JP2018508579A

JP2018508579A - ２型自然リンパ球細胞、インターロイキン３３、及び／またはインターフェロン誘導性タンパク質４４による癌免疫の調節

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Publication number: JP2018508579A
Application number: JP2017564785A
Authority: JP
Inventors: ウィルフレッドジェフリーズ; イリーナユリニーナサランコバ
Original assignee: ウィルフレッドジェフリーズ
Priority date: 2015-03-03
Filing date: 2016-03-03
Publication date: 2018-03-29
Anticipated expiration: 2036-03-03
Also published as: AU2016228147A1; CA3015392A1; JP6991863B2; EP3265114A4; AU2016228147B2; JP2022033933A; WO2016138590A1; US20220226440A1; US20180050091A1; CN107847563A; HK1252402A1; EP3265114A1; JP7373543B2; AU2021203291A1; US11213571B2

Abstract

本発明は、２型自然リンパ球細胞（ＩＬＣ２）、インターロイキン３３（ＩＬ−３３）、ＩＦＩ４４、またはこれらの組み合わせを用いて、癌免疫を調節する方法を提供する。また、２型自然リンパ球細胞（ＩＬＣ２）、インターロイキン３３（ＩＬ−３３）、ＩＦＩ４４、またはこれらの組み合わせを含む療法による治療によって、腫瘍転移及び／または癌の進行を防止する方法も提供される。また、癌の予後を評価するための診断方法も提供される。

Description

本発明は、癌免疫の分野に関する。具体的には、本発明は、２型自然リンパ球細胞（ＩＬＣ２）、インターロイキン３３（ＩＬ−３３）、及び／またはインターフェロン誘導性タンパク質４４（ＩＦＩ４４）による癌免疫の調節に関する。

癌は、先進国世界において主な死亡原因であり、癌遺伝子及び腫瘍抑制遺伝子で生じる遺伝子突然変異の結果として発生する。これらの突然変異は、抑制されない細胞増殖を引き起こし、原発性腫瘍が突然変異し続けることを可能にし、しばしば、疾患の致命的な転移性形態に進展し得る（ＨａｎａｈａｎａｎｄＷｅｉｎｂｅｒｇ，２０１１、Ｊａｎｅｗａｙｅｔａｌ．，２００８）。腫瘍のゲノムプロファイリングは、多くの異なる腫瘍型に共通である「転移性遺伝子特性」を示している（ＨａｎａｈａｎａｎｄＷｅｉｎｂｅｒｇ，２０１１）。この転移性特性が、局所的増殖潜在能力を有する腫瘍を、遠位部位に播種するように遺伝的に構成されている腫瘍と区別する。したがって、腫瘍細胞の運動性、浸潤、免疫回避、血管新生、及びコロニー形成を媒介する遺伝子は、転移性進行遺伝子に分類されている。これらの遺伝子によってコードされるタンパク質は、免疫学的に検出することができないが、腫瘍細胞が細胞間の接着力を克服し、遠位部位に移動し、遠位臓器に生存し、定着することを可能にする。

免疫系は、腫瘍の出現を制限する。免疫系の細胞アームは、転移性癌に対する保護を提供するために極めて重要である。免疫系のＣＤ８＋Ｔ細胞は、細胞表面上の主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ−Ｉ）分子をモニタリングすることによって、正常細胞と癌性細胞またはウイルス感染細胞とを区別することができる。ヒトにおいてヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子として知られているＭＨＣ−Ｉ分子は、実質的にすべての細胞によって提示され、細胞からタンパク質の断片、またはペプチドとの複合体を形成する。腫瘍は、悪性形質転換事象、その後の主要の成長及び拡大に関連する、タンパク質を発現する。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）と称されるこれらのタンパク質からの抗原ペプチドは、現行の免疫療法のアプローチの焦点である。それ故に、現行のパラダイムは、腫瘍の出現が、ＴＡＡの異常な発現を認識するロバスト適用免疫反応によって制限されるべきであると考える（Ｓｅｔｉａｄｉｅｔａｌ．，２００８、Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，２００８）。癌の発生時に、新生細胞は、免疫学的に認識することができない形態に表現型のシフトを促す多種多様の染色体を変化させ得る。免疫認識の平衡の不在下で、インフルエンザＡ及びＢウイルスにおける遺伝的浮動と同様に、結果として得られた免疫回避クローンは、転移を作動させる成長の利点を有し得る（Ａｌｉｍｏｎｔｉｅｔａｌ．，２０００ａ、Ｇａｂａｔｈｕｌｅｒｅｔａｌ．，１９９４）。腫瘍組織における遺伝子発現プロファイルは、結合組織の外郭構造と称される局所的微環境によってかなりの程度まで影響される。この外郭構造は、間質線維芽細胞等の正常細胞、浸潤免疫細胞、及び細胞外マトリックスからなる。現在、腫瘍浸潤免疫細胞及びサイトカイン関連シグナル伝達経路は、腫瘍成長の動力学に密接な関連があることが、概ね認められている。転移性遺伝子特徴は、腫瘍の悪性の可能性を定義するために、共に作用する遺伝子の組み合わせである。免疫逃避の選択時の消失した遺伝子の発現の相補性は、それらを免疫学的に認識可能にし、腫瘍の免疫回避を潜在的に停止し得る（Ａｌｉｍｏｎｔｉｅｔａｌ．，２０００ａ、Ｇａｂａｔｈｕｌｅｒｅｔａｌ．，１９９４）。

主要組織適合性クラスＩ遺伝子（ＭＨＣ−Ｉ）／ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子の発現の下方制御を含む、腫瘍における免疫回避についてのいくつかの機構がある。ＨＬＡク
ラスＩ分子の欠失は、腫瘍の攻撃性及び転移性の可能性と関連がある。胸部、腎臓、黒色腫、結腸直腸、頭頸部扁平上皮細胞、子宮頸部、及び前立腺癌を含む、いくつかのタイプの癌は、ＨＬＡの下方制御、不良な予後、及び疾患の転移性拡散の間の相関関係を示す。

免疫細胞の重要な群は、自然リンパ球細胞（ＩＬＣ）である（Ｓｐｉｔｓｅｔａｌ．，２０１３）。ＩＬＣファミリーは、再配置された抗原特異的な受容体の不在、及び幹細胞抗原１（Ｓｃａ１）、リンパ前駆細胞マーカーＩＬ７Ｒａ（ＣＤ１２７）、ＩＬ２Ｒａ（ＣＤ２５）、ＩＬ１７ＢＲ（ＩＬ２５Ｒのサブユニット）、ＩＬ−３３受容体Ｔ１／ＳＴ２鎖の発現によって、表現型的に特徴付けられる、細胞のサイトカイン産生群である（Ｗａｌｋｅｒｅｔａｌ．，２０１３）。ＩＬＣは、現在、３つの主な群に分割され、それらが産生するサイトカインによって定義される（Ｌａｎｉｅｒ，２０１３）。群２
ＩＬＣ（ＩＬＣ２）は、２型サイトカイン（例えばＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１３）を産生し得、自然ヘルパー細胞であると考えられる（Ｎｅｉｌｌｅｔａｌ．，２０１０、ＲｏｅｄｉｇｅｒａｎｄＷｅｎｉｎｇｅｒ，２０１５）。ＩＬＣ２は、粘膜中の上皮細胞によって産生される、ＩＬ−２５及びＩＬ−３３等のプロアレルギー性サイトカインに応答する（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｇｏｎｚａｌｅｚｅｔａｌ．，２０１５）。さらに、ＩＬＣ２によって媒介されるぜんそく様症状は、単独でＩＬ−３３を用いて、Ｔ及びＢ細胞を欠失するマウスにおいて誘導されている（Ｎａｂｅ，２０１４）。

群３ＩＬＣは、サイトカインＩＬ−１７Ａ及び／またはＩＬ−２２を産生するそれらの能力によって定義される。それらは、宿主の腸内免疫系と自然微生物叢との間のバランスを調節する特定の役割を有する、細胞外細菌への反応を促進する際に重要である。

インターロイキン３３（ＩＬ−３３）は、ＩＬ−１スーパーファミリーに属するサイトカインである（ＣａｙｒｏｌａｎｄＧｉｒａｒｄ，２０１４、Ｇａｏｅｔａｌ．，２０１５、Ｇｕａｂｉｒａｂａｅｔａｌ．，２０１４、Ｋｅａｒｌｅｙｅｔａｌ．，２０１５、Ｍａｒｔｉｎ，２０１３、Ｍｕｓｏｌｉｎｏｅｔａｌ．，２０１４、Ｐａｓｃｕａｌ−ＦｉｇａｌａｎｄＪａｎｕｚｚｉ，２０１５）。ＩＬ−３３は、核因子及び炎症性サイトカインとしての機能を果たす二重機能タンパク質である。核局在化及びヘテロクロマチンとの関連は、Ｎ末端ドメインによって媒介され、かつＩＬ−３３が、ＮＦ−κＢ錯体のｐ６５サブユニットの新規の転写調節因子として作用するのを可能にする。Ｃ末端ドメインは、ＳＴ２受容体と結合し、かつ極性Ｔｈ２細胞（Ｃａｒｒｉｅｒｅｅｔａｌ．，２００７）及びＩＬＣ２細胞からの２型サイトカイン（例えばＩＬ−５及びＩＬ−１３）の産生を活性化するのに十分である。

インターフェロン誘導性タンパク質４４（ＩＦＩ４４）は、２つのヒト黒色腫細胞株において抗増殖性活性を有することがこれまでに示されているＩＦＮ−アルファ誘導タンパク質である。（Ｈａｌｌｅｎｅｔａｌ．，２００７）。

本発明の目的は、２型自然リンパ球細胞及び／またはインターロイキン３３による癌免疫の調節を提供することである。本発明によると、治療上有効な量のインターロイキン−３３を投与することを含む、癌を治療し、かつ／または癌の進行を抑制するための方法が、提供される。本発明の別の態様によると、２型自然リンパ球細胞（ＩＬＣ２）の数を増加させることを含む、癌を治療するための方法が、提供される。本発明の別の態様によると、ＩＬＣ２細胞を投与することを含む、癌を治療し、かつ／または癌の進行を抑制するための方法が、提供される。本発明の別の態様によると、インターロイキン３３及び／または２型自然リンパ球細胞を投与することを含む、免疫反応を刺激する方法が、提供される。本発明の別の態様によると、治療上有効な量のＩＦＩ４４を投与することを含む、癌を治療し、かつ／または癌の進行を抑制するための方法が、提供される。本発明の別の態
様によると、インターロイキン−３３の発現をモニタリングするステップを含む、癌の予後を評価する方法が、提供される。本発明の別の態様によると、腫瘍中／またはその周辺の好酸球の存在についてスクリーニングすることを含む、癌の予後を判定する、疾患の進行を判定し、かつ／または癌の臨床転帰を判定する方法が、提供される。

