CN104884612A - Mait样细胞及其制作方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于提供由MAIT细胞制作人工多能干细胞的方法、以及MAIT细胞来源的人工多能干细胞。另外，本发明的课题在于提供由人工多能干细胞制作MAIT样细胞的方法、以及MAIT样细胞。通过本发明，可以将具有MAIT细胞特异的TCR基因的人工多能干细胞分化诱导，从而建立MAIT样细胞。

Description

MAIT样细胞及其制作方法
技术领域
本发明涉及由MAIT细胞制作人工多能干细胞的方法、以及MAIT细胞来源的人工多能干细胞。另外，本发明涉及由人工多能干细胞制作MAIT样细胞的方法、以及由此得到的MAIT样细胞。
背景技术
MAIT细胞(Mucosal associated invariant T cells，粘膜相关的恒定T细胞)可产生各种细胞因子以控制各种免疫反应，是作为承担自然免疫和获得免疫的“桥梁作用”的细胞而已知的自然免疫T淋巴细胞的一种。MAIT细胞在人中丰富地存在，例如在肝脏中的T细胞中占20-50％，占肠道粘膜淋巴细胞固有层(lamina propria lymphocytes：LPL)或外周血单核细胞(peripheral bloodmononuclear cells：PBMC)的1-10％，另一方面，在小鼠中为稀有的细胞(Dusseaux et al.,2011；Le Bourhis et al.,2011)。
作为MAIT细胞的另一特征，可以举出T细胞受体(T cell receptor：TCR)的单一性。T细胞特异性表达的TCR将与主要组织相容性复合体(MajorHistocompatibility Complex：MHC)分子结合的肽片段作为抗原进行识别。TCR由在细胞表面表达的两个多肽链、α链和β链构成，两条链均在N末端的抗原结合区针对被称为可变(variable：V)区的每个TCR分子具有氨基酸序列不同的部位，该V区的多样性决定了免疫反应中的T细胞的抗原特异性。TCR的V区与免疫球蛋白同样地由包括多个亚型的V(Variable)、D(Diversity)、J(Joining)基因片段构成，α链中V和J的各1个片段通过DNA重组而结合，β链中V、D、J的各1个片段通过DNA重组而结合，形成了编码该区域的基因。
另一方面，在T细胞中，作为其TCR未呈多样性的单一的细胞，已知自然杀伤T细胞(Natural killer T cells：NKT细胞)和MAIT细胞这两种。在人的情况下，MAIT细胞的TCRα链仅为Vα7.2-Jα33的组合，在NKT细胞的情况下，其组合为Vα24-Jα18(Le Bourhis et al.,2011)。另外，在小鼠的情况下，MAIT细胞的TCRα链仅为Vα19-Jα33的组合，在NKT细胞的情况下，其组合为Vα14-Jα18。对两细胞的TCR来说，能够结合的抗原呈递分子(约束性)也不同，MAIT细胞的TCR识别·结合与一般的T细胞中的抗原呈递分子MHC类似的、无多样性的MR1(MHC-相关分子-1)，在NKT的情况下，将MHC类似的CD1d(cluster of differentiation(分化群)-1d)作为抗原呈递分子。MAIT细胞特异性的TCR和MR1以进化良好的方式被保存，暗示了在广泛物种中的功能重要性(Le Bourhis et al.,2011)。
MAIT细胞在表达上述invariant TCRα链的同时，作为特异性的表面抗原标记分子而表达作为C型凝集素的CD161(别名，natural killer cell surfaceprotein(自然杀伤细胞表面蛋白)：NKRP1)和白细胞介素(IL)-18受体α链(IL-18Rα)(Cosmi et al.,2008；Le Bourhis et al.,2010)。即，MAIT细胞可以与CD3等一般性的T细胞标记物一同作为表达MAIT特异性的invariant TCRα链、CD161、IL-18Rα的细胞来进行规定。另外，MAIT细胞呈现出CD45RA-、CD45RO+、CD95high、CD62Llow等效应/记忆型T细胞的性状，同时由于趋化因子受体的表达为CCR9int、CCR7-、CCR5high、CXCR6high、CCR6high，因而暗示了向肠道或肝脏等的归位指向性(Dusseaux et al.,2011)。
另外，据报道：MAIT细胞在产生干扰素(IFN)γ、IL-17、IL-2等细胞因子、或颗粒酶B的同时，几乎不显示出增殖性，表达多药耐药性转运体ABCB1而显示出多药耐药性(Dusseaux et al.,2011)。通过这些特性，暗示了MAIT细胞对于肠内细菌产生的异物具有抵抗性，和/或参与生物体内的感染防御系统。事实上，据报道MAIT细胞是与感染结核菌等细菌或真菌的细胞发生反应的特殊的T细胞，同时在结核等的细菌感染患者中发现了MAIT细胞的减少，并且由使用了小鼠的模型实验表明，MAIT细胞防御脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)、大肠杆菌(Escherichia coli)的感染(Le Bourhis etal.,2010；Gold et al.,2010；Dusseaux et al.,2011)。由以上的结果推测了MAIT细胞作为针对细菌感染的自然免疫淋巴细胞的功能。
此外，MAIT细胞暗示了与以多发性硬化症为代表的自身免疫性疾病、炎症性疾病、癌的发病和发展的相关性。CD8+/CD161highT细胞集聚于肝脏或关节等的炎症部位，是被认为是多发性硬化症的发病原因的T细胞群，表明，在人PBMC中CD8+/CD161highT细胞的90％为作为MAIT细胞特异性的TCRα链的Vα7.2+(Walker et al.,2011)。进而，据报道，在多发性硬化症患者中其病变部集聚有更多的MAIT细胞(Illes et al.,2004；Miyazaki et al.,2011)。还有报道称，MAIT细胞的集聚为肾癌或脑肿瘤(Peterfalvi et al.,2008)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(Illes et al.,2004)。另外，关于以溃疡性结肠炎或克隆病为代表的炎症性肠疾病，据报道，引入的MAIT细胞对药物引起的炎性组织损伤具有保护作用(Xiao Ruijing et al.,2012)。
这样，MAIT细胞被暗示参与各种疾病或病状，但现状是，关于免疫控制机制、特别是自然免疫中的作用及其详细的机理、有助于其的因子及分子、进而在病状发病和发展中的意义等，还未进行充分的研究和分析。作为其重要的原因之一，可以举出能够供体外(in vitro)及体内(in vivo)试验的细胞来源的问题。
如上所述，在作为实验用动物而频繁使用的小鼠中，MAIT细胞是非常稀有的细胞群，难以使用该动物进行功能分析。另一方面，与小鼠相比，MAIT细胞在人中丰富地存在，但是由外周血等人生物体试样大量制备MAIT细胞存在界限。另外，在这种方法中，所得到的MAIT细胞的数量及性质发生大幅变动的可能性也高，使用该细胞的试验的稳定性和再现性存在困难。进而，MAIT细胞通常为几乎不具有细胞增殖能力的状态，而且诱导其增殖的因子及刺激未被确定，因此在in vitro条件下无法增殖(Dusseaux etal.,2011)。所以，作为为了广泛进行使用MAIT细胞的研究的一个解决方案，例如考虑了利用与MAIT细胞功能类似的模型细胞，但现状是几乎不知道具有这种特性的细胞株。
