KR20190086764A - 사람 선천성 림프 세포 전구체: 확인, 특성화, 적용 - Google Patents

사람 선천성 림프 세포 전구체: 확인, 특성화, 적용 Download PDF

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Abstract

선천성 림프 세포(ILC)는 수임된(committed) ILC 전구체(ILCP)로부터 분화하는 T 헬퍼 및 세포독성 T 세포의 선천성 버젼을 나타낸다. ILCP가 성숙한 조직-상주성 ILC와 어떻게 관련되지는 여전히 불분명하다. 혈액 및 모든 시험한 림프 및 비-림프 사람 조직에서 존재하는 ILCP가 확인되었다. 사람 ILCP는 시그니처 전사 인자(TF) 및 성숙한 NK 세포 및 ILC의 사이토킨 생산을 발현하지 못하지만 이렇게 후생적으로 유지하고 있다. 사람 ILCP는 시험관내 및 생체내에서 모든 ILC 서브세트를 견고하게 생성한다. 사람 ILCP는 RAR 관련된 오르판 수용체 C(RORC)를 발현하지만, 순환하는 ILCP는 EOMES+ NK 세포, T-BET+ ILC1, GATA-3+ ILC2 및 IL-22+에 대한 분화능을 보유하지만 IL-17A+ ILC3에 대해서는 분화능을 보유하지 않는 RORC-결핍성 환자에서 발견될 수 있다. 조직 ILC 분화 모델('ILC-생성(poiesis)')이 제안되어 있으며 이에 의해 다양한 ILC 서브세트가 환경 스트레스인자, 염증 및 감염에 대한 반응시 ILCP로부터 자체적으로 생성된다.

Description

사람 선천성 림프 세포 전구체: 확인, 특성화, 적용
발명의 배경
선천성 림프세포(ILC)는 세포독성 세포(NK 세포) 및 '헬퍼-유사('helper-like)' ILC로 이루어진, 조기 면역 반응에서 필수적인 역활을 제공하는 림프 효과기 세포(lymphoid effector cell)의 신규한 계열이다. 후자는 인터루킨-7 수용체(IL-7Rα/CD127)의 발현에 의해 특징화되며 T 헬퍼(TH) 세포에 대한 이들의 전사 인자(TF) 및 특징적인 사이토킨 생산 유사성을 기반으로 3개의 명백한 그룹으로 분류된다. 제1 그룹 ILC(ILC1)는 T-BET/TBX21을 발현하여 TH1-관련 사이토킨 IFN-γ 및 TNF-α를 생산한다. 제2 그룹 ILC(ILC2)는 GATA-3 및 RORα-의존적인 경로를 통해 TH2-관련 사이토킨, IL-5 및 IL-13을 발현한다. 제3 그룹 ILC(ILC3)는 관련된 오르판(orphan) 수용체 C(RORγt를 암호화하는 RORC)를 이용하여 TH17-관련된 사이토킨, IL-17 및/또는 IL-22의 생산을 구동시킨다(Serafini et al., 2015; Spits et al., 2013). 이러한 상이한 ILC 서브세트(subset)는 다양한 림프 및 비-림프 조직에서 발견되며, 이들은 이들의 장벽 기능 및 선천성 면역 방어에서 필수적인 역활을 담당하는 점막 부위에 풍부하다(Artis 및 Spits, 2015; Eberl et al., 2015).
다양한 사람 ILC 서브세트가 2차 림프 조직에서 최초로 확인되었고 후속적으로 수개의 비-림프 조직 부위(장, 폐, 간, 피부)에서 보고되었다((Juelke 및 Romagnani, 2016)에서 검토됨).
제1 그룹 ILC는 제1형 사이토킨(예컨대, IFNγ 및 TNF)을 생산할 수 있으며 천연 킬러 세포(Natural killer(NK) cell) 및 ILC1(Wikipedia)을 포함한다. ILC1은 ILC3와 밀접하게 관련된 약한 세포독성 세포이다(상기 참고). NK 세포는 세포독성의 선천성 효과기 세포이다(상기 참고). 이들은 혈액, 기관, 및 림프 조직 전체에 분포하며 말초 혈액 림프구의 대략 15%를 구성한다(상기 참고). NK 세포는 종양 감시(tumor surveillance) 및 바이러스-감염된 세포의 신속한 제거에서 역활을 담당한다(상기 참고).
IFN-γ-생산 ILC1의 2개의 명백한 부류가 기술되어 왔다. 고 수준의 CD127(CD127+ ILC1로 지칭됨) 및 CD161을 발현하지만 다른 특이적인 표면 마커를 결여하고 있는 T-BET+ 세포는 편도선 및 염증이 생긴 장에서 확인되었다(Bernink et al., 2013). 대조적으로, NKp44 및 CD103을 발현하지만 CD127을 발현하지 않는 상피내 ILC1은 점막 부위에 존재한다(Fuchs et al., 2013). 이러한 ILC1 둘 다는 IL-12에 대한 반응시 IFN-γ를 생산하며 최소의 에오메소데르민(EOMES) 발현에 의해 NK 세포로부터 분화될 수 있다.
제2 그룹 ILC는 제2형 사이토킨(예컨대, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13)을 생산할 수 있다(Wikipedia). ILC2(또한 천연 헬퍼 세포, 누오사이트(nuocyte), 또는 선천성 헬퍼 2 세포로 명명됨)는 기생충 감염에 대한 반응시 제2형 사이토킨을 분비하는 중요한 역활을 한다(상기 참고). 이들은 또한 알레르기 폐 염증의 발달과 연루되어 왔다(상기 참고). 이들은 케모킨에 대한 특징적인 표면 마커 및 수용체를 발현하며, 이들는 특정 기관 부위로 림프 세포의 분배에 관여한다(상기 참고). 이들은 이들의 발달을 위해 IL-7을 필요로 하며, 이는 2개의 전사 인자(둘 다는 이러한 세포에 의해 요구된다)-RORα 및 GATA3을 활성화시킨다. ILC2는 폐에서 국소 Th2 항원에 대한 주요 반응에 중요하지만 전신계로 전달된 Th2 항원에 대한 반응에 불필요하다(상기 참고).
사람 GATA-3+ ILC2는 화학주성인자 수용체 CRTh2를 발현하며, IL-25R 및 IL-33R(Mjoesberg et al., 2011)는 광범위하게 분포되어 있고(Montaldo et al., 2015)(폐, 피부, 위, 비용종, 지방 조직) 다양한 생리학적- 및 병리학적 상황 하에서 제2형 사이토킨 IL-5 및 IL-13을 생산한다((Kim and Artis, 2015)에서 고찰됨).
제3 그룹 ILC는 사이토킨 IL-17A 및/또는 IL-22를 생산하는 이들의 능력에 의해 정의된다(Wikipedia). 이들은 ILC3 및 림프 조직-유도인자(LTi) 세포를 포함한다(상기 참고). ILC3은 IL-22를 생산할 수 있고 NKp46(NK 세포 활성화 수용체)를 발현할 수 있는 림프 세포 집단이다(상기 참고). 그럼에도 불구하고, ILC3은 전사 인자 RORγt에 의존적이고, 세포독성 효과인자(페르포린, 그란자임 및 사멸 수용체)를 결여하고 있으며 IFNγ 또는 TNF를 생산하지 않으므로, NK 세포와는 상이하다(상기 참고). 이들은 주로 점막 조직에서 및 특히 장관에서 발견된다(상기 참고).
림프 조직 유도인자('LTi') 세포는 림프 조직의 발달에 필요한 ILC 발현 분자의 서브세트이다(상기 참고). 이들은 배발생 동안 림프 기관의 발달에 필수적이며 출생 후 림프 조직의 구성(architecture)을 조절한다(상기 참고). 이들은 또한 T 세포 기억을 유지하는 것과 연관되어 있다(상기 참고).
제3 그룹 ILC는 태아 림프 조직-유도인자(LTi) 세포 뿐만 아니라 전사 인자 RORγt를 발현하고 사이토킨 IL-17A 및/또는 IL-22를 생산하는 성체 계통-CD127+CD117+ 세포도 포함한다((Montaldo et al., 2015)에 검토됨). ILC3은 태아 장간막 림프절 및 비장(Cupedo et al., 2009) 및 성체 편도선, 장, 비장, 피부, 폐, 자궁내막 및 탈락막에서 확인되었다. ILC3의 서브세트는 천연의 세포독성 수용체(NKp30, NKp44 및 NKp46을 포함하는, NCR)를 발현하며 IL-22-생산 세포 내에서 풍부하다(세포a et al., 2009).
쥐의 성숙한 ILC는 조혈 줄기 세포(HSC)로부터 일반적인 림프 선조세포(common lymphoid progenitor: CLP)를 통해 분화하여 태아 간(FL) 및 성체 골수(BM)내에서 다양한 ID2+TCF-1+PLZF+ ILC 전구체(ILCP)를 생성한다(Constantinides et al., 2014; Yang et al., 2015). 다양한 TF 및 신호전달 경로는 마우스에서 이러한 공정을 조절하며(Serafini et al., 2015); 대조적으로, 사람 ILC 발달은 거의 잘 특성화되어 있지 않다((Juelke 및 Romagnani, 2016)에서 검토됨). 세포독성 CD56+ NK 세포를 생성하는 NK 전구체(NKP)는 FL, BM, 제대혈(CB) 및 성체 편도선에서 확인된 반면(Renoux et al., 2015), 시험관내(in vitro)에서 IL22-생산 NCR+ ILC3을 생성하는 수임된(committed) ILC3 전구체(ILC3P)는 편도선 및 창자 고유판(intestinal lamina propria)에서 발견되지만 말초 혈액(PB), 흉선 또는 BM에서는 발견되지 않는다(Montaldo et al., 2014). 최근의 연구는 RORγt를 발현하며 성숙한 세포독성 및 헬퍼 ILC로 발달할 수 있는 편도선 사람 ILCP를 확인하였다(Scoville et al., 2016). 흥미롭게도, 이러한 사람 NKP, ILC3P 및 ILCP는 CD34+이었으며 2차 림프 조직에서 풍부하였지만 순환으로부터는 드물거나 부재하였다. 이러한 ILCP가 조직에서 발견된 성숙한 ILC 소세트와 발달적으로 관련되어 있는지는 명확하지 않았다.
선천성 림프 세포는 선천성 면역 반응의 발달에 중요하며, 보호 면역성 및 항상성 및 염증의 조절에 있어 중요한 역활을 제공한다(Wikipedia). 결과적으로, 이들의 조절장애는 알레르기, 기관지 천식 및 자가면역질환과 같은 염증 병리학을 초래할 수 있다(상기 참고). ILC의 공급원을 제공하기 위하여, ILC의 전구체 세포를 단리하기 위한 조성물 및 방법의 발달을 위한 필요성이 당해 분야에 존재한다. 본 발명은 이러한 필요성을 충족시킨다.
발명의 간단한 요약
본 발명은 선천성 림프 세포 전구체(ILCP), 이러한 조성물의 용도, 및 이러한 조성물의 제조 및 사용 방법을 포함한다.
다양한 구현예에서, 조성물은 선천성 림프 세포 전구체(ILCP)의 정제된 집단을 포함하며, 여기서 집단내 세포의 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 90%는 표현형 CD127+CD117+CD3-CRTh2-를 가지면, 임의로 표현형 CD7+, NKp44-, CD94-, 및/또는 Lin-, 및/또는 임의로 CD26+, 및/또는 CD62L+를 갖는다. 일부 구현예에서, 집단내 세포의 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 90%는 표현형 CD127+CD117+Lin-CRTh2-(여기서 Lin-은 CD3-를 포함한다)를 가지고, 임의로 표현형 CD7+, NKp44-, 및/또는 CD94-, 및/또는 임의로 CD26+ 및/또는 CD62L+를 갖는다. 바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 90%는 표현형 CD127+CD117+Lin-CRTh2-CD7+ 또는 CD127+CD117+Lin-CRTh2-CD94-, 및 임의로 CD26+ 및/또는 CD62L+를 가지고; 보다 바람직하게는 집단내 세포의 적어도 99% 또는 100%는 표현형 CD127+CD117+Lin-CRTh2-CD94-, 및 임의로 CD26+ 및/또는 CD62L+를 갖는다.
일 구현예에서, 본 발명은 사람 세포 샘플을 제공하는 단계, 및 세포의 집단을 제공하기 위해 표현형 CD127+CD117+CD3-CRTh2-를 갖고, 임의로 표현형 CD7+, NKp44-, CD94-, 및/또는 Lin-, 및/또는 임의로 CD26+ 및/또는 CD62L+를 갖는 세포 샘플 내 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 선천성 림프 세포 전구체(ILCP)의 정제된 집단을 제조하는 방법을 포함하며, 여기서 집단내 세포의 적어도 75%는 표현형 CD127+CD117+CD3-CRTh2-를 갖고, 임의로 표현형 CD7+, NKp44-, CD94-, 및/또는 Lin, 및/또는 임의로 CD26+ 및/또는 CD62L+를 갖는다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 표현형 CD127+CD117+Lin-CRTh2-(여기서 Lin-은 CD3-를 포함한다)를 갖고, 임의로 표현형 CD7+, NKp44-, 및/또는 CD94-, 및/또는 임의로 CD26+ 및/또는 CD62L+를 갖는 세포 샘플 내에서 세포를 선택하는 단계를 포함한다. 방법의 일부 구현예에서, 집단내 세포의 적어도 75%는 표현형 CD127+CD117+Lin-CRTh2-(여기서 Lin-는 CD3-를 포함한다)를 갖고, 임의로 표현형 CD7+, NKp44-, 및/또는 CD94-, 및/또는 임의로 CD26+ 및/또는 CD62L+를 갖는다. 바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 90%는 표현형 CD127+CD117+Lin-CRTh2-CD7+ 또는 CD127+CD117+Lin-CRTh2-CD94- 및 임의로 CD26+ 및/또는 CD62L+를 갖고; 보다 바람직하게는 집단내 세포의 적어도 99% 또는 100%는 표현형 CD127+CD117+Lin-CRTh2-CD94-, 및 임의로 CD26+ 및/또는 CD62L+를 갖는다.
일 구현예에서, 본 발명은 선천성 림프 세포 전구체(ILCP)의 집단을 제공하는 단계, 세포 집단을 외부 자극에 적용시키는 단계, 및 ILC1, ILC2, ILC3, 및 NK 세포로부터 선택된 세포형에 있어어의 증가를 검출하는 단계를 포함하여, ILC1, ILC2, ILC3, 및 NK 세포로부터 선택된 세포형을 제조하는 방법을 포함한다.
바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 90%는 표현형 CD127+CD117+CD3-CRTh2-를 갖고, 임의로 표현형 CD7+, NKp44-, CD94-, 및/또는 Lin-, 및/또는 임의로 CD26+ 및/또는 CD62L+를 갖는다. 이러한 방법의 일부 구현예에서, 집단내 세포의 적어도 90%는 표현형 CD127+CD117+Lin-CRTh2-(여기서 Lin-는 CD3-를 포함한다)를 갖고, 임의로 표현형 CD7+, NKp44-, 및/또는 CD94-, 및/또는 임의로 CD26+ 및/또는 CD62L+를 갖는다. 바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 90%는 표현형 CD127+CD117+Lin-CRTh2-CD7+ 또는 CD127+CD117+Lin-CRTh2-CD94-, 및 임의로 CD26+ 및/또는 CD62L+를 갖고; 보다 바람직하게는 집단내 세포의 적어도 99% 또는 100%는 표현형 CD127+CD117+Lin-CRTh2-CD94-, 및 임의로 CD26+ 및/또는 CD62L+를 갖는다.
일 구현예에서, 이러한 방법은 생체내(in vivo)에서 수행된다.
일 구현예에서, 본 발명은 환자에게 ILCP의 정제된 집단을 투여하는 단계를 포함하는, 사람 환자의 치료 방법을 포함하며, 여기서 집단내 세포의 적어도 90%는 표현형 CD127+CD117+CD3-CRTh2-를 갖고, 임의로 표현형 CD7+, NKp44-, CD94-, 및/또는 Lin-, 및/또는 임의로 CD26+ 및/또는 CD62L+를 갖는다. 이러한 방법의 일부 구현예에서, 집단내 세포의 적어도 90%는 표현형 CD127+CD117+Lin-CRTh2-(여기서 Lin-은 CD3-를 포함한다)를 갖고, 임의로 표현형 CD7+, NKp44-, 및/또는 CD94-, 및/또는 임의로 CD26+ 및/또는 CD62L+를 갖는다. 바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 90%는 표현형 CD127+CD117+Lin-CRTh2-CD7+ 또는 CD127+CD117+Lin-CRTh2-CD94-, 및 임의로 CD26+ 및/또는 CD62L+를 가지며; 보다 바람직하게는 집단내 세포의 적어도 99% 또는 100%가 표현형 CD127+CD117+Lin-CRTh2-CD94-, 및 임의로 CD26+ 및/또는 CD62L+를 갖는다.
