TWI764917B - 抗體、結合片段及使用方法 - Google Patents

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黃久珍
陳建有
朱國慶
啟惠 翁
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Abstract

本發明係關於抗SSEA4抗體及其結合片段，其等包含能夠高親和力結合至SSEA4分子及SSEA4相關表現腫瘤細胞(例如乳癌、胰臟癌及腎癌細胞)之特異性互補決定區。該等抗SSEA4抗體及結合片段會誘導靶向腫瘤細胞中之ADCC或CDC效應並抑制及/或減輕癌症/腫瘤增殖。本發明亦提供用於治療癌症之呈醫藥組合物形式之抗SSEA4抗體及其結合片段。另外，該等抗SSEA4抗體及結合片段可用於診斷癌症。

Description

抗體、結合片段及使用方法
本發明係關於用於治療增生性病症(包括癌症)之免疫療法及診斷該等病症之方法之抗體及結合片段。具體而言，本發明係關於包含針對免疫原性寡醣SSEA4之抗體及/或結合片段之碳水化合物相關之免疫療法及醫藥組合物。此外，本發明係關於過度增生性病況及在異常細胞上表現之腫瘤相關或特異性碳水化合物之檢測及/或診斷。
階段特異性胚胎抗原4 (Stage-specific embryonic antigen 4；SSEA4)係屬球系列鞘醣脂(GSL)之六醣且包含Neu5Acα 2→3Galβ 1→3GalNAcβ 1→3Galα 1→4Galβ 1→4Glcβ 1之結構。自從1983年SSEA4首次自人類畸形癌細胞分離(KannagiR 等人，1983)，迄今為止其一直廣泛用作表面標記物來定義人類胚胎幹細胞(hESC)。在過去幾十年中，越來越多的研究指示，GloboH係與SSEA4共用核心結構Galβ 1→3GalNAcβ 1→3Galα 1→4Galβ 1→4Glcβ 1 (SSEA3)之GSL，其在許多上皮癌(包括卵巢癌、胃癌、前列腺癌、肺癌、乳癌及胰臟癌)中過表現(Zhang S等人，1997)。且在腎細胞癌(Saito S等人，1997)及多形性神經膠母細胞瘤(Lou YW等人，2014)中觀察到SSEA4之大量表現。更有趣的是，不僅在乳房腫瘤細胞中且亦在乳癌幹細胞中發現SSEA4以及SSEA3及GloboH之表現(Chang WW等人，2008；Huang YL等人，2013)。 然而，碳水化合物抗原通常為免疫系統可耐受，且因此誘導弱或非特異性免疫反應(Stein KE等人，1992；Snapper CM等人，1996。)。業內提出，碳水化合物抗原無法被抗原呈遞細胞(APC) (例如巨噬細胞、B細胞或樹突細胞)內化及消化，且因此無法呈遞至輔助T (Th)細胞。自APC至T細胞缺少模擬導致不存在抗體成熟及同型切換。因此，主要產生針對碳水化合物抗原之低親和力及非類別切換IgM抗體(Musher DM等人，1990；Lortan JE等人，1993)。業內已研發出多種方法來解決缺陷。自從1950年代即研發出偶聯碳水化合物抗原與載體蛋白以改良免疫原性(Lindberg AA等人，1999)。該類高免疫原性蛋白包括白喉類毒素(DT)、破傷風類毒素(TT)、CRM197 (白喉毒素之無毒變體)及來自腦膜炎雙球菌(N. meningitides )之複合外膜蛋白(OMP)混合物(Ada G.等人，1999)。除該等蛋白質之固有免疫原性外，若接受者之前已經該等類毒素免疫，則預期加強效應。載體蛋白-碳水化合物抗原偶聯物提供與欲處理且由APC經由MHC II分子呈遞之某些碳水化合物抗原偶聯之肽。藉由自Th細胞共模擬，針對某些碳水化合物抗原之T及B細胞則被活化。隨後進行抗體同型切換及成熟，可進一步生成具有高親和力及特異性之針對某些碳水化合物抗原之IgG抗體(Bazendale HE等人，2000)。WO 2016029071提供基於碳水化合物之疫苗，其包含經由連接體化學偶聯至免疫原性載體白喉毒素交叉反應材料197 (CRM 197)之合成SSEA4類似物。 儘管載體蛋白在碳水化合物疫苗接種中提供改良免疫原性之解決方案，但該策略引起一些新的及現有問題(Ingale S等人，2007)。第一，外源載體蛋白及附接連接體可引發強免疫反應，由此導致抑制針對碳水化合物抗原之抗體反應。第二，化學偶聯基本上處於蛋白質表面之離胺酸上。該實驗過程難以控制，從而產生異質組成及最終結構。不明確的組成可能引起不同的免疫反應。第三，模擬細胞表面上之碳水化合物表現之偶聯並不理想，由此經誘導抗體可能無法識別碳水化合物簇。研究替代性方法(例如碳水化合物聚乙二醇化) (Giorgi ME.等人，2014)來克服所存在問題。 然而，上文所提及之活性免疫療法在處於免疫低下狀態之癌症患者中並不充分實用。尤其接受化學療法或放射療法之彼等以及晚期癌症患者，活性免疫介入之效能通常有限。 根據上文，業內需要研發出針對癌症碳水化合物表位之治療抗體來替代疫苗接種以適應被動免疫。
本發明提供實例性經分離抗SSEA4單株抗體、其結合片段、編碼其之核酸、及含有該等抗體及其片段之組合物、及其用於抑制及/或減少腫瘤生長及治療癌症之方法。本文所提供之實例性單株抗SSEA4抗體及結合片段可調介抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)活性以靶向並殺死表現SSEA4之腫瘤細胞。另外，在實例性診斷應用中，本文所提供之單株抗SSEA4抗體可用於檢測腫瘤樣品及/或切片內之表現SSEA4之腫瘤細胞。 因此，本文提供特異性結合至SSEA4或其衍生物之新穎重組抗SSEA4抗體及片段、及其用於抗腫瘤免疫療法(例如癌症治療)中之方法。結合至癌症抗原後，抗體可立即誘導抗體依賴性細胞介導之細胞毒性，活化補體系統，及抑制腫瘤生長。 在一個實施例中，SSEA4在多個腫瘤細胞上高表現，該等腫瘤細胞包括腦瘤細胞、肺腫瘤細胞、乳房腫瘤細胞、口腫瘤細胞、食道腫瘤細胞、胃腫瘤細胞、肝腫瘤細胞、膽管腫瘤細胞、胰臟腫瘤細胞、結腸腫瘤細胞、腎腫瘤細胞、子宮頸腫瘤細胞、卵巢腫瘤細胞、前列腺腫瘤細胞。 在一個實施例中，單株抗SSEA4抗體特異性結合至SSEA4分子及衍生物。 在一個實施例中，包含本文所述抗SSEA4抗體之組合物可用於抗癌療法中。具體而言，本實施例提供特異性抗SSEA4抗體之互補決定區(CDR)序列，其可用於多個抗SSEA4結合部分中。具體而言，本發明提供能夠結合至SSEA4或其衍生物之人類化或嵌合抗體或其抗原結合片段。 在某些實施例中，CDR序列係由Kabat方法定義。 在某些實施例中，抗SSEA4抗體具有在結合至SSEA4陽性或SSEA4表現細胞時抑制腫瘤生長之活性。 在某些實施例中，經分離抗SSEA4抗體係單株抗體。針對SSEA4之單株抗體可根據業內之知識及技能製得。舉例而言，其可藉由向測試個體注射人類胚胎癌細胞且然後分離具有期望序列或功能特徵之雜交瘤表現抗體來製得。 在一個實施例中，本發明提供結合至SSEA4之經分離單株抗體或其抗原結合部分，其中在靶結合時抗體具有CDC誘導活性。 在一個實施例中，本發明提供結合至SSEA4之經分離單株抗體或其抗原結合部分，其中在靶結合時抗體具有ADCC誘導活性。 在一態樣中，本發明提供經分離單株抗體或其抗原結合片段，其分別包含： (i) 選自SEQ ID No. 10、40、50、60、70、80、100、120、130、140、150及170之H-CDR1、或其80%或更保守之序列同系物； (ii) 選自SEQ ID No. 11、41、51、61、71、81、101、121、131、141、151及171之H-CDR2、或其80%或更保守之序列同系物； (iii) 選自SEQ ID No: 12、42、52、62、72、82、102、122、132、142、152及172之H-CDR3、或其80%或更保守之序列同系物； (iv) 選自SEQ ID No. 15、45、55、65、75、85、105、125、135、145、155及175之L-CDR1、或其80%或更保守之序列同系物； (v) 選自SEQ ID No. 16、46、56、66、76、86、106、126、136、146、156及176之L-CDR2、或其80%或更保守之序列同系物，及 (vi) 選自SEQ ID No: 17、47、57、67、77、87、107、127、137、147、157及177之L-CDR3、或其80%或更保守之序列同系物。 在一態樣中，本發明提供經分離單株抗體或其抗原結合片段，其包含： (i) 選自SEQ ID No. 10、40、50、60、70、80、100、120、130、140、150及170之H-CDR1或其含有少於5個胺基酸取代之保守序列同系物； (ii) 選自SEQ ID No. 11、41、51、61、71、81、101、121、131、141、151及171之H-CDR2或其含有少於5個胺基酸取代之保守序列同系物； (iii) 選自SEQ ID No: 12、42、52、62、72、82、102、122、132、142、152及172之H-CDR3或其含有少於5個胺基酸取代之保守序列同系物；及 (iv) 選自SEQ ID No. 15、45、55、65、75、85、105、125、135、145、155及175之L-CDR1或其含有少於5個胺基酸取代之保守序列同系物； (v) 選自SEQ ID No. 16、46、56、66、76、86、106、126、136、146、156及176之L-CDR2或其含有少於5個胺基酸取代之保守序列同系物；及 (vi) 選自SEQ ID No: 17、47、57、67、77、87、107、127、137、147、157及177之L-CDR3或其含有少於5個胺基酸取代之保守序列同系物。 在某些實施例中，經分離單株抗體或其抗原結合片段進一步包含選自重鏈上之A100R、N31S、T62A中之一或多者及/或輕鏈上之S52Y的CDR上之胺基酸取代。 在某些實施例中，經分離單株抗體或其抗原結合片段進一步包含選自重鏈上之V50A、G53A、S35T中之一或多者及/或輕鏈上之V30I/A、G91A、Y94F中之一或多者的CDR上之胺基酸取代。 在一態樣中，本發明提供經分離單株抗體或其抗原結合片段，其包含：(i) 選自SEQ ID No. 13、23、33、43、53、63、73、83、103、123、133、143、153及173之重鏈可變結構域，或其80%或更保守之序列同系物；及(ii) 選自SEQ ID No. 18、28、38、48、58、68、78、88、108、128、138、148、158及178之輕鏈可變結構域，或其80%或更保守之序列同系物。 在一個實施例中，技術方案1之經分離單株抗體或其抗原結合片段進一步包含：(i) 選自SEQ ID No. 13、23、33、43、53、63、73、83、103、123、133、143、153及173之重鏈可變結構域或其80%或更保守之序列同系物，其分別進一步包含選自SEQ ID No. 10、40、50、60、70、80、100、120、130、140、150及170之H-CDR1；選自SEQ ID No. 11、41、51、61、71、81、101、121、131、141、151及171之H-CDR2、選自SEQ ID No: 12、42、52、62、72、82、102、122、132、142、152及172之H-CDR3，及(ii) 選自SEQ ID No. 18、28、38、48、58、68、78、88、108、128、138、148、158及178之輕鏈可變結構域或其80%或更保守之序列同系物，其進一步包含選自SEQ ID No. 15、45、55、65、75、85、105、125、135、145、155及175之L-CDR1；及選自SEQ ID No. 16、46、56、66、76、86、106、126、136、146、156及176之L-CDR2、及選自SEQ ID No: 17、47、57、67、77、87、107、127、137、147、157及177之L-CDR3。 在一態樣中，本發明提供經分離單株抗體或其抗原結合片段，其包含：(i) 選自SEQ ID No. 13、23、33、43、53、63、73、83、103、123、133、143、153及173之重鏈可變結構域或其含有少於10個胺基酸取代之保守序列同系物；及(ii) 選自SEQ ID No. 18、28、38、48、58、68、78、88、108、128、138、148、158及178之輕鏈可變結構域或其含有少於10個胺基酸取代之保守序列同系物。 在一個實施例中，經分離單株抗體或其抗原結合片段進一步包含：(i) 選自SEQ ID No. 13、23、33、43、53、63、73、83、103、123、133、143、153及173之重鏈可變結構域或其含有少於10個胺基酸取代之保守序列同系物，其分別進一步包含選自SEQ ID No. 10、40、50、60、70、80、100、120、130、140、150及170之H-CDR1；選自SEQ ID No. 11、41、51、61、71、81、101、121、131、141、151及171之H-CDR2、選自SEQ ID No: 12、42、52、62、72、82、102、122、132、142、152及172之H-CDR3，及(ii) 選自SEQ ID No. 18、28、38、48、58、68、78、88、108、128、138、148、158及178之輕鏈可變結構域或其含有少於10個胺基酸取代之保守序列同系物，其進一步包含選自SEQ ID No. 15、45、55、65、75、85、105、125、135、145、155及175之L-CDR1；及選自SEQ ID No. 16、46、56、66、76、86、106、126、136、146、156及176之L-CDR2、及選自SEQ ID No: 17、47、57、67、77、87、107、127、137、147、157及177之L-CDR3。 在一態樣中，本發明提供經分離單株抗體或其抗原結合片段，其進一步包含：(i) 選自SEQ ID No. 13、23、33、43、53、63、73、83、103、123、133、143、153及173之重鏈可變結構域或其含有少於10個胺基酸取代之保守序列同系物；及(ii) 選自SEQ ID No. 18、28、38、48、58、68、78、88、108、128、138、148、158及178之輕鏈可變結構域或其含有少於10個保守胺基酸取代之序列同系物，其進一步包含選自SEQ ID No. 15、45、55、65、75、85、105、125、135、145、155及175之L-CDR1；及選自SEQ ID No. 16、46、56、66、76、86、106、126、136、146、156及176之L-CDR2、及選自SEQ ID No: 17、47、57、67、77、87、107、127、137、147、157及177之L-CDR3。 在一態樣中，本發明提供經分離單株抗體或其抗原結合片段，其進一步包含：(i) 選自SEQ ID No. 13、23、33、43、53、63、73、83、103、123、133、143、153及173之重鏈可變結構域或其含有少於10個胺基酸取代之保守序列同系物，其分別進一步包含選自SEQ ID No. 10、40、50、60、70、80、100、120、130、140、150及170之H-CDR1；選自SEQ ID No. 11、41、51、61、71、81、101、121、131、141、151及171之H-CDR2、選自SEQ ID No: 12、42、52、62、72、82、102、122、132、142、152及172之H-CDR3；及(ii) 選自SEQ ID No. 18、28、38、48、58、68、78、88、108、128、138、148、158及178之輕鏈可變結構域；或其含有少於10個胺基酸取代之保守序列同系物。 在一態樣中，本發明提供經分離單株抗體或其抗原結合片段，其包含如表2A-2D中之每一變體中所示之各別相應VH、VL及各別H-CDR及L-CDR。 在某些實施例中，經分離抗體或抗原結合片段係： a. 嵌合抗體或其片段；或 b. 人類化抗體或其片段；或 c. 人類抗體或其片段；或 d. 選自由以下組成之群之抗原結合片段：Fab、Fab’、Fv、scFv、dsFv、F(ab)2 、Fd及雙價抗體。 在某些實施例中，經分離抗體或抗原結合片段係IgG。 在某些實施例中，經分離抗體或其抗原結合片段靶向具有結構Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1之碳水化合物抗原SSEA4。 在某些實施例中，本發明提供經分離抗體或抗原結合片段，其中抗體在結合至靶細胞時具有CDC及/或ADCC誘導活性。 在某些實施例中，本發明提供醫藥組合物，其包含經分離抗體或其抗原結合片段及醫藥上可接受之載劑。 在某些實施例中，本發明提供醫藥組合物，其進一步包含一或多種抗腫瘤劑。 在某些實施例中，本發明提供醫藥組合物，其中抗腫瘤劑係化學治療劑。 在某些實施例中，本發明提供免疫偶聯物，其包含抗體及細胞毒性劑。 在某些實施例中，本發明提供免疫偶聯物，其具有式AB-(L-D)p，其中：(a) AB係技術方案1-10中任一者之抗體；(b) L係連接體；(c) D係適宜細胞毒性藥物，且(d) p介於1至8範圍內。 在某些實施例中，本發明提供免疫偶聯物，其中藥物係MMAE。 在某些實施例中，本發明提供免疫偶聯物，其中連接體係可裂解連接體。 在某些實施例中，本發明提供ADC，其中連接體係烷氧基胺可裂解連接體。 在某些實施例中，本發明提供醫藥調配物，其包含技術方案之免疫偶聯物及醫藥上可接受之載劑。 在某些實施例中，本發明提供醫藥調配物，其進一步包含另一治療劑。 在某些實施例中，本發明提供經分離核酸(cDNA)，其編碼本文所揭示之抗體或結合片段。 在某些實施例中，本發明提供宿主細胞，其包含編碼本文所揭示之抗體或結合片段之核酸。 在某些實施例中，本發明提供產生抗體之方法，其包含培養宿主細胞以使得產生抗體。 在某些實施例中，本發明提供抗體，其係藉由包含以下之步驟產生： (a) 提供編碼3個具有以下序列之VL結構域CDR之核酸：分別為選自SEQ ID No. 15、45、55、65、75、85、105、125、135、145、155及175之L-CDR1；及選自SEQ ID No. 16、46、56、66、76、86、106、126、136、146、156及176之L-CDR2、及選自SEQ ID No: 17、47、57、67、77、87、107、127、137、147、157及177之L-CDR3； (b) 組合編碼3個具有以下序列之VH結構域CDR之核酸譜系：分別為選自SEQ ID No. 10、40、50、60、70、80、100、120、130、140、150及170之H-CDR1；選自SEQ ID No. 11、41、51、61、71、81、101、121、131、141、151及171之H-CDR2、選自SEQ ID No: 12、42、52、62、72、82、102、122、132、142、152及172之H-CDR3 與編碼3個VL結構域CDR之核酸，以提供編碼3個VL結構域CDR及3個VH結構域CDR譜系之核酸之產物譜系 (c) 表現產物譜系之核酸； (d) 選擇包含特異性結合至SSEA4且自產物譜系之核酸表現之可變結構域的抗原結合片段；及 (e) 產生包含抗原結合片段之抗體。 在某些實施例中，本發明提供治療患有SSEA4陽性癌症之個體之方法，該方法包含向有需要之個體投與有效量之本文所揭示醫藥組合物。 在某些實施例中，本發明提供方法，其中SSEA4陽性癌症選自腦癌、肺癌、乳癌、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽管癌、胰臟癌、結腸癌、腎癌、子宮頸癌、卵巢癌及前列腺癌。 在某些實施例中，本發明提供方法，其進一步包含向個體組合投與另一治療方式或藥劑。 在某些實施例中，本發明提供方法，其中組合治療方式選自治療抗體、細胞療法、輻射、細胞介素及/或化學治療劑。 在某些實施例中，本發明提供抑制SSEA4陽性細胞增殖之方法，該方法包含在容許抗體/片段/ADC與表現碳水化合物抗原之細胞表面上之SSEA4結合之條件下將細胞暴露於如本文所揭示之醫藥調配物，藉此抑制細胞增殖。 在某些實施例中，本發明提供治療患有SSEA4陽性癌症之個體之方法，其中SSEA4陽性癌症對第一治療劑有抗性，該方法包含向個體投與有效量之本文所揭示醫藥調配物。 在某些實施例中，本發明提供方法，其中SSEA4陽性癌症係腦癌、肺癌、乳癌、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽管癌、胰臟癌、結腸癌、腎癌、子宮頸癌、卵巢癌及/或前列腺癌。 在某些實施例中，本發明提供方法，其中第一治療劑包含結合除SSEA4外之抗原之第一抗體/結合片段/ADC及/或輻射及/或化學治療劑。 在某些實施例中，本發明提供檢測生物樣品中之SSEA4之方法，其包含使生物樣品與如本文所揭示之抗SSEA4抗體在容許抗SSEA4抗體與天然SSEA4結合之條件下接觸，及檢測在抗SSEA4抗體與生物樣品中之天然SSEA4之間是否形成複合物。 在某些實施例中，本發明提供方法，其中生物樣品係癌症樣品。 在某一態樣中，本發明提供檢測SSEA4陽性癌症之方法，其包含(i) 向患有或懷疑患有碳水化合物抗原表現腫瘤之個體投與經標記抗SSEA4抗體，其中經標記抗SSEA4抗體包含如本文所揭示之抗SSEA4抗體，及(ii) 檢測個體中之經標記抗SSEA4抗體，其中檢測到經標記抗SSEA4抗體指示個體中之SSEA4陽性癌症。 在某些實施例中，本發明提供經分離抗體，其中抗體以小於10-7 M之親和常數特異性結合至SSEA4。 在某些實施例中，本發明提供經分離抗體，其中抗體係IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。 在某些實施例中，本發明提供經分離抗體，其中抗體係IgG1λ或IgG1κ。 在某些實施例中，本發明提供單株抗體或其抗原結合部分，其中單株抗體或其抗原結合部分以1×10-7 M或更小之KD 結合至SSEA4，且其中KD 係藉由表面電漿共振(Biacore)分析來量測。 在某些實施例中，本發明提供經分離抗SSEA4抗體或其結合片段，其中結合親和力為＜ 50 nM。 本發明係關於根據本發明態樣/實施例中任一者之特異性結合至SSEA4之抗體及其結合片段。在一態樣中，本發明提供結合至SSEA4之經分離單株抗體或其結合片段，其中在靶結合時抗體具有ADCC誘導活性。 根據某些實施例，抗體係單株抗體。 根據某些實施例，抗體係嵌合或人類化抗體。 根據某些實施例，抗體係雙特異性抗體。 根據某些實施例，本發明揭示選擇性結合至SSEA4之嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor；CAR)。在此實施例中，CAR可包含具有可變重鏈(VH )及可變輕鏈(VL )之抗原結合結構域。 在一態樣中，藉由ELISA結合分析，抗體或其結合片段具有與SSEA4之半最大結合，且EC50 為約5奈克/mL、10奈克/mL、15奈克/mL、20奈克/mL、15奈克/mL、30奈克/mL、35奈克/mL、40奈克/mL、45奈克/mL、50奈克/mL、55奈克/mL、60奈克/mL、65奈克/mL、70奈克/mL、75奈克/mL、80奈克/mL、85奈克/mL、90奈克/mL、95奈克/mL、100奈克/mL、105奈克/mL、110奈克/mL、115奈克/mL、120奈克/mL、125奈克/mL、130奈克/mL、135奈克/mL、140奈克/mL、145奈克/mL、150奈克/mL、155奈克/mL、160奈克/mL、165奈克/mL、170奈克/mL、175奈克/mL、180奈克/mL、185奈克/mL、190奈克/mL、195奈克/mL、200奈克/mL、205奈克/mL、210奈克/mL、215奈克/mL、220奈克/mL、225奈克/mL、230奈克/mL、235奈克/mL、240奈克/mL、245奈克/mL、250奈克/mL或本文所列舉兩個值中任一者之間之值。 在一態樣中，經分離抗SSEA4抗體或其結合片段，其中結合親和力為＜ 50 nM (小於50 nM)。在某些實施例中，結合親和力可介於＜5 nM、＜ 10 nM、＜ 15 nM、＜ 20 nM、＜ 25 nM、＜ 30 nM、＜ 35 nM、＜ 40 nM、＜ 45 nM或＜ 50 nM範圍內。 根據本發明之一實施例，醫藥組合物包含(1) 治療有效量之根據本發明態樣/實施例中任一者之抗體或抗原結合片段，及視情況(2) 醫藥上可接受之載劑。 在一態樣中，本發明係關於治療有需要之個體之癌症之醫藥組合物，其包含包括如本文所揭示之實例性H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2及L-CDR3之經分離抗體或其抗原結合片段及醫藥上可接受之載劑。 在某些實施例中，醫藥組合物可用於治療過度增生性疾病，例如癌症。 在某些態樣中，本發明提供治療有需要之個體之癌症之方法，其中該方法包含向個體投與治療有效量之代表性醫藥組合物，其中所投與抗體增強該個體中之ADCC或CDC活性。 在某些實施例中，所提供方法治療選自由以下組成之群之癌症：腦癌、肺癌、乳癌、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽管癌、胰臟癌、結腸癌、腎癌、骨癌、皮膚癌、子宮頸癌、卵巢癌及前列腺癌。 根據本發明之實施例，該方法包括向個體投與有效量之包含抗體之醫藥組合物及/或根據本發明態樣/實施例中任一者之醫藥組合物。 在某些實施例中，本發明提供診斷癌症之方法。
