JP2020514734A - 腫瘍組織の免疫プロファイリング - Google Patents

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Abstract

患者の腫瘍組織において腫瘍免疫応答の直接の惹起、阻害、維持および／またはそれ以外の調節をするプロセスに関与するタンパク質を検出および定量するためにＳＲＭ／ＭＲＭアッセイが使用される。これらのアッセイは、組織微小環境の免疫プロファイルを提供し、癌免疫応答を操作する薬剤を癌治療薬と併用する免疫療法の改良法の一部として使用され得る。

Description

患者の個別の腫瘍免疫プロファイルを提供するために、癌患者から得られた腫瘍組織に対して、質量分析に基づく定量的プロテオーム分析を行う。患者の腫瘍組織に対して行われたタンパク質アッセイは、１）最適な免疫療法を予測する、２）最適な免疫療法に対する陽性応答と関連する、かつ／または３）患者自身の腫瘍細胞を攻撃するように患者自身の免疫系の惹起、阻害、維持、促進、および／もしくはそれ以外の調節をするタンパク質の検出およびそのレベルの定量的測定に有用である。これらのタンパク質の定量的分析によって提供される癌患者腫瘍組織免疫プロファイルは、例えば、患者の腫瘍免疫応答を操作するように設計された癌治療薬が患者に投与される場合に、治療法の決定に関して情報を得るために使用することができる。
多くの癌薬物は、腫瘍細胞の増殖および生存を促す特定のタンパク質を阻害することによって働くが、ある腫瘍種でどのタンパク質が発現されるのかを先験的に知ることができない場合が多い。従って、患者の腫瘍組織でのこれらのタンパク質の直接的検出および定量は、その腫瘍においてそのタンパク質活性を阻害し、癌を治療し、全体としての患者の生存に有益な効果を持つ治療薬、または薬剤の組合せの選択に指針を得るために使用され得る。組織中に存在する腫瘍細胞の単離物を含む腫瘍組織中のタンパク質の正確かつ精密な検出および定量は、組織顕微解剖により患者の腫瘍組織から抽出された腫瘍細胞で発現されるタンパク質に由来する特異的ペプチドの質量分析−ＳＲＭ／ＭＲＭ分析を経て行うことができる。これらのタンパク質は、検出前にこれらの特異的ペプチドを提供するように消化される。腫瘍組織の１回のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイでタンパク質群が定量されれば、腫瘍細胞を標的とする癌療法に関して情報を得るために使用できるタンパク質発現の「プロファイル」または「シグネチャー」が得られる。標的治療薬を用いた治療法の決定に関して情報を得るための定量的アッセイの例は、ＩＧＦ−１Ｒタンパク質（例えば、米国特許第８，７２８，７５３号参照）およびｃＭｅｔタンパク質（例えば、米国特許第９，３７２，１９５号）である。
癌患者における腫瘍に対する免疫応答には、多くのタンパク質が関与する。これらのタンパク質は、充実組織および様々なリンパ球系譜において腫瘍細胞および良性細胞などの多くの異なる細胞種で正常にも異常にも発現される。これらのタンパク質は共同して、患者自身の腫瘍細胞に対する患者自身の免疫応答を惹起、促進、調節、または阻害するように働く。各タンパク質は異なる機能を有するが、免疫系に対する効果は、どの細胞がタンパク質を発現しているかによって決まり得る。正常な状態では、免疫系は、リンパ球依存性腫瘍細胞傷害を介した自己と非自己の認識の複雑な分子シグナル伝達プロセスを経て腫瘍細胞を根絶する働きをする。しかしながら、この複雑なプロセスは、免疫監視を逃れる腫瘍細胞によって乱されることがある。多大な研究が、腫瘍細胞を攻撃し死滅させるように免疫系を操作することを試みるために、癌患者の腫瘍免疫応答タンパク質と相互作用するような小分子および生物学的治療薬を開発することに向けられてきた。標的免疫調節治療薬の投与が成功すれば、どの標的タンパク質が組織内で発現されるかを決定するために、患者の免疫系のランドスケープのタンパク質発現「プロファイル」または「シグネチャー」から大きな利益が得られるであろう。次に、この免疫プロファイルは、最適な患者転帰のためにはどの治療薬、または薬剤の組合せが腫瘍細胞に対して患者免疫系を武装させる、調節する、操作する、および／または補助する最大の機会を提供する可能性が最も高いのかという情報をもたらし得る。
患者の免疫系を操作するように設計された癌治療薬の例には、免疫チェックポイントタンパク質として知られるタンパク質のコレクションを標的とする免疫チェックポイント阻害剤が含まれる。ＰＤ−１タンパク質は、通常Ｔ細胞上に存在し、Ｔ細胞が体内の他の細胞を攻撃しないように保つ助けをする一種の「スイッチオフ」として機能する免疫チェックポイントタンパク質である。ＰＤ−１は、一部の正常（および癌）細胞の表面に存在するタンパク質であるＰＤ−Ｌ１に結合することによって機能する。ＰＤ−１がＰＤ−Ｌ１に結合すると、ＰＤ−１は、Ｔ細胞にＰＤ−Ｌ１を発現する細胞を攻撃しないようにシグナルを送る。癌細胞には多量のＰＤ−Ｌ１を発現するものがあり、このＰＤ−Ｌ１は免疫系に対して癌細胞をマスクし、Ｔ細胞からの攻撃を避けることによって癌細胞を免疫監視から逃れさせることを可能とする。ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１のいずれかを標的とするモノクローナル抗体は、癌細胞の「マスクを外し」、癌細胞に対する免疫応答を増強する。この癌治療戦略はある種の癌の治療に大いに有望視され、ＰＤ−１阻害剤の例としては、ペンブロリズマブ（キートルーダ(Keytruda)）およびニボルマブ（オプジーボ(Opdivo)）が挙げられる。これらの薬物は、黒色腫、非小細胞肺癌、腎臓癌、頭頸部癌、およびホジキンリンパ腫を含む数種の癌の治療に有用であることが示された。ＰＤ−Ｌ１阻害剤の例は、膀胱癌の治療に現在使用されているアテゾリズマブ（テセントリク(Tecentriq)）である。これらの薬物は、他種の癌に対する使用に関しても研究されている。ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１のいずれかを標的とする他の多くの薬物が、現在、臨床試験において、単剤または他の薬物との併用で試験されている。
ＣＴＬＡ４は、免疫系をチャージするまたは免疫系を不活性に保つことに効果を持ち得る免疫チェックポイントタンパク質として機能する、一部のＴ細胞上の別のタンパク質である。ＣＴＬＡ４と結合する薬物の一例は、ＣＴＬＡ４を阻害し、腫瘍細胞に対して身体の免疫応答を増強するモノクローナル抗体であるイピリムマブ（ヤーボイ(Yervoy)）である。この薬物は、黒色腫を治療するために現在使用されており、上述の薬物のように、これもまた他の癌に対しても研究されている。
これらの例は、腫瘍細胞および免疫系細胞の両方の分子状態に関する知識が有効な標的免疫癌治療戦略の一部としてどのように使用できるかを示す。組織学的に特定された細胞集団の分子プロファイリングのために、患者の腫瘍組織切片に直接由来する細胞の均質な集団を獲得できることは極めて有利であり、それにより、例えば、正常な上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、および免疫細胞を含む他のタイプの細胞内に存在し得る腫瘍細胞が研究できる。レーザーキャプチャーマイクロダイセクション(Laser Capture Microdissection)（ＬＣＭ）技術（米国特許第６，８６７，０３８号参照）は、正確に定義された細胞集団への腫瘍組織の分子分析の区画化を可能とする。ＬＣＭ、ならびにＤＩＲＥＣＴＯＲ技術（米国特許第７，３８１，４４０号）を含む他の市販の組織顕微解剖技術は、組織サンプルに由来する細胞の分子プロファイリングを病理学的に関連のある背景の中でとらえることを可能とすることによって、組織サンプルの分析を改善した。
組織顕微解剖は純粋な腫瘍細胞集団を提供するが、腫瘍組織から不十分な対象細胞しか得られない場合に、信頼性のある分子分析のためには、その使用は限定される。腫瘍免疫応答を惹起／維持するタンパク質の多くは、腫瘍組織に存在しないこともある少数の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）および／または免疫系細胞により発現され、従って、組織顕微解剖によって採集された対象細胞の純粋な集団の分析は、場合によっては可能でないことがある。腫瘍組織中で潜在的免疫調節治療候補タンパク質の存在を検出するためには、腫瘍細胞だけでなく、腫瘍の微小環境全体が考慮されよう。以下に記載する方法は、患者の腫瘍組織の分子免疫プロファイルの作製を可能とする。