일 구현예에서, 본 발명은 선천성 림프 세포 전구체(ILCP)의 집단을 제공하는 단계, 세포 집단과 시험 화합물을 접촉시키는 단계, 및 세포 집단내 세포의 표현형에 있어서의 변화를 검출하는 단계를 포함하여, ILC의 발달에 영향을 미치는 화합물을 스크리닝(screening)하는 방법을 포함한다.
일 구현예에서, 시험 화합물은 ILC의 분화에 있어서의 감소를 유발한다. 일 구현예에서, 시험 화합물은 ILC의 분화에 있어서의 증가를 유발한다.
일 구현예에서, 방법은 마우스에 선천성 림프 세포 전구체(ILCP)를 주입하는 단계 및 마우스에게 시험 화합물을 투여하는 단계를 포함한다.
다양한 구현예에서, 세포는 가소성이 없이 확장한다.
일 구현예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 ILCP의 정제된 집단을 IL-1ß 및 IL-2를 포함하는 배양 배지 속에서 배양하는 단계를 포함하는, ILCP의 확장 방법을 포함한다.
다양한 구현예에서, ILCP는 IL-1ß 및 IL-2를 포함하는 배양 배지 속에서 배양된다.
일 구현예에서, 본 발명은 ILC3 세포를 최소의 가소성으로 확장시키는 방법을 포함하며, 여기서 배양 배지는 IL-1ß, IL-2 및 IL-7을 포함한다.
도면의 간단한 설명
도 1a 내지 d는 말초 혈액 CD117 + ILC의 특성화를 나타낸다. (A) 사람 PB ILC의 FACS 분석에 대한 게이팅 전략(Gating strategy). 총 ILC를 생존하는 CD45+ Lin- (CD3- CD4- CD5- TCRαβ- TCRγδ- CD14- CD19-) CD7+ CD127+ 세포(적색) 위에 게이팅하였다. NK 세포는 CD56Dim(회색)에 의해 확인되고, ILC2는 CRTh2+ 세포(녹색)에 의해 표시되며 CD117+ ILC는 CRTh2- CD117+ 집단(청색) 위에 게이팅된다. (B) PB 속에서 건강한 성체 공여자의 총 ILC로부터 살아있는 CD45+ 및 CD117+ ILC로부터의 총 ILC의 퍼센트. 27명의 건강한 개인으로부터의 결과(중앙값). (C) 표면 표현형(NKp44, IL1R1 및 CD69)의 발현 및 PB CD117+ ILC 및 위 CD117+NKp44+/- ILC의 세포내 전사 인자(EOMES, T-BET, GATA-3 및 RORγt) 프로파일. (D) 3시간 PMA/이온 자극에 대한 반응시 PB CD117+ ILC 및 위 CD117+NKp44+/- ILC의 기능성 프로파일(IFN-γ, IL-13, IL-22 및 IL-17A). 적어도 3회의 독립된 실험으로부터 분석된 적어도 3명의 개인의 대표적인 데이타.
도 2a 내지 e는 CD117 + ILC의 전사 시그니처(transcriptional signature) 및 크로마틴 랜드스케이프(chromatin landscape)를 나타낸다. (A) 대량의 RNA Seq 및 Chip Seq을 수행하기 위해 FACS에 의해 건강한 공여자의 말초 혈액으로부터 새로이 단리한 CD117+ ILC 및 CD34+ HSC에 대한 개략도 및 게이팅 전략. (B) 1989개의 영역이 CD117+ ILC로부터 특이적으로 확인되었던 36449 고-신뢰 향상 영역의 H3K4me2 강도를 타나낸 표준화된 ChIPm-Seq 신호를 나타내는 적외선열지도(heatmap). 벤다이어 그램(Venn diagram)은 H3KMe2+ 영역의 3개의 범주('CD34+ HSC-특이적'; 'CD117+ ILC-특이적' 및 '공유')를 나타내었다. 영역은 H3K4Me2+ 농축 수준이 > 2배 상이한 경우 세포-형 특이적인 것으로 고려하였다. (C) CD117+ ILC(청색) 및 CD34+ HSC(오렌지색)으로부터 유일하게 확인된 GRE 근처에 위치한 유전자에 대한 분자 경로 강화의 적외선 열지도. (D) RNA seq에 의해 확인된 CD34+ HSC와 비교하여 CD117+ ILC에 의해 차등적으로 발현된 1540개의 유전자의 군집화를 나타내는 적외선 열지도. (E) RNA seq로부터 CD117+ ILC에 의해 고도로 발현된 1540개 유전자와 'CD117+ ILC-특이적인' H3KMe2+ GRE로부터 확인된 2283개 유전자의 오버랩.
도 3의 A-E는 시험관내( in vitro) 에서 CD117 + ILC의 계통 잠재력을 나타낸다. (A) 사이토킨(각각의 사이토킨에 대해 20 ng/ml)을 사용한 기질 세포-유리된 상태 하에서 대량 배양된 CD117+ ILC(10일)의 확장. 4개의 독립된 공여자로부터의 결과; 쌍을 이룬 스튜던츠 t-시험(paired Student's t test)을 사용한 ns, P>0.05; **, P<0.01; ****, P<0.0001(중앙값). (B) NK 세포(EOMES+ 세포), ILC1(IFN-γ+ 세포), ILC2(IL-13+) 및 ILC3(IL-22+ 및/또는 IL-17A+)를 확인하기 위한 3시간 PMA/이오노마이신 자극 후 표면 표현형, 세포내 EOMES 및 사이토킨 발현에 대한 대량 배양된 CD117+ ILC의 FACS 분석. (C) CD117+ ILC-OP9 기질 공-배양 시스템의 개략도 및 형태학. (D) 단일의 PB CD117+ ILC를 FACS 지수 분류하고 OP9 또는 OP9-DL4 기질 세포 상에서 14 내지 18일 동안 배양하였다. 세포를 표면 및 사이토킨 프로파일에 대해 분석하기 3시간 전에 PMA/iono로 자극시켰다. 적어도 100개의 생존하는 사람 CD45+ 세포가 FACS에 의해 검출된 경우 양성 클론으로 고려하였다. 상응하는 사이토킨의 5% 이상이 총 살아있는 CD45 세포내에서 검출된 경우 ILC 서브세트의 존재를 점수매겼다. (E) 검출된 모든 가능한 ILC 조합을 나타내는 파이 차트(Pie chart). 총 양성 웰 중에서 각각의 단일 또는 다중 ILC 분화의 빈도. 데이타는 각각 하나의 공여자를 사용한 4회의 별도의 실험으로부터 요약하였다. 평균적으로, 클로닝 효능은 OP9에서 40% 및 OP9-DL4 기질 세포에서 26%이었다.
도 4a 내지 c는 CD117 + ILC가 생체내( in vivo )에서 다중-ILC 계통을 효과적으로 증가시킴을 나타낸다. (A) 생체내 전달 시험의 개략도. (B-C) 신생 BRGS 마우스에게 건강한 개인의 PB로부터의 FACS에 의해 새로이 분리된 1-3 X 105 CD117+ ILC 또는 CD34+ HSC를 간내 이전시켰다. 이러한 집단의 후대세포를 4주 주사 후 분석하였다. (B) CD117+ ILC 또는 대조군 CD34+ HSC를 이전시킨 BRGS 마우스의 골수 및 위로부터의 생존하는 사람 CD45+ 세포에서 게이트된 림프구 및 골수 표면 마커에 대한 FACS 분석. (C) CD117+ ILC를 이전시킨 BRGS 마우스의 폐, 위, 간 및 비장에서 표면 NKp44 및 CD117 발현, 세포내 EOMES 및 세포내 사이토킨(IFN-γ, IL-13, IL-22 및 IL-17A) 생산에 의한 상이한 ILC 서브세트의 FACS 분석. 3회의 독립된 실험으로부터 각각의 그룹에서 적어도 4마리의 마우스의 대표적인 데이타.
도 5a 내지 e는 사람 ILCP가 사람 면역계(HIS) 마우스에서 축적됨을 나타낸다. (A) HIS 마우스의 생성의 개략도. 사람 태아 간으로부터 단리된 1.5-2 X 105 CD117+ ILC 또는 CD34+ CD38- HSC를 신생 BRGS 마우스내로 간내 이전시켰다. 마우스를 이식 후 8 내지 9주째에 분석하였다. (B) HIS 마우스의 비장, BM, 폐 및 간에서 사람 ILCP(Lin- CD7+ CD127+ CD117+)의 대표적인 FACS 분석. (C) HIS 마우스의 비장, BM, 폐 및 간에서 총 사람 CD45+로부터의 ILCP의 퍼센트(중앙값). (D) HIS 마우스의 비장으로부터 ILCP 및 NK 세포의 표면 표현형 및 전사 인자 프로파일의 FACS 분석. (E) OP9-DL4와 IL-2, -7, -1β, 및 -23의 배양 전 및 배양 후 10일 동안 HIS 마우스로부터 비장 CD117+ ILC의 사이토킨 생산. 사이토킨 생산을 PMA/iono 자극의 3시간 후 분석하였다. 적어도 3회의 독립적인 실험으로부터 8마리의 마우스의 대표적인 데이타.
도 6a 내지 n은 림프 및 비-림프 기관으로부터 CD117 + ILC의 시험관내 대량 및 클로닝 검정을 나타낸다. 상이한 기관으로부터 대량의(100 내지 300개의 세포) 또는 단일의 CD117+ NKp44+/- CD117+ ILC를 OP9 또는 OP9-DL4를 예비-씨딩(pre-seeding)하고 IL-2, -7, -1β 및 -23(각각 20 ng/ml)이 공급된 96-웰 환저(round bottom) 플레이트 내로 FACS 분류하였다. 3시간 PMA/iono 자극에 대한 반응시 사이토킨 생산을 위한 세포내 FACS 분석을 수행하여 8 내지 10일 대량 배양(A, D, G, J, M) 또는 14 내지 18일 단일 세포 배양(B-C, E-F, H-I, K-L, N-O) 후 ILC1(IFN-γ+), ILC2(IL-13+) 및 ILC3(IL-22+ 및/또는 IL-17A+)를 확인하였다. (A) FL, (D) CB, (G) 폐, (J) 편도로부터 분리한 다량의 CD117+ NKp44- ILC 및 (M) 편도로부터의 CD117+ NKp44+로부터의 후대세포의 대표적인 FACS 분석. 파이 차트는 OP9 및 OP9-DL4에서 (B-C) FL, (E-F) CB, (H-I) 폐, (K-L) 편도로부터의 CD117+ NKp44- ILC 및 (M-N) 편도로부터의 CD117+ NKp44+의 클론 확장 후 모든 가능한 ILC 조합을 나타낸다. 또한 도 3 범례를 참고한다. 데이타는 하나의 공여체 각각을 사용한 적어도 2회의 독립된 실험으로부터 요약하였다.
도 7a 내지 c는 RORC -/- 환자로부터 ILCP의 발달 가능성을 나타낸다.
(A) 건강한 및 RORC-/- 환자 샘플로부터 말초 혈액 ILC 서브세트의 FACS 분석. (B) 건강한 및 RORC-/- 환자의 PB의 총 ILC로부터의 생존하는 CD45+ 세포로부터의 NKDim 및 NKBr의 퍼센트. 22명의 건강한 공여자 및 2명의 RORC-/- 환자로부터의 결과. 쌍을 이룬 스튜던츠 t 시험을 사용한 ns, P>0.05; *, P<0.05; **, P<0.01(중앙값) (C) 건강한 공여자 또는 RORC-/- 환자로부터의 ILCP를 FACS 분류하고 OP9-DL4 위에서 IL-2, -7, -1β 및 -23과 함께 8일 동안 배양하였다. 표면 표현형, 세포내 EOMES 발현 및 사이토킨 생산 프로파일을 PMA/iono로 3시간 자극 후 분석하였다.
도 8a 내지 f는 ILCP 마커의 유동 혈구계산 분석(flow cytometric analysis)을 나타낸다.
몇몇의 정상인 건강한 공여자로부터의 세포의 FACS 분석을 다양한 마커를 사용하여 수행하고 나타낸 세포의 퍼센트를 측정하였다.
도 9a 내지 g는 ILCP 마커의 유동 혈구계산 분석을 나타낸다.
몇명의 정상인 건강한 공여자로부터의 세포의 FACS 분석을 다양한 마커를 사용하여 수행하고 나타낸 세포의 퍼센트를 측정하였다.
도 10은 CD62L 및 CD26 사람 ILCP 서브세트의 분석을 나타낸다.
계통 고갈된 사람 말초 혈액 세포의 FACS 분석에 대한 게이팅 전략을 나타낸다. Lin-CD7+CD127+CD117+ 게이트(사람 ILCP) 내에서 CD45RA의 균질한 발현 및 CD62L 및 CD26의 다양한 발현이 존재한다.
도 11은 사람 ILCP 클론 발현을 나타낸다.
사람 ILCP(Lin-CD7+CD127+CD117+)를 사람 IL-1b, IL-2, IL-7 및 IL-23이 보충된 OP9 기질 세포(DLL4를 발현하거나 발현하지 않음)를 사용한 단일 세포 분류 후 나타낸 조직으로부터 클로닝하였다. 이후에, 클론을 PMA/이오노마이신으로 3시간 자극 후에 사이토킨 생산(IFN-g, IL-13, IL-17A, IL-22)에 대해 분석하였다. 추정적인 ILCP를 사이토킨 비-생산자로서 확인하였다. 개개 ILCP 클론에서 절대적인 수의 세포를 나타낸다.
도 12는 사람 ILCP 클론 표현형을 나타낸다. 성체 말초 혈액으로부터 기원한 사람 ILCP 클론을 나타낸 세포 표면 마커에 대해 염색하였다.
발명의 상세한 설명
본 발명자들은 말초 혈액 CD117+ ILC의 표현형, 분자, 및 기능적 속성을 특성화하였다. 이러한 표현형을 지닌 세포가 사람 ILC3를 나타내는 것으로 이미 제안되었지만(Hazenberg and Spits, 2014), 이러한 세포가 EOMES+ NK 세포를 포함하는, 모든 공지된 ILC 서브세트에 대해 시험관내 및 생체내에서 생성될 수 있는 다분화능(multi-potent) 및 단분화능(uni-potent) ILC 전구체(ILCP)에 현저히 농축되어 있음을 예상치 못하게 발견하였다. CD117+ ILCP는 순환에서만이 아니라 ILC 다분화능을 보유한 조직에서도 발견된다. 전신 분포된 ILCP의 확인은 이에 의해 순환하는 ILCP가 감염, 염증, 및 세포 형질전환에 대한 반응시 조직에서 ILC 분화에 대한 세포 기질을 제공하는 모델을 제시한다.
이와 관련하여, 본 발명자는 제대혈 및 성체 혈액 뿐만 아니라 태아 간 및 수개의 성체 조직에서 Lin-CD7+CD127+CD117+ 세포의 서브세트로서 사람 ILC 전구체(ILCP)를 확인하고 특성화한다. 사람 ILCP는 시험관내 배양 또는 면역결핍성 마우스에게로 생체내 전달 후 광범위한 사이토킨(IFN-γ, IL-13, IL-17A, IL-22)을 생산할 수 있는 모든 성숙한 ILC 서브세트를 생성한다. 사람 ILCP는 또한 EOMES+ NK 세포를 생성하여 사이토킨-생산 뿐만 아니라 세포독성 ILC에 대한 이들의 분화능(potential)도 입증한다. 이는 임의의 종에서 순환하는 ILCP에 대한 첫번째 증거이며 또한 점막 부위를 포함하는 사람 림프 및 비-림프 조직의 광범위한 전신계 분포를 입증한다.
