KR20180121786A - 항체, 제약 조성물 및 방법 - Google Patents

항체, 제약 조성물 및 방법 Download PDF

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KR20180121786A
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쳉-더 토니 유
지안-시운 라이
이-주 첸
치우-춘 린
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오비아이 파머 인코퍼레이티드
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Abstract

단계-특이적 배아 항원 4 (SSEA-4)에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 제약 조성물, 뿐만 아니라 그의 사용 방법이 본원에 기재된다. 사용 방법은 암 요법 및 진단법을 비제한적으로 포함한다. 본 개시내용의 항체는 특정 암 세포 표면에 결합할 수 있다. 본원에 개시된 항체의 예시적인 표적은 암종, 예컨대 유방암, 폐암, 식도암, 직장암, 담도암, 간암, 협부암, 위암, 결장암, 비인두암, 신장암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 췌장암, 고환암, 방광암, 두경부암, 구강암, 신경내분비암, 부신암, 갑상선암, 골암, 피부암, 기저 세포 암종, 편평 세포 암종, 흑색종 및/또는 뇌 종양을 포함할 수 있다.

Description

항체, 제약 조성물 및 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2016년 3월 29일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/314,841을 우선권 주장한다. 상기 언급된 출원의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
분야
본 개시내용은 탄수화물 항원에 대한 항체 및 그의 결합 단편, 뿐만 아니라 예컨대 항체를 코딩하는 핵산, 상보적 핵산, 폴리펩티드, 벡터, 숙주 세포, 및 이를 제조 및 사용하는 방법, 또한 상기 항체 및/또는 결합 단편을 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 게다가, 대상체에게 암 세포를 억제하는데 효과적인 양으로 항체를 투여하는 방법이 제공된다. 특히, 단계-특이적 배아 항원 4 (SSEA-4)에 결합하는 항체, 뿐만 아니라 관련 조성물 및 사용 방법이 본원에 개시되어 있다. 사용 방법은 암 요법 및 진단법을 비제한적으로 포함한다.
발명의 배경
수많은 표면 탄수화물이 악성 종양 세포에서 발현된다. 예를 들어, 글로보 H는 다양한 상피암에 과다발현하는 것으로 나타났고, 유방암 및 소세포 폐 암종에서 종양 공격성 및 불량한 예후와 연관된다. 이전의 연구는 글로보 H 및 단계-특이적 배아 항원 3 (SSEA-3, Gb5로도 불림)이 유방암 세포 및 유방암 줄기 세포에서 관찰되었다는 것을 밝혀냈다 (WW Chang et al. "Expression of Globo H and SSEA3 in breast cancer stem cells and the involvement of fucosyl transferases 1 and 2 in Globo H synthesis." PNAS, 105(33): 11667-11672, 2008). 암에 대한 효과적인 치료 및/또는 예방에 대한 의학적 미충족 필요가 여전히 존재하기 때문에, 이들 발견은 종양 연관된 탄수화물 항원에 대한 항체 개발의 근거를 뒷받침한다. 암과 연관되고/거나 암을 예측하는 글리칸 마커를 확인하고 광범위한 암을 진단하고 치료하는데 사용되는 마커에 대한 항체를 개발하는 것이 큰 관심 대상이다.
발명의 개요
본 개시내용은 단계-특이적 배아 항원 4 (SSEA-4)가 광범위한 암에서 풍부하게 발현되지만, 정상 세포에서는 그렇지 않다는 발견에 기초한다. SSEA-4를 발현하는 암은 유방암, 폐암, 식도암, 직장암, 담도암, 간암, 협부암, 위암, 결장암, 비인두암, 신장암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 췌장암, 고환암, 방광암, 두경부암, 구강암, 신경내분비암, 부신암, 갑상선암, 골암, 피부암, 기저 세포 암종, 편평 세포 암종, 흑색종 또는 뇌 종양을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
한 측면에서, 본 개시내용은 SSEA-4에 특이적인 항체 또는 그의 결합 단편을 특색으로 한다. 항-SSEA-4 항체는 Neu5Acα2→ 3Galβ1→ 3GalNAcβ1→ 3Galα1→ 4Galβ1→ 4Glcβ1에 결합한다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 1J1s (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) (ATCC) 수탁 번호 PTA-122679 하에 기탁됨), 1G1s (ATCC 수탁 번호 PTA-122678 하에 기탁됨), 2F20s (ATCC 번호 PTA-122676 하에 기탁됨)로서 지정된 하이브리도마 클론, 및 그로부터 생산된 항체 또는 항원-결합 단편을 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 서열 상동성의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및/또는 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 상동성의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다 (표 1). 일부 측면에서, 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 서열 상동성의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH)의 아미노산 서열은 자연 발생 서열을 포함하거나 제외할 것이다. 일부 측면에서, 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 서열 상동성의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL)의 아미노산 서열은 자연 발생 서열을 포함하거나 제외할 것이다.
특정 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 추가로
표 1에 제시된 (i)-(iii)으로부터 선택된 H-CDR1, H-CDR2, 및 H-CDR3:
각각 (i) 서열식별번호: 13으로부터 선택된 H-CDR1;
(ii) 서열식별번호: 15로부터 선택된 H-CDR2;
(iii) 서열식별번호: 17로부터 선택된 H-CDR3
을 포함하고,
(iv)-(vi)로부터 선택된 L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3:
각각 (iv) 서열식별번호: 6으로부터 선택된 L-CDR1;
(v) 서열식별번호: 8로부터 선택된 L-CDR2; 및
(vi) 서열식별번호: 10으로부터 선택된 L-CDR3
을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 중쇄 영역을 포함하며, 여기서 중쇄 영역은 서열식별번호: 13, 15 또는 17로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 상동성의 상보성 결정 영역 (CDR) 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 경쇄 영역을 포함하며, 여기서 경쇄 영역은 서열식별번호: 6, 8 또는 10으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 상동성의 상보성 결정 영역 (CDR) 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 자연 발생 서열을 제외한다. 특정 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 자연 발생 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 추가로
표 1에 제시된 (i)-(iv)로부터 선택된 H-FW1, H-FW2, H-FW3, 및 H-FW4:
각각 (i) 서열식별번호: 12로부터 선택된 H-FW1;
(ii) 서열식별번호: 14로부터 선택된 H-FW2;
(iii) 서열식별번호: 16으로부터 선택된 H-FW3;
(iv) 서열식별번호: 18로부터 선택된 H-FW4
를 포함하고,
(v)-(viii)으로부터 선택된 L-FW1, L-FW2, L-FW3, 및 L-FW4:
각각 (v) 서열식별번호: 5로부터 선택된 L-FW1;
(vi) 서열식별번호: 7로부터 선택된 L-FW2;
(vii) 서열식별번호: 9로부터 선택된 L-FW3;
(viii) 서열식별번호: 11로부터 선택된 L-FW4
를 포함한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 ATCC 수탁 번호 PTA-122679 하에 기탁된 1J1s로서 지정된 하이브리도마에 의해 생산된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 ATCC 수탁 번호 PTA-122679 하에 기탁된 1J1s로서 지정된 하이브리도마를 제공한다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 21에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 서열 상동성의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및/또는 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 상동성의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다 (표 2). 일부 측면에서, 서열식별번호: 21에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 서열 상동성의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH)의 아미노산 서열은 자연 발생 서열을 포함하거나 제외할 것이다. 일부 측면에서, 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 서열 상동성의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL)의 아미노산 서열은 자연 발생 서열을 포함하거나 제외할 것이다.
특정 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 추가로
표 2에 제시된 (i)-(iii)으로부터 선택된 H-CDR1, H-CDR2, 및 H-CDR3:
각각 (i) 서열식별번호: 31로부터 선택된 H-CDR1;
(ii) 서열식별번호: 33으로부터 선택된 H-CDR2;
(iii) 서열식별번호: 35로부터 선택된 H-CDR3;
을 포함하고,
(iv)-(vi)로부터 선택된 L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3:
각각 (iv) 서열식별번호: 24로부터 선택된 L-CDR1;
(v) 서열식별번호: 26으로부터 선택된 L-CDR2; 및
(vi) 서열식별번호: 28로부터 선택된 L-CDR3
을 포함한다.
특정 실시양태에서 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 중쇄 영역을 포함하며, 여기서 중쇄 영역은 서열식별번호: 31, 33 또는 35로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 상동성의 상보성 결정 영역 (CDR) 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 경쇄 영역을 포함하며, 여기서 경쇄 영역은 서열식별번호: 24, 26 또는 28로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 상동성의 상보성 결정 영역 (CDR) 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서 항체 또는 항원-결합 단편은 자연 발생 서열을 포함하거나 제외한다.
특정 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 추가로
표 2에 제시된 (i)-(iv)로부터 선택된 H-FW1, H-FW2, H-FW3 및 H-FW4:
각각 (i) 서열식별번호: 30으로부터 선택된 H-FW1;
(ii) 서열식별번호: 32로부터 선택된 H-FW2;
(iii) 서열식별번호: 34로부터 선택된 H-FW3;
(iv) 서열식별번호: 36으로부터 선택된 H-FW4
를 포함하고,
(v)-(viii)로부터 선택된 L-FW1, L-FW2, L-FW3 및 L-FW4:
각각 (v) 서열식별번호: 23으로부터 선택된 L-FW1;
(vi) 서열식별번호: 25로부터 선택된 L-FW2;
(vii) 서열식별번호: 27로부터 선택된 L-FW3;
(viii) 서열식별번호: 29로부터 선택된 L-FW4
를 포함한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 ATCC 수탁 번호 PTA-122678 하에 기탁된 1G1s로서 지정된 하이브리도마에 의해 생산된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 ATCC 수탁 번호 PTA-122678 하에 기탁된 1G1s로서 지정된 하이브리도마를 제공한다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 39에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 서열 상동성의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및/또는 서열식별번호: 40에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 상동성의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다 (표 3). 일부 측면에서 서열식별번호: 39에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 서열 상동성의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH)의 아미노산 서열은 자연 발생 서열을 포함하거나 제외할 것이다. 일부 측면에서 서열식별번호: 40에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 서열 상동성의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL)의 아미노산 서열은 자연 발생 서열을 포함하거나 제외할 것이다.
특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 추가로
표 3에 제시된 (i)-(iii)으로부터 선택된 H-CDR1, H-CDR2, 및 H-CDR3:
각각 (i) 서열식별번호: 49로부터 선택된 H-CDR1;
(ii) 서열식별번호: 51로부터 선택된 H-CDR2;
(iii) 서열식별번호: 53으로부터 선택된 H-CDR3
을 포함하고,
(iv)-(vi)로부터 선택된 L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3:
각각 (iv) 서열식별번호: 42로부터 선택된 L-CDR1;
(v) 서열식별번호: 44로부터 선택된 L-CDR2; 및
(vi) 서열식별번호: 46으로부터 선택된 L-CDR3
을 포함한다.
특정 실시양태에서 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 중쇄 영역을 포함하며, 여기서 중쇄 영역은 서열식별번호: 49, 51 또는 53으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 상동성의 상보성 결정 영역 (CDR) 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 경쇄 영역을 포함하며, 여기서 경쇄 영역은 서열식별번호: 42, 44 또는 46으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 상동성의 상보성 결정 영역 (CDR) 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서 항체 또는 항원-결합 단편은 자연 발생 서열을 포함하거나 제외한다.
특정 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 추가로
표 3에 제시된 (i)-(iv)로부터 선택된 H-FW1, H-FW2, H-FW3 및 H-FW4:
각각 (i) 서열식별번호: 48로부터 선택된 H-FW1;
(ii) 서열식별번호: 50으로부터 선택된 H-FW2;
(iii) 서열식별번호: 52로부터 선택된 H-FW3;
(iv) 서열식별번호: 54로부터 선택된 H-FW4
를 포함하고,
(v)-(viii)으로부터 선택된 L-FW1, L-FW2, L-FW3 및 L-FW4:
각각 (v) 서열식별번호: 41로부터 선택된 L-FW1;
(vi) 서열식별번호: 43으로부터 선택된 L-FW2;
(vii) 서열식별번호: 45로부터 선택된 L-FW3;
(viii) 서열식별번호: 47로부터 선택된 L-FW4
를 포함한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 ATCC 수탁 번호 PTA-122676 하에 기탁된 2F20s로서 지정된 하이브리도마에 의해 생산된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 ATCC 수탁 번호 PTA-122676 하에 기탁된 2F20s로서 지정된 하이브리도마를 제공한다.
특정 실시양태에서, 예시적인 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하나 이상의 탄수화물 항원에 결합할 수 있는 가변 도메인을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 탄수화물 항원 SSEA-4 (Neu5Acα2→ 3Galβ1→ 3GalNAcβ1→ 3Galα1→ 4Galβ1→ 4Glcβ1) (SSEA-4 헥사사카라이드)를 표적화한다.
특정 측면에서, 본 개시내용은 항체 또는 그의 결합 단편을 제공하며, 여기서 항체 또는 그의 결합 단편은 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 21 또는 서열식별번호: 39로부터 선택된 VH 및 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 22 또는 서열식별번호: 40으로부터 선택된 VL을 포함한다. 일부 측면에서 본 개시내용은 서열식별번호: 3, 21 또는 39에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 서열 상동성의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및/또는 서열식별번호: 4, 22 또는 40에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 상동성의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 일부 측면에서 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 천연 서열을 포함하거나 제외할 수 있다.
특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은
(a) 완전 이뮤노글로불린 분자;
(b) scFv;
(c) Fab 단편;
(d) F(ab')2; 또는
(e) 디술피드 연결된 Fv
로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 항체는 인간화 항체이다.
특정 실시양태에서, 항체는 IgG 또는 IgM이다.
한 측면에서, 본 개시내용은 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편; 및 적어도 1종의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
특정 실시양태에서, 제약 조성물은 적어도 1종의 추가의 치료제를 추가로 포함한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 암 세포의 증식 억제를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 예시적인 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 암 세포의 증식이 억제되는 것인, 암 세포의 증식을 억제하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 방법은 본원에 기재된 유효량의 예시적인 항체를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 암은 유방암, 폐암, 식도암, 직장암, 담도암, 간암, 협부암, 위암, 결장암, 비인두암, 신장암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 췌장암, 고환암, 방광암, 두경부암, 구강암, 신경내분비암, 부신암, 갑상선암, 골암, 피부암, 기저 세포 암종, 편평 세포 암종, 흑색종 또는 뇌 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 측면에서, 본 개시내용은
(a) 대상체로부터 수득된 세포 또는 조직 샘플에 SSEA-4의 발현을 검출하는 하나 이상의 항체를 적용하는 단계;
(b) 하나 이상의 항체의 세포 또는 조직 샘플에 대한 결합을 검정하는 단계;
(c) 결합을 정상 대조군과 비교하여 대상체에서 암의 존재를 결정하는 단계; 및
(d) 정상 기준선 지수와 비교하여 상응하는 항체 결합의 상대 수준에 기초하여 질환 진행 병기를 카테고리화하는 단계
를 포함하는, 대상체에서 암을 병기결정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태의 상세내용이 하기 설명에 제시된다. 본 발명의 다른 특색 및/또는 이점은 하기 도면, 여러 실시양태의 상세한 설명, 및 또한 첨부된 청구범위로부터 명백할 것이다.
도 1은 비히클, 10 mL/kg x 10을 사용하여, 복강내로, 매주 2회 치료한 후에 제36일에 HPAC 이식된 종양을 갖는 BALB/c 누드 수컷 마우스의 사진을 보여준다.
도 2는 글로보 H-2C2, 0.4 mg/kg x 10을 사용하여, 복강내로, 매주 2회 치료한 후에 제36일에 HPAC 이식된 종양을 갖는 BALB/c 누드 수컷 마우스의 사진을 보여준다.
도 3은 상업용 SSEA-4 항체 (MC-813-70), 0.4 mg/kg x 10을 사용하여, 복강내로, 매주 2회 치료한 후에 제36일에 HPAC 이식된 종양을 갖는 BALB/c 누드 수컷 마우스의 사진을 보여준다.
도 4는 1G1s, 0.4 mg/kg x 10을 사용하여, 복강내로, 매주 2회 치료한 후에 제36일에 HPAC 이식된 종양을 갖는 BALB/c 누드 수컷 마우스의 사진을 보여준다.
도 5는 1J1s, 0.4 mg/kg x 10을 사용하여, 복강내로, 매주 2회 치료한 후에 제36일에 HPAC 이식된 종양을 갖는 BALB/c 누드 수컷 마우스의 사진을 보여준다.
도 6은 2F20s, 0.4 mg/kg x 10을 사용하여, 복강내로, 매주 2회 치료한 후에 제36일에 HPAC 이식된 종양을 갖는 BALB/c 누드 수컷 마우스의 사진을 보여준다.
도 7은 36일에 걸친 항체 주사의 과정 동안 종양 부피의 측정의 그래프를 보여준다. SSEA-4 항체 1G1s, 2F20s 및 1J1s의 효과를 HPAC 종양 상에서 측정하였다. 상업용 SSEA-4 항체 (MC-813-70) 및 비히클 (PBS)을 또한 측정하였다.
도 8은 유동 세포측정 히스토그램을 보여준다. 2x105 세포/튜브를 시험된 항체 (녹색 선) 또는 이소형 대조군 (흑색 선)으로 염색한 다음, FITC-접합된 2차 항체와 함께 인큐베이션하였다.
도 9는 다양한 암 및 비-암 세포주에 대한 예시적인 SSEA-4 항체 1J1s, 1G1s, 2F20s, 및 상업용 클론 MC-813-70의 FACS 결합 검정 결과를 보여준다. 시험된 암 세포주는 MCF-7 (유방암), MDA-MB231 (유방암), HPAC (췌장암), LN-18 (교모세포종) 및 LL-2 (루이스 폐 암종)였다. 시험된 비-종양발생 세포주는 HK2 (신장, 피질/근위 세관), NL-20 (기관지 상피), THLE-3 (간, 정상 세포) 및 HuMEC (인간 유방 상피 세포)였다.
도 10은 지질1에 접합된 SS 연속 당 및 Gb 연속 당의 구조를 보여준다.
도 11은 적정 ELISA에 의한 에피토프의 특징화를 보여준다. (A) 상업용 SSEA-4 항체 (MC-813-70), (B) 1G1s, (C) 1J1s (D) 2F20s.
도 12는 화학발광 샌드위치 ELISA 분석에 의해 비오티닐화 당과의 교차 반응성 시험을 보여준다.
도 13은 37일에 걸친 항체 조합 주사의 과정 동안 종양 부피의 측정의 그래프를 보여준다. 항체 2C2 (항-글로보 H) 및 1J1s (항-SSEA4)의 효과를 HPAC 종양 상에서 측정하였다.
발명의 상세한 설명
광범위한 암을 진단하고 치료하는데 사용하기 위한 마커에 관한 항체 방법 및 조성물이 제공된다. 항-SSEA-4 항체가 본원에 개발되고 개시된다. 사용 방법은 암 요법 및 진단법을 비제한적으로 포함한다. 본원에 기재된 항체는 광범위한 SSEA-4-발현 암 세포에 결합할 수 있으며, 그로 인해 암 진단 및 치료를 용이하게 한다. 항체에 의해 표적화될 수 있는 세포는 암종, 예컨대 피부, 혈액, 림프절, 뇌, 폐, 유방, 구강, 식도, 위, 간, 담관, 췌장, 결장, 신장, 자궁경부, 난소, 전립선 암 등에서의 것을 포함한다.
정의
본 발명의 실시는, 달리 나타내지 않는 한, 관련 기술분야의 기술 내에 있는 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기술을 사용한다. 이러한 기술은 문헌에 상세하게 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Antibodies: A Laboratory Manual, by Harlow and Lane s (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988); 및 Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986)]을 참조한다.
본원에 사용된 용어 "글리칸"은 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드를 지칭한다. 글리칸은 또한 당접합체, 예컨대 당단백질, 당지질, 당펩티드, 글리코프로테옴, 펩티도글리칸, 리포폴리사카라이드 또는 프로테오글리칸의 탄수화물 부분을 지칭하는 것으로 본원에서 사용된다. 글리칸은 통상적으로 모노사카라이드 사이의 O-글리코시드 연결만으로 이루어진다. 예를 들어, 셀룰로스는 β-1,4-연결된 D-글루코스로 구성된 글리칸 (또는 보다 구체적으로는 글루칸)이고, 키틴은 β-1,4-연결된 N-아세틸-D-글루코사민으로 구성된 글리칸이다. 글리칸은 모노사카라이드 잔기의 단독중합체 또는 이종중합체일 수 있으며, 선형 또는 분지형일 수 있다. 글리칸은 당단백질 및 프로테오글리칸에서와 같이 단백질에 부착된 것으로 발견될 수 있다. 이들은 일반적으로 세포의 외부 표면 상에서 발견된다. O- 및 N-연결된 글리칸은 진핵생물에서 매우 통상적이지만, 또한 원핵생물에서도 보다 덜 통상적이긴 하지만 발견될 수 있다. N-연결된 글리칸은 시퀀에서 아스파라긴의 R-기 질소 (N)에 부착된 것으로 발견된다. 시퀀은 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr 서열이며, 여기서 X는 프랄린을 제외한 임의의 아미노산이다.
본원에 사용된 용어 "항원"은 면역 반응을 도출할 수 있는 임의의 물질로서 정의된다.
본원에 사용된 용어 "면역원성"은 면역 반응을 도출하기 위한 면역원, 항원 또는 백신의 능력을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "에피토프"는 항체 또는 T 세포 수용체의 항원 결합 부위와 접촉하는 항원 분자의 부분으로서 정의된다.
본원에 사용된 용어 "백신"은 완전 질환-유발 유기체 (사멸 또는 약화된 것) 또는 이러한 유기체의 성분, 예컨대 단백질, 펩티드 또는 폴리사카라이드로 이루어진 항원을 함유하며, 유기체가 유발하는 질환에 대한 면역을 부여하는데 사용되는 제제를 지칭한다. 백신 제제는 천연, 합성 또는 재조합적으로 유래된 제제 중 임의의 하나를 포함하거나 또는 제외할 수 있다. 재조합적으로 유래된 제제는 예를 들어 재조합 DNA 기술에 의해 수득될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "항원 특이적"은 특정한 항원 또는 항원의 단편의 공급이 특이적 세포 증식을 발생시키도록 하는 세포 집단의 특성을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "특이적 결합"은 결합 쌍 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 상호작용을 지칭한다. 다양한 경우에, 특이적 결합은 약 10-6 몰/리터, 약 10-7 몰/리터, 또는 약 10-8 몰/리터, 또는 그 미만의 친화도 상수에 의해 구현될 수 있다.
본원에 사용된 어구 "실질적으로 유사한", "실질적으로 동일한", "동등한", 또는 "실질적으로 동등한"은 관련 기술분야의 통상의 기술자가 값 (예를 들어, Kd 값, 항-바이러스 효과 등)에 의해 측정된 생물학적 특징의 맥락 내에서 2개의 값 사이의 차이를 생물학적 및/또는 통계적 유의성이 거의 또는 전혀 없는 것으로 간주하도록 하는, 2개의 수치값 (예를 들어, 하나는 분자와 연관되고, 다른 것은 참조/비교 분자와 연관됨) 사이의 충분히 높은 정도의 유사성을 나타낸다. 상기 2개의 값 사이의 차이는 참조/비교 분자에 대한 값의 함수로서, 예를 들어 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만 및/또는 약 10% 미만이다.
본원에 사용된 어구 "실질적으로 감소된" 또는 "실질적으로 상이한"은 관련 기술분야의 통상의 기술자가 값 (예를 들어, Kd 값)에 의해 측정된 생물학적 특징의 맥락 내에서 2개의 값 사이의 차이를 통계적 유의성을 갖는 것으로 간주하도록 하는, 2개의 수치 값 (일반적으로 하나는 분자와 연관되고, 다른 것은 참조/비교 분자와 연관됨) 사이의 충분히 높은 정도의 차이를 나타낸다. 상기 2개의 값 사이의 차이는 참조/비교 분자에 대한 값의 함수로서, 예를 들어 약 10% 초과, 약 20% 초과, 약 30% 초과, 약 40% 초과 및/또는 약 50% 초과이다.
본원에 사용된 "결합 친화도"는 일반적으로, 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총 합계의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내인성 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 나타내어질 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것들을 포함한, 관련 기술분야에 공지된 통상의 방법에 의해 측정될 수 있다. 저-친화도 항체는 일반적으로 항원에 느리게 결합하고 용이하게 해리되는 경향이 있는 반면에, 고-친화도 항체는 일반적으로 항원에 보다 신속하게 결합하고 보다 오랫동안 결합된 채로 남아있는 경향이 있다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 이 중 임의의 것이 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 구체적인 예시적 실시양태가 하기에 기재된다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 "Kd" 또는 "Kd 값"은 하기 검정에 의해 기재된 바와 같이 관심 항체의 Fab 버전 및 그의 항원을 사용하여 수행되는 방사성표지된 항원 결합 검정 (RIA)에 의해 측정한다. 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화도는 비표지된 항원의 적정 시리즈의 존재 하에 (125I)-표지된 항원의 최소 농도로 Fab를 평형화시킨 후, 항-Fab 항체-코팅된 플레이트를 사용하여 결합된 항원을 포획함으로써 측정한다 (Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881). 검정에 대한 조건을 확립하기 위해, 마이크로타이터 플레이트 (다이넥스(Dynex))를 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중 5 μg/mL의 포획 항-Fab 항체 (카펠 랩스(Cappel Labs))로 밤새 코팅하고, 후속적으로 PBS 중 2% (w/v) 소 혈청 알부민으로 2 내지 5시간 동안 실온 (대략 23℃)에서 차단한다. 비-흡착 플레이트 (눈크(Nunc) #269620)에서는 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원을 관심 Fab의 연속 희석물과 혼합한다 (예를 들어, 문헌 [Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)]의 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치함). 이어서, 관심 Fab를 밤새 인큐베이션하였으나, 평형이 도달하는 것을 확실하게 하기 위해 더 오랜 시간 (예를 들어, 65시간) 동안 계속 인큐베이션할 수 있다. 이후에, 혼합물을 포획 플레이트로 옮겨 실온에서 (예를 들어, 1시간 동안) 인큐베이션한다. 이어서, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중의 0.1% 트윈(Tween)-20으로 8회 세척한다. 플레이트를 건조시킬 때, 150 μL/웰의 섬광제 (마이크로신트(MicroScint)-20; 팩커드(Packard))를 첨가하고, 플레이트를 탑카운트(Topcount) 감마 계수기 (팩커드) 상에서 10분 동안 카운팅한다. 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각 Fab의 농도를 선택하여 경쟁적 결합 검정에 사용한다. 또 다른 실시양태에 따르면, Kd 또는 Kd 값은 ~ 10의 반응 단위 (RU)로 고정된 항원 CM5 칩을 사용하여 25℃에서 비아코어(BIAcore)™-2000 또는 비아코어™-3000 (비아코어, 인크.(BIAcore, Inc.), 뉴저지주 피스카타웨이)을 사용하는 표면 플라즈몬 공명 검정을 사용함으로써 측정한다. 간략하게, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어 인크.)을 공급업체의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 pH 4.8의 10 mM 아세트산나트륨을 사용하여 5 μg/mL (~0.2 μM)로 희석한 후에 커플링된 단백질의 대략 10 반응 단위 (RU)가 달성되도록 5 μL/분의 유량으로 주입한다. 항원의 주입 후, 1 M 에탄올아민을 주입하여 미반응기를 차단한다. 각각의 실험에서, 스팟을 활성화하고 에탄올아민을 참조 차감을 위해 사용되도록 고정 단백질 없이 차단한다. 동역학 측정을 위해, Fab의 2-배 연속 희석물 (0.78 nM 내지 500 nM)을 약 25 μL/분의 유량으로 25℃에서 0.05％ 트윈 20을 갖는 PBS (PBST) 내에 주입한다. 회합률 (kon) 및 해리율 (koff)은 회합 및 해리 센소그램을 동시에 핏팅시켜서 단순한 일-대-일 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델 (BIAcore 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 koff/kon의 비로 계산한다. 예를 들어, 문헌 [Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881]을 참조한다. 상기 표면 플라스몬 공명 검정에 의해 온-레이트가 106 M-1s-1을 초과하는 경우, 온-레이트는 분광계, 예컨대 정지-유동 설비 분광광도계 (아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments) 또는 교반 큐벳이 구비된 8000-시리즈 SLM-아민코(Aminco) 분광광도계 (써모스펙트로닉(ThermoSpectronic))에서 측정할 때 증가하는 농도의 항원의 존재 하에, PBS (pH 7.2) 중 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 광도 (여기=295 nm; 방출=340 nm, 16 nm 통과 대역)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 사용하여 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 "온-레이트" 또는 "회합의 비율" 또는 "회합률" 또는 "kon"은 또한 고정된 항원 CM5 칩을 사용하여 25℃에서 비아코어™-2000 또는 비아코어™-3000 (비아코어, 인크., 뉴저지주 피스카타웨이)을 사용하는 상기 기재된 동일한 표면 플라즈몬 공명 기술에 의해 결정할 수 있거나, 또는 본 발명에 따른 "회합률" 또는 "kon"은 또한 공급업체의 지침에 따라 동일한 표면 플라즈몬 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)에 의해 결정할 수 있다. 항원을 pH 4.8의 10 mM 아세트산나트륨을 사용하여 5 μg/mL (~0.2 μM)로 희석한 후에 커플링된 단백질의 대략 10 반응 단위 (RU)가 달성되도록 5 μL/분의 유량으로 주입한다. 항원의 주입 후, 1 M 에탄올아민을 주입하여 미반응기를 차단한다. 동역학 측정을 위해, Fab의 2-배 연속 희석물 (0.78 nM 내지 500 nM)을 약 25 μL/분의 유량으로 25℃에서 0.05％ 트윈 20을 갖는 PBS (PBST) 내에 주입한다. 회합률 (kon) 및 해리율 (koff)은 회합 및 해리 센소그램을 동시에 핏팅시켜서 단순한 일-대-일 랭뮤어 결합 모델 (비아코어 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 koff/kon의 비로 계산한다. 예를 들어, 문헌 [Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881]을 참조한다. 그러나, 상기 표면 플라즈몬 공명 검정에 의해 온-레이트가 106 M-1s-1을 초과하는 경우, 온-레이트는 분광계, 예컨대 정지-유동 설비 분광광도계 (아비브 인스트루먼츠) 또는 교반 큐벳이 구비된 8000-시리즈 SLM-아민코 분광광도계 (써모스펙트로닉)에서 측정할 때 증가하는 농도의 항원의 존재 하에, PBS (pH 7.2) 중 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295nm; 방출 = 340nm, 16nm 통과 대역)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 사용하여 결정할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 그에 연결된 또 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 벡터의 하나의 유형은 추가의 DNA 절편이 라이게이션될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 파지 벡터이다. 또 다른 유형의 벡터는 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터는 그것이 도입되는 숙주 세포에서 자율 복제될 수 있다 (예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로의 도입 시 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 간단히, "재조합 벡터")로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환가능하게 사용될 수 있으며, 이는 플라스미드가 가장 통상적으로 사용되는 벡터의 형태이기 때문이다.
본원에서 상호교환가능하게 사용된 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하며, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기 및/또는 그의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해, 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 혼입될 수 있는 임의의 기재일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오티드 및 그의 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우에, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 개재될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 합성 후에, 예컨대 표지와의 접합에 의해 추가로 변형될 수 있다. 다른 유형의 변형은, 예를 들어 "캡", 자연 발생 뉴클레오티드 중 1개 이상의 유사체로의 치환, 뉴클레오티드간 변형, 예컨대 예를 들어 비하전된 연결 (예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트 등) 및 하전된 연결 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)을 갖는 것, 펜던트 모이어티, 예컨대 예를 들어 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-리신 등)을 함유하는 것, 삽입제 (예를 들어, 아크리딘, 프소랄렌 등)를 갖는 것, 킬레이트화제 (예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화 금속 등)를 함유하는 것, 알킬화제를 함유하는 것, 변형된 연결 (예를 들어, 알파 아노머 핵산 등)을 갖는 것, 뿐만 아니라 비변형된 형태의 폴리뉴클레오티드(들)를 포함한다. 추가로, 당 내에 통상적으로 존재하는 임의의 히드록실 기는, 예를 들어 포스포네이트 기, 포스페이트 기에 의해 대체되거나, 표준 보호기에 의해 보호되거나, 추가의 뉴클레오티드에 대한 추가의 연결이 제조되도록 활성화되거나, 또는 고체 또는 반고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 인산화되거나, 또는 아민 또는 1 내지 20개 탄소 원자의 유기 캡핑 기 모이어티로 치환될 수 있다. 다른 히드록실이 또한 표준 보호 기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 예를 들어, 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카르보시클릭 당 유사체 (아민 또는 1 내지 20개의 탄소 원자의 유기 캡핑 기 모이어티로 치환됨)를 포함하는, 일반적으로 관련 기술분야에 공지된 리보스 또는 데옥시리보스 당의 유사한 형태를 함유할 수 있다. 다른 히드록실이 또한 표준 보호 기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 측쇄를 함유할 수 있다. 1개 이상의 포스포디에스테르 연결은 대안적 연결 기에 의해 대체될 수 있다. 이들 대안적 연결 기는 포스페이트가 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), (O)NR2 ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2 ("포름아세탈")에 의해 대체된 실시양태를 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 여기서 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H, 또는 임의로 에테르 (1 내지 20개의 탄소 원자)를 함유하는 치환 또는 비치환된 알킬 (1-20C)이다. 다른 히드록실이 또한 표준 보호 뉴클레오티드로 유도체화될 수 있고 동일할 필요가 있다. 상기 기재는 RNA 및 DNA를 포함한, 본원에 언급된 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.
본원에 사용된 "올리고뉴클레오티드"는 일반적으로, 반드시는 아니지만 전형적으로 길이가 약 200개 뉴클레오티드 미만으로 짧은 단일-가닥의 합성 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호 배타적이지 않다. 폴리뉴클레오티드에 대한 상기 기재는 올리고뉴클레오티드에 대해 동등하게 및 완전하게 적용가능하다.
본원에 사용된 "항체" (Ab) 및 "이뮤노글로불린" (Ig)은 동일한 구조적 특징을 갖는 당단백질이다. 항체는 특정 항원에 대해 결합 특이성을 나타내지만, 이뮤노글로불린은 항체, 및 일반적으로 항원 특이성이 결여된 다른 항체-유사 분자 둘 다를 포함한다. 후자 종류의 폴리펩티드는, 예를 들어 림프계에 의해 낮은 수준으로 및 골수종에 의해 증가된 수준으로 생산된다.
본원에 사용된 용어 "항체" 및 "이뮤노글로불린"은 가장 넓은 의미에서 상호교환가능하게 사용되고, 모노클로날 항체 (예를 들어, 전장 또는 무손상 모노클로날 항체), 폴리클로날 항체, 1가 항체, 다가 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이중특이적 항체)를 포함하고, 또한 특정 항체 단편 (본원에서 보다 상세히 기재된 바와 같음)을 포함할 수 있다. 항체는 키메라 항체, 인간 항체, 인간화 항체 및/또는 친화도 성숙 항체일 수 있다.
