JP7351618B2 - 癌患者への癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性を判定するマーカー及びその使用 - Google Patents
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Description
本発明は、癌患者への癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性を判定するマーカー及びその使用に関する。より具体的には、本発明は、癌患者への癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性を判定するマーカー、癌患者への癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性評価のためのデータを取得する方法、癌患者への癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性を判定するためのキット、癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤、癌治療用キット、及び、癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤のスクリーニング方法に関する。
最近、癌細胞を認識するＴ細胞を誘導する癌免疫療法により、進行期の固形癌でも治癒が可能であることが示されている。癌免疫療法の一つが、抗ＰＤ－１抗体等の免疫チェックポイント阻害薬を用いた治療法であり、悪性黒色腫や肺癌をはじめとする多数の癌腫で明らかな臨床効果を示している。
免疫チェックポイント阻害薬を用いた治療は、単独療法での奏効率は約２０％にとどまっている。不応例の多くでは、癌に対するＴ細胞応答惹起を阻害する免疫抑制的な癌微小環境が構築されている。このため、この免疫抑制を解除する治療法の開発が必要である。また、癌患者への癌免疫療法の適用の有効性を判定する方法の開発が求められている（例えば、特許文献１を参照）。一般的な抗癌剤治療や、手術においても、最初の免疫状態が悪い癌患者は、これらの治療法の予後が悪い可能性がある。
ところで、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ２５－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ（以下、「Ｃｈ２５Ｈ」という場合がある。）はコレステロールを２５－水酸化コレステロール（以下、「２５ＯＨＣ」という場合がある。）に代謝する酵素である。
しかしながら、特許文献１に記載された、抗癌剤による治療効果を試験する方法は、抗癌剤が投与された患者由来の試料を用いて所定の細胞表面分子のＴ細胞上での発現を調べることを含むものである。このため、治療前に癌患者への癌免疫療法の適用の有効性を判定することはできない。本発明は、癌患者への癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性を判定する新たな技術を提供することを目的とする。
本発明は以下の態様を含む。
［１］癌患者への癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性を判定するマーカーとしてのＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ２５－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ（Ｃｈ２５Ｈ）遺伝子、Ｃｈ２５Ｈタンパク質又は２５－水酸化コレステロール（２５ＯＨＣ）の使用。
［２］癌患者由来の生体試料中の、Ｃｈ２５Ｈ遺伝子のｍＲＮＡ、Ｃｈ２５Ｈタンパク質又は２５ＯＨＣの存在量を測定することを含み、前記ｍＲＮＡ、前記タンパク質又は前記２５ＯＨＣの存在量を、対照の生体試料中における存在量と比較した量の多寡が、前記癌患者への癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性評価のためのデータである、前記癌患者への癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性評価のためのデータを取得する方法。
［３］前記ｍＲＮＡ、前記タンパク質又は前記２５ＯＨＣの存在量が、対照の生体試料中における存在量よりも多いことが、前記癌患者への癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性が低いことを示す、［２］に記載の方法。
［４］前記ｍＲＮＡ、前記タンパク質又は前記２５ＯＨＣの存在量が、対照の生体試料中における存在量よりも多いことが、前記癌患者への癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性が高いことを示す、［２］に記載の方法。
［５］前記生体試料が、血液又は腫瘍組織である、［２］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］Ｃｈ２５Ｈ遺伝子のｃＤＮＡを増幅するプライマーセット、Ｃｈ２５Ｈ遺伝子のｍＲＮＡにハイブリダイズするプローブ、Ｃｈ２５Ｈタンパク質に対する特異的結合物質又は２５ＯＨＣの検出試薬を含む、癌患者への癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性を判定するためのキット。
［７］Ｃｈ２５Ｈタンパク質の阻害薬を有効成分として含有する、癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤。
［８］前記Ｃｈ２５Ｈタンパク質の阻害薬が、Ｃｈ２５Ｈ遺伝子の発現を抑制する物質である、［７］に記載の癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤。
［９］前記Ｃｈ２５Ｈ遺伝子の発現を抑制する物質が、Ｃｈ２５Ｈ遺伝子のｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡである、［８］に記載の癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤。
［１０］［７］～［９］のいずれかに記載の癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤と、抗癌剤とを含む、癌治療用キット。
［１１］癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下で、コレステロールとＣｈ２５Ｈタンパク質とを接触させて、２５ＯＨＣを生成させることと、前記２５ＯＨＣの生成量が、前記被験物質の非存在下における２５ＯＨＣの生成量と比較して減少又は増加した場合に、前記被験物質は癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤であると判定すること、を含む、方法。
［１２］前記２５ＯＨＣの生成量が、前記被験物質の非存在下における２５ＯＨＣの生成量と比較して減少した場合に、前記被験物質は癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤であると判定する、［１１］に記載の方法。
［１３］癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下で癌細胞を培養することと、前記癌細胞におけるＣｈ２５Ｈ遺伝子若しくはＣｈ２５Ｈタンパク質の発現量又は２５ＯＨＣの生成量を測定することと、前記Ｃｈ２５Ｈ遺伝子若しくは前記Ｃｈ２５Ｈタンパク質の発現量又は前記２５ＯＨＣの生成量が、前記被験物質の非存在下と比較して減少又は増加した場合に、前記被験物質は癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤であると判定すること、を含む、方法。
［１４］前記Ｃｈ２５Ｈ遺伝子若しくは前記Ｃｈ２５Ｈタンパク質の発現量又は前記２５ＯＨＣの生成量が、前記被験物質の非存在下と比較して減少した場合に、前記被験物質は癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤であると判定する、［１３］に記載の方法。
［１］癌患者への癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性を判定するマーカーとしてのＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ２５－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ（Ｃｈ２５Ｈ）遺伝子、Ｃｈ２５Ｈタンパク質又は２５－水酸化コレステロール（２５ＯＨＣ）の使用。