因此，提供針對標記物之抗體方法及組合物用於診斷及治療廣譜癌症。抗SSEA4抗體經研發且揭示於本文中。使用方法包括(但不限於)癌症療法及診斷。本文所述之抗體可結合至廣譜表現SSEA4之腫瘤細胞，由此幫助癌症診斷及治療。可由抗體靶向之細胞包括癌瘤，例如腦癌、肺癌、乳癌、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽管癌、胰臟癌、結腸癌、腎癌、子宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌等中之彼等。定義 除非本文中另有定義，否則本發明中所用之科學及技術術語應具有熟習此項技術者通常理解且使用之含義。除非上下文另有要求，否則應理解，單數術語應包括其複數形式且複數術語應包括單數形式。具體而言，除非上下文另外明確指明，否則如本文及申請專利範圍中所用之單數形式「一(a及an)」包括複數個指示物。另外，如本文及申請專利範圍中所用之術語「至少一種」及「一或多種」具有相同含義且包括一種、兩種、三種或更多種。 儘管闡述本發明廣泛範圍之數值範圍及參數係近似值，但儘可能精確地報告具體實例中所述之數值。然而，任一數值固有地含有必然由各別測試量測中發現之標準偏差引起之某些誤差。另外，如本文所用之術語「約」通常意指在給定值或範圍之10%、5%、1%或0.5%內。或者，術語「約」意指當由熟習此項技術者考慮時在平均值之可接受標準誤差內。除在操作/工作實例中或除非另外明確說明，否則本文所揭示之所有數值範圍、量、值及百分比(例如材料之量、持續時間、溫度、操作條件、量比率及其類似物之彼等)應理解為在所有情況下經術語「約」修飾。因此，除非指示相反情況，否則本發明及隨附申請專利範圍中所述之數值參數為可視需要改變之近似值。無論如何至少，每一數值參數應至少根據所報告有意義數字之數值並藉由應用普通四捨五入技術來解釋。 除非另有說明，否則在本文所用之多核苷酸注釋中，根據標準用法及慣例，左手方向為5’末端且右手方向為3’末端；在本文所用之肽注釋中，左手方向為胺基末端(N末端)方向且右手方向為羧基末端(C末端)方向。 如本文所互換使用之術語「多核苷酸」或「核酸」係指任一長度之核苷酸之聚合物，且包括DNA及RNA。核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾核苷酸或鹼基及/或其類似物或可藉由DNA或RNA聚合酶或藉由合成反應納入聚合物中之任一受質。 如本文所用之術語「寡核苷酸」通常係指長度通常(但不必)小於約200個核苷酸之短、通常單鏈、通常合成多核苷酸。術語「寡核苷酸」及「多核苷酸」並不互斥。上文針對多核苷酸之描述同樣且完全適用於寡核苷酸。 如本文所用之術語「載體」欲指能夠轉運與其連接之另一核酸之核酸分子。一類載體為「質體」，其係指其他DNA區段可連接至其中之環形雙鏈DNA環。另一類載體係噬菌體載體。另一類載體為病毒載體，其中其他DNA區段可連接至病毒基因體中。某些載體能夠在已引入其之宿主細胞中進行自主複製(例如，具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如非游離型哺乳動物載體)可在引入宿主細胞中時整合至宿主細胞之基因體中，並藉此隨宿主基因體一同複製。另外，某些載體能夠引導與其可操作連接之基因之表現。該等載體在本文中稱為「重組表現載體」 (或簡稱「重組載體」)。一般而言，在重組DNA技術中可用之表現載體通常呈質體形式。在本說明書中，「質體」與「載體」可互換使用，此乃因質體係載體之最常用形式。 術語「聚醣」係指多醣或寡醣。聚醣在本文中亦用於指醣偶聯物(例如醣蛋白、醣脂、醣肽、醣蛋白質組、肽多醣、脂多醣或蛋白聚醣)之碳水化合物部分。聚醣通常僅由單醣之間之O-醣苷鏈接組成。聚醣可為單醣殘基之均聚物或異聚物，且可為直鏈或具支鏈。可發現聚醣附接至蛋白質，如在醣蛋白及蛋白聚醣中。其通常發現於細胞之外表面上。O-及N-連接聚醣極常見於真核細胞中，但亦可發現(但較不常見)於原核細胞中。發現N-連接聚醣附接至序列子中天冬醯胺之R-基團氮(N)。序列子係Asn-X-Ser或Asn-X-Thr序列，其中X係除脯胺酸外之任一胺基酸。 術語「萬能聚醣」係指聚醣序列Sia2 (α2-6)Gal2 GlcNAc2 Man3 GlcNAc2 。 該結構係
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，其中
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係唾液酸(Sia)；
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係半乳糖(Gal)；
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係N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)；
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係甘露糖(Man) 如本文中所用之術語「抗原」定義為能夠引發免疫反應之物質。該免疫反應可涉及抗體產生或特異性免疫勝任細胞之活化或二者皆有。 術語「表位」係指通常由免疫球蛋白VH /VL 對結合之結構單元。表位定義抗體之最小結合位點，且因此代表抗體之特異性靶。 如本文所用之術語「免疫原」係指能夠誘導抗體產生之抗原。 如本文所用之術語「免疫原性」通常係指免疫原或抗原刺激免疫反應之能力。 術語「疫苗」係指含有由全致病性生物體(殺死或減弱)或該等生物體之組分(例如蛋白質、肽或多醣)組成之抗原之製劑，其用於賦予針對生物體引起之疾病之免疫性。疫苗製劑可為天然、合成或藉由重組DNA技術衍生而來。 如本文所用之術語「抗原特異性」係指特定抗原或抗原片段之供應產生特異性細胞增殖之細胞群體之性質。 如本文所用之術語「特異性結合」係指結合對(例如抗體與抗原)之間之相互作用。在各種情況下，特異性結合可體現為親和常數為約10-6 莫耳/公升、約10-7 莫耳/公升或約10-8 莫耳/公升或更小。在另一或替代性實施例中，根據抗體特異性，抗體與其各別抗原之結合稱為特異性。術語「特異性」在此處通常用於指以下情形：結合對之一個成員將不顯示與除其特異性結合配偶體外之分子之任何顯著結合，且例如具有與除本文所指定彼等外之任何其他分子之小於約30%、較佳20%、15%、10%、5%或1%交叉反應性。 術語「結合親和力」通常係指分子(例如，抗體)之單一結合位點與其結合配偶體(例如，抗原)之間之全部非共價相互作用之總強度。除非另外指示，否則如本文所用「結合親和力」係指反映結合對之成員(例如，抗體與抗原)之間之1:1相互作用的固有結合親和力。分子X對其配偶體Y之親和力通常可由解離常數(Kd )表示。親和力可藉由業內已知之常用方法(包括本文所述之彼等)來量測。低親和力抗體通常緩慢地結合抗原且往往易於解離，而高親和力抗體通常較快結合抗原且往往保持較長時間結合。多種量測結合親和力之方法為業內已知，其任一者皆可用於本發明目的。 如本文所用之術語「解離常數(Kd )」係在複合物分解成其組成分子時量測較大物體可逆地解離成較小組分之傾向的特定類型之平衡常數。對於反應Ax By ⇌ xA + yB，解離常數定義為Kd = [A]x [B]y / [Ax By ]，其中[A]、[B]及[Ax By ]分別係A、B及Ax By 之濃度。具體而言，Kd 值係藉由Biacore表面電漿共振系統或酶聯免疫吸附分析(ELISA)定義。 如本文所用「特異性結合至SSEA4」之抗體欲指以1×10-7 M或更小、更佳5×10-8 M或更小、更佳1×10-8 M或更小、更佳5×10-9 M或更小之KD 結合至SSEA4或以1×10-8 M與1×10-10 M之間或更小之KD 結合至SSEA-4之抗體。 如本文所用之術語K 「K締合 」或「Ka 」欲指特定抗體-抗原相互作用之締合速率，而如本文所用之術語「K解離 」或「Kd 」欲指特定抗體-抗原相互作用之解離速率。如本文所用之術語「KD 」欲指解離常數，其係自Kd 對Ka 之比率(即Kd /Ka )獲得且以莫耳濃度(M)表示。可使用業內已充分確立之方法測定抗體之KD 值。測定抗體之KD 之較佳方法係藉由使用表面電漿共振，較佳使用生物感測器系統(例如Biacore®系統)。 如本文所用之術語對IgG抗體之「高親和力」係指抗體對靶抗原具有10-8 M或更小、更佳10-9 M或更小且甚至更佳10-10 M或更小之KD 。然而，對於其他抗體同型，「高親和力」結合可發生變化。舉例而言，對IgM同型之「高親和力」結合係指抗體具有10-7 M或更小、更佳10-8 M或更小、甚至更佳10-9 M或更小之KD 。 術語「半最大有效濃度(EC50 )」係指藥物、抗體或毒物在指定暴露時間後誘導在基線與最大效應之間之中途之反應的濃度。其用作藥物功效之量度。 術語「抗體」及「免疫球蛋白」在最廣泛意義上可互換使用且包括單株抗體(例如，全長或完整單株抗體)、多株抗體、單價、多價抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)且亦可包括某些抗體片段。大多數抗體係具有以下相同結構特徵之醣蛋白：兩條重鏈及兩條輕鏈藉由二硫鍵彼此連接。輕鏈包括可變結構域(VL )及恆定結構域(CL )；而重鏈包括可變結構域(VH )及三個恆定結構域(CH 1、CH 2及CH 3，統稱為CH )。輕鏈(VL )及重鏈(VH )二者之可變區決定結合識別及對抗原之特異性。VH 及VL 區可進一步細分成具有超變性之區(稱為超變區(HVR))及更保守之區(稱為框架區(FR))，二者間雜排列。輕鏈(CL )及重鏈(CH )之恆定區結構域賦予重要生物性質，例如抗體鏈締合、分泌、經胎盤活動性、補體結合及與Fc受體(FcR)之結合。端視其重鏈之恆定結構域之胺基酸序列，可將抗體分配至不同類別。存在5大類免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且該等類別中之若干可進一步分成亞類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同類別之免疫球蛋白之重鏈恆定結構域分別稱為α、δ、ε、γ及µ。不同類別之免疫球蛋白之亞單位結構及三維構形為業內所熟知且通常闡述於例如Abbas等人，Cellular and Mol. Immunology ，第4版(2000)。抗體可為較大融合分子之一部分，其係藉由抗體與一或多種其他蛋白質或肽之共價或非共價締合來形成。抗體可為嵌合、人類、人類化及/或親和力成熟抗體。 基於抗體恆定結構域之胺基酸序列，可將來自任何脊椎動物物種之抗體(免疫球蛋白)之「輕鏈」分配至兩種完全不同類型(稱為卡帕(κ)及蘭布達(λ))中之一者。在一個實施例中，鏈係κ型。在另一實施例中，鏈係λ型。 如本文所用「可變結構域」係指抗體分子輕鏈及重鏈之包括超變區(HVR)及框架區(FR)之胺基酸序列之部分。根據本文所述之方法，分配至HVR及FR之胺基酸位置可根據Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest , 國立衛生研究院, Bethesda, Md., 1987及1991)定義。抗體或抗原結合片段之胺基酸編號亦根據Kabat定義。 如本文所用之術語「如Kabat中之可變結構域殘基編號」或「如Kabat中之胺基酸位置編號」及其變化形式係指在Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest ，第5版，Public Health Service, 國立衛生研究院, Bethesda, Md. (1991)中用於抗體編譯之重鏈可變結構域或輕鏈可變結構域之編號系統。使用此編號系統，實際線性胺基酸序列可含有較少或額外之對應於可變結構域FR或HVR之縮短或插入之胺基酸。舉例而言，重鏈可變結構域可包括在H2之殘基52後之單胺基酸插入(根據Kabat之殘基52a)及重鏈FR殘基82後之插入殘基(例如，根據Kabat之殘基82a、82b及82c等)。可藉由將抗體序列之同源區與標準Kabat編號序列比對來確定給定抗體殘基之Kabat編號。 如本文所用之術語「框架區」 (FR)殘基係除如本文所定義之超變區殘基外之彼等可變結構域殘基。 如本文所用之術語「超變區」 (HVR或HV)及「互補決定區」 (CDR)可互換使用，在用於本文中時係指抗體可變結構域之序列具有超變性及/或形成結構上經定義之環之區域。通常，抗體包含6個超變區；三個在VH (H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3)中，且三個在VL (L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3)中。本文使用且涵蓋多個超變區之描繪。Kabat互補決定區(CDR)係基於序列可變性且為最常用的(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest ，第5版，Public Health Service, 國立衛生研究院, Bethesda, Md. (1991))。而Chothia係指結構環之位置(Chothia及Lesk，J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。AbM超變區代表Kabat CDR與Chothia結構環之間之折衷方案，且用於Oxford Molecular之AbM抗體建模軟體中。「接觸」超變區係基於對可獲得複雜晶體結構之分析。「IMGT」 (國際ImMunoGeneTics資訊系統)提供免疫球蛋白及T細胞受體可變結構域及Ig超家族V樣結構域之獨特編號。來自該等超變區中每一者之藉由Kabat、AbM、Chothia及Contact定義之殘基註明於下文中；IMGT在網站http://www.imgt.org/上預測
Figure 02_image011
術語「全長抗體」、「完整抗體」與「全抗體」在本文中可互換使用，其係指呈實質上完整形式之抗體，且不為如下文所定義之抗體片段。該等術語尤其係指含有Fc區之重鏈之抗體。 術語「抗體片段」僅包含完整抗體之一部分，其中該部分保留至少一種及(至多)大部分或所有通常在存在於完整抗體中時與該部分相關之功能。在一實施例中，抗體片段包含完整抗體之抗原結合位點且因此保留結合抗原之能力。在另一實施例中，抗體片段(例如包含Fc區者)保留通常與存在於完整抗體中之Fc區相關之生物學功能中之至少一者，例如FcRn結合、抗體半衰期調節、ADCC功能及補體結合。在一個實施例中，抗體片段係活體內半衰期實質上與完整抗體類似之單價抗體。舉例而言，該抗體片段可包含連接至能夠賦予片段活體內穩定性之Fc序列之抗原結合臂。 如本文所用之術語「Fc區」在本文中用於定義免疫球蛋白重鏈之C末端區域，包括天然序列Fc區及變體Fc區。儘管免疫球蛋白重鏈之Fc區之邊界可發生變化，但通常將人類IgG重鏈Fc區界定為自Cys226位處之胺基酸殘基或自Pro230延伸至其羧基末端。Fc區之C末端離胺酸(根據EU編號系統之殘基447)可例如在抗體產生或純化期間或藉由重組改造編碼抗體重鏈之核酸來移除。因此，完整抗體之組合物可包含移除所有K447殘基之抗體群體、未移除K447殘基之抗體群體及具有含及不含K447殘基之抗體之混合物之抗體群體。適用於本發明抗體中之天然序列Fc區包括人類IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3及IgG4。 如本文所用之術語「Fv區」係含有完全抗原識別及結合位點之最小抗體片段。在雙鏈Fv物質中，此區域係由一個重鏈可變結構域與一個輕鏈可變結構域之緊密非共價締合二聚體組成。在單鏈Fv物質中，一個重鏈可變結構域及一個輕鏈可變結構域可藉由撓性肽連接體共價連接，使得該等輕鏈及重鏈可以與雙鏈Fv物質中類似之「二聚」結構締合。每一可變結構域之3個CDR以此構形相互作用以界定VH -VL 二聚體之表面上之抗原結合位點。六個CDR共同賦予了該抗體抗原結合特異性。然而，即使單一可變結構域(或Fv之一半，其僅包含三個特異性針對抗原之CDR)具有識別並結合抗原之能力，但其親和力低於完整結合位點。 如本文所用之術語「Fab片段」含有Fv區、輕鏈之恆定結構域及重鏈之第一恆定結構域(CH 1)。Fab′片段與Fab片段之不同之處在於在重鏈CH 1結構域之羧基末端添加幾個殘基，包括一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸。 術語「抗原結合片段」係指抗體之保留特異性結合至抗原能力之全長或一或多個片段。已顯示，抗體之抗原結合功能可由全長抗體之片段來實施。術語「抗原結合片段」內所涵蓋結合片段之實例包括Fab片段；Fv片段；單鏈Fv(scFv)片段；雙價抗體；Fab’-SH片段，其在本文中係針對其中恆定結構域之半胱胺酸殘基帶有游離硫醇基之Fab’命名；F(ab)2 片段，其係包含在鉸鏈區藉由二硫橋連接之兩個Fab片段之二價片段；Fd片段，其係由VH 及CH 1結構域組成；dAb片段(Ward等人，1989Nature 341 :544-546)，其係由VH 結構域組成；dsFv片段，其係藉由撓性連接體肽連接之兩個不同的二硫鍵穩定之Fv抗體片段；及經分離互補決定區(CDR)；或包含該抗原結合片段之任何融合蛋白。 術語「單鏈Fv」或「scFv」抗體片段包含抗體之VH 及VL 結構域，其中該等結構域係以單一多肽鏈存在。通常，scFv多肽進一步包含VH 結構域與VL 結構域之間之多肽連接體，其使得scFv能夠形成用於抗原結合之期望結構。關於scFv之綜述，參見Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies ，第113卷，Rosenburg及Moore編輯，Springer-Verlag, New York，第269-315頁(1994)。 術語「雙價抗體」係指具有兩個抗原結合位點之小抗體片段，該等片段包含在同一多肽鏈(VH -VL )中連接至輕鏈可變結構域(VL )之重鏈可變結構域(VH )。藉由使用過短而不允許在同一鏈上之兩個結構域之間配對之連接體，迫使該等結構域與另一鏈之互補結構域配對並產生兩個抗原結合位點。雙價抗體更全面闡述於例如EP 404,097；WO93/1161；及Hollinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)中。 如本文所用之術語「單株抗體(mAb)」係指自實質上同源抗體之群體獲得之抗體，例如除可少量存在之可能天然突變外，構成該群體之個別抗體皆相同。因此，修飾語「單株」指示並非離散抗體混合物之抗體性質。該單株抗體通常包括包含結合靶之多肽序列之抗體，其中靶結合多肽序列係藉由包括自複數個多肽序列選擇單一靶結合多肽序列之過程獲得。舉例而言，選擇過程可為自複數個純系(例如一組雜交瘤純系、噬菌體純系或重組DNA純系)選擇獨特純系。應理解，可進一步改變所選靶結合序列以(例如)改良對靶之親和力，人類化靶結合序列，改良其在細胞培養物中之產生，減小其活體內免疫原性，產生多特異性抗體等，且包含經改變靶結合序列之抗體亦係本發明之單株抗體。與通常包括針對不同表位之不同抗體之多株抗體製劑相比，單株抗體製劑之每一單株抗體針對抗原上之單個表位。除其特異性外，單株抗體製劑之優勢在於其通常不受其他免疫球蛋白污染。修飾語「單株」指示抗體之特徵在於自實質上同源之抗體群體獲得，且不應理解為需要藉由任一特定方法來產生該抗體。舉例而言，欲根據本發明使用之單株抗體可藉由多種技術製得，該等技術包括例如雜交瘤方法(例如，Kohler等人，Nature , 256: 495 (1975)；Harlow等人，Antibodies : A Laboratory Manual , (Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版，1988)；Hammerling等人，Monoclonal Antibodies and T-Cell hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981))、重組DNA方法(例如，參見美國專利第4,816,567號)、噬菌體展示技術(例如，參見Clackson等人，Nature , 352: 624-628 (1991)；Marks等人，J. Mol. Biol . 222: 581-597 (1992)；Sidhu等人，J. Mol. Biol . 338(2): 299-310 (2004)；Lee等人，J. Mol. Biol . 340(5): 1073-1093 (2004)；Fellouse,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)；及Lee等人，J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)，及用於在具有部分或全部人類免疫球蛋白基因座或編碼人類免疫球蛋白序列之基因之動物中產生人類或人類樣抗體之技術(例如，參見WO98/24893；WO96/34096；WO96/33735；WO91/10741；Jakobovits等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993)；Jakobovits等人，Nature 362: 255-258 (1993)；Bruggemann等人，Year in Immunol . 