本発明のこれら及び他の特性は、参照が添付の図面に対してなされた、以下の詳細な説明においてより明らかになるであろう。

ＩＬ−３３及び様々な抗原提示タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子は、マウス転移性肺及び前立腺癌において下方制御される。転移性肺癌（Ａ９、ＴＣ−１腫瘍細胞に由来した転移性クローン）の遺伝子発現は、原発性非転移性腫瘍（ＴＣ１）と比較された。転移性前立腺癌（ＬＭＤ）の遺伝子発現は、原発性の非転移性腫瘍（ＰＡ）と比較された。マイクロアレイデータは、Ａｇｉｌｅｎｔチップ及びＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇＧＸソフトウェアを用いて得られた。ＩＬ−３３の遺伝子発現は、ヒト良性及び原発性前立腺腫瘍と比較して、ヒト転移性前立腺癌において下方制御される。データは、ＥｕｒｏｐｅａｎＢｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ（アクセス日：２０１３年１月３０日）によって作成されたＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｔｌａｓから得られた。ＩＬ−３３は、マウス転移性肺癌クローンＡ９細胞における増加したＴＡＰ−１及びＨ２−Ｋｂの発現ならびにシグナル伝達の一因となる。ａ）ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＩＬ−３３遺伝子によるＴＡＰ欠失Ａ９細胞の一過性トランスフェクションが、ＴＡＰ−１の遺伝子発現を復元することを示す。陽性対照は、ＴＡＰ−１及びＭＨＣ−Ｉの両方を発現する、ＴＣ１細胞（原発性腫瘍）である。陰性対照は、Ａ９細胞単独、及びベクター単独でトランスフェクトされたＡ９細胞である。β−アクチンのレベルは、負荷対照として使用した。ＩＬ−３３は、マウス転移性肺癌クローンＡ９細胞における増加したＴＡＰ−１及びＨ２−Ｋｂの発現ならびにシグナル伝達の一因となる。ｂ）ウェスタンブロット：ＩＬ−３３遺伝子によるＡ９細胞の一過性トランスフェクションは、ＴＡＰ−１及びＨ２−Ｋｂのタンパク質発現を復元する。Ａ９またはＴＣ１細胞は、ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰベクター単独またはＩＬ−３３遺伝子を含有するベクターのいずれかで一過性にトランスフェクションされた。トランスフェクションされなかったＡ９細胞もまた、サイトカインで処理された。マウスＴＡＰ−１及びＨ２−Ｋｂの検出は、ウサギポリクローナル抗マウスＴＡＰ−１またはＨ２−Ｋｂウサギポリクローナル抗体（抗エクソン８）を用いてウェスタンブロットにおいて見られ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０ヤギ抗ウサギは、二次抗体として使用した。レーン１は、未処理のＡ９細胞を示し、レーン２は、空のベクターでトランスフェクションされたＡ９を示し、レーン３は、ＩＬ−３３でトランスフェクションされたＡ９を示し、レーン４は、ＩＬ−３３サイトカイン（５０ｎｇ／ｍｌ）で処理されたＡ９細胞を示し、レーン５は、ＩＦＮ−γサイトカイン（５０ｎｇ／ｍｌ）で処理されたＡ９細胞を示し、レーン６は、ＩＬ−３３でトランスフェクションされたＴＣ１細胞を示す。ベクター単独での細胞の一過性トランスフェクションはまた、ＴＡＰ−１及びＨ２−Ｋｂの発現を上方制御した。空のベクターでのトランスフェクションから得られたＴＡＰ−１及びＨ２−Ｋｂの発現の上方制御は、自然ＤＮＡセンシング機構の結果であり得る。タンパク質として添加されたＩＬ−３３サイトカインはまた、ＴＡＰ−１及びＨ２−Ｋｂの発現を上方制御した。ＩＬ−３３タンパク質の添加は、ＤＮＡ依存性自然免疫シグナル伝達経路を避ける。ＩＬ−３３遺伝子でトランスフェクションされたＴＣ１細胞株はまた、ｍＴＡＰ１及びＨ２−Ｋｂの発現の上方制御の増加を示した。ＩＬ−３３は、マウス転移性肺癌クローンＡ９細胞における増加したＴＡＰ−１及びＨ２−Ｋｂの発現ならびにシグナル伝達の一因となる。ｃ）ＦＡＣＳ分析は、ＭＨＣ−Ｉ（Ｈ２−Ｋｂ）タンパク質の表面発現が、ＩＬ−３３遺伝子によるトランスフェクションの際にＡ９細胞において増加することを示す。Ａ９細胞は、ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰベクター単独（青色／左から二番目のピーク）またはＩＬ−３３を含むベクター（緑色）のいずれかで一過性にトランスフェクションされた。次いで、細胞を、ＰＥ共役抗Ｋｂマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（ＢＤＨａｒｍｉｎｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）で染色し、ＦＡＣＳｃａｎサイトメータ上で分析した。細胞表面上に発現したＨ２Ｋｂの量もまた、評価した。トランスフェクションされなかったＡ９細胞（灰色／左から一番目のピーク）は、陰性対照として使用したが、ＩＦＮ−γで処理されたものは、陽性対照（赤色）として使用した。転移性マウス肺癌細胞（Ａ９）内のＩＬ−３３の発現は、Ｂ３ＺＴ細胞による抗原特異的認識を増強した。さらに、外因性ＩＬ−３３サイトカインタンパク質の添加により、ＯＶＡ特異的なＢ３ＺＴ細胞の活性化を誘導した。ＩＦＮ−γの添加は、陽性対照として使用した。ＩＬ−３３遺伝子の下方制御は、原発性肺腫瘍細胞におけるＭＨＣ−ＩＨ２−Ｋｂタンパク質発現を減少させた。ＴＣ−１原発性腫瘍細胞を、ＩＬ−３３に対して標的にされるｓｉＲＮＡで、４８または７２時間処理した。ａ）ＥＬＩＳＡアッセイは、細胞上清中の分泌されたＩＬ−３３のレベルを測定するために使用した（Ｒｅａｄｙ−Ｓｅｔ−ｇｏＥＬＩＳＡキットカタログ番号８８−７３３３−８８（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））。ｂ）ウェスタンブロット分析は、細胞ペレット中のＩＬ−３３タンパク質のレベルを測定するために使用し、（ＩＬ−３３（Ａｂｃａｍ）ａｂ５４３８５に対する「Ｎｅｓｓｙ−１」マウス抗体）は、一次抗体として使用し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８９ヤギ抗マウス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）Ａ２１０５８は、二次抗体として使用した）。ｃ）ＦＡＣＳは、腫瘍細胞の表面上のＭＨＣ−ＩＨ２−Ｋｂの発現を測定するために使用した。ＴＣ−１細胞を、ＩＬ−３３に対してｓｉＲＮＡで７２時間処理し、ＭＨＣ−ＩＨ２−Ｋｂの細胞表面発現は、フローサイトメトリーによって評価した：抗ＩＬ−３３ｓｉＲＮＡ（水色）、非標的ｓｉＲＮＡ（赤色）、または未処理の状態のまま（青色）。次いで、細胞を、ＰＥコンジュゲート抗Ｋｂマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）で染色したか、または染色せず（灰色）、ＦＡＣＳｃａｎサイトメータ上で分析した。ＭＨＣ−ＩＨ２−Ｋｂの下方制御は、マウス原発性肺腫瘍細胞、ならびにＨ２−Ｋｂ−／−マウスにおけるＩＬ−３３遺伝子発現を減少させた。ＴＣ１原発性腫瘍細胞を、マウスＭＨＣ−Ｉ（Ｈ２−Ｋｂ）に対して特異的に標的化された２つの異なるｓｉＲＮＡで９６時間処理した。Ｈ２−Ｋｂ−／−マウスから単離された膵細胞は、ＩＬ−３３及びＨ２−Ｋｂ遺伝子の同時制御を試験するために使用した。ａ）ＦＡＣＳ：ＭＨＣ−Ｉ表面発現は、抗Ｈ２−Ｋ１ｓｉＲＮＡ処理により、ＴＣ１細胞において下方制御した。ＭＨＣ−ＩＨ２−Ｋｂの下方制御は、マウス原発性肺腫瘍細胞、ならびにＨ２−Ｋｂ−／−マウスにおけるＩＬ−３３遺伝子発現を減少させた。ＴＣ１原発性腫瘍細胞を、マウスＭＨＣ−Ｉ（Ｈ２−Ｋｂ）に対して特異的に標的化された２つの異なるｓｉＲＮＡで９６時間処理した。Ｈ２−Ｋｂ−／−マウスから単離された膵細胞は、ＩＬ−３３及びＨ２−Ｋｂ遺伝子の同時制御を試験するために使用した。ｂ）ＲＴ−ＰＣＲ：Ｈ２−Ｋｂに対するプライマーは、Ｈ２−Ｋｂ遺伝子の結果として得られる転写レベルを試験するために使用した：レーン１は、分子量の制御を示し、レーン２は、Ｈ２−Ｋｂに対してｓｉＲＮＡで処理されたＴＣ１細胞を示し、レーン３は、未処理のＴＣ１細胞を示し、β−アクチンは、負荷制御として使用した。ｃ）ＲＴ−ＰＣＲ：次いで、ＩＬ−３３に対するプライマーは、ＩＬ−３３遺伝子の結果として得られる転写レベルを試験するために使用した：レーン１及び２は、Ｈ２−Ｋｂに対してｓｉＲＮＡで処理されたＴＣ１細胞を示し、レーン３は、未処理のＴＣ１細胞を示し、レーン４及び５は、非特異的ｓｉＲＮＡで処理されるＴＣ１細胞を示し、β−アクチンは、負荷制御として使用した。ｄ）ＲＴ−ＰＣＲ：Ｈ２−Ｋｂ、ＩＬ−３３、及びｍＴＡＰ−１に対するプライマーは、Ｈ２−Ｋｂ−／−マウスの膵細胞における遺伝子の結果として得られる転写レベルを試験するために使用した：レーン１は、Ｈ２−Ｋｂ−／−マウスの膵細胞を示し、レーン２は、未処理のＴＣ１細胞を示し、β−アクチンは、負荷制御として使用した。ＭＨＣ−ＩＨ２−Ｋｂの下方制御は、マウス原発性肺腫瘍細胞、ならびにＨ２−Ｋｂ−／−マウスにおけるＩＬ−３３遺伝子発現を減少させた。ＴＣ１原発性腫瘍細胞を、マウスＭＨＣ−Ｉ（Ｈ２−Ｋｂ）に対して特異的に標的化された２つの異なるｓｉＲＮＡで９６時間処理した。Ｈ２−Ｋｂ−／−マウスから単離された膵細胞は、ＩＬ−３３及びＨ２−Ｋｂ遺伝子の同時制御を試験するために使用した。ｂ）ＲＴ−ＰＣＲ：Ｈ２−Ｋｂに対するプライマーは、Ｈ２−Ｋｂ遺伝子の結果として得られる転写レベルを試験するために使用した：レーン１は、分子量の制御を示し、レーン２は、Ｈ２−Ｋｂに対してｓｉＲＮＡで処理されたＴＣ１細胞を示し、レーン３は、未処理のＴＣ１細胞を示し、β−アクチンは、負荷制御として使用した。ｃ）ＲＴ−ＰＣＲ：次いで、ＩＬ−３３に対するプライマーは、ＩＬ−３３遺伝子の結果として得られる転写レベルを試験するために使用した：レーン１及び２は、Ｈ２−Ｋｂに対してｓｉＲＮＡで処理されたＴＣ１細胞を示し、レーン３は、未処理のＴＣ１細胞を示し、レーン４及び５は、非特異的ｓｉＲＮＡで処理されるＴＣ１細胞を示し、β−アクチンは、負荷制御として使用した。ｄ）ＲＴ−ＰＣＲ：Ｈ２−Ｋｂ、ＩＬ−３３、及びｍＴＡＰ−１に対するプライマーは、Ｈ２−Ｋｂ−／−マウスの膵細胞における遺伝子の結果として得られる転写レベルを試験するために使用した：レーン１は、Ｈ２−Ｋｂ−／−マウスの膵細胞を示し、レーン２は、未処理のＴＣ１細胞を示し、β−アクチンは、負荷制御として使用した。Ｈ２−Ｋｂの下方制御は、Ｈ２−Ｋｂ−／−マウスの膵細胞におけるＩＬ−３３遺伝子発現を減少した。Ｔａｐ１の発現においてＨ２−Ｋｂの下方制御の増分効果があると思われるが、ＩＬ−３３の発現は、ＭＨＣ−Ｉの閾値発現を必要とすると思われる。転移性細胞は、ヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）をもたらす、ＩＬ−３３プロモーター−エンハンサー領域内の突然変異を有する。ＧＡＴＡ結合領域内の転移性Ａ９細胞のＩＬ−３３プロモーターにおける単一塩基対突然変異Ａ１１４Ｇは、あるＩＬ−３３対立遺伝子に影響を及ぼし、ヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）、及び３つのＧＡＴＡ転写因子の消失をもたらした。ＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌＢｉｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒのデータベース（ｗｗｗ．ｃｂｒｃ．ｊｐ）を使用した。ＩＬ−３３遺伝子相補作用は、兆候及び症状の重症度ならびに進行速度の観点から疾患の臨床症状を変化し得る。Ａ９細胞へのＩＬ−３３遺伝子の安定したトランスフェクションは、（Ａ）腫瘍成長速度を抑制し、（Ｂ）インビボで動物の体重を維持する。ＩＬ−３３遺伝子相補作用は、兆候及び症状の重症度ならびに進行速度の観点から疾患の臨床症状を変化し得る。Ａ９細胞へのＩＬ−３３遺伝子の安定したトランスフェクションは、（Ａ）腫瘍成長速度を抑制し、（Ｂ）インビボで動物の体重を維持する。ＩＬ−３３遺伝子相補作用は、マウスモデルにおける副腎への腫瘍細胞の転移拡散を抑制する。ＧＦＰ陽性循環腫瘍細胞は、初期皮下移植から遠位である副腎から単離され、フローサイトメトリーを用いて評価された。ａ）腫瘍のない対照動物から単離される代表的な結果がここに示される。各グラフは、ある動物からのデータを表す。ＩＬ−３３遺伝子相補作用は、マウスモデルにおける副腎への腫瘍細胞の転移拡散を抑制する。ＧＦＰ陽性循環腫瘍細胞は、初期皮下移植から遠位である副腎から単離され、フローサイトメトリーを用いて評価された。ｂ）［Ａ９＋ベクター］が注入された動物から単離される代表的な結果がここに示される。各グラフは、ある動物からのデータを表す。ＩＬ−３３遺伝子相補作用は、マウスモデルにおける副腎への腫瘍細胞の転移拡散を抑制する。ＧＦＰ陽性循環腫瘍細胞は、初期皮下移植から遠位である副腎から単離され、フローサイトメトリーを用いて評価された。ｃ）［Ａ９＋ＩＬ−３３遺伝子］が注入された動物から単離される代表的な結果がここに示される。各グラフは、ある動物からのデータを表す。ＩＬ−３３遺伝子相補作用は、マウスモデルにおける副腎への腫瘍細胞の転移拡散を抑制する。ＧＦＰ陽性循環腫瘍細胞は、初期皮下移植から遠位である副腎から単離され、フローサイトメトリーを用いて評価された。ｄ）ｃ帯におけるＧＦＰ陽性循環腫瘍細胞の定量化から単離される代表的な結果がここに示される。各グラフは、ある動物からのデータを表す。腫瘍の形態。ＩＬ−３３遺伝子発現は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の数の増加を促した。フローサイトメトリーは、切除された腫瘍から単離されたＴＩＬを数えないように使用した。さらに、ＴＩＬは、Ａ９＋ＩＬ−３３及び原発性腫瘍ＴＣ１の両方を含む、ＩＬ−３３を発現した腫瘍に存在することが見出された。転移性（Ａ９＋ベクター）、原発性（ＴＣ１）、及び遺伝的に補完された転移性（Ａ９＋ＩＬ−３３）腫瘍における、腫瘍浸潤リンパ球及び他の標的物（ＣＤ４、ＣＤＳ、ＭＨＣ−Ｉ、ＣＤ６８、Ｌｙ６Ｇ、Ｆｏｘｐ３）のための免疫組織化学染色。免疫回避腫瘍の遺伝的相補性は、免疫認識に対する表現型のシフトをもたらす。厚さ１０μｍの切片は、適切な抗体で染色し、２０倍の倍率で画像化した。ＩＬＣ２の頻度は、ＩＬ−３３遺伝子で安定にトランスフェクトされた原発性腫瘍及び転移性腫瘍を持つ動物において上昇した。非凝集性リンパ節及び腫瘍組織から単離されたＩＬＣ２を、Ｌｉｎ・ＳＴ２^＋ＣＤ１２７^＋ＣＤ９０．２^＋細胞としてフローサイトメトリーによって分析した。ゲート戦略は、初めに、系統陰性（Ｌｉｎ⁻）及び（ＣＤ９０．２）陽性白血球においてゲート化することと、ＳＴ２^＋及びＣＤ１２７^＋の発現のためにさらに分析することと、を含んだ：ａ）リンパ節から単離された染色されたＩＬＣ、ｂ）リンパ節から単離されたＩＬＣ２の定量化。これらの範囲は、各処理群における８匹の異なる動物を比較するデータを表す。ｃ）腫瘍から単離された染色されたＩＬＣ、ｄ）腫瘍から単離されたＩＬＣ２の定量化。これらの範囲は、各処理群における４匹の異なる動物を比較するデータを表す；＊Ｐ＜０．０５は、原発性［ＴＣ１＋ベクター］及び転移性［Ａ９＋ベクター］腫瘍から単離されたＩＬＣ２細胞で比較された（スチューデントｔ検定）。キメラマウスにおける腫瘍成長速度。Ａ９細胞へのＩＬ−３３遺伝子の安定したトランスフェクションは、ＲＯＲα−／−キメラと比較した場合に、野生型マウスにおいて著しく抑制された腫瘍形成をもたらした。抗腫瘍免疫反応への自然リンパ球の関与は、腫瘍の発達の早期段階時により高い。マウスに、ＲＯＲα−／−または野生型骨髄のいずれかを移植し、骨髄の再増殖が成功した後に、ＩＬ−３３を発現する転移性腫瘍［Ａ９＋ＩＬ−３３］を、これらのキメラマウスに注入した。ａ）腫瘍の構築から３週間後に、隣接したリンパ節に見出されるＩＬＣ２細胞の数は、野生型キメラと比較して、ＲＯＲα−／−マウスにおいて著しく低かった。４週間目には、ＩＬＣ２細胞の数は、ＲＯＲα−／−及び野生型マウスの両方において低下した。ｂ）ＲＯＲα欠失は、ＣＤ４／ＣＤ８リンパ球の比率において効果がなかった。ＩＬ−３３及びＩＦＩ４４（インターフェロン誘導性タンパク質４４）は、転移性腫瘍の免疫認識を補足する。転移性マウス肺癌細胞（Ａ９）内のＩＦＩ４４遺伝子の発現は、Ｂ３ＺＴ細胞による抗原特異的認識を、ＩＬ−３３遺伝子と比較して、より高いレベルまで増強した。［ＴＣ１＋ベクター］細胞株は、陽性対照として使用した。ＩＬ−３３遺伝子相補作用は、マウスモデルにおける副腎への腫瘍細胞の転移拡散を抑制する：ＧＦＰ陽性循環腫瘍細胞は、初期皮下移植から遠位である副腎から単離され、フローサイトメトリーを用いて評価された。ａ）［Ａ９＋ベクター］が注入された動物、［Ａ９＋１Ｌ−３３遺伝子］が注入された動物、［ＴＣ１＋ベクター）が注入された動物；ｂ）腫瘍のない対照動物、ｃ）ａ）におけるＧＦＰ陽性循環腫瘍細胞の定量化、の群から単離される代表的な結果がここに示される。このグラフは、各群における８匹の動物から個々に収集された副腎において検出されたＣＴＣのデータを表す。＊Ｐ＜０．０５、原発性［ＴＣ１＋ベクター）または遺伝的に補完された［Ａ９＋ＩＬ−３３］ものを有する転移性［Ａ９＋ベクター］腫瘍を持つ、動物の副腎から単離されたＣＴＣを比較した場合。抗腫瘍炎症反応における好酸球の関与。免疫回避腫瘍の遺伝的相補性は、抗腫瘍炎症反応の上方制御に対するシフトを示す。ＩＬ−３３の発現によってもたらされた因子の放出は、微環境を修正し、転移性の未処理腫瘍と比較した場合に、好酸球が組織を流れるのを可能にした。厚さ１０μｍの切片は、ギムザで染色し、２０倍の拡大で画像化した。ａ）悪性腫瘍の周辺に隣接した正常な組織内の好酸球の蓄積の２つの焦点領域、ｂ）好酸球は、転移性腫瘍を発現するＩＬ−３３の組織を流れる。バール＝２００μｍ免疫反応性及び免疫回避腫瘍モデルの比較。転移性及び非転移性細胞株を比較する、遺伝子オントロジー分析。このプログラムは、それらの生物学的特性、細胞組成、機能に基づいて異なる遺伝子をグループ化する。マウスゲノムにおける１０群の遺伝子産物は、細胞外マトリックスリモデリングに関与した遺伝子及び免疫反応に関与した遺伝子を含む、転移性細胞株と非転移性細胞株との間に著しい差があった。免疫回避を示す遺伝子。ＩＬ−３３、ＩＦＩ４４、及び様々な抗原提示タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子は、マウス転移性肺及び前立腺癌において下方制御される。ＭＲ１−非ペプチド提示分子。ＩＬ−３３、ＭＲ１、及びＩＦＩ４４は、ヒト転移性前立腺癌において下方制御される。ＩＬ−３３、ＩＦＩ４４遺伝子は、ＭＨＣ欠失Ａ９マウス肺癌細胞における増加したＴＡＰ−１及びＨ２−Ｋｂの発現／シグナル伝達の一因となる。ＩＬ−３３、ＩＦＩ４４遺伝子は、ＭＨＣ欠失Ａ９マウス肺癌細胞における増加したＴＡＰ−１及びＨ２−Ｋｂの発現／シグナル伝達の一因となる。ＩＬ−３３−サイトカインは、ＭＨＣ欠失Ａ９マウス肺癌細胞における増加したＨ２−Ｋｂの発現／シグナル伝達の一因となる。ＩＬ−３３、ＭＲ−１は、ＭＨＣ欠失Ａ９マウス肺癌細胞における増加したＨ２−Ｋｂの発現／シグナル伝達の一因となった。ＩＦＩ４４の下方制御は、Ｈ２−Ｋｂの発現を減少させた。ＩＬ−３３の下方制御は、Ｈ２−Ｋｂの発現を減少させた。ＩＬ−３３、ＭＲ−１、及びＩＦＩ４４の下方制御は、Ｈ２−Ｋｂの表面発現を減少させた。Ｈ２−Ｋｂの下方制御は、選択された遺伝子候補の発現を減少させた。Ｈ２−Ｋｂの下方制御は、Ｈ２−Ｋｂ−／−マウスの膵細胞における選択された遺伝子候補の発現を減少させるように思われる。ＴＣ−１細胞においてＩＦＩ４４に対して標的化されたｓｉＲＮＡは、ＭＲ−１遺伝子発現を下方制御した。ＭＲ１−タンパク質発現は、遺伝子候補で安定にトランスフェクトされたすべてのＡ９クローンにおいて上方制御された。ＩＦＩ４４は、Ａ９細胞によってＩＬ−３３タンパク質産生を上方制御した。ＩＦＩ４４及びＩＬ−３３遺伝子発現は、インビボで腫瘍成長速度の抑制を促した。［Ａ９＋ＭＲ１］腫瘍成長速度における回帰分析。ＩＬ−３３またはＩＦＩ４４遺伝子相補作用は、兆候及び症状の重症度ならびに進行速度の観点から疾患の臨床症状を変化し得る。具体的には、Ａ９細胞へのＩＬ−３３またはＩＦＩ４４遺伝子の安定したトランスフェクションは、インビボで腫瘍成長速度を抑制する。ＩＬ−３３またはＩＦＩ４４遺伝子相補作用は、兆候及び症状の重症度ならびに進行速度の観点から疾患の臨床症状を変化し得る。具体的には、Ａ９細胞へのＩＬ−３３またはＩＦＩ４４遺伝子の安定したトランスフェクションは、インビボで動物の体重を維持する。ＩＬ−３３及びＩＦＩ４４遺伝子相補作用は、インビボで疾患の転移拡散を防ぐ。ＩＦＩ４４遺伝子相補作用は、マウスモデルにおける疾患の転移拡散を停止するように思われる。（ａ）Ａ９細胞へのＩＦＦＩ４４遺伝子の安定したトランスフェクションは、腫瘍の皮下移植の初期部位から遠位であった副腎へのＧＦＰ陽性腫瘍細胞の転移拡散を効果的に停止した。副腎におけるＧＦＰ陽性循環腫瘍細胞の存在は、フローサイトメトリーによって評価された。副腎は、Ａ９（左）またはＡ９＋ＩＦＩ４４腫瘍（中央）または原発性腫瘍（右）を持つ動物から単離された。各グラフは、ある代表的な動物からのデータに対応する。（ｂ）全細胞の割合として、（ａ）中のＧＦＰ陽性循環腫瘍細胞の定量化。このグラフは、各群における８匹の代表的な動物からのデータに対応する。＊Ｐ＜０．０５、ＴＣ１またはＡ９またはＡ９＋ＩＦＩ４４腫瘍（ｔｕｍｏｕｒ）を持つマウスから単離されたＧＦＰ陽性ＣＴＣ細胞を比較する（スチューデントｔ検定）。（ｃ）転移性小結節は、転移性Ａ９腫瘍（左）を持つ動物から単離された肥大肝において検出された。Ａ９＋ＩＦＩ４４腫瘍（右）を持つ動物から単離された肝臓。ＩＦＩ４４腫瘍及びリンパ節におけるＣＤ４／ＣＤ８の計数。ＩＬ−３３が補完された腫瘍におけるＣＤ４／ＣＤ８の計数。腫瘍形態学遺伝子操作された腫瘍における炎症反応の上方制御（好酸球、ギムザ染色）。リンパ節におけるＩＬＣ２。Ａ９＋ベクター、ＩＬ−３３、ＴＣ１におけるＩＬＣ２リンパ節及び腫瘍におけるＩＬＣ転移性（Ａ９＋ベクター）、原発性（ＴＣ１）、及び遺伝的に補完された転移性（Ａ９＋ＩＬ−３３）、（Ａ９＋１ＦＩ４４）、（Ａ９＋ＭＲ１）腫瘍における、腫瘍浸潤リンパ球及び他の標的物（ＣＤ４、ＣＤＳ、ＭＨＣｌ、ＣＤ６８、Ｌｙ６Ｇ、Ｆｏｘｐ３）のための免疫組織化学染色。ＩＦＩ４４またはＩＬ−３３を含む免疫回避腫瘍の遺伝的相補性は、免疫認識に対する表現型のシフトを示す。ＭＲ１遺伝子を含むＡ９細胞の遺伝子操作は、転移性腫瘍の免疫認識に影響を及ぼさなかった。厚さ１０μｍの切片は、適切な抗体で染色し、２０倍の倍率で画像化した。固形組織からの切片上の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）のＩＨＣによる可視化は、陰性対照と比較した場合に、ＩＦＩ４４またはＩＬ−３３で処理した腫瘍内の、ＭＨＣ１９（ａ）、ＣＤＳ（ｂ）、及びＣＤ４（ｃ）の陽性細胞に対して増加した染色度を示した。ＣＴＬによる免疫認識の陽性変化は、免疫抑制細胞含有物（ｅ）とうまく一致した：悪性腫瘍の微環境は、耐性関連マーカー（ＦｏｘＰ３＋）の上方制御を特徴とするが、ＩＦＩ４４／ＩＬ−３３の変化は、免疫抑制細胞の拡大及び蓄積に影響を及ぼすように思われた。抗腫瘍炎症反応は、腫瘍組織を通じて、小食細胞（ｄ）及び好中球（ｆ）の浸潤を試験した後に分析された。腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は、転移性対照［Ａ９＋ベクター］と比較して、原発性［ＴＣ１＋ベクター］及びＩＦＩ４４またはＩＬ−３３がトランスフェクトされた腫瘍において、より高い浸潤レベルを有するすべての収集された腫瘍内に均等に分布していることが見出された。この領域内の腫瘍成長による組織損傷時に、局所的マクロファージ及び他の細胞は、損傷を感知し、腫瘍組織への好中球等の多数の多形核白血球の浸潤を刺激するサイトカイン及びケモカイン等の炎症性メディエータを生成する。脂肪組織の急性炎症は、原発性［ＴＣ１＋ベクター］及び遺伝的に補完された転移性腫瘍における好中球浸潤を特徴とした。したがって、炎症細胞及びメディエータは、原発性［ＴＣ１＋ベクター］及び［Ａ９＋ＩＦＩ４４］または［Ａ９＋ＩＬ−３３］腫瘍の微環境において上昇するが、転移性腫瘍［Ａ９＋ベクター］においては上昇せず、これは、プロスタグランジン及びロイコトリエンファミリー等の炎症関連遺伝子、ならびにインターロイキン（ＩＬ）関連遺伝子の著しい下方制御を示す、我々のマイクロアレイデータと一致している。転移性（Ａ９＋ベクター）、原発性（ＴＣ１）、及び遺伝的に補完された転移性（Ａ９＋ＩＬ−３３）、（Ａ９＋１ＦＩ４４）、（Ａ９＋ＭＲ１）腫瘍における、腫瘍浸潤リンパ球及び他の標的物（ＣＤ４、ＣＤＳ、ＭＨＣｌ、ＣＤ６８、Ｌｙ６Ｇ、Ｆｏｘｐ３）のための免疫組織化学染色。ＩＦＩ４４またはＩＬ−３３を含む免疫回避腫瘍の遺伝的相補性は、免疫認識に対する表現型のシフトを示す。ＭＲ１遺伝子を含むＡ９細胞の遺伝子操作は、転移性腫瘍の免疫認識に影響を及ぼさなかった。厚さ１０μｍの切片は、適切な抗体で染色し、２０倍の倍率で画像化した。固形組織からの切片上の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）のＩＨＣによる可視化は、陰性対照と比較した場合に、ＩＦＩ４４またはＩＬ−３３で処理した腫瘍内の、ＭＨＣ１９（ａ）、ＣＤＳ（ｂ）、及びＣＤ４（ｃ）の陽性細胞に対して増加した染色度を示した。ＣＴＬによる免疫認識の陽性変化は、免疫抑制細胞含有物（ｅ）とうまく一致した：悪性腫瘍の微環境は、耐性関連マーカー（ＦｏｘＰ３＋）の上方制御を特徴とするが、ＩＦＩ４４／ＩＬ−３３の変化は、免疫抑制細胞の拡大及び蓄積に影響を及ぼすように思われた。抗腫瘍炎症反応は、腫瘍組織を通じて、小食細胞（ｄ）及び好中球（ｆ）の浸潤を試験した後に分析された。腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は、転移性対照［Ａ９＋ベクター］と比較して、原発性［ＴＣ１＋ベクター］及びＩＦＩ４４またはＩＬ−３３がトランスフェクトされた腫瘍において、より高い浸潤レベルを有するすべての収集された腫瘍内に均等に分布していることが見出された。この領域内の腫瘍成長による組織損傷時に、局所的マクロファージ及び他の細胞は、損傷を感知し、腫瘍組織への好中球等の多数の多形核白血球の浸潤を刺激するサイトカイン及びケモカイン等の炎症性メディエータを生成する。脂肪組織の急性炎症は、原発性［ＴＣ１＋ベクター］及び遺伝的に補完された転移性腫瘍における好中球浸潤を特徴とした。したがって、炎症細胞及びメディエータは、原発性［ＴＣ１＋ベクター］及び［Ａ９＋ＩＦＩ４４］または［Ａ９＋ＩＬ−３３］腫瘍の微環境において上昇するが、転移性腫瘍［Ａ９＋ベクター］においては上昇せず、これは、プロスタグランジン及びロイコトリエンファミリー等の炎症関連遺伝子、ならびにインターロイキン（ＩＬ）関連遺伝子の著しい下方制御を示す、我々のマイクロアレイデータと一致している。転移性（Ａ９＋ベクター）、原発性（ＴＣ１）、及び遺伝的に補完された転移性（Ａ９＋ＩＬ−３３）、（Ａ９＋１ＦＩ４４）、（Ａ９＋ＭＲ１）腫瘍における、腫瘍浸潤リンパ球及び他の標的物（ＣＤ４、ＣＤＳ、ＭＨＣｌ、ＣＤ６８、Ｌｙ６Ｇ、Ｆｏｘｐ３）のための免疫組織化学染色。ＩＦＩ４４またはＩＬ−３３を含む免疫回避腫瘍の遺伝的相補性は、免疫認識に対する表現型のシフトを示す。ＭＲ１遺伝子を含むＡ９細胞の遺伝子操作は、転移性腫瘍の免疫認識に影響を及ぼさなかった。厚さ１０μｍの切片は、適切な抗体で染色し、２０倍の倍率で画像化した。固形組織からの切片上の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）のＩＨＣによる可視化は、陰性対照と比較した場合に、ＩＦＩ４４またはＩＬ−３３で処理した腫瘍内の、ＭＨＣ１９（ａ）、ＣＤＳ（ｂ）、及びＣＤ４（ｃ）の陽性細胞に対して増加した染色度を示した。ＣＴＬによる免疫認識の陽性変化は、免疫抑制細胞含有物（ｅ）とうまく一致した：悪性腫瘍の微環境は、耐性関連マーカー（ＦｏｘＰ３＋）の上方制御を特徴とするが、ＩＦＩ４４／ＩＬ−３３の変化は、免疫抑制細胞の拡大及び蓄積に影響を及ぼすように思われた。抗腫瘍炎症反応は、腫瘍組織を通じて、小食細胞（ｄ）及び好中球（ｆ）の浸潤を試験した後に分析された。腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は、転移性対照［Ａ９＋ベクター］と比較して、原発性［ＴＣ１＋ベクター］及びＩＦＩ４４またはＩＬ−３３がトランスフェクトされた腫瘍において、より高い浸潤レベルを有するすべての収集された腫瘍内に均等に分布していることが見出された。この領域内の腫瘍成長による組織損傷時に、局所的マクロファージ及び他の細胞は、損傷を感知し、腫瘍組織への好中球等の多数の多形核白血球の浸潤を刺激するサイトカイン及びケモカイン等の炎症性メディエータを生成する。脂肪組織の急性炎症は、原発性［ＴＣ１＋ベクター］及び遺伝的に補完された転移性腫瘍における好中球浸潤を特徴とした。したがって、炎症細胞及びメディエータは、原発性［ＴＣ１＋ベクター］及び［Ａ９＋ＩＦＩ４４］または［Ａ９＋ＩＬ−３３］腫瘍の微環境において上昇するが、転移性腫瘍［Ａ９＋ベクター］においては上昇せず、これは、プロスタグランジン及びロイコトリエンファミリー等の炎症関連遺伝子、ならびにインターロイキン（ＩＬ）関連遺伝子の著しい下方制御を示す、我々のマイクロアレイデータと一致している。転移性（Ａ９＋ベクター）、原発性（ＴＣ１）、及び遺伝的に補完された転移性（Ａ９＋ＩＬ−３３）、（Ａ９＋１ＦＩ４４）、（Ａ９＋ＭＲ１）腫瘍における、腫瘍浸潤リンパ球及び他の標的物（ＣＤ４、ＣＤＳ、ＭＨＣｌ、ＣＤ６８、Ｌｙ６Ｇ、Ｆｏｘｐ３）のための免疫組織化学染色。ＩＦＩ４４またはＩＬ−３３を含む免疫回避腫瘍の遺伝的相補性は、免疫認識に対する表現型のシフトを示す。ＭＲ１遺伝子を含むＡ９細胞の遺伝子操作は、転移性腫瘍の免疫認識に影響を及ぼさなかった。厚さ１０μｍの切片は、適切な抗体で染色し、２０倍の倍率で画像化した。固形組織からの切片上の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）のＩＨＣによる可視化は、陰性対照と比較した場合に、ＩＦＩ４４またはＩＬ−３３で処理した腫瘍内の、ＭＨＣ１９（ａ）、ＣＤＳ（ｂ）、及びＣＤ４（ｃ）の陽性細胞に対して増加した染色度を示した。ＣＴＬによる免疫認識の陽性変化は、免疫抑制細胞含有物（ｅ）とうまく一致した：悪性腫瘍の微環境は、耐性関連マーカー（ＦｏｘＰ３＋）の上方制御を特徴とするが、ＩＦＩ４４／ＩＬ−３３の変化は、免疫抑制細胞の拡大及び蓄積に影響を及ぼすように思われた。抗腫瘍炎症反応は、腫瘍組織を通じて、小食細胞（ｄ）及び好中球（ｆ）の浸潤を試験した後に分析された。腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は、転移性対照［Ａ９＋ベクター］と比較して、原発性［ＴＣ１＋ベクター］及びＩＦＩ４４またはＩＬ−３３がトランスフェクトされた腫瘍において、より高い浸潤レベルを有するすべての収集された腫瘍内に均等に分布していることが見出された。この領域内の腫瘍成長による組織損傷時に、局所的マクロファージ及び他の細胞は、損傷を感知し、腫瘍組織への好中球等の多数の多形核白血球の浸潤を刺激するサイトカイン及びケモカイン等の炎症性メディエータを生成する。脂肪組織の急性炎症は、原発性［ＴＣ１＋ベクター］及び遺伝的に補完された転移性腫瘍における好中球浸潤を特徴とした。したがって、炎症細胞及びメディエータは、原発性［ＴＣ１＋ベクター］及び［Ａ９＋ＩＦＩ４４］または［Ａ９＋ＩＬ−３３］腫瘍の微環境において上昇するが、転移性腫瘍［Ａ９＋ベクター］においては上昇せず、これは、プロスタグランジン及びロイコトリエンファミリー等の炎症関連遺伝子、ならびにインターロイキン（ＩＬ）関連遺伝子の著しい下方制御を示す、我々のマイクロアレイデータと一致している。転移性（Ａ９＋ベクター）、原発性（ＴＣ１）、及び遺伝的に補完された転移性（Ａ９＋ＩＬ−３３）、（Ａ９＋１ＦＩ４４）、（Ａ９＋ＭＲ１）腫瘍における、腫瘍浸潤リンパ球及び他の標的物（ＣＤ４、ＣＤＳ、ＭＨＣｌ、ＣＤ６８、Ｌｙ６Ｇ、Ｆｏｘｐ３）のための免疫組織化学染色。