［２］癌患者由来の生体試料中の、Ｃｈ２５Ｈ遺伝子のｍＲＮＡ、Ｃｈ２５Ｈタンパク質又は２５ＯＨＣの存在量を測定することを含み、前記ｍＲＮＡ、前記タンパク質又は前記２５ＯＨＣの存在量を、対照の生体試料中における存在量と比較した量の多寡が、前記癌患者への癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性評価のためのデータである、前記癌患者への癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性評価のためのデータを取得する方法。
［３］前記ｍＲＮＡ、前記タンパク質又は前記２５ＯＨＣの存在量が、対照の生体試料中における存在量よりも多いことが、前記癌患者への癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性が低いことを示す、［２］に記載の方法。
［４］前記ｍＲＮＡ、前記タンパク質又は前記２５ＯＨＣの存在量が、対照の生体試料中における存在量よりも多いことが、前記癌患者への癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性が高いことを示す、［２］に記載の方法。
［５］前記生体試料が、血液又は腫瘍組織である、［２］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］Ｃｈ２５Ｈ遺伝子のｃＤＮＡを増幅するプライマーセット、Ｃｈ２５Ｈ遺伝子のｍＲＮＡにハイブリダイズするプローブ、Ｃｈ２５Ｈタンパク質に対する特異的結合物質又は２５ＯＨＣの検出試薬を含む、癌患者への癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性を判定するためのキット。
［７］Ｃｈ２５Ｈタンパク質の阻害薬を有効成分として含有する、癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤。
［８］前記Ｃｈ２５Ｈタンパク質の阻害薬が、Ｃｈ２５Ｈ遺伝子の発現を抑制する物質である、［７］に記載の癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤。
［９］前記Ｃｈ２５Ｈ遺伝子の発現を抑制する物質が、Ｃｈ２５Ｈ遺伝子のｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡである、［８］に記載の癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤。
［１０］［７］～［９］のいずれかに記載の癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤と、抗癌剤とを含む、癌治療用キット。
［１１］癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下で、コレステロールとＣｈ２５Ｈタンパク質とを接触させて、２５ＯＨＣを生成させることと、前記２５ＯＨＣの生成量が、前記被験物質の非存在下における２５ＯＨＣの生成量と比較して減少又は増加した場合に、前記被験物質は癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤であると判定すること、を含む、方法。
［１２］前記２５ＯＨＣの生成量が、前記被験物質の非存在下における２５ＯＨＣの生成量と比較して減少した場合に、前記被験物質は癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤であると判定する、［１１］に記載の方法。
［１３］癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下で癌細胞を培養することと、前記癌細胞におけるＣｈ２５Ｈ遺伝子若しくはＣｈ２５Ｈタンパク質の発現量又は２５ＯＨＣの生成量を測定することと、前記Ｃｈ２５Ｈ遺伝子若しくは前記Ｃｈ２５Ｈタンパク質の発現量又は前記２５ＯＨＣの生成量が、前記被験物質の非存在下と比較して減少又は増加した場合に、前記被験物質は癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤であると判定すること、を含む、方法。
［１４］前記Ｃｈ２５Ｈ遺伝子若しくは前記Ｃｈ２５Ｈタンパク質の発現量又は前記２５ＯＨＣの生成量が、前記被験物質の非存在下と比較して減少した場合に、前記被験物質は癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤であると判定する、［１３］に記載の方法。
本発明によれば、癌患者への癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性を判定する新たな技術を提供することができる。
［癌患者への癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性を判定するマーカー］
１実施形態において、本発明は、癌患者への癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性を判定するマーカーとしてのＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ２５－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ（Ｃｈ２５Ｈ）遺伝子、Ｃｈ２５Ｈタンパク質又は２５－水酸化コレステロール（２５ＯＨＣ）の使用を提供する。
１実施形態において、本発明は、癌患者への癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性を判定するマーカーとしてのＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ２５－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ（Ｃｈ２５Ｈ）遺伝子、Ｃｈ２５Ｈタンパク質又は２５－水酸化コレステロール（２５ＯＨＣ）の使用を提供する。
ここで、Ｃｈ２５Ｈタンパク質とは、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ２５－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅと同義であり、コレステロールの２５位に水酸基を導入し、２５ＯＨＣを生成する酵素である。
実施例において後述するように、発明者らは、癌組織中におけるＣｈ２５Ｈの発現が高いマウスでは、癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性が低下することを明らかにした。また、Ｃｈ２５Ｈの発現が高い癌組織を有するマウスは、血清中の２５ＯＨＣの存在量が増加することを明らかにした。また、癌免疫療法を含む癌治療法の種類等によっては、逆に、癌組織中におけるＣｈ２５Ｈの発現が高い場合に癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性が向上することも考えられる。Ｃｈ２５Ｈの発現または血中の２５ＯＨＣの発現は、患者の免疫状態を反映していると考えられる。
したがって、Ｃｈ２５Ｈ遺伝子、Ｃｈ２５Ｈタンパク質又は２５ＯＨＣを癌患者への癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性を判定するマーカーとして使用することができる。
ヒトＣｈ２５Ｈ遺伝子のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＭ＿００３９５６．３であり、ヒトＣｈ２５Ｈタンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＰ＿００３９４７．１である。また、マウスＣｈ２５Ｈ遺伝子のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＭ＿００９８９０．１であり、マウスＣｈ２５Ｈタンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＰ＿０３４０２０．１である。
［癌患者への癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性を判定する方法］