癌患者の腫瘍組織から直接調製されたプロテオームライゼート中の特定のタンパク質を検出し、そのレベルを定量するためにＳＲＭ／ＭＲＭアッセイが使用される。これらのタンパク質は、最適な免疫療法の予測、最適な免疫療法に対する期待した有益な応答との連携、および／または癌患者自身の腫瘍細胞を死滅させるための癌患者の腫瘍免疫応答の惹起／阻害／維持／調節に関与する。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、癌患者の免疫系状態の個別の免疫プロファイルを構築するために有用である。これらのタンパク質の発現状態が決定されれば、次に、特定の治療薬を患者に投与することができ、それにより、このような薬剤は、患者自身の腫瘍細胞を死滅させるように癌患者自身の免疫系を操作するためにそれらの機能を阻害または促進するようにこれらの免疫系タンパク質と相互作用し、従って、患者の生存の向上をもたらす。このような免疫系操作治療薬は、今回記載されるＳＲＭ／ＭＲＭアッセイで決定されるように、癌患者の免疫系プロファイルに直接適合し得る生物学的薬剤および／または小分子薬剤を含んでなり、免疫癌治療の個別化戦略を提供する。
癌患者から得られたホルマリン固定腫瘍組織の生物学的サンプルにおいてタンパク質発現プロファイルを、生物学的サンプルから得られたタンパク質消化物において、ヒト免疫系の惹起、維持、促進、阻害、またはそれ以外の調節をする働きをする１以上のタンパク質を、質量分析を用いて検出および／またはそのレベルを定量すること、および前記生物学的サンプル中のタンパク質のレベルを計算することによって決定する方法が提供され、前記レベルは相対レベルまたは絶対レベルであり、前記１以上のタンパク質は、Ｂ７−１、Ｂ７Ｈ２、β−カテニン、ＣＡＬＲ、ＣＣＲ４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１６６、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４７、ＣＤ６８、ＣＤ７０、ＣＤ７３、ＣＤ８Ａ、ＣＥＡＣＡＭ５、ｃＭＹＣ、ＣＯＸ−２、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、ＤＮＭＴ１、ＥＺＨ２、ＧＢＰ２、ＨＭＧＢ１、ＩＮＦＧＲ２、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＲＦ１、ＭｙＤ８８、ＮＡＭＰＴ、ＮＡＰＲＴ１、ＮＹＥＳＯ１、ＯＸ４０Ｌ、ＰＤ−１、ＳＴＡＴ３、ベクリン−１、ＰＨＤ２、ＰＩ３Ｋβ、ＰＩ３Ｋδ、ＰＩ３Ｋγ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＩＦＮγ、ＳＴＫ１１、ＢＴＫ、ＡＲＧ１、ＴＤＯ、ＴＧＦβ１、ＣＤ１６、ＯＸ４０、ＩＬ−２、ＳＬＦＮ１１、ＣＤ３９、ＣＤ４４、ＣＳＦ１Ｒ、ＧＺＭＢ、ＰＲＦ１、ＣＤ２０６、ＧＮＬＹ、ＣＤ３Ｚ、ＡＴＦ３、ＴＬＲ８、ＣＤ１９、およびＣＴＬＡからなる群から選択される。
この消化物は、１以上のフラグメントペプチドを検出および／または定量する前に分画されてよく、その分画工程は、例えば、液体クロマトグラフィー、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、または逆相高速液体クロマトグラフィーであり得る。生物学的サンプルのタンパク質消化物は、Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅプロトコールによって調製されてよい。タンパク質消化物は、トリプシン消化物などのプロテアーゼ消化物を含み得る。
質量分析法は、例えば、タンデム質量分析、イオントラップ質量分析、三連四重極質量分析、ハイブリッドイオントラップ／四重極質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析、ＭＡＬＤＩ質量分析、および／またはタイムオブフライト質量分析であり得、使用する質量分析様式は、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、インテリジェント選択反応モニタリング（ｉＳＲＭ）、および／または多重選択反応モニタリング（ｍＳＲＭ）であり得る。
これらの方法では、フラグメントペプチドは、配列番号１〜１１のいずれかまたは総てのペプチドからなる群から選択され得る。より具体的には、以下のペプチドは、タンパク質：Ｂ７−１（配列番号１、配列番号２）、Ｂ７Ｈ２（配列番号３、配列番号４）、β−カテニン（配列番号５、配列番号６）、ＣＡＬＲ（配列番号７、配列番号８）、ＣＣＲ４（配列番号９、配列番号１０）、ＣＤ１３３（配列番号１１、配列番号１２）、ＣＤ１３７（配列番号１３）、ＣＤ１３７Ｌ（配列番号１４、配列番号１５）、ＣＤ１６６（配列番号１６、配列番号１７）、ＣＤ２８（配列番号１８）、ＣＤ３８（配列番号１９、配列番号２０）、ＣＤ３Ｇ（配列番号２１、配列番号２２）、ＣＤ４０（配列番号２３）、ＣＤ４０Ｌ（配列番号２４）、ＣＤ４７（配列番号２５、配列番号２６）、ＣＤ６８（配列番号２７、配列番号２８）、ＣＤ７０（配列番号２９）、ＣＤ７３（配列番号３０、配列番号３１）、ＣＤ８Ａ（配列番号３２、配列番号３３）、ＣＥＡＣＡＭ５（配列番号３４）、ｃＭＹＣ（配列番号３５、配列番号３６）、ＣＯＸ−２（配列番号３７、配列番号３８）、ＣＸＣＲ４（配列番号３９）、ＣＸＣＲ７（配列番号４０、配列番号４１）、ＤＮＭＴ１（配列番号４２、配列番号４３）、ＥＺＨ２（配列番号４４、配列番号４５）、ＧＢＰ２（配列番号４６、配列番号４７）、ＨＭＧＢ１（配列番号４８、配列番号４９）、ＩＮＦＧＲ２（配列番号５０、配列番号５１）、ＩＬ１３ＲＡ２（配列番号５２、配列番号５３）、ＩＲＦ１（配列番号５４、配列番号５５）、ＭｙＤ８８（配列番号５６、配列番号５７）、ＮＡＭＰＴ（配列番号５８、配列番号５９）、ＮＡＰＲＴ１（配列番号６０、配列番号６１）、ＮＹＥＳＯ１（配列番号６２、配列番号６３）、ＯＸ４０Ｌ（配列番号６４、配列番号６５）、ＰＤ−１（配列番号６６）、ＳＴＡＴ３（配列番号６７）、ベクリン−１（配列番号６８）、ＰＨＤ２（配列番号６９、配列番号７０）、ＰＩ３Ｋβ（配列番号７１、配列番号７２）、ＰＩ３Ｋδ（配列番号７３、配列番号７４）、ＰＩ３Ｋγ（配列番号７５、配列番号７６）、ＣＥＡＣＡＭ１（配列番号７７、配列番号７８）、ＩＦＮγ（配列番号７９、配列番号８０）、ＳＴＫ１１（配列番号８１、配列番号８２）、ＢＴＫ（配列番号８３、配列番号８４）、ＡＲＧ１（配列番号８５、配列番号８６）、ＴＤＯ（配列番号８７、配列番号８８）、ＴＧＦβ１（配列番号８９、配列番号９０）、ＣＤ１６（配列番号９１、配列番号９２）、ＯＸ４０（配列番号９３）、ＩＬ−２（配列番号９４）、ＳＬＦＮ１１（配列番号９５、配列番号９６）、ＣＤ３９（配列番号９７、配列番号９８）、ＣＤ４４（配列番号９９、配列番号１００）、ＣＳＦ１Ｒ（配列番号１０１、配列番号１０２）、ＧＺＭＢ（配列番号１０３、配列番号１０４）、ＰＲＦ１（配列番号１０５、配列番号１０６）、ＣＤ２０６（配列番号１０７、配列番号１０８）、ＧＮＬＹ（配列番号１０９、配列番号１１０）、ＣＤ３Ｚ（配列番号１１１、配列番号１１２）、ＡＴＦ３（配列番号１１３、配列番号１１４）、ＴＬＲ８（配列番号１１５、配列番号１１６）、ＣＤ１９（配列番号１１７、配列番号１１８）、およびＣＴＬＡ４（配列番号１１９）のそれぞれから選択され得る。
上記の方法では、組織はパラフィン包埋組織であり得る。組織は、原発腫瘍または続発性腫瘍などの腫瘍から得られ得る。
有利には、少なくとも１つのフラグメントペプチドが定量される。フラグメントペプチドの定量は、例えば、ある生物学的サンプル中のフラグメントペプチドの量を異なる別の生物学的サンプル中の同じフラグメントペプチドの量と比較することによって達成され得る。別の定量法では、生物学的サンプル中のフラグメントペプチドの量が、同じアミノ酸配列を有する、添加した既知量の内部標準ペプチドと比較することによって決定される。この内部標準ペプチドは、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈから選択される１以上の重い安定な同位体およびそれらの組合せを含有するペプチドなどの同位体標識ペプチドであり得る。
タンパク質消化物中の少なくとも１つのフラグメントペプチドの検出および／または定量は、被験体における対応するタンパク質の存在および癌との関連を示すために使用され得る。少なくとも１つのフラグメントペプチドの検出および／または量の定量の結果、もしくは対応するタンパク質のレベルは、癌患者の免疫系の活性化状態と相関させることができる。この相関工程は、癌患者の腫瘍細胞の分子状態についてさらなる情報を提供するために、他のタンパク質もしくは他のタンパク質由来のペプチドの検出および／または定量と組み合わせてもよい。
これらの方法はいずれも、生物学的サンプルが得られた患者または被験体に治療上有効な量の癌治療薬を投与することと組み合わせてよく、ここで、癌治療薬および／またはその癌治療薬の投与量は、タンパク質リストの配列番号１〜１１９のいずれか１以上の（複数の）フラグメントペプチドの検出および／または量に基づくものであり、それにより、この癌治療薬は、患者の腫瘍細胞を攻撃し死滅させるために癌患者の免疫応答の惹起、促進、操作、および／またはそれ以外の調節をするようにこれらのタンパク質の１以上と相互作用する免疫調節癌治療薬である。タンパク質リストの配列番号１〜１１９のいずれか１以上の（複数の）フラグメントペプチドの検出および／または量は、患者の腫瘍細胞を攻撃し死滅させるために癌患者の免疫応答の惹起、促進、操作、および／またはそれ以外の調節をするようにこれらのタンパク質の１以上と相互作用する免疫調節癌治療薬で処置された患者の治療転帰を予測するために使用することができる。
