ES2797747T3

ES2797747T3 - Composiciones de glucoconjugado inmunogénicas/terapéuticas y usos de las mismas

Info

Publication number: ES2797747T3
Application number: ES15842660T
Authority: ES
Inventors: Cheng-Der Tony Yu; Yih Huang Hsieh; I Ju Chen; Wei-Han Lee; Nan-Hsuan Wang
Original assignee: OBI Pharma Inc
Current assignee: OBI Pharma Inc
Priority date: 2014-09-15
Filing date: 2015-09-15
Publication date: 2020-12-03
Anticipated expiration: 2035-09-15
Also published as: KR102702705B1; TW201628646A; EP3193919A1; PH12017500478A1; AU2015317889B2; BR112017005120A2; AR101871A1; CA2961522A1; KR20230109783A; RU2017112982A; TWI726850B; JP6774941B2; WO2016044326A9; US20160339089A1; SG11201702037SA; BR112017005120B1; KR102679516B1; IL251120B; AU2015317889A1; CN107427564A

Abstract

Una composición que comprende una pluralidad de unidades estructurales Globo H enlazadas covalentemente a una hasta veinte unidades estructurales de hemocianina de lapa de ojo de cerradura (KLH), en donde las unidades estructurales Globo H están enlazadas covalentemente a las unidades estructurales KLH en uno o más residuos de aminoácidos; y un adyuvante de α-galactosil-ceramida (α-GalCer); en donde la unidad estructural Globo H enlazada covalentemente a una subunidad de la unidad estructural KLH está enlazada por un enlazante 4-(4-N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilhidrazida (MMCCH); y en donde la composición tiene una relación epítopo/vehículo que varía de aproximadamente 800 a aproximadamente 3200.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones de glucoconjugado inmunogénicas/terapéuticas y usos de las mismas

Campo de la invención

La presente divulgación está dirigida a composiciones y métodos para inmunoterapia contra el cáncer y glucoconjugados inmunogénicos/terapéuticos capaces de provocar respuestas inmunitarias contra el cáncer en particular.

Antecedentes. El antígeno de carbohidrato Globo H (Fuc a 1^-2 Gal p 1^-3 GalNAc p 1^-3 Gal a 1 ^ 4 Gal p 1 ^ 4 Glc) se aisló por primera vez como un glucolípido enlazado a ceramida y fue identificado en 1984 por Hakomori et al. a partir de células de cáncer de mama Mc F-7. (Bremer E G, et al. (1984) J Biol Chem 259: 14773-14777). Otros estudios con anticuerpos monoclonales anti-Globo H mostraron que Globo H estaba presente en muchos otros tipos de cáncer, incluidos los de próstata, gástrico, pancreático, pulmón, ovario y colon y solo una expresión mínima en la superficie luminal del tejido secretor normal que no es fácilmente accesible para el sistema inmunitario. (Ragupathi G, et al. (1997) Angew Chem Int Ed 36: 125-128). Además, se ha establecido que el suero de pacientes con cáncer de mama contiene un alto nivel de anticuerpo anti-Globo H. (Gilewski T et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98: 3270 3275; Huang C-Y, et al. (2006) Proc Natl Acad Sci USA 103: 15-20; Wang C-C, et al. (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105(33): 11661-11666). Los pacientes con tumores Globo H-positivos mostraron una supervivencia más corta en comparación con los pacientes con tumores Globo H-negativos. (Chang, Y-J, et al. (2007) Proc Natl Acad Sci USA 104(25): 10299-10304). Estos hallazgos hacen que Globo H, un epítopo de hexasacárido, sea un marcador tumoral atractivo y un objetivo factible para el desarrollo de vacunas contra el cáncer. Wong et al. (US 2010/0136042) se refieren a composiciones inmunogénicas que comprenden Globo H o un fragmento inmunogénico del mismo enlazado a una proteína transportadora por un enlazador p-nitrofenilo.

Resumen de la invención

Mientras que las vacunas se han desarrollado para provocar respuestas de anticuerpos contra Globo H, sus eficacias anticancerígenas son insatisfactorias debido a la baja antigenicidad de Globo H. Existe la necesidad de una nueva vacuna capaz de provocar altos niveles de respuestas inmunitarias dirigidas a Globo H.

KLH contiene subunidades de polipéptidos glicosilados que pueden ensamblarse para formar partículas decaméricas (10-mero), didecaméricas (20-mero) y más grandes. Estas estructuras multiméricas se han caracterizado por técnicas de ultracentrifugación que producen coeficientes de sedimentación de 11-19S para las subunidades disociadas y 92-107S para los multímeros didecaméricos. Una variedad de factores puede afectar la distribución del tamaño de las hemocianinas de moluscos, incluida la KLH. Estos factores incluyen la fuerza iónica, el pH, la temperatura, el pO2 y la disponibilidad de ciertos cationes divalentes, especialmente calcio y magnesio.

Los inventores actuales han desarrollado una composición con una eficacia sorprendentemente incrementada que se compone principalmente de dímeros, trímeros y otros multímeros de KLH enlazados a una pluralidad de unidades estructurales Globo H.

Por consiguiente, la presente divulgación generalmente abarca composiciones terapéuticas y/o profilácticas que incluyen Globo H, así como inmunoterapéuticos, vacunas, formas de dosificación, kits y métodos de fabricación y tratamiento de los mismos.

En una realización, la invención abarca un conjugado terapéutico aislado que comprende una unidad estructural Globo H enlazada a una subunidad de la unidad estructural hemocianina de lapa de ojo de cerradura (KLH). En ciertas realizaciones, el enlace es un enlace covalente.

En otra realización, la invención abarca un conjugado terapéutico aislado que comprende una unidad estructural Globo H enlazada covalentemente a una subunidad de hemocianina de lapa de ojo de cerradura (KLH), en el que la KLH es una KLH derivada. Como se usa en el presente documento, el término "unido covalentemente" cuando se refiere a Globo-H y KLH significa: Globo-H está directamente enlazado covalentemente a KLH, o Globo-H está enlazado covalentemente a KLH derivada (como se establece aquí), o Globo-H está enlazado covalentemente a KLH a través de un grupo enlazador (como se establece aquí), o Globo-H está enlazado covalentemente a KLH a través de un grupo enlazador y una KLH derivada.

En ciertas realizaciones ilustrativas, la KLH derivada de la invención tiene la siguiente estructura:

En una realización, la invención abarca un conjugado terapéutico aislado que comprende una unidad estructural Globo H enlazada covalentemente a una subunidad de la unidad estructural hemocianina de lapa de ojo de cerradura (KLH) a través de una molécula enlazadora.

En una realización, las unidades estructurales Globo H están enlazadas a un residuo de lisina de una subunidad de unidad estructural KLH.

En una realización, hay un total de exactamente o aproximadamente 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160 residuos de lisina totales por subunidad de unidad estructural KLH que están disponibles o se unen directa o indirectamente a una unidad estructural Globo H.

En otra realización, la invención abarca un conjugado terapéutico aislado que comprende una unidad estructural Globo H enlazada covalentemente a una subunidad de la unidad estructural hemocianina de lapa de ojo de cerradura (KLH) mediante un grupo enlazador4-(4-N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilhidrazida (MMCCH). El enlazador MMCCH de la invención tiene la siguiente estructura:

ENLAZADOR MMCCH

En otra realización ilustrativa, la invención abarca un conjugado terapéutico aislado que tiene la siguiente estructura general:

en donde n es un número entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 160. En ciertas realizaciones, una unidad estructural KLH monomérica puede incluir de aproximadamente 1 a aproximadamente 160 unidades estructurales Globo H. Un experto en la materia reconocerá que las estructuras se ilustran como las sales de hidrocloruro de iminio, pero también pueden existir o coexistir como la forma de imina. Por consiguiente, la invención abarca tanto la imina como sus sales, incluida, por ejemplo, la sal de hidrocloruro de iminio. En ciertas realizaciones, una unidad estructural KLH monomérica puede incluir de aproximadamente 1 a aproximadamente 125 unidades estructurales Globo H. En ciertas realizaciones, una unidad estructural KLH monomérica puede incluir de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 unidades estructurales Globo H. En ciertas realizaciones, una unidad estructural KLH monomérica puede incluir de 1 a aproximadamente 75 unidades estructurales Globo H. En ciertas realizaciones, una unidad estructural KLH monomérica puede incluir de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 unidades estructurales Globo H. En ciertas realizaciones, una unidad estructural KLH monomérica puede incluir de aproximadamente 1 a aproximadamente 25 unidades estructurales Globo H. En ciertas realizaciones, una unidad estructural KLH monomérica puede incluir de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 unidades estructurales Globo H.

En ciertas realizaciones, las unidades estructurales Globo H se conjugan con las unidades estructurales KLH covalentemente a ciertos residuos de aminoácidos. En ciertas realizaciones, los residuos de aminoácidos pueden incluir o excluir arginina, lisina, histidina, asparagina, prolina, glutamina o una combinación de los mismos.

En otra realización, las unidades estructurales Globo H están enlazadas a sitios de conjugación de lisina en una subunidad de unidad estructural KLH monomérica.

En otra realización, hay exactamente o aproximadamente 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 o 110 sitios de conjugación de lisina en cada subunidad de unidad estructural KLH monomérica disponible para unirse o realmente unirse a una unidad estructural Globo H. En otra realización, hay 62, 66, 67, 68, 70, 72, 76, 86, 87, 88, 90, 92, 93, 100 de dichos sitios de conjugación de lisina en cada subunidad de la unidad estructural KLH.

En ciertas realizaciones de composición terapéutica que contienen una mezcla de subunidades de unidad estructural (por ejemplo, KLH1 y KLH2 o variantes de las mismas), la lisina total disponible (para ambas subunidades) como se cuenta entre los diferentes tipos de subunidades y puede ser o es exactamente aproximadamente 290, 291,292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301,302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309 o 310 en número. En tales realizaciones, hay exactamente o aproximadamente 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159 o 160 sitios de conjugación de lisina juntos a través de las diferentes subunidades (por ejemplo, KLH1 y KLH2 o variantes de los mismos). En otras de tales realizaciones, hay 136, 137, 141, 140, 143, 147 o 155 sitios de conjugación de lisina.

En otra realización ilustrativa, la invención abarca un conjugado inmunogénico/terapéutico aislado que tiene la siguiente estructura general:

en donde n es independientemente un número entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 3000 y m es independientemente un número entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 20. En ciertas realizaciones, cuando m es mayor que 1, las unidades estructurales KLH pueden agregarse para formar estructuras multiméricas. En ciertas realizaciones, la agregación es un enlace covalente. En ciertas otras realizaciones, la agregación no es un enlace covalente (por ejemplo, la agregación se forma por enlaces H o interacciones hidrófobas). En ciertas realizaciones, una unidad estructural KLH monomérica (es decir, donde m=1) puede incluir de aproximadamente 1 a aproximadamente 160 unidades estructurales Globo H. En ciertas realizaciones, una unidad estructural KLH dimérica (es decir, donde m=2) puede incluir de aproximadamente 1 a aproximadamente 300 unidades estructurales Globo H. En ciertas realizaciones, una unidad estructural KLH trimérica (es decir, donde m=3) puede incluir de aproximadamente 1 a aproximadamente 450 unidades estructurales Globo H. En ciertas realizaciones, una unidad estructural KLH tetramérica (es decir, donde m=4) puede incluir de aproximadamente 1 a aproximadamente 600 unidades estructurales Globo H. En ciertas realizaciones, una unidad estructural KLH pentamérico (es decir, donde m=5) puede incluir de aproximadamente 1 a aproximadamente 750 unidades estructurales Globo H. En ciertas realizaciones, una unidad estructural KLH hexamérica (es decir, donde m=6) puede incluir de aproximadamente 1 a aproximadamente 900 unidades estructurales Globo H. En ciertas realizaciones, una unidad estructural KLH didecamérica (es decir, donde m=20) puede incluir de aproximadamente 1 a aproximadamente 3000 unidades estructurales Globo H.

en donde n es independientemente un número entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 150 y m es independientemente un número entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 20.

En otras realizaciones, la invención abarca un conjugado terapéutico aislado que tiene la siguiente estructura general:

en donde n independientemente es un número entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 160, y en donde m es independientemente un número entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 20. En ciertas realizaciones, m es un número entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 5. En ciertas realizaciones, m es un número entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 3. En ciertas realizaciones, m es 1. En ciertas realizaciones, m es 2. En ciertas realizaciones, m es 3. En ciertas realizaciones, m es 4. En ciertas realizaciones, m es 5. En ciertas realizaciones, m es 6. En ciertas realizaciones, m es 7. En ciertas realizaciones, m es 8. En ciertas realizaciones, m es 9. En ciertas realizaciones, m es 10. En ciertas realizaciones, m es 11. En ciertas realizaciones, m es 12. En ciertas realizaciones, m es 13. En ciertas realizaciones, m es 14. En ciertas realizaciones, m es 15. En ciertas realizaciones, m es 16. En ciertas realizaciones, m es 17. En ciertas realizaciones, m es 18 En ciertas realizaciones, m es 19. En ciertas realizaciones, m es 20. En ciertas realizaciones, para cualquiera de las realizaciones anteriores, cuando m es de 1 a 20, cada n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159 o 160, respectivamente.

En ciertas realizaciones, hay más de una unidad estructural Globo H enlazada a cada unidad estructural KLH monomérica. En ciertas realizaciones ilustrativas, el más de una unidad estructural Globo H enlazada a cada unidad estructural KLH está enlazada a través de un enlazador. En otras realizaciones ilustrativas, los más de una unidad estructural Globo H enlazada a cada unidad estructural KLH se unen a través de un enlazador y se unen a una unidad estructural KLH derivada.

En otra realización, la relación de unidades estructurales Globo H a subunidades de unidad estructural KLH es al menos 1. En otra realización, la relación de unidades estructurales Globo H a subunidades de unidad estructural KLH es al menos 10. En otra realización, la relación de Globo H unidades estructurales a unidad estructural KLH es al menos 25. En otra realización, la relación de unidades estructurales Globo H a subunidades de unidad estructural KLH es al menos 50. En una realización adicional, la proporción de unidades estructurales Globo H a subunidades de unidad estructural KLH es al menos 100. En una realización adicional, la proporción de unidades estructurales Globo H a subunidades de unidad estructural KLH es al menos 150. En otra realización más, la proporción de unidades estructurales Globo H a subunidades de unidad estructural KLH es al menos 500. En otra realización adicional, la proporción de unidades estructurales Globo H a subunidades de unidad estructural KLH es de al menos 750. En otra realización más, la relación de unidades estructurales Globo H a subunidades de unidad estructural KLH es de al menos 1000. En otra realización más, la proporción de unidades estructurales Globo H a subunidades de unidad estructural KLH es de al menos 1500. En todavía otra realización, la proporción de Globo H unidades estructurales a subunidades de unidad estructural KLH es al menos 2000.

En diversas realizaciones, la invención abarca un monómero único de KLH a múltiples subunidades de KLH (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20) cada uno de los cuales ha enlazado múltiples unidades estructurales Globo H. En ciertas realizaciones, la proporción de unidades estructurales Globo H a unidad estructural KLH es la misma. En otras realizaciones, la proporción de unidades estructurales Globo H a unidad estructural KLH es diferente.

Otra realización de la invención abarca una composición que comprende al menos dos unidades estructurales KLH. Por ejemplo, una unidad estructural KLH derivada en forma de un dímero. En otra realización, las al menos dos unidades estructurales KLH son iguales. En otra realización, las al menos dos unidades estructurales KLH son diferentes. En una realización adicional, las al menos dos unidades estructurales KLH tienen la misma relación de subunidad de unidad estructural Globo H a unidad estructural KLH. En otra realización adicional, las al menos dos unidades estructurales KLH tienen una relación de subunidad de unidad estructural Globo H a KLH diferente.

Otra realización de la invención abarca una composición terapéutica que comprende al menos tres unidades estructurales KLH, por ejemplo, una unidad estructural KLH derivada en forma de un trímero. En ciertas realizaciones, las al menos tres unidades estructurales KLH son iguales. En otra realización, las al menos tres unidades estructurales KLH no son iguales. En una realización adicional, las al menos tres unidades estructurales KLH tienen la misma relación de subunidad de unidad estructural Globo H a unidad estructural KLH. En otra realización adicional, las al menos tres unidades estructurales KLH tienen una relación de subunidad de unidad estructural Globo H a KLH diferente.

Otra realización de la invención abarca una composición terapéutica que comprende al menos cuatro unidades estructurales KLH, por ejemplo, una unidad estructural KLH derivada en forma de un tetrámero. En ciertas realizaciones, las al menos cuatro unidades estructurales KLH son iguales. En otra realización, las al menos cuatro unidades estructurales KLH no son iguales. En una realización adicional, las al menos cuatro unidades estructurales KLH tienen la misma relación de subunidad de unidad estructural Globo H a unidad estructural KLH. En otra realización adicional, las al menos cuatro unidades estructurales KLH tienen una relación de subunidad de unidad estructural Globo H a KLH diferente.

Otra realización de la invención abarca una composición terapéutica que comprende al menos cinco unidades estructurales KLH, por ejemplo, una unidad estructural KLH derivada en forma de pentámero. En ciertas realizaciones, las al menos cinco unidades estructurales KLH son iguales. En otra realización, las al menos cinco unidades estructurales KLH no son iguales. En una realización adicional, las al menos cinco unidades estructurales KLH tienen la misma relación de subunidad de unidad estructural Globo H a unidad estructural KLH. En otra realización adicional, las al menos cinco unidades estructurales KLH tienen una relación de subunidad de unidad estructural Globo H a KLH diferente.

Otra realización de la invención abarca una composición terapéutica que comprende al menos seis unidades estructurales KLH, por ejemplo, una unidad estructural KLH derivada en forma de un hexámero. En ciertas realizaciones, las al menos seis unidades estructurales KLH son iguales. En otra realización, las al menos seis unidades estructurales KLH no son lo mismo. En una realización adicional, las al menos seis unidades estructurales KLH tienen la misma relación de subunidad de unidad estructural Globo H a unidad estructural KLH. En otra realización adicional, las al menos seis unidades estructurales KLH tienen una relación de subunidad de unidad estructural Globo H a KLH diferente.

Otra realización de la invención abarca una composición terapéutica que comprende al menos veinte unidades estructurales KLH, por ejemplo, una unidad estructural KLH derivada en forma de didecámero. En ciertas realizaciones, las al menos veinte unidades estructurales KLH son iguales. En otra realización, las al menos veinte unidades estructurales KLH no son lo mismo. En una realización adicional, las al menos veinte unidades estructurales KLH tienen la misma relación de subunidad de unidad estructural Globo H a unidad estructural KLH. En otra realización adicional, las al menos veinte unidades estructurales KLH tienen una relación de subunidad de unidad estructural Globo H a KLH diferente.

En una realización, la unidad estructural Globo H comprende (Fuc a 1 ^ 2 Gal p 1 ^ 3 GalNAc p 1 ^-3 Gal a 1 ^ 4 Gal p 1 ^ 4 Glc). En una realización adicional, la subunidad de la unidad estructural KLH es una unidad estructural KLH-1 o KLH-2 o una combinación de los mismos. Como se usa en el presente documento, el término "KLH" se refiere a KLH-1, KLH-2 y/o combinaciones de los mismos.