마커 CD127+CD117+ 세포는 CD3+인 약 20%의 ILCP 및 60 내지 80%의 T 세포를 생성하였다(도 8a 또는 도 9a). 계통 세포(Lineage cell)(CD3 포함)를 제외하고는 CD127+CD117+ 세포내에 ILCP가 강력하게 농축되어 있다(도 8e 및 f; 도 9e 내지 g). Lin-CD127+CD117+ 세포에서 CRTh2 ILC2의 제외는 또한 ILCP의 적어도 75%를 생성하는, ILCP 농축을 제공한다(도 8e 및 f; 도 9e, 도 9f 및 도 9g). 마커 CD127+CD117+CD7+CRTh2-Lin-를 사용한 분류는 대략 90%의 ILCP를 생성하였다(도 8e 및 9f). CD56+ NK 세포를 제외함으로써(이는 CD94를 발현하는 유일한 Lin- 세포이다), ILCP의 순수한 집단이 확인될 수 있었다. 따라서, 마커CD127+CD117+CRTh2-Lin-CD94-를 사용한 분류는 대략 100%의 ILCP를 생성하였다(도 8f 및 도 9g). Lin+ 세포내에서, CD3+ T 세포는 CD127 또는 CD117을 발현하는 필수적으로 유일한 세포이다. 따라서, CD127+ CD117+CRTh2-CD3- 대 CD127+ CD117+CRTh2-Lin-을 비교하는 경우 수득된 ILCP의 퍼센트에 있어서의 차이는 필수적으로 존재하지 않는다.
사람 ILCP의 확인은 단일 세포 수준에서 ILC 분화능을 평가할 수 있는 강력한 OP9 기질 세포-기반 검정 덕분에 가능하였다. 이러한 시도를 사용하여, 본 발명자는 IFN-γ+ ILC1, IL-13+ ILC2 또는 IL-17A+ 및/또는 IL-22+ ILC3을 생성할 수 있는 단-분화능 ILCP 뿐만 아니라 2개 이상의 ILC 서브세트를 생성할 수 있는 다분화능 사람 ILCP도 확인하였다. 본 발명자는 사람 CD34+ HSC가 다-계통 ILC 분화능을 지닌 ILCP를 지닌 CD117+ 세포로 생체내에서 발달할 수 있음을 입증한다. 이와 함께, 본 발명자는 이에 의해 다분화능 CD34+ HSC가 3개의 주요 ILC 그룹(EOMES+ NK 세포 포함)을 생성할 수 있는 다능성 ILCP(CD34-CD7+CD127+CD117+CD45RA+ 표현형을 지님)으로 점진적을 분화할 수 있는 사람 ILCP 발달에 대한 모델을 제안한다. CD34+ HSC 및 다분화능 ILCP 둘 다는 태아 간에 존재하며 이러한 조직이 이러한 변이에 관대함을 시사한다. CD117+ ILCP가 사람 BM 속에 존재하는지의 여부를 아는 것은 흥미로울 것이다. 앞서 기술된 사람 편도의 ILCP(Scoville et al., 2016)는 이러한 경로에서 중간체를 나타낼 수 있다. BM 뿐만 아니라 성체 및 제대혈에서 CD34+CD117+CD45RA+ ILCP의 부재(Scoville et al., 2016)는 이러한 ILCP가 국소적으로 발생함을 시사한다. 본 발명자가 본원에 기술한 순환하는 및 조직에 상주하는 사람 ILCP는 또한 보다 제한된 단분화능 ILC를 지닌 세포를 지닌다. 본 발명자는 다분화능 ILCP와 단분화능 ILCP 사이의 구별을 허용하는 마커를 확인하지 않았지만, 본 발명자는 이들이 전구체-생성물 관계를 지니고 있다고 추정한다.
순환하는 사람 ILCP의 트랜스크립토믹(Transcriptomic) 및 에피게노믹(epigenomic) 분석은 ILC 계통으로의 부분적 사양(partial specification)과 일치하는 시그니처(signature)를 나타내었다. 마우스에서 ILC 발달에 중요한 것으로 알려진 TF(TCF7, TOX, ID2 및 GATA3 포함; (Klose et al., 2014; Seehus et al., 2015; Yagi et al., 2014; Yang et al., 2015))는 순환하는 HSC와 비교하여 ILCP에서 명확하게 상향-조절되었다. 대조적으로, 조기 B 및 T 림프구생성의 시그니처는 명백하지 않으며 시험관내 또는 생체내에서 적응성 림프구로의 이들 세포의 불능과 일치한다. ILC 그룹-정의 TF(BCL2, TBX21, EOMES, RORC)는 부재하거나 저 수준으로 발현되었으며 이는 ILC1, ILC2 또는 ILC3에 대한 개입이 여전히 완전하지 않았음을 시사한다. 흥미롭게도, 이러한 인자를 암호화하는 유전자자리(loci)는 풍부한 H3K4Me2 변형에 의해 입증되는 바와 같이 여전히 '침착(poised)'하였다. 이러한 크로마틴 랜드스케이프(chromatin landscape)는 사이토킨-유래된 확장 후 분화된 ILC 서브세트의 생성을 촉진하며(Zook et al., 2016) 시그니처 사이토킨 및 TF 유전자자리가 우성 H3K27 메틸화로 불활성화 상태로 있는 나이브 T 세포(naive T 세포)에서의 상황과는 대조적이다(Koues et al., 2016; Shih et al., 2016).
단분화능 및 다분화능 ILCP가 시험한 모든 사람 조직 샘플에서 확인되었지만, 단분화능 또는 다분화능인 ILCP의 상대적인 집단에서 명백한 차이가 존재하였다. 따라서, 각각의 조직은 환경 신호에 의해 조건화된 독특한 ILCP '레퍼토리'를 지니는 경향이 있다. 이들은 후에 ILC 분화의 단계를 조절하는 동일한 성장 인자 및 사이토킨을 포함할 수 있으며((Diefenbach et al., 2014)에서 참고), 이는 특수한 ILC 서브세트의 발달을 유도하기 위해 ILCP에서 작용할 수 있다. 대안적으로, 사이토킨 수용체의 확률적 발현(stochastic expression)은 추가로 분화하는 능력을 지닌 ILCP의 분획을 제공할 수 있다. 상이한 조직 환경 내에서 ILCP 반응성을 조절하는 메카니즘의 보다 나은 이해는 사람 질환에서 잠재적인 치료학적 적용을 위해 중요할 것이다.
본 발명자의 연구는 단분화능 및 다분화능 ILCP로부터의 사람 ILC 분화를 조절하는데 있어서 Notch 신호에 대한 중요한 역활을 강조한다. 조직으로부터의 및 혈액내의 ILCP는 Notch 신호의 존재하에서 보다 큰 다분화능을 나타낸다(OP9-DL4 배양 시스템). 이는 Notch-의존성 생존 및 증식 신호에 대한 다분화능 ILCP의 보다 높은 의존성을 나타낼 수 있다(Chea et al., 2016b). 대안적으로, 특수한 ILC 서브세트는 이들의 항상성의 측면에서 보다 더 Notch-의존성일 수 있다. 특히, 마우스에서 NCR+ ILC3 서브세트는 작용 메카니즘이 명확하지 않다고 해도, Notch-의존성이다(Chea et al., 2016a). OP9-DL4 배양물 속에서 대량 및 클로날 수준에서 IL-17A 및 IL-22-생산 세포의 증가된 빈도는 사람 시스템에서 유사한 요건을 반영할 수 있다.
사람 태아 간의 본 발명자의 분석은 임신 동안 다분화능 ILCP 및 ILC3-제한된 선조세포에 대한 최초의 증거를 제공한다. 다른 단분화능 ILCP가 이러한 조직에서 드물게 검출되었다는 것은 놀라운 것이었며, 이는 태아 발달의 이러한 단계에서, 간 미소환경이 ILCP를 ILC3로 강력하게 분열시키는(polarize) 신호를 전달할 수 있음을 시사한다. 마우스에서, 유사한 발견이 보고되었다(Cherrier et al., 2012). Notch 신호는 마우스 태아 간에서 림프 세포 운명 결정을 지시하는데 있어 역활을 담당하여, T-계통 프라이밍된 전구체의 발달을 촉진할 뿐 아니라 ILCP의 항상성을 변형시키는 것으로 제안되어 왔다(Chea et al., 2016b; Dallas et al., 2005). 가용성 인자는 ILCP가 이들을 조직 염증 및 스트레스에 대해 감지하도록 하는 수개의 사이토킨 수용체(IL-1R, IL-2R, IL-18R)를 발현하므로 관련될 수 있다.
TF 발현의 조절은 ILC 운명 뿐만 아니라 기능도 좌우한다. 시그니처 TF는 이들의 분화를 특히 사이토킨에 대한, 표면 표현형 및 효과기 배출의 수준에서 '고정'시키는 ILC 서브세트에 대해 확인되어 왔다((Serafini et al., 2015)에서 검토됨). TF RORC는 ILC3 소세트를 정의하는데 도움을 주며 마우스에서 ILC3(ILC1, ILC2 또는 NK 세포가 아님)의 발달 및 유지에 요구된다(Luci et al., 2009; Sawa et al., 2010). 예측한 바와 같이, RORC는 사람 ILC3 및 수임된 ILC3P에 의해 발현된다(Montaldo et al., 2014). 모든 사람 ILC 서브세트가 RORC를 발현한다는 최근의 보고(Scoville et al., 2016)는 사람 ILC 분화에 있어서 이러한 TF에 대한 보다 광범위한 역활을 시사하였다. RORC-결핍성 환자로부터의 혈액을 분석함으로써, 본 발명자는 RORC가 사람에서 전반적인 ILC 분화에 요구되지 않았지만, 오히려 IL-17+ ILC3 서브세트의 분화에 중요하였음을 입증할 수 있었다. RORC-결핍성 환자에서 ILCP는 다른 ILC 및 NK 세포 서브세트를 생성하는 능력을 보유하였다. 흥미롭게도, IL-22+ ILC3은 RORC-의존적 양식으로 발달하였으며, 이는 사람에서 이러한 세포에 대한 보상적 경로를 시사한다.
OP9 기질의 사용은 사람 ILC2 가소성을 최소화시킴이 이미 밝혀져 있으며(Lim et al., 2016) 본 출원에서 본 발명자는 거의 대부분의 NKp44+ ILC3 클론이 이들의 기능적 속성을 보유하고 이러한 배양 시스템에서 ILC1 표현형에 대해 가소성을 거의 나타내지 않음을 입증한다. 더욱이, 앞서의 보고는 ILC1이 IL-1b의 존재하에서 ILC3 운명을 향해 신속하게 분화하지만(Bernink et al., 2015), 본 발명자의 OP9 배양 시스템(IL-1β 함유)에서 ILC1 클론은 이들의 IFN-γ 시그니처를 보유하였음을 제안하였다. 따라서, 본 발명자의 배양 시스템은 ILCP로부터 '주요' ILC 운명을 증진시키는 신호를 평가하는데 유용한 것으로 나타난다.
최종적으로, 순환하는 및 조직에 상주하는 사람 ILCP에 대한 본 발명자의 확인은 '요구형 ILC-생성(ILC-poiesis on-demand)'의 개념을 시사하며, 여기서 ILC 분화는 임의의 조직 및 임의의 연령에서도 일어날 수 있다. 마우스에서 병체결합(parabiosis)을 사용한 최근의 연구는 ILC가 정지 상태 및 일부의 염증 상태 하에서 재순환하지 않는 장기간 생존하는 조직에 상주하는 세포이다(Gasteiger et al., 2015). 대조적으로, 다른 보고는 수개의 점막 ILC 서브세트의 반감기가 주(week)의 순서임을 나타내었으며, 이러한 세포가 재생되어야만 함을 시사한다(Sawa Science). 순환하는 ILCP의 발견은 정지상태 손실에 대한 반응 및 감염 및 염증과 관련하여 조직 ILC를 보충하기 위한 메카니즘을 제공한다. 본 발명은 ILCP를 포함하는 조성물 및 제조 및 ILCP의 사용 방법을 포함한다.
ILCP를 포함하는 조성물
본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 선천성 림프 세포 전구체(ILCP)를 포함하는 조성물을 포함한다. 본원(예컨대, 실시예에서)에 사용된 마커 모두는 ILCP의 마커로서 사용하기 위한 임의의 및 모든 조합에서 구체적으로 고려되어 있으며 본 발명의 다양한 구현예에서 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 선천성 림프 세포 전구체(ILCP)의 정제된 집단을 포함한다. 바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 25%, 35%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 표현형 CD34-CD7+CD127+CD117+CD45RA+를 갖는다. 바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 25%, 35%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 NKp44 및/또는 RORγt의 발현을 결여하고 있다. 바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 25%, 35%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 IL-1R1+ 및/또는 CD69-이다. 보다 바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 25%, 35%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 표현형 CD34-CD7+CD127+CD117+CD45RA+를 가지며, NKp44 및/또는 RORγt의 발현을 결여하고, IL-1R1+ 및/또는 CD69-이다. 보다 바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 25%, 35%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 표현형 Lin-CD34-CD7+CD127+CD117+CD45RA+를 가지고, NKp44 및/또는 RORγt의 발현을 결여하며, IL-1R1+ 및/또는 CD69-이고, 임의로 CD62L 및/또는 CD26을 추가로 발현한다.
바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 25%, 35%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 Lin-CD7+CD127+CD117+이다.
일부 구현예에서, 집단내 세포의 적어도 25%, 35%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 Lin-CD7+CD127+CD117+CRTh2-이다.
일부 구현예에서, 집단내 세포의 적어도 25%, 35%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 Lin-CD94- CRTh2-CD127+CD117+이다.
가장 바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 25%, 35%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 CD127+CD117+CD3-CRTh2-이다. 일부 구현예에서, 상기 집단내 세포의 적어도 25%, 35%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 또한 CD7+, NKp44-, CD94-, 및/또는 Lin-, 및/또는 또한 CD26+, 및/또는 CD62L+이다. 방법의 일부 구현예에서, 집단내 세포의 적어도 25%, 35%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 CD127+CD117+Lin-CRTh2-(여기서 Lin-은 CD3-을 포함한다)이고, 임의로 또한 CD7+, NKp44-, 및/또는 CD94-, 및/또는 임의로 또한 CD26+ 및/또는 CD62L+이다. 바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 CD127+CD117+Lin-CRTh2-(여기서 Lin-는 CD3-을 포함한다), 및 임의로 또한 CD7+, NKp44-, 및/또는 CD94-, 및/또는 임의로 또한 CD26+ 및/또는 CD62L+이다. 일부 바람직한 구현예에서, 집단내 세포의 적어도 90%는 표현형 CD127+CD117+Lin-CRTh2-CD7+ 또는 CD127+CD117+Lin-CRTh2-CD94-, 및 임의로 CD26+ 및/또는 CD62L+를 가지고; 보다 바람직하게는 집단내 세포의 적어도 99% 또는 100%는 표현형 CD127+CD117+Lin-CRTh2-CD94-, 및 임의로 CD26+ 및/또는 CD62L+를 갖는다. 바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 25%, 35%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 이러한 사이토킨이 위 CD117+ 세포에 의해 생산되는 조건 하에서 자극 후 IL-17A 또는 IL-22를 생산하지 않는다.
바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 25%, 35%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 T-BET, EOMES, 및 GATA-3hi를 발현하지 않는다.
바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 25%, 35%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 CD94, CD244, 및 CRTh2를 발현하지 않는다.
바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 25%, 35%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 약리학적 활성인자를 사용한 자극 후 IL-13 또는 IFN-γ를 생산하지 않는다.
바람직하게는, 세포의 집단은 적어도 104, 105, 106, 107, 108, 109, 또는 1010개의 ILCP 세포를 포함한다.