ＩＦＩ４４またはＩＬ−３３を含む免疫回避腫瘍の遺伝的相補性は、免疫認識に対する表現型のシフトを示す。ＭＲ１遺伝子を含むＡ９細胞の遺伝子操作は、転移性腫瘍の免疫認識に影響を及ぼさなかった。厚さ１０μｍの切片は、適切な抗体で染色し、２０倍の倍率で画像化した。固形組織からの切片上の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）のＩＨＣによる可視化は、陰性対照と比較した場合に、ＩＦＩ４４またはＩＬ−３３で処理した腫瘍内の、ＭＨＣ１９（ａ）、ＣＤＳ（ｂ）、及びＣＤ４（ｃ）の陽性細胞に対して増加した染色度を示した。ＣＴＬによる免疫認識の陽性変化は、免疫抑制細胞含有物（ｅ）とうまく一致した：悪性腫瘍の微環境は、耐性関連マーカー（ＦｏｘＰ３＋）の上方制御を特徴とするが、ＩＦＩ４４／ＩＬ−３３の変化は、免疫抑制細胞の拡大及び蓄積に影響を及ぼすように思われた。抗腫瘍炎症反応は、腫瘍組織を通じて、小食細胞（ｄ）及び好中球（ｆ）の浸潤を試験した後に分析された。腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は、転移性対照［Ａ９＋ベクター］と比較して、原発性［ＴＣ１＋ベクター］及びＩＦＩ４４またはＩＬ−３３がトランスフェクトされた腫瘍において、より高い浸潤レベルを有するすべての収集された腫瘍内に均等に分布していることが見出された。この領域内の腫瘍成長による組織損傷時に、局所的マクロファージ及び他の細胞は、損傷を感知し、腫瘍組織への好中球等の多数の多形核白血球の浸潤を刺激するサイトカイン及びケモカイン等の炎症性メディエータを生成する。脂肪組織の急性炎症は、原発性［ＴＣ１＋ベクター］及び遺伝的に補完された転移性腫瘍における好中球浸潤を特徴とした。したがって、炎症細胞及びメディエータは、原発性［ＴＣ１＋ベクター］及び［Ａ９＋ＩＦＩ４４］または［Ａ９＋ＩＬ−３３］腫瘍の微環境において上昇するが、転移性腫瘍［Ａ９＋ベクター］においては上昇せず、これは、プロスタグランジン及びロイコトリエンファミリー等の炎症関連遺伝子、ならびにインターロイキン（ＩＬ）関連遺伝子の著しい下方制御を示す、我々のマイクロアレイデータと一致している。転移性（Ａ９＋ベクター）、原発性（ＴＣ１）、及び遺伝的に補完された転移性（Ａ９＋ＩＬ−３３）、（Ａ９＋１ＦＩ４４）、（Ａ９＋ＭＲ１）腫瘍における、腫瘍浸潤リンパ球及び他の標的物（ＣＤ４、ＣＤＳ、ＭＨＣｌ、ＣＤ６８、Ｌｙ６Ｇ、Ｆｏｘｐ３）のための免疫組織化学染色。ＩＦＩ４４またはＩＬ−３３を含む免疫回避腫瘍の遺伝的相補性は、免疫認識に対する表現型のシフトを示す。ＭＲ１遺伝子を含むＡ９細胞の遺伝子操作は、転移性腫瘍の免疫認識に影響を及ぼさなかった。厚さ１０μｍの切片は、適切な抗体で染色し、２０倍の倍率で画像化した。固形組織からの切片上の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）のＩＨＣによる可視化は、陰性対照と比較した場合に、ＩＦＩ４４またはＩＬ−３３で処理した腫瘍内の、ＭＨＣ１９（ａ）、ＣＤＳ（ｂ）、及びＣＤ４（ｃ）の陽性細胞に対して増加した染色度を示した。ＣＴＬによる免疫認識の陽性変化は、免疫抑制細胞含有物（ｅ）とうまく一致した：悪性腫瘍の微環境は、耐性関連マーカー（ＦｏｘＰ３＋）の上方制御を特徴とするが、ＩＦＩ４４／ＩＬ−３３の変化は、免疫抑制細胞の拡大及び蓄積に影響を及ぼすように思われた。抗腫瘍炎症反応は、腫瘍組織を通じて、小食細胞（ｄ）及び好中球（ｆ）の浸潤を試験した後に分析された。腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は、転移性対照［Ａ９＋ベクター］と比較して、原発性［ＴＣ１＋ベクター］及びＩＦＩ４４またはＩＬ−３３がトランスフェクトされた腫瘍において、より高い浸潤レベルを有するすべての収集された腫瘍内に均等に分布していることが見出された。この領域内の腫瘍成長による組織損傷時に、局所的マクロファージ及び他の細胞は、損傷を感知し、腫瘍組織への好中球等の多数の多形核白血球の浸潤を刺激するサイトカイン及びケモカイン等の炎症性メディエータを生成する。脂肪組織の急性炎症は、原発性［ＴＣ１＋ベクター］及び遺伝的に補完された転移性腫瘍における好中球浸潤を特徴とした。したがって、炎症細胞及びメディエータは、原発性［ＴＣ１＋ベクター］及び［Ａ９＋ＩＦＩ４４］または［Ａ９＋ＩＬ−３３］腫瘍の微環境において上昇するが、転移性腫瘍［Ａ９＋ベクター］においては上昇せず、これは、プロスタグランジン及びロイコトリエンファミリー等の炎症関連遺伝子、ならびにインターロイキン（ＩＬ）関連遺伝子の著しい下方制御を示す、我々のマイクロアレイデータと一致している。減少したＩＬ−３３の発現は、前立腺及び腎臓の腎細胞の癌の進行と関連している。（ａ）良性前立腺組織ならびに低及び高リスクの原発性腫瘍と比較した、ＣＲＰＣにおけるＩＬ−３３のｍＲＮＡ。減少したＩＬ−３３の発現は、前立腺及び腎臓の腎細胞の癌の進行と関連している。（ｂ）異なるグリソングレードの前立腺腫瘍の組織マイクロアレイにおけるＩＬ−３３の発現を示す代表的な免疫組織化学染色（左パネル）。厚さ５μｍの切片は、染色し、２０倍の倍率で画像化した。右パネルは、著しく短期間で、ＰＳＡの再発を有する、前立腺全摘出術で原発性腫瘍の低いＩＬ−３３の発現の関連性を示す。減少したＩＬ−３３の発現は、前立腺及び腎臓の腎細胞の癌の進行と関連している。（ｃ）原発性及び転移性前立腺腫瘍におけるＩＬ−３３ｍＲＮＡの発現は、この独立した１３１の前立腺腫瘍のコホートにおいて、低いＩＬ−３３の発現（−２未満の正常な良性と比較したｚ−スコア）とＰＳＡ再発までの時間との関連性を確認する。減少したＩＬ−３３の発現は、前立腺及び腎臓の腎細胞の癌の進行と関連している。（ｄ）低いＩＬ−３３の発現（−１未満の正常な良性と比較したｚ−スコア）と腎臓の腎細胞癌患者の生存との関連性を確認する。ＩＬ−３３は、ＭＨＣ−Ｉ欠失Ａ９癌細胞におけるＴＡＰ−１及びＨ２−Ｋ１の発現／シグナル伝達、ならびに腫瘍の免疫認識を復元する。（ａ）ＩＬ−３３遺伝子によるＡ９細胞の一過性トランスフェクションは、ＲＴ−ＰＣＲによって検出されるような、ＴＡＰ−１の遺伝子発現を復元する。ＴＣ１は、ＩＬ−３３及びＴＡＰ−１の両方の発現のための陽性対照として使用したが、トランスフェクションされなかったＡ９及びＡ９＋空ベクターは、陰性対照として使用した。β−アクチンは、負荷対照として使用した。ＩＬ−３３は、ＭＨＣ−Ｉ欠失Ａ９癌細胞におけるＴＡＰ−１及びＨ２−Ｋ１の発現／シグナル伝達、ならびに腫瘍の免疫認識を復元する。（ｂ）ＩＬ−３３遺伝子によるＡ９の一過性トランスフェクションは、ＴＡＰ−１及びＨ２−Ｋ１のタンパク質発現を復元する。レーン１＝Ａ９細胞、レーン２＝Ａ９＋空ベクター、レーン３＝Ａ９＋ＩＬ−３３、レーン４＝Ａ９＋ＩＬ−３３サイトカイン（５０ｎｇ／ｍｌ）、レーン５＝Ａ９＋ＩＦＮ−ｇサイトカイン（５０ｎｇ／ｍｌ）、レーン６＝ＴＣ１＋ＩＬ−３３。ＩＬ−３３は、ＭＨＣ−Ｉ欠失Ａ９癌細胞におけるＴＡＰ−１及びＨ２−Ｋ１の発現／シグナル伝達、ならびに腫瘍の免疫認識を復元する。（ｃ）ＩＬ−３３により誘導された変化は、Ａ９細胞においてＨ２−Ｋ１の表面発現を増加した：単独でｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰベクターで導入されたＡ９（青色）；ＩＬ−３３で処理されたＡ９（緑色）；陰性対照−トランスフェクションされなかったＡ９（灰色）；陽性対照−ＩＦＮ−ガンマ（ＩＦＮ−γ）で処理されたＡ９（赤色）。ＩＬ−３３は、ＭＨＣ−Ｉ欠失Ａ９癌細胞におけるＴＡＰ−１及びＨ２−Ｋ１の発現／シグナル伝達、ならびに腫瘍の免疫認識を復元する。（ｄ）ＩＬ−３３遺伝子の発現または外因性ＩＬ−３３サイトカインタンパク質の添加は、腫瘍細胞の表面上にあるＯＶＡのＢ３ＺＴ細胞によって抗原特異的な認識を増強した。ＩＦＮ−γは、陽性対照として使用した。ＩＬ−３３遺伝子相補作用は、インビボでの腫瘍成長速度を抑制し、マウスモデルにおける腫瘍細胞の転移拡散を抑制する。（ａ）Ａ９細胞へのＩＬ−３３遺伝子の安定したトランスフェクションは、マウスにおいて著しく抑制された腫瘍形成をもたらした。ＧＦＰ陽性循環腫瘍細胞は、初期皮下移植から遠位である副腎から単離され、フローサイトメトリーを用いて評価された。ＩＬ−３３遺伝子相補作用は、インビボでの腫瘍成長速度を抑制し、マウスモデルにおける腫瘍細胞の転移拡散を抑制する。（ｂ）Ａ９細胞が注入された動物（左）；ＩＬ−３３を発現した転移性細胞が注入された動物（中央）；原発性腫瘍を持つ動物（右）。ＩＬ−３３遺伝子相補作用は、インビボでの腫瘍成長速度を抑制し、マウスモデルにおける腫瘍細胞の転移拡散を抑制する。（ｃ）副腎は、フローサイトメトリーゲートにおいて重複する自己蛍光細胞を示さない腫瘍のない野生型動物から単離された。ＩＬ−３３遺伝子相補作用は、インビボでの腫瘍成長速度を抑制し、マウスモデルにおける腫瘍細胞の転移拡散を抑制する。（ｄ）全細胞の割合として、（ｂ）中のＧＦＰ陽性循環腫瘍細胞の定量化。各グラフは、ある代表的な動物からのデータに対応する。＊Ｐ＜０．０５、原発性（ＴＣ１）及び転移性（Ａ９）を持つ動物から単離されたＧＦＰ陽性ＣＴＣ細胞を比較する（スチューデントｔ検定）。腫瘍の免疫組織化学的染色。上パネル：転移性Ａ９、原発性ＴＣ１、及びＩＬ−３３が遺伝的に補完された転移性腫瘍における、腫瘍浸潤リンパ球及び他の標的物（ＣＤ４、ＣＤ８、ＭＨＣ−Ｉ、ＣＤ６８、Ｌｙ−６Ｇ、ＦｏｘＰ３）。免疫回避腫瘍の遺伝的相補性は、免疫認識に対する明らかな表現型のシフトを示す。厚さ１０μｍの切片は、適切な抗体で染色し、２０倍の倍率で画像化した。下パネル：腫瘍組織への好酸球動員は、ＩＬ−３３の発現（マウス）によって誘導させる。（ａ）好酸球は、転移性（Ａ９）腫瘍と正常組織との間の境界に位置している。（ｂ）ＩＬ−３３によって誘導された変化は、ＩＬ−３３を発現する腫瘍組織への好酸球の浸潤を可能にする。厚さ１０μｍの腫瘍切片は、ギムザで染色し、１０倍の倍率で画像化した。ＩＬＣ２の頻度は、ＩＬ−３３遺伝子で安定にトランスフェクトされた原発性腫瘍及び転移性腫瘍を持つ動物において上昇した。非凝集性リンパ節及び腫瘍組織から単離された自然リンパ球を、Ｌｉｎ−ＳＴ２＋ＣＤ１２７＋ＣＤ９０．２＋細胞としてフローサイトメトリーによって分析した。ゲート戦略は、初めに、系統陰性（Ｌｉｎ−）及び（ＣＤ９０．２）陽性白血球においてゲート化することと、ＳＴ２＋及びＣＤ１２７＋の発現のためにさらに分析すること、を含んだ。（ａ）ゲート化、及び（ｂ）リンパ節から単離されたＩＬＣ２の定量化。これらの範囲は、各処理群における８匹の異なる動物を比較するデータを表す。ＩＬＣ２の頻度は、ＩＬ−３３遺伝子で安定にトランスフェクトされた原発性腫瘍及び転移性腫瘍を持つ動物において上昇した。非凝集性リンパ節及び腫瘍組織から単離された自然リンパ球を、Ｌｉｎ−ＳＴ２＋ＣＤ１２７＋ＣＤ９０．２＋細胞としてフローサイトメトリーによって分析した。ゲート戦略は、初めに、系統陰性（Ｌｉｎ−）及び（ＣＤ９０．２）陽性白血球においてゲート化することと、ＳＴ２＋及びＣＤ１２７＋の発現のためにさらに分析すること、を含んだ。（ａ）ゲート化、及び（ｂ）リンパ節から単離されたＩＬＣ２の定量化。これらの範囲は、各処理群における８匹の異なる動物を比較するデータを表す。ＩＬＣ２の頻度は、ＩＬ−３３遺伝子で安定にトランスフェクトされた原発性腫瘍及び転移性腫瘍を持つ動物において上昇した。非凝集性リンパ節及び腫瘍組織から単離された自然リンパ球を、Ｌｉｎ−ＳＴ２＋ＣＤ１２７＋ＣＤ９０．２＋細胞としてフローサイトメトリーによって分析した。ゲート戦略は、初めに、系統陰性（Ｌｉｎ−）及び（ＣＤ９０．２）陽性白血球においてゲート化することと、ＳＴ２＋及びＣＤ１２７＋の発現のためにさらに分析すること、を含んだ。（ｃ）ゲート化、及び（ｄ）腫瘍から単離されたＩＬＣの定量化。これらの範囲は、各処理群における４匹の異なる動物を比較するデータを表す；＊Ｐ＜０．０５は、原発性及び転移性腫瘍から単離されたＩＬＣ２細胞を比較した（スチューデントｔ検定）。ＩＬＣ２の頻度は、ＩＬ−３３遺伝子で安定にトランスフェクトされた原発性腫瘍及び転移性腫瘍を持つ動物において上昇した。非凝集性リンパ節及び腫瘍組織から単離された自然リンパ球を、Ｌｉｎ−ＳＴ２＋ＣＤ１２７＋ＣＤ９０．２＋細胞としてフローサイトメトリーによって分析した。ゲート戦略は、初めに、系統陰性（Ｌｉｎ−）及び（ＣＤ９０．２）陽性白血球においてゲート化することと、ＳＴ２＋及びＣＤ１２７＋の発現のためにさらに分析すること、を含んだ。（ｃ）ゲート化、及び（ｄ）腫瘍から単離されたＩＬＣの定量化。これらの範囲は、各処理群における４匹の異なる動物を比較するデータを表す；＊Ｐ＜０．０５は、原発性及び転移性腫瘍から単離されたＩＬＣ２細胞を比較した（スチューデントｔ検定）。ＩＬ−３３は、腫瘍の進行を修正し、ＩＬＣ２がＲＯＲα−ＩＬ−３３−ＩＬＣ２軸を通して癌免疫学的監視に関与するという結論を支援することができる。マウスに、ＲＯＲα−／−または野生型骨髄を移植し、骨髄の再増殖が成功した後に、ＩＬ−３３の発現を有する及びその発現を有しない転移性腫瘍を、これらのキメラマウスに注入した。（ａ）Ａ９細胞へのＩＬ−３３遺伝子の安定したトランスフェクションは、ＲＯＲα−／−キメラと比較した場合に、野生型マウスにおいて著しく抑制された腫瘍形成をもたらした。ＩＬ−３３は、腫瘍の進行を修正し、ＩＬＣ２がＲＯＲα−ＩＬ−３３−ＩＬＣ２軸を通して癌免疫学的監視に関与するという結論を支援することができる。マウスに、ＲＯＲα−／−または野生型骨髄を移植し、骨髄の再増殖が成功した後に、ＩＬ−３３の発現を有する及びその発現を有しない転移性腫瘍を、これらのキメラマウスに注入した。（ｂ）隣接したリンパ節に見出されるＩＬＣ２細胞の数は、野生型キメラと比較して、ＲＯＲα−／−マウスにおいて著しく低かった。ＩＬ−３３は、腫瘍の進行を修正し、ＩＬＣ２がＲＯＲα−ＩＬ−３３−ＩＬＣ２軸を通して癌免疫学的監視に関与するという結論を支援することができる。マウスに、ＲＯＲα−／−または野生型骨髄を移植し、骨髄の再増殖が成功した後に、ＩＬ−３３の発現を有する及びその発現を有しない転移性腫瘍を、これらのキメラマウスに注入した。（ｃ）ＲＯＲα欠失は、ＣＤ４／ＣＤ８リンパ球の比率において効果がなかった。ＩＬ−３３−ＩＬＣ２軸は、腫瘍の発達中に、共に適応及び自然免疫反応を結び付ける。ＩＬ−３３を発現する腫瘍環境は、ＩＬＣ２細胞の発生を刺激し、それらを、ＳＴ２受容体経路を通して機能的に活性化する。機能的に活性なＩＬＣ２は、ＭＨＣＩＩ分子を介して直接抗原提示と一緒に、ＩＬ−４及びＩＬ−１３の分泌を通して２型エフェクター経路を誘発する。ＩＬＣ２及びその後の好酸球の動員によってＩＬ−５の放出を通して、腫瘍微環境のケモカインプロファイルは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を引き付け、ＣＴＬ媒介性の死滅及び癌の拒絶の活性化を導くように変化させる。ＩＬ−３３及び様々な抗原提示タンパク質遺伝子の発現は、マウス転移性肺及び前立腺癌において下方制御された。転移性肺癌（Ａ９）の遺伝子発現は、原発性の非転移性腫瘍（ＴＣ１）と比較された。転移性前立腺癌（ＬＭＤ）の遺伝子発現は、原発性の非転移性腫瘍（ＰＡ）と比較された。マイクロアレイデータは、ヒトＡｇｉｌｅｎｔチップ及びＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇＧＸソフトウェアを用いて得られた。ＩＬ−３３＝インターロイキン３３；Ｈ２−Ｋ１＝主要組織適合性複合体クラスＩ；ＴＡＰ−１＝抗原処理と関連する輸送体１；ＴＡＰ−２＝抗原処理と関連する輸送体２；Ｔａｐａｓｉｎ＝ＴＡＰ関連糖タンパク質；Ｐｓｍｂ８＝プロテアソームサブユニットベータタイプ８。ＩＬ−３３遺伝子一過性トランスフェクションは、Ａ９細胞によるＩＬ−３３−タンパク質の分泌（ＥＬＩＳＡ）、及び全細胞内ＩＬ−３３タンパク質レベル（ウェスタンブロット）を上方制御した。ＩＬ−３３のための完全長ｃＤＮＡによる遺伝子発現構築物は、ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰベクター内に生成されている。ＩＬ−３３遺伝子は、ＭＨＣ−Ｉ欠失の表現型を有し、免疫回避である、マウス肺癌細胞株Ａ９に導入された。ＩＬ−３３タンパク質の分泌は、ＥＬＩＳＡによって測定され、全細胞内ＩＬ−３３タンパク質レベルは、それぞれ、様々な時点：２４時間、４８時間、７２時間でウェスタンブロットによって測定された。ＴＣ１＝原発性腫瘍細胞；Ａ９＝転移性腫瘍細胞；Ａ９＋ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰベクター＝ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰでトランスフェクションされた転移性腫瘍細胞；Ａ９＋ＩＬ−３３＝ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰベクター＋ＩＬ−３３遺伝子でトランスフェクションされた転移性腫瘍細胞。特定の細胞傷害性Ｔ細胞エフェクター機構におけるＩＬＣ２の影響。ＩＬＣ２を含む（右パネル）またはＩＬＣ２細胞を含まない（左パネル）マウス前立腺癌細胞（ＬＭＤ）及びＣＤ８Ｔ細胞の同時培養：（ａ）ＩＬＣ２細胞による活性化の前（左）及び後（右）のＬＭＤ細胞中のＴＡＰ−１発現レベル：（ｂ）ＩＬＣ２細胞による活性化の前（左）及び後（右）のＣＴＬ細胞によるグランザイムｂの発現。ＩＬ−３３遺伝子の下方制御は、原発性肺腫瘍細胞中のＨ２−Ｋ１タンパク質発現を減少した。ＴＣ１原発性腫瘍細胞は、ＩＬ−３３に対して標的にされるｓｉＲＮＡで、４８または７２時間処理した。（ａ、上）ＥＬＩＳＡアッセイは、上清中の分泌されたＩＬ−３３のレベルを測定するために使用された）。（ａ、下）ウェスタンブロット分析は、細胞ペレット中のＩＬ−３３タンパク質のレベルを測定するために使用された。（ｂ）ＦＡＣＳは、腫瘍細胞の表面上にＨ２−Ｋ１の発現を測定するために使用された。ＴＣ１細胞は、ＩＬ−３３に対してｓｉＲＮＡで７２時間処理し、Ｈ２−Ｋ１の細胞表面発現は、フローサイトメトリーによって評価した。Ｈ２−Ｋ１の下方制御は、マウス原発性肺腫瘍細胞中のＩＬ−３３遺伝子発現を減少した。ＴＣ１原発性腫瘍細胞を、マウスＭＨＣ−Ｉ（Ｈ２−Ｋ１）に対して特異的に標的化された２つの異なるｓｉＲＮＡで９６時間処理し、その後、ｃＤＮＡを単離した。（ａ）ＭＨＣ−Ｉ表面発現は、抗Ｈ２−Ｋ１ｓｉＲＮＡ処理（ＦＡＣＳ）に応答して、ＴＣ１細胞において下方制御した。Ｈ２−Ｋ１の下方制御は、マウス原発性肺腫瘍細胞中のＩＬ−３３遺伝子発現を減少した。ＴＣ１原発性腫瘍細胞を、マウスＭＨＣ−Ｉ（Ｈ２−Ｋ１）に対して特異的に標的化された２つの異なるｓｉＲＮＡで９６時間処理し、その後、ｃＤＮＡを単離した。（ｂ）Ｈ２−Ｋ１に対するプライマーは、Ｈ２−Ｋ１遺伝子の結果として得られる転写レベルを試験するために使用した（ＲＴ−ＰＣＲ）：レーン１＝分子量制御、（ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ１ｋｂＤＮＡｌａｄｄｅｒ，ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；レーン２＝Ｈ２−Ｋ１に対してｓｉＲＮＡで処理されるＴＣ１細胞；レーン３＝未処理のＴＣ１細胞；β−アクチンは、負荷制御として使用した。Ｈ２−Ｋ１の下方制御は、マウス原発性肺腫瘍細胞中のＩＬ−３３遺伝子発現を減少した。ＴＣ１原発性腫瘍細胞を、マウスＭＨＣ−Ｉ（Ｈ２−Ｋ１）に対して特異的に標的化された２つの異なるｓｉＲＮＡで９６時間処理し、その後、ｃＤＮＡを単離した。（ｃ）次いで、ＩＬ−３３に対するプライマーは、ＩＬ−３３遺伝子の結果として得られる転写レベルを試験するために使用した（ＲＴ−ＰＣＲ）：レーン１、２＝Ｈ２−Ｋ１に対してｓｉＲＮＡで処理されるＴＣ１細胞；レーン３＝未処理のＴＣ１細胞；レーン４、５＝非特異的ｓｉＲＮＡで処理されるＴＣ１細胞；β−アクチンは、負荷制御として使用した。ＩＬ−３３遺伝子は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の数の増加を促した。フローサイトメトリーは、切除された腫瘍から単離されたＴＩＬを数えないように使用し、これは、腫瘍における全細胞の割合として、ここで示されている。さらに、ＴＩＬは、Ａ９＋ＩＬ−３３及び原発性腫瘍ＴＣ１の両方を含む、ＩＬ−３３を発現した腫瘍に存在することが見出された。ＩＬ−３３によって媒介される変化は、腫瘍細胞の増殖を減少させたが、アポトーシスにおける効果がなかった。（ａ）Ａ９転移性腫瘍（上）の末梢に沿って強力な増殖は、ＩＬ−３３によって遺伝的に補完された転移性腫瘍（下）においてインビボで著しく低下する。（ｂ）ＩＬ−３３の発現は、細胞アポトーシスに影響を及ぼさない：Ａ９転移性腫瘍（上）；遺伝的に補完された腫瘍Ａ９＋ＩＬ−３３（下）。腫瘍の厚さ１０μｍの切片は、抗Ｋｉ−６７（Ａ）及び抗カスパーゼ３（Ｂ）抗体で染色し、１０倍の倍率で画像化した。自然免疫反応へのＧＡＴＡ３／ＲＯＲαの関与。ＩＬＣ２の発達及び機能は、微環境においてＩＬ−３３の存在に応じて異なる。原発性／転移性腫瘍細胞の比較的マイクロアレイプロファイリング（初期の監視されていないクラスタリング、２８００５Ｔｗｏ−ＣｏｌｏｕｒＡｇｉｌｅｎｔアレイ）。初期の監視されていないクラスタリングは、アレイ上のすべてのプローブを用いて行われた。これは、ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄｃｌｕｓｔｅｒ−ａｌｌｓａｍｐｌｅｓ−ＴＲＥＥ．ｐｎｇに示されている。遺伝子は、縦軸上にあり、個々のサンプルは、横軸上にある。左パネルは、サンプルのすべてを示し、アレイ上のプローブはすべて、一緒にクラスタ化された。右パネルは、左パネル中の領域の引き伸ばしである。右パネルは、下に沿ってサンプル識別子を示す場合に含まれる。クラスタリングは、平均連結規則に従って、ピアソンを中心とした距離メトリックを有する２方向の階層クラスタリングを用いて行われた。以下のように、極度の結論は、サンプルがそれらの組織部位に基づいて非常に異なる発現特徴を示すことである。２つの組織タイプ間に統計的に異なった遺伝子が、同定された。初めに、データをフィルタ処理して、いずれかのチャネルはその後の分析において有し得る、全くシグナルを示さない交絡効果プローブを除去した。強度分布の上位８０パーセンタイルであるプローブのみを、このフィルタ処理を通過することができた。最終的なセットは、４８７３１プローブを含んだ。Ｃｙ３緑色、Ｃｙ５赤色。次いで、各フルオロフォアの相対強度は、上方制御及び下方制御した遺伝子を同定するために、比率に基づいた分析において使用され得る。完全に相補鎖は、強力に、部分的に弱く結合する。サンプルは、それらの組織部位に基づいて非常に異なる発現特徴を示す。ＩＬ−３３遺伝子相補作用は、インビボでの腫瘍成長速度を抑制し、マウスモデルにおける腫瘍細胞の転移拡散を抑制する。（ａ）Ａ９細胞へのＩＬ−３３遺伝子の安定したトランスフェクションは、マウスにおいて著しく抑制された腫瘍形成をもたらした。ＧＦＰ陽性循環腫瘍細胞は、初期皮下移植から遠位である副腎から単離され、フローサイトメトリーを用いて評価された：（ｂ）Ａ９細胞が注入された動物（左）；ＩＬ−３３を発現した転移性細胞が注入された動物（中央）；原発性腫瘍を持つ動物（右）。（ｃ）副腎は、フローサイトメトリーゲートにおいて重複する自己蛍光細胞を示さない腫瘍のない野生型動物から単離された。（ｄ）全細胞の割合として、（ｂ）中のＧＦＰ陽性循環腫瘍細胞の定量化。各グラフは、ある代表的な動物からのデータに対応する。＊Ｐ＜０．０５、原発性（ＴＣ１）及び転移性（Ａ９）を持つ動物から単離されたＧＦＰ陽性ＣＴＣ細胞を比較する（スチューデントｔ検定）。免疫回避腫瘍の遺伝的相補性は、免疫認識に対する明らかな表現型のシフトを示す。（ａ）多病巣性の問題を克服するために、ＦＡＣＳ分析は、ＴＩＬを計数するために使用した。腫瘍によってＩＬ−３３の発現は、ＣＤ８陽性細胞の数の統計的に有意な増加が、転移性（Ａ９）に対して遺伝子操作された（Ａ９＋ＩＬ−３３）腫瘍に示され得る場合に、細胞傷害性Ｔ細胞応答に向かってＴＩＬを歪曲する（スチューデントｔ検定）、＊＊Ｐ＜０．００５。（ｂ〜ｊ）免疫組織化学的染色は、ＦＡＣＳ分析を支援するために使用した。より多くの数のＣＤ８陽性細胞が、遺伝子操作された（Ａ９＋ＩＬ−３３）腫瘍（ｂ、ｄ）対遺伝子操作されない（Ａ９）腫瘍（ｃ）内に見られ得る。ＩＬ−３３の発現は、遺伝子操作されないＡ９（ｅ）対Ａ９＋ＩＬ−３３（ｆ）の、腫瘍細胞表面上にＭＨＣ−Ｉの発現を増加し、それによって、抗原提示を増加する。より少ない制御性Ｔ細胞が、より低いＦｏｘＰ３の染色、Ａ９（ｇ）対Ａ９＋ＩＬ−３３（ｈ）によって示されるように、ＩＬ−３３を発現する腫瘍中に存在する。増加したマクロファージ反応は、遺伝子操作されないＡ９（ｉ）対Ａ９＋ＩＬ−３３（ｊ）の、ＩＬ−３３を発現する腫瘍において見られる。厚さ１０μｍの切片は、適切な抗体で染色し、５倍（ｂ）または２０倍（ｃ〜ｊ）に拡大して画像化した。減少したＩＬ−３３の発現は、前立腺及び腎臓の腎細胞の癌の進行と関連している。（ａ）去勢耐性前立腺癌（ＣＲＰＣ）におけるＩＬ−３３のｍＲＮＡの発現レベルは、良性前立腺組織ならびに低及び高リスクの原発性腫瘍と比較して低い。Ｄ’Ａｍｉｃｏリスク分類：低リスク＝１０以下の前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、６以下のグリソンスコア、及び臨床段階Ｔ１−２ａ；高リスク＝２０超のＰＳＡ、８以下のグリソンスコア、または臨床段階Ｔ２ｃ−３ａ。減少したＩＬ−３３の発現は、前立腺及び腎臓の腎細胞の癌の進行と関連している。（ｂ）異なるグリソングレード（グリソンパターンとしても知られている）の前立腺腫瘍の組織マイクロアレイにおけるＩＬ−３３の発現を示す代表的な免疫組織化学染色における（左パネル）。全体のグリソンスコア（３＋３）は、上の画像のために与えられ、下の画像のために（５＋５）が与えられた。厚さ５μｍの切片は、染色し、２０倍の倍率で画像化した。右パネルは、著しく短期間で、ＰＳＡの再発を有する、前立腺全摘出術で原発性腫瘍の低いＩＬ−３３の発現の関連性を示す。減少したＩＬ−３３の発現は、前立腺及び腎臓の腎細胞の癌の進行と関連している。（ｃ）１３１症例の原発性前立腺腫瘍及び３７症例の転移性前立腺腫瘍におけるＩＬ−３３ｍＲＮＡの発現は、この独立した１３１の原発性前立腺腫瘍のコホートにおいて、低いＩＬ−３３の発現（−２未満の正常な良性と比較したｚ−スコア）とＰＳＡ再発までの時間との関連性を確認する。減少したＩＬ−３３の発現は、前立腺及び腎臓の腎細胞の癌の進行と関連している。（ｄ）低いＩＬ−３３の発現（−１未満の正常な良性と比較したｚ−スコア）と腎臓の腎細胞癌患者の生存との関連性を確認する。ＩＬＣ２の頻度は、ＩＬ−３３を発現する腫瘍を持つ動物において上昇する。ＩＬ−３３−ＩＬＣ２軸は、腫瘍の発達中に、共に適応及び自然免疫反応を結び付ける。ＩＬ−３３を発現する腫瘍環境は、ＩＬＣ２細胞の発生を刺激し、それらを、ＳＴ２受容体経路を通して機能的に活性化する。機能的に活性なＩＬＣ２は、ＭＨＣＩＩ分子を介して直接抗原提示と一緒に、ＩＬ−４及びＩＬ−１３の分泌を通して２型エフェクター経路を誘発する。ＩＬＣ２及びその後の好酸球の動員によってＩＬ−５の放出を通して、腫瘍微環境のケモカインプロファイルは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を引き付け、ＣＴＬ媒介性の死滅及び癌の拒絶の活性化を導くように変化させる。低いＩＬ−３３の内容物を有する転移性腫瘍では、ＩＬ−３３−ＩＬＣ２経路を停止する。肺から単離されたＩＬＣ２の養子移入後のマウスにおける原発性腫瘍の完全成長停止。免疫療法研究：ＩＬＣ２は、インビボで抗癌反応を促進し得る。活性化したＩＬＣ２の養子移入は、原発性（ＴＣ−１）腫瘍成長速度を抑制することができた：（青色）ＩＬＣ２の静脈内注入しない原発性腫瘍成長速度及びドナー肺から単離された静脈内注入後の原発性腫瘍の完全成長停止（緑色）。腫瘍体積は、皮下注入の初期部位で測定された。ＩＬＣ２の頻度は、ＩＬ−３３遺伝子で安定にトランスフェクトされた原発性腫瘍及び転移性腫瘍を持つ動物において上昇する。（ａ）腫瘍からのＩＬＣ２は、ＬｉｎＳＴ２＋ＣＤ１２７＋ＣＤ９０．２＋細胞としてＦＡＣＳによって分類された。ＩＬＣ２検出戦略は、初めに、腫瘍組織から単離されたＩＬＣ２の定量化後のＣＤ９０．２＋及びＣＤ１２７＋の発現のためにさらなる分析を用いて、系統陰性（Ｌｉｎ−）及び（ＳＴ２）陽性白血球においてゲート化すること、を含んだ。ＩＬＣ２の頻度は、ＩＬ−３３遺伝子で安定にトランスフェクトされた原発性腫瘍及び転移性腫瘍を持つ動物において上昇する。（ｂ）非凝集性リンパ節及び原発性腫瘍組織から単離されたＩＬＣ２は、完全に機能的であると思われ、ＩＬ−１３及びＩＬ−５を分泌する能力を保持した。ＩＬＣ２の頻度は、ＩＬ−３３遺伝子で安定にトランスフェクトされた原発性腫瘍及び転移性腫瘍を持つ動物において上昇する。（ｃ）腫瘍から単離され得るＩＬＣ２細胞の割合は、ＩＬ−３３を分泌する腫瘍細胞の能力に直接的な関係にと比較した。この差異は、原発性及び転移性腫瘍から単離されたＩＬＣ２細胞の数の間で統計的に有意であった（＊Ｐスチューデントｔ検定）。これらの範囲は、リンパ節（ｎ＝８匹の動物）及び腫瘍（ｎ＝４匹の動物）である、各処理群内の動物からのデータを表す。ＩＬ−３３は、腫瘍の進行を修正し、ＩＬＣ２がＲＯＲα−ＩＬ−３３−ＩＬＣ２軸を通して癌免疫学的監視に関与するという結論を支援することができる。マウスに、ＲＯＲα−／−または野生型骨髄を移植し、成功した骨髄の再増殖後に、ＩＬ−３３の発現を有する及びその発現を有しない転移性腫瘍を、これらのキメラマウスに注入した。（ａ）Ａ９細胞へのＩＬ−３３遺伝子の安定したトランスフェクションは、ＲＯＲα−／−キメラと比較した場合に、野生型マウスにおいて著しく抑制された腫瘍形成をもたらした。（ｂ）隣接したリンパ節に見出されるＩＬＣ２細胞の数は、野生型キメラと比較して、ＲＯＲα−／−マウスにおいて著しく低かった。（ｃ）ＲＯＲα欠失は、Ａ９＋ＩＬ−３３腫瘍に応じて、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋リンパ球の比率において効果がなかった。ＲＯＲαは、疾患の転移性拡散に影響を及ぼす、重要な転写調節因子である。（ａ）循環腫瘍細胞集団は、局所的増殖の可能性がある腫瘍を持つＲＯＲα−／−キメラ動物の副腎において検出された。（ｂ）隣接したリンパ節に見出されるＩＬＣ２細胞の数は、野生型キメラと比較して、ＲＯＲα−／−マウスにおいて著しく低かった。（ｃ）ＲＯＲα欠失は、Ａ９＋ＩＬ−３３腫瘍に応じて、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋リンパ球の比率において効果がなかった。特定の細胞傷害性Ｔ細胞エフェクター機構におけるＩＬＣ２の影響。ＩＬＣ２を含む（右パネル）またはＩＬＣ２細胞を含まない（左パネル）、転移性マウス前立腺ＴＡＰ−１低い癌細胞（ＬＭＤ）及びＣＤ８Ｔ細胞の同時培養：（ａ）ＩＬＣ２細胞による活性化の前（左）及び後（右）のＬＭＤ細胞中のＴＡＰ−１発現レベル；（ｂ）ＩＬＣ２細胞による活性化の前（左）及び後（右）のＣＴＬ細胞によるグランザイムｂの発現；（ｃ）腫瘍細胞のＣＴＬ媒介性の死滅。（ａ）養子移入のためにＩＬＣ２細胞を選択するためのゲート化戦略：ドナー肺及びドナー腫瘍からの単離（ＴＣ１腫瘍を持つマウス）。（ｂ）ドナー肺から単離されたＩＬＣ２の養子移入後のマウスにおける原発性腫瘍の完全成長停止。（ｃ）腫瘍組織への好酸球動員は、ＩＬＣ２によって誘導させる。ＩＬ−３３−ＩＬＣ２軸は、腫瘍の発達中に、共に適応及び自然免疫反応を結び付ける。ＩＬ−３３を発現する腫瘍環境は、ＩＬＣ２細胞の発生を刺激し、それらを、ＳＴ２受容体経路を通して機能的に活性化する。機能的に活性なＩＬＣ２は、自然及び適応免疫反応を誘発する腫瘍微環境を変化する。ＩＬＣ２は、ＩＬ−１３の産生を通して樹状細胞及びＭＨＣＩＩ分子を介して直接抗原提示を通してＴｈ２細胞を動員する。ＩＬＣ２及びその後の好酸球の動員によってＩＬ−５の放出を通して、腫瘍微環境のケモカインプロファイルは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を引き付け、ＣＴＬ媒介性の死滅及び癌の拒絶の活性化を導くように変化させる。低いＩＬ−３３の内容物を有する転移性腫瘍では、ＩＬ−３３−ＩＬＣ２経路を停止する。