これらの方法では、タンパク質リストの配列番号１〜１１９の１以上の（複数の）フラグメントペプチドの検出および／または定量は、正の免疫系の活性化状態を検出するために使用可能であり、それにより、患者の免疫系は、患者自身の腫瘍細胞を活発に検出、攻撃し、死滅させている。
これらの方法は、患者の腫瘍細胞の増殖を促す他の癌タンパク質の分析と組み合わせてよく、ここで、患者の腫瘍細胞の増殖を阻害するように癌タンパク質の機能を阻害または調節する標的癌治療薬が、患者の腫瘍細胞を攻撃し死滅させるために癌患者の免疫応答の惹起、促進、操作、および／またはそれ以外の調節をするようにこれらのタンパク質の１以上と相互作用する免疫調節癌治療薬と同時に、組み合わせて患者に投与される。
発明の具体的説明
癌患者の免疫プロファイルを構築するために使用可能な特定の質量分析−ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイのための方法および組成物が提供される。免疫調節タンパク質由来の特定のプロテアーゼ消化ペプチドが、患者の腫瘍組織から直接調製されたプロテオームライゼートにおいて検出され、正確に定量される。これらのプロセスおよびアッセイは、患者の腫瘍の免疫ランドスケープを分析するためおよび患者自身の腫瘍細胞に対する活発かつ良好な免疫応答を誘導および補助する最適な癌治療薬による改善された治療方法を導くために使用することができる。具体的には、これらの方法は、癌患者から例えばホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍組織などの生物学的サンプルを得ること；前記腫瘍組織から、場合により組織顕微解剖を用いて細胞を採集すること；採集した細胞から質量分析用のライゼートを調製すること（例えば、米国特許第７，４７３，５３２号に記載のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ試薬およびプロトコールを使用）；ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを用いて前記ライゼートを分析すること（ここで、これらのアッセイは個々に実施されても多重実施されてもよい）；および前記ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイからのタンパク質検出／定量データを利用して免疫プロファイルを構築することを含む。これらの方法では、患者に対して改善された治療方法を決定するために使用可能なＳＲＭ／ＭＲＭアッセイデータが作成され、前記ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイにより検出および／または定量されたタンパク質の１以上と直接相互作用することによって患者の免疫系の惹起、調節、作用、促進、およびそれ以外の操作をする治療薬が選択される。
記載のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイによる患者の免疫プロファイルの決定は、限定されるものではないが、血液、尿、痰、胸水、腫瘍周囲の炎症液、正常組織、および／または腫瘍組織を含む、様々な患者由来サンプルで実施することができる。これらのタイプの患者由来生物学的サンプルの総てが分析可能であるが、有利には、サンプルは、ホルマリン固定パラフィン包埋（「ＦＦＰＥ」）患者腫瘍組織である。
外科的に摘出された組織のホルムアルデヒド／ホルマリン固定は、癌組織サンプル保存法として世界的に極めて一般的な方法であり、標準的な病理学の実践において受け入れられた慣例である。ホルムアルデヒドの水溶液は、ホルマリンと呼ばれる。「１００％」ホルマリンは、水中のホルムアルデヒドの飽和溶液（約４０容量％または３７質量％）と酸化および重合度を制限するために少量の安定剤、通常はメタノールからなる。組織が保存される最も一般的な方法は、組織全体をホルムアルデヒド水溶液（一般に１０％中性緩衝ホルマリンと呼ばれる）に長時間（８時間〜４８時間）浸漬した後、固定された組織全体を室温での長期保存のためにパラフィンワックスに包理することである。ホルマリン固定癌組織を分析することができる分子分析方法は、癌患者の組織の分析のためのおそらく最も受け入れられ、頻用されている方法である。
癌患者の組織、特に、ＦＦＰＥ組織でタンパク質発現を研究するために最も広く使用されている慣例法は、免疫組織化学（ＩＨＣ）である。ＩＨＣ法では、抗体に基づく検出を使用する。ＩＨＣ試験の結果は、ほとんどの場合、病理学者または組織検査技師によって解釈され、この解釈は主観的であり、特定のタンパク質を標的とする治療薬に対する感受性を予測し得る定量的データを提供することができない。加えて、Ｈｅｒ２ ＩＨＣ試験などのＩＨＣアッセイを含む研究は、このような試験から得られた結果が不良であるかまたは紛らわしい場合があることを示唆している。これはおそらく、研究室が異なれば陽性および陰性ＩＨＣ状態を分類するために使用する規則も異なるためである。検査を行う各病理学者もまた、結果が陽性であるかまたは陰性であるかを決定するために異なる判定基準を用いることがある。ほとんどの場合、これは検査結果がボーダーラインである場合、すなわち、結果が強い陽性でも強い陰性でもない場合に起こる。他の場合では、癌組織切片の一領域に存在する細胞で陽性と判定されても、癌組織切片の異なる領域の細胞では陰性と判定されることがある。
不正確なＩＨＣ検査結果は、癌を有すると診断された患者が最善の治療を受けないことを意味し得る。腫瘍組織の総てのまたは特定の領域／細胞が特定のタンパク質に関して真に陽性であるが、検査結果がそれを陰性と分類すれば、医師はその患者に適切な治療薬を投与する見込みがない。腫瘍組織は特定されたタンパク質の発現に関して真に陰性であるが、検査結果がそれを陽性と分類すれば、医師は、患者が利益を受ける見込みがないだけでなく、薬剤の二次的リスクに曝露されるにもかかわらず、特定の治療薬を使用する可能性がある。よって、不要な毒性および他の副作用を軽減すると同時に、患者が良好な免疫調節治療計画を受ける最大の機会を得られるように、腫瘍組織において特定の免疫系タンパク質を正確に検出し、その定量的レベルを適切に評価できることに大きな臨床価値がある。
腫瘍組織における特定の免疫系タンパク質の正確な検出および定量的レベルの適切な評価は、ＳＲＭ／ＭＲＭ法によって質量分析計で極めて効果的に決定することができる。この方法は、免疫系タンパク質を含む特定のタンパク質に由来するユニークなフラグメントペプチドを検出および定量するものであり、この場合、各ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャークロマトグラフィーピーク面積は、例えばＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅライゼート中に存在する複雑なペプチド混合物内で決定される（米国特許第７，４７３，５３２号参照）。米国特許第７，４７３，５３２号に記載の方法は、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．（ロックヴィル，Ｍｄ．）から入手可能なＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ試薬およびプロトコールを用いて好都合に行うことができる。タンパク質の定量的レベルは、それにより生物学的サンプル中の各タンパク質に由来する個々の特定されたペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャークロマトグラフィーピーク面積が、個々のフラグメントペプチドのそれぞれに関する既知量の「スパイク」内部標準のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャークロマトグラフィーピーク面積と比較されるＳＲＭ／ＭＲＭ法によって決定される。
一つの実施形態では、「スパイク」内部標準は、同じ正確なタンパク質由来フラグメントペプチドの合成型であり、ここで、この合成ペプチドは、２Ｈ、１８Ｏ、１７Ｏ、１５Ｎ、１３Ｃ、またはそれらの組合せなどの１以上の重い同位体で標識された１以上のアミノ酸残基を含有する。このような同位体標識内部標準は、質量分析が、天然のフラグメントペプチドクロマトグラフィーシグネチャーピークとは違った、独特で、比較ピークとして使用可能な予測可能で一貫したＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャークロマトグラフィーピークを生成するように合成される。よって、内部標準は、生物学的サンプル由来のタンパク質またはペプチド調製物に既知量で「スパイク(添加)され」、質量分析によって分析される場合に、天然ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャークロマトグラフィーピーク面積が内部標準ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャークロマトグラフィーピーク面積と比較され、この数値の比較が、生物学的サンプル由来の元のプロテオーム調製物中に存在する天然ペプチドの絶対モル濃度および／または絶対重量を示す。フラグメントペプチドの定量的データは、サンプルごとに分析されるプロテオームライゼートの量に従って示される。
