CN104971341B - 肿瘤干细胞分子标记 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子标记，该分子标记为用于检测作为检测对象的细胞团中的肿瘤干细胞的分子标记，其在该检测对象所含的肿瘤干细胞中能检测到，但在非肿瘤干细胞的癌细胞和正常细胞中检测不到；还涉及以该分子标记为指标来判定判定对象中是否存在肿瘤干细胞的方法。进而，本发明涉及试剂盒，其为用于判定肿瘤干细胞是否存在的试剂盒，至少含有用于检测前述分子标记的试剂。进而，本发明还涉及前述分子标记所编码的多肽、识别该分子标记的基因表达产物的表位的抗体、抑制该分子标记表达的核酸、含有来源于该分子标记的基因的核酸疫苗。

Description

肿瘤干细胞分子标记
技术领域
本发明涉及分子标记，其为用于检测作为检测对象的细胞团中的肿瘤干细胞的分子标记，其在该检测对象所含的肿瘤干细胞中能检测到，但在非肿瘤干细胞的癌细胞和正常细胞中检测不到。
背景技术
肿瘤干细胞被认为是癌症复发、转移的主要原因，癌症治疗中以肿瘤干细胞为靶标的重要性已被指出。但是肿瘤组织中肿瘤干细胞比率较低(非专利文献4)，特异性识别肿瘤干细胞并进行治疗是极其困难的。肿瘤干细胞的检测技术以及以肿瘤干细胞为靶标的新疗法的开发已成为癌症医疗中的重要课题。
目前，作为已知的肿瘤干细胞标记，有CD133、CD24、CD44等分子标记(非专利文献1～7)，据说仅在极少数癌细胞中具有有效性，为了在更多种类的癌症中检测肿瘤干细胞，需要鉴定新的分子标记。
现有技术文献
非专利文献1：Shu Zhang et al.,Cancer Res.68：(11)4311-4320,2008
非专利文献2：Shih-Hwa Chiou et al.,Clin.Cancer Res.14(13)4085-4095,2008
非专利文献3：Gang-Ming Zou,J.Cell.Physiol.217：598-604,2008
非专利文献4：Cheong J.Lee et al.,J Clin Oncol 26：2806-2812,2008
非专利文献5：Madhuri Kakarala et al.,J Clin Oncol 26：2813-2820,2008
非专利文献6：Craig D.Peacock et al.,J Clin Oncol 26：2883-2889,2008
非专利文献7：Xing Fan et al.,J Clin Oncol 26：2821-2827,2008
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于，提供在肿瘤干细胞的检测中有用的分子标记。
解决问题的手段
为解决上述课题，本发明人等在持续进行深入研究时着眼于如下新的见解，所述新见解为：对于肿瘤干细胞标记基因而言必不可少的是，在至少1种组织中有用性更高且优选在多个组织中的来源于该组织的正常细胞中看不到表达、在肿瘤干细胞中能看到表达，即在鉴定肿瘤干细胞基因时的待测物中通常含有正常组织的情况下在该待测物中的正常组织中几乎不表达。并且判明：迄今为止所报告的针对肿瘤干细胞的标记基因在正常组织中几乎都高水平表达，而本发明人等在进一步研究中发现，已知的转录因子基因-性别决定Y区域转录因子2(Sex determinig Region Y-box2，Sox2)基因虽然在成人正常细胞中看不到表达，但意外的是其在肿瘤干细胞中表达。并且，进一步研究时发现，以精子线粒体相关富含半胱酸蛋白(Sperm Mitochondria-associated Cysteine-rich Protein，Smcp)基因为首的其它基因也是在成人正常细胞中几乎不表达而在肿瘤干细胞中表达，从而完成了本发明。
即，本发明涉及分子标记，其为用于检测作为检测对象的细胞团中的肿瘤干细胞的分子标记，其在该检测对象所含的肿瘤干细胞中能检测到，但在非肿瘤干细胞的癌细胞和正常细胞中检测不到。
此外，本发明涉及前述分子标记，检测对象为来源于选自心脏、脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏、胰脏、脾脏、胸腺、前列腺、精巢、卵巢、小肠、白细胞、结肠、胃、骨髓、大肠和末梢血单核细胞所组成的组中的1种或2种以上细胞或组织的细胞团。
进而，本发明涉及前述分子标记，其在本发明全部检测对象的非肿瘤干细胞的癌细胞和正常细胞中检测不到。
进而，本发明还涉及前述分子标记，该分子标记为选自Or7c1、Dnajb8、Sox2、Smcp、Ints1、Kox12、Mdf1、FLJ13464、667J232、Surf6、Pcdh19、Dchs2、Pcdh21、Gal3st1、Rasl11b、Hes6、Znf415、Nkx2－5、Pamci、Pnmt和Scgb3a1所组成的组中的1种或2种以上基因的表达产物。
此外，本发明涉及以前述分子标记为指标来判定判定对象中是否存在肿瘤干细胞的方法。
进而，本发明涉及前述方法，细胞团含有正常细胞和/或非肿瘤干细胞的癌细胞。
进而，本发明涉及前述方法，细胞团来源于选自心脏、脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏、胰脏、脾脏、胸腺、前列腺、精巢、卵巢、小肠、白细胞、结肠、胃、骨髓、大肠和末梢血单核细胞所组成的组中的1种或2种以上细胞或组织。
此外，本发明涉及前述方法，判定是指：在检测到选自Or7c1、Dnajb8、Sox2、Smcp、Ints1、Kox12、Mdf1、FLJ13464、667J232、Surf6、Pcdh19、Dchs2、Pcdh21、Gal3st1、Rasl11b、Hes6、Znf415、Nkx2－5、Pamci、Pnmt和Scgb3a1所组成的组中的1种或2种以上基因的表达产物的情况下，判定为存在肿瘤干细胞。
此外，本发明涉及前述方法，基因的表达产物为mRNA和/或内源性多肽。
此外，本发明涉及前述方法，基因的表达产物为mRNA，该方法包括利用RT－PCR法检测的步骤。
此外，本发明涉及前述方法，基因的表达产物为内源性多肽，该方法包括利用与该内源性多肽特异性反应的试剂检测的步骤。
此外，本发明涉及前述方法，试剂为抗体。
此外，本发明涉及前述方法，判定在体外或体内进行。
此外，本发明涉及癌症治疗药的筛选方法，其包括下述步骤：
i)测定前述分子标记的、对细胞团投与候补化合物前的检测量A的步骤，
ii)对细胞团投与候补化合物的步骤，
iii)测定i)中所测定的分子标记的、对细胞团投与候补化合物后的检测量B的步骤，和
iv)比较A和B，在A显著大于B的情况下，将候补化合物判定为候补癌症治疗药的步骤。
进而，本发明涉及用于判定肿瘤干细胞是否存在的试剂盒，其含有用于检测前述分子标记的试剂。
此外，本发明涉及前述试剂盒，用于检测的试剂为用于检测mRNA的、具有与下述基因互补的碱基序列的探针和/或引物，所述mRNA为选自Or7c1、Dnajb8、Sox2、Smcp、Ints1、Kox12、Mdf1、FLJ13464、667J232、Surf6、Pcdh19、Dchs2、Pcdh21、Gal3st1、Rasl11b、Hes6、Znf415、Nkx2－5、Pamci、Pnmt和Scgb3a1所组成的组中的1种或2种以上基因的表达产物。
此外，本发明涉及用于判定肿瘤干细胞是否存在的试剂盒，用于检测的试剂为用于检测多肽的抗体，所述多肽为选自Or7c1、Dnajb8、Sox2、Smcp、Ints1、Kox12、Mdf1、FLJ13464、667J232、Surf6、Pcdh19、Dchs2、Pcdh21、Gal3st1、Rasl11b、Hes6、Znf415、Nkx2－5、Pamci、Pnmt和Scgb3a1所组成的组中的1种或2种以上基因的表达产物。
本发明还涉及癌症的判定方法，其使用前述试剂盒。
本发明还涉及多肽，所述多肽为能够用作用于抑制肿瘤干细胞的功能或杀灭肿瘤干细胞的抗原的多肽，所述多肽为由Or7c1、Dnajb8、Sox2、Smcp、Ints1、Kox12、Mdf1、FLJ13464、667J232、Surf6、Pcdh19、Dchs2、Pcdh21、Gal3st1、Rasl11b、Hes6、Znf415、Nkx2－5、Pamci、Pnmt和Scgb3a1所编码的多肽或其一部分，或者在该多肽或其一部分中缺失、置换或添加1个或多个氨基酸而形成的多肽。
本发明还涉及抗体，该抗体与源于选自Or7c1、Dnajb8、Sox2、Smcp、Ints1、Kox12、Mdf1、FLJ13464、667J232、Surf6、Pcdh19、Dchs2、Pcdh21、Gal3st1、Rasl11b、Hes6、Znf415、Nkx2－5、Pamci、Pnmt和Scgb3a1所组成的组中的1种或2种以上基因的表达产物的表位特异性反应。
此外，本发明涉及药物组合物，其含有至少一种以上的前述多肽和/或前述抗体。
本发明还涉及前述药物组合物，药物组合物为癌症治疗用或癌症预防用组合物。
本发明还涉及将前述多肽作为抗原抑制肿瘤干细胞的功能、或杀灭肿瘤干细胞的方法。
此外，本发明涉及前述方法，所述方法使用前述抗体。
