CN107427564A - 免疫原性/治疗性糖缀合物组合物及其用途 - Google Patents

免疫原性/治疗性糖缀合物组合物及其用途 Download PDF

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Abstract

本公开涵盖包含Globo H‑KLH糖缀合物(OBI‑822)和/或治疗性佐剂(OBI‑821/OBI‑834)的免疫原性/治疗性组合物以及制备和使用所述组合物以治疗增殖性病症，如癌症的方法。治疗性缀合物包含与载体连接的抗原。特别地，治疗性缀合物包含任选经由接头连接的Globo H部分和KLH部分和/或衍生化的KLH部分亚基。部分涵盖治疗性组合物作用为癌症疫苗，用于加强身体经由免疫系统保护自身免于由受损或异常的细胞，如癌细胞造成的危险的天然能力。示例性的免疫应答的特征可以在于疾病的严重性的降低，包括但不限于预防疾病、疾病发作的延迟、症状严重性的降低、降低的发病率和延迟的死亡率。

Description

免疫原性/治疗性糖缀合物组合物及其用途
发明领域
本公开涉及用于癌症免疫疗法的组合物和方法，特别是能够引发抗癌免疫应答的免疫原性/治疗性糖缀合物。
发明背景
糖抗原Globo H(Fucα1→2Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glc)在1984年由Hakomori等人第一次从乳腺癌MCF-7细胞中以神经酰胺连接的糖脂分离并且鉴定。(Bremer E G，et al.(1984)J Biol Chem 259：14773-14777)。用抗Globo H单克隆抗体的进一步研究显示了Globo H存在于许多其它癌症(包括前列腺癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌和结肠癌)上，以及在不容易接近免疫系统的正常分泌组织的腔体表面上仅最小长度表达。(Ragupathi G，et al.(1997)Angew Chem Int Ed 36：125-128)。另外，已经建立了乳腺癌患者的血清含有高水平的抗GloboH抗体。(Gilewski T et al.(2001)Proc Natl AcadSci USA 98：3270-3275；Huang C-Y，et al.(2006)Proc Natl Acad Sci USA 103：15-20；Wang C-C，et al.(2008)Proc NatlAcad Sci USA 105(33)：11661-11666)。Globo H阳性肿瘤患者与Globo H阴性肿瘤患者相比显示更短的存活。(Chang，Y-J，etal.(2007)Proc NatlAcad Sci USA 104(25)：10299-10304)。这些发现使Globo H(一种己糖表位)成为一种有吸引力的肿瘤标志物和对于癌症疫苗开发可行的靶物。
发明概述
虽然已经开发疫苗以引发针对Globo H的抗体应答，但是它们的抗癌效力由于Globo H的低免疫原性而不令人满足。需要能够引发高水平的靶向Globo H的免疫应答的新疫苗。
KLH含有糖基化的多肽亚基，其可以装配以形成十聚体(10-mer)、二十聚体(20-mer)、和更大的颗粒。已经通过超速离心技术表征这些多聚体结构，所述超速离心技术产生11-19S(对于解离的亚基)和92-107S(对于二十聚体多聚体)的沉降系数。多种因素可以影响软疣(molluscam)血蓝蛋白，包括KLH的大小分布。这些因素包括离子强度、pH、温度、pO2、和某些二价阳离子，特别是钙和镁的利用度。
本发明人已经开发出具有令人惊讶的升高的效力的组合物，其主要由与多个GloboH部分连接的KLH的二聚体、三聚体及其它多聚体组成。
因而，本公开一般涵盖包含Globo H的治疗性和/或预防性组合物，及免疫治疗剂、疫苗、剂量形式、试剂盒、和制备及其治疗的方法。
在一个实施方案中，本发明涵盖包含与匙孔血蓝蛋白(KLH)部分亚基连接的Globo H部分的分离的治疗性缀合物。在某些实施方案中，连接是共价键。
在另一个实施方案中，本发明涵盖分离的治疗性缀合物，其包含与匙孔血蓝蛋白(KLH)部分亚基共价连接的Globo H部分，其中KLH是衍生化的KLH。如本文中使用，术语“共价连接”在提及Globo-H和KLH时意指：Globo-H与KLH直接共价连接，或者Globo-H与衍生化的KLH(如本文中列出)共价连接，或者Globo-H经由接头基团(如本文中列出)与KLH共价连接，或者Globo-H经由接头基团和衍生化的KLH两者与KLH共价连接。
在某些示例性的实施方案中，本发明的衍生化的KLH具有以下结构：
在一个实施方案中，本发明涵盖分离的治疗性缀合物，其包含经由接头分子与匙孔血蓝蛋白(KLH)部分亚基共价连接的Globo H部分。
在一个实施方案中，Globo H部分与KLH部分亚基的赖氨酸残基结合。
在一个实施方案中，每个KLH部分亚基有可用于或实际上直接或间接直接Globo H部分的总共准确地或约145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160个总共赖氨酸残基。
在另一个实施方案中，本发明涵盖分离的治疗性缀合物，其包含经由4-(4-N-马来酰亚胺甲基)环己胺-1-羟基酰肼(MMCCH)接头基团与匙孔血蓝蛋白(KLH)部分亚基共价连接的Globo H部分。本发明的MMCCH接头具有以下结构：
在另一个示例性的实施方案中，本发明涵盖具有以下通用结构的分离的治疗性缀合物：
其中n是约1至约160的整数。在某些实施方案中，单体KLH部分可以包含约1至约160Globo H部分。本领域普通技术人员将认识到结构以盐酸亚铵盐(iminiumhydrochloride salt)例示，但是也可以以亚胺(imine)形式存在或共存。因而，本发明涵盖亚胺及其盐两者，包括例如盐酸亚铵盐。在某些实施方案中，单体KLH部分可以包括约1至约125Globo H部分。在某些实施方案中，单体KLH部分可以包括约1至约100Globo H部分。在某些实施方案中，单体KLH部分可以包括1至约75Globo H部分。在某些实施方案中，单体KLH部分可以包括约1至约50Globo H部分。在某些实施方案中，单体KLH部分可以包括约1至约25Globo H部分。在某些实施方案中，单体KLH部分可以包括约1至约10Globo H部分。
在某些实施方案中，Globo H部分与KLH部分缀合，与某些氨基酸残基共价缀合。在某些实施方案中，氨基酸残基可以包括或排除精氨酸、赖氨酸、组氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺或其组合。
在另一个实施方案中，Globo H部分与单体KLH部分亚基上的赖氨酸缀合位点结合。
在另一个实施方案中，每个单体KLH部分亚基上有可用于结合Globo H部分或实际上与Globo H部分结合的准确地或约60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109或110个赖氨酸缀合位点。在另一个实施方案中，每个KLH部分亚基上有62、66、67、68、70、72、76、86、87、88、90、92、93、100个此类赖氨酸缀合位点。
在含有部分亚基(例如KLH1和KLH2或其变体)的混合物的某些治疗性组合物实施方案中，总共可用的赖氨酸(对于这两种亚基)在不同亚基类型间计算在一起，并且数目可以是或是准确地约290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309或310。在此类实施方案中，不同亚基(例如KLH1和KLH2或其变体)间一起有准确地或约130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159或160个赖氨酸缀合位点。在其它此类实施方案中，存在有136、137、141、140、143、147或155个赖氨酸缀合位点。
在另一个示例性的实施方案中，本发明涵盖具有以下通用结构的分离的免疫原性/治疗性缀合物：
其中n独立是约1至约3000的整数，并且m独立是约1至约20的整数。在某些实施方案中，当m大于1时，KLH部分可以聚集以形成多聚体结构。在某些实施方案中，聚集是共价键。在某些其它实施方案中，聚集不是共价键(例如聚集通过H键键合或疏水性相互作用形成)。在某些实施方案中，单体KLH部分(即其中m＝1)可以包括约1至约160Globo H部分。在某些实施方案中，二聚体KLH部分(即其中m＝2)可以包括约1至约300Globo H部分。在某些实施方案中，三聚体KLH部分(即其中m＝3)可以包括约1至约450Globo H部分。在某些实施方案中，四聚体KLH部分(即其中m＝4)可以包括约1至约600Globo H部分。在某些实施方案中，五聚体KLH部分(即其中m＝5)可以包括约1至约750Globo H部分。在某些实施方案中，六聚体KLH部分(即其中m＝6)可以包括约1至约900Globo H部分。在某些实施方案中，二十聚体KLH部分(即其中m＝20)可以包括约1至约3000Globo H部分。
在另一个示例性的实施方案中，本发明涵盖具有以下通用结构的分离的免疫原性/治疗性缀合物：
其中n独立是约1至约150的整数，并且m独立是约1至约20的整数。
在另一个实施方案中，本发明涵盖具有以下通用结构的分离的治疗性缀合物：
其中n独立是约1至约160的整数，并且其中m独立是约1至约20的整数。在某些实施方案中，m是约1至约5的整数。在某些实施方案中，m是约1至约3的整数。在某些实施方案中，m是1。在某些实施方案中，m是2。在某些实施方案中，m是3。在某些实施方案中，m是4。在某些实施方案中，m是5。在某些实施方案中，m是6。在某些实施方案中，m是7。在某些实施方案中，m是8。在某些实施方案中，m是9。在某些实施方案中，m是10。在某些实施方案中，m是11。在某些实施方案中，m是12。在某些实施方案中，m是13。在某些实施方案中，m是14。在某些实施方案中，m是15。在某些实施方案中，m是16。在某些实施方案中，m是17。在某些实施方案中，m是18。在某些实施方案中，m是19。在某些实施方案中，m是20。在某些实施方案中，对于任何上述实施方案，当m是1至20时，每个n分别是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159或160。
在某些实施方案中，存在有与每个单体KLH部分附着的超过一个GloboH部分。在某些示例性的实施方案中，经由接头附着与每个KLH部分附着的超过一个Globo H部分。在其它示例性的实施方案中，经由接头附着与每个KLH部分附着的超过一个Globo H部分，并且附着到衍生化的KLH部分。