所与のタンパク質に関してフラグメントペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発および実施するために、単なるペプチド配列を超えるさらなる情報が質量分析計によって使用できる。このさらなる情報は、特定のフラグメントペプチドの適切かつ集中的分析を行うために質量分析計（例えば、三連四重極質量分析計）を指示および教示するために使用される。標的ペプチドに関するさらなる情報は、各ペプチドのモノアイソトピック質量；その前駆体の荷電状態；前駆体ｍ／ｚ値；ｍ／ｚ遷移イオン；および各遷移イオンのイオンタイプのうち１以上を含み得る。このさらなる情報は、極めて複雑なタンパク質ライゼート内での単一の単離された標的ペプチドの分析を可能とする適切な指令を伴った質量分析計を提供する。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、三連四重極質量分析計またはイオントラップ／四重極ハイブリッド装置で効果的に実施可能である。これらのタイプの質量分析計は、現在、細胞内に含まれる全タンパク質に由来する何十万から何百万という個々のペプチドからなり得る極めて複雑なタンパク質ライゼート内で単一の単離された標的ペプチドを分析するために最も適した装置であると考えられる。しかしながら、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、ＭＡＬＤＩ、イオントラップ、イオントラップ／四重極ハイブリッド、または三連四重極装置を含む他のタイプの質量分析計で開発および実施することもできる。
生物学的サンプルにおいて特定のタンパク質を検出および定量するための単一ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの基礎は、より長い全長型のタンパク質に由来する１以上のフラグメントペプチドの同定および分析である。これは、質量分析計が、単一のフラグメントペプチドなどの極めて小さな分子を分析する際に極めて有効で、熟達し、かつ、再現性のある装置ではあるものの、質量分析計は全長の完全なタンパク質を有効に、熟達度をもって、または再現性よく検出および定量することができないからである。１分子のペプチドは１分子のタンパク質に由来し、従って、フラグメントペプチドのモル量の測定は、対応するタンパク質のモル量の直接的測定を与える。
個々のタンパク質のための単一ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイが開発可能な候補ペプチドは、理論上は、完全な全長タンパク質の完全なプロテアーゼ消化、例えば、トリプシンによる消化によって生成されるありとあらゆる個々のペプチドである。しかしながら、所与のタンパク質に関してＳＲＭ／ＭＲＭによりアッセイするのに最も有利なペプチド、および各ペプチドについての具体的に定義されたアッセイの特徴は先験的に予測されず、経験的に発見および決定されなければならない。また、対応するタンパク質を検出および再現性良く定量するために使用できるペプチドが現時点で同定されていないタンパク質もあることも判明している。
この予測可能性の欠如は、特にホルマリン固定パラフィン包埋組織由来のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅライゼートなどのタンパク質ライゼートにおける分析に最良のＳＲＭ／ＭＲＭペプチドを同定する場合に当てはまる。今回記載するＳＲＭ／ＭＲＭアッセイでは、各タンパク質に関して１以上のプロテアーゼ消化ペプチド（トリプシン消化ペプチド）を指定し、各ペプチドは、ホルマリン固定患者組織から調製されたＬｉｑｕｉｄ ＴｉｓｓｕｅライゼートにおけるＳＲＭ／ＭＲＭアッセイに有利なペプチドであると決定されている。同定されたペプチドのそれぞれは、再現性良く検出および定量することができる。
今回記載するＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、患者の腫瘍組織微小環境の免疫プロファイルを構築するために使用可能なタンパク質を検出および定量する。このタンパク質のコレクションは、良好な個別の腫瘍免疫応答を惹起、阻害、維持、調節する、および良好な個別の腫瘍免疫応答を誘導するために最適な、または少なくとも好ましい治療薬に関連する様々な機能を提供する。これらのタンパク質には、限定されるものではないが、増殖因子、増殖因子受容体、細胞外基質タンパク質、核転写因子、上皮細胞分化因子、免疫細胞分化因子、細胞／細胞認識因子、自己・腫瘍認識因子、免疫細胞活性化因子、免疫細胞阻害因子、および免疫チェックポイントタンパク質が含まれる。このタンパク質コレクション内のこれらの個々のタンパク質のそれぞれは、限定されるものではないが、上皮腫瘍細胞、正常上皮細胞、正常線維芽細胞、腫瘍関連線維芽細胞、正常内皮細胞、腫瘍関連内皮細胞、正常間葉系細胞、および腫瘍関連間葉系細胞などのあらゆる種類の固形組織細胞を含む、癌患者内の多種の細胞によって発現され得る。これらのタンパク質のそれぞれはまた、限定されるものではないが、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状突起、肥満細胞、ナチュラルキラー細胞、好酸球、好中球、および好塩基球などのあらゆる種類のリンパ球を含む、多種の血液由来白血球細胞によっても発現され得る。多くの場合、これらの個々のタンパク質のそれぞれは、固形組織細胞および血液由来組織細胞の両方によって発現され得る。
これらのタンパク質のそれぞれの細胞発現パターンは、その個体の健康状態によって大きく異なり得る。正常および通常の健康状態では、これらのタンパク質は健康な免疫系を維持し、それにより、自己の細胞認識は、主として主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）を介して非自己の認識とバランスがとれている。ＭＨＣは、脊椎動物において外来分子を認識するために免疫系に不可欠な細胞表面タンパク質のセットであり、そしてこれが組織適合性を決定する。
ＭＨＣ分子の主要な機能は、病原体に由来するペプチドフラグメントに結合し、適当なＴ細胞による認識のためにそれらを細胞表面に提示することであり、従って、その病原体に対して免疫応答が惹起され得る。ＭＨＣ分子は、免疫細胞である白血球とそれ以外の白血球細胞または固形組織である体細胞との相互作用を媒介する。ＭＨＣは、臓器移植のドナーの適合性、ならびに交差反応免疫誘導を介して自己免疫疾患に対する個体の感受性を決定する。ヒトでは、ＭＨＣはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ともよばれる。細胞では、宿主自身の表現型の、または他の生物学的実体のタンパク質分子が絶えず合成されては分解される。細胞表面上の各ＭＨＣ分子は、エピトープとよばれるタンパク質の分子画分を提示している。提示される抗原は自己または非自己のいずれかであり得る。抗原が自己として認識されれば、生物体の免疫系は、その自身の細胞を免疫系の死滅応答で標的化しないようにする。
ＭＨＣは、身体を病原体から保護するだけでなく、自然の癌細胞制御にも主要な役割を果たす。癌細胞は、免疫系に警報を発するためにＭＨＣによって提示され得る、多くの突然変異タンパク質および異常な発現のタンパク質を含んでいる。腫瘍細胞はまた、正常タンパク質を、異常な場所で、異常な様式で、および／または異常な量で発現して、免疫応答を動員または阻害するようにシグナルを与えることがある。正常細胞は、正常な細胞タンパク質のターンオーバーからそのクラスＩ ＭＨＣ上にペプチドを提示し、免疫系細胞（白血球）は、白血球の表面に通常発現される特定のタンパク質によって媒介される中枢および末梢性免疫寛容機構のために、それらに応答して活性化されない。ウイルス感染後または癌細胞による異常なタンパク質発現の場合などに、細胞が外来タンパク質を発現する場合、クラスＩ ＭＨＣの一部が細胞表面にこれらのペプチドを提示する。結果として、そのＭＨＣ：ペプチド複合体に特異的な白血球が、異常なペプチドを提示する癌細胞を含むそれらの細胞を認識して死滅させる。あるいは、クラスＩ ＭＨＣそれ自体が、ウイルス感染細胞および癌細胞を死滅させるナチュラルキラー細胞（ＮＫ）とよばれる白血球の集団に対して阻害リガンドとして働くこともできる。表面クラスＩ ＭＨＣの正常なレベルの低下（免疫回避中にいくつかのウイルスにより、またはある種の腫瘍で使用される機構）は、ＮＫにより媒介される細胞死滅を不活化することによって、腫瘍細胞が免疫介在性死滅を回避するよう助ける。
