DE69222303T2

DE69222303T2 - Kationisierte antikörper gegen intrazelluläre eiweisse

Info

Publication number: DE69222303T2
Application number: DE69222303T
Authority: DE
Inventors: Bernard Malfroy-Camine
Original assignee: Eukarion Inc
Current assignee: Eukarion Inc
Priority date: 1991-04-30
Filing date: 1992-04-30
Publication date: 1998-01-22
Anticipated expiration: 2012-05-01
Also published as: WO1992019971A1; EP0586515A1; DE69222303D1; EP0586515B1; ATE158415T1; AU1991592A; CA2109093A1; US6703019B1

Description

Grundlagen der Erfindung

Mitglieder der Lentivirus-Familie, zu der der humane Immunschwäche Virus Typ 1 (HIV-1) gehört, sind pathogene Retroviren, die in ihren tierischen Wirten chronische degenerative Krankheiten induzieren. Die genomische Organisation und Regulationsmechanismen der Lentivirus-Familie sind wesentlich komplexer befunden worden als die anderer Mitglieder der Retrovirus-Familie. Zum Beispiel codiert das HIV-1 Genom die Virion-Proteine Gag, Pol und Env, die allen replikationsfähigen Retroviren gemeinsam sind, zwei zusätzliche Proteine, die für die Virion-Morphogenese und Reifung (Vif und Vpu) notwendig sind, ein Protein unbekannter Funktion (Vpr) und drei nicht-strukturelle Regulationsproteine (Tat, Rev und Nef).
Die Tat und Rev Genprodukte sind transaktivierende Proteine, die die HIV-1 Genexpression mittels spezifischer Interaktion mit strukturierten viralen RNS-Ziel- Sequenzen regulieren. Aufgrund ihrer Bedeutung als potentielle Ziele für eine chemotherapeutische Inter vention bei HIV induzierten Krankheiten sind diese Transaktivatoren Gegenstand intensiver wissenschaftlicher Untersuchung gewesen.
Außer den Lentiviren codieren fast alle DNS-Viren transkriptionale Transaktivatoren der viralen Genexpression. Zum Beispiel codiert der humane T-Zell Leukämie-Virus Typ 1 (HTLV-1) einen als Tax bezeichneten transkriptionalen Aktivator, der wie das HIV-1 Tat-Protein agiert, um die virale Genexpression beträchtlich zu erhöhen. HTLV-1 codiert ebenfalls einen Transaktivator, als Rex bezeichnet, der für die Expression der unvollständig gespleißten mRNSn, die die Gag, Pol und Env HTLV 1 Genprodukte codieren, benötigt wird. Neuere Studien haben gezeigt, daß das HTLV-1 Rex-Protein das HIV-1 Rev- Polypeptid funktionell ersetzen und die Replikation eines Rev defizienten HIV-1 Provirus retten kann.
Obwohl derartige intrazelluläre Proteine als poten tielle Interventionsziele erkannt worden sind, sind Anstrengungen hinsichtlich dieses Ziels nicht erfolgreich gewesen. Ein wirksames Verfahren zum Zielen auf und Inaktivieren derartiger intrazellulärer Proteine wäre allgemein einsetzbar.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Zielen auf ein intrazelluläres Protein zur Interaktion mit einem Antikörper in einer Zelle durch in-Kontakt-Bringen der Zelle mit einem kationisierten Antikörper, der spezifisch an das intrazelluläre Protein bindet. Die spezifische Bindung des kationisierten Antikörpers an das intrazelluläre Protein kann verwendet werden, um verschiedene Ziele zu erreichen. Zum Beispiel kann die Bindung des Antikörpers an das intrazelluläre Protein verwendet werden, um mit der Aktivität des intrazellulären Proteins zu interferieren. Dies ist besonders wichtig, wenn die Aktivität des intrazellulären Proteins eine schädigende Wirkung auf die Wirtszelle besitzt. Dies ist beispielsweise bei dem HIV-1 codierten Tat-Protein der Fall.
Alternativ kann die spezifische Bindung des kationisierten Antikörpers an das intrazelluläre Protein in einem Verfahren zur Detektion des Vorhandenseins eines intrazellulären Proteins in einer Zelle verwendet werden. Für eine derartige Anwendung würde der kationisierte Antikörper mit einer detektierbaren Reportergruppe markiert werden.
Die Verfahren der Erfindung sind sowohl bei in vivo immuntherapeutischen oder diagnostischen Anwendungen als auch in der in vitro Forschung und in der diagnostischen Anwendung einsetzbar. Ein bevorzugtes in vivo immuntherapeutisches Verfahren kann zur Behandlung eines von einem Virus infizierten Individuums, zum Beispiel HIV-1, verwendet werden. Eine wirksame Menge eines kationisierten Antikörpers in einer pharmazeutisch geeigneten Formulierung wird dein Individuum verabreicht.
Die in der vorliegenden Anmeldung veröffentlichten Verfahren und Zusammensetzungen bieten einen neuen und wirksamen Ansatz für das Zielen auf ein intrazelluläres Protein, der auf der Entdeckung basiert, daß kationisierte Antikörper nicht notwendigerweise in den intrazellulären Vesikeln abgesondert werden, wenn sie von einer Zelle aufgenommen werden, was im Gegensatz zu der Lehrmeinung nach dem Stand der Technik steht.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Abbildung 1 zeigt die Ergebnisse einer reverse Transkriptase-Aktivitätstest.
