ。生物発光イメージングを介して測定した、ＡＴＴ－Ｉ（５０ｍｇ／ｋｇ、毎日）および抗ＰＤ－１（２００μｇ／マウス、３回／週、合計５回の注射）の、腫瘍増殖に、そして同所性ＭＣ３８由来腫瘍モデル（ログランク検定）の生存期間、および生存率に及ぼす効果を、図４Ｄに示す。各群は５頭のマウスを含む。ＰＳＭＤ４ノックダウンがある、またはない、そして抗ＰＤ－１のみ、またはＡＴＴ－Ｉとの抗ＰＤ－１（コンボ）により処理したＭＣ３８由来腫瘍の腫瘍増殖曲線を示すグラフを図４Ｅに示す。各群は６頭のマウスを含む。統計分析を、二元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 ＡＴＴ－Ｉは、免疫性チェックポイント遮断免疫応答を増強する。図４Ａ～４Ｃは、皮下Ｃ５７ＢＬ／６マウスモデルにおけるＭＣ３８由来腫瘍の腫瘍増殖（図４Ａ）および腫瘍容量（図４Ｂ）に及ぼす、ＡＴＴ－Ｉ（毎日）および抗ＰＤ－１（３回／週、合計５回の注射）の効果を実証する。誤差バーは、ＳＥＭ（群あたりｎ＝１０マウス）を表す。示すデータは、２件の独立実験を表す。統計分析を、二元配置ＡＮＯＶＡ（図４Ａ）および一元配置ＡＮＯＶＡ（図４Ｂ）を用いて行った。摘出した腫瘍の写真を、図４Ｃに示す。スケールバー：１ｃｍ。生物発光イメージングを介して測定した、ＡＴＴ－Ｉ（５０ｍｇ／ｋｇ、毎日）および抗ＰＤ－１（２００μｇ／マウス、３回／週、合計５回の注射）の、腫瘍増殖に、そして同所性ＭＣ３８由来腫瘍モデル（ログランク検定）の生存期間、および生存率に及ぼす効果を、図４Ｄに示す。各群は５頭のマウスを含む。ＰＳＭＤ４ノックダウンがある、またはない、そして抗ＰＤ－１のみ、またはＡＴＴ－Ｉとの抗ＰＤ－１（コンボ）により処理したＭＣ３８由来腫瘍の腫瘍増殖曲線を示すグラフを図４Ｅに示す。各群は６頭のマウスを含む。統計分析を、二元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 ＡＴＴ－Ｉは、免疫性チェックポイント遮断免疫応答を増強する。図４Ａ～４Ｃは、皮下Ｃ５７ＢＬ／６マウスモデルにおけるＭＣ３８由来腫瘍の腫瘍増殖（図４Ａ）および腫瘍容量（図４Ｂ）に及ぼす、ＡＴＴ－Ｉ（毎日）および抗ＰＤ－１（３回／週、合計５回の注射）の効果を実証する。誤差バーは、ＳＥＭ（群あたりｎ＝１０マウス）を表す。示すデータは、２件の独立実験を表す。統計分析を、二元配置ＡＮＯＶＡ（図４Ａ）および一元配置ＡＮＯＶＡ（図４Ｂ）を用いて行った。摘出した腫瘍の写真を、図４Ｃに示す。スケールバー：１ｃｍ。生物発光イメージングを介して測定した、ＡＴＴ－Ｉ（５０ｍｇ／ｋｇ、毎日）および抗ＰＤ－１（２００μｇ／マウス、３回／週、合計５回の注射）の、腫瘍増殖に、そして同所性ＭＣ３８由来腫瘍モデル（ログランク検定）の生存期間、および生存率に及ぼす効果を、図４Ｄに示す。各群は５頭のマウスを含む。ＰＳＭＤ４ノックダウンがある、またはない、そして抗ＰＤ－１のみ、またはＡＴＴ－Ｉとの抗ＰＤ－１（コンボ）により処理したＭＣ３８由来腫瘍の腫瘍増殖曲線を示すグラフを図４Ｅに示す。各群は６頭のマウスを含む。統計分析を、二元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 ＡＴＴ－Ｉは、細胞傷害性Ｔリンパ球の腫瘍浸潤リンパ球および抗腫瘍活性を増強する。マウスに、ＭＣ３８細胞の同所性盲腸壁移植を受けさせて、ＡＴＴ－１、ＰＤ－１抗体、または組合せにより処置して、腫瘍を、質量サイトメトリ（ＣｙＴＯＦ）を用いる腫瘍微環境の分析用に２８日後に摘出した。同所性ＭＣ３８腫瘍を、移植の２８日後に外科的に摘出して、単一の細胞に解離して、金属同位体コンジュゲート抗体により染色した。免疫プロファイルを、ＣｙＴＯＦ（２６個のマーカー）を介して評価して、Ｃｙｔｏｂａｎｋプラットフォームを用いて分析した。ｖｉＳＮＥ分析を実行してから、ｖｉＳＮＥ上のＳＰＡＤＥを、免疫細胞集団のオーバーレイドクラスタリングについて評価した。図５Ａは、盲腸壁移植した腫瘍（各群においてｎ＝５）の代表的なＭＣ３８重量を示すグラフである。統計分析を、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。Ｃｙｔｏｂａｎｋにより分析した結腸直腸癌腫瘍内のＣＤ４５＋浸潤免疫細胞内の異なる免疫細胞集団（ｎ＝５）のパーセンテージを、表１に示す。皮下ＭＣ３８腫瘍が確立されると、マウスを、図５Ｂ～５Ｄに示すように、７つの群にランダムに割り当てて、処置した。Ｂ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇後の、腫瘍増殖（図５Ｂおよび図５Ｃ）および腫瘍容量（図５Ｄ）に及ぼすＡＴＴ－Ｉ（５０ｍｇ／ｋｇ、毎日）および抗ＰＤ－１（３回／週、合計５回の注射）処置の効果（ｎ＝６）。Ｉｓｏは、アイソタイプ対照抗体を示す。誤差バーはＳＥＭを表し、統計分析を、二元配置ＡＮＯＶＡ（ＥおよびＦ）および一元配置ＡＮＯＶＡ（Ｇ）を用いて行った。^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ＡＴＴ－Ｉは、細胞傷害性Ｔリンパ球の腫瘍浸潤リンパ球および抗腫瘍活性を増強する。マウスに、ＭＣ３８細胞の同所性盲腸壁移植を受けさせて、ＡＴＴ－１、ＰＤ－１抗体、または組合せにより処置して、腫瘍を、質量サイトメトリ（ＣｙＴＯＦ）を用いる腫瘍微環境の分析用に２８日後に摘出した。同所性ＭＣ３８腫瘍を、移植の２８日後に外科的に摘出して、単一の細胞に解離して、金属同位体コンジュゲート抗体により染色した。免疫プロファイルを、ＣｙＴＯＦ（２６個のマーカー）を介して評価して、Ｃｙｔｏｂａｎｋプラットフォームを用いて分析した。ｖｉＳＮＥ分析を実行してから、ｖｉＳＮＥ上のＳＰＡＤＥを、免疫細胞集団のオーバーレイドクラスタリングについて評価した。図５Ａは、盲腸壁移植した腫瘍（各群においてｎ＝５）の代表的なＭＣ３８重量を示すグラフである。統計分析を、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。Ｃｙｔｏｂａｎｋにより分析した結腸直腸癌腫瘍内のＣＤ４５＋浸潤免疫細胞内の異なる免疫細胞集団（ｎ＝５）のパーセンテージを、表１に示す。皮下ＭＣ３８腫瘍が確立されると、マウスを、図５Ｂ～５Ｄに示すように、７つの群にランダムに割り当てて、処置した。Ｂ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇後の、腫瘍増殖（図５Ｂおよび図５Ｃ）および腫瘍容量（図５Ｄ）に及ぼすＡＴＴ－Ｉ（５０ｍｇ／ｋｇ、毎日）および抗ＰＤ－１（３回／週、合計５回の注射）処置の効果（ｎ＝６）。Ｉｓｏは、アイソタイプ対照抗体を示す。誤差バーはＳＥＭを表し、統計分析を、二元配置ＡＮＯＶＡ（ＥおよびＦ）および一元配置ＡＮＯＶＡ（Ｇ）を用いて行った。^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ＡＴＴ－Ｉは、細胞傷害性Ｔリンパ球の腫瘍浸潤リンパ球および抗腫瘍活性を増強する。マウスに、ＭＣ３８細胞の同所性盲腸壁移植を受けさせて、ＡＴＴ－１、ＰＤ－１抗体、または組合せにより処置して、腫瘍を、質量サイトメトリ（ＣｙＴＯＦ）を用いる腫瘍微環境の分析用に２８日後に摘出した。同所性ＭＣ３８腫瘍を、移植の２８日後に外科的に摘出して、単一の細胞に解離して、金属同位体コンジュゲート抗体により染色した。免疫プロファイルを、ＣｙＴＯＦ（２６個のマーカー）を介して評価して、Ｃｙｔｏｂａｎｋプラットフォームを用いて分析した。ｖｉＳＮＥ分析を実行してから、ｖｉＳＮＥ上のＳＰＡＤＥを、免疫細胞集団のオーバーレイドクラスタリングについて評価した。図５Ａは、盲腸壁移植した腫瘍（各群においてｎ＝５）の代表的なＭＣ３８重量を示すグラフである。統計分析を、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。Ｃｙｔｏｂａｎｋにより分析した結腸直腸癌腫瘍内のＣＤ４５＋浸潤免疫細胞内の異なる免疫細胞集団（ｎ＝５）のパーセンテージを、表１に示す。皮下ＭＣ３８腫瘍が確立されると、マウスを、図５Ｂ～５Ｄに示すように、７つの群にランダムに割り当てて、処置した。Ｂ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇後の、腫瘍増殖（図５Ｂおよび図５Ｃ）および腫瘍容量（図５Ｄ）に及ぼすＡＴＴ－Ｉ（５０ｍｇ／ｋｇ、毎日）および抗ＰＤ－１（３回／週、合計５回の注射）処置の効果（ｎ＝６）。Ｉｓｏは、アイソタイプ対照抗体を示す。誤差バーはＳＥＭを表し、統計分析を、二元配置ＡＮＯＶＡ（ＥおよびＦ）および一元配置ＡＮＯＶＡ（Ｇ）を用いて行った。^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ＡＴＴ－Ｉは、細胞傷害性Ｔリンパ球の腫瘍浸潤リンパ球および抗腫瘍活性を増強する。マウスに、ＭＣ３８細胞の同所性盲腸壁移植を受けさせて、ＡＴＴ－１、ＰＤ－１抗体、または組合せにより処置して、腫瘍を、質量サイトメトリ（ＣｙＴＯＦ）を用いる腫瘍微環境の分析用に２８日後に摘出した。同所性ＭＣ３８腫瘍を、移植の２８日後に外科的に摘出して、単一の細胞に解離して、金属同位体コンジュゲート抗体により染色した。免疫プロファイルを、ＣｙＴＯＦ（２６個のマーカー）を介して評価して、Ｃｙｔｏｂａｎｋプラットフォームを用いて分析した。ｖｉＳＮＥ分析を実行してから、ｖｉＳＮＥ上のＳＰＡＤＥを、免疫細胞集団のオーバーレイドクラスタリングについて評価した。図５Ａは、盲腸壁移植した腫瘍（各群においてｎ＝５）の代表的なＭＣ３８重量を示すグラフである。統計分析を、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。Ｃｙｔｏｂａｎｋにより分析した結腸直腸癌腫瘍内のＣＤ４５＋浸潤免疫細胞内の異なる免疫細胞集団（ｎ＝５）のパーセンテージを、表１に示す。皮下ＭＣ３８腫瘍が確立されると、マウスを、図５Ｂ～５Ｄに示すように、７つの群にランダムに割り当てて、処置した。Ｂ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇後の、腫瘍増殖（図５Ｂおよび図５Ｃ）および腫瘍容量（図５Ｄ）に及ぼすＡＴＴ－Ｉ（５０ｍｇ／ｋｇ、毎日）および抗ＰＤ－１（３回／週、合計５回の注射）処置の効果（ｎ＝６）。