癌細胞は、他の方法でも免疫介在性細胞死を回避することができる。免疫監視を回避するために別の戦略を使用している癌細胞の例は、ＰＤ−Ｌ１チェックポイントタンパク質を異常発現する癌細胞の場合である。プログラムされた細胞死−リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）は、妊娠、組織同種移植、自己免疫疾患、および他の病態、例えば癌などの特定の事象の際に免疫系の抑制に主要な役割を果たす膜貫通タンパク質である。通常、免疫系は、リンパ節または脾臓にいくらかの蓄積がある場合に、ＰＤ−１を発現する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘発する外来抗原と反応する。ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合は、これらのＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を低減し、それにより、癌細胞を無視するように免疫系にシグナル伝達を行う阻害シグナルを伝達する。
癌細胞により上方調節されたＰＤ−Ｌ１の異常な発現は、癌細胞が宿主免疫系を回避することを可能とする。腎細胞癌を有する患者からの１９６の腫瘍検体の分析によれば、ＰＤ−Ｌ１の高い腫瘍発現は腫瘍の悪性度および死亡リスクの４．５倍の上昇に関連付けられることが見出された。ＰＤ−Ｌ１発現がより高い卵巣癌患者は、発現がより低い患者よりも有意に不良な予後を示す。また、ＰＤ−Ｌ１発現は上皮内ＣＤ８＋Ｔリンパ球数と逆相関があることも知られ、腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１が抗腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞を抑制し得ることが示唆される。多くのＰＤ−Ｌ１阻害剤が、現在、慣例の癌治療で使用されているか、免疫に基づく癌治療薬として開発中であり、これらの薬剤は、多くの患者で良好な奏効率を示す。
免疫に基づく癌治療戦略は、患者自身の免疫系を患者自身の癌細胞と闘い、死滅させるために惹起、調節、強化または操作するように設計されている。多くの形態の免疫療法が癌の治療のための有力な新規アプローチとなりつつある。本明細書に記載のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ法は、腫瘍により活性化される免疫応答を惹起および／またはそのバランスを調節するために免疫に基づく癌治療薬を用いる、可能性のある治療戦略の情報が得られるように、患者の腫瘍細胞中のＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１免疫チェックポイントタンパク質などの定量的タンパク質発現データを提供することを可能とする。免疫チェックポイントタンパク質に関する単一ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの例は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１０３８６においてＰＤ−Ｌ１タンパク質に関して記載されている。
今回記載するＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、多くの異なる細胞種により発現されるユニークなタンパク質の発現を検出および定量し、各タンパク質は癌細胞に対する免疫系の反応の惹起および／または調節に関与する。これらのアッセイのそれぞれは、単一のタンパク質を検出および測定するために同定された少なくとも１つの最適なペプチドを記載し、それにより、各アッセイは、個々にまたは他のタンパク質に関する他のペプチドと多重で行うことができる。このタンパク質およびペプチドの一覧を表１に示す。これらのアッセイが開発されたタンパク質を１以上の一般名および／または別名により表１に挙げる。
Ｂ７−１（分化抗原群(cluster of differentiation)８０、ＣＤ８０）、
Ｂ７Ｈ２（分化抗原群２７５、ＣＤ２７５）、
β−カテニン、
ＣＡＬＲ（カルレティキュリン、カルレグリン）、
ＣＣＲ４（分化抗原群１９４、ＣＤ１９４）、
ＣＤ１３３（分化抗原群１３３）、
ＣＤ１３７（分化抗原群１３７、ＴＮＦＲＳＦ９）、
ＣＤ１３７Ｌ（分化抗原群１３７リガンド）、
ＣＤ１６６（分化抗原群１６６、ＣＤ６Ｌ、ＭＥＭＤ）、
ＣＤ２８（分化抗原群２８）、
ＣＤ３８（分化抗原群３８、サイクリックＡＤＰリボースヒドロラーゼ）、
ＣＤ３Ｇ（分化抗原群３Ｇ）、
ＣＤ４０（分化抗原群４０）、
ＣＤ４０Ｌ（分化抗原群４０リガンド、ＣＤ１５４）、
ＣＤ４７（分化抗原群４７、インテグリン関連タンパク質）、
ＣＤ６８（分化抗原群６８）、
ＣＤ７０（分化抗原群７０）、
ＣＤ７３（分化抗原群７３、エクト−５’−ヌクレオチダーゼ）、
ＣＤ８Ａ（分化抗原群８Ａ）、
ＣＥＡＣＡＭ５（癌胎児性抗原関連細胞接着分子５、ＣＤ６６Ｅ）、
ｃＭＹＣ（ｖ−ｍｙｃ鶏骨髄球種ウイルス癌遺伝子ホモログ(v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog)）、
ＣＯＸ−２（シクロオキシゲナーゼ２）、
ＣＸＣＲ４（分化抗原群１８４）
ＣＸＣＲ７（Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体タイプ７、ＧＰＲ１５９）、
ＤＮＭＴ１（ＤＮＡシトシン−５−メチルトランスフェラーゼ１）、
ＥＺＨ２（ｚｅｓｔｅホモログ２のエンハンサー(enhancer of zeste homolog 2)）、
ＧＢＰ２（インターフェロン誘導グアニル酸結合タンパク質２(interferon-induced guanylate-binding protein 2)）、
ＨＭＧＢ１（高移動度群タンパク質１(high-mobility group protein 1)）、
ＩＦＮＧＲ２（インターフェロンγ受容体２）、
ＩＬ１３ＲＡ２（インターロイキン−１３受容体サブユニットα−２）、
ＩＲＦ１（インターフェロン調節因子１）、
ＭｙＤ８８（骨髄分化一次応答遺伝子８８(myeloid differentiation primary response gene 88)）、
ＮＡＭＰＴ（ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ）、
ＮＡＰＲＴ１（ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ）、
ＮＹＥＳＯ１（ニューヨーク食道扁平上皮癌１(New York Esophageal Squamous Cell Carcinoma 1)）、
ＯＸ４０Ｌ（分化抗原群２５２）、
ＰＤ−１（プログラム細胞死タンパク質−１）、
ＳＴＡＴ３（シグナル伝達兼転写活性化因子３(signal transducer and activator of transcription 3））、
ベクリン−１（ＢＥＣＮ１）、
ＰＨＤ２（プロリルヒドロキシラーゼドメイン含有タンパク質２(prolyl hydroxylase domain-containing protein 2)）、
ＰＩ３Ｋβ（ホスファチジルイノシトール−４，５−ビスリン酸３−キナーゼ−β）、
ＰＩ３Ｋδ（ホスファチジルイノシトール−４，５−ビスリン酸３−キナーゼ−δ）、
ＰＩ３Ｋγ（ホスファチジルイノシトール−４,５−ビスリン酸３−キナーゼ−γ）、
ＣＥＡＣＡＭ１（癌胎児性抗原関連細胞接着分子１(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1)、分化抗原群６６ａ、ＣＤ６６ａ）、
ＩＦＮγ（インターフェロンタイプＩＩ）、
ＳＴＫ１１（肝臓キナーゼＢ１、ＬＫＢ１）、
ＢＴＫ（ブルトンチロシンキナーゼ）、
ＡＲＧ１（アルギナーゼ）、
ＴＤＯ（トリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ）、
ＴＧＦβ１（トランスフォーミング増殖因子β１）、
ＣＤ１６（分化抗原群１６、ＦＣＧＲ３Ａ）、
ＯＸ４０（ＣＤ１３４、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー４）、
ＩＬ−２（インターロイキン２）、
ＳＬＦＮ１１（Ｓｃｈｌａｆｅｎファミリーメンバー１１）、
ＣＤ３９（エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ−１）、
ＣＤ４４（食細胞性糖タンパク質−１）、
ＣＳＦ１Ｒ（コロニー刺激因子１受容体）、
ＧＺＭＢ（グランザイムＢ）、
ＰＲＦ１（パーフォリン−１）、
ＣＤ２０６（マンノース受容体）、
ＧＮＬＹ（グラニュライシン）、
ＣＤ３Ｚ（Ｔ細胞受容体Ｔ３ζ鎖）、
ＡＴＦ３（サイクリックＡＭＰ依存性転写因子）、
ＴＬＲ８（Ｔｏｌｌ様受容体８）、
ＣＤ１９（Ｂリンパ球抗原ＣＤ１９）、および
ＣＴＬＡ４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４）。