另外，作为MAIT细胞的未来的活用法之一，考虑在罹患各种感染症或自身免疫性疾病、癌的患者中引入MAIT细胞或经人工修饰的MAIT细胞来进行治疗，即作为所谓细胞移植疗法中使用的细胞源进行利用。但是，为了实现该治疗法，依然需要确立具有稳定品质的、可制备大量的MAIT细胞的方法。
近年来，作为在生物体外制备各种细胞的方法，广泛地进行了下述尝试：将多能干细胞用作原始细胞，分化诱导该细胞而制作出目标细胞。多能干细胞(pluripotent stem cells)是指如下定义的细胞：通过试管内培养而保持未分化状态，在此状态下能够几乎永久或长期地进行细胞增殖，呈现出正常的核(染色体)型，在适当条件下具有分化成所有三胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的家谱的细胞的能力。作为多能干细胞，可以举出由早期胚胎分离的胚胎干细胞(embryonic stem cells：ES细胞)或由胎儿期的原始生殖细胞分离的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells)、由刚出生后的精巢分离的生殖干细胞(germline stem cells)、进而通过特殊的基因操作由成纤维细胞等体细胞制作的人工(诱导)多能干细胞(induced pluripotent stem cells；下文中称为iPS细胞)等(Lengner,2010；Pfannkuche et al,2010；Okita and Yamanaka,2011)。
关于由多能干细胞制作血细胞系细胞或淋巴细胞系细胞的事例有许多报道，选择性地制作出T细胞的方法也是公知的。即，在以未分化状态维持ES细胞或iPS细胞等多能干细胞后，接种于具有造血细胞维持能力的基质细胞(例如OP9细胞)上，诱导向造血干细胞和造血祖细胞的分化，对其进行回收后，接着在强制表达作为Notch配体的delta-like-1(DLL1)的OP9细胞(OP9/DLL1)上可以制作出具有作为T细胞的特性的细胞(Schmitt etal.,2004；Timmermans F et al.,2011)。另外还报道了下述方法：对于由小鼠NKT细胞制作的iPS细胞，通过使用该OP9共培养体系，制作具有作为NKT细胞的特性的细胞(WO2008/038579；Wakao H et al.,2008；WO2010/027094；Watarai etal.,2010)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2008/038579
专利文献2：WO2010/027094
非专利文献
非专利文献1：Dusseaux et al.,Blood 117,1250-1259(2011)
非专利文献2：Le Bourhis et al.,Trends in Immunol.32,212-218(2011)
非专利文献3：Cosmi et al.,J.Exp.Med.205,1903-1916,(2008)
非专利文献4：Le Bourhis et al.,Nat.Immunol.11,701-708(2010)
非专利文献5：Gold et al.,PLoS Biol.8,e1000407(2010)
非专利文献6：Walker et al.,Blood 119,422-433(2011)
非专利文献7：Illes et al.,Int.Immunol.16,223-230(2004)
非专利文献8：Miyazaki et al.,Int.Immunol.23,529-535(2011)
非专利文献9：Peterfalvi et al.,Int.Immunol.20,1517-1525(2008)
非专利文献10：Xiao Ruijing et al.,Hepatogastroenterology115,762-767(2012)
非专利文献11：Lengner CJ,Ann.N.Y.Acad.Sci.1192,38-44(2010)
非专利文献12：Pfannkuche K et al.,Cell Physiol Biochem.26,105-24(2010)
非专利文献13：Okita and Yamanaka,Philos.Trans.R Soc.Lond.BBiol.Sci.366,2198-2207(2011)
非专利文献14：Schmitt et al.,Nat.Immunol.5,410-417(2004)
非专利文献15：Timmermans et al.,J.Immunol.182,6879-6888(2011)
非专利文献16：Wakao et al.,FASEB J.22,2223-2231(2008)
非专利文献17：Watarai et al.,J.Clin.Invest.120,2610-8(2010)
发明内容
发明要解决的问题
在T细胞中，作为其TCR未呈多样性的单一(invariant，恒定)的细胞，已知NKT细胞和MAIT细胞这两种。NKT细胞在对细菌或癌进行个体防御方面起到重要的作用，同时在自我免疫性疾病中参与其病状，但主要通过使用小鼠的研究而被获知。另一方面，MAIT细胞大量存在于人的外周血或肠道、肝脏中，认为在粘膜免疫方面起到重要的作用，但是其详细情况大多并未阐明。
以往，着眼于NKT细胞的免疫控制能力，为了将NKT细胞与药物开发结合，主要使用小鼠进行功能分析，但经常观察到小鼠中的分析结果与人的分析结果不一致。NKT细胞在小鼠中比较丰富地存在，但在人中非常稀少，迄今为止对以人NKT细胞为目标的药物开发进行了许多尝试，但都以失败告终。
与此相对，已知MAIT细胞在小鼠中非常稀少，但是在人中丰富地存在。并且，由于NKT细胞和MAIT细胞呈现出类似的特异性性状，因而还提出了下述观点：人MAIT细胞具有与小鼠NKT细胞同样的功能、即与小鼠NKT细胞相当的人的功能细胞为MAIT细胞。因此，进行MAIT细胞的功能分析，将其用于药物开发极其重要。
然而，MAIT细胞对迄今为止已知的任何T细胞增殖刺激均不发生反应，因此难以制备功能分析所需要的大量的MAIT细胞。特别是，在作为实验用动物而频繁使用的小鼠中，MAIT细胞是非常稀有的细胞群，使用小鼠的MAIT细胞进行研究开发存在界限。另外，虽然在人中存在丰富的MAIT细胞，但是MAIT细胞的增殖困难，因此在依赖于从人生物体采集的方法中制备大量的MAIT细胞存在界限。这样，MAIT细胞的获得仅取决于从生物体采集和纯化，并不存在与体外的分化诱导和扩增法、性状类似细胞(模型细胞)有关的技术。
因此，本发明的目的之一在于建立与MAIT细胞具有同样功能的MAIT样细胞，确立制作这种细胞的技术。另外，本发明的课题还在于提供由MAIT细胞制作人工多能干细胞的方法、以及MAIT细胞来源的人工多能干细胞。
用于解决问题的方案
本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究，结果将MAIT细胞初始化，成功制作了MAIT细胞来源的人工多能干细胞(iPS细胞)；进而将MAIT细胞来源的人工多能干细胞分化诱导，成功得到MAIT样细胞。
本发明包括下述技术方案，但不限定于此。
(1)一种MAIT样细胞的制作方法，其包括：向MAIT细胞中导入初始化因子，得到保持以MAIT细胞特异的方式重构的TCRα链基因的人工多能干细胞；接着，将该人工多能干细胞分化诱导，得到MAIT样细胞。
(2)一种人工多能干细胞的制作方法，其包括：向MAIT细胞中导入初始化因子，得到保持以MAIT细胞特异的方式重构的TCRα链基因的人工多能干细胞。
(3)根据(1)或(2)所述的方法，其中，使用病毒载体导入初始化因子。
(4)根据(3)所述的方法，其中，病毒载体为仙台病毒载体。