在另一个实施方案中，Globo H部分与KLH部分亚基的比率是至少1。在另一个实施方案中，Globo H部分与KLH部分亚基的比率是至少10。在另一个实施方案中，Globo H部分与KLH部分的比率是至少25。在另一个实施方案中，Globo H部分与KLH部分亚基的比率是至少至少50。在别的实施方案中，Globo H部分与KLH部分亚基的比率是至少100。在别的实施方案中，Globo H部分与KLH部分亚基的比率是至少150。在又一个实施方案中，GloboH部分与KLH部分亚基的比率是至少500。在别的实施方案中，Globo H部分与KLH部分亚基的比率是至少750。在又一个实施方案中，Globo H部分与KLH部分亚基的比率是至少1000。在又一个实施方案中，Globo H部分与KLH部分亚基的比率是至少1500。在又一个实施方案中，Globo H部分与KLH部分亚基的比率是至少2000。
在多个实施方案中，本发明涵盖KLH的单一单体至多个各已经附着多个Globo H部分的KLH亚基(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20)。在某些实施方案中，Globo H部分与KLH部分的比率是相同的。在其它实施方案中，Globo H部分与KLH部分的比率是不同的。
本发明的另一个实施方案中包含组合物，其包含至少两个KLH部分。例如，二聚体形式的衍生化的KLH部分。在另一个实施方案中，至少两个KLH部分是相同的。在另一个实施方案中，至少两个KLH部分是不同的。在别的实施方案中，至少两个KLH部分具有相同的Globo H部分与KLH部分亚基比率。在别的实施方案中，至少两个KLH部分具有不同的GloboH部分与KLH部分亚基比率。
本发明的另一个实施方案中含有治疗性组合物，其包含至少三个KLH部分，例如，三聚体形式的衍生化的KLH部分。在某些实施方案中，至少三个KLH部分是相同的。在另一个实施方案中，至少三个KLH部分不是相同的。在别的实施方案中，至少三个KLH部分具有相同的Globo H部分与KLH部分亚基比率。在别的实施方案中，至少三个KLH部分具有不同GloboH部分与KLH部分亚基比率。
本发明的另一个实施方案中涵盖治疗性组合物，其包含至少四个KLH部分，例如，四聚体形式的衍生化的KLH部分。在某些实施方案中，至少四个KLH部分是相同的。在另一个实施方案中，至少四个KLH部分不是相同的。在别的实施方案中，至少四个KLH部分具有相同的Globo H部分至KLH部分亚基比率。在别的实施方案中，至少四个KLH部分具有不同的Globo H部分与KLH部分亚基比率。
本发明的另一个实施方案中含有治疗性组合物，其包含至少五个KLH部分，例如，五聚体形式的衍生化的KLH部分。在某些实施方案中，至少五个KLH部分是相同的。在另一个实施方案中，至少五个KLH部分不是相同的。在别的实施方案中，至少五个KLH部分具有相同的Globo H部分至KLH部分亚基比率。在别的实施方案中，至少五个KLH部分具有不同的Globo H部分与KLH部分亚基比率。
本发明的另一个实施方案中含有治疗性组合物，其包含至少六个KLH部分，例如，六聚体形式的衍生化的KLH部分。在某些实施方案中，至少六个KLH部分是相同的。在另一个实施方案中，至少六个KLH部分不是相同的。在别的实施方案中，至少六个KLH部分具有相同的Globo H部分至KLH部分亚基比率。在别的实施方案中，至少六个KLH部分具有不同的Globo H部分与KLH部分亚基比率。
本发明的另一个实施方案中含有治疗性组合物，其包含至少二十个KLH部分，例如，二十聚体形式的衍生化的KLH部分。在某些实施方案中，至少二十个KLH部分是相同的。在另一个实施方案中，至少二十个KLH部分不是相同的。在别的实施方案中，至少二十个KLH部分具有相同的Globo H部分至KLH部分亚基比率。在别的实施方案中，至少二十个KLH部分具有不同的Globo H部分与KLH部分亚基比率。
在一个实施方案中，Globo H部分包含(Fucα1→2Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glc)。在别的实施方案中，KLH部分亚基是KLH-1或KLH-2部分或其组合。如本文中使用，术语“KLH”指KLH-1、KLH-2、和/或其组合。
在另一个实施方案中，KLH部分亚基与相应天然存在的KLH部分亚基至少99％相同。
在另一个实施方案中，KLH部分亚基与相应天然存在的KLH部分亚基至少95％相同。
在另一个实施方案中，KLH部分亚基与相应天然存在的KLH部分亚基至少90％相同。
在另一个实施方案中，KLH部分亚基与相应天然存在的KLH部分亚基至少80％相同。
在另一个实施方案中，KLH部分亚基与相应天然存在的KLH部分亚基至少70％相同。
在另一个实施方案中，KLH部分亚基与相应天然存在的KLH部分亚基至少60％相同。
在另一个实施方案中，Globo H部分经由接头与匙孔血蓝蛋白(KLH)部分亚基共价连接。在别的实施方案中，Globo H部分通过4-(4-N-马来酰亚胺甲基)环己胺-1-羟基酰肼(MMCCH)连接与匙孔血蓝蛋白(KLH)部分亚基共价连接。在另一个实施方案中，Globo H部分与衍生化的匙孔血蓝蛋白(KLH)部分亚基共价连接，并且通过4-(4-N-马来酰亚胺甲基)环己胺-1-羟基酰肼(MMCCH)连接来连接。
在另一个实施方案中，基于具有约350KDa至约400KDa的分子量的KLH单体，分离的治疗性缀合物具有至少或约150的表位比率。在另一个实施方案中，分离的治疗性缀合物具有至少或约100的表位比率。在别的实施方案中，分离的治疗性缀合物具有至少或约75的表位比率。在别的实施方案中，分离的治疗性缀合物具有至少或约50的表位比率。在别的实施方案中，分离的治疗性缀合物具有至少或约25的表位比率。在又一个实施方案中，分离的治疗性缀合物具有至少或约15的表位比率。在又一个实施方案中，分离的治疗性缀合物具有至少或约5的表位比率。在又一个实施方案中，分离的治疗性缀合物具有至少或约1的表位比率。
本发明的另一个实施方案中涵盖药物组合物，其包含KLH部分亚基，其中每个KLH部分亚基包含与匙孔血蓝蛋白(KLH)部分亚基共价连接的一个或多个Globo H部分。在某些实施方案中，药物组合物包含至少两个KLH部分亚基的二聚体，其中每个KLH部分亚基包含与KLH部分亚基共价连接的一个或多个Globo H部分。在某些实施方案中，药物组合物包含至少三个KLH部分亚基的三聚体，其中每个KLH部分亚基包含与KLH部分亚基共价连接的一个或多个Globo H部分。在某些实施方案中，药物组合物包含至少四个KLH部分亚基，其中每个KLH部分亚基包含与KLH部分亚基共价连接的一个或多个Globo H部分。在某些实施方案中，药物组合物包含KLH部分亚基(例如单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体等等)的混合物，其中每个KLH部分亚基包含与KLH部分亚基共价连接的多个Globo H部分。
本发明的另一个方面涉及药物组合物，其包含KLH部分的单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体或其组合，其中每个KLH包含与匙孔血蓝蛋白(KLH)部分亚基共价连接的一个或多个Globo H部分。
在本发明的一个实施方案中，组合物中的治疗性缀合物的表位比率范围为约1至3000。在别的实施方案中，组合物中的治疗性缀合物的表位比率范围为约75至2000。在又一个实施方案中，组合物中的治疗性缀合物的表位比率范围为约100至1000。在又一个实施方案中，组合物中的治疗性缀合物的表位比率范围为约150至500。
在另一个实施方案中，组合物中的约1％至99％的治疗性缀合物是KLH单体。在别的实施方案中，组合物中的约1％至99％的治疗性缀合物是KLH二聚体。在又一个实施方案中，组合物中的约1％至99％的治疗性缀合物是KLH三聚体。在又一个实施方案中，组合物中的约1％至99％的治疗性缀合物是KLH四聚体。在别的实施方案中，组合物中的约1％至99％的治疗性缀合物是KLH五聚体。在别的实施方案中，组合物中的约1％至99％的治疗性缀合物包含6个KLH亚基。在又一个实施方案中，组合物中的约1％至99％的治疗性缀合物包含7个KLH亚基。在又一个实施方案中，组合物中的约1％至99％的治疗性缀合物包含8个KLH亚基。在又一个实施方案中，组合物中的约1％至99％的治疗性缀合物包含9个KLH亚基。在又一个实施方案中，组合物中的约1％至99％的治疗性缀合物包含10个KLH亚基。在又一个实施方案中，组合物中的约1％至99％的治疗性缀合物包含11个KLH亚基。在又一个实施方案中，在又一个实施方案中，组合物中的约1％至99％的治疗性缀合物包含12个KLH亚基。在又一个实施方案中，在又一个实施方案中，组合物中的约1％至99％的治疗性缀合物包含13个KLH亚基。在又一个实施方案中，在又一个实施方案中，组合物中的约1％至99％的治疗性缀合物包含14个KLH亚基。在又一个实施方案中，在又一个实施方案中，组合物中的约1％至99％的治疗性缀合物包含15个KLH亚基。在又一个实施方案中，组合物中的约1％至99％的治疗性缀合物包含16个KLH亚基。在又一个实施方案中，组合物中的约1％至99％的治疗性缀合物包含17个KLH亚基。在又一个实施方案中，组合物中的约1％至99％的治疗性缀合物包含18个KLH亚基。在又一个实施方案中，组合物中的约1％至99％的治疗性缀合物包含19个KLH亚基。在又一个实施方案中，在又一个实施方案中，组合物中的约1％至99％的治疗性缀合物包含20个KLH亚基。在另一个实施方案中，组合物中的约1％至99％的治疗性缀合物是单体、二聚体、三聚体、四聚体或其组合。在另一个实施方案中，组合物中的约99％的治疗性缀合物是单体、二聚体、三聚体、四聚体或其组合。
在某些实施方案中，某些示例性的组合物实施方案及其使用方法可以包括或排除(例如但书)本文中描述的任何一种或多种代表性的化合物和/或组合物实施方案。
在另一个实施方案中，药物组合物包含佐剂。如本文中使用，术语“免疫佐剂”指与免疫原一起使用的物质，其增强或修饰对免疫原的免疫应答。具体地，术语“佐剂”和“免疫佐剂”在本发明中可互换使用，并且指在单独对宿主施用时可以是非免疫原性，但是在与所述抗原结合施用时提升宿主对另一种抗原的免疫应答的化合物或混合物。可以通过本领域中已知的任何方法评估佐剂介导的免疫应答的增强和/或持续时间延长，所述方法包括但不限于下列一种或多种：(i)响应用佐剂/抗原组合的免疫生成的抗体数目相对于响应仅用抗原免疫生成的抗体数目的增加；(ii)识别抗原或佐剂的T细胞的数目增加；和(iii)一种或多种I型细胞因子水平升高。