本发明还涉及编码前述多肽的核酸。
本发明还涉及含有前述核酸的药物组合物。
此外，本发明涉及前述药物组合物，所述药物组合物为DNA或RNA疫苗用药物组合物。
本发明还涉及通过主要组织适合抗原进行抗原呈递的肽的筛选方法，所述方法包括下述步骤：
i)制备将目标多肽切断而成的具有适当长度的肽片段的步骤，
ii)将i)中获得的肽片段、抗原呈递细胞、和用目标多肽和/或i)中获得的肽片段致敏的T细胞一起培养的步骤，
iii)测定ii)中获得的T细胞的活化程度的步骤，
iv)筛选iii)中使T细胞活化的肽片段的步骤，
其中，目标多肽为前述多肽。
本发明还涉及核酸，该核酸用于抑制肿瘤干细胞中选自Or7c1、Dnajb8、Sox2、Smcp、Ints1、Kox12、Mdf1、FLJ13464、667J232、Surf6、Pcdh19、Dchs2、Pcdh21、Gal3st1、Rasl11b、Hes6、Znf415、Nkx2－5、Pamci、Pnmt和Scgb3a1所组成的组中的基因的表达。
此外，本发明涉及前述核酸，该核酸为DNA和/或RNA。
此外，本发明涉及药物组合物，其含有至少1种以上前述核酸。
此外，本发明涉及药物组合物，该药物组合物为癌症治疗用组合物。
此外，本发明涉及使用前述核酸抑制肿瘤干细胞的功能的方法。
发明效果
本发明提供的分子标记能够判别癌细胞所含的肿瘤干细胞、和非肿瘤干细胞的癌细胞。并且前述判别能够通过检测单一分子标记来进行，因此能够极其简便地判别肿瘤干细胞。
此外，本发明的分子标记能够在肺癌细胞、乳腺癌细胞、大肠癌细胞等、多种肿瘤干细胞中通用，作为具有通用性的肿瘤干细胞的分子标记是极其有效的。
进而，本发明的分子标记在正常细胞中完全检测不到或者几乎检测不到，因此在肿瘤干细胞的判别、以及含有肿瘤干细胞的肿瘤组织的判别中也是有用的。
此外，本发明的分子标记与成瘤性的相关性高，在以它们为靶标的肿瘤干细胞的免疫疗法、分子靶标治疗法、基因导入治疗法以及能够用于癌症治疗的药剂、肽等的筛选中也是有用的。
附图说明
图1是表示肺癌细胞系中SP解析结果的图。用线包围的部分为各自的SP级分，％表示SP级分细胞相对于全部细胞的比例。
图2是表示在NOD/SCID小鼠中肿瘤形成能力实验的结果的图。a)为移植后第8周的小鼠的照片。b)为移植了LHK2(肺癌细胞)的全部小鼠的肿瘤直径平均值±标准偏差、肿瘤存活的小鼠数/移植的全部小鼠数的表。c)为将分别移植了1500个LHK2(肺癌细胞)、MCF7(乳腺癌细胞)、SW480(大肠癌细胞)的组每周肿瘤大小的平均值图表化的图。
图3：图3的a)为表示人成人正常细胞中Sox2的表达的图，b)为表示癌细胞细胞系的SP级分和MP级分中Sox2的表达的图。
图4：图4的a)为表示人成人正常细胞中Smcp和FLJ13464的表达的图，b)为表示癌细胞细胞系的SP级分和MP级分中Smcp和FLJ13464的表达的图。
图5为表示调查的基因在各细胞中的表达的一览表的图。图中，看不到表达者表示为阴性，能看到表达者表示为阳性、能看到极微量表达但尚不能称之为显著表达的微量表达表示为假阳性。另外，假阳性判定为“检测不到”。此外，图中LHK2为肺癌、MFH03为软组织肉瘤、MCF7为乳腺癌、LHK2－SOX2为过度表达SOX2基因的LHK2细胞系、SW480和KM12为大肠癌细胞系。
图6是表示其它癌细胞系中Sox2的表达的图。
图7是表示其它癌细胞系中Smcp的表达的图。表示的是将PCR循环分别设定为35个循环和40个循环进行调查的结果。图中Caki－1、ACHN、SMKTR－1～4为肾细胞癌的细胞系，Sq－1为肺癌扁平上皮癌的细胞系，1－87、A549、LHK2为肺癌腺癌的细胞系，LC817为肺癌小细胞癌症的细胞系，86－2、Lu99为肺癌大细胞癌症的细胞系，HPC3为胰脏癌症的细胞系，LCC(Mouse)为小鼠肺癌细胞。
图8：图8a)为表示正常细胞和癌细胞系SW480、KM12、LHK2、MCF7的SP级分和MP级分中Ints1的表达的图；b)为表示癌细胞系中Ints1的表达的图。图中癌细胞系与图6和图7中相同。
图9是表示肺癌组织中免疫组织染色的结果的图。情形1和情形2分别为来自不同癌症患者的肺扁平上皮癌组织的染色像。蓝色部分表示通过苏木精染色而被染色的核，茶色部分为通过抗SOX2抗体染色后的SOX2抗原蛋白。
图10是表示乳腺癌组织中免疫组织染色的结果的图。情形1为细胞质图案，情形2为核图案的染色像，CK5为用抗CK5抗体染色的染色像，SOX2为用抗SOX2抗体染色的染色像。蓝色部分表示通过苏木精染色而被染色的核，茶色部分为通过抗CK5抗体或抗SOX2抗体染色后的抗原蛋白。
图11中a)是表示脑、b)是表示肺、c)是表示胰脏、d)是表示胃中免疫组织染色的结果的图。蓝色部分表示通过苏木精染色而被染色的核，茶色部分为通过抗SOX2抗体染色后的SOX2抗原蛋白。黑箭头所示的部分表示被SOX2抗体稍微染色的细胞。
图12是观察SOX2的强制表达所致的成瘤能力变化的图表。左边的照片为肿瘤移植9周后小鼠的照片。右边的图表是将移植了10000个细胞的组的经过9周后的肿瘤大小的平均值图表化的结果。图表中，黑正方形表示强制表达SOX2的LHK2细胞，黑菱形表示作为转染试剂对照的LHK2细胞。
图13是表示SOX2阳性乳腺癌患者和SOX2阴性乳腺癌患者的患者生存率的图表。
图14：图14a)是通过RT－PCR法研究导入了sh－SOX2基因的细胞、导入了sh－EGFP的细胞中SOX2基因的表达水平的结果；b)是表示将各细胞在含顺铂培养基中培养24小时时的细胞生存率用相对于顺铂浓度作图来表示的图表。
图15是表示来源于SOX2多肽的肽的HLA－A24结合分析结果的图。将显示与用作阳性对照的肽同等程度或与其接近的MFI的肽鉴定为HLA－A24结合性肽。
图16是表示SOX2＿109肽的细胞毒性分析结果的图。检测到与作为阴性对照的来源于HIV的肽相比显著大的细胞毒性。
图17是表示SOX2＿109肽的酶联免疫斑点检测结果的图。在作为阴性对照的来源于HIV的肽中没有检测到IFNγ的放出，但在SOX2＿109肽中确认到IFNγ的放出。
图18：图18的a)是SMCP基因导入中使用的质粒的模式图、移植的小鼠的模式图，b)是移植导入有SMCP表达基因的LHK2细胞和转染试剂对照LHK2细胞5周后的小鼠照片。c)是向小鼠中移植1000个导入有SMCP基因的LHK2细胞和10000个转染试剂对照LHK2细胞后各周中测得的肿瘤大小的图表。图表中，黑菱形表示强制表达SMCP基因的LHK2细胞，黑正方形表示转染试剂对照LHK2细胞。
图19：图19的a)是通过RT－PCR法调查下述细胞中SMCP基因的表达水平的结果，所述细胞为：2种导入针对SMCP的siRNA的细胞，和作为阴性对照的导入了“invitrogen公司Stealth RNAi(注册商标)siRNA Negative Control Hi GC目录No.12935－400”的细胞。b)表示在相同条件下培养各细胞时细胞数变化的图表。图表中，黑正方形表示阴性对照的LHK2细胞，黑三角形表示导入了SMCP1的LHK2细胞，黑圆形表示导入了SMCP3的LHK2细胞。
图20是将200000个下述细胞移植至NOD/SCID小鼠后各周中测得的肿瘤大小的图表，所述细胞为：2种导入针对SMCP的siRNA的细胞，和作为阴性对照的导入了“invitrogen公司Stealth RNAi(注册商标)siRNA Negative Control Hi GC目录No.12935－400”的细胞。图表中，黑正方形表示阴性对照的LHK2细胞，黑三角形表示导入SMCP1的LHK2细胞，黑圆形表示导入SMCP3的LHK2细胞。
图21是在的各组织细胞和培养癌细胞中的DNAJB8的RT－PCR结果。使用G3PDH作为阳性对照。
图22是ACHN、MCF7和RenCa细胞的流式细胞仪解析结果、和对各癌细胞的SP和MP的DNAJB8进行RT－PCR的结果。
图23是表示将RenCa的SP级分、MP级分和未分级的RenCa移植到大鼠中时时间和肿瘤体积的关系的图表。
图24：图24的a)是质粒构建物的图谱。正方形部分插入了Mock、存活素和DNAJB8的序列。b)是导入a)质粒的细胞的培养上清的蛋白质印迹杂交结果。
图25是表示投与各质粒疫苗的小鼠中移植肿瘤的体积和时间的关系的图表。圆形表示投与PBS来代替疫苗的小鼠(阴性对照)的结果，正方形表示投与未插入任何基因的质粒的小鼠的结果，三角形表示投与插入了存活素的质粒的小鼠的结果，竖线表示投与插入了DNAJB8的质粒的小鼠的结果。
图26：图26的a)是表示曝露于各肽时HLA－A24抗体的荧光变化的图表，b)是表示平均荧光强度的图表。
图27是表示转染试剂对照ACHN细胞、和强制表达DNAJB8的ACHN细胞中SP级分变化的图。
图28是人的各成熟组织细胞、胎儿组织细胞和培养癌细胞中or7c1的RT－PCR结果。使用G3PDH作为阳性对照。
图29是用相位差显微镜观察染试剂对照Sw480细胞、稳定表达or7c1的Sw480细胞和用siRNA敲除or7c1的Sw480细胞形态的图像和表示前述各细胞的or7c1的RT－PCR结果的图。使用G3PDH作为RT－PCR的阳性对照。