１実施形態において、本発明は、癌患者への癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性を判定する方法であって、前記癌患者由来の生体試料中の、Ｃｈ２５Ｈ遺伝子のｍＲＮＡ、Ｃｈ２５Ｈタンパク質又は２５ＯＨＣの存在量を測定することを含み、前記ｍＲＮＡ、前記タンパク質又は前記２５ＯＨＣの存在量が、対照の生体試料中における存在量よりも多いこと又は少ないことが、前記癌患者への癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性に関連する方法を提供する。本実施形態の方法は、癌患者への癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性評価のためのデータを取得する方法であるということもできる。
１実施形態において、本発明は、癌患者への癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性を判定する方法であって、前記癌患者由来の生体試料中の、Ｃｈ２５Ｈ遺伝子のｍＲＮＡ、Ｃｈ２５Ｈタンパク質又は２５ＯＨＣの存在量を測定することを含み、前記ｍＲＮＡ、前記タンパク質又は前記２５ＯＨＣの存在量が、対照の生体試料中における存在量よりも多いこと又は少ないことが、前記癌患者への癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性に関連する方法を提供する。本実施形態の方法は、癌患者への癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性評価のためのデータを取得する方法であるということもできる。
実施例において後述するように、発明者らは、癌組織中におけるＣｈ２５Ｈの発現が高いマウスでは、癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性が低下することを明らかにした。また、Ｃｈ２５Ｈの発現が高い癌組織を有するマウスは、血清中の２５ＯＨＣの存在量が増加することを明らかにした。また、癌免疫療法を含む癌治療法の種類等によっては、逆に、癌組織中におけるＣｈ２５Ｈの発現が高い場合に癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性が向上することも考えられる。
したがって、癌患者由来の生体試料中の、Ｃｈ２５Ｈ遺伝子のｍＲＮＡ、Ｃｈ２５Ｈタンパク質又は２５ＯＨＣの存在量が、対照の生体試料中における存在量よりも多い場合又は少ない場合に、前記癌患者への癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性が低いと判断することができる。また、本実施形態の方法によれば、治療前に、癌患者への癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性を判定することができる。
癌としては特に限定されないが、特に、悪性黒色腫、肺癌、腎癌、胃癌等の抗ＰＤ－１抗体が保険適応となっている癌が挙げられる。
本実施形態の方法において、検出するＣｈ２５遺伝子のｍＲＮＡ又はＣｈ２５タンパク質は、癌患者（又は患畜）と同種であるｍＲＮＡ又はタンパク質を検出することが好ましく、ヒトの癌患者への癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性を判定する場合には、ヒトＣｈ２５遺伝子のｍＲＮＡ又はヒトＣｈ２５タンパク質を検出することが好ましい。
本実施形態の方法において、生体試料としては、血液、腫瘍組織等が挙げられる。また、対照の生体試料としては、健常者又は癌免疫療法を含む癌治療法の適用が有効な患者由来の生体試料を用いることができる。血液試料としては、血清、血漿等が挙げられる。また、生体試料が腫瘍組織である場合、対照の生体試料としては、例えば、癌免疫療法を含む癌治療法の適用が有効であることが予め確認されている患者由来の腫瘍組織、健常者における前記腫瘍組織に対応する組織由来の試料等を用いることができる。
また、本実施形態の方法を実施するたびに対照の生体試料を用意する必要はなく、あらかじめ対照の生体試料中における、Ｃｈ２５Ｈ遺伝子のｍＲＮＡ、Ｃｈ２５Ｈタンパク質又は２５ＯＨＣの存在量を測定しておき、当該測定値を、癌患者由来の生体試料中における、Ｃｈ２５Ｈ遺伝子のｍＲＮＡ、Ｃｈ２５Ｈタンパク質又は２５ＯＨＣの存在量と比較してもよい。
Ｃｈ２５Ｈ遺伝子のｍＲＮＡの存在量の測定方法は特に限定されず、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ、定量的ＲＴ－ＰＣＴ、ＤＮＡマイクロアレイ解析等により行うことができる。
また、Ｃｈ２５Ｈタンパク質の存在量の測定方法は特に限定されず、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、フローストリップ法、プロテインチップ等により行うことができる。
また、２５ＯＨＣの存在量の測定方法は特に限定されず、例えば、質量分析、ＥＬＩＳＡ、各種クロマトグラフィー等により測定することができる。
本実施形態の方法において、癌免疫療法を含む癌治療法としては、免疫チェックポイント阻害薬の投与、サイトカイン療法、養子免疫療法、癌ワクチン療法等が挙げられる。養子免疫療法としては、体外で培養した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与する治療法、癌抗原に対するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子導入Ｔ細胞（ＴＣＲ－Ｔ）を投与する治療法、キメラ抗原受容体遺伝子導入Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）を投与する治療法等が挙げられる。
免疫チェックポイント阻害薬としては、例えば、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体等が挙げられる。抗ＰＤ－１抗体としては、例えば、ニボルマブ、ペムブロリズマブ等が挙げられる。抗ＣＴＬＡ－４抗体としては、例えば、イピリムマブ等が挙げられる。抗ＰＤ－Ｌ１抗体としては、例えば、アベルマブ、アテゾリズマブ等が挙げられる。
［癌患者への癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性を判定するためのキット］
１実施形態において、本発明は、Ｃｈ２５Ｈ遺伝子のｃＤＮＡを増幅するプライマーセット、Ｃｈ２５Ｈ遺伝子のｍＲＮＡにハイブリダイズするプローブ、Ｃｈ２５Ｈタンパク質に対する特異的結合物質又は２５ＯＨＣの検出試薬を含む、癌患者への癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性を判定するためのキットを提供する。
１実施形態において、本発明は、Ｃｈ２５Ｈ遺伝子のｃＤＮＡを増幅するプライマーセット、Ｃｈ２５Ｈ遺伝子のｍＲＮＡにハイブリダイズするプローブ、Ｃｈ２５Ｈタンパク質に対する特異的結合物質又は２５ＯＨＣの検出試薬を含む、癌患者への癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性を判定するためのキットを提供する。
本実施形態のキットにより、上述した、癌患者への癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性を判定する方法を実施することができる。
プライマーセットとしては、Ｃｈ２５Ｈ遺伝子のｃＤＮＡを増幅することができるものであれば特に限定されない。
また、プローブとしては、Ｃｈ２５Ｈ遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするものであれば特に限定されない。プローブは、担体上に固定されてＤＮＡマイクロアレイ等を構成していてもよい。
また、特異的結合物質としては、抗体、抗体断片、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。抗体断片としては、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。特異的結合物質は、Ｃｈ２５Ｈタンパク質に特異的に結合することができれば特に制限されず、市販のものであってもよい。また、特異的結合物質は、担体上に固定されてプロテインチップ等を構成していてもよい。
［癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤］
１実施形態において、本発明は、Ｃｈ２５Ｈタンパク質の阻害薬を有効成分として含有する、癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤を提供する。
１実施形態において、本発明は、Ｃｈ２５Ｈタンパク質の阻害薬を有効成分として含有する、癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤を提供する。
