KR102140451B1 - Mait 유사 세포 및 그 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, MAIT 세포로부터 인공 다능성 줄기 세포를 제조하는 방법, 및 MAIT 세포 유래의 인공 다능성 줄기 세포를 제공하는 것을 과제로 한다. 또한, 본 발명은, 인공 다능성 줄기 세포로부터 MAIT 유사 세포를 제조하는 방법, 및 MAIT 유사 세포를 제공하는 것을 과제로 한다. 본 발명에 의하여, MAIT 세포에 특이적인 TCR 유전자를 가지는 인공 다능성 줄기 세포를 분화 유도하여 MAIT 유사 세포를 수립할 수 있다.

Description

MAIT 유사 세포 및 그 제조 방법{MAIT-LIKE CELLS AND METHOD FOR MANUFACTURING SAME}

본 발명은, MAIT 세포로부터 인공 다능성 줄기 세포를 제조하는 방법, 및 MAIT 세포 유래의 인공 다능성 줄기 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 인공 다능성 줄기 세포로부터 MAIT 유사 세포를 제조하는 방법, 및 그에 따라 얻어진 MAIT 유사 세포에 관한 것이다.

MAIT 세포(Mucosal associated invariant T cells)는, 각종 사이토카인을 발생하여 각종 면역 반응을 제어하고, 자연 면역과 획득 면역의 「중개역」을 담당하는 세포로서 알려진 자연 면역 T 임파구의 일종이다. MAIT 세포는 인간에 있어서 풍부하게 존재하고, 예를 들면, 간장 중의 T 세포에서는 20-50 %, 장관 점막 고유층 임파구(lamina propria lymphocytes: LPL)나 말초혈 단핵구(peripheral blood mononuclear cells: PBMC)의 1-10 %를 차지하는 한편, 마우스에서는 희유(稀有)한 세포이다(Dusseaux et al., 2011; Le Bourhis et al., 2011).

MAIT 세포의 다른 하나의 특징으로서, T 세포 수용체(T cell receptor: TCR)의 단일성을 예로 들 수 있다. T 세포에 특이적으로 발현하는 TCR은 주요 조직 적합 유전자 복합체(Major Histocompatibility Complex: MHC) 분자에 결합한 펩티드 단편을 항원으로서 인식한다. TCR은 세포 표면에 발현하는 2개의 폴리펩티드 쇄, α쇄와 β쇄로 구성되어 있지만, 양쇄 모두 N 말단의 항원 결합 영역에 가변(variable: V) 영역으로 불리는 TCR 분자마다 아미노산 서열이 상이한 부위를 가지고 있고, 이 V 영역의 다양성이 면역 반응에서의 T 세포의 항원 특이성을 결정하고 있다. TCR의 V 영역은, 면역 글로불린과 마찬가지로 다수의 아형(亞型)으로 이루어지는 V(Variable), D(Diversity), J(Joining) 유전자 단편으로 이루어지고, α쇄는 V와 J의 1 단편씩이, β쇄는 V, D, J의 1 단편씩이 DNA 재조합에 의해 결합하고, 상기 영역을 코딩하는 유전자를 형성하고 있다.

한편, T 세포 중에서도 그 TCR이 다양성을 나타내지 않는 단일한 세포로서, 자연살생 T 세포(Natural killer T cells: NKT 세포)와 MAIT 세포의 2 종류가 알려져 있다. 인간의 경우, MAIT 세포의 TCRα쇄는 Vα7.2-Jα33의 조합뿐이며, NKT 세포의 경우, 그 조합은 Vα24-Jα18이다(Le Bourhis et al., 2011). 또한, 마우스의 경우, MAIT 세포의 TCRα쇄는 Vα19-Jα33의 조합뿐이며, NKT 세포의 경우, 그 조합은 Vα14-Jα18이 되어 있다. 양 세포의 TCR은 결합할 수 있는 항원 제시 분자(구속성)도 상이하며, MAIT 세포의 TCR은, 일반적인 T 세포에서의 항원 제시 분자인 MHC와 유사한, 다양성이 없는 MR1(MHC-related molecule-1)을 인식·결합하지만, NKT의 경우, MHC와 유사한 CD1d(cluster of differentiation-1d)를 항원 제시 분자로 한다. MAIT 세포 특이적인 TCR과 MR1은 진화적으로 양호하게 보존되어 있고, 광범위한 종에서의 기능적 중요성이 시사된다(Le Bourhis et al., 2011).

MAIT 세포는 상기 invariant TCRα쇄를 발현하고, 또한 특이적인 표면 항원 마커 분자로서, C형 렉틴인 CD161(별명, natural killer cell surface protein: NKRP1) 및 인터류킨(IL)-18 수용체 α쇄(IL-18Rα)을 발현한다(Cosmi et al., 2008; Le Bourhis et al., 2010). 즉, MAIT 세포는, CD3 등의 일반적인 T 세포 마커와 함께, MAIT 특이적 invariant TCRα쇄, CD161, IL-18 Rα를 발현하는 세포로서 규정할 수 있다. 또한, MAIT 세포는 CD45RA^-, CD45RO^＋, CD95^high, CD62L^low와 같은 이펙터/메모리(effecter/memorys)형 T 세포의 형질을 이루는 동시에, 케모카인 수용체의 발현이 CCR9^int, CCR7^-, CCR5^high, CXCR6^high, CCR6^high이므로, 장관이나 간장 등으로의 호밍(homing) 지향성이 시사된다(Dusseaux et al., 2011).

또한, MAIT 세포는 인터페론(IFN)γ나 IL-17, IL-2와 같은 사이토카인이나 그란자임 B를 발생하고, 또한 거의 증식성을 나타내지 않고, 다제(多劑)내성(耐性) 수송체인 ABCB1을 발현하여 다제내성을 나타내는 것이 보고되어 있다(Dusseaux et al., 2011). 이들 특성에 의해, MAIT 세포는 장내 세균이 생산하는 이물질에 대하여 저항성을 가지고, 및/또는, 생체 내의 감염 방어 시스템에 관여하는 것이 시사되었다. 사실, MAIT 세포는 결핵균등의 세균이나 진균류에 감염한 세포와 반응하는 특수한 T 세포인 것으로 보고되었고, 또한 결핵 등의 세균 감염 환자에서는 MAIT 세포의 감소가 관찰되며, 또한, 마우스를 사용한 모델 실험에 의해, MAIT 세포는 Mycobacterium abscessus나 Escherichia coli의 감염을 방어하는 것으로 나타났다(Le Bourhis et al., 2010; Gold et al., 2010; Dusseaux et al., 2011). 이상의 결과로부터, MAIT 세포는 세균 감염에 대한 자연 면역 임파구로서의 기능이 추측되고 있다.

그 외에, MAIT 세포는 다발성 경화증를 비롯하여 자기면역 질환이나 염증성 질환, 암의 발증·진전과의 관련성이 시사되고 있다. CD8^＋/CD161^high T 세포는 간장이나 관절 등의 염증 부위에 집적하고, 다발성 경화증의 발증 요인으로 주목되고 있는 T 세포군이지만, 인간 PBMC 중에서는 CD8^＋/CD161^high T 세포의 90%가 MAIT 세포 특이적 TCRα쇄인 Vα7.2^＋인 것이 나타나 있다(Walker et al., 2011). 또한, 다발성 경화증 환자에서는 그 병변부에, 보다 많은 MAIT 세포가 집적하고 있는 것이 보고되어 있다(Illes et al., 2004; Miyazaki et al., 2011). MAIT 세포의 집적은, 신장암이나 뇌종양(Peterfalvi et al., 2008), 만성 염증성 탈골수성 다발신경염(Illes et al., 2004)에서도 보고되어 있다. 또한, 궤양성 대장염이나 크론병으로 대표되는 염증성 장질환에 관하여, 약제에 의해 야기한 염증성 조직 상해에 대하여 이입(移入)한 MAIT 세포가 보호적으로 작용하는 것이 보고되어 있다(Xiao Ruijing et al., 2012).

이와 같은 MAIT 세포는 각종 질환이나 병의 용태에 대한 관여가 시사되지만, 면역 제어 기구(機構), 특히 자연 면역에서의 작용이나 그 상세한 메커니즘, 거기에 기여하는 인자나 분자, 또한 병의 용태 발증·진전에서의 의의 등에 대해서는, 검토·해석이 충분히 진전되고 있지 않은 것이 현재의 실정이다. 그 큰 이유의 하나로서, 인비트로(in vitro) 및 인비보(in vivo) 시험에 제공할 수 있는 세포 소스의 문제를 예로 들 수 있다.

전술한 바와 같이, 실험용 동물로서 빈번하게 사용되는 마우스에서는 MAIT 세포는 매우 희유인 세포 집단이며, 상기 동물을 사용한 기능 해석은 곤란하다. 한편, 인간에는 MAIT 세포가 마우스와 비교하면 풍부하게 존재하지만, MAIT 세포를 말초혈 등의 인간 생체 시료로부터 대량으로 조제하기 위해서는 한계가 있다. 또한, 이와 같은 방법에서는, 얻어지는 MAIT 세포의 수나 성질이 크게 변동할 가능성도 높으며, 상기 세포를 사용한 시험의 안정성·재현성에 곤란하다. 또한, MAIT 세포는 통상, 세포 증식능을 거의 가지고 있지 않은 상태에 있고, 또한 그 증식을 유도하는 인자나 자극이 동정(同定)되어 있지 않으므로, in vitro 조건 하에서 증폭시킬 수 없다(Dusseaux et al., 2011). 그러므로, MAIT 세포를 사용한 연구를 광범위하게 진행하기 위한 하나의 해결책으로서는, 예를 들면, MAIT 세포와 기능이 유사한 모델 세포의 이용을 고려할 수 있지만, 이와 같은 특성을 가지는 세포주는 거의 알려져 있지 않은 것이 현재의 실정이다.

또한, MAIT 세포의 장래적인 활용법의 하나로서, 각종 감염증이나 자기 면역 질환, 암 이환(罹患) 환자에게, MAIT 세포 또는 인위적으로 수식(修飾)한 MAIT 세포를 이입하여 치료하는, 이른바 세포 이식 요법에 사용하는 세포 소스로서의 이용을 고려할 수 있다. 그러나, 상기 치료법을 실현시키기 위해서는, 역시 안정된 품질을 가진, 대량의 MAIT 세포를 조제하는 방법의 확립이 필수적이다.

최근, 각종 세포를 생체외에서 조제하는 방법으로서, 다능성 줄기 세포를 기원(起源) 세포로서 사용하고, 상기 세포를 분화 유도하여 목적으로 하는 세포를 작출하는 것이 광범위하게 시도되고 있다. 다능성 줄기 세포(pluripotent stem cells)란, 시험관 내 배양에 의해 미분화 상태를 유지한 채, 거의 영속적 또는 장기간의 세포 증식이 가능하며, 정상(正常) 핵(염색체)형을 이루고, 적당한 조건 하에 있어서 3배엽(외배엽, 중배엽, 및 내배엽)의 모든 계보의 세포로 분화하는 능력을 가진 세포로서 정의된다. 다능성 줄기 세포로서는, 초기 배아로부터 단리되는 배아줄기세포(embryonic stem cells: ES 세포)나 태아기의 시원 생식 세포로부터 단리되는 배아생식세포(embryonic germ cells), 출생 직후의 정소로부터 단리되는 생식 세포 계열 줄기세포(germline stem cells), 나아가서는 섬유아세포 등의 체세포로부터 특수한 유전자 조작에 의해 제조되는 인공(유도) 다능성 줄기 세포(induced pluripotent stem cells; 이하, iPS 세포라고 함) 등을 예로 들 수 있다(Lengner, 2010; Pfannkuche et al, 2010; Okita and Yamanaka, 2011).

다능성 줄기 세포로부터 혈구계 세포나 임파구계 세포를 제조하는 사례는 많이 보고되어 있고, T 세포를 선택적으로 작출하는 방법도 공지되어 있다. 즉, ES 세포나 iPS 세포 등의 다능성 줄기 세포를 미분화 상태로 유지한 후, 조혈 세포 유지능을 가지는 스트로마 세포(예를 들면, OP9 세포) 상에 파종하여 조혈 줄기 세포 및 조혈 전구 세포로의 분화를 유도하고, 그것을 회수한 후, 이어서, Notch 리간드인 delta-like-1(DLL1)을 강제 발현시킨 OP9 세포(OP9/DLL1) 상에서 T 세포로서의 특성을 가지는 세포를 작출할 수 있다(Schmitt et al.,2004; Ti㎜ermans F et al., 2011). 또한, 마우스 NKT 세포로부터 제조한 iPS 세포를, 이 OP9 공배양계를 사용함으로써, NKT 세포로서의 특성을 가지는 세포를 제조하는 방법도 보고되어 있다(WO2008/038579; Wakao H et al., 2008; WO2010/027094; Watarai et al., 2010).