图30是表示对野生型Sw480细胞和用siRNA敲除or7c1的Sw480细胞的SP级分进行流式细胞仪解析的结果图。
图31是表示将转染试剂对照Sw480细胞和稳定表达or7c1的Sw480细胞移植到小鼠中时肿瘤体积随时间变化的图表、以及表示将用siRNA敲除or7c1的细胞和使用阴性siRNA的细胞移植到小鼠中时肿瘤体积随时间变化的图表。
图32是表示曝露于各肽时HLA－A24抗体的荧光变化的图表。
图33是表示使用实验例32中已确认结合的肽进行的酶联免疫斑点检测的结果的图。
图34是表示51Cr释放实验中的E/T比和杀伤率的关系的图表。
具体实施方式
以下详细说明本发明。
本发明的分子标记为用于检测作为检测对象的细胞团中的肿瘤干细胞的分子标记，其在该检测对象所含的肿瘤干细胞中能检测到，但在非肿瘤干细胞的癌细胞和正常细胞中检测不到。因此典型的是，用于从癌细胞团检测肿瘤干细胞。进而，例如，有时采集任意的作为检测对象的细胞团时混入有正常细胞而变成肿瘤干细胞、非肿瘤干细胞的癌细胞和正常细胞混杂存在的细胞团，即使这种情况下也能准确地检测肿瘤干细胞。
本发明中，“肿瘤干细胞”是指癌细胞中具有干细胞性质的细胞。干细胞是指即使经过细胞分裂也维持着分化能力的细胞。就肿瘤干细胞而言，在用Hoechst荧光染料(Hoechst33342)染色用流式细胞仪以UV激光(波长约350nm)为激发光进行检测时，侧群(Side Population，SP)级分会被浓缩。SP级分是指：相对于被Hoechst荧光染料染色的主群(Main Population，MP)级分而言，介由ABC转运体等将染料排出细胞外从而不被染色的级分。
本发明中，“正常细胞”是指生物体或组织的活动中具有正常功能的细胞。正常细胞可以含有体干细胞，优选为成熟细胞。
本发明的分子标记优选为在多个癌种的肿瘤干细胞共通被检测的分子标记，在多个癌种中能够作为单一的标记使用。在例如来源于心脏、脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏、胰脏、脾脏、胸腺、前列腺、精巢、卵巢、小肠、白细胞、结肠、胃、骨髓、大肠和末梢血单核细胞等细胞或组织的多个癌种的肿瘤干细胞中共通表达，因此能进行检测。
进而，本发明的分子标记在非肿瘤干细胞的癌细胞和正常细胞中检测不到。优选在例如来源于心脏、脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏、胰脏、脾脏、胸腺、前列腺、精巢、卵巢、小肠、白细胞、结肠、胃、骨髓、大肠和末梢血单核细胞等中的至少1种以上非肿瘤干细胞的癌细胞和正常细胞中检测不到。
本发明的分子标记能够在肿瘤干细胞中表达或检测，但在正常细胞中不能表达或检测，从而能够在采集自含有肿瘤干细胞的细胞或组织中的任意细胞团中检测肿瘤干细胞。
为了用作具有通用性的分子标记，优选在多个癌种中能够用作单一的标记，典型的是，在心脏、脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏、胰脏、脾脏、胸腺、前列腺、精巢、卵巢、小肠、白细胞、结肠、胃、骨髓、大肠和末梢血单核细胞等细胞或组织中的至少2种以上的正常细胞中检测不到，优选在至少3种以上中检测不到。最优选在全部的细胞或组织中的正常细胞中检测不到。
本说明书中，“基因的表达”是指以该基因的转录为起点的一系列的生物体反应，“表达产物”是指例如mRNA、内源性多肽等该一系列生物体反应所生成的分子。
另外，本说明书中，“表达”是指能够用例如RT－PCR、原位杂交、免疫检验法、色谱法等本领域技术人员已知的方法确认到表达产物。另外，“检测不到”是指在前述表达产物的确认方法中无法确认到表达产物。另外，在例如RT－PCR等灵敏度极高的检测方法中出现信号似乎被检测到但信号强度有显著差异、在免疫检验法等本发明实施方式中从实用性观点来看具有足够灵敏度的检测方法的检测水平以下等情况，这些情况在本说明书中也包括在“检测不到”中。
本发明检测的基因的表达产物优选为具有公知序列的基因的表达产物，但也可以为其同源体。优选为具有以下mRNA或cDNA序列的基因的表达产物。
Sox2：Gene accession No.NM_003106
Smcp：Gene accession No.NM_030663
Ints1：Gene accession No.NM_001080453
Kox12：Gene accession No.NM_152907
Mdf1：Gene accession No.NM_005586
FLJ13464：Gene accession No.AK023526
667J232：Gene accession No.AL833225
Surf6：Gene accession No.NM_006753
Pcdh19：Gene accession No.NM_001105243
Dchs2：Gene accession No.NM_017639
Pcdh21：Gene accession No.NM_033100
Gal3st1：Gene accession No.NM_004861
Rasl11b：Gene accession No.NM_023940
Hes6：Gene accession No.NM_018645
Znf415：Gene accession No.NM_018355
Nkx2－5：Gene accession No.NM_004387
Pamci：Gene accession No.NM_005447
Pnmt：Gene accession No.NM_002686
Scgb3a1：Gene accession No.NM_052863
Or7c1：Gene accession No.NM_198944
Dnajb8：Gene accession No.NM_153330
本发明中，判定对象优选为人、来源于人的组织和/或来源于人的细胞，但也可以为人以外的动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠等啮齿类、黑猩猩等灵长类、牛、山羊、绵羊等偶蹄目、马等奇蹄目、兔子、狗、猫等)、来源于该动物的组织、和/或来源于该动物的细胞。
判定是指在检测到本发明的分子标记时判定为存在肿瘤干细胞，判定对象中也可以含有正常细胞和/或非肿瘤干细胞的癌细胞。从能够在多个癌种中用作单一的标记的观点出发，优选检测Sox2、Smcp、Ints1、Kox12、Mdf1、FLJ13464、667J232、Surf6、Pcdh19、Dchs2、Pcdh21、Gal3st1、Rasl11b、Hes6、Znf415、Nkx2－5、Pamci、Pnmt、Scgb3a1、Or7c1、和Dnajb8的表达产物来进行判定，最优选检测Sox2的表达产物来进行判定。
本发明的分子标记为mRNA时，其检测中使用探针、引物等与mRNA特异性结合的试剂。从检测灵敏度高、操作简便性等观点出发，优选用RT－PCR法检测。
本发明的分子标记为内源性多肽时，其检测中使用抗体、配体等与肽特异性结合的试剂。例如，抗体可以使用多克隆抗体和/或单克隆抗体。从非特异性反应更低的观点出发，优选使用单克隆抗体。
判定可以是体内或体外的判定。本说明书中，“体外的判定”是指使从生物体采集的组织或细胞在例如培养液等生物体外环境中生长繁殖后进行判定。与此相对，“体内的判定”是指在生物体内直接判定，或者从生物体采集组织或细胞后立即判定或固定后判定。组织或细胞采集可以通过例如切开、细胞抽吸、采血、采尿等来进行，但并不仅限于此。
在体内进行判定时，可以使用本领域技术人员公知的体内检测法来进行。体内的判定可以使用例如血液检查、原位杂交、原位PCR、免疫组织染色等公知的检测法来进行。
在体外进行判定时，可以使用例如免疫组织染色、RT－PCR等本领域技术人员公知的体外检测法来进行，但不仅限于此。进行RT－PCR时，循环数优选为30～35个循环。在组织培养后的肿瘤组织中进行判定等也包括在体外的判定中。
本发明的分子标记在肿瘤干细胞中特异性表达，因此推测其检测量与肿瘤干细胞的个数是相关的。因此，在投与针对对象的候补化合物的前后，如果本发明的分子标记的检测量减少，则这可以认为是肿瘤干细胞的个数已减少。即，通过比较投与前后的分子标记的检测量，能够筛选作为针对肿瘤干细胞的候补治疗药的化合物。因此，该筛选方法也包含在本发明中。
另外，本发明还包含含有用于检测上述分子标记的试剂的试剂盒。试剂盒中，例如为了用于检测mRNA，可含有探针、引物等特异性检测mRNA的试剂；为了用于检测多肽，可含有配体、抗体等特异性检测多肽的试剂。试剂盒中可含有至少1种以上前述试剂。试剂盒中可含有例如反应用缓冲液、反应促进剂等适合于其使用方式的附带试剂。
从在多个癌种中能够单独利用的观点出发，可含有用于检测基因序列优选为Sox2、Smcp、Ints1、Kox12、Mdf1、FLJ13464、667J232、Surf6、Pcdh19、Dchs2、Pcdh21、Gal3st1、Rasl11b、Hes6、Znf415、Nkx2－5、Pamci、Pnmt、Scgb3a1、Or7c1、或Dnajb8、最优选为Sox2的基因产物的试剂。