可以施用佐剂作为包含抗原的药物或疫苗组合物的部分或者作为分开的配制剂，其与含有抗原的第二组合物结合施用。在这些组合物中的任一种中，可以将鞘糖脂(GSL)与其它佐剂和/或赋形剂/载体组合。这些其它佐剂包括但不限于油乳剂和基于乳化剂的佐剂，诸如完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、MF59、或SAF；矿物质凝胶，如氢氧化铝(明矾)、硫酸铝或硫酸钙；微生物衍生的佐剂，如霍乱毒素(CT)、百日咳毒素、大肠杆菌热不稳定性毒素(LT)、突变体毒素(例如LTK63或LTR72)、卡介苗(Bacille Calmette-Guerin，BCG)、小棒杆菌(Corynebacterium parvum)、DNA CpG基序、胞壁酰二肽、或单磷酰脂质A；颗粒佐剂，如免疫刺激性复合物(ISCOM)、脂质体、生物降解性微球、或皂苷(例如QS-21)；细胞因子，如IFN-γ、IL-2、IL-12或GM-CSF；合成佐剂，如非离子嵌段共聚物、胞壁酰肽类似物(例如N-乙酰基胞壁酰-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺[thr-MDP]、N-乙酰基去甲-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰基、N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰基-L-丙氨酸-2-[1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰基氧基]-乙胺)、聚膦腈(polyphosphazenes)、或合成多核苷酸、和表面活性物质，如溶血卵磷脂、pluronic多元醇、聚阴离子、肽、烃乳剂、或匙孔血蓝蛋白(KLH)、Toll样受体分子、LPS、脂质蛋白、脂肽、鞭毛蛋白、双链RNA、病毒DNA、未甲基化的CpG岛、左旋咪唑、卡介苗、异丙肌苷、日达仙(Zadaxin)、PD-1拮抗剂、PD-1抗体、CTLA拮抗剂、CTLA抗体、白介素、细胞因子、GM-CSF、糖脂、基于铝盐的、磷酸铝、明矾、氢氧化铝、脂质体、TLR2激动剂、脂肽、纳米颗粒、单磷酰基脂质A、OBI-821皂苷、皂苷、OBI-834佐剂、C34佐剂、水包油纳米乳剂、和细菌样颗粒。优选地，这些另外的佐剂也是药学可接受的，用于在人中使用。
在另一个实施方案中，药物组合物包含选自下组的细胞因子：IL-2、IL-12、IL-18、IL-2、IFN-γ、TNF、IL-4、IL-10、IL-13、IL-21、GM-CSF和TGF-β。在别的实施方案中，药物组合物包含趋化因子。
在别的实施方案中，免疫原性/治疗性药剂以药物组合物施用。
在又一个实施方案中，药物组合物包含单克隆抗体、化学治疗剂、激素治疗剂、类视色素(retinoid)受体调节剂、细胞毒性/细胞抑制剂、抗肿瘤剂、抗增殖剂、抗mTOR剂、抗Her2剂、抗EGFR剂、异戊二烯基-蛋白转移酶抑制剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、氮芥、亚硝基脲、血管生成抑制剂、贝伐单抗(bevacizumab)、细胞增殖和存活信号传导途径抑制剂、凋亡诱导剂、干扰细胞循环检查点的药剂、干扰受体酪氨酸激酶(RTK)的药剂、整联蛋白阻断剂、NSAID、PPAR激动剂、固有多药物抗性(MDR)抑制剂、止吐剂、可用于治疗贫血的药物、可用于治疗嗜中性粒细胞减少症的药物、免疫增强药物、双膦酸盐、芳香酶抑制剂、诱导新生细胞终末分化的药剂、γ-分泌酶抑制剂、癌症疫苗(例如活性免疫疗法)、单克隆抗体治疗剂(例如被动免疫疗法)、以及其任何组合。
在另一个实施方案中，本发明的治疗性组合物可以进一步包含PD-1/PD-L1抑制剂(细胞毒性T细胞淋巴细胞(CTL)免疫疗法)、CTLA-4免疫疗法、CDK4/6抑制剂(靶物疗法)、P13K抑制剂(靶物疗法)、mTOR抑制剂(靶物疗法)、AKT抑制剂(靶物疗法)、Pan-Her抑制剂(靶物疗法)。可以修饰这些抑制剂以也产生相应的单克隆抗体。可以在本发明的治疗性组合物中包含此类抗体。
在另一个实施方案中，药物组合物包含药学可接受载体。在别的实施方案中，药物组合物是癌症疫苗。在又一个实施方案中，配制药物组合物以皮下施用。在又一个实施方案中，配制药物组合物以肌肉内施用。在另一个实施方案中，配制药物组合物以动脉内施用。在又一个实施方案中，配制药物组合物以静脉内施用。
本发明的另一个实施方案中涵盖治疗有此需要的患者的方法，其包括对患者施用治疗有效量的包含Globo H和KLH的治疗性组合物。在一个实施方案中，患者已经诊断为或怀疑具有癌症。在另一个实施方案中，癌症是上皮癌。在别的实施方案中，癌症是乳腺癌。在又一个实施方案中，药物/治疗性组合物中的治疗有效量的Globo-H部分的范围可以是约0.001μg/kg至约250mg/kg。在别的实施方案中，药物/治疗性组合物中的治疗性有效量Globo-H部分包含每剂约10μg/kg至约50μg/kg一种治疗性缀合物。在别的实施方案中，药物/治疗性组合物中的治疗有效量Globo-H部分包含每剂约0.10μg/kg至约0.75μg/kg一种治疗性缀合物。
在又一个实施方案中，治疗性组合物中的治疗有效量的Globo-H-KLH复合物范围可以为约0.001μg/kg至约250mg/kg。在别的实施方案中，治疗性组合物中的治疗有效量的Globo-H-KLH复合物包含每剂约10μg/kg至约50μg/kg一种治疗性缀合物。在别的实施方案中，治疗性组合物中的治疗有效量的Globo-H-KLH复合物包含每剂约0.60μg/kg至约4.50μg/kg一种治疗性缀合物。
在又一个实施方案中，方法能够相对于对照安慰剂将无进展存活延长约或至少1周。在又一个实施方案中，方法能够相对于对照安慰剂将无进展存活延长约或至少2周。在又一个实施方案中，方法能够相对于对照安慰剂将无进展存活延长约或至少1个月。在又一个实施方案中，方法能够相对于对照安慰剂将无进展存活延长约或至少3个月。在又一个实施方案中，方法能够相对于对照安慰剂将无进展存活延长约或至少6个月。在又一个实施方案中，方法能够相对于对照安慰剂将无进展存活延长约或至少12个月。
附图简述
当结合随后的详细描述考虑时，参考附图可以获得对本发明的更完整的理解。附图中例示的实施方案仅旨在举例说明本发明，而不应解释为将本发明限于显示的实施方案。
图1A显示了Globo H的化学结构以及几个示例性Globo H类似物。Glc代表葡萄糖，Gal代表半乳糖，GalNAc代表N-乙酰半乳糖胺，并且Fuc代表岩藻糖。图1B显示了通过MMCCH接头缀合的示例性Globo H-KLH亚基。
图2A显示了示例性的Globo H-KLH亚基缀合合成途径。图2B显示了与Slovin etal(1999)，Proc Natl Acad Sci USA 96：5710-5和Gilewski et al(2001)，Proc NatlAcad Sci USA 98：3270-5中公开的Globo H缀合物相比较的本发明的Globo H-KLH二聚体和三聚体。
图3显示了天然KLH(8.3MDa)的多角度激光散射光谱法(MALS)的结果。
图4A显示使用多角度激光散射光谱法(MALS)作为检测器的KLH的大小排阻层析的结果。图4B显示KLH的质量分布分析。图4C显示了使用多角度激光散射光谱法(MALS)作为检测器的Globo H-KLH糖缀合物(OBI-822批次no.14001)的大小排阻层析法的结果。图4D显示了Globo H-KLH糖缀合物的质量分布。
图5A显示了用示例性Globo H-KLH糖缀合物(7.5μg和25μg)免疫的路易鼠(Lewisrat)中B细胞群体的时间顺序扩充。图5B显示了用示例性GloboH-KLH糖缀合物(7.5μg和25μg)免疫的路易鼠中CD3 T细胞群体的时间顺序扩充。图5C显示了用示例性Globo H-KLH糖缀合物(7.5μg和25μg)免疫的路易鼠中CD4 T细胞群体的时间顺序扩充。图5D显示了用示例性Globo H-KLH糖缀合物(7.5μg和25μg)免疫的路易鼠中CD8T细胞群体的时间顺序扩充。数据呈现为相对于PBS组的细胞数的百分比标准化的指定组中细胞数的百分比。使用双因素ANOVA分析多重比较，接着是Bonferroni的事后检验。与PBS相比，*，p＜0.05，**，p＜0.01和***，p＜0.001。
图6A显示了用示例性Globo H-KLH糖缀合物(7.5μg和25μg)免疫的路易鼠的血液中IgM抗体的倒数滴度(reciprocal titer)的时间顺序变化。图6B显示了用示例性GloboH-KLH糖缀合物(7.5μg和25μg)免疫的路易鼠的血液中IgG抗体的倒数滴度的时间顺序变化。
图7显示了响应于Globo H和KLH之间缀合比率(0.17∶1和0.07∶1)的小鼠中的IgM抗体滴度。
图8显示了用PBS、Globo H-KLH糖缀合物+皂苷佐剂(OBI-822+OBI-821)和GloboH-KLH糖缀合物+C34佐剂(OBI-822+OBI-834)免疫的C57BL/6小鼠的免疫原性。在第42天收集血清用于ELISA分析以测定抗Globo H IgM和IgG抗体的产生。图8A显示IgM产生。图8B显示IgG产生。Globo H-KLH糖缀合物的皮下(SC)施用为2μg，并且佐剂为20μg。
图9显示了给6组有免疫能力的(6-8周龄)、无病原体(SPF)C57BL/6雌性小鼠注射0.1mL中5.0×106个Lewis肺癌(LL/2，ATCC CRL-1642)细胞(对于C57BL/6小鼠同基因)，在第16天向实验小鼠的侧面皮下注射到腹部区域中。三个测试条件(仅PBS，OBI-822+OBI-821佐剂和OBI-822+OBI-834佐剂)在第0、5、11、19、29、34和39天以0.2mL/小鼠(在左、右腹部部位，0.1mL/部位)皮下施用或以10mL/kg的给药体积腹膜内施用。在第42天处死后拍摄包含肿瘤的全身体照片。
图10显示了在第0、5、11、19、29、34和39天用PBS、OBI-822+OBI-821佐剂和OBI-822+OBI-834佐剂皮下接种疫苗的经Globo H-KLH糖缀合物免疫的C57BL/6小鼠的LL/2(Lewis肺癌细胞系)肿瘤生长。在第16天将LL/2细胞(0.1mL中的5.0×106)皮下注射到每只小鼠中。在第16、19、23、26、30、34、37、40和42天监测肿瘤大小。