(5)根据(4)所述的方法，其中，仙台病毒载体是在同一载体内搭载有多个初始化因子的载体。
(6)一种人工多能干细胞，其由(2)～(5)中任一项所述的方法获得。
(7)一种人工多能干细胞，其保持以MAIT细胞特异的方式重构的TCRα链基因。
(8)根据(7)所述的人工多能干细胞，其中，作为TCRα链基因，仅保持以MAIT细胞特异的方式重构的单一的TCRα链基因。
(9)根据(7)或(8)所述的人工多能干细胞，其中，以MAIT细胞特异的方式重构的TCRα链基因在人的情况下为Vα7.2-Jα33，在小鼠的情况下为Vα19-Jα33。
(10)根据(7)～(9)中任一项所述的人工多能干细胞，其中，所述人工多能干细胞由(2)～(5)中任一项所述的方法获得。
(11)一种MAIT样细胞的制作方法，其包括：将(6)～(10)中任一项所述的人工多能干细胞分化诱导，得到MAIT样细胞。
(12)根据(11)所述的方法，其中，将所述人工多能干细胞与饲养细胞一起共培养，得到MAIT样细胞。
(13)一种MAIT样细胞，其通过将(6)～(10)中任一项所述的人工多能干细胞分化诱导而获得。
(14)一种MAIT样细胞，其由(11)或(12)所述的方法获得。
(15)根据(13)所述的MAIT样细胞，其中，CD45RA的表达为阳性。
(16)一种调整待测物质的MAIT细胞的功能的活性的评价方法，其包括：使(13)～(15)中任一项所述的MAIT样细胞与待测物质接触的工序。
(17)一种细胞疗法剂，其含有(13)～(15)中任一项所述的MAIT样细胞。
(18)根据(17)的细胞疗法剂，其是为了提高对于细菌感染或真菌感染的抵抗力而给药的。
发明的效果
根据本发明，可以由MAIT细胞制作人工多能干细胞。另外，根据本发明，可以由人工多能干细胞制作MAIT样细胞。
附图说明
图1上部是示出MAIT细胞中的TCRα链的基因重构方式的图。编码在生殖细胞系基因组(germline，生殖细胞系)中位于同一染色体上分开的位置的Vα7.2和Jα33区域的基因序列在MAIT细胞中被重构，编码一个连续的基因(rearranged，重构)。箭头示出实施例1中记载的序列号1和2的引物的设置位置。另外，图1下部为对由从人脐带血细胞制备的MAIT细胞所建立的iPS细胞样的5株中的Vα7.2和Jα33区域的重构进行研究的结果。以由各细胞株提取的基因组DNA作为模板，使用实施例1中记载的序列号1和2的引物进行PCR反应。用限制酶SacI消化PCR产物，在2％琼脂糖凝胶上进行分离，用溴化乙锭染色。1：由MAIT细胞制作的iPS细胞样的细胞(1-3D株)来源的PCR产物(SacI未消化)、2：用SacI消化1-3D株来源的PCR产物所得到的物质、M：DNA大小标记物、3-6：用SacI消化由MAIT细胞制作的iPS细胞样的细胞株来源的PCR产物所得到的物质。
图2A是由从人脐带血细胞制备的MAIT细胞所建立的iPS细胞的照片。
图2B是示出由人MAIT细胞所建立的iPS细胞(MAIT-iPS细胞：1-3D株)中的各种ES/iPS细胞特异性标记物的表达的染色图像。上部是使用特异性抗体进行免疫染色后的结果，下部是由DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)得到的核染色图像。
图3是示出MAIT-iPS细胞中的特异性基因表达的电泳照片。1：人iPS细胞(B7株)、2：人MAIT-iPS细胞(1-3D株)、3：人MAIT-iPS细胞(2-5D株)、人MAIT-iPS细胞(4-6D株)、人MAIT-iPS细胞(A11株)、人MAIT-iPS细胞(A13株)、人MAIT-iPS细胞(A46株)、人MAIT-iPS细胞(C4B株)、人MAIT-iPS细胞(C5B株)、人MAIT-iPS细胞(C7I株)。
图4是由MAIT-iPS细胞制作的畸胎瘤的组织图像。a：整体图像(倍率：×40)、b：包含黑色素阳性细胞(图中的黑色的细胞)的神经管样结构(倍率：×200)、c：由角蛋白阳性的上皮细胞构成的肠道样结构(倍率：×200)、d：呈结蛋白阳性的肌肉组织样结构(倍率：×200)。
图5是示出由MAIT-iPS细胞分化诱导的细胞中的各种MAIT细胞标记物的表达的图。数字(days)是诱导向T细胞系细胞的分化后的天数。上部示出对于抗TCR Vα7.2抗体(3C10)和抗TCRαβ抗体(IP26)的反应性，图内的实线包围的部分是共阳性组分(3C10+/TCRαβ+细胞)，用数值(％)表示在整体中所占的比例。下部是关于该共阳性组分示出了对于抗IL-18Rα抗体(H44)和抗CD161抗体(DX12)的反应性。
图6是示出iMAIT细胞中的各种表面抗原标记物的表达方式的图。
图7是示出iMAIT细胞的各种细胞因子产生能力的图。None：无刺激、PMA/Iono：有PMA/离子霉素刺激。
图8是示出移植至小鼠体内的iMAIT细胞在各种脏器中的存在的图，对于由各种脏器回收的淋巴细胞，调查了3C10+/TCRαβ+细胞。图内的实线包围的部分是3C10+/TCRαβ+细胞、即iMAIT细胞，用数值(％)表示在整体中所占的比例。BM：骨髄、Liv：肝脏、Spl：脾脏、IE：肠道上皮、LP：肠道粘膜固有层。
图9是确认了iMAIT细胞的感染防御作用的结果。将M.abscessus菌接种至移植了iMAIT细胞的小鼠，2周后测定肝脏(Liver)和脾脏(Spleen)中的菌体的菌落形成能力(colony forming unit，菌落形成单位)。
具体实施方式
在一个方式中，本发明为具有MAIT细胞样的性状的细胞(下文中称为MAIT样细胞)的制作方法，使用表达载体等将初始化因子导入MAIT细胞而得到MAIT细胞来源的人工多能干细胞(下文中称为iPS细胞)后，分化诱导该iPS细胞，从而可以得到MAIT样细胞。
将MAIT细胞初始化而得到iPS细胞也是本发明的方式之一。在优选的方式中，使用病毒载体、尤其是仙台病毒载体将初始化因子导入MAIT细胞中，从而可以得到MAIT细胞来源的iPS细胞。该iPS细胞是下述具备一般的iPS细胞的特征性性质的细胞(MAIT-iPS细胞)：TCRα链基因被重构成MAIT细胞特有的序列的、单一的Vα-Jα，并且具有自我增殖能力和分化多能性，呈现出与ES细胞类似的基因表达方式。
本发明中，“iPS细胞”是指通过在体细胞内导入和表达初始化因子(核初始化因子)，从而人为地获得了分化多能性和自我复制能力的细胞，是指与ES细胞具有类似的性状的细胞。“分化多能性”(pluripotency)定义为在适当条件下具有分化成所有家谱的细胞的能力的细胞，在本发明的实施中未必需要具有分化成所有家谱的细胞的分化能力，只要具有分化成MAIT细胞以及其干细胞和祖细胞的分化能力、具有能够分化成此外的一种以上的细胞系的能力即可。与ES细胞类似的性状可以用ES细胞特异的表面标记分子的存在、畸胎瘤形成能力等ES细胞特异的细胞生物学性质、ES细胞特异的基因的表达、或对象细胞中的多个基因群的表达方式的类似性的高度等来规定。
本发明中，MAIT细胞是指TCRα链基因被重构成特有且均一的Vα-Jα(小鼠中为Vα19-Jα33、人的情况下为Vα7.2-Jα33)的T细胞，更优选的是，也可以作为表达CD161或IL-18Rα的细胞来规定。另外，MAIT细胞的特征还在于，其TCRα链通过无多样性的MR1而被约束。此外，本发明中，MAIT细胞的确定可以利用MAIT细胞特异的基因的表达、MAIT细胞特异的细胞生物学的性质来进行。