Ｉｓｏは、アイソタイプ対照抗体を示す。誤差バーはＳＥＭを表し、統計分析を、二元配置ＡＮＯＶＡ（ＥおよびＦ）および一元配置ＡＮＯＶＡ（Ｇ）を用いて行った。^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１。 免疫チェックポイント遮断療法と組み合わせてＡＴＴ－Ｉにより処置したマウス結腸直腸腫瘍の単細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ分析の図である。同所性移植ＭＣ３８由来腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを、ビヒクル対照、ＡＴＴ－Ｉ（５０ｍｇ／ｋｇ、毎日）、抗ＰＤ－１（３回／週、合計５回）、またはＡＴＴ－Ｉ＋抗ＰＤ－１コンボにより処置した。腫瘍を、最初の処置の２週後に収集した（５つの腫瘍サンプルを、アーム単位でプールした）。細胞型を、知られているマーカー遺伝子の発現レベルによって評価して、選択した免疫細胞型における機能マーカー遺伝子の遺伝子発現プロファイルを分析した。様々な条件由来のＣＤ８＋エフェクターＴ細胞におけるＴ細胞活性化および細胞傷害性マーカー遺伝子の平均発現レベルを図６Ａに示す。ドットサイズは、各条件のＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の割合（ｙ軸）を、選択した遺伝子の発現レベル（強度によって示す）（ｘ軸）と共に特徴付ける。図６Ｂは、各条件下でのＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の細胞傷害性スコアの分布を提供する。各細胞の細胞傷害性レベルを、ＣＤ８＋Ｔマーカー遺伝子Ｐｒｆ１、Ｉｆｎｇ、Ｔｎｆ、Ｐｄｃｄ１、Ｓｌａ２、およびＣｄ８ａの平均発現レベルによって推測する。ｙ軸は、細胞傷害性スコアを表す。コンボ対抗ＰＤ－１（Ｐ＝１．１２１×１０－６）；コンボ対ＡＴＴ－Ｉ（Ｐ＝０．００２４）。統計分析を、対応のない両側ｔ検定を用いて行った。 免疫チェックポイント遮断療法と組み合わせてＡＴＴ－Ｉにより処置したマウス結腸直腸腫瘍の単細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ分析の図である。同所性移植ＭＣ３８由来腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを、ビヒクル対照、ＡＴＴ－Ｉ（５０ｍｇ／ｋｇ、毎日）、抗ＰＤ－１（３回／週、合計５回）、またはＡＴＴ－Ｉ＋抗ＰＤ－１コンボにより処置した。腫瘍を、最初の処置の２週後に収集した（５つの腫瘍サンプルを、アーム単位でプールした）。細胞型を、知られているマーカー遺伝子の発現レベルによって評価して、選択した免疫細胞型における機能マーカー遺伝子の遺伝子発現プロファイルを分析した。様々な条件由来のＣＤ８＋エフェクターＴ細胞におけるＴ細胞活性化および細胞傷害性マーカー遺伝子の平均発現レベルを図６Ａに示す。ドットサイズは、各条件のＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の割合（ｙ軸）を、選択した遺伝子の発現レベル（強度によって示す）（ｘ軸）と共に特徴付ける。図６Ｂは、各条件下でのＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の細胞傷害性スコアの分布を提供する。各細胞の細胞傷害性レベルを、ＣＤ８＋Ｔマーカー遺伝子Ｐｒｆ１、Ｉｆｎｇ、Ｔｎｆ、Ｐｄｃｄ１、Ｓｌａ２、およびＣｄ８ａの平均発現レベルによって推測する。ｙ軸は、細胞傷害性スコアを表す。コンボ対抗ＰＤ－１（Ｐ＝１．１２１×１０－６）；コンボ対ＡＴＴ－Ｉ（Ｐ＝０．００２４）。統計分析を、対応のない両側ｔ検定を用いて行った。 ＡＴＴ－Ｉは、ＣＲＣ患者由来腫瘍オルガノイドにおける自己由来Ｔ細胞応答を増強する。患者由来オルガノイド（ＰＤＯ）を、ＡＴＴ－Ｉの存在下または不在下で、自己由来ＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養した。８人の異なる患者由来の平均±ＳＤとして示すオルガノイドサイズの定量化（ＰＤＯ１～ＰＤＯ８；図７Ａ～７Ｈに示す）。オルガノイドのサイズを、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いて投影面積（μｍ２）として測定した。統計分析を、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。 ＡＴＴ－Ｉは、ＣＲＣ患者由来腫瘍オルガノイドにおける自己由来Ｔ細胞応答を増強する。患者由来オルガノイド（ＰＤＯ）を、ＡＴＴ－Ｉの存在下または不在下で、自己由来ＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養した。８人の異なる患者由来の平均±ＳＤとして示すオルガノイドサイズの定量化（ＰＤＯ１～ＰＤＯ８；図７Ａ～７Ｈに示す）。オルガノイドのサイズを、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いて投影面積（μｍ２）として測定した。統計分析を、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。 ＡＴＴ－Ｉは、ＣＲＣ患者由来腫瘍オルガノイドにおける自己由来Ｔ細胞応答を増強する。患者由来オルガノイド（ＰＤＯ）を、ＡＴＴ－Ｉの存在下または不在下で、自己由来ＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養した。８人の異なる患者由来の平均±ＳＤとして示すオルガノイドサイズの定量化（ＰＤＯ１～ＰＤＯ８；図７Ａ～７Ｈに示す）。オルガノイドのサイズを、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いて投影面積（μｍ２）として測定した。統計分析を、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。 ＡＴＴ－Ｉは、ＣＲＣ患者由来腫瘍オルガノイドにおける自己由来Ｔ細胞応答を増強する。患者由来オルガノイド（ＰＤＯ）を、ＡＴＴ－Ｉの存在下または不在下で、自己由来ＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養した。８人の異なる患者由来の平均±ＳＤとして示すオルガノイドサイズの定量化（ＰＤＯ１～ＰＤＯ８；図７Ａ～７Ｈに示す）。オルガノイドのサイズを、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いて投影面積（μｍ２）として測定した。統計分析を、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。 ＡＴＴ－Ｉは、ＣＲＣ患者由来腫瘍オルガノイドにおける自己由来Ｔ細胞応答を増強する。患者由来オルガノイド（ＰＤＯ）を、ＡＴＴ－Ｉの存在下または不在下で、自己由来ＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養した。８人の異なる患者由来の平均±ＳＤとして示すオルガノイドサイズの定量化（ＰＤＯ１～ＰＤＯ８；図７Ａ～７Ｈに示す）。オルガノイドのサイズを、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いて投影面積（μｍ２）として測定した。統計分析を、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。 ＡＴＴ－Ｉは、ＣＲＣ患者由来腫瘍オルガノイドにおける自己由来Ｔ細胞応答を増強する。患者由来オルガノイド（ＰＤＯ）を、ＡＴＴ－Ｉの存在下または不在下で、自己由来ＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養した。８人の異なる患者由来の平均±ＳＤとして示すオルガノイドサイズの定量化（ＰＤＯ１～ＰＤＯ８；図７Ａ～７Ｈに示す）。オルガノイドのサイズを、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いて投影面積（μｍ２）として測定した。統計分析を、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。 ＡＴＴ－Ｉは、ＣＲＣ患者由来腫瘍オルガノイドにおける自己由来Ｔ細胞応答を増強する。患者由来オルガノイド（ＰＤＯ）を、ＡＴＴ－Ｉの存在下または不在下で、自己由来ＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養した。８人の異なる患者由来の平均±ＳＤとして示すオルガノイドサイズの定量化（ＰＤＯ１～ＰＤＯ８；図７Ａ～７Ｈに示す）。オルガノイドのサイズを、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いて投影面積（μｍ２）として測定した。統計分析を、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。 ＡＴＴ－Ｉは、ＣＲＣ患者由来腫瘍オルガノイドにおける自己由来Ｔ細胞応答を増強する。患者由来オルガノイド（ＰＤＯ）を、ＡＴＴ－Ｉの存在下または不在下で、自己由来ＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養した。８人の異なる患者由来の平均±ＳＤとして示すオルガノイドサイズの定量化（ＰＤＯ１～ＰＤＯ８；図７Ａ～７Ｈに示す）。オルガノイドのサイズを、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いて投影面積（μｍ２）として測定した。統計分析を、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。 図８Ａおよび図８Ｂは、ＭＣ３８－ＯＶＡ細胞のＣＤ８^＋Ｔ細胞死滅に及ぼすイカリイン処理の効果を、示された腫瘍細胞対Ｔ細胞の様々な比率の下で測定したことを示す図である。データを、３件の独立実験の平均±ＳＤとして示す。統計分析を、二元配置ＡＮＯＶＡ検定を用いて行った。