Abbildung 2 ist ein Diagramm&sub1; das die Ergebnisse aus Experimenten darstellt, die die Wirkung von kationisiertem anti-Tat auf die Lebensfähigkeit von Virus-infizierten Zellen testen.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung des Anmelders beruht auf der Entdeckung, daß ein für das HIV-1 codierte Tat-Protein spezifischer kationisierter Antikörper effektiv die Replikation des HIV-1 Virus hemmt, wenn dieser Antikörper von infizierten Zellen aufgenommen wird. Diese Entdeckung war nach dem Stand der Technik (unten kurz besprochen) überraschend, denn kationisierte Proteine sollten in intrazelluläre Kompartimente abgesondert werden. Wenn die kationisierten anti-Tat Antikörper in intrazelluläre Vesikel abgesondert werden, wie der Stand der Technik behauptet, würden die Antikörper mit dem Tat-Protein, das im Cytoplasma produziert und in den Kern transportiert wird, nicht in Kontakt kommen.
Es ist auf dem Fachgebiet gut bekannt, daß die Passage kleiner polarer Moleküle durch die Plasmamembran von Transportproteinen vermittelt wird. Allerdings können diese Transportproteine Makromoleküle, wie beispielsweise Proteine, Polynucleotide oder Polysaccharide nicht transportieren. Der Mechanismus, mit dem eine Zelle derartige Makromoleküle aufnimmt oder sezerniert, beinhaltet erst die Bildung und dann Fusion Membran-gebundener Vesikel. Zum Beispiel beinhaltet die Verdauung das progressive Einschließen des Makromoleküls durch einen kleinen Teil der Plasmamembran, die sich zuerst einfaltet und dann abspaltet, um einen intrazellulären Vesikel, der das Makromolekül enthält, zu bilden. Die Sekretion eines Makromoleküls erfolgt mittels eines ähnlichen Mechanismus, außer daß ein intrazellulärer Vesikel gebildet wird, der mit der Zellmembran anschließend fusioniert und dabei die eingekapselten Makromoleküle in die intrazelluläre Flüssigkeit freisetzt. Verdauung und Sekretion durch diesen Mechanismus werden als Endocytose beziehungsweise Exocytose bezeichnet.
Ein wichtiger Aspekt dieses Transportmechanismus ist, daß die sezernierten oder aufgenommenen Makromoleküle in Vesikel abgesondert werden. Folglich vermengen sich von der Zelle mittels Endocytose aufgenommene Proteine nicht mit den meisten anderen Makromolekülen oder organellen in dem Cytoplasma. Die Vesikel sind dafür bestimmt, nur mit speziellen Membranen zu fusionieren, was einen direkten Transfer von Makromolekülen zwischen der Außenseite und Innenseite der Zelle bewirkt.
Spezifischer, der Endocytose-Zyklus beginnt an spezialisierten Bereichen der Plasmamembran, die als "coated pits" bezeichnet werden. Die Lebenszeit der "coated pits" ist kurz. Innerhalb von ca. einer Minute nach Bildung falten sich die "coated pits" in die Zelle ein und spalten ab, um coated Vesicles zu bilden. Die kurzlebigen coated Vesicles stoßen dann ihre Hülle ab und fusionieren mit Endosomen. Das Schicksal der innerhalb von Endosomen abgesonderten Makromolekülen ist auf drei Möglichkeiten beschränkt: 1) Transport zu den Lysosomen zum Abbau; 2) Wiederverwendung des Makromoleküls an der gleichen Plasmamembran-Domäne, von der es kam; oder 3) Transcytose zu einer anderen Domäne der Plasmamembran Wiederverwendung und Transcytose werden von einem Transportvesikel vermittelt, der von dem Endosom abspaltet und das Makromolekül an seinen vorher bestimmten Bestimmungsort an der Plasmamembran trägt.
Eine Kationisierung von Proteinen erhöht bekanntlicherweise im allgemeinen deren zelluläre Aufname. Nach dem Stand der Technik erfolgt die Aufnahme kationisierter Proteine durch Endocytose. Wie oben diskutiert, werden Proteine, die durch dieses Verfahren aufgenommen werden, in intrazelluläre Kompartimente abgesondert.
Zum Beispiel wird in einer Untersuchung, die sich auf die Aufnahme von kationisierter Meerrettich- Peroxidase konzentriert, Thyberg et al. (Eur. J. Cell Biol. 25: 308-318 (1981)) berichtet, daß das kationisierte Protein mittels Endocytose aufgenommen und in intrazelluläre Kompartimente abgesondert wurde. Präziser, die Autoren behaupten in dem Abstrakt, daß das kationisierte Protein über Membraneinfaltungen aufgenommen wurde und nicht nur zu Lysosomen sondern auch zu dem Golgiapparat transferriert wurde.
Eine andere Veröffentlichung, die die Lehrmeinung nach dem Stand der Technik untermauert, daß kationisierte Antikörper mittels Endocytose in Zellen aufgenommen werden, ist eine Übersichtsartikel von William Pardridge (Endocrin. Rev. 7: 314-330 (1986)). Der Autor behauptet auf Seite 318, daß "von dem Transcytose-Prozeß wird vermutet, daß er drei Hauptschritte umfaßt: (1) Endocytose an der lumenalen Membran oder Blutseite der BHS (Bluthirnschranke); (2) Diffusion durch das Endothelcytoplasma, vermutlich in nicht-Clathrin haltigen glatten Vesikeln; und (3) Rezeptor-vermittelte Endocytose an der antilumenalen Membran oder Himseite der BHS.
Die oben zitierten Veröffentlichungen sind für zahlreiche wissenschaftliche Artikel repräsentativ, wo darauf hingewiesen wird, daß kationisierte Antikörper mittels Endocytose aufgenommen und in intrazelluläre Kompartimente abgesondert werden. Die Erfindung des Anmelders hebt sich deutlich von der Lehrmeinung nach dem Stand der Technik ab.