본원에 사용된 항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 지칭한다. 이들 도메인은 일반적으로 항체의 가장 가변적인 부분이고, 항원-결합 부위를 함유한다.
본원에 사용된 용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체마다 서열에 있어서 광범위하게 상이하고, 각각의 특정한 항체의 그의 특정한 항원에 대한 결합 및 특이성에 사용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전반에 걸쳐 고르게 분포되지 않는다. 이는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 다에서 상보성-결정 영역 (CDR) 또는 초가변 영역으로 불리는 3개의 절편에 농축되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 (FR)로 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은, 루프 연결부를 형성하고 일부 경우에 베타-시트 구조의 부분을 형성하는 3개의 CDR에 의해 연결된, 주로 베타-시트 형상을 취하는 4개의 FR 영역을 각각 포함한다. 각각의 쇄에서의 CDR은 FR 영역에 근접하게 함께 유지되어 있고, 다른 쇄로부터의 CDR과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항체가 항원에 결합하는 것에 직접적으로 수반되지는 않지만, 항체-의존성 세포 독성에서의 항체의 참여와 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.
항체의 파파인 소화는 "Fab" 단편으로 불리는, 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 2개의 동일한 항원-결합 단편, 및 명칭이 용이하게 결정화되는 그의 능력을 반영한 것인 잔류 "Fc" 단편을 생성한다. 펩신 처리에 의해, 2개의 항원-결합 부위를 갖고 여전히 항원에 가교-연결될 수 있는 F(ab')2 단편이 생성된다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 -결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 2-쇄 Fv 종에서, 이러한 영역은 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인이 단단하게 비공유적으로 회합된 이량체로 이루어진다. 단일쇄 Fv 종에서, 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인은 경쇄 및 중쇄가 2-쇄 Fv 종에서의 경우와 유사한 "이량체" 구조로 회합할 수 있도록 가요성 펩티드 링커에 의해 공유 연결될 수 있다. 이 형상에서, 각각의 가변 도메인의 3개의 CDR은 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상에 항원-결합 부위를 정의한다. 집합적으로, 6개의 CDR이 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 단지 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)도 전체 결합 부위보다 친화도가 낮긴 하지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 1개 이상의 시스테인을 포함한 중쇄 CH1 도메인의 카르복실 말단에서의 몇몇 잔기의 부가에 의해 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 기를 보유하고 있는, Fab'에 대한 본원의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 원래 이들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.
임의의 척추동물 종으로부터의 항체 (이뮤노글로불린)의 "경쇄"는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 2가지 명확히 별개의 유형 중 하나에 할당될 수 있다.
중쇄 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체 (이뮤노글로불린)는 상이한 부류로 할당될 수 있다. 5가지 주요 부류의 이뮤노글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇가지는 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 나누어질 수 있다. 이뮤노글로불린 (bulin으로 불림)의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 상이한 부류로 할당될 수 있다. 이뮤노글로불린의 상이한 부류의 5개의 3-차원 형상이 널리 공지되어 있고 일반적으로 예를 들어, 문헌 [Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (2000)]에 기재되어 있다. 항체는 항체와 1종 이상의 다른 단백질 또는 펩티드의 공유 또는 비-공유 회합에 의해 형성되는, 보다 큰 융합 분자의 부분일 수 있다.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "완전 항체"는, 하기에 정의된 바와 같은 항체 단편이 아닌, 실질적으로 무손상 형태의 항체를 지칭하는 것으로 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 용어는 특히 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 "항체 단편"은 무손상 항체 내에 존재할 때 그 부분과 정상적으로 연관된 기능 중 적어도 하나 및 많게는 대부분 또는 모두를 유지하는 무손상 항체의 부분만을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 단편은 무손상 항체의 항원 결합 부위를 포함하므로 항원에 결합하는 능력을 유지한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 단편, 예를 들어 Fc 영역을 포함하는 항체 단편은, 무손상 항체 내에 존재하는 경우에 Fc 영역과 정상적으로 연관된 생물학적 기능들, 예컨대 FcRn 결합, 항체 반감기 조정, ADCC 기능 및 보체 결합 중 적어도 하나의 기능을 유지한다. 한 실시양태에서, 항체 단편은 무손상 항체와 실질적으로 유사한 생체내 반감기를 갖는 1가 항체이다. 예를 들어, 이러한 항체 단편은 단편에 생체내 안정성을 부여할 수 있는 Fc 서열에 연결된 항원 결합 아암을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉, 집단을 구성하는 개별 항체는 미량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고 동일하다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 개별 항체의 혼합물이 아닌 것으로서의 항체의 특징을 나타낸다. 이러한 모노클로날 항체는 전형적으로 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하며, 여기서 표적-결합 폴리펩티드 서열은 복수의 폴리펩티드 서열로부터 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열의 선택을 포함하는 방법에 의해 수득된 것이다. 특정 실시양태에서, 모노클로날 항체는 천연 서열을 제외할 수 있다. 일부 측면에서, 선택 방법은 복수의 클론, 예컨대 하이브리도마 클론, 파지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀로부터 고유한 클론을 선택하는 것일 수 있다. 선택된 표적 결합 서열을 추가로 변경시켜, 예를 들어 표적에 대한 친화도를 개선시키고, 표적 결합 서열을 인간화하고, 세포 배양물 중에서의 그의 생성을 개선시키고, 생체내에서 그의 면역원성을 감소시키고, 다중특이적 항체를 생성할 수 있으며, 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체도 또한 본 발명의 모노클로날 항체라는 것을 이해해야 한다. 상이한 결정기 (예를 들어, 에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 달리, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지시된다. 모노클로날 항체 제제는 그의 특이성에 추가로 다른 이뮤노글로불린에 의해 전형적으로 오염되지 않는다는 점에서 유리하다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 동종인 항체의 집단으로부터 수득됨에 따른 항체의 특징을 나타내며, 임의의 특정한 방법에 의한 항체의 제조를 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는, 예를 들어 하이브리도마 방법 (예를 들어, 문헌 [Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)]), 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조), 파지 디스플레이 기술 (예를 들어, 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)] 참조), 및 동물에서 인간 이뮤노글로불린 유전자좌 또는 인간 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 유전자 중 일부 또는 모두를 갖는 인간 또는 인간-유사 항체를 생산하는 기술 (예를 들어, 문헌 [WO98/24893; WO96/34096; WO96/33735; WO91/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); 미국 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016; Marks et al., Bio. Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996) 및 Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)] 참조)을 포함한 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
본원에서 모노클로날 항체는 구체적으로 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정한 종으로부터 유래되거나 특정한 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서의 상응하는 서열과 동일하거나 그에 상동이고, 쇄(들)의 나머지 부분은 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서의 상응하는 서열과 동일하거나 그에 상동인 "키메라" 항체, 뿐만 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이러한 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)]).
본 발명의 항체는 또한 본 발명의 항체에서 생성된 키메라화 또는 인간화 모노클로날 항체를 포함한다.
항체는 전장일 수 있거나, Fab, F(ab')2, Fab', F(ab)', Fv, 단일 쇄 Fv (scFv), 2가 scFv (비-scFv), 3가 scFv (트리-scFv), Fd, dAb 단편 (예를 들어, 문헌 [Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989)]), CDR, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 선형 항체, 단일-쇄 항체 분자, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하나 이에 제한되지 않는 항원-결합 부분을 갖는 항체의 단편 (또는 단편들)을 포함할 수 있다. 재조합 방법, 또는 합성 링커를 사용하여 항체 단편을 결합시킴으로써 제조된 단일 쇄 항체는 또한 본 발명에 의해 포함된다. 문헌 [Bird et al. Science, 1988, 242:423-426. Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85:5879-5883].
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 단일특이적, 이중-특이적 또는 다중특이적일 수 있다.
IgG (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA (IgA1, IgA2), IgD 또는 IgE를 포함한 모든 항체 이소형은 본 개시내용에 의해 포함된다 (모든 부류 및 하위부류가 본 발명에 의해 포함된다). 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 포유동물 (예를 들어, 마우스, 인간) 항체 또는 그의 항원-결합 부분일 수 있다. 항체의 경쇄는 카파 또는 람다 유형의 것일 수 있다.
따라서, 본 발명의 항암 항체는 본 발명의 항체에 혼입될 수 있는 비-뮤린 기원, 바람직하게는 인간 기원의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 프레임워크 영역 또는 그의 임의의 부분과의 조합을 포함한다.
항체는 참조 항체에 의해 생산된 항체의 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87% 초과, 적어도 약 88% 초과, 적어도 약 89% 초과, 적어도 약 90% 초과, 적어도 약 91% 초과, 적어도 약 92% 초과, 적어도 약 93% 초과, 적어도 약 94% 초과, 적어도 약 95% 초과, 적어도 약 96% 초과, 적어도 약 97% 초과, 적어도 약 98% 초과, 적어도 약 99% 초과 또는 약 100% 상동성인 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역을 갖고, 또한 탄수화물 항원 (예를 들어, SSEA-4)에 결합할 수 있다. 상동성은 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 수준으로 존재할 수 있다. 일부 측면에서 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열에 대해 인용된 상동성을 갖는 항체의 서열은 자연 발생 항체 서열을 제외할 것이다. 일부 측면에서 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열에 대해 인용된 상동성을 갖는 항체의 서열은 자연 발생 항체 서열을 포함할 것이다.
특정 실시양태에서, 표 1-3에서의 CDR에 상응하는 CDR은 서열 변이를 갖는다. 예를 들어, CDR에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 잔기, 또는 총 잔기의 20% 미만, 30% 미만, 또는 약 40% 미만이 치환되거나 결실된 CDR은 탄수화물 항원에 결합하는 항체 (또는 그의 항원-결합 부분)에 존재할 수 있다.
항체 또는 항원-결합 부분은 펩티드일 수 있다. 이러한 펩티드는 생물학적 활성, 예를 들어, 탄수화물 항원의 결합을 나타내는 펩티드의 변이체, 유사체, 오르토로그, 상동체 및 유도체를 포함할 수 있다. 펩티드는 아미노산 (예를 들어, 비-자연 발생 아미노산, 비관련된 생물학적 계에서 단지 자연적으로 발생하는 아미노산, 포유동물 계로부터의 변형된 아미노산 등을 포함함)의 1종 이상의 유사체, 치환된 연결을 갖는 펩티드, 뿐만 아니라 관련 기술분야에 공지된 다른 변형을 함유할 수 있다.
또한, 특정 아미노산이 치환되거나, 결실되거나, 부가된 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 본 발명의 범주 내에 있다. 예시적 실시양태에서, 이들 변경은 펩티드의 생물학적 특성 예컨대 결합 친화도에 대해 실질적 효과를 갖지 않는다. 또 다른 예시적 실시양태에서, 항체는 예컨대, 항원에 대한 항체의 결합 친화도를 개선하기 위해 프레임워크 영역 내에 아미노산 치환을 가질 수 있다. 또 다른 예시적 실시양태에서, 선택된, 소수의 수용자 프레임워크 잔기는 상응하는 공여자 아미노산에 의해 대체될 수 있다. 공여자 프레임워크는 성숙 또는 배선 인간 항체 프레임워크 서열 또는 컨센서스 서열일 수 있다. 표현형적 침묵 아미노산 치환을 어떻게 만드는지에 관한 안내는 문헌 [Bowie et al., Science, 247: 1306-1310 (1990). Cunningham et al., Science, 244: 1081-1085 (1989). Ausubel (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1994). T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Pearson, Methods Mol. Biol. 243:307-31 (1994). Gonnet et al., Science 256: 1443-45 (1992)]에 제공되어 있다.
항체, 또는 그의 항원-결합 부분은 또 다른 기능적 분자에 유도체화되거나 연결될 수 있다. 예를 들어, 항체는 1종 이상의 다른 분자적 실체, 예컨대 또 다른 항체, 검출가능한 작용제, 세포독성제, 제약 작용제, 또 다른 분자 (예컨대 스트렙타비딘 코어 영역 또는 폴리히스티딘 태그)와의 회합을 매개할 수 있는 단백질 또는 펩티드, 아미노산 링커, 신호 서열, 면역원성 담체, 또는 단백질 정제에 유용한 리간드, 예컨대 글루타티온-S-트랜스퍼라제, 히스티딘 태그, 및 스타필로코쿠스 단백질 A에 기능적으로 (화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유 상호작용 등에 의해) 연결될 수 있다. 유도체화 단백질의 한 가지 유형은 (동일한 유형의 또는 상이한 유형의) 2종 이상의 단백질을 가교시킴으로써 제조된다. 적합한 가교제는 적절한 스페이서에 의해 분리된 2개의 별개의 반응성 기를 갖는 이종이관능성 (예를 들어, m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르), 또는 동종이관능성 (예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트)의 것들을 포함한다. 이러한 링커는 록포드 111 소재 피어스 케미칼 캄파니(Pierce Chemical Company)로부터 입수가능하다. 단백질이 유도체화될 (또는 표지될) 수 있는 유용한 검출가능한 작용제는 형광 화합물, 다양한 효소, 보결분자단, 발광 물질, 생물발광 물질, 및 방사성 물질을 포함한다. 비-제한적인, 예시적인 형광 검출가능한 작용제는 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 및 피코에리트린을 포함한다. 단백질 또는 항체는 또한 검출가능한 효소, 예컨대 알칼리성 포스파타제, 양고추냉이 퍼옥시다제, 베타-갈락토시다제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코스 옥시다제 등으로 유도체화될 수 있다. 단백질은 또한 보결분자단 (예를 들어, 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴)으로 유도체화될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분의 기능적 활성 변이체를 코딩하는 핵산은 또한 본 발명에 의해 포함된다. 이들 핵산 분자는 중간 엄격성, 높은 엄격성, 또는 매우 높은 엄격성 조건 하에서 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분 중 임의의 것을 코딩하는 핵산과 혼성화할 수 있다. 혼성화 반응을 수행하기 위한 안내는 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. 6.3.1-6.3.6, 1989]에서 발견될 수 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다. 본원에 언급된 특이적 혼성화 조건은 하기와 같다: (1) 중간 엄격성 혼성화 조건: 약 45℃에서 6 X SSC, 이어서 60℃에서 0.2 X SSC, 0.1% SDS에서 1회 이상 세척; (2) 높은 엄격성 혼성화 조건: 약 45℃에서 6 X SSC, 이어서 65℃에서 0.2XSSC, 0.1% SDS에서 1회 이상 세척; 및 (3) 매우 높은 엄격성 혼성화 조건: 65℃에서 0.5 M 인산나트륨, 7% SDS, 이어서 65℃에서 0.2XSSC, 1% SDS에서 1회 이상 세척.
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 코딩하는 핵산을 적합한 발현 시스템에서 발현될 수 있는 발현 벡터 내로 도입한 후, 발현된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 단리 또는 정제할 수 있다. 임의로, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 코딩하는 핵산은 무세포 번역 시스템에서 번역될 수 있다. 미국 특허 번호 4,816,567. 문헌 [Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86: 10029-10033 (1989)].
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 목적하는 항체의 경쇄 및 중쇄 (또는 그의 부분)를 코딩하는 DNA로 형질전환된 숙주 세포에 의해 생산될 수 있다. 항체는 표준 기술을 사용하여 이들 배양 상청액 및/또는 세포로부터 단리되고, 정제될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 항체의 경쇄, 중쇄, 또는 둘 다를 코딩하는 DNA로 형질전환될 수 있다. 재조합 DNA 기술은 또한 결합에 필요하지 않은 (예를 들어, 불변 영역) 경쇄 및 중쇄 중 어느 하나 또는 둘 다를 코딩하는 DNA의 일부 또는 전부를 제거하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 핵산은 원핵 세포 및 진핵 세포, 예를 들어, 박테리아 세포 (예를 들어, 이. 콜라이(E. coli)), 효모 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 및 포유동물 세포를 포함한 다양한 적합한 세포에서 발현될 수 있다. 다수의 포유동물 세포주는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)으로부터 이용가능한 불멸화 세포주를 포함한다. 세포의 비제한적 예는 원숭이 신장 세포의 모 세포, 유도체 및/또는 조작된 변이체 (COS, 예를 들어, COS-1, COS-7), HEK293, 새끼 햄스터 신장 (BHK, 예를 들어, BHK21), 차이니스 햄스터 난소 (CHO), NS0, PerC6, BSC-1, 인간 간세포성 암종 세포 (예를 들어, Hep G2), SP2/0, HeLa, 마딘-다비(Madin-Darby) 소 신장 (MDBK), 골수종 및 림프종 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는 포유동물 기원 또는 포유동물-유사 특징의 모든 세포주를 포함한다. 조작된 변이체는 예를 들어, 글리칸 프로파일 변형된 및/또는 부위-특이적 통합 부위 유도체를 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 핵산을 포함하는 세포를 제공한다. 세포는 하이브리도마 또는 형질감염체일 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 관련 기술분야에 널리 공지된 고체 상 절차에 의해 합성될 수 있다. 문헌 [Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach by E. Atherton and R. C. Sheppard, published by IRL at Oxford University Press (1989). Methods in Molecular Biology, Vol. 35: Peptide Synthesis Protocols (ed. M. W.Pennington and B. M. Dunn), chapter 7. Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984). G. Barany and R. B. Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, editors E. Gross and J. Meienhofer, Vol. 1 and Vol. 2, Academic Press, New York, (1980), pp. 3-254. M. Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin (1984)].
비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 한 실시양태에서, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및/또는 능력을 갖는 비-인간 종 (공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류의 초가변 영역으로부터의 잔기에 의해 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 정밀화하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 것이다. 또한, 인간화 항체는 임의로 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc) 중 적어도 한 부분, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 것을 포함할 것이다. 추가의 세부사항에 대해서는, 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다. 또한, 하기 종설 논문 및 그에 인용된 참고문헌을 참조한다: 문헌 [Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)].
용어 "초가변 영역", "HVR", 또는 "HV"는, 본원에서 사용될 때, 서열이 초가변성이고/이거나 구조적으로 한정된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 초가변 영역을 포함하며; VH에 3개가 있고 (H1, H2, H3), VL에 3개가 있다 (L1, L2, L3). 다수의 초가변 영역 묘사가 사용되고 있으며 본원에 포괄된다. 카바트(Kabat) 상보성 결정 영역 (CDR)은 서열 가변성을 기초로 하며, 가장 통상적으로 사용된다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). 대신, 코티아(Chothia)는 구조적 루프의 위치를 지칭한다 (문헌 [Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]).
본원에 사용된 "프레임워크" 또는 "FW" 잔기는 본원에 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
용어 "카바트에서와 같은 가변 도메인 잔기 넘버링" 또는 "카바트에서와 같은 아미노산 위치 넘버링", 및 그의 변형은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에서의 항체의 편집의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 대해 사용된 넘버링 시스템을 지칭한다. 이러한 넘버링 시스템을 사용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 단축, 또는 그 내로의 삽입에 상응하게 보다 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 다음에 단일 아미노산 삽입물 (예를 들어, 카바트에 따라 잔기 52a), 및 중쇄 FR 잔기 82 다음에 삽입된 잔기 (예를 들어, 카바트에 따라 잔기 82a, 82b, 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 카바트 넘버링은 항체 서열을 "표준" 카바트 넘버링된 서열과 상동성 영역에서 정렬함으로써 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다.
본원에 사용된 "단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재한다. 일반적으로, scFv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위한 목적하는 구조를 형성할 수 있게 하는, VH 도메인과 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 검토에 대해서는 문헌 [Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.
본원에 사용된 용어 "디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 소형 항체 단편을 지칭하며, 상기 단편은 동일한 폴리펩티드 쇄에 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH) (VH-VL)을 포함한다. 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이의 쌍형성을 허용하기에 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍형성하도록 강제되고 2개의 항원-결합 부위를 생성한다. 디아바디는 예를 들어, EP 404,097; WO 93/1161; 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]에 보다 충분히 기재되어 있다.
본원에 사용된 "인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 보유하고/거나 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체를 제조하기 위한 임의의 기술을 사용하여 제조된 것이다. 인간 항체의 이러한 정의에서 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 구체적으로 제외된다.
본원에 사용된 "친화도 성숙 항체"는 변경(들)을 갖지 않는 모 항체에 비해 항원에 대한 항체의 친화도를 개선시키는, 그의 하나 이상의 HVR에 하나 이상의 변경을 갖는 항체이다. 한 실시양태에서, 친화도 성숙 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화도를 갖는다. 친화도 성숙 항체는 관련 기술분야에 공지된 절차에 의해 생산된다. 문헌 [Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992)]은 VH 및 VL 도메인 셔플링(shuffling)에 의한 친화도 성숙을 기재하고 있다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발이 하기 문헌에 기재되어 있다: 문헌 [Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); 및 Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)].
본원에 사용된 "차단 항체" 또는 "길항제 항체"는 그가 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 또는 감소시키는 항체이다. 특정 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 억제한다.
본원에 사용된 "효능제 항체"는 관심 폴리펩티드의 기능적 활성 중 적어도 하나를 모방하는 항체이다.
본원에 사용된 "장애"은 본 발명의 항체를 사용한 치료로부터 이익을 얻을 임의의 상태이다. 이는 만성 및 급성 장애 또는 질환 (포유동물이 해당 장애에 걸리기 쉬운 병리학적 상태 포함)을 포함한다. 본원에서 치료될 장애의 비제한적 예는 암을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "세포 증식성 장애" 및 "증식성 장애"는 어느 정도의 비정상 세포 증식과 연관된 장애를 지칭한다. 한 실시양태에서, 세포 증식성 장애는 암이다.
본원에 사용된 "종양"은 악성이든 양성이든 모든 신생물성 세포 성장 및 증식, 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다. 용어 "암", "암성", "세포 증식성 장애", "증식성 장애" 및 "종양"은 본원에 언급된 바와 같이 상호 배타적이지 않다.
본원에 사용된 용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 비조절된 세포 성장/증식을 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 상태를 지칭하거나, 또는 기재한다. 암의 예는 암종, 림프종 (예를 들어, 호지킨 및 비호지킨 림프종), 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예는 편평 세포암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평세포 암종, 복막암, 간세포성암, 위장암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 백혈병 및 다른 림프증식성 장애, 및 다양한 유형의 두경부암을 포함한다.
본원에 사용된 "치료"는 치료될 개체 또는 세포의 자연적인 경과를 변경하려는 시도에서의 임상 개입을 지칭하고, 예방을 위해 또는 임상 병리상태의 과정 도중에 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학 결과의 축소, 염증 및/또는 조직/장기 손상의 방지 또는 감소, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 호전, 및 완화 또는 개선된 예후를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 질환 또는 장애의 발병을 지연시키기 위해 사용된다.
본원에 사용된 "항체-약물 접합체 (ADC)"는 세포독성제, 예컨대 화학요법제, 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 그의 단편) 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성접합체)에 접합된 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 "T 세포 표면 항원"은 MHC-연관된 펩티드 항원의 특이적인 인식을 위해 T-세포에 의해 사용되는 모든 T-세포의 주요 한정 마커인, T-세포 항원 수용체 (TcR)를 포함하는, 관련 기술분야에 공지된 대표 T 세포 표면 마커를 포함할 수 있는 항원을 지칭한다. TcR과 연관된 예시는 CD3으로 공지된 단백질의 복합체이며, 이는 그의 동족 MHC/항원 복합체로의 TcR 결합에 이어서 세포내 신호의 전달에 참여한다. T 세포 표면 항원의 다른 예는 CD2, CD4, CD5, CD6, CD8, CD28, CD40L 및/또는 CD44를 포함 (또는 제외)할 수 있다.
본원에 사용된 "개체" 또는 "대상체"는 척추동물이다. 특정 실시양태에서, 척추동물은 포유동물이다. 포유동물에는 가축 (예컨대 소), 스포츠 동물, 애완동물 (예컨대 고양이, 개 및 말), 영장류, 마우스 및 래트가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 척추동물은 인간이다.
본원에 사용된 치료 목적을 위한 "포유동물"은 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 소 등을 포함하는, 포유동물로 분류되는 임의의 동물을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.
본원에 사용된 "유효량"은 목적하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량에서 및 이러한 기간 동안 유효한 양을 지칭한다.
본 발명의 물질/분자의 "치료 유효량"은 개체의 질환 상태, 연령, 성별, 및 체중, 및 개체에서 목적하는 반응을 유도하는 물질/분자의 능력과 같은 요인에 따라 변할 수 있다. 또한, 치료 유효량은 물질/분자의 임의의 독성 또는 유해한 효과를 치료상 유익한 효과가 능가하는 양이다. "예방 유효량"은 목적하는 예방 결과를 달성하는데 필요한 투여량 및 기간에서 이를 달성하는데 유효한 양을 지칭한다. 반드시는 아니지만 전형적으로, 예방 용량은 질환의 보다 초기 단계에 앞서, 또는 보다 초기 단계에서 대상체에서 사용되기 때문에, 예방 유효량은 치료 유효량 미만일 것이다.
본원에 사용된 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 방해하고/거나 세포의 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제 (예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드, 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입제), 효소 및 그의 단편, 예컨대 핵산분해 효소, 항생제, 및 독소, 예컨대 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 소분자 독소 또는 효소적 활성 독소 (그의 단편 및/또는 변이체 포함), 및 하기 개시한 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함하는 것으로 의도된다. 다른 세포독성제는 하기 기재되어 있다. 종양사멸제는 종양 세포의 파괴를 유발한다.
본원에 사용된 "화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예는 알킬화제 예컨대 티오테파 및 시톡산(CYTOXAN)® 시클로포스파미드; 알킬 술포네이트 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸라멜라민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로칸나비놀 (드로나비놀, 마리놀(MARINOL)®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜키신; 베툴린산; 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 (하이캄틴(HYCAMTIN)®), CPT-11 (이리노테칸, 캄프토사르(CAMPTOSAR)®), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴 및 9-아미노캄프토테신 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (이의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토피신 (특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신 (합성 유사체인 KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드 예컨대 클로람부실, 클로마파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레틸아민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라니무스틴; 항생제 예컨대 에네디인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 오메가I1 (예를 들어, 문헌 [Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)] 참조); 디네미신 A를 포함하는 디네미신; 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소단백질 에네디인 항생제 발색단, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 아드리아마이신(ADRIAMYCIN)® 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 예컨대 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사물 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루로우라실 (5-FU); 폴산 유사체 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신제 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 보충제 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK® 폴리사카라이드 복합체 (JHS 내츄럴 프로덕츠(JHS Natural Products), 오리건주 유진); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라큐린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신 (엘디신(ELDISINE)®, 필데신(FILDESIN)®); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 탁솔(TAXOL)® 파클리탁셀 (브리스톨-마이어스 스큅 온콜로지(Bristol-Myers Squibb Oncology), 뉴저지주 프린스턴), 파클리탁셀의 크레모포르-프리(Cremophor-free) 알부민-조작 나노입자 제제인 아브락산(ABRAXANE)™ (아메리칸 파마슈티칼 파트너스(American Pharmaceutical Partners), 일리노이주 샴버그) 및 탁소테레(TAXOTERE)® 도세탁셀 (롱-쁠랑 로러(Rhone-Poulenc Rorer), 프랑스 안토니); 클로람부실; 겜시타빈 (겜자르(GEMZAR)®); 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴 (벨반(VELBAN)®); 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴 (온코빈(ONCOVIN)®); 옥살리플라틴; 류코보빈; 비노렐빈 (나벨빈(NAVELBINE)®); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드 예컨대 레티노산; 카페시타빈 (젤로다(XELODA)®); 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 상기 중 2개 이상의 조합물 예컨대 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 조합 요법에 대한 약어인 CHOP, 및 5-FU 및 류코보빈과 조합된 옥살리플라틴 (엘록사틴(ELOXATIN)™)으로의 치료 요법에 대한 약어인 FOLFOX를 포함한다.
SSEA-4를 표적화하는 항체
본 개시내용의 한 측면은 SSEA-4 관련된 항원을 표적화하는 신규 항체를 특색으로 한다.
mAb 1J1s (ATCC 수탁 번호 PTA-122679)는 하이브리도마 세포주 (ATCC 수탁 번호 PTA-122679)에 의해 생산되는 모노클로날 항체이다. 본원에 기재된 항체는 항체 1J1s와 동일한 VH 및 VL 쇄를 함유할 수 있다. 1J1s와 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 또한 본 개시내용의 범주 내이다.
예시 및 그의 아미노산 및 핵산 구조/서열이 하기에 제공된다:
표 1. 항체 1J1s의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열
Figure pct00001
mAb 1G1s (ATCC 수탁 번호 PTA-122678)는 하이브리도마 세포주 (ATCC 수탁 번호 PTA-122678)에 의해 생산되는 마우스 모노클로날 항체이다. 본원에 기재된 항체는 항체 1G1s와 동일한 VH 및 VL 쇄를 함유할 수 있다. 1G1s와 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 또한 본 개시내용의 범주 내이다.
예시 및 그의 아미노산 및 핵산 구조/서열이 하기에 제공된다:
표 2. 항체 1G1s의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열
Figure pct00002
mAb 2F20s (ATCC 수탁 번호 PTA-122676)는 하이브리도마 세포주 (ATCC 수탁 번호 PTA-122676)에 의해 생산되는 모노클로날 항체이다. 본원에 기재된 항체는 항체 2F20s와 동일한 VH 및 VL 쇄를 함유할 수 있다. 2F20s와 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 또한 본 개시내용의 범주 내이다.
예시 및 그의 아미노산 및 핵산 구조/서열이 하기에 제공된다:
표 3. 항체 2F20s의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열
Figure pct00003
"1J1s 항체" 또는 "mAb 1J1s" 또는 "클론 1J1s로부터의 항체"는 클론 1J1s에 의해 발현되는 항체 또는 다른 방식으로 합성되지만, 동일한 CDR 및 임의로, 클론 1J1s에 의해 발현되는 항체와 동일한 프레임워크 영역을 갖는 항체를 지칭한다.
본 개시내용의 한 측면은 SSEA-4에 특이적인 신규 항체를 특색으로 한다. 항-SSEA-4 항체는 Neu5Acα2→ 3Galβ1→ 3GalNAcβ1→ 3Galα1→ 4Galβ1→ 4Glcβ1 (SSEA-4 헥사사카라이드)에 결합한다.
본원에 기재된 임의의 항체는 전장 항체 또는 그의 항원-결합 단편일 수 있다. 일부 예에서, 항원 결합 단편은 Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 단일-쇄 Fv 단편이다. 일부 예에서, 항원 결합 단편은 Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 단일-쇄 Fv 단편이다. 일부 예에서, 항체는 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체 또는 단일-쇄 항체이다.
본원에 기재된 임의의 항체는 하기 중 하나 이상의 특징을 갖는다: (a) 재조합 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체 단편, 이중특이적 항체, 단일특이적 항체, 1가 항체, IgG1 항체, IgG2 항체 또는 항체의 유도체임; (b) 인간, 뮤린, 인간화, 또는 키메라 항체, 항원-결합 단편 또는 항체의 유도체임; (c) 단일-쇄 항체 단편, 멀티바디(multibody), Fab 단편 및/또는 IgG, IgM, IgA, IgE, IgD 이소형 및/또는 그의 하위부류의 이뮤노글로불린임; (d) 하기 특징 중 하나 이상을 가짐: (i) 암 세포의 ADCC 및/또는 CDC를 매개함; (ii) 암 세포의 아폽토시스를 유도 및/또는 촉진함; (iii) 암 세포의 표적 세포의 증식을 억제함; (iv) 암 세포의 식세포작용을 유도 및/또는 촉진함; 및/또는 (v) 세포독성제의 방출을 유도 및/또는 촉진함; (e) 종양-특이적 탄수화물 항원인 종양-연관 탄수화물 항원에 특이적으로 결합함; (f) 비-암 세포, 비-종양 세포, 양성 암 세포 및/또는 양성 종양 세포 상에 발현되는 항원에 결합하지 않음; 및/또는 (g) 암 줄기 세포 상에 및 정상 암 세포 상에 발현되는 종양-연관 탄수화물 항원에 특이적으로 결합함.
바람직하게는 그의 각각의 항원으로의 항체의 결합은 특이적이다. 용어 "특이적"은 결합 쌍의 하나의 구성원이 그의 특이적 결합 파트너(들) 외에 다른 분자에 대하여 어떠한 유의한 결합을 나타내지 않을 것이고, 예를 들어 본원에 상세화된 것들 외에 임의의 다른 분자와 약 30% 미만, 바람직하게는 20%, 10% 또는 1% 교차-반응성을 갖는 상황을 언급하는데 일반적으로 사용된다.
항체는 고친화도 (낮은 KD 값)을 갖는 표적 에피토프에 적합하게 결합하고, 바람직하게는 KD는 나노몰 범위 이하이다. 친화도는 관련 기술분야에 공지된 방법, 예컨대 예를 들어 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정될 수 있다.
예시적인 항체 제조
본원에 기재된 글로보 H 에피토프 및 SSEA-4 에피토프에 결합할 수 있는 예시적인 항체는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Harlow and Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York]을 참조한다.
숙주 동물의 면역화 및 하이브리도마 기술
한 실시양태에서, 본 발명은 탄수화물 항원 (예를 들어, 글로보 H)에 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 하이브리도마를 제조하기 위한 방법을 제공한다. 방법은 하기 단계를 함유한다: 탄수화물 항원 (예를 들어, 글로보 H)을 포함하는 조성물로 동물을 면역화시키는 단계; 동물로부터 비장세포를 단리하는 단계; 비장세포로부터 하이브리도마를 생성하는 단계; 및 글로보 H에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택하는 단계. 문헌 [Kohler and Milstein, Nature, 256: 495, 1975. Harlow, E. and Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988].
한 실시양태에서, 탄수화물 항원은 마우스를 피하로 면역화시키는데 사용된다. 1개 이상의 부스트가 주어질 수 있거나, 그렇지 않을 수 있다. 혈장에서의 항체의 역가는 예를 들어, ELISA (효소-연결된 면역흡착 검정) 또는 유동 세포측정법에 의해 모니터링될 수 있다. 충분한 역가의 항-탄수화물 항원 항체를 갖는 마우스가 융합에 사용된다. 마우스는 희생 및 비장의 제거 전 3일에 항원으로 부스팅될 수 있거나, 그렇지 않을 수 있다. 마우스 비장세포를 단리하고, PEG로 마우스 골수종 세포주에 융합시킨다. 그 후, 생성된 하이브리도마를 항원-특이적 항체의 생산에 대해 스크리닝한다. 세포를 플레이팅한 후, 선택 배지에서 인큐베이션한다. 그 후, 개별 웰로부터의 상청액을 ELISA에 의해 인간 항-탄수화물 항원 모노클로날 항체에 대해 스크리닝한다. 항체 분비 하이브리도마를 반복하고, 다시 스크리닝하고, 항-탄수화물 항원 항체에 대해 여전히 양성인 경우에, 한계 희석에 의해 서브클로닝할 수 있다.