定義
本発明を説明して特許請求する際に、以下の専門用語が、以下に示される定義に従って用いられることとなる。

本明細書中で用いられる用語「約」は、明示される値または値の範囲よりも１０パーセント大きいか、または小さいことを意味するが、あらゆる値または値の範囲を、このより広い定義にのみ限定することは意図されない。また、用語「約」の後の各値または値の範囲は、明示される絶対値または値の範囲の実施形態を包含することが意図される。

本明細書中で用いられる用語「精製された」および類似の用語は、本来の、または天然の環境において分子または化合物と通常付随する混入物が実質的にない形態での分子または化合物の単離に関する。本明細書中で用いられる用語「精製された」は、絶対的な純度を必要としない；むしろ、相対的な定義として意図される。

用語「単離された」は、言及される材料が、その最初の環境（例えば、天然に存在するならば、自然環境）から取り出されていることを必要とする。例えば、生きている動物内に存在する、天然に存在するポリヌクレオチドは、単離されてないが、天然系における共存材料の一部もしくは全てから分離されている同ポリヌクレオチドは、単離されている。

本明細書中で用いられる用語「薬学的に許容される担体」は、あらゆる標準的な医薬担体、例えば、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、エマルジョン、例えば油／水または水／油エマルジョン、および種々のタイプの湿潤剤を含む。また、当該用語は、ヒトが挙げられる動物に用いられる、米国連邦政府の規制機関によって承認されているか、またはＵＳ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａに記載されているあらゆる剤を包含する。

本明細書中で用いられる用語「処置すること」は、特定の障害もしくは症状と関連する徴候の緩和、および／または前記徴候の予防もしくは除外を含む。
本明細書中で用いられる、薬物の「有効な」量または「治療的に有効な量」は、非毒性であるが、所望の効果を実現するのに十分な薬物を指す。「有効な」量は、対象毎に、または対象内ですら時間外に、個体の年齢および全身状態、投与方法等に応じて変動することとなる。ゆえに、正確な「有効な量」を特定することは、常に可能なわけではない。しかしながら、個々のあらゆる場合において適切な「有効な」量は、ルーチンの実験を用いて当業者によって決定され得る。

本明細書中で用いられる、更なる表示のない用語「患者」は、医師の管理の有無に拘わらず治療処置を受けている、あらゆる温血脊椎家畜動物（例えば、家畜、ウマ、ネコ、イヌ、および他のペットが挙げられるがこれらに限定されない）およびヒトを包含することが意図される。

用語「阻害する」は、活性、応答、症状、疾患、または他の生物学的パラメータの低下を定める。これとして、活性、応答、症状、または疾患の完全な除去が挙げられ得るが、これらに限定されない。これはまた、例えば、本来のレベルまたは対照レベルと比較して、活性、応答、症状、または疾患の１０％の引下げを含み得る。ゆえに、引下げは、本来のレベルまたは対照レベルと比較した、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％、またはそれらの間の任意の量の引下げであり得る。

詳細な説明
そうでないと定められない限り、本明細書中で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと類似しているか、または等しいあらゆる方法および材料が、本開示の実施または試験に用いられ得るが、好ましい方法および材料は、以下に記載される。

一実施形態に従えば、式Ｉの一般的な構造の化合物を含む医薬組成物が提供される：

一実施形態において、組成物は、精製されたアトラクチレノリドＩを含む。一実施形態において、組成物はさらに、１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤、例えば、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、または抗ＣＴＬＡ－４抗体と組み合わされる。一実施形態において、式Ｉの化合物を含む組成物は、抗癌免疫療法処置と併せて、癌患者に投与される。一実施形態において、処置されることとなる癌は、例えば結腸直腸癌が挙げられる固形腫瘍癌である。

一部の実施形態において、癌細胞を小分子と接触させることを含む方法が教示され、小分子はＡＴＴ－Ｉを含み、癌細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性効果に対する感度がより高められる。

一部の実施形態において、ＡＴＴ－Ｉは単独で提供される。一部の実施形態において、ＡＴＴ－Ｉは、実質的に純粋、約９８％純粋、約９７％純粋、約９６％純粋、約９５％純粋、約９４％純粋、約９３％純粋、約９２％純粋、約９１％純粋、または約９０％純粋である。

一部の実施形態において、ＡＴＴ－Ｉは、他の治療薬、抗体、または小分子と組み合わせて提供される。一部の実施形態において、他の治療薬として、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはＣＴＬＡ－４が挙げられる。これらの実施形態において、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはＣＴＬＡ－４は、部分的に、ＣＤ８＋Ｔ細胞が癌細胞を破壊するのを補助するのに有用である。

一部の実施形態において、癌細胞は、腫瘍を形成することができる。一部の実施形態において、癌細胞は腎臓癌に由来する。一部の実施形態において、癌細胞は結腸癌に由来する。

本明細書中で用いられる用語「感度を高めること」は、ＡＴＴ－Ｉとの接触の後に、癌細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識されることができる量で抗原を産生かつ提示し始めることを意味する。

イカリインの化学構造は、以下の通りである：

ビオカニンＡの化学構造は、以下の通りである：

４つの生物学的に異なる細胞培養体を調製して、２つをＤＭＳＯで処理し（対照）、２つをＡＴＴ－Ｉで処理した（処理）。各細胞ペレットの溶解の後に、結果として生じたタンパク質溶液を、６つの同一のアリコート（５０μＬ）に分けて、本方法に記載するように、６つの温度点（３５．０；４５．３；５０．１；５５．２；６０．７；および７４．９℃）にて３分間平衡化した。次に、各チューブの結果として生じた変性タンパク質をペレット化して、上清画分を、以下の手順に順番に供した：タンパク質分解消化（トリプシン／Ｌｙｓ－Ｃベース）、様々なアイソバリックタグ（ＴＭＴ：Ｔａｎｄｅｍ Ｍａｓｓ Ｔａｇ）によるペプチド標識化、混合、および高ｐＨ溶媒ベースの逆相分画。全ての画分を、本方法に記載するように、ｎａｎｏＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いて分析した。全ての生じたファイルを、実施例に記載するように、タンパク質存在量の値を特定かつ定量化するためにＭａｘＱｕａｎｔソフトウェアスイート１．６．０．１６を、そしてシグモイドタンパク質溶融曲線を生成するためにＪＭＰ（登録商標）Ｐｒｏ １４．０．０（６４ビット）を用いて分析して、以降のデータ分析により、ＡＴＴ－Ｉの潜在的標的をスクリーンアウトした。

本開示は、以下の非限定的な実施例を考慮すると、より完全に理解されるであろう。
実施例１ 研究設計
本研究の最初の目的は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞媒介細胞傷害性に対する結腸直腸癌（ＣＲＣ）細胞の応答性を増大させるハーバル医薬品由来の天然の小分子化合物を特定することであった。２つの基準をスクリーンに用いた：１）候補薬物は、腫瘍およびＴ細胞に及ぼす毒性がないか、または最小であり、特徴が化学療法薬物とは異なり；２）候補薬物は、腫瘍細胞に対するＣＤ８^＋Ｔ細胞の細胞傷害性に力を与える。５９４種の化合物のライブラリから、これらの２つの基準を満たすアトラクチレノリドＩ（ＡＴＴ－Ｉ）を特定した。２Ｄ共培養および３Ｄ腫瘍オルガノイドモデルを用いて、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の抗腫瘍活性に及ぼすＡＴＴ－Ｉの影響を判定するためのインビトロＴ細胞細胞傷害性アッセイを行った。結腸直腸癌細胞におけるＡＴＴ－Ｉの分子標的を特定するために、質量分析ベースの細胞サーマルシフトシフトアッセイ（ＣＥＴＳＡ）を、ＤＭＳＯまたはＡＴＴ－Ｉ（５．０μＭ）で処理したＭＣ３８腫瘍細胞の溶解物中の１３，０００個を超えるタンパク質に行った。

免疫プロテアソームの機能的構成要素であるＰｓｍｄ４を、ＡＴＴ－Ｉの最も可能性がある結合標的の１つと特定した。Ｐｓｍｄ４とのＡＴＴ－Ｉの相互作用を、マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）結合アッセイによって確認した。免疫プロテアソーム活性に及ぼすＡＴＴ－Ｉ処置の効果を、構成的２６Ｓプロテアソームおよび特定の免疫プロテアソームについての異なるプロテアーゼ基質を用いて試験した。ＡＴＴ－Ｉ処置が免疫チェックポイント遮断療法の有効性を増強するかを試験するために、免疫応答性マウスにおける同系腫瘍モデルを、（Ｃ５７ＢＬ／６マウス内の）ＭＣ３８細胞および（ＢＡＬＢ／ｃマウス内の）ＣＴ２６細胞の皮下同所性盲腸壁移植を用いて確立した。

全ての動物研究は、Ｉｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ ａｎｉｍａｌ ｃａｒｅ（ｐｒｏｔｏｃｏｌ＃１１２６９）によって承認され、そして施設および国家の方針に従って行われた。腫瘍移植の７日後に、マウスを４つの異なる処置群：ビヒクル対照、ＡＴＴ－Ｉ（５０ｍｇ／ｋｇ、毎日）、ＰＤ－１抗体（２００μｇ／マウス、３回／週、合計５回）、およびＡＴＴ－Ｉ＋ＰＤ－１コンボにランダムに割り当てた。皮下腫瘍増殖を、研究のエンドポイントでのサイズおよび腫瘍重量によって監視した。同所性腫瘍増殖を、ルシフェリンの腹腔内注入後のＩＶＩＳスペクトルを用いるインビボ生物発光腫瘍イメージングによって監視した。次に、ＣＲＣ腫瘍における免疫プロファイルに及ぼすＡＴＴ－Ｉ処置の効果を、ＣｙＴＯＦによって分析した。

ＡＴＴ－Ｉの抗腫瘍効果の原因となる免疫細胞型をさらに判定するために、ＣＤ４^＋Ｔ細胞（抗ＣＤ４）、ＣＤ８^＋Ｔ細胞（抗ＣＤ８）、Ｂ細胞（抗ＣＤ２０）、または対照（アイソタイプ抗体）の枯渇によるインビボ実験を行った。ＡＴＴ－Ｉの主な効果がＣＤ８^＋Ｔ細胞により媒介されたので、発明者らは次に、対照、ＡＴＴ－Ｉ、ＰＤ－１抗体、またはＡＴＴ－Ｉ＋ＰＤ－１コンボにより処置したマウス由来の結腸直腸腫瘍サンプルのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ分析を用いて、ＣＤ８^＋Ｔ細胞機能を各条件下でさらに評価した。ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータのｔ－ＳＮＥプロット分析法では、腫瘍内の細胞の種類を、その遺伝子発現シグネチャーによって評価した。最後に、ＡＴＴ－Ｉによる腫瘍オルガノイドの処理が、自己由来ＣＤ８^＋Ｔ細胞の細胞傷害性に影響を与えるかを判定するために、ヒト患者ＣＲＣサンプル由来の患者由来腫瘍オルガノイド（ＰＤＯ）を確立した。ＰＤＯを、予め活性化された自己由来ＣＤ８^＋Ｔ細胞と共培養した。スフェロイド解離およびＴ細胞細胞傷害性を、ＰＤＯのサイズおよび数、ならびに腫瘍細胞死によって評価した。