关于本发明中使用的MAIT细胞，对其来源没有特别限制，例如可以适当地使用人、小鼠、猴等哺乳动物来源的MAIT细胞。另外，由于生物体内的MAIT细胞基本上欠缺增殖能力，也没有确立在体外增殖MAIT细胞的技术，因此MAIT细胞需要从生物体内采集，但对采集的部位没有特别限制，例如可以适当使用来自脐带血、外周血、肝脏、胸腺、脾脏、骨髄、肠道(粘膜固有层、派尔集合淋巴结)等的MAIT细胞，本发明中特别可以适当使用外周血或脐带血来源的MAIT细胞。
本发明中将MAIT细胞初始化而制作iPS细胞的情况下，作为初始化因子(核初始化因子)，可以没有特别限制地使用公知的初始化因子，可以由蛋白质性因子或编码其的核酸(包括引入载体中的形态)、或者低分子化合物等任意物质构成。例如，可以使用作为山中因子已知的Oct3/4基因产物(核酸序列：序列号9)、以Klf4(核酸序列：序列号10)为代表的Klf家族基因产物、以c-Myc(核酸序列：序列号11)为代表的Myc家族基因产物、以Sox2(核酸序列：序列号12)为代表的Sox家族基因产物这四种因子，另外，已知在导入Oct3/4基因产物、Klf家族基因产物、Sox家族基因产物这3种因子后在碱性成纤维细胞增殖因子(bFGF)等的存在下培养而得到iPS细胞(参照国际公开WO2007/69666)。需要说明的是，作为家族基因，可以适当使用具有80％以上或90％以上的同源性的家族基因。
另外，还报道了用低分子化合物等试剂来代替上述因子的一部分，例如，利用作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的丙戊酸对导入了Oct3/4和Sox2这两种基因的细胞进行处理，从而可以制作iPS细胞(Huangfu D etal.,Nat.Biotechnol.26,1269-1275(2008))。进而，使用microRNAs来代替上述因子的方法(Miyoshi N et al.,Cell Stem Cells 8,633-638(2011))也是公知的。
作为用于将初始化因子导入MAIT细胞的方法，还有将上述因子以蛋白质的形式导入的方法，但优选以编码其的核酸(DNA、RNA、DNA/RNA嵌合体)的形态使用。该核酸(优选cDNA)插入能够在作为宿主的MAIT细胞中发挥功能的质粒载体或病毒载体中来构建表达载体，被供至核初始化工序。
作为表达载体，只要在MAIT细胞中能够对初始化因子基因进行有效的转录和表达，并诱导之后的初始化(iPS细胞化)即可，作为本发明中优选的示例，可以举出仙台病毒载体(SeV)。仙台病毒是具有单链的非分段负链RNA作为基因组的病毒，在细胞生物学领域中被广泛利用。仙台病毒载体能够将基因导入许多哺乳动物的细胞或组织中，载体基因组以RNA的状态停留于细胞质中，因此具有不会对宿主染色体产生影响的优点。用于构建仙台病毒载体的试剂盒制品有市售，本领域技术人员可以适当获得。
一般而言，作为使用病毒载体将基因有效地导入培养体系的方法，除了腺病毒外，还广泛已知使用逆转录病毒的方法。本发明人等进行了研究，结果发现，通过在使用MAIT细胞的本发明中使用仙台病毒载体，能够极其有效地将MAIT细胞初始化从而得到iPS细胞，进而不发生基因组改变，因此可以得到在安全性方面也优异的iPS细胞。
另外，为了导入多个初始化因子，通常制作在个别的载体中插入有1个或多个基因的载体，对这些多种载体同时进行处理，更优选使用将多个初始化基因搭载于1个载体中从而能够表达所有基因的载体。此处，“多个初始化因子”是指，从上述Oct3/4基因、Klf家族基因、Myc家族基因及Sox家族基因这4种因子中选择的至少2种以上的因子，优选为Oct3/4基因、Klf家族基因及Sox家族基因这3种因子，进一步优选全部4种因子。能够同时表达这样的多种初始化基因的仙台病毒载体是公知的，例如有如下报道：在仙台病毒载体中从转录开始位置起以c-Myc→Klf4→Oct3/4→Sox2的配置搭载了初始化因子的SeVdp(MKOS)302L(序列号13)、以Klf4→Oct3/4→Sox2→c-Myc的配置搭载了初始化因子的SeVdp(KOSM)(序列号14)等能够以极高的效率由成纤维细胞等诱导和建立iPS细胞(WO2010/134526；Nishimiura K etal.,J.Biol.Chem.286,4760-4771(2011)、WO2012/0063817)。另外，基于与这些载体有关的见解，构建对初始化因子的配置、插入位置、其他附加序列进行了任意设计的仙台病毒载体，并用于本发明。例如，实施例1中所用的SeVdp(KOSM)302L是指下述仙台病毒载体：其与SeVdp(KOSM)同样地以Klf4→Oct3/4→Sox2→c-Myc的配置搭载了初始化因子，关于插入位置、其他附加序列采用了SeVdp(KOSM)和SeVdp(MKOS)302L的特点。
这样，通过使用仙台病毒载体等将初始化因子导入MAIT细胞，从而可以得到MAIT细胞来源的iPS细胞，这种MAIT细胞来源的iPS细胞自身也是本发明的方式之一。将MAIT细胞初始化而得到的iPS细胞(MAIT-iPS细胞)表达MAIT细胞特异的TCRα链基因和/或其产物(下文中，将该特性称为“具有MAIT细胞特异的TCRα链”)，在这点上，与ES细胞或iPS细胞等以往存在的多能干细胞是不同的。如后所述，具有MAIT细胞特异的TCRα链基因的多能干细胞通过置于可诱导向T细胞分化的条件下，从而能够选择性地得到具有与MAIT细胞类似的特性的MAIT样细胞，极其有用。
对于将MAIT细胞初始化而得到的MAIT-iPS细胞，接着通过基于公知方法的细胞回收、分离、纯化法等可以高纯度且大量地进行回收。
在另一方式中，本发明涉及一种iPS细胞，其具有MAIT细胞特异的TCRα链基因。如上所述，这种iPS细胞可以通过使用仙台病毒载体等表达载体将初始化因子导入MAIT细胞而得到，除了这样将作为体细胞的MAIT细胞初始化的方法以外，还考虑通过将MAIT细胞特异的TCR基因导入ES细胞或一般的利用常规方法制作的iPS细胞等多能干细胞中而得到。该情况下，作为多能干细胞，不仅是ES细胞，还可以使用哺乳动物的成体脏器或组织的细胞、骨髄细胞、血液细胞、进而胚胎或胎儿的细胞等来源的、具有与ES细胞类似的性状的所有多能干细胞。该情况下，与ES细胞类似的性状可以用ES细胞特异的表面标记分子的存在或畸胎瘤形成能力等ES细胞特异的细胞生物学性质或ES细胞特异的基因表达、或对象细胞中的多个基因群的表达方式类似性的高度等来规定。
在一个方式中，本发明涉及一种MAIT样细胞的制作方法，将MAIT-iPS细胞等具有MAIT细胞特异的TCRα链基因的iPS细胞分化诱导，可以得到MAIT样细胞。如此得到的分化细胞具有与MAIT细胞同样的特性，在本发明中称为MAIT样细胞。特别是，本发明中，将对MAIT-iPS细胞进行分化诱导而得到的MAIT样细胞称为iMAIT细胞(学术上也称为“reMAIT细胞”)。
本发明中，在将具有MAIT细胞特异的TCRα链基因的iPS细胞分化诱导而得到MAIT样细胞的情况下，可以无限制地使用由以iPS细胞为代表的多能干细胞分化诱导T细胞的公知的方法。关于NKT细胞，迄今为止有下述报道：通过核移植制作由NKT细胞的核移植得到的ES细胞，将该细胞分化诱导而得到NKT样细胞；进而，使用逆转录病毒载体将小鼠NKT细胞初始化而制作iPS细胞，将该iPS细胞分化诱导而得到NKT样细胞。
本发明中，作为通过分化诱导得到MAIT样细胞时的培养法，只要是得到MAIT样细胞的方法就可以使用任意方法，例如可以举出与饲养细胞的共培养法、悬浮培养法、悬滴(hanging drop)培养法、旋转培养法、软琼脂培养法、微载体培养法等。在本发明的优选方式中，将iPS细胞分化诱导而得到MAIT样细胞的情况下，优选利用共培养进行，具体来说，将OP9细胞等基质细胞作为饲养细胞进行共培养，进而与强制表达作为Notch配体的DLL1的OP9细胞(OP9/DLL1)进行共培养，或者从最初开始与OP9/DLL1细胞进行共培养，从而可以由MAIT-iPS细胞高效地得到MAIT样细胞。