아주반트는 하나 이상의 탄수화물 항원의 면역원성을 증가시키는데 사용될 수 있다. 아주반트의 비제한적 예는 인산알루미늄, 수산화알루미늄, MF59 (4.3% w/v 스쿠알렌, 0.5% w/v 폴리소르베이트 80 (트윈 80), 0.5%> w/v 소르비탄 트리올레에이트 (스팬(Span) 85)), CpG-함유 핵산, QS21 (사포닌 아주반트), 갈락토실-세라미드 또는 그의 합성 유사체 (예를 들어, C34, 미국 8,268,969 참조), MPL (모노포스포릴 지질 A), 3DMPL (3-O-탈아실화 MPL), 아퀼라(Aquilla)로부터의 추출물, 이스콤(ISCOM) (예를 들어, 문헌 [Sjolander et al. (1998) J. Leukocyte Biol. 64:713]; WO90/03184; W096/11711; WO 00/48630; W098/36772; WO00/41720; WO06/134423 및 WO07/026190 참조), LT/CT 돌연변이체, 폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드) (PLG) 마이크로입자, 퀼(Quil) A, 인터류킨, 프로인트(Freund), N-아세틸-뮤라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민 (thr-MDP), N-아세틸-노르-뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타민 (CGP 11637, 노르-MDP로도 지칭됨), N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-( -2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시)-에틸아민 (CGP 19835 A, MTP-PE로도 지칭됨), 및 2%> 스쿠알렌/트윈 80 에멀젼 중에 박테리아로부터 추출된 3종의 성분, 모노포스포릴 지질 A, 트레할로스 디미콜레이트 및 세포벽 골격 (MPL+TDM+CWS)을 함유하는 RIBI를 포함한다.
항-SSEA-4 항체에 대한 예시적인 폴리클로날 항체는 혈청 내 목적하는 항체의 증가에 대하여 검사하는 면역화된 포유동물의 혈액을 수집함으로써, 및 임의의 통상의 방법에 의해 혈액으로부터 혈청을 분리함으로써 제조될 수 있다. 폴리클로날 항체는 폴리클로날 항체를 함유하는 혈청, 뿐만 아니라, 혈청으로부터 단리될 수 있는 폴리클로날 항체를 함유하는 분획을 포함한다.
폴리클로날 항체는 일반적으로 숙주 동물 (예를 들어, 토끼, 마우스, 말, 또는 염소)에서 관련 항원 및 아주반트의 다중 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사에 의해 유발된다. 이관능성 또는 유도체화 작용제, 예를 들어, 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시숙신이미드 (라이신 잔기를 통한 접합), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl2 등을 사용하여, 면역화될 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 관련 항원을 접합시키는 것이 유용할 수 있다.
임의의 포유동물 동물은 목적하는 항체를 생산하기 위해 항원에 의해서 면역화될 수 있다. 일반적으로, 설치목, 토끼목 또는 영장류의 동물이 사용될 수 있다. 설치목의 동물은 예를 들어 마우스, 래트 및 햄스터를 포함한다. 토끼목의 동물은 예를 들어 토끼를 포함한다. 영장류의 동물은 예를 들어 협비원류(Catarrhini) 원숭이 (구세계 원숭이) 예컨대 마카카 파시쿨라리스, 레서스 원숭이, 개코원숭이 및 침팬지를 포함한다.
항원에 의한 동물의 면역화 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 항원의 복강내 주사 또는 피하 주사가 포유동물의 면역화를 위한 표준 방법이다. 보다 구체적으로, 항원이 적절한 양의 포스페이트 완충 염수 (PBS), 생리 염수 등에 희석되고 현탁될 수 있다. 원하는 경우에, 항원 현탁액은 표준 아주반트, 예컨대 프로인트 완전 아주반트의 적절한 양과 혼합되고, 에멀젼으로 만들어진 다음, 포유동물 동물에게 투여될 수 있다. (각각 토끼 또는 마우스에 대해) 1 mg 또는 1 μg의 펩티드 또는 접합체를 3 부피의 프로인트 불완전 아주반트와 조합함으로써, 동물을 항원, 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 면역화시킬 수 있다.
동물은 역가가 정체 상태를 유지할 때까지 4 내지 21일마다 적절한 양의 프로인트 불완전 아주반트와 혼합된 항원을 여러 번 투여함으로써 상승될 수 있다. 프로인트 완전 아주반트 내의 펩티드 또는 접합체를 원래 양의 1/5 내지 1/10으로 다중 부위에 피하로 주사하여 동물을 부스팅시킨다. 7 내지 14일 후, 동물에서 채혈하여, 혈청을 항체 역가에 대해 검정한다. 적절한 담체가 또한 면역화를 위해 사용될 수 있다. 상기와 같이 면역화 후에, 혈청이 목적하는 항체 양의 증가에 대하여 표준 방법에 의해 검사된다. 바람직하게는, 상이한 단백질에 접합되었고/거나 상이한 가교 시약을 통해 접합되었으나 동일한 항원의 접합체로 동물을 부스팅한다. 접합체는 또한 재조합 세포 배양에서 단백질 융합체로서 제조될 수 있다. 또한, 명반과 같은 응집제를 적합하게 사용하여 면역 반응을 증진시킨다.
지난 20 내지 30년에 걸쳐, 수많은 방법론이 인간 생체내 치료 용도를 위해 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 제조하도록 개발되었다. 가장 많이 사용되는 증명된 방법론은 하이브리도마 방법론을 사용하여 마우스 mAb를 제조한 다음, 상기 mAb를 VH 및 VL 도메인의 프레임워크 영역 및 mAb의 불변 도메인을 인간 VH 및 VL 도메인의 대부분의 상동 인간 프레임워크 영역 및 목적하는 인간 γ 이뮤노글로불린 이소형 및 하위부류의 불변 영역으로 전환시키는 것에 의해 인간화시키는 것이다. 임상적으로 사용되는 많은 mAb, 예컨대 졸레어(Xolair)는 인간 γ1, κ 이소형 및 하위부류의 인간화 mAb이고 이러한 방법론을 사용하여 제조된다.
특정 실시양태에서, 항체는 통상적인 하이브리도마 기술에 의해 제조될 수 있다. 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]. 하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예컨대 햄스터 또는 토끼는 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도하기 위해 상기 기재된 바와 같이 면역화된다. 대안적으로, 림프구를 시험관내에서 면역화시킬 수 있다.
모노클로날 항체를 제조하기 위해, 면역 세포는 항원에 의해서 면역화된 포유동물로부터 수집되고, 상기 기재한 바와 같이 혈청 내 목적하는　항체의 증가된 수준을 확인하고, 세포 융합에 적용한다. 세포 융합에 사용된 면역 세포는 바람직하게는 비장으로부터 수득된다. 상기 면역세포와 융합될 다른 바람직한 모 세포는 예를 들어 포유동물의 골수종 세포, 및 보다 바람직하게는 약물에 의해 융합된 세포를 선택하기 위한 획득된 특성을 갖는 골수종 세포를 포함한다.
바람직한 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정적인 높은 수준의 생산을 지지하고, 배지, 예컨대 HAT 배지에 민감한 세포이다. 이들 중에, 바람직한 골수종 세포주는 뮤린 골수종 세포주, 예컨대 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center, 미국 캘리포니아주 샌디에고)로부터 입수가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래된 것, 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(미국 메릴랜드주 록빌)으로부터 입수가능한 SP-2 세포이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주는 또한 인간 모노클로날 항체의 생산에 대해 기재되었다 (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987).
상기 면역세포 및 골수종 세포는 공지된 방법 예를 들어, 밀스타인(Milstein) 등의 방법에 따라 융합될 수 있다 (Galfre et al., Methods Enzymol. 73:3-46, 1981). 림프구는 하이브리도마 세포를 형성하기 위해 적합한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포와 융합된다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). 세포 융합에 의해 수득된 생성된 하이브리도마는 표준 선택 배지, 예컨대 HAT 배지 (하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 함유 배지)에서 그들을 배양함으로써 선택될 수 있다. 세포 배양은 전형적으로 HAT 배지에서 목적하는 하이브리도마 (비-융합된 세포)를 제외하고 모든 다른 세포가 사멸하도록 하기에 충분한 시간인 수일 내지 수주 동안 계속된다. 이어서, 표준 한계 희석을 수행하여 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 스크리닝하고 클로닝한다.
이와 같이 제조된 하이브리도마 세포는, 바람직하게는 융합되지 않은 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 1종 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에 시딩하여 성장시킨다. 예를 들어, 모 골수종 세포에 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결여된 경우에, 하이브리도마를 위한 배양 배지는 전형적으로 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함할 것이며 (HAT 배지), 이러한 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다.
하이브리도마 세포가 성장되는 배양 배지를 항원에 대해 지시된 모노클로날 항체의 생산에 대해 검정한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성을 면역침전에 의해 또는 시험관내 결합 검정에 의해 결정한다. 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA), 효소 면역검정 (EIA), 방사선면역검정 (RIA) 및/또는 면역형광에서 흡광도의 측정은 본 발명의 항체의 항원 결합 활성을 측정하는데 사용될 수 있다. ELISA에서, 본 발명의 항체를 플레이트 상에 고정시키고, 본 발명의 단백질을 플레이트에 적용한 다음, 목적하는 항체를 함유하는 샘플, 예컨대 항체 생산 세포 또는 정제된 항체의 배양물 상청액을 적용한다. 이어서, 1차 항체를 인식하고, 효소 예컨대 알칼리성 포스파타제로 표지된 2차 항체를 적용하고, 플레이트를 배양시킨다. 다음에, 세척 후에, 효소 기질, 예컨대 p-니트로페닐 포스페이트를 플레이트에 첨가하고 흡광도를 측정하여 샘플의 항원 결합 활성을 평가한다. 단백질의 단편, 예컨대 C-말단 또는 N-말단 단편이 이 방법에 사용될 수 있다. 비아코어 (파마시아(Pharmacia))는 본 발명에 따른 항체의 활성을 평가하는데 사용될 수 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어 문헌 [Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)]의 스캐차드(Scatchard) 분석에 의해 결정될 수 있다.
상기 기재된 것들을 포함하는 임의의 통상적인 방법을 적용하여, 본원에 기재된 에피토프에 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 확인하고 추가적 특징화를 위해 선택할 수 있다.
목적하는 특이성, 친화도 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 클론을 한계 희석 절차에 의해 서브클로닝하고, 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). 이러한 목적에 적합한 배양 배지는, 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 통상의 이뮤노글로불린 정제 절차, 예컨대 예를 들어 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리한다.
추가로, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로서 생체내 성장할 수 있다. 예를 들어, 수득된 하이브리도마를 후속적으로 마우스의 복강에 이식할 수 있고 복수를 수확한다.
수득된 모노클로날 항체를 예를 들어 황산암모늄 침전, 단백질 A 또는 단백질 G 칼럼, DEAE 이온 교환 크로마토그래피, 또는 본 발명의 단백질을 커플링한 친화성 칼럼에 의해 정제할 수 있다. 본 발명의 항체는 본 발명의 단백질의 정제 및 검출을 위해 뿐만 아니라 본 발명의 단백질의 효능제 및 길항제의 후보로서 사용될 수 있다. 게다가 이 항체는 본 발명의 단백질과 관련된 질환을 위한 항체 치료에 적용될 수 있다.
재조합 기술
따라서 수득한 모노클로날 항체를 또한 유전 공학 기술을 사용하여 재조합적으로 제조할 수 있다 (예를 들어 문헌 [Borrebaeck C. A. K. and Larrick J. W. Therapeutic Monoclonal Antibodies, published in the United Kingdom by MacMillan Publishers LTD, 1990] 참조). 항체를 코딩하는 DNA를 면역 세포, 예컨대 적절한 벡터 내로 삽입된 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 면역화된 림프구로부터 클로닝하고, 재조합 항체를 제조하기 위해 숙주 세포로 도입할 수 있다. 본 발명은 또한 상기 기재한 바와 같이 제조된 재조합 항체를 제공한다.
수득한 항체가 인간 신체에 투여되는 경우 (항체 치료), 인간 항체 또는 인간화 항체는 면역원성을 감소시키기에 바람직하다. 예를 들어, 인간 항체 유전자의 저장소를 갖는 트랜스제닉 동물은 단백질, 단백질 발현 세포 또는 그의 용해물로부터 선택된 항원에 의해서 면역화될 수 있다. 항체 생산 세포를 이어서, 동물에서 수집하고, 단백질에 대한 인간 항체가 제조될 수 있는 하이브리도마를 수득하기 위해 골수종 세포와 융합한다. 대안적으로, 항체를 생산하는 면역 세포, 예컨대 면역화된 림프구를 종양유전자에 의해 불멸화하고, 모노클로날 항체를 제조하는 것에 사용할 수 있다.
모노클로날 항체를 코딩하는 DNA를 통상적인 절차를 사용하여 (예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 용이하게 단리 및 서열분석할 수 있다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서의 역할을 한다. 일단 단리되면, DNA를 발현 벡터 내로 위치시킬 수 있고, 이어서 달리 이뮤노글로불린 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포 내로 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체의 합성을 수득한다. 항체를 코딩하는 DNA의 박테리아에서의 재조합 발현에 대한 종설 논문은 문헌 [Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) 및 Pluckthun, Immunol. Rev., 130:151-188 (1992)]을 포함한다.
상기 기재된 하이브리도마 세포에 의해 생산된 항체를 코딩하는 DNA를 상용 기술을 통해 유전학적으로 변형하여 유전자 조작된 항체를 생산할 수 있다. 유전자 조작된 항체, 예컨대 인간화 항체, 키메라 항체, 단일-쇄 항체 및 이중-특이적 항체를 예를 들어 통상적인 재조합 기술을 통해 생산할 수 있다. 이어서, 예를 들어, 상동 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환함으로써 (Morrison et al., (1984) Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851), 또는 이뮤노글로불린 코딩 서열에 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드에 대한 전부 또는 일부 코딩 서열을 공유 연결함으로써 DNA가 변형될 수 있다. 그러한 방식으로, 표적 항원의 결합 특이성을 갖는 유전자 조작된 항체, 예컨대 "키메라" 또는 "하이브리드" 항체를 제조할 수 있다.
"키메라 항체"의 생산을 위해 개발된 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어 문헌 [Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851; Neuberger et al. (1984) Nature 312, 604; 및 Takeda et al. (1984) Nature 314:452]를 참조한다.
전형적으로, 이러한 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드는 항체의 불변 도메인에 대해 치환되거나, 또는 이들은 항체의 하나의 항원-결합 부위의 가변 도메인에 대해 치환되어, 항원에 대한 특이성을 갖는 하나의 항원-결합 부위 및 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 또 다른 항원-결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 생성한다.
또한, 키메라 또는 하이브리드 항체는 가교제를 수반하는 것을 포함하는 합성 단백질 화학에 공지된 방법을 사용하여 시험관내에서 제조될 수 있다. 예를 들어, 면역독소를 디술피드-교환 반응을 사용하여 또는 티오에테르 결합을 형성하여 구축할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트를 포함한다.
비-인간 항체를 인간화하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 이에 도입된 1개 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 전형적으로 "유입" 가변 도메인으로부터 취해지는 "유입" 잔기로 종종 지칭된다. 인간화는 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 인간 항체의 상응하는 서열로 치환함으로써 본질적으로 윈터(Winter) 및 동료들의 방법 (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))에 따라 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 적은 서열이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체 (미국 특허 번호 4,816,567)이다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체 내의 유사한 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다.
인간화 항체의 제조에 사용될 인간 가변 도메인, 경쇄 및 중쇄 둘 다의 선택은 항원성을 감소시키는데 매우 중요하다. 소위 "최적-피트" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열은 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 이어서, 설치류의 서열에 가장 근접한 인간 서열이 인간화 항체에 대한 인간 프레임워크 (FR)로서 허용된다 (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정한 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정한 프레임워크를 사용한다. 여러 상이한 인간화 항체에 대해 동일한 프레임워크를 사용할 수 있다 (문헌 [Carter et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 89:4285 (1992); Prestaetal., J. Immnol., 151:2623 (1993)]).
추가로, 항체가 항원에 대한 고친화도 및 다른 유리한 생물학적 특성을 보유하면서 인간화되는 것이 중요하다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 바람직한 방법에 따라, 인간화 항체는 모 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하는 모 서열 및 다양한 개념적 인간화 생성물의 분석 방법에 의해 제조된다. 3-차원 이뮤노글로불린 모델은 통상적으로 이용가능하고 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 친숙하다. 선택된 후보 이뮤노글로불린 서열의 가능한 3-차원 입체형태적 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이들 디스플레이들의 정밀검사로 후보 이뮤노글로불린 서열의 기능화에 있어서 잔기들의 가능한 역할을 분석할 수 있으며, 즉, 자신의 항원에 결합하는 후보 이뮤노글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 방식으로, 목적하는 항체 특징, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화도가 달성되도록 수용자 및 유입 서열로부터 FR 잔기들을 선택하고 조합시킬 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 영향을 미치는 데 직접적으로 및 가장 실질적으로 수반된다.
대안적으로, 면역화시에 내인성 이뮤노글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)을 생산하는 것이 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 배선 돌연변이체 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자의 동형접합 결실이 내인성 항체 생산의 완전한 억제를 일으킨다는 것이 기재된 바 있다. 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자 어레이를 이러한 배선 돌연변이체 마우스에게 전달하면, 항원 챌린지 시에 인간 항체의 생산이 유발될 것이다. 예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)]을 참조한다. 인간 항체는 또한 파지-디스플레이 라이브러리로부터 유래될 수 있다 (문헌 [Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]).
본원에 기재된 항-SSEA-4 항체를 코딩하는 핵산 중 임의의 것 (중쇄, 경쇄, 또는 둘 다를 포함함), 벡터 예컨대 하나 이상의 핵산을 포함하는 발현 벡터, 및 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포가 또한 본 개시내용의 범주 내이다. 일부 예에서, 벡터는 본원에 기재된 바와 같은 항-글로보 H 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 예에서, 벡터는 본원에 기재된 바와 같은 항-SSEA-4 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 다른 예에서, 벡터는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 둘 다를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 그의 발현이 단일 프로모터 또는 2개의 분리된 프로모터에 의해 제어될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 바와 같은 임의의 항-글로보 H 및 항-SSEA-4 항체를 생산하기 위한, 예를 들어, 본원에 기재된 재조합 기술을 통한 방법이 본원에 제공된다.
항체를 제조하기 위한 다른 기술
특정 실시양태에서, 완전 인간 항체는 특이적 인간 이뮤노글로불린 단백질을 발현하도록 조작된 상업적으로 입수가능한 마우스를 사용하여 수득될 수 있다. 보다 바람직한 (예를 들어, 완전 인간 항체) 또는 보다 강건한 면역 반응을 생성하도록 설계된 트랜스제닉 동물이 또한 인간화 또는 인간 항체의 생성을 위해 사용될 수 있다. 이러한 기술의 예는 암젠, 인크.(Amgen, Inc.) (캘리포니아주 프리몬트)로부터의 제노마우스(Xenomouse)RTM 및 메다렉스, 인크.(Medarex, Inc.) (뉴저지주 프린스턴)로부터의 HuMAb-마우스RTM 및 TC 마우스TM이다. 대안적으로, 파지 디스플레이 기술에 의해 항체를 재조합적으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,565,332; 5,580,717; 5,733,743; 및 6,265,150; 및 문헌 [Winter et al., (1994) Annu. Rev. Immunol. 12:433-455]을 참조한다. 대안적으로, 파지 디스플레이 기술 (McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-553)을 사용하여, 비면역화된 공여자로부터의 이뮤노글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관내에서 생산할 수 있다.
무손상 항체 (즉, 전장 항체)의 항원-결합 단편을 상용 방법을 통해 제조할 수 있다. 예를 들어, F(ab')2 단편을 항체 분자의 펩신 소화, 및 F(ab')2 단편의 디술피드 브리지를 환원시킴으로써 생성될 수 있는 Fab 단편에 의하여 생산할 수 있다.
대안적으로, 본원에 기재된 항-글로보 H 및 항-SSEA-4 항체를 문헌 [McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)]에 기재된 기술을 사용하여 생성된 항체 파지 라이브러리 (예를 들어, 단일-쇄 항체 파지 라이브러리)로부터 단리할 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol Biol., 222:581-597 (1991)]. 이후의 간행물은 쇄 셔플링에 의한 고친화도 (nM 범위) 인간 항체의 생산 (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), 뿐만 아니라 매우 큰 파지 라이브러리를 구축하기 위한 전략으로서의 조합 감염 및 생체내 재조합 (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993))을 기재한다. 따라서, 이러한 기술들은 모노클로날 항체의 단리를 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 실행가능한 대안이다.
본원에 기재된 바와 같이 수득된 항체를 균질할 때까지 정제할 수 있다. 예를 들어, 항체의 분리 및 정제는 일반적 단백질에 사용된 분리 및 정제 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 항체를, 이에 제한되지는 않지만 칼럼 크로마토그래피, 예컨대 친화성 크로마토그래피, 필터, 한외여과, 염석, 투석, SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 등전 포커싱 및 기타 (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)를 적절하게 선택 및 조합 사용하여 분리 및 단리시킬 수 있다. 상기와 같이 수득된 항체의 농도를 흡광도의 측정, 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA) 등에 의해 결정할 수 있다. 친화도를 제외하고는, 예시적인 크로마토그래피는 예를 들어 이온-교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과, 역상 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 등을 포함한다 (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). 크로마토그래피 절차를 액체-상 크로마토그래피, 예컨대 HPLC 또는 FPLC에 의해 수행할 수 있다.
항체를 관련 기술분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 특징화할 수 있다. 예를 들어, 한 방법은 항원이 결합하는 에피토프를 확인하는 것, 또는 "에피토프 맵핑"이다. 예를 들어, 문헌 [Chapter 11 of Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999]에 기재된 바와 같이, 항체-항원 복합체의 결정 구조 규명, 경쟁 검정, 유전자 단편 발현 검정, 및 합성 펩티드-기반 검정을 포함하여 단백질 상에서 에피토프의 위치를 맵핑하고 특징화하는 관련 기술분야에 공지된 많은 방법이 존재한다. 또한, 에피토프 맵핑을 사용하여 항체가 결합하는 서열을 결정할 수 있다. 에피토프는 선형 에피토프일 수 있고 (예를 들어, 아미노산의 단일 스트레치 내에 함유됨), 또는 반드시 단일 스트레치 (1차 구조 선형 서열) 내에 함유될 필요는 없을 수 있는 아미노산의 3차원 상호작용에 의해 형성된 입체형상 에피토프일 수 있다. 다양한 길이의 펩티드 (예를 들어, 적어도 4-6개의 아미노산의 길이)를 단리하거나 또는 (예를 들어, 재조합적으로) 합성하여, 항체와의 결합 검정에 사용할 수 있다. 또 다른 예에서, 항체가 결합하는 에피토프를 표적 항원 서열로부터 유래된 중첩 펩티드를 사용하여 항체에 의한 결합을 결정함으로써 체계적인 스크리닝에서 결정할 수 있다. 유전자 단편 발현 검정에 따르면, 표적 항원을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 무작위로 또는 특이적인 유전적 구축에 의해 단편화하고, 발현된 항원 단편과 시험될 항체와의 반응성을 결정한다. 유전자 단편을, 예를 들어, PCR에 의해 생산한 후, 방사성 아미노산의 존재 하에 시험관내에서 단백질로 전사 및 번역시킬 수 있다. 그 후, 방사성으로 표지된 항원 단편에 대한 항체의 결합을 면역침전 및 겔 전기영동에 의해 결정한다. 파지 입자의 표면 상에 디스플레이된 무작위 펩티드 서열의 대형 라이브러리 (파지 라이브러리)를 사용함으로써 특정 에피토프를 또한 확인할 수 있다. 대안적으로, 중첩 펩티드 단편의 규정된 라이브러리를 간단한 결합 검정에서 시험 항체에 대한 결합에 대해 시험할 수 있다.
또 다른 추가적인 예에서, 항원 결합 도메인의 돌연변이유발, 도메인 스와핑 실험 및 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 수행하여 에피토프 결합에 요구되고/되거나, 충분하고/하거나, 필수적인 잔기를 확인할 수 있다. 예를 들어, 후보 항체에 대한 결합 에피토프 내 다양한 잔기가 밀접하게 관련되지만 항원적으로 구별되는 단백질 (예컨대 뉴로트로핀 단백질 패밀리의 또 다른 구성원)로부터의 서열로 대체 (스와핑)된 표적 항원의 돌연변이체를 사용하여 도메인 스와핑 실험을 수행할 수 있다. 돌연변이체 표적 단백질에 대한 항체의 결합을 평가함으로써, 항체 결합에 대한 특정 항원 단편의 중요성을 평가할 수 있다.
대안적으로, 경쟁 검정을 동일한 항원에 결합하는 것으로 공지된 다른 항체를 사용하여 수행하여 항체가 이러한 다른 항체와 동일한 에피토프 (예를 들어, 본원에 기재된 MC45 항체)에 결합하는지 여부를 결정할 수 있다. 경쟁 검정은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
예시적인 적합한 일반 항체 생산 방법의 추가의 측면
동물 (예를 들어, 마우스, 토끼, 염소, 양, 또는 말)에서 모노클로날 및 폴리클로날 항체 및 그의 단편을 제조하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Harlow and Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York]을 참조한다. 용어 "항체"는 무손상 이뮤노글로불린 분자 뿐만 아니라 그의 단편, 예컨대 Fab, F(ab')2, Fv, scFv (단일 쇄 항체) 및 dAb (도메인 항체; 문헌 [Ward, et al. (1989) Nature, 341, 544])을 포함한다.
본원에 개시된 조성물은 본 개시내용을 정독하였을 때 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 확인가능한 추가의 활성제, 담체, 비히클, 부형제 또는 보조제와 함께 제약 조성물 내에 포함될 수 있다.
제약 조성물은 바람직하게는 적어도 1종의 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 이러한 제약 조성물에서, 본원에 기재된 조성물은 또한 "활성제"로서 언급되는 "활성 화합물"을 형성한다. 본원에 사용된 용어 "제약상 허용되는 담체"는 제약 투여와 상용성인, 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 보충 활성 화합물이 또한 조성물 내로 혼입될 수 있다. 제약 조성물은 그의 의도된 투여 경로와 상용성이도록 제제화된다. 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들어 정맥내, 피내, 피하, 경구 (예를 들어, 흡입), 경피 (예를 들어, 국소), 경점막, 및 직장 투여를 포함한다. 비경구, 피내 또는 피하 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액은 하기 성분을 포함할 수 있다: 멸균 희석제 예컨대 주사용수, 염수 용액, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항박테리아제 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제 예컨대 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 킬레이트화제 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트; 및 장성 조정제 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스. pH는 산 또는 염기, 예컨대 염산 또는 수산화나트륨에 의해 조정될 수 있다. 비경구 제제는 앰플, 일회용 시린지, 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다중 용량 바이알에 밀봉될 수 있다.
적어도 하나의 항-SSEA-4 항체 또는 항-SSEA-4 항체를 코딩하는 서열을 포함하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물이 제공된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 제약 조성물일 수 있다. 본원에 사용된, 조성물은 하나 이상의 SSEA-4에 결합하는 하나 이상의 항체 및/또는 하나 이상의 SSEA-4에 결합하는 하나 이상의 항체를 코딩하는 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이들 조성물은 적합한 담체, 예컨대 관련 기술분야에 널리 공지된 완충제를 포함하는 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 항-SSEA-4 항체는 모노클로날이다. 또 다른 실시양태에서, 항-SSEA-4 항체의 단편 (예를 들어, Fab, Fab'-SH 및 F(ab')2 단편)이 제공된다. 이들 항체 단편은 전통적인 수단, 예컨대 효소적 소화에 의해 생성될 수 있거나, 또는 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다. 상기 항체 단편은 키메라, 인간화 또는 인간 항체 단편일 수 있다. 이들 단편은 하기 제시된 진단 및 치료 목적에 유용하다.
관심 항체를 수득할 수 있는 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하기 위한 다양한 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 관심 항체를 생성하는 하나의 방법은 문헌 [Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93]에 기재된 바와 같은 파지 항체 라이브러리의 사용을 통해서이다.
본 발명의 항-SSEA-4 항체를 조합 라이브러리를 사용하여 제조하여 목적 활성(들)을 갖는 합성 항체 클론을 스크리닝할 수 있다. 원칙적으로, 파지 코트 단백질에 융합된 항체 가변 영역 (Fv)의 다양한 단편을 디스플레이하는 파지를 함유하는 파지 라이브러리를 스크리닝함으로써 합성 항체 클론이 선택된다. 목적하는 항원에 대한 친화성 크로마토그래피에 의해 이러한 파지 라이브러리가 패닝된다. 목적하는 항원에 결합할 수 있는 Fv 단편을 발현하는 클론이 항원에 흡착되고, 따라서 라이브러리 내의 비결합 클론으로부터 분리된다. 이어서, 결합 클론이 항원으로부터 용리되고, 항원 흡착/용리의 추가 주기에 의해 추가로 풍부화될 수 있다. 본 발명의 임의의 항-SSEA-4 항체는 관심 파지 클론을 선택하기 위한 적합한 항원 스크리닝 절차를 설계하고, 이어서 관심 파지 클론으로부터의 Fv 서열 및 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md. (1991), vols. 1-3]에 기재된 적합한 불변 영역 (Fc) 서열을 사용하여 전장 항-SSEA-4 항체 클론을 구축함으로써 수득할 수 있다.
항체의 항원-결합 도메인은 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH)로부터 각각 하나씩의, 아미노산 약 110개의 2개의 가변 (V) 영역으로부터 형성되고, 둘 다 3개의 초가변 루프 또는 상보성-결정 영역 (CDR)을 나타낸다. 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이, 가변 도메인은 VH 및 VL이 짧은 가요성 펩티드를 통해 공유 연결된 단일-쇄 Fv (scFv) 단편으로서, 또는 VH 및 VL이 불변 도메인에 각각 융합되어 비공유적으로 상호작용하는 Fab 단편으로서, 파지 상에 기능적으로 디스플레이될 수 있다. 본원에 사용된 scFv 코딩 파지 클론 및 Fab 코딩 파지 클론은 집합적으로 "Fv 파지 클론" 또는 "Fv 클론"으로 지칭된다.
VH 및 VL 유전자의 레퍼토리를 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 개별적으로 클로닝하여 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합할 수 있고, 이어서 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이 항원-결합 클론을 조사할 수 있다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 필요없이 면역원에 대한 높은 친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, 문헌 [Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 기재된 바와 같이 어떠한 면역화도 없이 광범위한 비-자기 항원 및 또한 자기 항원에 대한 인간 항체의 단일 공급원을 제공하도록 나이브 레퍼토리를 클로닝할 수 있다. 마지막으로, 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이 줄기 세포로부터의 재배열되지 않은 V-유전자 절편을 클로닝하고, 고도로 가변성인 CDR3 영역을 코딩하고 시험관내 재배열이 달성되도록 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함으로써, 나이브 라이브러리를 또한 합성적으로 제조할 수 있다.
사상 파지가 소수 코트 단백질 pIII에 대한 융합에 의해 항체 단편을 디스플레이하는데 사용된다. 예를 들어 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]에 의해 기재된 바와 같이 항체 단편은 VH 및 VL 도메인이 가요성 폴리펩티드 스페이서에 의해 동일한 폴리펩티드 쇄 상에 연결되는 단일 쇄 Fv 단편으로서, 또는 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991)]에 기재된 바와 같이, 하나의 쇄가 pIII에 융합되고 다른 것이 야생형 코트 단백질의 일부를 치환함으로써 파지 표면 상에 Fab-코트 단백질 구조의 어셈블리가 디스플레이되는 박테리아 숙주 세포 주변세포질로 분비되는 Fab 단편으로서 디스플레이될 수 있다.
일반적으로, 항체 유전자 단편을 코딩하는 핵산은 인간 또는 동물로부터 수거된 면역 세포로부터 수득된다. 항-SSEA-4 클론에 유리하게 편향된 라이브러리가 바람직한 경우, 대상체를 항체 반응을 생성하도록 SSEA-4로 면역화시키고, 비장 세포 및/또는 순환 B 세포 또는 다른 말초 혈액 림프구 (PBL)를 라이브러리 구축을 위해 회수한다. 한 실시양태에서, 항-인간 SSEA-4 클론에 유리하게 편향된 인간 항체 유전자 단편 라이브러리는, SSEA-4 면역화가 SSEA-4에 대한 인간 항체를 생산하는 B 세포를 유도하도록 기능적 인간 이뮤노글로불린 유전자 어레이를 보유하는 (기능적 내인성 항체 생산 시스템이 결여된) 트랜스제닉 마우스에서 항-인간 SSEA-4 항체 반응을 생성함으로써 수득된다. 인간 항체-생산 트랜스제닉 마우스의 생성은 하기에 기재된다.
항-SSEA-4 반응성 세포 집단을 추가로 농축시키는 것은 예를 들어, SSEA-4 친화성 크로마토그래피 또는 형광색소-표지된 /SSEA-4/에 대한 세포의 흡착 후 유동-활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하는 세포 분리에 의해 SSEA-4-특이적 항체를 발현하는 B 세포를 단리하는 적합한 스크리닝 방법을 사용하여 수득할 수 있다.
대안적으로, 비면역화 공여자로부터의 비장 세포 및/또는 B 세포 또는 다른 PBL의 사용은 가능한 항체 레퍼토리의 보다 우수한 제시를 제공하고, 또한 SSEA-4이 항원성이 아닌 임의의 동물 (인간 또는 비-인간) 종을 사용한 항체 라이브러리의 구축을 허용한다. 시험관내 항체 유전자 구축이 혼입된 라이브러리의 경우에는, 대상체로부터 줄기 세포를 수거하여 재배열되지 않은 항체 유전자 절편을 코딩하는 핵산을 제공한다. 관심 면역 세포는 다양한 동물 종, 예컨대 인간, 마우스, 래트, 토끼목, 이리, 개, 고양이, 돼지, 소, 말 및 조류 종 등으로부터 수득할 수 있다.
항체 가변 유전자 절편 (VH 및 VL 절편 포함)을 코딩하는 핵산을 관심 세포로부터 회수하여, 증폭시킨다. 재배열된 VH 및 VL 유전자 라이브러리의 경우, 림프구로부터의 게놈 DNA 또는 mRNA의 단리에 이어서 문헌 [Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989)]에 기재된 바와 같은 재배열된 VH 및 VL 유전자의 5' 및 3' 말단을 매칭시키는 프라이머를 사용한 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 목적하는 DNA를 수득할 수 있고, 이에 의해 발현을 위한 다양한 V 유전자 레퍼토리가 제조된다. 문헌 [Orlandi et al. (1989) 및 Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989)]에 기재된 바와 같이 성숙 V-도메인을 코딩하는 엑손의 5' 말단에서의 역방향 프라이머 및 J-절편 내에 기초가 된 정방향 프라이머를 사용하여, cDNA 및 게놈 DNA로부터 V 유전자를 증폭시킬 수 있다. 그러나, cDNA로부터 증폭시키는 것에 있어서, 역방향 프라이머는 또한 문헌 [Jones et al., Biotechnol., 9: 88-89 (1991)]에 기재된 바와 같이 리더 엑손에 기초할 수 있고, 불변 영역 내부의 정방향 프라이머는 문헌 [Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 5728-5732 (1989)]에 기재된 바와 같다. 상보성을 극대화하기 위해, 문헌 [Orlandi et al. (1989) or Sastry et al. (1989)]에 기재된 바와 같이 축중성을 프라이머에 혼입시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 라이브러리 다양성은 예를 들어 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]의 방법에 기재된 바와 같이, 또는 문헌 [Orum et al., Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993)]의 방법에 기재된 바와 같이, 면역 세포 핵산 샘플에 존재하는 모든 이용 가능한 VH 및 VL 배열을 증폭시키기 위해 각각의 V-유전자 패밀리를 표적화하는 PCR 프라이머를 사용함으로써 극대화된다. 증폭된 DNA를 발현 벡터 내로 클로닝하기 위해, 희귀 제한 부위가 문헌 [Orlandi et al. (1989)]에 기재된 바와 같이 한 말단에서 태그로서, 또는 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]에 기재된 바와 같이 태그부착된 프라이머를 사용하는 추가의 PCR 증폭에 의해, PCR 프라이머 내에 도입될 수 있다.