En otra realización, la subunidad de la unidad estructural KLH es al menos 99 % idéntica a una subunidad de la unidad estructural KLH que se produce naturalmente.

En otra realización, la subunidad de la unidad estructural KLH es al menos 95 % idéntica a una subunidad de la unidad estructural KLH que se produce naturalmente.

En otra realización, la subunidad de la unidad estructural KLH es al menos 90 % idéntica a una subunidad de la unidad estructural KLH que se produce naturalmente.

En otra realización, la subunidad de la unidad estructural KLH es al menos 80 % idéntica a una subunidad de la unidad estructural KLH que se produce naturalmente.

En otra realización, la subunidad de la unidad estructural KLH es al menos un 70 % idéntica a una subunidad de la unidad estructural KLH que se produce naturalmente.

En otra realización, la subunidad de la unidad estructural KLH es al menos 60 % idéntica a una subunidad de la unidad estructural KLH que se produce naturalmente.

En otra realización, la unidad estructural Globo H está enlazada covalentemente a una subunidad de la unidad estructural hemocianina de lapa de ojo de cerradura (KLH) mediante un enlazador. En otra realización más, la unidad estructural Globo H está enlazada covalentemente a una subunidad de la unidad estructural hemocianina de lapa de ojo de cerradura (KLH) mediante un enlazante 4-(4-N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilhidrazida (MMCCH). En otra realización adicional, la unidad estructural Globo H está enlazada covalentemente a una subunidad de la unidad estructural hemocianina de lapa de ojo de cerradura derivada (KLH) y está enlazada por un enlazante 4-(4-N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilhidrazida (MMCCH).

En otra realización, el conjugado terapéutico aislado tiene una relación epítopo/vehículo basada en un monómero KLH que tiene un peso molecular de aproximadamente 350 KDa a aproximadamente 400 KDa de al menos o aproximadamente 150. En otra realización, el conjugado terapéutico aislado tiene un epítopo/relación de vehículo de al menos o aproximadamente 100. En una realización adicional, el conjugado terapéutico aislado tiene una relación de epítopo/vehículo de al menos o aproximadamente 75. En otra realización adicional, el conjugado terapéutico aislado tiene una relación de epítopo/vehículo de al menos o aproximadamente 50. En otra realización más, el conjugado terapéutico aislado tiene una relación epítopo/vehículo de al menos o aproximadamente 25. En otra realización más, el conjugado terapéutico aislado tiene una relación epítopo/vehículo de al menos o aproximadamente 15. En Todavía otra realización, el conjugado terapéutico aislado tiene una relación epítopo/vehículo de al menos o aproximadamente 5. En otra realización más, el conjugado terapéutico aislado tiene una relación epítopo/vehículo de al menos hasta o aproximadamente 1.

Otra realización de la invención abarca una composición farmacéutica que comprende subunidades de unidad estructural KLH, en donde cada subunidad de unidad estructural KLH comprende una o más unidades estructurales Globo H enlazadas covalentemente a una subunidad de unidad estructural hemocianina de lapa de ojo de cerradura (KLH). En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica comprende dímeros de al menos dos subunidades de unidad estructural KLH, en donde cada subunidad de unidad estructural KLH comprende una o más unidades estructurales Globo H enlazadas covalentemente a una subunidad de unidad estructural KLH. En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica comprende trímeros de al menos tres subunidades de unidad estructural KLH, en donde cada subunidad de unidad estructural KLH comprende una o más unidades estructurales Globo H enlazadas covalentemente a una subunidad de unidad estructural KLH. En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica comprende al menos cuatro subunidades de unidad estructural KLH, en donde cada subunidad de unidad estructural KLH comprende una o más unidades estructurales Globo H enlazadas covalentemente a una subunidad de unidad estructural KLH. En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica comprende una mezcla de subunidades de unidad estructural KLH (por ejemplo, monómeros, dímeros, trímeros, tetrámeros, pentámeros, hexámeros, etc.), en donde cada subunidad de unidad estructural KLH comprende múltiples unidades estructurales Globo H enlazadas covalentemente a una subunidad de unidad estructural KLH.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende monómeros, dímeros, trímeros, tetrámeros, pentámeros, hexámeros o combinaciones de los mismos de unidades estructurales KLH, en donde cada KLH comprende una o más unidades estructurales Globo H enlazadas covalentemente a una subunidad de la unidad estructural hemocianina de lapa de ojo de cerradura (KLH).

En una realización de la invención, las relaciones epítopo/vehículo de los conjugados terapéuticos en la composición varían de aproximadamente 1 a 3000. En una realización adicional, las relaciones epítopo/vehículo de los conjugados terapéuticos en la composición varían de aproximadamente 75 a 2000 En aun otra realización, las relaciones epítopo/vehículo de los conjugados terapéuticos en la composición varían de aproximadamente 100 a 1000. En otra realización adicional, la relación promedio epítopo/vehículo de los conjugados terapéuticos en la composición varía de aproximadamente 150 a 500.

En otra realización, aproximadamente del 1 % al 99 % de los conjugados terapéuticos en la composición son monómeros de KLH. En una realización adicional, aproximadamente 0 % a 99 % de los conjugados terapéuticos en la composición son dímeros de KLH. En otra realización más, aproximadamente del 0 % al 99 % de los conjugados terapéuticos en la composición son trímeros de KLH. En otra realización más, aproximadamente del 0 % al 99 % de los conjugados terapéuticos en la composición son tetrámeros de KLH. En una realización adicional, aproximadamente 1 % a 99 % de los conjugados terapéuticos en la composición son pentámeros de KLH. En otra realización más, aproximadamente del 0 % al 99 % de los conjugados terapéuticos en la composición incluyen 6 subunidades KLH. En otra realización más, aproximadamente del 0 % al 99 % de los conjugados terapéuticos en la composición incluyen 7 subunidades KLH. En otra realización más, aproximadamente del 0 % al 99 % de los conjugados terapéuticos en la composición incluyen 8 subunidades KLH. En otra realización más, aproximadamente del 0 % al 99 % de los conjugados terapéuticos en la composición incluyen 9 subunidades KLH. En otra realización más, aproximadamente del 0 % al 99 % de los conjugados terapéuticos en la composición incluyen 10 subunidades KLH. En otra realización más, aproximadamente del 0 % al 99 % de los conjugados terapéuticos en la composición incluyen 11 subunidades KLH. En otra realización más, aproximadamente del 0 % al 99 % de los conjugados terapéuticos en la composición incluyen 12 subunidades KLH. En otra realización más, aproximadamente del 0 % al 99 % de los conjugados terapéuticos en la composición incluyen 13 subunidades KLH. En otra realización más, aproximadamente del 0 % al 99 % de los conjugados terapéuticos en la composición incluyen 14 subunidades KLH. En otra realización más, aproximadamente del 0 % al 99 % de los conjugados terapéuticos en la composición incluyen 15 subunidades KLH. En otra realización más, aproximadamente del 0 % al 99 % de los conjugados terapéuticos en la composición incluyen 16 subunidades KLH. En otra realización más, aproximadamente del 0 % al 99 % de los conjugados terapéuticos en la composición incluyen 17 subunidades KLH. En otra realización más, aproximadamente del 0 % al 99 % de los conjugados terapéuticos en la composición incluyen 18 subunidades KLH. En otra realización más, aproximadamente del 0 % al 99 % de los conjugados terapéuticos en la composición incluyen 19 subunidades KLH. En otra realización más, aproximadamente del 0 % al 99 % de los conjugados terapéuticos en la composición incluyen 20 subunidades KLH. En otra realización más, aproximadamente del 1 % al 99 % de los conjugados terapéuticos en la composición son monómeros, dímeros, trímeros, tetrámeros o combinaciones de los mismos. En otra realización más, aproximadamente el 99 % de los conjugados terapéuticos en la composición son monómeros, dímeros, trímeros, tetrámeros o combinaciones de los mismos.

En ciertas realizaciones, ciertas realizaciones de ejemplo de composición y métodos de uso de las mismas pueden incluir o excluir (por ejemplo, excluir) cualquiera o más de las otras realizaciones representativas de compuestos y/o composiciones descritas en este documento.

En otra realización, la composición farmacéutica comprende un adyuvante. Como se usa en el presente documento, los términos "adyuvante inmunológico" se refieren a una sustancia usada junto con un inmunógeno que mejora o modifica la respuesta inmune al inmunógeno. Específicamente, los términos "adyuvante" e "inmunoadyuvante" se usan indistintamente en la presente invención y se refieren a un compuesto o mezcla que puede ser no inmunogénico cuando se administra a un huésped solo, pero que aumenta la respuesta inmune del huésped a otro antígeno cuando se administra conjuntamente con ese antígeno. La mejora y/o extensión mediada por adyuvante de la duración de la respuesta inmune puede evaluarse mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, sin limitación, uno o más de los siguientes: (i) un aumento en el número de anticuerpos producidos en respuesta a la inmunización con la combinación adyuvante/antígeno versus los producidos en respuesta a la inmunización con el antígeno solo; (ii) un aumento en el número de células T que reconocen el antígeno o el adyuvante; y (iii) un aumento en el nivel de una o más citoquinas de Tipo I.

El adyuvante se puede administrar como parte de una composición farmacéutica o de vacuna que comprende un antígeno o como una formulación separada, que se administra conjuntamente con una segunda composición que contiene un antígeno. En cualquiera de estas composiciones, los glucoesfingolípidos (GSL) se pueden combinar con otros adyuvantes y/o excipientes/vehículos. Estos otros adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, emulsión de aceite y adyuvantes basados en emulsionantes tales como adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, MF59 o SAF; geles minerales tales como hidróxido de aluminio (alumbre), fosfato de aluminio o fosfato de calcio; adyuvantes derivados de microbios como la toxina del cólera (CT), la toxina pertussis, la toxina inestable al calor de Escherichia coli (LT), las toxinas mutantes (por ejemplo, LTK63 o LTR72), Bacille Calmette-Guerin (BCG), Corynebacterium parvum, motivos de ADN CpG, dipéptido de muramil, o monofosforil lípido A; adyuvantes en partículas tales como complejos inmunoestimuladores (ISCOM), liposomas, microesferas biodegradables o saponinas (por ejemplo, QS-21); citoquinas tales como IFN-y, IL-2, IL-12 o GM-CSF; adyuvantes sintéticos tales como copolímeros de bloque no iónicos, análogos de péptidos de muramil (por ejemplo, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina [thr-MDP], N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina, N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-[1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi]-etilamina), polifosfencenos o polinucleótidos sintéticos, y sustancias activas de superficie como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de hidrocarburos o hemocianinas de lapa de ojo de cerradura (KLH), moléculas receptoras tipo Toll, LPS, lipoproteínas, lipopéptidos, flagellina, ARN de doble cadena, ADN viral, islas CpG no metiladas, levamisol, bacilo Calmette-Guerin, Isoprinosina, zadaxina, antagonistas PD-1, anticuerpos PD-1, antagonistas CTLA, anticuerpos CTLA, interleucina, citoquinas, GM-CSF, glicolípido, sal de aluminio, fosfato de aluminio, alumbre, hidróxido de aluminio, liposomas, agonistas TLR2, lipopéptido, nanopartículas, monofosforil lípido A, saponina OBI-821, saponina, adyuvante OBI-834, adyuvante C34, nanoemulsiones de aceite en agua y partículas similares a bacterias. Preferiblemente, estos adyuvantes adicionales también son farmacéuticamente aceptables para uso en humanos.

En otra realización, la composición farmacéutica comprende una citoquina seleccionada del grupo que consiste en IL-2, IL-12, IL-18, IL-2, IFN-y, TNF, IL-4, IL-10, IL-13, IL-21, GM-CSF y TGF-p. En una realización adicional, la composición farmacéutica comprende una quimioquina.

En una realización adicional, el agente inmunogénico/terapéutico se administra como una composición farmacéutica.

En aun otra realización, la composición farmacéutica comprende anticuerpos monoclonales, quimioterapéuticos, agentes terapéuticos hormonales, moduladores de los receptores de retinoides, agentes citotóxicos/citostáticos, agentes antineoplásicos, agentes antiproliferativos, agentes anti-mTOR, agentes anti-Her2, agentes anti-EGFR, inhibidores de la prenil-proteína transferasa, inhibidores de la HMG-CoA reductasa, mostazas nitrogenadas, ureas nitrosas, inhibidores de la angiogénesis, bevacizumab, inhibidores de la proliferación celular y la vía de señalización de supervivencia, agentes inductores de apoptosis, agentes que interfieren con los puntos de control del ciclo celular, agentes que interfieren con el receptor tirosina quinasas (RTK), bloqueadores de integrinas, NSAIDs, agonistas de PPAR, inhibidores de la resistencia inherente a múltiples fármacos (MDR), agentes antieméticos, agentes útiles en el tratamiento de la anemia, agentes útiles en el tratamiento de la neutropenia, fármacos potenciadores inmunológicos, bifosfonatos , inhibidores de aromatasa, agentes que inducen la diferenciación terminal de células neoplásicas, secretasa y en inhibidores, vacunas contra el cáncer (por ejemplo, inmunoterapia activa), terapias con anticuerpos monoclonales (por ejemplo, inmunoterapia pasiva) y cualquier combinación de los mismos.

En otra realización, las composiciones terapéuticas de la invención pueden incluir además inhibidores de PD-1/PD-L1 (inmunoterapia con linfocitos de células T citotóxicas (CTL)), inmunoterapia con CTLA-4, inhibidores de CDK4/6 (terapia diana), PI3K inhibidores (terapia a la diana), inhibidores de mTOR (terapia a la diana), inhibidores de AKT (terapia a la diana), inhibidores de Pan-Her (terapia a la diana). Estos inhibidores pueden modificarse para generar también el anticuerpo monoclonal respectivo. Dichos anticuerpos pueden incluirse en composiciones terapéuticas de la invención.

En otra realización, la composición farmacéutica comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización adicional, la composición farmacéutica es una vacuna contra el cáncer. En otra realización más, la composición farmacéutica se formula para administración subcutánea. En otra realización más, la composición farmacéutica está formulada para administración intramuscular. En otra realización más, la composición farmacéutica está formulada para administración intraarterial. En otra realización más, la composición farmacéutica se formula para administración intravenosa.

Otra realización de la invención abarca un método para tratar a un paciente que lo necesita que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición terapéutica que comprende Globo H y KLH. En una realización, el paciente ha sido diagnosticado o se sospecha que tiene cáncer. En otra realización, el cáncer es un cáncer epitelial. En una realización adicional, el cáncer es cáncer de mama. En otra realización más, la cantidad terapéuticamente efectiva de una unidad estructural Globo-H en la composición farmacéutica/terapéutica puede variar de aproximadamente 0.001 pg/kg a aproximadamente 250 mg/kg. En otra realización más, la cantidad terapéuticamente eficaz de la unidad estructural Globo-H en la composición farmacéutica/terapéutica comprende aproximadamente 10 pg/kg a aproximadamente 50 pg/kg de un conjugado terapéutico por dosis. En otra realización adicional, la cantidad terapéuticamente eficaz de la unidad estructural Globo-H en la composición farmacéutica/terapéutica comprende aproximadamente 0.10 pg/kg a aproximadamente 0.75 pg/kg de un conjugado terapéutico por dosis.

En aun otra realización, la cantidad terapéuticamente efectiva del complejo Globo-H-KLH en la composición terapéutica puede variar de aproximadamente 0.001 pg/kg a aproximadamente 250 mg/kg. En otra realización más, la cantidad terapéuticamente efectiva del complejo Globo-H-KLH en la composición terapéutica comprende aproximadamente 10 pg/kg a aproximadamente 50 pg/kg de un conjugado terapéutico por dosis. En otra realización adicional, la cantidad terapéuticamente efectiva del complejo Globo-H-KLH en la composición terapéutica comprende aproximadamente 0.60 pg/kg a aproximadamente 4.50 pg/kg de un conjugado terapéutico por dosis.

En aun otra realización, el método es capaz de extender la supervivencia libre de progresión sobre un placebo de control en aproximadamente o al menos 1 semana. En otra realización más, el método es capaz de extender la supervivencia libre de progresión sobre un placebo de control en aproximadamente o al menos 2 semanas. En otra realización más, el método es capaz de extender la supervivencia libre de progresión sobre un placebo de control en aproximadamente o al menos 1 mes. En otra realización más, el método es capaz de extender la supervivencia libre de progresión sobre un placebo de control en aproximadamente o al menos 3 meses. En otra realización más, el método es capaz de extender la supervivencia libre de progresión sobre un placebo de control en aproximadamente o al menos 6 meses. En otra realización más, el método es capaz de extender o la supervivencia global sobre un placebo de control en aproximadamente o al menos 12 meses.

Breve descripción de las figuras

Se puede obtener una comprensión más completa de la invención haciendo referencia a los dibujos adjuntos, cuando se considera junto con la descripción detallada posterior. Las realizaciones ilustradas en los dibujos están destinadas únicamente a ejemplificar la invención y no deben interpretarse como limitantes de la invención a las realizaciones ilustradas.

La Figura 1A muestra la estructura química de Globo H y también varios ejemplos de análogos de Globo H. Glc representa glucosa, Gal representa galactosa, GalNAc representa N-acetilgalactosamina y Fuc representa fucosa. La Figura 1B muestra una subunidad Globo H-KLH de ejemplo conjugada por medio de un enlazador MMCCH.

La Figura 2A muestra una ruta de síntesis de conjugación de subunidad Globo H-KLH de ejemplo. La figura 2B muestra los dímeros y trímeros Globo H-KLH de la invención en comparación con los conjugados Globo H descritos en Slovin et al (1999), Proc Natl Acad Sci USA 96: 5710-5 y Gilewski et al (2001), Proc Natl Acad Sci USA 98: 3270-5.

La Figura 3 muestra el resultado de la espectrometría de dispersión láser de múltiples ángulos (MALS) de KLH nativo (8.3 MDa).

La Figura 4A muestra el resultado de la cromatografía de exclusión por tamaño de KLH usando espectrometría de dispersión láser de múltiples ángulos (MALS) como detector. La Figura 4B muestra el análisis de distribución de masas de KLH. La Figura 4C muestra el resultado de la cromatografía de exclusión por tamaño del glucoconjugado Globo H-KLH (OBI-822 Lote no. 14001) usando espectrometría de dispersión láser de múltiples ángulos (MALS) como detector. La Figura 4D muestra el análisis de distribución de masa del glucoconjugado Globo H-KLH.

La Figura 5A muestra la expansión cronológica de las poblaciones de células B en ratas Lewis inmunizadas con un glucoconjugado Globo H-KLH de ejemplo (7.5 pg y 25 pg). La Figura 5B muestra la expansión cronológica de las poblaciones de células T CD3 en ratas Lewis inmunizadas con un glucoconjugado Globo H-KLH de ejemplo (7.5 pg y 25 pg). La Figura 5C muestra la expansión cronológica de las poblaciones de células T CD4 en ratas Lewis inmunizadas con un glucoconjugado Globo H-KLH de ejemplo (7.5 pg y 25 pg). La Figura 5D muestra la expansión cronológica de las poblaciones de células T CD8 en ratas Lewis inmunizadas con un glucoconjugado Globo H-KLH de ejemplo (7.5 pg y 25 pg). Los datos se presentaron como porcentaje de números de células en el grupo indicado normalizado al porcentaje de números de células del grupo PBS. Se analizaron comparaciones múltiples utilizando ANOVA de dos vías, seguido de las pruebas post hoc de Bonferroni. *, p<0.05, **, p<0.01 y ***, p<0.001 en comparación con PBS.