图11显示了Globo H衍生物的化学结构。图11A显示了Globo H衍生物[化学式：C(56)H(91)N(5)O(33)S(1)，单同位素MW添加：1393.5317Da]。图11B显示了Globo H衍生物的中性丧失形式。化学式1：C(18)H(28)N(4)O(4)S(1)，单同位素MW添加：396.1831Da；化学式2：C(24)H(38)N(4)O(9)S(1)，单同位素MW添加：558.2360Da；化学式3：C(30)H(48)N(4)O(14)S(1)，单同位素MW添加：720.2888Da；化学式4：C(36)H(58)N(4)O(19)S(1)，单同位素MW添加：882.3416Da；化学式5：C(44)H(71)N(5)O(24)S(1)，单同位素MW添加：1085.4210Da。
图12显示了MMCCH衍生物的化学结构。图12A显示了MMCCH衍生物的化学结构[化学式：C(16)H(24)N(4)O(3)S(1)，单同位素MW添加：352.1569Da]。图12B显示了脱酰胺的MMCCH衍生物[化学式：C(16)H(22)N(2)O(4)S(1)，单同位素MW添加：338.1300Da]。
图13显示了赖氨酸残基上Globo H和MMCCH衍生肽鉴定的汇总。
图14显示了对于KLH1(A)和KLH2(B)的样品1(第1次LC-MS/MS)的赖氨酸残基上缀合有Globo-H的肽的鉴定详情。
图15显示了对于KLH1(A)和KLH2(B)的样品2(第1次LC-MS/MS)的赖氨酸残基上缀合有Globo-H的肽的鉴定详情。
图16显示了对于KLH1(A)和KLH2(B)的样品3(第1次LC-MS/MS)的赖氨酸残基上缀合有Globo-H的肽的鉴定详情。
图17显示了对于KLH1(A)和KLH2(B)的样品4(第1次LC-MS/MS)的赖氨酸残基上缀合有Globo-H的肽的鉴定详情。
图18显示了对于KLH1(A)和KLH2(B)的样品1(第2次LC-MS/MS)的赖氨酸残基上缀合有Globo-H的肽的鉴定详情。
图19显示了对于KLH1(A)和KLH2(B)的样品2(第2次LC-MS/MS)的赖氨酸残基上缀合有Globo-H的肽的鉴定详情。
图20显示了对于KLH1(A)和KLH2(B)的样品3(第2次LC-MS/MS)的赖氨酸残基上缀合有Globo-H的肽的鉴定详情。
图21显示了对于KLH1(A)和KLH2(B)的样品4(第2次LC-MS/MS)的赖氨酸残基上缀合有Globo-H的肽的鉴定详情。
图22显示了对于KLH1(A)和KLH2(B)的样品1(第1次LC-MS/MS)的赖氨酸残基上缀合有MMCCH的肽的鉴定详情。
图23显示了对于KLH1(A)和KLH2(B)的样品2(第1次LC-MS/MS)的赖氨酸残基上缀合有MMCCH的肽的鉴定详情。
图24显示了对于KLH1(A)和KLH2(B)的样品3(第1次LC-MS/MS)的赖氨酸残基上缀合有MMCCH的肽的鉴定详情。
图25显示了对于KLH1(A)和KLH2(B)的样品4(第1次LC-MS/MS)的赖氨酸残基上缀合有MMCCH的肽的鉴定详情。
图26显示了对于KLH1(A)和KLH2(B)的样品1(第2次LC-MS/MS)的赖氨酸残基上缀合有MMCCH的肽的鉴定详情。
图27显示了对于KLH1(A)和KLH2(B)的样品2(第2次LC-MS/MS)的赖氨酸残基上缀合有MMCCH的肽的鉴定详情。
图28显示了对于KLH1(A)和KLH2(B)的样品3(第2次LC-MS/MS)的赖氨酸残基上缀合有MMCCH的肽的鉴定详情。
图29显示了对于KLH1(A)和KLH2(B)的样品4(第2次LC-MS/MS)的赖氨酸残基上缀合有MMCCH的肽的鉴定详情。图30显示了KLH1(A)和KLH2(B)的(第1次LC-MS/MS)；KLH1(C)和KLH2(D)的(第2次LC-MS/MS)的缀合有Globo-H的赖氨酸位点鉴定的汇总。
图31显示了KLH1(A)和KLH2(B)的(第1次LC-MS/MS)；KLH1(C)和KLH2(D)的(第2次LC-MS/MS)的缀合有MMCCH的赖氨酸位点鉴定的汇总。
图32显示了第一次(A)和第二次(B)LC-MS/MS运行中的Globo-H缀合分析的汇总。
图33显示了组氨酸(H)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)和精氨酸(R)残基上的示例性Globo H和MMCCH衍生物肽鉴定的汇总。
图34显示了KLH1(A)和KLH2(B)的样品1(LC-MS/MS)的HNPQR残基上缀合有Globo H的肽和缀合有MMCCH的肽的鉴定详情。
图35显示了KLH1(A)和KLH2(B)的样品2(LC-MS/MS)的HNPQR残基上缀合有Globo H的肽和缀合有MMCCH的肽的鉴定详情。
图36显示了KLH1(A)和KLH2(B)的样品3(LC-MS/MS)的HNPQR残基上缀合有Globo H的肽和缀合有MMCCH的肽的鉴定详情。
图37显示了KLH1(A)和KLH2(B)的样品4(LC-MS/MS)的HNPQR残基上缀合有Globo H的肽和缀合有MMCCH的肽的鉴定详情。
图38显示了组氨酸(H)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)和精氨酸(R)残基上的示例性Globo H和MMCCH衍生物分析的汇总。
发明详述
除非另有指示，本发明的实践可以采用分子生物学、微生物学、和免疫学的常规技术，其在本领域技术内。此类技术在文献中完整解释。参见例如Molecular Cloning ALaboratory Manual，第2版，Sambrook编，Fritschand Maniatis(Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glover ed.，1985)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized CellsAnd Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the treatise，Methods In Enzymology(AcademicPress，Inc.，N.Y.)；GeneTransfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos编，1987，ColdSpring Harbor Laboratory)；Methods In Enzymology，卷154和155(Wu et al.编)，Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker编，Academic Press，London，1987)；Antibodies：A LaboratoryManual，Harlow and Lanes(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988)；以及Handbook Of ExperimentalImmunology，Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell编，1986)。
使用合成糖缀合物引发抗体首次由Goebel and Avery in 1929.(Goebel，W.F.，and Avery，O.T.，J.Exp.Med.，1929，50，521；Avery，O.T.，and Goebel，W.F.，J.Exp.Med.，1929，50，533.)证明。糖经由重氮苯正离子糖苷(benzenediazonium glycosides)与载体蛋白连接。用合成抗原免疫兔产生多克隆抗体。其他工作者(Allen，P.Z.，and Goldstein，I.J.，Biochemistry，1967，6，3029；Rude，E.，and Delius，M.M.，Carbohydr.Res.，1968，8，219；Himmelspach，K.，et al.，Eur.J.Immunol.，1971，1，106；Fielder，R.J.，et al.，J.Immunol.，1970，105，265)开发出用于将糖与蛋白质载体缀合的相似技术。
糖缀合物可用于从疫苗产生的活性免疫疗法，以特异性靶向肿瘤细胞上的已知靶作用剂。对糖抗原的应答通常不会引发T细胞的使用，这将有助于身体对肿瘤的排斥。虽然认为由于用缀合物的疫苗接种所致的完全肿瘤排斥的可能性是不太可能的，但是此类治疗将加强免疫监视，并且可以减少新的肿瘤集落的复发。(Dennis，J.，Oxford GlycosystemsGlyconews Second，1992；Lloyd，K.O.，于SpecificImmunotherapy of Cancer withVaccines，1993，New York Academy of Sciences，50-58)。Toyokuni和Singhal已经描述了一种合成的糖缀合物(Toyokuni，T.，etal.，J.Am.Chem.Soc.，1994，116，395)，其刺激了可测量的IgG滴度，一种重大的结果，因为IgG应答通常与辅助T细胞的征募(enlistment)有关。
显示与免疫佐剂组合的合成Globo H疫苗在前列腺和转移性乳腺癌患者两者中主要诱导IgM以及在较小程度上诱导IgG抗体。在I期临床试验中，疫苗也在疫苗接种部位处显示最小的毒性及短暂的局部皮肤反应。(Gilewski T etal.(2001)Proc Natl Acad SciUSA 98：3270-3275；Ragupathi G，et al.(1997)Angew Chem Int Ed 36：125-128；SlovinS F et al(1997)Proc Natl Acad Sci USA 96：5710-5715)。已经在一些患者中观察到轻度流感样症状可能与QS-21的副作用相关。已经报道了含有缀合至马来酰亚胺修饰的载体蛋白KLH的五种前列腺癌和乳腺癌相关糖抗原(Globo-H、GM2、STn、TF和Tn)的五价疫苗在ELISA测定法中以比IgM更高的IgG滴度产生抗Globo H血清。(Zhu J.et al.(2009)J.Am.Chem.Soc.131(26)：9298-9303)。
因此，本公开涉及由Globo H靶向/介导的免疫原性/治疗性化合物、组合物和/或药物配制剂组合物，以及免疫治疗剂、疫苗、剂量形式，试剂盒和其制造和治疗的方法。
当与权利要求书和/或说明书中的术语“包含”一起使用时，使用词语“一个”或“一种”可以意味着“一个/种”，但是它也与“一个/种或多个/种”、“至少一个/种”、“一个/种或超过一个/种”。
贯穿本申请，术语“约”用于指示数值包括例如测量装置，采用测定数值的方法的误差的固有变化，或存在于研究对象间的变化。根据情况，通常术语意在涵盖大约或小于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％的变化性。