7:33 (1993)；美國專利第5,545,807號；第5,545,806號；第5,569,825號；第5,625,126號；第5,633,425號；第5,661,016號；Marks等人，Bio. Technology 10: 779-783 (1992)；Lonberg等人，Nature 368: 856-859 (1994)；Morrison,Nature 368: 812-813 (1994)；Fishwild等人，Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996)；Neuberger,Nature Biotechnol. 14: 826 (1996)以及Lonberg及Huszar,Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)。 術語「嵌合抗體」係指其中重鏈及/或輕鏈之一部分與衍生自特定物種或屬特定抗體類別或亞類之抗體之相應序列一致或同源，而鏈之其餘部分與衍生自另一物種或屬另一抗體類別或亞類之抗體之相應序列一致或同源。具體而言，在本發明中，嵌合抗體可為其中非人類抗體之抗原結合序列/可變結構域已移植至人類抗體框架區上之人類化抗體。該等抗體只要展現期望生物活性即可(美國專利第4,816,567號；及Morrison等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。 如本文所用之術語「人類化抗體」係含有衍生自非人類免疫球蛋白之最小序列之嵌合抗體。在一實施例中，人類化抗體係如下人類免疫球蛋白(接受體抗體)：其中來自接受體超變區之殘基經來自非人類物種(例如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物)超變區(供體抗體)之具有期望特異性、親和力及/或能力之殘基替代。在一些情況下，人類免疫球蛋白之框架區殘基經相應的非人類殘基替代。另外，人類化抗體可包含接受體抗體或供體抗體中不存在之殘基。實施該等修飾以進一步細化抗體性能。通常，人類化抗體將包含實質上全部的至少一個且通常兩個可變結構域，其中全部或實質上全部超變環對應於非人類免疫球蛋白之超變環，且全部或實質上全部FR為人類免疫球蛋白序列之FR。人類化抗體視情況亦包含免疫球蛋白恆定區(Fc) (通常為人類免疫球蛋白恆定區)之至少一部分。其他細節參見Jones等人，Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332:323-329(1988)；及Presta，Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)。亦參見下列綜述文件及其中所引用之參考文獻：Vaswani及Hamilton, Ann. Allergy,Asthma Immunol. 1:105-115 (1998)；Harris, Biochem.Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)；Hurle及Gross,Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)。 術語「人類抗體」係其具有之胺基酸序列對應於由人類產生之抗體之胺基酸序列及/或使用如本文所揭示製備人類抗體的任一技術製備。人類抗體之此定義明確排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。 「親和力成熟抗體」係在其一或多個HVR中存在一或多處改變之抗體，該等改變會使抗體對抗原之親和力與不具有彼等改變之親代抗體有所改良。在一實施例中，親和力成熟抗體對靶抗原具有奈莫耳濃度或甚至皮莫耳濃度親和力。親和力成熟抗體係藉由業內已知之程序產生。Marks等人，BioTechnology 10:779-783 (1992)闡述藉由VH 及VL 結構域改組之親和力成熟。CDR及/或框架殘基之隨機誘變闡述於以下文獻中：Barbas等人，Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994)；Schier等人，Gene 169:147-155 (1995)；Yelton等人，J. Immunol. 155:1994-2004 (1995)；Jackson等人，J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995)；及Hawkins等人，J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)。 「經分離抗體」係已經鑑別並自其自然環境組分分離及/或回收之抗體。其天然環境之污染物組分係會干擾抗體之研究、診斷或治療用途之材料，且可包括酶、激素及其他蛋白質性或非蛋白質性溶質。在一個實施例中，抗體經純化(1) 至如藉由例如Lowry方法測定之大於90重量%之抗體、及在一些實施例中大於95重量%，2) 至藉由使用例如旋杯式測序儀測定之足以獲得N末端或內部胺基酸序列之至少15個殘基，或(3) 至藉由SDS-PAGE在還原或非還原條件下使用例如考馬斯藍(Coomassie blue)或銀染色測定之均質性。經分離抗體包括重組細胞內之原位抗體，此乃因不存在抗體天然環境之至少一種組分。然而，經分離抗體通常將藉由至少一個純化步驟製備。 「阻斷抗體」或「拮抗劑抗體」係抑制或降低所結合抗原之生物活性之抗體。某些阻斷抗體或拮抗劑抗體實質上或完全抑制抗原之生物活性。 如本文所用之「激動劑抗體」係模擬所關注多肽之功能活性中之至少一者的抗體。 術語「嵌合抗原受體(CAR)」係人工構築之雜合蛋白質或多肽，其含有抗體(例如scFv)之連接至T細胞信號傳導結構域之抗原結合結構域。CAR之特徵包括其利用單株抗體之抗原結合性質以非MHC限制性方式將T細胞特異性及反應性重定向至所選靶之能力。非MHC限制性抗原識別給予表現CAR之T細胞獨立於抗原處理識別抗原之能力，因此繞過腫瘤逃逸之主要機制。另外，當在T細胞中表現時，CAR有利地不與內源T細胞受體(TCR) α及β鏈發生二聚化。 「病症」係將受益於本發明抗體之治療之任一病況。此包括慢性及急性病症或疾病，包括使哺乳動物易患所討論病症之彼等病理學病況。本文欲治療病症之非限制性實例包括癌症。 術語「細胞增生性病症」或「增生性病症」係指與一定程度之異常細胞增殖相關之病症。在一實施例中，細胞增生性病症係癌症。 如本文所用之「腫瘤」係指所有腫瘤性細胞生長及增殖(無論係惡性的抑或係良性的)以及所有癌前期及癌性細胞及組織。如本文所提及之術語「癌症」、「癌性」、「細胞增生性病症」、「增生性病症」及「腫瘤」並不互斥。 術語「癌症」或「癌性」係指或闡述哺乳動物中特徵通常在於細胞生長/增殖失調之生理病況。癌症之實例包括(但不限於)癌瘤、淋巴瘤(例如霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)及非霍奇金氏淋巴瘤)、母細胞瘤、肉瘤及白血病。該等癌症之更具體實例包括腦癌、口腔癌、鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、胰臟癌、膠質母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、胃癌、膽管癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳癌、結腸癌、骨癌、結腸直腸癌、子宮內膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌(liver cancer)、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、白血病及其他淋巴組織增生性病症及各種類型之頭頸癌。 如本文所用之術語「個體(individual或subject)」意欲包括人類及非人類動物。較佳個體包括需要增強免疫及/或抗增生性及/或抗癌治療反應之人類患者。該等方法尤其適於治療適於活體內癌細胞治療之人類患者。 如本文所用之術語「治療劑」之特徵在於可降低及/或抑制過度增生性疾病之任一藥劑。實例性治療劑可包括(但不限於)細胞毒性劑、化學治療劑、抗增生劑、免疫調節劑、激素調節劑、細胞介素以及其他抗癌物質及/或方式。 如本文所用之術語「細胞毒性劑」係指抑制或阻止細胞功能及/或引起細胞破壞之物質。該術語意欲包括放射性同位素(例如At211 、I131 、I125 、Y90 、Re186 、Re188 、Sm153 、Bi212 、P32 、Pb212 及Lu之放射性同位素)；化學治療劑(例如胺甲喋呤(methotrexate)、阿黴素(adriamicin)、長春花生物鹼(長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、依託泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂黴素C (mitomycin C)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、柔紅黴素(daunorubicin)或其他嵌入劑)；酶及其片段，例如溶核酶；抗生素；及毒素，例如來自細菌、真菌、植物或動物起源之小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段及/或變體；及下文所揭示之各種抗腫瘤劑或抗癌劑。其他細胞毒性劑闡述於下文中。如本文所用之殺腫瘤劑引起腫瘤細胞破壞。細胞毒性劑及化學治療劑並不互斥。 另外或或者，細胞毒素或細胞毒性劑可包括對細胞有害(例如，殺死)之任一藥劑。實例包括汰癌勝(taxol)、細胞鬆弛素B、短桿菌素D、溴乙錠、依米丁(emetine)、絲裂黴素、依託泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、長春新鹼、長春鹼、秋水仙鹼(colchicin)、多柔比星、柔紅黴素、二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxyanthracindione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光輝黴素(mithramycin)、放線菌素D、1-去氫睪甾酮(1-dehydrotestosterone)、醣皮質素、普魯卡因(procaine)、四卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)及嘌呤黴素(puromycin)及其類似物或同系物。治療劑亦包括例如抗代謝物(例如胺甲喋呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶達卡巴嗪(5-fluorouracil decarbazine))、烷基化劑(例如甲基二氯乙基胺(mechlorethamine)、噻替派(thioepa)、氯芥苯丁酸、美法侖、卡莫司汀(carmustine) (BSNU)及洛莫司汀(lomustine) (CCNU)、環磷醯胺、白消安(busulfan)、二溴甘露醇、鏈佐黴素(streptozotocin)、絲裂黴素C及順式-二氯二胺鉑(II) (DDP)(順鉑(cisplatin))、蒽環抗生素(例如柔紅黴素(先前為道諾黴素(daunomycin))及多柔比星)、抗生素(例如放線菌素D (dactinomycin) (先前為放線菌素)、博來黴素(bleomycin)、光輝黴素及安麯黴素(anthramycin) (AMC))及抗有絲分裂劑(例如長春新鹼及長春鹼)。 術語「化學治療劑」係可用於治療癌症之化學化合物。化學治療劑之實例包括烷基化劑，例如噻替哌及CYTOXAN® (環磷醯胺)；磺酸烷基酯，例如白消安、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮雜環丙烷，例如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米得哌(meturedopa)及烏得哌(uredopa)；伸乙基亞胺及甲基蜜胺，包含六甲蜜胺(altretamine)、三伸乙基蜜胺、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫代磷醯胺及三羥甲基蜜胺；多聚乙醯(尤其布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氫大麻酚(屈大麻酚(dronabinol)、MARINOL® )；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙鹼(colchicine)；樺木酸；喜樹鹼(camptothecin) (包括合成類似物托泊替康(topotecan) (HYCAMTIN® )、CPT-11 (伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR® )、乙醯基喜樹鹼(acetylcamptothecin)、莨菪素(scopolectin)及9-胺基喜樹鹼)；苔蘚蟲素(bryostatin)；卡利司他汀(callystatin)；CC-1065 (包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)及比折來新(bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；念珠藻素(cryptophycin) (尤其念珠藻素1及念珠藻素8)；尾海兔素(dolastatin)；倍癌黴素(duocarmycin) (包括合成類似物KW-2189及CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉鹼(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海綿抑制素(spongistatin)；氮芥，例如氮芥苯丁酸、萘氮芥(chlomaphazine)、氯磷醯胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、甲基二氯乙基胺、鹽酸氧氮芥、美法侖、新氮芥(novembichin)、膽甾醇對苯乙酸氮芥(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；亞硝基脲，例如卡莫司汀、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀、尼莫司汀(nimustine)及雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如卡奇黴素(calicheamicin)，尤其卡奇黴素γ1I及卡奇黴素ωI1 (例如參見Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl. , 33: 183-186 (1994))；達內黴素(dynemicin)，包括達內黴素A；埃斯波黴素(esperamicin)；以及新製癌菌素髮色團(neocarzinostatin chromophore)及相關色蛋白烯二炔抗生素發色團)、阿克拉黴素(aclacinomysin)、放線菌素、安麯黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸、博來黴素、放線菌素C、卡拉黴素(carabicin)、洋紅黴素(caminomycin)、嗜癌黴素(carzinophilin)、色黴素(chromomycinis)、放線菌素D、柔紅黴素、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺基、ADRIAMYCIN® 多柔比星(包括嗎啉基-多柔比星、氰基嗎啉基-多柔比星、2-吡咯啉并-多柔比星及去氧阿黴素)、泛艾黴素(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycm)、絲裂黴素(例如絲裂黴素C)、黴酚酸、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、泊非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈佐黴素、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他汀(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝劑，例如胺甲喋呤及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，例如二甲葉酸(denopterin)、胺甲喋呤、蝶羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，例如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，例如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-阿紮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、二去氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷；雄激素，例如卡普睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內酯(testolactone)；抗腎上腺劑，例如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，例如亞葉酸；醋葡醛內酯；醛磷醯胺醣苷；胺基酮戊酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；貝斯特布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate)；地磷醯胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鳥胺酸(elformithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；埃博黴素(epothilone)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多醣；氯尼達明(lonidainine)；類美登素(maytansinoid)，例如美登素(maytansine)及安絲菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌；美得眠(mopidanmol)；硝基胺；噴司他汀(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基醯肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK®多醣複合物(JHS Natural Products, Eugene, Oreg.)；雷佐生(razoxane)；利索新(rhizoxin)；西左非蘭(sizofuran)；鍺螺胺(spirogermanium)；替奴佐酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2′,2″-三氯三乙胺；單端孢黴烯(trichothecene) (尤其T-2毒素、疣孢菌素A (verracurin A)、桿孢菌素A (roridin A)及蛇形菌素e (anguidine))；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine) (ELDISINE® 、FILDESIN® )；達卡巴嗪(達卡巴嗪)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加賽特辛(gacytosine)；阿糖胞苷(「Ara-C」)；噻替哌；類紫杉醇(taxoid)，例如TAXOL® 太平洋紫杉醇(paclitaxel) (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)、ABRAXANE™太平洋紫杉醇之無克列莫佛(Cremophor)、經白蛋白改造之奈米顆粒調配物(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Ill.)及TAXOTERE® 多西他賽(doxetaxel) (Rhône-Poulenc Rorer, Antony, France)；氮芥苯丁酸(chloranbucil)；吉西他濱(gemcitabine) (GEMZAR® )；6-硫鳥嘌呤；巰嘌呤；胺甲喋呤；鉑類似物，例如順鉑及卡鉑；長春鹼(VELBAN® )；鉑；依託泊苷(VP-16)；異環磷醯胺；米托蒽醌；長春新鹼(ONCOVIN® )；奧沙利鉑(oxaliplatin)；醛氫葉酸；長春瑞濱(vinorelbine) (NAVELBINE® )；能滅瘤(novantrone)；依達曲沙；道諾黴素；胺喋呤(aminopterin)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；拓樸異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；類視色素，例如視黃酸；卡培他濱(capecitabine) (XELODA® )；上述藥劑中任一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物；以及上述藥劑中之兩者或更多者之組合，例如環磷醯胺、多柔比星、長春新鹼及普賴蘇濃(prednisolone)之組合療法之縮寫CHOP及利用與5-FU及醛氫葉酸組合之奧沙利鉑(ELOXATIN™ )之治療方案的縮寫FOLFOX。 如本文所用之術語「細胞介素」包括(但不限於) Kiefer等人，2016, Immunol. Revs. 270:178-192中所列示之實例。實例性適宜細胞介素包括(但不限於) G-CSF、GM-CFS、IFNγ、IFNα、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-9、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-21、IL-23及TNF。 在一個實施例中，細胞介素經由離胺酸殘基之間之交聯連接至結合結構域。 術語「治療抗體」係可用於治療疾病之抗體。