WO2008/038579 WO2010/027094

Dusseaux et al., Blood 117, 1250-1259(2011) Le Bourhis et al., Trends in I㎜unol.32, 212-218(2011) Cosmi et al., J. Exp. Med.205, 1903-1916, (2008) Le Bourhis et al., Nat. I㎜unol.11, 701-708(2010) Gold et al., PLoS Biol.8, e1000407(2010) Walker et al., Blood 119, 422-433(2011) Illes et al., Int. I㎜unol.16, 223-230(2004) Miyazaki et al., Int. I㎜unol.23, 529-535(2011) Peterfalvi et al., Int. I㎜unol.20, 1517-1525(2008) Xiao Ruijing et al., Hepatogastroenterology 115, 762-767(2012) Lengner CJ, Ann. N. Y. Acad. Sci.1192, 38-44(2010) Pfannkuche K et al., Cell Physiol Biochem.26, 105-24(2010) Okita and Yamanaka, Philos. Trans. R Soc. Lond. B Biol. Sci.366, 2198-2207(2011) Schmitt et al., Nat. I㎜unol.5, 410-417(2004) Ti㎜ermans et al., J. I㎜unol.182, 6879-6888(2011) Wakao et al., FASEB J.22, 2223-2231(2008) Watarai et al., J. Clin. Invest.120, 2610-8(2010)

T 세포 중에서도 그 TCR이 다양성을 나타내지 않는 단일(invariant)한 세포로서, NKT 세포와 MAIT 세포의 2 종류가 알려져 있다. NKT 세포는, 세균이나 암에 대하여 개체를 방어하는 데 중요한 역할을 행하는 동시에 자기면역 질환에 있어서 그 병의 용태에 관여하는 것이, 주로 마우스를 사용한 검토에 의해 알려져 있다. 한편, MAIT 세포는, 인간의 말초혈이나 장관, 간장에 많이 존재하고, 점막 면역에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 여겨지고 있으나, 그 상세한 것에 대해서는 규명되어 있지 않은 점도 많다.

종래, NKT 세포의 면역 제어능에 착안하여, NKT 세포를 신약 개발(drug discovery)과 결부시킬 수 있도록 주로 마우스를 사용하여 기능 해석이 진행되어 왔지만, 마우스에서의 해석 결과가 인간의 해석 결과와 일치하지 않는 것이 많이 관찰된다. NKT 세포는 마우스에는 비교적 풍부하게 존재하고 있지만, 인간에서는 매우 희소하여, 지금까지, 인간 NKT 세포를 표적으로 한 신약 개발이 시도되어 왔지만 대부분 실패로 끝났다.

이에 비해, MAIT 세포는 마우스에서는 매우 희소한 한편, 인간에 있어서는 풍부하게 존재하는 것으로 알려져 있다. 그리고, NKT 세포와 MAIT 세포는 유사한 특이적인 형질을 나타내므로, 인간 MAIT 세포는 마우스 NKT 세포와 마찬가지의 기능, 즉 마우스 NKT 세포에 상당하는 인간의 기능 세포가 MAIT 세포라는 설도 제창되어 있다. 따라서, MAIT 세포의 기능 해석을 진행시켜 그것을 신약 개발에 활용하는 것은 극히 중요하다.

그러나, MAIT 세포는, 지금까지 알려진 어떤 T 세포 증식 자극에도 반응하지 않으므로, 기능 해석에 필요한 대량의 MAIT 세포를 조제하는 것이 곤란했다. 특히, 실험용 동물로서 빈용되는 마우스에서는 MAIT 세포는 매우 희유인 세포 집단이며, 마우스의 MAIT 세포를 사용하여 연구개발을 진행시키려면 한계가 있다. 또한, 인간에서는 MAIT 세포가 풍부하게 존재하지만, MAIT 세포의 증식이 곤란하므로, 인간 생체로부터의 채취에 의존한 방법에서는 대량의 MAIT 세포를 조제하기 위해서는 한계가 있다. 이와 같이, MAIT 세포의 취득은 생체로부터의 채취·정제에 의존할 수밖에 없으며, in vitro에서의 분화 유도·증폭법이나 형질 유사 세포(모델 세포)에 관한 기술도 존재하고 있지 않다.

이에, 본 발명은, MAIT 세포와 마찬가지의 기능을 가지는 MAIT 유사 세포를 수립하고, 그것을 제조하는 기술을 확립하는 것을 하나의 목적으로 한다. 또한, 본 발명은, MAIT 세포로부터 인공 다능성 줄기 세포를 제조하는 방법, 및 MAIT 세포 유래의 인공 다능성 줄기 세포를 제공하는 것도 그 과제로 한다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의(銳意) 연구를 행한 결과, MAIT 세포를 초기화 하여 MAIT 세포 유래의 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포)를 제조하는 것에 성공하였고, 나아가서는 MAIT 세포 유래의 인공 다능성 줄기 세포를 분화 유도하여 MAIT 유사 세포를 얻는 것에 성공하였다.

본 발명은, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 하기의 발명을 포함한다.

(1) MAIT 세포에 초기화 인자를 도입하여 MAIT 세포 특이적인 태양으로 재구성된 TCRα쇄 유전자를 유지하는 인공 다능성 줄기 세포를 얻는 것, 이어서, 이 인공 다능성 줄기 세포를 분화 유도하여 MAIT 유사 세포를 얻는 것을 포함하는, MAIT 유사 세포의 제조 방법.

(2) MAIT 세포에 초기화 인자를 도입하여 MAIT 세포 특이적인 태양으로 재구성된 TCRα쇄 유전자를 유지하는 인공 다능성 줄기 세포를 얻는 것을 포함하는, 인공 다능성 줄기 세포의 제조 방법.

(3) 바이러스 벡터를 사용하여 초기화 인자를 도입하는, (1) 또는 (2)에 기재된 방법.

(4) 바이러스 벡터가, 센다이 바이러스 벡터(Sendai virus vector)인, (3)에 기재된 방법.

(5) 센다이 바이러스 벡터가, 복수의 초기화 인자를 동일한 벡터 내에 탑재한 것인, (4)에 기재된 방법.

(6) (2)∼(5) 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 얻어지는 인공 다능성 줄기 세포.

(7) MAIT 세포에 특이적인 태양으로 재구성된 TCRα쇄 유전자를 유지하는 인공 다능성 줄기 세포.

(8) TCRα쇄 유전자로서, MAIT 세포에 특이적인 태양으로 재구성된, 단일 TCRα쇄 유전자만을 유지하는, (7)에 기재된 인공 다능성 줄기 세포.

(9) MAIT 세포에 특이적인 태양으로 재구성된 TCRα쇄 유전자가, 인간의 경우 Vα7.2-Jα33, 마우스의 경우 Vα19-Jα33인, (7) 또는 (8)에 기재된 인공 다능성 줄기 세포.

(10) (2)∼(5) 중 어느 하나의 방법에 의해 얻어지는, (7)∼(9) 중 어느 하나에 기재된 다능성 줄기 세포.

(11) (6)∼(10) 중 어느 하나에 기재된 인공 다능성 줄기 세포를 분화 유도하여 MAIT 유사 세포를 얻는 것을 포함하는, MAIT 유사 세포의 제조 방법.

(12) 상기 인공 다능성 줄기 세포를 (feeder cell)와 함께 공배양(共培養)하여 MAIT 유사 세포를 얻는, (11)에 기재된 방법.

(13) (6)∼(10) 중 어느 하나에 기재된 인공 다능성 줄기 세포를 분화 유도함으로써 얻어지는 MAIT 유사 세포.

(14) (11) 또는 (12)에 기재된 방법에 의해 얻어지는 MAIT 유사 세포.

(15) CD45RA의 발현이 양성인, (13)에 기재된 MAIT 유사 세포.

(16) (13) 내지 (15) 중 어느 하나에 기재된 MAIT 유사 세포와 피험 물질을 접촉시키는 공정을 포함하는, 피험 물질의 MAIT 세포의 기능을 조정하는 활성의 평가 방법.

(17) (13) 내지 (15) 중 어느 하나에 기재된 MAIT 유사 세포를 함유하는, 세포 요법제.

(18) 세균 감염 또는 진균 감염에 대한 저항력을 향상시키기 위해 투여되는, (17)의 세포 요법제.

본 발명에 의하면, MAIT 세포로부터 인공 다능성 줄기 세포를 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 의하면, 인공 다능성 줄기 세포로부터 MAIT 유사 세포를 제조할 수 있다.

도 1의 상단은, MAIT 세포에서의 TCRα쇄의 유전자 재구성 양식을 나타낸 도면이다. 생식 세포 계열 게놈(germline)에 있어서는 동일 염색체 상의 이격된 장소에 위치하고 있는 Vα7.2 및 Jα33 영역을 코딩하는 유전자 서열이, MAIT 세포에서는 재구성되어 1개의 연속된 유전자를 코딩한다(rearranged). 화살표는 실시예 1에 기재된 서열 번호 1과 2의 프라이머(primer)의 설치 위치를 도시한 것이다. 또한, 도 1의 하단은, 인간 제대혈 세포로부터 조제한 MAIT 세포로부터 수립한 iPS 세포상(狀)의 5주에서의 Vα7.2 및 Jα33 영역의 재구성을 조사한 것이다. 각 세포주로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하여, 실시예 1에 기재된 서열 번호 1과 2의 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 행하였다. PCR 산물을 제한 효소 SacI으로 소화하여 2% 아가로스겔 상에서 분리하고, 브롬화 에티듐(ethidium bromide)으로 염색했다. 1: MAIT 세포로부터 제조한 iPS 세포상의 세포(1-3D 주) 유래의 PCR 산물(SacI 미소화(未消化)), 2: 1-3D 주 유래 PCR 산물을 SacI으로 소화한 것, M: DNA 사이즈 마커, 3-6: MAIT 세포로부터 제조한 iPS 세포상의 세포주 유래 PCR 산물을 SacI으로 소화 한 것.
도 2a는, 인간 제대혈 세포로부터 조제한 MAIT 세포로부터 수립한 iPS 세포의 사진이다.
도 2b는, 인간 MAIT 세포로부터 수립한 iPS 세포(MAIT-iPS 세포: 1-3D 주)에서의 각종 ES/iPS 세포 특이적 마커의 발현을 나타내는 염색상(染色像)이다. 상단은, 특이적 항체를 사용하여 면역 염색한 것, 하단은 DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐인돌)에 의한 핵염색상이다.
도 3은 , MAIT-iPS 세포에서의 특이적인 유전자 발현을 나타내는 전기 영동사진이다. 1: 인간 iPS 세포(B7주), 2: 인간 MAIT-iPS 세포(1-3D 주), 3: 인간 MAIT-iPS 세포(2-5D 주), 인간 MAIT-iPS 세포(4-6D 주), 인간 MAIT-iPS 세포(A11주), 인간 MAIT-iPS 세포(A13주), 인간 MAIT-iPS 세포(A46주), 인간 MAIT-iPS 세포(C4B주), 인간 MAIT-iPS 세포(C5B주), 인간 MAIT-iPS 세포(C7I주).
도 4는, MAIT-iPS 세포로부터 제조한 기형종의 조직상이다. a: 전체상(배율: ×40), b: 멜라닌 양성 세포(도면 중의 흑색 세포)를 포함하는 신경관상 구조(배율: ×200), c: 케라틴 양성의 표피 세포로 구성되어 있는 장관상 구조(배율: ×200), d: 데스민 양성을 이루는 근조직상 구조(배율: ×200).
도 5는, MAIT-iPS 세포로부터 분화 유도한 세포에서의 각종 MAIT 세포 마커의 발현를 나타낸 도면이다. 숫자(days)는 T 세포 계열 세포로의 분화를 유도하고나서의 일수(日數). 상단은, 항TCR Vα7.2 항체(3C10)와 항TCRαβ항체(IP26)에 대한 반응성을 나타내고, 도면 내의 실선으로 둘러싼 부분이 공양성(double-positive) 획분(fraction)(3C10^＋/TCRαβ^＋ 세포)이며, 전체에서 차지하는 비율을 수치(%)로 나타낸다. 하단은, 이 공양성 획분에 대하여 항IL-18Rα항체(H44)와 항CD161 항체(DX12)에 대한 반응성을 나타낸다.
도 6은, iMAIT 세포에서의 각종 표면 항원 마커의 발현 양식를 나타낸 도면이다.
도 7은, iMAIT 세포의 각종 사이토카인 생산능을 나타낸 도면이다. None: 자극 없음, PMA/Iono:PMA/Ionomycin 자극 있음.
도 8은, 마우스 체내에 이식한 iMAIT 세포의 각종 장기에서의 존재를 나타낸 도면이며, 각종 장기로부터 회수한 임파구에 대하여 3C10^＋/TCRαβ^＋ 세포를 조사하였다. 도 내의 실선으로 둘러싼 부분이 3C10^＋/TCRαβ^＋ 세포, 즉 iMAIT 세포이며, 전체에서 차지하는 비율을 수치(%)로 나타낸다. BM: 골수, Liv: 간장, Spl: 비장, IE: 장관 표피, LP: 장관 점막 고유층.
도 9는, iMAIT 세포의 감염 방어 작용을 확인한 결과이다. iMAIT 세포를 이식한 마우스에 M. abscessus균을 접종하고, 2주일 후의 간장(Liver) 및 비장(Spleen)에서의 균의 콜로니 형성 능력(colony forming unit)을 측정하였다.