実施例２ マウスおよび細胞株
６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６およびＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入して、病原体フリーな条件の下で収容した。ＯＴ－Ｉマウス（Ｃ５７ＢＬ／６－Ｔｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）１１００Ｍｊｂ／Ｊ）を、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入して、社内で繁殖した。全てのマウスを、Ｉｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅの動物施設内に収容した。全ての手順を、Ｉｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅの承認およびＵｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅプロトコールに従って実行した。ＭＣ３８細胞株を、Ｄｒ．Ｐａｔｒｉｃｋ Ｈｗｕ，ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒから得て、ＣＴ２６、ＳＷ８３７、およびＨＣＴ１１６細胞株をＡＴＣＣから得た。ＭＣ３８、ＨＣＴ１１６、およびＳＷ８３７細胞を、１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および１％ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（１０，０００ユニット／ｍｌペニシリン＋１０，０００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、ＨｙＣｌｏｎｅ）を補充したＤＭＥＭ培地内で維持した。ＣＴ２６細胞を、１０％胎仔ウシ血清および１％ペニシリン－ストレプトマイシン溶液を補充したＲＰＭＩ培地内で維持した。細胞株を、５％ＣＯ_２入りの加湿インキュベータ内で３７℃にて培養した。

実施例３ 試薬
以下の抗体を用いた：Ｓ５ａ／ＰＳＭＤ４（３３３６Ｓ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）および抗β－アクチン（ｓｃ－８４３２、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）が挙げられるウェスタンブロッティング抗体；抗ヒトＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ（ａｂ７０３２８、Ａｂｃａｍ）および抗ＥＧＦＲ（＃４２６７、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）が挙げられる免疫蛍光染色抗体；抗ＣＤ８ａ（９８９４１Ｓ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗Ｆ４／８０（７００７６Ｓ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、および抗ＣＤ４（２５２２９Ｓ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）が挙げられる免疫組織化学染色抗体；Ｈ２ｋｂ－ＰｅｒＣＰＣｙ５．５（Ｃｌｏｎｅ ＡＦ６－８８．５；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ４５－ＢＶ６０５（Ｃｌｏｎｅ ３０－Ｆ１１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＴＣＲβ－ＰＥ／Ｃｙ７（Ｃｌｏｎｅ Ｈ５７－５９７；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１１ｂ－ｅＦｌｕｏｒ４５０（Ｃｌｏｎｅ Ｍ１／７０；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ４－ＡＦ７００（Ｃｌｏｎｅ ＧＫ１．５；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８－ＡＰＣ／Ｃｙ７（Ｃｌｏｎｅ ５３－６．７；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、７－ＡＡＤ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｈ－２ｋ^ｄ－ＡＰＣ（Ｃｌｏｎｅ ＳＦ１－１．１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、アイソタイプマウスＩｇＧ２ａ－ＡＰＣ（Ｃｌｏｎｅ ＭＯＰＣ－１７３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、およびＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ－ＡＰＣ／Ｃｙ７（Ｃｌｏｎｅ Ｗ６／３２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）が挙げられるフローサイトメトリ抗体；抗マウスＰＤ１（ｃｌｏｎｅ ＲＭＰ１－１４；ＢＥ０１４６）、抗マウスＣＤ４（ｃｌｏｎｅ ＧＫ１．５；ＢＥ０００３－１）、ラットＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（Ｃｌｏｎｅ ２Ａ３、ＢＥ００８９）、抗ＣＤ２０（Ｃｌｏｎｅ ＡＩＳＢ１２、ＢＥ０３０２）、抗ＣＤ８（Ｃｌｏｎｅ ５３－６．７２；ＢＥ０００４－１）が挙げられるＢｉｏＸＣｅｌｌ抗体。抗体の希釈を、ｐＨ７．０希釈バッファ（ＢｉｏＸｃｅｌｌ）を用いて行った。ＡＴＴ－Ｉ（Ｂ２００５４；ＣＡＳ＃７３０６９－１３－３）を、Ｙｕａｎｙｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．（Ｃｈｉｎａ）から購入した。

実施例４ 腫瘍移植および処置
盲腸内のＭＣ３８結腸直腸癌細胞の同所性注射のために、マウスを麻酔して、腹部周りをシェービングした。盲腸を露出させるために、発明者らは、皮膚および筋肉を小さく切開した。ルシフェラーゼを発現するＭＣ３８細胞を、３０ゲージ針を用いて、２×１０^５個の細胞を含有する５０μｌ ＰＢＳの最終容量で注射した。盲腸をマウス内に再配置して、創傷を、外科的縫合および創傷クリップを用いて閉じた。皮下腫瘍実験のために、１×１０^５個のＭＣ３８細胞または５×１０^４個のＣＴ２６細胞を、３０ゲージ針を用いて５０μｌ ＰＢＳの最終容量で注射した。マウスを、腫瘍移植の７日後に、異なる群にランダムに割り当てた。抗ＰＤ１またはアイソタイプ対照処置を、２００μｇ／マウスにて合計５回の注射について、１週あたり３回、腹膜内に施した。ＡＴＴ－Ｉを、５０ｍｇ／体重ｋｇにて毎日、腹膜内に投与した。枯渇実験について、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ２０、およびアイソタイプ抗体を、１週あたり３回投与した。抗体を、腫瘍細胞接種の２日前に投与して、注射を、実験の終わりまで続けた。同所性腫瘍増殖を、１５ｍｇ／ｍｌルシフェリン（カリウムルシフェリン；Ｇｏｌｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＭＯ，ＵＳＡ）の２００μｌの腹腔内注入後に、ＩＶＩＳスペクトルを用いるインビボ生物発光腫瘍イメージングによって監視した。蛍光シグナルを、基質投与の１５分後に得た。

実施例５ ＣｙＴＯＦサンプルプロセシングおよびデータ分析
腫瘍を切り出して、２ｍｍ×２ｍｍのピースに手でカットした。続いて、マウス腫瘍解離キットおよびＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、メーカーの手順に従って、酵素的および機械的に解離させた。さらに、細胞を、１００ミクロンフィルタ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）を用いて濾過した。遠心分離の後に、赤血球を溶解させて（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、中和して、洗浄して、自家製のＣｙＴＯＦバッファ（０．５％ＢＳＡおよび０．０２％アジドを含有する低温ＰＢＳ）中に再懸濁させた。サンプル毎に、１．５×１０^６個の細胞を用いた。ＣｙＴＯＦデータを、Ｃｙｔｏｂａｎｋプラットフォーム（３６）を用いるｖｉＳＮＥ分析を介して評価した。ｖｉＳＮＥ分析により、ｔ分布型確率的近傍埋込み（ｔＳＮＥ）アルゴリズムのＢａｒｎｅｓ－Ｈｕｔインプリメンテーションを用いる二次元での高次元解析の視覚化が可能となる。発明者らは、繰返し７５００、パープレキシティ３０、およびシータ０．５の比例サンプリングにより、サンプルにｖｉＳＮＥ分析を行った。このｖｉＳＮＥ分析に関して、発明者らは、ＳＰＡＤＥクラスタリングを実行した。続いて、細胞集団を、選択したマーカーに基づいて、ＳＰＡＤＥ樹上でマニュアルでゲーティングした。この後、これらのクラスタリングされた細胞集団を、ｖｉＳＮＥ上で、オーバレイされたプロットとして視覚化した。

実施例６ マイクロスケール熱泳動分析
精製したＰｓｍｄ４タンパク質を、Ａｌｅｘａ－６４７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ａ２０１７３）により標識した。化合物を、１ｎＭ～５００ｕＭの間で、一定の量のＡｌｅｘａ－６４７標識Ｐｓｍｄ４に滴定した。サンプルを、測定前の１０分間、室温にてインキュベートした。結合アッセイを、２０ｍＭトリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ、および０．０２％Ｔｗｅｅｎ－２０入りバッファ中で実行した。ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｍｏｎｏｌｉｔｈ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＮＴ．１１５）を、熱泳動を測定するのに用いた。標準的なキャピラリ（ｃａｔ＃Ｋ００２、Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ）を実験に用いた。化合物の存在下でのタンパク質の熱泳動を、３０秒間分析した。測定を、室温にて実行した。

実施例７ 三次元タンパク質構造分析
ＰｙＭｏｌグラフィックプログラムを用いて、三次元構造を表した。Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ創薬パッケージを用いて、ＡＴＴ－ＩとＰｓｍｄ４間の共有結合複合体の構造を予測した。Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ内のＭａｅｓｔｒｏモジュールを用いて、タンパク質構造をプロセシングした。水素原子を加えて、イオン性残基のプロトン化状態をｐｒｏ－ｐＫａによって割り当てた。構造は、エネルギーを最小にした。ＣｏｖＤｏｃｋモジュールを、Ｐｓｍｄ４へのＡＴＴ－Ｉの共有結合性ドッキングに用いた。

実施例８ マウスおよびヒト患者由来の腫瘍オルガノイドの生成
ＭＣ３８ ＯＶＡ腫瘍およびヒト結腸直腸癌サンプル（認可された施設のプロトコールおよび患者の同意を用いて得た）を、小さなピース（３ｍｍ×３ｍｍ）にカットして、ＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて小さなピースにプロセシングして、それぞれマウスまたはヒト腫瘍単離キットを用いて、メーカーのガイドライン（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ）に従って、単一の細胞に消化した。単離した細胞を、１％ペニシリン－ストレプトマイシンおよび１５０Ｕ／ｍｌマウスＩＬ２（＃５７５４０２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）またはヒトＩＬ２（＃５８９１０２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を補充したＦ１２／ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ培地により一晩培養した。オルガノイドを生成するために、接着細胞を収集した。また、ヒト臨床サンプルについて、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を、抗ヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞ビーズによって富化して、ヒトＴ－アクティベータＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によって刺激した。ＣＤ８^＋Ｔ細胞を、Ｆ１２／ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ培地内で消費した。接着細胞を、結腸直腸腫瘍オルガノイドの生成用に報告されている（３７）、１０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ Ｂａｓｅｍｅｎｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｍａｔｒｉｘ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５６２５５）を含有するＨＩＣＳマイナスＷｎｔ培地内で、２×１０^５個の細胞／ｍｌの濃度で懸濁させた。細胞を、超低接着表面（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を有する６ウェル培養プレート内に、１ウェルあたり２ｍｌの総容量で播種した。細胞を１週間培養して、オルガノイドを生成した。２～３日毎に、培地を、２つのウェル内に同じ容量で加えて分けた。直径７０～１５０μｍのマウスオルガノイドを、７０μｍ、そして続いて１５０μｍの細胞ストレーナ（７０μｍ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃０７２０１４３１；１５０μｍ、ｐｌｕｒｉＳｔｒａｉｎｅｒ、＃４３－５０１５０－０３）によって順番に濾過した。ＭＣ３８ ＯＶＡオルガノイドを、４８時間、薬物あり、そしてなしで処理してから、ＯＴ－Ｉマウスから単離したＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ活性化ＣＤ８^＋Ｔ細胞と２４時間共培養した。患者由来の腫瘍オルガノイドを、自己由来ＣＤ８^＋Ｔ細胞と共培養した。オルガノイドを光学顕微鏡下で画像化して、単一の細胞に消化して、フローサイトメトリによって分析した。オルガノイドサイズを、ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェア１．５０ｅを用いて分析した。