ILCP의 제조 방법
본 발명은 본 발명의 선천성 림프 세포 전구체(ILCP)의 제조 방법을 포함한다. 일 구현예에서, 방법은 사람 세포 샘플을 제공하는 단계, 및 샘플 속에서 ILCP를 선택하는 단계를 포함한다. ILCP는 본원(예컨대, 실시예)에 제시된 마커의 임의의 조합을 사용하여 선택할 수 있다. 일 구현예에서, 세포는 다음의 마커의 임의의 조합을 위해 선택된다: Lin-, CD34-CD7+CD127+CD117+CD45RA+, NKp44-, RORγt-, IL-1R1+, CD69-, CD62L+, CD26+; 특히, Lin-, CD34-CD7+CD127+CD117+CD45RA+, NKp44-, IL-1R1+, CD69-, CD62L+, CD26+. Lin-은 계통 음성 세포를 지칭하고; Lin-은 CD3-, CD4-, CD5-, TCRαβ-, TCRαβ-, CD14- 및 CD19-를 지칭한다. 선택은 예를 들면, 실시예에 기술된 바와 같이, FACS 분석 및 세포 분류에 의해서와 같이, 당해 분야의 통상의 기술에 의해 수행할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포는 이러한 사이토킨이 위 CD117+ 세포에 의해 생산되는 조건 하에서 자극 후 IL-17A 또는 IL-22의 생산의 결여를 위해 선택된다.
일부 구현예에서, 세포는 T-BET, EOMES, 및 GATA-3hi의 발현의 결여를 위해 선택된다.
일부 구현예에서, 세포는 CD94, CD244, 및 CRTh2의 발현의 결여를 위해 선택된다.
일부 구현예에서, 세포는 예를 들면, 실시예에 기술된 바와 같은, 약리학적 활성인자를 사용한 자극 후 IL-13 또는 IFN-γ의 생산의 결여를 위해 선택된다.
일부 구현예에서, 샘플은 혈액 또는 조직 샘플이다. 샘플은 성체 또는 태아 샘플일 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플은 혈액, 편도, 위, 태아 간, 또는 폐 샘플이다.
일부 구현예에서, 세포 샘플은 세포 분류에 의해서와 같이, Lin-CD7+CD127+CD117+CRTh2- 세포에 대해 선택된다. 일부 구현예에서, 세포 샘플은 Lin-CD94- CRTh2-CD127+CD117+ 세포에 대해 선택된다. 일부 구현예에서, 세포 샘플은 CD127+CD117+CD3-CRTh2- 세포에 대해 선택된다. 일부 구현예에서, 세포 샘플은 CD127+CD117+CD3-CRTh2-세포 및 또한 CD7+, NKp44-, CD94-, 및/또는 Lin- 세포, 및/또는 또한 CD26+ 및/또는 CD62L+ 세포에 대해 선택된다. 일부 바람직한 구현예에서, 세포 샘플은 CD127+CD117+Lin-CRTh2- 세포(여기서 Lin-은 CD3-을 포함한다), 및 임의로 또한 CD7+, NKp44-, 및/또는 CD94- 세포에 대해, 및/또는 임의로 또한 CD26+ 및/또는 CD62L+ 세포에 대해 선택된다. 바람직하게는, 세포 샘플은 CD127+CD117+Lin-CRTh2-CD7+ 또는 CD127+CD117+Lin-CRTh2-CD94- 세포에 대해, 및 임의로 또한 CD26+ 및/또는 CD62L+ 세포에 대해 선택되며; 보다 바람직하게는, 샘플은 CD127+CD117+Lin-CRTh2-CD94- 세포에 대해, 및 임의로 또한 CD26+ 및/또는 CD62L+ 세포에 대해 선택된다. 실시예에 제시된 바와 같은, 당해 분야의 통상의 기술을 사용하여 이러한 세포를 선택할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 세포는 당해 분야에 잘 공지된 방법을 사용하여 분류한다. 일부 구현예에서, FACS 또는 MACS® 기술(Miltenyi Biotech)을 사용하여 특수한 세포형을 단리한다. 본원에 기술된 임의의 마커에 대한 항체를 사용하여 본원에 기술된 임의의 세포 마커의 단리, 정제, 및/또는 검출을 달성할 수 있다.
ILCP의 확장 방법(Methods for expanding ILCP )
본 발명은 첨가될 ILCP 증식을 위한 방법을 포함한다. 세포의 풍부한 증식은 이들을 IL-1β와 함께 배양하는 경우 관찰된다. ILCP의 증식을 위해, 배양 배지는 IL-1β 및 바람직하게는 IL-1β 및 IL-2를 포함한다. 또한, 배지는 IL-7과 같은 다른 사이토킨을 임의로 포함할 수 있다.
세포는 실시예(예컨대, 실시예 3)에 제시된 바와 같이 또는 다른 유사한 기술에 의해 성장시킬 수 있다. 예를 들면, ILC는 사람 AB 혈청이 들어있는 이쎌 배지(Yssel's medium) 속에서 배양될 수 있고, 기질 세포, IL-7, IL-2, 및 IL-1β를 사용할 수 있다. 대안적으로, DMEM, IMDM, 또는 RPMI-1640과 같은 다른 배지를 사용할 수 있다. 배지 및/또는 배지 보충물은 세포 배양에 대해 당해 분야에 공지된 바와 같이 변화시킬 수 있다. 또한 포유동물 혈청이 들어있는 세포 배양 배지의 보충물이 고려된다.
배지는 바람직하게는 소 혈청, 송아지 혈청, 태아 송아지 혈청, 신생 송아지 혈청, 염소 혈청, 말 혈청, 사람 혈청, 닭 혈청, 돼지 혈청, 양 혈청, 토끼 혈청, 및 랫트 혈청 또는 혈청 대체물 또는 배아 유액으로부터 선택된 혈청을 함유한다. 아미노산과 같은 추가의 보충물을 배지에 가할 수 있다. 항생제 및 항진균제를 또한 배지에 가할 수 있다.
ILC1, ILC2, ILC3, 및 NK 세포의 제조 방법
본 발명은 ILC1, ILC2, ILC3, 및 NK 세포의 제조 방법을 포함한다. ILC1, ILC2, ILC3, 및 NK 세포는 본 발명의 ILCP로부터 당해 분야의 통상의 기술에 의해 생산할 수 있다. 예를 들면, ILC1, ILC2, ILC3, 및 NK 세포는 실시예에 개시된 구체적인 기술을 사용하여 생산할 수 있다. 일 구현예에서, 세포 시스템(예컨대, Mohtashami, et al. (2010)에 개시된 OP9 기질 세포 시스템)을 사용하여 본 발명의 ILCP로부터 ILC1, ILC2, ILC3, 및 NK 세포를 생성시킬 수 있다. 가장 바람직하게는, 세포는 또한 "가소성"으로 명명된 표현형 또는 기능에 있어서 변화없이 확장한다.
다양한 구현예에서, ILCP는 다양한 사이토킨으로 처리하여 ILC1, ILC2, ILC3, 및 NK 세포로의 분화를 촉진한다. 이러한 사이토킨은 IL-1β(IL-1 베타), IL-12, IL-18, IL-25, IL-33, IL-23, IL-2, 및 IL-7의 임의의 및 모든 조합을 포함한다.
다양한 구현예에서, ILC 서브세트는 기질 세포-기반 시도를 사용하여 확장시킬 수 있다. 다른 것은 성숙한 ILC가 시험관내에서 확장될 수 있음을 또한 밝혔지만, 본 발명자의 결과는 이러한 경우에 세포가 '가소성'(효과기 기능에 있어서, 특히 IFN-γ와 같은 사이토킨 생산에 대한 변화) 없이 확장하므로 상이하다. 이러한 가소성은 본 발명자가 ILC2에 대한 선행 공보(Lim et al, J Exp Med 2016)에서 밝혔던 바와 같이 특수한 사람 사이토킨(IL-12)에 의해 구동될 수 있다. ILC3 서브세트는 동일한 시도를 사용하여 최소의 가소성으로 시험관내에서 확장될 수 있다. 이러한 시도를 사용하여 이들의 기능적 특성을 변화시키지 않으면서 다량의 성숙한 ILC2 또는 ILC3를 성장시킬 수 있다.
ILC 서브세트는 단리된 ILCP로부터 발생된 ILC 서브세트로부터 또는 환자 샘플에서 직접 단리된 ILC 서브세트로부터 확장될 수 있다.
세포는 실시예에 제시된 바와 같이 또는 다른 유사한 기술에 의해 성장시킬 수 있다. 예를 들면, ILC는 사람 AB 혈청이 들어있는 이쎌 배지 속에서 배양시킬 수 있고, 기질 세포, IL-7, IL-2, 및 IL-1β를 사용할 수 있다. 대안적으로, DMEM, IMDM, 또는 RPMI-1640과 같은 다른 배지를 사용할 수 있다. 배지 및/또는 배지 보충물은 세포 배양을 위해 당해 분야에 공지된 바와 같이 변화시킬 수 있다. 또한, 포유동물 혈청이 들어있는 세포 배양 배지의 보충이 고려된다.
배지는 바람직하게는 소 혈청, 송아지 혈청, 태아 송아지 혈청, 신생 송아지 혈청, 염소 혈청, 말 혈청, 사람 혈청, 닭 혈청, 돼지 혈청, 양 혈청, 토끼 혈청, 및 랫트 혈청 또는 혈청 대체물 또는 배아 유액으로부터 선택된 혈청을 함유한다. 아미노산과 같은 추가의 보충물을 배지에 가할 수 있다. 항생제 및 항진균제를 또한 배지에 가할 수 있다.
가장 바람직하게는, IL-7, IL-2, 및 IL-1β를 함유하는 배지를 사용한다.
사람 ILCP는 기질 세포의 부재하에서 사이토킨을 사용하여 시험관내에서 확장시켰다. 다른 세포주를 ILCP를 배양하기 위해 사용할 수 있다.
ILCP의 바람직한 세포 공급원은 말초 혈액이지만, 또한 골수, 편도, 림프절, 피부, 지방 조직, 위, 간 및 폐를 포함할 수 있다. 이러한 상이한 조직 모두로부터의 ILCP를 시험관내에서 배양할 수 있으며 성숙한 ILC 서브세트를 생성할 수 있다.
특수한 성장 인자 조합을 배양 배지에 가하여 ILCP를 특이적인 서브세트로 분화시킬 수 있다. 예를 들면, IL-12 및 IL-18를 가하여 ILC1 서브세트를 생성할 수 있다. IL-25 및 IL-33을 가하여 ILC2 서브세트를 생성할 수 있다. IL-23을 가하여 ILC3 서브세트를 생성할 수 있다.
특수한 성장 인자 조합을 배양 배지에 가하여 ILCP의 특이적인 소세트로의 분화를 억제할 수 있다. 예를 들면, Tbet 또는 TBX21 발현을 변경시키는 소 분자, 화학제 또는 유전적 변형을 사용하여 ILC1 서브세트로의 분화를 억제할 수 있다. BCL11B 발현을 변경시키는 소 분자, 화학제 또는 유전적 변형을 사용하여 ILC2 서브세트로의 분화를 억제할 수 있다. RORγt(마우스에서 RORC) 발현을 변경시키는 소 분자, 화학제 또는 유전적 변형을 사용하여 ILC3 서브세트로의 분화를 억제할 수 있다.
OP9 세포주는 ATCC(자유로이 접근 가능)를 통해 이용가능하다. OP9 세포는 이미 사용되어 예를 들면, 미국 특허 제8,772,028호 및 미국 특허 제9,533,009호에서 조기 사람 T 세포 전구체를 발달시켰다.
최소의 가소성을 지닌 ILC3을 확장시키는 방법은 Lim et al. J Exp Med 2016에서 ILC2에 대해 기술된 것과는 상이하다. ILC2의 경우, 성숙한 ILC2(혈액으로부터 단리됨)를 IL-2, IL-7, IL-25 및 IL-33와 함께 배양(OP9에서) 하였다. ILC3의 경우, 성숙한 ILC3은 IL-2, IL-7 및 IL-1β와 함께 배양한다(참고: 실시예 3, 여기서 ILC3은 편도로부터 단리하여 OP9-DL4 위에서 IL-2, IL-7 및 IL-1β와 함께 배양한다).
편도 외에도, ILC3을 생성시키는 과정을 태아 간, 제대혈, 성체 말초 혈액, 폐, 지방 및 위 샘플과 함께 성공적으로 사용하였다.
ILCP 또는, ILC1, ILC2 또는 ILC3 세포는 또한 CRISPR, ZFN, 또는 TALEN, 또는 다른 게놈 편집 기술(genomic editing technology)을 사용하여 목적한 게놈 서열을 가하거나 제거할 수 있다. 레트로바이러스, AAV, 및 렌티바이러스 벡터를 포함하는 벡터를 또한 사용하여 이러한 세포를 변형시킬 수 있다. 다양한 구현예에서, RORC 또는 RORTγt, BCL11B, Tbet, 및 TBX21로부터 선택된 유전자를 불활성화시킨다.
세포를 또한 변형시켜 키메라 항원 수용체(CAR)를 함유시킬 수 있다. 이러한 CAR은 투과막 도메인(transmembrane domain) 및 이의 표적에 대한 결합 도메인의 결합에 대한 반응시 시그날을 전달하는 엔도도메인(endodomain)에 융합된, 모노클로날 항체 또는 나노바디(nanobody)로부터와 같은, 단일-쇄 결합 도메인을 전형적으로 포함한다. CAR의 예는 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 이러한 유전적으로 가공된 수용체를 사용하여 모노클로날 항체의 특이성을 성숙한 ILC에 이식할 수 있다. CAR을 발현하는 ILC는 ILC의 일부 서브세트(예컨대, ILC2)가 골수 세포를 통해 면역 반응을 억제하므로 일부 자가면역 질환에 유용할 수 있다.
다양한 구현에에서, ILCP는 생체내에서 투여하여 ILC1, ILC2, ILC3, 및 NK 세포내로의 분화를 촉진한다.
다양한 구현예에서, 방법은 선천성 림프 세포 전구체(ILCP)의 집단을 제공하는 단계, 세포 집단을 외부 자극에 적용시키는 단계, 및 ILC1, ILC2, ILC3, 및 NK 세포로부터 선택된 적어도 하나의 세포형에 있어서의 증가를 검출하는 단계를 포함한다. 다양한 구현예에서, ILC1, ILC2, ILC3, 및/또는 NK 세포를 분리하고/하거나, 정제하고/하거나 수거한다.
세포 집단은 생체내 또는 시험관내에서 외부 자극에 적용시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 집단을 사람화된 마우스 모델에서 외부 자극에 적용시킨다. 다양한 구현예에서, 외부 자극은 바이러스, 기생충, 미생물, 또는 세균 유기체(예컨대, HIV 또는 말라리아) 또는 이의 성분(예컨대, DNA 또는 단백질)이다. 다양한 구현예에서, 외부 자극은 사이토킨 또는 사이토킨의 혼합물이다. 다양한 구현예에서, 외부 자극은 시험 화합물이다.
바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 25%, 35%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 표현형 CD34-CD7+CD127+CD117+CD45RA+를 가지고/가지거나, NKp44 및 RORγt의 발현을 결여하고/하거나, IL-1R1+ 및 CD69-이며, 임의로 CD62L 및/또는 CD26을 추가로 발현한다. 바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 25%, 35%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 표현형 Lin-CD34-CD7+CD127+CD117+CD45RA+를 가지고/가지거나, NKp44 및 RORγt의 발현을 결여하고/하거나, IL-1R1+ 및 CD69-이고, 임의로 CD62L 및/또는 CD26을 추가로 발현한다.
일부 구현예에서, 집단내 세포의 적어도 25%, 35%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 Lin-CD7+CD127+CD117+CRTh2-이다. 바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 Lin-CD7+CD127+CD117+CRTh2-이고; 보다 바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 90%, 95%, 또는 99%는 Lin-CD7+CD127+CD117+CRTh2-이다.
일부 구현예에서, 집단내 세포의 적어도 25%, 35%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 Lin-CD94-CRTh2-CD127+CD117+이다. 바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 Lin-CD94-CRTh2-CD127+CD117+이고; 보다 바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 90%, 95%, 또는 99%는 Lin-CD94- CRTh2-CD127+CD117+이며; 여전히 보다 바람직하게는 집단내 세포의 적어도 99% 또는 100%는 Lin-CD94-CRTh2-CD127+CD117+이다.