驚くことに、表１に挙げられているタンパク質に由来する多くの潜在的ペプチド配列は、すぐに明らかにならないという理由で、質量分析に基づくＳＲＭ／ＭＲＭアッセイで使用するには好適でないか、または有効でないことが判明した。ＭＲＭ／ＳＲＭアッセイに最も好適なペプチドを予測することが不可能であったので、指定の各タンパク質に対して信頼性があり、正確なＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するために、実際のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅライゼート中の修飾および非修飾ペプチドを実験的に同定する必要があり、これは可能である。いずれの理論にも縛られるものではないが、いくつかのペプチドは、例えば、十分にイオン化しないか、または他のタンパク質と明瞭に異なるフラグメントを生成しないので、質量分析によって検出することが困難であり得ると考えられる。また、ペプチドはクロマトグラフィー分離で十分に分解できないことがあり、またはガラスもしくはプラスチック器具に付着することがある。
表１に見られるペプチドは、ホルマリン固定癌組織から獲得された細胞から調製された複雑なＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅライゼート内の総てのタンパク質のプロテアーゼ消化によるそれらの各指定タンパク質に由来した。そうではないことが記載されない限り、各場合において、プロテアーゼはトリプシンであった。次に、Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅライゼートを質量分析により分析して、質量分析により検出および分析される指定タンパク質に由来するペプチドを決定した。質量分析のためのペプチドの特定の好ましいサブセットの同定は、実験条件下で、タンパク質由来のどの１または複数のペプチドがＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅライゼートの質量分析でイオン化するのかの発見に基づき、従って、そのペプチドが、そのプロトコールおよびその質量分析法によって分析されるＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅライゼートの調製において使用される実験条件から生じる能力を示す。
このタンパク質コレクションの最適なペプチドは、次のようにして発見された。ホルマリン（ホルムアルデヒド）固定組織から直接獲得された細胞からのタンパク質ライゼートは、Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ試薬、および組織顕微解剖によって細胞をサンプル管に採取すること、次いでそれらの細胞をＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅバッファー中で長時間加熱することを含んでなるプロトコールを用いて調製した。ホルマリンにより誘導される架橋に悪影響があったところで、次に、それらの組織／細胞を、例えば、限定されるものではないがプロテアーゼトリプシンを含むプロテアーゼを用い、予測可能な様式で完全に消化した。各タンパク質ライゼートは、無傷のポリペプチドのプロテアーゼでの消化により、ペプチドコレクションとなった。ペプチドの多重グローバルプロテオームサーベイを実施するために、各Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅライゼートを分析し（例えば、イオントラップ質量分析による）、ここで、データは各タンパク質ライゼート中に存在する総ての細胞タンパク質から質量分析によって同定され得るできる限り多くのペプチドの同定として提供された。単一の複雑なタンパク質／ペプチドライゼートからできる限り多くのペプチドを同定するために、グローバルプロファイリングの実施が可能なイオントラップ質量分析計または他の形式の質量分析計が一般に使用される。しかしながら、イオントラップ質量分析計は、ペプチドのグローバルプロファイリングを行うための最良のタイプの質量分析計であり得る。
使用される条件下で単一のライゼートの単一のＭＳ分析においてできる限り多くのペプチドが同定されたところで、次に、ペプチドリストを照合し、そのライゼート中で検出されたタンパク質を決定するために使用した。このプロセスを複数のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅライゼートに対して繰り返し、極めて大きなペプチドリストが照合されて単一のデータセットを得る。このタイプのデータセットは、分析されたそのタイプの生物学的サンプル（プロテアーゼ消化後）において、具体的には、生物学的サンプルのＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅライゼートにおいて質量分析によって検出され得るペプチドを表すと考えることができ、従って、指定タンパク質のそれぞれに関するペプチドを含む。
一つの実施形態では、指定タンパク質の絶対量または相対量の決定において有用として同定されたトリプシンペプチドを表１に挙げる。これらのペプチドのそれぞれは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織から調製されたＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅライゼートにおける質量分析によって検出された。よって、各ペプチドは、直接的にはホルマリン固定患者組織を含むヒト生物学的サンプル中の指定タンパク質のための定量的ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するために使用することができる。
各指定タンパク質由来の特定のフラグメントペプチドについての特異的でユニークな特徴を、イオントラップおよび三連四重極質量分析計の両方で全フラグメントペプチドを分析することによって構築した。そのような情報は、ホルマリン固定サンプル／組織からのＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅライゼートにおいて直接、各また総ての候補ＳＲＭ／ＭＲＭペプチドに関して実験的に決定しなければならないが、それは興味深いことに、本明細書に記載されるようなＳＲＭ／ＭＲＭを用いてこのようなライゼート中で、いずれの指定タンパク質由来のペプチドも総てが検出できるわけではないためであり、検出されないフラグメントペプチドは、ホルマリン固定サンプル／組織からのＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅライゼートにおいて直接、ペプチド／タンパク質を定量する上で使用するためのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するための候補ペプチドと考えることはできないことを示す。
所与のペプチドの特定の遷移イオン特性は、ホルマリン固定された生物学的サンプル中の特定のフラグメントペプチドを検出するためだけではなく、このフラグメントペプチドを定量的に測定するためにも使用され得る。これらのデータは、このフラグメントペプチドの絶対量を、被分析タンパク質ライゼート１マイクログラム当たりのペプチドのモル量の関数として示す。ホルマリン固定された患者由来組織の分析に基づく、組織における対応するタンパク質レベルの評価は、各特定の患者についての診断、予後、および治療関連情報を提供することができる。
一つの実施形態では、生物学的サンプル中の表Ｉに挙げられたタンパク質のそれぞれのレベルを測定するための方法であって、その生物学的サンプルから調製されたタンパク質消化物中の１以上のフラグメントペプチドの量を、質量分析を用いて検出および／または定量すること；ならびに前記サンプル中の修飾または非修飾タンパク質のレベルを計算することを含んでなる方法が提供され、ここで、前記レベルは相対レベルまたは絶対レベルである。関連の実施形態では、１以上の修飾または非修飾フラグメントペプチドの定量は、生物学的サンプル中のフラグメントペプチドのそれぞれの量を、添加した既知量の内部標準ペプチドとの比較により決定することを含んでなり、ここで、生物学的サンプル中のフラグメントペプチドのそれぞれが、同じアミノ酸配列を有する内部標準ペプチドと比較される。いくつかの実施形態では、内部標準は、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈまたはそれらの組合せから選択される１以上の重い安定同位体を含んでなる、同位体で標識された内部標準ペプチドである。１分子の所与のペプチドが単一分子のタンパク質に由来するので、ペプチドのモル量は、存在するタンパク質のモル量の直接的な測定値である。
本明細書に記載の生物学的サンプル中の指定タンパク質（またはそのサロゲートとしてのフラグメントペプチド）のレベルを測定するための方法は、患者または被験体における癌の診断指標として使用することができる。一つの実施形態では、指定タンパク質のレベルの測定から得られた結果は、組織に見られるタンパク質のレベルを正常組織および／または癌組織もしくは前癌組織に見られるタンパク質のレベルと相関させる（例えば、比較する）ことによって癌の診断ステージ／グレード／状態を決定するために使用することができる。別の実施形態では、指定タンパク質のレベルの測定から得られた結果は、どの癌治療薬で癌患者を処置するか、従って、最適な癌治療計画を決定するために使用することができる。