本发明中，“具有与基因互补的碱基序列的探针和/或引物”是具有与基因序列的一部分序列互补的序列从而能够与其特异性结合的DNA或RNA，其可以用例如荧光标记、放射线标记等随意标记。
使用上述试剂盒检测肿瘤干细胞从而判定判定对象是否为癌的方法也包含在本发明中。
本发明的具有作为分子标记功能的多肽能够用作抑制肿瘤干细胞功能、或杀灭肿瘤干细胞的抗原。这些多肽只要具有例如抗体识别部位、蛋白质结合部位等功能性部位即可，长度可以为例如9～11个氨基酸左右。另外，例如蛋白质的三级结构被抗体识别的情况、以多聚体形式进行抗体识别的情况、通过结合修饰基而成为抗体识别部位的情况等需要经过一些修饰、变形等方能显示功能性部位的情况下，也可以具有该功能性部位的结构。这些多肽优选来源于选自Sox2、Smcp、Ints1、Kox12、Mdf1、FLJ13464、667J232、Surf6、Pcdh19、Dchs2、Pcdh21、Gal3st1、Rasl11b、Hes6、Znf415、Nkx2－5、Pamci、Pnmt、Scgb3a1、Or7c1和Dnajb8所组成的组中的基因的表达产物。
以这些多肽为抗原杀灭肿瘤干细胞的方法包括例如基于诱导CTL的方法、利用多肽特异性抗体引起免疫反应的方法、通过与多肽结合从而抑制或拮抗其功能的方法等，但不仅限于此。
本发明基因表达产物来源的表位、和与其特异性反应的抗体结合时，其结合抗体作为信号而活化免疫反应。该表位自身为在肿瘤干细胞中特异性表达的分子标记或其结构的一部分，因此强烈暗示通过特异性抗体结合能够引起特异性识别肿瘤干细胞的免疫级联的活化。另外，抗体也能够与攻击癌细胞的药剂等结合使用。因此，能够应用于阻击肿瘤干细胞的所谓导弹疗法中。
因此，上述方法中使用的抗体以及含有多肽和/或抗体的药物组合物也包含在本发明中。
作为药物组合物，可列举出例如癌症疫苗、抗癌剂等，但不仅限于此。这些组合物中，除本发明的多肽和/或抗体外，根据需要可适当含有例如具有抗肿瘤作用的药剂、助剂、药学上允许的载体等。
进而编码上述多肽的核酸、和含有该核酸的药物组合物也包含在本发明中。含有前述核酸的药物组合物可列举出例如DNA疫苗等，但不仅限于此。这些组合物中，除本发明的核酸外，根据需要可适当含有例如具有抗肿瘤作用的药剂、助剂、药学上允许的载体等。
在本发明的分子标记的多肽片段中，存在通过被称为主要组织适合抗原(MHC分子)蛋白进行抗原呈递的片段。细胞毒性T细胞(CTL)通过识别与MHC I类分子结合的特定抗原，引发引导抗原呈递细胞进入细胞凋亡的免疫反应。
根据发明人等的研究获知，来源于本发明的分子标记的多肽中，一部分多肽与人MHC分子之一的HLA－A24显示较高亲和性，进而其一部分具有诱导CTL、引导细胞进入细胞凋亡的能力。该结果强烈暗示通过本发明的多肽能够赋予针对肿瘤干细胞的免疫记忆。这表示，本发明的多肽显示出能够实际应用于特异性治疗肿瘤干细胞的方法的性质。
由于本发明的分子标记在肿瘤干细胞中特异性表达，因此暗示其多肽的一部分中的一者能够通过MHC分子进行抗原呈递。通过该MHC分子进行抗原呈递的多肽(表位肽)的筛选对于癌的治疗是有用的。因此，该筛选方法也包含在本发明中。
筛选中可使用通常的表位作图法。例如，将目标多肽切成适当长度的肽片段，并制备多种该肽片段后，将目标多肽和/或肽片段、抗原呈递细胞和T细胞一起培养，从而致敏T细胞。然后，将致敏的T细胞、抗原呈递细胞和肽片段一起培养，对T细胞进行再刺激。然后，测定T细胞的活化程度，筛选出活化程度高的肽，测定表位序列。此时，活化程度、细胞毒性活性、细胞因子产生量的测定等可适当选择本领域技术人员公知的方法。另外，通过限定T细胞的HLA型，能够选择限定于特定的HLA型的抗原肽。
可以认为，本发明的具有作为分子标记功能的DNA为在肿瘤干细胞中特异性表达的DNA，通过抑制其表达，从而能够抑制肿瘤干细胞所具有的功能。由此用于抑制本发明的具有作为分子标记功能的DNA表达的核酸也包含在本发明中。
抑制表达的方法可列举出例如RNAi、阻遏物的表达等，但不仅限于此。因此，用于抑制DNA表达的核酸包含例如siRNA、shRNA、shDNA等，但不仅限于此。核酸只要具有足以抑制DNA表达的碱基数即可，可以为任意长度。
核酸除了为DNA、RNA外，也可以为核酸类似物，从通用性等观点出发，优选为DNA和/或RNA。
通过抑制本发明的具有作为分子标记功能的DNA的表达，暗示能够特异性和/或高效攻击肿瘤干细胞。即，暗示了上述核酸能够应用于基因导入治疗。因此含有本发明的核酸的药物组合物也包含在本发明中。
上述的药物组合物可以用作例如抗癌剂、转移抑制剂、包括DNA疫苗在内的癌症疫苗等癌症治疗药，但不仅限于此。这些药物组合物中，除本发明的核酸外，根据需要可适当含有例如具有抗肿瘤作用的药剂、助剂、药学上允许的载体等。
另外，使用本发明的核酸抑制肿瘤干细胞中的本发明的具有作为分子标记功能的DNA表达的方法也包含在本发明中。
以下的实验例是对本发明进行具体说明的例子，对本发明范围无任何限定。本领域技术人员可根据所具有的常规知识和技术在不脱离本发明的精神的范围内对下述实验例所述的实施方式进行多种改变，所述改变后的方式当然也包含在本发明内。
实施例1
实验例1：癌细胞的SP级分的分离
a)试剂的调制
培养基：调制加入5％的抗胎牛血清(FCS)的DMEM培养基，预先升温到37℃。戊脉安：调制成50mM，用5％FCS+DMEM稀释至5mM。Hoechst33342：用5％FCS+DMEM调制成250μg/ml。DNAseI：用DDW调制成1mg/ml并用0.2μm的过滤器过滤灭菌。
b)流式细胞仪(FACS)用细胞的调制
将细胞用4ml的5％FCS+DMEM悬浮，数出细胞数。再加入5％FCS+DMEM，将细胞浓度调整为1×106个/ml，对于戊脉安(+)用，在Falcon管中加入1ml上述细胞。将戊脉安(+)用和剩余的细胞(戊脉安(－)用)在水浴中于37℃孵育10分钟。孵育后，在戊脉安(+)用中加入戊脉安溶液，使戊脉安的最终浓度为50～75μM，然后，在戊脉安(+)用和戊脉安(－)用中加入Hoechst33342溶液，使Hoechst33342的最终浓度为2.5μM～5.0μM。
于37℃下震荡孵育90分钟，立即在冰上冷却。以1100～1500rpm、4℃离心分离3分钟，除去上清。用1×PBS+5％FCS液悬浮，转移至预先冰冷的FACS管。再次以1100～1500rpm、4℃离心分离3分钟，除去上清，用1×PBS+5％FCS液悬浮。再一次以1100～1500rpm、4℃离心分离3分钟，除去上清，在1×PBS+5％FCS中加入EDTA使EDTA最终浓度达到2mM，用500μl该液体悬浮。加入0.5μl DNAseI液，移液，使其通过FACS用过滤器。加入0.5μl1mg/ml的碘化丙啶(PI)，以流动速度1000～2000个/秒来进行FACS。
c)流式细胞仪(FACS)
流式细胞仪使用的是BD FACS Aria II special edition(注册商标)(ecton,Dickinson and Company公司制)。FACS的操作按照操作说明书来进行。最初流入戊脉安(－)的细胞，确认是否能检测到SP级分的细胞，若能够检测到，则对SP级分设门，流入戊脉安(+)的细胞，确认SP级分的细胞是否消失。若消失，则断定该级分的细胞是SP级分细胞，分离出该级分的细胞。将分离后的细胞于4℃、1500rpm离心分离15分钟，除去上清后，以100～200μl的1×PBS悬浮，数出细胞数。
其结果，在腺癌A549、LHK2、和小细胞癌Lc817中检测到了SP级分的细胞。其结果如图1所示。
考察
在肺癌中，也在被视为较易发生转移的系统的腺癌、小细胞癌中检测到了SP级分的细胞，这与肿瘤干细胞是转移的主要原因的见解是一致的。
实施例2
实验例2：肿瘤形成能力实验
通过与实验例1同样的方法分别使用LHK2、MCF7和SW480细胞系进行分级，将分级得到的SP细胞和MP细胞接种于小鼠中，以确认肿瘤形成能力。将数量相同的SP细胞和MP细胞分别在冰上悬浮于100μl的1×PBS中，混合到100μl的基底胶(Matrigel)中。将100μl的细胞基底胶混合液接种到NOD/SCID小鼠(由オリエンタル工房公司获得)的背部皮下，且SP和MP细胞分别在每1处接种1500个，从形成肿瘤时起测定长径和短径的长度，近似成旋转椭球体，计算体积并进行比较。结果如图2所示。
其结果，从LHK2分级得到的SP细胞，在仅移植15个细胞时，5匹中的2匹中形成了肿瘤，或者在移植150个时5匹全部形成了肿瘤，等；可知其与移植150个时1匹中都没有形成肿瘤的MP细胞相比，具有非常高的肿瘤形成能力。这与肿瘤干细胞是肿瘤形成的极其重要的原因、SP级分细胞中浓缩了肿瘤干细胞的见解是一致的。(参考文献Kondo T,Setoguchi T,Taga T.Persistence of a small subpopulation of cancer stem-like cells in theC6 glioma cell line.Proc NatlAcad Sci U SA.20：781-786,2004.)