하나의 태양에 있어서 본 발명은 MAIT 세포상의 형질을 가지는 세포(이하, MAIT 유사 세포)의 제조 방법이며, 발현 벡터 등을 사용하여 초기화 인자를 MAIT 세포에 도입하여 MAIT 세포 유래의 인공 다능성 줄기 세포(이하, iPS 세포)를 얻은 후, 이 iPS 세포를 분화 유도함으로써 MAIT 유사 세포를 얻을 수 있다.

MAIT 세포를 초기화하여 iPS 세포를 얻는 것도 본 발명의 하나의 태양이다. 바람직한 태양에 있어서, 바이러스 벡터, 그 중에서도 센다이 바이러스 벡터를 사용하여 초기화 인자를 MAIT 세포에 도입함으로써 MAIT 세포 유래의 iPS 세포를 얻을 수 있다. 상기 iPS 세포는, TCRα쇄 유전자가 MAIT 세포에 특유한 서열의, 단일한 Vα-Jα로 재구성되어 있고, 또한 자기 증식능 및 분화 다능성을 가지고, ES 세포와 유사한 유전자 발현 양식을 나타내는, 일반적인 iPS 세포의 특징적인 성질을 구비한 세포(MAIT-iPS 세포)이다.

본 발명에 있어서 「iPS 세포」란, 체세포 내에 초기화 인자(핵초기화 인자)를 도입·발현시킴으로써, 인위적으로 분화 다능성 및 자기 복제능을 획득한 세포로서, ES 세포와 유사한 형질을 가지는 세포를 말한다. 「분화 다능성」(pluripotency)이란, 적당한 조건 하에 있어서 모든 계보의 세포로 분화하는 능력을 가진 세포로 정의되지만, 본 발명의 실시에 있어서는, 반드시 모든 계보의 세포로의 분화능을 가지고 있을 필요는 없고, MAIT 세포 및 그의 줄기·전구 세포로의 분화능을 가지고, 그 외에 1개 이상의 세포 계열로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있으면 된다. ES 세포와 유사한 형질이란, ES 세포에 특이적인 표면 마커 분자의 존재나 테라토마 형성 능력 등의 ES 세포에 특이적인 세포 생물학적 성질이나 ES 세포 특이적인 유전자의 발현, 또는 대상 세포에서의 다수의 유전자군의 발현 양식의 유사성의 높음 등으로 규정할 수 있다.

본 발명에 있어서 MAIT 세포란, TCRα쇄 유전자가 특유하면서 또한 균일한 Vα-Jα(마우스에서는 Vα19-Jα33, 인간의 경우에는 Vα7.2-Jα33)로 재구성되어 있는 T 세포이며, 더욱 바람직하게는, CD161나 IL-18Rα를 발현하는 세포로서도 규정할 수 있다. 또한, MAIT 세포는 그 TCRα쇄가, 다양성이 없는 MR1에 의해 구속되는 것도, 그 특징으로 할 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서 MAIT 세포의 특정은, MAIT 세포에 특이적인 유전자의 발현이나, MAIT 세포에 특이적인 세포 생물학적 성질을 가지고 행할 수 있다.

본 발명에 있어서 사용하는 MAIT 세포는, 특별히 유래의 제한은 없고, 예를 들면, 인간, 마우스, 원숭이 등의 포유동물 유래의 MAIT 세포를 바람직하게 사용할 수 있다. 또한, 생체 내의 MAIT 세포는 증식능을 거의 결실하고 있고, MAIT 세포를 in vitro로 증식하는 기술도 확립되어 있지 않으므로, MAIT 세포는 생체 내로부터 채취할 필요가 있지만, 채취하는 부위에 대해서는 특별히 제한은 없고, 예를 들면, 제대혈, 말초혈, 간장, 흉선, 비장, 골수, 장관(점막 고유층, 페이에르판(Peyer patch)) 등으로부터 유래하는 MAIT 세포를 바람직하게 사용할 수 있고, 말초혈 또는 제대혈 유래의 MAIT 세포를 본 발명에 있어서 특히 바람직하게 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서 MAIT 세포를 초기화하여 iPS 세포를 제조하는 경우, 초기화 인자(핵초기화 인자)로서는, 공지의 것을 특별히 제한하지 않고 사용할 수 있고, 단백성 인자 또는 그것을 코딩하는 핵산(벡터에 편입된 형태를 포함함), 또는 저분자 화합물 등의 어떠한 물질로 구성해도 된다. 예를 들면, 야마나카 인자(Yamanaka factors)로서 알려진 Oct3/4 유전자 산물(핵산 서열: 서열 번호 9), Klf4(핵산 서열: 서열 번호 10)를 비롯한 Klf 패밀리 유전자 산물, c-Myc(핵산 서열: 서열 번호 11)를 비롯한 Myc 패밀리 유전자 산물, Sox2(핵산 서열: 서열 번호 12)를 비롯한 Sox 패밀리 유전자 산물의 4인자를 사용할 수 있고, 또한, Oct3/4 유전자 산물, Klf 패밀리 유전자 산물, Sox 패밀리 유전자 산물의 3인자를 도입한 후에 염기성 섬유아세포 증식 인자(bFGF) 등의 존재 하에서 배양하여 iPS 세포를 얻는 것이 알려져 있다(국제 공개 WO2007/69666 참조). 그리고, 패밀리 유전자로서는, 80% 이상 또는 90% 이상의 동일성을 가지는 것을 바람직하게 사용할 수 있다.

또한, 상기 인자의 일부를 저분자 화합물 등의 약제로 대용할 수 있는 것도 보고되어 있고, 예를 들면, Oct3/4와 Sox2의 2개의 유전자를 도입한 세포를, 히스톤탈아세틸화 효소 저해제인 발프로산(valproic acid)으로 처리함으로써, iPS 세포를 제조할 수 있다(Huangfu D et al., Nat. Biotechnol.26, 1269-1275(2008). 또한 상기 인자 대신 microRNAs를 사용하는 방법(Miyoshi N et al., Cell Stem Cells 8, 633-638(2011))도 공지되어 있다.

초기화 인자를 MAIT 세포에 도입하기 위한 방법으로서는, 상기한 인자를 단백질로서 도입하는 방법도 있지만, 이들을 코딩하는 핵산(DNA, RNA, DNA/RNA 키메라)의 형태로 사용하는 것이 오히려 바람직하다. 상기 핵산(바람직하게는 cDNA)은, 숙주가 되는 MAIT 세포에서 기능할 수 있는 플라스미드 벡터나 바이러스 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 구축하고, 핵초기화 공정에 제공된다.

발현 벡터로서는, MAIT 세포에 있어서 초기화 인자 유전자의 효율적인 전사 및 발현이 가능하며, 그 후의 초기화(iPS 세포화)를 유도할 수 있는 것이면 되지만, 상기 발명에 있어서 바람직한 예로서는 센다이 바이러스 벡터(SeV)를 예로 들 수 있다. 센다이 바이러스는, 단일쇄의 비분절형 마이너스쇄 RNA를 게놈으로서 가지는 바이러스이며, 세포 생물학 분야에서 폭넓게 이용되어 왔다. 센다이 바이러스 벡터는, 대부분의 포유동물의 세포나 조직에 유전자를 도입할 수 있고, 벡터 게놈이 RNA의 상태로 세포질에 머물기 때문에 숙주 염색체에 영향을 미치지 않는 장점이 있다. 센다이 바이러스 벡터를 구축하기 위한 키트 제품은 시판되고 있어, 당업자이면 적절하게 입수할 수 있다.

일반적으로, 바이러스 벡터를 사용하여 유전자를 효율적으로 배양계에 도입하는 방법으로서, 아데노바이러스 외에 레트로바이러스를 사용하는 방법도 널리 알려져 있다. 본 발명자들이 검토한 바, MAIT 세포를 사용하는 본 발명에 있어서는 센다이 바이러스 벡터를 사용함으로써, 극히 효율적으로 MAIT 세포를 초기화하여 iPS 세포를 얻을 수 있고, 또한 게놈 개변(改變)을 생기게 하지 않으므로, 안전성의 점에서도 우수한 iPS 세포를 얻을 수 있다.

또한, 복수의 초기화 인자를 도입하기 위해서는, 그 1개 또는 복수의 유전자를 개별 벡터에 삽입한 것을 제조하고, 이들 복수 종류의 벡터를 동시에 처리하는 것이 일반적이지만, 복수의 초기화 유전자를 1개의 벡터에 탑재하고, 모든 유전자를 발현할 수 있는 벡터를 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 여기서, 「복수의 초기화 인자」란, 전술한, Oct3/4 유전자, Klf 패밀리 유전자, Myc 패밀리 유전자 및 Sox 패밀리 유전자의 4인자로부터 선택되는 적어도 2개 이상의 인자이며, 바람직하게는 Oct3/4 유전자, Klf 패밀리 유전자 및 Sox 패밀리 유전자의 3인자이며, 더욱 바람직하게는, 4인자 모두이다. 이와 같은 복수의 초기화 유전자를 동시에 발현할 수 있는 센다이 바이러스 벡터는 공지되어 있으며, 예를 들면, 센다이 바이러스 벡터에 초기화 인자를, 전사 개시 위치로부터, c-Myc→lf4→Oct3/4→Sox2의 배치로 탑재한 SeVdp(MKOS)302L(서열 번호 13)이나 Klf4→Oct3/4→ox2→c-Myc의 배치로 탑재한 SeVdp(KOSM)(서열 번호 14) 등은, 극히 높은 효율로 섬유아세포 등으로부터 iPS 세포를 유도·수립할 수 있는 것에 대하여 보고되어 있다(WO2010/134526; Nishimiura K et al., J. Biol. Chem. 286, 4760-4771(2011), WO2012/0063817). 또한, 이들 벡터에 관한 지견에 기초하여, 초기화 인자의 배치, 삽입 위치, 그 외의 부가 서열에 관하여, 임의로 설계한 센다이 바이러스 벡터를 구축하고, 본 발명에 사용할 수 있다. 예를 들면, 실시예 1에서 사용한 SeVdp(KOSM)302L은, 초기화 인자를 SeVdp(KOSM)과 마찬가지로, Klf4→Oct3/4→Sox2→c-Myc의 배치로 탑재하고, 삽입 위치, 그 외의 부가 서열에 관하여, SeVdp(KOSM) 및 SeVdp(MKOS)302L의 특징을 채용한 센다이 바이러스 벡터이다.

이와 같이, 센다이 바이러스 벡터 등을 사용하여 초기화 인자를 MAIT 세포에 도입함으로써 MAIT 세포 유래의 iPS 세포를 얻을 수 있지만, 이와 같은 MAIT 세포 유래의 iPS 세포 자체도 본 발명의 하나의 태양이다. MAIT 세포를 초기화하여 얻어진 iPS 세포(MAIT-iPS 세포)는, MAIT 세포에 특이적인 TCRα쇄 유전자 및/또는 그 산물을 발현하고 있는(이하, 상기 특성을 「MAIT 세포에 특이적인 TCRα쇄를 가지고 있는」으로 표현함) 점에서, ES 세포나 iPS 세포 등 종래부터 존재하고 있던 다능성 줄기 세포와는 상이하다. MAIT 세포에 특이적인 TCRα쇄 유전자를 가지고 있는 다능성 줄기 세포는, 후술하는 바와 같이, T 세포로의 분화를 유도할 수 있는 조건 하에 둠으로써 MAIT 세포와 유사한 특성을 가지는 MAIT 유사 세포를 선택적으로 얻을 수 있어, 극히 유용하다.

MAIT 세포를 초기화하여 얻어지는 MAIT-iPS 세포는, 계속하여, 공지의 방법에 의한 세포 회수, 분리, 정제법 등에 의해 고순도로 또한 다량으로 회수할 수 있다.