治療抗體之實例係埃達珠單抗(etaracizumab)、阿塔珠單抗(atlizumab)、托珠單抗(tocilizumab)、他妥珠單抗替塞坦(tacatuzumab tetraxetan)、魯利珠單抗(ruplizumab)、奧法木單抗(ofatumumab)、替非珠單抗(tefibazumab)、貝伐珠單抗(bevacizumab)、貝利木單抗(belimumab)、托西莫單抗(tositumomab)、布魯珠單抗(blontuvetmab)、美泊利單抗(mepolizumab)、拉貝珠單抗(labetuzumab)、阿西莫單抗(arcitumomab)、聚乙二醇化賽妥珠單抗(certolizumab pegol)、雷莫蘆單抗(ramucirumab)、TRBS07、西妥昔單抗(cetuximab)、比西單抗(biciromab)、奧妥珠單抗(obinutuzumab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、克立瓦妥珠單抗替塞坦(clivatuzumab tetraxetan)、沃圖莫單抗(votumumab)、紮木單抗(zanolimumab)、紮魯木單抗(zalutumumab)、阿達木單抗(adalimumab)、芳妥珠單抗(fontolizumab)、噴替酸阿托珠單抗(altumomab pentetate)、卡那單抗(canakinumab)、伊戈伏單抗(igovomab)、曲妥珠單抗艾坦辛(trastuzumab emtansine)、阿倫單抗(alemtuzumab)、羅維珠單抗(rovelizumab)、硫索單抗(sulesomab)、蘭尼單抗(ranibizumab)、FBTA05、貝妥莫單抗(bectumomab)、利妥昔單抗(rituximab)、依芬古單抗(efungumab)、吉妥珠單抗奧唑米星(gemtuzumab ozogamicin)、英西單抗(imciromab)、法索單抗(fanolesomab)、莫維珠單抗(motavizumab)、維西珠單抗(visilizumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、尼沃魯單抗(nivolumab)、莫羅單抗-cd3 (muromonab-cd3)、奧戈伏單抗(oregovomab)、依決洛單抗(edrecolomab)、地諾單抗(denosumab)、卡羅單抗噴替肽(capromab pendetide)、依法利珠單抗(efalizumab)、英利昔單抗(infliximab)、卡妥索單抗(catumaxomab)、吉瑞妥昔單抗(girentuximab)、阿昔單抗(abciximab)、厄馬索單抗(ertumaxomab)、巴利昔單抗(besilesomab)、戈利木單抗(golimumab)、巴利昔單抗(basiliximab)、依庫珠單抗(eculizumab)、優特克單抗(ustekinumab)、帕利珠單抗(palivizumab)、塔托單抗(tamtuvetmab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、帕圖莫單抗(pemtumomab)、那他珠單抗(natalizumab)、帕尼單抗(panitumumab)、諾莫單抗默噴坦(nofetumomab merpentan)、奧馬珠單抗(omalizumab)、伊匹單抗(ipilimumab)、達克珠單抗(daclizumab)、替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)。 如本文所用之「治療」係指試圖改變所治療個體或細胞之自然過程之臨床介入，且可用於預防或在臨床病理學過程期間實施。期望治療效應包括防止疾病發生或復發、緩解症狀、減少疾病之任何直接或間接病理結果、防止或降低發炎及/或組織/器官損害、降低疾病進展速率、改善或緩和疾病況態及緩解或改良預後。在一些實施例中，使用本發明抗體來延遲疾病或病症之發生。 用於治療目的之術語「哺乳動物」係指分類為哺乳動物之任何動物，包括人類、家畜及農場動物以及動物園動物、運動動物或寵物(例如狗、馬、貓、牛等)。在某些實施例中，哺乳動物係人類。 術語「有效量」係指在所需時間段內以所需劑量有效達成期望治療或預防結果之量。 如本文所用術語本發明之物質/分子之「治療有效量」可根據諸如以下等因素而變化：疾病狀態、個體之年齡、性別及體重以及物質/分子在個體內引發期望反應之能力。治療有效量亦為物質/分子之治療有益效應勝過其任何毒性或有害效應之量。「預防有效量」係指在所需時間段內以所需劑量有效達成期望預防結果之量。通常但未必，因預防劑量係在患病之前或患病早期用於個體中，故預防有效量將小於治療有效量。 如本文所用術語「預防有效量」係指在所需時間段內以所需劑量有效達成期望預防結果之量。通常但未必，因預防劑量係在患病之前或患病早期用於個體中，故預防有效量將小於治療有效量。 如本文所用之術語「醫藥上可接受之載劑」係適用於個體而無過度不良之副作用(例如毒性、刺激及過敏反應)並與合理益處/風險比相稱者。另外，在與醫藥組合物之其他成分相容之意義上，每一載劑必須為「可接受」。載劑可呈固體、半固體或液體稀釋劑、乳霜或膠囊形式。在與調配物之其他成分相容之意義上，載劑必須為「可接受」，且經選擇以最小化活性劑之任何降解並最小化個體中之任何不良副作用。 如本文所用之片語「實質上類似」、「實質上相同」、「等效」或「實質上等效」表示兩個數值(例如一個值與分子相關且另一值與參照/比較分子相關)之間具有足夠高相似度，使得熟習此項技術者會認為該兩個值之間之差異在藉由該等值(例如Kd 值、抗病毒效應等)所量測生物特徵之背景下具有較少或不具生物及/或統計學顯著性。該兩個值之間之差異係例如小於約50%、小於約40%、小於約30%、小於約20%及/或小於約10%，其隨參照/比較分子之值而變化。 如本文所用之片語「實質上減少」或「實質上不同」表示兩個數值(通常一個值與分子相關且另一值與參照/比較分子相關)之間具有足夠高差異度，使得熟習此項技術者會認為該兩個值之間之差異在藉由該等值(例如Kd 值)所量測生物學特徵之背景下具有統計學顯著性。該兩個值之間之差異係例如大於約10%、大於約20%、大於約30%、大於約40%及/或大於約50%，其隨參照/比較分子之值而變化。 術語相對於本文所鑑別出之胺基酸序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為，在比對序列並引入空位(若需要)以達成最大序列一致性百分數且不將任何保守取代視為序列一致性之一部分後，候選序列中與特定多肽序列中之胺基酸殘基一致之胺基酸殘基的百分比。出於確定序列一致性百分比之目的，比對可以熟習此項技術者所熟知之多種方式來達成，例如使用可公開獲得之電腦軟體，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可測定用於量測比對之適當參數，包括在所比較序列之全長範圍內達成最大比對所需之任何演算法。出於本文之目的，兩條胺基酸序列之間之序列比較係藉由國家生物技術資訊中心(Nation Center for Biotechnology Information，NCBI)在線提供之電腦程式Blastp (蛋白-蛋白BLAST)來達成。具體而言，給定胺基酸序列A與給定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性百分比(或者，其可表達為給定胺基酸序列A與給定胺基酸序列B具有某一胺基酸序列一致性%)係藉由下式如下計算： (X÷Y) × 100 % 其中在A與B之程式比對中由序列比對程式BLAST評定為一致性匹配之胺基酸殘基數，且其中Y係A或B (以較短者為准)中胺基酸殘基之總數。 相對於指定胺基酸序列之序列一致性或同源性在本文中定義為，在比對序列且引入空位(若需要)以達成最大同源性百分數且不將任何保守取代視為序列一致性之一部分後，候選序列中與指定殘基一致之胺基酸殘基之百分比。N末端、C末端或內部延伸、缺失或插入指定序列中皆不應理解為影響同源性。本發明中需要之所有序列比對皆為該等最大同源性比對。如本文所論述，預期蛋白質/多肽之胺基酸序列之微小變化涵蓋於本文所揭示且主張之本發明概念中，條件係胺基酸序列之變化維持至少80% (例如至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%)之變化。 涵蓋「保守修飾胺基酸取代」。保守修飾胺基酸取代係在其側鏈相關之胺基酸家族內進行之彼等。經遺傳編碼之胺基酸通常分成以下家族： (1) 酸性：天冬胺酸鹽(D)、麩胺酸鹽(E)； (2) 鹼性：離胺酸(K)、精胺酸(R)、組胺酸(H)； (3) 非極性：甘胺酸(G)、丙胺酸(A)、纈胺酸(V)、白胺酸(L)、異白胺酸(I)、脯胺酸(P)、苯丙胺酸(F)、甲硫胺酸(M)、色胺酸(W)；及 (4) 不帶電極性：天冬醯胺(N)、麩醯胺酸(Q)、半胱胺酸(C)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、酪胺酸(Y)。 更佳家族係： (3-1) 脂肪族：丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸； (3-2) 芳香族：苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸。 (4-1) 脂肪族-羥基：絲胺酸及蘇胺酸； (4-2) 含醯胺：天冬醯胺及麩醯胺酸； 舉例而言，合理地預期異白胺酸或纈胺酸對白胺酸、麩胺酸鹽對天冬胺酸鹽、絲胺酸對蘇胺酸之經分離取代或結構相關胺基酸對胺基酸之類似替代對所得分子之結合或性質不具主效應，尤其當取代不涉及框架位點內之胺基酸時。胺基酸變化是否產生功能肽可容易地藉由分析多肽衍生物之比活性來確定。蛋白質/多肽之片段或類似物可容易地由熟習此項技術者製備。片段或類似物之較佳胺基及羧基末端出現在功能結構域之邊界附近。亦可利用例如Creighton (1984) Proteins: Structure and Molecular Properties (第2版，1993), W.H. Freeman and Company中所述之原則系統地闡述胺基酸之其他各群。 在某些實施例中，保守胺基酸取代可包括與參照序列(例如CDR、VH、VL、框架、全長等)相差1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30或更多個經取代胺基酸殘基之序列同系物。 衍生物 本發明亦提供獲得特異性針對SSEA4之抗體之方法。該等抗體中之CDR並不限於表2及本文別處所鑑別出之特定VH 及VL 序列且可包括該等序列之保留特異性結合SSEA4能力之變體。該等變體可衍生自熟習此項技術者使用業內所熟知之技術在下文列示之序列及其保守取代。
Figure 106128500-A0304-0001
 在某些實施例中，本發明抗體包含包括H-CDR1、H-CDR2及H-CDR3序列之重鏈可變區及包括L-CDR1、L-CDR2及L-CDR3序列之輕鏈可變區，其中基於本文所述之較佳抗體或其保守修飾，該等CDR序列中之一或多者包含指定胺基酸序列，且其中該等抗體保留本發明抗SSEA4抗體之期望功能性質。因此，本發明提供經分離單株抗體或其抗原結合部分，其包含包括H-CDR1、H-CDR2及H-CDR3序列之重鏈可變區及包括L-CDR1、L-CDR2及L-CDR3序列之輕鏈可變區以及其經保守胺基酸取代之變體以及包含所有3個重鏈及/或輕鏈CDR之全長序列及其同系物。 經改造及經修飾抗體 本發明之抗體另外可使用具有本文所揭示之VH 及/或VL 序列中之一或多者之抗體作為起始材料來製備以改造經修飾抗體，該經修飾抗體可具有自起始抗體改變之性質。抗體可藉由修飾一或兩個可變區(即VH 及/或VL )內、例如一或多個CDR區內及/或一或多個框架區內之一或多個殘基來改造。另外或或者，抗體可藉由修飾恆定區內之殘基來改造，例如以改變抗體之效應物功能。 可實施之一類可變區改造係CDR移植。抗體與靶抗原主要經由位於六個重鏈及輕鏈互補決定區(CDR)中之胺基酸殘基相互作用。出於此原因，在個別抗體之間CDR內之胺基酸序列比CDR外之序列更多樣。由於CDR序列負責大部分抗體-抗原相互作用，故可藉由構築包括來自移植至具有不同性質之不同抗體之框架序列上之特異性天然抗體之CDR序列的表現載體表現模擬特異性天然抗體之性質的重組抗體(例如參見Riechmann, L.等人(1998)Nature 332:323-327；Jones, P.等人(1986)Nature 321:522-525；Queen, C.等人(1989)Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033；頒予Winter之美國專利第5,225,539號以及頒予Queen等人之美國專利第5,530,101號、第5,585,089號、第5,693,762號及第6,180,370號)。 因此，本發明之另一實施例係關於經分離單株抗體或其抗原結合部分，其包含包括H-CDR1、H-CDR2及H-CDR3序列之重鏈可變區及包括L-CDR1、L-CDR2及L-CDR3序列之輕鏈可變區。因此，該等抗體含有本文所述單株抗體之VH 及VL CDR序列，亦可含有不同於該等抗體之框架序列。 該等框架序列可自包括種系抗體基因序列之公共DNA數據庫或公開參考文獻來獲得。舉例而言，人類重鏈及輕鏈可變區基因之種系DNA序列可參見「VBase」人類種系序列數據庫(可在網際網路www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase上獲得)以及Kabat, E. A.等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國衛生及公共服務部(U.S. Department of Health and Human Services)，NIH公開號91-3242；Tomlinson, I. M.等人(1992) 「The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops」J. Mol. Biol. 227:776-798；及Cox, J. P. L.等人(1994) 「A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage」Eur. J. Immunol. 24:827-836；該等文獻各自之內容係以引用方式明確併入本文中。作為另一實例，人類重鏈及輕鏈可變區基因之種系DNA序列可參見基因庫數據庫。舉例而言，在HCo7 HuMAb小鼠中發現之以下重鏈種系序列可以下列隨附基因庫登錄號獲得：1-69 (NG_0010109、NT_024637及BC070333)、3-33 (NG_0010109及NT_024637)及3-7 (NG_0010109及NT_024637)。作為另一實例，在HCo12 HuMAb小鼠中發現之以下重鏈種系序列可以隨附基因庫登錄號獲得：1-69 (NG_0010109、NT_024637及BC070333)、5-51 (NG_0010109及NT_024637)、4-34 (NG_0010109及NT_024637)、3-30.3 (AJ556644)及3-23 (AJ406678)。 可將CDR1、CDR2及CDR3序列移植至具有與發現於衍生出框架序列之種系免疫球蛋白基因中之序列一致之序列的框架區上，或可將CDR序列移植至與種系序列相比含有一或多個突變之框架區上。舉例而言，已發現，在某些情況下，有益地突變框架區內之殘基以維持或增強抗體之抗原結合能力(例如，參見頒予Queen等人之美國專利第5,530,101號、第5,585,089號、第5,693,762號及第6,180,370號)。 另一類型之可變區修飾係突變每一各別重鏈或輕鏈CDR1、CDR2及/或CDR3區內之胺基酸殘基，藉此改良所關注抗體之一或多種結合性質(例如親和力)。可實施定點誘變或PCR介導之誘變以引入突變，且可在如本文所述且於實例中提供之活體外或活體內分析中評估對抗體結合之效應或所關注之其他功能性質。較佳引入保守修飾(如上文所論述)。突變可為胺基酸取代、添加或缺失，但較佳係取代。另外，通常改變CDR區內之不超過一個、兩個、三個、四個或五個殘基。 本發明之經改造抗體包括已對VH 及/或VL 內之框架殘基進行修飾以例如改良抗體性質之彼等。通常，該等框架修飾經製備以降低抗體之免疫原性。舉例而言，一種方式係將一或多個框架殘基「回復突變」成相應的種系序列。更具體而言，已經歷體細胞突變之抗體可含有與衍生出該抗體之種系序列不同之框架殘基。該等殘基可藉由比較抗體框架序列與衍生出該抗體之種系序列來鑑別。 除在框架或CDR區內進行之修飾外或或者，本發明抗體可經改造以包括Fc區內之修飾，通常以改變抗體之一或多種功能性質，例如血清半衰期、補體固定、Fc受體結合及/或抗原依賴性細胞毒性。另外，本發明抗體可經化學修飾(例如，可將一或多個化學部分附接至該抗體)或經修飾以改變其醣基化，以亦改變抗體之一或多種功能性質。 在另一實施例中，修改抗體之醣基化。舉例而言，可製備無醣基化抗體(即抗體缺少醣基化)。可改變醣基化以例如增加抗體對抗原之親和力。另外或或者，可製備具有經改變醣基化類型之抗體，例如具有降低量之岩藻糖基殘基之低岩藻糖基化抗體或具有增加之二等分GlcNac結構的抗體。已證實，該等經改變醣基化模式增加抗體之ADCC能力。 本發明所涵蓋本文抗體之另一修飾係聚乙二醇化。抗體可經聚乙二醇化以例如延長抗體之生物(例如血清)半衰期。為聚乙二醇化抗體，通常在其中一或多個PEG基團變得附接至抗體或抗體片段之條件下使抗體或其片段與聚乙二醇(PEG) (例如PEG之反應性酯或醛衍生物)反應。較佳地，聚乙二醇化係經由與反應性PEG分子(或類似反應性水溶性聚合物)之醯化反應或烷基化反應來實施。如本文所用之術語「聚乙二醇」意欲涵蓋PEG之已用於衍生其他蛋白質之任一形式，例如單(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-馬來醯亞胺。在某些實施例中，欲經聚乙二醇化之抗體係無醣基化抗體。聚乙二醇化蛋白質之方法為業內已知且可適用於本發明抗體。例如參見Nishimura等人之EP 0 154 316及Ishikawa等人之EP 0 401 384。 在改造本發明抗體之方法之某些實施例中，可沿抗PD-1抗體編碼序列之全部或一部分隨機或選擇性引入突變，且可針對結合活性及/或如本文所述之其他功能性質篩選所得經修飾抗SSEA4抗體。突變方法已於業內有所闡述。舉例而言，PCT公開案WO 02/092780簡短闡述使用飽和誘變、合成連接組裝或其組合產生及篩選抗體突變之方法。或者，Lazar等人之PCT公開案WO 03/074679闡述使用計算篩選方法最佳化抗體之物理化學性質之方法。 編碼本發明抗體之核酸分子 本發明之另一態樣係關於編碼本發明抗體之核酸分子。該等核酸可存在於完整細胞中，存在於細胞溶解物中，或以部分純化或實質上純淨之形式存在。當藉由標準技術實施純化以清除其他細胞組分或其他污染物(例如其他細胞核酸或蛋白質)時，核酸係「經分離」或「使得實質上純的」，該等標準技術包括鹼/SDS處理、CsCl顯帶、管柱層析、瓊脂糖凝膠電泳及業內熟知之其他方法。參見F. Ausubel等人編輯(1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York。本發明之核酸可為例如DNA或RNA且可含或可不含內含子序列。在較佳實施例中，核酸係cDNA分子。在某些實施例中，核酸係由載體表現。 本發明之核酸可使用標準分子生物學技術獲得。對於由雜交瘤(例如自攜載人類免疫球蛋白基因之轉基因小鼠製備之雜交瘤，如下文進一步闡述)表現之抗體，編碼藉由雜交瘤製備之抗體之輕鏈及重鏈的cDNA可藉由標準PCR擴增或cDNA選殖技術來獲得。對於自免疫球蛋白基因文庫(例如使用噬菌體展示技術)獲得之抗體，可自該文庫回收編碼該抗體之核酸。 本發明之實例性核酸分子係編碼實例性Ab6單株抗體之VH 及VL 胺基酸序列之彼等(參見表 2A-2D )。 框架區(FR)上含有實例性胺基酸取代之序列顯示於表2B中。與SSEA4及SSEA4表現細胞之結合活性之確認藉由如實例部分中所說明之結合分析展示。確認結合親和功能係保守的且甚至在各別實例性輕鏈及重鏈之框架上含有高達3/5胺基酸取代之實例性變體中得以保留。 CDR上含有實例性非保守修飾胺基酸取代之序列顯示於表2C中。與SSEA4及SSEA4表現細胞之結合活性之確認藉由如實例部分中所說明之結合分析展示。確認結合親和力及功能係保守的且在輕鏈及重鏈之CDR上含有以下非限制性實例性胺基酸取代(例如但不限於重鏈：A100R 、 N31S 、 T62A 。 輕鏈：S52Y )之實例性變體中得以保留。 CDR上含有實例性保守修飾胺基酸取代之序列顯示於表2D中。與SSEA4及SSEA4表現細胞之結合活性之確認藉由如實例部分中所說明之結合分析展示。確認結合親和力及功能係保守的且在輕鏈及重鏈之CDR上含有非限制性實例性胺基酸取代(例如但不限於重鏈：V50A 、 G53A 、 S35T 。輕鏈：V30I/A 、 G91A 、 Y94F )之實例性變體中得以保留表 2A ：實例性親代抗體 chAb6序列(No. 01x)
Figure 106128500-A0304-0002
 表 2B ：含有框架區修飾之實例性抗體實施例 hAb6-2序列(No.02x)
Figure 106128500-A0304-0003
 hAb6-3序列(No.03x)
Figure 106128500-A0304-0004
 表 2C ：含有非保守 CDR 修飾之實例性抗體實施例 hAb6-3.1序列(No.04x, H-CDR3:A100R)
Figure 106128500-A0304-0005
 hAb6-3.2序列(No.05x, H-CDR1:N31S及H-CDR3:A100R)
Figure 106128500-A0304-0006
 hAb6-3.3序列(No.06x, H-CDR2:T62A及H-CDR3:A100R)
Figure 106128500-A0304-0007
 hAb6-3.4序列(No.07x, L-CDR2:S52Y及H-CDR3:A100R)
Figure 106128500-A0304-0008
 表 2D ：含有保守 CDR 修飾之實例性抗體實施例 hAb6-3.101序列(No.08x, H-CDR2:V50A及H-CDR3:A100R)
Figure 106128500-A0304-0009
 hAb6-3.103序列(No.10x, H-CDR2:G53A及H-CDR3:A100R)
Figure 106128500-A0304-0010
 hAb6-3.105序列(No.12x, H-CDR1:S35T及H-CDR3:A100R)
Figure 106128500-A0304-0011
 hAb6-3.106序列(No.13x, L-CDR1:V30I及H-CDR3:A100R)
Figure 106128500-A0304-0012
 hAb6-3.107序列(No.14x, L-CDR1:V30A及H-CDR3:A100R)
Figure 106128500-A0304-0013
 hAb6-3.108序列(No.15x, L-CDR3:G91A及H-CDR3:A100R)
Figure 106128500-A0304-0014
 hAb6-3.110序列(No.17x, L-CDR3:Y94F及H-CDR3:A100R)
Figure 106128500-A0304-0015