Kationisierung im allgemeinen

Antikörper sind Proteine, die sowohl positive als auch negative Ladungen besitzen, deren Anzahl jeweils von dem pH der Antikörper-Lösung abhängt. Der pH, bei dem gleich viele positive und negative Ladungen vorhanden sind, wird als isoelektrischer Punkt (pI) bezeichnet. Verfahren zur Messung des pI eines gegebenen Antikörpers oder Proteins sind gut bekannt und beinhalten im allgemeinen eine isoelektrische Fokussierung nach konventionellen elektrophoretischen Verfahren. Die meisten Antikörper besitzen einen isoelektrischen Punkt zwischen ca. 5 bis 6.
Der relativ niedrige isoelektrische Punkt von Antikörpern ist auf das Vorhandensein von Carboxylgruppen auf der Oberfläche der Antikörper zurückzuführen. Die Kationisierung umfaßt die Substituierung durch basische Gruppen anstelle einer hinreichenden Anzahl an Carboxylgruppen auf der Oberfläche, um den pI des Antikörpers auf zwischen 8,0 bis 11,0 zu erhöhen. Der optimale pI inner halb dieses Bereichs wird empirisch bestimmt. Wie in den folgenden Beispielen gezeigt, können zum Beispiel Antikörper in unterschiedlichen Ausmaßen kationisiert werden (was zu einem Wertebereich von pI-Werten innerhalb des oben definierten Bereichs führt) und diese können einzeln auf ihre Wirksamkeit in einem passend entwickelten Test getestet werden.
Die Kationisierung des Antikörpers kann nach einem beliebigen bekannten Verfahren zur Modifizierung von Oberflächen-Carboxylgruppen auf Proteinen mit basischen Kationen durchgeführt werden. Bevorzugte Kationisierungsmittel umfassen Aminverbindungen, wie beispielsweise Hexamethylendiamin und verwandte Aminverbindungen. Hexamethylendiamin ist das bevorzugte Kationisierungsmittel, da es einfach erhältlich ist und die Techniken für seine Verwendung bei der Kationisierung von Proteinen gut bekannt sind. Die Menge an Kationisierungsmittel und die Bedingungen zur Reaktion mit dem Antikörper können so lange variiert werden, bis der endgültig kationisierte Antikörper einen pI innerhalb des oben erwähnten Bereichs besitzt, der für einen Transport in eine Zelle bevorzugt ist.
Obwohl Hexamethylendiamin die bevorzugte Verbindung zur Verwendung bei Kationisierung von Antikörpern ist, sind andere Kationisierungsmittel ebenfalls zweckdienlich. Zum Beispiel können Ethylendiamin, N,N-Dimethyl-1,3-propandiamin, Putrescin oder Polylysin verwendet werden. Die Kationisierung wird durch eine Car boxylaktivierung mit Hilfe von N-Ethyl, N¹(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-Hydrochlorid (EDAC) als bevorzugte Verbindung unter Verwendung der von Hoar und Koshland beschriebenen Methode katalysiert (J. Biol. Chem. 342: 2447-2453 (1967)).
Um Verminderungen der Immunreaktivität eines Antikörpers während der Kationisierung zu verhindern, kann der Antikörper vor der Kationisierung an das Antigen von Interesse vorgebunden werden. Dieses Vorbinden mit Antigen blockiert wirksam die immunreaktiven Stellen auf dem Antikörper und verhindert ihre Kationisierung. Nachdem die Kationisierung vollständig ist und der pI des Antikörpers auf den gewünschten Bereich zwischen 8,0 bis 11,0 erhöht worden ist, wird der kationisierte Antikörper dann behandelt, um das Antigen von dem Antikörper abzulösen. Das Ablösen wird gemäß bekannten Verfahren durchgeführt, wo der Antikörper-Antigen Komplex mit einer Säure behandelt wird, um die Antikörper-Antigen Bindung zu lösen. Der Antikörper wird dann mittels Säulenchromatographie oder anderer üblicher Trenn- und Wiedergewinnungsverfahren wiedergewonnen.
Die kationisierten Antikörper dieser Erfindung sind vorzugsweise, aber nicht notwendigerweise, monoklonale Antikörper. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper sind dem Fachmann gut bekannt. Kationisierte polyklonale Antikörper liegen ebenfalls innnerhalb des Rahmens dieser Erfindung.