La Figura 6A muestra los cambios cronológicos en títulos recíprocos de anticuerpos IgM en la sangre de ratas Lewis inmunizadas con un glucoconjugado Globo H-KLH de ejemplo (7.5 |jg y 25 |jg). La Figura 6B muestra los cambios cronológicos en títulos recíprocos de anticuerpos IgG en la sangre de ratas Lewis inmunizadas con un glucoconjugado Globo H-KLH de ejemplo (7.5 jg y 25 jg).

La Figura 7 muestra los títulos de anticuerpos IgM en ratones en respuesta a la relación de conjugación entre Globo H y KLH (0.17:1 y 0.07:1).

La Figura 8 ilustra la inmunogenicidad de ratones C57BL/6 que fueron inmunizados con PBS, glucoconjugado Globo H-KLH adyuvante de saponina (OBI-822 OBI-821) y adyuvante glucoconjugado Globo H-KLH adyuvante C34 (OBI-822 OBI-834). Los sueros se recolectaron el día 42 para el análisis ELISA para determinar la producción de anticuerpos anti-Globo H IgM e IgG. La Figura 8A muestra la producción de IgM. La Figura 8B muestra la producción de IgG. La administración subcutánea (SC) de glucoconjugado Globo H-KLH fue de 2 jg y el adyuvante fue de 20 jg .

La Figura 9 ilustra seis grupos de ratones hembra C57BL/6 inmunocompetentes (6-8 semanas de edad), libres de patógenos (SPF), que fueron inyectados con 5.0 * 106 en 0.1 mL de células de carcinoma de pulmón Lewis (LL/2, ATCC CRL-1642), singénico para ratones C57BL/6, se inyectó por vía subcutánea en la región abdominal hacia el lado lateral de ratones experimentales el día 16. Tres condiciones de prueba (solo PBS, adyuvante OBI-822 OBI-821 y adyuvante OBI-822 OBI-834) se administraron por vía subcutánea en 0.2 ml/ratón (a ambos lados del abdomen izquierdo y derecho, 0.1 ml/sitio) o intraperitonealmente en el volumen de dosificación de 10 ml/kg los días 0, 5, 11, 19, 29, 34 y 39. Se tomaron imágenes que incluyen tumor con todo el cuerpo después del sacrificio el día 42.

La Figura 10 ilustra el crecimiento del tumor LL/2 (línea celular de carcinoma de pulmón de Lewis) en ratones C57BL/6 inmunizados con glucoconjugado Globo H-KLH que se vacunaron por vía subcutánea con adyuvante PBS, OBI-822 OBI-821 y adyuvante OBI-822 OBI-834 los días 0, 5, 11, 19, 29, 34 y 39. Las células LL/2 (5.0 * 106 en 0.1 mL) se inyectaron por vía subcutánea en cada ratón el día 16. Los tamaños de los tumores se monitorearon los días 16, 19, 23, 26, 30, 34, 37, 40 y 42.

La Figura 11 ilustra la estructura química del derivado Globo H. La figura 11A ilustra el derivado Globo H [Fórmula química: C(56) H(91) N(5) O(33) S(1), adición de MW monoisotópico: 1393.5317 Da]. La Figura 11B ilustra las formas de pérdida neutra del derivado Globo H. Fórmula química 1: C(18) H(28) N(4) O(4) S(1), adición de MW monoisotópico: 396,1831 Da; Fórmula química 2: C(24) H(38) N(4) O(9) S(1), adición de MW monoisotópico: 558,2360 Da; Fórmula química 3: C(30) H(48) N(4) 0(14) S(1), adición de m W monoisotópico: 720.2888 Da; Fórmula química 4: C(36) H(58) N(4) 0(19) S(1), adición de MW monoisotópico: 882.3416 Da; Fórmula química 5: C(44) H(71) N(5) O(24) S(1), adición de MW monoisotópico: 1085.4210 Da.

La Figura 12 ilustra la estructura química del derivado de MMCCH. La Figura 12A ilustra la estructura química del derivado de MMCCH [Fórmula química: C(16) H(24) N(4) O(3) S(1), adición de MW monoisotópico: 352,1569 Da]. La Figura 12B ilustra el derivado de MMCCH desamidado [Fórmula química: C(16) H(22) N(2) O(4) S(1), adición de MW monoisotópico: 338.1300 Da].

La Figura 13 muestra un resumen de la identificación del péptido derivado de Globo H y MMCCH en el residuo de lisina.

La Figura 14 ilustra los detalles de identificación de péptidos conjugados con Globo-H en el residuo de lisina para la muestra 1 (1a LC-MS/MS) para KLH1 (A) y KLH2 (B).

La Figura 15 ilustra los detalles de identificación de péptidos conjugados con Globo-H en el residuo de lisina para la muestra 2 (1a LC-MS/MS) para KLH1 (A) y KLH2 (B).

La Figura 16 ilustra los detalles de identificación de péptidos conjugados con Globo-H en el residuo de lisina para la muestra 3 (1a LC-MS/MS) para KLH1 (A) y KLH2 (B).

La Figura 17 ilustra los detalles de identificación de péptidos conjugados con Globo-H en el residuo de lisina para la muestra 4 (1a LC-MS/MS) para KLH1 (A) y KLH2 (B).

La Figura 18 ilustra los detalles de identificación de péptidos conjugados con Globo-H en el residuo de lisina para la muestra 1 (2a LC-MS/MS) para KLH1 (A) y KLH2 (B).

La Figura 19 ilustra los detalles de identificación de péptidos conjugados con Globo-H en el residuo de lisina para la muestra 2 (2a LC-MS/MS) para KLH1 (A) y KLH2 (B).

La Figura 20 ilustra los detalles de identificación de péptidos conjugados con Globo-H en el residuo de lisina para la muestra 3 (2a LC-MS/MS) para KLH1 (A) y KLH2 (B).

La Figura 21 ilustra los detalles de identificación de péptidos conjugados con Globo-H en el residuo de lisina para la muestra 4 (2a LC-MS/MS) para KLH1 (A) y KLH2 (B).

La Figura 22 ilustra los detalles de identificación de péptidos conjugados con MMCCH en el residuo de lisina para la muestra 1 (1a LC-MS/MS) para KLH1 (A) y KLH2 (B).

La Figura 23 ilustra los detalles de identificación de péptidos conjugados con MMCCH en el residuo de lisina para la muestra 2 (1a LC-MS/MS) para KLH1 (A) y KLH2 (B).

La Figura 24 ilustra los detalles de identificación de péptidos conjugados con MMCCH en el residuo de lisina para la muestra 3 (1a LC-MS/MS) para KLH1 (A) y KLH2 (B).

La Figura 25 ilustra los detalles de identificación de péptidos conjugados con MMCCH en el residuo de lisina para la muestra 4 (1a LC-MS/MS) para KLH1 (A) y KLH2 (B).

La Figura 26 ilustra los detalles de identificación de péptidos conjugados con MMCCH en el residuo de lisina para la muestra 1 (2a LC-MS/ MS) para KLH1 (A) y KLH2 (B).

La Figura 27 ilustra los detalles de identificación de péptidos conjugados con MMCCH en el residuo de lisina para la muestra 2 (2a LC-MS/MS) para KLH1 (A) y KLH2 (B).

La Figura 28 ilustra los detalles de identificación de péptidos conjugados con MMCCH en el residuo de lisina para la muestra 3 (2a LC-MS/MS) para KLH1 (A) y KLH2 (B).

La Figura 29 ilustra los detalles de identificación de péptidos conjugados con MMCCH en el residuo de lisina para la muestra 4 (2a LC-MS/MS) para KLH1 (A) y KLH2 (B).

La Figura 30 ilustra el resumen de la identificación de sitios de lisina conjugada con Globo-H para (1a LC-MS / MS) para KLH1 (A) y KLH2 (B); (2a LC-MS/MS) para KLH1 (C) y KLH2 (D).

La Figura 31 ilustra el resumen de la identificación de sitios de lisina conjugada con MMCCH para (1a LC-MS/MS) para KLH1 (A) y KLH2 (B) y (2a LC-MS/MS) para KLH1 (C) y KLH2 (D).

La Figura 32 ilustra un resumen del análisis de conjugación Globo-H en la primera (A) y segunda (B) ejecuciones de LC-MS/MS.

La Figura 33 muestra un resumen de un ejemplo de identificación de péptido derivado de Globo H y MMCCH en residuos de histidina (H), asparagina (N), prolina (P), glutamina (Q) y arginina (R).

La Figura 34 ilustra los detalles de identificación de péptidos conjugados con Globo H y MMCCH en residuos de HNPQR para la muestra 1 (LC-MS/MS) para KLH1 (A) y KLH2 (B).

La Figura 35 ilustra los detalles de identificación de péptidos conjugados con Globo H y MMCCH en residuos HNPQR para la muestra 2 (LC-MS/MS) para KLH1 (A) y KLH2 (B).

La Figura 36 ilustra los detalles de identificación de péptidos conjugados con Globo H y MMCCH en residuos HNPQR para la muestra 3 (LC-MS/MS) para KLH1 (A) y KLH2 (B).

La Figura 37 ilustra los detalles de identificación de péptidos conjugados con Globo H y MMCCH en residuos de HNPQR para la muestra 4 (LC-MS/MS) para KLH1 (A) y KLH2 (B).

La Figura 38 ilustra un resumen de un ejemplo de análisis de derivados de Globo H y MMCCH sobre residuos de histidina (H), asparagina (N), prolina (P), glutamina (Q) y arginina (R).

Descripción detallada de la invención

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología e inmunología, que están dentro de la habilidad de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la literatura. Véase, por ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Antibodies: A Laboratory Manual, by Harlow and Lanes (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988); y Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weirand C. C. Blackwell, eds., 1986).

El uso de conjugados de carbohidratos sintéticos para provocar anticuerpos fue demostrado por primera vez por Goebel and Avery en 1929. (Goebel, W.F., and Avery, O.T., J. Exp. Med., 1929, 50, 521; Avery, O.T., and Goebel, W.F., J. Exp. Med., 1929, 50, 533.) Los carbohidratos se unieron a las proteínas transportadoras a través de glucósidos de bencendiazonio. La inmunización de conejos con los antígenos sintéticos generó anticuerpos policlonales. Otros investigadores (Allen, P.Z. and Goldstein, I.J., Biochemistry, 1967, 6, 3029; Rude, E. and Delius, M.M., Carbohydr. Res., 1968, 8, 219; Himmelspach, K., et al., Eur. J. Immunol., 1971, 1, 106; Fielder, R.J., et al., J. Immunol., 1970, 105, 265) desarrollaron técnicas similares para la conjugación de carbohidratos a vehículos de proteínas.

Los glucoconjugados pueden usarse en inmunoterapia activa generada a partir de vacunas para apuntar específicamente a agentes diana conocidos en células tumorales. La respuesta a los antígenos de carbohidratos normalmente no incluye el uso de células T, lo que ayudaría en el rechazo del tumor por parte del cuerpo. Si bien se cree que la probabilidad de rechazo completo del tumor como resultado de la vacunación con un conjugado es improbable, tales tratamientos aumentarán la vigilancia inmunológica y se puede reducir la recurrencia de nuevas colonias tumorales. (Dennis, J., Oxford Glycosystems Glyconews Second, 1992; Lloyd, K. O., in Immunotherapy of Cancer with Vaccines, 1993, New York Academy of Sciences, 50-58). Toyokuni y Singhal han descrito un glucoconjugado sintético (Toyokuni, T., et al., J. Am. Chem. Soc., 1994, 116, 395) que estimuló un título de IgG medible, un resultado que es significativo ya que una respuesta de IgG está generalmente asociada con el alistamiento de células T auxiliares.

Se demostró que una vacuna sintética Globo H en combinación con un adyuvante inmunológico induce principalmente anticuerpos IgM y, en menor medida, IgG en pacientes con cáncer de próstata y de mama metastásico. En un ensayo clínico de fase I, la vacuna también mostró una toxicidad mínima con reacciones cutáneas locales transitorias en el sitio de vacunación. (Gilewski T et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98: 3270-3275; Ragupathi G, et al. (1997) Angew Chem Int Ed 36: 125-128; Slovin S F et al (1997) Proc Natl Acad Sci Estados Unidos 96: 5710-5715). Los síntomas leves similares a la gripe que se han observado en algunos de los pacientes probablemente se asociaron con el efecto secundario de QS-21. Se ha informado que una vacuna pentavalente que contiene cinco antígenos de carbohidratos asociados a cáncer de próstata y cáncer de mama-Globo-H, GM2, STn, TF y Tn conjugados con la proteína vehículo modificada con maleimida KLH produce sueros anti-Globo H con títulos más altos de IgG que IgM en ensayos ELISA. (Zhu J. et al. (2009) J. Am. Chem. Soc. 131 (26): 9298-9303).

Por consiguiente, la presente divulgación está dirigida a compuestos inmunogénicos/terapéuticos, composiciones y/o composiciones de formulación farmacéutica dirigidas/mediadas por Globo H, así como a inmunoterapéuticos, vacunas, formas de dosificación, kits y métodos de fabricación, y tratamiento de los mismos.

El uso de la palabra "una" o "un" cuando se usa junto con el término "que comprende" en las reivindicaciones y/o la especificación puede significar "uno", pero también es coherente con el significado de "uno o más", "al menos uno" y "uno o más de uno".

A lo largo de esta solicitud, el término "aproximadamente" se usa para indicar que un valor incluye, por ejemplo, la variación inherente de error para un dispositivo de medición, el método empleado para determinar el valor o la variación que existe entre el estudio asignaturas. Por lo general, el término abarca aproximadamente o menos del 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 % o 20 % de variabilidad dependiendo de la situación.

Como se usa en el presente documento, el término "alquilo" se refiere a un hidrocarburo monovalente lineal o ramificado que contiene, a menos que se indique lo contrario, 1-20 átomos de carbono, por ejemplo, C1-C8 o C1-C4, que pueden estar sustituidos o no sustituidos. Ejemplos de alquilo incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, i-butilo y t-butilo.

El uso del término "o" en las reivindicaciones se usa para significar "y/o" a menos que se indique explícitamente que se refieren solo a alternativas o las alternativas son mutuamente excluyentes, aunque la divulgación respalda una definición que se refiere solo a alternativas y "y/o".

Como se usa en esta especificación y en la(s) reivindicación(es), las palabras "que comprende" (y cualquier forma de comprender, tal como "comprenden" y "comprende"), "tener" (y cualquier forma de tener, tal como" tienen" y "tiene"), "incluir" (y cualquier forma de incluir, como "incluye" e "incluyen") o "contener" (y cualquier forma de contener, como "contiene" y "contienen") son inclusivas o abiertas y no excluyen elementos o pasos del método adicionales no requeridos. Se contempla que cualquier realización discutida en esta especificación se puede implementar con respecto a cualquier método o composición de la invención, y viceversa. Además, las composiciones de la invención se pueden usar para lograr los métodos de la invención.

"Tratar" o "que trata" se refiere aquí como la administración de una composición terapéutica aun sujeto con el propósito de curar, aliviar, atenuar, remediar, prevenir o mejorar un trastorno, síntomas del trastorno, un estado de enfermedad secundario al trastorno, o predisposición hacia el trastorno.

Una "cantidad efectiva" es una cantidad de una composición terapéutica que es capaz de producir un resultado médicamente deseable como se describe aquí en un sujeto tratado. El resultado médicamente deseable puede ser objetivo (es decir, medible por alguna prueba o marcador) o subjetivo (es decir, el sujeto da una indicación o siente un efecto).

"Enfermedad susceptible de tratamiento con una composición terapéutica" como se menciona en el presente documento significa cualquier procedimiento, afecciones, trastornos, dolencias y/o enfermedades que pueden tratarse mediante la administración de las composiciones terapéuticas descritas en el presente documento.

Un "trastorno proliferativo" es uno en el que se producen demasiados de algún tipo de célula que da como resultado un deterioro de la salud. Un trastorno proliferativo puede ser benigno o maligno. Los trastornos proliferativos pueden incluir, por ejemplo, cáncer.

Como se usa en el presente documento, el "cáncer" que puede tratarse mediante las composiciones terapéuticas descritas en el presente documento incluye células con un estado de crecimiento anormal. Las células cancerosas pueden caracterizarse por la pérdida de mecanismos de control normales y, por lo tanto, pueden expandirse continuamente, invadir tejidos adyacentes, migrar a partes distantes del cuerpo y promover el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos de los cuales las células obtienen nutrientes. Como se usa en este documento, un cáncer puede ser maligno o benigno. El cáncer puede desarrollarse a partir de cualquier tejido dentro del cuerpo. A medida que las células crecen y se multiplican, forman una masa de tejido, llamada tumor. El término tumor puede incluir un crecimiento o masa anormal. Los tumores pueden ser cancerosos (malignos) o no cancerosos (benignos). Los tumores cancerosos pueden invadir los tejidos vecinos y extenderse por todo el cuerpo (metástasis). Sin embargo, los tumores benignos generalmente no invaden los tejidos vecinos y no se propagan por todo el cuerpo. El cáncer se puede dividir en los de la sangre y los tejidos formadores de sangre (leucemia y linfoma) y los tumores "sólidos". Los tumores "sólidos" pueden incluir carcinomas o sarcomas.

Los cánceres que pueden tratarse mediante las composiciones terapéuticas de la invención incluyen los clasificados por sitio incluyen el cáncer de la cavidad oral y la faringe (labio, lengua, glándula salival, suelo de la boca, encías y otra boca, nasofaringe, amígdalas, orofaringe), hipofaringe, otros orales/faríngeos); cánceres del sistema digestivo (esófago; estómago; intestino delgado; colon y recto; ano, canal anal y anorrecto; hígado; conducto biliar intrahepático; vesícula biliar; otros biliares; páncreas; retroperitoneo; peritoneo, epiplón y mesenterio; otros digestivos); cánceres del sistema respiratorio (cavidad nasal, oído medio y senos paranasales; laringe; pulmón y bronquios; pleura; tráquea, mediastino y otras vías respiratorias); cánceres del mesotelioma; huesos y articulaciones; y tejidos blandos, incluido el corazón; cánceres de piel, incluidos melanomas y otros cánceres de piel no epiteliales; sarcoma de Kaposi y cáncer de mama; cáncer del sistema genital femenino (cuello uterino; cuerpo uterino; útero, ovario; vagina; vulva; y otros genitales femeninos); cánceres del sistema genital masculino (glándula prostática; testículo; pene; y otros genitales masculinos); cánceres del sistema urinario (vejiga urinaria; riñón y pelvis renal; uréter; y otros urinarios); cánceres de ojo y órbita; cánceres del cerebro y del sistema nervioso (cerebro; y otro sistema nervioso); cánceres del sistema endocrino (glándula tiroides y otros endocrinos, incluido el timo); linfomas (enfermedad de Hodgkin y linfoma no Hodgkin), mieloma múltiple y leucemia (leucemia linfocítica, leucemia mieloide, leucemia monocítica y otras leucemias).