如本文中使用，除非另有说明，术语“烷基”指含可以取代或未取代的1-20个碳原子，例如C1-C8或C1-C4的直链或支链一价烃。烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基和叔丁基。
尽管本公开内容支持仅指备选方案和“和/或”的定义，但在权利要求书中使用术语“或”用于表示“和/或”，除非明确指出仅指备选方案或备选方案是相互排斥的。
如本说明书和权利要求书中使用，词语“包含”(以及包括的任何形式)，“具有”(以及具有的任何形式)、“包括”(以及“包括”的任何形式)或“含有”(及含有的任何形式)是包含或开放式的，并且不排除额外的不需要的元素或方法步骤。可以设想本说明书中讨论的任何实施方案可以就本发明的任何方法或组合物而言实现，反之亦然。此外，本发明的组合物可用于实现本发明的方法。
“治疗”或“处理”在本文中称为对受试者施用治疗性组合物，其目的是治愈、缓和、缓解、补救、预防或改善病症、病症的症状、病症继发性的疾病状态、或病症的素因。
“有效量”是能够在治疗受试者中产生如本文中描绘的医学上期望结果的治疗性组合物的量。医学上期望的结果可以是客观的(即通过某些测试或标志物可测量)或主观的(即受试者给出效果的指示或感觉到效果)。
如本文中提及，“适合于用治疗性组合物治疗的疾病”指可以通过本文公开的治疗性组合物的施用来治疗的任何规程、状况、疾病、精神失调(ailments)和/或病。
“增殖性病症”是其中产生太多的某种类型的细胞，导致健康恶化的病症。增生性病症可以是良性或恶性的。增生性疾病可以包括例如癌症。
如本文中使用的，可以由本文公开的治疗性组合物治疗的“癌症”包括具有异常生长状态的细胞。癌细胞的特征在于丧失正常的控制机制，因此能够连续扩充，侵入相邻组织，迁移到身体的远处部分，并且促进细胞取得营养物的新血管的生长。如本文中使用的，癌症可以是恶性的或良性的。癌症可以从身体内的任何组织形成。当细胞生长繁殖时，它们形成称为肿瘤的组织块。术语肿瘤可以包括异常生长或块。肿瘤可能是癌性(恶性)或非癌性(良性)。癌性肿瘤可侵入邻近组织并扩散遍及全身(转移)。然而，良性肿瘤通常不侵入邻近组织，并且不会扩散遍及全身。癌症可以分为血液和血液形成组织的癌症(白血病和淋巴瘤)和“实体”瘤。“实体”肿瘤可以包括癌或肉瘤。
可以由本发明的治疗性组合物治疗的癌症包括按部位分类的癌症，包括口腔和咽(唇、舌、唾液腺、口底部、齿龈和其它口、鼻咽、扁桃体、口咽癌、咽下、其他口/咽)；消化系统(食道；胃；小肠；结肠和直肠；肛门、肛门、肛门直肠；肝；肝内胆管；胆囊；其它胆汁；胰腺；腹膜后；腹膜、网膜和肠系膜；其它消化道)的癌症；呼吸系统(鼻腔、中耳和鼻窦；喉；肺和支气管；胸膜；气管、纵隔和其它呼吸系统)的癌症；间皮瘤癌；骨骼和关节；和软组织，包括心脏；皮肤癌，包括黑素瘤和其他非上皮性皮肤癌；卡波西肉瘤和乳腺癌；女性生殖系统(子宫颈；子宫体；子宫，卵巢；阴道；外阴；和其它女性生殖器)的癌症；男性生殖器系统(前列腺；睾丸，阴茎和其它男性生殖器)的癌症；泌尿系统(膀胱；肾和肾盂；输尿管和其它泌尿系统)的癌症；眼和眼眶的癌症；脑和神经系统(脑；和其它神经系统)的癌症；内分泌系统(甲状腺和其它内分泌，包括胸腺)的癌症；淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、多发性骨髓瘤、白血病(淋巴细胞白血病、髓样白血病；单核细胞白血病和其它白血病)。
可以作为根据本发明的治疗性组合物的合适靶标的根据组织学类型分类的其它癌症包括但不限于新生物、恶性；癌，NOS；癌，未分化，NOS；巨细胞癌和梭形细胞癌；小细胞癌，NOS；乳头癌，NOS；鳞状细胞癌，NOS；淋巴上皮癌；基底细胞癌，NOS；毛基质癌(Pilomatrix carcinoma)；移行细胞癌，NOS；乳头状移行细胞癌；腺癌，NOS；胃泌素瘤，恶性；胆管上皮癌；肝细胞癌，NOS；结合性肝细胞癌和胆管癌(Combined hepatocellularcarcinoma and cholangiocarcinoma)；小梁性腺癌(Trabecular adenocarcinoma)；腺样囊性癌；腺瘤性息肉内腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌，NOS；类癌肿瘤，恶性；细支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌，NOS；嫌色性癌(Chromophobe carcinoma)；嗜酸性细胞癌(Acidophil carcinoma)；嗜酸性腺癌(Oxyphilic adenocarcinoma)；嗜碱性细胞癌(Basophil carcinoma)；透明细胞腺癌(Clear cell adenocarcinoma)，NOS；粒细胞癌(Granular cell carcinoma)；滤泡性腺癌(Follicular adenocarcinoma)，NOS；乳头状和滤泡性腺癌；无包膜形成的硬化性癌(Nonencapsulating sclerosing carcinoma)；肾上腺皮质癌(Adrenal cortical carcinoma)；子宫内膜癌(Endometroid carcinoma)；皮肤附件癌(Skin appendage carcinoma)；大汗腺腺癌(Apocrine adenocarcinoma)；皮脂性腺癌(Sebaceous adenocarcinoma)；盯聍腺腺癌(Ceruminous adenocarcinoma)；粘液表皮样癌(Mucoepidermoid carcinoma)；囊腺癌，NOS；乳头状囊腺癌，NOS；乳头状浆液性囊腺癌(Papillary serous cystadenocarcinoma)；粘液囊腺癌(Mucinouscystadenocarcinoma)，NOS；粘液腺癌(Mucinous adenocarcinoma)；印戒细胞癌(Signetring cell carcinoma)；浸润性导管癌；髓样癌(Medullary carcinoma)，NOS；小叶癌(Lobular carcinoma)；炎性癌；佩吉特病(Paget’s disease)，乳腺；腺泡细胞癌(Acinarcellcarcinoma)；腺鳞状癌；腺癌w/鳞状化生；胸腺瘤，恶性；卵巢基质肿瘤，恶性；泡膜细胞瘤(Thecoma)，恶性；粒层细胞瘤，恶性；卵巢男性细胞瘤(Androblastoma)，恶性；Sertoli细胞癌；Leydig细胞瘤，恶性；脂质细胞瘤，恶性；副神经节瘤，恶性；乳腺外副神经节瘤(Extra-mammary paraganglioma)，恶性；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑素瘤，NOS；无黑色素黑色素瘤；浅表扩散性黑素瘤；巨大色素痣中的恶性黑素瘤(Malig melanoma ingiant pigmented nevus)；上皮样细胞黑素瘤；蓝痣，恶性；肉瘤，NOS；纤维肉瘤，NOS；纤维组织细胞瘤，恶性；粘液肉瘤；脂肪肉瘤，NOS；平滑肌肉瘤，NOS；横纹肌肉瘤，NOS；胚胎横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；间质肉瘤，NOS；混合肿瘤，恶性，NOS；苗勒混合瘤(Mullerianmixed tumor)；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤，NOS；间叶瘤，恶性；勃勒纳瘤(Brennertumor)，恶性；叶状瘤(Phyllodes tumor)，恶性；滑膜肉瘤，NOS；间皮瘤，恶性；无性细胞瘤；胚胎癌，NOS；畸胎瘤，恶性，NOS；卵巢甲状腺肿，恶性；绒毛膜癌；中肾瘤，恶性；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性；卡波西肉瘤；血管外皮细胞瘤，恶性；淋巴管肉瘤；骨肉瘤，NOS；近皮质骨肉瘤；软骨肉瘤，NOS；软骨母细胞瘤，恶性；间充质软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤文氏肉瘤(Ewing’s sarcoma)；牙源性肿瘤，恶性；成釉细胞牙肉瘤；成釉细胞瘤，恶性；成釉细胞纤维肉瘤；松果体瘤，恶性；脊索瘤；神经胶质瘤，恶性；室管膜瘤，NOS；星形细胞瘤，NOS；原浆性星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤，NOS；少突神经胶质瘤，NOS；成少突神经胶质细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤，NOS；神经节成神经细胞瘤；神经母细胞瘤，NOS；视网膜母细胞瘤，NOS；嗅神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性；神经鞘瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；恶性淋巴瘤，NOS；霍奇金病，NOS；霍奇金；类肉芽肿，NOS；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞；恶性淋巴瘤，大细胞，弥漫性；恶性淋巴瘤，滤泡，NOS；蕈样真菌病；其它规定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增多症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增殖性小肠炎；白血病，NOS；淋巴样白血病，NOS；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓样白血病，NOS；嗜碱细胞性白血病；嗜酸性白血病，NOS；肥大细胞白血病；巨核母细胞性白血病；髓样肉瘤和毛细胞白血病。
如本文中所定义，“上皮癌”指从皮肤、中空内脏和其它器官中的上皮或相关组织形成的癌症。上皮癌包括但不限于乳腺癌、肺癌、肝癌、颊癌(buccal cancer)、胃癌、结肠癌、鼻咽癌、真皮癌、肾癌、脑肿瘤、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、肠癌、胰腺癌和膀胱癌。
如本文中使用，“患者”或“受试者”指诊断具有或怀疑具有或发展增殖性疾病如癌症的哺乳动物受试者。示例性的患者可以是可以有益于发展增殖性疾病如癌症的人、猿、狗、猪、牛、猫、马、山羊、绵羊、啮齿动物和其它哺乳动物。