바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 25%, 35%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 CD127+CD117+CD3-CRTh2-이다. 보다 바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 25%, 35%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 CD127+CD117+CD3-CRTh2- 및 또한 CD7+, NKp44-, CD94-, 및/또는 Lin-, 및/또는 또한 CD26+, 및/또는 CD62L+이다. 방법의 일부 구현예에서, 집단내 세포의 적어도 25%, 35%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 CD127+CD117+Lin-CRTh2-(여기서 Lin-는 CD3-를 포함한다), 및 임의로 또한 CD7+, NKp44-, 및/또는 CD94-, 및/또는 임의로 또한 CD26+ 및/또는 CD62L+이다. 바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 CD127+CD117+Lin-CRTh2-(여기서 Lin-는 CD3-를 포함한다), 및 임의로 또한 CD7+, NKp44-, 및/또는 CD94-, 및/또는 임의로 또한 CD26+ 및/또는 CD62L+이다. 일부 바람직한 구현예에서, 집단내 세포의 적어도 90%는 표현형 CD127+CD117+Lin-CRTh2-CD7+ 또는 CD127+CD117+Lin-CRTh2-CD94-, 및 임의로 CD26+ 및/또는 CD62L+를 가지고; 보다 바람직하게는 집단내 세포의 적어도 99% 또는 100%는 표현형 CD127+CD117+Lin-CRTh2-CD94-, 및 임의로 CD26+ 및/또는 CD62L+를 갖는다.
치료 방법 및 조성물
본 발명은 선천성 면역계 조절이 필요한 환자를 치료하는데 사용하기 위한 선천성 림프 세포 전구체(ILCP)를 포함하는 조성물을 포함한다. 따라서, 본 발명은 환자를 치료하기 위한 이러한 화합물의 용도 및 이들을 치료하는 방법을 포함한다.
다양한 구현예에서, 환자는 기생충 감염, 장 병원체 감염, 종양, 바이러스 감염, 알레르기, 천식, 염증 또는 자가면역 질환(예컨대, 다발 경화증, 전신 홍반성 루푸스, 또는 제I형 진성당뇨병)을 갖는다.
다양한 구현예에서, 환자는 면역 결핍성이거나, 면역약화되거나, 면역 억제될 수 있다. 다양한 구현예에서, 환자는 암 환자이거나 만성 질환(예컨대, 크론 질환(Crohn's disease), IBD)를 갖는다.
다양한 구현예에서 본 발명은 환자에게 ILCP의 정제된 집단을 투여함을 포함하는, 사람 환자의 치료 방법을 포함하며, 여기서 집단내 세포의 적어도 90%는 표현형 CD34-CD7+CD127+CD117+CD45RA+를 가지고/가지거나, NKp44 및 RORγt의 발현을 결여하고/하거나, IL-1R1+ 및 CD69-, 및/또는 임의로 CD26+, 및/또는 CD62L+이다.
다양한 구현예에서 본 발명은 환자에게 ILCP의 정제된 집단을 투여함을 포함하는, 사람 환자의 치료 방법을 포함하며, 여기서 집단내 세포의 적어도 90%는 표현형 Lin-CD34-CD7+CD127+CD117+CD45RA+을 가지고/가지거나, NKp44 및 RORγt의 발현을 결여하고/하거나, IL-1R1+ 및 CD69-, 및/또는 임의로 CD26+, 및/또는 CD62L+이다. 일부 구현예에서, 집단내 세포의 적어도 90%, 95%, 또는 99%는 Lin-CD7+CD127+CD117+CRTh2-이다. 일부 구현예에서, 집단내 세포의 적어도 90%, 95%, 또는 99%는 Lin-CD94- CRTh2-CD127+CD117+이다.
바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 90%, 95%, 또는 99%는 CD127+CD117+CD3-CRTh2-이다. 보다 바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 90%, 95%, 또는 99%는 CD127+CD117+CD3-CRTh2- 및 또한 CD7+, NKp44-, CD94-, 및/또는 Lin, 및/또는 또한 CD26+ 및/또는 CD62L+이다. 일부 바람직한 구현예에서, 집단내 세포의 적어도 90%, 95%, 또는 99%는 CD127+CD117+Lin-CRTh2-(여기서 Lin-는 CD3-를 포함한다), 및 임의로 또한 CD7+, NKp44-, 및/또는 CD94-, 및/또는 임의로 또한 CD26+ 및/또는 CD62L+이다. 바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 90%는 표현형 CD127+CD117+Lin-CRTh2-CD7+ 또는 CD127+CD117+Lin-CRTh2-CD94-, 및 임의로 CD26+ 및/또는 CD62L+를 갖고; 보다 바람직하게는 집단내 세포의 적어도 99% 또는 100%는 표현형 CD127+CD117+Lin-CRTh2-CD94-, 및 임의로 CD26+ 및/또는 CD62L+를 갖는다.
다양한 구현예에서, 단분화능 및 다분화능 ILCP, 특히 다분화능 ILCP는 적절한 인자와 조합되어 이들을 시험관내 또는 생체내에서 치료될 질환에 따라, 특수한 형태(ILC1, ILC2 또는 ILC3)로 분화하도록 할 수 있다. 일부 구현예에서, 질환에 따라서, ILCP의 분화를 증가시키거나 억제하거나 특수한 유형으로의 분화를 억제하는 것이 유리할 수 있다(참고: 예컨대, 제WO2016/138590호, US 제2016/0145344호, 및 US 제2016/0304574호, 이는 본원에 참고로 포함된다).
ILC 서브세트는 감염, 암, 염증, 조직 보수, 및 항상성을 포함하는 각종 질환 및 세포 공정에 연루되어 있다. 본원에 참고로 포함된, Tait Wojne et al, 2016. ILC3은 장에서 GALT 형성, 염증, 면역성, 및 항상성을 촉진하므로(상기 참고), 본 발명의 방법에 의해 생성된 ILC3을 사용하여 이러한 공정에 연루된 질환을 치료할 수 있다. ILC2는 조혈 및 비조혈 세포와의 상호작용을 통해 염증, 면역성, 조직 보수, 및 항상성에 영향을 미치므로(상기 참고), 본 발명의 방법에 의해 생성된 ILC2를 사용하여 이러한 과정에 연루된 질환을 치료할 수 있다. ILC1는 T-bet 및 IFN-γ를 발현하고 제1형 염증에 기여하므로(상기 참고), 본 발명의 방법에 의해 생성된 ILC1를 사용하여 이러한 과정에 연루된 질환을 치료할 수 있다.
세포는 환자에게 당해 분야의 통상의 기술로 투여할 수 있다. 바람직하게는, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 또는 1010개의 ILCP 세포를 환자에게 투여한다.
자가, 동종이식성, 또는 이종이식성 ILC 또는 ILCP를 대상체, 바람직하게는 사람에게, 조직 또는 혈액 등으로 직접 주사하여 투여할 수 있다. 바람직하게는, 세포는 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여된다. 세포는 단일 또는 적어도 2, 3, 4, 5회 등의 주사로 투여될 수 있다. 세포는 유전적으로 변형시켜 이들의 면역 인식을 수정할 수 있다.
ILCP를 사용한 스크리닝 방법
본 발명은 ILCP의 ILC1, ILC2, ILC3, 및/또는 NK 세포로의 분화를 조절하는(즉, 억제하거나 향상시키는) 화합물에 대해 스크리닝하는 방법을 포함한다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 ILCP의 집단을 생체내 또는 시험관내에서 시험 화합물과 접촉시키고 분화시 화합물의 효과를 평가한다. 효과는 세포 집단내에서 세포의 표현형에 있어서의 변화를 검출함으로써 관찰할 수 있다.
시험 화합물은 천연 화합물 또는 합성 화합물일 수 있다. 다양한 구현예에서, 시험 화합물은 바이러스, 기생충, 미생물, 또는 세균 유기체(즉, HIV 또는 말라리아) 또는 이의 성분(예컨대, DNA 또는 단백질)일 수 있다. 다양한 구현예에서, 시험 화합물은 사이토킨 또는 사이토킨의 혼합물이다.
일부 구현예에서, 세포 집단내 세포의 표현형에 있어서의 변화는 시험 화합물과 접촉시키기 전 및 후에 세포 집단내 ILCP, ILC1, ILC2, ILC3, 및/또는 NK 세포의 수준을 측정함으로써 검출한다. 세포의 표현형은 실시예에 개시된 바와 같이 및 기술자에게 공지된 유사한 기술에 의해 검출할 수 있다. 일부 구현예에서, 시험 화합물과 접촉 후 ILCP, ILC1, ILC2, ILC3, 및/또는 NK 세포의 수준은 처리하지 않은 ILCP 대조군과 비교한다.
일 구현예에서, 본 발명은 선천성 림프 세포 전구체(ILCP)를 제공하는 단계, 세포 집단을 시험 화합물과 접촉시키는 단계, 및 세포 집단내에서 세포의 표현형에 있어서의 변화를 검출하는 단계를 포함하는, ILC의 발달에 영향을 미치는 화합물에 대한 스크리닝 방법을 포함한다.
일부 구현예에서, 시험 화합물은 ILCP의 분화에 있어서의 감소를 유발한다. 일부 구현예에서, 시험 화합물은 ILCP의 분화에 있어서의 증가를 유발한다. 일부 구현예에서, 시험 화합물은 특이적인 ILC 서브세트로의 분화에 있어서의 감소를 유발한다. 일부 구현예에서, 시험 화합물은 특이적인 ILC 서브세트로의 분화에 있어서의 증가를 유발한다.
일부 구현예에서, 방법은 ILCP를 이들을 분화시킬 수 있는 자극(예컨대, OP9-DL4 배양 시스템)과 조합시키는 단계 및 세포 집단을 시험 화합물과 접촉시켜 분화에 대한 화합물의 효과를 검출하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 화합물의 효과는 이러한 자극의 부재하에서 및/또는 다른 화합물 또는 자극(예컨대, 사이토킨)의 첨가시 측정된다.
일부 구현예에서, 방법은 마우스에게 선천성 림프 세포 전구체(ILCP)의 집단을 주입하는 단계 및 시험 화합물을 마우스에 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 마우스는 사람화된 마우스이다.
바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 25%, 35%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 표현형 CD34-CD7+CD127+CD117+CD45RA+를 가지고, NKp44 및 RORγt의 발현을 결여하며, IL-1R1+ 및 CD69-, 및/또는 임의로 CD26+, 및/또는 CD62L+이다.
바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 25%, 35%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 표현형 Lin-CD34-CD7+CD127+CD117+CD45RA+를 가지고, NKp44 및 RORγt의 발현을 결여하며, IL-1R1+ 및 CD69-, 및/또는 임의로 CD26+, 및/또는 CD62L+이다.
일부 구현예에서, 집단내 세포의 적어도 25%, 35%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 Lin-CD7+CD127+CD117+CRTh2-이다.
일부 구현예에서, 집단내 세포의 적어도 25%, 35%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 Lin-CD94-CRTh2-CD127+CD117+이다. 가장 바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 25%, 35%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 CD127+CD117+CD3-CRTh2-이다. 일부 구현예에서, 상기 집단내 세포의 적어도 25%, 35%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 또한 CD7+, NKp44-, CD94-, 및/또는 Lin-, 및/또는 또한 CD26+, 및/또는 CD62L+이다. 일부 구현예에서, 집단내 세포의 적어도 25%, 35%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 CD127+CD117+Lin-CRTh2-(여기서 Lin-는 CD3-를 포함한다), 및 임의로 또한 CD7+, NKp44-, 및/또는 CD94-, 및/또는 임의로 또한 CD26+ 및/또는 CD62L+이다. 바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 CD127+CD117+Lin-CRTh2-(여기서 Lin-는 CD3-를 포함한다), 및 임의로 또한 CD7+, NKp44-, 및/또는 CD94-, 및/또는 임의로 또한 CD26+ 및/또는 CD62L+이다. 일부 바람직한 구현예에서, 집단내 세포의 적어도 90%는 표현형 CD127+CD117+Lin-CRTh2-CD7+ 또는 CD127+CD117+Lin-CRTh2-CD94-, 및 임의로 CD26+ 및/또는 CD62L+를 가지고; 보다 바람직하게는 집단내 세포의 적어도 99% 또는 100%는 표현형 CD127+CD117+Lin-CRTh2-CD94-, 및 임의로 CD26+ 및/또는 CD62L+를 갖는다.
실시예
물질 및 방법
사람 혈액 및 조직 샘플
건강한 공여자로부터의 혈액 샘플을 Establissement Franγais du Sang (EFS, 파리 소재)로부터 파스퇴르 연구소(Institut Pasteur)가 서명한 동의하에 입수하였다. RORC 돌연변이(RORC-/--P1; RORC-/--P2, p.A421X/Q421X)를 지닌 환자로부터의 혈액 샘플은 이미 보고되어 왔다(26160376). 제대 혈액을 정상 분만으로부터 수집하였다. 편도는 편도선 절제술을 받은 소아 환자로부터 입수하였다. 태아 간은 14 내지 20주 범위의 임신 기간의 낙태아로부터 입수하였다. 사람 태아 간을 사용한 실험은 파스퇴르 연구소의 의학 및 윤리 위원회(Medical and Ethical Committees)에 의해 승인되었고 프랑스 법률에 완전히 부응하여 수행되었다. 폐는 수술한 환자로부터 입수하였고 샘플은 제이엠 살렌바브(JM Sallenave)(Hoepital Bichat) 박사가 제공하였다. 장은 수술한 결장암 환자로부터 입수하였고 엠 알레츠(M Allez)(Hoepital Saint Louis) 박사가 제공하였다. 사전 동의서는 각각의 환자로부터 요청하여 입수하였고 넥커 의학 학교(Necker Medical School), 파리 데카르트 대학(Paris Descartes University), 비카 병원(Hoepital Bichat), 생 루이 병원(Hoepital Saint Louis), 복지 사업 - 드 파리 병원(Assistance Publique - Hoepital de Paris)의 기관감사위원회에 의해 승인되었다.
사람 면역계(HIS) 마우스 모델
BALB/c R ag2 -/- Il2rg -/- S irpa NOD(BRGS) 마우스는 기술되어 왔으며 파스퇴르 연구소에서 격리자에 의해 유지되었다. CD34+ HSC 또는 CD117+ ILC를 FACS Aria를 사용하여 건강한 공여자의 말초 혈액으로부터 분류하였다. 태아 간 CD34+ HSC를 CD34 마이크로비드 키트(Microbead Kit)(Miltenyi)를 사용하여 단리하였다. 생체내 전달 실험을 위해, 1 내지 3 x 105개의 CD117+ ILC 또는 CD34+ HSC를 아치사 조사된(sublethal irradiated)(3Gy) 신생(3 내지 7일령) BRGS 마우스내에 0.3 μg의 IL-2 및 -7(Miltenyi)과 함께 간내 주사하였다. 마우스에게 IL-2, -7, -1β, -23, -25 및 -33(각각 0.3 μg)을 복강내 주사에 의해 매주 제공하고 이식 4주 후에 분석하였다. HIS 마우스의 생성을 위해, 태아 간 유래된 CD34+ HSC를 아치사 조사된(3Gy) 신생(3 내지 7일령) BRGS 마우스내로 간내 주사하였다. 마우스를 주사 후 8 내지 9주째에 희생시켰다. 실험은 파스퇴르 연구소의 윤리 위원회에 의해 승인되었고 프랑스 교육연구부(French Ministry of Education and Research)에 의해 인증되었다.
혈액, 편도, 위, 태아 간 및 폐로부터의 세포 단리
CB 및 PB로부터의 사람 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 피콜-파크(Ficoll-Paque)(GE Healthcare) 밀도 구배 원심분리로 단리하였다. 태아 간 및 편도로부터의 단일 세포 현탁액을 70-μm 여과기를 통한 기계적 파괴로 달성하였다. 폐 및 장 샘플을 잘게 썰어서 리버라제(Liberase) TL(25 μg/ml; Roche) 및 DNase I(50 μg/ml; Sigma-Aldrich)으로 45분 동안 37℃ 진탕 항온처리기 속에서 소화시켰다. 소화된 조직을 70-μm 여과기를 통과시켰다. 간, 폐 및 위로부터의 림프구를 피콜-파크 밀도 구배 원심분리로 단리하였다.
FACS 분석 및 세포 분류
FACS 분석을 위해, 세포를 가요성의 실행가능한 염료(Flexible Viability Dye) eFluor 506(eBioscience)로 10분 동안 먼저 염색한 후 20분까지 표면 항체 염색을 브릴리언트 염색된 완충제(Brilliant Stained Buffer: BD)를 사용하여 빙상에서 염색하였다. 세포내 TF 염색을 포함하는 실험을 위해, 세포를 고정시키고, 투과시키고 Foxp3/전사 인자 염색 완충제 키트(eBioscience)를 사용하여 염색하였다. 세포내 사이토킨 염색을 위해, 세포를 PMA(10ng/ml; Sigma) 및 이오노마이신(1μg/ml; Sigma)을 사용하여 Golgi Plug(BD)의 존재하에 3시간 동안 자극하였다. 세포를 고정시키고, 투과하며 Cytofix/Cytoperm Kit(BD)를 사용하여 염색하였다. 샘플을 LSRFortessa(BD) 위에서 획득하고 FlowJ10(Tree Star)로 분석하였다.