Otros cánceres, clasificados por tipo histológico, que pueden ser dianas adecuadas para las composiciones terapéuticas de acuerdo con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, neoplasma, maligno; Carcinoma, NOS; Carcinoma indiferenciado, NOS; Carcinoma de células gigantes y fusiformes; Carcinoma de células pequeñas, NOS; Carcinoma papilar, NOS; Carcinoma de células escamosas, NOS; Carcinoma linfoepitelial; Carcinoma basocelular, NOS; Carcinoma pilomatriz; Carcinoma de células transicionales, NOS; Carcinoma papilar de células de transición; Adenocarcinoma, NOS; Gastrinoma maligno; Colangiocarcinoma; Carcinoma hepatocelular, NOS; Combinado carcinoma hepatocelular y colangiocarcinoma; Adenocarcinoma trabecular; Carcinoma adenoide quístico; Adenocarcinoma en pólipo adenomatoso; Adenocarcinoma, poliposis coli familiar; Carcinoma sólido, NOS; Tumor carcinoide, maligno; Adenocarcinoma bronquioloalveolar; Adenocarcinoma papilar, NOS; Carcinoma cromófobo; Carcinoma acidófilo; Adenocarcinoma oxifílico; Carcinoma basófilo; Adenocarcinoma de células claras, NOS; Carcinoma de células granulares; Adenocarcinoma folicular, NOS; Adenocarcinoma papilar y folicular; Carcinoma esclerosante no encapsulante; Carcinoma cortical suprarrenal; Carcinoma endometroide; Carcinoma de apéndice de la piel; Adenocarcinoma apocrino; Adenocarcinoma sebáceo; Adenocarcinoma ceruminoso; Carcinoma mucoepidermoide; Cistadenocarcinoma, NOS; Cistadenocarcinoma papilar, NOS; Cistadenocarcinoma seroso papilar; Cistadenocarcinoma mucinoso, NOS; Adenocarcinoma mucinoso; Carcinoma de células en anillo de sello; Carcinoma ductal infiltrante; Carcinoma medular, NOS; Carcinoma lobular; Carcinoma inflamatorio; Enfermedad de Paget, mamaria; Carcinoma de células acinares; Carcinoma adenoescamoso; Adenocarcinoma con metaplasia escamosa; Timoma maligno; Tumor del estroma ovárico, maligno; Tecoma maligno; Tumor de células de la granulosa, maligno; Androblastoma maligno; Carcinoma de células de Sertoli; Tumor de células de Leydig, maligno; Tumor de células lipídicas, maligno; Paraganglioma maligno; Paraganglioma extramamario, maligno; Feocromocitoma; Glomangiosarcoma; Melanoma maligno, NOS; Melanoma amelanótico; Melanoma de diseminación superficial; Melanoma de Malig en nevo pigmentado gigante; Melanoma de células epitelioides; Nevo azul, maligno; Sarcoma, NOS; Fibrosarcoma, NOS; Histiocitoma fibroso, maligno; Mixosarcoma; Liposarcoma, NOS; Leiomiosarcoma, NOS; Rabdomiosarcoma, NOS; Rabdomiosarcoma embrionario; Rabdomiosarcoma alveolar; Sarcoma del estroma, NOS; Tumor mixto, maligno, NOS; Tumor mixto de Mullerian; Nefroblastoma; Hepatoblastoma; Carcinosarcoma, NOS; Mesenquimoma maligno; Tumor de Brenner, maligno; Tumor filodes maligno; Sarcoma sinovial, NOS; Mesotelioma maligno; Disgerminoma; Carcinoma embrionario, NOS; Teratoma maligno, NOS; Struma ovarii, maligno; Coriocarcinoma; Mesonefroma, maligno; Hemangiosarcoma; Hemangioendotelioma maligno; Sarcoma de Kaposi; Hemangiopericitoma maligno; Linfangiosarcoma; Osteosarcoma, NOS; Osteosarcoma yuxtacortical; Condrosarcoma, NOS; Condroblastoma maligno; Condrosarcoma mesenquimatoso; Tumor de células gigantes de hueso; Sarcoma de Ewing; Tumor odontogénico, maligno; Odontosarcoma ameloblástico; Ameloblastoma maligno; Fibrosarcoma ameloblástico; Pinealoma maligno; Cordoma; Glioma maligno; Ependimoma, NOS; Astrocitoma, NOS; Astrocitoma protoplasmático; Astrocitoma fibrilar; Astroblastoma; Glioblastoma, NOS; Oligodendroglioma, NOS; Oligodendroblastoma; Neuroectodérmico primitivo; Sarcoma cerebeloso, NOS; Ganglioneuroblastoma; Neuroblastoma, NOS; Retinoblastoma, NOS; Tumor neurogénico olfativo; Meningioma maligno; Neurofibrosarcoma; Neurilemmoma, maligno; Tumor de células granulares, maligno; Linfoma maligno, NOS; Enfermedad de Hodgkin, NOS; de Hodgkin; paragranuloma, NOS; Linfoma maligno, linfocítico pequeño; Linfoma maligno, de células grandes, difuso; Linfoma maligno, folicular, NOS; Micosis fungoide; Otros linfomas no Hodgkin especificados; Histiocitosis maligna; Mieloma múltiple; Sarcoma de mastocitos; Enfermedad inmunoproliferativa del intestino delgado; Leucemia, NOS; Leucemia linfoide, NOS; Leucemia de células plasmáticas; Eritroleucemia; Leucemia de células de linfosarcoma; Leucemia mieloide, NOS; Leucemia basofílica; Leucemia eosinofílica; Leucemia monocítica, NOS; Leucemia de mastocitos; Leucemia megacarioblástica; Sarcoma mieloide; y leucemia de células vellosas.

Los "cánceres epiteliales" tal como se definen en el presente documento se refieren a cáncer(s) que se desarrollan a partir del epitelio o tejidos relacionados en la piel, vísceras huecas y otros órganos. Los cánceres epiteliales incluyen, entre otros, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer bucal, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer de nasofaringe, cáncer dérmico, cáncer renal, tumor cerebral, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de endometrio, cáncer intestinal, cáncer pancreático y cáncer de vejiga.

"Paciente" o "Sujeto", como se usa en el presente documento, se refiere a un sujeto mamífero diagnosticado o sospechoso de tener o desarrollar una enfermedad proliferativa tal como cáncer. Pacientes de ejemplo pueden ser humanos, simios, perros, cerdos, vacas, gatos, caballos, cabras, ovejas, roedores y otros mamíferos que pueden beneficiarse del desarrollo de enfermedades proliferativas como el cáncer.

Como se usa en el presente documento, "sustancialmente purificado" o "sustancialmente aislado" se refiere a una molécula (por ejemplo, un compuesto) en un estado en el que está separada sustancialmente de todas las demás moléculas normalmente asociadas con ella en su estado nativo. Preferiblemente, una molécula sustancialmente purificada es la especie predominante presente en una preparación. Particularmente, una molécula sustancialmente purificada puede tener más de 60 % de libertad, preferiblemente 75 % de libertad, más preferiblemente 90 % de libertad, y lo más preferiblemente 95 % de libertad de las otras moléculas (excluyendo el solvente) presentes en la mezcla natural. El término "sustancialmente purificado" o "sustancialmente aislado" no pretende incluir moléculas o sustancias presentes en su estado nativo. En ciertas realizaciones, el término "sustancialmente purificado" o "sustancialmente aislado" incluye purificar una unidad estructural KLH de otra unidad estructural KLH (por ejemplo, sustancialmente purificar o aislar sustancialmente una unidad estructural dímero de KLH de una unidad estructural trímero de KLH). En otra realización, el término "sustancialmente purificado" o "sustancialmente aislado" no incluye la purificación de una unidad estructural KLH de otra unidad estructural KLH (por ejemplo, los dímeros de KLH y los trímeros KLH se incluyen en una composición sustancialmente purificada o sustancialmente aislada) pero las impurezas se eliminan sustancialmente.

En el presente documento se hace referencia a "administrar" como proporcionar una composición terapéutica de la invención a un paciente. A modo de ejemplo y sin limitación, la administración de la composición, por ejemplo, inyección, puede realizarse por inyección intravenosa (i.v.), inyección subcutánea (s.c.), inyección intradérmica (i.d.), inyección intraperitoneal (i.p.) o inyección intramuscular (i.m.). Se pueden emplear una o más de tales rutas. La administración parenteral puede ser, por ejemplo, mediante inyección en bolo o mediante perfusión gradual a lo largo del tiempo. Alternativamente, o simultáneamente, la administración puede ser por vía oral. Además, la administración también puede ser por deposición quirúrgica de un bolo o posicionamiento de un dispositivo médico.

"Un paciente que lo necesita" se denomina en este documento como un paciente diagnosticado o sospechoso de tener un trastorno proliferativo. En una realización, el paciente tiene o es probable que desarrolle cáncer.

Como se usa en el presente documento, el término "antígeno" se define como cualquier sustancia capaz de provocar una respuesta inmune, con o sin la ayuda de un vehículo proteico y/o un adyuvante. Preferiblemente, el antígeno de las composiciones de la invención incluye un carbohidrato y más preferiblemente antígeno de glicano y lo más preferiblemente una unidad estructural Globo H.

Como se usa en el presente documento, el término "inmunogenicidad" se refiere a la capacidad de un inmunógeno, antígeno o vacuna para estimular una respuesta inmune.

Como se usa en el presente documento, el término "inmunoterapia" se refiere a una serie de estrategias de tratamiento basadas en el concepto de modular el sistema inmunitario para lograr un objetivo profiláctico y/o terapéutico.

Como se usa en el presente documento, el término "epítopo" se define como las partes de una molécula de antígeno que contactan con el sitio de enlace al antígeno de un anticuerpo o un receptor de células T.

Las "composiciones terapéuticas" de la invención incluyen "conjugados inmunogénicos y/o conjugados terapéuticos y/o "anticuerpos terapéuticos". Los conjugados terapéuticos incluyen al menos un antígeno enlazado a un vehículo. Preferiblemente, el enlace del conjugado terapéutico es covalente. En una realización del conjugado terapéutico, el antígeno es un glicano tal como la unidad estructural Globo H, y el vehículo es una unidad estructural KLH y/o una subunidad de unidad estructural KLH. Como tal, el término conjugado terapéutico abarca una o más subunidades de unidad estructural KLH enlazadas a una o más unidades estructurales Globo H. En una realización, el término conjugado terapéutico abarca una o más unidades estructurales KLH enlazadas a aproximadamente o al menos 1, 10, 102 o 103 unidades estructurales Globo H. En otra realización, el término conjugado terapéutico abarca una o más unidades estructurales KLH vinculados a aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160 o más unidades estructurales Globo H. Otra realización abarca dímeros, trímeros, tetrámeros, hexámeros o hexámeros aislados de tales subunidades de unidad estructural KLH enlazadas a Globo H, o combinaciones de las mismas.

En una realización, el conjugado terapéutico es: Fuca(1^2) Galp(1^-3) GalNAcp(1^-3) Gala(1^4) Galp(1^-4) Glup(1-O-etilhidrazil-1-carbonil-ciclohexil-4-(metil-N-maleimido)-3-(tiobutil-imidil)-hemocianina de lapa de ojo de cerradura (KLH) también conocida como OBI-822.

Los "anticuerpos terapéuticos" se definen como anticuerpos (como se define adicionalmente más adelante) que se unen específicamente a los conjugados terapéuticos de la invención y preferiblemente a la porción de la unidad estructural Globo H de los conjugados terapéuticos.

Como se usa en este documento, el término "vacuna" se refiere a una composición terapéutica que contiene un conjugado terapéutico que se usa para conferir inmunidad contra una enfermedad asociada con el antígeno. Las vacunas contra el cáncer están diseñadas para aumentar la capacidad natural del cuerpo para protegerse, a través del sistema inmunitario, de los peligros que representan las células dañadas o anormales, como las células cancerosas. Una respuesta inmune protectora es aquella que reduce la gravedad de la enfermedad, que incluye, entre otros, la prevención de la enfermedad, el retraso en la aparición de la enfermedad, la disminución de la gravedad de los síntomas, la disminución de la morbilidad y la mortalidad retrasada. Preferiblemente, una vacuna es capaz de activar tanto la respuesta inmune humoral (por ejemplo, la estimulación de la producción de anticuerpos por los linfocitos B) como la respuesta inmune celular (por ejemplo, una respuesta inmune mediada por los linfocitos T y/u otras células, como las células NKy macrófagos). Se han desarrollado ensayos estándar para determinar la respuesta inmune, como el ensayo de inmunosorción ligada a enzimas (ELISA), citometría de flujo, ensayo de proliferación celular, ensayos CTL y ensayos ADCC/CDC.

Como se usa en el presente documento, el término "glicano" se refiere a un polisacárido u oligosacárido. El glicano también se usa en el presente documento para referirse a la porción de carbohidrato de un glucoconjugado, tal como una glucoproteína, glucolípido, glucopéptido, glucoproteoma, peptidoglucano, lipopolisacárido o un proteoglicano. Los glicanos generalmente consisten únicamente en enlaces O-glucosídicos entre monosacáridos. Por ejemplo, la celulosa es un glicano (o más específicamente un glucano) compuesto de D-glucosa enlazada a p-1,4, y la quitina es un glicano compuesto de N-acetil-D-glucosamina enlazada a p-1,4. Los glicanos pueden ser homo o heteropolímeros de residuos de monosacáridos, y pueden ser lineales o ramificados. Los glucanos se pueden encontrar enlazados a proteínas como en glucoproteínas y proteoglucanos. Generalmente se encuentran en la superficie exterior de las células. Los glucanos enlazados a O y N son muy comunes en eucariotas, pero también se pueden encontrar, aunque con menos frecuencia, en procariotas. Los glicanos enlazados a N se encuentran enlazados al nitrógeno del grupo R(N) de asparagina en el secuón. El secuón es una secuencia Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, donde X es cualquier aminoácido excepto pralina. El glicano preferido es una unidad estructural Globo H.

El Globo H es un hexasacárido, que es miembro de una familia de carbohidratos antigénicos que se expresan altamente en diversos tipos de cánceres, especialmente cánceres de mama, próstata, páncreas, estómago, ovario, colon y pulmón. En realizaciones ilustrativas, ciertos pacientes no exhibieron niveles de anticuerpo anti-Globo H en el tiempo cero, y después de la inmunización con la composición terapéutica de la invención se detectaron títulos altos. En otras realizaciones ilustrativas, ciertos pacientes exhibieron niveles de anticuerpo anti-Globo H en el tiempo cero, y después de la inmunización con la composición terapéutica de la invención se detectaron títulos altos. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-Globo H se expresa en la superficie de la célula cancerosa como un glicolípido y posiblemente como una glicoproteína. En otras realizaciones, el suero de pacientes con cáncer de mama contenía altos niveles de anticuerpos contra el epítopo Globo H. En ciertas realizaciones, este epítopo también está dirigido por los anticuerpos monoclonales Mbrl, VK9 y anti-SSEA-3 en estudios de inmunohistoquímica. Aunque ciertos tejidos normales también reaccionan con Mbrl, incluidos el tejido normal de mama, páncreas, intestino delgado y próstata, el antígeno en estos tejidos se localiza predominantemente en los límites secretores donde el acceso al sistema inmunitario está restringido.

La "unidad estructural Globo H" se define aquí como un glicano (es decir, una molécula que contiene una unidad estructural azúcar) que es Globo H o un fragmento o análogo del mismo. Globo H es un glicano que contiene el epítopo de hexasacárido (Fuc a 1 ^ 2 Gal p 1 ^ 3 GalNAc p 1 ^ 3 Gal a 1 ^ 4 Gal p 1 ^ 4 Glc), y opcionalmente, una unidad estructural no azúcar. Su fragmento es un glicano que contiene un fragmento del epítopo de hexasacárido y, si corresponde, la unidad estructural no azúcar. Estos oligosacáridos se pueden preparar por métodos de rutina. (Véase Huang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 15-20 (2006)). Si se desea, se pueden vincular a una unidad estructural no azúcar. La Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 12/485,546 se refiere a un método para producir anticuerpos específicos para Globo H o su fragmento administrando a un mamífero no humano (por ejemplo, ratón, conejo, cabra, oveja o caballo) la composición inmune descrita anteriormente y aislando del anticuerpo de mamífero que se une a Globo H o su fragmento.

Los análogos de Globo H pueden generarse usando microarreglos de glicanos e incluyen los descritos en Wang et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2008 August 19; 105(33): 11661-11666 y se muestran en la Figura 1.

Los análogos de Globo H se unen preferiblemente a los anticuerpos VK-9, Mbrl y anti-SSEA-3. Preferiblemente, los análogos de Globo H se unen con una constante de disociación particular (Kd,suP). La isoterma de Langmuir puede usarse para analizar las curvas de enlace para generar las constantes de disociación en superficie (Kd,suP). En las condiciones de equilibrio durante la incubación, la fluorescencia media de los puntos replicados (Fobs) se puede describir mediante:

F obs — F máx[/"3]/(K D ,su p [P ] )

donde Fmax es la intensidad máxima de fluorescencia, una medida de la cantidad de carbohidratos activos en la superficie, [P] es la concentración total de anticuerpos y Kd,suP es la constante de disociación de equilibrio para los carbohidratos de superficie y el anticuerpo. Como se describe en Wang et al. En algunas realizaciones, el análogo preferido (Kd,sup) de los análogos de Globo H es al menos aproximadamente 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5 o 1.6 nM con respecto a los anticuerpos VK-9, Mbrl y anti-SSEA-3 descritos en Wang et al.

La "hemocianina de lapa de ojo de cerradura" (KLH) es una metaloproteína grande, de múltiples subunidades, vehículo de oxígeno que se encuentra en la hemolinfa de la lapa gigante californiana, Megathura crenulata. KLH es una proteína glucosilada heterogénea que consiste en subunidades con un peso molecular de aproximadamente 350.000 a aproximadamente 390.000 en agregados con pesos moleculares de aproximadamente 400 kDa (por ejemplo, un monómero KLH) a aproximadamente 8000 kDa (por ejemplo, un didecámero de KLH). Cada dominio de una subunidad KLH contiene dos átomos de cobre que unen una sola molécula de oxígeno. Cuando el oxígeno se une a la hemocianina, la molécula adquiere un distintivo color azul opalescente transparente. En ciertas realizaciones, la proteína KLH es potencialmente inmunogénica pero segura en humanos. En ciertas realizaciones, KLH puede purificarse de la hemolinfa de Megathura crenulata mediante una serie de pasos que típicamente incluyen precipitación con sulfato de amonio y diálisis, y puede implicar purificación cromatográfica para obtener la pureza más alta. En ciertas realizaciones, la purificación de KLH también puede incluir la eliminación de endotoxinas, pero este paso puede ser innecesario porque la endotoxina puede servir como adyuvante cuando se inyecta para la producción de anticuerpos. Preferiblemente, una preparación de KLH de alta calidad con el color azul opalescente claro es el mejor indicador de la solubilidad de KLH. En ciertas realizaciones, las unidades monoméricas de KLH se ensamblan en un multímero grande (decámero o didecámero) con un peso molecular total de aproximadamente 4.000 kDa a 8.000 kDa. La "unidad estructural de hemocianina de lapa de ojo de cerradura" o "unidad estructural de KLH" se define en el presente documento como una proteína KLH1 (SEQ ID NO. 1) o KLH2 (SEQ ID NO. 2) o una proteína sustancialmente idéntica a la misma o una mezcla de las mismas. “Sustancialmente idéntico” en este contexto significa que cada unidad estructural KLH tiene una secuencia amino al menos, aproximadamente o exactamente: 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 77, 76 o 75 por ciento idéntico al de KLH de tipo salvaje nativo. En ciertas realizaciones, la KLH de la invención tiene una actividad inmunogénica potenciada, particularmente una actividad antitumoral potenciada. En ciertas realizaciones, la KLH en la composición de la presente invención comprende una subunidad intacta, no degradada de aproximadamente 400.000 en peso molecular. En otras realizaciones, la KLH de la invención comprende multímeros de KLH superiores.