如本文中使用，“基本上纯化的”或“基本上分离的”指下述状态的分子(例如化合物)，使得它与在其天然状态中与它通常相关联的基本上所有其它分子分离。优选地，基本上纯化的分子是制剂中存在的主要种类。特别地，基本上纯化的分子可以大于60％不含，优选75％不含，更优选90％不含，最优选95％不含天然混合物中存在的其它分子(不包括溶剂)。术语“基本上纯化”或“基本上分离”不意图包括以其天然状态存在的分子或物质。在某些实施方案中，术语“基本上纯化的”或“基本上分离的”包括从另一种KLH部分纯化一种KLH部分(例如，从KLH三聚体部分基本上纯化或基本上分离KLH二聚体部分)。在另一个实施方案中，术语“基本上纯化的”或“基本上分离的”不包括从另一种KLH部分纯化一种KLH部分(例如，在基本上纯化的或基本上分散的组合物中包括KLH二聚体和KLH三聚体)，但是基本上除去杂质。
“施用”在本文中称为对患者提供本发明的治疗性组合物。作为举例而非限制，可以通过静脉内(i.v.)注射、皮下(s.c.)注射、皮内(i.d.)注射、腹膜内(i.p.)注射、或肌肉内(i.m)注射进行组合物施用，例如注射。可以采用一种或多种此类路线。肠胃外施用可以例如通过推注或通过随时间逐渐灌注进行。或者或同时，可以通过口服路径施用。此外，施用也可以通过推注的手术沉积(surgical deposition of a bolus)或定位医疗装置进行。
“有此需要的患者”在本文中称为诊断具有或怀疑具有增殖性病症的患者。在一个实施方案中，患者具有或可能发展癌症。
如本文中使用，术语“抗原”定义为在或不在蛋白质载体和/或佐剂的帮助下能够引发免疫应答的任何物质。优选地，本发明的组合物的抗原包括糖和更优选地聚糖抗原和最优选地Globo H部分。
如本文中使用，术语“免疫原性”指免疫原、抗原或疫苗刺激免疫应答的能力。
如本文中使用，术语“免疫疗法”指出基于调节免疫系统实现预防和/或治疗性目标的构思的一批治疗策略。
如本文中使用，术语“表位”定义为与抗体或T细胞受体的抗原结合位点接触的抗原分子的部分。
本发明的“治疗性组合物”包括“免疫原性缀合物和/或治疗性缀合物和/或治疗性抗体”。治疗性缀合物包括至少一种与载体连接的抗原。优选地，治疗性缀合物的连接是共价的。在治疗性缀合物的一个实施方案中，抗原是聚糖如Globo H部分，并且载体是KLH部分和/或KLH部分亚基。因此，术语治疗性缀合物包含连接至一个或多个Globo H部分的一个或多个KLH部分亚基。在一个实施方案中，术语治疗性缀合物涵盖连接至约或至少1、10、102或103个Globo H部分的一个或多个KLH部分。在另一个实施方案中，术语治疗性缀合物涵盖连接至约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160，或更多个Globo H部分的一个或多个KLH部分。另一个实施方案涵盖此类连接有Globo H的KLH部分亚基的分离的二聚体、三聚体、四聚体、五聚体或六聚体或其组合。
在一个实施方案中，治疗性缀合物是：Fucα(1→2)Galβ(1→3)GalNAcβ(1→3)Galα(1→4)Galβ(1→4)Gluβ(1-O-乙基肼基(hydrazyl)-1-羰基-环己基-4-(甲基-N-马来酰亚胺)-3-(硫代丁基-酰亚胺基(imidyl))-匙孔血蓝蛋白(KLH)，也称为OBI-822。
“治疗性抗体”定义为特异性结合本发明治疗性缀合物，优选地是治疗性缀合物的Globo H部分的抗体(如下文进一步定义)。
如本文中使用，术语“疫苗”指含有用于赋予针对与抗原相关的疾病的免疫的治疗性缀合物的治疗性组合物。癌症疫苗设计为加强身体通过免疫系统保护自身免于由受损或异常细胞(如癌细胞)造成的危险的天然能力。保护性免疫应答是减轻疾病严重性，包括但不限于预防疾病、延迟疾病发作、症状严重性降低、发病率降低和死亡率延迟的免疫应答。优选地，疫苗能够激活体液免疫反应(例如，刺激由B淋巴细胞产生抗体)和细胞免疫应答(例如由T淋巴细胞和/或其它细胞如NK细胞和巨噬细胞介导的免疫应答)。已经开发了用于测定免疫应答的标准测定法，如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、流式细胞术、细胞增殖测定法，CTL测定法和ADCC/CDC测定法。
如本文中使用，术语“聚糖”指多糖或寡糖。甘氨酸在本文中也用于指糖缀合物如糖蛋白、糖脂、糖肽、糖蛋白质组、糖聚糖，脂多糖或蛋白聚糖的糖部分。糖通常仅由单糖之间的O-糖苷连接组成。例如，纤维素是由β-1，4-连接的D-葡萄糖组成的聚糖(或更特别是葡聚糖)，并且壳多糖是由β-1，4-连接的N-乙酰基D-葡糖胺组成的聚糖。甘氨酸可以是单糖残基的同或异聚合物，并且可以是直链或支链的。可以发现与糖蛋白附着的聚糖，如在糖蛋白和蛋白聚糖中一样。它们通常在细胞的外表面上发现。O-和N-连接的聚糖在真核生物中非常常见，但也可以在原核生物中发现，尽管不常见。发现与序列中的天冬酰胺的R-基团氮(N)附着的N连接的聚糖。序列是Asn-X-Ser或Asn-X-Thr序列，其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸。优选的聚糖是Globo H部分。
Globo H是一种六糖，它是抗原性糖家族成员，所述抗原性糖在各种类型的癌症，特别是乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、结肠癌和肺癌上高度表达。在示例性的实施方案中，某些患者在时间零时没有显示抗Globo H抗体水平，并且在用本发明的治疗性组合物免疫后，检测到高滴度。在其他示例性的实施方案中，某些患者在时间零时显示抗Globo H抗体水平，并且在用本发明的治疗性组合物免疫后，检测到高滴度。在某些实施方案中，抗Globo H抗体作为糖脂并且可能作为糖蛋白在癌细胞表面上表达。在其它实施方案中，乳腺癌患者血清含有高水平的针对Globo H抗原表位的抗体。在某些实施方案中，该表位在免疫组织化学研究中也由单克隆抗体Mbr1、VK9和抗SSEA-3靶向。虽然某些正常组织也与Mbr1(包括正常乳腺、胰腺、小肠和前列腺组织)发生反应，但是这些组织中的抗原主要位于限制对免疫系统的接近的分泌边界处。
“Globo H部分”在本文中定义为作为Globo H或其片段或类似物的聚糖(即含有糖部分的分子)。Globo H是含有六糖表位(Fucα1→2Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Gcc)，以及任选地非糖部分的聚糖。其片段是含有六糖表位的片段和在适用时非糖部分的聚糖。可以通过常规方法制备这些寡糖。(参见Huang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA103：15-20(2006))。如果期望的话，它们可以连接到非糖部分。美国专利申请流水号12/485,546涉及通过对非人哺乳动物(例如小鼠、兔、山羊、绵羊或马)施用上述免疫组合物并且从哺乳动物分离结合Globo H或其片段的抗体生成对Globo H或其片段特异性的抗体的方法。
Globo H的类似物可以使用聚糖微阵列产生，并包括在Wang et al.，Proc NatlAcad Sci US A.2008August 19；105(33)：11661-11666中公开并且图1中显示的类似物。
Globo H类似物优选结合抗体VK-9、Mbr1和抗SSEA-3。优选地，Globo H类似物以特定的解离常数(KD，surf)结合。Langmuir等温线可用于分析结合曲线以产生表面上的解离常数(KD，surf)。在温育过程中的平衡条件下，复制点(Fobs)的平均荧光可以通过以下方式描述：
其中Fmax是最大荧光强度，表面上活性糖的量的测量值，[P]是总抗体浓度，并且KD，surf是表面糖和抗体的平衡解离常数。如Wang等人所述。在一些实施方案中，就Wang等人中描述的VK-9、Mbrl和抗SSEA-3抗体而言，Globo H类似物的优选(KD，surf)是至少、约或准确地0.4，0.5.，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5或1.6nM。
“匙孔血蓝蛋白”(KLH)是一种在巨型匙孔Megathura crenulata的血淋巴中发现大的、多亚基、携氧的金属蛋白。KLH是由分子量为约400kDa(例如，KLH单体)至约8000kDa(例如，KLH二十聚体)的聚集体中的分子量约350,000至约390,000的亚基组成的异质糖基化蛋白。KLH亚基的每个域含有两个一起结合单个氧分子的铜原子。当氧气与血蓝蛋白结合时，该分子呈现独特的透明、乳白色蓝色，在某些实施方案中，KLH蛋白在人体中是有力地免疫原性的且安全的。在某些实施方案中，可以通过一系列步骤从Megathuracrenulata的血淋巴纯化KLH，所述步骤通常包括硫酸铵沉淀和透析，并且可以涉及层析纯化以获得最高的纯度，在某些实施方案中，KLH纯化也可以包括内毒素除去，但是此步骤可以是不必要的，因为当注射用于抗体生产时，内毒素可以充当佐剂。优选地，具有清澈的乳白色蓝色的高质量KLH制剂是KLH溶解度的最佳指标。在某些实施方案中，KLH单体单元组装成大的多聚体(十聚体或二十聚体)，总共分子量约4000kDa至8,000kDa。“匙孔血蓝蛋白部分”或“KLH部分”在本文中定义为KLH1(SEQ ID NO.1)或KLH2(SEQ ID NO.2)蛋白质或与其基本相同的蛋白质或其混合物。在此背景中基本相同的意指每个KLH部分与与天然野生型KLH具有至少、约或准确地：100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76或75％相同的氨基序列。在某些实施方案中，本发明的KLH具有增强的免疫原性活性，特别是增强的抗肿瘤活性。在某些实施方案中，本发明的组合物中的KLH包含约40万分子量的完整的非降解亚基。在其它实施方案中，本发明的KLH包括较高的KLH多聚体。
在某些实施方案中，较高的KLH多聚体具有约800-1000万的分子量，沉降系数约为92-107S。存在的较高的KLH多聚物的量是基于沉降平衡和/或沉降速度超速离心分析。在其它实施方案中，本发明的KLH表现出增强的免疫原性活性，特别是增强的抗肿瘤活性。看到增强的免疫原性活性，例如但不限于(a)通过注射KLH(无佐剂)，(b)通过用作佐剂的KLH，(c)通过用作半抗原的载体免疫原或弱免疫原性抗原的KLH，(d)通过用作抗肿瘤剂的KLH。本发明的KLH组合物对许多肿瘤表现出增强的抗肿瘤活性，包括但不限于膀胱、乳腺、卵巢肿瘤等。在某些实施方案中，两个KLH部分可通过在KLH单体之间共价连接形成二聚体。不受理论的限制，认为KLH部分之间的共价连接是通过二硫键。在某些实施方案中，两个或更多个KLH部分可以通过KLH单体、二聚体、三聚体等之间的共价连接而形成二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体等。不受理论的限制，认为KLH部分之间的共价连接通过二硫化物键。