 編碼本發明抗體或其抗原結合部分之核酸分子以及包含該等核酸之表現載體及包含該等表現載體之宿主細胞亦涵蓋於本發明中。另外，本發明提供包含人類免疫球蛋白重鏈及輕鏈轉基因之轉基因小鼠，其中小鼠表現本發明抗體，以及自該小鼠製備之雜交瘤，其中雜交瘤產生本發明抗體。 本發明單株抗體之產生 本發明之單株抗體(mAb)可藉由多種技術來產生，該等技術包括習用單株抗體方法，例如Kohler及Milstein (1975)Nature 256: 495之標準體細胞雜交技術。儘管體細胞雜交程序較佳，但原則上，可採用產生單株抗體之其他技術，例如B淋巴球之病毒或致癌轉變。 用於製備雜交瘤之較佳動物系統係鼠類系統。小鼠中之雜交瘤產生係已充分確立之程序。業內已知分離融合用免疫脾細胞之免疫方案及技術。亦已知融合配偶體(例如鼠類骨髓瘤細胞)及融合程序。 本發明之嵌合或人類化抗體可基於如上文所述製備之鼠類單株抗體之序列製備。編碼重鏈及輕鏈免疫球蛋白之DNA可自所關注鼠類雜交瘤獲得並使用標準分子生物學技術進行改造以含有非鼠類(例如人類)免疫球蛋白序列。舉例而言，為產生嵌合抗體，可使用業內已知方法將鼠類可變區連接至人類恆定區(例如，參見頒予Cabilly等人之美國專利第4,816,567號)。為產生人類化抗體，可使用業內已知方法(例如，參見頒予Winter之美國專利第5,225,539號以及頒予Queen等人之美國專利第5,530,101號、第5,585,089號、第5,693,762號及第6,180,370號)將鼠類CDR區插入人類框架中。 在實施例中，本發明抗體係人類單株抗體。可使用攜載人類免疫系統而非小鼠系統之部分之轉基因或轉染色體小鼠來生成針對SSEA4之該等人類單株抗體。該等轉基因及轉染色體小鼠包括在本文中分別稱為HuMAb小鼠及KM Mice™之小鼠，且在本文中統稱為「人類Ig小鼠」。 HuMAb小鼠(Medarex, Inc.)含有編碼非重排人類重鏈(µ及γ)及κ輕鏈免疫球蛋白序列以及使內源µ及κ鏈基因座不活化之靶突變的人類免疫球蛋白基因微小基因座(例如，參見Lonberg等人(1994) Nature 368(6474): 856-859)。因此，小鼠展現減少的小鼠IgM或K表現及免疫反應，所引入人類重鏈及輕鏈轉基因經歷類別轉換及體細胞突變以生成高親和力人類IgGK單株(Lonberg, N.等人(1994)，上文文獻；綜述於Lonberg, N. (1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101；Lonberg, N.及Huszar, D. (1995)Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93以及Harding, F.及Lonberg, N. (1995)Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546中)。HuMab小鼠及該等小鼠所攜載之基因體修飾之製備及使用進一步闡述於以下文獻中：Taylor, L.等人(1992)Nucleic Acids Research 20:6287-6295；Chen, J.等人(1993)International Immunology 5: 647-656；Tuaillon等人(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724；Choi等人(1993)Nature Genetics 4:117-123；Chen, J.等人(1993)EMBO J. 12: 821-830；Tuaillon等人(1994)J. Immunol. 152:2912-2920；Taylor, L.等人(1994)International Immunology 6: 579-591；及Fishwild, D.等人(1996)Nature Biotechnology 14: 845-851，其內容皆係全文以引用方式明確併入本文中。進一步參見皆頒予Lonberg及Kay之美國專利第5,545,806號；第5,569,825號；第5,625,126號；第5,633,425號；第5,789,650號；第5,877,397號；第5,661,016號；第5,814,318號；第5,874,299號；及第5,770,429號；頒予Surani等人之美國專利第5,545,807號；皆頒予Lonberg及Kay之PCT公開案第WO 92/03918號、第WO 93/12227號、第WO 94/25585號、第WO 97/13852號、第WO 98/24884號及第WO 99/45962號；及頒予Korman等人之PCT公開案第WO 01/14424號。 在另一實施例中，本發明之人類抗體可使用在轉基因及轉染色體上攜載人類免疫球蛋白序列之小鼠(例如攜載人類重鏈轉基因及人類輕鏈轉染色體之小鼠)產生。在本文中稱為「KM Mice™」之該等小鼠詳細闡述於頒予Ishida等人之PCT公開案WO 02/43478中。 另外，業內可獲得表現人類免疫球蛋白基因之替代性轉基因動物系統且可使用其來產生本發明之抗PD-1抗體。舉例而言，可使用稱為Xenomouse (Abgenix, Inc.)之替代性轉基因系統；該等小鼠闡述於例如頒予Kucherlapati等人之美國專利第5,939,598號；第6,075,181號；第6,114,598號；第6,150,584號及第6,162,963號中。 另外，業內可獲得表現人類免疫球蛋白基因之替代性轉染色體動物系統且可使用其來產生本發明之抗SSEA4抗體。舉例而言，可使用攜載人類重鏈轉染色體及人類輕鏈轉染色體二者之小鼠，稱為「TC小鼠」；該等小鼠闡述於Tomizuka等人(2000)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727中。另外，攜載人類重鏈及輕鏈轉染色體之牛已在業內加以闡述(Kuroiwa等人(2002)Nature Biotechnology 20:889-894)且可使用其來產生本發明之抗PD-1抗體。 本發明之人類單株抗體亦可使用噬菌體展示方法篩選人類免疫球蛋白基因文庫來製備。業內已建立分離人類抗體之該等噬菌體展示方法。參見例如：頒予Ladner等人之美國專利第5,223,409號；第5,403,484號；及第5,571,698號；頒予Dower等人之美國專利第5,427,908號及第5,580,717號；頒予McCafferty等人之美國專利第5,969,108號及第6,172,197號；以及頒予Griffiths等人之美國專利第5,885,793號；第6,521,404號；第6,544,731號；第6,555,313號；第6,582,915號及第6,593,081號。 本發明之人類單株抗體亦可使用SCID小鼠來製備，其中人類免疫細胞已經重構，使得可在免疫後生成人類抗體反應。該等小鼠闡述於例如頒予Wilson等人之美國專利第5,476,996號及第5,698,767號中。 產生本發明人類單株抗體之雜交瘤之生成 為生成產生本發明人類單株抗體之雜交瘤，可自免疫小鼠分離脾細胞及/或淋巴結細胞並融合至適當永生細胞系，例如小鼠骨髓瘤細胞系。所得雜交瘤可經篩選用於產生抗原特異性抗體。 產生本發明單株抗體之轉染瘤之生成 本發明之抗體亦可在宿主細胞轉染瘤中使用例如如業內所熟知之重組DNA技術及基因轉染方法之組合產生(例如Morrison, S. (1985)Science 229:1202)。 術語「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性」或「ADCC」係指一種形式的細胞毒性，其中結合至存在於某些細胞毒性細胞(例如自然殺手(NK)細胞、嗜中性球及巨噬細胞)上之Fc受體(FcR)之分泌性Ig會使該等細胞毒性效應細胞能夠特異性結合帶抗原之靶細胞且隨後利用細胞毒素殺死該靶細胞。抗體會「臂連」細胞毒性細胞，且為藉由此機制殺死靶細胞所必需。用於調介ADCC之原代細胞(NK細胞)僅表現FcγRIII，而單核球表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血細胞上之FcR表現匯總於Ravetch及Kinet,Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991)之第464頁表3中。為評價所關注分子之ADCC活性，可實施活體外ADCC分析，例如闡述於美國專利第5,500,362號或美國專利第5,821,337號中者。可用於該等分析之效應細胞包括末梢血單核細胞(PBMC)及天然殺手(NK)細胞。或者或另外，可在活體內(例如在諸如揭示於Clynes等人，PNAS USA 95:652-656 (1998)中之動物模型等動物模型中)評價所關注分子之ADCC活性。 術語「補體依賴性細胞毒性」或「CDC」係指在補體存在下靶細胞之溶解。經典補體路徑之活化係藉由補體系統之第一組分(C1q)與抗體(適當亞類)之結合來起始，該等抗體結合至其同族抗原。為評價補體活化，可實施CDC分析，例如如Gazzano-Santoro等人，J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)中所述。具有經改變Fc區胺基酸序列及增加或減小的C1q結合能力之抗體變體闡述於美國專利第6,194,551B1號及第WO99/51642號中。彼等專利公開案之內容以引用方式明確併入本文中。亦參見Idusogie等人，J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)。 術語「抑制生長」 (例如提及細胞，例如腫瘤細胞)意欲包括與抗SSEA4抗體接觸時與不與抗SSEA4抗體接觸之相同細胞之生長相比細胞生長之任何可量測之減緩，例如至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99%或100%的細胞培養物之生長抑制。細胞生長之該減緩可藉由多種機制(例如效應細胞吞噬作用、ADCC、CDC及/或細胞凋亡)發生。 在另一態樣中，本發明之特徵在於偶聯至治療部分(例如細胞毒素、藥物(例如，免疫抑制劑)或放射性毒素)之抗SSEA4抗體或其片段。 可偶聯至本發明抗體之治療性細胞毒素之其他實例包括倍癌黴素、卡奇黴素、美登素及奧裡斯他汀及其衍生物。卡奇黴素抗體偶聯物之實例在市面上有售(Mylotarg™; Wyeth-Ayerst)。 細胞毒素可使用連接體技術偶聯至本發明抗體。已用於偶聯細胞毒素與抗體之連接體類型之實例包括(但不限於)腙、硫醚、酯、二硫化物及含肽連接體。可選擇例如易於藉由溶酶體隔室內之低pH裂解或易於藉由蛋白酶(例如優先在腫瘤組織中表現之蛋白酶，例如細胞自溶酶(例如，細胞自溶酶B、C、D))裂解之連接體。 為進一步論述細胞毒素之類型，用於偶聯治療劑與抗體之連接體及方法亦參見Saito, G.等人(2003)Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215；Trail, P. A.等人(2003)Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337；Payne, G. (2003)Cancer Cell 3:207-212；Allen, T. M. (2002)Nat. Rev. Cancer 2:750-763；Pastan, I.及Kreitman, R. J. (2002)Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091；Senter, P. D.及Springer, C. J. (2001)Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264。 抗體-藥物偶聯物(ADC)可包括靶向化學治療分子，其藉由使強效細胞毒性藥物靶向表現抗原之腫瘤細胞(Teicher, B. A. (2009)Current Cancer Drug Targets 9:982-1004)組合抗體及細胞毒性藥物二者之性質，由此藉由最大化效能及最小化脫靶毒性來增強治療指數(Carter, P. J.及Senter P. D. (2008)The Cancer Jour. 14(3):154-169；Chari, R. V. (2008)Acc. Chem. Res. 41:98-107。 本發明之ADC化合物包括具有抗癌活性之彼等。在一些實施例中，ADC化合物包括偶聯、即共價附接至藥物部分之抗體。在一些實施例中，抗體經由連接體共價附接至藥物部分。本發明之抗體-藥物偶聯物(ADC)將有效劑量之藥物選擇性遞送至腫瘤組織，藉此可達成更大選擇性，即更低有效劑量，同時增加治療指數(「治療窗」)。 在某些實施例中，ADC具有式AB-(L-D)p，其中：AB係本文所述之抗體或結合片段，L係連接體；D係適宜細胞毒性藥物，且p可介於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更大範圍內。 適於ADC構築之實例性連接體「L」可包括選自由以下組成之群之「L」：6-馬來醯亞胺基己醯基(MC)、馬來醯亞胺基丙醯基(MP)、纈胺酸-瓜胺酸(val-cit)、丙胺酸-苯丙胺酸(ala-phe)、對胺基苄基氧基羰基(PAB)、4-(2-吡啶基硫基)戊酸N-琥珀醯亞胺基酯(SPP)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1甲酸N-琥珀醯亞胺基酯(SMCC)、(4-碘-乙醯基)胺基苯甲酸N-琥珀醯亞胺基酯(STAB)、葡萄糖醛酸苷酶受質及PEG。 抗體-藥物偶聯物(ADC)之藥物部分(D)可包括具有細胞毒性或細胞生長抑制效應之任一化合物、部分或基團。藥物部分可藉由包括(但不限於)以下機制賦予其細胞毒性及細胞生長抑制效應：微管蛋白結合、DNA結合或插入及RNA聚合酶、蛋白質合成及/或拓樸異構酶之抑制。實例性藥物部分包括(但不限於)類美登素、尾海兔素、奧裡斯他汀、卡奇黴素、吡咯并苯并二氮呯(PBD)、單甲基奧裡斯他汀E (MMAE)、單甲基奧裡斯他汀F (MMAF)、奈莫柔比星(nemorubicin)及其衍生物、PNU-159682、蒽環、倍癌黴素、長春花生物鹼、紫杉烷、單端孢黴烯、CC1065、喜樹鹼、依利奈法德(elinafide)及立體異構物、同電子排列體、其具有細胞毒性活性之類似物及衍生物。 本發明之抗體亦可偶聯至放射性同位素以生成細胞毒性放射性醫藥，亦稱為放射性免疫偶聯物。 雙特異性分子 在另一態樣中，本發明之特徵在於包含本發明之抗SSEA4抗體或其片段之雙特異性分子。本發明之抗體或其抗原結合部分可衍生或連接至另一功能分子，例如另一肽或蛋白質(例如另一抗體或針對一受體的配體)，以生成結合至至少兩個不同結合位點或靶分子之雙特異性分子。本發明之抗體事實上可衍生或連接至一個以上之其他功能分子，以生成結合至兩個以上不同結合位點及/或靶分子之多特異性分子；該等多特異性分子亦欲涵蓋於如本文所用之術語「雙特異性分子」中。為產生本發明之雙特異性分子，本發明之抗體可在功能上連接(例如藉由化學偶合、遺傳融合、非共價締合或其他方式)至一或多個其他結合分子，例如另一抗體、抗體片段、肽或結合模擬物，使得產生雙特異性分子。 醫藥組合物 在另一態樣中，本發明提供含有本發明單株抗體中之一者或組合或其抗原結合部分與醫藥上可接受之載劑調配在一起之組合物，例如醫藥組合物。該等組合物可包括本發明抗體或免疫偶聯物或雙特異性分子中之一者或組合(例如兩種或更多種不同者)。舉例而言，本發明之醫藥組合物可包含結合至靶抗原上之不同表位或具有互補活性之抗體(或免疫偶聯物或雙特異性分子)之組合。 本發明之醫藥組合物亦可以組合療法、即與其他藥劑組合投與。舉例而言，組合療法可包括本發明抗SSEA4抗體與至少一種其他抗發炎或免疫抑制劑之組合。可用於組合療法中之治療劑之實例更詳細闡述於下文關於本發明抗體之用途部分中。 如本文所用「醫藥上可接受之載劑」包括任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑及生理上相容之類似試劑。較佳地，載劑適於靜脈內、肌內、皮下、非經腸、脊柱或表皮投與(例如藉由注射或輸注)。端視投與途徑，可於材料中對活性化合物(即抗體、免疫偶聯物或雙特異性分子)進行包衣以保護化合物免受酸及可使化合物不活化之其他天然條件的作用。 本發明之醫藥化合物可包括一或多種醫藥上可接受之鹽。「醫藥上可接受之鹽」係指保留母體化合物之期望生物活性且不賦予任何不期望毒理學效應之鹽(例如，參見Berge, S. M.等人(1977)J. Pharm. Sci . 66:1-19)。該等鹽之實例包括酸加成鹽及鹼加成鹽。酸加成鹽包括源自無毒無機酸(例如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸及諸如此類)以及源自無毒有機酸(例如脂肪族單羧酸及二羧酸、經苯基取代之烷酸、羥基烷酸、芳香族酸、脂肪族及芳香族磺酸及諸如此類)之彼等。鹼加成鹽包括源自鹼土金屬(例如鈉、鉀、鎂、鈣及諸如此類)以及源自無毒有機胺(例如N,N′-二苄基乙二胺、N-甲基葡萄糖胺、氯普魯卡因(chloroprocaine)、膽鹼、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因及諸如此類)之彼等。 本發明之醫藥組合物亦可包括醫藥上可接受之抗氧化劑。醫藥上可接受之抗氧化劑之實例包括：(1)水溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸、半胱胺酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉及諸如此類；(2)油溶性抗氧化劑，例如棕櫚酸抗壞血酯、丁基化羥基苯甲醚(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚及諸如此類；及(3)金屬螯合劑，例如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸及諸如此類。 可用於本發明醫藥組合物中之適宜水性及非水性載劑之實例包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、聚乙二醇及諸如此類)及其適宜混合物、植物油(例如橄欖油)及可注射有機酯(例如油酸乙酯)。舉例而言，可藉由使用諸如卵磷脂等包衣材料、維持所需粒徑(在分散劑之情形下)及使用表面活性劑維持適當流動性。 該等組合物亦可含有佐劑，例如防腐劑、潤濕劑、乳化劑及分散劑。藉由上述滅菌程序並納入各種抗細菌及抗真菌劑(例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸及諸如此類)二者可確保防止微生物之存在。亦可期望在該等組合物中納入等滲劑，例如糖、氯化鈉及諸如此類。另外，可注射醫藥形式之長效吸收可藉由納入吸收延遲劑(例如單硬脂酸鋁及明膠)來實現。 醫藥上可接受之載劑包括無菌水溶液或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉劑。業內已知用於醫藥活性物質之該等介質及藥劑之使用。除與活性化合物不相容之任何習用介質或藥劑外，本發明涵蓋其於本發明醫藥組合物中之用途。該等組合物中亦可納入補充活性化合物。 治療組合物通常必須無菌且在製造及儲存條件下穩定。可將組合物調配成溶液、微乳液、脂質體或適於高藥物濃度之其他有序結構。載劑可為溶劑或分散介質，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及諸如此類)及其適宜混合物。可例如藉由使用諸如卵磷脂等包衣、維持所需粒徑(在分散劑之情形下)及使用表面活性劑維持適當流動性。在許多情形下，較佳可將等滲劑(例如糖、多元醇(例如甘露醇、山梨醇)或氯化鈉)納入組合物中。可注射組合物之長效吸收可藉由向組合物中納入吸收延遲劑(例如單硬脂酸鹽及明膠)來實現。 無菌可注射溶液可藉由以下步驟來製備：將所需量之活性化合物納入含有上文所列舉成分中之一者或組合(視需要)之適當溶劑中，隨後進行無菌微濾。通常，藉由將活性化合物納入含有基本分散介質及來自上文所列舉之彼等之所需其他成分之無菌媒劑中來製備分散液。在使用無菌粉劑製備無菌可注射溶液之情形下，較佳製備方法係真空乾燥及冷凍乾燥(凍乾)，其可自其預先經無菌過濾之溶液產生由活性成分加上任一額外期望成分構成之粉劑。 可與載劑材料組合產生單一劑型之活性成分之量將端視所治療個體及特定投與模式而變化。可與載劑材料組合產生單一劑型之活性成分之量通常為產生治療效應之組合物之量。通常，以100%計，在與醫藥上可接受之載劑之組合中，此量介於約0.01%至約99%活性成分、較佳約0.1%至約70%、最佳約1%至約30%活性成分範圍內。 投藥及劑量 對劑量方案進行調整以提供最佳期望反應(例如治療反應)。舉例而言，可投與單次濃注，可隨時間投與若干個分次劑量或可根據治療狀況之緊急程度所指示按比例減少或增加劑量。尤其有利的係將非經腸組合物調配成劑量單位形式以便於投與及劑量均勻性。如本文所用之劑量單位形式係指適於作為單位劑量供欲治療個體使用之物理離散單元；各單元含有預定量之活性化合物，此預定量經計算與所需醫藥載劑一起產生期望治療效應。本發明劑量單位形式之規格依賴於且直接取決於下列因素：(a) 活性化合物之獨特特徵及欲達成之特定治療效應，及(b) 複合該活性化合物以治療個體敏感性之技術中所固有之限制條件。 對於抗體之投與，劑量介於約0.0001 mg/kg至100 mg/kg、且更通常0.01 mg/kg至5 mg/kg宿主體重範圍內。舉例而言，劑量可為0.3 mg/kg體重、1 mg/kg體重、3 mg/kg體重、5 mg/kg體重或10 mg/kg體重或在1-10 mg/kg範圍內。實例性治療方案需要每週一次、每兩週一次、每三週一次、每四週一次、每月一次、每3個月一次或每3至6個月一次投與。本發明抗PD-1抗體之較佳劑量方案包括經由靜脈內投與1 mg/kg體重或3 mg/kg體重，其中抗體係使用以下投藥時間表中之一者給予：(i) 每四週共六個劑量，隨後每三個月；(ii) 每三週；(iii) 3 mg/kg體重一次，之後每三週1 mg/kg體重。 在一些方法中，同時投與兩種或更多種具有不同結合特異性之單株抗體，在該情形下所投與每一抗體之劑量在所指示範圍內。抗體通常係在多個情況下來投與。單一劑量之間之間隔可為例如每週、每月、每三個月或每年。間隔亦可如藉由量測患者之針對靶抗原之抗體血液含量所指示而不規則。在一些方法中，對劑量進行調整以達成約1-1000 µg/ml且在一些方法中約25-300 µg/ml之血漿抗體濃度。 或者，抗體可以持續釋放調配物來投與，在該情形下需要較不頻繁之投與。劑量及頻率端視抗體在患者中之半衰期而變化。一般而言，人類抗體顯示最長半衰期，其次為人類化抗體、嵌合抗體及非人類抗體。投與劑量及頻率端視治療為預防性抑或治療性而變化。在預防性應用中，以相對較不頻繁之間隔經較長時間段投與相對較低之劑量。一些患者在其餘生中持續接受治療。在治療性應用中，有時需要相對較短間隔之相對較高之劑量直至疾病進展減輕或終止為止，且較佳地直至患者顯示疾病症狀之部分或完全改善為止。此後，可向患者投與預防性方案。 本發明醫藥組合物中之活性成分之實際劑量值可有所變化以便獲得可有效達成對特定患者有期望治療反應之量的活性成分、組合物及投與模式，而對患者無毒。所選劑量值將端視多種藥物動力學因素而定，該等因素包括所用本發明特定組合物或其酯、鹽或醯胺之活性、投與途徑、投與時間、所用特定化合物之排泄速率、治療之持續時間、與所用特定組合物組合使用之其他藥物、化合物及/或材料、所治療患者之年齡、性別、體重、狀況、一般健康情況及先前病史及已為醫學技術中所熟知之類似因素。 本發明抗SSEA4抗體之「治療有效劑量」較佳可降低疾病症狀之嚴重程度，增加無疾病症狀期之頻率及持續時間或預防因感病性所致之損害或失能。舉例而言，對於腫瘤治療而言，「治療有效劑量」較佳相對於未治療個體將細胞生長或腫瘤生長抑制至少約20%、更佳至少約40%、甚至更佳至少約60%且更佳至少約80%。