実施例において後述するように、宿主側又は癌細胞側においてＣｈ２５Ｈ遺伝子又はタンパク質の発現を抑制することにより、癌免疫療法を含む癌治療法の有効性を向上することができる。したがって、Ｃｈ２５Ｈタンパク質の阻害薬を、癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤の用途に用いることができる。
本実施形態の向上剤において、Ｃｈ２５Ｈタンパク質の阻害薬とは、Ｃｈ２５Ｈタンパク質の機能を阻害する物質であれば特に限定されない。より具体的には、例えば、Ｃｈ２５Ｈ遺伝子の発現（転写又は翻訳）を阻害又は抑制する物質、Ｃｈ２５Ｈタンパク質の阻害薬等が挙げられる。Ｃｈ２５Ｈタンパク質の阻害薬は低分子化合物であってもよい。
Ｃｈ２５Ｈ遺伝子の転写又は翻訳を阻害する物質の具体例としては、Ｃｈ２５Ｈ遺伝子のｍＲＮＡに対する阻害性核酸が挙げられる。また、阻害性核酸としては、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等が挙げられる。Ｃｈ２５Ｈ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは周知の方法によって作製することができる。
Ｃｈ２５Ｈタンパク質の阻害薬としては、Ｃｈ２５Ｈタンパク質の、コレステロールの２５位に水酸基を導入し、２５ＯＨＣを生成する活性を阻害する物質等が挙げられる。
［癌治療用キット］
１実施形態において、本発明は、上述した癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤と、抗癌剤とを含む、癌治療用キットを提供する。
１実施形態において、本発明は、上述した癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤と、抗癌剤とを含む、癌治療用キットを提供する。
癌患者に、上述した癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤と抗癌剤とを組み合わせて投与することにより、癌免疫療法を含む癌治療法の有効性（治療効果）を向上させることができる。本実施形態のキットにおいて、癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤と抗癌剤とは、別々に患者に投与してもよいし、混合して患者に投与してもよい。
抗癌剤としては、癌免疫療法を含む癌治療法に用いられる薬物が挙げられ、例えば、免疫チェックポイント阻害薬、サイトカイン療法に用いられるサイトカイン（例えば、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－２、ＩＦＮ－γ等）、キメラ抗原受容体遺伝子導入Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）療法に用いられるＣＡＴ－Ｔ細胞、癌抗原に対するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子導入Ｔ細胞療法に用いられるＴＣＲ－Ｔ細胞、体外で培養した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与する治療法に用いられるＴＩＬ、癌ワクチン療法に用いられるペプチドワクチン等が挙げられる。免疫チェックポイント阻害薬としては上述したものと同様であり、例えば、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、イピリムマブ、アベルマブ、アテゾリズマブ等、その他通常用いられている抗癌剤が挙げられる。
［癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤のスクリーニング方法］
（第１実施形態）
第１実施形態に係る、癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤のスクリーニング方法は、被験物質の存在下で、コレステロールとＣｈ２５Ｈタンパク質とを接触させて、２５ＯＨＣを生成させることと、前記２５ＯＨＣの生成量が、前記被験物質の非存在下における２５ＯＨＣの生成量と比較して減少又は増加した場合に、前記被験物質は癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤であると判定することを含む方法である。
（第１実施形態）
第１実施形態に係る、癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤のスクリーニング方法は、被験物質の存在下で、コレステロールとＣｈ２５Ｈタンパク質とを接触させて、２５ＯＨＣを生成させることと、前記２５ＯＨＣの生成量が、前記被験物質の非存在下における２５ＯＨＣの生成量と比較して減少又は増加した場合に、前記被験物質は癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤であると判定することを含む方法である。
実施例において後述するように、発明者らは、癌組織中におけるＣｈ２５Ｈの発現が高いマウスでは、癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性が低下することを明らかにした。また、Ｃｈ２５Ｈの発現が高い癌組織を有するマウスは、血清中の２５ＯＨＣの存在量が増加することを明らかにした。
したがって、２５ＯＨＣの生成量が、被験物質の非存在下における２５ＯＨＣの生成量と比較して減少した場合に、前記被験物質は癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤であると判定することができる。
また、癌免疫療法を含む癌治療法の種類等によっては、逆に、癌組織中におけるＣｈ２５Ｈの発現が高い場合に癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性が向上することも考えられる。このような場合には、２５ＯＨＣの生成量が、被験物質の非存在下における２５ＯＨＣの生成量と比較して増加した場合に、前記被験物質は癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤であると判定することができる。
被験物質としては特に制限されず、例えば、天然化合物ライブラリ、合成化合物ライブラリ、既存薬ライブラリ、代謝物ライブラリ等が挙げられる。
第１実施形態のスクリーニング方法では、まず、被験物質の存在下で、コレステロールとＣｈ２５Ｈタンパク質とを接触させて、２５ＯＨＣを生成させる。本工程は、精製されたＣｈ２５Ｈタンパク質を用いて試験管内で実施してもよいし、Ｃｈ２５Ｈ遺伝子を導入した細胞等を用いて実施してもよい。
続いて、生成された２５ＯＨＣの量を定量する。２５ＯＨＣの定量方法は特に限定されず、例えば、質量分析、ＥＬＩＳＡ、各種クロマトグラフィー等が挙げられる。その結果、被験物質の存在下における２５ＯＨＣの生成量が、被験物質の非存在下における２５ＯＨＣの生成量と比較して減少又は増加した場合、当該被験物質は癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤又はその候補であると判定することができる。
（第２実施形態）
第２実施形態に係る、癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤のスクリーニング方法は、被験物質の存在下で癌細胞を培養することと、前記癌細胞におけるＣｈ２５Ｈ遺伝子若しくはＣｈ２５Ｈタンパク質の発現量又は２５ＯＨＣの生成量を測定することと、前記Ｃｈ２５Ｈ遺伝子若しくは前記Ｃｈ２５Ｈタンパク質の発現量又は前記２５ＯＨＣの生成量が、前記被験物質の非存在下と比較して減少又は増加した場合に、前記被験物質は癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤であると判定することを含む方法である。
第２実施形態に係る、癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤のスクリーニング方法は、被験物質の存在下で癌細胞を培養することと、前記癌細胞におけるＣｈ２５Ｈ遺伝子若しくはＣｈ２５Ｈタンパク質の発現量又は２５ＯＨＣの生成量を測定することと、前記Ｃｈ２５Ｈ遺伝子若しくは前記Ｃｈ２５Ｈタンパク質の発現量又は前記２５ＯＨＣの生成量が、前記被験物質の非存在下と比較して減少又は増加した場合に、前記被験物質は癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤であると判定することを含む方法である。
実施例において後述するように、発明者らは、癌組織中におけるＣｈ２５Ｈの発現が高いマウスでは、癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性が低下することを明らかにした。また、Ｃｈ２５Ｈの発現が高い癌組織を有するマウスは、血清中の２５ＯＨＣの存在量が増加することを明らかにした。