KLH部分与抗原的连接有多种方法，包括直接缀合和与双功能接头基团如4-(4-N-马来酰亚胺甲基)环己胺-1-羰基酰肼(MMCCH)的缀合。此类连接技术在美国专利No.6,544,952中公开。在一些实施方案中，为了制备本发明的治疗性缀合物，例如，Globo H烯丙基糖苷通过臭氧解转化为醛，并且醛基附着到交联剂MMCCH上的NH基团，得到Globo H-MMCCH；载体蛋白KLH经硫醇化反应产生KLH-SH；然后将硫醇化的KLH上的巯基附着到MMCCH上的马来酰亚胺基团上，产生Globo H-KLH缀合物。
在一个实施方案中，Globo H烯丙基糖苷通过化学合成制备。也使用硫醇化试剂2-亚氨基硫烷和cGMP级KLH和4-(4-N-马来酰亚胺甲基)-环己胺-1-羟基酰肼(MMCCH)接头。在一些实施方案中，进行以下步骤：(1)将Globo H烯丙基糖苷转化成Globo H-醛；(2)分别将Globo H-醛与MMCCH偶联成Globo H-MMCCH；(3)KLH的化学硫醇化；(4)Globo H-MMCCH与硫醇化KLH的缀合；和(5)Globo H-KLH糖缀合物(OBI-822)的纯化。图2A中显示了Globo H-KLH亚基缀合途径。
在某些实施方案中，在将Globo H部分蛋白与KLH部分缀合期间，在某些实施方案中，KLH部分蛋白与完整分子相比显示分子量的降低，优选地由于Globo H部分亚基解离所致。在其它实施方案中，本文公开的缀合方法导致先前未报道的KLH亚基解离。虽然不希望受限于任何特定的理论，但是设想的是，本发明的Globo H部分-KLH部分亚基缀合物的高糖基化水平导致Globo H部分之间的形成氢键键合。因而，在某些实施方案中，通过Globo H氢键键合置换KLH部分亚基之间的范德华力和疏水相互作用，并且这导致KLH部分亚基分离。缀合后，Globo H部分-KLH部分缀合物的KLH部分亚基优选聚集形成新颖的单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体或其任何组合。所得的例示性的治疗性Globo H部分-KLH部分缀合物(具有大得出乎意料的表位比率)具有令人惊讶且出乎意料的卓越的免疫原性属性。在某些实施方案中，Globo H部分与KLH1和KLH2上的赖氨酸缀合。在其它实施方案中，GloboH部分不与KLH1和KLH2上的赖氨酸缀合。在某些实施方案中，发现缀合有Globo H的赖氨酸位点在肽定位分析中保守，提示了GloboH-KLH糖缀合物组合物在其结构上是独特的。
在一个实施方案中，本发明的治疗性组合物包含一个或多个KLH部分亚基，其中至少一个此类亚基与下列缀合至少、约或准确地1、10、100或1000次：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108，109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126，127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144，145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159或160或更多个Globo H部分。
发明人使用质谱分析发现了Globo H部分与KLH的赖氨酸残基缀合。在某些实施方案中，因此优选Globo H部分与赖氨酸残基缀合。
在一个实施方案中，每个KLH部分亚基总共有准确地或约145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160个总计赖氨酸残基。在另一个实施方案中，每个KLH部分亚基有准确地或约150或156个赖氨酸残基。在另一个实施方案中，可用于结合Globo H部分或实际上与Globo H部分结合的每个KLH部分亚基有准确地或约60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109或110个赖氨酸缀合位点。在另一个实施方案中，每个KLH部分亚基上有62、66、67、68、70、72、76、86、87、88、90、92、93、100个此类赖氨酸缀合位点。赖氨酸缀合位点是可用于结合或实际上结合Globo H部分和/或与Globo H部分的接头，如例如MMCCH接头的KLH部分中的那些赖氨酸残基。
在含有部分亚基的混合物(例如KLH1和KLH2或其变体)的某些治疗性实施方案，总计可用赖氨酸(对于这两种亚基)在不同亚基类型之间一起计算，并且数目可以是或是准确地约290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309或310。在此类实施方案中，在不同亚基(例如KLH1和KLH2或其变体)之间一起有或可以有准确地或约130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159或160个赖氨酸缀合位点。在其它此类实施方案中，存在有136、137、141、140、143、147或155个赖氨酸缀合位点。
在最优选的实施方案中，KLH1/KLH2中的总共306个赖氨酸残基间有136、137、140、141、143、147或155个赖氨酸缀合位点。
在某些实施方案中，本发明的治疗性组合物含有KLH部分亚基-Globo H部分缀合物的混合物，其中此类缀合物保持单体或者形成二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体或其任何组合。在另一个实施方案中，本发明的治疗性组合物包括分离的KLH部分亚基-GloboH部分缀合物单体、二聚体、三聚体或四聚体或其组合二。在别的实施方案中，本发明的治疗性组合物仅包含KLH部分亚基-Globo H部分缀合物二聚体和三聚体。
在另一个实施方案中，治疗性组合物含有至少两个KLH部分亚基，其中两个KLH部分亚基之每个与不同聚糖连接。可与KLH部分亚基连接的其它肿瘤相关聚糖抗原可以包括但不限于GM2、GD2、GD3、岩藻糖基、GM1、sTn、唾液酰基-Lewisx、Lewisx、唾液酰基Lewisa、Lewisa、sTn、TF、多唾液酸、Lewisy、粘蛋白、T抗原等。在仅一些实施方案中，治疗性组合物中的至少或约10、20、30、40、50、60、70、80、90或100％的KLH部分亚基与GloboH部分连接，而治疗性组合物中的剩余KLH部分亚基与其它肿瘤相关聚糖抗原连接。
如本文中使用，涉及本文中公开的治疗性缀合物的“表位比率”指例如治疗性缀合物中的抗原表位与载体分子的关系。优选地，它指Globo H部分与KLH部分的关系。最优选地，使用以下公式＝(实际Globo H部分重量/Globo H部分分子量)/(实际KLH部分重量/KLH部分分子量)组合计算治疗性缀合物的表位比率。表位比率可由本领域技术人员容易测定。优选地，例如通过高效阴离子交换层析及脉冲安培计检测(HPAEC-PAD)测定Globo H重量。
优选地，本发明的治疗性缀合物的表位比率是约、至少或准确地：1、10、25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1025、1050、1075、1100、1125、1150、1175、1200、1225、1250、1275、1300、1325、1350、1375、1400、1425、1450、1475、1500、1525、1550、1575、1600、1625、1650、1675、1700、1725、1750、1775、1800、1825、1850、1875、1900、1925、1950、1975、2000、2025、2050、2075、2100、2125、2150、2175、2200、2225、2250、2275、2300、2325、2350、2375、2400、2425、2450、2475、2500、2525、2550、2575、2600、2625、2650、2675、2700、2725、2750、2775、2800、2825、2850、2875、2900、2925、2950、2975或3000。
在一个实施方案中，本发明的治疗性组合物包含具有表位比率范围的治疗性缀合物的混合物。在一个实施方案中，治疗性组合物中治疗性缀合物的范围、均值或中值表位比率是约10至约3200、约800至约2500、约1000至约2000、约1250至约1750或约1400至约1600。在另一个实施方案中，治疗性组合物中的治疗性缀合物的范围、均值或中值表位比率是约10至约150、约40至约125、约50至约100、约62至约87或约70至约80。在另一个实施方案中，治疗性组合物中的治疗性缀合物的范围、均值或中值表位比率是约20至约300、约80至约250、约100至约200、约125至约175或约140至约160。在另一个实施方案中，治疗性组合物中的治疗性缀合物的范围、均值或中值表位比率是约30至约450、约120至约375、约150至约300、约185至约260或约210至约240。在一些药物组合物中，至少或约30，40，50，60，70，80，90，95，98，99或100％的治疗性缀合物以单体，或以二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体或其组合存在。
针对治疗性缀合物的抗体
在某些示例性的实施方案中，本发明还包括以亲和性特异性结合本文所公开的治疗性缀合合物的分离的治疗性抗体，以及它们在增殖性疾病的治疗和/或诊断中的用途。
如本文中使用，术语“抗体”(免疫球蛋白)包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、骆驼化(camelised)抗体、嵌合抗体、单链Fvs(scFv)、单链抗体、单域抗体、域抗体、Fab片段，F(ab′)2片段，表现出期望的生物学活性的抗体片段、二硫化物连接的Fv(sdFv)和抗独特型(抗Id)抗体(包括例如针对本发明的抗体的抗-Id抗体)、内抗体(intrabodies)和上述任何一种的表位结合片段。特别地，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即含有抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。
抗体对表位的“亲和力”，例如本文所述的治疗中使用的治疗性缀合物的Globo H部分是本文中充分理解的术语，并且意指抗体结合表位的程度或强度。亲和力可以以本领域已知的多种方式测量和/或表达，包括但不限于平衡解离常数(KD或Kd)、表观平衡解离常数(KD或Kd)和IC50(在竞争测定法中实现50％抑制需要的量)。应当理解，为了本发明的目的，亲和力是对结合表位的给定抗体群体的平均亲和力。尽管可以使用血浆，但是本文中按每mL的mg IgG或mg/mL报告的KD值指示每mL血清的mg Ig。当使用抗体亲和力作为实施本文所述治疗方法或选择本文所述治疗方法的基础时，可以在治疗之前和/或期间测量抗体亲和力，并且所获得的值可由临床医生用于评估人患者是否是适合治疗的候选者。