En ciertas realizaciones, los multímeros de KLH superiores tienen pesos moleculares de aproximadamente 8-10 millones con coeficientes de sedimentación de aproximadamente 92-107S. La cantidad de multímeros de KLH más altos presentes se basa en análisis de equilibrio de sedimentación y/o ultracentrifugación de velocidad de sedimentación. En otras realizaciones, la KLH de la invención demuestra una actividad inmunogénica potenciada, particularmente una actividad antitumoral potenciada. La actividad inmunogénica mejorada se observa, por ejemplo, pero sin limitación, (a) con inyección de KLH (sin adyuvante), (b) con KLH usado como adyuvante, (c) con KLH usado como inmunógeno vehículo para haptenos o débilmente inmunogénico antígenos, y (d) con KLH usado como agente antitumoral. La composición de KLH de la invención exhibe una actividad antitumoral mejorada para muchos tumores, que incluyen, pero no se limitan a, tumores de vejiga, mama, ovario, etc. En ciertas realizaciones, dos unidades estructurales de KLH pueden formar un dímero a través de un enlace covalente entre monómeros de KLH. Sin estar limitado por la teoría, se cree que el enlace covalente entre las unidades estructurales KLH es a través de un enlace disulfuro. En ciertas realizaciones, dos o más unidades estructurales KLH pueden formar un dímero, trímero, tetrámero, pentámero, hexámero, etc. a través de un enlace covalente entre monómeros, dímeros, trímeros, etc. de KLH. Sin estar limitado por la teoría, se cree que el covalente El enlace entre las unidades estructurales KLH es a través de un enlace disulfuro.

Hay una variedad de métodos para unir una unidad estructural KLH a un antígeno, que incluyen conjugación directa y conjugación con un grupo enlazador bifuncional tal como 4-(4-N-maleimidometil)cidohexano-1-carboxilhidrazida (MMCCH). Dichas técnicas de enlace se describen en la Patente de los Estados Unidos No. 6,544,952. En algunas realizaciones, para preparar los conjugados terapéuticos de la invención, por ejemplo, el glucósido de alilo Globo H se convierte en un aldehído mediante ozonólisis y el grupo aldehído se une a los grupos NH en el reticulador MMCCH, dando Globo H-MMCCH; la proteína transportadora, KLH, se somete a tiolación para producir KLH-SH; y los grupos sulfhidrilo en KLH tiolada se unen luego al grupo maleimida en el MMCCH, produciendo conjugados Globo H-KLH.

En una realización, el glucósido de alilo Globo H se prepara mediante síntesis química. También se usa un reactivo tiolante, 2-iminotiolano y KLH de grado cGMP y un enlazador 4-(4-N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilhidrazida (MMCCH). En algunas realizaciones, se llevan a cabo los siguientes pasos: (1) Conversión de glucósido de alilo de Globo H en el aldehído de Globo H; (2) Acoplamiento de Globo H-aldehído con MMCCH a Globo H-MMCCH, por separado; (3) tiolación química de KLH; (4) Conjugación de Globo H-MMCCH con la KLH tiolada; y (5) Purificación del glucoconjugado Globo H-KLH (OBI-822). La ruta de conjugación de la subunidad Globo H-KLH se muestra en la Figura 2A.

En ciertas realizaciones, durante la conjugación de una proteína de la unidad estructural Globo H con una unidad estructural KLH, una proteína de la unidad estructural KLH en ciertas realizaciones muestra una reducción en el peso molecular en comparación con la molécula intacta, preferiblemente debido a la disociación de la subunidad de la unidad estructural Globo H. En otras realizaciones, los métodos de conjugación descritos en el presente documento dan como resultado una disociación de la subunidad KLH no informada previamente. Si bien no se desea limitarse a ninguna teoría en particular, se prevé que el alto nivel de glucosilación de los conjugados de la subunidad de la fracción Globo H-KLH de la invención da como resultado la formación de enlaces de hidrógeno entre las partes Globo H. Como tal, en ciertas realizaciones, las fuerzas de Van Der Waals y las interacciones hidrófobas entre las subunidades de la unidad estructural KLH son desplazadas por el enlace de hidrógeno Globo H y esto conduce a la separación de la subunidad de la unidad estructural KLH. Después de la conjugación, las subunidades de la unidad estructural KLH de un conjugado de la unidad estructural Globo H-KLH se agregan preferiblemente para formar nuevos monómeros, dímeros, trímeros, tetrámeros, pentámeros, hexámeros o cualquier combinación de los mismos. Los conjugados terapéuticos de ejemplo de la fracción Globo H-KLH, con una relación epítopo/vehículo inesperadamente grande, tienen atributos inmunogénicos superiores sorprendentes e inesperados. En ciertas realizaciones, las unidades estructurales Globo H se conjugan con lisinas en KLH1 y KLH2. En otras realizaciones, las unidades estructurales Globo H no se conjugan con lisinas en KLH1 y KLH2. En ciertas realizaciones, los sitios de lisina conjugada con Globo H se encuentran conservados en el análisis por mapeo de péptidos que sugiere que la composición de glucoconjugado Globo H-KLH es única en su estructura.

En una realización, las composiciones terapéuticas de la invención incluyen una o más subunidades de unidad estructural KLH en las que al menos una de tales subunidades se conjuga al menos, aproximadamente o exactamente 1, 10, 100 o 1000 veces: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ,30 , 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54,55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 , 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104 , 105, 106, 107, 108,109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126,127, 128, 129, 130, 131 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144,145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157 , 158, 159 o 160 o más unidades estructurales Globo H.

Los inventores encontraron usando análisis espectrométrico de masas que las unidades estructurales Globo H están conjugadas con residuos de lisina de KLH. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, se prefiere que las unidades estructurales Globo H se conjuguen con residuos de lisina.

En una realización, hay un total de exactamente o aproximadamente 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160 residuos de lisina totales por KLH subunidad de la mitad. En otra realización, hay exactamente o aproximadamente 150 o 156 residuos de lisina por subunidad de unidad estructural KLH. En otra realización, hay exactamente o aproximadamente 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 8081, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 o 110 sitios de conjugación de lisina en cada subunidad de la unidad estructural KLH disponible para unirse o realmente unirse a una unidad estructural Globo H. En otra realización, hay 62, 66, 67, 68, 70, 72, 76, 86, 87, 88, 90, 92, 93, 100 de dichos sitios de conjugación de lisina en cada subunidad de la unidad estructural KLH. Los sitios de conjugación de lisina son aquellos residuos de lisina en la unidad estructural KLH que están disponibles para unirse o realmente unirse a una unidad estructural Globo H y/o un enlazador a una unidad estructural Globo H tal como, por ejemplo, un enlazador MMCCH.

En ciertas realizaciones terapéuticas que contienen una mezcla de subunidades de unidad estructural (por ejemplo, KLH1 y KLH2 o variantes de las mismas), la lisina total disponible (para ambas subunidades) como se cuenta entre los diferentes tipos de subunidades y puede ser o es exactamente aproximadamente 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309 o 310 en número. En tales realizaciones, hay o puede haber exactamente o aproximadamente 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159 o 160 sitios de conjugación de lisina juntos a través de las diferentes subunidades (por ejemplo, KLH1 y KLH2 o variantes de los mismos). En otras de tales realizaciones, hay 136, 137, 141, 140, 143, 147 o 155 sitios de conjugación de lisina.

En una realización más preferida hay 136, 137, 140, 141, 143, 147 o 155 y sitios de conjugación de lisina entre los 306 residuos de lisina totales en KLH1/KLH2.

En ciertas realizaciones, las composiciones terapéuticas de la invención contienen una mezcla de conjugados de la subunidad del grupo KLH-grupo Globo H en donde dichos conjugados permanecen monómeros o forman dímeros, trímeros, tetrámeros, pentámeros, hexámeros o cualquier combinación de los mismos. En otra realización, las composiciones terapéuticas de la invención incluyen monómeros, dímeros, trímeros o tetrámeros conjugados de la subunidad de la unidad estructural KLH-subunidad de la unidad estructural Globo H conjugad. En una realización adicional, las composiciones terapéuticas de la invención incluyen solo dímeros y trímeros conjugados de la subunidad de la unidad estructural KLH- unidad estructural Globo H.

En otra realización, las composiciones terapéuticas contienen al menos dos subunidades de unidad estructural KLH en donde cada una de las dos subunidades de unidad estructural KLH está enlazada a diferentes glicanos. Otros antígenos de glucano asociados a tumores que se pueden unir a las subunidades de la unidad estructural KLH pueden incluir, entre otros, GM2, GD2, GD3, fucosilo, GM1, sTn, sialil-Lewisx, Lewisx, sialil Lewisa, Lewisa, sTn, TF, ácido polisialico, Lewisy, mucinas, antígeno T y similares. Solo en algunas realizaciones, al menos o aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 por ciento de las subunidades de la unidad estructural KLH en una composición terapéutica están enlazadas a una unidad estructural Globo H mientras que las unidades estructurales KLH restantes en la composición terapéutica están enlazadas a otros antígenos de glucano asociados a tumores.

Como se usa en el presente documento, la "relación epítopo/vehículo" en relación con los conjugados terapéuticos descritos en el presente documento se refiere, por ejemplo, a la relación de los epítopos antigénicos con las moléculas vehículos en un conjugado terapéutico. Preferiblemente, se refiere a la relación de las unidades estructurales Globo H con las unidades estructurales KLH. Lo más preferiblemente, la relación epítopo/vehículo de un conjugado terapéutico se calcula usando la siguiente fórmula=(peso real de la unidad estructural Globo H/peso molecular de la unidad estructural Globo H)/(peso real de la unidad estructural KLH/peso molecular de la unidad estructural KLH). Las relaciones epítopo/vehículo son fácilmente determinables por los expertos en la materia. Preferiblemente, los pesos de Globo H se determinan, por ejemplo, mediante cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento con detección amperométrica pulsada (HPAEC-PAD).

Preferentemente, las relaciones epítopo/vehículo de los conjugados terapéuticos de la invención son aproximadamente, al menos o exactamente: 1,10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1025, 1050, 1075, 1100, 1125, 1150, 1175, 1200, 1225, 1250, 1275, 1300, 1325, 1350, 1375, 1400, 1425, 1450, 1475, 1500, 1525, 1550, 1575, 1600, 1625, 1650, 1675, 1700, 1725, 1750, 1775, 1800, 1825, 1850, 1875, 1900, 1925, 1950, 1975, 2000, 2025, 2050, 2075, 2100, 2125, 2150, 21752200, 2225, 2250, 2275, 2300, 2325, 2350, 2375, 2400, 2425, 2450, 2475, 2500, 2525, 2550, 2575, 2600, 2625, 2650, 2675, 2700, 2725, 2750, 2775, 2800,2825, 2850, 2875, 2900, 2925, 2950, 2975 o 3000.

En una realización, las composiciones terapéuticas de la invención incluyen una mezcla de conjugados terapéuticos que tienen un rango de relaciones epítopo/vehículo. En una realización, el rango, las relaciones media o mediana de epítopo/vehículo de los conjugados terapéuticos en la composición terapéutica es de aproximadamente 10 a aproximadamente 3200, de aproximadamente 800 a aproximadamente 2500, de aproximadamente 1000 a aproximadamente 2000, de aproximadamente 1250 a aproximadamente 1750 o aproximadamente 1400 a aproximadamente 1600. En otra realización, el rango, las relaciones media o mediana de epítopo/vehículo de los conjugados terapéuticos en la composición terapéutica es de aproximadamente 10 a aproximadamente 150, de aproximadamente 40 a aproximadamente 125, de aproximadamente 50 a aproximadamente 100, aproximadamente 62 a aproximadamente 87 o aproximadamente 70 a aproximadamente 80. En otra realización, el rango, las relaciones media o mediana de epítopo/vehículo de los conjugados terapéuticos en la composición terapéutica es de aproximadamente 20 a aproximadamente 300, de aproximadamente 80 a aproximadamente 250, de aproximadamente 100 a aproximadamente 200, aproximadamente 125 a aproximadamente 175 o aproximadamente 140 a aproximadamente 160. En otra realización, el rango, las relaciones media o mediana de epítopo/vehículo de los conjugados terapéuticos en la composición terapéutica es de aproximadamente 30 a aproximadamente 450, de aproximadamente 120 a aproximadamente 375, alrededor de 150 para aproximadamente 300, aproximadamente 185 a aproximadamente 260 o aproximadamente 210 a aproximadamente 240. En algunas composiciones farmacéuticas al menos o aproximadamente 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98, 99, o 100 % de los conjugados terapéuticos existen como monómeros, o como dímeros, trímeros, tetrámeros, pentámeros, hexámeros o combinaciones de los mismos.

Anticuerpos para los conjugados terapéuticos

En ciertas realizaciones ilustrativas, la invención también abarca anticuerpos terapéuticos aislados, que se unen específicamente a los conjugados terapéuticos descritos aquí con afinidad, así como su uso en el tratamiento y/o diagnóstico de enfermedades proliferativas.

Como se usa en el presente documento, los términos "anticuerpo" y "anticuerpos" (inmunoglobulinas) abarcan anticuerpos monoclonales (que incluyen anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos camelizados, anticuerpos quiméricos, Fvs de cadena sencilla (scFv), anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos de dominio único, anticuerpos de dominio, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos de anticuerpos que exhiben la actividad biológica deseada, Fvs enlazados por disulfuro (sdFv) y anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id) (incluidos, por ejemplo, anticuerpos anti-Id para anticuerpos de la invención), intracuerpos y fragmentos de enlace a epítopos de cualquiera de los anteriores. En particular, los anticuerpos incluyen moléculas de inmunoglobulina y fragmentos inmunológicamente activos de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de enlace al antígeno. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase.

"Afinidad" de un anticuerpo para un epítopo, por ejemplo, la unidad estructural Globo H de un conjugado terapéutico, para ser utilizado en el tratamiento o tratamientos descritos en este documento es un término bien entendido en la técnica y significa la extensión o la fuerza, de enlace del anticuerpo al epítopo. La afinidad puede medirse y/o expresarse de varias maneras conocidas en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, constante de disociación de equilibrio (KD o Kd), constante de disociación de equilibrio aparente (KD' o Kd') e IC50 (cantidad necesario para efectuar una inhibición del 50 % en un ensayo de competición). Se entiende que, para los fines de esta invención, una afinidad es una afinidad promedio para una población dada de anticuerpos que se unen a un epítopo. Los valores de KD' descritos aquí en términos de mg de IgG por ml o mg/ml indican mg de Ig por ml de suero, aunque se puede usar plasma. Cuando la afinidad de anticuerpos se utiliza como base para la administración de los métodos de tratamiento descritos en este documento, o la selección de los métodos de tratamiento descritos en este documento, la afinidad de anticuerpos se puede medir antes y/o durante el tratamiento, y los valores obtenidos pueden ser utilizados por un médico para evaluar si un paciente humano es un candidato apropiado para el tratamiento.

Como se usa en el presente documento, el término "enlace específico" se refiere a la interacción entre pares de enlaces (por ejemplo, un anticuerpo y un antígeno). En varios casos, el enlace específico puede realizarse mediante una constante de afinidad de al menos o aproximadamente 10'6 mol/litro, aproximadamente 10'7 mol/litro, o aproximadamente 10'8 mol/litro, o menos.

Los anticuerpos de ejemplo contra el Globo H pueden prepararse recogiendo fluido corporal del sujeto inmunizado examinado para el aumento de anticuerpos deseados tales como el suero, y separando el suero de la sangre mediante cualquier método convencional.

Los anticuerpos surgen generalmente mediante inyecciones múltiples del antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante con una proteína que es inmunogénica en la especie por inmunizar, por ejemplo, la hemocianina de lapa de ojo de cerradura.

Los métodos para inmunizar animales con antígenos son conocidos en la técnica. La inyección intraperitoneal o la inyección subcutánea de antígenos es un método estándar para la inmunización de mamíferos. Más específicamente, los antígenos pueden diluirse y suspenderse en una cantidad apropiada de solución salina regulada con fosfato (PBS), solución salina fisiológica, etc. Si se desea, la suspensión de antígeno se puede mezclar con una cantidad apropiada de un adyuvante, y luego administrarse al sujeto.

En ciertas realizaciones, los sujetos se pueden estimular hasta la meseta de titulación mediante varias administraciones de antígeno mezclado con una cantidad apropiada de adyuvante. También se puede usar un vehículo apropiado para la inmunización. Después de la inmunización como se indicó anteriormente, se examina el suero mediante un método para detectar un aumento en la cantidad de anticuerpos deseados.

Ensayos biológicos

En una realización, cuando se administra a un paciente, las composiciones terapéuticas que contienen conjugados terapéuticos de la invención pueden inducir títulos de anticuerpos anti-Globo H al menos o aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 50, 100, 250, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000 o 5000 veces mayor que el mismo título de anticuerpos anti-Globo H antes de la administración (es decir, un título de referencia previo al tratamiento) en el mismo experimento. En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-Globo H son anticuerpos IgM. En otra realización, los anticuerpos anti-Globo H son anticuerpos IgG.

Las composiciones terapéuticas de la invención son capaces de inducir respuestas humorales y celulares en un sujeto. En ciertas realizaciones, la composición de vacuna de la invención induce la producción de anticuerpos IgG e IgM específicos de la fracción Globo H y la expansión de células B y células T (por ejemplo, células T CD3+, células T CD4+ y/o células T CD8+). Típicamente, estas respuestas inmunes ocurren cronológicamente después de la administración. En un ejemplo particular, después de la administración, la producción de células B aparece aproximadamente a los 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30 o 60 días, seguida de la producción de anticuerpos IgG e IgM aproximadamente al día 10, 20, 30, 60 o 90 y posterior producción de células T aproximadamente a los días 24, 30, 40, 50, 60, 90, 120, 150 o 180. La composición de la vacuna de la invención proporciona potencialmente un inmunológico a largo plazo efecto protector que podría prevenir el crecimiento de pequeñas cantidades de células cancerosas, por lo que es ideal para una enfermedad residual mínima a fin de lograr la estabilización de la enfermedad y la mejora de la supervivencia.

"Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos" y "ADCC" se refieren a una reacción mediada por células en donde las células citotóxicas no específicas (por ejemplo, células Asesinas Naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) reconocen el anticuerpo enlazado en una célula diana y posteriormente causan lisis de la célula diana. En una realización, tales células son células humanas. Si bien no desean limitarse a ningún mecanismo de acción particular, estas células citotóxicas que median en ADCC generalmente expresan receptores Fc (FcR). Las células primarias para mediar las células ADCC, NK, expresan FcyRIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII, FcyRIII y/o FcyRIV. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9: 457-92 (1991). Para evaluar la actividad ADCC de una molécula, puede realizarse un ensayo ADCC in vitro, como el descrito en la Patente de los Estados Unidos No 5,500,362 o 5,821,337. Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células asesinas naturales (NK). Alternativamente, o adicionalmente, la actividad ADCC de los conjugados terapéuticos de la invención puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal como el descrito en Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (Estados Unidos), 95: 652-656 (1998).