Zielproteine

Die folgenden Beispiele zeigen deutlich die Wirksainkeit des Verfahrens des Anmelders zur Behandlung von Zellen, die mit dem HIV-1 Virus infiziert sind. Ein monoklonaler Antikörper, der spezifisch mit dem HIV-1 codierten Tat-Protein reaktiv ist, wurde mit Hilfe konventioneller Techniken kationisiert. Das Tat-Protein ist ein transaktivierendes Protein, das die HIV-1 Genexpression über einen Mechanismus reguliert, der von der spezifischen Erkennung von strukturierten viralen RNS- Ziel-Sequenzen abhängt. Die primäre Rolle des Tat- Proteins ist, als ein hochwirksamer Transaktivator der long terminal Repeat (LTR) abhängigen Transkription von HIV zu wirken.
Der Umfang der vorliegenden Erfindung beschränkt sich allerdings nicht auf das Zielen des HIV-1 codierten Tat-Proteins. Ein Fachmann kann basierend auf den Aussagen der Patentbeschreibung vorhersagen, daß kationisierte Antikörper verwendet werden können, um auf ein beliebiges intrazelluläres Protein zu zielen. Intrazelluläre Proteine sind Proteine, die sich innerhalb der Zellmembran befinden. Dies unterscheidet sie von jenen Proteinen, die zumindest teilweise an der Außenseite der Zelle exponiert sind. Derartige Proteine, die zumindest teilweise an der Außenseite der Zelle exponiert sind, liegen ebenfalls vor Transport an die Zelloberfläche innerhalb des Rahmens dieser Erfindung. Ebenfalls besitzen verschiedene derartige Proteine (z.B. proto- Onkogene) eine funktionale intrazelluläre Domäne, die mit Hilfe der kationisierten Antikörper, die gegen derartige Domänen gerichtet sind, blockiert werden können. Innerhalb des Rahmens dieser Erfindung liegt die Verwendung kationisierter Antikörper, die mit einem intrazellulären Teil derartiger Transmembran- Proteine spezifisch interagieren.
Wie in dem Abschnitt Grundlagen der Erfindung diskutiert wurde, codieren Retroviren (insbesondere der Zweig der Lentiviren) und DNS-Viren eine Reihe an transagierenden intrazellulären Proteinen, auf die mit Hilfe des hier beschriebenen Verfahrens gezielt werden kann. Dies schließt zum Beispiel das HIV-1 Rev-Protein und das HTLV-1 Rex-Protein ein.
Ein Fachmann würde vorhersagen, daß auf ein beliebiges intrazelluläres Protein, insbesondere ein nicht-kompartimentiertes Cytoplasmaprotein, wie hier beschrieben, gezielt werden könnte. Es ist die fundamentale Aussage des Anmelders, daß kationisierte Antikörper mit Cytoplasmaproteinen interagieren können, was ein Zielen auf derartige Proteine ermöglicht. Nach dieser Aussage würde ein Fachmann mit einer großen Sicherheit vorhersagen, daß derartige Antikörper mit dem Ziel-Protein unter physiologischen Bedingungen komplexieren würden.