对于如此得到的MAIT样细胞，接着利用公知的方法进行细胞回收、分离、纯化。由本发明得到的MAIT样细胞是与生物体内的MAIT细胞显示出几乎同等的形态学、生理学和/或免疫学特征的细胞。生理学和/或免疫学特征不特别限定于此，MAIT样细胞的鉴定可以通过确认MAIT细胞特异的1种或2种以上的标记物的表达来进行。关于标记物的表达，对其方法没有特别限制，可以通过使用抗体的免疫染色法或逆转录酶介导的聚合酶链反应(RT-PCR)、杂交分析等公知的细胞组织生物学方法以及分子生物学方法来确认。纯化MAIT样细胞的方法只要是公知的细胞分离纯化法就可以使用任意方法，作为其具体例，可以举出流式细胞术或磁珠、洗淘分离(panning)法等基于抗原-抗体反应的方法、或使用蔗糖、Percoll等载体的基于密度梯度离心的细胞分级法(“Monoclonal Antibodies：principles and practice,Third Edition”Acad.Press,1993；“Antibody Engineering：A Practical Approach”IRL Press at OxfordUniversity Press,1996)。
具体而言，MAIT样细胞与MAIT细胞同样地对抗TCR Vα7.2抗体(3C10)、抗CD161抗体、抗IL-18Rα抗体等为阳性(3C10+/CD161+/IL-18Rα+)。另一方面，生物体内的MAIT细胞的CCR7的表达为阴性，与此相对，虽然较弱但抗原未致敏的(刚制作后的)MAIT样细胞确认到了CCR7的表达，确认到在生物体内MAIT细胞与MAIT样细胞之间存在差异。另外，例如在外周血来源的MAIT细胞中，作为效应记忆型T细胞的标记物的CD45RO的表达为阳性，作为初始型T细胞的标记物的CD45RA的表达为阴性或者仅在极少一部分细胞中为阳性，与此相对，在抗原未致敏的(刚制作后的)MAIT样细胞中几乎未确认到CD45RO的阳性细胞，强烈确认到CD45RA的表达。这样可知，MAIT样细胞虽然与生物体内MAIT细胞呈现出几乎同样的性状，但具有一部分不同的性状。
另外，确认到：由本发明建立的MAIT样细胞具备与生物体内MAIT细胞几乎同样的细胞表面抗原、基因表达、细胞因子产生能力，通过移入小鼠中，从而集中存在于肠道或肝脏等组织中并增殖。另外，确认到MAIT样细胞具有与MAIT细胞同样的抗菌/抗感染性。即，确认到由本发明建立的MAIT样细胞具备与生物体内MAIT细胞同样的功能及特性。
在一个方式中，本发明涉及一种MAIT样细胞。本发明的MAIT样细胞在进行MAIT细胞的功能分析方面可以用作重要的研究工具。另外，本发明的MAIT样细胞可以用于对促进MAIT细胞的产生及分化诱导、再生、生存、增殖等的新因子或物质、试剂进行鉴定的筛选。
本发明的MAIT样细胞对药物等各种生理活性物质及功能未知的新基因产物等的药理评价和活性评价有用。例如，可以用于与MAIT细胞的功能调节有关的物质或试剂、进而对MAIT细胞具有毒性或伤害性的物质或试剂的筛选。特别是，在现状下，难以为了进行MAIT细胞的功能分析而准备充分的MAIT细胞，MAIT细胞的特性尚未被充分阐明，结果由本发明制备的MAIT样细胞成为用于实施上述筛选的有用细胞源。另外，还有报道称集聚于人癌或多发性硬化症巢的Tc17细胞(具有IL-17产生能力的CD8+细胞)的大部分为MAIT细胞，进而阐明MAIT细胞的功能并进行药物开发是有用的。
在另一方式中，包含由本发明制备的MAIT样细胞的检测试剂盒对上述筛选有用。另外，关于MAIT细胞的功能分析中所用的单克隆抗体的制作、控制MAIT细胞的增殖、活化、成熟化的激动剂或拮抗剂的筛选，也可以使用本发明的MAIT样细胞来实施。
作为供筛选的待测物质，没有特别限制，例如可以举出低分子化合物、高分子化合物、有机化合物、无机化合物、蛋白质、肽、基因、病毒、细胞、细胞培养液、微生物培养液等。
在另一方式中，使用由本发明制备的MAIT样细胞，将其与通过间接体内疗法(ex vivo)由自我免疫性疾病、癌、感染等显示出免疫异常的患者外周血所制备的淋巴细胞(单核细胞、树突细胞、B细胞、NK细胞、T细胞等)付之共培养，由此还能够将MAIT样细胞或者患者淋巴细胞表面抗原分布图的变化或/和转录因子、细胞因子/趋化因子等的产生能力变化作为指标，应用于其病状、药物效果、或预后的预测等诊断中。
此外，对本发明的MAIT样细胞来说，可以将其自身进行细胞移植并用于细胞移植疗法中，或者可以作为包含MAIT样细胞作为实质性有效成分的细胞疗法剂进行给药。MAIT细胞会使对于细菌感染和真菌感染的抵抗性亢进，因此，例如通过细胞移植或给药本发明的MAIT样细胞，可以提高对于细菌感染或真菌感染的抵抗性。另外，据报道MAIT细胞有可能参与自我免疫性疾病或癌等，例如通过细胞移植本发明的MAIT样细胞，从而有可能治疗人自我免疫性疾病或癌。即，在一个方式中，本发明涉及MAIT样细胞在细胞移植疗法中的使用、细胞移植疗法用的MAIT样细胞、包括对MAIT样细胞进行细胞移植的疗法、包含MAIT样细胞作为实质性有效成分的细胞疗法剂等。这种细胞移植疗法或细胞给药疗法的对象患者为需要提高对于细菌感染的抵抗力的患者、接受了脏器移植治疗或血液干细胞等各种细胞移植治疗的患者、自我免疫性疾病患者、癌患者等，优选为患者具有的血液中的MAIT细胞比标准少和/或MAIT细胞的活性降低的患者。
在本发明的实施中，关于分子生物学或重组DNA技术等基因工程学的方法和一般的细胞生物学方法及现有技术，只要不特别示出，则实施者可以参考该领域的标准性书籍。作为这样的书籍，例如可以举出“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”(Sambrook&Russell、Cold Spring Harbor LaboratoryPress、第3版、2001)；“Current Protocols in Molecular biology”(Ausubel et al.编、John Wiley&Sons、1987)；“Methods in Enzymology”系列(Academic Press)；“PCR Protocols：Methods in Molecular Biology”(Bartlett&Striling编、HumanaPress、2003)；“Animal Cell Culture：A Practical Approach”(Masters编、OxfordUniversity Press、第3版、2000)；“Antibodies：A Laboratory Manual”(Harlow etal.&Lane编、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1987)等，这些以参考的方式引入本说明书中。另外，在本说明书中被参考的用于细胞培养、细胞生物学实验的的试剂和试剂盒类可以由Sigma公司、Invitrogen公司、Clontech公司、R&D systems公司、BD Bioscience公司等市售业者获得。