합성적으로 재배열된 V 유전자의 레퍼토리가 시험관내에서 V 유전자 절편으로부터 유래될 수 있다. 대부분의 인간 VH-유전자 절편이 클로닝 및 서열분석되어 있고 (문헌 [Tomlinson et al., J. Mol. Biol., 227: 776-798 (1992)]에 보고됨), 맵핑되어 있으며 (문헌 [Matsuda et al., Nature Genet., 3: 88-94 (1993)]에 보고됨); 이들 클로닝된 절편들 (H1 및 H2 루프의 모든 주요 형태 포함)은 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이 다양한 서열 및 길이의 H3 루프를 코딩하는 PCR 프라이머로 다양한 VH 유전자 레퍼토리를 생성시키는데 사용될 수 있다. VH 레퍼토리는 또한 문헌 [Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461 (1992)]에 기재된 바와 같이 단일 길이의 긴 H3 루프에 초점이 맞추어진 모든 서열 다양성으로 제조될 수 있다. 인간 Vκ 및 Vλ 절편이 클로닝 및 서열분석되어 있고 (문헌 [Williams and Winter, Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461 (1993)]에 보고됨), 합성 경쇄 레퍼토리를 제조하는데 사용될 수 있다. 광범위한 VH 및 VL 폴드, 및 L3 및 H3 길이에 기초하는 합성 V 유전자 레퍼토리는 상당한 구조적 다양성의 항체를 코딩할 것이다. DNA를 코딩하는 V-유전자의 증폭에 이어서, 배선 V-유전자 절편이 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]의 방법에 따라 시험관내에서 재배열될 수 있다.
항체 단편의 레퍼토리는 VH 및 VL 유전자 레퍼토리를 함께 여러 방식으로 조합하여 구축할 수 있다. 각각의 레퍼토리는 상이한 벡터 내에 생성될 수 있고, 벡터는 예를 들어 문헌 [Hogrefe et al., Gene, 128: 119-126 (1993)]에 기재된 바와 같이 시험관내에서, 또는 조합 감염, 예를 들어 문헌 [Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993)]에 기재된 loxP 시스템에 의해 생체내에서 재조합될 수 있다. 생체내 재조합 접근법은 이. 콜라이 형질전환 효율에 의해 부과된 라이브러리 크기의 제한을 극복하기 위해 Fab 단편의 2-쇄 성질을 이용한다. 나이브 VH 및 VL 레퍼토리를 하나는 파지미드 내로, 다른 것은 파지 벡터 내로 개별적으로 클로닝한다. 이어서, 2개의 라이브러리를 파지미드-함유 박테리아의 파지 감염에 의해 조합하여 각각의 세포가 상이한 조합을 함유하도록 하고, 라이브러리 크기는 존재하는 세포의 개수로만 제한된다 (약 1012개 클론). 벡터는 둘 다, VH 및 VL 유전자가 단일 레플리콘에서 재조합되어 파지 비리온 내에 공동-패키징되도록 하는 생체내 재조합 신호를 함유한다. 이들 거대한 라이브러리는 우수한 친화도의 다수의 다양한 항체를 제공한다.
대안적으로, 레퍼토리는 예를 들어 문헌 [Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991)]에 기재된 바와 같이 동일한 벡터 내로 순차적으로 클로닝될 수 있거나, 또는 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]에 기재된 바와 같이 PCR에 의해 함께 조립된 후에 클로닝될 수 있다. VH 및 VL DNA를 가요성 펩티드 스페이서를 코딩하는 DNA로 연결시켜 단일 쇄 Fv (scFv) 레퍼토리를 형성시키는데 PCR 조립이 또한 사용될 수 있다. 또 다른 기술에서, 문헌 [Embleton et al., Nucl. Acids Res., 20: 3831-3837 (1992)]에 기재된 바와 같이, VH 및 VL 유전자를 림프구 내에서 PCR에 의해 조합시킨 후, 연결된 유전자들의 레퍼토리를 클로닝하는데 "세포내 PCR 어셈블리"가 사용된다.
라이브러리의 스크리닝은 임의의 관련 기술분야에 공지된 기술에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, SSEA-4 표적은 흡착 플레이트의 웰을 코팅하기 위해 사용되거나, 흡착 플레이트에 고정된 숙주 세포 상에 발현되거나, 또는 세포 분류에서 사용되거나, 또는 스트렙타비딘-코팅된 비드로 포획하기 위해 비오틴에 접합되거나, 또는 파지 디스플레이 라이브러리를 패닝하기 위한 임의의 다른 관련 기술분야에 공지된 방법에서 사용될 수 있다.
파지 라이브러리 샘플을, 파지 입자의 적어도 일부를 흡착제와 결합시키는데 적합한 조건 하에서 고정화된 SSEA-4와 접촉시킨다. 일반적으로, pH, 이온 강도, 온도 등을 비롯한 조건은 생리학적 조건을 모방하도록 선택된다. 고체 상에 결합된 파지를 세척한 후, 예를 들어 문헌 [Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991)]에 기재된 바와 같이 산에 의해, 또는 예를 들어 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]에 기재된 바와 같이 알칼리에 의해, 또는 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]의 항원 경쟁 방법과 유사한 절차로 SSEA-43/ 항원 경쟁에 의해 용리시킨다. 단일 라운드의 선택으로 파지가 20-1,000배 풍부화될 수 있다. 또한, 풍부화된 파지가 박테리아 배양에서 성장되어, 추가적인 선택 라운드에 적용될 수 있다.
선택 효율은 세척 동안의 해리 동역학, 및 단일 파지 상의 다중 항체 단편들이 동시에 항원과 맞물릴 수 있는지 여부를 비롯한 다수의 인자에 따라 달라진다. 신속한 해리 동역학 (및 약한 결합 친화도)을 갖는 항체는 단시간 세척, 다가 파지 디스플레이 및 고체상 내의 항원의 고 코팅 밀도를 사용함으로써 보유될 수 있다. 고밀도는 다가 상호작용을 통해 파지를 안정화시킬 뿐만 아니라, 해리된 파지의 재결합을 돕는다. 느린 해리 동역학 (및 우수한 결합 친화도)의 항체의 선택은 문헌 [Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990)] 및 WO 92/09690에 기재된 바와 같은 1가 파지 디스플레이 및 장시간 세척, 및 문헌 [Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992)]에 기재된 바와 같은 항원의 낮은 코팅 밀도를 사용함으로써 촉진될 수 있다.
SSEA-4에 대한 상이한 친화도, 심지어 근소하게 상이한 친화도를 갖는 파지 항체 사이에서의 선택이 가능하다. 그러나, 선택된 항체의 무작위 돌연변이 (예를 들어, 상기 기재된 친화도 성숙 기술들 중 일부에서 수행되는 바와 같은 돌연변이)는 다수의 돌연변이체를 일으키기 쉽고, 이때 대부분은 항원에 결합하고 몇몇은 친화도가 더 높다. SSEA-4를 제한하여, 희귀 고친화도 파지를 경쟁시킬 수 있다. 친화력이 더 높은 모든 돌연변이체를 유지시키기 위해, 파지가 과량의, 그러나 SSEA-4에 대한 표적 몰 친화도 상수보다 더 낮은 몰 농도의 비오티닐화 SSEA-4와 함께 인큐베이션될 수 있다. 이후에, 고친화도-결합 파지가 스트렙타비딘-코팅된 상자성 비드에 의해 포획될 수 있다. 이러한 "평형 포획"은 친화도가 더 낮은 과량의 파지로부터 친화도가 2배 정도 더 높은 돌연변이체 클론의 단리를 허용하는 감도로 항체가 이들의 결합 친화도에 따라 선택되도록 한다. 고체 상에 결합된 파지를 세척하는데 사용된 조건이 또한 해리 동역학을 기반으로 구별되도록 조작될 수 있다.
항-SSEA-4 클론은 선택될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명은 SSEA-4 리간드와 SSEA-4 사이의 결합을 차단하지만 SSEA-4 리간드와 제2 단백질 사이의 결합을 차단하지 않는 항-SSEA-4 항체를 제공한다. 이러한 항-SSEA-4 항체에 대응하는 Fv 클론은 (1) 상기 섹션 B(I)(2)에 기재된 바와 같은 파지 라이브러리로부터 항-SSEA-4 클론을 단리하고, 임의로 파지 클론의 단리된 집단을 적합한 박테리아 숙주에서 집단을 성장시킴으로써 증폭시키고; (2) 각각 차단 및 비-차단 활성이 요망되는 SSEA-4 및 제2 단백질을 선택하고; (3) 항-SSEA-4 파지 클론을 고정화된 SSEA-4에 흡착시키고; (4) 과량의 제2 단백질을 사용하여 제2 단백질의 결합 결정기와 중복되거나 공유되는 SSEA-4-결합 결정기를 인식하는 임의의 목적하지 않은 클론을 용리시키고; (5) 단계 (4) 이후에 흡착되어 남아있는 클론을 용리시킴으로써 선택될 수 있다. 임의로, 본원에 기재된 선택 절차를 1회 이상 반복함으로써 목적하는 차단/비차단 특성을 갖는 클론을 추가로 풍부화시킬 수 있다.
본 발명의 Fv 클론을 코딩하는 DNA를 통상적인 절차를 사용하여 (예를 들어, 하이브리도마 또는 파지 DNA 주형으로부터 관심 중쇄 및 경쇄 코딩 영역을 특이적으로 증폭시키도록 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용함으로써) 용이하게 단리하고 서열분석한다. DNA를 단리하였으면, 이를 발현 벡터 내로 넣은 다음 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포 내로 형질감염시켜 (그렇지 않으면 상기 세포는 이뮤노글로불린 단백질을 생산하지 않음) 재조합 숙주 세포에서 목적하는 모노클로날 항체의 합성을 수득한다. 항체-코딩 DNA의 박테리아에서의 재조합 발현에 대한 종설 논문은 문헌 [Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256 (1993) 및 Pluckthun, Immunol. Revs, 130: 151 (1992)]을 포함한다.
본 발명의 Fv 클론을 코딩하는 DNA는 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 코딩하는 공지의 DNA 서열 (예를 들어, 적절한 DNA 서열은 카바트 등의 상기 문헌으로부터 얻을 수 있음)과 조합되어, 전장 또는 부분적 길이 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 클론을 형성할 수 있다. IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE 불변 영역을 비롯한 임의의 이소형의 불변 영역이 이러한 목적에 사용될 수 있고, 이러한 불변 영역은 임의의 인간 또는 동물 종으로부터 수득될 수 있음이 인지될 것이다. 한 동물 (예컨대 인간) 종의 가변 도메인 DNA로부터 유래된 후, 또 다른 동물 종의 불변 영역 DNA에 융합되어 "하이브리드" 전장 중쇄 및/또는 경쇄에 대한 코딩 서열(들)을 형성한 Fv 클론이 본원에서 사용된 "키메라" 및 "하이브리드" 항체의 정의에 포함된다. 한 실시양태에서, 인간 가변 DNA로부터 유래된 Fv 클론이 인간 불변 영역 DNA에 융합되어 모두 인간형인 전장 또는 부분적 길이의 중쇄 및/또는 경쇄에 대한 코딩 서열(들)을 형성한다.
나이브 라이브러리 (천연 또는 합성 중 어느 하나)에 의해 제조된 항체는 중등의 친화도일 수 있지만, 친화도 성숙은 또한 상기 문헌 [Winter et al. (1994)]에 기재된 바와 같이 2차 라이브러리로부터 구축하여 재선택함으로써 시험관내에서 모방할 수 있다. 일부 측면에서 항체는 자연 발생 항체 서열을 제외할 수 있다. 일부 측면에서, 문헌 [Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992)]의 방법 또는 문헌 [Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3576-3580 (1992)]의 방법에서의 오류-유발 폴리머라제 (문헌 [Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989)]에 보고됨)를 사용함으로써 시험관내에서 무작위로 돌연변이가 도입될 수 있다. 추가로, 친화도 성숙은, 예를 들어 선택된 개별 Fv 클론에서 관심 CDR에 이르는 무작위 서열을 보유하는 프라이머를 사용한 PCR을 사용하여 하나 이상의 CDR을 무작위로 돌연변이시키고, 친화도가 더 높은 클론을 스크리닝함으로써 수행될 수 있다. WO 9607754 (1996년 3월 14일 공개)에는 이뮤노글로불린 경쇄의 상보성 결정 영역에서 돌연변이유발을 유도하여 경쇄 유전자의 라이브러리를 생성시키는 방법이 기재되어 있다. 또 다른 효과적인 접근법은, 면역화되지 않은 공여자로부터 수득한 자연 발생 V 도메인 변이체의 레퍼토리를 갖는 파지 디스플레이에 의해 선택된 VH 또는 VL 도메인을 재조합하고, 문헌 [Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992)]에 기재된 바와 같이 여러 라운드의 쇄 재셔플링(reshuffling)으로 보다 높은 친화도에 대해 스크리닝하는 것이다. 상기 기술은 친화도가 10-9 M 범위인 항체 및 항체 단편을 생산하도록 한다.
항-SSEA-4 항체를 생성하는 다른 방법
항체의 친화도를 생성하고 평가하는 다른 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Kohler et al., Nature 256: 495 (1975)]; 미국 특허 번호 4,816,567; 문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986; Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987; Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980); Engels et al., Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 28: 716-734 (1989); Abrahmsen et al., EMBO J., 4: 3901 (1985); Methods in Enzymology, vol. 44 (1976); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)]에 기재되어 있다.
일반적 방법
일반적으로, 본 발명은 친화도-성숙된 SSEA-4 항체를 제공한다. 이들 항체는 SSEA-4에 대한 증가된 친화도 및 특이성을 갖는다. 친화도 및 감수성에서의 이러한 증가는 본 발명의 분자가 (a) 본 발명의 분자의 상승된 감수성 및/또는 (b) 본 발명의 분자에 의한 SSEA-4의 강력한 결합에 의해 이익을 얻는 용도 및 방법에 사용되도록 허용한다.
한 실시양태에서, SSEA-4 항체는 하나 이상의 SSEA-4 활성의 부분 또는 전체 차단이 바람직한 SSEA-4-매개 장애의 치료에 유용하다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항 SSEA-4 항체는 암을 치료하는데 사용된다.
본 발명의 항-SSEA-4 항체는 간단한 상용 생체분자 검정 예컨대 면역침전, ELISA, 또는 질량 분광측정법 또는 유전자 조작이 필요없는 면역 현미경 검사(immunomicroscopy)에서 에피토프의 감수성 및 특이적 검출을 허용한다. 이것은 다시, 이들 경로의 정상적 기능을 관찰 및 설명하는 것 둘 다에 있어서, 및 경로가 비정상적으로 기능하고 있는 경우 검출하는 것에 있어서 상당한 이점을 제공한다.
본 발명의 SSEA-4 항체는 또한 질환의 발생 및 발병기전에서의 역할을 결정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 SSEA-4 항체는 하나 이상의 질환 상태와 상관될 수 있는 TACA가 정상적으로 일시적으로 발현되는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 SSEA-4 항체는 추가로, 본 발명의 항-SSEA-4 항체에 특이적이지 않은 SSEA-4의 정상 활성을 방해하지 않고 하나 이상의 SSEA-4가 비정상적으로 조절되거나 또는 비정상적으로 기능하는 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 항-SSEA-4 항체는 다양한 세포 유형 및 조직에서 암 상태의 검출을 위한 시약으로서 유용성을 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 항-SSEA-4 항체는 본 발명의 대상 항체의 것과 유사한 차단 활성 패턴을 갖는 SSEA-4 길항제의 개발에 유용하다. 예를 들어, 본 발명의 항-SSEA-4 항체는 차단 SSEA-4 경로의 동일한 SSEA-4 결합 특징 및/또는 능력을 갖는 다른 항체를 결정하고 확인하는데 사용될 수 있다.
추가의 예로서, 본 발명의 항-SSEA-4 항체는 본원에 예시된 항체와 동일한 SSEA-4의 항원 결정기(들) (선형 및 입체형태적 에피토프 포함)에 실질적으로 결합하는 다른 항-SSEA-4 항체를 확인하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 항-SSEA-4 항체는, 항체가 그러한 것처럼 SSEA-4에 대한 하나 이상의 결합 파트너의 결합을 차단함에 있어서 유사한 약리학적 효과를 나타낼 SSEA-4의 소분자 길항제에 대한 스크리닝에 SSEA-4가 수반되는 생리학적 경로에 기초한 검정에 사용될 수 있다.
항체의 생성은 본원에 기재된 것을 포함한 관련 기술분야의 상용 기술, 예를 들어 하이브리도마 기술 및 결합제 분자의 파지 디스플레이된 라이브러리의 스크리닝을 사용하여 달성될 수 있다. 이들 방법은 관련 기술분야에 잘 확립되어 있다.
간단하게, 본 발명의 항-SSEA-4 항체는 목적하는 활성(들)을 갖는 합성 항체 클론을 스크리닝하는 조합 라이브러리를 사용하여 제조될 수 있다. 원칙적으로, 파지 코트 단백질에 융합된 항체 가변 영역 (Fv)의 다양한 단편을 디스플레이하는 파지를 함유하는 파지 라이브러리를 스크리닝함으로써 합성 항체 클론이 선택된다. 목적하는 항원에 대한 친화성 크로마토그래피에 의해 이러한 파지 라이브러리가 패닝된다. 목적하는 항원에 결합할 수 있는 Fv 단편을 발현하는 클론이 항원에 흡착되고, 따라서 라이브러리 내의 비-결합 클론으로부터 분리된다. 이어서, 결합 클론이 항원으로부터 용리되고, 항원 흡착/용리의 추가 사이클에 의해 추가로 풍부화될 수 있다. 본 발명의 임의의 항-SSEA-4 항체는 관심 파지 클론을 선택하기 위한 적합한 항원 스크리닝 절차를 설계하고, 이어서 관심 파지 클론으로부터의 Fv 서열 및 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md. (1991), vols. 1-3]에 기재된 적합한 불변 영역 (Fc) 서열을 사용하여 전장 항-SSEA-4 항체 클론을 구축함으로써 수득할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-SSEA-4 항체는 모노클로날이다. 본원에 제공된 항-SSEA-4 항체의 항체 단편 예컨대 Fab, Fab', Fab'-SH 및 F(ab')2 단편, 및 그의 변이체가 또한 본 발명의 범주의 내에 포함된다. 이들 항체 단편은 전통적인 수단, 예컨대 효소적 소화에 의해 생성할 수 있거나, 또는 재조합 기술에 의해 생성할 수 있다. 이러한 항체 단편은 키메라, 인간 또는 인간화일 수 있다. 이들 단편은 본원에 제시된 실험, 진단, 및 치료 목적을 위해 유용하다.
모노클로날 항체는 실질적으로 동종 항체의 집단으로부터 수득할 수 있고, 즉 상기 집단을 구성하는 개별 항체들은 미량으로 존재할 수도 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 개별 항체의 혼합물이 아닌 것으로서의 항체의 특징을 나타낸다.
본 발명의 항-SSEA-4 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 처음 기재된 하이브리도마 방법을 포함하여 관련 기술분야에 공지된 다양한 방법을 사용하여 제조할 수 있거나, 대안적으로 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567)에 의해 제조할 수 있다.
벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법
본 발명의 항체의 재조합 생산을 위해서는, 이를 코딩하는 핵산을 단리시키고, 추가의 클로닝 (DNA 증폭) 또는 발현을 위한 복제가능한 벡터 내에 삽입한다. 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 것에 의해) 용이하게 단리 및 서열분석한다. 다수의 벡터가 이용가능하다. 벡터의 선택은 부분적으로는 사용되는 숙주 세포에 따라 달라진다. 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 (일반적으로 포유동물) 기원의 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE 불변 영역을 포함하는 임의의 이소형의 불변 영역이 이러한 목적에 사용될 수 있고, 이러한 불변 영역은 임의의 인간 또는 동물 종으로부터 수득될 수 있음이 인지될 것이다.
원핵 숙주 세포를 사용한 항체의 생성
벡터 구축
본 발명의 항체의 폴리펩티드 성분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 표준 재조합 기술을 사용하여 수득할 수 있다. 목적하는 폴리뉴클레오티드 서열을 항체 생산 세포, 예컨대 하이브리도마 세포로부터 단리하여 서열분석할 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 합성기 또는 PCR 기술을 사용하여 합성할 수 있다. 일단 수득된 후에, 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 원핵 숙주에서 이종 폴리뉴클레오티드를 복제 및 발현할 수 있는 재조합 벡터 내로 삽입한다. 입수가능하고 관련 기술분야에 공지된 다수의 벡터를 본 발명의 목적에 사용할 수 있다. 적절한 벡터의 선택은 주로 벡터에 삽입되는 핵산의 크기 및 벡터로 형질전환되는 특정한 숙주 세포에 따라 달라질 것이다. 각각의 벡터는 그의 기능 (이종 폴리뉴클레오티드의 증폭 또는 발현, 또는 둘 다) 및 벡터가 존재하게 되는 특정한 숙주 세포와의 상용성에 따라 다양한 성분을 함유한다. 벡터 성분은 일반적으로 복제 기점, 선택 마커 유전자, 프로모터, 리보솜 결합 부위 (RBS), 신호 서열, 이종 핵산 삽입물 및 전사 종결 서열을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일반적으로, 숙주 세포와 상용성인 종으로부터 유래된 레플리콘 및 제어 서열을 함유하는 플라스미드 벡터가 이러한 숙주에 대하여 사용된다. 벡터는 통상적으로 복제 부위, 뿐만 아니라 형질전환된 세포에서 표현형 선택을 제공할 수 있는 마킹 서열을 포함한다. 예를 들어, 이. 콜라이는 전형적으로 이. 콜라이 종으로부터 유래된 플라스미드인 pBR322를 사용하여 형질전환시킨다. pBR322는 암피실린 (Amp) 및 테트라시클린 (Tet) 내성을 코딩하는 유전자를 함유하고, 따라서 형질전환된 세포를 확인하기 위한 용이한 수단을 제공한다. pBR322, 그의 유도체, 또는 다른 미생물 플라스미드 또는 박테리오파지 또한 내인성 단백질의 발현을 위해 미생물 유기체에 의해 사용될 수 있는 프로모터를 함유할 수 있거나, 또는 상기 프로모터를 함유하도록 변형될 수 있다. 특정한 항체의 발현을 위해 사용되는 pBR322 유도체의 예는 미국 특허 번호 5,648,237 (Carter et al.)에 상세하게 기재되어 있다.
또한, 숙주 미생물과 상용성인 레플리콘 및 제어 서열을 함유하는 파지 벡터를 이러한 숙주에 대한 형질전환 벡터로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 박테리오파지, 예컨대 λGEM™-11이 이. 콜라이 LE392와 같은 감수성 숙주 세포의 형질전환에 사용될 수 있는 재조합 벡터의 제조에 이용될 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 각각의 폴리펩티드 성분을 코딩하는 2종 이상의 프로모터-시스트론 쌍을 포함할 수 있다. 프로모터는 시스트론의 발현을 조정하는, 시스트론의 상류 (5')에 위치하는 비번역 조절 서열이다. 원핵 프로모터는 전형적으로 2종의 부류의 프로모터, 유도성 및 구성적 프로모터로 분류된다. 유도성 프로모터는 배양 조건에서의 변화, 예를 들어 영양소의 존재 또는 부재, 또는 온도 변화에 반응하여 그의 제어 하에 있는 시스트론의 전사 수준 증가를 개시시키는 프로모터이다.
다양한 잠재적 숙주 세포에 의해 인식되는 다수의 프로모터가 널리 공지되어 있다. 선택된 프로모터는, 제한 효소 소화를 통해 공급원 DNA로부터 프로모터를 제거하고 단리된 프로모터 서열을 본 발명의 벡터 내로 삽입함으로써, 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는 시스트론 DNA에 작동가능하게 연결될 수 있다. 천연 프로모터 서열 및 다수의 이종 프로모터를 둘 다 사용하여 표적 유전자의 증폭 및/또는 발현을 지시할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이종 프로모터는 일반적으로 천연 표적 폴리펩티드 프로모터에 비해 발현된 표적 유전자의 보다 큰 전사 및 보다 높은 수율을 가능하게 하기 때문에 이것이 이용된다.
원핵 숙주와 함께 사용하기 적합한 프로모터는 PhoA 프로모터를 포함하고, 박테리아 프로모터 (예컨대 다른 공지된 박테리아 또는 파지 프로모터)도 또한 적합하다. 그의 뉴클레오티드 서열은 공개되었으며, 그로 인해 숙련된 작업자가 임의의 필요한 제한 부위를 공급하기 위한 링커 또는 어댑터를 사용하여 그들을 표적 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 시스트론에 작동가능하게 라이게이션할 수 있도록 한다 (Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269).
본 발명의 한 측면에서, 재조합 벡터 내의 각각의 시스트론은 발현된 폴리펩티드의 막을 가로지른 전위를 지시하는 분비 신호 서열 성분을 포함한다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 성분일 수 있거나, 또는 벡터 내에 삽입되는 표적 폴리펩티드 DNA의 일부일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 선택된 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단)되는 것이어야 한다. 이종 폴리펩티드에 천연인 신호 서열을 인식 및 프로세싱하지 않는 원핵 숙주 세포의 경우에, 신호 서열이, 예를 들어 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, Ipp, 또는 열-안정성 장독소 II (STII) 리더, LamB, PhoE, PelB, OmpA 및 MBP로 이루어진 군으로부터 선택된 원핵 신호 서열로 치환된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 발현 시스템의 시스트론 둘 다에 사용되는 신호 서열은 STII 신호 서열 또는 그의 변이체이다.
본 발명에 따른 이뮤노글로불린의 생산은 숙주 세포의 세포질에서 일어날 수 있으며, 따라서 각 시스트론 내의 분비 신호 서열의 존재를 요구하지 않는다. 이와 관련하여, 이뮤노글로불린 경쇄 및 중쇄가 발현되고, 폴딩되고, 어셈블리되어, 세포질 내에서 기능적 이뮤노글로불린을 형성한다. 특정 숙주 균주 (예를 들어, 이. 콜라이 trxB- 균주)는 디술피드 결합 형성에 유리한 세포질 조건을 제공함으로써, 발현된 단백질 서브유닛의 적절한 폴딩 및 어셈블리를 허용한다. 문헌 [Proba and Pluckthun Gene, 159:203 (1995)].
본 발명의 항체는 또한, 발현된 폴리펩티드 성분들의 정량적 비를 조정하여, 분비되어 적절하게 어셈블리된 본 발명의 항체의 수율을 최대화할 수 있는 발현 시스템을 사용함으로써 제조될 수 있다. 이러한 조정은 폴리펩티드 성분에 대한 번역 강도의 동시 조정에 의해 적어도 부분적으로 달성된다.
번역 강도의 조정을 위한 한 가지 기술은 미국 특허 번호 5,840,523 (Simmons et al.)에 개시되어 있다. 이는 시스트론 내의 번역 개시 영역 (TIR)의 변이체를 이용한다. 주어진 TIR에 대해, 일련의 아미노산 또는 핵산 서열 변이체는 소정 범위의 번역 강도로 생성되고, 이에 의해 상기 인자를 특정 쇄의 목적하는 발현 수준을 위해 조정하는 편리한 수단을 제공할 수 있다. TIR 변이체는 아미노산 서열을 변경시킬 수 있는 코돈 변화를 초래하는 통상적인 돌연변이 유발 기술에 의해 생성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열 상의 변화는 침묵이다. TIR의 변경은, 예를 들어 신호 서열의 변경과 함께, 샤인-달가노 서열의 수 또는 스페이싱의 변경을 포함할 수 있다. 돌연변이체 신호 서열을 생성하는 한 방법은 신호 서열의 아미노산 서열이 변하지 않는 (즉, 변화가 침묵임) 코딩 서열의 도입부에서의 "코돈 뱅크"의 생성이다. 이는 각각의 코돈의 제3 뉴클레오티드 위치를 변화시킴으로써 달성될 수 있으며; 추가로 류신, 세린 및 아르기닌과 같은 일부 아미노산은 상기 뱅크를 제조하는데 있어서 복잡성을 부가할 수 있는 다수의 제1 및 제2 위치를 갖는다. 돌연변이유발의 이러한 방법은 문헌 [Yansura et al. (1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol. 4:151-158]에 상세하게 기재되어 있다.
한 실시양태에서, 내부에 각 시스트론에 대한 소정 범위의 TIR 강도를 지닌 벡터 세트를 생성시킨다. 상기 제한된 세트는 각각의 쇄의 발현 수준 뿐만 아니라 다양한 TIR 강도 조합 하에서 목적하는 항체 생성물의 수율의 비교를 제공한다. TIR 강도는 미국 특허 번호 5,840,523 (Simmons et al.)에 상세히 기재된 바와 같은 리포터 유전자의 발현 수준을 정량화함으로써 결정할 수 있다. 번역 강도 비교를 기반으로 하여, 목적하는 개별 TIR을 본 발명의 발현 벡터 구축물에서 조합되도록 선택한다.
본 발명의 항체의 발현에 적합한 원핵 숙주 세포는 아르카에박테리아 및 유박테리아, 예컨대 그람-음성 또는 그람-양성 유기체를 포함한다. 유용한 박테리아의 예는 에스케리키아(Escherichia) (예를 들어, 이. 콜라이), 바실루스(Bacilli) (예를 들어, 비. 서브틸리스(B. subtilis)), 엔테로박테리아(Enterobacteria), 슈도모나스(Pseudomonas) 종 (예를 들어, 피. 아에루기노사(P. aeruginosa)), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 시겔라(Shigella), 리조비움(Rhizobia), 비트레오실라(Vitreoscilla) 또는 파라코쿠스(Paracoccus)를 포함한다. 한 실시양태에서는, 그람-음성 세포가 사용된다. 한 실시양태에서, 이. 콜라이 세포가 본 발명에서 숙주로서 사용된다. 이. 콜라이 균주의 예는 균주 W3110 (문헌 [Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219]; ATCC 기탁 번호 27,325) 및 그의 유도체 (유전자형 W3110을 갖는 균주 33D3 포함, 문헌 [hmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219]; ATCC 기탁 N이. 콜라이 294 (ATCC 31,446))를 포함하며, 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 E, coliCC 31,446), enod 이. 콜라이 RV308 (ATCC 31,608)이 또한 적합하다. 이들 예는 제한적이기보다는 예시적이다. 규정된 유전자형을 갖는 임의의 상기-언급된 박테리아의 유도체를 구축하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990)]에 기재되어 있다. 박테리아 세포 내의 레플리콘의 복제능을 고려하여 적절한 박테리아를 선택하는 것이 일반적으로 필요하다. 예를 들어, pBR322, pBR325, pACYC177 또는 pKN410과 같은 널리 공지된 플라스미드가 레플리콘을 공급하는데 사용된 경우에는, 이. 콜라이, 세라티아 또는 살모넬라 종이 숙주로서 적합하게 사용될 수 있다. 전형적으로, 숙주 세포는 최소량의 단백질분해 효소를 분비해야 하며, 추가의 프로테아제 억제제가 바람직하게는 세포 배양물에 혼입될 수 있다.
항체 생산
숙주 세포를 상기 기재된 발현 벡터로 형질전환시키고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양시킨다.
형질전환은 DNA가 염색체외 요소로서 또는 염색체 구성요소에 의해 복제가능하도록 DNA를 원핵 숙주 내로 도입시키는 것을 의미한다. 사용되는 숙주 세포에 따라, 형질전환은 그 세포에 적절한 표준 기술을 이용하여 수행된다. 염화칼슘을 사용한 칼슘 처리는 실질적인 세포 벽 장벽을 함유하는 박테리아 세포에 일반적으로 사용된다. 또 다른 형질전환 방법은 폴리에틸렌 글리콜/DMSO를 사용한다. 사용되는 또 다른 기술은 전기천공이다.
본 발명의 폴리펩티드를 생산하는데 사용되는 원핵 세포를 관련 기술분야에 공지되어 있는, 선택된 숙주 세포의 배양에 적합한 배지에서 성장시킨다. 적합한 배지의 예는 필수 영양 보충물이 부가된 루리아 브로쓰 (LB)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 배지는 또한 발현 벡터를 함유하는 원핵 세포의 성장을 선택적으로 허용하는, 발현 벡터의 구축에 기반하여 선택되는 선택 작용제를 함유한다. 예를 들어, 암피실린은 암피실린 내성 유전자를 발현하는 세포를 성장시키기 위한 배지에 첨가된다.
또한, 탄소, 질소 및 무기 포스페이트 공급원 이외의 임의의 필요한 보충물이, 단독으로, 또는 복합 질소 공급원과 같은 또 다른 보충물 또는 배지와의 혼합물로서 도입되어 적절한 농도로 포함될 수 있다. 임의로, 배양 배지는 글루타티온, 시스테인, 시스타민, 티오글리콜레이트, 디티오에리트리톨 및 디티오트레이톨로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 환원제를 함유할 수 있다.
원핵 숙주 세포를 적합한 온도에서 배양한다. 이. 콜라이 성장을 위해 예를 들어 약 20℃ 내지 약 39℃, 약 25℃ 내지 약 37℃을 포함하는 온도 범위에서, 및 약 30℃에서 성장이 발생한다. 배지의 pH는 주로 숙주 유기체에 따라서 약 5 내지 약 9의 범위의 임의의 pH일 수 있다. 이. 콜라이에 대해, pH는 약 6.8 내지 약 7.4, 또는 약 7.0일 수 있다.