En ciertas realizaciones, la administración de la composición farmacéutica puede generar una respuesta inmune, que incluye la generación de anticuerpos que se unen específicamente a Globo H. En ciertas realizaciones, los anticuerpos se desarrollan para atacar a uno o más de GloboH expresados en la superficie de células cancerosas y desencadenan CDC y/o ADCC para matar estas células. En ciertas realizaciones, los anticuerpos incluyen predominantemente anticuerpos IgG. En ciertas realizaciones, las composiciones inmunogénicas proporcionadas en el presente documento inducen principalmente IgG1, IgG2b, IgG2c e IgG3.

La "citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refiere a la capacidad de un conjugado terapéutico para iniciar la activación del complemento y someter a lisis una diana en presencia de complemento. La vía de activación del complemento se inicia mediante el enlace del primer componente del sistema del complemento (C1q) a una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) complejada con un antígeno afín. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar ensayo de CDC, por ejemplo, cómo se describe en Gazzano-Santaro et al., J. Immunol. Methods, 202: 163 (1996),.

En otra realización, cuando se administra a un paciente, las composiciones terapéuticas que contienen conjugados terapéuticos de la invención pueden inducir la producción en un paciente/sujeto de sueros inmunes anti-Globo H, que se une específicamente a líneas celulares de cáncer positivas para Globo H, por ejemplo, células MCF-7.

Combinaciones

Las composiciones terapéuticas pueden incluir otros fármacos anticancerígenos/antiproliferativos, así como adyuvantes y otras moléculas inmunomoduladoras tales como citoquinas o quimioquinas. En ciertas realizaciones, la combinación puede ser una coadministración de agentes/composiciones separadas o coformulación. Estos agentes se pueden entregar en un kit juntos en contenedores separados o en un solo contenedor. Los agentes pueden combinarse en el momento de la administración o al menos o aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 minutos, horas o días antes de la administración.

Los adyuvantes son agentes farmacológicos o inmunológicos que modifican los efectos de otros agentes. Pueden ser una sustancia química inorgánica u orgánica, macromolécula o células cancerosas enteras o porciones de las mismas que mejoran la respuesta inmune al antígeno dado. Los adyuvantes incluyen adyuvante completo e incompleto de Freund, moléculas receptoras similares a Toll y sus miméticos, LPS, lipoproteínas, lipopéptidos, flagelina, ARN bicatenario, islas CpG no metiladas, levamisol, bacilo, Calmette-Guerin, octreotida, isoprinosina y Zadaxin, diversas formas de ADN y ARN liberados de manera clásica por bacterias y virus, antagonistas de PD-1 y antagonistas de CTLA. En una realización, el adyuvante es un adyuvante de saponina.

En cierta realización, el adyuvante de saponina es saponina OBI-821, que es sustancialmente pura. En otras realizaciones, la saponina oBl-821 es un fragmento biológicamente activo de la misma. El adyuvante también puede abarcar formas impuras de saponinas OBI-821. Las saponinas OBI-821 purificadas exhiben un efecto adyuvante mejorado cuando se administran con una vacuna descrita en este documento o se mezclan con otros adyuvantes de saponina o no saponina sustancialmente puros.

Las saponinas OBI-821 son glucósidos naturales, extraídos en alta purificación de la corteza del árbol Quillaja saponaria Molina, por cromatografía líquida de alta presión (HPLC), cromatografía líquida a baja presión en sílice y cromatografía hidrófila interactiva (HILIC) como se describe en, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No.

5,057,540 y la Patente de los Estados Unidos No. 6,524,584. El análisis por cromatografía líquida de alta presión muestra que OBI-821 es una mezcla de compuestos isoméricos estructuralmente relacionados. Se han identificado y divulgado diferentes compuestos isoméricos purificados de saponinas OBI-821.

En ciertas realizaciones, la saponina OBI-821 comprende al menos un compuesto aislado de fórmula I como sigue:

osa

Ga actosa

Formula (I) en donde

R1 es p-D-Apiosa o p-D-Xilosa; y

R2 y R3 son independientemente H, alquilo,

La saponina OBI-821 también puede comprender un compuesto aislado de fórmula I, en donde (i) R1 es p-D-Apiosa, R2 es la unidad estructural acilo graso para el compuesto 1989 representado anteriormente, y R3 es H (compuesto 1989 V1A);

(ii) R1 es p-D-Apiosa, R2 es H y R3 es la unidad estructural de acilo graso para el compuesto 1989 representado anteriormente (compuesto 1989 V1B);

(iii) R1 es p-D-Xilosa, R2 es la unidad estructural de acilo graso para el compuesto 1989 representado anteriormente, y R3 es H (compuesto 1989 V2A); o

(iv) R1 es p-D-Xilosa, R2 es H y R3 es la unidad estructural de acilo graso para el compuesto 1989 representado anteriormente (compuesto 1989 V2B). En conjunto, el compuesto 1989 VIA, el compuesto 1989 V1B, el compuesto 1989 V2Ay el compuesto 1989 V2B se denominan "mezcla de compuestos 1989".

La Tabla 1 resume los grupos funcionales de los compuestos 1989 y el % molar de cada compuesto 1857 en la mezcla de compuestos 1857.

Tabla 1

La saponina OBI-821 puede comprender un compuesto aislado de fórmula I donde:

(i) R1 es p-D-Apiosa, R2 es la unidad estructural de acilo graso para el compuesto 1857 representado anteriormente, y R3 es H (compuesto 1857 V1A);

(ii) R1 es p-D-Apiosa, R2 es H y R3 es la unidad estructural acilo graso para el compuesto 1857 representado anteriormente (compuesto 1857 V1B);

(iii) R1 es p-D-Xilosa, R2 es la unidad estructural acilo graso para el compuesto 1857 representado anteriormente, y R3 es H (compuesto 1857 V2A); o

(iv) R1 es p-D-Xilosa, R2 es H y R3 es la unidad estructural acilo graso para el compuesto 1857 representado anteriormente (compuesto 1857 V2B).

Colectivamente, el compuesto 1857 VIA, el compuesto 1857 V1B, el compuesto 1857 V 2A ye l compuesto 1857 V2B se denominan "mezcla de compuestos 1857".

La Tabla 2 resume los grupos funcionales de compuestos 1857 y el % molar de cada compuesto 1857 en la mezcla de compuestos 1857. HPLC

Tabla 2

La saponina OBI-821 comprende uno o más de los siguientes compuestos:

(i) compuesto 1857 V1A;

(ii) compuesto 1857 V1B;

(iii) compuesto 1857 V2A;

(iv) compuesto 1857 V2B;

(v) compuesto 1989 V1A;

(vi) compuesto 1989 V1B;

(vii) compuesto 1989 V2A; u

(viii) compuesto 1989 V2B.

Los porcentajes de la mezcla de compuestos 1857 y la mezcla de compuestos 1989 en saponina OBI-821 pueden variar de la siguiente manera:

(i) aproximadamente 1 % molar a aproximadamente 15 % molar de OBI-821 que comprende una mezcla de compuestos 1857; y

(ii) aproximadamente 85 % molar a aproximadamente 99 % molar de OBI-821 que comprende una mezcla de compuestos 1989.

Todo el % molar puede variarse en incrementos de 0.1 % (por ejemplo, aproximadamente 87 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 90.5 % a aproximadamente 97 %, aproximadamente 3.5 % a aproximadamente 11 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 14 %).

La mezcla de compuestos 1989 puede comprender aproximadamente 60-70 % molar del compuesto 1989 V1A; aproximadamente 1-5 % molar del compuesto 1989 V1B; aproximadamente 30-40 % molar del compuesto V2A de 1989; y aproximadamente 0.1-3 % molar del compuesto V2B de 1989. Todo el % molar se puede variaren incrementos de 0.1 (por ejemplo, 65 %, 2.5 %, 35.6 %).

La mezcla de compuestos 1857 puede comprender aproximadamente 60-70 % molar del compuesto 1857 V1A; aproximadamente 1-5 % molar del compuesto 1857 V1B; aproximadamente 30-40 % molar de 1857 compuesto V2A; y, aproximadamente 0.1-3 % molar del compuesto 182 V2B. Todo el % molar se puede variar en incrementos de 0.1 (por ejemplo, 65 %, 2.5 %, 35.6 %).

En otra realización, el OBI-821 sustancialmente puro se purifica a partir de un extracto crudo de Quillaja saponaria, en el que dicho OBI-821 se caracteriza por un único pico predominante que comprende el 90 % o más del área total de todos los picos de un cromatograma, excluyendo el pico de disolvente, cuando se analiza en HPLC de fase inversa en una columna Symmetry C18 que tiene un tamaño de partícula de 5 um, poro 100 A, 4.6 mm IDx25 cm L con un programa de elución que comprende fase móvil de A: B 95 %: 5 % a 75 %: 25 % en 11 minutos, cuya fase móvil A es agua destilada con ácido trifluoroacético al 0.1 %, y la fase móvil B es acetonitrilo con ácido trifluoroacético al 0.1 % a un caudal de 1 ml/min.

En una realización, la composición farmacéutica comprende el compuesto de fórmula (I)

en donde,

R1 es p-D-Apiosa o p-D-Xilosa; y

R2 y R3 son independientemente H, alquilo o

(Unidad estructural de acilo graso para el compuesto 1857), y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La vacuna puede comprender un antígeno de carbohidrato o su fragmento inmunogénico y una saponina OBI-821. En otra realización más, la vacuna comprende un antígeno de carbohidrato o su fragmento inmunogénico; una proteína transportadora y una saponina OBI-821. En otra realización, la vacuna comprende un antígeno de carbohidrato seleccionado de Globo H, KLH y una saponina OBI-821. Ejemplos no limitantes de proteína transportadora incluyen KLH.

Los términos "a-galactosil-ceramida" y "a-GalCer" se refieren a un glicolípido que estimula a las células T asesinas naturales a producir tanto T auxiliar 1 (TH1) como citoquina TH2, como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 8,268,969, cuyo contenido se incorpora por referencia en su totalidad. En cierta realización, el adyuvante OBI-834 (conocido como C34) se caracteriza por la siguiente estructura de ejemplo:

Como se usa en este documento, el término "citoquina" se refiere a cualquiera de las numerosas proteínas pequeñas secretadas que regulan la intensidad y la duración de la respuesta inmune al afectar el proceso de diferenciación de las células inmunes, que generalmente implica cambios en la expresión génica por los cuales una célula precursora se convierte en un tipo de célula especializada. Las citoquinas se han denominado de diversas maneras como linfoquinas, interleuquinas y quimioquinas, en función de su presunta función, célula de secreción u objetivo de acción. Por ejemplo, algunas interleuquinas comunes incluyen, entre otras, IL-2, IL-12, IL-18, IL-2, IFN-y, TNF, IL-4, IL-10, IL-13, IL-21, GM-CSF y TGF-p.

Como se usa en este documento, el término "quimioquina" se refiere a cualquiera de diversas citoquinas quimiotácticas pequeñas liberadas en el sitio de infección que proporcionan un medio para la movilización y activación de linfocitos. Las quimioquinas atraen leucocitos a los sitios de infección. Las quimioquinas han conservado residuos de cisteína que les permiten ser asignadas a cuatro grupos. Los grupos, con quimioquinas representativas, son las quimioquinas C-C (r A n TES, MCP-1, MIP-1a y MIP-1p), las quimioquinas C-X-C (lL-8), las quimioquinas C (linfoctatina) y las quimioquinas CXXXC (Fractalquina).

Las composiciones terapéuticas de la invención pueden incluir además inhibidores PD-1/PD-L1 (inmunoterapia con linfocitos de células T citotóxicas (CTL)), inmunoterapia conCTLA-4, inhibidores de CDK4/6 (terapia diana), inhibidores de PI3K (terapia diana), inhibidores de mTOR (terapia diana), inhibidores de AKT (terapia diana), inhibidores de Pan-Her (terapia diana). Estos inhibidores pueden modificarse para generar también el anticuerpo monoclonal respectivo. Dichos anticuerpos pueden incluirse en composiciones terapéuticas de la invención.

Las composiciones terapéuticas pueden incluir otros agentes anticancerígenos/antiproliferativos o quimioterapéuticos. En algunas realizaciones, se encuentran ejemplos de tales agentes en Cancer Principles and Practice of Oncology by V.T. Devita and S. Hellman (editors), 6th edition (February 15, 2001), Lippincott Williams & Wilkins Publishers. Dichos agentes anticancerígenos incluyen, entre otros, los siguientes: agentes terapéuticos hormonales (por ejemplo, moduladores selectivos del receptor de estrógenos, moduladores del receptor de andrógenos), terapia con anticuerpos monoclonales, quimioterapia, moduladores de los receptores retinoides, agentes citotóxicos/citostáticos, agentes antineoplásicos, agentes antiproliferativos, inhibidores de la prenil-proteína transferasa, inhibidores de la HMG-CoA reductasa, mostazas nitrogenadas, nitrosoureas, inhibidores de la angiogénesis (por ejemplo, bevacizumab), inhibidores de la proliferación celular y la vía de señalización de supervivencia, agentes inductores de apoptosis, agentes que interfieren con los puntos de control del ciclo celular, agentes que interfieren con los receptores tirosina quinasas (RTK), inhibidores de la diana de la rapamicina en mamíferos (mTOR), inhibidores del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2), inhibidores del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), bloqueadores de integrinas, NSAIDs, agonistas de PPAR, inhibidores de resistencia inherente a múltiples fármacos (MDR), agentes antieméticos, agentes útiles en el tratamiento de la anemia, agentes útiles en el tratamiento de la neutropenia, fármacos que mejoran la inmunidad, bifosfonatos, inhibidores de la aromatasa, agentes que inducen la diferenciación terminal de las células neoplásicas, inhibidores de la Y-secretasa, vacunas contra el cáncer y cualquier combinación de los mismos.

Formulaciones de la invención

Las composiciones terapéuticas (también denominadas en este documento composiciones farmacéuticas) generalmente incluyen un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tal como se usa en el presente documento, el término "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. Los compuestos activos suplementarios también se pueden incorporar en las composiciones. Una composición farmacéutica está formulada para ser compatible con su ruta de administración prevista. Ejemplos de vías de administración incluyen la administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraarterial, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (tópica), transmucosa y rectal. Las soluciones o suspensiones utilizadas para la aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril como agua para inyección, solución salina, solución salina regulada con fosfato, solución salina regulada con tris, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol, u otros solventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; reguladores como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad como cloruro de sodio o dextrosa. El valor del pH se puede ajustar con ácidos o bases, como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede incluirse en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiples de vidrio o plástico.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para un uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (donde son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL® (BASF, Parsippany, N.J.) o solución salina regulada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista una fácil manipulación con jeringa. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y preservarse contra la acción contaminante de microorganismos como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. Se puede mantener la fluidez adecuada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento como la lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos se puede lograr mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede lograrse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación incluyen secado al vacío y liofilización, que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución previamente filtrada estéril del mismo.

Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un vehículo comestible. Para el propósito de la administración terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de tabletas, pastillas o cápsulas, por ejemplo, cápsulas de gelatina. Las composiciones orales también se pueden preparar usando un vehículo fluido para usar como enjuague bucal. Se pueden incluir agentes aglutinantes farmacéuticamente compatibles o materiales adyuvantes como parte de la composición. Las tabletas, píldoras, cápsulas, pastillas y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente desintegrante tal como ácido algínico, primogel o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o esterotes; un deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante como menta, salicilato de metilo o aroma de naranja.

Además, para la administración oral, las formulaciones de la invención pueden tomar la forma de, por ejemplo, tabletas o cápsulas preparadas por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes aglutinantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa); cargas (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o fosfato de hidrógeno cálcico); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice); desintegrantes (por ejemplo, almidón de patata o almidón glicolato de sodio); o agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato de sodio). Las tabletas pueden recubrirse por métodos bien conocidos en la técnica. Las composiciones de la invención también se pueden introducir en microesferas o microcápsulas, por ejemplo, fabricadas a partir de ácido poliglicólico/ácido láctico (PGLA) (véanse las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,814,344; 5,100,669 y 4,849,222; Publicaciones de PCT números WO 95/11010 y WO 93/07861). Las preparaciones líquidas para administración oral pueden tomar la forma de, por ejemplo, soluciones, jarabes, emulsiones o suspensiones, o pueden presentarse como un producto seco para su reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Dichas preparaciones líquidas pueden prepararse por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsionantes (por ejemplo, lecitina o acacia); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendras, ésteres oleosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (por ejemplo, metil o propil-p-hidroxibenzoatos o ácido sórbico). Las preparaciones también pueden contener sales reguladoras, saborizantes, colorantes y edulcorantes, según corresponda. Las preparaciones para la administración oral pueden formularse adecuadamente para proporcionar una liberación controlada del compuesto activo.

Para la administración por inhalación, los compuestos se administran en forma de aerosol desde un recipiente o dispensador presurizado que contiene un propulsor adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono o un nebulizador.

La administración sistémica también puede ser transmucosa o transdérmica. Para la administración transmucosa o transdérmica, se usan penetrantes apropiados para la barrera que se va a atravesar con la formulación. Tales penetrantes son generalmente conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, para administración transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosa se puede lograr mediante el uso de aerosoles nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en pomadas, ungüentos, geles o cremas como se conoce generalmente en la técnica. Los compuestos también se pueden preparar en forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorios convencionales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para el suministro rectal.

Según las implementaciones, los compuestos activos se preparan con vehículos que protegerán el compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como acetato de etileno y vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de tales formulaciones serán evidentes para los expertos en la materia. Los materiales también se pueden obtener comercialmente. Las suspensiones de liposomas (incluidos los liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales contra antígenos específicos de células) también se pueden usar como vehículos farmacéuticamente aceptables. Estos pueden prepararse de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, cómo se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 4,522,811, que se incorpora aquí como referencia.

Es ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma de unidad de dosificación como se usa en el presente documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto por tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido.

Las formulaciones inmunogénicas de la invención pueden administrarse por vía parenteral, es decir, por administración intravenosa (i.v.), subcutánea (s.c.), intraperitoneal (i.p.), intramuscular (i.m.), subdérmica (s.d.) o intradérmica (i.d.), mediante inyección directa, mediante, por ejemplo, inyección en bolo, infusión continua o pistola de genes (por ejemplo, para administrar una vacuna vectorial a un sujeto, como ADN o ARN desnudo). Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en envases multidosis, con un conservante añadido. Las composiciones pueden tomar formas tales como excipientes, suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para su reconstitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos, antes de su uso.

La presente invención también contempla diversas estrategias de vacunación de la mucosa.

Formas de dosificación

La toxicidad y la eficacia terapéutica de tales composiciones terapéuticas pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales de experimentación, por ejemplo, para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50 % de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50 % de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación DL50/DE50. Se prefieren las composiciones terapéuticas que exhiben altos índices terapéuticos. Si bien se pueden usar compuestos que exhiben efectos secundarios tóxicos, se debe tener cuidado al diseñar un sistema de administración que dirija dichos compuestos al sitio de la ubicación afectada para minimizar el daño potencial a las células no infectadas y, por lo tanto, reducir los efectos secundarios.