实施例3
实验例3：利用DNA微阵列确认表达
a)mRNA的提取
将通过与实验例1同样的方法分离得到的SP细胞和MP细胞于室温、1500rpm下离心分离5分钟，除去上清。mRNA的提取使用RNeasy试剂盒(QIAGEN K.K.制)并按照试剂盒的规程来进行。
b)mRNA的扩增和标记
使用从Sigma Genosys公司获得的RNA扩增试剂盒，对提取得到的mRNA进行mRNA扩增，再用从Sigma Genosys公司获得的mRNA标记试剂盒，对扩增得到的mRNA进行标记，其中从SP级分提取得到的产物用Cy5标记，从MP级分提取得到的产物用Cy3标记，再交换染料，用Cy3标记从SP级分提取得到的产物，用Cy5标记从MP级分提取得到的产物。
c)微阵列
将用不同染料标记的来源于SP级分的mRNA和来源于MP级分的mRNA混合，使用由Sigma Genosis公司获得的DNA下芯片(Panorama(注册商标)微芯片,Human)，按照微阵列试剂盒的规程进行杂交，进行mRNA的表达解析。其结果，确认了：Sox2基因、Smcp基因、Ints1基因、Kox12基因、Mdf1基因、FLJ13464基因、667J232基因、Surf6基因、Pcdh19基因、Dchs2基因、Pcdh21基因、Gal3st1基因、Rasl11b基因、Hes6基因、Znf415基因、Nkx2－5基因、Pamci基因、Pnmt基因、Scgb3a1基因、Or7c1基因、和Dnajb8，在SP级分中表达但在MP级分中不表达或虽然表达但极微量。
实施例4
实验例4：Sox2的表达
a)RT－PCR中使用的引物
实验例中RT－PCR中使用的引物的列表如表1所示。
[表1]
正向引物 反向引物
Sox2 acttttgtcggagacggaga gttcatgtgcgcgtaactgt
Smcp tgtgtgaccagacaaaacacag gttgggctcagactccatgt
Ints1 tgtccagcatgagcaaactc aaaccgtagcagggtcacac
Kox12(Znf19) atgtggaaaagcaccaggac tcctctggtgccgaattaac
Mdf1 caggaagactgctgtgtcca atgcagatctccaggcagtc
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b)Sox2在正常细胞中的表达
对于实验例3c)中已确认的Sox2，为了进一步确认有用性，调查了其在人成人正常细胞中的表达。由Clontech公司获得来源于人成人正常组织的mRNA Panel，使用其进行RT-PCR。mRNA Panel中包括了来源于心脏、脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏、胰脏、脾脏、胸腺、前列腺、精巢、卵巢、小肠、大肠、末梢血单核细胞的各成人正常细胞和组织的mRNA。
首先，使用SuperScript(注册商标)III逆转录酶(invitrogen公司制)并按照试剂盒的规程从mRNA合成cDNA。
对合成的cDNA，使用正向引物和反向引物(参照表1)，利用RT－PCR扩增Sox2的cDNA。另外作为对照，通过同样方法扩增G3PDH的cDNA。PCR条件如表2所示。
[表2]
对扩增得到的扩增产物，使用1.5％琼脂糖凝胶，在100V下进行25分钟电泳。结果如图3a)所示。
c)Sox2在癌细胞系中的表达
对肺癌细胞系LHK2、大肠癌细胞系SW480和KM12LM以及乳腺癌细胞系MCF7，与实验例1同样分离成SP级分和MP级分。从各个SP级分和MP级分中，与实验例3a)同样提取mRNA，与实验例4b)同样合成cDNA。使用Sox2引物(参照表1)按照表2的条件扩增Sox2的cDNA，对扩增产物，使用1.5％琼脂糖凝胶，在100V下进行25分钟电泳。结果如图3b)所示。
考察
确认Sox2在人的成人正常组织中不表达。这表示Sox2为不识别组织中的正常细胞的标记，另外暗示存在利用Sox2进行肿瘤细胞的特异性治疗的可能性。另外对LHK2、SW480、KM12LM、MCF7这4个系统的SP和MP级分的细胞进行调查，结果在所有4个系统的SP级分的细胞中Sox2均强烈表达，而在MP级分的细胞中几乎看不到表达，这表示Sox2能够用作SP级分的细胞、即肿瘤干细胞特异性标记。
实施例5
实验例5：Smcp和FLJ13464的表达
对于实验例3c)中已确认的Smcp和FLJ13464，为了进一步确认有用性，调查了其在人成人正常组织和其它癌细胞中的表达。人成人正常组织使用了由Clontech公司获得的包括心脏、脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏、胰脏、脾脏、胸腺、前列腺、精巢、卵巢、小肠、白细胞、结肠、胃、骨髓在内的人成人正常组织mRNA Panel，癌细胞使用的是肺癌细胞系LHK2，大肠癌细胞系SW480、KM12LM、乳腺癌细胞系MCF7、恶性纤维组织细胞瘤细胞系MFH03。
从各细胞和组织的mRNA与实验例4b)同样合成cDNA。对于合成的cDNA，使用Smcp正向引物和反向引物(参照表1)、以及FLJ13464正向引物和反向引物(参照表1)，按照表2所示的PCR条件扩增Smcp和FLJ13464的cDNA。另外作为对照，通过与上述同样的方法扩增G3PDH的cDNA。对扩增获得的扩增产物，使用1.5％琼脂糖凝胶，在100V下进行25分钟电泳。结果如图4a)所示。
与实验例4同样，由SW480，KM12、LHK2、MCF7的SP和MP级分的细胞合成cDNA，使用Smcp和FLJ13464扩增引物对扩增各自的cDNA，对于扩增产物进行琼脂糖电泳。结果如图4b)所示。
考察
Smcp和FLJ13464在人的大部分成人正常组织中看不到表达，FLJ13464在胰脏和胃中能看到若干表达，Smcp在精巢中能看到若干表达。这表示在大部分组织中Smcp和FLJ13464是不识别组织中的正常细胞的标记，暗示对于在正常细胞中看不到表达的组织具有能够进行肿瘤细胞的特异性治疗的可能性。另外，与实验例4的结果同样，在SW480、KM12、LHK2、MCF7中，Smcp在SP级分细胞中特异性表达，FLJ13464也是在MCF7的SP级分细胞中特异性表达，因此结果也显示出Smcp和FLJ13464能用作癌细胞特异性标记的可能性。
实施例6
实验例6：在其它基因中的表达
对其它基因，也与实验例5同样确认了在各正常细胞中的表达。结果如图5的一览表所示。
实施例7
实验例7：Sox2在其它癌细胞细胞系中的表达
为了详细调查Sox2是否在实验例4所调查的癌细胞细胞系以外表达，在14种肺癌细胞细胞系、3种肾细胞癌细胞系、1种前列腺癌细胞细胞系、子宫癌细胞细胞系HeLa细胞中，与实验例4同样对Sox2的表达进行了确认。阳性对照使用了胎儿脑细胞，阴性对照使用了双蒸水。结果如图6所示。
考察
确认了Sox2在调查的全部癌细胞细胞系中均表达。这表示：与现在已知的其它肿瘤干细胞分子标记相比，Sox2在更多种癌细胞细胞系中具有作为肿瘤干细胞分子标记的功能。另外Sox2在多种多样的细胞系中共通表达，这暗示了Sox2不论在体内何种部位均能作为癌症治疗的靶标。
实施例8
实验例8：Smcp在其它癌细胞中的表达
与实验例5同样，详细调查了Smcp在其它癌细胞细胞系中是否表达。与实验例5同样确认了Smcp在6种肾细胞癌细胞系、7种肺癌细胞细胞系、1种前列腺癌细胞细胞系这些癌细胞细胞系中均表达。阳性对照使用了精巢细胞，阴性对照使用了小鼠的肺癌细胞。PCR的循环数为35个循环和40个循环时的结果如图7所示。
考察
在调查的全部癌细胞细胞系中均确认了Smcp的表达。这暗示：与Sox2同样地，与已有的肿瘤干细胞分子标记相比，Smcp在更多种癌细胞细胞系中具有作为分子标记的功能和用作治疗靶标的可能性。
实施例9
实验例9：Ints1在正常细胞、其它癌细胞和癌细胞系中的表达
a)在正常细胞和其它癌细胞中的表达
对于实验例3c)中已确认的Ints1，为了进一步确认有用性，与实验例5同样地，使用Ints1正向引物和反向引物(参照表1)调查其在人成人正常细胞和其它癌细胞中的表达。其结果如图8a)所示。
b)在其它癌细胞系中的表达
使用与实验例8相同的细胞系，确认Ints1在其它癌细胞系中的表达情况。结果如图8b)所示。
考察
在正常细胞中能看到Ints1在胰脏和脾脏中极微量地表达，在其它体系中没有确认到表达。该结果表示在几乎全部组织中Ints1为不识别组织中的正常细胞的标记，暗示对于在正常细胞中看不到表达的组织或能看到表达的胰脏和脾脏中基于检测灵敏度而能够进行肿瘤细胞的特异性治疗的可能性。另外与实验例4的结果同样，基本在SW480，KM12、LHK2、MCF7的SP细胞中特异性表达，因此暗示作为肿瘤干细胞的标记是有用的。
在其它癌细胞系中，确认到在除一部分细胞系外的大部分癌细胞系中表达。这暗示：Ints1与已有的肿瘤干细胞分子标记相比在更多种癌细胞细胞系中具有作为分子标记的功能和用作治疗靶标的可能性。
实施例10
实验例10：使用抗SOX2抗体进行的肺癌组织的免疫组织染色