したがって、被験物質の存在下における癌細胞によるＣｈ２５Ｈ遺伝子若しくはＣｈ２５Ｈタンパク質の発現量又は２５ＯＨＣの生成量が、被験物質の非存在下と比較して減少した場合に、前記被験物質は癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤であると判定することができる。
また、上述したように、癌免疫療法を含む癌治療法の種類等によっては、逆に、癌組織中におけるＣｈ２５Ｈの発現が高い場合に癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性が向上することも考えられる。このような場合には、被験物質の存在下における癌細胞によるＣｈ２５Ｈ遺伝子若しくはＣｈ２５Ｈタンパク質の発現量又は２５ＯＨＣの生成量が、被験物質の非存在下におけるＣｈ２５Ｈ遺伝子若しくはＣｈ２５Ｈタンパク質の発現量又は２５ＯＨＣの生成量がと比較して増加した場合に、前記被験物質は癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤であると判定することができる。
第２実施形態のスクリーニング方法では、まず、被験物質の存在下で、癌細胞を培養する。被験物質としては第１実施形態のスクリーニング方法と同様である。癌細胞は、癌患者由来の癌細胞であってもよいし、樹立された癌細胞であってもよい。
続いて、癌細胞におけるＣｈ２５Ｈ遺伝子若しくはＣｈ２５Ｈタンパク質の発現量又は２５ＯＨＣの生成量を測定する。Ｃｈ２５Ｈ遺伝子のｍＲＮＡの存在量の測定方法、Ｃｈ２５Ｈタンパク質の存在量の測定方法、２５ＯＨＣの生成量の測定方法は上述したものと同様である。
その結果、被験物質の存在下におけるＣｈ２５Ｈ遺伝子若しくはＣｈ２５Ｈタンパク質の発現量又は２５ＯＨＣの生成量が、被験物質の非存在下におけるＣｈ２５Ｈ遺伝子若しくはＣｈ２５Ｈタンパク質の発現量又は２５ＯＨＣの生成量と比較して減少又は増加した場合、当該被験物質は癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤又はその候補であると判定することができる。
［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、癌患者由来の生体試料中の、Ｃｈ２５Ｈ遺伝子のｍＲＮＡ、Ｃｈ２５Ｈタンパク質又は２５ＯＨＣの存在量を測定することと、前記ｍＲＮＡ、前記タンパク質又は前記２５ＯＨＣの存在量が、対照の生体試料中における存在量と同等以下である場合に、前記癌患者に癌免疫療法を含む癌治療法を適用すること、を含む、癌の治療方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、癌患者由来の生体試料中の、Ｃｈ２５Ｈ遺伝子のｍＲＮＡ、Ｃｈ２５Ｈタンパク質又は２５ＯＨＣの存在量を測定することと、前記ｍＲＮＡ、前記タンパク質又は前記２５ＯＨＣの存在量が、対照の生体試料中における存在量と同等以下である場合に、前記癌患者に癌免疫療法を含む癌治療法を適用すること、を含む、癌の治療方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、癌患者由来の生体試料中の、Ｃｈ２５Ｈ遺伝子のｍＲＮＡ、Ｃｈ２５Ｈタンパク質又は２５ＯＨＣの存在量を測定することと、前記ｍＲＮＡ、前記タンパク質又は前記２５ＯＨＣの存在量が、対照の生体試料中における存在量よりも多い場合に、前記癌患者に癌免疫療法を含む癌治療法を適用すること、を含む、癌の治療方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、癌患者由来の生体試料中の、Ｃｈ２５Ｈ遺伝子のｍＲＮＡ、Ｃｈ２５Ｈタンパク質又は２５ＯＨＣの存在量を測定することと、前記ｍＲＮＡ、前記タンパク質又は残基２５ＯＨＣの存在量が、対照の生体試料中における存在量よりも多い場合に、前記癌患者に、Ｃｈ２５Ｈタンパク質の阻害薬及び抗癌剤を投与すること、を含む、癌の治療方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、癌の治療のためのＣｈ２５Ｈタンパク質の阻害薬を提供する。
１実施形態において、本発明は、癌の治療のためのＣｈ２５Ｈ遺伝子の発現抑制剤を提供する。
１実施形態において、本発明は、癌の治療薬を製造するためのＣｈ２５Ｈタンパク質の阻害薬又はＣｈ２５Ｈ遺伝子の発現抑制剤の使用を提供する。
これらの各実施形態において、生体試料、対照、癌免疫療法を含む癌治療法、抗癌剤、Ｃｈ２５Ｈタンパク質の阻害薬については上述したものと同様である。
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
＜Ｉ．Ｃｈ２５Ｈを強制発現させた癌細胞を野生型マウスに移植したモデルでの検討＞
［実験例１］
（抗ＰＤ－１抗体療法の有効性の検討１）
マウス大腸癌細胞株ＣＴ２６にマウスＣｈ２５Ｈ遺伝子の発現ベクターを遺伝子導入し、安定過剰発現細胞株を得た。
［実験例１］
（抗ＰＤ－１抗体療法の有効性の検討１）
マウス大腸癌細胞株ＣＴ２６にマウスＣｈ２５Ｈ遺伝子の発現ベクターを遺伝子導入し、安定過剰発現細胞株を得た。
続いて、野生型のＢａｌｂ／ｃマウスの側腹部位に、Ｃｈ２５Ｈを過剰発現させたＣＴ２６細胞株を移植し、腫瘍の体積を経時的に測定した。また、比較のために、野生型のＢａｌｂ／ｃマウスの側腹部位に、Ｃｈ２５Ｈを導入していないＣＴ２６細胞株（空の発現ベクターのみを導入したＣＴ２６細胞株）を移植し、腫瘍の体積を経時的に測定した。
また、細胞移植から５日目、９日目、１３日目に、各マウスに抗ＰＤ－１抗体（ＢｉｏＸｃｅｌｌ社）２００μｇ／マウスを腹腔内投与した。また、比較のために、抗ＰＤ－１抗体の代わりにアイソタイプコントロール抗体（ハムスターＩｇＧ、ＢｉｏＸｃｅｌｌ社）２００μｇ／マウスを腹腔内投与した群も用意した。
図１（ａ）～（ｄ）は、各群のマウスの腫瘍の体積の経時変化を示すグラフである。図１（ａ）～（ｄ）中、「ＭＯＣＫ」はＣｈ２５Ｈを導入していないＣＴ２６細胞株を移植したマウスの結果であることを示し、「Ｃｈ２５Ｈ」はＣｈ２５Ｈを過剰発現させたＣＴ２６細胞株を移植したマウスの結果であることを示し、「アイソタイプ」は、アイソタイプコントロール抗体を投与したマウスの結果であることを示し、「抗ＰＤ－１抗体」は抗ＰＤ－１抗体を投与したマウスの結果であることを示す。
その結果、Ｃｈ２５Ｈを導入していないＣＴ２６細胞株を移植したマウス（ＭＯＣＫ）では、抗ＰＤ－１抗体の投与により腫瘍体積の増加が有意に抑制された。これに対し、Ｃｈ２５Ｈを過剰発現させたＣＴ２６細胞株を移植したマウス（Ｃｈ２５Ｈ）では、抗ＰＤ－１抗体の投与による腫瘍体積の増加の抑制が認められなくなり、抗ＰＤ－１抗体療法に対して不適応になったことが明らかとなった。
［実験例２］
（抗ＰＤ－１抗体療法の有効性の検討２）
マウス線維芽肉腫細胞株ＭＣＡ２０５にマウスＣｈ２５Ｈ遺伝子の発現ベクターを遺伝子導入し、安定過剰発現細胞株を得た。
（抗ＰＤ－１抗体療法の有効性の検討２）
マウス線維芽肉腫細胞株ＭＣＡ２０５にマウスＣｈ２５Ｈ遺伝子の発現ベクターを遺伝子導入し、安定過剰発現細胞株を得た。
続いて、野生型のＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部位に、Ｃｈ２５Ｈを過剰発現させたＭＣＡ２０５細胞株を移植し、腫瘍の体積を経時的に測定した。また、比較のために、野生型のＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部位に、Ｃｈ２５Ｈを導入していないＭＣＡ２０５細胞株（空の発現ベクターのみを導入したＭＣＡ２０５細胞株）を移植し、腫瘍の体積を経時的に測定した。
また、細胞移植から４日目、８日目、１２日目、１５日目に、各マウスに抗ＰＤ－１抗体（ＢｉｏＸｃｅｌｌ社）２００μｇ／マウスを腹腔内投与した。また、比較のために、抗ＰＤ－１抗体の代わりにアイソタイプコントロール抗体（ハムスターＩｇＧ、ＢｉｏＸｃｅｌｌ社）２００μｇ／マウスを腹腔内投与した群も用意した。
図２（ａ）～（ｄ）は、各群のマウスの腫瘍の体積の経時変化を示すグラフである。図２（ａ）～（ｄ）中、「ＭＯＣＫ」はＣｈ２５Ｈを導入していないＭＣＡ２０５細胞株を移植したマウスの結果であることを示し、「Ｃｈ２５Ｈ」はＣｈ２５Ｈを過剰発現させたＭＣＡ２０５細胞株を移植したマウスの結果であることを示し、「アイソタイプ抗体」は、アイソタイプコントロール抗体を投与したマウスの結果であることを示し、「抗ＰＤ－１抗体」は抗ＰＤ－１抗体を投与したマウスの結果であることを示す。