또한 하나의 태양에 있어서, 본 발명은, MAIT 세포에 특이적인 TCRα쇄 유전자를 가지는 iPS 세포이다. 이와 같은 iPS 세포는, 전술한 바와 같이, 센다이 바이러스 벡터 등의 발현 벡터를 사용하여 초기화 인자를 MAIT 세포에 도입함으로써 얻을 수 있지만, 이와 같이 체세포인 MAIT 세포를 초기화하는 방법 이외에도, MAIT 세포에 특이적인 TCR 유전자를 ES 세포나 일반적인, 통상적인 방법으로 제조된 iPS 세포 등의 다능성 줄기 세포에 도입함으로써 얻는 것도 고려할 수 있다. 이 경우에, 다능성 줄기 세포로서는, ES 세포뿐만 아니라, 포유동물의 성체 장기나 조직의 세포, 골수 세포, 혈액 세포, 또한 배아나 태아의 세포 등으로부터 유래하는, ES 세포와 유사한 형질을 가지는 모든 다능성 줄기 세포를 사용할 수 있다. 이 경우에, ES 세포와 유사한 형질은, ES 세포에 특이적인 표면 마커 분자의 존재나 테라토마 형성 능력 등의 ES 세포에 특이적인 세포 생물학적 성질이나 ES 세포 특이적인 유전자의 발현, 또는 대상 세포에서의 다수의 유전자군의 발현 양식의 유사성의 높음 등으로 규정할 수 있다.

하나의 태양에 있어서 본 발명은 MAIT 유사 세포의 제조 방법이며, MAIT-iPS 세포 등의, MAIT 세포에 특이적인 TCRα쇄 유전자를 가지는 iPS 세포를 분화 유도하여 MAIT 유사 세포를 얻을 수 있다. 이와 같이 하여 얻어진 분화 세포는, MAIT 세포와 마찬가지의 특성을 가지고 있고, 본 발명에 있어서 MAIT 유사 세포라고 한다. 특히, MAIT-iPS 세포를 분화 유도하여 얻어진 MAIT 유사 세포를, 본 발명에 있어서 iMAIT 세포라고 한다(학술적으로는, 「reMAIT 세포」라고도 한다).

본 발명에 있어서, MAIT 세포에 특이적인 TCRα쇄 유전자를 가지는 iPS 세포를 분화 유도하여 MAIT 유사 세포를 얻는 경우, iPS 세포를 비롯한 다능성 줄기 세포로부터 T 세포를 분화 유도하는 공지의 방법을 제한없이 사용할 수 있다. NKT 세포에 대해서는, 핵이식에 의해 NKT 세포의 핵이식에 의해 얻어진 ES 세포를 제조하고, 상기 세포를 분화 유도하여 NKT 유사 세포를 얻은 것과, 또한 레트로바이러스 벡터를 사용하여 마우스 NKT 세포를 초기화하여 iPS 세포를 제조하고, 그 iPS 세포를 분화 유도하여 NKT 유사 세포를 얻은 것이 지금까지 보고되어 있다.

본 발명에 있어서 분화 유도에 의해 MAIT 유사 세포를 얻을 때의 배양법으로서는, MAIT 유사 세포를 얻을 수 있는 방법이면, 모두 사용할 수 있고, 예를 들면, 피더 세포와의 공배양법, 부유 배양법, 현적(hanging drop) 배양법, 선회 배양법, 연한천 배양법, 마이크로 캐리어 배양법 등이 있다. 본 발명의 바람직한 태양에 있어서, iPS 세포를 분화 유도하여 MAIT 유사 세포를 얻는 경우, 공배양에 의한 것이 바람직하고, 구체적으로는, OP9 세포 등의 스트로마 세포를 피더 세포로 하여 공배양하고, 또한 Notch 리간드인 DLL1을 강제 발현시킨 OP9 세포(OP9/DLL1)와 공배양하는 것, 또는 처음부터 OP9/DLL1 세포와 공배양함으로써, MAIT-iPS 세포보다 효율적으로 MAIT 유사 세포를 얻을 수 있다.

이와 같이 하여 얻어진 MAIT 유사 세포는, 계속하여, 공지의 방법에 의한 세포 회수, 분리, 정제를 행할 수 있다. 본 발명에 의해 얻어진 MAIT 유사 세포는, 생체 내의 MAIT 세포와 거의 동등한 형태학적, 생리학적 및/또는 면역학적 특징을 나타내는 세포이다. 생리학적 및/또는 면역학적 특징은, 특히 이를 한정하지 않지만, MAIT 유사 세포의 확인은, MAIT 세포에 특이적인 하나 또는 그 이상의 마커의 발현을 확인함으로써 행할 수 있다. 마커의 발현은, 특히 그 방법은 제한하지 않으며, 항체를 사용한 면역 염색법이나 역전사 효소 개재성 폴리메라제 연쇄 반응(RT-PCR), 하이브리다이제이션 해석과 같은 공지의 세포 조직 생물학적 방법 및 분자 생물학적 방법에 의해 확인할 수 있다. MAIT 유사 세포를 정제하는 방법은, 공지되어 있는 세포의 분리 정제법이면 모두 사용할 수 있으며, 그 구체적 예로서, 플로우사이트미터나 자기(磁氣) 비즈, 패닝법 등의 항원-항체 반응에 준한 방법이나, 수크로오스, 퍼콜(percoll) 등의 담체를 사용한 밀도 기울기 원심분리에 의한 세포 분화법을 들 수 있다(「Monoclonal Antibodies: principles and practice, Third Edition」Acad. Press, 1993; 「Antibody Engineering: A Practical Approach」IRL Press at Oxford University Press, 1996).

구체적으로는, MAIT 유사 세포는, MAIT 세포와 마찬가지로, 항TCR Vα7.2 항체(3C10), 항CD161 항체, 항IL-18Rα 항체 등에 대하여 양성(3C10^＋/CD161^＋/IL-18Rα^＋)이었다. 한편, 생체 내의 MAIT 세포는 CCR7의 발현이 음성인데 대하여, 항원 미감작(未感作)의(제조 직후의) MAIT 유사 세포는 약하기는 하지만 CCR7의 발현이 확인되어 생체내 MAIT 세포와 MAIT 유사 세포의 사이에 차이가 있는 것이 확인되었다. 또한, 예를 들면, 말초혈 유래의 MAIT 세포에서는, 이펙터 메모리 형 T 세포의 마커인 CD45RO의 발현이 양성이며, 나이브형 T 세포의 마커인 CD45RA의 발현이 음성이 극히 일부의 세포에서만 양성인데 대하여, 항원 미감작의(제조 직후의) MAIT 유사 세포에서는, CD45RO의 양성 세포는 거의 인정되지 않고, CD45RA의 발현이 강하게 인정되었다. 이와 같이, MAIT 유사 세포는, 생체내 MAIT 세포와 거의 동일한 형질을 나타내지만, 일부 상이한 형질을 가지고 있는 것을 알았다.

또한, 본 발명에 의해 수립된 MAIT 유사 세포는, 생체내 MAIT 세포와 거의 동일한 세포 표면 항원, 유전자 발현, 사이토카인 생산능을 구비하고 있고, 마우스에 이입함으로써, 장관이나 간장 등의 조직에 국재하여, 증식하는 것이 확인되었다. 또한, MAIT 유사 세포는, MAIT 세포와 마찬가지의 항균/감염 저항성을 가지는 것이 확인되었다. 즉, 본 발명에 의해 수립된 MAIT 유사 세포는, 생체내 MAIT 세포와 마찬가지의 기능이나 특성을 구비하고 있는 것이 확인되었다.

하나의 태양에 있어서, 본 발명은 MAIT 유사 세포이다. 본 발명의 MAIT 유사 세포는, MAIT 세포의 기능 해석을 진행시키는 데 있어서 귀중한 연구 툴로서 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 MAIT 유사 세포는, MAIT 세포의 발생이나 분화 유도, 재생, 생존, 증식 등을 촉진하는 신규 인자 또는 물질이나 약제를 동정하기 위한 스크리닝에 사용할 수 있다.

본 발명의 MAIT 유사 세포는, 약물 등의 각종 생리 활성 물질이나 기능이 미지의 신규 유전자 산물 등의 약리 평가 및 활성 평가에 유용하다. 예를 들면, MAIT 세포의 기능 조절에 관한 물질이나 약제, 또한 MAIT 세포에 대하여 독성이나 상해성을 가지는 물질이나 약제의 스크리닝에 이용할 수 있다. 특히 현재로서는, MAIT 세포의 기능 해석을 진행시키기 위해 충분한 MAIT 세포를 준비하는 것이 곤란하며, MAIT 세포의 특성이 충분히 규명되어 있지 않으므로, 본 발명에 의해 조제된 MAIT 유사 세포는, 전술한 바와 같은 스크리닝을 실시하기 위한 유용한 세포 소스가 된다. 또한, 인간암이나 다발성 경화증소(硬化症巢)에 집적하는 Tc17 세포(IL-17 생산능을 가지는 CD8^＋ 세포)의 대부분이 MAIT 세포로 보고되어 있으며, MAIT 세포의 기능을 규명하여 신약 개발을 행하는 것이 유용하다.

새로운 태양에서는, 본 발명에 의해 조제한 MAIT 유사 세포를 포함하는 어세이 키트는, 상기 스크리닝을 행하는 데 유용하다. 또한, MAIT 세포의 기능 해석에 사용하는 모노크로날 항체의 제조, MAIT 세포의 증식, 활성화, 성숙화를 제어하는 아고니스트나 안타고니스트의 스크리닝에 대해서도, 본 발명의 MAIT 유사 세포를 사용하여 실시할 수 있다.

스크리닝에 제공하는 피험 물질로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 저분자 화합물, 고분자 화합물, 유기 화합물, 무기 화합물, 단백질, 펩티드, 유전자, 바이러스, 세포, 세포 배양액, 미생물 배양액 등이 있다.

다른 태양에서는, 본 발명에 의해 조제한 MAIT 유사 세포를 사용하여 이것을 엑스비보(ex vivo)에서 자기 면역 질환, 암, 감염 등의 면역 이상(異常)을 나타내는 환자 말초혈로부터 조제한 임파구(단구, 수상(樹狀) 세포, B 세포, NK 세포, T 세포 등)와 공배양에 제공함으로써 의하여, MAIT 유사 세포 또는 환자 임파구 표면 항원 프로필의 변화 및/또는 전사 인자, 사이토카인/케모카인 등의 생산능 변화를 지표로 하여 그 병의 용태, 약제 효과, 또는 예후의 예측 등의 진단에 응용하는 것도 가능하다.

또한, 본 발명의 MAIT 유사 세포는, 그 자체를 세포 이식하여 세포 이식 요법에 사용할 수 있고, 또는 MAIT 유사 세포를 실질적인 유효 성분으로서 포함하는 세포 요법제로서 투여할 수 있다. MAIT 세포는 세균 감염 및 진균 감염에 대한 저항성을 항진시키기 때문에, 예를 들면, 본 발명의 MAIT 유사 세포를 세포 이식 또는 투여함으로써 세균 감염 또는 진균 감염에 대한 저항성을 향상시킬 수 있다. 또한, MAIT 세포는, 자기면역 질환이나 암 등에 관여할 가능성에 대하여 보고되어 있고, 예를 들면, 본 발명의 MAIT 유사 세포를 세포 이식함으로써 인간 자기면역 질환이나 암을 치료할 수 있을 가능성이 있다. 즉, 하나의 태양에 있어서 본 발명은, MAIT 유사 세포의 세포 이식 요법에서의 사용, 세포 이식 요법용의 MAIT 유사 세포, MAIT 유사 세포를 세포 이식하는 것을 포함하는 요법, MAIT 유사 세포를 실질적인 유효 성분으로서 포함하는 세포 요법제 등에 관한 것이다. 이와 같은 세포 이식 요법 또는 세포 투여 요법의 대상 환자는, 세균 감염에 대한 저항력을 향상시킬 필요가 있는 환자, 장기 이식 치료 또는 혈액 줄기 세포 등 각종 세포 이식 치료를 받은 환자, 자기면역 질환 환자, 암환자 등이지만, 바람직하게는, 환자가 보유하는 혈액 중의 MAIT 세포가 표준보다 적은, 및/또는 MAIT 세포의 활성이 저하되어 있는, 환자이다.

본 발명의 실시에 있어서, 분자 생물학이나 재조합 DNA 기술 등의 유전자 공학적 방법 및 일반적인 세포 생물학의 방법 및 종래 기술에 대하여, 실시자는, 특별히 나타내지 않으면, 상기 분야의 표준적인 서적을 참조할 수 있다. 이와 같은 서적으로서는, 예를 들면, 「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」(Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 제3판, 2001); 「Current Protocols in Molecular biology」(Ausubel et al.편, John Wiley & Sons, 1987); 「Methods in Enzymology」시리즈(Academic Press); 「PCR Protocols: Methods in Molecular Biology」(Bartlett & Striling편, Humana Press, 2003); 「Animal Cell Culture: A Practical Approach」(Masters편, Oxford University Press, 제3판, 2000); 「Antibodies: A Laboratory Manual」(Harlow et al. & Lane편, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1987) 등이 있고, 이들은 참조에 의해 본 명세서에 포함될 수 있다. 또한, 본 명세서에 있어서 참조되는 세포 배양, 세포 생물학 실험을 위한 시약 및 키트류는 Sigma사나 Invitrogen사, Clontech사, R&D systems사, BD Bioscience사 등의 시판업자로부터 입수 가능하다.