使用抗SOX2多克隆抗体(ZYMED公司制)，对肺癌组织进行免疫组织染色。用乙醇对用20％福尔马林固定液固定的人肺癌石蜡包埋切片进行脱石蜡处理。将切片浸渍于0.01mol/L的柠檬酸缓冲液(pH6.0)中，于110℃下进行5分钟高压蒸汽处理，以进行抗原赋活处理。将0.5ml抗SOX2多克隆抗体滴加到切片上，于室温孵育1小时。然后用PBS－T(0.05％Tween20/PBS、pH7.4)洗涤3次。向切片上滴加作为二抗的用过氧化物酶标记的抗小鼠IgG抗体(Simple Stain MAX－PO、nichirei公司制)，于室温孵育30分钟。然后用PBS－T洗涤3次。将切片浸渍于双氧水和DAB底物的混合液(Simple Stain MAX－PO，nichirei公司制)中，进行1～2分钟的显色反应。然后用流水洗涤切片1分钟，用苏木精进行1～2分钟核染色。结果如图9所示。
考察
SOX2抗原蛋白被染色成茶色。除一部分细胞被染色成深茶色外，相当于肿瘤浸润部(Infiltrated Region)的部分被染色成浅色带状。该结果表示通过使用抗SOX2抗体进行免疫染色能够明确肺癌组织中的肿瘤干细胞的形态、细胞数、位置。
实施例11
实验例11：使用抗SOX2抗体进行的乳腺癌组织的免疫组织染色
与实验例10同样对基底细胞样乳腺癌组织进行免疫组织染色。作为比较例，还用基底细胞标记CK(细胞角蛋白)5进行了染色。结果如图10所示。在乳腺癌组织中，也观察到SOX2抗原蛋白被染色成茶色。这表示在乳腺癌中SOX2也能明确肿瘤干细胞的形态、细胞数、位置。通常认为，基底细胞样乳腺癌予后不良，转移率高，暗示这可能与SOX2有关。
实施例12
实验例12：使用抗SOX2抗体进行的正常组织的免疫组织染色
与实验例10同样，对脑、肺、胃、胰脏的正常组织进行免疫染色。结果如图11所示。在胃较小部分能看到核的浓染像，在其它组织中看不到表达。这表示在正常组织中SOX2几乎不表达。
实施例13
实验例13：强制表达SOX2所致的成瘤能力的变化
对NOD/SCID小鼠，在左右的背部皮下分别接种各10000个强制表达Sox2的细胞(LHK2－SOX2细胞)和转染试剂对照细胞(LHK2－mock细胞)的100μL的细胞基底胶混合液，从形成肿瘤时起测定长径和短径的长度，近似成旋转椭球体，计算体积并进行比较。结果如图12所示。
考察
在强制表达Sox2的肿瘤组织中，与未强制表达的肿瘤组织相比，可观察到显著的成瘤性。该结果表示Sox2表达时提高了细胞的成瘤能力。认为该机制与iPS细胞的癌化也有关。
实施例14
实验例14：SOX2阳性乳腺癌患者的生存率调查
进行乳腺癌原发巢组织的免疫染色，将201例子乳腺癌例分类为SOX2阳性乳腺癌40例和SOX2阴性乳腺癌161例。图13是表示各分类中生存率随时间变化的图表。可知，SOX2阳性乳腺癌患者与SOX2阴性乳腺癌患者相比，生存率显著低。
实施例15
实验例15：SOX2的表达抑制
作为Sox2用，使用与序列号43、44的寡核苷酸退火的shDNA寡核苷酸；作为阴性对照用，使用与序列号45、46的寡核苷酸退火的shDNA寡核苷酸，按照载体的规程导入到RNAi-Ready pSIREN-RetroQ载体中，分别制备sh－SOX2质粒和sh－EGFP质粒。对LHK2细胞系转染sh－SOX2质粒和作为阴性对照的sh－EGFP质粒，用分别含有0、10、30、100μM浓度的顺铂的DMEM培养基于37℃培养24小时。然后通过MTT法测定细胞生存率。结果如图14所示。
考察
在导入sh－SOX2的细胞中，Sox2基因的表达受到显著抑制。进而，Sox2基因的表达受抑制的细胞与未受到抑制的细胞相比，在含顺铂培养基的培养中生存率明显降低。这表示通过抑制Sox2基因的表达显著提高了细胞对顺铂的感受性。
实施例16
实验例16：来源于Sox2的肽的HLA－A24肽结合分析
Sox2的氨基酸序列如序列号62所示。已知结合于HLA－A24的肽的第2位氨基酸为酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸或甲硫氨酸，C末端的氨基酸为亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸或甲硫氨酸。从Sox2的氨基酸序列所含的序列中选择具有该HLA－A24结合基序的9～11个氨基酸的序列，合成了以下共13种肽。
SOX2＿1：MYNMMETEL(序列号47)
SOX2＿50：VWSRG Q RRKM(序列号48)
SOX2＿58：KMA Q ENPKM(序列号49)
SOX2＿89：PFIDEAKRL(序列号50)
SOX2＿109：KYRPRRKTKTL(序列号51)
SOX2＿119：LMKKDKYTL(序列号52)
SOX2＿124：KYTLPGGLL(序列号53)
SOX2＿165：GWSNGSYSM(序列号54)
SOX2＿170：SYSMM Q D QL(序列号55)
SOX2＿196：PMHRYDVSAL(序列号56)
SOX2＿209：SMTSS Q TYM(序列号57)
SOX2＿216：YMNGSPTYSM(序列号58)
SOX2＿226：SYS Q Q GTPGM(序列号59)
T2－A24细胞是在人淋巴母细胞样细胞T2细胞中导入HLA－A2402基因并使其表达的细胞株。该细胞的细胞表面表达低水平的HLA－A24分子，能够使用HLA－A24特异性单克隆抗体和流式细胞仪进行检测。表达水平可以以平均荧光强度(MFI)进行定量。在试管内对该细胞添加合成肽时，添加的肽与HLA－A24分子结合的情况下，由于结合亲和性细胞表面HLA－A24表达水平增加。使用该实验体系，解析本发明的来源于SOX2癌症抗原肽的HLA－A24结合亲和性。
将T2－A24细胞于26℃培养一晚。然后用PBS洗涤细胞，加入来源于SOX2的合成肽，作为阳性对照的来源于人免疫缺陷病毒的肽(HIV肽，序列号60)、来源于爱泼斯坦-巴尔病毒的肽(EBV肽，序列号61)，和作为阴性对照的来源于卵清白蛋白的肽(SL8肽，序列号63)，于26℃下共培养3小时。将温度调整为37℃，再共培养2.5小时后，离心分离，除去上清，分离得到细胞。在分离得到的细胞中加入HLA－A24抗体(C7709A2.6)，于4℃静置1小时，然后用PBS洗涤。加入作为二抗的荧光标记抗小鼠IgG+IgM抗体，于4℃静置30分钟后，加入1％福尔马林固定细胞。用流式细胞仪(BD FACS Calibur)测定固定细胞的FITC荧光强度。
结果如图15所示。将显示与阳性对照同等以及更强、或与其接近的荧光强度的8个SOX2肽判定为HLA－A24结合性肽。
实施例17
实验例17：CTL诱导
从已经得到知情同意(informed consent)的HLA－A24阳性肺癌患者或HLA－A24阳性健康人的末梢血50ml中，通过在Ficoll-conray密度梯度中进行离心，从而分离并回收末梢血单核细胞(PBMC)。接着，使用CD8MACS珠通过PBMC分离成CD8阳性淋巴细胞和CD8阴性淋巴细胞。
在96孔板中将200000个/孔的CD8阴性淋巴细胞和上述HLA－A24结合性SOX2肽分别混合，于室温静置2小时后以100Gy量进行放射线处理。将处理后的细胞与20U/ml的IL－2(武田药品工业)、100000个/孔的CD8阳性淋巴细胞共培养，对CD8阳性淋巴细胞每周进行1次刺激，共计进行3次刺激，以诱导CTL。通过细胞毒性分析或酶联免疫斑点检测对诱导得到的CTL的肽特异性反应性进行评价。
实施例18
实验例18：细胞毒性分析
在T2A24中加入Cr51，在RPMI培养基中于37℃培养1小时以进行放射线标记后，用RPMI培养基洗涤4次。在Cr标记的T2A24中混入SOX2肽或对照肽(HIV肽)，于室温静置1小时。将用SOX2肽或对照肽施加脉冲的2000个/孔的T2A24、和实施例2中诱导的14000个/孔的CD8阳性淋巴细胞在RPMI培养基中于37℃下共培养4小时。然后回收上清，通过伽玛计数仪测定伽玛剂量。
另外将仅RPMI培养基和肽脉冲T2A24进行培养时的剂量作为自然放出(SPR)、将细胞溶解液(2％的NP40)和肽脉冲T2A24进行培养时的剂量作为最大放出(MXR)，以(测定值－SPR)/(MXR－SPR)×100来计算细胞毒性活性。
其结果，在用SOX2＿109肽施加脉冲的T2A24中检测到特异性毒性的CTL。结果如图16所示。作为对照肽的来源于HIV的肽中几乎检测不到来源于损伤细胞的放射线，与此相对在SOX2＿109肽中检测到大量放射线。
实施例19
实验例19：酶联免疫斑点检测
实验使用Human IFNγELISPOT set(BD)来进行。将抗IFNγ抗体在ELISPOT板中于4℃下静置一晚，以进行包被。在T2A24中分别加入SOX2肽或对照肽(HIV肽)，于室温静置1小时。将施加50000个肽脉冲的T2A24、和实施例2中诱导的10000个CTL，在包被了抗IFNγ抗体的板中于37℃下共培养一晚。用1×PBS和0.05％的Tween20洗涤后，加入生物素标记抗IFNγ抗体，于室温静置2小时。用1×PBS和0.05％的Tween20洗涤后，加入HRP标记的链霉亲和素，于室温静置1小时。用1×PBS和0.05％的Tween20洗涤后，加入显色试剂，测定斑点数。