その結果、Ｃｈ２５Ｈを導入していないＭＣＡ２０５細胞株を移植したマウス（ＭＯＣＫ）では、抗ＰＤ－１抗体の投与により腫瘍体積の増加が有意に抑制され、６匹中５匹が完治した。これに対し、Ｃｈ２５Ｈを過剰発現させたＭＣＡ２０５細胞株を移植したマウス（Ｃｈ２５Ｈ）では、抗ＰＤ－１抗体の投与による腫瘍体積の増加の抑制が認められなくなり、抗ＰＤ－１抗体療法に対して不適応になったことが明らかとなった。
［実験例３］
（細胞傷害性Ｔ細胞の検討１）
実験例２で作製した担癌マウスにおける所属リンパ節内及び腫瘍組織内の腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の誘導作用を、ＩＦＮ－γ産生アッセイで評価した。
（細胞傷害性Ｔ細胞の検討１）
実験例２で作製した担癌マウスにおける所属リンパ節内及び腫瘍組織内の腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の誘導作用を、ＩＦＮ－γ産生アッセイで評価した。
具体的には、まず、実験例２でアイソタイプコントロール抗体を投与した、Ｃｈ２５Ｈを導入していないＭＣＡ２０５細胞株を移植したマウス、及び、Ｃｈ２５Ｈを過剰発現させたＭＣＡ２０５細胞株を移植したマウスを、細胞移植から３８日後に安楽死させた。
続いて、各マウスから腫瘍組織を摘出し、はさみで切り刻んだ後、コラゲナーゼ溶液２０ｍＬ（２ｍｇ コラゲナーゼ＋３０Ｕ ＤＮａｓｅ／１ｍＬ ＲＰＭＩ１６４０）に入れ、３７℃で３０分間振盪した。その後、ＣＤ８磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を用いて、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を分離した。
また、各マウスから所属リンパ節（癌細胞移植側の腋窩、鼠径リンパ節）を摘出し、スライドグラスを用いてすり潰すようにしてリンパ節を破壊し、リンパ節細胞を回収した。その後、ＣＤ８磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を用いて、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を分離した。
得られた腫瘍組織及びリンパ節由来のＴ細胞（３×１０５～５×１０５個）のそれぞれを、野生型健常マウスより採取し、３２Ｇｙの放射線照射処理した脾臓細胞（１×１０７個）と混合し、腫瘍抗原ｇｐ７０ペプチド（マウス白血病ウイルスＭｕＬＶ ｇｐ７０ ｐ１５Ｅの第６０４～６１１番目のアミノ酸からなるペプチド：ＫＳＰＷＦＴＴＬ、配列番号１）（１．０μｇ／ｍＬ）、ヒトインターロイキン（ＩＬ）－２（２０Ｕ／ｍＬ）、マウスＩＬ－７（１０ｎｇ／ｍＬ）を含む１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地中、４８ウェルプレート（１ｍＬ／ウェル）で、腫瘍組織由来Ｔ細胞は２日間、リンパ節由来Ｔ細胞は７日間培養した。
続いて、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｌｅｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＡＳ）を用いてＴ細胞を回収した。回収した腫瘍組織由来のＴ細胞（１×１０５個）を、マウスリンパ腫由来の細胞であるＥＬ４細胞（１×１０５個）と終濃度１μｇ／ｍＬのｇｐ７０ペプチドの存在下、９６ウェルプレート（２００μＬ／ウェル）中、１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地で、各群３ウェルずつ混合培養し、培養２４時間後の培養上清中のＩＦＮ－γをＥＬＩＳＡ法で測定した。
同様に、回収したリンパ節由来のＴ細胞（５×１０４個）を、ＥＬ４細胞（１×１０５個）と終濃度１μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．０１μｇ／ｍＬ、０．００１μｇ／ｍＬ及び０μｇ／ｍＬのｇｐ７０ペプチドの存在下、９６ウェルプレート（２００μＬ／ウェル）中、１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地で、各群３ウェルずつ混合培養し、培養２４時間後の培養上清中のＩＦＮ－γをＥＬＩＳＡ法で測定した。
また、比較のために、ｇｐ７０ペプチドの代わりに無関係のβ－Ｇａｌペプチド（β－ガラクトシダーゼの第９６～１０３番目のアミノ酸からなるペプチド：ＤＡＰＩＹＴＮＶ、配列番号２）（１．０μｇ／ｍＬ）を接触させた群も用意した。
この結果、Ｔ細胞中に癌抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞が存在した場合、癌抗原ペプチドを接触させることによりＩＦＮ－γが産生される。
図３（ａ）及び（ｂ）は、ＩＦＮ－γの産生量を定量した結果を示すグラフである。図３（ａ）は、腫瘍組織由来の細胞の結果であり、図３（ｂ）はリンパ節由来の細胞の結果である。図３（ａ）及び（ｂ）中、「Ｔｕｍｏｒ」は腫瘍組織由来の細胞の結果であることを示し、「ＬＮ」はリンパ節由来の細胞の結果であることを示し、「ＭＯＣＫ」はＣｈ２５Ｈを導入していないＭＣＡ２０５細胞株を移植したマウス由来の腫瘍組織又はリンパ節の結果であることを示し、「Ｃｈ２５Ｈ」はＣｈ２５Ｈを過剰発現させたＭＣＡ２０５細胞株を移植したマウス由来の腫瘍組織又はリンパ節の結果であることを示し、「ｇｐ７０」はｇｐ７０ペプチドを接触させた結果であることを示し、「β－ｇａｌ」はβ－ｇａｌペプチドを接触させた結果であることを示す。また、また、「＊」はｐ＜０．０５で有意差が存在することを示す。
その結果、Ｃｈ２５Ｈを導入していないＭＣＡ２０５細胞株を移植したマウス由来の腫瘍組織及びリンパ節には、癌抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞が存在することが明らかとなった。また、Ｃｈ２５Ｈを過剰発現させたＭＣＡ２０５細胞株を移植したマウス由来の腫瘍組織及びリンパ節中の癌抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞の数は、Ｃｈ２５Ｈを導入していないＭＣＡ２０５細胞株を移植したマウス由来の腫瘍組織及びリンパ節中の癌抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞の数よりも有意に少ないことが明らかとなった。
以上の結果は、癌細胞がＣｈ２５Ｈを過剰発現すると、腫瘍組織及びリンパ節において、癌抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞の数が減少することを示す。
［実験例４］
（細胞傷害性Ｔ細胞の検討２）
実験例２で作製した担癌マウス（細胞移植から３８日目）より、腫瘍組織を摘出してホルムアルデヒド固定し、組織切片を作製した。続いて、作製した組織切片を抗ＣＤ８抗体で染色し、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を検出した。
（細胞傷害性Ｔ細胞の検討２）
実験例２で作製した担癌マウス（細胞移植から３８日目）より、腫瘍組織を摘出してホルムアルデヒド固定し、組織切片を作製した。続いて、作製した組織切片を抗ＣＤ８抗体で染色し、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を検出した。
図４（ａ）及び（ｂ）は、免疫染色した組織切片の光学顕微鏡写真である。図４（ａ）及び（ｂ）中、「ＭＣＡ２０５－ＭＯＣＫ」はＣｈ２５Ｈを導入していないＭＣＡ２０５細胞株を移植したマウス由来の腫瘍組織の結果であることを示し、「ＭＣＡ２０５－Ｃｈ２５Ｈ」はＣｈ２５Ｈを過剰発現させたＭＣＡ２０５細胞株を移植したマウス由来の腫瘍組織の結果であることを示す。スケールバーはいずれも１００μｍである。
その結果、Ｃｈ２５Ｈを過剰発現させたＭＣＡ２０５細胞株を移植したマウス由来の腫瘍組織では、Ｃｈ２５Ｈを導入していないＭＣＡ２０５細胞株を移植したマウス由来の腫瘍組織と比較して、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の侵入が顕著に減少したことが明らかとなった。
［実験例５］
（血清中２５－水酸化コレステロール（２５ＯＨＣ）の検出）
実験例２で作製した担癌マウス（細胞移植から３８日目）より採血し、血清を調製した。続いて、血清中の２５－水酸化コレステロール（２５ＯＨＣ）の存在量を質量分析により定量した。
（血清中２５－水酸化コレステロール（２５ＯＨＣ）の検出）
実験例２で作製した担癌マウス（細胞移植から３８日目）より採血し、血清を調製した。続いて、血清中の２５－水酸化コレステロール（２５ＯＨＣ）の存在量を質量分析により定量した。