건강한 PB로부터의 세포 분류를 위하여, PBMC를 먼저 T 세포, B 세포, pDC 및 단핵세포를 바이오틴-접합된 항-CD3, 항-CD4, 항-CD19, 항-CD14, 항-CD123으로 표지시킨 다음 제조업자의 설명서에 따라서 항-바이오틴 미세비드(Miltenyi)로 표지함으로서 고갈시켰다. CB 및 조직으로부터의 분류를 계통 고갈(lineage depletion)로 수행하였다. 다량의 집단을 순도 ≥ 99%로서 또는 단일 세포 지수 분류(둘 다 FACSAria II 사용; BD)로서 분류하였다.
다량의 RNA 단리, 라이브러리 작제, 서열분석 및 분석
각각의 집단으로부터의 103개의 세포를 50 μl의 분해/결합 완충제(Life Technologies)내로 직접 FACS 분류하였다. mRNA를 다이아나비드 올리고(Dynabeads oligo)(dT)(Life Technologies)로 포획하고, 세척하고 70℃에서 10 μl의 10mM 트리스-Cl(pH7.5)을 사용하여 용출시켰다. 단일-세포 RNA-seq에 대해 전개시킨 기술된 바와 같은(24531970), MARS-seq의 유도체를 사용하여 집단당 최소 2개의 복제물를 갖는 발현 라이브러리를 생산하였다. 라이브러리당 평균 4백만개의 판독물을 서열분석하고 디폴트 매개변수(default parameter)(19289445)를 지닌 TopHat v2.0.10을 사용하여 사람 참고 게놈(NCBI)에 정렬하였다. 발현 수준을 각각의 샘플의 경우 전체 수의 판독물에 대해 HOMER 소프트웨어(homer.salk.edu)를 사용하여 계산하고 표준화하였다. 이는 임의의 2개의 아형의 평균 사이의 노이즈(8개 판독물)에 걸쳐 2배 차이를 지닌 고도로 발현된 유전자에 집중되었다. KEGG 분석을 DAVID(12734009)를 사용하여 수행하였다.
ChipMentation을 사용한 크로마틴 면역침전 및 서열 분석(Chip-Seq)
FACS 분류된 세포(20-50K)를 1% 포름아미드를 함유하는 PBS(Sigma) 속에서 10분 동안 실온에서 ChIP-Seq 분석을 위해 즉시 가교결합시켰다. 가교결합은 글리신(0.125M의 최종 농도)를 가한 후 5분 동안 실온에서 항온처리함으로써 퀀칭(quenching)하였다. 세포를 빙상에 두고, PBS로 세척하고 -80℃에서 저장하기 위해 스냅-동결(snap-frozen)시켰다. 펠렛을 병행하여 가공시켜 기술적 편차를 최소화하였다. 세포를 100μl의 초음파 완충액(1% SDS, 10mM EDTA, 50mM 트리스-HCl pH8 및 1x EDTA-유리된 완전 프로테아제 억제제; Roche) 속에 재현탁시키고 0.65ml의 Bioruptor 초음파 튜브(Diagenode)에 이전시켰다. 빙상에서 15분 항온처리한 후, 세포를 30주기(30초 작동 - 30초 정지) 동안 Bioruptor Pico 초음파기(Diagenode)를 사용하여 초음파처리함으로써 크로마틴을 ±250 bp 단편으로 전단시켰다. 크로마틴을 900μl의 10x ChIP 희석 완충액(0.01% SDS, 1.1% 트리톤 X-100, 1.2mM EDTA, 16.7mM 트리스-HCl pH8, 167mM NaCl)을 가함으로써 평형화시키고 밤새 4℃에서 1μl의 H3K4Me2-특이적인 항체(ab32356, Abcam) 또는 음성 대조군으로서 정상의 토끼 IgG(sc-2027, Santa Cruz)와 함께 항온처리하였다. 또한, IP당 20μl의 단백질 A Dynabeads(Thermo Fisher Scientific)을 0.1% BSA(Sigma)를 함유하는 PBS 속에서 밤새 4℃에서 항온처리함으로써 차단시켰다. 다음날, 비드(bead)를 원래의 용적으로 ChIP 희석 완충액을 사용하여 재현탁시키고 크로마틴 추출물에 가하였다. 4℃에서 2시간 항온처리한 후, 비드를 수집하고 저염 완충액(0.1% SDS, 1% 트리톤 X-100, 2mM EDTA, 20mM 트리스-HCl pH8, 150mM NaCl), 고 염 완충액(0.1% SDS, 1% 트리톤 X-100, 2mM EDTA, 20mM 트리스-HCl pH8, 500mM NaCl) 및 LiCl 완충액(10mM 트리스-HCl pH8, 1mM EDTA, 250mM LiCl, 0.5% NP-40, 0.5% 데옥시콜산)으로 세척하였다. 자기 비드 상에 고정된 크로마틴-항체를 이후에 최근 기술된 바와 같이(Schmidl et al., 2015) 태그화(tagmentation)에 적용시켰다. 용출된 DNA를 MinElute 스핀 컬럼(Qiagen)을 사용하여 정제하고 8 내지 12주기 동안 Nextera PCR 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 라이브러리를 이중(0.5x-2.0x) SPRI Ampure XP 비드(Beckman Coulter)를 사용하여 정제하고, 혼주시키고(pooling)(서열분석 작동당 10회까지) 단일-판독 75bp 프로토콜을 작동하는 NextSeq500 (Illumina)에서 서열분석하였다.
ChIP-Seq 데이타 가공, 분석 및 가시화
판독물을 BaseSpace(Illumina)를 사용하여 탈멀티플렉스화(demultiplex)하고 마우스 게놈(mm10 빌드(build))에 Bowtie(Langmead, B. & Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods 9, 357-359, doi:10.1038/nmeth.1923 (2012))를 사용하여 표준 설정으로 정렬시키고, 독특하게 맵핑될 수 없는 판독물을 제거하였다. 색인화되고 분류된 밤 파일(bam file)을 추가의 분석을 위해 HOMER(Heinz, S. et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell 38, 576-589, doi:10.1016/j.molcel.2010.05.004 (2010))에 대해 분석하였다. Tag 디렉토리를 중복 판독물(-tbp 1 선택사항)이 제거된 각각의 샘플에 대해 생성시켰다. 표준화된 수(백만당 판독물)을 나타내는 BedGraph 파일을 직접 가시화를 위해 UCSC Genome Browser(https://genome.ucsc.edu/)에서 makeUCSCfile HOMER script를 사용하여 생성시켰다. H3K4Me2 농축된 영역은 -영역 -크기 1000 -minDist 2500 선택사항을 지닌 HOMER findPeaks를 사용하여 확인하였다. 2개의 샘플 사이의 오버랩핑(overlapping) 및 비-오버랩핑 영역을 BEDTools(Quinlan, A. R. & Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics 26, 841-842, doi:10.1093/bioinformatics/btq033 (2010))의 교차 기능 또는 최소 1bp의 오버랩을 필요로하는 HOMER mergePeaks script(-d 제공된 선택사항)를 사용하여 확인하였다. 세포형-특이적인 H3K4Me2+ 영역의 세트를 적외선열지도로서 Java TreeView(Saldanha, A. J. Java Treeview--extensible visualization of microarray data. Bioinformatics 20, 3246-3248, doi:10.1093/bioinformatics/bth349 (2004))를 사용하여 가시화하였다. 영역/피크를 추정의 표적 유전자 GREAT(McLean, C. Y. et al. GREAT improves functional interpretation of cis-regulatory regions. Nat Biotechnol 28, 495-501, doi:10.1038/nbt.1630 (2010))에 지정하였다. GREAT를 후속적으로 사용하여 공지된 경로 시그니처에 대한 이들 유전자의 농축물 배경으로서 전체 게놈을 사용하여 계산하였다.
다량 및 단일 세포 배양물
모든 시험관내 배양 실험을 2% 사람 AB 혈청(EFS)이 보충된 이쎌 배지(Yssel's medium)(18432890) 속에서 수행하였다. 2-3 x 103개의 기질 세포를 배양 하루밤 전에 96-웰 환저 플레이트 속에 예비-씨딩하였다. 이쎌 배지는 IMDM(Invitrogen) 및 0.25%(w/v) 소 혈청 알부민(Sigma), 1.8 μg/L 2-아미노 에탄올, 40 μg/L Apo-트랜스페린, 5 μg/L 인슐린 및 페니실린/스트렙토마이신을 사용하여 연구소내에서 제조한다. 다량 배양을 위하여, 100 내지 300개의 FACS 분류된 세포를 기질 세포 위에 플레이팅하였다. 클로닝 실험을 위해, 세포를 기질 세포로 예비-씨딩된 96-웰 플레이트내로 색인-분류하였다. 사이토킨 IL-2, -7(각각 20 ng/ml, Miltenyi), IL-12, -18, -25, -33, -1β, -23(각각 20 ng/ml, R&D)은 나타낸 바와 같은 다양한 조합으로 제공하였다. 다량의 배양을 위해, 신선한 사이토킨 및 배지를 5일마다 보충하고 10일 확장 후 분석하였다. 클로닝 실험을 위해, 사이토킨 및 배지를 7일마다 보충하고 배양 14 내지 18일 후 분석하였다.
실시예 1: 사람 말초 혈액 CD117 + ILC의 특성화
데이타는 달리 규정하지 않는 한 중앙값(median)으로 나타낸다. 각각의 실험에 대한 샘플 크기 및 실험의 중복 수는 도면의 범례에 포함된다. 순환하는 ILC는 건강한 개인 뿐만 아니라 다양한 임상 증상을 앓는 환자의 계통―CD7+CD56―CD127+ 말초 혈액(PB) 세포내 낮은 빈도의 집단(총 CD45+ 세포의 < 0.2%)으로 확인할 수 있다((Hazenberg and Spits, 2014; Munneke et al., 2014; 도 1a 및 도 1b). PB ILC의 ILC1, ILC2 및 ILC3으로의 추가의 분획화는 CD161, CRTh2, CD117 및 NKp44을 포함하는, 태아 조직 및 편도에서 ILC 서브세트를 확인하는 표현형 마커를 사용하여 달성하였다(Spits et al., 2013). 따라서, 앞서의 보고는 사람 혈액 속에서 순환하는 ILC2(CD161+CRTh2+GATA-3+ 세포) 뿐만 아니라 ILC1(CD161+CRTh2―CD117―T-BET+ 세포)도 확인하였다(Mjoesberg et al., 2011). 순환하는 ILC는 또한 CRTh2 발현을 결여하는 우세한 CD117+ 서브세트를 포함한다((Munneke et al., 2014; Vιly et al., 2016); 도 1a 및 도 1b). 앞서의 연구는 조직-상주 ilc3이 cd117을 강력하게 발현하므로 이러한 세포를 순환하는 ILC3으로서 고려하였다(Cella et al., 2009; Cupedo et al., 2009). 그러나, PB CD117+ ILC는 이들이 NKP44 및 ILC3을 확인하는 전사 인자 (TF) RORγt의 발현을 결여한다는 점에서 위(gut) CD117+ ILC와는 현저히 상이하다(도 1c). 따라서, PB CD117+ ILC는 자극 후 IL-17A 또는 IL-22를 생산하지 않는 반면, 위 CD117+ 세포는 이러한 ILC3-관련된 사이토킨을 풍부하게 생산한다(도 1d). 흥미롭게도, 순환하는 CD117+ ILC는 고 수준의 IL-1R1, CD45RA를 발현하며 CD69―인 반면, 위에 상주하는 ILC3은 CD69+이지만 IL-1R1― 및 CD45RA―이다(도 1c). 이러한 관찰은 PB CD117+ ILC가 진짜(bona fide) ILC3이 아님을 시사한다.
PB CD117+ ILC는 다른 공지된 ILC 서브세트(즉: T-BET, EOMES, GATA-3hi)를 특징화하는 시그니처 TF를 발현하지 않았다(도 1c). 따라서, PB CD117+ ILC는 CD94, CD244, CRTh2와 같은, NK 세포, ILC1 및 ILC2와 연합된 마커를 발현하지 못하였고(도 1a) 약리학적 활성인자를 사용한 자극 후 IFN-γ 또는 IL-13을 생산하지 않았다(도 1d). 이와 함께, 이러한 결과는 PB CD117+ ILC가 임의의 후보자 ILC 서브세트를 나타내지 않음을 시사한다.
실시예 2: CD117 + ILC의 전사 및 크로마틴 랜드스케이프(landscape)는 ILC 전구체 프로파일을 나타낸다
CD117은 혈액-림프 선조세포에서 고도로 발현되므로(Ikuta and Weissman, 1992; Kikushige et al., 2008), PB CD117+ ILC는 수임되지 않은 림프 전구체를 포함할 수 있다. PB CD117+ ILC의 동일성(identity)을 추가로 이해하기 위하여, 고도로 정제된 순환하는 CD117+ ILC의 트랜스크립토믹 및 에피게네틱 랜드스케이프를 프로파일링하여 CD34+ HSC와 비교하였고(도 2a); 후자는 다-계통 분화능을 지닌 미성숙 조혈 선조세포를 나타낸다(Baum et al., 1992; Mohtashami et al., 2010).
크로마틴 면역침전을 발명자가 작은 수의 정제된 세포의 에피게놈을 직접 분석하도록 트랜스포사제-매개된 태그화(ChIPm-Seq)를 사용하여 고-처리량 서열분석에 따라 수행하였다. CD34+ HSC 및 CD117+ ILC의 일반적인 및 독특한 후생적 특징을 나타내기 위하여, 히스톤 H3 라이신 4 디메틸화(H3KMe2)는 다른 히스톤 변형보다 우수한 정확성으로 활성 및 유지된(poised) 유전자 조절 성분(GRE) 둘 다를 표시하므로, 맵핑하였다(Zhang et al. 2012 Cell, Koche et al. Cell Stem Cell 2011). 대략 18,000 및 35,000개의 GRE가 CD117+ ILC 및 CD34+ HSC에서 각각 확인되었고(도 2b), 이의 대부분은 인트론 및 유전자사이 영역(intergenic region)에 위치하였다(Supp. Fig. X). 유의적인 수의 H3K4Me2+ GRE가 2개의 세포형 사이에 공유되었고: CD117+ ILC에서 확인된 GRE의 89%는 HSC에서 유사한 농축을 나타내었고 이의 많은 수가 하우스키핑 기능(housekeeping function)을 암호화하고 있는 13159개의 유전자와 관련되었다. 그럼에도 불구하고, CD117+ ILC에서 검출된 H3K4Me2+ GRE의 11%는 잠재적으로 2283개 유전자를 조절하는, CD34+ HSC에서 부재하였다. 이러한 유전자의 경로 분석은 면역계 및 림프구 관련 과정을 위한 강력한 농축을 나타내었다(도 2c). 예를 들면, IL1R1, IL7R, IL2RA/B와 같은 림프 개발 및 기능에 중요한 사이토킨/케모킨 신호전달 유전자는 CD117+ ILC-특이적인 GRE에 연결되었다. 역으로, CD34+ HSC(CD34+ HSC내 모든 GRE의 54%)에서만 활성인 GRE는 항상성, 혈소판 활성화 및 노치 신호전달 경로를 포함하는 조혈에 중요한 보다 일반적인 경로에 연루된 가까운 유전자에 위치하였다(도 2c).