另外，关于以iPS细胞为代表的多能干细胞的制作、继代、保存法及细胞生物学实验的一般方法，实施者可以参考该领域的标准性书籍。作为这些的示例，可以举出“Guide to Techniques in Mouse Development”(Wasserman etal.编、Academic Press,1993)；“Embryonic Stem Cell Differentiation invitro”(M.V.Wiles、Meth.Enzymol.225：900,1993)；“Manipulating the MouseEmbryo：A laboratory manual”(Hogan et al.编、Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1994)；“Embryonic Stem Cells”(Turksen编、Humana Press,2002)，这些以参考的方式引入本说明书中。在本说明书中被参考的用于细胞培养、发生·细胞生物学实验的试剂和试剂盒类可以由Invitrogen公司、Sigma公司等市售业者获得。
实施例
下面举出实施例来更详细地说明本发明，但本发明不受下述实施例等的任何限制。
实施例1：由人来源MAIT细胞建立iPS细胞
使用Ficoll由人脐带血制备单核细胞。对于该单核细胞，混合对特异性识别MAIT细胞的TCR(Vα7.2)的单克隆抗体3C10(由法国L'Institut Curie的Olivier Lantz博士赠与、或Biolegend公司)进行了生物素标记的物质，使用利用了亲和素磁珠的MACS柱(Miltenyi Biotech公司制造)对与3C10抗体具有反应性的细胞进行阳性选择，从而浓缩MAIT细胞。使用不同的3名供体来源的脐带血进行该操作，结果由FACS分析作为3C10阳性细胞所规定的MAIT细胞分别为96％、88％、78％的纯度。
对于如此纯化的20万个3C10阳性细胞，在室温下感染作为人iPS细胞制作用载体的SeVdp(KOSM)302L(由产业综合研究所的中西真人博士赠与)2小时(MOI＝2.5)。该载体是在同一载体内搭载有人来源的4种基因(编码Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc的核酸)的仙台病毒载体，具有高效的iPS细胞制作能力(WO2010/134526)。通过离心操作除去包含病毒载体的溶液，悬浮于在包含20％Knockout血清替代物(KSR；Invitrogen公司)、0.1mmol/L MEM非必须氨基酸液、2mmol/L L-谷氨酰胺和0.1mmol/L 2-巯基乙醇的DMEM/F12培养基(Sigma公司)中添加了4ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF：basicfibroblast growth factor、Reprotech公司)的ES/iPS细胞专用培养基中，接种至用丝裂霉素C进行了处理的小鼠胚性成纤维细胞(MEF)上，在37℃、5％CO2浓度下进行共培养。12天后，回收呈现ES/iPS样形态的菌落，重新散布于接种至24孔板的MEF上。用ES/iPS细胞专用培养基进行培养后，以形态判断生长的菌落，选择为ES/iPS细胞样的形态的菌落。
为了确认如此得到的iPS细胞为人MAIT细胞来源，以基因组DNA作为模板，调查T细胞抗原受体α链(TCRα)基因座是否引起了MAIT细胞特异的基因重构。此处，如图1所示，已知：在具有MAIT细胞特异的TCRα链基因的细胞中，编码TCRα区域的基因的一方重构成Vα7.2-Jα33。于是，使用下述所示的引物，以各iPS细胞克隆的基因组DNA作为模板进行PCR，确认了重构的有无。在具有Vα7.2-Jα33发生基因重构的TCRα链时，通过使用下述引物的基因组PCR，282bp的条带被扩增，若该PCR产物被制限酶SacI消化，则产生191+91bp的DNA片段。另一方面，在未重构为Vα7.2-Jα33的情况下，282bp的条带未被扩增。
(正向引物)5’-GGTGCCATTGTCCAGATCAACTGC-3’(序列号1)
(反向引物)5’-CTTTATAATTAGCTTGGTCCCAGC-3’(序列号2)
根据如上确认的结果，由3名供体来源的细胞实施独立的3次实验，由此建立了50株以上的来源于人MAIT细胞的iPS细胞(MAIT-iPS细胞)。
实施例2：MAIT-iPS细胞的特性分析
实施例1中个别建立和分离的MAIT-iPS细胞株1-3D、2-5D、4-6D在MEF饲养上呈现出单层且轮廓扁平、明确的菌落，显示出与一般的人ES/iPS细胞极其相似的形态(图2A)。
另外，使用如此继代维持的MAIT-iPS细胞，调查了人ES/iPS细胞特异的标记物的表达。对于固定的MAIT-iPS细胞，与作为一抗的抗碱性磷酸酶(ALP)抗体、抗SSEA4抗体、抗Oct-3/4抗体、抗Nanog抗体(以上、R&D System公司)、抗TRA-1-60抗体(BD Bioscience公司)、或抗TRA-1-81抗体(Santa Cruz公司)反应后，使用罗丹明标记二抗(Jackson ImmunoResearch公司)进行染色。细胞核用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI：4’,6-diamidino-2-phenylindole)溶液(1μg/mL)染色。在荧光显微镜下对这些抗体及色素形成的染色图像进行观察。其结果，MAIT-iPS细胞对碱性磷酸酶、SSEA4、Oct-3/4、Nanog、TRA-1-60、TRA-1-81全部显示出强阳性(图2B)。
同样地制备MAIT-iPS细胞的RNA，确认了作为未分化的人iPS细胞特异性基因的Oct-3/4和Nanog的表达。使用由MAIT-iPS细胞或人iPS细胞制备的总RNA来合成cDNA，将其作为模板进行使用以下引物的聚合酶链反应(polymerase chain reaction：PCR)，进行各种基因片段的扩增。
Oct-3/4〔扩增大小：144bp〕
(正向引物)5’-GACAGGGGGAGGGGAGGAGCTAGG-3’(序列号3)
(反向引物)5’-CTTCCCTCCAACCAGTTGCCCCAAAC-3’(序列号4)
Nanog〔扩增大小：391bp〕
(正向引物)5’-CAGCCCCGATTCTTCCACCAGTCCC-3’(序列号5)
(反向引物)5’-CGGAAGATTCCCAGTCGGGTTCACC-3’(序列号6)
GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)〔扩增大小：382bp〕
(正向引物)5’-AATCCCATCACCATCTTCC-3’(序列号7)
(反向引物)5’-CATCACGCCACAGTTTCC-3’(序列号8)
用1.5％琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳，用溴化乙锭(Merck公司)染色后，使用凝胶拍摄装置(ATTO公司)进行检测。其结果，在个别建立和分离的MAIT-iPS细胞株1-3D、2-5D、4-6D、A11、A13、C4B、C5B的各细胞株中，与人iPS细胞同样地确认到Oct-3/4以及Nanog基因的强表达(图3)。
为了更包罗万象地研究MAIT-iPS细胞株的基因表达状况，进行DNA微阵列(Agilent公司)分析，调查了MAIT-iPS细胞和人iPS/ES细胞中的基因表达分布图的相互关系。其结果示于表1。由表1可知，MAIT-iPS细胞呈现出与人ES细胞或人iPS细胞极其相似的基因表达模式(在所有的比较中，相关系数为0.95以上)，另一方面，与成为作出的原始细胞的人脐带血来源MAIT细胞不同。另外，在MAIT-iPS细胞中，与一般的人ES/iPS细胞同样，也可以确认Oct-3/4基因或Nanog基因启动子区域的去甲基化、及高端粒酶活性，能够在维持未分化性状的状态下继代培养数十代以上。