実施例９ Ｐｓｍｄ４タンパク質の発現および精製
ｐＧＥＸ－６Ｐ－１ベクターを用いて、組換えタンパク質ＧＳＴ－Ｐｓｍｄ４をクローニングした。Ｍｏｕｓｅｒ ＰＳＭＤ４ ｃＤＮＡ断片（ＮＭ＿００１３３０６９２．２．）を増幅して、ｐＧＥＸ－６Ｐ－１ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ）中にライゲートした。組換えタンパク質を得るために、ｐＧＥＸ－６Ｐ－１／ＰＳＭＤ４を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ）（ＢｉｏＬａｂ、ＵＫ）中に形質転換した。ポジティブクローンをＬＢ培地中で、３７℃にてＯＤ_６００が約０．６に達するまで培養した。イソプロピルβ－ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、Ｓｉｇｍａ）を用いて、１ｍＭの最終濃度でタンパク質発現を３７℃にて５時間誘導した。細胞を収集して、結合バッファ（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．３）中に懸濁させた。細胞を３０分間の超音波処理によって溶解させてから、細胞片を１２，０００ｒｐｍ、４℃、２０分間の遠心分離によって除去した。上清を収集して、メーカーの説明書に従って、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ ＦＦカラム（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）にアプライして、組換えタンパク質を精製した。ＧＳＴ－タグを、Ｐｒｅｓｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）によって消化して、タグなしＰｓｍｄ４タンパク質を精製した。

実施例１０ ＣＤ８^＋Ｔ細胞傷害性アッセイ
成熟した細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を生成するために、脾細胞をＯＴ－Ｉマウスから単離して、２ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－２の存在下で５μｇ／ｍｌ ＯＶＡ_{２５７－２６４}（Ｓ７９５１－１ＭＧ、Ｓｉｇｍａ）により３日間刺激した。続いて、Ｔ細胞を遠心分離して、２ｎｇ／ｍｌマウスＩＬ２、１０％ＦＢＳ、および１％ＰＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。ＣＤ８^＋Ｔ細胞の細胞傷害性を測定するために、５０，０００個の富化ＣＤ８^＋Ｔ細胞を、９６ウェルプレート内で、ＭＣ３８－ＯＶＡ細胞と５：１、１：１、または１：５の比率にて混合した。ＡＴＴ－Ｉを、共培養の４８時間前に、ＭＣ３８細胞またはＣＤ８^＋Ｔ細胞に加えた。発明者らは、腫瘍細胞とのＴ細胞の６時間の共培養の後に、ルシフェラーゼ（＃Ｅ１９１０、Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ）の活性を測定することによって、死滅効率を評価した。

実施例１１ ＰＳＭＤ４ ｓｈＲＮＡ、および安定したＰＳＭＤ４ノックダウンのあるＭＣ３８細胞
２つのＰＳＭＤ４ ｓｈＲＮＡを、ＰＳＭＤ４ノックダウンに用いた：
ＰＳＭＤ４ ｓｈＲＮＡ ＃１：
５’－ＣＣＧＧＴＴＡＴＡＧＡＡＣＡＧＧＧＴＣＡＣＡＴＴＧＣＴＣＧＡＧＣＡＡＴＧＴＧＡＣＣＣＴＧＴＴ ＣＴＡＴＡＡＴＴＴＴＴＧ－３’（配列番号１）。

ＰＳＭＤ４ ｓｈＲＮＡ ＃２：
５’－ＣＣＧＧＧＴＧＡＡＴＧＴＴＧＡＣＡＴＣＡＴＴＡＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＴＡＡＴＧＡＴＧＴＣＡＡＣ ＡＴＴＣＡＣＴＴＴＴＴＧ－３’（配列番号２）。

レンチウイルスＰＳＭＤ４ ｓｈＲＮＡをＭＣ３８細胞中に形質導入した。感染の４８時間後に、ＭＣ３８細胞を、２μｇ／ｍｌピューロマイシンを加えて培養して、生存した細胞を、単一のコロニーになるまで増殖させた。そこから、ＰＳＭＤ４の安定したノックダウンのあるコロニー（ＰＳＭＤ４発現は、ｑ－ＰＣＲによって判定した）をインビボ選択した。

実施例１２ 免疫プロテアソームアッセイ
免疫プロテアソーム活性蛍光定量アッセイ（ＵＢＰＢｉｏ、Ｃａｔ Ｊ４１７０）を用いて、発明者らは、ＤＭＳＯ対照または５μＭ ＡＴＴ－Ｉ処理により処理したＭＣ３８およびＭＣ３８－ＰＳＭＤ４^ｌｏｓｓ腫瘍細胞のキモトリプシン様活性、トリプシン様活性、およびカスパーゼ様活性を判定した。処理の２４時間後、細胞可溶化物を得た。各基質に対する曝露によるそれぞれの免疫プロテアソーム開裂能力を、３６０ｎｍの励起および４６０ｎｍの放射波長にて検出されるＡＭＣ蛍光を用いて判定した。インキュベーション期間および基質を、メーカーのガイドラインに従って用いた。

実施例１３ 免疫蛍光
以前に記載されるように（３８）、免疫蛍光を実行した。手短に言えば、細胞（ウェルあたり５×１０^３個）を、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ ＥＺ ８ウェルグラススライドに播種して、一晩培養して、ＰＢＳによりリンスして、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）により室温にて１０分間固定した。固定した細胞を、０．５％トリトンＸ－１００／ＰＢＳと共にインキュベートして、０．２％ＢＳＡ／ＰＢＳによりブロックした。続いて、細胞を、一次抗体（抗ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ）と４℃にて一晩、その後Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（希釈１：３００）と室温にて１時間インキュベートした。ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）染色を、抗体染色後に実行した。サンプルを、封入剤（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）でマウントして、Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ８（直立高速多光子）共焦点イメージング系を用いて蛍光画像をとった。３Ｄモデルを、Ｉｍａｒｉｓ ｘ６４ ８．１．２ソフトウェアにより構築して、分析した。３Ｄイメージングについては、Ｉｍａｒｉｓ顕微鏡観察画像分析ソフトウェアｖ８．０を用いて、３Ｄモデルを構築した。

実施例１４ 単一細胞ＲＮＡ配列決定（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）分析
腫瘍の単一細胞懸濁液を、ＣｙＴＯＦサンプルについて調製する。この後、単一細胞を、以下について染色した：ＣＤ４５－ＢＶ６０５、ＴＣＲβ－ＰＥ／Ｃｙ７、ＣＤ１１ｂ－ｅＦ４５０、ＣＤ４－ＡＦ７００、ＣＤ８－ＡＰＣ／Ｃｙ７、および７－ＡＡＤ。生存可能な（７－ＡＡＤネガティブ）単一細胞を、ＣＤ４５^＋、ＣＤ１１ｂ^－、ＴＣＲβ^＋としてソートした。ソートしたサンプルを直ぐに、ｓｃＲＮＡ配列決定のために、サンプル調製のためのコア施設に提出した。下流ｓｃＲＮＡ配列決定用のライブラリを、３’ｖ２ライブラリ調製キットを用いて、メーカーのプロトコール（１０Ｘ ｇｅｎｏｍｉｃｓ）に従って構築する。増幅および正規化の後に、インデックスバーコードを有するｃＤＮＡを、ＮｏｖａＳｅｑ ６０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）にロードして、これによって配列決定した。

Ｃｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒ（１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を利用することによって、遺伝子発現カウントマトリックスの検索のために、配列決定データを逆多重化して、ｍｍ１０ゲノムにマッッピングした。特に明記しない限り、これらのマトリックスの下流分析を、Ｓｅｕｒａｔ（Ｖ３．１）によって行った。細胞フィルタリングは、全てのサンプルについて、２つの基準に従う：１）単一細胞内のＲＮＡの検出数は、５００を超えるべきである、２）単一細胞内に検出されるミトコンドリア遺伝子のパーセンテージは、１５％を超えるべきでない。各サンプル由来の残りの細胞を統合して、対数正規化した。ＳｅｕｒａｔのＰｈｅｎｏＧｒａｐｈを用いて、解析度セット０．５で細胞をクラスター化した。低次元ｔ－ＳＮＥ視覚化を、パープレキシティセッティング３０で正規化転写発現プロファイルを用いるＲｔｓｎｅパッケージによってコンピュータで行った。各細胞クラスターを、ＳｅｕｒａｔのＦｉｎｄＡｌｌＭａｒｋｅｒｓ機能によって見出されるマーカー遺伝子によって注釈する。続いて、Ｈｅａｔｍａｐを、対数正規化発現レベルにより描く。発明者らはさらに、ドット視覚化による代表的な遺伝子上のＴ細胞活性化および細胞傷害性レベルを調べた。各コードのカラーコードは、異なるサンプル由来の相対平均発現レベルを表し、各ドットのサイズは、サンプル内の発現細胞のパーセンテージを表す。各細胞の細胞傷害性レベルを評価するために、発明者らは、６つの細胞傷害性ＣＤ８^＋Ｔ細胞マーカー遺伝子、すなわち：Ｐｒｆ１、Ｉｆｎｇ、Ｔｎｆ、Ｐｄｃｄ１、Ｓｌａ２、およびＣｄ８ａの平均発現レベルを用いた。各細胞における各細胞傷害性マーカー遺伝子の有意な発現を、左側切断混合ガウスモデルを用いることによって、コンピュータで求めた。発現される細胞傷害性遺伝子が有意なＣＤ８^＋エフェクターＴ細胞を、６つの遺伝子中の少なくとも３つが有意に発現されるＣＤ８^＋エフェクターＴ細胞によって定義し、その割合をさらにコンピュータで求めた。

実施例１５ 溶融温度（Ｔｍ）シフトを用いてＭＣ３８細胞内のＡＴＴ－Ｉの潜在的標的を特定するための質量分析（ＭＳ）ベースの細胞サーマルシフトシフトアッセイ（ＣＥＴＳＡ）
高スループット様式でＡＴＴ－Ｉについての潜在的結合標的に関してスクリーニングするために、細胞の２つの群を、それらのタンパク質レベル温度依存性の変性プロファイルについて、群毎に２つの生物学的に異なる反復細胞培養を用いて比較した。簡潔に、２つの群は、１）ＤＭＳＯ処理対照ＭＣ３８細胞；および２）ＡＴＴ－Ｉ（５．０μＭ）処理ＭＣ３８細胞であった。サンプル調製、質量分析、バイオインフォマティクス、およびデータ評価を、以下に記載するＩｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ＭｅｔｈｏｄｓのＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙと協力して実行した。手短に言えば、以前に公開された報告（３９～４３）、およびベンダー提供のプロトコールからの改作物であった。