结果如图17所示。在用SOX2＿109肽施加脉冲的T2A24中检测到特异性反应的CTL。作为对照肽的来源于HIV的肽中几乎检测不到T细胞放出的IFNγ，在SOX2＿109肽中能确认放出了大量IFNγ。
实施例20
实验例20：SMCP的过度表达所致的、成瘤性的变化
对NOD/SCID小鼠，在左右的背部皮下分别接种10000个强制表达Smcp的细胞(LHK2－SMCP细胞)和1000个LHK2－mock细胞的100μL的细胞基底胶混合液，从形成肿瘤时起测定长径和短径的长度，近似成旋转椭球体，计算体积并进行比较。结果如图18所示。
考察
过度表达SMCP的细胞与转染试剂对照细胞相比，快速形成了大型的肿瘤。即使是特别少的细胞也具有显著高的成瘤性，这暗示，SMCP为与肿瘤干细胞的肿瘤形成能力相关的基因。
实施例21
实验例21：SMCP的表达抑制
si－RNA使用Stealth Select RNAi(注册商标)siRNA(Catalog#1299003)(invitrogen)。SMCP1是指OligoID HSS142897，SMCP3是指OligoID HSS142899。作为阴性对照使用了StealthRNA(注册商标)siRNA Negative Control Hi GC(12935-400)。将100pmolsi－RNA和4μl Lipofectamine RNAi MAX混合，在DMEM培养液中于37℃培养2天，通过RT－PCR测定mRNA表达水平。结果如图19a)所示。另外，测定从基因导入1天后至4天后各细胞数的增加情况。结果如图19b)所示。在基因导入2天后，在NOD/SCID小鼠左右的背部皮下，分别接种200000个导入了SMCP1的细胞(LHK2－si－SMCP1细胞)或导入了SMCP3的细胞(LHK2－si－SMCP3细胞)、和导入了阴性对照的细胞(LHK2－si－对照细胞)的100μL的细胞基底胶混合液，从形成肿瘤时起测定长径和短径的长度，近似成旋转椭球体，计算体积并进行比较。结果如图20所示。
考察
SMCP基因表达受到抑制的细胞，其细胞增殖能力和肿瘤形成能力显著降低。部分序列不同的si－SMCP1和si－SMCP3之间，增殖能力和肿瘤形成能力的降低方面也存在显著差异。这些结果暗示：通过抑制SMCP基因的表达，能够治疗癌。
实施例22
实验例22：DNAJB8的RT－PCR
DNAJB8是DNAJ/HSP40家族的一员，为编码26KD的蛋白的基因，除认识到在精巢中高度表达以外，其定位、功能均没有详细报道。DNAJ/HSP40家族N末端大多具有J结构域，通常认为，该J结构域通过与HSP70结合而促进ATP水解，引起HSP70的底物结合区域的结构性变化，从而控制HSP70的活性。HSP40自身也具有肽结合区域，还存在具有将肽递送给HSP70功能的成员。
将Human Multiple Tissue cDNA Panels I,II(Clontech)作为正常组织的cDNA使用，培养癌细胞株的RNA使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)来提取。作为培养癌细胞株，分别使用肾癌细胞株ACHN、Caki－1、SMKTR2、SMKTR3，小鼠肾癌细胞株RenCa，膀胱癌细胞株SW780、LB905－BLC、UM－UC3、T24，前列腺癌细胞株DU145、LN－CaP，乳腺癌细胞株MCF7。使用Superscript III逆转录酶和寡(dT)引物(Invitrogen)从2μg提取得到的RNA中纯化cDNA。PCR以含有0.25μg cDNA、0.1μgTaq DNA聚合酶(Qiagen)和12pmol引物的共计20μl来进行。PCR条件按照实验例4b)的表2记载的条件，进行了35个循环。用于检测小鼠DNAJB8的引物序列用TGACAGATGGAGAGCAGGTG(序列号64)、反向引物CCCTCATGAGCTTCTCCTTG(序列号65)来进行。PCR产物的大小为：人DNAJB8为408bp，小鼠DNAJB8为463bp。作为对照的G3PDH用引物序列ACCACAGTCCATGCCATCAC(序列号66)、反向引物TCCACCACCCTGTTGCTGTA(序列号67)来进行，PCR产物的大小为452bp。
结果如图21所示。除在精巢中强烈表达以外，在人的正常细胞中几乎看不到DNAJB8的表达。另一方面，上述培养癌细胞株中表达水平存在若干差异，但在全部细胞株中均看到了表达。
实施例23
实验例23：流式细胞仪解析
将ACHN、MCF7、RenCa细胞培养至80％的密度，与实验例1同样用流式细胞仪进行解析。结果如图22所示。
3种细胞株中均分离出SP级分，确认了比MP级分更强的DNAJB8表达。
实施例24
实验例24：成瘤能力的检验
用与实验例2同样的方法，将RenCa细胞以104、103、102、101分别接种到balb/c小鼠(雌性、6周)的背部皮下的左右，每周测定肿瘤直径。通过以下的近似式计算肿瘤的体积。
肿瘤体积(mm3)＝长径(mm)×短径(mm)2×1/2。
结果如图23所示。可确认RenCa的SP细胞比MP细胞、细胞分离前的细胞成瘤能力更强。
实施例25
实验例25：DNA疫苗免疫、预防实验
a)DNA质粒的制备
为了制备表达DNAJB8、存活素的质粒，从RenCacDNA克隆DNAJB8、存活素，并插入到pcDNA3.1(+)表达载体(Invitrogen)的BamHI、XhoI的限制酶位点。在抗原的5’侧，将免疫球蛋白κ链的信号序列5’-ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGAC-3’插入到NheI、HindIII的限制酶位点，在抗原的3’侧，将FLAG序列5’-GATTACAAGGATGACGACGATAAG-3’插入到XbaI、PmeI的限制酶位点。DNA质粒通过EndoFreePlasmid Giga kit(Qiagen)进行扩增、纯化，DNA的浓度通过260nm的吸光度进行测定。
b)蛋白质印迹杂交
将HEK293T细胞培养至70％的密度。将含有抗原的质粒用FuGENE HD(Roche)导入到HEK293T细胞。于37℃培养48小时后，回收培养上清，以1500rpm离心5分钟，收集其上清。在上清中加入总量的10％的0.1M的DTT，在100℃下加热5分钟。
样品在12％凝胶上通过SDS－PAGE分离，转移到硝基纤维素膜。封闭膜，并加入稀释5000倍的一抗，于室温反应30钟后，用稀释5000倍的过氧化物酶标记二抗于室温反应30分钟。使用ECL Western blotting detection reagents(Amersham)通过化学发光法鉴定抗原。
结果如图24所示。图24a)表示质粒构建物的图谱，该质粒构建物编码分泌型DNAJB8。并且3’末端侧具有FLAG标签序列。图24b)表示蛋白质印迹杂交的结果。由此可知，该质粒构建物表达分泌型DNAJB8和存活素。
c)疫苗免疫、预防实验
将DNA质粒疫苗以200μg/匹接种到各组5匹的balb/c小鼠(6周、雌性)的足上，每周1次共接种4次，最终接种日的1周后，将RenCa以105/匹接种到背部皮下。每周测定肿瘤直径，以研究DNA疫苗的免疫原性。
结果如图25所示。可确认，经DNAJB8免疫的小鼠比经存活素免疫的小鼠抑制肿瘤增大的效果更显著。
实施例26
实验例26：利用来源于DNAJB8的肽片段进行的肽结合分析
用BIMAS(http：//www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/)预测HLA－A24限制性的DNAJB8所编码的抗原肽序列，并制备了4个抗原肽。
DNAJB8(22－30)：AYRKLALRW(序列号68)
DNAJB8(90－99)：GYTFRNPEDI(序列号69)
DNAJB8(99－107)：IFREFFGGL(序列号70)
DNAJB8(143－151)：AFMEAFSSF(序列号71)
分析中使用在肽转运体(peptide transporter)缺损的T2细胞中导入了HLA－A2402的细胞株T2A24，与实验例16同样进行实验。本实验例中，作为阴性对照使用SL－8，作为阳性对照使用存活素-2B(序列号72)。
结果如图26所示。图26a)表示荧光的迁移，图26b)表示平均荧光强度。可确认，设计出的4个肽中的3个与HLA－A24结合。
实施例27
实验例27：DNAJB8稳定表达株的制备
将肾癌细胞株ACHN培养至70％，通过逆转录病毒载体导入抗原基因。于37℃培养48小时后，加入1μg/ml嘌呤霉素，进行细胞选择。
结果如图27所示。在恒定表达DNAJB8的细胞株中，SP级分的细胞数显著增加。
实施例28
实验例28：OR7C1的RT－PCR
嗅觉受体,家族7,亚家族C,成员1(olfactory receptor family 7 subfamily Cmember 1，OR7C1)基于其结构而归类于嗅觉受体家族，为G蛋白共轭型蛋白质、7次跨膜型蛋白质。除了报告在舌部表达外，至今对其配体等尚无详细报告。