유도성 프로모터가 본 발명의 발현 벡터에 사용되는 경우에, 단백질 발현은 프로모터의 활성화에 적합한 조건 하에서 유도된다. 본 발명의 한 측면에서, PhoA 프로모터가 폴리펩티드의 전사의 제어에 사용된다. 따라서, 형질전환된 숙주 세포는 유도를 위한 포스페이트-제한 배지에서 배양된다. 한 실시양태에서, 포스페이트-제한 배지는 C.R.A.P 배지이다 (예를 들어, 문헌 [Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147] 참조). 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 사용되는 벡터 구축물에 따라 다양한 다른 유도제가 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 발현된 폴리펩티드는 숙주 세포의 주변세포질 내로 분비되고 그로부터 회수된다. 전형적으로, 단백질 회수는 일반적으로 삼투 쇼크, 초음파처리 또는 용해와 같은 수단에 의해 미생물을 분쇄하는 것을 포함한다. 세포가 파괴되면, 세포 파편 또는 전세포를 원심분리 또는 여과에 의해 제거할 수 있다. 단백질은 예를 들어 친화성 수지 크로마토그래피에 의해 추가로 정제할 수 있다. 대안적으로, 단백질은 배양 배지 내로 전달되고, 그 안에서 단리할 수 있다. 세포를 배양물로부터 제거하고, 배양 상청액을 추가의 정제를 위해 여과하고 농축할 수 있다. 발현된 폴리펩티드를, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE) 및 웨스턴 블롯(Western blot) 검정과 같은 통상적으로 공지된 방법을 사용하여 추가로 단리하고 확인할 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 항체 생성은 발효 공정에 의해 대량으로 수행된다. 다양한 대규모 유가식 발효 절차가 재조합 단백질의 생산에 이용가능하다. 대규모 발효는 적어도 1000 리터의 용량, 예를 들어 약 1,000 내지 100,000 리터의 용량을 갖는다. 이들 발효기는 교반기 임펠러를 사용하여 산소 및 영양소, 특히 글루코스 (통상의 탄소/에너지 공급원)를 분배한다. 소규모 발효는 일반적으로, 부피가 대략 100 리터 이하인 발효기 내에서의 발효를 지칭하고, 이는 약 1 리터 내지 약 100 리터 범위일 수 있다.
발효 공정에서, 단백질 발현의 유도는 전형적으로 세포를 적합한 조건 하에서 이 단계에서 세포는 초기 고정상에 있는 목적하는 밀도 (예를 들어 약 180-220의 OD550)로 성장시킨 후에 개시된다. 관련 기술분야에 공지되고 상기 기재된 바와 같이, 사용되는 벡터 구축물에 따라 다양한 유도제를 사용할 수 있다. 세포를 유도 전에 보다 짧은 기간 동안 성장시킬 수 있다. 세포를 통상적으로 약 12-50시간 동안 유도하지만, 보다 길거나 보다 짧은 유도 시간이 사용될 수도 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 생산 수율 및 품질을 개선하기 위해, 다양한 발효 조건을 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 분비된 항체 폴리펩티드의 적절한 어셈블리와 폴딩을 개선시키기 위해, 샤페론(chaperone) 단백질, 예컨대 Dsb 단백질 (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD 및/또는 DsbG) 또는 FkpA (샤페론 활성을 지니고 있는 펩티딜프롤릴 시스,트랜스-이소머라제)를 과다발현하는 추가의 벡터를 사용하여 숙주 원핵 세포를 공동-형질전환시킬 수 있다. 샤페론 단백질은 박테리아 숙주 세포에서 생산된 이종 단백질의 적절한 폴딩 및 용해도를 용이하게 하는 것으로 입증되었다. 문헌 [Chen et al. (1999) J Bio Chem 274:19601-19605]; 미국 특허 번호 6,083,715 (Georgiou et al.); 미국 특허 번호 6,027,888 (Georgiou et al.); 문헌 [Bothmann and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105; Ramm and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113; Arie et al. (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210].
발현된 이종 단백질 (특히, 단백질분해에 감수성인 단백질)의 단백질분해를 최소화하기 위해, 단백질분해 효소가 결핍된 특정 숙주 균주를 본 발명에 사용할 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포 균주를 변형시켜, 공지된 박테리아 프로테아제, 예컨대 프로테아제 III, OmpT, DegP, Tsp, 프로테아제 I, 프로테아제 Mi, 프로테아제 V, 프로테아제 VI 및 그의 조합물을 코딩하는 유전자에서 유전자 돌연변이(들)를 수행할 수 있다. 일부 이. 콜라이 프로테아제-결핍 균주가 이용가능하며, 예를 들어, 상기 문헌 [Joly et al. (1998)]; 미국 특허 번호 5,264,365 (Georgiou et al.); 미국 특허 번호 5,508,192 (Georgiou et al.); [Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996)]에 기재되어 있다.
한 실시양태에서, 단백질분해 효소가 결핍되고 하나 이상의 샤페론 단백질을 과다발현하는 플라스미드로 형질전환된 이. 콜라이 균주가 본 발명의 발현 시스템에서 숙주 세포로서 사용된다.
항체 정제
한 실시양태에서, 추가적인 검정 및 용도를 위한 실질적으로 균질한 제제를 수득하기 위해 본원에서 생산된 항체 단백질을 추가로 정제한다. 관련 기술분야에 공지된 표준 단백질 정제 방법이 사용될 수 있다. 하기 절차는 예시적인 적합한 정제 절차이다: 면역친화성 또는 이온-교환 칼럼 상의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상 또는 양이온-교환 수지, 예컨대 DEAE 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전, 및 예를 들어 세파덱스(Sephadex) G-75를 사용하는 겔 여과.
한 측면에서, 고체 상에 고정된 단백질 A는 본 발명의 항체 생성물의 면역친화성 정제에 사용된다. 단백질 A는 항체의 Fc 영역에 고친화도로 결합하는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 41 kD 세포벽 단백질이다. 문헌 [Lindmark et al. (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13]. 단백질 A가 고정화되는 고체 상은 유리 또는 실리카 표면을 포함하는 칼럼, 또는 제어 공극 유리 칼럼 또는 규산 칼럼일 수 있다. 일부 적용에서는, 오염물의 비특이적 부착을 가능한 방지하기 위해, 상기 칼럼을 글리세롤과 같은 시약으로 코팅한다.
정제의 제1 단계로서, 상기 기재된 바와 같은 세포 배양액으로부터 유래된 제제를 단백질 A 고정된 고체 상에 적용하여 관심 항체가 단백질 A에 특이적으로 결합하게 한다. 이어서, 상기 고체 상을 세척하여 이러한 고체 상에 비특이적으로 결합된 오염물을 제거한다. 최종적으로, 관심 항체를 용리에 의해 고체 상으로부터 회수한다.
진핵 숙주 세포를 사용한 항체의 생성
벡터 성분은 일반적으로 하기 중 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 1종 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열.
(i) 신호 서열 성분
진핵 숙주 세포에 사용하기 위한 벡터는 또한 신호 서열, 또는 관심 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 선택된 이종 신호 서열은 일반적으로 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱된 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단된) 것이다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 신호 서열 뿐만 아니라 바이러스 분비 리더, 예를 들어, 단순 포진 gD 신호가 이용가능하다.
이러한 전구체 영역을 위한 DNA는 항체를 코딩하는 DNA에 리딩 프레임으로 라이게이션된다.
(ii) 복제 기점
일반적으로, 복제 기점 성분은 포유동물 발현 벡터에 대해서는 필요하지 않다. 예를 들어, SV40 기점이 전형적으로 사용될 수 있는데, 그 이유는 단지 이것이 초기 프로모터를 함유하기 때문이다.
(iii) 선택 유전자 성분
발현 및 클로닝 벡터는 선택 마커로도 불리는 선택 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라시클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 적절한 경우에 영양요구성 결핍을 보충하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 이용가능하지 않은 중요한 영양소를 공급하는 단백질을 코딩한다.
선택 계획의 한 예는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 사용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환된 이들 세포는 약물 저항성을 부여하는 단백질을 생산하고, 따라서 선택 요법에서 생존한다. 이러한 우성 선택의 예는 약물 네오마이신, 미코페놀산 및 히그로마이신을 사용한다.
포유동물 세포에 적합한 선택 마커의 또 다른 예는 항체 핵산, 예컨대 DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II (예를 들어, 영장류 메탈로티오네인 유전자), 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카르복실라제 등을 섭취하는 능력을 갖는 세포의 확인을 가능하게 하는 것이다.
예를 들어, DHFR 선택 유전자로 형질전환된 세포는 먼저 메토트렉세이트 (Mtx), DHFR의 경쟁적 길항제를 포함하는 배양 배지에서 모든 형질전환체를 배양함으로써 확인할 수 있다. 야생형 DHFR을 사용할 때 적합한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결여된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주 (예를 들어, ATCC CRL-9096)이다.
대안적으로, 항체, 야생형 DHFR 단백질 및 또 다른 선택 마커, 예컨대 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH)를 코딩하는 DNA 서열로 형질전환되거나 또는 공동-형질전환된 숙주 세포 (특히 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)는 선택 마커, 예컨대 아미노글루코시드계 항생제, 예를 들어 카나마이신, 네오마이신 또는 G418에 대한 선택 작용제를 함유하는 배지에서의 세포 성장에 의해 선택될 수 있다. 미국 특허 번호 4,965,199를 참조한다.
(iv) 프로모터 성분
발현 및 클로닝 벡터는 통상적으로, 숙주 유기체에 의해 인식되고 관심 폴리펩티드 (예를 들어, 항체)를 코딩하는 핵산과 작동가능하게 연결되는 프로모터를 함유한다. 진핵생물에 대한 프로모터 서열이 공지되어 있다. 실질적으로 모든 진핵 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 대략 25 내지 30개 염기 상류에 위치하는 AT-풍부 영역을 갖는다. 많은 유전자의 전사 출발점으로부터 70 내지 80개 염기 상류에서 발견되는 또 다른 서열은 CNCAAT 영역으로, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있다. 코딩 서열의 3' 말단에 폴리 A 테일을 부가하기 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 대부분의 진핵 유전자의 3' 말단에 존재한다. 모든 이들 서열은 진핵 발현 벡터 내로 적합하게 삽입된다.
포유동물 숙주 세포에서의 벡터로부터의 항체 폴리펩티드 전사는, 예를 들어, 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스 (예컨대 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 시토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 원숭이 바이러스 40 (SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어, 액틴 프로모터 또는 이뮤노글로불린 프로모터로부터, 또는 열-충격 프로모터로부터 수득된 프로모터에 의해 제어될 수 있고, 단 이러한 프로모터들은 숙주 세포 시스템과 상용성이다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 기점을 또한 함유하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 인간 시토메갈로바이러스의 극초기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 소 유두종 바이러스를 벡터로 사용하여 포유동물 숙주에서 DNA를 발현시키기 위한 시스템이 미국 특허 번호 4,419,446에 개시되어 있다. 이 시스템의 변형이 미국 특허 번호 4,601,978에 기재되어 있다. 또한, 단순 포진 바이러스로부터의 티미딘 키나제 프로모터의 제어 하에 마우스 세포에서 인간 β-인터페론 cDNA를 발현시키는 것에 대해서는 문헌 [Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982)]을 참조한다. 대안적으로, 라우스 육종 바이러스의 긴 말단 반복부를 프로모터로서 사용할 수 있다.
(v) 인핸서 요소 성분
보다 고등한 진핵세포에 의한 본 발명의 항체 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 전사는 종종 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가된다. 많은 인핸서 서열이 현재 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백질 및 인슐린)로부터 공지되어 있다. 그러나, 전형적으로 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 예는 복제 기점의 하류 쪽 (bp 100-270)의 SV40 인핸서, 시토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 하류 쪽의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 또한, 진핵 프로모터의 활성화를 위한 인핸서 요소에 대해 문헌 [Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)]을 참조한다. 인핸서는 항체 폴리펩티드-코딩 서열에 대한 5' 또는 3' 위치에서 벡터 내로 분할될 수 있지만, 일반적으로 프로모터로부터 5' 부위에 위치한다.
(vi) 전사 종결 성분
진핵 숙주 세포에 사용되는 발현 벡터는 전형적으로 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열 또한 함유할 것이다. 이러한 서열은 통상적으로 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및, 때때로 3', 비번역 영역으로부터 이용가능하다. 이들 영역은 항체를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 절편을 함유한다. 하나의 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. WO94/11026 및 여기에 개시된 발현 벡터를 참조한다.
(vii) 숙주 세포의 선택 및 형질전환
본원의 벡터에서 DNA의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 척추동물 숙주 세포를 비롯한 본원에 기재된 고등 진핵생물 세포를 포함한다. 배양 (조직 배양)에서 척추동물 세포의 증식은 상용 절차가 된 바 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (293 또는 현탁 배양에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, 문헌 [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, 문헌 [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간세포암 세포주 (Hep G2)이다.
숙주 세포는 항체 생산을 위해 상기 기재된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고, 프로모터를 유도하거나 형질전환체를 선택하거나 또는 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형된 통상의 영양 배지에서 배양된다.
(viii) 숙주 세포의 배양
본 발명의 항체를 생산하는데 사용된 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 입수가능한 배지, 예컨대 햄(Ham) F10 (시그마(Sigma)), 최소 필수 배지 (MEM) (시그마), RPMI-1640 (시그마), 및 둘베코(Dulbecco) 개질된 이글(Eagle) 배지 (DMEM) (시그마)가 숙주 세포의 배양에 적합하다. 또한, 문헌 [Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980)], 미국 특허 번호 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 등록 30,985에 기재된 임의의 배지를 숙주 세포를 위한 배양 배지로서 사용할 수 있다. 이들 임의의 배지는 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예컨대, 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제 (예컨대, HEPES), 뉴클레오티드 (예컨대, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예컨대, 젠타마이신(GENTAMYCIN)™ 약물), 미량 원소 (보통 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로 정의됨), 및 글루코스 또는 등가의 에너지원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충물은 또한 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되었을 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포에 대해 이전에 기재된 바와 같고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
(ix) 항체의 정제
재조합 기술을 사용할 때, 항체는 세포 내에서 생성되거나, 또는 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포 내에서 생산되면, 제1 단계로서, 미립자 파편, 숙주 세포 또는 용해된 단편은 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 항체를 배지에 분비한 경우에는, 일반적으로 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액을 먼저 상업적으로 입수가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 장치를 이용하여 농축시킨다. 단백질분해를 억제하기 위해 상기 단계 중 임의의 단계에 프로테아제 억제제, 예컨대 PMSF를 포함시킬 수 있고, 우발적 오염물의 성장을 방지하기 위해 항생제를 포함시킬 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은 예를 들어, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있고, 친화성 크로마토그래피가 일반적으로 허용되는 정제 기술이다. 친화성 시약, 예를 들어 친화성 리간드로서의 단백질 A의 적합성은 항체 내에 존재하는 임의의 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 의존한다. 단백질 A를 사용하여 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄 기재의 항체를 정제할 수 있다 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 γ3에 대해 권장된다 (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 흔하게는 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예컨대 조절 공극 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스에 의해 달성될 수 있는 것보다 빠른 유속 및 짧은 가공 시간을 허용한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, 베이커본드(Bakerbond) ABX™ 수지 (제이. 티. 베이커(J. T. Baker), 뉴저지주 필스버그)가 정제에 유용하다. 회수될 항체에 따라, 이온 교환 칼럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상 크로마토그래피, 헤파린 세파로스(SEPHAROSE)™ 상 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예를 들어, 폴리아스파르트산 칼럼) 상 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 황산암모늄 침전과 같은 다른 단백질 정제 기술도 또한 이용가능하다.
임의의 예비 정제 단계(들) 후에, 관심 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물은 필요한 경우, 예를 들어 약 2.5-4.5의 pH에서, 일반적으로 낮은 염 농도 (예를 들어, 약 0-0.25M 염)에서 수행되는 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 추가의 정제 단계에 적용될 수 있다.
일반적으로, 연구, 시험 및 임상 용도로 사용하기 위한 항체의 제조를 위한 기술 및 방법은 관련 기술분야에 널리 확립되어 있으며, 상기와 일치하고/하거나 목적하는 특정 항체에 대한 통상의 기술자에 의해 적절한 것으로 간주되는 바와 같음을 유념해야 한다.
활성 검정
본 발명의 항체는 관련 기술분야에 공지된 다양한 검정에 의해 그의 물리적/화학적 특성 및 생물학적 기능에 대해 특징화될 수 있다.
본 개시내용의 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 또한 항원에 대한 그의 결합 친화도의 관점에서 기재되거나 구체화될 수 있다. 탄수화물 항원에 대한 항체의 친화도는 임의의 적합한 방법을 사용하여 실험적으로 결정될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Berzofsky et al., "Antibody- Antigen Interactions," In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, N.Y. (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992)]; 및 본원에 기재된 방법 참조). 특정 항체-탄수화물 항원 상호작용의 측정된 친화도는 상이한 조건 (예를 들어, 염 농도, pH) 하에 측정시 달라질 수 있다. 따라서, 친화도 및 다른 항원-결합 파라미터 (예를 들어, KD, Ka, Ka)의 측정은 바람직하게는 항체 및 항원의 표준화된 용액, 및 표준화된 완충제로 수행된다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 시험관내 및 생체내 치료, 예방, 및/또는 진단 유용성을 갖는다. 예를 들어, 이들 항체는 암을 치료, 억제, 재발 방지 및/또는 진단하기 위해 예를 들어 시험관내 또는 생체외에서 배양물 내의 세포에 또는 예를 들어 생체내에서 대상체에게 투여될 수 있다.
정제된 항체는 N-말단 서열분석, 아미노산 분석, 비-변성 크기 배제 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC), 질량 분광측정법, 이온 교환 크로마토그래피 및 파파인 소화를 포함하나 이에 제한되지 않는 일련의 검정에 의해 추가로 특징화될 수 있다.
필요에 따라, 항체를 그의 생물학적 활성에 대해 분석한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체를 그의 항원 결합 활성에 대하여 시험한다. 관련 기술분야에 공지되어 있으며 본원에 사용될 수 있는 항원 결합 검정은 웨스턴 블롯, 방사성면역검정, ELISA (효소 연결 면역흡착 검정), "샌드위치" 면역검정, 면역침전 검정, 형광 면역검정, 화학발광 면역검정, 나노입자 면역검정, 압타머 면역검정, 및 단백질 A 면역검정과 같은 기술을 사용하는 임의의 직접적 또는 경쟁적 결합 검정을 비제한적으로 포함한다.
항체 단편
본 발명은 항체 단편을 포함한다. 특정 상황에서는, 완전 항체가 아닌 항체 단편을 사용하는 것이 유리하다. 단편의 크기가 작을수록 클리어런스가 신속하고, 고형 종양에 대한 접근을 개선시킬 수 있다.
항체 단편의 생산을 위하여 다양한 기술이 개발되어 왔다. 전통적으로, 이들 단편은 무손상 항체의 단백질분해적 소화를 통해 유래되었다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); 및 Brennan et al., Science, 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 현재 이들 단편들은 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생산될 수 있다. Fab, Fv 및 ScFv 항체 단편은 모두 이. 콜라이에서 발현되어 그로부터 분비될 수 있어서 다량의 이들 단편의 용이한 생산을 가능하게 한다. 항체 단편은 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접적으로 회수되고, 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다 (Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). 또 다른 접근법에 따라, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리될 수 있다. 샐비지 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하는, 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')2 단편이 미국 특허 5,869,046에 기재되어 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술들이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 다른 실시양태에서, 선택된 항체는 단일 쇄 Fv 단편 (scFv)이다. WO 93/16185; 미국 특허 번호 5,571,894; 및 5,587,458을 참조한다. Fv 및 sFv는 불변 영역이 결여된 무손상 결합 부위를 갖는 유일한 종이어서, 생체내 사용 동안 비특이적 결합을 감소시키는데 적합하다. sFv의 아미노 또는 카르복시 말단에서 이펙터 단백질의 융합체가 생성되도록 sFv 융합 단백질을 구축할 수 있다. 상기 문헌 [Antibody Engineering, ed. Borrebaeck]을 참조한다. 또한 항체 단편은, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,641,870에 기재된 바와 같이, 예로써 "선형 항체"일 수 있다. 이러한 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
인간화 항체
본 발명은 인간화 항체를 포함한다. 비-인간 항체를 인간화하는 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 인간화 항체에는 비-인간 공급원으로부터 유래된 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입되어 있을 수 있다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 전형적으로 "유입" 가변 도메인으로부터 취해지는 "유입" 잔기로 종종 지칭된다. 인간화는 본질적으로, 윈터(Winter) 및 공동연구자들의 방법 (문헌 [Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536])에 따라, 인간 항체의 상응하는 서열을 초가변 영역 서열로 치환함으로써 수행할 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 실질적으로 무손상 인간 가변 도메인 이외의 부분이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체이다 (미국 특허 번호 4,816,567). 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 초가변 영역 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다.
인간화 항체의 제조에 사용될 경쇄 및 중쇄 모두의 인간 가변 도메인의 선택은 항원성을 감소시키는데 중요할 수 있다. 소위 "최적-피트" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열은 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 설치류의 것과 가장 근접한 인간 서열은 이어서 인간화 항체에 대한 인간 프레임워크로서 허용된다 (Sims et al. (1993) J. Immunol. 151:2296; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정한 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정한 프레임워크를 사용한다. 동일한 프레임워크가 여러 상이한 인간화 항체에 대해 사용될 수 있다 (Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285; Presta et al. (1993) J. Immunol., 151:2623).
항원에 대한 높은 친화도 및 기타 바람직한 생물학적 특성을 유지하면서 항체를 인간화시키는 것이 추가로 일반적으로 바람직하다. 이러한 목적을 달성하기 위해서, 한 방법에 따라, 인간화 항체는 모 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하는 모 서열 및 다양한 개념적 인간화 생성물의 분석 공정에 의해 제조된다. 3-차원 이뮤노글로불린 모델은 통상적으로 이용가능하고 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 친숙하다. 선택된 후보 이뮤노글로불린 서열의 가능한 3-차원 입체형태적 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이들 디스플레이들의 검사로 후보 이뮤노글로불린 서열의 기능화에 있어서 잔기들의 가능한 역할을 분석할 수 있으며, 즉, 자신의 항원에 결합하는 후보 이뮤노글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 방식으로, 목적하는 항체 특징, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화도가 달성되도록 수용자 및 유입 서열로부터 FR 잔기들을 선택하고 조합시킬 수 있다. 일반적으로, 항원 결합에 대한 영향에는 초가변 영역 잔기가 직접적이고 가장 실질적으로 관여한다.
인간 항체
본 발명의 인간 항-SSEA-4 항체는 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열(들)을 상기 기재한 바와 같은 공지된 인간 불변 도메인 서열(들)과 조합함으로써 구축할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 인간 모노클로날 항-SSEA-4 항체는 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있다. 인간 모노클로날 항체 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주는, 예를 들어 문헌 [Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)]에 기재되었다.
면역화시에 내인성 이뮤노글로불린의 생성 없이 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생성할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)을 생성하는 것이 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 배선 돌연변이체 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자의 동형접합 결실이 내인성 항체 생산의 완전한 억제를 일으킨다는 것이 기재되었다. 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자 어레이를 이러한 배선 돌연변이체 마우스에게 전달하면, 항원 챌린지 시에 인간 항체의 생산이 유발될 것이다. 예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol., 7: 33 (1993)]을 참조한다.
유전자 셔플링은 또한 비-인간, 예를 들어 설치류 항체로부터 인간 항체를 유도하는데 사용될 수 있고, 이때 인간 항체는 출발 비-인간 항체와 유사한 친화도 및 특이성을 갖는다. "에피토프 각인(imprinting)"으로 또한 칭해지는 이러한 방법에 따라, 상기 기재된 바와 같은 파지 디스플레이 기술에 의해 수득된 비-인간 항체 단편의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역이 인간 V 도메인 유전자의 레퍼토리로 대체되어, 비-인간 쇄/인간 쇄 scFv 또는 Fab 키메라의 집단이 생성된다. 항원에 의한 선택 결과로서, 인간 쇄에 의해 1차 파지 디스플레이 클론에서 상응하는 비-인간 쇄의 제거 시에 파괴된 항원 결합 부위가 복원된 비-인간 쇄/인간 쇄 키메라 scFv 또는 Fab가 단리되며, 즉 에피토프가 인간 쇄 파트너의 선택을 좌우 (각인)한다. 나머지 비-인간 쇄를 대체하기 위해 프로세스가 반복될 때, 인간 항체가 수득된다 (1993년 4월 1일 공개된 PCT WO 93/06213 참조). CDR 그라프팅에 의한 비-인간 항체의 전통적인 인간화와는 달리, 이 기술은 비-인간 기원의 FR 또는 CDR 잔기가 없는 완전 인간 항체를 제공한다.
이중특이적 항체
이중특이적 항체는 적어도 2종의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 인간 또는 인간화 항체이다. 특정 실시양태에서, 결합 특이성 중 하나는 특이적 리신 연결을 포함하는 SSEA-4에 대한 것이고, 다른 것은 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 2개의 상이한 리신 연결을 갖는 2개의 상이한 SSEA-4에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')2 이중특이적 항체)으로 제조될 수 있다.
이중특이적 항체의 제조 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동-발현에 기초하고, 이때 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (문헌 [Milstein and Cuello, Nature, 305: 537 (1983)]). 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 편성으로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마)는 10종의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생산하고, 이중 1종만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 통상적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 상기 정확한 분자의 정제는 다소 성가시고 생성 수율이 낮다. 유사한 절차가 1993년 5월 13일자로 공개된 WO 93/08829 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655 (1991)]에 개시되어 있다.
상이한 실시양태에 따르면, 목적하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체 가변 도메인이 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 융합은 예를 들어 힌지의 적어도 일부, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 도메인을 사용한다. 특정 실시양태에서, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 융합체의 적어도 하나에 존재한다. 이뮤노글로불린 중쇄 융합체 및 목적하는 경우에 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 개별 발현 벡터 내로 삽입하고, 적합한 숙주 유기체 내로 공동-형질감염시킨다. 이는, 구축에 사용된 3개의 폴리펩티드 쇄의 동등하지 않은 비가 최적의 수율을 제공하는 경우의 실시양태에서, 3종의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 있어서 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 적어도 2종의 폴리펩티드 쇄의 동등한 비에서의 발현이 고수율을 발생시키거나 또는 비가 특정한 유의성을 갖지 않는 경우에, 2종 또는 모든 3종의 폴리펩티드 쇄에 대한 코딩 서열을 1개의 발현 벡터에 삽입하는 것이 가능하다.
한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 하나의 아암에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄, 및 다른 아암에 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성 제공)으로 구성된다. 이중특이적 분자의 한쪽 절반에만 이뮤노글로불린 경쇄가 존재하는 것이 용이한 분리 방식을 제공하기 때문에, 이러한 비대칭 구조는 원치않는 이뮤노글로불린 쇄 조합으로부터의 목적하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 한다는 것이 발견되었다. 이러한 접근법이 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이중특이적 항체의 생성에 대한 추가의 세부사항에 대해서는 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]을 참조한다.
또 다른 접근법에 따라, 한 쌍의 항체 분자 사이의 인터페이스를 조작하여 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 백분율을 최대화할 수 있다. 인터페이스는 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이러한 방법에서, 제1 항체 분자의 인터페이스로부터의 1개 이상의 소형 아미노산 측쇄가 보다 대형의 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 대형 아미노산 측쇄를 보다 소형의 것 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체함으로써 대형 측쇄(들)에 대해 동일하거나 유사한 크기의 보상성 "함몰부"가 제2 항체 분자의 인터페이스 상에 생성된다. 이는 동종이량체와 같은 다른 원치않는 최종-산물에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키는 메카니즘을 제공한다.
이중특이적 항체는 가교된 또는 "이종접합체" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종접합체 내의 항체들 중 하나는 아비딘에 커플링되고, 다른 하나는 비오틴에 커플링될 수 있다. 이러한 항체는 예를 들어 면역계 세포의 원치않는 세포로의 표적화 (미국 특허 번호 4,676,980) 및 HIV 감염의 치료 (WO 91/00360, WO 92/00373, 및 EP 03089)를 위해 제안된 바 있다. 임의의 편리한 가교 방법을 사용하여 이종접합체 항체를 제조할 수 있다. 적합한 가교제가 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 다수의 가교 기술과 함께 미국 특허 번호 4,676,980에 개시되어 있다.
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성시키는 기술이 또한 문헌에 기재되었다. 예를 들어, 화학적 연결을 사용하여 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)]은 무손상 항체를 단백질 분해적으로 절단하여 F(ab')2 단편을 생성시키는 과정을 기재한다. 이들 단편을 디티올 착화제 아비산나트륨의 존재 하에서 환원시켜, 이웃자리 디티올을 안정화시키고 분자간 디술피드 형성을 방지한다. 이어서 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 이어서 Fab'-TNB 유도체 중 1종을 메르캅토에틸아민에 의한 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환시키고, 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성한다. 생산된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 작용제로서 사용될 수 있다.
최근의 진보는 이중특이적 항체를 형성하도록 화학적으로 커플링될 수 있는, 이. 콜라이로부터의 Fab'-SH 단편의 직접 회수를 용이하게 하였다. 문헌 [Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)]은 완전히 인간화된 이중특이적 항체 F(ab')2 분자의 생성을 기재한다. 각각의 Fab' 단편을 이. 콜라이로부터 개별적으로 분비시키고, 이중특이적 항체를 형성하도록 시험관내 유도 화학적 커플링을 실시하였다. 이와 같이 형성된 이중특이적 항체는 HER2 수용체를 과다발현하는 세포 및 정상적인 인간 T 세포에 결합할 수 있을 뿐만 아니라, 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 촉발할 수 있었다.
재조합 세포 배양물로부터 직접적으로 이중특이적 항체 단편을 제조 및 단리하는 다양한 기술이 또한 기재되었다. 예를 들어, 류신 지퍼를 사용하여 이중특이적 항체가 생산되었다. 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드는 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 유전자 융합에 의해 연결되었다. 항체 동종이량체는 힌지 영역에서 환원되어 단량체를 형성하고 이어서 재-산화되어 항체 이종이량체를 형성하였다. 이러한 방법은 또한 항체 동종이량체의 생산에 이용될 수 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편의 제조를 위한 대안적인 메카니즘을 제공한다. 상기 단편은 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이의 쌍형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 따라서, 하나의 단편의 VH 및 VL 도메인은 또 다른 단편의 상보적 VL 및 VH 도메인과 쌍 형성하도록 강제되어, 2개의 항원-결합 부위를 형성한다. 단일-쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또 다른 전략이 또한 보고되었다. 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)]을 참조한다.
2가 초과의 원자가를 갖는 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체가 제조될 수 있다. 문헌 [Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)].
다가 항체
다가 항체는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 2가 항체보다 더 신속하게 내재화 (및/또는 이화)될 수 있다. 본 발명의 항체는 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 (예를 들어, 4가 항체) 다가 항체 (IgM 부류 이외의 것)일 수 있고, 이는 항체의 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 핵산의 재조합 발현에 의해 용이하게 생산될 수 있다. 다가 항체는 이량체화 도메인 및 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 이량체화 도메인은 예를 들어 Fc 영역 또는 힌지 영역을 포함한다 (또는 이것으로 이루어진다). 이러한 시나리오에서, 항체는 Fc 영역, 및 Fc 영역의 아미노-말단에 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 것이다. 한 실시양태에서, 다가 항체는 예를 들어 3 내지 약 8개, 또는 4개의 항원 결합 부위를 포함한다 (또는 이것으로 이루어진다). 다가 항체는 적어도 1개의 폴리펩티드 쇄 (예를 들어, 2개의 폴리펩티드 쇄)를 포함하며, 여기서 폴리펩티드 쇄(들)는 2개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드 쇄(들)는 VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc (여기서, VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, Fc는 Fc 영역의 1개 폴리펩티드 쇄이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩티드를 나타내고, n은 0 또는 1임)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 쇄(들)는 VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-Fc 영역 쇄; 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역 쇄를 포함할 수 있다. 본원에서의 다가 항체는 적어도 2개 (예를 들어, 4개)의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 본원에서의 다가 항체는, 예를 들어 약 2 내지 약 8개의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본원에서 고려되는 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 임의로 CL 도메인을 추가로 포함한다.
항체 변이체
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체의 아미노산 서열 변형(들)이 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 적절한 뉴클레오티드 변화를 항체 핵산 내에 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조된다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 내 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구축물에 도달하기 위해 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있으며, 단 최종 구축물은 목적하는 특징을 보유해야 한다. 아미노산 변경은 서열이 제조되는 시점에 대상 항체 아미노산 서열에 도입될 수 있다.
돌연변이유발에 바람직한 위치인 항체의 특정 잔기 또는 영역을 확인하는데 유용한 방법은 문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이라 불린다. 여기서, 잔기 또는 표적 잔기의 군이 확인되고 (예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대 arg, asp, his, lys, 및 glu), 이는 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 대체되어 아미노산의 항원과의 상호작용에 영향을 미친다. 이어서, 치환에 대해 기능적 감수성을 나타내는 아미노산 위치가, 치환 부위에 또는 치환 부위에 대해 추가의 또는 다른 변이체를 도입하는 것에 의해 정밀화된다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위는 미리 결정되며, 돌연변이 그 자체의 성질을 미리 결정할 필요는 없다. 예를 들어, 주어진 부위에서의 돌연변이의 성능을 분석하기 위해, 표적 코돈 또는 영역에서 ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이유발을 수행하고, 발현된 이뮤노글로불린을 목적 활성에 대해 스크리닝한다.
아미노산 서열 삽입은 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드의 길이의 범위의 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 세포독성 폴리펩티드에 융합된 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 N- 또는 C-말단에 대한 효소 (예를 들어 ADEPT의 경우) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드의 융합을 포함한다.
또 다른 유형의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는 상이한 잔기에 의해 대체된 항체 분자 내의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 갖는다. 치환 돌연변이유발을 위한 가장 관심 부위는 초가변 영역을 포함하지만, 프레임워크 변경도 또한 고려된다.
항체의 생물학적 특성에 있어서의 실질적인 변형은 (a) 예를 들어 시트 또는 나선형 입체형태로서, 치환 영역 내의 폴리펩티드 백본의 구조, (b) 표적 부위에서의 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는 것에 대한 효과가 유의하게 상이한 치환을 선택함으로써 달성된다. 아미노산은 그의 측쇄 특성의 유사성에 따라 하기 군으로 나뉠 수 있다 (A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)):
(1) 비-극성: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(2) 비하전된 극성: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)
(3) 산성: Asp (D), Glu (E)
(4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His (H)
대안적으로, 자연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 특성에 기초하여 하기 군으로 나뉠 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다. 이러한 치환된 잔기는 또한 보존적 치환 부위 내로 또는 나머지 (비-보존된) 부위 내로 도입될 수 있다.
치환 변이체의 한 유형은 모 항체 (예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 1개 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 수반한다. 일반적으로, 추가 개발을 위해 선택된 생성 변이체(들)는 이들이 생성되는 모 항체에 비해 변형된 (예를 들어 개선된) 생물학적 특성을 가질 것이다. 이러한 치환 변이체를 생성하는 편리한 방법은 파지 디스플레이를 사용한 친화도 성숙을 수반한다. 간략하게, 여러 초가변 영역 부위 (예를 들어, 6-7개 부위)를 각 부위에서 모든 가능한 아미노산 치환이 생성되도록 돌연변이시킨다. 이로써 생성된 항체를, 각 입자 내에 패키지된 파지 코트 단백질 (예를 들어, M13의 유전자 III 생성물)의 적어도 일부에 대한 융합체로서 사상 파지 입자로부터 디스플레이한다. 이어서, 파지-디스플레이된 변이체는 본원에 개시된 바와 같이 그의 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다. 변형시킬 후보 초가변 영역 부위를 확인하기 위해서, 스캐닝 돌연변이유발 (예를 들어, 알라닌 스캐닝)을 수행하여 항원 결합에 유의하게 기여하는 초가변 영역 잔기를 확인할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위해서 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃 잔기가 관련 기술분야에 공지된 기술, 예를 들어 본원에서 상술된 기술에 따라 치환시킬 후보이다. 일단 이러한 변이체가 생성되면, 변이체의 패널을 본원에 기재된 기술을 포함한, 관련 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 스크리닝에 적용하고, 하나 이상의 관련 검정에서 우월한 특성을 지닌 항체를 추가 개발을 위해 선택할 수 있다.