実施例１６ 細胞溶解およびタンパク質アッセイ
細胞溶解について、フレッシュな溶媒系（１０ｍＬ）を、最初に、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５ｍＭβ－グリセロホスファート、０．１ｍＭ活性化オルトバナジン酸ナトリウム、２ｍＭ ＴＣＥＰ（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド）、および１×ＥＤＴＡフリーのプロテアーゼ阻害剤（ｃＯｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ、Ｒｏｃｈｅ）を含むように調製した。続いて、ペレット化した細胞を、１．５ｍＬマイクロチューブ（Ｄｉａｇｅｎｄｅ Ｉｎｃ．の超音波処理用のＴＰＸプラスチック）内に含有されるこの溶媒バッファ系（８００μＬ）内に結集した。次に、結集した細胞を、Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ（登録商標）超音波処理系（Ｄｉａｇｅｎｄｅ）を４℃の低温水浴内で１５分間の３０秒／３０秒の各オン／オフサイクルで用いる超音波処理に供した。各サンプルの総タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを用いて判定した。続いて、全ての溶解物を、以降の温度処理のために２μｇ／μｌのタンパク質濃度に希釈した。

実施例１７ 温度処理、上清「デカンティング」、およびタンパク質分解消化
ＤＭＳＯまたは化合物により処理した各サンプルの６つのアリコート（５０μｌ）を、他の文献（３９、４１）に記載されるサーモサイクラー（Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ Ｐｒｏ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）系により、ＰＣＲワークフロー用に設計した６本のチューブ内に入れて、６つの温度点（３５．０；４５．３；５０．１；５５．２；６０．７；および７４．９℃）にて３分間平衡化した。熱処理の後に、溶解物を４℃にて２０分間遠心分離して、不溶性のタンパク質をペレット化してから、可溶性の画分をデカントした。熱処理した各サンプル由来の４５μＬのアリコートを、タンパク質沈殿に供してから、Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中８Ｍ尿素の３０μＬ中で再構成した。次に、サンプルを、５ｍＭ ＴＣＥＰによるＣｙｓ－Ｃｙｓ結合の、そして１０ｍＭクロロアセトアミド（ＣＡＭ）によるアルキル化の還元に供して、還元Ｃｙｓ残基を保護した。サンプルを、２Ｍ尿素を有するように希釈して、トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて溶液中で一晩消化して、ペプチドを誘導した。

実施例１８ ペプチドの濃縮
結果として生じたペプチドを、真空マニホールドを使用するＳｅｐ－Ｐａｋ（登録商標）Ｖａｃ １ｃｃ Ｃ１８カートリッジ、カートリッジあたり５０ｍｇの吸着剤、５５～１０５μｍの粒子サイズ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏ．）を用いて「脱塩した」。簡潔に、抽出マニホールド上に適合したカラムを最初に、（１）ＡＣＮ（５００μＬ）２回、（２）ＡＣＮ／Ｈ_２Ｏ ７０／３０（ｖ／ｖ；０．１％ＦＡ；２００μＬ）１回、および（３）ＭＳグレード水（５００μＬ）２回により順番に洗浄した。続いて、各「消化」溶液由来のペプチドを、抽出マニホールド真空チャンバ中への真空での穏やかなアプライによるＣ１８材料上での固定に供して、各溶液を３回、「フロースルー」画分を収集して同カラム上に再び走らせることによって、移動させる。次に、ペプチド結合Ｃ１８カラムを、５００μＬのＭＳグレードＨ_２Ｏにより洗浄してから、１５０μＬのＡＣＮ／Ｈ_２Ｏ ７０／３０（ｖ／ｖ；０．１％ＦＡ）の３回の通過によって溶出した。全ての溶出画分を、１．５ｍＬ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中に収集して、速度真空系を用いた完全な乾燥に供した。

実施例１９ Ｔａｎｄｅｍ Ｍａｓｓ Ｔａｇ（ＴＭＴ）ベースのペプチド標識化および分画
続いて、乾燥した各サンプルを、ｓｉｘｐｌｅｘキット（ＴＭＴ６ｐｌｅｘ（商標）Ｉｓｏｂａｒｉｃ Ｌａｂｅｌ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｅｔ、２×０．８ｍｇ）を用いるＴＭＴベースの標識化に供した。ＴＭＴチャンネル（ＴＭＴ１２６、ＴＭＴ１２７、ＴＭＴ１２８、ＴＭＴ１２９、ＴＭＴ１３０、およびＴＭＴ１３１）を使用して、３５．０；４５．３；５０．１；５５．２；６０．７；および７４．９℃の温度処理由来のペプチド溶液を標識した。簡潔に、乾燥した各サンプル（１０μｇのタンパク質消化物の等価物）を、１００μＬの５０ｍＭ重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）中で再構成し、そして乾燥標識化試薬を、４０μＬのアセトニトリル（ＡＣＮ）中に溶解させた。続いて、再構成したペプチド溶液を、４０μＬの標識化試薬溶液と混合して、室温にて一晩維持して、ペプチドを標識した。次に、８μＬの５％ヒドロキシルアミンを加えて、反応混合液を室温にて１５分超の間維持することによって、標識化反応をクエンチした。次に、標識したペプチド溶液を一緒に混合して、速度真空系による完全な乾燥に供した。標識した乾燥ペプチド混合液を、ベンダー提供プロトコール（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用する逆相分画カラム（８つの画分）を用いて分画した。結果として生じた８つの画分を、速度真空系を用いて乾燥させて、ｎａｎｏ－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の前に０．１％ギ酸（３０μＬ）中で再構成した。

実施例２０ Ｎａｎｏ－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析
Ｎａｎｏ－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を、ＥＡＳＹ－ｎＬＣ（商標）ＨＰＬＣ系（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に連結したＱ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ（商標）質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で実行した。上記由来の１０μＬ等容量の再構成画分を、自社調製した逆相カラム上への最大印圧として３０，０００，０００Ｐａ（３００ｂａｒ）を用いて負荷した。Ｐ－２０００レーザープラーを用いて１００μｍ融合シリカカラムを引いてナノスプレー用の５μｍチップを持たしてから、キャピラリをＣ１８逆相樹脂（粒子サイズ：３μｍ直径；Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ ＨＰＬＣ ＧｍｂＨ）で充填することによって、各逆相カラムを調製した。９５％Ａ相（ＦＡ／Ｈ２Ｏ ０．１／９９．９、ｖ／ｖ）から２４％Ｂ相（ＦＡ／ＡＣＮ ０．４／９９．６、ｖ／ｖ）の１５０分間の、２４％Ｂ相から３５％Ｂ相の２５分間の変動移動相（ＭＰ）勾配を用いてから、全てのペプチドの溶出を確実にするための、４００ｎＬ／分での５分間超の同ＭＰ組成を維持することによって、ペプチドを溶出した。Ｎａｎｏ－ＬＣ移動相を、Ｎａｎｏｓｐｒａｙ Ｆｌｅｘ Ｓｏｕｒｃｅ（Ｐｒｏｘｅｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ａ／Ｓ）を用いて質量分析計中に導入した。加熱したキャピラリ温度を２７５℃にて維持して、イオンスプレー電圧を２．５ｋＶに維持した。ペプチド溶出の間、質量分析計の方法を、トップ２０の方法を用いてフルＭＳスキャンから最も強力なイオンを選択するようにプログラム化した正イオンモードで１８０分間作動させた。追加のパラメータ：Ｍｉｃｒｏｓｃａｎｓ １；解析度７０ｋ；ＡＧＣ標的３Ｅ６；最大ＩＴ ５０ｍｓ；スキャン範囲数１；スキャン範囲４００～１６００ｍ／ｚ；およびスペクトルデータタイプ「プロファイル」、そしてその後、データ依存性ＭＳ／ＭＳスキャンを以下のパラメータにより実行：Ｍｉｃｒｏｓｃａｎｓ １；解析度３５ｋ；ＡＧＣ標的１Ｅ５；最大ＩＴ ６４ｍｓ；ループカウント２０；ＭＳＸカウント１；単離ウィンドウ０．７ｍ／ｚ；固定した第１の質量１００ｍ／ｚ；ＮＣＥ ３８．０；およびスペクトルデータタイプ「Ｃｅｎｔｒｏｉｄ」。それぞれのデータ依存性セッティングを、以下のパラメータによりセット：最小ＡＧＣ標的１．００ｅ３；強度閾値１．６ｅ４；頂点トリガー「－」；チャージ排除「１，７，８，＞８」；Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｃｈａｒｇｅ Ｓｔａｔｅ「全て」；ペプチドマッチ「好ましい」；同位体を排除「オン」；動的排除３０．０ｓ；アイドル状態ならば「他を選ぶ」。データを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｘｃａｌｉｂｕｒ（４．１．３１．９）ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて記録した。

実施例２１ データ分析
結果として生じたＲＡＷファイルを、ＭａｘＱｕａｎｔソフトウェアスイート１．６．０．１６を用いて分析した。ＭＳ／ＭＳスペクトルを、ＵｎｉＰｒｏｔシーケンスデータベース（ｖ．２０１７年５月）由来のＭｕｓ筋タンパク質データベース（ＦＡＳＴＡフォーマット）のトリプシン消化物に対してインシリコ調査した。デフォルトＭａｘＱｕａｎｔパラメータセッティングを、以下を除いて、ｗｗｗ．ｍａｘｑｕａｎｔ．ｏｒｇからダウンロードして利用した：１）群特異的パラメータタブにおいて、「ＲｅｐｏｒｔｅｒイオンＭＳ２」として「タイプ」；「６ｐｌｅｘ ＴＭＴ」として選択した「アイソバリックラベル」；「０．００３Ｄａ」として「リポーター質量ｔｏｌ．」を有する；２）群特異的パラメータ、見逃した切断が最大３つの、トリプシンに特異的な「消化」モード；３）群特異的パラメータ、可変修飾アセチル（タンパク質Ｎ末端）を有するような、「修飾」；ペプチドあたり最大数５つの修飾を有するようなペプチドによる蛍光体（ＳＴＹ）およびメチオニン酸化；ならびに４）最小ペプチド長７残基、最大ペプチド質量４６００Ｄａを有するような、グローバルパラメータタブ。注、４つのそのような検索を、４つのサンプル毎に別々に実行した。続いて、結果として生じたＭａｘｑｕａｎｔ「ｐｅｐｔｉｄｅｓ．ｔｘｔ」ファイルを、プロセシングのために、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（商標）（バージョン１４．０７１８２．５０００、３２ビット）に、そしてその後ＪＭＰ（登録商標）１２．１．０（６４ビット、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓ ７ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ ６４ビット、Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｐａｃｋ １、Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ（Ｃ）２０１５ ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．）にインポートした。最小のＰＥＰ値が０．０５と特定したペプチドのみを、更なる評価のために選択した。タンパク質定量化値を、固有のペプチドのみ（１つのタンパク質について少なくとも１つ）の定量化値の合計から導き出した。以下の方法論を、各実験において、タンパク質毎に得た定量化値の手続き上の誤り訂正／正規化に利用した。