또한, iPS 세포를 비롯한 다능성 줄기 세포의 제조, 계대(繼代), 보존법이나 세포 생물학 실험의 일반적 방법에 대하여, 실시자는, 상기 분야의 표준적인 서적을 참조할 수 있다. 이들의 예로서, 「Guide to Techniques in Mouse Development」(Wasserman et al.편, Academic Press, 1993); 「Embryonic Stem Cell Differentiation in vitro」(M. V. Wiles, Meth. Enzymol.225: 900, 1993); 「Manipulating the Mouse Embryo: A laboratory manual」(Hogan et al.편, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994); 「Embryonic Stem Cells」(Turksen편, Humana Press, 2002)을 들 수 있고, 참조에 의해 본 명세서에 포함할 수 있다. 본 명세서에 있어서 참조되는 세포 배양, 발생·세포 생물학 실험을 위한 시약 및 키트류는 Invitrogen사나 Sigma사 등의 시판업자로부터 입수 가능하다.

실시예

이하에서 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 하기 실시예 등에 의해 아무런 제약을 받지 않는다.

실시예1 : 인간 유래 MAIT 세포로부터의 iPS 세포의 수립

인간 제대혈로부터 피콜(ficoll)를 사용하여 단핵구 세포를 조제하였다. 이 단핵구 세포에, MAIT 세포의 TCR(Vα7.2)을 특이적으로 인식하는 모노크로날 항체 3C10(프랑스·퀴리 연구소의 Olivier Lantz 박사 제공, 또는 Biolegend사)를 비오틴 표지한 것을 혼화시켜, 아비딘 자기 비즈를 이용한 MACS 컬럼(Miltenyi Biotech사 제조)을 사용하여 3C10 항체에 반응성을 가지는 세포를 포지티브 선택함으로써, MAIT 세포를 농축했다. 이 조작을, 상이한 3명의 도너 유래의 제대혈를 사용하여 행한 결과, FACS 해석에 의해 3C10 양성 세포로서 규정되는 MAIT 세포는, 각각 96%, 88%, 78%의 순도였다.

전술한 바와 같이 정제한 20만 개의 3C10 양성 세포에, 인간 iPS 세포 제조용 벡터인 SeVdp(KOSM)302L(산교소고겐큐죠의 나카니시 마사토 박사로부터 제공받음)을 실온에서 2시간 감염시켰다(MOI=2.5). 상기 벡터는, 인간 유래의 4 유전자(Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc를 코딩하는 핵산)를 동일 벡터 내에 탑재하고 있는 센다이 바이러스 벡터이며, 효율적인 iPS 세포 제조능을 가진다(WO2010/134526). 바이러스 벡터를 포함하는 용액을 원심분리 조작에 의해 제거하고, 20% Knockout Serum Replacement(KSR; Invitrogen사), 0.1 ㎜ol/L MEM 비필수 아미노산액, 2 ㎜ol/L L-글루타민, 및 0.1 ㎜ol/L 2-메르캅토에탄올을 포함하는 DMEM/F12 배지(Sigma사)에 4 ng/mL의 염기성 섬유아세포 증식 인자(bFGF: basic fibroblast growth factor, Reprotech사)를 첨가한 ES/iPS 세포 전용 배지에 현탁하여, 마이토마이신 C로 처리한 마우스 배성 섬유아세포(MEF) 상으로 파종하고, 37℃, 5% CO₂ 농도 하에서 공배양을 행하였다. 12일 후, ES/iPS상의 형태를 이루는 콜로니를 회수하고, 24 웰 플레이트에 파종한 MEF 상에 다시 파종하였다. ES/iPS 세포 전용 배지에서 배양한 후, 성장한 콜로니를 형태적으로 판단하고, ES/iPS 세포상의 형태를 취하는 콜로니를 선발했다.

전술한 바와 같이 얻어진 iPS 세포가 인간 MAIT 세포 유래인 것을 확인하기 위하여, 게놈 DNA를 주형으로 하고, T 세포 항원 수용체 α쇄(TCRα) 유전자 시트가 MAIT 세포 특이적인 유전자 재구성을 일으키고 있는지의 여부를 조사하였다. 여기서, 도 1에 나타낸 바와 같이, MAIT 세포에 특이적인 TCRα쇄 유전자를 가지는 세포에서는, TCRα 영역을 코딩하는 유전자의 한쪽이 Vα7.2-Jα33으로 재구성하는 것으로 알려져 있다. 이에, 하기에 나타낸 프라이머를 사용하여, 각 iPS 세포 클론의 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR을 행하고, 재구성의 유무를 확인하였다. Vα7.2-Jα33이 유전자 재구성하고 있는 TCRα쇄를 가지고 있는 경우, 하기 프라이머를 사용한 게놈 PCR에 의해 282bp의 밴드가 증폭되고, 상기 PCR 산물은 제한 효소 SacI으로 소화하면 191＋91 bp의 DNA 단편을 발생시킨다. 한편, Vα7.2-Jα33으로 재구성하고 있지 않은 경우, 282bp의 밴드는 증폭되지 않는다.

(정방향(Forward)) 5'-GGTGCCATTGTCCAGATCAACTGC-3'(서열번호 1)

(역방향(Reverse)) 5'-CTTTATAATTAGCTTGGTCCCAGC-3'(서열번호 2)

이상과 같이 하여 확인한 결과, 3명의 도너 유래 세포로부터, 독립된 3회의 실험을 행함으로써, 인간 MAIT 세포로부터 유래하는 iPS 세포(MAIT-iPS 세포)를 50주 이상 수립할 수 있었다.

실시예 2: MAIT - iPS 세포의 특성 해석

실시예 1에서 개별적으로 수립·단리된 MAIT-iPS 세포주인 1-3D, 2-5D, 4-6D는, MEF 피더 상에서 단층이면서 또한 편평하며 명확한 윤곽의 콜로니를 나타내고, 일반적인 인간 ES/iPS 세포와 매우 유사한 형태를 나타낸다(도 2a).

또한, 이와 같이 계대 유지한 MAIT-iPS 세포를 사용하고, 인간 ES/iPS 세포에 특이적인 마커의 발현을 조사하였다. 고정한 MAIT-iPS 세포에 대하여, 1차 항체로서 항알칼리포스파타제(ALP) 항체, 항SSEA4 항체, 항Oct-3/4 항체, 항Nanog 항체(이상, R&D System사), 항TRA-1-60 항체(BD Bioscience사), 또는 항TRA-1-81 항체(Santa Cruz사)와 반응시킨 후, 로다민 표지 2차 항체(Jackson I㎜unoResearch사)를 사용하여 염색했다. 세포핵은 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI: 4',6-diamidino-2-phenylindole) 용액(1μg/mL)으로 염색했다. 이들 항체나 색소에 의한 염색상을 형광 현미경 하에서 관찰했다. 그 결과, MAIT-iPS 세포는 알칼리포스파타제, SSEA4, Oct-3/4, Nanog, TRA-1-60, TRA-1-81의 모두에 대하여 강한 양성(강양성)을 나타내었다(도 2b).

마찬가지로 MAIT-iPS 세포의 RNA를 조제하고, 미분화된 인간 iPS 세포 특이적인 유전자인 Oct-3/4 및 Nanog의 발현을 확인하였다. MAIT-iPS 세포나 인간 iPS 세포로부터 조제한 전체 RNA를 사용하여 cDNA를 합성하고, 이것을 주형으로 하여 이하의 프라이머를 사용한 폴리머라아제 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR)을 행하여, 각종 유전자 단편의 증폭을 행하였다.

Oct-3/4[증폭 사이즈: 144bp]

(정방향) 5'-GACAGGGGGAGGGGAGGAGCTAGG-3'(서열 번호 3)

(역방향) 5'-CTTCCCTCCAACCAGTTGCCCCAAAC-3'(서열 번호 4)

Nanog[증폭 사이즈: 391 bp]

(정방향) 5'-CAGCCCCGATTCTTCCACCAGTCCC-3'(서열 번호 5)

(역방향) 5'-CGGAAGATTCCCAGTCGGGTTCACC-3'(서열 번호 6)

GAPDH(그리세르알데히드-3-인산 데하이드로게나제)[증폭 사이즈: 382bp]

(정방향) 5'-AATCCCATCACCATCTTCC-3'(서열 번호 7)

(역방향) 5'- CATCACGCCACAGTTTCC-3'(서열 번호 8)

PCR 산물을 1.5% 아가로스겔로 전기 영동하여, 브롬화 에티듐(Merck사)으로 염색한 후, 겔 촬영 장치(ATTO사)를 사용하여 검출하였다. 그 결과, 개별적으로 수립·단리된 MAIT-iPS 세포주인 1-3D, 2-5D, 4-6D, A11, A13, C4B, C5B의 각 세포주에 있어서, 인간 iPS 세포와 마찬가지로 Oct-3/4 및 Nanog 유전자의 강한 발현이 인정되었다(도 3).

보다 철저하게 MAIT-iPS 세포주의 유전자 발현 상황을 검토하기 위하여, DNA 마이크로 어레이(Agilent사) 해석을 행하여, MAIT-iPS 세포와 인간 iPS/ES 세포에서의 유전자 발현 프로파일의 상관 관계를 조사하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다. 표 1로부터 밝혀진 바와 같이, MAIT-iPS 세포는 인간 ES 세포 또는 인간 iPS 세포와 극히 유사한 유전자 발현 패턴(모든 비교에 있어서 상관 계수가 0.95 이상)를 나타내었으며, 한편, 작출의 기원 세포가 된 인간 제대혈 유래 MAIT 세포와는 상이하였다. 또한, MAIT-iPS 세포에서는, 일반적인 인간 ES/iPS 세포와 마찬가지로, Oct-3/4 유전자나 Nanog 유전자 프로모터 영역의 탈메틸화나, 높은 텔로머라아제 활성도 확인할 수 있으며, 수십 대(代) 이상, 미분화 형질을 유지한 채로 계대 배양할 수 있다.

이상의 결과로부터, MAIT 세포로부터 수립한 iPS 세포주(MAIT-iPS 세포주)가 일반적인 iPS 세포상의 특성·기능을 가지고 있는 것을 나타낸다.

[표 1]

그리고, 이하의 실험에는, 상기와 마찬가지로, MAIT-iPS 세포로서 1-3D 주, 2-5D 주, 4-6D 주 등의 복수의 세포주를 사용하였지만, 대체로 세포주의 상위(相違)에 의한 실험 결과의 상위는 관찰되지 않았다. 이에 따라, 이하의 실시예에서는, 특별히 언급하지 않는 한, 1-3D 주를 사용한 실시예 데이터를 나타낸다.

계속하여, MAIT-iPS 세포의 분화능을 검토했다. MEF 상에서 미분화 형질을 유지하면서 계대 배양한 MAIT-iPS 세포를 세포 해리액(0.25% 트립신, 1 mg/ml 콜라게나아제 IV를 포함함)으로 처리하여 작은 덩어리로 만들고, bFGF를 포함하지 않는 ES/iPS 세포 전용 배지로 현탁한 후, 저접착성 플레이트에 파종했다. 8일 후에 세포 응집괴(凝集塊)를 회수하고, 이들을 젤라틴으로 전처리한 세포 접착성 플레이트에 파종하고, 16일 후에 고정하였다. 고정한 세포는 1차 항체로서 항근성(抗筋性) 엑틴 항체(Nichirei Bioscience사)나 항Sox-17 항체(R&D System사), 항네스틴 항체(Sigma사)와 반응시킨 후, 상기한 방법과 마찬가지로 염색 및 형광 현미경 관찰을 행하였다. 그 결과, MAIT-iPS 세포를 분화 유도한 것으로부터, 본 조건 하에 있어서 근성 엑틴 양성의 중배엽 세포나 Sox-17 양성의 내배엽성 세포, 네스틴 양성의 외배엽성 세포의 출현을 확인할 수 있었다.

또한, 8×10⁶∼10×10⁶ 개의 MAIT-iPS 세포를 NOD/scid 마우스(Charles River사)의 피하에 이식한 바, 10∼14 주 후에 기형종(teratoma)의 형성을 관찰할 수 있었다. 각 종양의 파라핀 포매(包埋) 표본으로부터 조직 절편을 제조하고, 1차 항체로서 항범 사이토케라틴 항체(DAKO사) 또는 항데스민 항체(DAKO사)와 반응시킨 후, 비오틴 표지 2차 항체(DAKO사)와 반응시키고, 마지막으로 디아미노벤지딘을 사용한 정색(呈色) 반응을 행하였다. 헤마톡실린액으로 염색한 후, 광학 현미경 하에서 관찰한 바, MAIT-iPS 세포 유래 종양 내에는, 멜라닌 양성 세포를 포함하는 신경관상 구조나 사이토케라틴 양성 세포로 구성되는 장관상 구조, 나아가서는 데스민 양성의 근세포 유사 조직의 존재가 인정되었다(도 4).