本発明は、癌の進行におけるインターロイキン３３（ＩＬ−３３）、インターフェロン誘導性タンパク質４４（ＩＦＩ４４）、及び２型自然リンパ球細胞（ＩＬＣ２）の役割の発見に基づいている。具体的には、本発明は、ＩＬ−３３及びＩＦＩ４４が、良性または原発性腫瘍と比較して、転移性腫瘍において下方制御または突然変異され、かつ転移性腫瘍の成長及び転移性腫瘍細胞（ＣＴＣ）を循環する頻度は、腫瘍がＩＬ−３３またはＩＦＩ４４を発現するように遺伝子操作されている場合に、軽減するという発見に基づいている。本発明は、さらに、ＩＬＣ２がインビボで癌の免疫認識に役立ち、転移及び腫瘍成長速度を制限するという発見に基づいている。

したがって、本発明は、癌の進行を抑制し、かつ／または癌の治療を提供するための方法及び組成物を提供する。癌の進行の抑制及び／または癌の治療には、腫瘍成長の抑制、腫瘍退縮の刺激、腫瘍細胞の免疫認識の増大、または抗腫瘍免疫の刺激、原発性腫瘍の治療、腫瘍転移の予防、及び／または治療が含まれるが、これらに限定されない。また、ＭＨＣ−Ｉ及び／またはＴＡＰ−１の発現を増強することによって抗原提示を刺激する方法も、提供される。さらに、腫瘍浸潤免疫細胞（ＩＬＣ２細胞等のＴＩＬ）を増加させる方法が提供される。

当業者は、どのタイプの癌が治療され得るかを容易に判定することができる。癌は、固形腫瘍であり得る。ある特定の実施形態では、癌は、肉腫、癌腫、またはリンパ腫である。ある特定の実施形態では、癌は、乳癌、卵巣癌、肝臓癌、腎臓癌、黒色腫、結腸直腸癌、頭頸部扁平上皮細胞癌、子宮頸癌、または前立腺癌から選択される。ある特定の実施形態では、癌は、白血病または他の血液癌である。

ある特定の実施形態では、ＩＬ−３３及び／またはＩＦＩ４４の発現及び／または活性を増強させることによって、癌の進行の抑制及び／または癌の治療のための方法及び組成物が提供される。

ＩＬ−３３及び／またはＩＦＩ４４は、ポリペプチドとして、タンパク質を発現するポリヌクレオチドとして、ポリペプチドを発現するベクターまたは細胞として、提供され得る。ＩＬ−３３及びＩＦＩ４４の核酸及びポリペプチド配列は、当該技術分野で周知である。構造的及び腫瘍特異的プロモーターを含む適切なプロモーター、及び発現ベクターは、当業者には明らかであり得る。そのようなベクターが個体に直接投与され得ることもまた、当業者には明らかであり得る。当業者であれば、（静脈内、皮下、または腹腔内投与が含まれるが、これらに限定されない）腫瘍部位または腫瘍部位より遠位に直接投与され得るポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはベクターが、容易に理解し得る。

あるいは、自己細胞または異種細胞のいずれかの細胞は、エクスビボでポリヌクレオチドまたはベクター、及び個体に提供される細胞で遺伝子操作され得る。ある特定の実施形態では、細胞は、ＩＬＣ２を含むが、これに限定されない、免疫細胞である。他の実施形態では、細胞は、腫瘍細胞である。

したがって、ある特定の実施形態では、ＩＬ−３３及び／またはＩＦＩ４４ポリペプチドもしくはその活性断片を含む組成物及びそれを使用する方法が、提供される。他の実施形態では、ＩＬ−３３及び／またはＩＦＩ４４もしくはその活性断片を発現する、ポリヌクレオチド、発現ベクター、及び／または細胞が、提供される。ポリペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクター、及び／または細胞は、薬学的に許容される希釈剤または担体を含む薬学的組成物として投与され得る。

他の実施形態では、ＩＬＣ２の活性を刺激し、かつ／またはその数を拡大することによって、癌の進行の抑制及び／または癌の治療のための組成物及び方法が、提供される。これは、ＩＬ−３３、インターフェロン誘導性タンパク質４４（ＩＦＩ４４）、及び／またはＭＲ１等のＩＬＣ２調節因子（またはＩＬＣ２調節因子をコードするポリヌクレオチドもしくはベクター）の投与によって、インビボで行われ得る。

ある特定の実施形態では、を、ＩＬ−３３、ＩＦＩ４４、及び／またはＩＬＣ２細胞を含む遠位臓器に、循環腫瘍細胞の転移性拡散を抑制する方法が、提供される。

ある特定の実施形態では、ＩＬＣ２細胞を投与することによって、癌の進行の抑制及び／または癌の治療のための組成物及び方法が、提供される。ある特定の実施形態では、ＩＬＣ２細胞は、自己細胞または異種である。細胞は、肺組織または腫瘍組織を含むが、これらに限定されない、様々な組織から単離され得る。単離後、細胞は、任意に、エクスビボで刺激されるか、または操作される。ＩＬＣ２細胞は、他の細胞で共培養によって、及び／または様々なサイトカイン等の１つ以上の刺激分子で培養することによって、刺激され得る。エクスビボでの操作はまた、ＩＬＣ２の遺伝子操作も含み得る。ある特定の実施形態では、ＩＬＣ２は、サイトカインを含むが、これに限定されない、免疫調節分子を発現するように操作されている。ある特定の実施形態では、ＩＬＣ２は、ＩＬ−３３及び／またはＩＦＩ４４を発現するように遺伝子操作されている。ある特定の実施形態では、ＩＬＣ２細胞は、マーカーを発現するように遺伝子操作されている。ある特定の実施形態では、ＩＬＣ２は、腫瘍抗原特異的ＴＣＲが含まれるが、これに限定されない、ＴＣＲ、またはＩｇを発現するように遺伝子操作されている。ある特定の実施形態では、ＩＬＣ２は、ＣＡＲ受容体の発現が遺伝子操作されている。ある特定の実施形態では、ＩＬＣ２は、ＣＡＲ受容体の発現が遺伝子操作されている。

ＩＬ−３３（ＩＬ−３３ポリペプチド、ＩＬ−３３をコードするポリヌクレオチド、もしくはＩＬ−３３をコードするベクター）、ＩＦＩ４４（ＩＦＩ４４ポリペプチド、ＩＦＩ４４をコードするポリヌクレオチド、もしくはＩＦＩ４４をコードするベクター）、及びＩＬＣ２は、単独でもしくは互いに組み合わせて、及び／または免疫を刺激する、癌を治療し、かつ／または癌の進行を抑制する、他の療法と共に使用され得る。他の療法には、他のサイトカイン（ＩＬ−９及びＩＬ−２１等のＩＬＣ２軸における他のサイトカインが含まれるが、これらに限定されない）、細胞療法（ＩＬＣ２等の免疫細胞の投与が含まれるが、これに限定されない）、ワクチン療法、及び化学療法が含まれるが、これに限定されない。

ＩＬ−３３及び／またはＩＦＩ４４及び／またはＩＬＣ２が組み合わせて使用され得る療法の特定の非限定的な例には、ＴＮＦアルファ；インターロイキン−２１；インターロイキン−１３；インターロイキン（ＩＬ）−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、及びＩＬ−１３の組み合わせ；ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＰＤＬ−１の組み合わせ；インターフェロンアルファ、ベータ、またはガンマを含むが、これらに限定されない、インターフェロン；ＧＭ−ＣＳＦ；Ｇ−ＣＳＦ；ＨＤＡＣｉ；ＨＡＴ；メチル化阻害剤；ＣＡＲＴ細胞、自己Ｔ細胞、特異的ＴＣＲによる自己Ｔ細胞トランスデューサーを含むが、これらに限定されない、Ｔ細胞、自己Ｂ細胞、樹枝状細胞サブセット、ウイルス性、細菌性、及び腫瘍抗原を
含むが、これらに限定されない、対象となる抗原；腫瘍抗原そのようなハーセプチンを標的とする抗体を含むが、これらに限定されない、抗体；他の生物学的療法；造血幹細胞の移植；ナチュラルキラー細胞；Ｔｏｌｌ受容体アゴニスト；ケモカイン；抗血管新生分子；ＩＬ−２を含むが、これに限定されない、免疫療法に使用される他のサイトカイン；化学療法；ウイルスベクター；腫瘍崩壊ウイルス；アジュバント；細胞毒性薬；ならびに制御性Ｔ細胞を枯渇させる療法が含まれるが、これらに限定されない。

ある特定の実施形態では、ＩＬ−３３及び／またはＩＦＩ４４の発現及び／または活性を調節することによって、免疫力及び／または免疫反応を調節する方法が、提供される。ある特定の実施形態では、ＩＬ−３３及び／またはＩＦＩ４４の発現及び／または活性を調節することによって、抗原提示を調節する方法が、提供される。ある特定の実施形態では、ＩＬ−３３及び／またはＩＦＩ４４の発現及び／または活性を調節することによって、ＭＨＣＩの発現を調節する方法が、提供される。

ある特定の実施形態では、ＩＬ−３３及び／またはＩＦＩ４４の発現及び／または活性を増強させることによって、免疫力及び／または免疫反応を調節する方法が、提供される。ある特定の実施形態では、ＩＬ−３３及び／またはＩＦＩ４４の発現及び／または活性を増強させることによって、抗原提示を増強させる方法が、提供される。ある特定の実施形態では、ＩＬ−３３及び／またはＩＦＩ４４の発現及び／または活性を調節することによって、ＭＨＣＩの発現を増強させる方法が、提供される。対象のポリペプチドの発現及び／または活性を増強させるための方法の非限定的な例には、対象となるポリペプチドの投与、対象となるポリペプチドをコードする核酸またはベクターの投与、または対象となるポリペプチドの発現を増強させる１つ以上の分子の投与が含まれる。

代替の実施形態では、ＩＬ−３３及び／またはＩＦＩ４４の発現及び／または活性を抑制することによって、免疫力及び／または免疫反応を減少させる方法が、提供される。ある特定の代替の実施形態では、ＩＬ−３３及び／またはＩＦＩ４４の発現及び／または活性を抑制することによって、抗原提示を低下させる方法が、提供される。ある特定の実施形態では、ＩＬ−３３及び／またはＩＦＩ４４の発現及び／または活性を抑制することによって、ＭＨＣＩの発現を低下させる方法が、提供される。対象のポリペプチドの発現及び／または活性を抑制するための方法の非限定的な例には、対象となるポリペプチドに対する抗体、及び対象となるポリペプチドをコードする核酸を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ等の核酸が含まれるが、これらに限定されない、アンタゴニストの投与が含まれる。

ある特定の実施形態では、ＩＣＬ２の細胞数及び／または活性を調節することによって、免疫力及び／または免疫反応を調節する方法が、提供される。ある特定の実施形態では、ＩＣＬ２の細胞数及び／または活性を増加させることによって、免疫力及び／または免疫反応を増強させる方法が、提供される。ある特定の実施形態では、ＩＣＬ２の細胞数及び／または活性を減少させることによって、免疫力及び／または免疫反応を抑制する方法が、提供される。

診断方法：
マイクロアレイ分析は、遺伝子発現が、転移性細胞株と非転移性細胞株との間で異なることを実証する。細胞外マトリックスリモデリング遺伝子と免疫反応に関与する遺伝子との差は、転移性細胞及び非転移性細胞において観察され得る。例えば、マイクロアレイ分析は、転移性細胞株（プロスタグランジン及びロイコトリエン、インターロイキン（ＩＬ）関連遺伝子（例えばＩＬ−１１ｒａ１、ＩＬ−１３ｒａ、ＩＬ１５、ＩＬ−３３）、腫瘍壊死因子、及びカスパーゼファミリー（ＴＮＦｓｆ９、Ｃａｓｐ７、Ｃａｓｐ１２）、抗原処理及び提示（例えばＨ２−Ｋ１、Ｈ２−ＤＭｂ１、Ｈ２−Ｑ５、Ｈ２−Ｑ６、ＴＡ
Ｐ１、ＴＡＰ２、Ｔａｎａｓｉｎ、ＬＭＰ２）等）における、マトリックスリモデリングに関与する上方制御遺伝子（ＭＭＰ２、ＭＭ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１３）、ならびに下方制御免疫及び炎症関連遺伝子の数が実証された。

したがって、ある特定の実施形態では、１つ以上の遺伝子の発現を判定することによって、転移性細胞を非転移性細胞と区別する方法が、提供される。他の実施形態では、１つ以上の遺伝子の発現を判定することによって、転移性疾患への進行を判定するための方法が、提供される。これらの遺伝子は、マトリックスリモデリングならびに免疫及び炎症関連遺伝子に関与する遺伝子であり得る。ある特定の実施形態では、マトリックスリモデリングに関与する遺伝子は、転移性疾患において、上方制御され、免疫及び炎症関連遺伝子に関与する遺伝子は、下方制御される。

ＩＬ−３３、ＩＦＩ４４、及び様々なＡＰＰ遺伝子（ＭＲ１等）のレベルは、良性及び／または原発性腫瘍と比較して、転移性肺及び前立腺癌において低下するように思われる。したがって、ある特定の実施形態では、ＩＬ−３３、ＩＦＩ４４、及び／または様々なＡＰＰ遺伝子（ＭＲ１等）の発現を判定することによって、転移性疾患への進行を判定するための方法が、提供される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−３３、ＩＦＩ４４、及び／または様々なＡＰＰ遺伝子（ＭＲ１等）の発現のレベルを判定することによって、転移性形態の前立腺癌または転移性肺癌への進行を診断する方法が、提供される。ある特定の実施形態では、ＩＬ−３３の発現が、判定される。ある特定の実施形態では、ＩＦＩ４４の発現が、判定される。ある特定の実施形態では、ＩＬ−３３及びＩＦＩ４４の発現が、判定される。

ある特定の実施形態では、１つ以上の遺伝子の発現を判定することによって、癌患者の臨床転帰を判定する方法が、提供される。特定の実施形態では、ＩＬ−３３、ＩＦＩ４４、及び／またはＭＲ１の発現を判定することによって、癌患者の臨床転帰を判定する方法が、提供される。ある特定の実施形態では、ＩＬ−３３の発現が、判定される。ある特定の実施形態では、ＩＦＩ４４の発現が、判定される。ある特定の実施形態では、ＩＬ−３３及びＩＦＩ４４の発現が、判定される。他の実施形態では、患者の状態は、経時的に、ＩＬ−３３、ＩＦＩ４４、及び／またはＭＲ１の発現の変化をモニタリングすることによって、別の時間をモニタリングされる。ある特定の実施形態では、ＩＬ−３３の発現の変化は、経時的にモニタリングされる。ある特定の実施形態では、ＩＦＩ４４の発現の変化は、経時的にモニタリングされる。ある特定の実施形態では、ＩＬ−３３及びＩＦＩ４４の発現の変化は、経時的にモニタリングされる。

転移性組織中のＩＬ−３３及び／またはＩＬＣ２の不在下で、好酸球は、転移性腫瘍組織に侵入しないが、悪性腫瘍の末端に隣接して蓄積する。したがって、本発明のある特定の実施形態では、腫瘍中／またはその周辺の好酸球の存在に基づく、転移性疾患への進行、及び／または臨床転帰が含まれるが、これらに限定されない、予後、疾患の進行を判定する方法も存在する。好酸球を同定する方法は、当該技術分野で周知であり、ヘンゼル染色、ライト・ギムザ染色等の様々な染色、及びＮｏｖｕｓＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓからの好酸球抗体（ＢＭＫ−１３）を含む。

本明細書に記載される本発明のより良い理解を得るために、以下の実施例を示す。これらの実施例は、本発明の例示的な実施形態を記載することを目的とし、決して本発明の範囲を制限することを目的としないことが理解されよう。

実施例１：転移と相関する炎症関連遺伝子の同定
概要：２型自然リンパ球細胞（ＩＬＣ２）は、適応免疫反応を増強し、かつ組織微環境における炎症性「アラルミン」インターロイキン３３（ＩＬ−３３）に対する第１のレス
ポンダーのうちの１つである。ここで、我々は、ＩＬ−３３が、マウス及びヒトの良性または原発性同系形態と比較して、それらの転移性形態で下方制御するかまたは突然変異することを示す。転移性腫瘍の成長及び循環転移性腫瘍細胞（ＣＴＣ）の頻度は、腫瘍が、ＩＬ−３３を発現するように遺伝子組み換えされている場合に、軽減することを実証する。最終的に、腫瘍成長速度が、野生型（ＷＴ）動物と比較して、ＩＬＣ２欠失マウスにおいて著しく増加したことを示す。これらの観察は、ＩＬ−３３が疾患の転移性拡散を修正し得ることを実証し、かつＲＯＲα−ＩＬ−３３−ＩＬＣ２軸を通して癌免疫学的監視においてＩＬＣ２についての役割を実証する。

結果：
アレイ分析は、転移と相関する炎症遺伝子を同定する：免疫系は、腫瘍細胞が染色体を変化させない限り、免疫学的に認識することができない形態に表現型のシフトを促し、悪性腫瘍をもたらす、腫瘍の発達を制限する。転移性遺伝子特徴は、腫瘍の悪性の可能性の一因となる場合に、共に作用する転移進行遺伝子の組み合わせである。ＭＨＣ−Ｉ欠失の可能性及び転移への腫瘍の進行の機構をさらに理解するために、比較マイクロアレイによりマウス前立腺及び肺癌の先行非転移性及び転移性細胞株における遺伝子発現レベルのプロファイリングが行われた。マウス肺腫瘍モデルは、細胞の種類が、原発性腫瘍細胞からの免疫選択によるが、腫瘍の攻撃性及び転移と相関すると考えられる、ＭＨＣ−Ｉ欠失表現型自然発生的に獲得したことを表す。マウス前立腺腫瘍モデルは、転移プロセス中に調和して下方制御したＭＨＣ−Ｉレベルを有する癌の進行モデルを表す。我々が承知している限り、転移による免疫選択されたＭＨＣ欠失及び自然ＭＨＣ欠失が同様の遺伝子発現を調節するどうか、またはこのことが癌生物学を理解するために何を意味するのか、直接比較したものがない。

ｍＲＮＡは、両方のモデル系から単離され、ｔｈｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＨｅａｌｔｈＣｅｎｔｒｅ（Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）のマイクロアレイセンターに送られ、ここで、合計５５８２１のプローブを用いて、２８００５Ｔｗｏ−ＣｏｌｏｒＡｇｉｌｅｎｔマイクロアレイにハイブリダイズされた。Ａｇｉｌｅｎｔチップからのデータは、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇＧＸにインポートされ、推奨されたＡｇｉｌｅｎｔの空間トレンド除去Ｌｏｅｓｓ機能を用いて正規化した。次いで、データをフィルタ処理して、両チャネルにおけるシグナル不足を示したあらゆるプローブを除去した。強度分布の上位８０パーセンタイルのプローブを、さらなる分析のために保持した。次いで、遺伝子は、前立腺癌及び肺癌の両方の非転移性形態とＭＨＣ−Ｉの欠失または転移性形態との間に少なくとも２の倍率の変化を示した場合、転移の潜在的調節因子として示された。

著しく異なるプローブの一覧をさらに狭めるために、遺伝的オントロジー（ＧＯ）分析は、最も顕著な影響を受けたＧＯＩＤを判定するために、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ及びＹｕｋｅｔｉｅｌｅ超幾何学的補正検定統計を用いて行われた。細胞外マトリックスリモデリング遺伝子及び免疫反応に関与する遺伝子は、ＭＨＣ−Ｉ欠失または転移性細胞株と非転移性細胞株との間の遺伝子産物の最も影響を及ぼした群であることが見出され、転移及び免疫回避のために示した遺伝子がこれらのオントロジーに由来すると期待されていたという考えを支持した。具体的には、マイクロアレイ分析は、かなりの数の、マトリックスリモデリング（ＭＭＰ２、ＭＭ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１３）に関与する上方制御遺伝子ならびに下方制御免疫及び炎症関連遺伝子を実証した。多くの公知のインターフェロン（ＩＦＮ）誘導性遺伝子（例えば、ＩＲＦ１、ＩＲＦ５、ＩＲＦ７、ＩＲＦ９、ＩＦＩ２７、ＩＦＩ４４、ＰＳＭＢ８、ＰＳＭＢ９、ＩＦＩＴ２、ＩＦＩＴ１、Ｉｇｔｐ）、プロスタグランジン及びロイコトリエンファミリー（Ｐｔｇｆｒ、Ｐｔｇｉｒ、Ｐｔｇｒ１、Ｐｔｇｉｓ、Ｌｔｂ４ｒ１）、インターロイキン（ＩＬ）関連遺伝子（例えば、ＩＬ−１１ｒａ１、ＩＬ−１３ｒａ、ＩＬ１５、ＩＬ−３３）、腫瘍壊死因子及びカスパーゼファミリー（ＴＮＦｓｆ９、Ｃａｓｐ７、Ｃａｓｐ１２）、ならびに抗原処理及び提示をコードす
る遺伝子（例えば、Ｈ２−Ｋ１、Ｈ２−ＤＭｂ１、Ｈ２−Ｑ５、Ｈ２−Ｑ６、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、Ｔａｐａｓｉｎ、ＬＭＰ２）があった。選択された遺伝子のための発現レベルは、リアルタイム定量的逆転写酵素ポリメラーゼ鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって確認された。転移性／非転移性細胞株における遺伝子の異常発現は、腫瘍における免疫認識から免疫回避への移行の機構を特徴付け、理解するために手段を提供し得る。強調は、ＡＰＭと相互作用することが知られている遺伝子、炎症または免疫力の新規の態様に関与する遺伝子、及びインターフェロン（ＩＦＮ）によって誘導される遺伝子に置かれた（図１）。

ヒト癌における検証：ＥｕｒｏｐｅａｎＢｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃＩｎｓｔｉｔｕｔｅによって作成されたＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｔｌａｓから得られたデータ（アクセス日：２０１３年１月３０日）を用いて、ＩＬ−３３遺伝子のレベルが、ヒト良性及び原発性前立腺腫瘍と比較して、ヒト転移性前立腺癌において下方制御されることが見出された（図２）。ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｔｌａｓからのデータは、ＩＬ−３３の発現レベルが前立腺腫瘍のその転移性形態への移行に対する予後マーカーとして潜在的に使用され得ることを示す、ｍＲＮＡとタンパク質発現との間の合意を反映する。

ＩＬ−３３は、ＴＡＰ−１及びＨ２−Ｋｂの発現／シグナル伝達の一因となる：ＴＡＰ−１／ＭＨＣ−Ｉの下方制御は、ヒトにおける急速な腫瘍の進行及び転移に対する主要な指標として文献に示され、したがって、この研究において主要な指標として使用されている。ＴＡＰ−１／ＭＨＣ−Ｉの発現におけるＩＬ−３３−遺伝子の効果を精査するために、この遺伝子は、ＭＨＣ−Ｉ欠失の表現型を有し、それ故に、免疫回避する、輸送体ＴＡＰ−１欠失マウス肺癌細胞株（Ａ９）に導入された。ＩＬ−３３のための完全長ｃＤＮＡによる遺伝子発現構築物は、ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰベクターを用いて生成されている。安定にトランスフェクトされたクローンは、ＧＦＰ陽性細胞から単離され、この研究のために使用された。選択された遺伝子候補の免疫調節活性は、初めに、ｍＲＮＡの発現に基づいて分析された。ｍＲＮＡを形質転換体から単離し、ＴＡＰ−１に特異的なプライマーを用いて、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を行った。分析される８つの異なる遺伝子候補をコードするｍＲＮＡの中で、ＩＬ−３３の転写は、最高の発現を有した（図３ａ）。ＩＬ−３３の過剰発現は、ＥＬＩＳＡ及び免疫ブロット分析によって確認され、ＭＨＣ−Ｉ欠失癌腫Ａ９形質転換体におけるＴＡＰ−１及びＨ２−Ｋ１のタンパク質発現レベルの変化を研究した。ウェスタンブロット分析は、研究モデルにおけるＴＡＰ−１及びＨ２−Ｋ１の生成の増加を確認した（図３ｂ）。さらに、ＴＡＰ−１の発現の増加がＨ２−Ｋ１の細胞表面の提示を誘導することが可能であり得るかどうかを試験するために、フローサイトメトリー分析を用いた。蛍光シグナルは、ＡＰＭの機能性の回復による可能性のある陰性対照と比較して、ＩＬ−３３のトランスフェクション後に著しくシフトした（図３ｃ）。まとめると、これらの所見は、ＩＬ−３３遺伝子のトランスフェクションがｍＲＮＡにおけるＴＡＰ−１及びＨ２−Ｋｂの発現、タンパク質、及び分子レベルを誘導することができることを示した。この遺伝子が、ＴＡＰ−１及びＨ２−Ｋｂの発現／シグナル伝達をもたらす経路（複数を含む）に関与することが推測され得る。

ＩＬ−３３は、転移性腫瘍の免疫認識を企図する：ＩＬ−３３によって誘導された変化の機能性をさらに評価するために、トランスフェクトされ、ＩＬ−３３−サイトカインで処理されたＡ９細胞の、Ｈ２−Ｋ１に制限されたオボアルブミンエピトープＯＶＡ（２５７−２６４、ＳＩＩＮＦＥＫＬ）を示す能力が評価された。可溶性ＯＶＡ（２５７−２６４）により細胞を１６時間インキュベーションした後に、それらを、ＯＶＡ（２５７−２６４）に関連して、Ｈ−２Ｋ^ｂの認識によって活性化される、Ｔ細胞ハイブリドーマであるＢ３Ｚで培養した。ＩＬ−３３サイトカインの存在下で、Ａ９細胞は、ＩＬ−３３の形質転換体よりも高い存在度のＨ２−Ｋ１−ＯＶＡ（２５７−２６４）錯体を有した。これ
により、恐らく、ＩＬ−３３タンパク質の核内形態と比較して、ＩＬ−３３タンパク質の細胞外形態のより高い重要性／活性のため、Ｔ細胞プライミング及び活性化に対してより多くの能力を生じた（図４）。これらのデータは、ＩＬ−３３がＭＨＣ−Ｉ欠失肺癌Ａ９の免疫認識を改善することを実証した。

悪性遺伝子発現プログラミングの調節：腫瘍免疫回避におけるＩＬ−３３の役割に取り組むために、一連のノックダウン実験が、ＩＬ−３３に特異的なｓｉＲＮＡを用いて行われた。ＩＬ−３３に対して標的化されたｓｉＲＮＡは、ＭＨＣ−Ｉの発現の下方制御が非転移性細胞中に生じ得るかどうかを評価するために使用された。無関係なｓｉＲＮＡで処理されるかまたは未処理の状態の原発性腫瘍細胞（ＴＣ１）は、対照として使用された。ＥＬＩＳＡ及び免疫ブロット分析によるＩＬ−３３の下方制御を確認し（図５ａ）、フローサイトメトリーによる原発性腫瘍細胞（ＴＣ１）におけるＨ２−Ｋ１細胞表面の発現レベルの変化を研究した。ＩＬ−３３により誘導されたｓｉＲＮＡで処理したＴＣ１細胞は、対照で処理した細胞よりもはるかに低い存在度のＨ２−Ｋ１錯体を有した（図５ｃ）。ＩＬ−３３の発現におけるＭＨＣ−Ｉの下方制御の効果を精査するために、ｓｉＲＮＡは、ＭＨＣ−Ｉ（図６）、及びＨ２−Ｋ１−／−マウスからの膵細胞（図７）に対して使用された。ＩＬ−３３は、ＴＣ１細胞株における免疫認識可能な表現型の発現には重要であると思われた。さらに、データは、ＭＨＣ−Ｉ及びＩＬ−３３が原発性腫瘍の転移性再プログラミング中に同時調節され得ることを示唆し、ＩＬ−３３遺伝子の転移性の可能性を示す。

転移性細胞は、ＬＯＨをもたらすＩＬ−３３のプロモーター−エンハンサー領域内の突然変異を有する：予備データをさらに検証するために、原発性ＴＣ１細胞及び転移性Ａ９細胞におけるＩＬ−３３、Ｈ２−Ｋ１、及びＩＦＮγ遺伝子のプロモーター−エンハンサー領域が、配列決定され、Ｇｅｎｏｍａｔｉｘソフトウェア、ＥｕｋａｒｙｏｔｉｃＰｒｏｍｏｔｅｒＤａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｅｐｄ．ｖｉｔａｌ−ｉｔ．ｃｈ）、及びＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌＢｉｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ
Ｄａｔａｂａｓｅ（ｗｗｗ．ｃｂｒｃ．ｊｐ）を用いて分析された。推定上の結合部位は、ＣＲＥＢ、ＡＰ−１、ＮＦ−ｋＢ、ＨＳＦ、ＡＭＬ−１ａ、ＲＯＲα、ＧＡＴＡを含む、一般的な転写因子について同定された（下の表１）。
表１：ＩＬ−３３、ＭＨＣ−Ｉ、及びＩＦＮ−γのプロモーター分析は、いくつかの一般的な転写因子に対して高スコアの結合部位を示した。推定上の転写因子結合部位を予測するために、ＧｅｎｏｍａｔｉｘウェブサイトからのＭａｔｉｎｓｐｅｃｔｏｒソフトウェア及びＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎＢｉｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ｗｗｗ．ｃｂｒｃ．ｊｐ）のデータベースを使用した。