具体的には、まず、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１０倍に希釈した血清１ｍＬに１μｇの内部標準（エタノールに０．１ｍｇ／ｍＬになるように重水素標識Ｄ６－２５水酸化コレステロールを溶解したもの）１０μＬを加えた。続いて、試料を珪藻土カラム（商品名「ＳＬＥ＋」、Ｂｉｏｔａｇｅ社）に１ｍＬアプライし、３ｍＬのｎ－ヘキサンで溶出した。続いて、溶出物の全量をシリカカラム（商品名「Ｓｅｐ－ｐａｋ」、ｗａｔｅｒｓ社）にアプライし、ｎ－ヘキサン：酢酸エチル（９：１）１ｍＬで洗浄してコレステロールを除去し、更に酢酸エチル１ｍＬをアプライして溶出物を回収した。オキシステロールは全てこの画分に回収された。
続いて、溶出液を４０℃に加温し、窒素気流下で乾固させた後、１０μＬのピリジンに溶解し、５０μＬのＢＳＴＦＡ：ＴＭＣＳ（９９：１）を加えて混和し、ＯＨ基を全てトリメチルシリル化した。続いて、誘導化された試料２μＬをＧＣ－ＭＳにインジェクションして解析した。定量値は、内部標準と２５ＯＨＣのピーク面積比を用いて計算した。
ＧＣ－ＭＳの分析条件は以下の通りであった。
《ＧＣ－ＭＳ分析条件》
キャピラリーカラム：Ｒｔｘ－５ＭＳ（長さ３０ｍ、内径０．２５ｍｍ、膜厚０．２５μｍ）
オーブン温度：１５０℃、保持１分－２０℃／分→２５０℃、５℃／分→２８０℃、保持１０分－２０℃／分→３３０℃、保持３分。
キャリアガス：Ｈｅ、線速度３９．０ｃｍ／秒
イオン源温度：２００℃
インターフェース温度：２８０℃
気化室温度：２５０℃
《ＧＣ－ＭＳ分析条件》
キャピラリーカラム：Ｒｔｘ－５ＭＳ（長さ３０ｍ、内径０．２５ｍｍ、膜厚０．２５μｍ）
オーブン温度：１５０℃、保持１分－２０℃／分→２５０℃、５℃／分→２８０℃、保持１０分－２０℃／分→３３０℃、保持３分。
キャリアガス：Ｈｅ、線速度３９．０ｃｍ／秒
イオン源温度：２００℃
インターフェース温度：２８０℃
気化室温度：２５０℃
図５は血清中の２５ＯＨＣの測定値を示すグラフである。図５中、「ＭＣＡ２０５－ＭＯＣＫ」はＣｈ２５Ｈを導入していないＭＣＡ２０５細胞株を移植したマウス由来の血清中の２５ＯＨＣの定量値を示し、「ＭＣＡ２０５－Ｃｈ２５Ｈ」はＣｈ２５Ｈを過剰発現させたＭＣＡ２０５細胞株を移植したマウス由来の血清中の２５ＯＨＣの定量値を示す。
その結果、Ｃｈ２５Ｈを過剰発現させたＭＣＡ２０５細胞株を移植したマウス由来の血清中の２５ＯＨＣの存在量は、Ｃｈ２５Ｈを導入していないＭＣＡ２０５細胞株を移植したマウス由来の血清中の２５ＯＨＣの存在量よりも有意に多いことが明らかとなった（ｐ＝０．００１５）。この結果は、血液試料を用いて、２５ＯＨＣの存在量を測定できることを示す。
＜ＩＩ．マウス癌細胞をＣｈ２５Ｈノックアウトマウスに移植したモデルでの検討＞
［実験例６］
（抗ＰＤ－Ｌ１抗体療法の有効性の検討）
Ｃｈ２５Ｈ遺伝子のノックアウトマウスの側腹部位に、マウス大腸癌細胞株であるＭＣ３８を移植し、腫瘍の体積を経時的に測定した。また、比較のために、野生型のＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部位に、ＭＣ３８細胞株を移植し、腫瘍の体積を経時的に測定した。
［実験例６］
（抗ＰＤ－Ｌ１抗体療法の有効性の検討）
Ｃｈ２５Ｈ遺伝子のノックアウトマウスの側腹部位に、マウス大腸癌細胞株であるＭＣ３８を移植し、腫瘍の体積を経時的に測定した。また、比較のために、野生型のＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部位に、ＭＣ３８細胞株を移植し、腫瘍の体積を経時的に測定した。
また、細胞移植から４日目、７日目、１０日目、１４日目に、各マウスに抗ＰＤ－Ｌ１抗体（ＢｉｏＸｃｅｌｌ社）２００μｇ／マウスを腹腔内脈投与した。また、比較のために、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の代わりにアイソタイプコントロール抗体（ラットＩｇＧ２ｂ、ＢｉｏＸｃｅｌｌ社）２００μｇ／マウスを腹腔内投与した群も用意した。
図６（ａ）～（ｄ）は、各群のマウスの腫瘍の体積の経時変化を示すグラフである。図６（ａ）～（ｄ）中、「ＷＴ」は野生型マウスの結果であることを示し、「Ｃｈ２５Ｈ ＫＯ」はＣｈ２５Ｈノックアウトマウスの結果であることを示し、「アイソタイプ抗体」は、アイソタイプコントロール抗体を投与したマウスの結果であることを示し、「抗ＰＤ－Ｌ１抗体」は抗ＰＤ－Ｌ１抗体を投与したマウスの結果であることを示す。
その結果、野生型マウスでは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の投与により腫瘍体積の増加が抑制されなかった個体が存在したのに対し、Ｃｈ２５Ｈノックアウトマウス（Ｃｈ２５Ｈ－ＫＯ）では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の投与により全ての個体において、腫瘍が完全に拒絶された。
この結果は、宿主側のＣｈ２５Ｈを除去又は阻害することにより、抗ＰＤ－Ｌ１抗体療法の有効性が向上することを示す。
［実験例７］
（細胞傷害性Ｔ細胞の検討３）
実験例６で作製した担癌マウスにおける所属リンパ節内及び腫瘍組織内の腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の誘導作用を、ＩＦＮ－γ産生アッセイで評価した。
（細胞傷害性Ｔ細胞の検討３）
実験例６で作製した担癌マウスにおける所属リンパ節内及び腫瘍組織内の腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の誘導作用を、ＩＦＮ－γ産生アッセイで評価した。
具体的には、まず、実験例６でアイソタイプコントロール抗体を投与した、ＭＣ３８細胞株を移植した野生型マウス、及び、ＭＣ３８細胞株を移植したＣｈ２５Ｈノックアウトマウスを、細胞移植から２２日後に安楽死させた。
続いて、各マウスから腫瘍組織を摘出し、はさみで切り刻んだ後、コラゲナーゼ溶液２０ｍＬ（２ｍｇ コラゲナーゼ＋３０Ｕ ＤＮａｓｅ／１ｍＬ ＲＰＭＩ１６４０）に入れ、３７℃で３０分間振盪した。その後、ＣＤ８磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を用いて、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を分離した。
得られた腫瘍組織由来のＴ細胞を、１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地中、野生型健常マウスより採取し、３２Ｇｙの放射線照射処理した脾臓細胞と混合し、Ｔ細胞脾臓細胞混合懸濁液Ａ（Ｔ細胞４×１０５個＋脾臓細胞１×１０７個／ｍＬ）を作製した。
また、各マウスから所属リンパ節（癌細胞移植側の腋窩、鼠径リンパ節）を摘出し、スライドグラスを用いてすり潰すようにしてリンパ節を破壊し、リンパ節細胞を回収し、１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地中、７×１０６個／ｍＬに調製したリンパ節細胞懸濁液Ｂを作製した。
続いて、Ｔ細胞脾臓細胞混合懸濁液Ａを、腫瘍抗原ｇｐ７０ペプチド（マウス白血病ウイルスＭｕＬＶ ｇｐ７０ ｐ１５Ｅの第６０４～６１１番目のアミノ酸からなるペプチド：ＫＳＰＷＦＴＴＬ、配列番号１）（１．０μｇ／ｍＬ）、ヒトＩＬ－２（２０Ｕ／ｍＬ）、マウスＩＬ－７（１０ｎｇ／ｍＬ）を含む１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地中、４８ウェルプレート（１ｍＬ／ウェル）で、２日間培養した。
また、リンパ節細胞懸濁液Ｂを、腫瘍抗原ｇｐ７０ペプチド（１．０μｇ／ｍＬ）、ヒトＩＬ－２（２０Ｕ／ｍＬ）、マウスＩＬ－７（１０ｎｇ／ｍＬ）を含む１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地中、４８ウェルプレート（１ｍＬ／ウェル）で、７日間培養した。
続いて、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｌｅｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＡＳ）を用いてリンパ球を回収した。回収した腫瘍組織由来のＴ細胞（１×１０５個）を、ＥＬ４細胞（１×１０５個）と終濃度１μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬのｇｐ７０ペプチドの存在下、９６ウェルプレート（２００μＬ／ウェル）中、１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地で、各群３ウェルずつ混合培養し、培養２４時間後の培養上清中のＩＦＮ－γをＥＬＩＳＡ法で測定した。