이상의 결과로부터, MAIT-iPS 세포는 일반적인 인간 ES/iPS 세포와 마찬가지로, 미분화 상태 특이적인 마커 유전자 및 단백을 발현하고, 3 배엽으로의 분화 다능성을 가진 세포인 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3: MAIT - iPS 세포로부터의 MAIT 세포 제조

ES 세포 등의 줄기 세포는, OP9 세포를 피더 세포로 한 공배양에 의해, CD34 양성의 혈구/임파구 전구 세포로 분화 유도할 수 있고, 또한 Notch 리간드인 DLL1을 강제 발현한 OP9 세포(OP9/DLL1)와 공배양함으로써, T 세포 계열의 세포로 분화 유도시킬 수 있는 것으로 알려져 있다(Schmitt TM et al., Nat. I㎜un.5, 410-417(2004); Wakao H et al., FASEB J.22, 2223-2231(2008); Wakao H et al., WO2008/038579; Watarai H et al., J. Clin. Invest.120, 2610-2618(2010); WO2010/027094; Ti㎜ermans F et al., J. I㎜unol.182, 6879-6888(2011)).

본 실시예에서는, 상기 방법에 기초하여, MAIT-iPS 세포로부터 MAIT 세포로의 분화 유도를 시도했다.

OP9 세포 및 OP9/DLL1 세포는, 이화학 연구소 바이오 자원 센터(Riken Cell Bank)로부터 구입한 것을 사용하였다. 먼저, 칸플루엔트(confluent)로 만들어 3∼7 일 후의 OP9 세포 상에, MAIT-iPS 세포의 콜로니를 100개 정도의 작은 덩어리로 분산한 것을, 10 cm 디쉬당 1×10⁶개 파종하고, 10% 우태아 혈청(FBS) 및 0.1 mM 1-thioglycerol를 포함하는αMEM 배지 중에서 배양하고, 혈구 및 임파구계의 줄기·전구 세포로 분화 유도했다. 파종 후 11∼12 일째에 콜로니형으로 형성된 세포집 덩어리를 인산 완충액(PBS)으로 2회 세정한 후, 1 mg/mL의 collagenase IV(Invitrogen사)를 포함하는αMEM 배지 및 0.01% 트립신/EDTA(Sigma사)를 가하여 잘 교반하여, 단일 세포에 분산시켰다. 이 세포 집단을 CD34 MultiSort Kit(Miltenyi사)를 사용하여 CD34 양성 세포 분획(순도 95% 이상)을 조제·회수한 후, 20% FBS, 인간 SCF(stem cell factor), 인간·인터류킨 7(IL-7), 인간 Flt3 리간드(FL)(모두 Reprotech사, 각각 5 ng/mL)를 포함하는 αMEM 배지(이하, MAIT 세포 분화 유도 배지)에 현탁하고, 사전에 24 웰 세포 배양 플레이트에 파종하고, 칸플루엔트로 만들어 3∼7 일 후의 OP9/DLL1 세포 상에 파종했다. MAIT 세포 분화 유도 배지를 4일마다 절반씩 교환하고, 배양을 14∼30 일간 계속한 후, 세포를 피펫팅 조작에 의해 피더 세포로부터 분리시켜, 회수하였다.

전술한 바와 같이 MAIT-iPS 세포로부터 분화시킨 세포의 형질을, 플로우사이토메트리(flow cytometry: FCM)법으로, 항TCR Vα7.2 항체(3C10), 항TCRαβ 항체(IP26; Biolegend사), 항CD161 항체(DX12; BD Bioscience사) 및 항IL-18Rα 항체(H44; Biolegend사)에 대한 반응성을 지표로 하여 검토했다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

먼저, 상기한 방법에 의해 조제한 MAIT-iPS 세포로부터 유래하는 분화 세포(OP9/DLL1 세포에 파종하여 30일째)를, 상기 4종의 항체로 염색한 바, 거의 모든 세포가 TCR Vα7.2^＋/TCRαβ^＋가 되었다(이하, TCR Vα7.2^＋를 3C10 항원 양성: 3C10^＋로 기재함). 또한, 이 공양성 획분의 세포는, 동시에 거의 전부가 CD161^＋ 및 IL-18Rα^＋이며, MAIT-iPS 세포로부터 MAIT 유사 세포를 분화 유도할 수 있는 것을 나타낸다.

이 MAIT 유사 세포는 본 발명에 의해 양호한 재현성으로, 또한 고효율로 제조할 수 있으며, 복수 회의 검토에 있어서 3C10^＋/TCRαβ^＋/CD161^＋/IL-18Rα^＋로 규정되는 MAIT 유사 세포는, 항상 전체의 85% 이상을 차지하는 것을 확인할 수 있었다.

이하에서, 본 발명에 의해 MAIT-iPS 세포로부터 분화 유도된 MAIT 유사 세포를 iMAIT 세포라고 칭한다.

실시예 4: iMAIT 세포의 특성 해석

Lantz등의 일련의 보고(Dusseaux et al., 2011)에 의하면, 생체내, 특히 말초혈에 존재하는 MAIT 세포는, TCR Vα7.2, CD161, IL-18Rα 이외에 CD26(DPP-IV)이나 CD27, CD28, CD62L(L-selectin), CD95(Fas), CD127(IL-7Rα), CD244(SLAMF4)와 같은 세포 표면 마커가 양성인 것으로 알려져 있다. 이에 전술한 방법에 기초하여, iMAIT 세포에서의, 이들 마커에 특이적인 항체에 대한 반응성을 조사하였다.

양성 대조군으로서, 인간 말초혈 단핵구 세포(Cellular Technology사)로부터 상기한 방법과 마찬가지로 3C10^＋/TCRαβ^＋/CD161^＋ 획분 세포를 조제하고, 상기 세포를 인간 말초혈 유래 MAIT 세포(이하, PBMC-MAIT 세포)로서 사용하였다.

[표 2]

표 2에 결과를 나타내었다. PBMC-MAIT 세포에서는, 기보(旣報)와 같이, CD26이나 CD27, CD28, CD62L, CD95, CD127, CD244의 발현이 인정되었다. iMAIT 세포에 있어서도, 발현에 약간의 강약이 있지만, 이들 모든 마커의 발현을 확인할 수 있었다(도 6, 표 2).

또한, PBMC-MAIT 세포는 CCR5나 CCR6와 같은 케모카인 수용체를 강하게 발현하는 한편, CCR7의 발현이 음성인 것으로 알려져 있다(Dusseaux et al., 2011). 이에, PBMC-MAIT 세포와 iMAIT 세포에서의, 이들 케모카인 수용체의 발현을 전술한 방법과 마찬가지로 검토한 바, iMAIT 세포에서는, PBMC-MAIT 세포와 마찬가지로, CCR5와 CCR6의 강한 발현이 인정되었다. 한편, CCR7은 약하지만 발현이 확인되어, PBMC-MAIT 세포와는 상이한 특성을 나타낸다(표 2).

또한, PBMC-MAIT 세포는 일반적으로 이펙터 메모리형 T 세포의 마커인 CD45RO의 발현이 양성이며, 나이브형 T 세포(항원 자극을 받기 전의 T 세포)의 마커로서 알려진 CD45RA의 발현은 음성 또는 극히 일부 세포에서만 양성이지만, iMAIT 세포에서는 CD45RA의 발현이 강하게 인정되고, CD45RO 양성 세포는 거의 인정되지 않았다(도 6, 표 2).

이상의 결과로부터, iMAIT 세포는 PBMC-MAIT 세포와 거의 동일한 형질을 나타내는 것이 강하게 나타내어지고, 한편 CD45RA나 CCR7의 발현으로 규정되는 나이브형 T 세포로서의 특성을 유지하고 있으며, PBMC-MAIT와는 일부 상이한 형질을 가지고 있는 것이 밝혀졌다.

실시예 5: iMAIT 세포의 사이토카인 생산능 확인

MAIT 세포의 특징으로서, CD3/TCR과 CD28로의 공자극(共刺戟) 시그널(이하, CD3/CD28 자극), 또는 포볼(phorbol) 12-미리스테이드 13-아세테이트(phorbol12-myristate 13-acetate: PMA)와 이오노마이신(Ionomycin)에 의한 자극(이하, PMA/Iono 자극)에 의해 인터페론(IFN)γ 등의 사이토카인을 발생하는 것으로 알려져 있다(Dusseaux et al., 2011). 이에, 실시예 2, 3에 기재된 방법에 기초하여 제조한 iMAIT 세포를, 항CD3 항체 및 항CD28 항체로 코팅된 자기 비즈(Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28; Invitrogen사)와 혼화 배양하고 CD3/CD28 자극을 48시간 행하였다. 또한, 마찬가지로 iMAIT 세포 배양계에 PMA(10 ng/mL; 와코순약사)와 Ionomycin(1μM; 와코순약사)을 첨가하여 PMA/Iono 자극을 48시간 행하였다.

그 후, 배지 상청액을 회수하고, 각종 사이토카인의 양을 Bioplex Pro-Human Cytokine 21-plex Assay 및 Pro-Human Cytokine 27-plex Assay 시스템(BioRad사)을 사용하여 측정하였다. 그 결과, iMAIT 세포는 미자극 상태에서는 IFNγ를 발생하고 있지 않았지만, CD3/CD28 자극 또는 PMA/Iono 자극을 주면, 현저하게 높은 IFNγ의 발생이 인정된다(도 7). 또한, 그 외의 사이토카인 생산능도 조사한 바, iMAIT 세포는 미자극 상태에서는 IL-2, IL-17, TNF-α의 발생이 관찰되지 않았지만, PMA/Iono 자극에 의해 분명한 발생 항진 효과가 인정되었다. 한편, IL-4나 IL-10의 생산은 관찰되지 않으며, 이상의 결과는 PBMC-MAIT 세포와 극히 유사한 경향을 나타내고 있다.

또한, MAIT 세포는, 세균을 탐식(貪食)시킨 모노사이트와 공배양함으로써, 인터페론(IFN)γ 등의 사이토카인을 발생하는 것으로 알려져 있다. 이에, 동일한 계를 사용하여 iMAIT 세포의 사이토카인 생산능을 검토했다. 인간 말초혈 유래 단핵구 세포(1×10₆개/mL; Cellular Technology사)를 세포 배양용 96웰 플레이트에 1×10⁵개씩 파종하고, 1시간 방치한 후, 바닥면에 부착성 세포로서 남는 세포(약 1×10⁴개)를 모노사이트로서 사용하였다. 무혈청·무첨가의 DMEM 배지 중의 부착성 세포에 대하여 대장균(Escherichia coli; 다중 감염도 MOI=100)을 3시간 감염시켰다. 그 후, 10% FBS 및 페니실린·스트렙토마이신을 가한 DMEM으로 세정·치환하고, 거기에 실시예 3, 4와 마찬가지의 방법으로 조제한 iMAIT 세포를 2×10⁴개씩 파종했다. 48시간 공배양을 행한 후, 배지의 상청액을 회수하고, 각종 사이토카인의 양을 측정하였다. 그 결과, 상기 공배양계에 있어서도, IFNγ나 IL-2, IL-17, TNF-α와 같은 사이토카인의 생산량 증대를 확인할 수 있었다.

실시예 6: 마우스 체내에서의 iMAIT 세포의 정착과 감염 방어 효과의 검토

iMAIT 세포가 동물체 내에서, 통상의 MAIT 세포와 마찬가지의 거동(擧動)할 수 있는지를 확인하기 위하여, 사전에 320 cGy의 방사선 조사(照射)를 행한 8∼10 주령의 NOD/scid 마우스(Charles River사)에, 실시예 3에서 제조한 iMAIT 세포(5×10⁴개/마리)를 경정맥(經靜脈) 투여에 의해 주입 이식했다. 6∼10 주 후에 안락사시킨 후, 골수나 간장, 비장, 소장 표피나 점막 고유층을 적출했다. 다음으로, 상기 장기로부터 임파구를 회수하고, 실시예 3과 마찬가지의 FCM법을 이용하여, 임파구 중의 iMAIT 세포, 즉 3C10^＋/TCRαβ^＋ 세포의 존재를 조사하였다.

그 결과, 조사한 모든 장기에 있어서 iMAIT 세포의 존재가 확인되었고, 특히 소장 점막 고유층에 고율(高率)로 집적하고 있는 것이 나타났다(도 8). 또한, 소장 점막 고유층에서 검출된 iMAIT 세포수가, 이입한 세포수 중 적어도 100배를 넘고 있는 예가 확인되어, iMAIT 세포가 마우스 체내 환경 하에서 증식하고 있는 것이 시사되었다.