組織免疫ランドスケープは極めて複雑であり、それによって、複数のタイプの固形組織細胞および局在性／非局在性の免疫細胞によって発現される複数のタンパク質は、複数の治療薬適応のために複数のアッセイを必要とする。このレベルのタンパク質アッセイの複雑性は、今回記載するＳＲＭ／ＭＲＭアッセイによって分析することができる。これらのアッセイは、限定されるものではないが、可溶性タンパク質、膜結合タンパク質、核因子、分化因子、細胞間相互作用を調節するタンパク質、分泌タンパク質、免疫チェックポイントタンパク質、免疫阻害タンパク質、サイトカイン、およびリンパ球活性化／阻害因子を含む様々な分子機能を有する多くの異なるタンパク質を同時に検出および定量するように設計される。
組織顕微解剖は、患者の腫瘍細胞の状態を具体的に定義する免疫プロファイルを決定するために、記載されるＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを用いて、タンパク質発現分析向けに患者腫瘍組織から純粋な腫瘍細胞集団を獲得するために有利に使用される。腫瘍組織の組織顕微解剖は、ＤＩＲＥＣＴＯＲ技術を利用した細胞および細胞集団のレーザー誘起前方転送のプロセスを用いて実施することができる。エネルギー移動層間コーティングの利用を介した、組織のレーザー誘起前方転送のためのＤＩＲＥＣＴＯＲスライドの使用を記載する方法が米国特許第７，３８１，４４０号に記載され、その内容は引用することによりそれらの全体が本明細書の一部とされる。しかしながら、腫瘍細胞の顕微解剖純粋集団は、腫瘍細胞を死滅させると期待される細胞、すなわち、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）のタンパク質発現シグネチャー／プロファイルを無視する可能性がある。この制限は、純粋な腫瘍細胞集団に加え、純粋なＴＩＬ集団を獲得するために組織顕微解剖を利用することによって克服することができ、それにより、大集団のＴＩＬを含む組織領域が採取でき、記載のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを用いるタンパク質発現分析向けに処理することができる。２つの明瞭に異なる細胞集団の採集および分析を介し、患者にとって好ましいまたは最適な治療計画についての情報を得るために患者の免疫プロファイルを決定することができ、それにより、最適な免疫介在性腫瘍細胞死滅のための特定の免疫調節薬によって免疫系を調節することができ、標的治療薬および／または免疫介在性腫瘍細胞死により腫瘍細胞を標的とすることができる。
組織顕微解剖はＳＲＭ／ＭＲＭ分析用の患者組織から、特定された細胞集団の純粋な集団を作り出すが、大部分の腫瘍組織は、明瞭に異なるＴＩＬ集団の大領域が顕微解剖されることを好適に示すわけではない。ほとんどの場合、ＴＩＬは、不均質な複雑組織微小環境にまばらに散在するので、比較的純粋な腫瘍細胞集団は効果的に分析できるが、純粋なＴＩＬ集団の分析はいつも効果的であるわけではない。腫瘍組織由来ＴＩＬは、免疫系調節薬を用いて免疫応答の正の操作について情報を得るために重要な多くのタンパク質を発現するので、分析するべきである。この制限は、患者組織内に存在する腫瘍微小環境の全域から、記載のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ用の分析可能なタンパク質ライゼートを調製することによって克服することができる。このライゼートは、限定されるものではないが、腫瘍細胞、良性の非腫瘍細胞、および免疫細胞を含む、多くの異なる細胞種の全体の複雑な環境のプロテオーム表現を含有する。このように、極めて複雑な患者特異的免疫プロファイルは、患者の腫瘍環境の全免疫ランドスケープをキャプチャーすることによって決定することができる。加えて、同じ組織から連続切片の組織顕微解剖により回収されるような精製された腫瘍細胞集団の分析は、全域腫瘍微小環境ランドスケープと比較および対比することができる。このアプローチは、その組織サンプル中には存在しない局在性のＴＩＬおよび／または免疫細胞によって発現される可能性が最も高い免疫応答タンパク質およびそれらのタンパク質が腫瘍免疫ランドスケープに及ぼし得る影響を同定するために、免疫細胞プロファイルから腫瘍細胞プロファイルを機能的に分離している。
今回記載するＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、固形腫瘍組織から調製されたライゼート中の特定のタンパク質の発現を検出および定量するが、純粋な細胞集団が回収および分析されなければ、これらのアッセイは、どの細胞がどのタンパク質を発現するかについての詳細な情報を提供することができない。例えば腫瘍細胞が、通常には正常細胞、正常リンパ球細胞、および／またはＴＩＬによってのみ発現される免疫阻害因子を発現する場合に、腫瘍微小環境では異常なタンパク質発現が一般的であるので、このことは重要であり得る。よって、候補治療タンパク質標的の発現が記載のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイによって検出および定量された場合には、欠落している細胞局在情報を提供するために追跡アッセイが必要とされることがある。細胞発現状況という目的を達成するための方法は、免疫組織化学である。どのタンパク質が腫瘍微小環境内で発現されるかおよびどの細胞がこれらのタンパク質を発現するかを理解することで、有利には、腫瘍細胞を探し出して死滅させるよう患者自身の免疫応答を変調するための最適な治療決定に関する情報が得られる。今回記載するＳＲＭ／ＭＲＭアッセイおよび分析法は、患者の腫瘍組織において直接、免疫調節癌治療薬のタンパク質標的を検出および定量する能力を提供する。
腫瘍細胞の死滅化のための有利なアプローチは、免疫調節薬が最適な患者応答のために腫瘍細胞標的化薬と組み合わせて相乗的に使用される併用療法を使用することである。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、それに対して阻害治療薬が開発された癌タンパク質標的の、患者の腫瘍組織における、量的発現状態を決定するために使用することができる。癌タンパク質の量的状態を決定するためのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの例は、Ｍｅｔタンパク質（米国特許第９，３７２，１９５号参照）およびＩＧＦ−１Ｒタンパク質（米国特許第８，７２８，７５３号参照）に関して記載されている。薬物クリゾチニブおよびカボザンチニブはＭｅｔタンパク質機能を阻害するが、フィギツムマブおよびシクスツムマブ(cixutumumab)はＩＧＦ−１Ｒタンパク質機能を阻害する。これらのアッセイからの情報は、腫瘍組織の免疫状態を理解するために、今回記載されるＳＲＭ／ＭＲＭアッセイからの情報と組み合わせることができる。両データセットは一緒に、標的化された免疫に基づく組合せ治療アプローチのための治療計画に関する情報を得るために使用することができる。従って、例えば、患者の腫瘍細胞がＰＤ−Ｌ１タンパク質およびＭｅｔタンパク質の両方を過剰発現することがＳＲＭ／ＭＲＭ法により決定されれば、論理的組合せ治療計画は、ニボルマブ（ＰＤ−１阻害剤）またはアテゾリズマブ（ＰＤ−Ｌ１阻害剤）とクリゾチニブ（Ｍｅｔ阻害剤）の組合せを投与することを含み得る。このようなアプローチの結果は、腫瘍細胞を攻撃し死滅させるように患者の免疫系を武装するとともに、腫瘍細胞を特異的に標的とし死滅させる治療薬を最適に使用するということになろう。
核酸およびタンパク質の両方が同じＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ生体分子調製物から分析できるので、今回記載されるＳＲＭ／ＭＲＭアッセイで分析された同じサンプルにおいて核酸からの薬物治療決定に関するさらなる情報を生み出すことが可能である。特定のタンパク質が今回記載されるＳＲＭ／ＭＲＭアッセイにより、ある特定の細胞によって増大したレベルで発現されることを見出すことができるが、同時に、特定の遺伝子および／または核酸ならびにそれらがコードするタンパク質の突然変異状態についての情報（例えば、ｍＲＮＡ分子およびそれらの発現レベルまたはスプライスバリエーション）を得ることができる。それらの核酸は、例えば、シークエンシング法、ポリメラーゼ連鎖反応法、制限断片多形分析、欠失、挿入の同定、および／または限定されるものではないが、単一塩基対多形、トランジション、トランスバージョン、またはそれらの組合せを含む、突然変異の存在の決定のうち１以上、２以上、または３以上によって調べることができる。
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Claims (22)

  1. 癌患者から得られたホルマリン固定腫瘍組織の生物学的サンプルにおいて、タンパク質発現プロファイルを、前記生物学的サンプルから調製されたタンパク質消化物においてヒト免疫系の惹起、維持、促進、阻害、またはそれ以外の調節をする働きをする１以上のタンパク質を、質量分析を用いて検出し、そのレベルを定量すること、および前記生物学的サンプル中の前記タンパク質のレベルを計算することにより、決定する方法であって、