可在預測在人類腫瘤中之效能之動物模型系統中評估化合物抑制腫瘤生長之能力。或者，可藉由熟習此項技術者已知之分析檢驗化合物之抑制(例如活體外抑制)能力來評估組合物之此性質。治療有效量之治療化合物可減小腫瘤大小，或另外改善個體之症狀。熟習此項技術者能夠基於諸如以下等因素來確定該等量：個體大小、個體症狀之嚴重程度及所選具體組合物或投與途徑。 在另一態樣中，本發明提供包含抗SSEA4抗體之部件之醫藥套組，如本文所述。該套組亦可進一步包含用於治療過度增生性疾病(例如如本文所述之癌症)之說明書。在另一實施例中，抗SSEA4抗體可共包裝於單位劑型中，例如PD-1調節及/或CAR-T治療劑。 在另一態樣中，本發明提供可與任何其他「細胞療法」或授受性免疫治療方式組合投與之治療方法及組合物。實例性授受性免疫治療方式闡述於例如Maus等人，Annu. Rev. Immunol. 2014. 32:189-225中；且可包括嵌合抗原受體(CAR-T)療法、抗PD-1療法、抗PD-L1療法及抗CTL4療法等。 本發明組合物可使用業內已知之多種方法中之一或多者經由一或多個投與途徑投與。如熟習此項技術者應瞭解，投與途徑及/或模式應視期望結果而變化。本發明抗體之較佳投與途徑包括靜脈內、肌內、皮內、腹膜內、皮下、脊柱或其他非經腸投與途徑，例如藉由注射或輸注。如本文所用之片語「非經腸投與」意指除經腸及局部投與外之投與模式，通常藉由注射，且包括(但不限於)靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內、硬膜外及胸骨內注射及輸注。 或者，本發明抗體可經由腸道途徑投與，例如局部、表皮或黏膜投與途徑，例如經鼻內、經口、經陰道、經直腸、經舌下或經局部。 活性化合物可利用保護化合物免於快速釋放之載劑製備，例如受控釋放調配物，包括植入物、經皮貼劑及微囊封遞送系統。可使用生物可降解之生物相容聚合物，例如乙烯基乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯及聚乳酸。用於製備該等調配物之許多方法已獲得專利權或通常為熟習此項技術者已知。例如，參見Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems , J. R. Robinson編輯，Marcel Dekker, Inc., New York, 1978。 可使用業內已知之醫學器件投與治療組合物。舉例而言，在較佳實施例中，可使用無針皮下注射器件(例如揭示於美國專利第5,399,163號、第5,383,851號、第5,312,335號、第5,064,413號、第4,941,880號、第4,790,824號或第4,596,556號中之器件)投與本發明之治療組合物。可用於本發明中之熟知植入物及模組之實例包括：美國專利第4,487,603號，其揭示用於以可控速率分配藥劑之可植入微輸注幫浦；美國專利第4,486,194號，其揭示用於經由皮膚投與藥劑之治療器件；美國專利第4,447,233號，其揭示用於以精確輸注速率遞送藥劑之藥劑輸注幫浦；美國專利第4,447,224號，其揭示用於連續藥物遞送之可變流量可植入輸注裝置；美國專利第4,439,196號，其揭示具有多室隔室之滲透藥物遞送系統；及美國專利第4,475,196號，其揭示滲透藥物遞送系統。該等專利皆以引用方式併入本文中。熟習此項技術者已知許多其他該等植入物、遞送系統及模組。 在某些實施例中，本發明之人類單株抗體可經調配以確保在活體內之合理分佈。舉例而言，血腦障壁(BBB)排斥許多高度親水性化合物。為確保本發明之治療化合物穿過BBB (若需要)，可將其調配成例如脂質體形式。關於製造脂質體之方法參見例如美國專利第4,522,811號、第5,374,548號及第5,399,331號。脂質體可包含一或多個選擇性轉運至特定細胞或器官中之部分，由此增強靶向藥物遞送(例如參見V. V. Ranade (1989)J. Clin. Pharmacol. 29:685)。實例性靶向部分包括葉酸或生物素(例如，參見頒予Low等人之美國專利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人，(1988)Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038)；抗體(P. G. Bloeman等人(1995)FEBS Lett. 357:140；M. Owais等人(1995)Antimicrob. Agents Chemother . 39:180)；表面活性劑蛋白A受體(Briscoe等人(1995)Am. J. Physiol. 1233:134)；p120 (Schreier等人(1994)J. Biol. Chem. 269:9090)；亦參見K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994)FEBS Lett. 346:123; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994)Immunomethods 4:273。 本發明之用途及方法 本發明之抗體、抗體組合物及方法涉及多種活體外及活體內效用。在較佳實施例中，本發明抗體係人類抗體。舉例而言，可將該等分子活體外或離體投與培養物中之細胞，或例如活體內投與人類個體，以增強多種情況下之免疫性。因此，在一態樣中，本發明提供改良個體之ADCC反應之方法，其包含向個體投與本發明之抗體或其抗原結合部分，使得改良個體之ADCC反應。較佳地，反應得以增強、刺激或上調。 因此，在一實施例中，本發明提供抑制個體之腫瘤細胞生長之方法，其包含向該個體投與治療有效量之抗SSEA4抗體或其抗原結合部分。較佳地，抗體係人類抗SSEA4抗體(例如本文所述之人類抗SSEA4抗體中之任一者)。另外或或者，抗體可為嵌合或人類化抗SSEA4抗體。 在某些實施例中，本文所論述治療抗體之組合可以單一組合物形式於醫藥上可接受之載劑中同時投與，或以單獨組合物形式與醫藥上可接受之載劑中之每一抗體同時投與。抑制腫瘤生長之抗體 本文提供特異性結合至SSEA4或其衍生物之新穎重組抗SSEA4抗體及其用於抗腫瘤免疫療法(例如癌症治療)中之方法。結合至癌症抗原後，抗體可立即誘導抗體依賴性細胞介導之細胞毒性，活化補體系統，及抑制腫瘤生長。 在一個實施例中，SSEA4在多個腫瘤細胞上高表現，該等腫瘤細胞包括腦瘤細胞、肺腫瘤細胞、乳房腫瘤細胞、口腫瘤細胞、食道腫瘤細胞、胃腫瘤細胞、肝腫瘤細胞、膽管腫瘤細胞、胰臟腫瘤細胞、結腸腫瘤細胞、腎腫瘤細胞、子宮頸腫瘤細胞、卵巢腫瘤細胞、前列腺腫瘤細胞。 在一個實施例中，單株抗SSEA4抗體特異性結合至SSEA4分子。 在一個實施例中，包含本文所述抗SSEA4抗體之組合物可用於抗癌療法中。具體而言，本實施例提供特異性抗SSEA4抗體之互補決定區(CDR)序列，其可用於多個抗SSEA4結合部分中。具體而言，本發明提供能夠結合至SSEA4或其衍生物之人類化或嵌合抗體或其抗原結合片段。 在某些實施例中，CDR序列係由Kabat方法定義。 在某些實施例中，抗SSEA4抗體具有抑制腫瘤生長之活性。 在某些實施例中，經分離抗SSEA4抗體係單株抗體。針對SSEA4之單株抗體可根據業內之知識及技能製得。舉例而言，其可藉由向測試個體注射人類胚胎癌細胞且然後分離具有期望序列或功能特徵之雜交瘤表現抗體來製得。 在一個實施例中，本發明提供結合至SSEA4之經分離單株抗體或其抗原結合部分，其中在靶結合時抗體具有CDC誘導活性。 在一個實施例中，本發明提供結合至SSEA4之經分離單株抗體或其抗原結合部分，其中在靶結合時抗體具有ADCC誘導活性。 在一態樣中，本發明提供經分離單株抗體或其抗原結合片段，其包含：(i) 選自SEQ ID No. 13、23、33、43、53、63、73、83、103、123、133、143、153及173之重鏈可變區、或其至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之保守序列同系物；及(ii) 選自SEQ ID No. 18、28、38、48、58、68、78、88、108、128、138、148、158及178之輕鏈可變區、或其至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之保守序列同系物。 在一態樣中，本發明提供經分離單株抗體或其抗原結合片段，其包含：(i) 選自SEQ ID No. 13、23、33、43、53、63、73、83、103、123、133、143、153及173之重鏈可變區或其含有少於或等於15個、14個、13個、12個、11個、10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個或1個胺基酸取代之保守序列同系物；及(ii) 選自SEQ ID No. 18、28、38、48、58、68、78、88、108、128、138、148、158及178之輕鏈可變區或其含有少於或等於15個、14個、13個、12個、11個、10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個或1個胺基酸取代之保守序列同系物。 在一個實施例中，經分離單株抗體或其抗原結合片段進一步包含：(i) 選自SEQ ID No. 13、23、33、43、53、63、73、83、103、123、133、143、153及173之重鏈可變區或其80%或更保守之序列同系物，其分別進一步包含選自SEQ ID No. 10、40、50、60、70、80、100、120、130、140、150及170之H-CDR1或其含有少於或等於5個、4個、3個、2個或1個胺基酸取代之保守序列同系物；選自SEQ ID No. 11、41、51、61、71、81、101、121、131、141、151及171之H-CDR2或其含有少於或等於5個、4個、3個、2個或1個胺基酸取代之保守序列同系物；選自SEQ ID No: 12、42、52、62、72、82、102、122、132、142、152及172之H-CDR3或其含有少於或等於5個、4個、3個、2個或1個胺基酸取代之保守序列同系物，及(ii) 選自SEQ ID No. 18、28、38、48、58、68、78、88、108、128、138、148、158及178之輕鏈可變區或其80%或更保守之序列同系物，其進一步包含選自SEQ ID No. 15、45、55、65、75、85、105、125、135、145、155及175之L-CDR1或其含有少於或等於5個、4個、3個、2個或1個胺基酸取代之保守序列同系物；及選自SEQ ID No. 16、46、56、66、76、86、106、126、136、146、156及176之L-CDR2或其含有少於或等於5個、4個、3個、2個或1個胺基酸取代之保守序列同系物、及選自SEQ ID No: 17、47、57、67、77、87、107、127、137、147、157及177之L-CDR3或其含有少於或等於5個、4個、3個、2個或1個胺基酸取代之保守序列同系物。 在一個實施例中，經分離單株抗體或其抗原結合片段，其包含：(i) 選自SEQ ID No. 13、23、33、43、53、63、73、83、103、123、133、143、153及173之重鏈可變區或其含有少於10個胺基酸取代之保守序列同系物，其分別進一步包含選自SEQ ID No. 10、40、50、60、70、80、100、120、130、140、150及170之H-CDR1；選自SEQ ID No. 11、41、51、61、71、81、101、121、131、141、151及171之H-CDR2、選自SEQ ID No: 12、42、52、62、72、82、102、122、132、142、152及172之H-CDR3，及(ii) 選自SEQ ID No. 18、28、38、48、58、68、78、88、108、128、138、148、158及178之輕鏈可變區或其含有少於10個胺基酸取代之保守序列同系物，其進一步包含選自SEQ ID No. 15、45、55、65、75、85、105、125、135、145、155及175之L-CDR1；及選自SEQ ID No. 16、46、56、66、76、86、106、126、136、146、156及176之L-CDR2、及選自SEQ ID No: 17、47、57、67、77、87、107、127、137、147、157及177之L-CDR3。 在一態樣中，本發明提供經分離單株抗體或其抗原結合片段，其包含：(i) 選自SEQ ID No. 13、23、33、43、53、63、73、83、103、123、133、143、153及173之重鏈可變區，及(ii) 選自SEQ ID No. 18、28、38、48、58、68、78、88、108、128、138、148、158及178之輕鏈可變區或其含有少於10個胺基酸取代之保守序列同系物，其進一步包含選自SEQ ID No. 15、45、55、65、75、85、105、125、135、145、155及175之L-CDR1；及選自SEQ ID No. 16、46、56、66、76、86、106、126、136、146、156及176之L-CDR2、及選自SEQ ID No: 17、47、57、67、77、87、107、127、137、147、157及177之L-CDR3。 在一態樣中，本發明提供經分離單株抗體或其抗原結合片段，其包含：(i) 選自SEQ ID No. 13、23、33、43、53、63、73、83、103、123、133、143、153及173之重鏈可變區或其含有少於10個胺基酸取代之保守序列同系物，其分別進一步包含選自SEQ ID No. 10、40、50、60、70、80、100、120、130、140、150及170之H-CDR1；選自SEQ ID No. 11、41、51、61、71、81、101、121、131、141、151及171之H-CDR2、選自SEQ ID No: 12、42、52、62、72、82、102、122、132、142、152及172之H-CDR3，及(ii) 選自SEQ ID No. 18、28、38、48、58、68、78、88、108、128、138、148、158及178之輕鏈可變區。 在一態樣中，本發明提供經分離單株抗體或其抗原結合片段，其包含如表2A-2D中之每一變體中所示之各別相應VH、VL及各別H-CDR及L-CDR。 如本文所用，同系物或保守序列同系物可包括靶向SSEA4之經分離單株抗體或其抗原結合片段，其包含與如本文所揭示之參照序列相比具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性及/或與參照序列相比具有少於或等於40個、39個、38個、37個、36個、35個、34個、33個、32個、31個、30個、29個、28個、27個、26個、25個、24個、23個、22個、21個、20個、19個、18個、17個、16個、15個、14個、13個、12個、11個、10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個或1個胺基酸取代的各別相應VH、VL及各別H-CDR及L-CDR。 在某些實施例中，抗SSEA4抗體係單株抗體。 在某些實施例中，抗SSEA4抗體係嵌合或人類化抗體。 在一態樣中，框架序列衍生自人類共有框架序列或人類種系框架序列。 在另一態樣中，重鏈可變結構域、抗體或抗原結合片段進一步包含至少CH 1結構域。 在另一態樣中，重鏈可變結構域、抗體或抗原結合片段進一步包含CH 1、CH 2及CH 3結構域。 在另一態樣中，可變區輕鏈、抗體或抗體片段進一步包含CL 結構域。 在另一態樣中，抗體進一步包含CH 1、CH 2、CH 3及CL 結構域。 在另一特定態樣中，抗體進一步包含人類或鼠類恆定結構域。 在另一態樣中，人類恆定區選自由以下組成之群：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。 在另一態樣中，核酸進一步包含適於表現編碼任一前述抗SSEA4抗體之核酸之載體。在另一特定態樣中，載體進一步包含適於表現核酸之宿主細胞。在另一特定態樣中，宿主細胞係真核細胞或原核細胞。在特定態樣中，真核細胞係哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)。在另一態樣中，細胞係酵母細胞。 在實施例中，本發明提供製備抗SSEA4抗體或抗原其結合片段之方法，其包含在適於產生該抗體或片段之條件下以適於表現之形式培養含有編碼任一前述抗SSEA4抗體或抗原結合片段之核酸之宿主細胞，及回收該抗體或片段。 在實施例中，本發明提供組合物，其包含如本文所提供之抗SSEA4抗體或其抗原結合片段及至少一種醫藥上可接受之載劑。 在一態樣中，本發明提供結合至SSEA4之經分離單株抗體或其抗原結合部分，其中在靶結合時抗體具有ADCC及CDC誘導活性。 本文所述之任一抗體可為全長抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，抗原結合片段係Fab片段、F(ab')2 片段或單鏈Fv片段。在一些實施例中，抗原結合片段係Fab片段、F(ab')2 片段或單鏈Fv片段(scFv)。在一些實施例中，經分離抗體係人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體或單鏈抗體。 本文所述之任一抗體具有以下一或多種特徵： a)係重組抗體、單株抗體、嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體、抗體片段、雙特異性抗體、單特異性抗體、單價抗體、IgG抗體或抗體之衍生物；b)係人類、鼠類、人類化或嵌合抗體、抗體之抗原結合片段或衍生物；c)係單鏈抗體片段、多抗體、Fab片段及/或免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、IgE、IgD同型及/或其子類；d)具有以下特徵中之一或多者：(i)調介癌細胞之ADCC及/或CDC；(ii)誘導及/或促進癌細胞之細胞凋亡；(iii)抑制癌細胞之靶細胞增殖；(iv)誘導及/或促進癌細胞之吞噬作用；及/或(v)誘導及/或促進細胞毒性劑之釋放；e)特異性結合腫瘤相關碳水化合物抗原，其係腫瘤特異性碳水化合物抗原；f)不結合在非癌細胞、非腫瘤細胞、良性癌細胞及/或良性腫瘤細胞上表現之抗原；及/或g)特異性結合在癌症幹細胞及正常癌細胞上表現之腫瘤相關碳水化合物抗原。 抗體適於以高親和力(低KD 值)結合至其靶表位，且較佳地KD 介於萘莫耳濃度或更低範圍內。親和力可藉由業內已知之方法(例如表面電漿共振)來量測。 在某些實施例中，實例性抗SSEA4抗體或抗原結合片段藉由與一或多種細胞毒性劑、化學治療劑或治療抗體組合抑制或減緩腫瘤生長。 在實施例中，本發明提供包含融合至或藉由間隔體連接至T細胞結合分子(包括但不限於抗CD3抗體或其抗原結合片段)之實例性抗SSEA4抗體或其抗原結合片段之雙特異性抗體之組合物。 在另一實施例中，本發明提供包含以下各項之嵌合抗原受體(CAR)之組合物：含有實例性抗SSEA4抗體或其抗原結合片段之細胞外結構域、使CAR錨定至細胞膜之跨膜結構域及在CAR與SSEA4接合後立即將活化信號傳遞至免疫細胞之細胞內結構域。CAR可遺傳/人工表現於免疫細胞(包括但不限於T細胞、NK細胞及NKT細胞)上以靶向並殺死表現SSEA4之癌細胞。 藉由以下實例進一步說明本發明，其不應理解為進一步限制本發明。本申請案通篇中所引用之所有圖及所有參考文獻、專利及公開專利申請案之內容皆以引用方式明確併入本文中。實例 實例 1. 檢測多個癌細胞系上之球系列鞘醣脂表現 在冰上，用50 μL FACS緩衝液(含有1% FBS之PBS溶液)中之0.5 μg Alexa Flour 488偶聯之抗SSEA3 mAb (MC-631)、抗SSEA4 mAb (MC813-70)或別藻藍蛋白(APC)偶聯之抗GloboH mAb (VK9，來自Philip O. Livingston, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York之饋贈)將多個癌細胞系(包括腦瘤細胞、肺腫瘤細胞、乳房腫瘤細胞、口腫瘤細胞、食道腫瘤細胞、胃腫瘤細胞、肝腫瘤細胞、膽管腫瘤細胞、胰臟腫瘤細胞、結腸腫瘤細胞、腎腫瘤細胞、子宮頸腫瘤細胞、卵巢腫瘤細胞、前列腺腫瘤細胞(表4))之細胞(1 × 105 )染色30 min。對於凝集素染色，將細胞在冰上在含有生物素化凝集素之凝集素結合緩衝液[1% BSA、0.5×不含Carbo之封阻緩衝液(Vector Laboratories)、2 mM MgCl2 、2 mM CaCl2 ]中培育30 min。用凝集素結合緩衝液洗滌兩次後，將細胞與鏈黴抗生物素蛋白-APC (1:500稀釋於FACS緩衝液中；Biolegend)一起培育。用200 μL FACS緩衝液洗滌兩次後，將細胞重懸浮於200 μL含有1 μg/mL碘化丙啶(PI)之FACS緩衝液中且經受分析。在FACSCanto (BD Biosciences)上用FACSDiva軟體(BD Biosciences)實施數據獲取，且使用FlowJo軟體(TreeStar)實施數據分析。對活的PI- 細胞設門以供分析。對於甲醇洗滌，在室溫下用PBS中之4% (wt/vol)多聚甲醛將細胞洗滌且固定15 min，然後在甲醇中培育10 min，隨後用特異性抗體染色。表 4. 腫瘤細胞系上之球系列鞘醣脂表現之列表 . 表現高球系列鞘醣脂之多種腫瘤細胞，例如腦瘤細胞、肺腫瘤細胞、乳房腫瘤細胞、口腫瘤細胞、食道腫瘤細胞、胃腫瘤細胞、肝腫瘤細胞、膽管腫瘤細胞、胰臟腫瘤細胞、結腸腫瘤細胞、腎腫瘤細胞、子宮頸腫瘤細胞、卵巢腫瘤細胞、前列腺腫瘤細胞。腫瘤細胞系中球系列鞘醣脂之表現 . 藉由流式細胞術測定球系列GSL之表現。將在流式細胞術中大於15%之總細胞呈陽性之細胞系標記為陽性。