由以上结果表明，由MAIT细胞建立的iPS细胞株(MAIT-iPS细胞株)具有一般的iPS细胞样的特性和功能。
[表1]
需要说明的是，以下的实验中与上述同样地使用了1-3D株、2-5D株、4-6D株等多种细胞株作为MAIT-iPS细胞，总的来说没有观察到细胞株的差异导致的实验结果的差异。因此，在以下的实施例中，只要没有特别声明则示出使用1-3D株的实施例数据。
接下来，研究了MAIT-iPS细胞的分化能力。对于在MEF上一边保持未分化的性状一边继代培养的MAIT-iPS细胞，用细胞分解液(包含0.25％胰蛋白酶、1mg/ml胶原酶IV)进行处理使其成为小块，用不包含bFGF的ES/iPS细胞专用培养基悬浮后，接种至低粘接性培养皿。8天后回收细胞凝集块，将它们接种至经明胶前处理的细胞粘接性培养皿，16天后进行固定。固定后的细胞与作为一抗的抗肌性肌动蛋白抗体(Nichirei Bioscience公司)或抗Sox-17抗体(R&D System公司)、抗巢蛋白抗体(Sigma公司)反应后，与上述方法同样地进行染色以及荧光显微镜观察。其结果，由分化诱导MAIT-iPS细胞的物质在本条件下可以确认到肌性肌动蛋白阳性的中胚层细胞或Sox-17阳性的内胚层性细胞、巢蛋白阳性的外胚层性细胞的出现。
另外，将8×106～10×106个MAIT-iPS细胞移植至NOD/scid小鼠(CharlesRiver公司)的皮下，结果10～14周后发现了畸胎瘤(teratoma)的形成。由各肿瘤的石蜡包埋标本制作组织切片，与作为一抗的抗广谱细胞角蛋白抗体(DAKO公司)或抗结蛋白抗体(DAKO公司)反应后，与生物素标记二抗(DAKO公司)反应，最后进行使用了二氨基联苯胺的显色反应。用苏木精液染色后，在光学显微镜下进行观察，结果在MAIT-iPS细胞来源肿瘤内确认到包含黑色素阳性细胞的神经管样结构或由细胞角蛋白阳性细胞构成的肠道样结构、以及结蛋白阳性的肌肉细胞样组织的存在(图4)。
由以上结果可以确认，MAIT-iPS细胞与一般的人ES/iPS细胞同样地表达未分化状态特异的标记物基因以及蛋白，是具有向三胚层的分化多能性的细胞。
实施例3：由MAIT-iPS细胞制作MAIT细胞
关于ES细胞等干细胞，已知的是：通过将OP9细胞作为饲养细胞的共培养，可以分化诱导为CD34阳性的血细胞/淋巴细胞祖细胞，进而通过与强制表达作为Notch配体的DLL1的OP9细胞(OP9/DLL1)共培养，可以分化诱导为T细胞系列的细胞(Schmitt TM et al.,Nat.Immun.5,410-417(2004)；Wakao H et al.,FASEB J.22,2223-2231(2008)；Wakao H et al.,WO2008/038579；Watarai H et al.,J.Clin.Invest.120,2610-2618(2010)；WO2010/027094；Timmermans F et al.,J.Immunol.182,6879-6888(2011))。
本实施例中，基于该方法，尝试了由MAIT-iPS细胞向MAIT细胞的分化诱导。
OP9细胞和OP9/DLL1细胞使用了由理化学研究所生物资源中心(RikenCell Bank)购入的细胞。首先，在融合后3～7天后的OP9细胞上，将使MAIT-iPS细胞的菌落分散成100个左右小块的物质在10cm培养皿附近接种1×106个，在包含10％胎牛血清(FBS)和0.1mM 1-硫代甘油的αMEM培养基中进行培养，分化诱导为血细胞和淋巴细胞系的干细胞和祖细胞。接种后第11～12天，将形成为菌落状的细胞集块用磷酸缓冲液(PBS)清洗2次后，加入包含1mg/mL的胶原酶IV(Invitrogen公司)的αMEM培养基和0.01％胰蛋白酶/EDTA(Sigma公司)并充分搅拌，分散成单一细胞。对于该细胞群体，用CD34MultiSort Kit(Miltenyi公司)制备并回收CD34阳性细胞组分(纯度95％以上)后，悬浮于包含20％FBS、人SCF(干细胞因子)、人·白细胞介素7(IL-7)、人Flt3配体(FL)(均为Reprotech公司、各5ng/mL)的αMEM培养基(以下为MAIT细胞分化诱导培养基)中，接种至事先接种于24孔细胞培养皿并融合3～7天后的OP9/DLL1细胞上。每隔4天将MAIT细胞分化诱导培养基更换一半量，将培养继续14～30天后，通过移液操作由饲养细胞分离回收细胞。
对于如此由MAIT-iPS细胞分化的细胞的性状，利用流式细胞术(flowcytometry：FCM)法，以对于抗TCR Vα7.2抗体(3C10)、抗TCRαβ抗体(IP26；Biolegend公司)、抗CD161抗体(DX12；BD Bioscience公司)和抗IL-18Rα抗体(H44；Biolegend公司)的反应性为指标进行研究。将其结果示于图5。
首先，对于通过上述方法制备的MAIT-iPS细胞来源的分化细胞(接种至OP9/DLL1细胞后第30天)，用上述4种抗体进行染色，结果几乎所有的细胞成为了TCR Vα7.2+/TCRαβ+(下文中，将TCR Vα7.2+记为3C10抗原阳性：3C10+)。另外表明，该共阳性组分的细胞同时几乎全部为CD161+和IL-18Rα+，能够由MAIT-iPS细胞分化诱导MAIT样细胞。
该MAIT样细胞可以利用本方法以良好的再现性和高比例进行制作，在多次研究中可以确认，由3C10+/TCRαβ+/CD161+/IL-18Rα+规定的MAIT样细胞常常占整体的85％以上。
以下，将利用本方法由MAIT-iPS细胞分化诱导的MAIT样细胞称为iMAIT细胞。
实施例4：iMAIT细胞的特性分析
根据Lantz等人的一系列报道(Dusseaux et al.,2011)可知，存在于生物体内、尤其是外周血的MAIT细胞除了TCR Vα7.2、CD161、IL-18Rα以外，CD26(DPP-IV)或CD27、CD28、CD62L(L-选择素)、CD95(Fas)、CD127(IL-7Rα)、CD244(SLAMF4)之类的细胞表面标记物为阳性。因此，基于上述方法研究了iMAIT细胞中的对于这些标记物特异的抗体的反应性。
作为阳性对照，与上述方法同样地由人外周血单核细胞(CellularTechnology公司)制备3C10+/TCRαβ+/CD161+组分细胞，将该细胞用作人外周血来源的MAIT细胞(下文中为PBMC-MAIT细胞)。
[表2]
结果示于表2。在PBMC-MAIT细胞中，如已经报道的那样，确认到CD26、CD27、CD28、CD62L、CD95、CD127、CD244的表达。在iMAIT细胞中，虽然表达有略微的强弱，但可以确认到这些所有标记物的表达(图6、表2)。
另外已知的是，PBMC-MAIT细胞强烈表达CCR5、CCR6之类的趋化因子受体，但另一方面CCR7的表达是阴性的(Dusseaux et al.,2011)。于是，与上述方法同样地对PBMC-MAIT细胞和iMAIT细胞中的这些趋化因子受体的表达进行了研究，结果在iMAIT细胞中与PBMC-MAIT细胞同样地确认到CCR5和CCR6的强烈表达。另一方面，虽然弱但CCR7确认到表达，与PBMC-MAIT细胞呈现出不同的特性(表2)。
此外，关于PBMC-MAIT细胞，通常作为效应记忆型T细胞的标记物的CD45RO的表达为阳性，作为初始型T细胞(受到抗原刺激前的T细胞)的标记物已知的CD45RA的表达为阴性或者仅在极少一部分细胞中为阳性，但在iMAIT细胞中强烈确认到CD45RA的表达，几乎未确认到CD45RO阳性细胞(图6、表2)。