Methoden der Erfindung

In einem Aspekt beziehen sich die Verfahren der Erfindung auf die Verwendung eines kationisierten Antikörpers zum Zielen auf ein intrazelluläres Protein zur Interaktion mit einem Antikörper in einer Zelle. Es gibt eine Reihe an Gründen zum Zielen auf ein intrazelluläres Protein zur Interaktion mit einem Antikörper. Wenn zum Beispiel das intrazelluläre Protein eine Rolle spielt, die für die Wirtszelle schädigend ist, ist es vielleicht wünschenswert, die Aktivität des intrazellulären Proteins zu beeinträchtigen. Die Einführung eines kationisierten Antikörpers, der an das intrazelluläre Protein spezifisch bindet, kann in dieser Hinsicht wirksam sein, wie es deutlich durch die folgenden Beipiele dargestellt wird.
Wie es dem Fachmann bekannt ist, zeigen Proteine ein sehr hohes Ausmaß an Spezifität. Dies gilt für alle Proteinklassen, einschließlich beispielsweise für Enzyme, strukturelle Proteine und regulatorische Proteine. Die Bindung eines kationisierten Antikörpers an ein intra zelluläres Protein kann mit der Aktivität des intrazellulären Proteins in vielfältiger Weise interferieren. Zum Beispiel kann eine Interferenz durch eine Bindung an das intrazelluläre Protein so bewirkt werden, daß eine aktive Stelle auf dem intrazellulären Protein blockiert wird. Eine Hemmung kann sich aus einer Interferenz von dem Antikörper durch Konformationsänderungen in dem intrazellulären Protein ergeben, die für die Funktion des intrazellulären Protein essentiell sind. Eine Hemmung könnte sich ebenfalls aus der Wirkung einer Antikörperbindung auf den intrazellulären Proteintransport ergeben. Wenn zum Beispiel das intrazelluläre Protein ein DNS bindendes Protein ist, könnte die Bindung des kationisierten Antikörpers an das Protein mit dem Transport des intrazellulären Proteins in den Kern interferieren. Viele mögliche Mechanismen sind denkbar, aber die vorliegende Erfindung ist nicht von einer beliebigen mechanistischen Hemmungstheorie beschränkt.
Die praktische Anwendung dieses Verfahren ist technisch unkompliziert. Alles was benötigt wird, ist ein kationisierter Antikörper, der mit dem intrazellulären Protein von Interesse reaktiv ist, und ein Test auf die Aktivität des intrazellulären Proteins von Interesse. Folglich ist das Verfahren für eine Vielzahl intrazellulärer Proteine anwendbar.
Ein spezifisches Beispiel für dieses Verfahren wird in den folgenden Beispielen geliefert, die sich auf das HIV-1 codierte Tat-Protein beziehen. Das Tat-Protein ist ein regulatorisches Protein (spezifischer ein Transaktivator), der die Transkription HIV-1 codierter Proteine stimuliert. Antikörper, die spezifisch mit diesem Protein reaktiv sind, sind kommerziell erhältlich. Ein empfindlicher Test zur Kontrolle der Tat-Aktivität, der reverse Transkriptase-Test, ist ebenfalls gut bekannt. Mit dem reverse Transkriptase-Test wird deutlich gezeigt, daß kationisierte anti-Tat Antikörper mit der normalen Funktion des Tat-Proteins in HIV-1 infizierten Zellen interferieren. Interferenz in diesem Zusammenhang bedeutet deshalb, daß der kationisierte Antikörper an das Tat-Protein bindet ünd dadurch den Transkriptionsgrad von HIV-1 relativ zu dem Transkriptionsgrad vermindert, der in Abwesenheit des kationisierten anti-Tat Antikörpers detektiert werden würde. Spezifischer wird dies in Abbildung 1 gezeigt, daß beim HIV-1 Aktivitätsmaximum eine Zugabe vom kationisierten anti-Tat Antikörper zu einer Abnahme zwischen 70-80% der reverse Transkriptase- Aktivität führt.
Ein weiterer Grund zum Zielen auf ein intrazelluläres Protein zur Interaktion mit einem Antikörper, neben dem oben beschriebenen Ziel zur Hemmung, ist die Detektion Antikörper können mit einer Reihe an detektierbaren Reportergruppen mittels konventioneller Verfahren markiert werden. Mit derartigen Reportergruppen markierte Antikörper werden in Zellen eingeführt, die auf das Vorhandensein eines intrazellulären Proteins von Interesse untersucht werden sollen, und die Detektion des spezifisch gebundenen Antikörpers wird mit Hilfe geeigneter Mittel detektiert.
Derartige Verfahren sind sowohl in vivo als auch in vitro zweckdienlich. In vivo Anwendungen umfassen sowohl therapeutische als auch diagnostische Anwendungen. Ein kationisierter Antikörper kann einem Individuum vorzugsweise intravenös verabreicht werden. Zusammensetzungen für eine intravenöse Verabreichung sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Zum Beispiel kann der kationisierte Antikörper in einer gepufferten Lösung, vorzugsweise mit einer Konzentration von ca. 20% oder weniger, suspendiert werden. Vorzugsweise besitzt diese Lösung eine hinreichende Ionenstärke und einen hinreichenden pH, um den Monomergehalt des Immunoglobulins auf einem maximalen Niveau zu halten. Der pH der Lösung wird vorzugsweise zwischen ca. 3,5 bis 5,0 durch Zugabe einer physiologisch geeigneten Säure (z.B. Essigsäure) eingestellt.
Nach der pH-Einstellung wird die Zusammensetzung behandelt, um ihre Ionenstärke zu vermindern und auch um den Monomergehalt des Immunoglobulins auf maximalen Niveaux zu halten. Das Präparat wird dann behandelt, um es isotonisch zu machen, d.h. es mit physiologischen Bedingungen physiologisch kompatibel zu machen oder für eine Injektion geeignet zu machen. In dieser Hinsicht ist es wichtig zu anzumerken, daß die Isotonität ohne Erhöhung der Ionenstärke des Präparats erreicht werden muß. Dieses Ziel wird durch Zugabe einer Menge an Aminosäure wie beispielsweise Glycin oder ähnlichem oder einem Kohlenhydrat, wie beispielsweise Maltose, Dextrose, Fructose oder ähnlichem oder einem Zuckeralkohol, wie beispielsweise Mannit, Sorbit etc. oder Mischungen davon, zu dem Präparat erreicht. Folglich kann beispielsweise das Präparat mit ca. 10% Maltose (auf der Basis von Gewicht pro Volumen) gemischt werden, um das Präparat isotonisch zu machen.
Der in den Beispielen beschriebene und für eine intravenöse Verabreichung kationisierte anti-Tat Antikörper kann einem Individuum, das mit dem HIV-1 Virus infiziert ist, verabreicht werden. Der in dem Beispielteil beschriebene Test ahmt in einem großen Umfang physiologische Bedingungen nach. Deshalb kann ein Fach mann mit großer Sicherheit vorhersagen, daß intravenös verabreichte kationisierte Antikörper von infizierten Lymphocyten aufgenommen würden und daß diese Antikörper mit der Replikation des HIV-1 Virus in vivo interferierten.
In einem in vivo immundiagnostischen Verfahren wäre die Technik eine ähnliche. Jedoch wären die kationisierten Antikörper mit einer detektierbaren Reportergruppe markiert, die für eine Einführung in einem Menschen sicher ist. Derartige Reportergruppen sind dem Fachmann bekannt.
In vitro können die Verfahren der Erfindung diagnostisch oder für beliebig andere geeignete Forschungszwecke verwendet werden. In einem bevorzugten diagnostischen Verfahren ist der Antikörper mit einer fluoreszierenden Reportergruppe markiert, und die Zellen werden auf das Vorhandensein des intrazellulären Proteins von Interesse mittels Durchflußcytometrie untersucht.
Das folgende Beipiel zeigt die Leistungen der beanspruchten Methoden für eine Verwendung in der Grundlagenforschung. Viele Krankheitsstadien, einschließlich beispielsweise viraler Infektion und Krebs, sind durch das Vorhandensein eines bestimmten intrazellulären Proteins gekennzeichnet und werden gewöhnlicherweise mit in Kultur gewachsenen menschlichen Zellen untersucht.