MAIT 세포는, 결핵균 등의 세균에 감염한 세포와 반응하여, 감염 방어의 기능을 가지는 것으로 알려져 있다. iMAIT 세포는, 감염 방어 시에 중요한 역할을 담당하는 IFNγ나 IL-17, IL-2를 생산하고(실시예 5 참조), 이들 사이토카인과 마찬가지로, 세포 상해성을 유도하는 데 있어서 중심적인 역할을 담당하는 퍼포린(perforin) 및 그란자임(granzyme)도 생산하고 있다(데이터로 나타내지 않음). 이에, iMAIT 세포가, 실제로 세균 감염에 대한 방어 효과를 나타내는지의 여부를 검토했다.

NOG(NOD.Cg-Prkdc scid Il2rgtm1Sug/Jic) 마우스(실험동물 중앙 연구소)에, 실시예 3의 방법에 기초하여 제조한 iMAIT 세포(5×10⁴개/마리)를 경정맥 투여에 의해 주입 이식했다. 그 5주일 후, 비결핵성항산균(Mycobacterium abscessus)을 1.0×10⁶ CFU/마리로 접종했다. 그 2주일 후에 안락사시켜 간장과 비장을 적출하고, 상기 장기 내에서 생존하는 M. abscessus균의 수(콜로니 형성 능력)를 조사하였다.

결과를 도 9에 나타내지만, iMAIT 세포를 이입하지 않았던 군(群)인 iMAIT(-)와 비교하여, iMAIT 세포를 이입한 군인 iMAIT(＋)에서는 간장에서의 생균(형성 콜로니) 수가 유의하게 저감하고 있고, 비장에 있어서도 동일한 경향이 인정되었다.

이상의 실험 결과는, 동물체 내에 있어서, iMAIT 세포는 MAIT 세포와 동등한 기능이나 효과를 나타내는 것을 분명하게 나타낸 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED and NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION HOKKAIDO UNIVERSITY <120> MAIT-LIKE CELLS AND THEIR PREPARATION METHOD <130> FA1511-13114 <150> JP 2012-239195 <151> 2012-10-30 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for MAIT-TCR gene <400> 1 ggtgccattg tccagatcaa ctgc 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for MAIT-TCR gene <400> 2 ctttataatt agcttggtcc cagc 24 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for Oct3/4 cDNA <400> 3 gaagttggag aaggtggaac c 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for Oct3/4 cDNA <400> 4 gcctcatact cttctcgttg g 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for Nanog cDNA <400> 5 aaagtgagat tagccccgag 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for Nanog cDNA <400> 6 tcccatcccc ttcaatagca 20 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for GAPDH cDNA <400> 7 ggaagcttgt catcaacgg 19 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for GAPDH cDNA <400> 8 ctcttgctca gtgtccttgc 20 <210> 9 <211> 1599 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 aacatttcca aatcttggca ttcttatcca caaagtgaag ataataattg tcaattcaca 60 ggtgattatg atttaaagag attacttttg aagagttcct aacacattca gtcaacattt 120 aatgatgctt caggcactgt gttcattgct agtgagcgta tgacacacac agccatacgg 180 tcacagagct ttcaatgaaa agtaacataa ttgctcattt caccaggccc ccggcttggg 240 gcgccttcct tccccatggc gggacacctg gcttcggatt tcgccttctc gccccctcca 300 ggcggtgggg gtgatgggcc atggggggcg gagccgggct gggttgatcc tctgacctgg 360 ctaagcttcc aaggccctcc tggagggcca ggaatcgggc cgggggttgg gccaggctct 420 gaggtgtggg ggattccccc ttgccccccg ccgtatgagt tatgtggggg gatggcgtac 480 tgtgggcctc aggttggagt ggggctagtg ccccaaggcg gcttggagac ctctcagcct 540 gagagcgaag caggagtcgg ggtggagagc aactccaatg gggcctcccc ggaaccctgc 600 accgtccccc ctggtgccgt gaagctggag aaggagaagc tagagcaaaa cccggagaag 660 tcccaggaca tcaaagctct gcagaaagaa ctcgagcaat ttgccaagct cctgaagcag 720 aagaggatca ccctgggata tacacaggcc gatgtggggc tcatcctggg ggttctattt 780 gggaaggtgt tcagccaaaa gaccatctgc cgctttgagg ctctgcagct tagcttcaag 840 aacatgtgta agctgcggcc cttgctgcag aagtgggtgg aggaagctga caacaatgaa 900 aatcttcagg agatatgcaa agcagaaacc ctcatgcagg cccgaaagag aaagcgaacc 960 agtatcgaga accgagtgag aggcaacctg gagaatttgt tcctgcagtg cccgaaaccc 1020 acactgcaga tcagccacat cgcccagcag cttgggctcg agaaggatgt ggtccgagtg 1080 tggttctgta accggcgcca gaagggcaag cgatcaagca gcgactatgc acaacgagag 1140 gattttgagg ctgctgggtc tcctttctca gggggaccag tgtcctttcc tccggcccca 1200 gggccccatt ttggtacccc aggctatggg agccctcact tcactgcact gtactcctca 1260 gtccctttcc ctgaggggga agtctttccc ccagtctccg tcatcactct gggctctccc 1320 atgcattcaa actgaggtgc ctgcccttct aggaatgggg aacaggggag gggaggagct 1380 agggaaagag aacctggagt ttgtggcagg gcttttggga ttaagttctt cattcactaa 1440 ggaaggaatt gggaacacta agggtggggg caggggagtt tggggcaact ggttggaggg 1500 aaggtgaagt tcaatgatgc tcttgatttt aatcccacat catgtatcac ttttttctta 1560 aataaagaag cctgggacac agtaaaaaaa aaaaaaaaa 1599 <210> 10 <211> 2949 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 agtttcccga ccagagagaa cgaacgtgtc tgcgggcgcg cggggagcag aggcggtggc 60 gggcggcggc ggcaccggga gccgccgagt gaccctcccc cgcccctctg gccccccacc 120 ctcccacccg cccgtggccc gcgcccatgg ccgcgcgcgc tccacacaac tcaccggagt 180 ccgcgccttg cgccgccgac cagttcgcag ctccgcgcca cggcagccag tctcacctgg 240 cggcaccgcc cgcccaccgc cccggccaca gcccctgcgc ccacggcagc actcgaggcg 300 accgcgacag tggtggggga cgctgctgag tggaagagag cgcagcccgg ccaccggacc 360 tacttactcg ccttgctgat tgtctatttt tgcgtttaca acttttctaa gaacttttgt 420 atacaaagga actttttaaa aaagacgctt ccaagttata tttaatccaa agaagaagga 480 tctcggccaa tttggggttt tgggttttgg cttcgtttct tctcttcgtt gactttgggg 540 ttcaggtgcc ccagctgctt cgggctgccg aggaccttct gggcccccac attaatgagg 600 cagccacctg gcgagtctga catggctgtc agcgacgcgc tgctcccatc tttctccacg 660 ttcgcgtctg gcccggcggg aagggagaag acactgcgtc aagcaggtgc cccgaataac 720 cgctggcggg aggagctctc ccacatgaag cgacttcccc cagtgcttcc cggccgcccc 780 tatgacctgg cggcggcgac cgtggccaca gacctggaga gcggcggagc cggtgcggct 840 tgcggcggta gcaacctggc gcccctacct cggagagaga ccgaggagtt caacgatctc 900 ctggacctgg actttattct ctccaattcg ctgacccatc ctccggagtc agtggccgcc 960 accgtgtcct cgtcagcgtc agcctcctct tcgtcgtcgc cgtcgagcag cggccctgcc 1020 agcgcgccct ccacctgcag cttcacctat ccgatccggg ccgggaacga cccgggcgtg 1080 gcgccgggcg gcacgggcgg aggcctcctc tatggcaggg agtccgctcc ccctccgacg 1140 gctcccttca acctggcgga catcaacgac gtgagcccct cgggcggctt cgtggccgag 1200 ctcctgcggc cagaattgga cccggtgtac attccgccgc agcagccgca gccgccaggt 1260 ggcgggctga tgggcaagtt cgtgctgaag gcgtcgctga gcgcccctgg cagcgagtac 1320 ggcagcccgt cggtcatcag cgtcagcaaa ggcagccctg acggcagcca cccggtggtg 1380 gtggcgccct acaacggcgg gccgccgcgc acgtgcccca agatcaagca ggaggcggtc 1440 tcttcgtgca cccacttggg cgctggaccc cctctcagca atggccaccg gccggctgca 1500 cacgacttcc ccctggggcg gcagctcccc agcaggacta ccccgaccct gggtcttgag 1560 gaagtgctga gcagcaggga ctgtcaccct gccctgccgc ttcctcccgg cttccatccc 1620 cacccggggc ccaattaccc atccttcctg cccgatcaga tgcagccgca agtcccgccg 1680 ctccattacc aagagctcat gccacccggt tcctgcatgc cagaggagcc caagccaaag 1740 aggggaagac gatcgtggcc ccggaaaagg accgccaccc acacttgtga ttacgcgggc 1800 tgcggcaaaa cctacacaaa gagttcccat ctcaaggcac acctgcgaac ccacacaggt 1860 gagaaacctt accactgtga ctgggacggc tgtggatgga aattcgcccg ctcagatgaa 1920 ctgaccaggc actaccgtaa acacacgggg caccgcccgt tccagtgcca aaaatgcgac 1980 cgagcatttt ccaggtcgga ccacctcgcc ttacacatga agaggcattt ttaaatccca 2040 gacagtggat atgacccaca ctgccagaag agaattcagt attttttact tttcacactg 2100 tcttcccgat gagggaagga gcccagccag aaagcactac aatcatggtc aagttcccaa 2160 ctgagtcatc ttgtgagtgg ataatcagga aaaatgagga atccaaaaga caaaaatcaa 2220 agaacagatg gggtctgtga ctggatcttc tatcattcca attctaaatc cgacttgaat 2280 attcctggac ttacaaaatg ccaagggggt gactggaagt tgtggatatc agggtataaa 2340 ttatatccgt gagttggggg agggaagacc agaattccct tgaattgtgt attgatgcaa 2400 tataagcata aaagatcacc ttgtattctc tttaccttct aaaagccatt attatgatgt 2460 tagaagaaga ggaagaaatt caggtacaga aaacatgttt aaatagccta aatgatggtg 2520 cttggtgagt cttggttcta aaggtaccaa acaaggaagc caaagttttc aaactgctgc 2580 atactttgac aaggaaaatc tatatttgtc ttccgatcaa catttatgac ctaagtcagg 2640 taatatacct ggtttacttc tttagcattt ttatgcagac agtctgttat gcactgtggt 2700 ttcagatgtg caataatttg tacaatggtt tattcccaag tatgccttaa gcagaacaaa 2760 tgtgtttttc tatatagttc cttgccttaa taaatatgta atataaattt aagcaaacgt 2820 ctattttgta tatttgtaaa ctacaaagta aaatgaacat tttgtggagt ttgtattttg 2880 catactcaag gtgagaatta agttttaaat aaacctataa tattttatct gaaaaaaaaa 2940 aaaaaaaaa 2949 <210> 11 <211> 2121 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 ctgctcgcgg ccgccaccgc cgggccccgg ccgtccctgg ctcccctcct gcctcgagaa 60 gggcagggct tctcagaggc ttggcgggaa aaaagaacgg agggagggat cgcgctgagt 120 ataaaagccg gttttcgggg ctttatctaa ctcgctgtag taattccagc gagaggcaga 180 gggagcgagc gggcggccgg ctagggtgga agagccgggc gagcagagct gcgctgcggg 240 cgtcctggga agggagatcc ggagcgaata gggggcttcg cctctggccc agccctcccg 300 cttgatcccc caggccagcg gtccgcaacc cttgccgcat ccacgaaact ttgcccatag 360 cagcgggcgg gcactttgca ctggaactta caacacccga gcaaggacgc gactctcccg 420 acgcggggag gctattctgc ccatttgggg acacttcccc gccgctgcca ggacccgctt 480 ctctgaaagg ctctccttgc agctgcttag acgctggatt tttttcgggt agtggaaaac 540 cagcagcctc ccgcgacgat gcccctcaac gttagcttca ccaacaggaa ctatgacctc 600 gactacgact cggtgcagcc gtatttctac tgcgacgagg aggagaactt ctaccagcag 660 cagcagcaga gcgagctgca gcccccggcg cccagcgagg atatctggaa gaaattcgag 720 ctgctgccca ccccgcccct gtcccctagc cgccgctccg ggctctgctc gccctcctac 780 gttgcggtca cacccttctc ccttcgggga gacaacgacg gcggtggcgg gagcttctcc 840 acggccgacc agctggagat ggtgaccgag ctgctgggag gagacatggt gaaccagagt 900 ttcatctgcg acccggacga cgagaccttc atcaaaaaca tcatcatcca ggactgtatg 960 tggagcggct tctcggccgc cgccaagctc gtctcagaga agctggcctc ctaccaggct 1020 gcgcgcaaag acagcggcag cccgaacccc gcccgcggcc acagcgtctg ctccacctcc 1080 agcttgtacc tgcaggatct gagcgccgcc gcctcagagt gcatcgaccc ctcggtggtc 1140 ttcccctacc ctctcaacga cagcagctcg cccaagtcct gcgcctcgca agactccagc 1200 gccttctctc cgtcctcgga ttctctgctc tcctcgacgg agtcctcccc gcagggcagc 1260 cccgagcccc tggtgctcca tgaggagaca ccgcccacca ccagcagcga ctctgaggag 1320 gaacaagaag atgaggaaga aatcgatgtt gtttctgtgg aaaagaggca ggctcctggc 1380 aaaaggtcag agtctggatc accttctgct ggaggccaca gcaaacctcc tcacagccca 1440 ctggtcctca agaggtgcca cgtctccaca catcagcaca actacgcagc gcctccctcc 1500 actcggaagg actatcctgc tgccaagagg gtcaagttgg acagtgtcag agtcctgaga 1560 cagatcagca acaaccgaaa atgcaccagc cccaggtcct cggacaccga ggagaatgtc 1620 aagaggcgaa cacacaacgt cttggagcgc cagaggagga acgagctaaa acggagcttt 1680 tttgccctgc gtgaccagat cccggagttg gaaaacaatg aaaaggcccc caaggtagtt 1740 atccttaaaa aagccacagc atacatcctg tccgtccaag cagaggagca aaagctcatt 1800 tctgaagagg acttgttgcg gaaacgacga gaacagttga aacacaaact tgaacagcta 1860 cggaactctt gtgcgtaagg aaaagtaagg aaaacgattc cttctaacag aaatgtcctg 1920 agcaatcacc tatgaacttg tttcaaatgc atgatcaaat gcaacctcac aaccttggct 1980 gagtcttgag actgaaagat ttagccataa tgtaaactgc ctcaaattgg actttgggca 2040 taaaagaact tttttatgct taccatcttt tttttttctt taacagattt gtatttaaga 2100 attgttttta aaaaatttta a 2121 <210> 12 <211> 2520 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 ggatggttgt ctattaactt gttcaaaaaa gtatcaggag ttgtcaaggc agagaagaga 60 gtgtttgcaa aagggggaaa gtagtttgct gcctctttaa gactaggact gagagaaaga 120 agaggagaga gaaagaaagg gagagaagtt tgagccccag gcttaagcct ttccaaaaaa 180 taataataac aatcatcggc ggcggcagga tcggccagag gaggagggaa gcgctttttt 240 tgatcctgat tccagtttgc ctctctcttt ttttccccca aattattctt cgcctgattt 300 tcctcgcgga gccctgcgct cccgacaccc ccgcccgcct cccctcctcc tctccccccg 360 cccgcgggcc ccccaaagtc ccggccgggc cgagggtcgg cggccgccgg cgggccgggc 420 ccgcgcacag cgcccgcatg tacaacatga tggagacgga gctgaagccg ccgggcccgc 480 agcaaacttc ggggggcggc ggcggcaact ccaccgcggc ggcggccggc ggcaaccaga 540 aaaacagccc ggaccgcgtc aagcggccca tgaatgcctt catggtgtgg tcccgcgggc 600 agcggcgcaa gatggcccag gagaacccca agatgcacaa ctcggagatc agcaagcgcc 660 tgggcgccga gtggaaactt ttgtcggaga cggagaagcg gccgttcatc gacgaggcta 720 agcggctgcg agcgctgcac atgaaggagc acccggatta taaataccgg ccccggcgga 780 aaaccaagac gctcatgaag aaggataagt acacgctgcc cggcgggctg ctggcccccg 840 gcggcaatag catggcgagc ggggtcgggg tgggcgccgg cctgggcgcg ggcgtgaacc 900 agcgcatgga cagttacgcg cacatgaacg gctggagcaa cggcagctac agcatgatgc 960 aggaccagct gggctacccg cagcacccgg gcctcaatgc gcacggcgca gcgcagatgc 1020 agcccatgca ccgctacgac gtgagcgccc tgcagtacaa ctccatgacc agctcgcaga 1080 cctacatgaa cggctcgccc acctacagca tgtcctactc gcagcagggc acccctggca 1140 tggctcttgg ctccatgggt tcggtggtca agtccgaggc cagctccagc ccccctgtgg 1200 ttacctcttc ctcccactcc agggcgccct gccaggccgg ggacctccgg gacatgatca 1260 gcatgtatct ccccggcgcc gaggtgccgg aacccgccgc ccccagcaga cttcacatgt 1320 cccagcacta ccagagcggc ccggtgcccg gcacggccat taacggcaca ctgcccctct 1380 cacacatgtg agggccggac agcgaactgg aggggggaga aattttcaaa gaaaaacgag 1440 ggaaatggga ggggtgcaaa agaggagagt aagaaacagc atggagaaaa cccggtacgc 1500 tcaaaaagaa aaaggaaaaa aaaaaatccc atcacccaca gcaaatgaca gctgcaaaag 1560 agaacaccaa tcccatccac actcacgcaa aaaccgcgat gccgacaaga aaacttttat 1620 gagagagatc ctggacttct ttttggggga ctatttttgt acagagaaaa cctggggagg 1680 gtggggaggg cgggggaatg gaccttgtat agatctggag gaaagaaagc tacgaaaaac 1740 tttttaaaag ttctagtggt acggtaggag ctttgcagga agtttgcaaa agtctttacc 1800 aataatattt agagctagtc tccaagcgac gaaaaaaatg ttttaatatt tgcaagcaac 1860 ttttgtacag tatttatcga gataaacatg gcaatcaaaa tgtccattgt ttataagctg 1920 agaatttgcc aatatttttc aaggagaggc ttcttgctga attttgattc tgcagctgaa 1980 atttaggaca gttgcaaacg tgaaaagaag aaaattattc aaatttggac attttaattg 2040 tttaaaaatt gtacaaaagg aaaaaattag aataagtact ggcgaaccat ctctgtggtc 2100 ttgtttaaaa agggcaaaag ttttagactg tactaaattt tataacttac tgttaaaagc 2160 aaaaatggcc atgcaggttg acaccgttgg taatttataa tagcttttgt tcgatcccaa 2220 ctttccattt tgttcagata aaaaaaacca tgaaattact gtgtttgaaa tattttctta 2280 tggtttgtaa tatttctgta aatttattgt gatattttaa ggttttcccc cctttatttt 2340 ccgtagttgt attttaaaag attcggctct gtattatttg aatcagtctg ccgagaatcc 2400 atgtatatat ttgaactaat atcatcctta taacaggtac attttcaact taagttttta 2460 ctccattatg cacagtttga gataaataaa tttttgaaat atggacactg aaaaaaaaaa 2520 <210> 13 <211> 15810 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SeVdp(MKOS)302L <400> 13 accaaacaag agaagaaaca tgtatggaat atataatgaa gtttaagaaa aacttagggt 60 caaagtatcc accctgagga gcaggttcca gatccttttc tttgctgcca aagttcacga 120 tggccgggtt gttgagcacc ttcgatacat ttagctctag gaggagcgaa agtattaata 180 agtcgggagg aggtgctgtt atccccggcc agaggagcac agtctcagtg ttcatactag 240 gcccaagtgt gactgatgat gcagacaagt tattcattgc aacaaccttc ctagctcact 300 cattggacac agataagcag cactctcaga gaggagggtt cctcgtctct ctgcttgcca 360 tggcttacag tagtccagaa ttgtacttga caacaaacgg agtaaacgcc gatgtcaaat 420 atgtgatcta caacatagag 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aggagaggct cagacatcat ctggcaaact 1320 tgtccggtgg ggatggtgct taccacaaac caacaggcgg tggtgcaatt gaggtagctc 1380 tagacaatgc cgatatcgac ctggaaacag aagctcatgc ggaccaggac gctaggggtt 1440 ggggtggaga tagtggtgaa agatgggcac gtcaggtgag tggtggccac tttgtcacac 1500 tacatggggc tgaacggtta gaggaggaaa ccaatgatga ggatgtatca gacatagaga 1560 gaagaatagc catgagactc gcagagagac ggcaagagga ttctgcaacc catggagatg 1620 aaggccgcaa taacggtgtt gatcacgaag aagatgacga tgccgcagca gcagctggga 1680 taggaggaat ctaggatcat acgaggcctc aaggtacttg atccgcagta agaaaaactt 1740 agggtgaaag ttcatccacc gatcggctca ggcaaggcca cacccaaccc caccgaccac 1800 acccagcagt cgagacagcc acggcttcgg ctacacttac cgcatggatc aagatgcctt 1860 cattcttaaa gaagattctg aagttgagag gaaggcgcca ggaggacgag agtcgctctc 1920 ggatgttatc ggattcctcg atgctgtcct gtcgaatgaa ccaactgaca tcggagggga 1980 cagaagctgg ctccacaaca ccatcaacac tccccaagga ccaggctctg ctcatagagc 2040 caaaagtgag ggcgaaggag aagtctcaac accgtcgacc caagataatc gatcaggtga 2100 ggagagtaga gtctctggga gaacaagcaa 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Claims (18)