さらに、転移性Ａ９細胞のＩＬ−３３プロモーターにおける単一塩基対突然変異Ａ_１１４Ｇは、あるＩＬ−３３対立遺伝子に影響を及ぼしヘテロ接合性の喪失をもたらした、ＧＡＴＡ結合領域内に見出された（図８）。さらに、突然変異は、非突然変異ＤＮＡ配列（ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ３）中に存在し、かつ領域内の任意の別のＴＦによって置換されなかった３つのＧＡＴＡ転写因子（ＴＦ）の喪失をもたらした。Ｔｈ２免疫反応に関与するＩＬＣ２の発生及び機能のような、ＴＦＧＡＴＡ及びＩＬ−３３に応じたシグナル伝達経路は、悪影響を及ぼされ得ると仮定した。加えて、ＩＬ−３３及びＭＨＣ−Ｉのプロモーター分析は、ＧＡＴＡ３及びＩＬ−３３と共に、ＩＬＣ２免疫反応を調整するＲＯＲα ＴＦに対して高スコアの結合部位を示した。さらに、オーファン核受容体ＲＯＲαの活性化が細胞増殖の有意な減少をもたらし、癌細胞の侵襲性及び遊走性能力を低減することが文献において示されている。癌の進行におけるＩＬ−３３の下方制御の根底にある分子機構は、全く知られていないが、ＩＬＣ２の発生及び機能を制御するＲＯＲα関連プロセスにあり得る。これに直接対処するために、野生型及びＲＯＲα−／−マウスにおけるＩＬ−３３−遺伝子の相補性を有する及び有しない、Ａ９腫瘍の進行を比較するために骨髄移植実験を行った。

ＩＬ−３３遺伝子相補性は、インビボで転移を逆転させる：ＩＬ−３３欠失が細胞表面上に示されたより少ないＨ−２Ｋ１錯体をもたらしたという所見は、これらの分子が原発性腫瘍の悪性形態への転移性形質転換中に同時に調節され得ることを示唆した。ＴＡＰ−１／ＭＨＣ−Ｉ欠失細胞株（Ａ９）におけるＴＡＰ−１及びＭＨＣ−Ｉの発現のＩＬ−３３によって誘導された増加がインビボでＩＬ−３３−遺伝子の抗腫瘍効果の一因となり得るかどうかを試験するために、遺伝子相補性マウス研究が行われた。［ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ］空ベクターで安定にトランスフェクトされたＴＣ１及びＡ９細胞は、それぞれ、陽性対照及び陰性対照として使用された。いくつかのパラメータを用いた遺伝子相補性戦略の重要性が比較された：１）腫瘍成長速度、２）臨床提示の重症度、３）転移を形成する可能性としての遠位臓器へのＣＴＣの広がり（ＦＡＣＳ）、４）免疫反応：ａ）ＴＩＬ：ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＬＣ２、マクロファージ、好中球、Ｔｒｅｇ（ＦＡＣＳ、ＩＨＣ）；ｂ）ＬＮ：ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＬＣ２（ＦＡＣＳ）。

Ａ９細胞へのＩＬ−３３遺伝子の安定したトランスフェクションは、著しく抑制された腫瘍を形成することが見出された。［Ａ９＋ＩＬ−３３遺伝子］細胞から腫瘍増殖の平均体積は、研究の持続期間にわたって、原発性腫瘍と比較して、［Ａ９＋ベクター］から約３０％〜約４５％低かった。未処理の腫瘍［Ａ９＋ベクター対照］は、集中した成長速度（図９）だけでなく、重症度の臨床提示によっても特徴付けられた。研究の第２部中の対照転移性群において急速な体重減少が検出されたが、原発性腫瘍及びＩＬ−３３でトランスフェクトされた腫瘍を有する動物は、安定に体重増加した（図９ａ）。さらに、隣接組織の出血がある潰瘍（ステージ４〜５）は、群内でいくつかの腫瘍において検出されたが、原発性またはＩＬ−３３で処理された腫瘍については検出されなかった。しかしながら、腫瘍の発達の臨床経過において最も重要かつ好ましくない予後因子は、疾患の転移拡散である。転移を開始する細胞は、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）内に存在した。マウスの身体にわたる循環腫瘍細胞の播種を評価するために、フローサイトメトリーを使用した。ＩＬ−３３が安定にトランスフェクトされた腫瘍を、野生型（腫瘍なし）、Ａ９（未処理の腫瘍）、Ａ９＋ベクター対照、ＴＣ１＋ベクター対照の異なる対照と比較して、脳、肺、副腎、リンパ節、及び血液組織等の肺癌において最も一般的な転移部の非凝集性組織における
ＧＦＰ＋腫瘍細胞を探求していた。フローサイトメトリー分析は、［Ａ９＋ベクター対照］腫瘍を持つ動物の肝臓（約３２％）及び副腎（約１６％）において最高の割合のＧＦＰ陽性細胞を検出した。ＩＬ−３３によるＡ９細胞のトランスフェクションは、肝臓では約０．１５％、及び副腎では約２．６３％までＧＦＰ＋細胞の平均数を減少させた（図１０）。単一の緑色細胞は、肺及び血液中で検出されたが、脳試料はすべて、ＧＦＰを含まなかった。循環腫瘍細胞は、遠位部位に播種するようにプログラム化されていない、局所的増殖の可能性を有する腫瘍（ＴＣ１）を持つ動物の試験された組織及び臓器のすべてにおいて検出されなかった。この見解は、原発性腫瘍形態と転移性腫瘍形態との間で明らかな形質学的分化を示した、切除された腫瘍の病理組織学的試験によって支持された。転移性細胞の核は、さらに多形性であった。悪性細胞は、より小さい細胞質含量、及びより大きな核／細胞質の比率、密度の高い、均一に分散された固体構造の形成を有した（図１１ａ）。原発性腫瘍は、隣接組織（図１１ｂにある預託組織）の中に分布しており、スポンジに似た「柔らかい」構造を形成し、それらを悪性腫瘍細胞増殖と明らかに区別した。さらに、原発性腫瘍は、線維芽細胞及びコラーゲン沈着からなる、明確な線維性被膜によって封入された（図１１ｃ）。この被膜の存在は、原発性腫瘍が出現部位で局在化した状態を可能にし、原発性腫瘍と悪性腫瘍との間で形質学的及び生物学的分化の基本的な基準を定義する。対照的に、悪性腫瘍は、通常、被膜を有せず、そのため、遠位臓器に播種することが可能である。それ故に、免疫選択によるＭＨＣ−Ｉ欠失表現型を自然発生的に獲得したマウス肺腫瘍モデル（Ａ９）は、移植時に、インビボでその転移性特性を保持することができ、ＭＨＣ−Ｉ欠失表現型を、疾患の浸潤的拡散を有する悪性の可能性と相関させることを可能にした。さらに、ＩＬ−３３によって誘導された変化は、腫瘍の発達の臨床経過を変化させることができた。まとめると、これらの観察は、ＩＬ−３３遺伝子相補が、悪性遺伝子発現のプログラミングを修正することができることを示唆している。結果として、腫瘍成長速度、疾患の転移拡散、及びその重症度を低下させることによって癌細胞集団の転移の可能性に影響を及ぼす。

腫瘍浸潤免疫細胞：腫瘍浸潤免疫細胞は、腫瘍成長の動力学に密接な関連がある。腫瘍浸潤免疫細胞計数の遺伝子相補で誘導された変化を定量化するために、フローサイトメトリーが適用され、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって視覚化された。自然（ＩＬＣ２、好中球、マクロファージ）及び適応免疫（ＣＤ４、ＣＤ８Ｔ細胞）系の免疫反応への関与、及び免疫抑制細胞含有物（制御性Ｔ細胞）が、評価された。非凝集性腫瘍組織におけるフローサイトメトリーによって検出されたＣＤ８＋細胞の割合は、ＩＬ−３３を発現した腫瘍において増加した（図１２）。遺伝的に補完された腫瘍におけるＣＤ４＋細胞のレベルは、陰性対照と比較して、増加した。固形組織からの切片上の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）のＩＨＣによる可視化は、陰性対照と比較した場合に、ＩＬ−３３が補完された腫瘍内の、ＭＨＣ１、ＣＤ８＋、及びＣＤ４＋の陽性細胞に対して増加した染色度を示した（図１３）。ＣＴＬによる免疫認識の正の変化は、免疫抑制細胞含有物とうまく一致した。それ故に、悪性腫瘍の微環境は、耐性関連マーカー（ＦｏｘＰ３＋）の上方制御を特徴とするが、ＩＬ−３３によって誘導された変化は、免疫抑制細胞の拡大及び蓄積に影響を及ぼすように思われた。転移性腫瘍に導入されたＩＬ−３３の腫瘍におけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の頻度及び数の増加は、ＴＩＬのサブセットがマウス肺癌における保護的な抗腫瘍免疫を媒介し得ることを示唆した。Ｔ細胞もまた、ＣＤ８の上方制御の発現への抗原刺激を必要とするという事実は、ＩＬ−３３によって誘導された変化がインビボでの転移性腫瘍のＴＡＰ−１／ＭＨＣ−Ｉ欠損を克服し、我々のインビトロでの相補性実験からの結論を支持し得ることを示唆している。抗腫瘍炎症反応は、腫瘍組織を通じて、小食細胞、好中球、及び好酸球の浸潤を試験した後に分析された。腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は、転移性対照［Ａ９＋ベクター］と比較して、原発性［ＴＣ１＋ベクター］及びＩＬ−３３で処理した［Ａ９＋ＩＬ−３３］ものにおいて、より高い浸潤レベルを有するすべての収集された腫瘍内に均等に分布していることが見出された。この領域内の腫瘍成長による組織損傷時に、局所的マクロファージ及び他の細胞は、損傷を感知し、腫瘍組織への
好中球、好酸球等の多数の多形核白血球の浸潤を刺激するサイトカイン及びケモカイン等の炎症性メディエータを生成する。脂肪組織の急性炎症は、原発性［ＴＣ１＋ベクター］及び遺伝的に補完された転移性腫瘍における好中球浸潤を特徴とした。したがって、炎症細胞及びメディエータは、原発性［ＴＣ１＋ベクター］及び［Ａ９＋ＩＬ−３３］腫瘍の微環境において上昇するが、転移性腫瘍［Ａ９＋ベクター］においては上昇せず、これは、プロスタグランジン及びロイコトリエンファミリー等の炎症関連遺伝子、ならびにインターロイキン（ＩＬ）関連遺伝子の著しい下方制御を示す、我々のマイクロアレイデータと一致している。転移性組織における炎症反応の重要な誘引物質の欠如は、好酸球のためにギムザ染色を用いて実証された。好酸球の蓄積の２つの焦点領域は、悪性腫瘍の周辺に隣接した正常な組織内に認められた。ＩＬ−３３の発現によってもたらされた因子の放出は、微環境を大幅に修正し、好酸球が組織を流れるのを可能にした。ＩＬ−３３が修正された腫瘍の部分を通してランダムに分布した好酸球の著しい浸潤があった（図１９）。これらの観察は、系におけるＩＬ−３３の存在が、腫瘍微環境内で炎症反応を変化させ得、自然及び適応レベルのマウス肺癌における保護的な抗腫瘍免疫を媒介し得ることを示唆している。

ＩＬＣ２の頻度は、ＩＬ−３３を発現する原発性腫瘍及び転移性腫瘍において上昇する：癌の進行におけるＩＬＣ２及びＩＬ−３３の関与を直接試験するために、複合多色染色を用いたフローサイトメトリーアプローチが使用された。非凝集性腫瘍組織のフローサイトメトリー分析は、白血球系統の細胞表面マーカー（Ｌｉｎ：ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ１１ｃ、Ｇｒ−１、ＮＫ１．１、Ｔｅｒ１１９）を発現しなかった細胞の存在を示した。これらの細胞は、Ｉｌ−３３受容体Ｔ１／ＳＴ２（ＳＴ２）鎖、ＩＬ−７受容体サブユニットＩＬ−７Ｒａ（ＣＤ１２７）、及びＴｈｙ１．２（ＣＤ９０．２）の細胞表面マーカー発現の異なるパターンを示した。Ｌｉｎ−ＳＴ２＋ＣＤ１２７＋ＣＤ９０．２＋細胞の集団は、リンパ球と同様に形質学的であった：細胞質に対して高い核の比率を有する形が丸みを帯びている。ＩＬＣ２の表現型に選択された集団がＴｈ２細胞型サイトカインを産生する機能的な能力があることを証明するために、サイトカインの産生は、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定された。Ｌｉｎ−ＳＴ２＋ＣＤ１２７＋ＣＤ９０．２＋細胞のサブセットは、胸腺間質リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）及びＩＬ−３３の組み合わせによる刺激の際に、ＩＬ−５及びＩＬ−１３を成長させ、分泌することができたことが見出された。これらのデータは、腫瘍において検出されたＬｉｎ−ＳＴ２＋ＣＤ１２７＋ＣＤ９０．２＋細胞の集団が、自然リンパ球群２細胞と表現型的及び機能的に類似することを示唆した。

ＩＬＣ２の発達及び機能は、微環境においてＩＬ−３３の存在に強く依存する。原発性腫瘍と転移性腫瘍との間のＩＬ−３３の発現の差は、癌の進行におけるＩＬＣ２及びＩＬ−３３の関与を試験することを可能にした。ＩＬ−３３の相補性を有するまたは有しない、原発性（ＴＣ１）及び転移性（Ａ９）腫瘍におけるＩＬＣ２のレベルを比較した。転移性腫瘍対原発性またはＩＬ−３３を相補した新生物の非凝集性組織におけるＩＬＣ２計数の著しい減少が、見出された（図１４）。これらのデータは、ＩＬＣ２が腫瘍に対する癌免疫学的監視に関与したことを示唆した。これは、ＩＬ−３３の発現が腫瘍成長及び疾患の転移拡散を抑制することを実証する我々のインビボ研究によってさらに支持された。

ＩＬＣ２がインビボでの癌の免疫認識を支援する直接的な論証：癌の進行におけるＩＬＣ２及びＩＬ−３３の役割を試験するために、ＲＯＲα欠損（ＩＬＣ２を欠いている）及び野生型（ＷＴ）マウスにおけるＩＬ−３３の相補性を有する及び有しない転移性Ａ９腫瘍の進行を比較した。骨髄キメラが構築された。このために、致死的な放射線を浴びたＢ６．Ｐｅｐ３ｂ（ＣＤ４５．１）マウスが、４週齢の野生型またはＲＯＲα−／−（ＣＤ４５．２）マウスのいずれかから全骨髄（ＢＭ）細胞により再構築された。９週間後、移植の質が、末梢血中のＣＤ４５．１陽性細胞とＣＤ４５．２陽性細胞の比率を決定するこ
とによって評価され、ＣＤ４５．２を再増殖されたキメラにおける腫瘍が設置された。腫瘍を、１カ月間成長させた。Ａ９細胞へのＩＬ−３３遺伝子の安定したトランスフェクションは、ＩＬＣ２を欠いているマウスと比較して、野生型マウスにおける腫瘍成長速度を著しく抑制した（図１５）。リンパ節におけるフローサイトメトリーによって検出されたＩＬＣ２の割合は、ＲＯＲα−／−の割合と比較して、［Ａ９＋ＩＬ−３３−遺伝子］野生型動物において増加した（図１６）。これらの観察は、ＩＬ−３３が、腫瘍の進行を修正し、ＩＬＣ２がＲＯＲα−ＩＬ−３３−ＩＬＣ２軸を通して癌免疫学的監視に関与するという結論を支援することができることを実証した。

実施例２：免疫回避の調節因子
免疫系は、腫瘍細胞が染色体を変化させない限り、免疫学的に認識することができない形態に表現型のシフトを促し、悪性腫瘍をもたらす、腫瘍の発達を制限する。腫瘍における免疫回避についてのいくつかの機構があり、それらのうちの１つが、主要組織適合性クラスＩ遺伝子（ＭＨＣ−Ｉ）の下方制御であり、ヒトにおいてヒト白血球抗原（ＨＬＡ）として知られている。ＨＬＡクラスＩ分子の欠失は、腫瘍の攻撃性及び転移性の可能性と関連がある。胸部、腎臓、黒色腫、結腸直腸、頭頸部扁平上皮細胞、子宮頸部、及び前立腺癌を含む、いくつかのタイプの癌は、ＨＬＡの下方制御、不良な予後、及び疾患の転移性拡散の間の相関関係を示す。しかしながら、転移性遺伝子特徴は、腫瘍の悪性の可能性を定義するために、共に作用する遺伝子の組み合わせである。遺伝子発現の修正は、それらを免疫学的に認識可能にし、腫瘍の免疫回避を潜在的に停止し得る。

転移への腫瘍の移行の可能性のある調節因子を見つけることを目的として、ＴｗｏＣｏｌｏｕｒＡｇｉｌｅｎｔＭｉｃｒｏａｒｒａｙＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙを用いて、マウス肺及び前立腺癌の先行の非転移性及び転移性の細胞株の比較マイクロアレイプロファイリングが行われた。原発性腫瘍細胞株及びそれらの転移性誘導体の全ＲＮＡ試料が、マウス肺及び前立腺癌の両方から収集され、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＨｅａｌｔｈＮｅｔｗｏｒｋ（ＵＨＮ）マイクロアレイセンターに送られた。蛍光標識された試料は、平均連結規則に従って、ピアソンを中心とした距離メトリックを有する２方向の階層クラスタリングを用いて、１つのアレイ上でハイブリダイズされた。Ａｇｉｌｅｎｔチップからデータは、分析のためにＧｅｎｅｓｐｒｉｎｇｖ１１．０．１にインポートされ、推奨されたＡｇｉｌｅｎｔの空間トレンド除去Ｌｏｅｓｓ機能を用いて正規化した。可視化目的のために「プローブ当たり」平均を中心とした正規化を使用して、クラスタリングする場合に組織型間の差を可視化した。すべてのデータ分析は、ｌｏｇ２に変換したデータにおいて行われた。Ａｇｉｌｅｎｔ２８００５アレイ上に合計５５８２１のプローブがあった。次いで、データをフィルタ処理して、いずれかのチャネルにおいてもシグナルを示さなかったあらゆるプローブを除去した。強度分布の上位８０パーセンタイルのプローブを、今後の分析のためにプローブ数を４８７３１まで減少して、保持した。次に、正規化し、フィルタ処理した染料強度値を、８つの試料すべてにわたって平均化した。３７８９８のプローブは、さらなる分析のために利用可能であった。非転移性細胞株と転移性細胞株との間の遺伝子発現は、ｐ＜０．０５の複数の試験で補正された閾値を有するゼロに対してＴ検定を用いて比較された。５４０１のプローブが、有意であると見出された。遺伝子は、両方の腫瘍型の非転移性形態と転移性形態との間で２を超える倍率変化を示した場合、転移への腫瘍の進行の潜在的調節因子として示された。これは、プローブの数を１５７７まで制限した。

１５７７の著しく異なるプローブの一覧をさらに狭めるために、遺伝的オントロジー（ＧＯ）分析は、最も著しい影響を受けた遺伝子産物を判定するために、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ及びＹｕｋｅｔｉｅｌｅ超幾何学的補正検定統計を用いて行われた。遺伝子オントロジープロジェクトは、マウスゲノムデータベースを含む、いくつかの遺伝子データベースのコラボレーションである。ＧＯは、一般的な生物学的プロセス、細胞成分、及び分子機能
への関連性に関する遺伝子産物を記載する。ＧＯ分析を用いて、転移性（すなわち、ＭＨＣ−Ｉの喪失）細胞株と非転移性（すなわち、ＭＨＣ−Ｉを発現する）細胞株との間に最も特異的に調節する１０群の遺伝子が、同定された。具体的には、１０群の遺伝子産物は、細胞外マトリックスリモデリング遺伝子及び免疫反応に関与する遺伝子の例を含み、これらにより、マイクロアレイの結果に対する信頼を増加させ、転移及び免疫回避について示される遺伝子がこれらのオントロジーによってもたらされることが期待されるという見解を支持する（表２を参照のこと）。
表２：転移性細胞株と非転移性細胞株との間で最も著しく影響を受けた遺伝子産物。

原発性腫瘍のその転移性形態への移行のための調節因子を選択するために、１０個の最も影響を受けたＧＯＩＤを、インタラクトーム及び最新の文献源を用いて評価した。この評価から、マトリックスリモデリング（例えば、ＭＭＰ２、ＭＭ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１３）に関与する上方制御遺伝子ならびに下方制御した免疫及び炎症関連遺伝子の数を、同定した。多くの公知のインターフェロン（ＩＦＮ）誘導性遺伝子（例えば、ＩＲＦ１、ＩＲＦ５、ＩＲＦ７、ＩＲＦ９、ＩＦＩ２７、ＩＦＩ４４、ＰＳＭＢ８、ＰＳＭＢ９、ＩＦＩＴ２、ＩＦＩＴ１、Ｉｇｔｐ）、プロスタグランジン及びロイコトリエンファミリー（例えば、Ｐｔｇｆｒ、Ｐｔｇｉｒ、Ｐｔｇｒ１、Ｐｔｇｉｓ、Ｌｔｂ４ｒ１）、インターロイキン（ＩＬ）関連遺伝子（例えば、ＩＬ−１１ｒａ１、ＩＬ−１３ｒａ、ＩＬ１５、ＩＬ−３３）、腫瘍壊死因子及びカスパーゼファミリー（例えば、ＴＮＦｓｆ９、Ｃａｓｐ７、Ｃａｓｐ１２）、ならびに抗原処理及び提示をコードする遺伝子（例えば、Ｈ
２−Ｋ１、Ｈ２−ＤＭｂ１、Ｈ２−Ｑ５、Ｈ２−Ｑ６、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、Ｔａｐａｓｉｎ、ＬＭＰ２）があった。データは、原発性腫瘍の炎症性表現型が、ＭＨＣ−Ｉ関連遺伝子、及び転移性形態への移行においてＩＦＮシグナル伝達に関与する遺伝子と共に下方制御されたことを示した。２つの異なるタイプの新生物の発生時の身体上の異常の同様のパターンは、これらの遺伝子が同時調節された可能性があることを示唆した。

ＩＬ−３３及びＩＦＩ４４は、さらなる分析のために選択された。

選択された遺伝子のための発現レベルは、リアルタイム定量的逆転写酵素ポリメラーゼ鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって確認された。転移性／非転移性細胞株における遺伝子の異常発現は、腫瘍における免疫認識から免疫回避への移行の機構を特徴付け、理解するために手段を提供する。

インターロイキン３３（ＩＬ−３３）は、ＩＬ−１スーパーファミリーに属するサイトカインであり、炎症／免疫学的攻撃後に、宿主反応に影響を及ぼすことが知られている。ＩＬ−３３は、炎症性サイトカインとしてだけでなく、核因子としても作用する二重機能タンパク質である。核局在化及びヘテロクロマチンとの関連は、Ｎ末端ドメインによって媒介され、かつＩＬ−３３が、ＮＦ−κＢ錯体のｐ６５サブユニットの新規の転写調節因子として作用するのを可能にする。Ｃ末端ドメインは、ＳＴ２受容体と結合し、かつ極性Ｔｈ２細胞２２及びＩＬＣ２細胞からの２型サイトカインの生成を活性化するのに十分である。

インターフェロン誘導性タンパク質４４（ＩＦＩ４４）は、主に、免疫組織：単球、樹状細胞、ＮＫ細胞、Ｔ細胞（ＣＤ４＋）、Ｔ細胞（ＣＤ８＋）、Ｂリンパ芽球、によって発現される、４８ｋＤａの細胞質タンパク質である。ＩＦＩ４４ｃＤＮＡの過剰発現は、ＩＦＮ−αに応答しない細胞中でさえ、インビトロで抗増殖性状態を誘導する。ＩＦＩ４４は、完全なＧＴＰ結合部位を含む。観察は、ＩＦＩ４４が細胞内ＧＴＰに結合し、この枯渇は、細胞シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）のシグナル伝達を停止し、最終的には、細胞周期停止及びＩＦＩ４４の抗増殖活性をもたらす、機能的モデルを提案することを可能にする。

選択された遺伝子の可能性を検証するために、ＥｕｒｏｐｅａｎＢｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）からのヒト組織データが、最終的な遺伝子選択の前に、考慮された。ＩＬ−３３及びＩＦＩ４４は、良性または原発性腫瘍と比較した場合に、ヒト前立腺癌の転移性形態で減少することが確認された。両方の遺伝子は、遺伝子発現レベル及び／またはタンパク質レベルの間で一致しており、それは、転移に対して良好な予測子であり得ることを示す。

選択された遺伝子候補の同時調節：２つの異なる新生物の発生時の遺伝子発現プロファイルの同様のパターンは、これらの遺伝子が同時調節された可能性があることを示唆した。真核細胞において協調的に制御された遺伝子は、同じ化学シグナルによって活性化され、一連の制御要素を共有することが期待される。原発性ＴＣ１細胞及び転移性Ａ９細胞におけるＩＬ−３３、ＩＦＩ４４、Ｈ−２Ｋ１、及びＩＦＮγ遺伝子のプロモーター−エンハンサー領域が、配列決定され、Ｇｅｎｏｍａｔｉｘソフトウェア、ＥｕｋａｒｙｏｔｉｃＰｒｏｍｏｔｅｒＤａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｅｐｄ．ｖｉｔａｌ−ｉｔ．ｃｈ）、及びＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌＢｉｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒＤａｔａｂａｓｅ（ｗｗｗ．ｃｂｒｃ．ｊｐ）を用いて分析された。ＩＬ−３３、ＩＦＩ４４、Ｈ−２Ｋ１、及びＩＦＮｇ遺伝子のプロモーター−エンハンサー領域を整列させて、ＣＲＥＢ、ＡＰ−１、ＮＦ−ｋＢ、ＨＳＦ、ＡＭＬ−１ａ、ＲＯＲα、ＧＡＴＡを含む、一般的な転写因子について可能な結合部位を同定した（上の表１を参照のこと
）。

選択された遺伝子候補の相互作用：これらの遺伝子の相互作用を試験するために、転移性及び原発性腫瘍細胞株において、それぞれ、ＩＬ−３３及びＩＦＩ４４の過剰発現及びｓｉＲＮＡを標的とした下方制御を使用した。Ａ９細胞株におけるＩＦＩ４４の過剰発現が、未処理の細胞または空ベクターでトランスフェクトされた細胞と比較して、ＲＮＡ及びタンパク質レベルにおいてＩＬ３３の生成の上方制御をもたらすが、ＴＣ１細胞株におけるＩＦＩ４４の下方制御として、未処理のＴＣ１細胞または無関係なｓｉＲＮＡで処理されたＴＣ１細胞と比較して、ＩＦＩ４４及びＩＬ−３３遺伝子発現レベルの抑制をもたらすことを見出した。相互に、ＩＬ−３３遺伝子及びタンパク質の両方が、免疫回避研究モデルにおいてＩＦＩ４４を高めることが可能であった。興味深いことには、Ｈ−２Ｋ１欠失背景による動物からの脾細胞（ｓｐｌｅｅｎｏｃｙｔｅｓ）は、ＩＬ−３３発現の低下を示した。このことは、ＩＬ−３３及びＩＦＩ４４が、同時調節されるか、または癌の発生において同じシグナル伝達経路に関与する可能性があることを示唆している。

選択された遺伝子候補は、ＭＨＣクラスＩ−欠失腫瘍の免疫認識を補足するかどうかを判定するために試験された。具体的には：
●ＩＬ−３３、ＩＦＩ４４遺伝子は、ＭＨＣ欠失Ａ９マウス肺癌細胞における増加したＴＡＰ−１及びＨ２−Ｋｂの発現／シグナル伝達の一因となる（図２６）。
●ＩＬ−３３、ＩＦＩ４４遺伝子は、ＭＨＣ欠失Ａ９マウス肺癌細胞における増加したＴＡＰ−１及びＨ２−Ｋｂの発現／シグナル伝達の一因となる（図２７）。
●ＩＬ−３３−サイトカインは、ＭＨＣ欠失Ａ９マウス肺癌細胞における増加したＨ２−Ｋｂの発現／シグナル伝達の一因となる（図２８）。
●ＩＬ−３３、ＭＲ−１は、ＭＨＣ欠失Ａ９マウス肺癌細胞における増加したＨ２−Ｋｂの発現／シグナル伝達の一因となった（図２９）。
●ＭＨＣ−１及び選択された遺伝子候補は、それらの（遺伝子の）転移性の可能性を示す原発性腫瘍の転移性の再プログラミング中に同時調節されることが実証された。具体的には、図３０〜３２は、ＩＬ−３３、ＭＲ−１、またはＩＦＩ４４の下方制御がＨ２−Ｋｂの発現を減少することを示し、図３３及び３４は、Ｈ２−Ｋｂの下方制御が選択された遺伝子候補の発現を減少させたことを示す。

ＴＡＰ−１／ＭＨＣ−Ｉ欠失細胞株Ａ９におけるＴＡＰ−１及びＭＨＣ−Ｉの発現の候補遺伝子に誘導された増加がインビボでこれらの遺伝子の抗腫瘍効果の一因となり得るかどうかを試験するために、遺伝子相補性マウス研究が行われた。ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰを発現するベクター系（両方とも、＋及び−ＩＦＩ４４遺伝子）は、Ａ９及びＴＣ１細胞に安定にトランスフェクトされた。ＥＧＦＰは、構造的に発現され、緑色の腫瘍細胞を注入の初期部位を越える広がりに対して追跡することを可能にした。ＩＦＩ４４またはＩＬ−３３の発現は、Ａ９腫瘍形成を著しく抑制した（図３８〜４０）。Ａ９クローンを単独で注入されたマウスが、著しい体重減少という形での重度の臨床症状も患った一方で、ＩＬ−３３のＡ９＋ＩＦＩ４４が注入されたマウスは、そうではなかった（図４１）。加えて、ＩＬ−３３及びＩＦＩ４４遺伝子相補作用は、インビボで疾患の転移拡散を逆転させる（図４２及び４３、下の表３）。
表３：ＩＬ−３３及びＩＦＩ４４遺伝子相補作用は、遠位臓器への循環腫瘍細胞の転移拡散を抑制する。