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實例 2. 生成及產生實例性單株抗 SSEA4 抗體之代表性方法 採用雜交瘤技術來生成特異性針對及/或靶向SSEA4之單株抗體。舉例而言，以2週間隔向6週齡之雌性Balb/c小鼠(Biolasco, Taiwan)腹膜內注射三次107 個NCCIT細胞。在第3次免疫後一週收集血清，且藉由ELISA量測抗SSEA4 IgG及/或IgM抗體之效價。藉由使用經0.1 μg BSA偶聯之SSEA4包覆之96孔分析板實施ELISA。一週後，然後給予符合融合準則之小鼠107 個NCCIT細胞之最終加強免疫。在最終加強免疫後3天，殺死小鼠且使用該等小鼠之脾細胞生成雜交瘤。選擇對BSA偶聯之SSEA4呈陽性且對BSA呈陰性之雜交瘤純系來進一步亞選殖以確保每個雜交瘤純系衍生自單一細胞。在一個實例性運行中，自5,000個以上之純系選擇總共10個SSEA4陽性雜交瘤純系。在該等純系中，僅Ab6為IgG抗體，且其他皆為IgM抗體。藉由抗體同型套組進一步確定Ab6之子類，且結果顯示Ab6之同型為IgG3κ。測序後，對Ab6之鼠類可變區(VH 及VL )進行PCR擴增且將其亞選殖至含有人類IgG1恆定區(CH 及CL )之表現載體中以生成人類-小鼠嵌合抗體chAb6。實例 3. 藉由 ELISA 之實例性抗 SSEA4 抗體與 SSEA4 之結合 藉由ELISA測定實例性嵌合及人類化抗SSEA4抗體對SSEA4之結合親和力。簡言之，將抗體以所指示濃度稀釋於PBS中且然後在室溫下在96孔分析板中與BSA偶聯之SSEA4一起培育1小時。洗滌週期後，將HRP偶聯之山羊抗人類IgG抗體(1:10,000稀釋於PBS中，Jackson Immuno Research)添加至孔中且在室溫下再培育1小時。洗滌週期後，添加TMB ELISA受質(Abcam)用於顯色，且藉由添加等體積之2N H2 SO4 來終止反應。藉由M5 ELISA讀取器(Molecular Device)讀取O.D. 450 nm下之吸光度且記錄。(圖6A-6D)實例 4. chAb6 對胰臟癌細胞系 HPAC 之結合親和力 對於流式細胞術分析，在4℃下將5 × 105 個HPAC細胞與所指示濃度之chAb6在FACS緩衝液(1% FBS於PBS中)中一起培育30分鐘。藉由FACS緩衝液洗滌後，然後在4℃下將細胞與PE偶聯之山羊抗人類IgG抗體(1:250稀釋於FACS緩衝液中，Jackson Immuno Research)一起培育30分鐘。然後藉由BD FACSVerse流式細胞計數器分析抗SSEA4抗體與細胞之結合。(圖10A-10B) 實例5. 實例性抗 SSEA4 抗體之結合特異性 藉由使用含有152種化學合成聚醣之聚醣微陣列分析實例性抗SSEA4抗體之結合特異性(圖7)。簡言之，在37℃下將聚醣微陣列與所指示濃度之抗體一起培育1小時。藉由PBST (0.05% Tween 20於PBS中)洗滌後，然後在室溫下將聚醣微陣列與經FITC標記之山羊抗人類IgG抗體一起培育1小時。另一洗滌週期後，風乾聚醣微陣列且在635 nm下藉由微陣列螢光晶片讀取器(4000B, Genepix)掃描。然後藉由GenePix Pro-6.0 (Axon Instruments)分析數據。實例 6. chAb6 對胰臟腫瘤細胞系 HPAC 之抗體依賴性細胞毒性 (ADCC) 活性 首先將經鈣黃綠素AM標記之HPAC細胞(一種具有高SSEA4表現之人類胰臟腫瘤細胞系)與PBMC混合，然後添加所指示濃度之抗SSEA4抗體並在37℃下培育4 hr。培育後，收集培養物上清液且在ex.485 nm /em.535 nm下檢測，並將細胞毒性百分比計算為(實驗值 - 自發溶解)/(最大溶解 - 自發溶解) × 100。(圖12)實例 7. chAb6 對胰臟腫瘤細胞系 HPAC 之補體依賴性細胞毒性 (CDC) 活性 對於CDC分析，在37℃下將2×105 個HPAC細胞與15%之人類血清及所指示濃度之抗SSEA4抗體一起培育1小時。培育後，在室溫下藉由碘化丙啶(PI)將細胞染色5分鐘，且然後藉由BD FACSVerse流式細胞計數器計數並分析(圖15A)。實例 8. HPAC 異種移植物模型中實例性抗 SSEA4 抗體之活體內抗腫瘤效能 為評估實例性抗SSEA4抗體之活體內抗腫瘤效能，向8週齡之雄性CB17.SCID小鼠(Biolasco, Taiwan)皮下注射5×106 個HPAC細胞。在腫瘤形成且體積達到50 mm3 至100 mm3 的同時，將媒劑或實例性抗SSEA4抗體(20 mpk)每週兩次靜脈內注射至尾靜脈中。藉由用游標卡尺量測垂直腫瘤直徑、長度(L)及寬度(W)每週兩次監測腫瘤生長。藉由式V=LW2 /2計算腫瘤體積(V )。在第24天(移植後24天)，殺死小鼠以量測腫瘤重量。所有結果顯示為平均值 ± S.D. (對於每組n = 3)，且使用司徒頓T測試(Student’s t test)進行統計分析。(圖16A-16B)實例 9. 藉由使用實例性 chAb6 檢測腫瘤組織中之 SSEA4 表現 採用免疫組織化學(IHC)來檢測腫瘤組織中SSEA4之存在(圖19)。簡言之，首先在室溫下用10%中性緩衝福馬林(Sigma-Aldrich)將HPAC異種移植物腫瘤之冷凍切片固定10分鐘，且藉由在室溫下將切片於ddH2 O中之0.3%過氧化氫/0.1%疊氮化鈉中浸沒15 min來淬滅內源過氧化酶活性。洗滌週期(PBS 3次，每次5分鐘)後，在4℃下將切片與2 μg/mL之經FITC標記之chAb6或人類IgG1κ一起培育過夜。過夜培育後，然後洗滌切片且在室溫下與經HRP標記之山羊抗FITC抗體(1:200, KPL)一起培育1小時。另一洗滌週期後，使用DAB受質(Vector laboratories)顯色，且使用蘇木素(Sigma-Aldrich)對比染色。 實例 10 病症之治療 可需要免疫反應強化之具有癌症風險或易患癌症之個體將受益於呈可溶形式之本發明SSEA4抗體之治療。最通常而言，在門診環境下藉由緩慢靜脈內(IV)輸注每週投與約0.1-10 mg/kg劑量來投與抗體。拮抗劑之適宜治療有效劑量由治療臨床醫師選擇且將大致介於1 μg/kg至20 mg/kg、1 μg/kg至10 mg/kg、1 μg/kg至1 mg/kg、10 μg/kg至1 mg/kg、10 μg/kg至100 μg/kg、100 μg至1 mg/kg及500 μg/kg至5 mg/kg範圍內。預期本發明SSEA4抗體將以每月一次或更小之頻率投與。治療持續時間可介於一個月與幾年之間。 為測試人類中抗體之臨床效能，鑑別出癌症個體且將其隨機化至治療組。治療組包括安慰劑組及1至3個SSEA4抗體(不同劑量)治療組。預期對個體隨訪1至3年。預期接受治療之個體將展現改良。實例 11 ：藉由表面電漿共振之實例性抗 SSEA4 抗體之動力學結合分析 . 使用Biacore T200系統藉由表面電漿共振(SPR)分析實例性抗SSEA4抗體之動力學結合。首先，將生物素化SSEA4固定於生物感測器晶片SA上。將代表性抗SSEA4抗體hAb6-3.1、hAb6-3及chAb6於運行緩衝液(含有0.05% Tween-20之1× PBS緩衝液，pH7.4)中連續稀釋至100 nM、33.3 nM、11.1 nM、3.7 nM、1.2 nM之濃度，且然後使用單週期模式以30 uL/min注射5 min。藉由BIA評估軟體實施參數分析。(圖5)實例 12 ： 藉由流式細胞術分析實例性抗 SSEA4 抗體與細胞之結合 對於流式細胞術分析，在4℃下將3 × 105 個癌細胞(例如乳癌細胞系MDA-MB-231、MCF7)與所指示濃度之實例性抗SSEA4抗體於FACS緩衝液(1%之FBS於PBS中)一起培育30分鐘。藉由FACS緩衝液洗滌後，然後在4℃下將細胞與PE或Alexa Fluor488偶聯之山羊抗人類IgG抗體(1:250至1:400稀釋於FACS緩衝液中，Jackson Immuno Research)一起培育30分鐘。然後藉由BD FACSVerse流式細胞計數器分析抗SSEA4抗體與細胞之結合。(參見圖9A-9B及圖11A-11F)實例 13 ： 實例性嵌合及人類化 Ab6 對乳房及胰臟癌細胞系之抗體依賴性細胞毒性 (ADCC) 活性 . 用20 uM鈣黃綠素AM將MDA-MB-231、MCF7及HPAC細胞標記30 min。洗滌後，將經鈣黃綠素-AM標記之靶細胞(1×104 個細胞/孔)與新鮮分離之人類PBMC (2.5×105 個細胞/孔，E/T比率 = 25/1)共培育，且在具或不具經連續稀釋之抗SSEA4抗體下處理4 hr。藉由M5 ELISA讀取器(ex. 485, em. 520)檢測鈣黃綠素-AM之釋放且用於評估相對細胞毒性。(圖13、圖14A-14B)實例 14 ： 實例性嵌合及人類化 Ab6 對乳房及胰臟癌細胞系之補體依賴性細胞毒性 (CDC) 活性 . 對於HPAC，在37℃下將2×105 個細胞與15%之人類血清及所指示濃度之抗SSEA4抗體一起培育1小時。培育後，在室溫下藉由碘化丙啶(PI)將細胞染色5分鐘，且然後藉由BD FACSVerse流式細胞計數器計數並分析。(圖15A) 對於MCF7，首先用20 uM之鈣黃綠素AM將細胞標記30 min。洗滌後，將經鈣黃綠素-AM標記之靶細胞(1×104 個細胞/分析)與10%之人類血清共培育，且在具或不具所指示濃度之抗SSEA4抗體下在37℃下處理2小時。藉由M5 ELISA讀取器(ex. 485, em. 520)檢測鈣黃綠素-AM之釋放且用於評估相對細胞毒性。(圖15B)實例 15 ： MDA-MB-231 異種移植物模型中抗 SSEA4 抗體之活體內抗腫瘤效能 為評估抗SSEA4抗體之活體內抗腫瘤效能，係8週齡之雌性Balb/c裸小鼠(NLAC, Taiwan)正位注射5×106 個MDA-MB-231細胞。在腫瘤形成且體積達到100 mm3 至150 mm3 的同時，將媒劑、賀癌平或抗SSEA4抗體(20 mpk)每週兩次靜脈內注射至尾靜脈中。藉由用游標卡尺量測垂直腫瘤直徑、長度(L)及寬度(W)每週兩次監測腫瘤生長。藉由式V=LW2 /2計算腫瘤體積(V )。所有結果顯示為平均值 ± SEM (對於每組n = 8)，且使用司徒頓T測試進行統計分析。(圖17)實例 16 ： MCF7 異種移植物模型中抗 SSEA4 抗體之活體內抗腫瘤效能 為建立MCF7異種移植物模型，在第1天向雌性Balb/c裸小鼠(8週齡，購自Biolasco, Taiwan)皮下植入17-β-雌二醇丸劑。將5百萬個MCF7細胞與基質膠混合，且然後正位注射至乳腺脂肪墊中。在腫瘤形成且體積達到150 mm3 至200 mm3 的同時，將媒劑或hAb6-3.1 (以所指示劑量)每週兩次靜脈內注射至尾靜脈中。藉由用游標卡尺量測垂直腫瘤直徑、長度(L)及寬度(W)每週兩次監測腫瘤生長。藉由式V=LW2 /2計算腫瘤體積(V )。所有結果顯示為平均值 ± SEM (對於每組n = 7)，且使用司徒頓T測試進行統計分析。(圖18)實例 17 ：研發醣基工程化 hAb6-3.1 之實例性方法 產生醣基工程化hAb6-3.1 經由與內源β-N-乙醯基胺基葡糖苷酶及岩藻糖苷酶共培育使實例性抗SSEA4抗體hAb6-3.1之聚醣水解成單GlcNAc形式。藉由在內源β-N-乙醯基胺基葡糖苷酶突變體存在下將萬能聚醣轉醣基化至單GlcNAc上、然後藉由rProtein A層析純化產生醣基工程化抗體。藉由SDS-PAGE及流式細胞術分析實施醣基工程化Ab6-3.1之表徵(分別為圖20及21)。 醣基工程化hAb6-3.1之活體外功能分析 顯示醣基工程化改良抗體對在免疫細胞上表現之Fcγ受體之結合親和力，此有助於免疫系統之保護功能。展示醣基工程化hAb6-3.1之Fcγ受體IIIA結合及ADCC功能(抗體依賴性細胞介導之細胞毒性)如下。 Fcγ 受體 IIIA 結合 將Fcγ受體IIIA塗覆於ELISA板上，且與所指示濃度之天然及醣基工程化抗體一起培育。然後藉由使用HRP偶聯之抗人類IgG H+L及TMB受質測定結合活性。(圖22)ADCC 分析 首先將經鈣黃綠素AM標記之MDA-MB-231細胞(一種具有高SSEA-4表現之人類三陰性乳癌細胞系)與PBMC混合，且然後添加所指示濃度之天然或醣基工程化抗SSEA-4抗體並在37℃下培育4小時。培育後，收集培養物上清液且在ex.485/em.535下檢測，並將細胞毒性百分比計算為：(實驗值 - 自發溶解)/(最大溶解 - 自發溶解) × 100。(圖23) 抗SSEA-4抗體之醣基工程化顯著增強抗體與Fcγ受體IIIA之結合，此與天然抗體相比改良抗體依賴性細胞毒性(ADCC)活性。實例 18 ：研發 / 形成抗體 - 藥物偶聯複合物之代表性方法 若干化學方法可用於抗體-藥物偶聯，例如離胺酸及半胱胺酸殘基上之硫醇-馬來醯亞胺形成(Lewis Phillips等人，2008)、硒基半胱胺酸殘基上之硒醇-馬來醯亞胺形成(Hofer等人，2009)、肟連接至經修飾Fc聚醣(Zhou等人，2014)、點擊化學(Axup等人，2012)、肼基-異-皮克特(Pictet)-施彭格勒(Spengler)連接至甲醯基甘胺酸殘基(Drake等人，2014)。吾人修改使用代表性肟連接至經修飾Fc聚醣作為本發明實例性ADC形成方法。在25℃下在抗體(8 mg/mL)及A01 (3 mM)存在下在100 mM乙酸鹽緩衝液(pH 4.5)中實施抗體上之經修飾聚醣與酬載化合物A1 (具有烷氧基胺可裂解連接體之細胞毒性藥物MMAE，M.W.: 1348.7265)之間之肟連接。將反應物培育48小時且藉由rProtein A、Capto S及Capto Q管柱相繼純化產物。藉由SDS-PAGE分析hAb6-3.1-A01複合物形成之結果(圖24A-B)。實例 19 ：藉由流式細胞術之 hAb6-3.1-A01 與 SSEA4 表現細胞之結合能力 用PBS洗滌SSEA4表現細胞系MCF7及SKOV3，且在冰上將1×105 個細胞與FACS緩衝液(含有2% FBS及0.1% NaN3 之PBS)中之10 ug/mL hAb6-3.1或hAb6-3.1-A01一起培育1 hr。用PBS洗滌後，用經Alexa-Fluor 488標記之抗人類IgG抗體對細胞染色且在冰上培育0.5 hr。藉由流式細胞術檢測抗體之細胞結合信號(圖XX11AB)。結果指示，hAb6-3.1-A01與SSEA4表現細胞之結合性質與親代抗體hAb6-3.1相似(圖25A-B)。實例 20 乳癌細胞系中之活體外細胞毒性分析 將MCF7 (一種表現SSEA4之乳癌細胞系)接種於96孔白色板(1×103 個細胞/孔)中且在37℃下培育過夜。用經連續稀釋之hAb6-3.1或hAb6-3.1-A01處理細胞且再培育5天。處理後，移除培養基且用CellTiter Glo試劑(Promega)處理細胞。培育10 min後，藉由ELISA讀取器(M5)檢測發光信號，且計算細胞存活率(將未處理細胞之信號設定為100%存活率)。 如圖26中所顯示，hAb6-3.1-A01以劑量依賴性方式發揮細胞毒性。ADC展現S型曲線，此指示特異性結合至靶SSEA-4。相比之下，單獨hAb6-3.1不具較大細胞毒性。此結果指示，ADC達成特異性及細胞毒性二者之優點。保持的細胞毒性將達成預期治療效應，同時特異性將靶向癌細胞且節省正常細胞，由此最小化不良效應。實例 21. 卵巢癌細胞系中之活體外細胞毒性分析 SKOV3 (一種表現SSEA4之卵巢癌細胞系)適用於展示hAb6-3.1-A01之效能。細胞毒性分析之方法闡述於實例20中。hAb6-3.1-A01展現對SKOV3奈莫耳濃度程度之更強效細胞毒性效能。 出於闡述及揭示例如該等公開案中所述可結合本發明使用之方法之目的，所鑑別出之所有專利及其他公開案皆以引用方式明確併入本文中。該等公開案僅因其揭示內容先於本申請案之申請日期而提供。絕不能由於揭示內容為先前發明或任何其他原因而解釋為承認本發明無權先於該揭示內容。所有關於日期之陳述或關於該等文件之內容之表述皆係基於申請者可獲得之資訊，且並不構成關於該等文件之日期或內容之準確性之任何承認。 除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語皆具有與熟習本發明所屬技術領域者通常所理解含義相同之含義。儘管任何已知方法、器件及材料皆可用於本發明之實踐或測試中，但本文闡述關於此之方法、器件及材料。
如本文所用，用於闡述聚醣及相關結構之符號、圖形及文本術語在業內充分確立及理解，包括例如Ajit Varki等人之「Symbols Nomenclatures for Glycan Representation 」, Proteomics. 2009年12月; 9(24): 5398-5399。圖 1A-1E. 1A ：代表性 Ab6 抗體及 / 或結合片段之 CDR 序列 . CDR序列分別係由Kabat、AbM、Chothia、Contact及IMGT方法來定義。圖1B：展示具有CDR修飾之抗SSEA4抗體. 圖1C：展示具有可變結構域修飾之抗SSEA4抗體. 圖1D. 展示具有非保守CDR修飾之抗SSEA4抗體：hAb6-3、hAb6-3.1/2/3/4之序列比對. 圖1E. 展示具有保守CDR修飾之抗SSEA4抗體：hAb6-3及hAb6-3.101/103/105/106/107/108/110之序列比對圖 2. 在可變結構域中具有 6 個或 10 個胺基酸取代之代表性人類化 Ab6 序列 . CDR區加下劃線且經取代胺基酸以粗體表示。圖 3. chAb6 重鏈可變結構域之 Kabat 編號 . 圖 4. chAb6 輕鏈可變結構域之 Kabat 編號 . 圖 5. 藉由表面電漿共振之實例性嵌合及人類化 Ab6 之動力學結合分析 . 使用Biacore系統測定hAb6-3.1、hAb6-3及chAb6之抗原結合親和力。hAb6-3.1、hAb6-3及chAb6之經計算Kd值分別為23.1 nM、17.8 nM及10.11 nM。圖 6A. 藉由 ELISA 測定一實例性 chAb6 與 SSEA4 之結合親和力 . 實例性嵌合Ab6 (chAb6)以劑量依賴性方式結合至SSEA4。chAb6與SSEA4之結合EC50 為約50 ng/mL。圖 6B. 藉由 ELISA 測定其他實例性嵌合及人類化 Ab6 與 SSEA4 之結合親和力 . 實例性嵌合及人類化Ab6以劑量依賴性方式結合至SSEA4。chAb6、hAb6-3及hAb6-3.1與SSEA4之結合EC50 分別為約106 ng/mL、125 ng/mL及98 ng/mL。圖 6C-6D. 圖 6C 表示展示非保守修飾胺基酸取代之結合親和力。圖 6D 表示展示保守修飾胺基酸取代之結合親和力。圖 7. 實例性 chAb6 與 SSEA4 之結合特異性 . 檢查chAb6針對各種寡醣之結合特異性且結果指示chAb6結合至SSEA4 (斑點A)及SSEA4類似物SSEA4 Gc (在SSEA4之胺基上經Gc取代之唾液酸，斑點B)。圖 8A-8B. chAb6 及人類化 Ab6 與乳癌細胞系之結合 . 藉由流式細胞術分析表徵chAb6、hAb6 (hAb6-2、hAb6-3)與(8A) MDA-MB-231及(8B) MCF-7之結合。圖 9A-9B ：實例性 chAb6 及人類化 Ab6 與乳癌細胞系之結合 . 藉由流式細胞術分析檢查chAb6、hAb6-2及hAb6-3與(a) MDA-MB-231及(b) MCF7細胞之結合。用於染色之抗體濃度為1微克/毫升。圖 10A-10B. 藉由流式細胞術分析測定實例性 chAb6 與胰臟癌細胞系 HPAC 之結合親和力 . (10A) 實例性嵌合Ab6 (chAb6, 20 μg/mL)以(如10B中所顯示)劑量依賴性方式以SSEA4高表現量結合至實例性胰臟腫瘤細胞系HPAC。與HPAC細胞之結合EC50 為約4 μg/mL。圖 11A-11B ：實例性嵌合及人類化 Ab6 與乳癌及胰臟癌細胞系之結合 . 藉由流式細胞術分析檢查chAb6、hAb6-3及hAb6-3.1與(11A) MDA-MB-231及(11B) HPAC細胞之結合。用於染色之抗體濃度為5微克/毫升。圖 11C- 圖 11D. 展示具有非保守CDR修飾之實例性人類化hAb6與MDA-MB-231 (11C)及MCF7 (11D)細胞系之結合.圖 11E- 圖 11F. 展示具有保守CDR修飾之實例性人類化hAb6與MDA-MB-231 (11E)及MCF7 (11F)細胞系之結合.圖 12. 展示實例性 chAb6 對胰臟腫瘤細胞系 HPAC 之 ADCC 活性 . 代表性chAb6以劑量依賴性方式誘導ADCC以殺死HPAC細胞。EC50 為5 ng/mL。使用人類IgG1κ (hIgG1κ)作為對照。圖 13. 實例性 chAb6 及人類化 Ab6 對 MDA-MB-231 細胞之 ADCC 活性 . 實例性 chAb6、hAb6以劑量依賴性方式調介ADCC以殺死MDA-MB-231細胞。chAb6及hAb6之EC50 分別為約5 ng/mL及10 ng/mL。圖 14A-14B ：實例性人類化 Ab6 對乳癌細胞系之 ADCC 活性 . 實例性hAb6-3及實例性hAb6-3.1二者皆以劑量依賴性方式調介ADCC以殺死(a) MDA-MB-231及(b) MCF7細胞。在此研究中，hAb6-3介導之殺死MDA-MB-231及MCF7之ADCC之EC50 分別為39.2 ng/mL及39.5 ng/mL。對於hAb6-3.1介導之殺死MDA-MB-231及MCF7之ADCC分別為32.6 ng/mL及38.9 ng/mL。圖 15A-15B. 15A ：展示實例性 chAb6 對 HPAC 細胞之 CDC 活性 . 代表性chAb6以劑量依賴性方式誘導CDC以殺死HPAC細胞。EC50 為3 μg/mL。在此研究中使用人類IgG1κ (hIgG1κ)作為陰性對照。15B ：展示實例性人類化 Ab6 對乳癌細胞系之 CDC 活性 . 實例性人類化抗SSEA4抗體hAb6-3及hAb6-3.1以劑量依賴性方式誘導CDC以殺死MCF7細胞。hAb6-3及hAb6-3.1之EC50 分別為約4.4 μg/mL及約2.6 μg/mL。圖 16A-16B. 展示在 HPAC 異種移植物模型中代表性抗 SSEA4 抗體之活體內抗腫瘤效能 . 與媒劑對照組相比，在經抗SSEA4抗體治療之小鼠中腫瘤之生長受顯著抑制。此外，如圖中所顯示，經chAb6治療之小鼠中之平均腫瘤體積(a)及重量(b)顯著小於經hMC41治療之彼等，此展示此實例性chAb6具有意外驚人的活體內抗腫瘤活性。圖 17. 展示在 MDA-MB-231 原位模型中實例性人類化 Ab6 之活體內抗腫瘤效能 . 與對照組(媒劑及賀癌平(Herceptin))相比，藉由用實例性抗SSEA4抗體hAb6-3及hAb6-3.1治療帶有腫瘤之小鼠顯著抑制活體內腫瘤生長。在此研究中使用賀癌平作為對照抗體。圖 18 ：展示在 MCF7 原位模型中實例性人類化 Ab6 之活體內抗腫瘤效能 . 與媒劑對照治療相比，在hAb6-3.1治療下腫瘤之生長以劑量依賴性方式受顯著抑制。圖 19 展示診斷效用：使用實例性 chAb6 檢測腫瘤組織中之 SSEA4 表現 . 免疫組織化學染色之結果顯示，chAb6可適用於檢測腫瘤樣品中之SSEA4表現。圖 20. 藉由 SDS-PAGE 表徵醣基工程化 hAb6-3.1. 泳道1，自哺乳動物細胞產生之天然抗體；泳道2，具有單-GlcNAc之抗體；泳道3-4，在30 min及60 min內產生之醣基工程化hAb6-3.1；泳道5，經純化醣基工程化抗體。圖 21. 藉由細胞流式細胞術測定醣基工程化 hAb6-3.1 之結合性質 . 醣基工程化抗體(紅線)展現與天然抗體(藍線)相似之與表現SSEA4之細胞系MDA-MB-231之結合性質。結果指示，醣基工程化並不影響hAb6-3.1之抗原結合性質。圖 22. Fcγ 受體 IIIA 結合 . hAb6-3.1與Fcγ受體IIIA之結合(EC50)藉由醣基工程化顯著增強。天然及醣基工程化抗體之EC50分別為0.84 μg (微克)/mL及0.047 μg (微克)/mL。圖 23. 天然及醣基工程化 hAb6-3.1 對 MDA-MB-231 細胞之 ADCC 活性 . 天然及醣基工程化hAb6-3.1二者皆以劑量依賴性方式調介ADCC以殺死MDA-MB-231細胞。hAb6-3.1之ADCC活性藉由醣基工程化顯著改良。天然及醣基工程化hAb6-3.1之EC50分別為約50.29 ng/ml及約6.02 ng/ml。圖 24A. (A) 將藥物肟連接至Fc聚醣上以形成ADC. (B) ADC複合物形成之SDS-PAGE特徵. 泳道1：標記物，泳道2：加hAb6-3.1之標籤之酮，泳道3：hAb6-3.1-A01圖 25A 及 25B . 比較hAb6-3.1與hAb6-3.1-A01之細胞結合性質圖 26. 比較hAb6-3.1-A01與抗體hAb6-3.1對表現SSEA4之乳房細胞系MCF7之細胞毒性之效能.圖 27. 比較hAb6-3.1-A01與抗體hAb6-3.1對表現SSEA4之卵巢細胞系SKOV3之細胞毒性之效能.