実施例２２ 統計分析
統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰｒｉｓｍおよびＲを用いて行った。２つのデータセットの比較を、対応のないスチューデントのｔ検定を用いて行った。２つを超えるデータセットの比較を、一元配置ＡＮＯＶＡに続いてボンフェローニの多重比較検定を用いて行った。腫瘍増殖アッセイのために、発明者らは、二元配置ＡＮＯＶＡに続いてテューキーの多重比較検定を用いた。結果を、平均±ＳＤまたは±ＳＥＭとして示す。カプラン－マイヤープロットを生存曲線に用いて、ログランク検定を用いて分析した。星印の数は、有意性のレベルを示す：^＊、ｐ＜０．０５；^＊＊、ｐ＜０．０１；^＊＊＊、ｐ＜０．００１、および^＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑのために、それらのマトリックスの下流分析を、Ｓｅｕｒａｔ（Ｖ３．１）によって行った。細胞フィルタリングは、全てのサンプルについて、２つの基準に従う：１）単一細胞内のＲＮＡの検出数は、５００を超えるべきである、２）単一細胞内に検出されるミトコンドリア遺伝子のパーセンテージは、１５％を超えるべきでない。各サンプル由来の残りの細胞を統合して、対数正規化した。ＳｅｕｒａｔのＰｈｅｎｏＧｒａｐｈを用いて、解析度セット０．５で細胞をクラスター化した。低次元ｔ－ＳＮＥ視覚化を、パープレキシティセッティング３０で正規化転写発現プロファイルを用いるＲｔｓｎｅパッケージによってコンピュータで行った。各細胞クラスターを、ＳｅｕｒａｔのＦｉｎｄＡｌｌＭａｒｋｅｒｓ機能によって見出されるマーカー遺伝子によって注釈する。各ＣＤ８^＋Ｔ細胞における細胞傷害性マーカー遺伝子の有意な発現を、左側切断混合ガウスモデルを用いることによって、コンピュータで求めた。ＣＥＴＳＡについての統計分析を、詳細に記載しており、本方法に含めた。

実施例２３ ＡＴＴ－Ｉは、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介腫瘍細胞死を促進する天然の小化合物である
結腸直腸腫瘍細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞媒介死をインビトロで向上させるための小分子化合物を特定するために、発明者らは、従来の漢方薬に広く用いられてきた５００種超のハーバル医薬草木から精製された５９４種の小分子化合物を含有するライブラリをスクリーニングした（化合物の表は示さず）。スクリーン系は、ＯＶＡ２５７－２６４（ニワトリオバルブミンのＭＨＣクラスＩ制限ペプチドエピトープ）を安定して発現するマウス結腸直腸腫瘍細胞株ＭＣ３８、およびＭＨＣクラスＩに制限され、かつＯＶＡ特異的ＴＣＲを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＯＴ－Ｉマウス（Ｃ５７ＢＬ／６－Ｔｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）１１００Ｍｊｂ／Ｊ）の脾臓からフレッシュに単離した。細胞傷害性活性が化学療法薬物のものに類似する化合物を排除するために、発明者らは最初に、ＣＤ８＋Ｔ細胞および腫瘍細胞の双方に及ぼす細胞傷害性を評価した（図１Ａ）。Ｔ細胞および腫瘍細胞（ビヒクル処理細胞の＞８０％の生存能力）の双方に及ぼす細胞傷害性が最小～低い４４９種の化合物を、インビトロルシフェラーゼアッセイを用いて、ＭＣ３８－ＯＶＡ腫瘍細胞の抗原特異的ＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞死の次のスクリーンのためにソートした。Ｔ細胞活性に最も強力に影響を与えたトップスリーランクの化合物は、イカリイン、ビオカニンＡ、およびアトラクチレノリドＩである（図１Ｂ）。それらの活性を、Ｔ細胞の、対腫瘍細胞の比率が５：１～１：５に及ぶＴ細胞細胞傷害性アッセイにより証明した（図１Ｃ）。アトラクチレノリドＩ（ＡＴＴ－Ｉ）が最も強力な活性を示したので、発明者らは、その作用機構をさらに特定することを選択する。ＣＤ８＋Ｔ細胞または腫瘍細胞の別々の前処理により、発明者らは、ＡＴＴ－Ｉが、ＣＤ８＋Ｔ細胞にではなく腫瘍細胞に依存して腫瘍死滅効果を増強することを見出した。これは、ＣＤ８＋Ｔ細胞のみの処理が、細胞傷害性に及ぼす顕著な効果を有していなかったからである（図１Ｄおよび１Ｅ）。ＡＴＴ－Ｉの活性をさらに確認するために、発明者らは、ＭＣ３８－ＯＶＡ腫瘍に由来する３Ｄ腫瘍オルガノイドを生成して、ＯＴ－Ｉ細胞と共培養した（図２）。ＡＴＴ－Ｉの処理により、腫瘍オルガノイドは、未処理のオルガノイドのものと比較して、ＯＴ－Ｉ細胞からの著しく高い死滅を示した。しかしながら、この処理は、ＯＴ－Ｉ細胞の追加なしでは、オルガノイドに及ぼす顕著な効果を有していなかった。まとめて、結果は、ＡＴＴ－Ｉ処理が、腫瘍細胞の免疫原性を増大させることを示唆している。

実施例２４ ＡＴＴ－Ｉは、免疫プロテアソーム構成要素Ｐｓｍｄ４と相互作用する
ＡＴＴ－Ｉは、オオバナオケラ（Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ ｍａｃｒｏｃｅｐｈａｌａ）の根茎から単離される主要な生物活性成分の１つである。以前の研究が、抗炎症、神経保護活性、および抗腫瘍活性が挙げられるＡＴＴ－Ｉの種々の薬理活性を報告してきた。しかしながら、報告されている生物活性はさておき、ＡＴＴ－Ｉの分子標的および関連する作用機構は、まだ確定されていない。ＡＴＴ－Ｉの化学構造に起因して、親和性プルダウンアッセイ等の直接的な生化学的法によってタンパク質標的を特定することは、技術的に困難である。ここで、発明者らは、細胞サーマルシフトシフトアッセイ（ＣＥＴＳＡ）と称される、溶融温度シフトに基づく質量サイトメトリスクリーニングアッセイを、ＡＴＴ－Ｉあり、またはなしで処理したＭＣ３８腫瘍細胞に行った。ＣＥＴＳＡアプローチは、高温に曝した場合に、小分子化合物の標的タンパク質が溶融曲線の変更を示す点で、そして薬物結合が、潜在的標的タンパク質の重要な熱安定化または不安定化を導く点で、従来のサーマルシフトアッセイと同じ原理で確立されている。対照の、そしてＡＴＴ－Ｉ処理したＭＣ３８腫瘍細胞の可溶化物を、様々な温度（３２℃～７５℃）に加熱した。細胞可溶化物の可溶性画分内の検出可能なタンパク質を、質量分析によって定量化して、その溶融温度シフトを確定した。スクリーンから特定したトップの潜在的タンパク質標的（Ｃｇｇｂｐ１、Ｓｏｒｂｓ３、Ｃｏｐｂ１、およびＰｓｍｄ４）の中で、発明者らは、そのタンパク質変性曲線およびサーマルシフトから、Ｐｓｍｄ４を、ＡＴＴ－Ｉの主な標的タンパク質として確認した。プロテアソーム２６Ｓサブユニット非ＡＴＰアーゼ４（Ｐｓｍｄ４）は、ＭＨＣＩ関連抗原ペプチドをプロセシングする２６Ｓ免疫プロテアソーム複合体における１９Ｓ調節因子リッドの必須の構成要素である。免疫プロテアソームにおいて、Ｐｓｍｄ４は、分解および抗原プロセシングのためにユビキチン化タンパク質の補充を媒介するユビキチン（Ｕｂ）受容体としての機能を果たす。Ｐｓｍｄ４の改変タンパク質安定性およびサーマルシフトを、さらに、マウス（ＭＣ３８）およびヒト（ＨＣＴ１１６）ＣＲＣ細胞でのウェスタンブロッティングアッセイによって証明した。これは、ＡＴＴ－Ｉ処理によるＰｓｍｄ４タンパク質安定性の増強を示した。Ｐｓｍｄ４とのＡＴＴ－Ｉの直接的相互作用を確認するために、細菌的に発現されたマウスＰｓｍｄ４を精製して、マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）結合アッセイにおいて、様々な濃度の下でＡＴＴ－Ｉとインキュベートした。結果は、Ｐｓｍｄ４に対するＡＴＴ－Ｉの顕著に高い親和性（Ｋｄ＝０．４μＭ）を示した（図２）。Ｐｓｍｄ４含有ヒト２６Ｓプロテアソームの構造分析は、Ｐｓｍｄ４のＣｙｓ５８基の近くに、ＡＴＴ－Ｉについての潜在的結合部位を予測した。ＡＴＴ－Ｉの結合は、プロテアソームの別の調節サブユニットであるＰｓｍｄ７が、Ｐｓｍｄ４と相互作用するのを妨げ得る。免疫プロテアソームにおけるＰｓｍｄ７の機能的役割が知られていない一方、発明者らは、ＡＴＴ－Ｉが、癌細胞内での抗原プロセシングにおける免疫プロテアソームの活性を促進するかを見ることを望んだ。２６Ｓ免疫プロテアソーム上でのＡＴＴ－Ｉの活性を確認するために、発明者らは、ＡＴＴ－１あり、またはなしで処理したＭＣ３８細胞の溶解物に関するキモトリプシン様活性、トリプシン様活性、およびカスパーゼ様活性を評価した。Ａｃ－ＡＮＷ－ＡＭＣ（キモトリプシン基質）、Ａｃ－ＰＡＬ－ＡＭＣ（トリプシン基質）、およびＡｃ－ＫＱＬ－ＡＭＣ（カスパーゼ基質）基質を、免疫プロテアソームとインキュベートして、それらの切断活性を、放出されるＡＭＣ蛍光によって測定した。ＡＮＷおよびＰＡＬは、免疫プロテアソームのための好ましい基質である一方、ＫＱＬは、免疫プロテアソームおよび構成的２６Ｓのプロテアソームの双方によって切断され得る。ＡＴＴ－Ｉ処理は、３つの全種類の基質をプロセシングする際に、免疫プロテアソームの著しく増強した活性を導く。しかしながら、細胞におけるＰＳＭＤ４のノックダウンは、ＡＴＴ－Ｉの効果を無効にした。このことは、免疫プロテアソームに及ぼすＡＴＴ－Ｉ活性が、ＰＳＭＤ４に依存性であることを示唆している。