腫瘍浸潤免疫細胞は、腫瘍成長の動力学に密接な関連がある。自然免疫（例えば、ＩＬＣ２、好中球、マクロファージ、好酸球）及び適応免疫（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞）の関与は、フローサイトメトリー及び免疫組織化学によって評価された。原発性（ＴＣ１）腫瘍、ＩＦＩ４４もしくはＩＬ−３３を発現するベクターまたは対照ベクターで遺伝子操作されている、転移性（Ａ９腫瘍）の免疫細胞計数については、図４４〜５０を参照のこと。

結論：
●ＩＬ３３及びＩＦＩ４４は、腫瘍成長速度、疾患の転移拡散、及びその重症度を低下させる癌細胞集団の転移の可能性に影響を及ぼす。
●腫瘍におけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の含量増加は、このＴＩＬのサブセットが保護的な抗腫瘍免疫を媒介し得ることを示唆した。
●転移性腫瘍対原発性または相補の新生物の非凝集性組織におけるＩＬＣ２計数の著しい減少は、ＩＬＣ２が腫瘍に対する免疫学的監視に関与することを示唆する。
Ｔｈ２免疫反応は、ＩＬ−３３−ＩＬＣ２軸を通して癌免疫学的監視に関与し得る。

実施例３：２型自然リンパ球細胞によって媒介された免疫防御は、概要の免疫回避をもたらす転移性癌において妨害される。
概要：原発性から転移性癌への移行は、ＩＬ−３３の発現の低下及び抗原処理機構（ＡＰＭ）の機能の喪失を特徴とする。転移性腫瘍におけるＩＬ−３３の発現の誘導は、ＡＰＭの機能を刺激し、腫瘍成長及び循環腫瘍細胞の数を減少させるが、Ｔｙｐｅ−２型自然リンパ球細胞（ＩＬＣ２）の頻度を増加させた。さらに、腫瘍は、ＩＬＣ２を欠いているマウスにおける成長速度を増加させた。さらに、臨床研究は、ＩＬ−３３の低い腫瘍発現を有する前立腺及び腎臓癌患者が、平均生存期間がより短いことを実証した。概して、ＩＬ−３３の発現の不在は、エフェクターＴ−リンパ球でははっきりしない腫瘍を示す、Ａ
ＰＭの機能性の低下、ならびに免疫回避及び癌転移を理解するための新しいパラダイムを提供するＩＬＣ２の誘導の失敗の両方をもたらした。

結果
ＩＬ−３３の発現は、悪性癌において減少する：転移性遺伝子特徴のネットワークに対処するために、比較マイクロアレイ分析は、ＴｗｏＣｏｌｏｕｒＡｇｉｌｅｎｔＭｉｃｒｏａｒｒａｙＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙを用いて、マウス肺及び前立腺癌の先行の非転移性及び転移性の細胞株において行われた。転移性／非転移性細胞株における遺伝子の異常発現は、腫瘍における免疫認識から免疫回避への移行の機構を特徴付け、理解するために手段を提供する。選択された遺伝子の翻訳の可能性を検証するために、主要なヒト組織データが、考慮された。遺伝子候補が、ヒト前立腺癌の転移性形態で減少することが確認された。具体的には、ＥｕｒｏｐｅａｎＢｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ（アクセス日：２０１３年１月３０日）によって作成されたＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｔｌａｓから得られたデータを用いて、対象となる遺伝子が、良性及び原発性前立腺腫瘍と比較して、転移性前立腺癌において下方制御されることが見出された。データの遺伝子発現レベル及び／またはタンパク質レベルの間で一致しており、それは、転移に対して良好な予測子であり得ることを示す。

炎症または免疫力の新規の態様に関与することが知られている遺伝子、抗原提示機構と相互作用し得る遺伝子、及びインターフェロン（ＩＦＮ）−シグナル伝達経路に関与し得る遺伝子が、さらなる研究のために選択された。具体的には、ある遺伝子、ＩＬ−３３は、転移性腫瘍における下方制御であることが見出され、ヘルパーＴ細胞及び自然免疫細胞の主要な誘導因子であるため、さらなる研究のために選択された。マイクロアレイデータに従って、ＩＬ−３３は、転移性マウス癌において３〜６倍下方制御される（図５９）。このことは、インビトロで増殖された細胞上の別々のｑＲＴ−ＰＣＲによって確認された。

前立腺癌を制限する際の免疫反応の関与、及び癌の再発を軽減する際の免疫療法のアプローチの潜在的効果は、依然として、広範に議論されている。ＶａｎｃｏｕｖｅｒＰｒｏｓｔａｔｅＣｅｎｔｒｅ（ＶＰＣ）で得られた前立腺癌の標本におけるＩＬ−３３の発現が、試験された。ｍＲＮＡレベルで、ＩＬ−３３の発現は、良性前立腺組織において、原発性腫瘍よりも高く（ｐ＜０．０００１；ｔ検定）、大規模コホートのＲＮＡシークエンシングデータにおける去勢耐性前立腺癌（ＣＲＰＣ）においてさらに減少し（図５２ａ）、このことは、疾患の進行との相関関係を示唆している。次に、ＩＬ−３３のタンパク質発現は、前立腺切除で得られた３４２個の前立腺癌の標本における免疫組織化学によって評価された（図５２ｂ）。注目すべきことには、低いＩＬ−３３の発現は、前立腺切除後の前立腺に特異的な抗原（ＰＳＡ）の再発（逆戻りのマーカー）までの還元時間と著しく関連した（ｐ＜０．０００１；Ｌｏｇｒａｎｋ試験）（図５２ｂ）。低い腫瘍ＩＬ−３３の発現を有する患者は、高い腫瘍ＩＬ−３３の発現を有する患者における９７カ月と比較して、５６．７カ月の再発までの平均時間を有した。この効果は、グレソンパターン３〜５の腫瘍間でのＩＬ−３３の発現の有意差があったため、グレソングレードに依存すると思われた。この臨床的関連性を確認するために、ＩＬ−３３の発現は、前立腺切除で得られた１３１個の前立腺癌の標本、及び１９個の転移性腫瘍（ＰＭＩＤ：２０５７９９４１）からの、独立した公的に入手可能なコホートのｍＲＮＡ発現データにおいてさらに詳査された。さらに、ＩＬ−３３は、疾患の進行により発現の低下を示し、ＩＬ−３３の下方制御は、ＰＳＡの再発までの時間の減少と著しく関連した（ｐ＝０．０１３；Ｌｏｇｒａｎｋ試験）（図５２ｃ）。概して、このデータは、前立腺癌細胞のＩＬ−３３の発現の軽減が、転移性疾患への進行と関連していることを示唆している。同様の傾向が、腎臓の腎細胞癌に罹患している患者において観察された（ＴｈｅＣａｎｃｅｒＧｅｎｏｍｅＡｔｌａｓのデータセットは、５１３症例から得られた（ｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅ
ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｉｈ．ｇｏｖ））。ＩＬ−３３の下方制御は、生存期間の減少と著しく関連し（図５２ｄ）、かつ低いＩＬ−３３の発現を有する患者は、より高い腫瘍ＩＬ−３３の発現を有する患者（８０．６２カ月）と比較して、平均生存期間が短かった（５２．０４カ月）。

ＩＬ−３３は、ＭＨＣ−Ｉ、転移性腫瘍の抗原処理及び免疫認識を補完する：ＴＡＰ−１／ＭＨＣ−Ｉの下方制御は、ヒトにおける急速な腫瘍の進行及び転移に対する主要な指標であることが示されており（Ｂｌａｄｅｓｅｔａｌ．，１９９５、Ｎａｏｅｅｔ
ａｌ．，２００２、Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，２００３）、したがって、ＴＡＰ−１／ＭＨＣ−Ｉの発現におけるＩＬ−３３の効果を精査することを望んだ。ＭＨＣ−Ｉの発現が大いに軽減した、ＴＡＰ−１欠失マウス肺癌細胞株（Ａ９）において、ＩＬ−３３（図６０）を過剰発現した。これらの細胞におけるＩＬ−３３の過剰発現は、ＴＡＰ−１及びＨ２−Ｋ１の両方の発現を増加した（図５３ａ、５３ｂ）。組換えＩＬ−３３タンパク質の添加はまた、ＤＮＡ依存性自然免疫シグナル伝達経路に依然として影響を及ぼさないＴＡＰ−１及びＨ２−Ｋ１の発現も上方制御する（図５３ｂ）。さらに、表面Ｈ２−Ｋ１の発現の増加が観察され、これは、ＩＬ−３３がこれらの細胞においてＭＨＣ−Ｉの発現を回復させるために抗原提示経路の上流に作用することを示唆した（図５３ｃ）。

ＩＬ−３３によって誘導された変化の機能性をさらに評価するために、ＩＬ−３３にトランスフェクトされ、ＩＬ−３３−サイトカインで処理されたＡ９細胞のＨ２−Ｋ１に制限されたオボアルブミンエピトープ（ＯＶＡ（２５７−２６４）；ＳＩＩＮＦＥＫＬ）を示す能力が評価された。可溶性ＯＶＡ（２５７−２６４）により細胞をインキュベーションした後に、処理済みのＡ９細胞を、ＯＶＡ（２５７−２６４）と関連して、Ｈ−２Ｋｂの認識によって活性化される、Ｔ細胞ハイブリドーマであるＢ３Ｚ細胞（Ｋａｒｔｔｕｎｅｎｅｔａｌ．，１９９２）で培養した。外因性ＩＬ−３３サイトカインで処理したＡ９細胞は、単独でＩＬ−３３遺伝子でトランスフェクトされたＡ９細胞よりもそれらの表面上でより高い数のＨ２−Ｋ１−ＯＶＡ（２５７−２６４）錯体を示すことができた。これにより、Ｂ３ＺＴ細胞プライミング及び活性化におけるより多くの能力をもたらした（図５３ｄ）。このことは、分泌されたサイトカインとしてＩＬ−３３の役割、及び核タンパク質としてのその役割を越える、その対応する細胞表面受容体に結合するＩＬ−３３によって引き起こされるシグナル伝達カスケードの重要性を強調し得る。これらのデータは、ＩＬ−３３がＭＨＣ−Ｉ欠失肺癌Ａ９の免疫認識を改善することを実証する。

さらに、ＩＬＣ２は、同時にインキュベートされた転移性前立腺腫瘍におけるＴＡＰ−１プロモーター転写を誘導することができ、これにより、ＩＬＣ２が腫瘍において抗原処理及び提示経路を直接誘導し得るという見解を支持する。別々の機構では、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞媒介された細胞毒性におけるＩＬＣ２の効果が、マウス前立腺モデル（ＬＭＤ）において研究された。ＩＬＣ２細胞が細胞毒性Ｔリンパ球の特異的なエフェクター機能であるグランザイムＢを上方制御し得ることが見出された。これは、ＩＬＣ２がＣＴＬエフェクター機能を促進することができることを示唆している。（図６１）。

悪性遺伝子発現プログラミングの調節：腫瘍免疫回避におけるＩＬ−３３の役割に取り組むために、ＩＬ−３３は、原発性腫瘍細胞（ＴＣ１）においてｓｉＲＮＡを用いて抑制された。ｓｉＲＮＡを７２〜９６時間処理した後、ＭＨＣ−Ｉの表面発現レベルが評価された。ＩＬ−３３の下方制御は、ＥＬＩＳＡ及び免疫ブロット分析によって確認された（図６２ａ）。ＩＬ−３３により誘導されたｓｉＲＮＡで処理したＴＣ１細胞は、対照よりもはるかに低い存在度のＨ２−Ｋ１錯体を有した（図６２ｂ）。ＩＬ−３３の発現におけるＭＨＣ−Ｉの下方制御の効果を精査するために、ＭＨＣ−Ｉに対して誘導されたｓｉＲＮＡ（図５６）が、原発性腫瘍細胞上で使用された。ＩＬ−３３は、ＴＣ１細胞株における免疫認識可能な表現型の発現には重要であると思われた。さらに、データは、ＭＨＣ−
Ｉ及びＩＬ−３３が転移におけるＩＬ−３３遺伝子の関与を示す原発性腫瘍の転移性再プログラミング中に同時調節され得ることを示唆した。

ＩＬ−３３遺伝子相補性は、インビボで転移を逆転させる：ＩＬ−３３欠失がより少ないＨ２−Ｋ１錯体をもたらすという所見は、これらの分子が原発性腫瘍の悪性形態への転移性形質転換中に同時に調節され得ることを示唆し、このことは、ＩＬ−３３の発現を抗原提示に結び付ける。ＴＡＰ−１／ＭＨＣ−Ｉ欠失細胞株Ａ９におけるＴＡＰ−１及びＭＨＣ−Ｉの発現のＩＬ−３３によって誘導された増加がインビボでＩＬ−３３−遺伝子の抗腫瘍効果の一因となり得るかどうかを試験するために、遺伝子相補性マウス研究が行われた。ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰを発現するベクター系（両方とも、＋及び−ＩＬ−３３遺伝子）は、Ａ９及びＴＣ１細胞に安定にトランスフェクトされた。ＥＧＦＰは、構造的に発現され、緑色の腫瘍細胞を注入の初期部位を越える広がりに対して追跡することを可能にした。

ＩＬ−３３の発現は、Ａ９腫瘍形成を著しく抑制した。Ａ９＋ＩＬ−３３細胞から増殖した腫瘍の平均体積は、Ａ９対照からの腫瘍の平均体積よりも約３０〜４５％低かったが、研究の持続期間にわたって、原発性ＴＣ１腫瘍と比較して、両方とも高かった（図５４ａ）。Ａ９クローンが注入されたマウスはまた、著しい体重減少の形態で重度の臨床所見に悩まされた。それ故に、研究の第２部中の対照転移性群において急速な体重減少が生じた。原発性腫瘍（ＴＣ１）及びＡ９＋ＩＬ−３３腫瘍を有する動物は、研究を通して体重を維持または増加した。隣接組織の出血がある腫瘍の潰瘍（ステージ４〜５）は、単独でＡ９が注入された群内でいくつかの症例において検出されたが、ＴＣ１またはＡ９＋ＩＬ−３３細胞が注入されたものについては検出されなかった。

腫瘍の発達の臨床経過において最も重要かつ好ましくない予後因子は、疾患の転移拡散である。したがって、肺癌において最も一般的な転移部の非凝集性組織における循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の出現が評価された：脳、肺、肝臓、副腎、リンパ節、及び血液組織。ＧＦＰ陽性腫瘍細胞の最高の割合は、Ａ９腫瘍を持つ動物の肝臓（約３２．０％）及び副腎（約１６．０％）で検出された。Ａ９腫瘍細胞によるＩＬ−３３の発現は、肝臓では約０．１５％、副腎では約２．６３％までＧＦＰ陽性細胞の平均数を減少させた（図５４ｂ、５４ｃ、５４ｄ）。単一の腫瘍細胞のみが、肺及び血液から検出されたが、脳試料はすべて、腫瘍が出現しなかった。ＣＴＣは、遠位部位に播種するようにプログラム化されていない、局所的増殖の可能性を有する皮下腫瘍（ＴＣ１）を持つ動物の試験された組織及び臓器のいずれにも検出されなかった（下の表）。
表４：ＩＬ−３３遺伝子相補作用は、遠位臓器への腫瘍細胞の転移拡散を抑制する。ＧＦＰ陽性循環腫瘍細胞は、初期皮下移植から遠位である部位から単離され、フローサイトメ
トリーを用いて評価された。各処理群における８匹の動物からの代表的な結果が、ここに示される。

まとめると、これらの観察は、ＩＬ−３３遺伝子相補が、悪性遺伝子発現のプログラミングを修正することができることを示唆している。結果として、ＩＬ−３３は、腫瘍成長速度、疾患の転移拡散、及びその重症度を低下させる、癌細胞集団の転移の可能性に影響を及ぼす可能性がある。

腫瘍浸潤免疫細胞：腫瘍浸潤免疫細胞は、腫瘍成長の動力学に密接な関連がある（ｄｅＬｅｅｕｗｅｔａｌ．，２０１５、Ｆｒｉｄｍａｎｅｔａｌ．，２０１２）。自然免疫（例えば、ＩＬＣ２、好中球、マクロファージ、好酸球）及び適応免疫（例えば、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞及びＦｏｘＰ３＋Ｔ制御細胞）の関与は、フローサイトメトリー及び免疫組織化学によって評価された。フローサイトメトリーを用いて、非凝集性Ａ９腫瘍組織におけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の割合は、いずれかの原発性ＴＣ１またはＡ９＋ＩＬ−３３腫瘍のいずれかから単離されたＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の割合よりも低かった（図６４）。腫瘍切片の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の免疫組織化学による可視化は、Ａ９単独と比較した場合に、ＩＬ−３３を発現する腫瘍内のＭＨＣ−Ｉ＋、ＣＤ８＋、及びＣＤ４＋陽性細胞に対して増加した染色度を示した。Ｂ３Ｚアッセイにおける細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によってこれまでに示されている上方制御された免疫認識（図５３）は、腫瘍内に見られるＣＤ４＋及びＣＤ８＋ＴＩＬの数とうまく一致した（図５５）。ＩＬ−３３を発現する腫瘍におけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度及び数の増加は、これらのＴＩＬがマウス肺癌における保護的な抗腫瘍免疫を媒介し得ることを示唆している。Ｔ細胞もまた、ＣＤ８の上方制御の発現への抗原刺激を必要とするという事実は、ＩＬ−３３によって誘導された変化がインビボでの転移性腫瘍のＴＡＰ−１／ＭＨＣ−Ｉ欠損を克服し、インビトロでの相補性実験からの結論を支持し得ることを示唆している。興味深いことには、悪性腫瘍の微環境は、腫瘍免疫耐性とも関連している、抑制Ｔ制御細胞マーカー（ＦｏｘＰ３＋）を示すＴＩＬを特徴とした。腫瘍によるＩＬ−３３の発現は、これらの免疫抑制細胞の蓄積を防ぐように思われた。さらに、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）及び好中球は、転移性Ａ９腫瘍と比較して、ＩＬ−３３を発現するＴＣ１及びＡ９＋ＩＬ−３３腫瘍においてより高い浸潤レベルを有することが見出された（図５５、上パネル）。好酸球は、転移性Ａ９腫瘍において、正常な組織に隣接した腫瘍末梢で見られ得るが、ＩＬ−３３の発現は、微環境を修正するように思われ、恐らく、ＩＬＣ２によるＩＬ−５の生成により、好酸球が腫瘍組織に流れ込み、抗腫瘍効果を発揮することを可能にする（図５５、下パネル）。これらの観察は、系におけるＩＬ−３３の存在が、癌における保護的な抗腫瘍免疫を媒介することを示唆している。

ＩＬＣ２の頻度は、ＩＬ−３３を発現する原発性腫瘍及び転移性腫瘍において上昇する：ＩＬＣ２の存在は、フローサイトメトリーを用いて、非凝集性腫瘍組織において検出された。ＩＬＣ２は、白血球系統の細胞表面マーカー（Ｌｉｎ：ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ１１ｃ、Ｇｒ−１、ＮＫ１．１、Ｔｅｒ１１９）を発現しなかった細胞として同定されたが、ＩＬ−３３受容体Ｔ１／ＳＴ２（ＳＴ２）鎖、ＩＬ−７受容体サブユニットＩＬ−７Ｒａ（ＣＤ１２７）、及びＴｈｙ１．２（ＣＤ９０．２）の細胞表面マーカー発現の異なるパターンを示した。Ｌｉｎ−ＳＴ２＋ＣＤ１２７＋ＣＤ９０．２＋細胞の集団は、リンパ球と同様に形質学的であることがさらに示された：細胞質に対して高い核の比率を有する形が丸みを帯びている。インビトロでの単離の際に、この細胞のサブセットは、胸腺間質リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）及びＩＬ−３３の組み合わせによる刺激後に、ＩＬ−５及びＩＬ−１３を成長させ、分泌することができた。これらのデータは、腫瘍において検出されたＬｉｎ−ＳＴ２＋ＣＤ１２７＋ＣＤ９０．２＋細胞の集団が、表現型及び機能的にＩＬＣ２であったことを示唆した。

ＩＬＣ２の発達及び機能は、微環境においてＩＬ−３３の存在に強く依存する。原発性腫瘍と転移性腫瘍との間のＩＬ−３３の発現の差は、癌の進行におけるＩＬＣ２及びＩＬ−３３の関与を試験することを可能にした。ＩＬ−３３の相補性を有するまたは有しない、原発性（ＴＣ１）及び転移性（Ａ９）腫瘍におけるＩＬＣ２のレベルが評価された。転移性腫瘍対原発性またはＩＬ−３３を相補した新生物の非凝集性組織におけるＩＬＣ２計数の著しい減少が、観察された（図５６）。これらのデータは、ＩＬＣ２が腫瘍に対する免疫学的監視に関与することを示唆した。これは、ＩＬ−３３の発現が腫瘍成長及び疾患の転移拡散を抑制したことを実証する上のデータによってさらに支持された（図５４、上の表）。

興味深いことには、ＩＬ−３３遺伝子相補性が、腫瘍細胞の増殖を減少したことも観察され（図６５）、このことは、免疫反応の不在下で、インビトロでのＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖におけるＩＬ−３３の二重機能を強調する最近の報告によって支持されている（Ｔｏｍｉｎａｇａら）。ＩＬ−３３が、Ｔｏｍｉｎａｇａらに従って、腫瘍細胞アポトーシスに影響を及ぼさなかったことがさらに見出された。データは、ＩＬ−３３が２つの別々の方法で腫瘍成長に影響を及ぼすことを示唆している：腫瘍細胞増殖を直接抑制することと、別々に、免疫反応を活性化すること。

ＩＬＣ２がインビボでの癌の免疫認識を支援する論証：癌の進行におけるＩＬＣ２及びＩＬ−３３の役割を直接試験するために、ＲＯＲα欠損（ＩＬＣ２を欠いている）及び野生型マウスにおけるＩＬ−３３の相補性を有する及び有しない転移性Ａ９腫瘍の進行の比較が行われた。ＲＯＲα−／−マウスは、ＮＫ細胞及びＩＬＣ３の正常数を有し、ＲＯＲα陽性前駆（ＣＨＩＬＰ）から発達しない（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｇｏｎｚａｌｅｚｅｔ
ａｌ．，２０１５）。ＩＬＣ２とは異なり、Ｔｈ１７細胞は、ＲＯＲα及びＲＯＲγを発現し、ＲＯＲα欠失は、ＲＯＲα−／−マウスにおけるＴｈ１７細胞への最小効果を示唆しているＲＯＲγによって補正され得る（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｇｏｎｚａｌｅｚｅｔ
ａｌ．，２０１５）。骨髄キメラは、４週齢の野生型またはＲＯＲα−／−（両方ともＣＤ４５．２）マウスのいずれかから全骨髄（ＢＭ）細胞による致死的な放射線を浴びたＢ６．Ｐｅｐ３ｂ（ＣＤ４５．１）マウスの再構成によって生成された。骨髄移植片受容者が、６週間回復することを可能にし、その後、９２％超の効率であったと判定された。次いで、Ａ９またはＡ９＋ＩＬ−３３細胞を皮下に注入し、成長させた。Ａ９細胞によるＩＬ−３３の発現は、ＩＬＣ２を欠いているマウスと比較して、野生型マウスにおける腫瘍成長速度を著しく抑制したことが観察された（図５７ａ）。リンパ節におけるＩＬＣ２の割合は、ＲＯＲα−／−キメラと比較して、Ａ９＋ＩＬ−３３野生型動物において増加した（図５７ｂ）が、適応免疫反応は、影響を受けなかった（図５７ｃ）。これらの観察は、ＩＬ−３３が、腫瘍の進行を修正し、ＩＬＣ２がＲＯＲα−ＩＬ−３３−ＩＬＣ２軸を通して癌免疫学的監視に関与するという結論を支援し得ることを実証した。

考察：この実施例では、マイクロアレイ分析は、前立腺及び肺癌の転移性遺伝子特徴を定義し始めるように行われた。具体的には、多機能のアラルミンＩＬ−３３は、原発性から転移性腫瘍への移行中、ヒト及びマウス癌における下方制御するように同定された。ＩＬ−３３は、炎症プロセスと関連することが知られており、ＩＬ−３３の発現が、自然及び適応免疫反応を促進するＩＬＣ２の両方の生成を通して、ならびに傍分泌及び自己分泌誘導を通して正常な上皮細胞または原発性腫瘍におけるＡＰＭの転写誘導によって、腫瘍の免疫認識を促進することをさらに実証した。相互に、ここでは、初めて、腫瘍の転移性移行中に生じる、免疫回避機構を記載され、それによって、ＩＬ−３３の下方制御が、その結果として、腫瘍におけるＡＰＭ活性の低下及びＩＬＣ２機能を助長しない、免疫回避を促進する２つの臨床事象をもたらす。

原発性及び転移性癌の腫瘍微環境内のＩＬ−３３レベルの差は、ＩＬＣ２の研究につな
がり、この発達及び機能性は、このシステムにおけるＩＬ−３３の発現に強く依存する。ＩＬＣ２の数の有意な減少は、転移性腫瘍対原発性またはＩＬ−３３を相補した新生物の非凝集性組織において観察された。これらのデータは、ＩＬＣ２が腫瘍に対する免疫学的監視に関与し、それ故に、癌の進行をＩＬＣ２の不在に関連付けることを示唆している。骨髄キメラマウスの生成は、腫瘍の進行の修正におけるＩＬＣ２の関与の機械的な詳細を研究することを可能にした。ＲＯＲα欠失マウスは、著しく少数のＩＬＣ２を有する。特に、このモデルでは、ＲＯＲα欠失は、リンパ節におけるＣＤ４及びＣＤ８細胞のレベルに影響を及ぼさず、自然及び適応リンパ球の生成のための経路が実際には異なることを示唆している。Ａ９細胞へのＩＬ−３３遺伝子の安定したトランスフェクションは、ＩＬＣ２を欠いているマウスと比較して、野生型マウスにおける腫瘍成長速度を著しく抑制したことが観察され、ＩＬＣ２がＲＯＲα−ＩＬＣ２経路を通して癌免疫学的監視に関与することを初めて実証した。ＲＯＲα−ＩＬ−３３を活性化したＩＬＣ２は、ＩＬ−５の産生を介した好酸球等の他の細胞を動員することによって、腫瘍排除における重要な役割を果たし得る。これらの観察及び最新の刊行物（Ｃａｒｒｅｔｅｒｏｅｔａｌ．，２０１５）の観点から、ＣＤ８＋Ｔ細胞の化学誘引を通して腫瘍拒絶への好酸球の役割における、癌免疫学的監視において非常に重要な欠けている関連付けが明らかになる。細胞機構モデルは、ＩＬＣ２の現行の知識と一致することが提案されている（図５８）（Ｃａｒｒｅｔｅｒｏｅｔａｌ．，２０１５、Ｄｒａｋｅｅｔａｌ．，２０１４、Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｇｏｎｚａｌｅｚｅｔａｌ．，２０１５、ＭｃＫｅｎｚｉｅｅｔａｌ．，２０１４）。注目に値する本研究の他の主要な所見は、ＩＬ−３３が転移性癌におけるＭＨＣ−Ｉ及び抗原処理の強い誘導因子であることである。腫瘍の出現が、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＴＡＡ−ＭＨＣ−Ｉ錯体との相互作用によって生成されるロバスト適用免疫反応によって制限される現行のパラダイム。免疫学的監視の本機構は、腫瘍細胞がＡＰＭの要素の発現の喪失及びその後の免疫回避の表現型への転換をもたらす染色体を変化するまで効率良く作用すると考えられる。ＩＬ−３３は、前立腺及び肺癌の免疫認識にとって重要であることが同定された。まとめると、データは、ＩＬ−３３が傍分泌及び／または自己分泌様式で作用して、ＡＰＭ遺伝子を誘導し、かつＩＬ−３３が正常な上皮及び原発性腫瘍から分泌されるが、転移性腫瘍において下方制御され、それによって、腫瘍が、ＡＰＭ機能に付随して軽減させることによって、ＣＴＬの認識を回避または妨害することを可能にすることを示唆する。ＭＨＣ１関連遺伝子の下方制御は、最終的に、転移性癌における免疫学的監視の減少をもたらす。その結果として、免疫学的に変化した表現型は、元の形態にわたって適応成長利点を有し、この成長は、免疫系によって妨げられた状態である。さらに、本研究は、腫瘍細胞とＩＬ−３３との相補作用は、抗原提示欠失を逆転させ得、続いて、免疫回避から免疫系によって認識されるものの腫瘍表現型をシフトすることを示す。ＩＬ−３３が、転移性癌におけるＭＨＣ−Ｉ及び内因性抗原処理を誘導するだけでなく、ＭＨＣ−Ｉ及びＩＬ−３３もまた、原発性マウス肺腫瘍の転移性再プログラミング中に同時調節されると思われ、ＩＬ−３３遺伝子の転移性の可能性を示す。多くの研究は、ＡＰＭの要素が下方制御される、ヒト癌の症例へのこれらの観察の関連性を支持する（Ａｌｉｍｏｎｔｉｅｔａｌ．，２０００ｂ、Ａｌｐａｎｅｔａｌ．，１９９６、Ｄｅｌｐｅｔａｌ．，２０００、Ｇａｂａｔｈｕｌｅｒｅｔａｌ．，１９９４、Ｈａｒｒｉｓｅｔａｌ．，１９９４、Ｊｏｈｎｓｅｎｅｔａｌ．，１９９９、Ｋａｋｌａｍａｎｉｓｅｔａｌ．，１９９５、Ｌａｎｋａｔ−Ｂｕｔｔｇｅｒｅｉｔａｎｄ
Ｔａｍｐｅ，２００２、Ｌｉｕｅｔａｌ．，１９９７、ＲｉｔｚａｎｄＳｅｌｉｇｅｒ，２００１、Ｓｅｌｉｇｅｒｅｔａｌ．，１９９７，２０００ａ、Ｓｅｌｉｇｅｒｅｔａｌ．，２０００ｂ、Ｖｉｔａｌｅｅｔａｌ．，１９９８）（Ａｌｉｍｏｎｔｉｅｔａｌ．，２０００ｂ、Ｇａｂａｔｈｕｌｅｒｅｔａｌ．，１９９４、Ｇｉｏｒｄａｅｔａｌ．，２００３、Ｋｏｒｋｏｌｏｐｏｕｌｏｕｅｔａｌ．，１９９６、Ｌｏｕｅｔａｌ．，２００８、Ｌｏｕｅｔａｌ．，２００５、Ｓｉｎｇａｌｅｔａｌ．，１９９６）。さらに、ヒト黒色腫における研究は、ＭＨＣ−
Ｉの下方制御と不良な予後との間の明らかな相関関係を示す（Ｔａｏｅｔａｌ．，
２００８）。加えて、腎癌（Ｋｉｔａｍｕｒａｅｔａｌ．，２００７）、結腸直腸癌（Ｗａｔｓｏｎｅｔａｌ．，２００６）、頭頸部扁平上皮細胞癌（Ａｎｄｒａｔｓｃｈｋｅｅｔａｌ．，２００３）、子宮頸癌（Ｍｅｈｔａｅｔａｌ．，２００８）、及び乳癌（Ｚｉａｅｔａｌ．，２００１）を含む、いくつかの他の種類の癌の研究は、同様に統計的に有意な関係を有する。別の研究は、タバコの煙が肺組織における抗原提示要素の発現を減少することを示した（Ｆｉｎｅｅｔａｌ．，２００２）。この興味深い観察は、喫煙と肺癌の回避の増加との間の直接関連付けを示し得る。