CD117+ ILC 및 CD34+ HSC의 트랜스크립톰을 비교하기 위하여, RNA 서열분석(RNA-Seq)을 수행하였다. 유전자 발현 프로파일에 있어서의 명확한 차이는 CD117+ ILC에서 실질적으로 보다 높은 수준으로 발현된 1540개 유전자의 거대 집단과 함께 드러났다(도 2d). 이들 중에서 IKZF1, CD2, CD7 및 IL7R (도 2d)를 포함하는 림프 계통과 강력하게 연결된 많은 유전자가 존재하였다. 대조적으로, CD34+ HSC 세포는 ID1, GATA1, GATA2 및 MYB를 포함하는, 다양한 조혈 계통(도 2d) 뿐만 아니라 골수 계통(CSF3R, CSF2RB, FLT3)의 사이토킨 수용체의 광범위한 발달에 연루된 유전자도 고도로 발현하였다. HSC와 비교하여, CD117+ ILC는 ID2, GATA3, TOX 및 TCF7를 포함하는, 쥐 ILC 발달에 필수적인 것으로 밝혀진 고 수준의 TF를 발현한다. RAG1, RAG2, EBF1, CD3E, BCL11A 또는 LMO2와 같은, T 및 B 세포 발달의 특징적인 전사체는 이들 유전자의 일부가 HSC에 의해 발현되지만, CD117+ ILC에서 검출되지 않았다.
CD117+ ILC의 트랜스크립토믹 및 에피게네틱 분석 둘 다가 강력한 림프 시그니처를 확인하였지만, 이러한 데이타세트는 CD117+ ILC의 발달 상태로의 통찰력을 획득하기 위하여 교차시켰다. CD117+ ILC에서 가장 고도로 발현된 유전자의 실질적인 비율(26%)은 CD117+ ILC-특이적인 GRE의 바로 부근에 위치하였다(도 2e). 놀랍게도, 이들은 ID2, GATA3, ETS1, TOX, TCF7, RORA 및 NOTCH1를 포함하는, 마우스 ILC 발달에 이미 연루된 많은 전사 인자를 포함하였고(도 2e) - 이는 선천성 림프 운명에 대한 CD117+ ILC의 개입(commitment)과 일치한다. 대조적으로, 주목할만한 발현 수준은 성숙한 ILC TF(EOMES, TBX21, RORC), 사이토킨 수용체(CCR6, IL1RL1, IL23R) 또는 시그니처 사이토킨(IFNG, IL13, IL5, IL22, IL17A) 중 어느 것에 대해서도 검출되지 않았다. 그러나, 이러한 성숙한 ILC 동일성 유전자 중 일부는 H3K4Me2로 이미 표시되었으며, 침착한 상태로 이들이 상주함을 입증한다(도 2e). 대조적으로, B 및 T 세포 발달의 주요 조절인자(RAG1, RAG2, EBF1, BCL11A, HES1, LMO2)는 H3K4Me2로 선택적으로 표시되지 않았다. 이와 함께, 이러한 분석은 CD117+ ILC가 후성적인 침착한 상태의 주요한 성숙 ILC 시그니처 유전자를 지닌 다분화능 ILC 전구체(ILCP)를 닮은 TF 발현 프로파일을 수반하는 림프-편향된 선조세포를 나타냄을 시사한다.
실시예 3: 말초 혈액 CD117 + ILC는 다분화능 ILC 전구체(ILCP)를 포함한다
순환하는 CD117+ ILC의 조혈 잠재능을 평가하기 위하여, 이러한 세포를 다양한 사이토킨의 존재하에서 대량 배양하였다. CD117+ ILC는 CD25, CD127 및 CD121a(IL-1R1)를 발현하므로(도 1a, 도 1c), IL-2, IL-7 및/또는 IL-1β를 이러한 배양물에 가하였다. 다량의 배양물은 IL-2 및 IL-7의 존재하에서 최소로 확장되는 반면, 세포를 IL-1β 속에서 배양하는 경우 강력한 증식이 관찰되었다(도 3a). ILC1/NK(IL-12, -18), ILC2(IL-25, -33) 또는 ILC3(IL-23) 발달을 구동할 수 있는 사이토킨의 추가의 존재는 IL-1β를 사용하여 수득된 것보다 세포 수율을 추가로 증가시키지 않았다(도 3a). 대량 배양된 세포는 B(CD19+) 또는 T(CD3+CD5+) 세포를 지니지 않았지만 CD161+이고 다양한 수준의 CD117 및 CD25를 발현한 CD7+ 세포의 순수한 집단을 포함하였다(도 3b).
놀랍게도, 확장된 세포는 일부 EOMES+CD94+ NK 세포 뿐만 아니라 3개의 기본 ILC 그룹: IFN-γ+ ILC1, IL-13+ ILC2 및 NKp44+IL-17A+IL-22+ ILC3을 나타내는 세포도 포함하였다(도 3b). IL-25 및 IL-33 보충은 이러한 배양물에서 ILC 서브세트의 분포를 적절히 변경시키지 않았지만, IL-12의 첨가는 EOMES+CD94+ IFN-γ-생산 NK 세포의 발달을 촉진하였고 IL-23은 IL-17A-생산-ILC에 중요하였다(도 3b). 이러한 결과는 다-계통 ILC 및 NK 세포 생성을 뒷받침하는 사이토킨 '혼합물'(IL-2, IL-7, IL-1β, IL-23)을 정의할 뿐 아니라 PB CD117+ ILC가 다-계통 ILC 전구체(ILCP)를 지님을 시사한다.
순환하는 CD117+ ILC의 다-계통 분화능을 B 세포, T 세포 및 골수 세포 발달에 대해 허용되는 개질된 기질 세포-기반 배양 시스템을 사용하여 추가로 특성화하였다(도 3c; Mohtashami et al., 2010)). 더욱이, 이러한 시스템은 최소의 가소성으로 클론 수준에서 사람 NK 세포 및 ILC 서브세트를 집중적으로 확장시킬 수 있다(Lim et al., 2016). OP9 및 OP9-DL4에서 배양된 단일 PB CD117+ ILC의 후대세포를 분석하여 IFN-γ, IL-13, IL-17A 및/또는 IL-22를 생산하는 EOMES+ NK 세포 및 ILC 서브세트를 확인하였다(도 3d). OP9-DL4 기질은 강력한 Notch 리간드를 발현함으로써 본 발명자가 이러한 경로의 개시(triggering)에 대한 영향을 평가하도록 한다(Mohtashami et al., 2010). 340개의 클론 배양물에 대한 본 발명자의 분석은 몇가지 의견이 이루어지도록 한다. 첫째로, PB CD117+ ILC는 단분화능 및 다분화능 ILC 전구체(ILCP)의 이종 집단을 나타낸다. 단일의 CD117+ ILC로부터 유래된 배양물의 거의 1/2은 단일의 ILC 서브세트(ILC1, ILC2 또는 ILC3 단독)를 생성하므로 계통-제한된 ILCP를 나타내지만, 나머지는 2개 이상의 별도의 Lin-CD7+ ILC 계통을 생성할 수 있는 다분화능 ILCP이다(도 3e). B 세포 및 T 세포 분화능은 관찰되지 않았다. 둘째로, 다분화능 ILCP 집단내에서, 실질적인 분획(9 내지 17%)은 모든 3개의 ILC 서브세트를 생성할 수 있으며 미성숙의 수임되지 않은 ILCP를 나타내는 경향이 있다. 더욱이, 클론성 IFN-γ+ 배양물은 또한 EOMES+ NK 세포를 포함하며 일부 PB ILCP가 단일 세포 수준에서 '헬퍼' 및 '세포독성' ILC 게통 둘다를 생성하는 잠재능을 가짐을 입증한다. 셋째로, Lin-CD7+ ILC 클론의 서브세트는 시험한 임의의 사이토킨을 생산하는데 실패하였다(도 3e). 이러한 클론은 고 수준의 CD7 및 CD117을 유지하였지만 다른 ILC 마커는 결여하였으므로, 이들은 추가로 분화하지 않는 ILCP를 나타낼 수 있다. 넷째로, Notch 신호는 ILC3-함유 세포의 다분화능 및 발달이 OP9-DL4에서 향상되므로 CD117+ ILCP의 세포 운명 잠재능에 명확하게 영향을 미친다(도 3e). 이와 함께, 이러한 데이타는 PB CD117+ ILC를 수임된 ILC 선조세포의 순환하는 혼주물로서 확인한다. 다량 및 클론 분석의 비교는 CD117+ ILC 세포 운명 잠재능의 이질성을 정의하고 기능적 다분화능을 확립하기 위한 단일 세포 시도의 중요성을 명확하게 입증한다.
실시예 4: 순환하는 CD117 + ILCP는 사람화된 마우스에서 생체내 다중-ILC 분화능을 갖는다.
PB CD117+ ILCP의 생체내 분화능을 다음에 평가하였다. 앞서의 연구는 사람 CD34+ 조혈 줄기 세포(HSC) 선조세포가 이식된 심각하게 면역결핍성인 마우스 균주의 림프(B, T, NK) 및 골수(DC, 대식구, 호중구) 세포 서브세트를 생성하는 능력을 입증하였다((Shultz et al., 2012)에서 검토됨). 견고한 다-계통 사람 조혈 세포 이식이 허용되는 BALB/c R ag2 -/- Il2rg -/- S irpa NOD(BRGS) 마우스를 사용하였다(Legrand et al., 2011). 동일한 공여자로부터의 사람 PB CD34+ HSC 및 CD117+ ILCP를 신생 BRGS 마우스로 양자 이전(adoptively transfer)시키고; 사이토킨 보충물(IL-2, IL-7, IL-1β, IL-23)을 제공하고 마우스를 4주 후 분석하였다(도 4a). 사람 CD34+ HSC가 이식된 BRGS 마우스는 골수에서 CD19+ B 세포 및 CD14/CD33+ 골수 세포를 발달시킨 반면, CD3/CD5+ T 세포 및 Lin- CD7+ NK/ILC는 위에서 검출되었다(도 4b). 대조적으로, PB CD117+ ILCP를 제공받은 BRGS 마우스는 Lin-CD7+ 세포를 발달시켰으나 골수 세포, B 세포 또는 T 세포를 발달시키지 않았다. 이전된 CD117+ ILCP로부터의 사람 CD45+ 후대세포는 비장, 폐, 위 및 간을 포함하는 다수의 기관에서 검출되었다(도 4c). 각각의 이러한 조직 부위에서, EOMES+ NK 세포 뿐만 아니라 다양한 CD127+ ILC 서브세트는 자극시 생체외(ex vivo)에서 IFN-γ, IL-13, IL-17A 및/또는 IL-22를 생산하는 것으로 확인되었다(도 4c). 이러한 결과는 PB CD117+ ILCP가 생체내에서 모든 공지된 ILC 서브세트 및 NK 세포를 생성하는 분화능을 지님을 입증한다. PB CD117+ ILCP는 골수, B 및 T 세포 분화능을 결여하므로, 이러한 세포는 수임된 ILC 선조세포를 포함한다고 결론지었다.
실시예 5: 사람 CD117 + ILCP는 생체내에서 CD34 + HSC로부터 발달한다.
CD34+ HSC와 CD117+ ILCP 사이의 발달 관계는 다음에 조사하였다. 면역결핍성 신생의 BRGS 마우스에 정제된 CD34+ HSC를 이식하고 8 내지 9주 후 희생시켰다(도 5a). 사람 CD45+ 세포를 골수, 폐, 간 및 비장에서 분석하였다. 예측한 바와 같이(Legrand et al., 2011), 이러한 상이한 조직 부위는 다양한 계통+ T, B 및 골수 세포를 포함하는, 사람 CD45+ 세포를 지녔다(도 5b, 데이타는 나타내지 않음). 더욱이, Lin-CD7+ 세포의 소세트 내에서, CD127+CD117+ 세포의 명확하게 정의된 소집단은 T-BET 및 EOMES 발현을 결여한 다수의 조직에서 파악될 수 있었다(도 5b). 이는 저 수준의 GATA-3 및 RORγt를 발현한 CD127+CD117+ 세포를 포함하였으며 NKp44- 이었으므로(도 5d), PB CD117+ ILCP를 닮았다. 생체외 자극은 CD127+CD117+ 세포로부터 사이토킨 생산을 유발시키는데 실패하였다(도 5e). 이러한 세포는 분류하여 IL-2, IL-7, IL-1β 및 IL-23의 존재하에서 다량 배양하였다. 확장된 세포는 IFN-γ, IL-13, IL-17A 및 IL-22를 생산할 수 있는 서브세트를 함유함으로써(도 5e) 사람 ILCP의 존재를 확인하였다. 이러한 결과는 CD34+ HSC가 생체내에서 CD117+ ILCP를 생성할 수 있음을 입증한다.
실시예 6: 사람 CD117 + ILCP는 태아 간, 제대혈 및 성체 폐에 존재한다.
사람 CD117+ ILCP가 발생하는 경우 발달 단계를 다음에 평가하였다. 이러한 기관은 몇가지 미성숙 조혈 전구체 집단을 지니고(Rollini et al., 2007) 마우스에서 림프 조직 유도인자 세포의 발달에 대한 견해로서 제안되므로(Cherrier et al., 2012) 태아 간(FL)에서 사람 ILC 서브세트를 먼저 연구하였다. FL 내의 Lin-CD127+ ILC는 우세한 CD117+ 서브세트를 함유한다. 흥미롭게도, 이러한 세포는 RORγt를 이들의 말초 혈액 대응부를 초과하는 수준으로 발현하며(도 1c) 더욱이 CCR6, 뉴로필린(Neuropilin)-1(NRP-1)을 발현하나 NKp44는 발현하지 않는다. 이러한 차이에도 불구하고, FL CD117+ ILC는 자극 후 유의적인 양의 IL-17A 또는 IL-22를 생산하지 않았으며 이는 이들이 완전히 성숙한 ILC3이 아니었음을 시사한다. 그럼에도 불구하고, FL CD117+ ILC가 시험관내에서 확장되는 경우, IL-17A-생산 ILC3이 풍부하게 생성되었다. 더욱이, IL17A+ ILC3은 DL4를 결여하는 기질 세포에서 발달하였으며 추가의 Notch 개입(engagement)이 이러한 과정에 필수적이지 않았음을 시사한다(도 6a). 흥미롭게도, FL CD117+ ILC의 다량의 배양물은 또한 비록 낮은 빈도에서지만, 검출가능한 IL-13- 및 IFN-γ-생산 세포를 함유한다. 클론 분석은 FL CD117+ ILC가 예측한 바와 같이, 고 비율의 ILC3 수임된 선조세포를 지님을 나타내었다. 여전히, 이러한 집단의 실질적인 분획은 Notch 리간드의 존재를 보다 명확하게 나타낸 다분화능 ILCP를 포함한다(도 6b, 6c). 이러한 결과는 사람 FL이 모든 공지된 ILC 서브세트를 생성할 수 있는 CD34-CD127+CD117+ 다분화능 ILCP를 지님을 입증한다. 이러한 조직 부위에서 ILC3-수임된 선조세포의 농축은 환경 신호가 이러한 기간 동안 ILC3 운명을 향한 다분화능 ILCP의 추가의 사양을 지시할 수 있음을 시사한다.
사람 제대혈(CB)로부터의 CD117+ ILC를 다음에 특성화하였다. 이들의 PB 대응물과 같이, NKp44 발현을 결여한 CB CD117+ ILC 뿐만 아니라, CCR6 및 NRP-1의 것은 CD45RA+이었다. 더욱이, CB CD117+ ILC는 RORγt 및 T-BET를 발현하는데 실패하였지만 GATA-3lo이었으므로, PB ILCP와 유사하다. PB CD117+ ILC와 같이, CB CD117+ ILC는 자극 후 생체외에서 사이토킨(IFN-γ, IL-13, IL-17A 또는 IL-22)을 생산하지 않았다. 그러나, IL-2, IL-7, IL-1β 및 IL-23내 CB CD117+ ILC의 다량의 배양은 IFN-γ+ ILC1, IL-13+ ILC2 및 IL-17A+ 또는 IL-22+ ILC3을 포함한 다양한 사이토킨-생산 ILC 서브세트를 생성하였다(도 6d). T, B 또는 골수 세포는 CB CD117+ ILC의 배양물에서 검출되지 않았다(데이타는 나타내지 않음). 추가의 클론 분석은 CB CD117+ ILC가 단분화능 및 다분화능 ILCP의 다양한 혼합물을 지녔음을 나타내었다(도 6e 및 도 6f). FL CD117+ ILC와는 달리, CB CD117+ ILC는 ILC3-수임된 선조세포에 대해 평향되지 않았지만, PB CD117+ ILCP에 보다 근접하게 유사하였다. PB 또는 FL로부터의 ILCP와 관련하여, Notch 자극은 향상된 빈도의 다분화능 ILCP(특히 IL-17A+ 및 IL-22+ ILC3에 대한 분화능을 갖는 것들)를 야기하며 사이토킨- ILC 클론의 빈도를 감소시켰으며, 이러한 경로는 특이적인 ILC 서브세트의 지시된 발달을 촉진시켰음을 시사한다.