항체의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 관련 기술분야에 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 이들 방법은 천연 공급원으로부터의 단리 (자연 발생 아미노산 서열 변이체의 경우), 또는 항체의 앞서 제조된 변이체 또는 비-변이체 버전의 올리고뉴클레오티드-매개 (또는 부위-지정) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발 및 카세트 돌연변이유발에 의한 제조를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 측면에서 핵산 분자는 자연 발생 서열을 제외할 것이다.
본 발명의 항체의 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 변형을 도입하여 Fc 영역 변이체를 생성시키는 것이 바람직할 수 있다. Fc 영역 변이체는 힌지 시스테인의 위치를 포함한 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
면역접합체
또 다른 측면에서, 본 발명은 세포독성제, 예컨대 화학요법제, 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 박테리아, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소, 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성접합체)에 접합된 항체를 포함하는 면역접합체 또는 항체-약물 접합체 (ADC)를 제공한다.
암의 치료에서 세포독성제 또는 세포증식억제제, 즉 종양 세포를 사멸시키거나 억제하는 약물의 국부 전달을 위해 항체-약물 접합체를 사용하는 것 (문헌 [Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172]; 미국 특허 번호 4,975,278)은 종양에 대한 약물 모이어티의 표적화 전달 및 그곳에서의 세포내 축적을 허용하고, 반면에 접합되지 않은 이러한 약물 작용제의 전신 투여는 제거하려고 하는 종양 세포뿐만 아니라 정상 세포에 허용할 수 없는 수준의 독성을 초래할 수 있다 (Baldwin et al., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), pp. 475-506). 따라서, 최소 독성을 갖는 최대 효능이 추구된다. 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체는 둘 다 이러한 전략에서 유용한 것으로 보고되었다 (Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87). 이들 방법에 사용되는 약물은 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 및 빈데신을 포함한다 (Rowland et al., (1986), 상기 문헌). 항체-독소 접합체에서 사용되는 독소는 박테리아 독소, 예컨대 디프테리아 독소, 식물 독소, 예컨대 리신, 소분자 독소, 예컨대 겔다나마이신 (Mandler et al (2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581; Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), 메이탄시노이드 (EP 1391213; 문헌 [Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623]), 및 칼리케아미신 (Lode et al (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al (1993) Cancer Res. 53:3336-3342)을 포함한다. 독소는 튜불린 결합, DNA 결합, 또는 토포이소머라제 억제를 비롯한 메카니즘에 의해 세포독성 및 세포증식억제성 효과에 영향을 미칠 수 있다. 일부 세포독성 약물은 큰 항체 또는 단백질 수용체 리간드에 접합될 때 불활성이거나 보다 적은 활성인 경향이 있다.
항체 유도체
본 발명의 항체는 관련 기술분야에 공지되고 용이하게 이용가능한 추가의 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 한 실시양태에서, 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체이다. 수용성 중합체의 비제한적 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 그의 혼합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에서의 안정성으로 인해 제조에 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량의 것일 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 변할 수 있고, 1개를 초과하는 중합체가 부착될 경우, 중합체들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선시킬 항체의 특정한 특성 또는 기능, 항체 유도체가 요법에서 규정된 조건 하에 사용될 것인지 여부 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 고려사항을 기초로 하여 결정될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체, 및 방사선 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질성 모이어티의 접합체가 제공된다. 한 실시양태에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 102: 11600-11605 (2005)). 방사선은 임의의 파장의 것일 수 있고, 통상적인 세포에는 해를 끼치지 않지만 항체-비단백질성 모이어티에 근접한 세포는 사멸시키는 온도로 비단백질성 모이어티를 가열하는 파장을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
제약 제제
한 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 부분 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 코딩하는 핵산 및 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 제약상 허용되는 담체는 생리학상 적합한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 대상체에서 암 세포를 억제하는데 효과적이다.
본 발명의 제약 조성물의 투여 경로는 정맥내, 근육내, 비강내, 피하, 경구, 국소, 피하, 피내, 경피, 피하(subdermal), 비경구, 직장, 척추 또는 표피 투여를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 제약 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서의 주사제로서, 또는 주사 전 액체 비히클 내의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태로서 제조될 수 있다. 제약 조성물은 또한 지속 전달에 사용되는 리포솜 비히클 또는 다른 미립자 담체 내에 캡슐화된, 유화되는 고체 형태 또는 활성 성분으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 제약 조성물은 제약 조성물의 지속 방출을 가능하게 하는, 오일 에멀젼, 유중수 에멀젼, 수중유중수 에멀젼, 부위-특이적 에멀젼, 긴-체류(long-residence) 에멀젼, 점성에멀젼, 마이크로에멀젼, 나노에멀젼, 리포좀, 마이크로입자, 마이크로구체, 나노구체, 나노입자 및 다양한 천연 또는 합성 중합체, 예컨대 비재흡수성 불투과성 중합체, 예컨대 에틸렌비닐 아세테이트 공중합체 및 하이트렐 (Hytrel)® 공중합체, 팽윤성 중합체, 예컨대 히드로겔, 또는 재흡수성 중합체, 예컨대 콜라겐 및 특정 폴리산 또는 폴리에스테르, 예컨대 재흡수성 봉합을 생성하는데 사용되는 것들의 형태일 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 포유동물 대상체에 전달하기 위한 제약 조성물 내로 제제화된다. 제약 조성물은 단독으로 및/또는 제약상 허용되는 비히클, 부형제 또는 담체와 혼합되어 투여된다. 적합한 비히클은, 예를 들어, 물, 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등, 및 이들의 조합물이다. 또한, 비히클은 미량의 보조 물질 예컨대 습윤제 또는 유화제, pH 완충제 또는 아주반트를 함유할 수 있다. 제약상 허용되는 담체는 예를 들어 본 발명의 제약 조성물의 흡수 또는 클리어런스율을 안정화시키거나 증가시키거나 감소시키기 위한, 생리학상 허용되는 화합물을 함유할 수 있다. 생리학상 허용되는 화합물은 예를 들어 탄수화물, 예컨대 글루코스, 수크로스, 또는 덱스트란, 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 글루타티온, 킬레이트화제, 저분자량 단백질, 세제, 리포솜 담체, 또는 부형제 또는 다른 안정화제 및/또는 완충제를 포함할 수 있다. 다른 생리학상 허용되는 화합물은 습윤제, 유화제, 분산제 또는 보존제를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [the 21st edition of Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton, Pa. ("Remington's")]을 참조한다. 본 발명의 제약 조성물은 또한 보조 물질, 예컨대 약리학적 작용제, 시토카인 또는 다른 생물학적 반응 조절제를 포함할 수 있다.
게다가, 제약 조성물은 중성 또는 염 형태로 제약 조성물 내로 제제화될 수 있다. 제약상 허용되는 염은 무기 산 예컨대 예를 들어, 염산 또는 인산, 또는 유기 산 예컨대 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등으로 형성되는 산 부가염 (활성 폴리펩티드의 유리 아미노 기로 형성됨)을 포함한다. 유리 카르복실 기로부터 형성된 염은 또한, 무기 염기 예컨대 예를 들어, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘, 또는 수산화제2철, 및 유기 염기 예컨대 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래될 수 있다.
이러한 투여 형태를 제조하는 실제 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있거나, 또는 명백할 것이다. 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 21st edition]을 참조한다.
제약 조성물이 예방적 또는 치유적 목적 등에 사용되든 아니든, 제약 조성물은 스케줄에 따라 및 대상체의 연령, 체중 및 상태, 사용되는 특정한 조성물 및 투여 경로에 적절한 시간 주기에 걸쳐, 단일 용량 치료 또는 다중 용량 치료로 투여될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 제약 조성물은 1개월에 1회, 1개월에 2회, 1개월에 3회, 격주로 (qow), 1주에 1회 (qw), 1주에 2회 (biw), 1주에 3회 (tiw), 1주에 4회, 1주에 5회, 1주에 6회, 격일로 (qod), 매일 (qd), 1일 2회 (qid), 또는 1일 3회 (tid) 투여된다.
본 발명에 따른 항체의 투여의 지속기간, 즉, 제약 조성물이 투여되는 기간은 임의의 다양한 인자, 예를 들어, 대상체 반응 등에 따라 다를 수 있다. 예를 들어, 제약 조성물은 약 1초 이상 내지 1시간 이상, 1일 내지 약 1주, 약 2주 내지 약 4주, 약 1개월 내지 약 2개월, 약 2개월 내지 약 4개월, 약 4개월 내지 약 6개월, 약 6개월 내지 약 8개월, 약 8개월 내지 약 1년, 약 1년 내지 약 2년, 또는 약 2년 내지 약 4년, 또는 그보다 많은 범위의 기간에 걸쳐 투여될 수 있다.
투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 경구 또는 비경구 제약 조성물을 사용할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 투여 단위 형태는 치료될 대상체에 대한 단위 투여량으로서 적합한 물리적 이산 단위를 지칭하며; 각각의 단위는 요구되는 제약 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 화합물을 함유한다.
세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 수득되는 데이터는 인간에 사용하기 위한 투여량 범위를 제제화하는데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 이러한 화합물의 투여량은 독성이 거의 없거나 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 투여량은 사용되는 투여 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 변화할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 치료 유효 용량은 세포 배양 검정으로부터 초기에 추정될 수 있다. 세포 배양물에서 결정된 IC50 (즉, 증상의 반수-최대 억제를 달성하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하는 용량이 동물 모델에서 설정될 수 있다. 문헌 [Sonderstrup, Springer, Sem. Immunopathol. 25: 35-45, 2003. Nikula et al., Inhal. Toxicol. 4(12): 123-53, 2000].
본 발명의 항체 또는 항원-결합 부분의 치료 또는 예방 유효량에 대한 예시적인, 비-제한적 범위는 약 0.001 내지 약 60 mg/kg 체중, 약 0.01 내지 약 30 mg/kg 체중, 약 0.01 내지 약 25 mg/kg 체중, 약 0.5 내지 약 25 mg/kg 체중, 약 0.1 내지 약 20 mg/kg 체중, 약 10 내지 약 20 mg/kg 체중, 약 0.75 내지 약 10 mg/kg 체중, 약 1 내지 약 10 mg/kg 체중, 약 2 내지 약 9 mg/kg 체중, 약 1 내지 약 2 mg/kg 체중, 약 3 내지 약 8 mg/kg 체중, 약 4 내지 약 7 mg/kg 체중, 약 5 내지 약 6 mg/kg 체중, 약 8 내지 약 13 mg/kg 체중, 약 8.3 내지 약 12.5 mg/kg 체중, 약 4 내지 약 6 mg/kg 체중, 약 4.2 내지 약 6.3 mg/kg 체중, 약 1.6 내지 약 2.5 mg/kg 체중, 약 2 내지 약 3 mg/kg 체중, 또는 약 10 mg/kg 체중이다.
제약 조성물은 유효량의 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 함유하도록 제제화되며, 여기서 양은 치료되는 동물 및 치료될 상태에 의존한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 약 0.01 mg 내지 약 10 g, 약 0.1 mg 내지 약 9 g, 약 1 mg 내지 약 8 g, 약 2 mg 내지 약 7 g, 약 3 mg 내지 약 6 g, 약 10 mg 내지 약 5 g, 약 20 mg 내지 약 1 g, 약 50 mg 내지 약 800 mg, 약 100 mg 내지 약 500 mg, 약 0.01 μg 내지 약 10g, 약 0.05 μg 내지 약 1.5 mg, 약 10 μg 내지 약 1 mg 단백질, 약 30 μg 내지 약 500 μg, 약 40 μg 내지 약 300 μg, 약 0.1 μg 내지 약 200 μg, 약 0.1 μg 내지 약 5 μg, 약 5 μg 내지 약 10 μg, 약 10 μg 내지 약 25 μg, 약 25 μg 내지 약 50 μg, 약 50 μg 내지 약 100 μg, 약 100 μg 내지 약 500 μg, 약 500 μg 내지 약 1 mg, 약 1 mg 내지 약 2 mg의 범위의 용량으로 투여된다. 임의의 특정 대상체에 대한 구체적 용량 수준은 특정 펩티드의 활성, 연령, 체중, 전반적 건강, 성별, 식이, 투여 시간, 투여 경로, 및 배출 속도, 약물 조합 및 요법을 받는 특정 질환의 중증도를 포함한 다양한 인자에 의존하며, 이는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 과도한 실험없이 결정될 수 있다.
본 발명의 항체를 포함하는 치료 제제는 목적하는 정도의 순도를 갖는 항체를 임의의 생리학상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 혼합함으로써 보관을 위해 수용액, 동결건조 또는 다른 건조 제제의 형태로 제조된다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 히스티딘 및 기타 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 기타 탄수화물 (글루코스, 만노스 또는 덱스트린 포함); 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.
본원의 제제는 또한 치료되는 특정한 적응증에 필요하지만, 서로 유해한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 포함하는 (그러나 이에 제한되지는 않음) 1종 초과의 활성 화합물을 함유할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합물에 적합하게 존재한다.
활성 성분은 또한, 예를 들어 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 내에, 또는 마크로에멀젼 내에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
생체내 투여에 사용될 제제는 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
지속-방출 제제가 제조될 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 본 발명의 이뮤노글로불린을 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이러한 매트릭스는 성형 물품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속-방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산 및 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 마이크로구체), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 중합체 예컨대 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산은 100일을 초과하여 분자를 방출할 수 있는 반면에, 특정 히드로겔은 단백질을 보다 짧은 기간 동안 방출한다. 캡슐화된 이뮤노글로불린이 오랜 시간 동안 신체 내에 유지되는 경우, 이들은 37℃에서 습기에 노출될 때 변성 또는 응집되어 생물학적 활성의 손실 및 면역원성의 가능한 변화가 야기될 수 있다. 수반되는 메카니즘에 따라 안정화를 위한 합리적인 전략이 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀지면, 안정화는 술프히드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 수분 함량의 제어, 적절한 첨가제의 사용, 및 특정 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 달성될 수 있다.
용도
본 발명의 항체는, 예를 들어 시험관내, 생체외 및 생체내 치료 방법에서 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는 시험관내, 생체외 및/또는 생체내에서 특정 항원 활성을 부분적으로 또는 완전하게 차단하는 길항제로서 사용될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 항체의 적어도 일부는 다른 종으로부터의 항원 활성을 중화할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는, 예를 들어, 항원을 함유하는 세포 배양물에서, 인간 대상체에서, 또는 본 발명의 항체가 교차-반응하는 항원을 갖는 기타 포유동물 대상체 (예를 들어 침팬지, 개코원숭이, 마모셋, 시노몰구스 및 레서스, 돼지 또는 마우스)에서, 특정 항원 활성을 억제하는데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 항원 활성이 억제되도록 항체를 항원과 접촉시킴으로써 항원 활성을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 항원은 인간 단백질 분자이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 대상체에서의 항원 활성이 억제되도록 본 발명의 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 항원 활성이 해로운 장애를 앓고 있는 대상체에서 항원을 억제하는 방법에 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 항원은 인간 단백질 분자이고 대상체는 인간 대상체이다. 대안적으로, 대상체는 본 발명의 항체가 결합하는 항원을 발현하는 포유동물일 수 있다. 또한 추가적으로, 대상체는 (예를 들어 항원의 투여에 의해 또는 항원 트랜스진(transgene)의 발현에 의해) 항원이 도입된 포유동물일 수 있다. 본 발명의 항체는 치료 목적을 위해 인간 대상체에게 투여될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 항체는 수의학 목적을 위해 또는 인간 질환의 동물 모델로서, 항체가 교차-반응하는 항원을 발현하는 비-인간 포유동물 (예를 들어 영장류, 돼지 또는 마우스)에 투여될 수 있다. 동물 모델과 관련하여, 이러한 동물 모델은 본 발명의 항체의 치료 효능을 평가하는데 (예를 들어 투여량 및 투여의 시간 경과를 시험하는데) 유용할 수 있다. 본 발명의 항체는 또는 암, 근육 장애, 유비퀴틴-경로-관련 유전 장애, 면역/염증 장애, 신경계 장애 및 기타 유비퀴틴 경로-관련 장애를 포함하나 이에 제한되지는 않는, SSEA-4 및 SSEA-4 관련 단백질의 비정상적 발현 및/또는 활성과 연관된 질환, 장애 또는 상태를 치료, 억제, 진행 지연, 재발 방지/지연, 호전, 또는 예방하는데 사용될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명의 차단 항체는 SSEA-4에 특이적이다.
특정 실시양태에서, 세포독성제와 접합된 본 발명의 항체를 포함하는 면역접합체가 환자에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 그것이 결합된 면역접합체 및/또는 항원은 SSEA-4와 연관된 그의 세포 표면 상의 하나 이상의 단백질을 발현하는 세포에 의해 내재화되고, 결과적으로 그것이 연관된 표적 세포를 사멸시키는 것에 있어서 면역접합체의 치료 효능을 상승시킨다. 한 실시양태에서, 세포독성제는 표적 세포 내의 핵산을 표적으로 하거나 방해한다. 이러한 세포독성제의 예는 본원에서 언급된 임의의 화학요법제 (예컨대, 메이탄시노이드 또는 칼리케아미신), 방사성 동위원소, 또는 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제를 포함한다.
본 발명의 항체는 요법에서 단독으로 또는 다른 조성물과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 또 다른 항체, 및/또는 아주반트/치료제 (예를 들어, 스테로이드)와 함께 공-투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 치료 계획에서, 예를 들어 암, 근육 장애, 유비퀴틴-경로-관련 유전 장애, 면역/염증 장애, 신경계 장애, 및 기타 유비퀴틴 경로-관련 장애를 포함하는, 본원에 기재된 임의의 질환을 치료함에 있어서 항-염증제 및/또는 방부제와 조합될 수 있다. 상기 언급된 이러한 조합 요법은 조합 투여 (여기서 2종 이상의 작용제가 동일 또는 개별 제제에 포함됨) 및 개별 투여를 포함하고, 이 경우에 본 발명 항체는 보조 요법 또는 요법들의 투여 전 및/또는 후에 투여될 수 있다.
본 발명의 항체 (및 보조 치료제)는 비경구, 피하, 복강내, 폐내 및 비강내, 및 원한다면 국부 치료용의 병변내 투여를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 또한, 항체는 특히 항체의 용량을 감소시킨 펄스 주입에 의해 적합하게 투여된다. 투여는 부분적으로 투여가 단기적인지 아니면 만성적인지에 따라 임의의 적합한 경로, 예를 들어 주사 (예를 들어, 정맥내 또는 피하 주사)에 의해 이루어질 수 있다.
본 발명의 항체의 결합 표적의 위치는 항체의 제조 및 투여에 있어서 고려될 수 있다. 결합 표적이 세포내 분자일 경우, 본 발명의 특정 실시양태는 결합 표적이 위치하는 세포 내에 도입되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인트라바디로서 세포내에서 발현될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "인트라바디"는, 문헌 [Marasco, Gene Therapy 4: 11-15 (1997); Kontermann, Methods 34: 163-170 (2004)]; 미국 특허 번호 6,004,940 및 6,329,173; 미국 특허 출원 공보 번호 2003/0104402, 및 PCT 공개 번호 WO2003/077945에 기재된 바와 같이, 세포내에서 발현되고 표적 분자에 선택적으로 결합할 수 있는 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 지칭한다. 인트라바디의 세포내 발현은 목적하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 코딩하는 핵산 (이러한 항체 또는 항원-결합 단편을 코딩하는 유전자와 일반적으로 회합되는 야생형 리더 서열 및 분비 신호가 결여됨)을 표적 세포 내로 도입함으로써 실행된다. 핵산을 세포 내에 도입하는 임의의 표준 방법을 사용할 수 있고, 예를 들어 미세주사, 탄도 주사, 전기천공, 인산칼슘 침전, 리포솜, 및 관심 핵산을 운반하는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 및 백시니아 벡터에 의한 형질감염이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 항-SSEA-4 항체의 전부 또는 일부를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 표적 세포에 전달하여 하나 이상의 인트라바디를 발현시킬 수 있고, 이는 SSEA-4에 대한 세포내 결합 및 하나 이상의 SSEA-4-매개 세포 경로의 조정을 가능하게 한다.
또 다른 실시양태에서, 항체를 내재화하는 방법이 제공된다. 항체는 세포 내로의 항체의 전달을 강화하는 특정 특성을 지닐 수 있거나, 또는 이같은 특성을 지니도록 변형될 수 있다. 이를 달성하기 위한 기술이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 항체의 양이온화는 세포 내로의 그의 흡수를 용이하게 하는 것으로 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,703,019 참조). 리포펙션 또는 리포솜을 또한 사용하여 항체를 세포 내로 전달할 수 있다. 항체 단편이 사용되는 경우에는, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 최소 억제 단편이 일반적으로 유리하다. 예를 들어, 항체의 가변-영역 서열에 기초하여, 표적 단백질 서열에 결합하는 능력을 보유하는 펩티드 분자가 설계될 수 있다. 이러한 펩티드는 화학적으로 합성되고/거나 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)]을 참조한다.
표적 세포 내로의 조정제 폴리펩티드의 진입이 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 증진될 수 있다. 예를 들어, 특정 서열, 예컨대 HIV Tat 또는 안테나페디아(Antennapedia) 호메오도메인 단백질로부터 유래된 것이 세포막을 가로지르는 이종 단백질의 효율적인 흡수를 지시할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), 96:4325-4329]을 참조한다.
결합 표적이 뇌 내에 존재하는 경우, 본 발명의 특정 실시양태는 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 특정 신경변성 질환은 혈액-뇌 장벽의 투과성 증가와 연관되어, 항체 또는 항원-결합 단편이 뇌에 용이하게 도입될 수 있다. 혈액-뇌 장벽이 무손상으로 유지되는 경우, 물리적 방법, 지질-기반 방법, 및 수용체 및 채널-기반 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 혈액-뇌 장벽을 가로질러 분자를 수송하기 위한 여러 관련 기술분야-공지 접근법이 존재한다.
혈액-뇌 장벽을 가로질러 항체 또는 항원-결합 단편을 수송하는 물리적 방법에는 완전히 혈액-뇌 장벽을 우회하는 것, 또는 혈액-뇌 장벽에 구멍을 생성시키는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 우회 방법은 뇌로의 직접 주사 (예를 들어, 문헌 [Papanastassiou et al., Gene Therapy 9: 398-406 (2002)] 참조), 간질 주입/대류-증진 전달 (예를 들어, 문헌 [Bobo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2076-2080 (1994)] 참조), 및 뇌 내 전달 장치의 이식 (예를 들어, 문헌 [Gill et al., Nature Med. 9: 589-595 (2003)]; 및 길포드 파마슈티칼(Guildford Pharmaceutical)의 글리아델 웨이퍼즈(Gliadel Wafers)™ 참조)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 장벽에 구멍을 생성시키는 방법에는 초음파 (예를 들어 U.S. 특허 공개 번호 2002/0038086 참조), 삼투압 (예를 들어 고장성 만니톨 (Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 & 2, Plenum Press, N.Y. (1989))의 투여에 의한 것), 예를 들어 브래디키닌 또는 투과제 A-7에 의한 투과화 (예를 들어 미국 특허 번호 5,112,596, 5,268,164, 5,506,206, 및 5,686,416 참조), 및 항체 또는 항원-결합 단편을 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터를 사용한 혈액-뇌 장벽을 걸치는 뉴런의 형질감염 (예를 들어 미국 특허 공개 번호 2003/0083299 참조)이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
혈액-뇌 장벽을 가로질러 항체 또는 항원-결합 단편을 수송하는 지질-기반 방법은 항체 또는 항원-결합 단편을 혈액-뇌 장벽의 혈관 내피 상의 수용체에 결합하는 항체 결합 단편에 커플링된 리포솜에 캡슐화하는 것 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 20020025313 참조), 및 항체 또는 항원-결합 단편을 저밀도 지단백질 입자 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 20040204354 참조) 또는 아포지단백질 E (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 20040131692 참조)에 코팅하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
혈액-뇌 장벽을 가로질러 항체 또는 항원-결합 단편을 수송하는 수용체 및 채널-기반 방법은 글루코코르티코이드 차단제를 사용하여 혈액-뇌 장벽의 투과성을 증가시키는 것 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2002/0065259, 2003/0162695 및 2005/0124533 참조); 칼륨 채널을 활성화하는 것 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2005/0089473 참조), ABC 약물 수송체를 억제하는 것 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2003/0073713 참조); 항체를 트랜스페린으로 코팅하고 하나 이상의 트랜스페린 수용체의 활성을 조정하는 것 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2003/0129186 참조), 및 항체를 양이온화하는 것 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,004,697 참조)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 항체 조성물은 우수한 의료 행위에 부합되는 방식으로 제제화되고, 조제되고, 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려할 인자는 치료될 특정한 장애, 치료될 특정한 포유동물, 개별 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄링, 및 의료 진료의에게 공지된 다른 인자를 포함한다. 항체는, 그럴 필요는 없지만, 임의로 해당 장애를 예방 또는 치료하는데 현재 사용되는 1종 이상의 작용제와 함께 제제화된다. 이러한 다른 작용제의 유효량은 제제 내에 존재하는 본 발명의 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 다른 상기 논의된 요인에 좌우된다. 이들은 일반적으로 상기에 기재된 것과 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 본원에 기재된 투여량의 약 1 내지 99%로, 또는 실험적으로/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 투여량으로 임의의 경로에 의해 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체의 적절한 투여량 (단독으로, 또는 화학요법제와 같은 다른 추가의 치료제와 조합되어 사용되는 경우)은 치료될 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 담당 의사의 판단에 따라 달라질 것이다. 항체는 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 예를 들어 1회 이상의 개별 투여에 의한 것이든 또는 연속 주입에 의한 것이든, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.1 mg/kg-10 mg/kg)의 항체가 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 하나의 전형적 1일 투여량은 질환의 예방 또는 치료를 위해 약 1 μg으로부터의 범위일 수 있고, 상태에 따라 수일 또는 그 이상 동안 본 발명의 항체가 적절하게 투여되고, 치료는 질환 증상의 목적하는 억제가 발생할 때까지 일반적으로 지속될 것이다. 하나의 예시적인 항체 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 범위 내일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 그의 임의의 조합) 중 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3주마다 투여될 수 있다 (예를 들어, 환자가 약 2회 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회 용량의 항체를 제공받도록). 초기의 보다 높은 부하 용량에 이어서, 1회 이상의 보다 낮은 용량이 투여될 수 있다. 예시적인 투여 요법은 항체를 약 4 mg/kg의 초기 부하 용량에 이어서 매주 약 2 mg/kg의 유지 용량으로 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 통상적인 기술 및 검정에 의해 이러한 요법의 진행이 용이하게 모니터링된다.
제조 물품
본 발명의 또 다른 측면에서, 상기에 기재된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기 및 용기 상의 또는 용기와 회합된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어, 병, 바이알, 시린지 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 조성물 그 자체 또는 상태를 치료, 예방 및/또는 진단하는데 효과적인 또 다른 조성물과 조합된 조성물을 보유하고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫릴 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물 내 적어도 1종의 활성제는 본 발명의 항체이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 선택 상태를 치료하기 위해 사용된다는 것을 나타낸다. 더욱이, 제조 물품은 (a) 내부에 본 발명의 항체를 포함하는 조성물이 수용된 제1 용기; 및 (b) 내부에 추가의 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함하는 조성물이 수용된 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 이러한 실시양태에서 제조 물품은, 조성물이 특정한 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있다는 것을 나타내는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 제조 물품은 제약상 허용되는 완충제, 예컨대 정박테리아 주사용수 (BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 그것은 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 포함한, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 치료되는 대상체는 포유동물이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 집동물, 예컨대 개, 고양이, 소, 돼지, 말, 양, 또는 염소이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 반려 동물, 예컨대 개 또는 고양이이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 가축 동물, 예컨대 소, 돼지, 말, 양 또는 염소이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 동물원 동물이다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 연구 동물, 예컨대 설치류, 개, 또는 비-인간 영장류이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 비-인간 트랜스제닉 동물, 예컨대 트랜스제닉 마우스 또는 트랜스제닉 돼지이다.
제약 조성물 및 제제
본원에 기재된 바와 같은 항체의 제조 후에, "미리-동결건조된 제제"가 생산될 수 있다. 제제를 제조하기 위한 항체는 바람직하게는 본질적으로 순수하고, 바람직하게는 본질적으로 동질이다 (즉, 오염 단백질 등이 없다). "본질적으로 순수한" 단백질은 조성물의 총 중량에 기초하여 적어도 약 90 중량％의 단백질, 바람직하게는 적어도 약 95 중량％를 포함하는 조성물을 의미한다. "본질적으로 동질적" 단백질은 조성물의 총 중량에 기초하여 적어도 약 99 중량％의 단백질을 포함하는 조성물을 의미한다. 특정 실시양태에서, 단백질은 항체이다.
미리-동결건조된 제제 내에 존재하는 항체의 양은 목적하는 용량 부피, 투여 방식(들) 등을 고려하여 결정한다. 선택 단백질이 무손상 항체 (전장 항체)인 경우, 약 2 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 바람직하게는 약 5 mg/mL 내지 약 40 mg/mL, 가장 바람직하게는 약 20-30 mg/mL가 예시적인 출발 단백질 농도이다. 단백질은 일반적으로, 용액 중에 존재한다. 예를 들어, 단백질은 약 4-8, 바람직하게는 약 5-7의 pH에서 pH-완충 용액 중에 존재할 수 있다. 예시적인 완충제는 히스티딘, 포스페이트, 트리스, 시트레이트, 숙시네이트 및 기타 유기 산을 포함한다. 완충제 농도는, 예를 들어 완충제, 및 제제 (예를 들어, 재구성된 제제)의 목적하는 등장도에 따라 약 1 mM 내지 약 20 mM, 또는 약 3 mM 내지 약 15 mM일 수 있다. 바람직한 완충제는, 하기 입증된 바와 같이, 이것이 동결건조보호 특성을 가질 수 있다는 점에서 히스티딘이다. 숙시네이트는 또 다른 유용한 완충제인 것으로 밝혀졌다.
동결건조보호제는 미리-동결건조된 제제에 첨가된다. 바람직한 실시양태에서, 동결건조보호제는 수크로스 또는 트레할로스와 같은 비-환원당이다. 미리-동결건조된 제제에서 동결건조보호제의 양은 일반적으로 재구성시에 생성된 제제가 등장성일 것인 양이다. 그러나, 고장성 재구성된 제제가 또한 적합할 수 있다. 또한, 동결건조보호제의 양은 동결건조시에 단백질의 허용되지 않는 양의 분해/응집이 일어날만큼 너무 낮지 않아야 한다. 동결건조보호제가 당 (예컨대 수크로스 또는 트레할로스)이고 단백질이 항체인 경우, 미리-동결건조된 제제 내의 예시적인 동결건조보호제 농도는 약 10 mM 내지 약 400 mM, 바람직하게는 약 30 mM 내지 약 300 mM, 가장 바람직하게는 약 50 mM 내지 약 100 mM이다.
동결건조보호제에 대한 단백질의 비는 각각의 단백질 및 동결건조보호제 조합에 대해 선택된다. 높은 단백질 농도를 갖는 등장성 재구성된 제제를 생성하기 위한 선택 단백질로서의 항체 및 동결건조보호제로서의 당 (예를 들어, 수크로스 또는 트레할로스)의 경우에, 항체에 대한 동결건조보호제의 몰비는 1 몰 항체에 대해 약 100 내지 약 1500 몰의 동결건조보호제, 바람직하게는 1 몰 항체에 대해 약 200 내지 약 1000 몰의 동결건조보호제, 예를 들어 1 몰 항체에 대해 약 200 내지 약 600 몰의 동결건조보호제일 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 미리-동결건조된 제제에 계면활성제를 첨가하는 것이 바람직한 것으로 밝혀졌다. 대안적으로 또는 추가로, 계면활성제는 동결건조 제제 및/또는 재구성된 제제에 첨가할 수 있다. 예시적인 계면활성제는 비이온성 계면활성제 예컨대 폴리소르베이트 (예를 들어, 폴리소르베이트 20 또는 80); 폴록사머 (예를 들어, 폴록사머 188); 트리톤 (Triton); 소듐 도데실 술페이트 (SDS); 소듐 라우렐 술페이트; 소듐 옥틸 글리코시드; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일-, 또는 스테아릴-술포베타인; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-사르코신; 리놀레일-, 미리스틸-, 또는 세틸-베타인; 라우로아미도프로필-, 코카미도프로필-, 리놀레아미도프로필-, 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 이소스테아르아미도프로필-베타인 (예를 들어, 라우로아미도프로필); 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 이소스테아르아미도프로필-디메틸아민; 소듐 메틸 코코일- 또는 디소듐 메틸 올레일-타우레이트; 및 모나쿼트(MONAQUAT)™ 시리즈 (모나 인더스트리즈, 인크.(Mona Industries, Inc.), 미국 뉴저지주 패터슨), 폴리에틸 글리콜, 폴리프로필 글리콜, 및 에틸렌 및 프로필렌 글리콜의 공중합체 (에를 들어, 플루로닉스(Pluronics), PF68 등)를 포함한다. 첨가되는 계면활성제의 양은 이것이 재구성된 단백질의 응집을 감소시켜 재구성 후 미립자의 형성을 최소화하도록 하는 것이다. 예를 들어, 계면활성제는 약 0.001-0.5%, 및 바람직하게는 약 0.005-0.05%의 양으로 미리-동결건조된 제제 중에 존재할 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 동결건조보호제 (예컨대 수크로스 또는 트레할로스)와 벌킹제 (예를 들어 만니톨 또는 글리신)의 혼합물을 미리-동결건조된 제제의 제조에 사용한다. 벌킹제는 내부에 과도한 포켓 등이 없는 균일한 동결건조된 케이크의 생산을 가능하게 할 수 있다.
다른 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제, 예컨대 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기재된 것은 미리-동결건조된 제제 (및/또는 동결건조된 제제 및/또는 재구성된 제제)에 포함될 수 있고, 단 이들은 제제의 목적하는 특성에 유해한 영향을 미치지 않는다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 추가의 완충제; 보존제; 공-용매; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 생분해성 중합체, 예컨대 폴리에스테르; 및/또는 염-형성 반대이온, 예컨대 나트륨을 포함한다.
본원에 기재된 제약 조성물 및 제제는 바람직하게는 안정적이다. "안정한" 제제/조성물은 보관시 그 안의 항체가 그의 물리적 및 화학적 안정성, 및 완전성을 본질적으로 유지하는 것이다. 단백질 안정성을 측정하기 위한 다양한 분석 기술이 관련 분야에서 이용 가능하고, 문헌 ([Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) 및 Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)]참조)에 고찰되었다. 안정성은 선택된 온도에서 선택된 기간 동안 측정될 수 있다.