ヒト研究結果が、ＩＬ−３３の発現レベルが、原発性前立腺腫瘍のその転移性形態への移行を反映することを示唆している。前立腺全摘除術の標本における低いＩＬ−３３含有物が、高いＩＬ−３３の発現を有する標本と比較して、術後の再発までの著しく減少した時間と関連し、かつ、より高い腫瘍ＩＬ−３３の発現を有する患者（８０．６２カ月）と比較して、平均生存期間が短かった（５２．０４カ月）ことが、ｍＲＮＡ及びタンパク質発現レベルに基づいて実証された。データは、下方制御、または場合によっては、ヒト前立腺及び腎臓癌におけるＩＬ−３３の突然変異が、癌の早期再発を予測することを示す。それ故に、ＩＬ−３３は、先行研究があるバイオマーカーを提供することができない、前立腺癌における初めに同定された陽性免疫バイオマーカーになる。

転移性癌は、最終段階の疾患であると見なされ、ほんのわずかの患者のみが、この形態の疾患で生存するであろう。一般的な癌治療の適用における深刻な制限は、患者間の腫瘍における遺伝的及び表現型の異質性である。さらに、現行の免疫療法は、個体に特異的な腫瘍抗原に基づいて治療をカスタマイズする必要性、及び対応するＴＩＬにおける個体に特異的なＴ細胞受容体の発現に阻まれている（ＲｉｇａｍｏｎｔｉａｎｄＢｅｌｌｏｎｅ，２０１２、Ｓｌｏｖｉｎ，２０１５）。ＰＤ−１、ＰＤ−１Ｌ、またはＣＴＬＡ４治療に対する反応性等の、これらのパラメータ及びその他は、治療選択に影響を及ぼす。ここで、ＩＬ−３３が、転移性癌におけるＭＨＣ−Ｉ及び内因性抗原処理を誘導することが実証され、転移性癌細胞を認識することに関与する免疫学的監視の新しい戦力としてＩＬ−３３によって誘導されたＩＬＣ２を同定した。

材料及び方法：細胞株：
マウス前立腺癌モデル：ＰＡ及びＬＭＤ細胞株は、それぞれ、非転移性及び転移性前立腺癌のモデルとして使用された。ＰＡは、高い発現のＭＨＣ−Ｉを示すマウス前立腺再構成モデル系を用いた１２９／Ｓｖマウス由来の原発性マウス前立腺癌細胞株である。ＬＭＤは、ＰＡ細胞の直列輸送中に腎臓被膜から逃避し、転移した後に、転移性娘として出現するＰＡの転移性ＴＡＰ−及びＭＨＣ−Ｉ欠失誘導体である（Ｌｅｅｅｔａｌ．，２０００）。

マウス肺腫瘍モデル：ＴＣ１細胞株は、ヒトパピローマウイルス遺伝子Ｅ６／Ｅ７を持つ両種性レトロウイルスベクターＬＸＳＮ１６を用いて不死化され、続いて、活性化ヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ癌遺伝子を発現するｐＶＥＪＢプラスミドで形質転換された、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの原発性肺上皮細胞由来のマウス肺腫瘍モデルである。ＴＣ１細胞は、高い発現のＴＡＰ−１及びＭＨＣ−Ｉを示す。細胞株Ａ９は、ＴＣ１腫瘍細胞株に由来し、免疫付与／挑戦実験中にインビボでの免疫選択によってＭＨＣ−Ｉ（またはＨ２−Ｋ１）の自発的下方制御を示す（Ｓｍａｈｅｌら）。上の細胞株はすべて、１０％の加熱不活性化ウシ胎仔血清、２ｍＭｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、及び１０ｍＭＨＥＰＥＳを補充した、ダルベッコ改変イーグル培地において成長された。

両方の細胞系のマイクロアレイ分析：両方の癌細胞モデル系から精製されたｍＲＮＡ試料は、ｔｈｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＨｅａｌｔｈＣｅｎｔｒｅ（現在、ＴｈｅＰ
ｒｉｎｃｅｓｓＭａｒｇａｒｅｔＧｅｎｏｍｉｃｓＣｅｎｔｒｅと呼ばれる（Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ））のマイクロアレイセンターに送られ、ここで、合計５５８２１のプローブを用いて、２８００５Ｔｗｏ−ＣｏｌｏｒＡｇｉｌｅｎｔマイクロアレイにハイブリダイズされた。データ分析は、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇＧＸソフトウェア（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて行われた。

遺伝子発現構築物及びトランスフェクション：注記：トランスフェクトされていない細胞は、マイクロアレイ研究及びｓｉＲＮＡ研究のために使用された。

一過性クローン：選択されたマウスＩＬ−３３遺伝子のための完全長ｃＤＮＡを有する遺伝子発現構築物（ＮＭ＿００１１６４７２４．１）は、ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰベクター（ＣｌｏｎｔｅｃｈＬａｂ）を用いて生成された。ベクター構築物、すなわち、ベクター単独またはベクター＋ＩＬ−３３遺伝子のいずれかが、ＦｕＧｅｎｅ６トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、原発性ＴＣ−１細胞株及び先行免疫回避のＭＨＣ−Ｉ欠失細胞株Ａ９の両方にトランスフェクトされた。

安定したクローン：ＴＣ−１及びＡ９細胞は、インビトロで、ＦｕＧｅｎｅ６トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ−遺伝子構築物でトランスフェクトされた。トランスフェクションから４８時間後、ＧＦＰ陽性細胞は、安定な形質転換体を得るために、ＦＡＣＳ（ＢＤＡｒｉａＩＩ細胞分別機）によって分類された。培地中の選択及び拡大は、細胞は、最終的に、単一細胞クローンに分類される前に、２回繰り返された。安定にトランスフェクトされたクローンは、ＧＦＰ陽性細胞の集団からのフローサイトメトリーによって単離された。これらの安定にＧＦＰを発現する細胞は、すべてのマウス研究のために使用された。

ｓｉＲＮＡ研究：ＴＣ１細胞は、ＨｉＰｅｒＦｅｃｔトランスフェクション試薬（３０１７０４）を用いて、ＩＬ−３３（ＧＳ７７１２５）、Ｈ２−Ｋ１（ＧＳ１０２７４１６）、非標的ｓｉＲＮＡ（１０２２０７６）に対して標的されるｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたか、または未処理のままであった。すべての試薬は、Ｑｉａｇｅｎｅから購入した。ＩＬ−３３及びＨ２−Ｋ１の発現レベルは、７２〜９６時間で評価された。

ＲＴ−ＰＣＲ分析：全細胞ＲＮＡは、ＩｌｌｕｓｔｒａＲＮＡｓｐｉｎミニキット（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ）を用いて抽出された。１μｇの全細胞ＲＮＡの逆転写は、全体積２０μｌのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからの逆転写（ＲＴ）キット（ＳＳＩＩＲＴ）を用いて行われた。ｃＤＮＡの２マイクロリットルのアリコートを、１×ＰＣＲ緩衝液、２５０μＭのデオキシヌクレオチド三リン酸塩、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｎＭの各プライマー、及び２．５ＵＴａｑまたはＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含む合計５０μｌの反応混合物におけるＰＣＲ用の鋳型として使用した。ｃＤＮＡ増幅は、変性（１分、９５℃）、アニーリング（１分、５４〜６４℃）、及び伸長（２分、７２℃）の２５〜３５サイクルでＴ勾配サーモサイクラー（Ｂｉｏｍｅｔｒａ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において実施した。サイクルは、１０分間７２℃の最終伸長で終了した。２０マイクロリットルの増幅産物を、アガロースゲル上で分析し、臭化エチジウムで染色し、紫外線光下で写真撮影した。ＰＣＲ増幅のために使用されたプライマー（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）：
ＴＡＰ１
Ｆ：５’−ＴＧＧＣＴＣＧＴＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＡＡＡ−３’，
Ｒ：５’−ＴＣＡＧＴＣＴＧＣＡＧＧＡＧＣＣＧＣＡＡＧＡ−３’；
β−アクチン
Ｆ：５’−ＡＴＧＧＡＴＧＡＣＧＡＴＡＴＣＧＣＴＧＣ−３’，
Ｒ：５’−ＴＴＣＴＣＣＡＧＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴ−３’；
ＩＬ−３３
Ｆ：５’−ＡＧＧＡＡＧＡＧＡＴＣＣＴＴＧＣＴＴＧＧＣＡＧＴ−３’；
Ｒ：５’−ＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＴＣＴＴＣＣＣＡＴＣＣＡＣＡ−３’；
Ｈ２−Ｋ１
Ｆ：５’−ＣＡＣＧＣＴＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＴＴ−３’；
Ｒ：５’−ＴＴＣＡＣＧＣＴＡＧＡＧＡＡＴＧＡＧＧＧＴ−３’。

リアルタイム定量ＰＣＲ分析：精製したゲノムＤＮＡは、合計１０μｌの反応混合物において、２００〜５００ｎＭの各プライマー及び１μｌのＳＹＢＲＧｒｅｅｎＴａｑ
ＲｅａｄｙＭｉｘ（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて増幅用の鋳型として使用した。変性（５秒、９５℃）、アニーリング（５秒、６１〜６３℃）、及び伸長（２０秒、７２℃）の３５〜４０サイクルは、ＲｏｃｈｅＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０装置を用いて実施した。

ウェスタンブロット：ＲＩＰＡＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒＳｙｓｔｅｍ（ｓｃ−２４９４８，ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）は、細胞及び組織からのタンパク質単離のために使用した。ゲノムＤＮＡをせん断するために、溶解した試料を、２１ゲージ針を通して１０回通過させ、次いで、氷上で３０分間インキュベートした。ホモジネートを、４℃で、１４０００×ｇで１０分間遠心分離した。上清からのタンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって決定され、試料を、１レーン当たり５０μｇの最終濃度まで調節した。タンパク質は、１０％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移した。ブロットは、リン酸緩衝生理食塩水中で５％脱脂乳で遮断し、抗ＩＬ−３３［Ｎｅｓｓｙ−１］（ａｂ５４３８５，Ａｂｃａｍ）マウスモノクローナル抗体、エクソン８によってコードされたＨ２−Ｋ１の領域に向けて進められたマウス抗血清（Ｗｉｌｌｉａｍｓ博士（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｏｒｏｎｔｏ）によって好意的に提供）、ウサギ抗マウスＴＡＰ−１プロクローナル抗体（Ｊｅｆｆｅｒｉｅｓの実験室によって社内で作製（Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，２００７））を用いて、４℃で一晩インキュベートし、続いて、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にコンジュゲートされた一次抗体の種に優遇された、二次抗体でインキュベートした。

Ｂ３Ｚアッセイ：Ｂ３ＺＴ細胞は、インターロイキン２プロモーター（ＳｈａｓｔｒｉａｎｄＧｏｎｚａｌｅｚ，１９９３）からの活性化されたＴ細胞の要素の核因子によって動かされるｂ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）構築物を運搬することに加えて、Ｈ２−Ｋ１との関連において、ＯＶＡ（２５７−２６４）（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）を特異的に認識するＴＣＲを発現する。遺伝子操作されている腫瘍細胞を、洗浄し、１：１の細胞比で、ＯＶＡ（２５７−２６４）と関連して、Ｈ２−Ｋ１の認識によって活性化される、Ｔ細胞ハイブリドーマであるＢ３ＺＴ細胞で一晩インキュベートする前に、１０ｕｇ／ｍｌの濃度のＯＶＡ（２５７−２６４）で１６時間インキュベートした。クロロフェノールレッド−β−ガラクトピラノシド（ＣＰＲＧ）、ｂ−ガラクトシダーゼ基質を使用して、Ｂ３ＺＴ細胞からの全培養溶解物中のＬａｃＺの活性をアッセイした。培養ウェルの吸光度（５６０ｎｍ）を、４時間のインキュベーション後に読み込んだ。

ＣＤ８＋Ｔ細胞単離及びＩＬＣ２による同時培養：膵臓ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＮｅｇａｔｉｖｅＳｅｌｅｃｔｉｏｎＥａｓｙＳｅｐＣＤ８＋Ｔ細胞濃縮キット（１９７５３，ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｈｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＯＴ−１マウスから単離した。ＯＴ−１マウスから単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｈ２−Ｋ１との関連において、ＯＶＡ（２５７−２６４）（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）を特異的に認識するＴＣＲを発現する。ＣＤ８＋ＤＣは、「ＣＤ８＋樹状細胞単離キットマウス」（１３０−０９１−１６９，Ｍｉ
ｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．）を用いて、Ｂ／６マウスから単離した。転移性前立腺腫瘍細胞（ＬＭＤ＋ｐＴＡＰ１／ＧＦＰ、２×１０４細胞／ウェル）を、９６ウェルプレート中でＩＬＣ２（１×１０４）を用いて及びそれを用いずに培養した。４８時間後、細胞を、１０ｕｇ／ｍｌの濃度のＯＶＡ（２５７−２６４）ペプチドで約４時間パルスした後に、新たに単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞（２×１０４または４×１０４細胞／ウェル）及びＣＤ８＋ＤＣと一緒に用いて４日間インキュベーションした。

抗体、試薬、ＦＡＣＳ分類、及び分析
骨髄移植後のマウスにおけるキメラ現象について確認するためのフローサイトメトリー用に使用された抗体：ＦＩＴＣコンジュゲートＣＤ４５．１（１１−０４５３−８１，＃Ａ−２０）及びＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲートＣＤ４５．２（４５−０４５４−８０，＃１０４）は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。

Ｆｃ受容体を遮断するために使用された抗体：ＣＤ１６／３２（５６４２２０，ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ）

フローサイトメトリーから生き残れない細胞を含まない：ＦｉｘａｂｌｅＶｉａｂｉｌｉｔｙＤｙｅｅＦｌｕｏｒ７８０（６５−０８６５−１４，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）

ＩＬＣ２単離：以下の抗体は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。ＣＤ３、ＣＤ８ａ、ＴＣＲｂ、ＣＤ１９、Ｂ２２０、ＮＫ１．１、Ｍａｃ−１、ＧＲ−１、及びＴｅｒ１１９に対するＦＩＴＣコンジュゲート系統マーカーモノクローナル抗体；ＣＤ１２７に対するフィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート抗体；ＳＴ２に対するＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲート抗体；Ｔｈｙ１．２に対するＢＶ６００ＡｍＣｙａｎコンジュゲート抗体。

ＣＤ４、ＣＤ８染色：ＣＤ４に対するＡＰＣコンジュゲート抗体（５５３０５１，ＲＭ４−５，ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＣＤ８ａに対するＰＥ−Ｃｙ７コンジュゲート抗体（２５−００８１−８２，５３−６．７，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。

Ｈ２−Ｋ１の発現：ＰＥコンジュゲート抗Ｋｂマウスモノクローナル抗体（５５３５７０，ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ）。

グランザイムｂの発現：ＣＤ８ａに対するＡＰＣコンジュゲート抗体（４７−００８１−８０）、固化及び透過化緩衝液キット（８８−８８２３−８８）、グランザイムｂに対するＰＥコンジュゲート抗体（１２−８８９８−８０）。すべての試薬は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。

フローサイトメトリー：ＢＤＦＡＣＳＡｒｉａＩＩは、細胞分類及び表現型の分析のために使用した。プログラムＦｌｏｗＪｏｖ．８．６は、データ分析のために使用した。

マウス：Ｃ５７ＢＬ／６及びＣ５７Ｂｌ／６．Ｐｅｐ３ｂマウスは、ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、ＢｒｉｔｉｓｈＣｏｌｕｍｂｉａＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｒｅ（ＢＣＣＲＣ）無菌動物施設において維持された。ＲＯＲα−／−（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｒｏｒａｓｇ−３Ｊ／Ｊ）マウスは、ＢＣＣＲＣでＦｕｍｉｏＴａｋｅｉによって作製され、ＢＣＣＲＣで維持された。マウスは、４〜８週齢で使用された。これらの実験は、ＡｎｉｍａｌＣａｒｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅｏｆｔｈｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＢｒｉｔｉｓｈＣｏｌｕｍｂｉａによって
承認された。動物は、ＣａｎａｄｉａｎＣｏｕｎｃｉｌｏｎＡｎｉｍａｌＣａｒｅのガイドラインに従って、人道的な条件下で、維持され、殺処分された。

ＢＭＴ及び腫瘍構築：Ｂ６．Ｐｅｐ３ｂ（Ｂ６．ＳＪＬ−ＰｔｐｒｃａＰｅｐｃｂ／ＢｏｙＪ）マウスは、致死的な放射線を浴びさせられ（１，０００Ｒａｄ）、４週齢の野生型またはＲＯＲα−／−（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｒｏｒａｓｇ−３Ｊ／Ｊ）マウスからの１０７個の全骨髄細胞の移植を受容した。マウスは、シプロフロキサシンを４週間与えられた。ＢＭ移植の質は、末梢血中のＣＤ４５．１陽性細胞とＣＤ４５．２陽性細胞の比率を決定することによって、８〜１６週間後に、ＦＡＣＳによって分析された。遺伝子操作されている腫瘍細胞（５０μｌの５×１０５）を、キメラ動物に皮下注入した。腫瘍成長は、キャリパーを用いた腫瘍寸法を測定することによってモニタリングされた。腫瘍の長さ及び幅測定値は、毎週３回得られた。腫瘍体積は、腫瘍体積の方程式＝長さ×幅×高さ×π／６（長さ（ｍｍ）は腫瘍の長軸である）に従って計算された。動物は、腫瘍測定の際に体重を量った。

原発性白血球の調製：細胞懸濁液を、腫瘍及びリンパ節から調製した（Ｈａｌｉｍｅｔａｌ．，２０１２）。組織を、剃刀で小塊に切断し、ＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン及びストレプトマイシン（Ｐ＋Ｓ）、５０ｍＭ２−メルカプトエタノール（２ＭＥ）、コラゲナーゼＩＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びＤＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）中で、３７℃で４０分間消化させた。消化した組織を、７０μｍ濾過器を通して濾過し、続いて、白血球のＰｅｒｃｏｌｌ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）勾配濃縮を行った。

ＩＬＣ２細胞の単離：単一細胞を、Ｆｃ受容体を遮断するために、２．４Ｇ２でインキュベートした。ＦＩＴＣコンジュゲート系マーカーｍＡｂ（ＣＤ３、ＣＤ８ａ、ＴＣＲｂ、ＣＤ１９、Ｂ２２０、ＮＫ１．１、Ｍａｃ−１、ＧＲ−１、及びＴｅｒ１１９）で染色した後、ＰＥコンジュゲートＣＤ１２７、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲートＳＴ２、ＢＶ６００ＡｍＣｙａｎコンジュゲートＴｈｙ１．２細胞を、ＦＡＣＳによって精製／分類した。

サイトカイン産生アッセイ：フローサイトメトリーで精製した細胞を、１０％ＦＢＳ、Ｐ＋Ｓ、及び２ＭＥを含む２００ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０培地中で、３７Ｃで培養した。細胞を、ＴＳＬＰ（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−３３（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。ＩＬ−５、ＩＬ−１３の分泌を、製造業者のプロトコルに従って、（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって評価した。

ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、製造業者のプロトコルに従って、行われた：ＩＬ−３３Ｒｅａｄｙ−Ｓｅｔ−ｇｏＥＬＩＳＡキット（８８−７３３３−８８，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））、ＩＬ−５Ｒｅａｄｙ−Ｓｅｔ−ｇｏＥＬＩＳＡキット（８８−７０５４−２２，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＩＬ−１３Ｒｅａｄｙ−Ｓｅｔ−ｇｏＥＬＩＳＡキット（８８−７１３７−８８；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。

免疫組織化学：腫瘍を、ドライアイス上のＴｉｓｓｕｅ−ＴｅｋＯ．Ｃ．Ｔ培地（Ｓａｋｕｒａ）中に包埋し、切片化するまで−８０℃で直ちに保存した。厚さ１０μｍの切片は、Ｌｅｉｃａ低温保持装置上に収集し、染色まで−８０℃で保存した。スライドを−８０℃から取り出し、冷アセトンまたはアセトン：メタノール中で固定した。ＴＢＳ中で洗浄した後、スライドをタンパク質ブロックでインキュベートし、その後、特異抗体で一晩インキュベートした。使用した抗体：抗ＣＤ４（５５３０４３，ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ＣＤ８（５５３０２７，ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ＭＨＣＩ（１５６８１，Ａｂｃａｍ）、抗ＦｏｘＰ３（５４５０１，Ａｂｃａｍ）、抗Ｌｙ−６Ｇ（ＭＡ
Ｂ１０３７，Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍ）、抗ＣＤ６８（５３４４４，Ａｂｃａｍ）。適切な西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート二次抗体を、一次抗体の検出のために使用し、ＤＡＢ色素原で発色させた。スライドを、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で対比染色し、エタノール及びキシレン中で脱水した。次いで、スライドにカバーガラスを載せ、２０倍の倍率でＡｐｅｒｉｏＳｃａｎＳｃｏｐｅを用いて画像化した。

ヒト前立腺試料：
ｍＲＮＡシークエンシングコホート：ＶａｎｃｏｕｖｅｒＰｒｏｓｔａｔｅＣｅｎｔｒｅからのＲＮＡシークエンシングデータを得、これまでに記載された（ＰＭＩＤ：２５１５５５１５）と全く同じように分析した。（ＰＭＩＤ：２０５７９９４１）からの公開データを、ｃＢｉｏＰｏｒｔａｌ（ＰＭＩＤ：２２５８８８７７）を用いて探求した。

免疫組織化学：免疫組織化学的染色は、酵素標識ビオチンストレプトアビジンシステム、及び１／５０濃度のウサギポリクローナルＩＬ−３３抗体（ＨＰＡ０２４４２６Ｓｉｇｍａ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた溶媒耐性ＤＡＢＭａｐキットを用いた、Ｖｅｎｔａｎａ自動染色機モデルＤｉｓｃｏｖｅｒＸＴ（ＶｅｎｔａｎａＭｅｄｉｃａｌＳｙｓｔｅｍ，Ｔｕｓｃａｎ，Ａｒｉｚｏｎａ）を用いて、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ
ＰｒｏｓｔａｔｅＣｅｎｔｒｅで実施した。染色は、ＶａｎｃｏｕｖｅｒＰｒｏｓｔａｔｅＣｅｎｔｒｅから得られた３４２の前立腺癌標本において行われた。Ｈ＆Ｅスライドは、精査し、所望の領域は、それら及びそれらの対応するパラフィンブロックに印を付けた。５つのＴＭＡを、各試料に対して１ｍｍの重複コアに穴を開けることによって手動で構成した（ＢｅｅｃｈｅｒＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＭＤ，ＵＳＡ）。染色したスライドを、２０倍に相当する倍率で、ＳＬ８０１オートローダー及びＬｅｉｃａＳＣＮ４００走査システム（ＬｅｉｃａＭｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）でデジタル化した。代表的なコア（明らかに陽性、明らかに陰性、及び陽性／陰性の混合）を、経験豊富な病理学者（ＬＦ）によって手動で同定し、４ポイントスケールを以下の通りに割り当てた：０は、いかなる腫瘍細胞においても染色がないことを示す、１は、淡いもしくは病巣のある、または疑わしい染色の存在を示す、２及び３は、細胞の大部分において説得力の強い染色を示す。比較のために、０または１のスコアは、低いＩＬ−３３の発現があると見なされた。

統計学：データをＥｘｃｅｌで分析した。スチューデントｔ検定は、群間の統計学的な差異を決定するために使用した、ｐ≦０．０５は、有意であると見なされた。マイクロアレイ結果の統計学的分析は、ＦｌｅｘＡｒｒａｙ（ＧｅｎｏｍｅＱｕｅｂｅｃ）を用いて実施した。

実施例４：癌に対する免疫療法として２型自然リンパ球の養子移入
現行の免疫療法アプローチは、主に、免疫抑制を抑制及び／または免疫活性化を促進する戦略に基づいている。異なるアプローチの組み合わせは、永続的な臨床反応をもたらす、異なるステップの癌免疫サイクルに影響を及ぼし得る。腫瘍特異的な免疫反応（抗原依存性因子）の活性化と共に、抑制腫瘍微環境（抗原非依存性因子）の改変を組み合わせることを目的として、インビトロで活性化したＩＬＣ２細胞の養子移入を実施した。

局所微環境等の抗原非依存性因子が、ケモカイン及びサイトカイン関連シグナル伝達経路を介して腫瘍組織における調節プロセスに影響を及ぼし、腫瘍組織ネットワークの文脈特異的な生物学的機能を強調することができることが概ね認められている。組織損傷に対する迅速な応答のうちの１つが、局所微環境の必要性に対する免疫反応を修正することができる、自然リンパ群の細胞（ＩＬＣ）である。２つのＩＬＣのサブセットは、群１ＩＬＣ（ＩＬＣ１；ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）１７及び群３ＩＬＣ（ＩＬＣ３）を含む、腫瘍免疫に関与している。腫瘍免疫学的監視における群２ＩＬＣ（ＩＬＣ２）の
役割は、間接的な関連性が暗に示されているが、依然として確立されていない。

ここで、ＩＬＣ２を遺伝的に欠いているマウスが、腫瘍成長速度を著しく増加したことが報告されている。また、腫瘍特異的な免疫反応を強化するＭＨＣ１の発現を上方制御することができる、ＩＬＣ２の養子移入が高いＩＬ−３３の含量を有する腫瘍の成長を完全に無効にすることも実証する。それ故に、内因性Ｔ細胞プールの有効性に影響を及ぼす抗原非依存性因子が、癌免疫サイクルの後のステップで腫瘍特異的な認識を増強する戦略と組み合わせて非常に重要となる。我々のデータは、ＩＬＣ２が腫瘍免疫学的監視を媒介し、かつ、ＩＬＣ２の養子移入が癌の根絶に役立つ新規の免疫療法アプローチであるという結論を支持する。