由以上的结果可知，iMAIT细胞强烈显示出与PBMC-MAIT细胞呈现出几乎同样的性状，另一方面，保持了作为由CD45RA或CCR7的表达所规定的初始型T细胞的特性，具有与PBMC-MAIT部分不同的性状。
实施例5：iMAIT细胞的细胞因子产生能力的确认
作为MAIT细胞的特征，已知通过向CD3/TCR和CD28的共刺激信号(下文中为CD3/CD28刺激)、或佛波醇酯(phorbol12-myristate 13-acetate：PMA)与离子霉素(ionomycin)所产生的刺激(下文中为PMA/Iono刺激)，产生干扰素(IFN)γ等细胞因子(Dusseaux et al.,2011)。于是，将基于实施例2、3中记载的方法所制作的iMAIT细胞与用抗CD3抗体以及抗CD28抗体包覆的磁珠(Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28；Invitrogen公司)进行混合培养，进行48小时CD3/CD28刺激。另外，同样地在iMAIT细胞培养系中添加PMA(10ng/mL；和光纯药株式会社)和离子霉素(1μM；和光纯药株式会社)，进行48小时PMA/Iono刺激。
之后，回收培养基上清，使用Bioplex Pro-Human Cytokine 21-plex Assay和Pro-Human Cytokine 27-plex Assay系统(BioRad公司)测定了各种细胞因子的量。其结果，iMAIT细胞在未刺激状态下不产生IFNγ，但在提供CD3/CD28刺激或PMA/Iono刺激后，确认到显著高的IFNγ的产生(图7)。另外，还调查了其他的细胞因子产生能力，结果iMAIT细胞在未刺激状态下未观察到IL-2、IL-17、TNF-α的产生，但通过PMA/Iono刺激确认到了明显的产生亢进效果。另一方面，未观察到IL-4或IL-10的产生，以上的结果显示出与PBMC-MAIT细胞非常类似的倾向。
另外，已知的是：MAIT细胞通过与贪食细菌的单核细胞进行共培养，从而可产生干扰素(IFN)γ等细胞因子。于是，使用同样的体系研究了iMAIT细胞的细胞因子产生能力。将人外周血来源单核细胞(1×106个/mL；CellularTechnology公司)分别以1×105个接种至细胞培养用96孔培养板，放置1小时后，使用作为附着性细胞残留于底面的细胞(约1×104个)作为单核细胞。对于无血清·无添加的DMEM培养基中的附着性细胞，感染大肠杆菌(Escherichiacoli；感染复数MOI＝100)3小时。之后，用加入有10％FBS和青霉素-链霉素的DMEM进行清洗和置换，向其中分别以2×104个接种利用与实施例3、4同样的方法所制备的iMAIT细胞。进行48小时共培养后，回收培养基的上清，测定各种细胞因子的量。其结果，在该共培养系中也能够确认到IFNγ或IL-2、IL-17、TNF-α之类的细胞因子的产生量增大。
实施例6：小鼠体内的iMAIT细胞的固定和感染防御效果的研究
为了确认iMAIT细胞在动物体内是否取得与通常的MAIT细胞同样的举动，对于事先进行了320cGy的放射线照射的8～10周龄NOD/scid小鼠(Charles River公司)，通过经静脉给药注入移植了实施例3中制作的iMAIT细胞(5×104个/只)。6～10周后使其安乐死，之后摘除骨髄或肝脏、脾脏、小肠上皮或粘膜固有层。接着，由该脏器回收淋巴细胞，使用与实施例3同样的FCM法调查了淋巴细胞中的iMAIT细胞、即3C10+/TCRαβ+细胞的存在。
其结果，在所调查的所有脏器中确认到iMAIT细胞的存在，表明尤其在小肠粘膜固有层中以高比例集中(图8)。另外，确认到在小肠粘膜固有层中检测出的iMAIT细胞数超过所移入的细胞数的至少100倍的例子，暗示了iMAIT细胞在小鼠体内环境下发生了增殖。
已知MAIT细胞与感染结核菌等细菌的细胞反应，具有感染防御的功能。iMAIT细胞产生在感染防御时起到重要作用的IFNγ或IL-17、IL-2(参照实施例5)，同时与这些细胞因子同样地还产生在引起细胞损伤性方面起到中心作用的穿孔素和颗粒酶(未示出数据)。于是，对iMAIT细胞是否实际上显示出对于细菌感染的防御效果进行了研究。
对于NOG(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm 1Sug/Jic)小鼠(实验动物中央研究所)，通过经静脉给药注入移植了基于实施例3的方法制作的iMAIT细胞(5×104个/只)。5周后，以1.0×106CFU/只接种脓肿分枝杆菌(Mycobacteriumabscessus)。2周后使其安乐死，摘除肝脏和脾脏，调查在该脏器内生存的M.abscessus菌的个数(菌落形成能力)。
结果示于图9，与未移入iMAIT细胞的群iMAIT(-)相比，在移入了iMAIT细胞的群iMAIT(+)中，肝脏中的活菌(形成菌落)数显著降低，在脾脏中也确认到了同样的倾向。
以上的实验结果明确示出，在动物体内，iMAIT细胞呈现出与MAIT细胞同等的功能和效果。

Claims (18)

1.一种MAIT样细胞的制作方法，其包括：
向MAIT细胞中导入初始化因子，得到保持以MAIT细胞特异的方式重构的TCRα链基因的人工多能干细胞；
接着，将该人工多能干细胞分化诱导，得到MAIT样细胞。
2.一种人工多能干细胞的制作方法，其包括：
向MAIT细胞中导入初始化因子，得到保持以MAIT细胞特异的方式重构的TCRα链基因的人工多能干细胞。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，使用病毒载体导入初始化因子。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，病毒载体为仙台病毒载体。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，仙台病毒载体是在同一载体内搭载有多个初始化因子的载体。
6.一种人工多能干细胞，其由权利要求2～5中任一项所述的方法获得。
7.一种人工多能干细胞，其保持以MAIT细胞特异的方式重构的TCRα链基因。
8.根据权利要求7所述的人工多能干细胞，其中，作为TCRα链基因，仅保持以MAIT细胞特异的方式重构的单一的TCRα链基因。
9.根据权利要求7或8所述的人工多能干细胞，其中，以MAIT细胞特异的方式重构的TCRα链基因在人的情况下为Vα7.2-Jα33，在小鼠的情况下为Vα19-Jα33。
10.根据权利要求7～9中任一项所述的人工多能干细胞，其中，所述人工多能干细胞由权利要求2～5中任一项所述的方法获得。
11.一种MAIT样细胞的制作方法，其包括：将权利要求6～10中任一项所述的人工多能干细胞分化诱导，得到MAIT样细胞。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，将所述人工多能干细胞与饲养细胞一起共培养，得到MAIT样细胞。
13.一种MAIT样细胞，其通过将权利要求6～10中任一项所述的人工多能干细胞分化诱导而获得。
14.一种MAIT样细胞，其由权利要求11或12所述的方法获得。
15.根据权利要求13所述的MAIT样细胞，其中，CD45RA的表达为阳性。
16.一种调整待测物质的MAIT细胞的功能的活性的评价方法，其包括：使权利要求13～15中任一项所述的MAIT样细胞与待测物质接触的工序。
17.一种细胞疗法剂，其含有权利要求13～15中任一项所述的MAIT样细胞。
18.根据权利要求17的细胞疗法剂，其是为了提高对于细菌感染或真菌感染的抵抗力而给药的。
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