생체내 투여에 사용될 제제는 멸균되어야 한다. 이는 동결건조 및 재구성 전 또는 후에 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다. 대안적으로, 전체 혼합물의 멸균은 예를 들어 약 120℃에서 약 30분 동안 단백질을 제외한 성분을 오토클레이빙시켜 달성될 수 있다.
단백질, 동결건조보호제 및 다른 임의적인 성분을 함께 혼합한 후, 제제를 동결건조시킨다. 다수의 상이한 동결-건조기, 예컨대 Hull50® (휼(Hull), 미국) 또는 GT20® (레이볼드-헤라우스(Leybold-Heraeus), 독일) 동결-건조기가 이 목적을 위해 이용가능하다. 동결-건조는 제제를 동결시킨 후에 1차 건조에 적합한 온도에서 동결된 내용물로부터 얼음을 승화시켜 달성된다. 이러한 조건 하에, 생성물 온도는 제제의 공융점 또는 붕괴 온도 아래이다. 전형적으로, 1차 건조를 위한 저장 온도는 적합한 압력 (전형적으로 약 50 내지 250 mTorr 범위)에서 약 -30 내지 25℃ 범위일 것이다 (단, 생성물은 1차 건조 동안 동결상태를 유지함). 제제, 샘플을 보유하는 용기 (예를 들어, 유리 바이알)의 크기 및 유형, 및 액체의 부피가 건조에 필요한 시간을 좌우할 것이고, 이는 수시간 내지 수일 (예를 들어, 40-60시간) 범위일 수 있다. 2차 건조 단계는, 주로 사용된 단백질의 유형 및 용기의 유형 및 크기에 따라, 약 0-40℃에서 수행될 수 있다. 그러나, 2차 건조 단계가 필요하지 않을 수 있다는 것이 본원에서 발견되었다. 예를 들어, 동결건조의 전체 물 제거 단계 전반에 걸친 저장 온도는 약 15-30℃ (예를 들어, 약 20℃)일 수 있다. 2차 건조에 요구되는 시간 및 압력은 예를 들어 온도 및 다른 파라미터에 따라 적합한 동결건조된 케이크를 생산하는 것일 것이다. 2차 건조 시간은 생성물 내의 목적하는 잔류 수분 수준에 의해 좌우되고, 전형적으로는 적어도 약 5시간 (예를 들어 10-15시간)이 걸린다. 압력은 1차 건조 단계 동안 사용되는 것과 동일할 수 있다. 동결-건조 조건은 제제 및 바이알 크기에 따라 달라질 수 있다.
일부 경우에, 옮기는 단계를 피하기 위해 단백질의 재구성이 수행될 용기 내에서 단백질 제제를 동결건조하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 경우의 용기는, 예를 들어, 3, 5, 10, 20, 50 또는 100 cc 바이알일 수 있다. 일반적인 제안으로서, 동결건조는 그의 수분 함량이 약 5% 미만, 바람직하게는 약 3% 미만인 동결건조 제제를 생성할 것이다.
목적하는 단계에, 전형적으로 단백질을 환자에게 투여할 시간인 때, 재구성된 제제에서의 단백질 농도가 적어도 50 mg/mL, 예를 들어 약 50 mg/mL 내지 약 400 mg/mL, 보다 바람직하게는 약 80 mg/mL 내지 약 300 mg/mL, 가장 바람직하게는 약 90 mg/mL 내지 약 150 mg/mL이도록 동결건조 제제를 희석제로 재구성할 수 있다. 재구성된 제제에서의 이러한 높은 단백질 농도는 재구성된 제제의 피하 전달을 의도한 경우에 특히 유용할 것으로 여겨진다. 그러나, 다른 투여 경로, 예컨대 정맥내 투여의 경우에, 재구성된 제제에서의 보다 낮은 농도의 단백질이 바람직할 수 있다 (예를 들어, 재구성된 제제에서 약 5-50 mg/mL, 또는 약 10-40 mg/mL 단백질). 특정 실시양태에서, 재구성된 제제에서의 단백질 농도는 미리-동결건조된 제제에서보다 유의하게 더 높다. 예를 들어, 재구성된 제제에서의 단백질 농도는 미리-동결건조된 제제의 것의 약 2-40배, 바람직하게는 3-10배, 가장 바람직하게는 3-6배 (예를 들어 적어도 3배 또는 적어도 4배)일 수 있다.
재구성은 일반적으로 완전한 수화를 보장하기 위해 약 25℃의 온도에서 일어나지만, 원하는 경우 다른 온도를 사용할 수도 있다. 재구성에 요구되는 시간은, 예를 들어 희석제의 유형, 부형제(들) 및 단백질의 양에 따라 달라질 것이다. 예시적인 희석제는 멸균수, 정박테리아 주사용수 (BWFI), pH 완충 용액 (예를 들어, 포스페이트 완충 염수), 멸균 염수 용액, 링거액 또는 덱스트로스 용액을 포함한다. 희석제는 임의로 보존제를 함유할 수 있다. 예시적인 보존제는 상기 기재되어 있으며, 바람직한 보존제는 방향족 알콜 예컨대 벤질 또는 페놀 알콜이다. 사용되는 보존제의 양은 단백질과의 호환성에 대한 상이한 보존제 농도의 평가 및 보존제 효능 시험에 의해 결정된다. 예를 들어, 보존제가 방향족 알콜 (예컨대, 벤질 알콜)인 경우에, 이는 약 0.1-2.0%, 바람직하게는 약 0.5-1.5%, 가장 바람직하게는 약 1.0-1.2%의 양으로 존재할 수 있다. 바람직하게는, 재구성된 제제는 바이알당 >10 μm 크기인 6000개 미만의 입자를 갖는다.
치료 용도
치료 유효량의 본원에 기재된 하나 이상의 항체를 포함하는 조성물을 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법이 본원에 기재된다.
특정 실시양태에서, 치료를 필요로 하는 대상체 (예를 들어, 인간 환자)는 암으로 진단되거나, 암을 갖는 것으로 의심되거나, 또는 암에 대한 위험이 있다. 암의 예는 육종, 피부암, 백혈병, 림프종, 뇌암, 폐암, 유방암, 구강암, 식도암, 위암, 간암, 담관암, 췌장암, 결장암, 신장암, 자궁경부암, 난소암 및 전립선암을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 암은 육종, 피부암, 백혈병, 림프종, 뇌암, 폐암, 유방암, 난소암, 전립선암, 결장암 또는 췌장암이다. 일부 바람직한 실시양태에서, 암은 뇌암 또는 다형성 교모세포종 (GBM) 암이다.
바람직한 실시양태에서, 항체는 SSEA-4-발현 암 세포를 표적화할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 암 세포 상의 SSEA-4를 표적화할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 암에서 SSEA-4를 표적화할 수 있다.
치료는 종양 크기의 감소, 악성 세포의 제거, 전이의 방지, 재발의 방지, 파종성 암의 감소 또는 사멸, 생존의 연장 및/또는 종양 암 진행 시간의 연장을 생성한다.
특정 실시양태에서, 치료는 상기 항체 투여 전에, 그 동안에, 또는 그 후에 상기 대상체에게 추가의 요법을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 추가의 요법은 화학요법제에 의한 치료다. 특정 실시양태에서, 추가의 요법은 방사선 요법이다.
본 발명의 방법은 조기 종양을 치료 및 예방하는 데에 특히 유리하므로, 보다 진행된 병기로의 진행을 방지하여 진행성 암과 연관된 이환율 및 사망률을 감소시킨다. 본 발명의 방법은 또한 예를 들어 원발성 종양의 제거 후에 지속되는 휴면 종양과 같은 종양의 재발 또는 종양의 재성장을 방지하거나, 또는 종양의 발생을 감소시키거나 방지하는데 유리하다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 예를 들어 증가된 글로보 H, SSEA-3 및/또는 SSEA-4 발현을 특징으로 하는 암의 치료 또는 예방에 유용하다. 특정 실시양태에서 암은 암 줄기 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 암은 전-암 및/또는 악성 암 및/또는 요법 저항성 암이다. 특정 실시양태에서, 암은 뇌암이다.
본 발명의 방법의 경우, 암은 액상 종양, 예를 들어, 예컨대 백혈병 및 림프종, 고형 종양, 예를 들어, 유방암, 결장직장암, 직장암, 폐암, 신세포암, 신경교종 (예를 들어, 역형성 성상세포종, 역형성 핍지교성상세포종, 역형성 핍지교종, 다형성 교모세포종 (GBM)), 신장암, 전립선암, 간암, 췌장암, 연조직 육종, 카르시노이드 암종, 두경부암, 흑색종, 및 난소암일 수 있다. 한 실시양태에서, 암은 뇌암 또는 GBM이다. 본원에 개시된 방법을 실시하기 위해, 본원에 기재된 적어도 하나의 항체를 함유하는 상기 기재된 제약 조성물/제제의 유효량을 치료를 필요로 하는 대상체 (예를 들어, 인간)에게 적합한 경로, 예컨대 정맥내 투여를 통해, 예를 들어, 볼루스로서 또는 일정 기간에 걸친 연속 주입에 의해, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활막내, 척수강내, 경구, 흡입 또는 국소 경로에 의해 투여할 수 있다. 제트 네뷸라이저 및 초음파 네뷸라이저를 포함하는 상업적으로 입수가능한 액체 제제를 위한 네뷸라이저가 투여에 유용하다. 액체 제제는 직접적으로 연무될 수 있고, 동결건조 분말은 재구성 후에 연무될 수 있다. 대안적으로, 항체를 플루오로카본 제제 및 계량 용량 흡입기를 사용하여 에어로졸화할 수 있거나, 또는 동결건조 및 분쇄된 분말로서 흡입할 수 있다.
본원에 기재된 방법에 의해 치료될 대상체는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간일 수 있다. 포유동물은 농장 동물, 스포츠 동물, 애완동물, 영장류, 말, 개, 고양이, 마우스 및 래트를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 치료를 필요로 하는 인간 대상체는 유방암, 폐암, 식도암, 직장암, 담도암, 간암, 협부암, 위암, 결장암, 비인두암, 신장암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 췌장암, 고환암, 방광암, 두경부암, 구강암, 신경내분비암, 부신암, 갑상선암, 골암, 피부암, 기저 세포 암종, 편평 세포 암종, 흑색종 또는 뇌 종양을 포함하나 이에 제한되지는 않는 암을 갖거나, 암에 대한 위험이 있거나, 암을 갖는 것으로 의심되는 환자일 수 있다. 암을 갖는 대상체는 일상적 의료 검진에 의해 확인할 수 있다.
본원에 사용된 "유효량"은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 활성 작용제와 조합되어 대상체에 대한 치료 효과를 부여하는데 요구되는 각각의 활성제의 양을 지칭한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자가 인식할 바와 같이, 유효량은 치료될 특정 상태, 상태의 중증도, 연령, 신체 상태, 체격, 성별 및 체중을 포함하는 개별적인 환자 파라미터, 치료 지속기간, 공동 요법 (존재하는 경우)의 성질, 특정 투여 경로, 및 건강 진료의의 지식 및 전문기술 내에 속하는 기타 인자에 따라 바뀐다. 이들 인자는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 불과 상용 실험으로 다루어질 수 있다. 개별 성분 또는 그의 조합의 최대 용량, 즉 타당한 의학적 판단에 따른 가장 높은 안전한 용량이 사용되는 것이 일반적으로 바람직하다. 그러나, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 환자가 의학적 이유, 심리적 이유 또는 실질적으로 임의의 다른 이유로 보다 낮은 용량 또는 허용가능한 용량을 요구할 수 있음을 이해할 것이다.
경험적 고려사항, 예컨대 반감기가 일반적으로 투여량의 결정에 기여할 것이다. 예를 들어, 인간 면역계와 상용성인 항체, 예컨대 인간화 항체 또는 완전 인간 항체가 사용되어 항체의 반감기를 연장시키고 항체가 숙주의 면역계에 의해 공격받는 것을 방지할 수 있다. 투여 빈도는 요법 과정에 따라 결정 및 조정할 수 있으며, 반드시는 아니지만 일반적으로, 암의 치료 및/또는 억제 및/또는 호전 및/또는 지연에 근거한다. 대안적으로, 본원에 기재된 항체의 지속적인 연속 방출 제제가 적절할 수 있다. 지속 방출을 달성하기 위한 다양한 제제 및 장치는 관련 기술분야에 공지되어 있다.
한 예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체에 대한 투여량은 1회 이상의 항체 투여가 제공된 개체에서 실험적으로 결정될 수 있다. 개체는 증분 투여량의 항체를 제공받는다. 항체의 효능을 평가하기 위해, 일상적 실시에 따라 질환 (예를 들어, 암)의 지표를 추적할 수 있다.
일반적으로, 임의의 본원에 기재된 항체의 투여를 위해, 초기 후보 투여량은 약 2 mg/kg일 수 있다. 본 개시내용의 목적을 위해, 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라, 약 0.1 μg/kg 내지 3 μg/kg 내지 30 μg/kg 내지 300 μg/kg 내지 3 mg/kg, 내지 30 mg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 초과 중 임의의 범위일 것이다. 수일 또는 그 초과에 걸친 반복 투여의 경우, 상태에 따라, 치료는 목적하는 증상 억제가 발생할 때까지 또는 충분한 치료 수준이 달성되어 암 또는 그의 증상이 완화될 때까지 지속된다. 예시적인 투여 요법은 항체를 초기 용량 약 2 mg/kg으로 투여한 후에 매주 유지 용량 약 1 mg/kg으로 투여하거나 격주로 유지 용량 약 1 mg/kg으로 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 진료의가 달성하고자 하는 약동학적 붕괴 패턴에 따라 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 예를 들어, 1주 1-4회 투여가 고려된다. 특정 실시양태에서, 약 3 μg/mg 내지 약 2 mg/kg (예컨대 약 3 μg/mg, 약 10 μg/mg, 약 30 μg/mg, 약 100 μg/mg, 약 300 μg/mg, 약 1 mg/kg, 및 약 2 mg/kg) 범위의 투여가 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 투여 빈도는 1주마다, 2주마다, 4주마다, 5주마다, 6주마다, 7주마다, 8주마다, 9주마다, 또는 10주마다 1회; 또는 1개월마다, 2개월마다, 또는 3개월마다, 또는 그 초과마다 1회이다. 통상적인 기술 및 검정에 의해 이러한 요법의 진행이 용이하게 모니터링된다. 시간에 따라 투여 요법 (사용된 항체 포함)은 변할 수 있다.
본 개시내용의 목적을 위해, 본원에 기재된 항체의 적절한 투여량은 사용된 특정 항체 (또는 그의 조성물), 암의 유형 및 중증도, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 담당 의사의 판단에 좌우될 것이다. 본원에 기재된 항체의 투여는 미리 선택된 기간에 걸쳐 본질적으로 연속적일 수 있거나 또는 일련의 이격된 투여, 예를 들어 암의 발병 전, 그 동안 또는 그 후의 투여일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료하는"은 하나 이상의 활성제를 포함하는 조성물을 암, 암의 증상, 또는 암에 대한 소인이 있는 대상체에게 이러한 암, 암의 증상, 또는 암에 대한 소인을 치유하거나, 고치거나, 완화시키거나, 경감시키거나, 변경시키거나, 구제하거나, 호전시키거나, 개선하거나, 이에 영향을 미칠 목적으로 적용 또는 투여하는 것을 지칭한다.
암을 완화시키는 것은 암의 발병 또는 진행을 지연시키거나, 암 중증도을 감소시키는 것을 포함한다. 암을 완화시키는 것은 치유적인 결과를 반드시 요구하지 않는다. 본원에 사용된 암의 발병을 "지연시키는 것"은 암의 진행을 연기, 방해, 둔화, 지체, 안정화, 및/또는 연장시키는 것을 의미한다. 이러한 지연은 암의 병력 및/또는 치료되는 개체에 따라 시간 길이가 다양할 수 있다. 암의 발병을 "지연" 또는 완화시키거나, 또는 암의 개시를 지연시키는 방법은 이러한 방법을 사용하지 않는 것과 비교하여 소정의 시간 프레임에서 하나 이상의 암의 증상이 발병할 가능성 (위험)을 감소시키고/거나 소정의 시간 프레임에서 증상의 정도를 감소시키는 방법이다. 이러한 비교는, 통계적으로 유의한 결과를 제공하는데 충분한 다수의 대상체를 사용하여, 전형적으로 임상 연구에 기초한다.
암의 "발병" 또는 "진행"은 암의 초기 징후 및/또는 그 후의 진행을 의미한다. 암의 발병은 관련 기술분야에 널리 공지된 표준 임상 기술을 사용하여 검출되고 평가될 수 있다. 그러나, 발병은 또한 검출불가능할 수 있는 진행을 지칭한다. 본 개시내용의 목적을 위해, 발병 또는 진행은 증상의 생물학적 과정을 지칭한다. "발병"은 발생, 재발, 및 개시를 포함한다. 본원에 사용된 암의 "개시" 또는 "발생"은 초기 개시 및/또는 재발을 포함한다.
치료될 질환의 유형 또는 질환 부위에 따라, 의학 분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 방법을 사용하여 제약 조성물을 대상체에게 투여할 수 있다. 이러한 조성물은 다른 통상적인 경로를 통해 또한 투여될 수 있고, 예를 들어, 경구로, 비경구로, 흡입 스프레이에 의해, 국소적으로, 직장으로, 비강으로, 협측으로, 질로, 또는 이식 저장소를 통해 투여될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 동맥내, 활막내, 흉골내, 척수강내, 병변내, 및 두개내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 추가적으로, 주사가능한 데포 투여 경로를 통해, 예컨대 1-, 3-, 또는 6-개월 데포 주사가능한 또는 생분해성 물질 및 방법을 사용하여 이를 대상체에게 투여할 수 있다.
주사가능한 조성물은 다양한 담체 예컨대 식물성 오일, 디메틸아세트아미드, 디메틸포름아미드, 에틸 락테이트, 에틸 카르보네이트, 이소프로필 미리스테이트, 에탄올 및 폴리올 (글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등)을 함유할 수 있다. 정맥내 주사의 경우, 수용성 항체가 점적 방법에 의해 투여될 수 있고, 이에 의해 항체 및 생리학상 허용되는 부형제를 함유하는 제약 제제가 주입된다. 생리학상 허용되는 부형제는, 예를 들어, 5% 덱스트로스, 0.9% 염수, 링거액 또는 다른 적합한 부형제를 포함할 수 있다. 근육내 제제, 예를 들어, 적합한 가용성 염 형태의 항체의 멸균 제제가 제약 부형제 예컨대 주사용수, 0.9% 염수, 또는 5% 글루코스 용액에 용해되어 투여될 수 있다.
진단 용도
(a) 대상체로부터 수득된 세포 또는 조직 샘플에, SSEA-4의 발현을 검출하는 하나 이상의 모노클로날 항체를 포함하는 조성물을 적용하는 단계; (b) 세포 또는 조직 샘플에 대한 모노클로날 항체의 결합을 검정하는 단계; 및 (c) 결합을 정상 대조군과 비교하여 대상체에서 암의 존재를 결정하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 진단하기 위한 방법이 본원에 기재된다.
검출 및 진단을 위한 암의 예는 육종, 피부암, 백혈병, 림프종, 뇌암, 폐암, 유방암, 구강암, 식도암, 위암, 간암, 담관암, 췌장암, 결장암, 신장암, 자궁경부암, 난소암 및 전립선암을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 암은 육종, 피부암, 백혈병, 림프종, 뇌암, 폐암, 유방암, 난소암, 전립선암, 결장암 또는 췌장암이다.
특정 실시양태에서, 항체는 글로보 H, SSEA-3 및 SSEA-4-발현 암 세포를 검출할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 암 세포 상의 글로보 H 및 SSEA를 검출할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 암에서 SSEA를 검출할 수 있다. 특정 실시양태에서, 암은 뇌암 또는 다형성 교모세포종 (GBM) 암이고, 항체는 항-SSEA-4 모노클로날 항체이다.
SSEA-4-특이적 모노클로날 항체는 SSEA-4-발현 암 세포를 검출하기 위한 시험관내 및 생체내 진단 검정을 위해 단독으로 또는 조합되어 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, SSEA-4 특이적 모노클로날 항체는 암을 갖거나 암을 갖는 것으로 의심되는 개체로부터의 생물학적 샘플과 접촉되고, 정상보다 더 높거나 낮은 항체 결합이 개체가 암을 갖는 것을 나타내는 경우에 샘플에서의 세포에 대한 항체 결합을 결정한다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈액 샘플 또는 혈액 분획 (예를 들어, 혈청, 혈장, 혈소판, 적혈구, 백혈구)이다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플은 예를 들어, 공지된 종양의 경계를 결정하기 위한, 예를 들어, 의심되는 종양 부위, 또는 이환된 것으로 알려진 조직으로부터의 조직 샘플 (생검)이다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플은 염증 부위로부터 수득된다.
생검은 전형적으로 조직으로부터 샘플, 즉, 비-유체 세포 유형을 수득하기 위해 수행된다. 적용되는 생검 기술은 평가할 조직 유형에 의존할 것이다 (예를 들어, 유방, 피부, 결장, 전립선, 신장, 폐, 방광, 림프절, 간, 골수, 기도 또는 폐). 암의 경우에 기술은 또한 다른 인자 중에, 종양의 크기와 유형에 의존할 것이다 (예를 들어, 고체, 현탁 또는 혈액). 생검 기술은 예를 들어, 문헌 [Harrison's Principles of Internal Medicine, Kasper, et al., eds., 16th ed., 2005, Chapter 70, and throughout Part V]에 논의되어 있다.
샘플에서 세포에 대한 항체 결합을 검출하는 임의의 방법이 본 발명의 진단 검정에 사용될 수 있다. 항체 결합을 검출하는 방법, 예를 들어, 유동 세포측정법, 형광 현미경검사, ELISA 등이 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 특정 실시양태에서, 방법은 결정 단계 전의 검출을 위해 생물학적 샘플을 제조하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 세포의 하위집단 (예를 들어, 백혈구)을 개체로부터의 샘플의 나머지 (예를 들어, 다른 혈액 성분)로부터 분리할 수 있거나, 조직 내 세포를 보다 용이한 검출을 위해 현탁시킬 수 있다.
특정 실시양태에서, 샘플에서의 SSEA-4 발현 세포의 백분율을 결정하고, 대조군, 예를 들어, 암을 갖는 것으로 알려진 개체 또는 개체 군 (양성 대조군) 또는 암을 갖지 않는 것으로 알려진 개체 또는 개체 군 (정상, 비-질환 또는 음성 대조군)으로부터의 샘플과 비교한다. 특정 실시양태에서, 대조군은 주어진 조직에 대해 확립된 SSEA-4 발현의 표준 범위이다. 정상보다 더 높거나 더 낮은 /SSEA-4 발현 세포의 백분율 또는 더 높거나 더 낮은 발현 수준은 개체가 암을 갖는 것을 나타낸다.
한 실시양태에서, 키트는 생물학적 샘플, 예컨대 혈액 샘플 또는 조직 샘플에서 SSEA-4를 검출하기 위해 제공된다. 예를 들어, 대상체에서 암 진단을 확인하기 위해, 생검은 조직학적 검사를 위한 조직 샘플을 수득하기 위해 수행할 수 있다. 대안적으로, 혈액 샘플은 SSEA-4의 존재를 검출하기 위해 수득할 수 있다. 폴리펩티드를 검출하기 위한 키트는 전형적으로 SSEA-4에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체, 예컨대 본원에 개시된 임의의 항체를 포함할 것이다. 추가 실시양태에서, 항체는 (예를 들어, 형광, 방사성 또는 효소적 표지로) 표지된다.
한 실시양태에서, 키트는 SSEA-4에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체의 사용 수단을 개시하는 지침서를 포함한다. 지침서는 전자적 형태 (예컨대 컴퓨터 디스켓 또는 콤팩트 디스크)로 쓰여질 수 있거나, 시각적일 수 있다 (예컨대 영상 파일). 키트는 또한 키트가 설계된 특정 적용을 용이하게 하기 위한 추가의 구성요소를 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 키트는 표지를 검출하는 수단 (예컨대 효소적 표지를 위한 효소 기질, 형광 표지를 검출하기 위한 필터 세트, 적절한 2차 표지, 예컨대 2차 항체 등)을 추가적으로 함유할 수 있다. 키트는 특정한 방법의 실시에 상용적으로 사용되는 완충제 및 다른 시약을 추가적으로 포함할 수 있다. 이러한 키트와 적절한 내용물은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
세포 표면 마커의 존재 또는 부재를 결정하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 항체는 효소, 자기 비드, 콜로이드성 자기 비드, 합텐, 형광색소, 금속 화합물, 방사성 화합물 또는 약물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 다른 화합물에 접합될 수 있다. 항체는 또한 면역검정 예컨대 방사선면역검정 (RIA), 효소 연결 면역흡착 검정 (ELISA) 또는 면역조직화학 검정 (이에 제한되지는 않음)에서 이용될 수 있다. 항체는 또한 형광 활성화 세포 분류 (FACS)에 사용될 수 있다. FACS는 세포를 분리하거나 분류하기 위해, 다른 보다 정교한 수준의 검출 중에, 복수의 색상 채널, 저각 및 둔각 광-산란 검출 채널 및 임피던스(impedance) 채널을 사용한다 (미국 특허 번호 5,061,620 참조). 본원에 기재된 바와 같이, SSEA-4에 결합하는 임의의 모노클로날 항체가 이들 검정에 사용될 수 있다. 따라서, 항체는 ELISA, RIA, FACS, 조직 면역조직화학, 웨스턴 블롯 또는 면역침전을 비제한적으로 포함하는 통상적인 면역검정에 사용될 수 있다.
종양의 병기결정 및/또는 예후 결정을 위한 방법
본 개시내용의 또 다른 측면은 (a) SSEA-4로 이루어지는 마커의 발현을 검출하는 하나 이상의 항체를 포함하는 조성물을 인간 환자로부터 수득된 세포 또는 조직 샘플에 적용하는 단계; (b) 세포 또는 조직 샘플에 대한 모노클로날 항체의 결합을 검정하는 단계; (c) 시험 샘플에서의 마커의 발현 수준을 참조 샘플의 수준과 비교하는 단계; 및 (d) 단계 (c)에서 확인된 결과에 기초하여 환자에서 종양의 병기 및/또는 예후를 결정하는 단계를 포함하는, 인간 환자에서 종양의 병기결정 및/또는 예후 결정을 위한 방법을 특색으로 한다.
추가의 상술 없이도, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상기 설명에 기초하여 본 발명을 그의 최대 범위까지 이용할 수 있을 것으로 여겨진다. 따라서, 하기 구체적 실시양태는 단지 예시적이며 어떠한 방식으로도 나머지의 본 개시내용을 제한하지 않는 것으로 해석되어야 한다. 본원에 인용된 모든 간행물은 본원에 언급된 목적 또는 대상을 위하여 참조로 포함된다.
실시예
실시예 1: 하이브리도마 융합 및 스크리닝
전형적인 하이브리도마 융합을 수행하였다. 마우스에게 OBI-821 사포닌 아주반트와 접합된 SSEA-4-DT-CRM197 (디프테리아 독소 교차 반응 물질 197)에 의한 그의 제1 면역화를 제공하였다. 각각의 마우스에게 좌우 양쪽 복부 부위에 피하 (s.c.) 주사 (100 μL/부위)를 통한 지정된 치료를 투여하였다. 마우스에게 4회 투여하였다 (제0일, 제7일, 제14일, 및 제23일). 혈액 샘플 (대략 0.1 mL 전혈/시점/동물)을 항응고제 없이 안면 정맥을 통해 제0일 전 (투여전), 제10일, 제17일, 제26일 및 희생일 (제35일, 소정 부피의 전혈을 안면 정맥 및 심장 천자를 통해 수집하였음)에 수득하였다. 응고된 혈액 샘플을 원심분리하고 (1500xg, 15분, 4℃), 혈청을 분리하고, 에펜도르프 튜브로 옮겼다. 모든 혈청 샘플을 항-SSEA-4 항체의 적정에 대하여 시험하였다. 5마리 마우스가 높은 수준의 항-SSEA-4 IgG 및 IgM을 생산하는 것을 발견했고, 이를 하이브리도마 제조에 사용하였다. 쾰러(Koehler) 및 밀스타인(Milstein)의 절차에 따라 마우스 골수종 세포를 마우스 비장세포와의 융합에 사용하였다 (Koehler G. and Milstein C, 1975). 하이브리도마 상청액을 웰당 0.2 μg SSEA-4-지질 1을 사용한 친화도 ELISA에 의해 스크리닝하였다. 상업용 SSEA-4 항체 (MC-813-70) (바이오레전드(Biolegend); Cat#330402)는 양성 대조군으로서 작용하였다. 상청액을 희석하지 않은 하이브리도마 클론의 OD. 배경 x 2를 선택하였다. 상위 3개의 하이브리도마 클론은 1G1s, 1J1s 및 2F20s였다.
실시예 2: 누드 마우스에서의 예시적인 항체의 항-종양 활성의 측정
인간 췌장 선암종의 이종이식 종양 모델에서, HPAC 세포를 BALB/c 수컷 누드 마우스 내로 피하로 (s.c.) 이식하였고, 평균 종양 크기가 50-120 mm3에 도달하였을 때 시작하여 시험 물품을 5주 동안 매주 2회 복강내 (i.p.) 주사에 의해 0.4 mg/kg으로 투여하였다. 종양 크기를 36일 동안 매주 2회 모니터링하고 기록하였다. 또한 사망률, 체중, 및 명백한 동물 독성의 징후를 36일 동안 매주 2회 기록하였다. 종양 성장은 T/C (치료군/대조군) x 100%로 계산하였다.
시험 물질 및 투여 패턴
시험 물질을 액체 형태로 1.45, 1 또는 0.5 mg/mL로 제조하였다. 시험 물질을 지정된 투여 농도 (0.04 mg/mL)를 수득하도록 포스페이트 완충제 염수 (PBS, pH7.4)로 스톡 용액을 희석함으로써 투여 전에 매일 새롭게 제조하였다. 시험 물질을 5주 동안 매주 2회 10 mL/kg 투여 부피로 복강내로 (i.p.) 투여하였다.
표 4. 제제의 예시적인 유형.
Figure pct00004
세포주
HPAC 종양 세포주 (ATCC CRL-2119, 인간 췌장 선암종)를 제조하고, 유로핀스 판랩스 타이완 리미티드(Eurofins Panlabs Taiwan Ltd.)에서 배양한 후, BALB/c 수컷 누드 마우스의 우측 측복부 내로 0.1 mL의 1 x 106 세포/마우스로 피하 이식하였다.
동물
18-22g 무게의 6-7주령 BALB/c 수컷 누드 마우스를 (찰스 리버 래보러토리즈 라이센시(Charles River Laboratories Licensee) 하의) 바이오라스코 타이완(BioLasco Taiwan)으로부터 수득하였다. 모든 동물을 12시간 명/암 사이클을 갖는 잘 제어된 온도 (20-24℃) 및 습도 (30-70%) 환경에서 유지하였다. 표준 실험 식이 [MFG (오리엔탈 이스트 캄파니 리미티드(Oriental Yeast Co., Ltd.), 일본)] 및 오토클레이빙된 수돗물에 자유롭게 접근하도록 하였다. 하우징, 실험, 및 동물 폐기를 포함한 본 연구의 모든 측면은 본 발명자들의 AAALAC-공인 실험 동물 설비에서 일반적으로 "실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침: 제8판(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: Eighth Edition)" (National Academies Press, Washington, D.C., 2011)에 따라 수행하였다. 게다가 동물 관리 및 사용 프로토콜을 유로핀스 판랩스 타이완 리미티드에서 IACUC에 의해 검토 및 승인받았다.
화학물질
DMEM/F12 배지 (인비트로젠(Invitrogen), 미국), 표피 성장 인자 (알앤디 시스템즈(R&D Systems), 미국), 소 태아 혈청 (인비트로젠, 미국), 인슐린 (시그마(Sigma), 미국), 히드로코르티손 (시그마, 미국) 및 페니실린/스트렙토마이신 용액 (인비트로젠, 미국).
장비
동물 케이지 (테크니플라스트(Tecniplast), 이탈리아), 비커 1000 mL (키맥스(Kimax), 미국), 캘리퍼 (미투토요(Mitutoyo), 일본), 부류 II 생물학적 안전 케비넷 (뉴에어(NuAire), 미국), 원심분리 5810 R (에펜도르프(Eppendorf), 독일), μ 인큐베이터 (포르마 사이언티픽 인크.(Forma Scientific Inc.), 미국), 개별 환기 케이지 (IVC, 36 소형 격리 시스템) (테크니플라스트, 이탈리아), 마우스 저울 # Z-40 (타코닉(Taconic), 미국), 스테인레스 겸자 (클라펜네커(Klappenecker), 독일) 및 수직 층류 (챠오-흐신(Tsao-Hsin), 대만).
방법
6-7주령의 18-22g 무게의 BALB/c 누드 수컷 마우스를 사용하였다. 인간 췌장 선암종 종양 세포 HPAC (ATCC CRL-2119, 0.1 mL 중의 1.0 x 106개)를 동물의 우측 측복부로 피하로 주사하였다. 후속적으로 동물을 각 군이 5마리의 동물로 이루어지는 6개의 군으로 나누었다. 평균 종양 크기가 50-120 mm3에 도달했을 때 시험 물질 및 비히클의 투여를 개시하였다 (제1일로 설정함). 시험 물질 (0.4 mg/kg)은 각각의 투여 전에 새롭게 제조하였다. 시험 물질 및 비히클을 5주 동안 복강내 주사 (i.p.)에 의해 매주 2회 투여하였다. 종양 크기, 체중, 및 사망률을 시험 물질 또는 비히클의 투여 전 36일 동안 매주 2회 기록하였다. 성장한 종양을 보유하는 동물의 사진을 연구의 종료 시에 찍었다 (도 1-6).
종양 부피 (mm3)를 타원체 식: 길이 x (폭)2 x 0.5에 따라 결정하였다. 종양 성장 (T/C)은 하기 식: T/C = (Tn)/(Cn) x 100% (여기서 C1 (Cn)은 대조군에서의 제n일의 종양 부피이고, T1 (Tn)은 치료군에서의 제n일의 종양 부피임)을 사용하여 계산하였다. T/C 값 ≤ 42%를 유의한 항종양 활성으로 간주하였다.
결과
표 5-1. 누드 마우스에서의 종양, 이종이식편, 췌장, HPAC
Figure pct00005
표 5-2. 누드 마우스에서의 종양, 이종이식편, 췌장, HPAC (이어짐)
Figure pct00006
시험 물질을 5주 동안 매주 2회 복강내로 투여하였다. 종양 크기를 36일 동안 매주 2회 측정하고 기록하였다. 종양 성장은 T/C (치료군/대조군) x 100%로 계산하였다.
T/C 값 ≤ 42%를 유의한 항종양 활성으로 간주하였다. 또한, 이원 ANOVA에 이어서 본페로니(Bonferroni) 시험을 적용하여 * P< 0.05에서 제1군 (비히클, PBS)과 비교하여 통계적으로 유의한 차이를 확인하였다.