ＩＬＣファミリーは、再配置された抗原特異的な受容体の不在によって、表現型的に特徴付けられる、細胞のサイトカイン産生群である。しかしながら、ＩＬＣはすべて、ＩＬＣの発達及び機能におけるγｃ依存性サイトカインの重要性を示す、γｃ−サブユニットのサイトカイン受容体を発現する。ＩＬＣは、現在、３つの主な群に分割され、それらが産生するサイトカインによって定義される。表面発現分子の変動は、異なるＩＬＣサブユニット、活性化期、及び元の組織を示す。ここでは、群２ＩＬＣ（ＩＬＣ２）に関連する。この細胞型は、いくつかのリンパ及び造血マーカーを発現する系統陰性細胞集団としてフローサイトメトリーによって精製され得る：リンパ前駆細胞マーカーＩＬ７Ｒａ（ＣＤ１２７）、ＩＬ２Ｒａ（ＣＤ２５）、ＩＬ１７ＢＲ（ＩＬ２５Ｒのサブセット）、ＩＬ−３３受容体Ｔ１／ＳＴ２鎖、Ｔｈｙ１．２（ＣＤ９０．２）、幹細胞抗原１（Ｓｃａ１）、ＣＤ４５、ｃ−ｋｉｔ（ＣＤ１１７）。単離された細胞集団は、ＩＬ−３３、及び２型サイトカイン（ＩＬ−５及びＩＬ−１３）を産生するＴＳＬＰによる処置に応答し、自然ヘルパー細胞であると見なされる。ＩＬ−１３は、微環境及び標的特異的な細胞に応じて、炎症性及び抗炎症性メディエータとして作用し得る。それ故に、Ｉｌ−１３は、単球によってサイトカイン産生を抑制し、ＭＤＳＣによってＴＧＦ−ｂの分泌を活性化し、選択的に活性化した表現型を得るために１２３のマクロファージを増進させることができる。他方では、ＩＬＣ２によるＩＬ−１３の分泌は、Ｔ細胞プライミング及び活性化が行われる、流入領域リンパ節への活性化した樹状細胞（ＤＣ）の遊走にとって重要である。さらに、腫瘍の発達の初期段階でのＩＬ−１３の分泌は、上皮細胞、結果として生じる好酸球の動員によって、好酸球化学誘引物質エオタキシンの産生を促進することができる。免疫反応の部位への到着時に、好酸球は、活性化及び生存のためにＩＬ−５を必要とし、これはまた、ＩＬＣ２１１によって分泌される。好酸球は、腫瘍部位へのＴ細胞の追跡を可能にする、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ５（ＳＴＡＴ１を介して）、またはＣＣＬ１７、ＣＣＬ２２（ＳＴＡＴ６を介して）等のＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の化学誘引物質の分泌を通して腫瘍拒絶を促進する。さらに、ＩＬＣ２は、それらの細胞表面上に発現する、ＭＨＣ−ＩＩ分子を介した細胞間の接触を通して適応免疫反応に影響を及ぼすことができる。ここでは、活性化したＩＬＣ２の養子移入が、原発性マウス肺癌の完全な成長停止をもたらし、作用の可能な機構を提案することを実証している。

材料及び方法
細胞株
マウス前立腺癌モデル：ＰＡ及びＬＭＤ細胞株は、それぞれ、非転移性及び転移性前立腺癌のモデルとして使用された。ＰＡは、高い発現のＭＨＣ−Ｉを示すマウス前立腺再構成モデル系を用いた１２９／Ｓｖマウス由来の原発性マウス前立腺癌細胞株である。ＬＭＤは、ＰＡ細胞の直列輸送中に腎臓被膜から逃避し、転移した後に、転移性娘として出現するＰＡの転移性ＴＡＰ−及びＭＨＣ−Ｉ欠失誘導体である（Ｌｅｅｅｔａｌ．，２０００）。ｐＴＡＰ−１−ＥＧＦＰで安定にトランスフェクトされたＬＭＤ細胞（Ｓｅｔｉａｄｉ２００５）は、ＴＡＰ欠失ＬＭＤ細胞中のＴＡＰ−１プロモーターの活性化差異の根底にある機構を研究するために使用した。

ウェスタンブロット：ＲＩＰＡＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒＳｙｓｔｅｍ（ｓｃ−２４９４８，ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）は、細胞及び組織からのタンパク質単離のために使用した。ゲノムＤＮＡをせん断するために、溶解した試料を、２１ゲージ針を通して１０回通過させ、次いで、氷上で３０分間インキュベートした。ホモジネートを、４℃で、１４０００×ｇで１０分間遠心分離した。上清からのタンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって決定され、試料を、１レーン当たり５０μｇの最終濃度まで調節した。タンパク質は、１０％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移した。ブロットは、リン酸緩衝生理食塩水中で５％脱脂乳で遮断し、抗ＩＬ−３３［Ｎｅｓｓｙ−１］（ａｂ５４３８５，Ａｂｃａｍ）マウスモノクローナル抗体、エクソン８によってコードされたＨ２−Ｋ１の領域に向けて進められたマウス抗血清（Ｗｉｌｌｉａｍ
ｓ博士（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｏｒｏｎｔｏ）によって好意的に提供）、ウサギ抗マウスＴＡＰ−１プロクローナル抗体（Ｊｅｆｆｅｒｉｅｓの実験室によって社内で作製（Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，２００７））を用いて、４℃で一晩インキュベートし、続いて、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にコンジュゲートされた一次抗体の種に優遇された、二次抗体でインキュベートした。

ＣＤ８＋Ｔ細胞単離及びＩＬＣ２による同時培養：膵臓ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＮｅｇａｔｉｖｅＳｅｌｅｃｔｉｏｎＥａｓｙＳｅｐＣＤ８＋Ｔ細胞濃縮キット（１９７５３，ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｈｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＯＴ−１マウスから単離した。ＯＴ−１マウスから単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｈ２−Ｋ１との関連において、ＯＶＡ（２５７−２６４）（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）を特異的に認識するＴＣＲを発現する。ＣＤ８＋ＤＣは、「ＣＤ８＋樹状細胞単離キットマウス」（１３０−０９１−１６９，ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．）を用いて、Ｂ／６マウスから単離した。転移性前立腺腫瘍細胞（ＬＭＤ＋ｐＴＡＰ１／ＧＦＰ、２×１０４細胞／ウェル）を、９６ウェルプレート中でＩＬＣ２（１×１０^４）を用いて及びそれを用いずに培養した。４８時間後、細胞を、１０ｕｇ／ｍｌの濃度のＯＶＡ（２５７−２６４）ペプチドで約４時間パルスした後に、新たに単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞（２×１０^４または４×１０^４細胞／ウェル）及びＣＤ８＋ＤＣと一緒に用いて４日間インキュベーションした。

抗体、試薬、ＦＡＣＳ分類、及び分析：骨髄移植後のマウスにおけるキメラ現象について確認するためのフローサイトメトリー用に使用された抗体：ＦＩＴＣコンジュゲートＣＤ４５．１（１１−０４５３−８１，＃Ａ−２０）及びＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲートＣＤ４５．２（４５−０４５４−８０，＃１０４）は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した；Ｆｃ受容体を遮断するために使用された抗体：ＣＤ１６／３２（５６４２２０，ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ）フローサイトメトリーから生き残れない細胞を含まない：ＦｉｘａｂｌｅＶｉａｂｉｌｉｔｙＤｙｅｅＦｌｕｏｒ７８０（６５−０８６５−１４，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。

Ｈ２−Ｋ１の発現：ＰＥコンジュゲート抗Ｋｂマウスモノクローナル抗体（５５３５７０，ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ）。５．２．５．６グランザイムｂの発現：ＣＤ８ａに対するＡＰＣコンジュゲート抗体（４７−００８１−８０）、固化及び透過化緩衝液キット（８８−８８２３−８８）、グランザイムｂに対するＰＥコンジュゲート抗体（１２−８８９８−８０）。すべての試薬は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。５．２．５．７フローサイトメトリー：ＢＤＦＡＣＳＡｒｉａＩＩは、細胞分類及び表現型の分析のために使用した。プログラムＦｌｏｗＪｏｖ．８．６は、データ分析のために使用した。

マウス：Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、ＢｒｉｔｉｓｈＣｏｌｕｍｂｉａＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔ
ｒｅ（ＢＣＣＲＣ）無菌動物施設において維持された。マウスは、４〜８週齢で使用された。

腫瘍構築：腫瘍細胞（ドナーに対しては、ＨＢＳＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中の５０μｌの５×１０^５及び受容者に対しては、５０μｌの５×１０^４）を、動物の左脇腹に皮下注入した。腫瘍成長は、キャリパーを用いた腫瘍寸法を測定することによってモニタリングされた。腫瘍の長さ及び幅測定値は、毎週３回得られた。腫瘍体積は、腫瘍体積の方程式＝長さ×幅×高さ×ｐ／６（長さ（ｍｍ）は腫瘍の長軸である）に従って計算された。動物は、腫瘍測定の際に体重を量った。

原発性白血球の調製：細胞懸濁液を、腫瘍、局所リンパ節（腸間膜、鼠径部、及び腰部）、ならびに肺（から調製した。組織を、剃刀で小塊に切断し、ＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン及びストレプトマイシン（Ｐ＋Ｓ）、５０ｍＭ２−メルカプトエタノール（２ＭＥ）、コラゲナーゼＩＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びＤＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）中で、３７℃で４０分間消化させた。消化した組織を、７０μｍ濾過器を通して濾過し、続いて、白血球のＰｅｒｃｏｌｌ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）勾配濃縮を行った。

養子細胞移入：今後の実験のためのＩＬＣ２細胞を単離するために、原発性マウス肺癌腫瘍（ＴＣ１）を、ドナーＣ５７ＢＬ／６動物において構築した。約３週間後、ＩＬＣ２細胞を、フローサイトメトリーによって、ドナー肺及びドナー腫瘍から精製した。精製した細胞を、１０％ＦＢＳ、Ｐ／Ｓ、２ＭＥを含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養し、ＩＬ−３３（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＴＳＬＰ（１０ｎｇ／ｍｌ）によって、５日間刺激した。拡張したＩＬＣ２細胞（１．５×１０３細胞から最大２００μｌ／ＰＢＳの２０ｇ）またはＰＢＳ対照を、腫瘍の構築後の翌日に、受容者マウスに、尾静脈によって注入した。

サイトカイン産生アッセイ：フローサイトメトリーで精製した細胞を、１０％ＦＢＳ、Ｐ＋Ｓ、及び２ＭＥを含む２００μｌのＲＰＭＩ−１６４０培地中で、３７Ｃで培養した。細胞を、ＴＳＬＰ（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−３３（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。ＩＬ−５、ＩＬ−１３の分泌を、製造業者のプロトコルに従って、（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって評価した。

免疫組織化学：腫瘍を、ドライアイス上のＴｉｓｓｕｅ−ＴｅｋＯ．Ｃ．Ｔ培地（Ｓａｋｕｒａ）中に包埋し、切片化するまで−８０℃で直ちに保存した。厚さ１０μｍの切片は、Ｌｅｉｃａ低温保持装置上に収集し、染色まで−８０℃で保存した。スライドを−
８００Ｃから取り出し、冷アセトンまたはアセトン：メタノール中で固定した。ＴＢＳ中で洗浄した後、スライドをタンパク質ブロックでインキュベートし、その後、特異抗体で一晩インキュベートした。適切な西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート二次抗体を、一次抗体の検出のために使用し、ＤＡＢ色素原で発色させた。スライドを、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で対比染色し、エタノール及びキシレン中で脱水した。ギムザ染色は、好酸球を検出するために使用した。次いで、スライドにカバーガラスを載せ、２０倍の倍率でＡｐｅｒｉｏＳｃａｎＳｃｏｐｅを用いて画像化した。

結果：ＩＬＣ２の頻度は、ＩＬ−３３を発現する原発性腫瘍及び転移性腫瘍において上昇するＩＬＣ２の発達及び機能は、微環境におけるＩＬ−３３の存在に強く依存する。原発性腫瘍と転移性腫瘍との間のＩＬ−３３の発現の差は、癌の進行におけるＩＬＣ２及びＩＬ−３３の関与を試験することを可能にした。初めに、ＩＬＣ２の存在は、フローサイトメトリーを用いて、非凝集性腫瘍組織において検出された。ＩＬＣ２は、白血球系統の細胞表面マーカー（Ｌｉｎ：ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ１１ｃ、Ｇｒ−１、ＮＫ１．１、Ｔｅｒ１１９）を発現しなかった細胞として同定されたが、ＩＬ−３３受容体Ｔ１／ＳＴ２（ＳＴ２）鎖、ＩＬ−７受容体サブユニットＩＬ−７Ｒａ（ＣＤ１２７）、及びＴｈｙ１．２（ＣＤ９０．２）の細胞表面マーカー発現の異なるパターンを示した（図７５ａ）。ＬｉｎＳＴ２＋ＣＤ１２７＋ＣＤ９０．２＋細胞の集団は、リンパ球と同様に形質学的であることがさらに示された：細胞質に対して高い核の比率を有する形が丸みを帯びている。インビトロでの単離の際に、この細胞のサブセットは、胸腺間質リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）及びＩＬ−３３の組み合わせによる刺激後に、ＩＬ−５及びＩＬ−１３を成長させ、分泌することができた（図７５ｂ）。これらのデータは、腫瘍において検出されたＬｉｎＳＴ２＋ＣＤ１２７＋ＣＤ９０．２＋細胞の集団が、表現型的及び機能的にＩＬＣ２であったことを示唆している。次に、ＩＬ−３３の相補性を有するまたは有しない、原発性（ＴＣ１）または転移性（Ａ９）腫瘍へのＩＬＣ２浸潤のレベルが評価された。転移性腫瘍（Ａ９）対原発性（ＴＣ１）またはＩＬ−３３を相補したＡ９細胞の非凝集性組織内に見出されたＩＬＣ２の数の著しい減少が、観察された（図７５ｃ）。これらのデータは、ＩＬＣ２が腫瘍に対する癌免疫学的監視に関与することを示唆している。

ＩＬＣ２がインビボでの癌の免疫認識を支援する論証：癌の進行におけるＩＬＣ２及びＩＬ−３３の役割を直接試験するために、ＲＯＲα欠損マウス及び野生型マウスにおけるＩＬ−３３の相補性を有する及び有しない転移性Ａ９腫瘍の進行の比較が行われた。ＲＯＲα−／−マウスは、ＩＬＣ２を特異的に欠いているが、正常数のＮＫ細胞及びＩＬＣ３
１６を維持する。骨髄キメラは、４週齢の野生型またはＲＯＲα−／−（両方ともＣＤ４５．２）マウスのいずれかから全骨髄（ＢＭ）細胞による致死的な放射線を浴びたＢ６．Ｐｅｐ３ｂ（ＣＤ４５．１）マウスの再構成によって生成された。骨髄移植受容者は、６週間で回復し、骨髄移植の質は、末梢血中のＣＤ４５．１陽性細胞とＣＤ４５．２陽性細胞の比率を決定する、ＦＡＣＳによって分析された。移植はすべて、９２〜９６％効率的であった。次いで、Ａ９、Ａ９＋ＩＬ−３３、ＴＣ１細胞を皮下に注入し、成長させた。ＩＬ−３３を発現する細胞は、ＩＬＣ２を欠いているマウスと比較して、野生型マウスにおける腫瘍成長速度を著しく抑制したことが観察された（図７６ａ）。興味深いことには、リンパ節において見出されるＩＬＣ２の数はまた、ＩＬ−３３を発現する腫瘍を持つ動物において増加した（図７６ｂ及び７７ｂ）。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、ＲＯＲα−／−を野生型動物と比較した場合に、影響を受けなかった（図７６ｃ）。転移した腫瘍細胞は、局所的増殖の可能性がある原発性腫瘍（ＴＣ１）を持つＲＯＲα−／−キメラから単離された非凝集性副腎（図７７ａ）において検出された。この観察は、ＲＯＲα転写因子が、原発性腫瘍の転移を制限するために重要であり、そうでなければ、疾患の転移拡散をもたらすことを示唆している。まとめると、これらのデータは、ＩＬ−３３遺伝子相補性が、腫瘍の進行を修正し、ＩＬＣ２が転移を制限し、ＲＯＲα−ＩＬ−３３−ＩＬＣ２軸を通して癌免疫学的監視に関与する役目を果たすという明らかな結論を支援す
ることを実証する。

細胞傷害性Ｔ細胞エフェクター機能におけるＩＬＣ２の効果：細胞傷害性Ｔ細胞エフェクター機構におけるＩＬＣ２の効果を評価するために、ドナーマウスの腫瘍からのＩＬＣ２を単離した。初めに、原発性マウス肺癌腫瘍（ＴＣ１）を、ドナーＣ５７ＢＬ／６動物において構築した。次に、ＩＬＣ２細胞を、腫瘍接種から約３週間後に、フローサイトメトリーによって、切除された腫瘍から精製した。

その後、転移性前立腺腫瘍細胞（ＬＭＤ）を、活性化したＩＬＣ２を用いて及びそれを用いずに培養した。４８時間後、細胞を、ＯＶＡ（２５７−２６４）ペプチドで約４時間パルスし、新たに単離されたＣＤ８ａ＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋ＤＣを一緒に用いて４日間インキュベーションした。これらの特定のＬＭＤ細胞は、ＴＡＰ１プロモーター１９の転写制御下でＥＧＦＰを発現し、ＥＧＦＰの発現の増加は、ＴＡＰ１及びＭＨＣ−１の発現の両方の増加と相関する。システムにおけるＩＬＣ２の存在は、通常、ＴＡＰ欠失転移性細胞である、ＬＭＤ細胞のＥＧＦＰの発現を上昇させる。この観察は、ＩＬＣ２、またはそれらによって分泌されるサイトカインとの直接相互作用は、ＬＭＤ細胞が、ＴＡＰ−１プロモーター／発現の活性の低下に関与する欠失を克服することを可能にすることを示唆している（図７８ａ）。ＣＤ８ａ＋との関連において、グランザイムｂの上昇したレベルは、インビトロでの細胞傷害性Ｔ細胞エフェクター機構におけるＩＬＣ２の効果を反映する（図７８ｂ及び７８ｃ）。

ＩＬＣ２の養子移入は、癌のない生存を媒介する：ＩＬＣ２が細胞に基づいた免疫療法として作用し得るかどうかを精査するために、ＩＬＣ２細胞の効果を、原発性腫瘍を持つ受容者動物への活性化したドナー由来のＩＬＣ２の養子移入を行うことによって、インビボで試験した。受容者マウスにおける腫瘍を構築するために、マウス肺癌細胞（５０μｌの５×１０^４）を、Ｃ５７ＢＬ／６匹のマウスの右脇腹に皮下注入した（０日目）。ドナー由来の肺及び腫瘍ＩＬＣ２細胞（２００ｕｌのＰＢＳ中の約１．２×１０^３〜１．５×１０^３個の細胞）またはＰＢＳ対照を、腫瘍の構築から１日後（１日目）に、受容者マウスに、尾静脈によって注入した。

原発性腫瘍の完全成長停止は、ドナー肺から単離されたＩＬＣ２の養子移入後のマウスにおいて検出された（１００％の減少）（図７９ａ及び７９ｂ）。興味深いことには、ドナー腫瘍から単離されたＩＬＣ２は、原発性腫瘍を６０％のみ減少し、このことは、異なる組織から単離されたＩＬＣ２の表現型の差が、それらの機能性に影響を及ぼし得ることを示唆している。概して、肺から単離されたＩＬＣ２は、表現型的により高い数のＳＴ２受容体を有する。したがって、高いＩＬ−３３含量を有する微環境において、ＳＴ２受容体を通して下流シグナル伝達は、腫瘍部位に対して免疫細胞をさらに引き付けるサイトカインエフェクター機能の結果として生じる強化により上方制御し得る。

ＩＬＣ２受容者の腫瘍部分における自然免疫細胞の数の増加は、これらの腫瘍浸潤免疫細胞が、マウス肺癌における保護的な抗腫瘍免疫を媒介し得ることを示唆している。例えば、好酸球は、ＩＬＣ２移入前に、正常組織に隣接した腫瘍末梢で見られ得るが、処置後、ＩＬＣ２により生成した産物は、微環境を修正するように思われ、好酸球が腫瘍組織に流れ込み、抗腫瘍効果を発揮することを可能にする（図７８ｃ）。

考察：この実施例では、腫瘍の免疫認識におけるＩＬＣ２の直接的な関与を初めて実証した。概して、ＩＬ−３３の下方制御及びＩＬＣ２の破壊は、原発性から転移性腫瘍への移行と同時に起こり、完全に新しい形態の腫瘍免疫回避を表す。

原発性及び転移性癌の腫瘍微環境内のＩＬ−３３レベルの差は、ＩＬＣ２の研究につな
がり、この発達及び機能性は、ＩＬ−３３の発現に強く依存する。転移性腫瘍対原発性またはＩＬ−３３を相補した新生物の非凝集性組織におけるＩＬＣ２計数の著しい減少が、観察された。これらのデータは、ＩＬＣ２が腫瘍に対する免疫学的監視に関与し、それ故に、癌の進行をＩＬＣ２の不在に関連付けることを示唆している。骨髄キメラの生成は、腫瘍の進行の修正におけるＩＬＣ２の関与の機械的な詳細を研究することを可能にした。結果として得られるＲＯＲα欠失マウスは、著しく少数のＩＬＣ２を有する。これらのデータは、ＲＯＲα転写因子が、ＩＬＣ２の生成、及び遠位臓器に転移し、コロニー化する可能性がある腫瘍細胞の再プログラミングに必須であることを示唆している。転移性細胞へのＩＬ−３３遺伝子の安定したトランスフェクションは、ＩＬＣ２を欠いているマウスと比較して、野生型マウスにおける腫瘍成長速度を著しく抑制したことが観察され、ＩＬＣ２がＲＯＲα−ＩＬＣ２経路を通して癌免疫学的監視に関与することを初めて実証した。場合により、ＲＯＲα−ＩＬ−３３を活性化したＩＬＣ２は、ＩＬ−１３の産生８を介したＭＨＣ−ＩＩ分子樹状細胞の発現を介したＴｈ２細胞及び／またはＩＬ−５の産生を介した好酸球等の他の細胞を動員することによって、腫瘍排除における重要な役割を果たす。

これらの観察の観点から、ＣＤ８＋Ｔ細胞の化学誘引を通して腫瘍拒絶への好酸球の役割、癌免疫学的監視においてＩＬＣ２細胞の非常に重要な欠落している関連付けが明らかになる：ＩＬ−３３は、腫瘍の免疫学的認識を再構成し、かつＩＬＣ２を活性化し、自然及び適応できる抗癌免疫をさらに形成する。細胞機構モデルが提案されている（図８０）。

活性化したＩＬＣ２細胞の養子移入は、腫瘍成長速度を大幅に減少させ、免疫反応を腫瘍に影響を及ぼし、したがって、癌免疫療法への一般化可能なアプローチを提供し得ることが初めて実証される。ＩＬＣ２の養子移入が、癌療法への挑戦において、有望かつこれまでに報告されていない新しい技術であると思われる。このアプローチは、癌免疫学的監視における異なるステップで抗原依存性及び非依存性因子に影響を及ぼす。養子移入したＩＬＣ２と腫瘍細胞との比率は、約１個のＩＬＣ２対約３０〜４０個の腫瘍細胞であるが、ＮＳＧマウスで成長させたヒト腫瘍のモデルにおいて、ＣＡＲ＋Ｔ細胞と腫瘍細胞との比率は、約約５〜１０個のＴ細胞対１個の腫瘍細胞である。さらに、ＣＡＲに基づいたアプローチの場合は、インビボでのＴ細胞の調製は、５日よりもさらに長くかかり、放射線によるリンパ枯渇が、細胞移入の前に必要とされる。それ故に、養子移入したＣＡＲ＋細胞を含む同様の研究と比較した場合に、ＩＬＣ２のアプローチは、比較的少数の細胞が無腫瘍生存を促進するために必要とされ、かつこのアプローチが抗原特異性に関係なく患者に対して一般的に適用される可能性があるため、優れていると思われる。

本発明は、ある特定の実施形態を参照して記載されているが、それらの様々な修正は、本発明の精神及び範囲から逸脱しない範囲であることは当業者であれば明らかであろう。当業者であれば明らかであり得る、すべてのそのような修正は、以下の特許請求の範囲内に含まれるよう意図されている。

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Claims

癌を治療し、かつ／または癌の進行を抑制するための方法であって、治療上有効な量のインターロイキン−３３を投与することを含む、方法。
前記癌が、乳癌、腎臓癌、黒色腫、結腸直腸癌、頭頸部扁平上皮細胞癌、子宮頸癌、または前立腺癌である、請求項１に記載の方法。
前記癌が、転移性である、請求項１に記載の方法。
前記インターロイキン−３３が、ポリペプチドまたはその活性断片として提供される、請求項１に記載の方法。
前記インターロイキン−３３が、インビボで治療上有効な量のインターロイキン−３３を生成するポリヌクレオチドとして提供される、請求項１に記載の方法。
癌の進行の抑制が、腫瘍成長の抑制、腫瘍退縮の刺激、腫瘍細胞の免疫認識の増大、または抗腫瘍免疫の刺激を含む、請求項１に記載の方法。
前記インターロイキン−３３が、他の療法と組み合わせて投与される、請求項１に記載の方法。
前記他の療法が、非インターロイキン−３３サイトカイン療法である、請求項７に記載の方法。
前記他の療法が、免疫細胞の養子移入である、請求項７に記載の方法。
前記免疫細胞が、２型自然リンパ球細胞（ＩＬＣ２細胞）である、請求項９に記載の方法。
癌を治療するための方法であって、２型自然リンパ球細胞（ＩＬＣ２細胞）の数を増加させることを含む、方法。
前記癌が、肺、乳癌、腎臓癌、黒色腫、結腸直腸癌、頭頸部扁平上皮細胞癌、子宮頸癌、または前立腺癌である、請求項１１に記載の方法。
前記癌が、転移性である、請求項１１に記載の方法。
癌を治療し、かつ／または癌の進行を抑制する方法であって、ＩＬＣ２細胞を投与することを含む、方法。
前記細胞が、自己細胞である、請求項１４に記載の方法。
前記細胞が、肺組織から単離される、請求項１４に記載の方法。
前記細胞が、腫瘍組織から単離される、請求項１４に記載の方法。
前記細胞が、遺伝子操作されている、請求項１４に記載の方法。
前記細胞が、免疫刺激抗腫瘍因子であるＴＣＲ、Ｉｇ、及び／またはＣＡＲ受容体を発
現するように遺伝子操作されている、請求項１８に記載の方法。
前記方法が、他の療法と組み合わせられる、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の方法。
前記他の療法が、免疫療法及び／または抗癌療法である、請求項２０に記載の方法。
免疫反応を刺激する方法であって、インターロイキン−３３及び／または２型自然リンパ球細胞（ＩＬＣ２細胞）を投与することを含む、方法。
癌を治療し、かつ／または癌の進行を抑制するための方法であって、治療上有効な量のＩＦＩ４４を投与することを含む、方法。
前記癌が、乳癌、腎臓癌、黒色腫、結腸直腸癌、頭頸部扁平上皮細胞癌、子宮頸癌、または前立腺癌である、請求項２３に記載の方法。
前記癌が、転移性である、請求項２３に記載の方法。
前記ＩＦＩ４４が、ポリペプチドまたはその活性断片として提供される、請求項２４に記載の方法。
前記ＩＦＩ４４が、インビボで治療上有効な量のインターロイキン−３３を生成するポリヌクレオチドとして提供される、請求項２３に記載の方法。
癌の進行の抑制が、腫瘍成長の抑制、腫瘍退縮の刺激、腫瘍細胞の免疫認識の増大、または抗腫瘍免疫の刺激を含む、請求項２３に記載の方法。
前記ＩＦＩ４４が、他の療法と組み合わせて投与される、請求項２３に記載の方法。
前記他の療法が、インターロイキン−３３サイトカイン療法である、請求項７に記載の方法。
癌の予後を評価する方法であって、インターロイキン−３３（ＩＬ−３３）及び／またはＩＦＩ４４遺伝子発現をモニタリングするステップを含む、方法。
ＩＬ−３３及び／またはＩＦＩ４４の発現が、良性及び／または原発性腫瘍と比較して、転移性形態の癌において低下する、請求項３１に記載の方法。
前記癌が、前立腺癌、腎臓癌、または肺癌である、請求項３２に記載の方法。
前記他の療法が、ＴＮＦアルファ；インターロイキン−２１；インターロイキン−１３；ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、及びＩＬ−１３の組み合わせ；ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＰＤＬ−１の組み合わせ；インターフェロンアルファ、ベータ、またはガンマを含むが、これらに限定されない、インターフェロン；ＧＭ−ＣＳＦ；Ｇ−ＣＳＦ；ＨＤＡＣｉ；ＨＡＴ；メチル化阻害剤；ＣＡＲＴ細胞、自己Ｔ細胞、特異的ＴＣＲを形質導入した自己Ｔ細胞を含むが、これらに限定されない、Ｔ細胞、自己Ｂ細胞、樹枝状細胞サブセット、ウイルス性、細菌性、及び腫瘍抗原を含むが、これらに限定されない、対象となる抗原；腫瘍抗原そのようなハーセプチンを標的とする抗体を含むが、これらに限定されない、抗体；他の生物学的療法；造血幹細胞の移植；ナチュラルキラー細胞；Ｔｏｌｌ受容体アゴニスト；ケモカイン；抗血管新生分子；ＩＬ−２を含むが、これに限定されない、免
疫療法に使用される他のサイトカイン；化学療法；ウイルスベクター；腫瘍崩壊ウイルス；アジュバント；細胞毒性薬；ならびに制御性Ｔ細胞を枯渇させる療法である、請求項７、２０、または２９に記載の方法。
癌の予後、疾患の進行、及び／または臨床転帰を判定する方法であって、癌組織中／または前記癌組織を取り囲む好酸球の存在についてスクリーニングすること、を含む、方法。
前記癌が、固形腫瘍である、請求項１、１１、１４、２３、３１、及び３５のいずれか１項に記載の方法。
前記癌が、肉腫、癌腫、またはリンパ腫である、請求項１、１１、１４、２３、３１、及び３５のいずれか１項に記載の方法。
前記癌が、乳癌、卵巣癌、肝臓癌、腎臓癌、黒色腫、結腸直腸癌、頭頸部扁平上皮細胞癌、子宮頸癌、または前立腺癌である、請求項１、１１、１４、２３、３１、及び３５のいずれか１項に記載の方法。
前記癌が、白血病または他の血液癌である、請求項１、１１、１４、２３、３１、及び３５のいずれか１項に記載の方法。