1. MAIT 세포에 초기화 인자를 도입하여 MAIT 세포에 특이적인 태양으로 재구성된 TCRα쇄 유전자를 유지하는 인공 다능성 줄기 세포를 얻는 것, 이어서,
   상기 인공 다능성 줄기 세포를 분화 유도하여 MAIT 유사 세포를 얻는 것
   을 포함하는, MAIT 유사 세포의 시험관 내 제조 방법으로서,
   상기 초기화 인자로서 Oct3/4 유전자, Klf 패밀리 유전자, Myc 패밀리 유전자, 및 Sox 패밀리 유전자를 사용하는, 제조 방법.
2. MAIT 세포에 초기화 인자를 도입하여 MAIT 세포 특이적인 태양으로 재구성된 TCRα쇄 유전자를 유지하는 인공 다능성 줄기 세포를 얻는 것을 포함하는, 인공 다능성 줄기 세포의 시험관 내 제조 방법으로서,
   상기 초기화 인자로서 Oct3/4 유전자, Klf 패밀리 유전자, Myc 패밀리 유전자, 및 Sox 패밀리 유전자를 사용하는, 제조 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   바이러스 벡터를 사용하여 초기화 인자를 도입하는, 방법.
4. 제3항에 있어서,
   바이러스 벡터가, 센다이 바이러스 벡터(Sendai virus vector)인, 방법.
5. 제4항에 있어서,
   상기 센다이 바이러스 벡터가, 복수의 초기화 인자를 동일한 벡터 내에 탑재한 것인, 방법.
6. 제2항에 기재된 방법에 의해 얻어지는 인공 다능성 줄기 세포.
7. MAIT 세포에 특이적인 태양으로 재구성된 TCRα쇄 유전자를 유지하는 인공 다능성 줄기 세포.
8. 제7항에 있어서,
   TCRα쇄 유전자로서, MAIT 세포에 특이적인 태양으로 재구성된, 단일 TCRα쇄 유전자만을 유지하는, 인공 다능성 줄기 세포.
9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
   MAIT 세포에 특이적인 태양으로 재구성된 TCRα쇄 유전자가, 인간의 경우 Vα7.2-Jα33, 마우스의 경우 Vα19-Jα33인, 인공 다능성 줄기 세포.
10. 제7항에 있어서,
    제2항에 기재된 방법에 의해 얻어지는, 인공 다능성 줄기 세포.
11. 제6항 또는 제7항에 기재된 인공 다능성 줄기 세포를 분화 유도하여 MAIT 유사 세포를 얻는 것을 포함하는, MAIT 유사 세포의 시험관 내 제조 방법.
12. 제11항에 있어서,
    상기 인공 다능성 줄기 세포를 피더 세포(feeder cell)와 함께 공배양(共培養)하여 MAIT 유사 세포를 얻는, 방법.
13. 제6항 또는 제7항에 기재된 인공 다능성 줄기 세포를 분화 유도함으로써 얻어지는, MAIT 유사 세포.
14. 제11항에 기재된 방법에 의해 얻어지는, MAIT 유사 세포.
15. 제13항에 있어서,
    CD45RA의 발현이 양성인, MAIT 유사 세포.
16. 제13항에 기재된 MAIT 유사 세포와 피험 물질을 시험관 내에서 접촉시키는 공정, 및
    상기 세포의 증식, 활성화 또는 성숙화의 정도를 측정하는 공정
    을 포함하는, MAIT 세포의 증식, 활성화 또는 성숙화를 제어하는 활성을 가지는 물질의 스크리닝 방법.
17. 제13항에 기재된 MAIT 유사 세포를 함유하는, 세균 감염 또는 진균 감염의 예방 또는 치료용 세포 요법제(療法劑).
18. 제17항에 있어서,
    세균 감염 또는 진균 감염에 대한 저항력을 향상시키기 위해 투여되는, 세포 요법제.

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