<110> 醣基生醫股份有限公司(CHO PHARMA,INC.)
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<151> 2016-08-22
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<223> 人工序列描述：合成肽
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Figure 106128500-A0305-02-0138-103
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Figure 106128500-A0305-02-0139-4
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Figure 106128500-A0305-02-0141-114
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Figure 106128500-A0305-02-0143-119
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Figure 106128500-A0305-02-0148-135
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<212> PRT
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Figure 106128500-A0305-02-0149-136
<210> 171
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列描述：合成肽
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Figure 106128500-A0305-02-0150-137
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Figure 106128500-A0305-02-0150-138
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 173
Figure 106128500-A0305-02-0150-139
Figure 106128500-A0305-02-0151-140
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<400> 174
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<210> 176
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 176
Figure 106128500-A0305-02-0151-142
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 177
Figure 106128500-A0305-02-0151-143
Figure 106128500-A0305-02-0152-144
<210> 178
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列描述：合成多肽
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Figure 106128500-A0305-02-0152-145
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<400> 179
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 181
Figure 106128500-A0305-02-0153-147
<210> 182
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 182
Figure 106128500-A0305-02-0153-150
<210> 183
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 183
Figure 106128500-A0305-02-0153-152
<210> 184
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列描述：合成肽
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Figure 106128500-A0305-02-0154-153
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 185
Figure 106128500-A0305-02-0154-154
<210> 186
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列描述：合成肽
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Figure 106128500-A0305-02-0154-155
<210> 187
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 187
Figure 106128500-A0305-02-0154-156
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 188
Figure 106128500-A0305-02-0155-157
<210> 189
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 189
Figure 106128500-A0305-02-0155-158
<210> 190
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<212> PRT
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<223> 人工序列描述：合成肽
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Figure 106128500-A0305-02-0155-160
<210> 191
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 191
Figure 106128500-A0305-02-0155-162
<210> 192
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 192
Figure 106128500-A0305-02-0156-163
<210> 193
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 193
Figure 106128500-A0305-02-0156-164
<210> 194
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 194
Figure 106128500-A0305-02-0156-166
Figure 106128500-A0305-02-0157-168
<210> 195
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 195
Figure 106128500-A0305-02-0157-169
Figure 106128500-A0305-02-0158-170
<210> 196
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 196
Figure 106128500-A0305-02-0158-171
<210> 197
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 197
Figure 106128500-A0305-02-0159-172

Claims (43)

  1. 一種經分離單株抗體或其抗原結合片段，其包含：(i)如SEQ ID No.10所示之H-CDR1，其中該SEQ ID No.10未經取代或該SEQ ID No.10之第1位置經Ser取代及/或第5位置經Thr取代；(ii)如SEQ ID No.11所示之H-CDR2，其中該SEQ ID No.11未經取代或該SEQ ID No.11之第1、4及/或13位置經Ala取代；(iii)如SEQ ID No：12所示之H-CDR3，其中該SEQ ID No.12未經取代或該SEQ ID No.12之第3位置經Arg取代；(iv)如SEQ ID No.15所示之L-CDR1，其中該SEQ ID No.15未經取代或該SEQ ID No.15之第6位置經Ile或Ala取代；(v)如SEQ ID No.16所示之L-CDR2，其中該SEQ ID No.16未經取代或該SEQ ID No.16之第3位置經Tyr取代；及(vi)如SEQ ID No：17所示之L-CDR3，其中該SEQ ID No.17未經取代或該SEQ ID No.17之第3位置經Ala取代及/或第6位置經Phe取代。
  2. 如請求項1經分離單株抗體或其抗原結合片段，其包含在CDR上之胺基酸取代，該取代選自重鏈上之A100R、N31S、T62A中之一或多者及/或輕鏈上之S52Y。
  3. 如請求項1之經分離單株抗體或其抗原結合片段，其包含CDR上之胺基酸取代，該取代選自重鏈上之V50A、G53A、S35T中之一或多者及/或輕鏈上之V30I/A、G91A、Y94F中之一或多者。
  4. 一種經分離單株抗體或其抗原結合片段，其包含：(i)SEQ ID No.13、23、33、43、53、63、73、83、103、123、133、143、153或173之重鏈可變結構域；及(ii)SEQ ID No.18、28、38、48、58、68、78、88、108、128、138、148、158或178之輕鏈可變結構域。
  5. 一種經分離單株抗體或其抗原結合片段，其包含：(i)SEQ ID No.10、40、50、60、70、80、100、120、130、140、150或170之H-CDR1；SEQ ID No.11、41、51、61、71、81、101、121、131、141、151或171之H-CDR2；及SEQ ID No：12、42、52、62、72、82、102、122、132、142、152或172之H-CDR3；及(ii)SEQ ID No.15、45、55、65、75、85、105、125、135、145、155或175之L-CDR1；SEQ ID No.16、46、56、66、76、86、106、126、136、146、156或176之L-CDR2；及SEQ ID No：17、47、57、67、77、87、107、127、137、147、157及177之L-CDR3。
  6. 一種經分離單株抗體或其抗原結合片段，其包含：(i)SEQ ID No.13、23、33、43、53、63、73、83、103、123、133、143、153或173之重鏈可變結構域；及(ii)SEQ ID No.15、45、55、65、75、85、105、125、135、145、155或175之L-CDR1；SEQ ID No.16、46、56、66、76、86、106、126、136、146、156或176之L-CDR2；及SEQ ID No：17、47、 57、67、77、87、107、127、137、147、157或177之L-CDR3。
  7. 一種經分離單株抗體或其抗原結合片段，其包含：(i)SEQ ID No.10、40、50、60、70、80、100、120、130、140、150或170之H-CDR1；SEQ ID No.11、41、51、61、71、81、101、121、131、141、151或171之H-CDR2；及SEQ ID No：12、42、52、62、72、82、102、122、132、142、152或172之H-CDR3；及(ii)SEQ ID No.18、28、38、48、58、68、78、88、108、128、138、148、158或178之輕鏈可變結構域。
  8. 一種經分離單株抗體或其抗原結合片段，其包含下述(1)至(14)中任一組之序列：(1)如SEQ ID No.10所示之H-CDR1；如SEQ ID No.11所示之H-CDR2；如SEQ ID No.12所示之H-CDR3；如SEQ ID No.13所示之重鏈可變結構域；如SEQ ID No.15所示之L-CDR1；如SEQ ID No.16所示之L-CDR2；如SEQ ID No.17所示之L-CDR3；及如SEQ ID No.18所示之輕鏈可變結構域；(2)如SEQ ID No.23所示之重鏈可變結構域；及如SEQ ID No.28所示之輕鏈可變結構域；(3)如SEQ ID No.33所示之重鏈可變結構域；及 如SEQ ID No.38所示之輕鏈可變結構域；(4)如SEQ ID No.40所示之H-CDR1；如SEQ ID No.41所示之H-CDR2；如SEQ ID No.42所示之H-CDR3；如SEQ ID No.43所示之重鏈可變結構域；如SEQ ID No.45所示之L-CDR1；如SEQ ID No.46所示之L-CDR2；如SEQ ID No.47所示之L-CDR3；及如SEQ ID No.48所示之輕鏈可變結構域；(5)如SEQ ID No.50所示之H-CDR1；如SEQ ID No.51所示之H-CDR2；如SEQ ID No.52所示之H-CDR3；如SEQ ID No.53所示之重鏈可變結構域；如SEQ ID No.55所示之L-CDR1；如SEQ ID No.56所示之L-CDR2；如SEQ ID No.57所示之L-CDR3；及如SEQ ID No.58所示之輕鏈可變結構域；(6)如SEQ ID No.60所示之H-CDR1；如SEQ ID No.61所示之H-CDR2；如SEQ ID No.62所示之H-CDR3；如SEQ ID No.63所示之重鏈可變結構域；如SEQ ID No.65所示之L-CDR1；如SEQ ID No.66所示之L-CDR2； 如SEQ ID No.67所示之L-CDR3；及如SEQ ID No.68所示之輕鏈可變結構域；(7)如SEQ ID No.70所示之H-CDR1；如SEQ ID No.71所示之H-CDR2；如SEQ ID No.72所示之H-CDR3；如SEQ ID No.73所示之重鏈可變結構域；如SEQ ID No.75所示之L-CDR1；如SEQ ID No.76所示之L-CDR2；如SEQ ID No.77所示之L-CDR3；及如SEQ ID No.78所示之輕鏈可變結構域；(8)如SEQ ID No.80所示之H-CDR1；如SEQ ID No.81所示之H-CDR2；如SEQ ID No.82所示之H-CDR3；如SEQ ID No.83所示之重鏈可變結構域；如SEQ ID No.85所示之L-CDR1；如SEQ ID No.86所示之L-CDR2；如SEQ ID No.87所示之L-CDR3；及如SEQ ID No.88所示之輕鏈可變結構域；(9)如SEQ ID No.100所示之H-CDR1；如SEQ ID No.101所示之H-CDR2；如SEQ ID No.102所示之H-CDR3；如SEQ ID No.103所示之重鏈可變結構域；如SEQ ID No.105所示之L-CDR1； 如SEQ ID No.106所示之L-CDR2；如SEQ ID No.107所示之L-CDR3；及如SEQ ID No.108所示之輕鏈可變結構域；(10)如SEQ ID No.120所示之H-CDR1；如SEQ ID No.121所示之H-CDR2；如SEQ ID No.122所示之H-CDR3；如SEQ ID No.123所示之重鏈可變結構域；如SEQ ID No.125所示之L-CDR1；如SEQ ID No.126所示之L-CDR2；如SEQ ID No.127所示之L-CDR3；及如SEQ ID No.128所示之輕鏈可變結構域；(11)如SEQ ID No.130所示之H-CDR1；如SEQ ID No.131所示之H-CDR2；如SEQ ID No.132所示之H-CDR3；如SEQ ID No.133所示之重鏈可變結構域；如SEQ ID No.135所示之L-CDR1；如SEQ ID No.136所示之L-CDR2；如SEQ ID No.137所示之L-CDR3；及如SEQ ID No.138所示之輕鏈可變結構域；(12)如SEQ ID No.140所示之H-CDR1；如SEQ ID No.141所示之H-CDR2；如SEQ ID No.142所示之H-CDR3；如SEQ ID No.143所示之重鏈可變結構域； 如SEQ ID No.145所示之L-CDR1；如SEQ ID No.146所示之L-CDR2；如SEQ ID No.147所示之L-CDR3；及如SEQ ID No.148所示之輕鏈可變結構域；(13)如SEQ ID No.150所示之H-CDR1；如SEQ ID No.151所示之H-CDR2；如SEQ ID No.152所示之H-CDR3；如SEQ ID No.153所示之重鏈可變結構域；如SEQ ID No.155所示之L-CDR1；如SEQ ID No.156所示之L-CDR2；如SEQ ID No.157所示之L-CDR3；及如SEQ ID No.158所示之輕鏈可變結構域；或(14)如SEQ ID No.170所示之H-CDR1；如SEQ ID No.171所示之H-CDR2；如SEQ ID No.172所示之H-CDR3；如SEQ ID No.173所示之重鏈可變結構域；如SEQ ID No.175所示之L-CDR1；如SEQ ID No.176所示之L-CDR2；如SEQ ID No.177所示之L-CDR3；及如SEQ ID No.178所示之輕鏈可變結構域。
  9. 如請求項1至8中任一項之經分離抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段係： a)嵌合抗體或其片段；或b)人類化抗體或其片段；或c)人類抗體或其片段；或d)選自由以下組成之群之抗原結合片段：Fab、Fab’、Fv、scFv、dsFv、F(ab)2、Fd及雙價抗體。
  10. 如請求項1至8中任一項之經分離抗體或抗原結合片段，其中該抗體係IgG。
  11. 如請求項1至8中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體結合靶或該結合片段靶係具有結構Neu5Ac α 2→3Gal β 1→3GalNAc β 1→3Gal α 1→4Gal β 1→4Glc β 1之碳水化合物抗原SSEA4。
  12. 如請求項1至8中任一項之經分離抗體或抗原結合片段，其中該抗體當結合至靶細胞時具有CDC及/或ADCC誘導活性。
  13. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至11中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段及醫藥上可接受之載劑。
  14. 如請求項13之醫藥組合物，其進一步包含一或多種治療劑。
  15. 如請求項14之醫藥組合物，其中該治療劑選自治療抗體、化學治療劑或細胞介素。
  16. 一種免疫偶聯物，其包含如請求項1至11中任一項之抗體及細胞毒性劑。
  17. 如請求項16之免疫偶聯物，其具有式AB-(L-D)p，其中：(a)AB係如請求項1至11中任一項之抗體；(b)L係連接體；(c)D係適宜細胞毒性藥物，且(d)p介於1至8範圍內。
  18. 如請求項17之免疫偶聯物(ADC)，其中該藥物係MMAE或MMAF。
  19. 如請求項17之免疫偶聯物，其中該連接體係可裂解連接體。
  20. 如請求項19之免疫偶聯物(ADC)，其中該可裂解連接體係烷氧基胺可裂解連接體。
  21. 一種醫藥調配物，其包含如請求項16至20中任一項之免疫偶聯物及醫藥上可接受之載劑。
  22. 如請求項21之醫藥調配物，其進一步包含另一治療劑。
  23. 一種經分離核酸(cDNA)，其編碼如請求項1至11中任一項之抗體。
  24. 一種宿主細胞，其包含如請求項23之核酸。
  25. 一種產生抗體之方法，其包含培養如請求項24之宿主細胞以使得產生該抗體。
  26. 一種抗體，其係藉由包含以下之步驟產生：(a)提供編碼3個具有以下序列之VL結構域CDR之核酸：選自SEQ ID No.15、45、55、65、75、85、105、125、135、145、155及175之L-CDR1；及選自SEQ ID No.16、46、56、66、76、86、106、126、136、146、156及176之L-CDR2、及選自SEQ ID No：17、47、57、67、77、87、107、127、137、147、157及177之L-CDR3；(b)組合編碼3個具有以下序列之VH結構域CDR之核酸譜系：選自SEQ ID No.10、40、50、60、70、80、100、120、130、140、150及170之H-CDR1；選自SEQ ID No.11、41、51、61、71、81、101、121、131、141、151及171之H-CDR2、選自SEQ ID No：12、42、52、62、72、82、102、122、132、142、152及172之H-CDR3；與編碼該3個VL結構域CDR之該核酸，以提供編碼該3個VL結構域CDR及3個VH結構域CDR之該譜系的核酸之產物譜系(c)表現該產物譜系之該等核酸；(d)選擇包含可變結構域之抗原結合片段，其可特異性結合至SSEA4且係表現自該產物譜系之該等核酸；及(e)產生包含該抗原結合片段之抗體。
  27. 一種如請求項13至15中任一項之醫藥組合物或如請求項21或22之醫藥調配物之用途，其用於製造用來治療患有SSEA4陽性癌症之個體之藥劑。
  28. 如請求項27之用途，其中該SSEA4陽性癌症選自腦癌、肺癌、乳癌、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽管癌、胰臟癌、結腸癌、腎癌、子宮頸癌、卵巢癌及前列腺癌。
  29. 如請求項27之用途，其中該藥劑進一步包含一或多種其他治療方式或藥劑，或與其組合使用。
  30. 如請求項29之用途，其中該組合治療方式選自治療抗體、細胞療法、輻射、細胞介素或化學治療劑。
  31. 一種如請求項13至15中任一項之醫藥組合物或如請求項21或22之醫藥調配物之用途，其用於製造用來抑制SSEA4陽性細胞增殖之藥劑，其中在容許該等抗體/片段/ADC與表現碳水化合物抗原之該細胞表面上之SSEA4結合之條件下將該細胞暴露於該藥劑，藉此抑制該細胞之增殖。
  32. 一種如請求項13至15中任一項之醫藥組合物或如請求項21或22之醫藥調配物之用途，其用於製造用來治療患有SSEA4陽性癌症之個體之藥劑，其中該SSEA4陽性癌症對第一治療劑有抗性。
  33. 如請求項32之用途，其中該SSEA4陽性癌症係腦癌、肺癌、乳癌、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽管癌、胰臟癌、結腸癌、腎癌、子宮頸癌、卵巢癌及/或前列腺癌。
  34. 如請求項32之用途，其中該第一治療劑包含結合除SSEA4以外之抗原的第一抗體/結合片段/ADC，及/或輻射及/或化學治療劑。
  35. 一種檢測生物樣品中之SSEA4之方法，其包含使該生物樣品與如請求項1至11中任一項之抗SSEA4抗體在容許該抗SSEA4抗體與天然SSEA4結合之條件下接觸，及檢測在該抗SSEA4抗體與該生物樣品中之天然SSEA4之間是否形成複合物。
  36. 如請求項35之方法，其中該生物樣品係癌症樣品。
  37. 一種如請求項1至14中任一項之抗SSEA4抗體之用途，其用於製備檢測SSEA4陽性癌症之製劑，其中該製劑之使用包含：(i)向患有或懷疑患有碳水化合物抗原表現腫瘤之個體投與該製劑，其包含如請求項1至11中任一項之抗SSEA4抗體，其中該抗體為經標記抗SSEA4抗體，及(ii)檢測該個體中之該經標記抗SSEA4抗體，其中檢測到該經標記抗SSEA4抗體指示該個體中之SSEA4陽性癌症。
  38. 一種檢測SSEA4陽性癌症之方法，其包含(i)使經標記抗SSEA4抗體與來自患有或懷疑患有碳水化合物抗原表現腫瘤之個體之樣品接觸，其中該經標記抗SSEA4抗體包含如請求項1至11中任一項之抗SSEA4抗體，及(ii)檢測該樣品中之該經標記抗SSEA4抗體，其中檢測到該經標記抗SSEA4抗體指示該樣品中之SSEA4陽性癌症。
  39. 如請求項1至8中任一項之經分離抗體，其中該抗體以小於10-7M之親和常數特異性結合至SSEA4。
  40. 如請求項1至8中任一項之經分離抗體，其中該抗體係IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
  41. 如請求項1至8中任一項之經分離抗體，其中該抗體係IgG1λ或IgG1κ。
  42. 如請求項1至8中任一項之單株抗體或其抗原結合部分，其中該單株抗體或其抗原結合部分以1×10-7M或更小之KD結合至SSEA4，且其中該KD係藉由表面電漿共振(Biacore)分析來量測。
  43. 如請求項42之經分離抗SSEA4抗體或其結合片段，其中結合親和力為<50nM。
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