実施例２５ ＡＴＴ－Ｉは、抗原提示を促進して、ＣＲＣ免疫治療の有効性を増強する
発明者らは、ＡＴＴ－Ｉ処理により、免疫プロテアソームによるプロテアーゼ基質の切断活性の増強を実証した。その結果として、この増強した免疫プロテアソーム活性は最終的に、腫瘍細胞上での抗原プロセシングおよび提示を促進し得る。ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する腫瘍抗原提示は、ＭＨＣクラスＩ複合体によって媒介される。ゆえに、発明者らは、マウス（ＭＣ３８、ＣＴ２６）およびヒト（ＨＣＴ１１６、ＳＷ８３７）ＣＲＣ細胞の表面上でのＭＨＣ－Ｉのレベルを評価した。結果は、マウス腫瘍細胞およびヒト腫瘍細胞が双方とも、細胞表面上でのＭＨＣ－Ｉ（ＭＣ３８およびＣＴ２６について、それぞれＨ－２ＫｂおよびＨ－２ｋｄ、そしてＨＣＴ１１６およびＳＷ８３７について、ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ）のレベルの増大を示すことを示した。このことは、ＡＴＴ－Ｉ処理した腫瘍細胞上での抗原提示の増大を示している。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＴＣＲとのＭＨＣ－Ｉの相互作用により腫瘍細胞を認識するので、発明者らは、腫瘍細胞認識の増強が、抗ＰＤ－１ベースの免疫治療の有効性を向上させるであろうと推測した。したがって、発明者らは、ＭＣ３８およびＣＴ２６由来の腫瘍を有するそれぞれＣ５７ＢＬ／６およびＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、ＡＴＴ－Ｉ（５０ｍｇ／ｋｇ）とのＰＤ－１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の組合せ処置に対するＣＲＣ腫瘍の治療的応答を評価した（図４Ａ、４Ｂ、および４Ｃ）。臨床の文脈について、マイクロサテライト不安定性が高い（ＭＳＩ－Ｈ）ＭＣ３８由来結腸直腸腫瘍は、ＰＤ－１処置により良好に応答した一方、マイクロサテライト安定（ＭＳＳ）腫瘍のモデルである、ＣＴ２６腫瘍を有するマウスは、低いＰＤ－１治療利益を示した。興味深いことに、双方の場合において、ＰＤ－１遮断処置へのＡＴＴ－Ｉの追加は、有意な腫瘍増殖制御をもたらした一方、ＡＴＴ－Ｉ処置は、それ自体のみでは、効果が控え目であった。結果は、ＡＴＴ－Ｉ処置が、ＭＳＩ－ＨおよびＭＳＳ腫瘍細胞内の腫瘍ネオアンチゲンの量に拘らず、腫瘍細胞のグローバルな抗原提示を促進し得ることを示唆した。加えて、免疫抑制腫瘍微環境に起因して、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、多くの場合、不活性状態にある。これは、抗原提示が増強した腫瘍細胞のより良好な死滅のためのＰＤ－１阻害によって活性化することができる。発明者らはさらに、同所性ＭＣ３８腫瘍モデルにおけるＰＤ－１遮断とのＡＴＴ－Ｉの組合せについての治療利益の増強を証明した（図４Ｄ）。ＰＤ－１ ｍＡｂ処置が、対照マウス（生存期間の中央値、３０日）またはＡＴＴ－Ｉのみで処置したマウス（生存期間の中央値、３５日）と比較して、腫瘍を有するマウスの生存期間（生存期間の中央値、５０日）を顕著に延長した一方、ＰＤ－１ ｍＡｂおよびＡＴＴ－Ｉの組合せはさらに、腫瘍を有するマウスの生存期間を延長し、生存期間の中央値が＞１５０日であった。臨床用途におけるオオバナオケラのバイオセーフティに関する以前の研究（最長７週間で毎日１．３２ｇ）と一致して、試験した用量でのＡＴＴ－Ｉの処置は、顕著なインビボ毒性がなかった。動物の体重、および主要臓器の病理分析は、ＡＴＴ－Ｉ処置群と対照ビヒクル群間の実質的ないかなる差異も明らかにしなかった。このことは、ＡＴＴ－Ｉの全身毒性が取るに足りないことを示唆している。Ｐｓｍｄ４上のＡＴＴ－Ｉの特異的標的化が、ＰＤ－１遮断の治療応答を増強したかを判定するために、発明者らは、ＭＣ３８－ＰＳＭＤ４ｌｏｓｓ腫瘍を有するマウスを、ＰＤ－１のみ、またはＡＴＴ－Ｉと組み合わせたＰＤ－１により処置した（図４Ｅ）。併用療法におけるＡＴＴ－Ｉ由来の追加の利益は、完全に消失することであった。これにより、Ｐｓｍｄ４を標的化することによるＡＴＴ－Ｉの特異的作用が確認された。

実施例２６ ＡＴＴ－Ｉは、ＣＲＣ免疫治療において、ＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤および細胞傷害性を増強する
ＡＴＴ－Ｉは免疫チェックポイント遮断療法において抗腫瘍免疫応答を促進するので、発明者らは次に、ＣＲＣ腫瘍の免疫学的変化に及ぼすＡＴＴ－Ｉ処置の効果を明確にすることを望んだ。この目的で、発明者らは、質量サイトメトリ（ＣｙＴＯＦ）を用いる腫瘍微環境の分析のために、ＭＣ３８細胞の同所性盲腸壁移植の２８日後に、結腸直腸腫瘍を収集した。上述の腫瘍増殖研究に類似して、ＡＴＴ－Ｉ処置は、ＰＤ－１ ｍＡｂ処置の抗腫瘍効果を有意に増強した（図５Ａ）。ＰＤ－１ ｍＡｂおよびＡＴＴ－Ｉの組合せは、ＰＤ－１ ｍＡｂまたはＡＴＴ－Ｉの単一剤処置と比較して、Ｔ細胞浸潤の大幅な増強、およびマクロファージ浸潤の引下げを導いた（表１）。これにより、より抗腫瘍の微環境に向けてバランスが傾く。更なる分析は、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の双方が、ＰＤ－１ ｍＡｂとのＡＴＴ－Ｉの組合せにより、より低いＣＤ６９発現レベルを示すことを明らかにした。ＣＤ６９の発現レベルの引下げは、Ｔ細胞疲弊からのレスキューの原因であり得る。これはまた、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）を分泌する能力の増強によって反映される。

ＡＴＴ－Ｉの抗腫瘍効果を担う免疫細胞集団を確定するために、発明者らは、マウスからＢ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、またはＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させた（図５Ｂ～５Ｄ）。枯渇抗体を、腫瘍接種前に、そしてその後３日毎に、実験の終わりまで腹膜内投与した。ＰＤ－１ ｍＡｂとのＡＴＴ－Ｉの組合せについての抗腫瘍効果は、ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇により完全に排除された。対照的に、ＣＤ４＋Ｔ細胞の枯渇は、顕著な効果がなかった一方、Ｂ細胞枯渇のみでは、抗腫瘍効果を最小限にしか引き下げなかった。ＡＴＴ－Ｉの主な効果が、ＣＤ８＋Ｔ細胞により媒介されたので、発明者らは次に、対照、ＡＴＴ－Ｉ、ＰＤ－１ ｍＡｂ、またはＡＴＴ－Ｉ＋ＰＤ－１ ｍＡｂにより処置したマウス由来の結腸直腸腫瘍サンプルの単細胞ＲＮＡ配列決定（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）分析を用いて、ＣＤ８＋Ｔ細胞機能を、各条件の下でさらに評価した。ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータのｔ－ＳＮＥプロット分析において、腫瘍内の細胞の型を、その遺伝子発現シグネチャーによって評価した。発明者らは、各処置により、腫瘍内のＴ細胞活性化遺伝子（Ｉｃｏｓ、Ｃｄ２８、Ｃｄ８ａ）および細胞傷害性遺伝子（Ｉｆｎｇ、Ｐｒｆ１、Ｐｄｃｄ１、およびＳｌａ２）の発現レベルを判定した（図６Ａ）。発明者らのデータにより、ＡＴＴ－ＩおよびＰＤ１ ｍＡｂの組合せ処置の活性化および細胞傷害性の増強が確認される（図６Ｂ）。組合せ処置群における細胞傷害性レベルは、高度に細胞傷害性のＣＤ８＋Ｔ細胞の有意な増大を示した。

次に、発明者らは、ＡＴＴ－Ｉによる腫瘍オルガノイドの処置が、同じ腫瘍組織由来の自己由来ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性に影響を与えるかを判定するために、患者由来の腫瘍オルガノイド（ＰＤＯ）モデルを用いた。フレッシュに摘出した腫瘍組織を、２人の結腸腺癌患者から得た。腫瘍解離の後に、腫瘍細胞を、接着間質細胞（線維芽細胞、内皮細胞、およびマクロファージ）と混合して、ＰＤＯを形成した。オルガノイドが直径１００μｍに達したときに、同じ腫瘍組織から単離した、予め活性化した自己由来ＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養した。スフェロイド解離およびＴ細胞細胞傷害性を評価した（図７Ａ～７Ｇ）。予想されるように、ＡＴＴ－Ｉ処理したＰＤＯは、著しく高いレベルのオルガノイド解離および腫瘍細胞死によって示されるように、対照ＰＤＯと比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞死の影響をより受けやすかった。まとめて、インビボ研究およびエクスビボ研究の結果は、ＡＴＴ－Ｉ処置がさらに、Ｔ細胞浸潤および細胞傷害を促進することによって結腸直腸癌を処置する際に、免疫チェックポイント遮断療法に力を与えることを示唆している。

Claims (12)

1. 癌性細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞細胞傷害性の有効性を増強させる方法であって、該癌性細胞をアトラクチレノリド（ＡＴＴ－Ｉ）と接触させるステップを含む、上記方法。
2. チェックポイント阻害剤を、ＡＴＴ－Ｉの投与と併せて投与するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. チェックポイント阻害剤が、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）またはプログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）の阻害剤である、請求項２に記載の方法。
4. 癌性細胞が結腸直腸癌（ＣＲＣ）細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
5. 癌細胞上での抗原負荷ＭＨＣ－Ｉ複合体の提示を増大させる方法であって、該癌細胞をＡＴＴ－Ｉと接触させるステップを含む、上記方法。
6. 癌細胞が結腸直腸癌（ＣＲＣ）細胞である、請求項５に記載の方法。
7. 接触がインビボで起こる、請求項５又は６に記載の方法。
8. 癌を処置する方法であって、癌を有する患者に、アトラクチレノリド（ＡＴＴ－Ｉ）を含む医薬組成物を投与するステップを含む、上記方法。
9. 癌が固形腫瘍であり、場合によっては、癌が結腸直腸癌（ＣＲＣ）である、請求項８に記載の方法。
10. チェックポイント阻害剤の投与をさらに含む、請求項８又は９に記載の方法。
11. 前記ＡＴＴ－Ｉが、化学療法と併せて投与される、請求項１０に記載の方法。
12. チェックポイント阻害剤が、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）またはプログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）の阻害剤である、請求項１０に記載の方法。