    前記レベルが相対レベルまたは絶対レベルであり、かつ、
    前記１以上のタンパク質が、Ｂ７−１、Ｂ７Ｈ２、β−カテニン、ＣＡＬＲ、ＣＣＲ４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１６６、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４７、ＣＤ６８、ＣＤ７０、ＣＤ７３、ＣＤ８Ａ、ＣＥＡＣＡＭ５、ｃＭＹＣ、ＣＯＸ−２、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、ＤＮＭＴ１、ＥＺＨ２、ＧＢＰ２、ＨＭＧＢ１、ＩＮＦＧＲ２、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＲＦ１、ＭｙＤ８８、ＮＡＭＰＴ、ＮＡＰＲＴ１、ＮＹＥＳＯ１、ＯＸ４０Ｌ、ＰＤ−１、ＳＴＡＴ３、ベクリン−１、ＰＨＤ２、ＰＩ３Ｋβ、ＰＩ３Ｋδ、ＰＩ３Ｋγ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＩＦＮγ、ＳＴＫ１１、ＢＴＫ、ＡＲＧ１、ＴＤＯ、ＴＧＦβ１、ＣＤ１６、ＯＸ４０、ＩＬ−２、ＳＬＦＮ１１、ＣＤ３９、ＣＤ４４、ＣＳＦ１Ｒ、ＧＺＭＢ、ＰＲＦ１、ＣＤ２０６、ＧＮＬＹ、ＣＤ３Ｚ、ＡＴＦ３、ＴＬＲ８、ＣＤ１９、およびＣＴＬＡ４からなる群から選択される、方法。
  2. 前記１以上のフラグメントペプチドを検出および／または定量する前に、前記タンパク質消化物を分画する工程をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
  3. 前記分画工程が、ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、または逆相高速液体クロマトグラフィーを含む群から選択される、請求項２に記載の方法。
  4. 前記生物学的サンプルの前記タンパク質消化物が、Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅプロトコールにより調製される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記タンパク質消化物がプロテアーゼ消化物を含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記タンパク質消化物がトリプシン消化物を含んでなる、請求項５に記載の方法。
  7. 前記質量分析が、タンデム質量分析、イオントラップ質量分析、三連四重極質量分析、ハイブリッドイオントラップ／四重極質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析、ＭＡＬＤＩ質量分析、および／またはタイムオブフライト質量分析を含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 使用する質量分析様式が、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、インテリジェント選択反応モニタリング（ｉＳＲＭ）、および／または多重選択反応モニタリング（ｍＳＲＭ）である、請求項７に記載の方法。
  9. 前記フラグメントペプチドが、配列番号１〜１１９の配列を有するペプチドからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記組織がパラフィン包埋組織である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記組織が腫瘍から得られる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記フラグメントペプチドの定量が、ある生物学的サンプル中の前記フラグメントペプチドの量を、異なる別の生物学的サンプル中の同じフラグメントペプチドの量と比較することを含んでなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記フラグメントペプチドの定量が、生物学的サンプル中の前記フラグメントペプチドの量を、同じアミノ酸配列を有する、添加した既知量の内部標準ペプチドと比較することによって決定することを含んでなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記内部標準ペプチドが同位体標識ペプチドである、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記同位体標識内部標準ペプチドが、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈまたはそれらの組合せから選択される１以上の重い安定な同位体を含んでなる、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記タンパク質消化物中の少なくとも１つのフラグメントペプチドの検出およびその定量が、対応するタンパク質の存在および被験体における癌との関連を示す、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記少なくとも１つのフラグメントペプチドの検出もしくはその量の定量の結果、または対応するタンパク質のレベルを、癌患者の免疫系の活性化状態と相関させることをさらに含んでなる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記少なくとも１つのフラグメントペプチドの検出および／またはその量の定量の結果、または対応するタンパク質のレベルを癌患者の免疫系の活性化状態と相関させることが、前記癌患者の腫瘍細胞の分子状態についてさらなる情報を提供するために、他のタンパク質または他のタンパク質由来のペプチドの検出および／またはその定量と組み合わせられる、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記生物学的サンプルが得られた患者または被験体に治療上有効な量の癌治療薬を投与することをさらに含んでなり、前記癌治療薬および／または癌治療薬の投与量が、配列番号１〜１１９の配列を有するペプチドから選択されるいずれか１以上のフラグメントペプチドの検出および／または量に基づくものであり、これにより、前記癌治療薬は、前記患者の腫瘍細胞を攻撃して死滅させるために前記癌患者の免疫応答の惹起、促進、操作、および／またはそれ以外の調節をするように前記タンパク質の１以上と相互作用する免疫調節癌治療薬である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記患者または被験体に、前記患者の腫瘍細胞を攻撃して死滅させるために前記癌患者の免疫応答の惹起、促進、操作、および／またはそれ以外の調節をするように前記タンパク質の１以上と相互作用する免疫治療癌治療薬をさらに投与する、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記生物学的サンプルから調製されたタンパク質消化物中の１以上のタンパク質を、質量分析を用いて検出し、そのレベルを定量すること、および前記生物学的サンプル中の前記タンパク質のレベルを計算することにより、患者の免疫系活性化状態を決定する方法であって、
    前記レベルが相対レベルまたは絶対レベルであり、かつ、
    前記１以上のタンパク質が、Ｂ７−１、Ｂ７Ｈ２、β−カテニン、ＣＡＬＲ、ＣＣＲ４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１６６、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４７、ＣＤ６８、ＣＤ７０、ＣＤ７３、ＣＤ８Ａ、ＣＥＡＣＡＭ５、ｃＭＹＣ、ＣＯＸ−２、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、ＤＮＭＴ１、ＥＺＨ２、ＧＢＰ２、ＨＭＧＢ１、ＩＮＦＧＲ２、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＲＦ１、ＭｙＤ８８、ＮＡＭＰＴ、ＮＡＰＲＴ１、ＮＹＥＳＯ１、ＯＸ４０Ｌ、ＰＤ−１、ＳＴＡＴ３、ベクリン−１、ＰＨＤ２、ＰＩ３Ｋβ、ＰＩ３Ｋδ、ＰＩ３Ｋγ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＩＦＮγ、ＳＴＫ１１、ＢＴＫ、ＡＲＧ１、ＴＤＯ、ＴＧＦβ１、ＣＤ１６、ＯＸ４０、ＩＬ−２、ＳＬＦＮ１１、ＣＤ３９、ＣＤ４４、ＣＳＦ１Ｒ、ＧＺＭＢ、ＰＲＦ１、ＣＤ２０６、ＧＮＬＹ、ＣＤ３Ｚ、ＡＴＦ３、ＴＬＲ８、ＣＤ１９、およびＣＴＬＡ４からなる群から選択される、方法。
  22. 前記フラグメントペプチドが配列番号１〜１１９の配列を有するペプチドからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
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