Los datos obtenidos de ensayos de cultivo celular y estudios en animales pueden usarse para formular un rango de dosificación para uso en humanos. La dosificación de tales compuestos se encuentra preferiblemente dentro de un rango de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este rango dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto utilizado en el método de la divulgación, la dosis terapéuticamente efectiva se puede estimar inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Se puede formular una dosis en modelos animales para lograr un rango de concentración en plasma circulante que incluya la IC50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que logra una inhibición de síntomas medio máxima) como se determina en el cultivo celular. Dicha información se puede utilizar para determinar con mayor precisión las dosis útiles en humanos. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución.

En las composiciones descritas, tanto el antígeno como el adyuvante están presentes en cantidades inmunogénicamente eficaces. Para cada antígeno específico, la cantidad inmunogénicamente eficaz óptima debe determinarse experimentalmente (teniendo en cuenta las características específicas de un paciente determinado y/o el tipo de tratamiento). Generalmente, esta cantidad está en el rango de 0.01 jg-250 mg de un antígeno por kg de peso corporal. Para cierto adyuvante de ejemplo de la presente invención, la cantidad inmunogénicamente efectiva puede estar en el rango de 10-250 |jg del adyuvante por kg de peso corporal.

En algunas realizaciones, una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición terapéutica (es decir, una dosificación efectiva) puede variar de aproximadamente 0.001 jg/kg a aproximadamente 250 g/kg, 0.01 jg/kg a 10 g/kg, o 0.1 jg/kg a 1 g/kg o aproximadamente o al menos: 0.001, 0.002, 0.003, 0.004, 0.005, 0.006, 0.007, 0.008, 0.009; 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09; 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 225 o 250 gramos o microgramos por kilogramo de peso corporal del paciente, o cualquier rango entre cualquiera de los números enumerados aquí, u otros rangos que serían evidentes y entendidos por los artesanos sin experimentación excesiva. El experto en la materia apreciará que ciertos factores pueden influir en la dosis y el tiempo requeridos para tratar eficazmente a un sujeto, que incluyen, entre otros, la gravedad de la enfermedad o trastorno, tratamientos previos, la salud general o la edad del sujeto y otras enfermedades presentes.

En otras realizaciones, una cantidad terapéuticamente efectiva de la unidad estructural Globo-H en la composición terapéutica (es decir, una dosificación efectiva) puede variar de aproximadamente 0.001 jg/kg a aproximadamente 250 g/kg, 0.01 jg/kg a 10 g/kg, o 0.1 jg/kg a 1 g/kg o aproximadamente o al menos: 0.001, 0.002, 0.003, 0.004, 0.005, 0. 006, 0.007, 0.008, 0.009; 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09; 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 225 o 250 gramos o microgramos por kilogramo de peso corporal del paciente, o cualquier rango entre cualquiera de los números enumerados aquí, u otros rangos que serían evidentes y entendidos por los artesanos sin experimentación excesiva. El experto en la materia apreciará que ciertos factores pueden influir en la dosis y el tiempo requeridos para tratar eficazmente a un sujeto, que incluyen, entre otros, la gravedad de la enfermedad o trastorno, tratamientos previos, la salud general o la edad del sujeto y otras enfermedades presentes.

En ciertas realizaciones, las composiciones terapéuticas descritas en el presente documento contienen o están asociadas con, al menos, un conjugado terapéutico o anticuerpo terapéutico por lo que cada al menos un conjugado terapéutico o anticuerpo terapéutico está presente en una dosis única a una concentración de aproximadamente, al menos o más de: 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 ,41 , 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66 ,67 , 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 cada vez 10-9, 10-8, 10-7, 10-6,10-5,10-4,10-3,10-2,10-1 molar por dosis. Preferiblemente, el conjugado terapéutico está presente en dosis única a una concentración entre aproximadamente: 1-100, 2-60, 3-50, 4-40, 5-30, 6-20, 7-15, 8-10, 2- 18, 3-16, 4-14, 5-12, 6-10 o 7-8 |j M, o cualquier rango entre cualquiera de las cifras enumeradas aquí.

En algunas realizaciones, las composiciones terapéuticas descritas en el presente documento contienen o están asociadas con, al menos, un conjugado terapéutico o anticuerpo terapéutico mediante el cual cada al menos un conjugado terapéutico o anticuerpo terapéutico está presente en una dosis única a una concentración de aproximadamente, al menos o más de: 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 ,41 , 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 cada 10'3, 10'2, 10'1 o 10 microgramos. En ciertas realizaciones, aproximadamente o al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 250 o se incluyen más microgramos de un conjugado terapéutico o anticuerpo terapéutico por dosis.

En ciertas realizaciones, las composiciones terapéuticas descritas en el presente documento se administran en una dosis de aproximadamente o al menos o más de: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 veces por día, semana o mes durante un período de aproximadamente o al menos o más de: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 días, semanas, meses o años.

Dosis efectivas y evaluaciones de seguridad

De acuerdo con los métodos de la presente invención, las composiciones farmacéuticas y de vacuna descritas en el presente documento se administran a un paciente a dosis inmunogénicamente eficaces, preferiblemente, con una toxicidad mínima. Como se menciona en la Sección titulada "Definiciones", "dosis inmunogénicamente efectiva" o "dosis terapéuticamente efectiva" de formulaciones divulgadas se refiere a la cantidad de antígeno y/o adyuvante que es suficiente para producir una respuesta inmune efectiva en el sujeto tratado y, por lo tanto, suficiente para resultar en un beneficio saludable para dicho sujeto.

Kits

0162] Según otro aspecto, la persona experta en la técnica puede imaginar uno o más kits de partes, los kits de partes para realizar al menos uno de los métodos aquí descritos, el kit de partes que comprende uno o más conjugados terapéuticos, agentes anticancerígenos/antiproliferativos, adyuvantes, citoquinas y/o quimioquinas. Las composiciones terapéuticas que comprenden solas o en combinación una cantidad efectiva de las composiciones terapéuticas descritas en el presente documento de acuerdo con al menos uno de los métodos mencionados anteriormente. Los agentes antes mencionados pueden venir en un solo recipiente o en diferentes recipientes en el kit.

Las composiciones pueden, si se desea, presentarse en un paquete o dispositivo dispensador que puede contener una o más formas de dosificación unitarias que contienen el ingrediente activo (es decir, un antígeno y/o un adyuvante que contiene glucoesfingolípidos (GSL)). El paquete puede, por ejemplo, comprender una lámina de metal o plástico, tal como un paquete de blíster. El paquete o dispositivo dispensador puede ir acompañado de instrucciones de administración. Las composiciones de la invención formuladas en un vehículo farmacéutico compatible también se pueden preparar, colocar en un recipiente apropiado y etiquetar para el tratamiento de una afección indicada.

Los kits posiblemente incluyen también identificadores de un evento biológico, u otros compuestos identificables por una persona experta al leer la presente divulgación. El kit también puede comprender al menos una composición que comprende una cantidad efectiva de las composiciones terapéuticas descritas en este documento. Las composiciones terapéuticas de los kits para realizar el al menos un método descrito en este documento de acuerdo con el procedimiento identificable por un experto en la materia.

La divulgación también incluye métodos para tratar enfermedades proliferativas utilizando las composiciones terapéuticas descritas en el presente documento. En una realización, los métodos implican el tratamiento del cáncer, por ejemplo, cáncer de mama. Los métodos generalmente implican proporcionar las composiciones terapéuticas descritas en el presente documento a un paciente que lo necesite en una cantidad efectiva para tratar el trastorno proliferativo.

En algunas realizaciones, las composiciones terapéuticas de la invención se administran a un sujeto que lo necesita

(por ejemplo, uno que tiene un cáncer tal como cáncer de mama) en un método que, en promedio, extiende la supervivencia libre de progresión o la supervivencia general sobre un placebo de control, por ejemplo, un placebo de solución salina regulada con fosfato, aproximadamente o al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,

17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 días, semanas, meses o años.

En algunas realizaciones, las composiciones terapéuticas se administran por vía subcutánea en la semana 0-2, 6, 14 y 26 en ausencia de toxicidad inaceptable o progresión de la enfermedad.

(por ejemplo, uno que tiene un cáncer tal como cáncer de mama) en un método que, en promedio, reduce el volumen de un tumor en el paciente en relación con un placebo de control, por ejemplo, un placebo de solución salina regulada con fosfato, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,

27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57,

58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88,

89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o más por ciento en el transcurso de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 días, semanas,

meses o años.

En algunas realizaciones, los volúmenes de los tumores se pueden medir con precisión en al menos una dimensión

(se debe registrar el diámetro más largo en el plano de medición) con un tamaño mínimo de 10 mm mediante tomografía computarizada (se recomienda que el grosor del corte de la tomografía computarizada esté entre 2.5 mm

y 5 mm).

Métodos de sintetizar las composiciones de la invención

La porción de hexasacárido Globo H de las composiciones terapéuticas de la invención se sintetizó químicamente como el glucósido de alilo y luego se preparó para la conjugación con KLH.

En una realización ilustrativa, la síntesis química de Globo H implica los siguientes pasos generales:

Se trató KLH con 2-iminotiolano en un regulador acuoso. La KLH tiolada se aisló luego del 2-iminotiolano sin reaccionar, a través de una columna de exclusión por tamaño con columna Sephadex G-15. La KLH tiolada se almacenó en atmósfera de gas inerte (nitrógeno o argón) y se usó inmediatamente para la conjugación con Globo H-MMCCH.

Ejemplos

Ejemplo 1: Preparación del glucoconjugado de la invención (Globo H-KLH)

El Globo H alil glucósido (disponible comercialmente) se convirtió en un aldehído por ozonólisis. El aldehído de Globo H se hizo reaccionar con el enlazador MMCCH y NaCNBH3 para dar Globo H-MMCCH. La mezcla se purificó con una columna para recibir Globo H-MMCCH. Las fracciones con Globo H-MMCCH positivas se confirmaron por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y luego se agruparon. Se disolvió KLH en regulador de tiolación y se añadió 2-iminotiolano a la reacción en porciones. La reacción se incubó hasta su finalización y luego KLH-SH se purificó mediante una columna. Globo H-MMCCH y KLH-SH se combinaron. La reacción se agitó hasta su finalización. El glucoconjugado Globo H-KLH se purificó para proporcionar el producto final.

Ejemplo 2: Análisis de la relación en peso de Globo H a KLH en el glucoconjugado

La relación en peso de Globo H y KLH en el glucoconjugado preparado se confirmó mediante cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento con detección amperométrica pulsada (HPAEC-PAD). El resultado se muestra en la Tabla 3.

Tabla 3: La relación en peso de Globo H y KLH en glucoconjugado

Ejemplo 3: Análisis de la relación epítopo/vehículo de Globo H a KLH en el glucoconjugado

El peso molecular de un didecámero KLH (la forma agregada naturalmente) es de alrededor de 7.5 MDa~8.6 MDa, como se describe en la literatura, como Micron 30 (1999) 597-623. La KLH nativa se confirmó mediante la cromatografía de exclusión por tamaño y espectrometría de dispersión láser de múltiples ángulos (MALS), que tiene un peso molecular de alrededor de 8.6 MDa (Véase Figura 3).

La distribución de masa del glucoconjugado de KLH y Globo H-KLH (OBI-822, Lote No. 14001) fue estimada y derivada por cromatografía de exclusión por tamaño usando un espectrómetro de dispersión láser de múltiples ángulos (SEC-MALS). El peso molecular se calculó con base en el contenido de proteína (£=1.39) (Véase Figura 4). En la Figura 4A, se observaron didecámero (n=20) y multidecámero (n>20) de KLH. La Figura 4B mostró que el área de pico del didecámero era del 74.3 % y el multidecámero era del 25.7 %. En la Figura 4C, se observaron monómero a hexámero (n=1-6) y multímero (n>7-20) de glucoconjugado Globo H-KLH (OBI-822). La Figura 4D mostró que el área de pico del monómero al hexámero (n=1-6) era el componente principal (>97 %) y el multímero (n>7-20) era solo una pequeña cantidad (2.2 %). El resumen del análisis de distribución de masa de oligómero KLH y OBI-822 se muestra en la Tabla 4.

Tabla 4: Resumen del análisis de distribución de masa de oligómero KLH y OBI-822

Los resultados mostraron que el glucoconjugado de la invención exhibía una masa reducida en peso molecular en comparación con didecámeros agregados nativos de KLH. La relación molecular se calculó como en la Tabla 5.

Tabla 5: Cálculo de la relación molecular de Globo H a KLH

Dado lo anterior, en ciertas realizaciones de glucoconjugado de la invención, las unidades monoméricas de KLH forman monómeros, dímeros, trímeros, tetrámeros, pentámeros y/o hexámeros después de la conjugación con Globo H.

Ejemplo 4: Preparación de composiciones de vacunas e inmunización en ratas

Se almacenaron a 4°C diferentes muestras de los glucoconjugados (Globo H-KLH) como se preparó en el Ejemplo 1, y se mezclaron con un adyuvante de saponina bajo una campana de flujo laminar. Las composiciones de vacuna resultantes se colocaron en hielo y se transportaron a una instalación animal para la inmunización posterior.

Tres grupos de ratas Lewis se inmunizaron con las diversas composiciones de vacuna como se muestra en la Tabla 6.

Tabla 6: Grupos de ratas inmunizadas

Las ratas se inmunizaron los días 0, 7, 14 y 21. Se recogieron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y plasma los días 0, 3, 10, 17, 24 y 31. Bazo, ganglio linfático y lavado peritoneal se cosecharon el día 31.

Ejemplo 5: Ensayos para la inducción de respuestas inmunitarias humorales y celulares en ratas

Ejemplo 5.1: Análisis de subpoblaciones de células efectoras inmunes por citometría de flujo

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de los animales y luego se identificaron diversas subpoblaciones de células efectoras inmunes en las PBMC mediante citometría de flujo usando anticuerpos específicos contra diferentes marcadores celulares. Las PBMC, aisladas de las ratas inmunizadas el día 0, 3, 10, 17, 24 y 31, se tiñeron con diferentes anticuerpos conjugados con fluorescencia (FITC) y se colocaron en hielo durante 30 minutos. Después de la incubación, las células se lavaron con el regulador de lavado (albúmina de suero bovino al 1 % (Sigma) y NaN3 al 0.1 % (Sigma) en solución salina regulada con fosfato (UniRegion Biotech) y se centrifugaron a 350 g durante 5 minutos. Las células se resuspendieron en regulador de lavado durante determinación de fluorescencia por FACS Canto (BD Bioscience). Los datos se analizaron con el software BD FACSDiva (BD Bioscience). Los resultados muestran que, en las ratas inmunizadas por el glucoconjugado de la presente invención, las células B y las células T se expandieron significativamente en comparación para el grupo de control de PBS. Específicamente, la población de células B apareció por primera vez en el día 3 y las células CD3T, CD4T y CD8T posteriores aparecieron en el día 24. Véase Figura 5A a Figura 5D.

Ejemplo 5.2: Prueba de anticuerpos específicos de Globo H por ELISA

La producción de anticuerpos específicos de Globo H en el plasma de las ratas inmunizadas se determinó mediante ensayo ELISA. Los resultados mostraron que los títulos de IgG específica de Globo H comenzaron a aumentar a los 10 días y alcanzaron su punto máximo a los 17 días después de la inmunización. Se observaron patrones similares en la producción del anticuerpo IgM específico de Globo H. Véase Figura 6A a Figura 6B. No hubo respuesta de los anticuerpos IgG e IgM específicos de Globo H en ratas tratadas solo con PBS.

En resumen, en las ratas inmunizadas, la producción de células B aparece en el día 3, seguida de la producción de anticuerpos IgM e IgG contra Globo H que aparece en el día 10 y las células CD3T, CD4T y CD8T posteriores que aparecen en el día 24. El glucoconjugado (Globo H-KLH) de la invención fue eficaz para inducir respuestas humorales y celulares.

Ejemplo 6: Prueba de inmunización en ratones y anticuerpos por ELISA

Se almacenaron diferentes muestras de los glucoconjugados (Globo H-KLH) a 4°C y se mezclaron con un adyuvante de saponina bajo una campana de flujo laminar. Las composiciones de vacuna resultantes se colocaron en hielo y se transportaron a una instalación animal para la inmunización posterior.

Los ratones Balb/c de aproximadamente ocho semanas de edad recibieron glucoconjugado Globo H-KLH con diferentes proporciones de carbohidrato a proteína (Globo H:KLH) una vez por semana durante cuatro semanas (Día 0, 7, 14 y 21) por inyección subcutánea. Se recogieron muestras de sangre a través de la vena retroorbital o facial sin anticoagulante preinmune o el día 0, y tres días después de cada vacunación (días 10, 17 y 24). Las muestras se centrifugaron para separar sueros y glóbulos rojos. Los sueros se recogieron y almacenaron a -20°C, que luego se analizaron por ELISA. La prueba t de Mann-Whitney se utilizó para el análisis estadístico.

Como se muestra en la Figura 7, el glucoconjugado (Globo H-KLH), en combinación con un adyuvante de saponina, según la invención, ha demostrado inducir significativamente las respuestas de anticuerpos IgM específicos de Globo H en el modelo animal, como en comparación con el grupo de control PBS. Específicamente, el glucoconjugado con una relación en peso de 0.17:1 (Globo H:KLH) indujo un mejor título de anticuerpos que el glucoconjugado con una relación en peso de 0.07:1 (Globo H:KLH).

En resumen, se ha demostrado que el glucoconjugado Globo H-KLH (OBI-822), en combinación con un adyuvante apropiado, según la invención, induce una respuesta inmune humoral y celular inesperadamente superior en el modelo animal, particularmente la expansión de células B y células T, incluidas las respuestas CTL e IgM e IgG, que son importantes en la inmunoterapia contra el cáncer.

Ejemplo 7: Estudio de inmunogenicidad de Globo H-KLH con diferentes adyuvantes en ratones

Se ha pareado la capacidad de la composición de Globo H de la invención, cuando se combina con diferentes adyuvantes (OBI-821/OBI-834), para provocar una respuesta inmune en ratones. Las células viables de carcinoma de pulmón de Lewis (LL/2, ATCC CRL-1642) (proporcionadas por Eurofins Panlabs Taiwan Ltd., 5.0 * 106 en 0.1 mL), singénicas para ratones C57BL/6, se inyectaron subcutáneamente en la región abdominal hacia el lado lateral de ratones experimentales en el día 16. Se inmunizaron subcutáneamente seis grupos de ratones hembra C57BL/6 de 6-8 semanas de edad con Globo H-KLH (OBI-822) y diferentes adyuvantes. Los niveles de dosis de OBI-822 fueron el equivalente de la cantidad en cada grupo. Cada inyección contenía una dosis equivalente a 2.0 |jg de vacuna (OBI-822) y 20 jg de adyuvantes (OBI-821/OBI-834) administrados por vía subcutánea en 0.2 ml/ratón (en el abdomen izquierdo y derecho, 0.1 ml/sitio). Las inmunizaciones ocurrieron los días 0, 5, 11, 19, 29, 34 y 39, y el suero se recogió el día 0 (preinyección) y el día 42 para el análisis comparativo por ELISA. Las respuestas serológicas se midieron por ELISA para determinar el título de anticuerpos IgM e IgG contra Globo H.