同様に、回収したリンパ節由来の細胞（５×１０４個）を、ＥＬ４細胞（１×１０５個）と終濃度１μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．０１μｇ／ｍＬ、０．００１μｇ／ｍＬ及び０μｇ／ｍＬのｇｐ７０ペプチドの存在下、９６ウェルプレート（２００μＬ／ウェル）中、１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地で、各群３ウェルずつ混合培養し、培養２４時間後の培養上清中のＩＦＮ－γをＥＬＩＳＡ法で測定した。
また、比較のために、ｇｐ７０ペプチドの代わりに無関係のβ－Ｇａｌペプチド（β－ガラクトシダーゼの第９６～１０３番目のアミノ酸からなるペプチド：ＤＡＰＩＹＴＮＶ、配列番号２）（１．０μｇ／ｍＬ）を接触させた群も用意した。
この結果、細胞中に癌抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞が存在した場合、癌抗原ペプチドを接触させることによりＩＦＮ－γが産生される。
図７（ａ）及び（ｂ）は、ＩＦＮ－γの産生量を定量した結果を示すグラフである。図７（ａ）は、腫瘍組織由来の細胞の結果であり、図７（ｂ）はリンパ節由来の細胞の結果である。図７（ａ）及び（ｂ）中、「Ｔｕｍｏｒ」は腫瘍組織由来の細胞の結果であることを示し、「ＬＮ」はリンパ節由来の細胞の結果であることを示し、「ＷＴ」は野生型マウス由来の腫瘍組織又はリンパ節の結果であることを示し、「Ｃｈ２５Ｈ ＫＯ」はＣｈ２５Ｈノックアウトマウス由来の腫瘍組織又はリンパ節の結果であることを示し、「ｇｐ７０」はｇｐ７０ペプチドを接触させた結果であることを示し、「β－ｇａｌ」はβ－ｇａｌペプチドを接触させた結果であることを示す。また、また、「＊」はｐ＜０．０５で有意差が存在することを示す。
その結果、Ｃｈ２５Ｈノックアウトマウス由来の腫瘍組織中の癌抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞の数は、野生型マウス由来の腫瘍組織中の癌抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞の数よりも有意に多いことが明らかとなった。また、Ｃｈ２５Ｈノックアウトマウス由来のリンパ節には、癌抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞が存在することが明らかとなった。これに対し、野生型マウス由来のリンパ節には、癌抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞の存在が明確には認められなかった。
以上の結果は、宿主側のＣｈ２５Ｈを除去又は阻害することにより、腫瘍組織及びリンパ節において、癌抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞の数が増加することを示す。
＜ＩＩＩ．各種ヒト癌組織におけるＣｈ２５Ｈの発現＞
［実験例８］
（各種ヒト癌組織におけるＣｈ２５Ｈの発現）
ＴＣＧＡ（Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ）（ｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）で公開されているＲＮＡシーケンスデータを用いて、各種ヒト癌組織におけるＣｈ２５Ｈの発現量を、Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ／）の提供する解析ツールを用いて検討した。図８は、各種ヒト癌組織におけるＣｈ２５Ｈ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。その結果、Ｃｈ２５Ｈ遺伝子の発現量が高い疾患例が認められた。これらの疾患例では、癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性が低い可能性が考えられた。
［実験例８］
（各種ヒト癌組織におけるＣｈ２５Ｈの発現）
ＴＣＧＡ（Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ）（ｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）で公開されているＲＮＡシーケンスデータを用いて、各種ヒト癌組織におけるＣｈ２５Ｈの発現量を、Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ／）の提供する解析ツールを用いて検討した。図８は、各種ヒト癌組織におけるＣｈ２５Ｈ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。その結果、Ｃｈ２５Ｈ遺伝子の発現量が高い疾患例が認められた。これらの疾患例では、癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性が低い可能性が考えられた。
本発明によれば、癌患者への癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性を判定する新たな技術を提供することができる。
Claims (6)
- Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ２５－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ（Ｃｈ２５Ｈ）遺伝子のｃＤＮＡを増幅するプライマーセット、Ｃｈ２５Ｈ遺伝子のｍＲＮＡにハイブリダイズするプローブ、Ｃｈ２５Ｈタンパク質に対する特異的結合物質又は２５－水酸化コレステロール（２５ＯＨＣ）の検出試薬を含む、癌患者への癌免疫療法を含む癌治療法の適用の有効性を判定するためのキット。
- Ｃｈ２５Ｈ遺伝子の発現を抑制する物質を有効成分として含有する、癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤。
- 前記Ｃｈ２５Ｈ遺伝子の発現を抑制する物質が、Ｃｈ２５Ｈ遺伝子のｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡである、請求項２に記載の癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤。
- 請求項２又は３に記載の癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤と、抗癌剤とを含む、癌治療用キット。
- 癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤のスクリーニング方法であって、
被験物質の存在下で、コレステロールとＣｈ２５Ｈタンパク質とを接触させて、２５ＯＨＣを生成させることと、
前記２５ＯＨＣの生成量が、前記被験物質の非存在下における２５ＯＨＣの生成量と比較して減少した場合に、前記被験物質は癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤であると判定すること、を含む、方法。 - 癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤のスクリーニング方法であって、
被験物質の存在下で癌細胞を培養することと、
前記癌細胞におけるＣｈ２５Ｈ遺伝子若しくはＣｈ２５Ｈタンパク質の発現量又は２５ＯＨＣの生成量を測定することと、
前記Ｃｈ２５Ｈ遺伝子若しくは前記Ｃｈ２５Ｈタンパク質の発現量又は前記２５ＯＨＣの生成量が、前記被験物質の非存在下と比較して減少した場合に、前記被験物質は癌免疫療法を含む癌治療法の有効性の向上剤であると判定すること、を含む、方法。
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| Simigdala et al.，Cholesterol biosynthesis pathway as a novel mechanism of resistance to estrogen deprivation in estrogen receptor-positive breast cancer，Breast Cancer Research，2016年，Vol.18，No.58 |
| WANG et al.，25-HC decreases the sensitivity of human gastric cancer cells to 5-fluorouracil and promotes cells invasion via the TLR2/NF-κB signaling pathway，International Journal of Oncology，2019年01月11日，Vol.54，Iss.3，p.966-980 |
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