도 1-6은 36일 동안 상이한 시험 화합물을 투여한 누드 마우스의 사진을 보여준다. 종양 억제 능력은 1G1s는 19.6%, 1J1s는 33.8%, 2F20s는 32.5%로 계산되었다. 이는 1J1s 및 2F20s 둘 다가 더 우수한 종양 억제 능력을 갖는다는 것을 나타냈다 (도 7).
실시예 3: MCF7에 의한 예시적인 항체의 세포 결합 능력의 FACS에 의한 결정
세포 배양
MCF-7 세포를 2 mM L-글루타민 (인비트로젠, Cat #25030081) 및 1 mM 피루브산나트륨 (인비트로젠, Cat #11360070)을 갖고, 0.01 mg/mL 인슐린 (시그마, Cat #SI-I9278-5mL), 10% 소 태아 혈청 (인비트로젠, Cat #16000044)이 보충된 최소 필수 배지 (인비트로젠, Cat #10370021) 내에서 배양하였다.
세포 염색
시험 세포를 단층 세포를 함유하는 시험 샘플 플라스크로부터 배지를 폐기함으로써 남겼다. 세포를 5 mL PBS로 2회 헹궜다. 0.05% 트립신 1 mL를 플라스크에 첨가하고, 모든 표면적을 덮도록 와류시키고, 5-10분 동안 37℃ CO2 인큐베이터에 넣었다. 완전한 성장 배지 5 mL를 첨가하였다. 세포를 온화하게 피펫팅함으로써 흡인하였다. 세포 현탁액을 15 mL 원추형 튜브로 옮겼다. 튜브를 200 g에서 5분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, 상청액을 제거하고, 세포 펠릿을 교반하였다.
세포 카운팅
1-2 mL FACS 완충제를 세포 펠릿에 첨가하고, 피펫팅함으로써 잘 혼합하였다. 세포를 세포-스트레이너 캡 (팔콘(Falcon), Cat #352235)이 장착된 5 mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브 상으로 첨가하여 무손상 생존 단일 세포를 수득하였다. 10 μL 세포 현탁액을 마이크로원심분리 튜브로 옮겼다. 트리판 블루 용액 (0.4 % 트리판 블루) 10 μL를 첨가하고, 피펫팅함으로써 잘 혼합한 다음, 생존 세포를 혈구계수기(hematocytometer) 상에서 카운팅하였다. 세포 농도를 4x106 세포/mL로 조정하고, 이어서 50 μL 세포 현탁액을 폴리스티렌 둥근 튜브 내로 피펫팅하여 튜브당 2x105 세포로 만들었다.
1차 항체
표 6. 예시적인 1차 항체
Figure pct00007
1차 항체를 10 μg/mL의 최종 항체 농도로 FACS 완충제 중에 희석하였다. 50 μL 항체 희석제를 50 μL 세포 현탁액에 첨가하여 튜브당 0.5 μg 항체에 도달시켰다. 각각의 튜브를 온화하게 볼텍싱하여 세포 현탁액과 1차 항체를 잘 혼합하고, 이어서 튜브를 얼음 상에서 대략 30분 인큐베이션하도록 두었다. 모든 튜브에 1 mL FACS 완충제를 채우고, 각각 5분 동안 400 g로 원심분리함으로써 1회 세척하였다. 세포 손실의 원인이 될 수 있는 흡인 작용에 주의하고 튜브의 하부를 접촉하는 것을 피하면서, 상청액을 진공 흡인에 의해 폐기하였다.
2차 항체
검정 셋업에 사용된 2차 항체: 1G1s, 1J1s 및 2F20s 검정을 위해 1 mg의 염소 항-마우스 IgG, 인간 ads-FITC (서던 바이오테크(Southern Biotech), Cat #1030-02). 2차 항체를 4 μg/mL의 최종 항체 농도로 FACS 완충제 중에 희석하였다. 100 μL 희석된 2차 항체를 모든 튜브에 첨가한 다음, 각각의 튜브를 온화하게 볼텍싱하여 세포 현탁액과 2차 항체를 잘 혼합하였다. 튜브를 얼음 상에서 광을 피해 대략 30분의 인큐베이션 시간 동안 두었다. 이어서, 모든 튜브에 1 mL FACS 완충제를 채우고, 각각 5분 동안 400 g로 원심분리함으로써 1회 세척하였다. 세포 손실의 원인이 될 수 있는 흡인 작용에 주의하고 튜브의 하부를 접촉하는 것을 피하면서, 상청액을 진공 흡인에 의해 폐기하였다. 4% 파라포름알데히드 고정 용액 300 μL를 모든 튜브에 첨가하였고, 튜브를 얼음 상에서 광을 피해 대략 30분 인큐베이션하도록 두었다. 모든 튜브에 1 mL FACS 완충제를 채우고, 각각 5분 동안 400 g로 원심분리함으로써 1회 세척하였다. 이어서, 세포 손실의 원인이 될 수 있는 흡인 작용에 주의하고 튜브의 하부를 접촉하는 것을 피하면서, 상청액을 진공 흡인에 의해 폐기하였다. 시험 세포 튜브를 400 μL의 FACS 완충제로 재현탁시킨 다음, 4 ± 2℃ 냉장고에 광을 피해 저장하였다.
유동 세포측정법 분석
유동 세포측정법을 염색 직후에 수행하였다. 데이터 분석을 수행하기 위해, MCF7 세포 결합의 백분율을 FCS 익스프레스 4 플로우 리서치(FCS Express 4 Flow Research) 소프트웨어에 의해 분석하였다. 히스토그램 플롯에서, 이소형 대조군을 게이팅하고, 5%의 게이팅 세포를 배경인 것으로 규정하였다. 배경의 셋팅에 기초하여, 시험 세포 튜브의 결합 영역 (M1)의 백분율을 결정하였다. 이 셋팅에서, 이소형 대조군보다 5% 또는 그 초과의 시험 세포를 MCF7 세포의 양성 결합으로 간주하였다. 도 8A는 HPAC 세포 상에서, 상업용 SSEA-4 항체 (MC-813-70)가 100%인 것을 보여준다. 도 8B는 HPAC 세포 상에서 1J1s가 99.59%인 것을 보여준다. 도 8C는 HPAC 세포 상에서 2F20s가 55.56%인 것을 보여준다. 도 8D는 HPAC 세포 상에서 1G1s가 95.76%인 것을 보여준다. 이는 1J1s가 HPAC 세포 (췌장 세포주) 상에서 최고 세포 결합 친화도를 갖는다는 것을 나타낸다. 또한, 도 9는 예시적인 SSEA-4 항체의 다양한 암 및 비-암 세포주에 대한 FACS 결합 검정 결과를 보여준다. 이는 또한 1J1s가 MCF-7 (유방암), MDA-MB231 (유방암) 및 HK2 (신장, 피질/근위 세관) 상에서 최고 세포 결합 친화도를 갖는다는 것을 나타낸다.
실시예 4: SSEA-4, SS 연속 및 Gb 연속 당을 사용한 ELISA 분석에 의한 예시적인 항-SSEA4 IgG 항체의 에피토프 맵핑
시약/완충제 제조
코팅 항원
SSEA4-지질1, SSEA4-세라미드, SS 연속 당-지질 1, 및 Gb 연속 당-지질 1 분말을 유리 병에서 100% 에탄올 중에 용해시키고, 사용 시까지 4℃에서 저장하였다. 10x 차단 완충제 (시그마, Cat #B6429)를 사용을 위해 이중-증류수 (d.d. H2O) 중에 1x로 희석하였다. 세척 완충제: 트윈 20 0.5 mL를 PBS 1L에 첨가하여 PBS 중 0.05% 트윈 20을 제조하였다.
1차 항체
상업용 MC-813-70 SSEA4 항체 (바이오레전드, Cat#330402), 1G1s, 1J1s 및 2F20s SSEA4 항체를 에펜도르프 튜브에서 차단 완충제 중에 10 μg/mL로 희석하였다.
2차 항체
염소 항-마우스 IgG-AP (서던 바이오테크, Cat #1030-04)를 재수화시켜 d.d. H2O 중 0.3 mg/mL 용액 2.0 mL를 제조하였다. 글리세롤 (ACS 또는 더 좋은 등급) 1.0 mL를 에펜도르프의 1 mL 눈금 표시에 도달하도록 2 mL 에펜도르프에 첨가하였다. 재수화된 항체 0.5 mL를 글리세롤 내로 옮기고, 잘 혼합하고, -20± 2℃ 냉장고에서 저장하였다.
기질 용액
4℃에서 원래 저장된 기질 용액 (ELISA를 위한 알칼리성 포스파타제 황색 (pNPP) 액체 기질 시스템, 시그마, Cat #P7998)을 사용 전에 37℃ 수조 내에서 가온시켰다.
플레이트 코팅
개별 SSEA4-지질1, SSEA4-세라미드, 지질1 접합된 SS/Gb 연속 당 (코팅 항원) 20 μg을 5 mL 에탄올에 첨가하고, 온화하게 혼합하였다 (0.2 μg의 당/웰 x 100-웰 플레이트 = 20 μg; 50 μL/웰 x 100 웰 = 5 mL). 코팅된 항원 50 μL를 얼음 상에서 개별 플레이트의 각 웰 내로 피펫팅하였다. 플레이트를 라벨링하고, 뚜껑으로 덮고, 밤새 실온에서 인큐베이션하였다. 차단 완충제 100 μL를 각 웰에 첨가하고, 대략 30분 동안 실온 (22-26℃)에서 인큐베이션하였다.
120 μL 1:50 희석된 1차 항체 (10 μg/mL)를 칼럼 2의 상단 웰로 피펫팅하였다. 이어서, 180 μL를 칼럼 2 웰의 나머지에 첨가하였으며, 블랭크를 위해 제1 칼럼 (칼럼 1)은 비어있는 채로 남겼다. 10 μg/mL 1차 항체 60 μL를 제1 웰에서 제2 웰로 옮겼다 (2.5 μg/mL 항-SSEA-4 항체). 웰을 반복해서 피펫팅함으로써 혼합하였다. 과정을 반복하고, 하기 웰의 1차 항체 희석물 (4배 희석)을 제조하였다: 제1 웰 = 10 μg/mL (1:50 희석물), 제2 웰 = 2.5 μg/mL (1:200 희석물), 제3 웰 = 0.625 μg/mL (1:800 희석물), 제4 웰 = 0.156 μg/mL (1:3200 희석물), 제5 웰 = 0.039 μg/mL (1:12800 희석물), 제6 웰 = 0.01 μg/mL (1:51200 희석물), 제7 웰 = 0.025 μg/mL (1:204800 희석물), 제8 웰 = 0.0006 μg/mL (1:819200 희석물).
항원-코팅된 플레이트를 차단 완충제와 30분 인큐베이션한 후, 차단 완충제를 흡인에 의해 제거하고, 각 웰을 200 μL 세척 완충제로 3회 세척하였다. 50 μL 희석된 양성 대조군 (상업용 SSEA-4 항체 MC-813-70) 및 예시적인 1차 항체를 희석 플레이트에서 개별 SSEA4 코팅 항원에 대한 시험 플레이트 내 웰로 첨가하였다. 시험 플레이트를 덮고, 라벨링하고, 대략 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 웰을 흡인하고, 200 μL 세척 완충제로 3회 세척하였다.
2차 항체 25 μL를 차단 완충제 4975 μL에 첨가하고 (1:200 희석물), 온화하게 혼합하였다 (50 μL/웰 x 100-웰 플레이트　= 5 mL). 2차 항체 용액 50 μL를 각 웰 내로 피펫팅하였다. 플레이트를 덮고, 라벨링하고, 대략 45분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 2차 항체 용액을 모든 웰로부터 흡인하였고, 모든 웰을 200 μL 세척 완충제로 4회 세척하였다.
100 μL 기질 용액을 각 웰 내로 피펫팅하고, 37 ± 2℃에서 20분 동안 인큐베이션하고, 정지 용액 (알칼리성 포스파타제 정지 용액, 시그마, Cat #A5852) 50 μL를 첨가함으로써 정지시키고, 잘 혼합한 다음, 플레이트를 ELISA 플레이트 판독기 상에서 405 nm로 판독하였다.
데이터 분석
데이터를 통계적으로 분석하였고, 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 6 소프트웨어를 사용하여 S자형 용량-반응 (가변 기울기) 방법에 의해 곡선을 그리고, 평균 및 SD는 이중 결과로부터 계산하였다. 2차 항체는 단지 음성 대조군으로서 였다.
도 10은 말단절단된 SSEA-4의 구조: 지질1과 접합된 SS 연속 당과 Gb 연속 당을 보여준다. 도 11은 1차 SSEA-4 항체의 에피토프 맵핑 결과를 보여준다. 말단절단된 글리칸 말단 항원은 완전한 SSEA-4 구조가 1J1s 및 2F20s 인식에 요구된다는 것을 보여주었다. 다른 한편으로는, 상업용 SSEA-4 항체 MC-813-70 및 1G1s는 또한 마지막 화합물 구조 (N-아세틸뉴라민산; NeuAc)로 인해 SSEA-4 및 SS5 둘 다를 인지한다. 이는 당의 환원 말단에서의 제1 화합물 구조 (글루코스)가 에피토프 인식에는 덜 필수적이라는 것을 의미한다.
실시예 5: SSEA-4-지질1 코팅 화학발광 샌드위치 ELISA 분석에 의한 예시적인 비오티닐화 당과의 교차 활성
시약
차단 완충제 (써모피셔(ThermoFisher), Cat #37515)인 슈퍼블록(SuperBlock)을 그대로 사용하였다. 1차 SSEA-4 항체 (1G1s, 1J1s, 2F20s, 및 MC-813-70)를 2.5 μg/mL로 슈퍼블록 중에 희석하였다. 세척 완충제: 트윈 20 0.5 mL를 1L의 PBS에 첨가하여 0.05% PBS 중 트윈 20을 제조하였다. 2차 항체: 1:50000 희석으로 슈퍼블록 중 염소 항-마우스 IgG-HPR (잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch), Cat#109-035-003). 비오티닐화 당 (하기 열거됨) 및 D-비오틴 (카르보신트(Carbosynth), Cat # FB02633)을 1x PBS (시그마, Cat #P5493-4L) 중에 용해시켜서 1 mg/mL 스톡을 제조하였다.
표 7. 종양 연관된 당의 목록 (코팅된 항원)
Figure pct00008
플레이트 코팅
96-웰 상업상 이용가능한 스트렙타비딘 HBC 코팅된 흑색 플레이트 (써모사이(ThermoSci), Cat #15503)를 웰당 200 μL 세척 완충제 (시그마, Cat#P5493)로 1회 세척하였다. 비오티닐화 당 스톡을 1x PBS 중에 1 ng/mL로 희석하였다. 희석된 비오티닐화 당의 부피를 시험 플레이트 (50 μL/웰; 50 ng/웰)에 첨가하였다. 시험 플레이트를 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 웰을 200 μL 세척 완충제로 1회 세척하였다. 200 μL의 슈퍼블록을 각 웰에 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다.
1차 항체
표 8. 예시적인 1차 항체
Figure pct00010
인큐베이션 후에, 웰을 흡인하고, 200 μL 세척 완충제로 1회 세척하였다. 2.5 μg/mL 1차 항체 50 μL를 개별 플레이트에 첨가하였다. 시험 플레이트를 덮고, 라벨링하고, 대략 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 웰을 흡인하고, 200 μL 세척 완충제로 4회 세척하였다.
2차 항체
2차 항체 용액 50 μL를 각 웰 내로 피펫팅하였다. 플레이트를 덮고, 라벨링하고, 대략 45분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 2차 항체 용액을 모든 웰로부터 흡인하고, 모든 웰을 200 μL 세척 완충제로 5회 세척하였다.
100 μL 기질 용액 (써모사이, Cat#PIE37074)을 각 웰 내로 피펫팅하고, 1 내지 5분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 470 nm에서 ELISA 플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices), 스펙트라맥스(SpectraMax) L)로 판독하였다.
데이터 분석
데이터는 그래프패드 프리즘 6 소프트웨어를 사용하여 통계적으로 분석하였다. 평균 및 SD는 3중 결과로부터 계산하였다.
도 12는 SSEA-4 항체의 ELISA 친화도 검정 결과를 보여준다. 1G1s, 1J1s, 2F20s, 및 상업용 MC-813-70을 포함하는 예시적인 SSEA-4 항체는 다른 종양 연관된 당과의 최소 상호작용을 나타냈고, SSEA-4 항원 (SSEA4 및 SSEA4-b-N-Sp)에 특이적이다. 이는 본 발명에서 SSEA4-항체의 결합 특이성을 나타냈다.
실시예 6: 누드 마우스에서의 글로보 H 항체와 조합된 예시적인 항체의 항-종양 활성의 측정
인간 췌장 선암종의 이종이식 종양 모델에서, HPAC 세포를 BALB/c 수컷 누드 마우스에 피하로 (s.c.) 이식하였고, 평균 종양 크기가 50-120 mm3에 도달했을 때 시작하여 시험 물품을 5주 동안 매주 2회 복강내 (i.p.) 주사에 의해 0.1 mg/kg으로, 10 mg/kg으로, 또는 항체 둘 다를 0.1 mg/kg으로 조합하여 투여하였다. 이어서, 종양 크기를 37일 동안 매주 2회 모니터링하고 기록하였다. 사망률, 체중 및 명백한 동물 독성의 징후를 37일 동안 매주 2회 기록하였다. 종양 성장은 T/C (치료군/대조군) x 100%로 계산하였다.
시험 물질 및 투여 패턴
시험 물질을 액체 형태로 1 또는 1.03 mg/mL로 제조하였다. 시험 물질을 지정된 투여 농도 (0.01 mg/mL 또는 1 mg/mL)를 수득하도록 시트르산나트륨 완충제 (25 mM 시트르산나트륨 및 100 mM NaCl, pH6.5)로 스톡 용액을 희석함으로써 투여 전에 매일 새롭게 제조하였다. 시험 물질을 5주 동안 매주 2회 10 mL/kg 투여 부피로 복강내로 투여하였다.
표 9. 제제의 예시적인 유형.
Figure pct00011
세포주
HPAC 종양 세포주 (ATCC CRL-2119, 인간 췌장 선암종)를 제조하고, 유로핀스 판랩스 타이완 리미티드에서 배양한 후, BALB/c 수컷 누드 마우스의 우측 측복부 내로 0.1 mL의 1 x 106개 세포/마우스로 피하 이식하였다.
동물
18-22g 무게의 6-7주령 BALB/c 수컷 누드 마우스를 (찰스 리버 래보러토리즈 라이센시 하의) 바이오라스코 타이완으로부터 수득하였다. 모든 동물을 12시간 명/암 사이클을 갖는 잘 제어된 온도 (20-24℃) 및 습도 (30-70%) 환경에서 유지하였다. 표준 실험 식이 [MFG (오리엔탈 이스트 캄파니 리미티드, 일본)] 및 오토클레이빙된 수돗물에 자유롭게 접근하도록 하였다. 하우징, 실험, 및 동물 폐기를 포함한 본 연구의 모든 측면은 본 발명자들의 AAALAC-공인 실험 동물 설비에서 일반적으로 "실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침: 제8판" (National Academies Press, Washington, D.C., 2011)에 따라 수행하였다. 게다가 동물 관리 및 사용 프로토콜을 파마콜로지 디스커버리 서비시즈 타이완 리미티드(Pharmacology Discovery Services Taiwan Ltd)에서 IACUC에 의해 검토 및 승인받았다.
화학물질
DMEM/F12 배지 (인비트로젠, 미국), 표피 성장 인자 (알앤디 시스템즈, 미국), 소 태아 혈청 (인비트로젠, 미국), 인슐린 (시그마, 미국), 히드로코르티손 (시그마, 미국) 및 페니실린/스트렙토마이신 용액 (인비트로젠, 미국).
장비
동물 케이지 (테크니플라스트, 이탈리아), 비커 1000 mL (키맥스, 미국), 캘리퍼 (미투토요, 일본), 부류 II 생물학적 안전 케비넷 (뉴에어, 미국), 원심분리 5810 R (에펜도르프, 독일), μ 인큐베이터 (포르마 사이언티픽 인크., 미국), 개별 환기 케이지 (IVC, 36 소형 격리 시스템) (테크니플라스트, 이탈리아), 마우스 저울 # Z-40 (타코닉, 미국), 스테인레스 겸자 (클라펜네커, 독일) 및 수직 층류 (챠오-흐신, 대만).
방법
6-7주령의 18-22g 무게의 BALB/c 누드 수컷 마우스를 사용하였다. 인간 췌장 선암종 종양 세포 HPAC (ATCC CRL-2119, 0.1 mL 중의 1.0 x 106개)를 동물의 우측 측복부로 피하로 주사하였다. 후속적으로 동물을 각 군이 8마리의 동물로 이루어지는 6개의 군으로 나누었다. 평균 종양 크기가 50-120 mm3에 도달했을 때 시험 물질 및 비히클의 투여를 개시하였다 (제1일로 설정함). 시험 물질 (표 X의 투여에 따름)은 각각의 투여 전에 새롭게 제조하였다. 시험 물질 및 비히클을 5주 동안 복강내 주사에 의해 매주 2회 투여하였다. 종양 크기, 체중, 및 사망률을 시험 물질 또는 비히클의 투여 전 37일 동안 매주 2회 기록하였다.
종양 부피 (mm3)를 타원체 식: 길이 x (폭)2 x 0.5에 따라 결정하였다. 종양 성장 (T/C)은 하기 식: T/C = (Tn)/(Cn) x 100% (여기서 C1 (Cn)은 대조군에서의 제n일의 종양 부피이고, T1 (Tn)은 치료군에서의 제n일의 종양 부피임)을 사용하여 계산하였다. T/C 값 ≤ 42%를 유의한 항종양 활성으로 간주하였다.
결과
표 10. 누드 마우스에서의 종양, 이종이식편, 췌장, HPAC
Figure pct00012
Figure pct00013
시험 물질을 5주 동안 매주 2회 복강내로 투여하였다. 종양 크기를 37일 동안 매주 2회 측정하고 기록하였다. 종양 성장은 T/C (치료군/대조군) x 100%로 계산하였다.
T/C 값 ≤ 42%를 유의한 항종양 활성으로 간주하였다. 또한, 이원 ANOVA에 이어서 본페로니 시험을 적용하여 * P< 0.05에서 제1군 (비히클, PBS)과 비교하여 통계적으로 유의한 차이를 확인하였다.
도 13은 37일 동안 상이한 시험 화합물을 투여한 누드 마우스의 사진을 보여준다. 본 연구의 종료 시에 종양 성장 억제 (TGI (%) = (V대조군-V시험)/(V대조군-V본래)*100)는 0.1 mg/kg 1J1s는 10.8%, 10 mg/kg 1J1s는 24.4%, 10 mg/kg 2C2는 15.4% (0.1 mg/kg 2C2는 HPAC의 억제 능력을 나타내지 않았음)로 계산되었다. 그러나, 0.1 mg/kg 2C2와 조합된 0.1 mg/kg 1J1s는 1J1s 또는 2C2 단독에 의한 치료의 100배 투여보다 훨씬 더 높은, 33.7% 종양 성장 억제를 나타냈다.
본 발명의 구체적 측면을 기재하고 예시하였지만, 이러한 측면은 단지 본 발명의 예시인 것으로 간주되며, 첨부된 청구범위에 따라 해석되는 바와 같은 본 발명을 제한하는 것으로 간주되지 않아야 한다. 본 명세서에 인용된 모든 공개 및 특허 출원은 각각의 개별 공개 또는 특허 출원이 모든 목적을 위해 그 전문이 참조로 포함되는 것이라고 구체적이고 개별적으로 표시된 것처럼, 모든 목적을 위해 그의 전문이 참조로 포함된다. 상기 발명은 이해의 명확성의 목적으로 예시 및 실시예에 의해 일부 상세하게 기재되었지만, 첨부된 청구범위의 정신 또는 범위를 벗어나지 않고 그에 특정 변화 및 변형이 이루어질 수 있음이 이 발명의 교시의 관점에서 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 명백할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> OBI PHARMA, INC. <120> ANTIBODIES, PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS AND METHODS <130> G3004-00500 <140> 62/314,841 <141> 2016-03-29 <160> 54 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 1 caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatc 60 acttgcactg tctctgggtt ttcattaatc agctatggtg tagactgggt tcgccagcct 120 ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagta atatggggtg gtggaaatac aaattataat 180 tcatctctca tgtccagact gagcatcagc aaagacaact ccaagagcca agttttctta 240 aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatgtact actgtgccaa aactgggacc 300 ggatatgctt tggagtactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc c 351 <210> 2 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 2 gaaaatgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga aaaggtcacc 60 atgacctgca gtgccaggtc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca 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Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Val Ser Trp Ala Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Ala Leu Ile 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Leu Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Pro Glu Asn Trp Asp Gly Phe Asp Val Trp Gly Pro Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 40 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Polypeptide <400> 40 Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 41 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Polypeptide <400> 41 Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys 20 <210> 42 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Polypeptide <400> 42 Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His 1 5 10 <210> 43 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Polypeptide <400> 43 Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 44 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Polypeptide <400> 44 Ala Thr Ser Asp Leu Ala Ser 1 5 <210> 45 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Polypeptide <400> 45 Val Pro Thr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu 1 5 10 15 Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Polypeptide <400> 46 Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr 1 5 <210> 47 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Polypeptide <400> 47 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 1 5 10 <210> 48 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Polypeptide <400> 48 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser 20 25 <210> 49 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Polypeptide <400> 49 Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Val Ser 1 5 10 <210> 50 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Polypeptide <400> 50 Trp Ala Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly 1 5 10 <210> 51 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Polypeptide <400> 51 Val Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Ala Leu Ile Ser 1 5 10 15 <210> 52 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Polypeptide <400> 52 Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys 1 5 10 15 Leu Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Lys 20 25 30 <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Polypeptide <400> 53 Pro Glu Asn Trp Asp Gly Phe Asp Val 1 5 <210> 54 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Polypeptide <400> 54 Trp Gly Pro Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 1 5 10

Claims (50)

  1. 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 서열 상동성의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및/또는 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 상동성의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  2. 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이며, 여기서 중쇄는 서열식별번호: 13, 15 또는 17로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 상동성의 상보성 결정 영역 (CDR) 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  3. 경쇄 및 중쇄를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이며, 여기서 경쇄 영역은 서열식별번호: 6, 8 또는 10으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 상동성의 상보성 결정 영역 (CDR) 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  4. ATCC 수탁 번호 PTA-122679 하에 기탁된 1J1s로서 지정된 하이브리도마에 의해 생산된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  5. ATCC 수탁 번호 PTA-122679 하에 기탁된 1J1s로서 지정된 하이브리도마.
  6. 서열식별번호: 21에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 서열 상동성의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및/또는 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 상동성의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL)
    을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  7. 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이며, 여기서 중쇄는 서열식별번호: 31, 33 또는 35로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 상동성의 상보성 결정 영역 (CDR) 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  8. 경쇄 및 중쇄를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이며, 여기서 경쇄는 서열식별번호: 24, 26 또는 28로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 상동성의 상보성 결정 영역 (CDR) 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  9. ATCC 수탁 번호 PTA-122678 하에 기탁된 1G1s로서 지정된 하이브리도마에 의해 생산된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  10. ATCC 수탁 번호 PTA-122678 하에 기탁된 1G1s로서 지정된 하이브리도마.
  11. 서열식별번호: 39에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 서열 상동성의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및/또는 서열식별번호: 40에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 상동성의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  12. 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이며, 여기서 중쇄는 서열식별번호: 49, 51 또는 53으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 상동성의 상보성 결정 영역 (CDR) 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  13. 경쇄 및 중쇄를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이며, 여기서 경쇄는 서열식별번호: 42, 44 또는 46으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80% 상동성의 상보성 결정 영역 (CDR) 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  14. ATCC 수탁 번호 PTA-122676 하에 기탁된 2F20s로서 지정된 하이브리도마에 의해 생산된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  15. ATCC 수탁 번호 PTA-122676 하에 기탁된 2F20s로서 지정된 하이브리도마.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 가변 도메인이 하나 이상의 탄수화물 항원에 결합할 수 있는 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  17. 제16항에 있어서, 탄수화물 항원이 SSEA-4 (Neu5Acα2→ 3Galβ1→ 3GalNAcβ1→ 3Galα1→ 4Galβ1→ 4Glcβ1 (SSEA-4 헥사사카라이드)인 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
  18. 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 21 또는 서열식별번호: 39로부터 선택된 VH 및 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 22 또는 서열식별번호: 40으로부터 선택된 VL을 포함하는 항체 또는 그의 결합 단편.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 완전 이뮤노글로불린 분자; (b) scFv; (c) Fab 단편; (d) F(ab')2; 또는 (e) 디술피드 연결된 Fv로부터 선택된 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간화 항체인 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
  21. 제20항에 있어서, IgG 또는 IgM인 항체.
  22. 제20항에 있어서, SSEA-4에 특이적인 키메라 항원 수용체 (CAR) 도메인을 추가로 포함하는 항체.
  23. 제22항에 있어서, CAR 도메인이 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하며, 여기서 막횡단 도메인이 CD8 및/또는 CD28의 막횡단 도메인의 서열을 포함하고; 세포내 신호전달 도메인이 CD27, CD28, CD137, OX40, ICOS 및 CD3제타 중 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인의 서열을 포함하는 것인 항체.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 적어도 1종의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 적어도 1종의 추가의 치료제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
  26. 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 제약 조성물 및/또는 글로보 시리즈 항체의 조합을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  27. 암 세포의 증식의 억제를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제24항에 따른 제약 조성물 및/또는 글로보 시리즈 항체의 조합을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 암 세포의 증식이 억제되는 것인, 암 세포의 증식을 억제하는 방법.
  28. (a) 대상체로부터 체액 샘플 또는 세포 샘플을 수득하는 단계,
    (b) 샘플을 SSEA-3, SSEA-4 또는 글로보-H로 이루어진 군으로부터 선택된 암 마커의 패널의 발현을 검출할 수 있는 하나 이상의 항체와 접촉시키는 단계;
    (c) 하나 이상의 항체의 세포 또는 샘플에 대한 결합을 검정하는 단계; 및
    (d) 검정에서 대상체의 암 상태를, 항체 결합의 수준을 측정하고 정상 대조군과 비교하여 대상체에서 암의 존재를 결정함으로써 평가하는 단계
    를 포함하는 대상체에서의 암 진단을 위한 방법.
  29. (a) 환자로부터 체액 샘플 또는 세포/조직 샘플을 수득하는 단계;
    (b) 샘플을 SSEA-3, SSEA-4 또는 글로보-H로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 검출할 수 있는 하나 이상의 항체와 접촉시키는 단계;
    (c) 세포 또는 세포/조직 샘플에 대한 항체의 결합의 수준을 검정하는 단계;
    (d) 시험 샘플에서의 마커의 수준과 참조 샘플의 수준을 측정하고 비교하는 단계;
    (e) 단계 (d)에서의 결정에 기초하여 환자에서 종양의 병기 및/또는 예후를 결정하는 단계; 및
    (f) (e)에 기초하여 상기 환자의 면역요법을 위한 치료 계획을 조정하는 단계
    를 포함하는, 환자에서 종양의 예후를 모니터링함으로써 인간 환자를 치료하는 방법.
  30. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 유방암, 폐암, 식도암, 직장암, 담도암, 간암, 협부암, 위암, 결장암, 비인두암, 신장암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 췌장암, 고환암, 방광암, 두경부암, 구강암, 신경내분비암, 부신암, 갑상선암, 골암, 피부암, 기저 세포 암종, 편평 세포 암종, 흑색종 또는 뇌 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  31. 제26항 또는 제27항에 있어서, 글로보 시리즈 항체가 항-글로보 H, 항-SSEA3 또는 항-SSEA4 항체인 방법.
  32. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  33. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 암 줄기 세포인 방법.
  34. 제28항 또는 제29항에 있어서, 샘플이 혈청, 혈액, 혈장, 세포, 세포 배지, 타액, 소변, 림프절 유체, 종양 생검 또는 조직 배양물로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  35. (a) 유효량의 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 항체를 투여하는 단계이며, 여기서 항체는 영상화제에 접합된 것인 단계; 및
    (b) 대상체에서 영상화제를 검출하고 결정하는 단계; 및
    (c) 디스플레이 상에 이미지를 생성하고 디스플레이하는 단계
    를 포함하는 대상체를 영상화하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 영상화제가 형광단, 염료, MRI 조영제 또는 방사성핵종인 방법.
  37. 제35항에 있어서, 대상체가 암을 갖고, 방법은 암 전이를 검출하는 방법으로서 추가로 규정된 것인 방법.
  38. 제35항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  39. 제28항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 검정이 항체 기반 검정 또는 어레이인 방법.
  40. 치료제 및 SSEA-4에 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하며, 여기서 치료제는 링커에 의해 항체 또는 항원-결합 단편에 공유 접합된 것인 항체-약물 접합체 (ADC).
  41. 제40항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편이 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항으로부터 선택된 것인 ADC.
  42. 유효량의 제40항의 ADC를 암의 치료를 필요로 하는 경우에 투여하는 것을 포함하는 암을 치료하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 암이 유방암, 폐암, 식도암, 직장암, 담도암, 간암, 협부암, 위암, 결장암, 비인두암, 신장암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 췌장암, 고환암, 방광암, 두경부암, 구강암, 신경내분비암, 부신암, 갑상선암, 골암, 피부암, 기저 세포 암종, 편평 세포 암종, 흑색종 또는 뇌 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  44. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 글로보 시리즈 항원에 특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인 및 T 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중-특이적 항체 또는 그의 항원-결합 부분.
  45. 제44항에 있어서, 글로보 시리즈 항원이 글로보 H, SSEA-3 또는 SSEA-4를 포함하는 것인 이중-특이적 항체 또는 항원-결합 부분.
  46. 제44항에 있어서, T 세포 표면 항원이 CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD8, CD28, CD40L 또는 CD44를 포함하는 것인 이중-특이적 항체 또는 항원-결합 부분.
  47. 유효량의 제44항의 이중-특이적 항체 또는 항원-결합 부분을 암의 치료를 필요로 하는 경우에 투여하는 것을 포함하는 암을 치료하는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 암이 유방암, 폐암, 식도암, 직장암, 담도암, 간암, 협부암, 위암, 결장암, 비인두암, 신장암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 췌장암, 고환암, 방광암, 두경부암, 구강암, 신경내분비암, 부신암, 갑상선암, 골암, 피부암, 기저 세포 암종, 편평 세포 암종, 흑색종 또는 뇌 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  49. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 모노클로날 항체를 α-푸코시다제 및 적어도 하나의 엔도글리코시다제와 접촉시키는 단계;
    (b) 단일 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)을 갖는 탈푸코실화 항체를 생성하는 단계; 및
    (c) 항체의 Fc 영역의 GlcNAc에 보편적 글리칸을 첨가하여 상기 당형태를 갖는 동종 항체를 형성하는 단계
    를 포함하는 동종 항체의 집단을 제조하는 방법.
  50. 제49항에 있어서, 동종 항체가 SSEA-4에 결합하는 것인 방법.
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