Beispiele

Beispiel 1

Es ist zuvor gezeigt worden, daß zu menschlichen Lymphocyten-Zellkulturen gegebenes gereinigtes Tat- Protein von den Zellen schnell aufgenommen wird und daß aufgenommenes Tat auf eine noch nicht identifizierte Weise die Blockierung der Lymphocyten-Proliferation erleichtert. Wie in dem vorliegendem Beispiel diskutiert, wurde die Aktivität des kationisierten anti-Tat Antikörpers zuerst in einem Lymphocyten-Proliferationstest untersucht und dann wurde seine Wirkung auf HIV-1 Virus infizierte Lymphocyten bestimmt.

Herstellung des kationisierten Antikörpers

Monoklonale Antikörper, die mit dem vom HIV-1 Virus codierten Tat-Protein reaktiv sind, wurden von American Biotechnologies, Inc. (Cambridge, MA) erhalten. Die mit dem Tat-Protein reaktiven Antikörper wurden in verschiedenen Ausmaßen mit Hilfe konventioneller Verfahren kationisiert (siehe z.B. Kumagai et al., J. Biol. Chem. 262: 15214-15219 (1987); Pardridge et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 146: 307-313 (1987)).
Um die anti-Tat Antikörper in verschiedenen Ausmaßen zu kationisieren, wurden fünf getrennte Reaktions mischungen hergestellt, wobei jede annähernd 1 mg anti- Tat Antikörper enthielt. Die anti-Tat Reaktionsmischungen (als anti-Tat #1 bis anti-Tat #5 bezeichnet) enthielten 5,2 µmol N-Ethyl-N'-3-(Dimethylaminopropyl)carbodiimid Hydrochlorid. Zusätzlich enthielt anti-Tat #1 bis anti- Tat #5 54, 27, 13, 6 beziehungsweise 2,7 µmol Hexamethylendiamin. Der Effekt der verschiedenen Konzentrationen des kationisierenden Reagenzes ist ein variierender Kationisierungsgrad von sehr hoch (#1) bis gering (#5).
Die Kationisierungsreaktionen wurden in Abwesenheit des Tat-Proteins durchgeführt und deshalb wurde die Affinität des kationisierten Antikörpers für das Tat- Protein mittels eines ELISA Bindungstests bestimmt. Das in dem Bindungstest und in dem unten beschriebenen Sup T1 Tests verwendete Tat-Protein wurde ebenfalls von American Biotechnologies bezogen. In dem ELISA Test wurde festgestellt, daß die kationisierten Antikörper nur ca. 5-10% der Tat Bindungsaffinität relativ zu dem nativen Antikörper beibehielten.

Lymphocyten-Proliferationstest

Lymphocyten-Proliferationstests wurden mit Hilfe der gut bekannten Sup T1 Zellinie durchgeführt. Die Sup T1 Zellinie ist eine CD4 tragende Zellinie, die mit HIV-1 in vitro infiziert werden kann. Tat-Protein (10 µg/ml) wurde zu einer Sup T1 Zellkultur (2 x 10&sup5; Zellen/Vertiefung) 8 Stunden gegeben, und ³H Thymidin wurde in die Kultur für die letzten 2 Stunden des 8 stündigen Zeitraums zugegeben. Der Einbau der markierten Nucleotide ist eine Funktion des Zellwachstums und der Zellteilung. Die Zugabe von Tat zu dem Wachstumsmedium führte zu einem durchschnittlichen Anstieg von 70% der Lymphocyten- Proliferation. Wie in Tabelle 1 unten gezeigt, lagen die durchschnittlichen Counts pro Minute, die von Kontrollzeilen (nicht Tat ausgesetzt) eingebaut wurden, in 4 separaten Experimenten bei 35.691, während die dem Tat- Protein ausgesetzte Kultur 10.057 Counts pro Minute einbaute. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit früheren Berichten und bestätigt die Richtigkeit des Sup T1 Lymphocyten- Proliferationstests.
Kationisierte anti-Tat Antikörper-Präparate (#1 bis #5) wurden auf ihre Wirkung auf die Lymphocyten-Proliferation in dem Sup T1 Test getestet. Ann&hernd 2 x 10&sup5; Zellen wurden 5 µg/ml anti-Tat Antikörper 10 Minuten ausgesetzt, 4 mal mit PBS gewaschen und dann mit oder ohne Zugabe von Tat-Protein (10 µg/ml) kultiviert. Die Zellen wurden insgesamt 8 Stunden, einschließlich eines 2 stündigen Impulses mit 1 µCi ³H Thymidin kultiviert. Das Experiment wurde 4 mal durchgeführt und die Mittelwerte sind in Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1
In Tabelle 1 stellt anti-Tat #6 eine Blindkontrolle dar (d.h. nativer Antikörper zusammen mit Tat-Protein zu der Sup T1 Zellkultur). Als nativer Antikörper wird ein nicht-kationisierter anti-Tat Antikörper bezeichnet. Die Zugabe von nativem anti-Tat Antikörper hat keine blockierende Wirkung, sogar bei Konzentrationen von 30 Mikrogramm/ml. Es sollte ebenfalls angemerkt werden, daß ausschließlich mit anti-Tat behandelte Zellen eine Thymidin-Aufnahme in ähnlicher Höhe zeigten, wie es auch bei den Kontrollzellen in allen durchgeführten Experimenten beobachtet wurde.
Die Ergebnisse zeigen deutlich die Fähigkeit des kationisierten Antikörpers, dem anti-proliferativen Effekt von Tat in dem Sup T1 Test entgegenzuwirken. Wie oben gezeigt, war anti-Tat #3 der wirksamste von den getesteten Antikörpern hinsichtlich seiner Fähigkeit, die Wirkung des Tat-Proteins zu blockieren. Dies zeigt, daß das höchste Kationisierungsausmaß nicht notwendigerweise mit optimaler Aktivität korreliert. Die Zugabe von Tat allein führte zu einer durchschnittlichen Abnahme von annähernd 70% bei der Lymphocyten-Proliferation. Die beobachtete Abnahme der Lymphocyten-Proliferation, wenn Tat mit anti-Tat #3 zugegeben wurde, war nur annähernd 10%.
Eine weitere Reihe an Experimenten wurde mit anti- Tat #3 in variierenden Konzentrationen durchgeführt, um eine Dosis-Antwort-Kurve aufzunehmen. Das verwendete Protokoll war mit dem oben skizzierten identisch, außer daß die Antikörper-Konzentration, wie angegeben, variiert wurde. Die Ergebnisse aus diesen Experiment sind in Tabelle 2 aufgeführt. Tabelle 2
Ein grober Zeitablauf hat gezeigt, daß die Wirkungen von anti-Tat bei einer 10 minütigen Exposition vor dem Waschen bei einer 24 Stunden Kultur nicht detektierbar sind.