Como se muestra en la Figura 8, no hubo respuesta en ratones tratados con solución salina regulada con fosfato (PBS). En contraste, los ratones tratados con OBI-822 OBI821 y OBI-822 OBI-834 respondieron con títulos significativos de IgM anti-Globo H (Figura 8A). Sin embargo, los títulos promedio de IgG fueron más bajos que los de IgG (Figura 8B). Indicó que tanto los adyuvantes OBI-821 como OBI-834 podrían inducir la inmunogenicidad de Globo H-KLH (OBI-822). La vacunación con Globo H-KLH y un adyuvante ha demostrado provocar respuestas IgG e IgM anti-Globo H en ratones hembra C57BL/6.

Como se muestra en la Figura 9, los seis grupos de ratones C57BL/6 se monitorizaron para determinar el peso corporal y el tamaño del tumor en los días 16, 19, 23, 26, 30, 34, 37, 40 y 42. Las imágenes incluyen tumor con se tomó todo el cuerpo después del sacrificio el día 42. Como se muestra en la Figura 10, el volumen del tumor (mm3) se estima de acuerdo con la fórmula para un elipsoide prolato: longitud (mm) * [ancho (mm)]2 x 0.5. El crecimiento tumoral en animales tratados con compuestos se calcula como T/C (Tratamiento/Control) x 100 %; se usó ANOVA unidireccional seguido de la prueba de Dunnetts o la prueba t de Student no pareada para determinar la inhibición significativa en el crecimiento tumoral que demuestra la actividad antitumoral. La tasa de inhibición tumoral en el día 42 de OBI-822 OBI-821 fue de aproximadamente el 35 % y OBI-822 OBI-834 fue de aproximadamente el 22 %. Parecía que tanto los adyuvantes OBI-821 como OBI-834 podrían inhibir el crecimiento tumoral con Globo H-KLH (OBI-822).

Ejemplo 8: Análisis LC-MS/MS de sitios de conjugación Globo-H (lisina) sobre KLH

Se identificaron sitios de conjugación de Globo H en cuatro muestras de KLH usando digestión enzimática múltiple y LC-MS/MS. Las cuatro muestras de KLH conjugadas con Globo H se digirieron primero con cuatro enzimas diferentes y luego se analizaron mediante LC-MS/MS y búsqueda en la base de datos de Mascot. Se identificaron dos tipos de derivados: el derivado Globo H (Globo H Mm CCH) y el derivado MMCCH (MMCCH solo). El derivado de Globo H y sus formas de pérdida neutra se tuvieron en cuenta para la identificación del sitio de conjugación de Globo H. La forma de MMCCH y su forma desamidada se tuvieron en cuenta para la identificación del sitio de conjugación de MMCCH. Solo se tuvieron en cuenta los péptidos con espectros de MS/MS de alta calidad y puntuación de mascota. Para el análisis de conjugación Globo H, se observaron 31 y 28 lisinas conjugadas de los dos análisis replicados LC-MS/MS de OBI-822-13001-DP (muestra 1); se observaron 19 y 21 lisinas conjugadas a partir de los dos análisis replicados LC-MS/MS de OBI-822-13002-DP (muestra 2); se observaron 10 y 11 lisinas conjugadas a partir de los dos análisis replicados LC-MS/MS de OBI-822-13003-DP (muestra 3); se observaron 18 y 19 lisinas conjugadas de los dos análisis de LC-MS/MS replicados de OBI-822-13004-DS (muestra 4). Para el análisis de conjugación de MMCCH, se encontraron 155 y 141 lisinas conjugadas de los dos análisis replicados LC-MS/MS de OBI-822-13001-DP (muestra 1); se encontraron 143 y 137 lisinas conjugadas de los dos análisis de LC-MS/MS replicados de OBI-822-13002-DP (muestra 2); se encontraron 147 y 143 lisinas conjugadas a partir de los dos análisis LC-MS/MS replicados de OBI-822-13003-DP (muestra 3); se encontraron 140 y 136 lisinas conjugadas de los dos análisis LC-MS/MS replicados de OBI-822-13004-DS (muestra 4).

Ejemplo 8: Materiales y métodos:

Las abreviaturas se listan de la siguiente manera:

K = lisina; LC-MS/MS = cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem;

DTT = Ditiolitreitol; IAM = yodoacetamida; ACN = acetonitrilo; FA = ácido fórmico; Glu-C = Endoproteinasa Glu-C; ABC = bicarbonato de amonio; RT = temperatura ambiente; MW = peso molecular.

Las cuatro muestras de KLH, muestras 1-4, se procesaron primero para el intercambio de regulador en una solución reguladora de bicarbonato de amonio 50 mM mediante filtros ultracentrífugos Amicon de corte de 100 kDa y se desnaturalizaron con urea 6 M. Luego, las muestras se redujeron con DTT 10 mM a 37°C durante 1 hora, se alquilaron usando IAM 50 mM durante 30 minutos en oscuridad a temperatura ambiente y se inactivaron con DTT 50 mM a temperatura ambiente durante 5 minutos. Las proteínas resultantes se diluyeron hasta que la concentración de urea era 1 M y se sometieron a digestión en solución con diferentes enzimas como se describe en la siguiente sección.

La digestión en solución con diferentes enzimas se realizó con las siguientes condiciones de digestión: (1) digestión con tripsina a 37°C durante 24 horas (proteína:enzima = 40:1) (2) digestión con Glu-C a 37°C por 24 horas (proteína:enzima = 25:1); (3) digestión con quimotripsina a temperatura ambiente durante 24 horas (proteína:enzima = 25:1); (4) digestión con termolisina a 37°C durante 24 horas (proteína:enzima = 25:1).

Las reacciones de digestión se terminaron agregando ácido fórmico y las cuatro muestras digeridas se sometieron a análisis por LC-MS/MS. Las muestras se analizaron con el espectrómetro de masas Q Exactive (Thermo Scientific) junto con el sistema Ultimate 3000 RSLC (Dionex). La separación por LC se realizó usando la columna C18 (Acclaim PepMap RSLC, 75 pm x 150 mm, 2 pm, 100 A) con el gradiente que se muestra en la Tabla 7.

Tabla 7: El gradiente de separación LC

El CID en la fuente se ajustó a 45 eV. La exploración completa de MS se realizó con el rango de m/z 350-2000, y los diez iones más intensos de la exploración de MS se sometieron a fragmentación para espectros de MS/MS. Los datos sin procesar fueron procesados en listas de picos por Proteome Discoverer 1.4 para la búsqueda en la base de datos de Mascot.

La búsqueda en la base de datos se realizó con Mascot versión 2.4.1 y Thermo Proteome Discoverer versión 1.4 contra la secuencia KLH1 (SEQ ID NO. 1) y la secuencia KLH2 (SEQ ID NO. 2). Los parámetros utilizados fueron los siguientes:

Enzima: tripsina, Glu-C, quimotripsina y termolisina según el método de digestión; Modificación fija: Carbamidometil (C);

Modificaciones variables para derivados de MMCCH (MMCCH solo): desamidada (NQ), oxidación (M), dK_MMCCH-1 (K), dK_MMCCH-2 (K);

Modificaciones variables para derivados de Globo H (Globo H MMCCH): Desamidada (NQ), Oxidación (M), Globo_H_MMCCH (K), dK_MMCCH_NL997 (K), dK_MMCCH_NL835 (K), dK_MMCCH_NL673 (K), dK_MMCCH_NL511 (K), dK_MMCCH_NL308 (K);

Péptido de tolerancia de masa: ± 10 ppm; Fragmento de Tolerancia de Masa: ± 0.05 Da; Escisión máxima perdida: 5; Tipo de instrumento: ESI-TRAP; Puntuación de corte de iones: 13.

"dK_MMCCH-1" en los parámetros de búsqueda indica la lisina conjugada con MMCCH con la adición de MW de 352,1569 Da.

"dK_MMCCH-2" en los parámetros de búsqueda indica la forma desamidada de lisina conjugada con MMCCH con la adición de MW de 338.1300 Da.

"Globo_H_MMCCH (K)" en los parámetros de búsqueda indica la lisina conjugada con Globo H con la adición de MW de 1393.5317 Da.

"dK_MMCCH_NL997" en los parámetros de búsqueda indica la forma de pérdida neutra de lisina conjugada con Globo H con la adición de MW de 396,1831 Da.

"dK_MMCCH_NL835" en los parámetros de búsqueda indica la forma de pérdida neutra de lisina conjugada con Globo H con la adición de MW de 558,2360 Da.

"dK_MMCCH_NL673" en los parámetros de búsqueda indica la forma de pérdida neutra de lisina conjugada con Globo H con la adición de MW de 720.2888 Da.

"dK_MMCCH_NL511" en los parámetros de búsqueda indica la forma de pérdida neutra de lisina conjugada con Globo H con la adición de MW de 882.3416 Da.

"dK_MMCCH_NL308" en los parámetros de búsqueda indica la forma de pérdida neutra de lisina conjugada con Globo H con la adición de MW de 1085.4210 Da.

La "adición de MW' implica la adición de peso molecular en comparación con el residuo de lisina intacto.

Resultados del ejemplo 8:

Las técnicas basadas en LC-MS/MS han surgido como una herramienta importante para la identificación de proteínas y la caracterización de la modificación de aminoácidos. Se puede obtener información detallada sobre secuencias de péptidos y sitios de modificación mediante la asignación de iones de fragmentos proporcionados por los espectros de MS/MS. Mascot es un motor de búsqueda y su algoritmo de puntuación basado en la probabilidad ha sido bien aceptado. La puntuación de Mascot se adoptó en este estudio como referencia de confianza para la secuenciación de proteínas y la identificación del sitio de conjugación Globo H o MMCCH. Para analizar ampliamente la distribución de los sitios de conjugación Globo H o MMCCH en las muestras 1-4, estas muestras se digirieron con múltiples enzimas seguidas de análisis LC-MS/MS.

La estructura química esperada para el derivado de Globo H (Globo H MMCCH) se mostró en la Figura 11A y la adición de MW correspondiente de 1393.53 Da en péptidos que contienen lisina se puede observar entre los resultados. Además, los polisacáridos lábiles tienden a caerse por pérdida neutra durante la ionización por electroaspersión en el análisis LC-MS. Por lo tanto, la adición de peso molecular de 396.18 Da, 558.24 Da, 720.29 Da, 882.34 Da y 1085.42 Da como resultado de la pérdida neutra también se puede observar para los péptidos glucoconjugados, como se muestra en la Figura 11B. Se consideraron todas las formas de derivación para la identificación de los sitios de conjugación de Globo H.

Además, el derivado de MMCCH también se observa (MMCCH solo) en estas muestras de KLH conjugadas con Globo H. La estructura química esperada para el derivado de MMCCH y su forma desamidada se muestran en la Figura 12A y la Figura 12B y la adición de MW correspondiente de 352,16 Da y 338,13 Da respectivamente en péptidos que contienen lisina, se puede observar entre los resultados. Ambas formas de derivación se consideraron para la identificación de sitios de conjugación de MMCCH. La conversión del derivado de Globo H a MMCCH no está clara, pero se supone que ocurre durante el tratamiento de la muestra.

La precisión en masa de ± 10 ppm para el ión precursor y ± 0.05 Da para el ión fragmento se usaron como criterios para la identificación de proteínas y la interpretación de los espectros. El derivado Globo H, así como sus formas de pérdida neutra, se eligieron como modificación variable para la identificación del sitio de conjugación Globo H, y el derivado MMCCH, así como su forma desamidada, se eligió como modificación variable para la identificación del sitio de conjugación MMCCH. La búsqueda en la base de datos se realizó contra la secuencia de KLH1 (SEQ ID NO. 1) y KLH2 (SEQ ID NO. 2). En el informe solo se enumeraron aquellos péptidos con espectros de MS/MS de alta calidad (puntaje iónico >13, p <0.05).

Para demostrar un resultado repetible, el análisis LC-MS/MS se realizó dos veces seguido de una búsqueda individual en la base de datos de Mascot para la identificación del sitio de conjugación Globo H y la identificación del sitio de conjunción MMCCH, como se resume en la Figura 13Ay la Figura 13B.

En el análisis del sitio de conjugación Globo H, se encontraron 31 y 28 lisinas respectivamente en la 1a LC-MS/MS y la 2a LC-MS/MS para la muestra 1; se encontraron 19 y 21 lisinas, respectivamente, en la ia LC-MS/MS y la 2a LC-MS/MS para la muestra 2; se encontraron 10 y 11 lisinas respectivamente en la 1a LC-MS/MS y la 2a LC-MS/MS para la muestra 3; se encontraron 18 y 19 lisinas respectivamente en la 1a LC-MS/MS y 2a LC-MS/MS para la muestra 4.

Los detalles de identificación se enumeraron en las Figuras 14 a 21. En el análisis de conjugación MMCCH, se encontraron 155 y 141 lisinas respectivamente en la 1a LC-MS/MS y 2a LC-MS/MS para la muestra 1; se encontraron 143 y 137 lisinas, respectivamente, en la 1a LC-MS/MS y la 2a LC-MS/MS para la muestra 2; se encontraron 147 y 143 lisinas, respectivamente, en la 1a LC-MS/MS y la 2a LC-MS/MS para la muestra 3; se encontraron 140 y 136 lisinas, respectivamente, en la 1a LC-MS/MS y la 2a LC-MS/MS para la muestra 4. Los detalles de identificación se enumeraron en las Figuras 22 a 29.

Los sitios de conjugación Globo H de múltiples experimentos enzimáticos se resumieron en la Figura 30 y los sitios de conjugación MMCCH se resumieron en la Figura 31. Los resultados globales del análisis del sitio de conjugación para muestras conjugadas con Globo H se resumieron en la Figura 32.

Ejemplo 8 Conclusión:

Las señales de espectrometría de masas de los péptidos conjugados derivados de Globo H son más bajas que las de los péptidos conjugados MMCCH debido a las múltiples formas de pérdida neutra y la menor eficiencia de ionización del polisacárido, lo que hace que la identificación directa de la conjugación Globo H sea más difícil. Esta es la razón por la cual el número de péptidos identificados es mayor para el análisis de conjugación de MMCCH. Por lo tanto, los resultados de MMCCH pueden usarse para representar la conjugación Globo H.

El análisis del sitio de conjugación sugiere que hay 155, 143, 147 y 140 sitios de conjugación de lisina identificados entre el total de 306 residuos de lisina en KLH1/KLH2 para las muestras 1-4, respectivamente. En el análisis de réplica, se identificaron 141, 137, 143 y 136 sitios de conjugación para las muestras 1-4, respectivamente.

Ejemplo 9: Análisis LC-MS/MS de sitios de conjugación Globo-H (histidina, asparagina, prolina, glutamina y arginina) en KLH

Se examinaron dos tipos de derivados en los cinco residuos, H, N, P, Q, R: GMd (enlazador Globo H MMCCH derivado de lisina) y Md (enlazador MMCCH derivado de lisina).

El análisis de modificación en HNPQR (GMd y Md) produjo 6 y 13 sitios HNPQR conjugados en KLH1 y KLH2, respectivamente, para OBI-822-13001-DP (muestra 1); 11 y 10 sitios HNPQR conjugados en KLH1 y KLH2, respectivamente, para OBI-822-13002-DP (muestra 2;

sitios HNPQR conjugados en KLH1 y KLH2, respectivamente, para OBI-822-13003-DP (muestra

sitios HNPQR conjugados en KLH1 y KLH2, respectivamente, para OBI-822-13004-DS (muestra 4).

Ejemplo 9 Materiales y métodos:

Las abreviaturas se listan de la siguiente manera:

K = lisina; H = histidina; N = asparagina; P = prolina; Q = glutamina; R = arginina; LC-MS/MS = cromatografía líquidaespectrometría de masas en tándem; MW = peso molecular.

La búsqueda en la base de datos se realizó con la versión 2.4.1 de Mascot contra la secuencia KLH1 (SEQ ID NO. 1) y la secuencia KLH2 (SEQ ID NO. 2). Los parámetros utilizados fueron los siguientes:

Enzima: tripsina, Glu-C, quimotripsina y termolisina según el método de digestión;

Modificación fija: Carbamidometilo (C);

Modificaciones variables: oxidación (M), desamidación (NQ);

1. OBI822_GMd (HKNPQR), GMd_NL997 (HKNPQR);

2. OBI822_Md (HKNPQR), Md_desamimado (HKNPQR);

Péptido de tolerancia de masa: ± 10 ppm; Fragmento de Tolerancia de Masa: ± 0.05 Da; Escisión máxima perdida: 5;

Tipo de instrumento: ESI-TRAP; Puntuación de corte de iones: 13.

"OBI822_GMd" en los parámetros de búsqueda indica los residuos conjugados con GMd (HKNPQR) con la adición de MW de 1393.5317 Da.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende una pluralidad de unidades estructurales Globo H enlazadas covalentemente a una hasta veinte unidades estructurales de hemocianina de lapa de ojo de cerradura (KLH), en donde las unidades estructurales Globo H están enlazadas covalentemente a las unidades estructurales KLH en uno o más residuos de aminoácidos; y un adyuvante de a-galactosil-ceramida (a-GalCer); en donde la unidad estructural Globo H enlazada covalentemente a una subunidad de la unidad estructural KLH está enlazada por un enlazante 4-(4-N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilhidrazida (MMCCH); y en donde la composición tiene una relación epítopo/vehículo que varía de aproximadamente 800 a aproximadamente 3200.

2. La composición de la reivindicación 1, en donde los residuos de aminoácidos son residuos de aminoácidos básicos, neutros, hidrófobos y/o una combinación de los mismos.

3. La composición de la reivindicación 1 o 2, en donde los residuos de aminoácidos son lisina, arginina, histidina, asparagina, prolina, glutamina y/o una combinación de los mismos.

4. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la unidad estructural KLH es un monómero, dímero, trímero, tetrámero, pentámero, hexámero, heptámero, octámero, nonámero, decámero, undecámero, dodecámero, tridecámero, tetradecámero, pentadecámero, hexadecámero, heptadecámero, octadecámero, nonadecámero o didecámero.

5. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la unidad estructural Globo H comprende (Fuca1^2 G a1p1^3 GalNAcp1^3 G a1a1^4 G a lp1^ 4Glc).

6. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la subunidad de la unidad estructural KLH es al menos 80 % idéntica a SEQ ID NO. 1 o SEQ ID NO. 2.

7. Una composición de cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en el tratamiento del cáncer en un paciente.

8. Una composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el cáncer es cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer bucal, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer nasofaríngeo, cáncer dérmico, cáncer renal, tumor cerebral, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de cérvix, cáncer endometrial, cáncer intestinal, cáncer pancreático o cáncer de vejiga.

9. La composición para uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el cáncer es un cáncer que expresa Globo H.

10. La composición de la reivindicación 1, en donde el adyuvante a-GalCer tiene la siguiente estructura:

11. La composición de la reivindicación 1, en donde las unidades estructurales KLH pueden formar un monómero, dímero, trímero, tetrámero, pentámero, hexámero, heptámero, octámero, nonámero, decámero, undecámero, dodecámero, tridecámero, tetradecámero, pentadecámero, hexadecámero, heptadecámero, octadecámero, nonadecámero o didecámero.

12. La composición de cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en un método para inducir anticuerpos en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de la composición de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.