성체 폐 조직으로부터의 CD117+ ILC의 표현형 및 분화능을 또한 시험하였다. 폐 CD117+ ILC는 NKp44+ 및 RORγt+ ILC의 분별되는 집단을 지녔지만 대부분 CD45A-이었다. 폐 CD117+ ILC의 다량의 집단은 다양한 사이토킨-생산 ILC 서브세트 및 EOMES+ NK 세포를 생성하였고(도 6g); 클론 분석을 사용한 추가의 분석은 폐 CD117+ ILC의 NKp44-를 단분화능 및 다분화능 ILCP의 혼합물로서 정의하였다(도 6h 및 도 6i). 이러한 결과는 다분화능 선조세포를 포함하는 다양한 ILCP가 사람 점막 조직내에 존재함을 입증한다.
실시예 7: 2차 림프 조직내 ILC 전구체 잔기
사람 2차 림프 조직(림프절, 편도)은 다양한 ILC 서브세트 및 이들의 전구체를 지닌다(Bernink et al., 2013; Cella et al., 2009; Fehniger et al., 2003; Mjoesberg et al., 2011; Renoux et al., 2015; Montaldo et al., 2015; Scoville et al., 2016). 따라서, 편도 CD117+ ILCP를 특성화하고 이들의 세포 운명 잠재능을 평가하는 것이 관심이 있었다. 소아 편도선으로부터의 CD117+ ILC는 자극되어 IL-17A 및 IL-22를 생산할 수 있는 우세한 NKp44+ ILC3 서브세트를 지닌다(Hoorweg et al., 2012). 이러한 집단은 또한 자극(IL-1β, IL-12, IL-23를 사용)이 이러한 세포의 사이토킨 배출을 변형시킬 수 있으므로 강력한 기능적 가소성을 갖는 것으로 여겨진다(Bernink et al., 2015; Bernink et al., 2013; Cella et al., 2010). 편도 CD117+ ILC 내에서, NKp44- 세포는 CD45RA+ 및 NRP-1-인 반면, NKp44+ 세포는 CD45RA- 및 NRP-1+인 것으로 밝혀졌다. 이는 NKp44+ ILC3가 보다 성숙되어 NKp44- 세포로부터 분화됨을 시사한다(Bernink et al., 2015). 그러나, 사이토킨 생산 프로파일은 편도 NKp44- 대 NKp44+ CD117+ ILC로부터의 다량 배양물에 있어서 상이하였다(도 6j 및 도 6M). 특히, IFN-γ+ 세포 및 IL-13+ 세포는 NKp44- 세포로부터 유래된 배양물, 특히 OP9 기질에서 보다 명백하였다(도 6j).
NKp44-와 NKp44+ CD117+ ILC 사이의 관계를 보다 잘 이해하기 위하여, 서브세트 둘 다로부터의 클론을 생성하고 이들의 사이토킨-생산 잠재능을 분석하였다. 현저한 차이가 관찰되었다. NKp44+ CD117+ ILC로부터 유래된 클론은 IL-17A 및/또는 IL-22를 생산하는 ILC3을 크게 농축시켰다(도 6n 및 도 6o). 클론의 분획은 앞서 나타낸 바와 같이 T-BET를 상향조절할 수 있는 '가소성' ILC3을 나타내는 경향이 있는 IFN-γ를 동시-발현하였다(14%)(Bernink et al., 2015). 대조적으로, NKp44- CD117+ ILC로부터 유래된 클론은 IL-22 및/또는 IL-17A를 생산할 뿐 아니라 풍부한 단일의 IFN-γ+ 클론 및 NKp44+ CD117+ ILC(도 6n 및 도 6o)로부터 검출되지 않는 단일의 IL-13+ 클론(도 6k 및 도 6l)을 생산하는 세포와는 상당히 이종이었다. IFN-γ+ ILC1 클론이 관찰되었다는 사실은 편도의 CD127+ ILC1이 IL-2, IL-23 및 IL-1β의 존재하에서 ILC3을 생산하는 IL-22로 분화한다는 앞서의 보고를 볼때 예측불가능하였다(Bernink et al., 2015). 최종적으로, 3개의 ILC 서브세트를 생성하는 다분화능 ILCP는 NKp44- CD117+ ILC에서만 발견되었다. 이와 함께, 이러한 결과는 편도의 CD117+ ILC가 NKp44- ILCP 뿐만 아니라 NKp44+ ILC3도 포함하여 상당이 이종임을 시사한다. 또한, 클론 검정의 본 발명자의 사용은 다량 배양 수준에서 가시화되지 않는 ILCP 레퍼토리의 정의를 명확하게 허용한다.
실시예 8: RORC-결핍성 환자는 ILCP를 지니지만 IL-17A + ILC3을 생성하지 못한다
CD34+CD45RA+CD117+ 표현형을 지닌 사람 2차 림프 조직에서 수임된 ILCP는 TF RORC를 고도로 발현하는 것으로 밝혀졌다(Scoville et al., 2016). CD117+ ILCP는 CD34+ HSC로부터 발육상 하부에 존재하므로(도 5), 앞서 기술된 CD34+CD45RA+CD117+ ILCP 서브세트가 이러한 경로에서 중간체임이 가능하다. RORC가 사람 CD117+ ILCP의 생성에 요구되는지의 여부에 촛점을 맞추기 위하여 RORC-결핍성 환자를 연구하였다. 사람에서 RORC 결핍성은 점막피부 칸디다증과 관련되어 있으며 앞서의 연구는 이러한 TF가 진균 병원체에 대해 보호하는 Th17 세포의 분화에 필수적임을 입증하였다(Okada et al., 2015). RORC 결핍증을 지닌 2명의 환자로부터의 말초 혈액 세포로부터의 ILC 서브세트를 연구하였다(도 7a). Lin-CD7+ 세포는 대조군 및 RORC-결핍성 환자 둘 다에서 CD56+ NK 세포(CD56bright 및 CD56dim 둘 다)의 우세한 집단을 함유하였으며 CD127+ ILC의 명백한 소집단도 또한 명확하게 검출되었다. 앞서 기술한 바와 같이(Okada et al., 2015), CD117-발현 ILC의 빈도에 있어서의 감소는, 이러한 집단이 여전히 명확하게 존재하였지만(도 7a 및 도 7b), RORC 결핍증을 지닌 환자에서 주목되었다. 대조적으로, ILC1이 존재하였으며 총 ILC로부터 ILC2의 퍼센트는 RORC의 부재하에서 유의적으로 증가하였다(도 7b). 대조군 및 RORC-결핍성 환자로부터 분류된 CD117+ ILC를 상기 기술한 바와 같이 다량 배양하였다. Lin-CD7+ 세포의 견고한 성장이 WT(야생형)와 RORC-결핍성 세포 사이에서 유의적인 차이없이 관찰되었다. IFN-γ, IL-13 또는 IL-22를 생산하는 세포를 포함하는, 다양한 사이토킨 생산 세포가 이러한 배양물에서 확인되었으나, IL-17A-생산 세포는 존재하지 않았다(도 7c). EOMES+IFN-γ+ NK 세포의 발달은 RORC의 부재에 의해 영향받지 않았다. 이러한 결과는 RORC가 NK 세포, ILC1, ILC2 또는 IL-22+ ILC3의 발달에 요구되지 않지만 사람에서 ILCP로부터 IL-17A+ ILC3의 생성에 필수적임을 입증한다.
실시예 9: 혈액에서 ILCP 마커의 분석
CD127 및 CD117이 ILCP에 의해 발현되지만, 이들은 특이적이지 않다. 최소의 필수적인 마커로의 견해를 획득하기 위해, ILCP를 고도로 농축시키는데 사용될 수 있는 마커의 조합을 분석하였다. 따라서, 상이한 세포형의 퍼센트를 상이한 마커를 사용하여 FACS로 측정함으로써 성체 말초 혈액으로부터 세포를 단리하였다. 결과는 다중-매개변수 FACS 분석을 사용하여 말초 혈액 속에서 사람 ILCP에 대한 농축의 분석을 나타낸다. 상이한 게이팅 반응을 사용하여, 존재할 수 있는 ILCP 뿐만 아니라 다른 세포형(T 세포, NK 세포, ILC2)의 농축도 평가할 수 있다. 결과는 도 8a 내지 f 및 도 9a 내지 g에 나타낸다.
마커 CD127+CD117+ 세포를 사용한 분류는 약 20%의 ILCP 및 60 내지 80%의 T 세포를 생성하였다(도 8a 및 도 9a). CD7 포함, CRTh2의 제외 또는 이들 둘 다의 조합은 오염된 T 세포가 우세하였으므로 CD127+CD117+ 세포 내에 ILCP를 농축시키는데 충분하지 않았다(도 8a 내지 d: 도 9a 내지 d). 계통 세포(CD3 포함)의 제외는 CD127+CD117+ 세포내에 ILCP를 강력하게 농축시켰다(도 8e 및 f; 도 9e 내지 g). Lin-CD127+CD117+ 세포내에 CRTh2 ILC2의 제외는 추가의 ILCP 농축을 제공하였으며, 이는 적어도 75%의 ILCP를 생성하였다(도 9e). CD7은 이러한 효과에 요구되지 않았다(도 8e 및 도 9f). CD94의 제외는 Lin-CD127+CD117+CRTh2- 세포로부터 순수한 ILCP의 단리를 허용하였다(도 8f 및 도 9g). 따라서, 마커 CD127+CD117+CD7+CRTh2-Lin-를 사용한 분류는 대략 90%의 ILCP를 생성하였고(도 8e 및 도 9f) 마커 CD127+CD117+CRTh2-Lin-CD94-를 사용한 분류는 대략 100%의 ILCP를 생성하였다(도 8f 및 도 9g).
실시예 10: 추가의 ILCP 마커
사람 ILCP(Lin-CD127+CD117+ CRTh2-로 정의됨)를 이러한 세포를 단리하기 위한 유용한 대용물일 수 있는 추가의 세포 표면 마커의 발현에 대해 추가로 스크리닝하였다. 다양한 CD62L 및 CD26 발현이 사람 ILCP에서 확인되었으며 대부분의 세포는 CD62L+이고 큰 비율의 세포는 CD26을 발현하였다(도 10).
클론 분석은 이러한 서브세트 모두가 다분화능 ILCP를 지녔음을 입증하였다(표 1).
Figure pct00001
나타낸 사람 ILCP 서브세트를 단일 세포로 분류하고 사람 IL-1b, IL-2, IL-7 및 IL-23이 보충된 OP9 기질에서 배양하였다. 이후에 클론을 PMA/이오노마이신으로 3시간 자극 후 사이토킨 생산 (IFNg, IL-13, IL-17A, IL-22)에 대해 분석하였다. 단분화능 및 다분화능 ILCP의 빈도를 나타낸다. 추정된 ILCP는 '사이토킨 없음'으로 확인된다.
이러한 결과는 사람 ILCP의 서브세트를 단리하는데 사용될 수 있는 추가의 '임의의' 마커(CD62L, CD26)를 확인한다.
사람 ILCP 확장: 사람 ILCP 클론의 분석(OP9 기질 세포 및 IL-2, IL-7, IL-1β 및 IL-23의 조합물 사용)은 임의의 시험한 사이토킨(IFN-g, IL-13, IL-17A, IL-22)을 발현하지 못한 세포를 확인하였다. 이러한 ILCP '클론'은 수에 있어 100- 내지 1000배 확장되었다(도 11). 이러한 세포는 표현형이었으며 CD117, CD45RA 및 CD26을 발현하지만 CD62L-인 것으로 밝혀졌다(도 12). 재클로닝 실험(recloning experiment)은 이러한 세포가 모든 ILC 서브세트에 대해 다-분화능을 지속적으로 가짐을 나타내었다. 사람 ILCP는 기질 세포 및 사이토킨의 조합물을 사용하여 확장시킬 수 있으며 기능적 특성을 보유하는 것으로 결론지어졌다.
[참고문헌]
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006

Claims (15)

  1. 선천성 림프 세포 전구체(ILCP)의 정제된 집단으로서, 집단 내 세포의 적어도 75%가 표현형 CD127+CD117+CD3-CRTh2-, 및 임의로 CD7+, NKp44-, CD94-, Lin-, CD26+ 및/또는 CD62L+를 갖는, ILCP의 정제된 집단.
  2. 제1항에 있어서,
    집단내 세포의 적어도 90%가 표현형 CD127+CD117+CD3-CRTh2-, 및 임의로 표현형 CD7+, NKp44-, CD94-, Lin-, CD26+ 및/또는 CD62L+를 갖는, ILCP의 정제된 집단.
  3. 사람 세포 샘플을 제공하는 단계, 및
    세포 샘플내에서 표현형 CD127+CD117+CD3-CRTh2-, 및 임의로 CD7+, NKp44-, CD94-, Lin-, CD26+ 및/또는 CD62L+를 갖는 세포를 선택함으로써, 집단내 세포의 적어도 75%가 표현형 CD127+CD117+CD3-CRTh2-, 및 임의로 CD7+, NKp44-, CD94-, Lin-, CD26+ 및/또는 CD62L+를 갖는, 세포의 집단을 제공하는 단계를 포함하는, 선천성 림프 세포 전구체(ILCP)의 정제된 집단을 제조하는 방법.
  4. 선천성 림프 세포 전구체(ILCP)의 집단을 제공하는 단계,
    세포 집단을 외부 자극에 적용시키는 단계, 및
    ILC1, ILC2, ILC3, 및 NK 세포로부터 선택된 세포형에 있어서의 증가를 검출하는 단계를 포함하는, ILC1, ILC2, ILC3, 및 NK 세포로부터 선택된 세포형(cell type)을 제조하는 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    집단내 세포의 적어도 90%가 표현형 CD127+CD117+CD3-CRTh2-, 및 임의로 CD7+, NKp44-, CD94-, Lin-, CD26+ 및/또는 CD62L+를 갖는 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    생체내(in vivo)에서 수행되는 방법.
  7. 면역 병리학(immune pathologies), 감염성 질환(infectious diseases), 또는 암의 치료시 사용하기 위한, ILCP의 정제된 집단을 포함하는 조성물로서, 집단내 세포의 적어도 90%가 표현형 CD127+CD117+CD3-CRTh2-, 및 임의로 CD7+, NKp44-, CD94-, Lin-, CD26+ 및/또는 CD62L+를 갖는 조성물.
  8. 하기를 포함하는, ILC의 발달에 영향을 미치는 화합물을 스크리닝(screening)하는 방법:
    선천성 림프 세포 전구체(ILCP)의 집단을 제공하는 단계로서, 여기서 집단내 세포의 적어도 75%가 표현형 CD127+CD117+CD3-CRTh2-, 및 임의로 CD7+, NKp44-, CD94-, Lin-, CD26+ 및/또는 CD62L+를 갖는 단계,
    세포 집단을 시험 화합물과 접촉시키는 단계, 및
    세포 집단내 세포의 표현형에 있어서의 변화를 검출하는 단계.
  9. 제8항에 있어서,
    시험 화합물이 ILCP이 분화에 있어서의 감소를 유발하는, ILC의 발달에 영향을 미치는 화합물을 스크리닝(screening)하는 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    시험 화합물이 ILCP의 분화에 있어서의 증가를 유발하는, ILC의 발달에 영향을 미치는 화합물을 스크리닝(screening)하는 방법.
  11. 제8항에 있어서,
    마우스에 선천성 림프 세포 전구체(ILCP)를 주입시키는 단계 및 시험 화합물을 마우스에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, ILC의 발달에 영향을 미치는 화합물을 스크리닝(screening)하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포가 가소성(plasticity) 없이 확장되는, 정제된 집단 또는 방법.
  13. 제1항 또는 제2항에 따른 ILCP의 정제된 집단을 IL-1ß 및 IL-2를 포함하는 배양 배지 속에서 배양하는 단계를 포함하는, ILCP의 확장 방법.
  14. 제3항 내지 제6항 및 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    ILCP를 IL-1ß 및 IL-2를 포함하는 배양 배지 속에서 배양하는 방법.
  15. 최소의 가소성(minimal plasticity)을 지닌 ILC3 세포를 확장시키는 방법으로서, 여기서 배양 배지가 IL-1β, IL-2 및 IL-7을 포함하는 방법.
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