Wirkung von anti-Tat auf HIV-1 infizierte Zellen

Um die Wirkung kationisierter anti-Tat Antikörper auf HIV-1 infizierte Zellen zu bestimmen, wurde wieder die Sup T1 Zellinie verwendet. Sup T1 Zellen wurden mit einem niedrigen Titer an HIV-1 kultiviert, bis Hinweise auf eine erfolgte Infektion beobachtet wurden. Am Tag 8 wurde dieses mit dem Auftauchen von größeren Zellen und Riesenzellen beobachtet. Am Tag 8 wurde ein Aliquot infizierter Zellen mit 5 µg/ml kationisiertem anti-Tat Antikörper behandelt, und ein weiteres Aliquot wurde mit nicht-kationisiertem anti-Tat Antikörper (10 µg/ml) in Kontakt gebracht. Der Antikörper wurde zu den Zellen gegeben und verblieb in der Kultur. In 24 Stundenintervallen wurden die Kulturen geerntet, und Aliquote für eine konventionelle reverse Transkriptase-Analyse entfernt. Die verbliebenen Zellen wurden gewaschen und in frischem Medium mit 5 µg/ml kationisiertem anti-Tat Antikörper oder 10 µg/ml nicht-kationisiertein Antikörper resuspendiert. Das Experiment wurde über 7 Tage durchgeführt, zu diesem Zeitpunkt wurden alle Aliquote auf reverse Transkriptase-Aktivität analysiert.
Die Ergebnisse aus diesem Experiment werden in Abbildung 1 gezeigt. Kurve A stellt eine Kontrollkultur dar, zu der kein Antikörper gegeben wurde. Kurve B stellt den Einbau der Markierung in Gegenwart von nativem anti- Tat dar. Kurve C stellt die eingebaute Markierung in Gegenwart von kationisiertem anti-Tat #3 dar.
Jede Kurve zeigt die charakteristische glockenförmige Verteilung. Die reverse Transkriptase-Aktivität für die unbehandelte Kontrolle an Tag 8 lag bei annähernd 250.000 CPM. So wie die virale Fracht bis Tag 10 zunahm, stieg der Einbau der Markierung auf annähernd 350.000 CPM. Nach Tag 10 führte der Zelltod als Ergebnis der HIV- 1 Infektion zu einer drastischen Abnahme bei der Aktivität.
Das Vorhandensein kationisierter anti-Tat #3 in dem Wachstumsmedium führte zu einer drastischen Abnahme der reverse Transkriptase-Aktivität. Zum Beispiel zeigten am Infektionsmaximum an Tag 10 die Aktivitätsniveaux, Kurve C (anti-Tat #3), einen Markierungseinbau, der ca. 70-80% geringer ist, als der in den Kontrollkurven A und B gezeigte Einbau.