将Human Multiple Tissue cDNA Panels I,II(Clontech)作为正常组织的cDNA使用。培养癌细胞株的RNA使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)来提取。作为培养癌细胞株，使用了人大肠癌细胞株Sw480、HT29、HCT15、KM12LM、人肺癌细胞株LHK2。使用SuperscriptIII逆转录酶和oligo(dT)primer(Invitrogen)由2μg提取得到的RNA纯化cDNA。PCR以含有0.25μg cDNA、0.1μg Taq DNA聚合酶(Qiagen)和12pmol引物的共计20μl来进行。PCR条件按照实验例4b)的表2记载的条件，进行了35个循环。PCR产物的大小为201bp。
结果如图28所示。在人成熟正常细胞和人胎儿正常细胞中，能检测到OR7C1的仅有人成熟正常细胞中的精巢。另一方面，在SW480培养癌细胞株中，在SP级分中确认到非常强的表达。在HT29、HCT15、KM12LM、LHK2细胞中，也确认到在SP级分中强烈表达。
实施例29
实验例29：or7c1稳定表达株和or7c1敲除株的制备
用10cm皿在加入了添加有1μg/ml的嘌呤霉素、10μg/ml的Brasticidin的10％FBS的DMEM培养基中，将PLAT－A细胞培养至50％左右的密度。将插入有or7c1的逆转录病毒载体pMXs－Ib10μg+Opti-MEM(Invitrogen)1000μl和于室温孵育5分钟的脂质转染胺2000(Invitrogen)40μl+Opti-MEM 1000μl混和，再于室温孵育20分钟。然后、混合到前述PLAT－A细胞的培养基中，于37℃培养，24小时后用加入了10％FBS的DMEM进行培养基交换，再过24小时后回收上清，将其作为病毒液。将1.5ml该病毒液和8μg/ml的凝聚胺与2×105个Sw480细胞一起在6孔板中于37℃培养，8小时后添加1ml新鲜的加入了10％FBS的DMEM，于37℃培养。48小时后加入2μg/ml嘌呤霉素，进行细胞选择，获得稳定表达株。
siRNA委托Invitrogen公司来制备(OR7C1 Stealth Select 3 RNAi(HSS120191；HSS178215；HSS178216)、StealthRNAi Negative control kit)。将siRNA100pmol+Opti-MEM(Invitrogen)250μl、和于室温孵育5分钟的脂质转染胺RNAiMAX(Invitrogen)5μl+Opti-MEM 250μl混和，再于室温孵育20分钟。然后，添加到在6孔板中培养至20％的密度的Sw480中，在加入了10％FBS的DMEM中于37℃培养，将培养48小时后的细胞作为or7c1敲除株使用。
or7c1稳定表达株、or7c1敲除株和作为比较对象的转染试剂对照Sw480细胞株的相位差显微镜图像和RT－PCR结果如图29所示。细胞形态方面，转染试剂对照Sw480和稳定表达株之间看不到特征差异，但敲除细胞株中各细胞丧失了黏着性。另外，由RT－PCR的结果可确认，or7c1在稳定表达株中强烈表达，在敲除株中几乎不表达。
与实验例1同样研究or7c1敲除株的SP级分的变化。结果如图30所示。在敲除细胞株中，SP细胞已消失。
实施例30
实验例30：成瘤能力的检验
用与实验例2同样的方法，将肿瘤细胞(SW480细胞株的or7c1稳定表达株)和作为阴性对照的转染试剂对照SW480细胞分别以104、103、102、101接种到NOD/SCID小鼠(雌性、5周)的背部皮下的左右，每周测定肿瘤直径。同样，分别接种104的or7c1敲除细胞和作为阴性对照的阴性siRNA株，每周测定肿瘤直径。
结果如图31所示。比较转染试剂对照Sw480和or7c1稳定表达株，在104和103中看不到显著差异，在102和101中，稳定表达株的肿瘤形成能力更高。在阴性siRNA和or7c1敲除株中，104时，or7c1敲除株肿瘤形成能力显著低。
实施例31
实验例31：利用来源于or7c1的肽片段进行的肽结合分析
与实验例26同样制备以下的肽，进行结合分析。
or7c1＿34(10)：MYLVTFTGNL(序列号73)
or7c1＿59(10)：MYFFlSNLSF(序列号74)
or7c1＿93(10)：TYAGCLS Q IF(序列号75)
or7c1＿131(10)：HYTViMNP Q L(序列号76)
or7c1＿217(10)：SYYKiVFSIL(序列号77)
or7c1＿251(10)：FYGTGFGVYL(序列号78)
or7c1＿277(9)：MYTMVTPML(序列号79)
结果如图32所示。由该结果可确认：277(9)、34(10)、251(10)、131(10)和93(10)与HLA－A2402结合。
实施例32
实验例32：CTL的诱导
使用Lymphoprep(Nycomed)从由受试者采集的全血(加肝素)分离PBMC。将PBMC于37℃培养24小时后，使用非黏附细胞进行实验。为了从该非黏附细胞获得CD8阳性细胞，使用磁性细胞分离系统(Miltenyi Biotech)分离CD8阳性细胞和阴性细胞。对于CD8阴性细胞，在AIM－V培养基(Life Technologies)中加入100U/ml的IL－2和1μg/ml的PHA－P，制成PHA－blast。对于CD8阳性细胞，在AIM－V培养基中于37℃培养，每周3次(第0天、第7天、第14天)用1/5量的PHA－blast进行刺激。第8天起在培养基中添加50U/ml的IL－2，以后每3～4天更换培养基，并添加50U/ml的IL－2。将该细胞作为CTL，在第21天实施ELISPOT，在第28天实施51Cr释放实验。
实施例33
实验例33：酶联免疫斑点检测
为了实施ELISPOT，使用5×105/ml前述诱导的CTL作为效应细胞。另外使用T2A24和K562细胞(K562为阴性对照)作为靶标。对于T2A24细胞，使用前述肽结合分析中已判明被HLA－A24呈递的肽各5μg/ml，于室温孵育2小时。靶标细胞调整为5×105/ml。在96孔multiscreen plate(Millipore)中以100μl/孔加入5μg/ml的IFN－γ捕获抗体(PharMingen)，浸渍于PBS中于4℃静置一晚。然后、用200μl/孔的RPMI1640(SigmaChemical Co)洗涤1次，在RPMI1640中固定2小时。在孔中分别加入100μl前述效应细胞/靶标细胞，孵育40小时，通过洗涤除去细胞后，添加检测用细胞因子抗体。再添加酶标记链霉亲和素，用ELISPOT分析仪计数。
结果如图33所示。可确认在93(10)的肽中放出了IFN－γ。
实施例34
实验例34：51Cr释放分析
在用于测定细胞毒性活性的分析中，用具有放射活性的51Cr标记细胞，测定CTL带来的细胞毒性活性。效应细胞使用了CTL，靶标细胞使用了T2A24、K562、Sw480、稳定表达or7c1的Sw480。首先，回收1×106的靶标细胞，加入10～100μl的51Cr，于37℃孵育1小时，用51Cr标记细胞。用RPMI1640洗涤4次标记结束的细胞，用RPMI1640溶解且使细胞为1×105/ml(最终以2000/孔使用靶标细胞)。T2A24用5μg/ml的肽施加脉冲，于室温孵育1小时。另一方面，对于CTL，在96孔板中分别根据E/T比用100μl的AMI－V溶解后进行接种。另外为进行数据解析，在用于测定自然放出的孔中预先加入100μl的AIM－V，在用于测定最大放出的孔中预先加入100μl的2％NP－40。在加入了效应细胞的96孔板的各个孔中各加入100μL靶标细胞，于37℃培养4小时。然后，分别回收培养上清，用伽玛计数仪测定。解析中使用以下式子。
杀伤％＝(测定放出－自然放出)×100/(最大放出－自然放出)
结果如图34所示。与Sw480相比，稳定表达or7c1的Sw480的细胞毒性活性更高。关于T2A24，在E/T比为20和6时，用肽93(10)施加脉冲的细胞毒性活性最高。
工业上的应用性
本发明提供的用于判别法的分子标记在通常成人正常细胞中几乎不表达，且在多种肿瘤干细胞中表达，因此仅特异性识别体内或组织中的肿瘤干细胞，从而能够以比目前的癌诊断技术更高的精度进行诊断。另外特别是由于特异性识别肿瘤干细胞，因此能够期待有助于癌免疫治疗、分子靶标治疗、基因导入治疗的发展等广泛的医疗产业中。

Claims (6)

1.肽，所述肽选自
DNAJB8(22－30)：AYRKLALRW
DNAJB8(99－107)：IFREFFGGL以及DNAJB8(143－151)：AFMEAFSSF。
2.权利要求1所述的肽在细胞毒性T细胞诱导的药物制造中的应用。
3.编码权利要求1所述的肽的核酸在细胞毒性T细胞诱导的药物制造中的应用。
4.对DNAJB8进行编码的核酸在用于抑制表达DNAJB8的肿瘤干细胞增殖的药物制造中的应用。
5.对DNAJB8基因的表达进行抑制的核酸在用于抑制表达DNAJB8的肿瘤干细胞增殖的药物制造中的应用。
6.药物组合物，包含权利要求1所述的肽作为活性成分。
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