Beispiel 2

Um den Kationisierungsgrad zu bestimmen, der hinreichend ist, um eine intrazelluläre Beförderung zu induzieren, wurde der in dem vorigen Experiment diskutierte monoklonale anti-Tat Antikörper mit Hilfe von Diamin-Putrescin kationisiert. Die Kationisierungsreaktion wurde in einer 500 µl Reaktionsmischung, bestehend aus 100 mM MOPS Puffer (pH 7,2); 10% Glycerol; 400 µg anti-Tat; 125 µMol Putrescin; 7,26 x 10&sup6; CPM ³H- Putrescin; und 1 µmol EDC (Carbodiimid) durchgeführt. Die Reaktion wurde ca. 20 Stunden bei Raumtemperatur gehalten.
Der kationisierte anti-Tat Antikörper wurden dann vom überschüssigen Putrescin und EDC mittels Chromatographie auf einer PD-10 Säule abgetrennt. Die Menge an Putrescin pro Antikörper wurde aus der Menge an wiedergewonnenem Antikörper und der eingebauten Radioaktivität berechnet und wurde auf ca. 9,05 geschätzt. Die Affinität des kationisierten Antikörpers für das Tat-Protein wurde mittels eines ELISA Bindungstests, wie zuvor erwähnt, beurteilt. Es wurde festgestellt, daß der modifizierte Antikörper ca. 15 % seiner Affinität für Tat beibehielt.
Dieses anti-Tat Präparat wurde an HIV-1 infizierten Zellen in vitro getestet. Genauer, Sup T1 Zellen wurden in Platten mit 24 Vertiefungen (2 ml Volumen, 200.000 Zellen pro Vertiefung) kultiviert. Von Tag 0 bis Tag 5 wurde das Kulturmedium täglich durch frisches Medium ersetzt, das entweder keinen Antikörper oder den anti-Tat Antikörper in seiner nativen Form oder, wie oben beschrieben, kationisiert (annähernd 10 µg/ml) enthielt. An Tag 1 wurden die zu infizierenden Zellen einer HIV-1 IIIB Präparation unter Bedingungen, die für eine Infektion geeignet sind, ausgesetzt. Die Zellzahl wurde täglich bestimmt. Von Tag 6 bis 10 wurde das Kulturmedium täglich mit frischen Medium ohne zugefügten Antikörper ersetzt.
Abbildung 2 zeigt die Zellzahl über die Zeit (von Tag 0 bis zu Tag 10). Während Sup T1 Zellen, die ohne Antikörper gehalten und nicht mit dem Virus infiziert waren, eine Dichte von ca. einer Million Zellen pro Vertiefung erreichten, erreichten die Zellen, wenn sie mit dem Virus infiziert waren, nur ca. die Hälfte dieser Dichte und nach Tag 8 begann die Zellzahl pro Vertiefung, aufgrund der cytopathischen Wirkung des Virus zu fallen. Während der native anti-Tat Antikörper keinen Effekt besaß, induzierte der kationisierte Antikörper einen Anstieg der Zelldichte, der besonders deutlich bis Tag 5 war. Von Tag 6 bis Tag 10 (wenn die Zellen ohne jeglichen zugegebenen Antikörper inkubiert wurden) nahm die Zelldichte ab, verblieb aber höher als die der unbehandelten infizierten Zellen oder infizierten Zellen, die mit dem nativen Antikörper behandelt wurden.

Claims

1. Ein in vitro Verfahren zum Zielen auf ein intrazelluläres Protein zur Interaktion mit einem Antikörper in einer Zelle, wobei das Verfahren das in-Kontakt-Bringen der Zelle mit einem kationisierten Antikörper umfaßtg der mit dem intrazellulären Protein spezifisch bindet.

2. Ein Verfahren nach Anspruch 1, worin der kationisierte Antikörper mit einer detektierbaren Reportergruppe markiert ist, wobei besagte Gruppe zum Beispiel eine fluoreszierende Komponente ist.

3. Ein in vitro Verfahren zur Hemmung der Aktivität eines intrazellulären Proteins in einer Zelle, wobei das Verfahren das in-Kontakt-Bringen der Zelle mit einem kationisierten Antikörper, z.B. einem monoklonalen Antikörper, umfaßt, der mit dem intrazellulären Protein spezifisch reagiert.

4. Ein Verfahren nach Anspruch 3, worin das intrazelluläre Protein ein trans-aktivierendes Protein ist.

5. Ein Verfahren nach Anspruch 4, worin das transaktivierende Protein ein Protein ist, das an Nucleinsäure in der Zelle bindet, zum Beispiel das HIV-1 Tat Protein.

6. Verwendung eines kationisierten Antikörpers, der mit einem Virus codierten Produkt spezifisch reagiert und dadurch mit der Replikation des Virus interferiert, zur Herstellung einer immuntherapeutischen Zusammensetzung zur Behandlung eines von einem Virus infizierten Individuums.

7. Die Verwendung nach Anspruch 6, worin das Virus aus DNS-Viren und Retroviren, wie beispielsweise Lentiviren, gewählt ist.

8. Verwendung eines kationisierten Antikörpers, der mit einem HIV-1 codierten trans-aktivierenden Faktor spezifisch reagiert, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines von dem HIV-1 Virus infizierten Individuums.

9. Die Verwendung nach Anspruch 8, worin der HIV-1 codierte trans-aktivierende Faktor das Tat Protein oder das Rev Protein ist.

10. Die Verwendung nach Anspruch 9, worin der kationisierte Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

11. Verwendung eines kationisierten Antikörpers, der mit einem intrazellulären Protein spezifisch bindet, zur Herstellung eines Medikaments oder diagnostischen Agens zum Zielen auf das intrazelluläre Protein mit dem Antikörper in einer Zelle.

12. Verwendung eines kationisierten Antikörpers, der mit einem intrazellulären Protein spezifisch reagiert, zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Aktivität des intrazellulären Proteins mit dem Antikörper in einer Zelle.