如本文中使用，术语“特异性结合”指结合对(例如抗体和抗原)之间的相互作用。在各种情况下，特异性结合可以通过至少或约10-6摩尔/升、约10-7摩尔/升或约10-8摩尔/升或更低的亲和常数来体现。
针对Globo H的示例性抗体可以通过从针对期望抗体增加检查的经免疫的受试者收集体液如血清，并通过任何常规方法从血液中分离血清来制备。
通常通过多次注射相关抗原和佐剂制备抗体。可以有用的是将相关抗原与待免疫的物种中免疫原性的蛋白质(例如匙孔血蓝蛋白)缀合。
用抗原免疫动物的方法是本领域已知的。抗原的腹膜内注射或皮下注射是哺乳动物免疫的标准方法。更具体地，可以将抗原稀释并悬浮在适量的磷酸盐缓冲盐水(PBS)、生理盐水等中。如果期望的话，可将抗原悬浮液与适量的佐剂混合，然后施用于受试者。
在某些实施方案中，可以通过几次施用与合适量的佐剂混合的抗原加强受试者，直至滴度平台期。合适的载体也可用于免疫。在如上所述进行免疫后，通过方法对血清检查期望抗体量的增加。
生物测定法
在一个实施方案中，当对患者施用时，含有本发明的治疗性缀合物的治疗性组合物能够诱导相同实验中施用前相同抗Globo H抗体滴度(即治疗前基线滴度)大至少或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、100、250、500、1000、1500、2000、2500、3000、4000或5000倍的抗Globo H抗体滴度。在某些实施方案中，抗Globo H抗体是IgM抗体。在另一个实施方案中，抗Globo H抗体是IgG抗体。
本发明的治疗性组合物能够在受试者中诱导体液和细胞应答两者。在某些实施方案中，本发明的疫苗组合物诱导Globo H部分特异性IgG和IgM抗体的产生和B细胞和T细胞(例如CD3+T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞)的扩充。通常，这些免疫应答在施用后按时间顺序发生。在具体的实例中，施用后，B细胞产生出现在约第3、4、5、6、7、8、9、10、20、30或60天，随后在约第10、20、30、60或90天时产生IgG和IgM抗体及随后在24、30、40、50、60、90、120、150或180天产生T细胞。本发明的疫苗组合物潜在提供长期的免疫保护效应，其可以防止少量癌细胞的生长，从而对于最小的残留疾病是理想的，使得达到疾病的稳定和存活改善。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”指细胞介导的反应，其中非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体，随后引起靶细胞的裂解。在一个实施方案中，此类细胞是人细胞。虽然不希望限于任何特定的作用机制，但是介导ADCC的这些细胞毒性细胞通常表达Fc受体(FcR)。用于介导ADCC的主要细胞NK细胞表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII、FcγRIII和/或FcγRIV。在Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.，9：457-92(1991)中汇总了造血细胞上的FcR表达。为了评估分子的ADCC活性，进行体外ADCC测定法，如美国专利No.5,500,362或5,821,337中描述的ADCC测定法。用于此类测定法的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可以在体内评估本发明的治疗性缀合物的ADCC活性，例如在动物模型中，如Clynes et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，95：652-656(1998)中公开的动物模型。
在某些实施方案中，药物组合物的施用可以产生免疫应答，包括产生与Globo H特异性结合的抗体。在某些实施方案中，抗体开发为靶向癌细胞表面上表达的一个或多个Globo H，并且触发CDC和/或ADCC以杀死这些细胞。在某些实施方案中，本文提供的免疫原性组合物主要诱导IgG1、IgG2b、IgG2c和IgG3。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指治疗性缀合物在补体存在下起始补体活化和裂解靶标的能力。补体激活途径是通过补体系统的第一组分(C1q)与同关联抗原复合的分子(例如抗体)的结合引发的。为了评估补体激活，可以进行CDC测定法，例如如Gazzano-Santaro et al.，J.Immunol.Methods，202：163(1996)中描述。
在另一个实施方案中，当对患者施用时，含有本发明的治疗性缀合物的治疗性组合物能够诱导抗Globo H免疫血清在患者/受试者中的产生，所述抗Globo H免疫血清特异性结合Globo H阳性癌细胞系，例如MCF-7细胞。
组合
治疗性组合物可以包括其它抗癌/抗增殖药物以及佐剂和其它免疫调节分子如细胞因子或趋化因子。在某些实施方案中，组合可以是单独的药剂/组合物或共配制剂的共施用。这些药剂可以在试剂盒中一起在单独的容器或单一容器中递送。药剂可以在施用时或施用前至少或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24分钟、小时或天组合。
佐剂是改变其它药物效果的药理学或免疫学药剂。它们可以是增强对给定抗原的免疫应答的无机或有机化学、大分子或完整癌细胞或其部分。佐剂包括完全和不完全弗氏佐剂、Toll样受体分子及其模拟物、LPS、脂蛋白、脂肽、鞭毛蛋白、双链RNA、未甲基化的CpG岛、左旋咪唑、卡介苗，奥曲肽(octreotide)、异丙肌苷和日达仙(Zadaxin)、由细菌和病毒典型释放的各种形式的DNA和RNA、PD-1拮抗剂和CTLA拮抗剂。在一个实施方案中，佐剂是皂苷佐剂。
在某些实施方案中，皂苷佐剂是OBI-821皂苷，其基本上是纯的。在其它实施方案中，OBI-821皂苷是其生物活性片段。佐剂还可以包含不纯形式的OBI-821皂苷。纯化的OBI-821皂苷当与本文所述的疫苗一起施用时或者与其它基本上纯的皂苷或非皂苷佐剂混合时显示增强的佐剂效果。
OBI-821皂苷是通过高压液相层析(HPLC)、低压液体硅胶层析(low pressureliquid silica chromatography)和亲水相互作用层析(HILIC)从石碱木(Quillajasaponaria Molina)树的树皮中高纯度提取的天然存在的糖苷，如例如美国专利No.5,057,540和美国专利No.6,524,584中描述，其内容通过引用整体并入本文。高压液相层析分析显示了OBI-821是结构相关的异构化合物的混合物。本文已经鉴定和公开了OBI-821皂苷的不同的纯化的异构体化合物。
在某些实施方案中，OBI-821皂苷包含至少一种如下式I的分离的化合物：
其中
R1是β-D-芹糖或β-D-木糖；并且
R2和R3独立是H、烷基、
(化合物1989的脂肪酰基部分)、或
(化合物1857的脂肪酰基部分)。
OBI-821皂苷还可以包含分离的式I化合物，其中
(i)R1是β-D-芹糖，R2是上述1989化合物的脂肪酰基部分，并且R3是H(1989化合物V1A)；
(ii)R1是β-D-芹糖，R2是H，并且R3是上述1989化合物的脂肪酰基部分(1989化合物V1B)；
(iii)R1是β-D-木糖，R2是上述1989化合物的脂肪酰基，并且R3是H(1989化合物V2A)；或者
(iv)R1是β-D-木糖，R2是H，并且R3是上述1989化合物的脂肪酰部分(1989化合物V2B)。1989化合物V1A、1989化合物V1B、1989化合物V2A和1989化合物V2B共同称为“1989化合物混合物”。
表1汇总了1989年化合物的官能团和1857化合物混合物中每种1857化合物的摩尔％。
OBI-821皂苷可以包含分离的式I化合物，其中：
(i)R1是β-D-芹糖，R2是上述1857化合物的脂肪酰部分，并且R3是H(1857化合物V1A)；
(ii)R1是β-D-芹糖，R2是H，并且R3是上述1857化合物的脂肪酰部分(1857化合物V1B)；
(iii)R1是β-D-木糖，R2是上述1857化合物的脂肪酰部分，并且R3是H(1857化合物V2A)；或者
(iv)R1是β-D-木糖，R2是H，并且R3是上述1857化合物的脂肪酰基部分(1857化合物V2B)。1857化合物V1A、1857化合物V1B、1857化合物V2A和1857化合物V2B共同称为“1857化合物混合物”。
表2汇总了1857化合物的官能团和1857化合物混合物中每种1857化合物的摩尔％。HPLC。
表2
OBI-821皂苷包含一种或多种以下化合物：
(i)1857化合物V1A；
(ii)1857化合物V1B；
(iii)1857化合物V2A；
(iv)1857化合物V2B；
(v)1989化合物V1A；
(vi)1989化合物V1B；
(vii)1989化合物V2A；或者
(viii)1989化合物V2B。
1857化合物混合物和1989化合物混合物在OBI-821皂苷中的百分比可以范围如下：
(i)约1摩尔％至约15摩尔％的OBI-821包含1857化合物混合物；和
(ii)约85摩尔％至约99摩尔％的OBI-821包含1989化合物混合物。
所有的摩尔％可以以增量0.1％(例如约87％至约90％、约90.5％至约97％、约3.5％至约11％、约10％至约14％)变化。
1989化合物混合物可以包含约60-70摩尔％的1989化合物V1A；约1-5摩尔％的1989化合物V1B；约30-40摩尔％的1989化合物V2A；和约0.1-3摩尔％的1989化合物V2B。所有的摩尔％可以以0.1增量(例如65％、2.5％、35.6％)变化。
1857化合物混合物可以包含约60-70摩尔％的1857化合物V1A；约1-5摩尔％的1857化合物V1B；约30-40摩尔％的1857化合物V2A；和约0.1-3摩尔％的1857化合物V2B。所有的摩尔％可以以0.1增量(例如65％、2.5％、35.6％)变化。
在另一个实施方案中，从粗制的皂树皂苷提取物中纯化基本上纯的OBI-821，其中所述OBI-821的特征在于当在具有5μm粒度、孔径、4.6mmIDx25cm L的对称C18柱上在反相HPLC上分析时单一主峰，其包含层析谱的所有峰的90％以上的总面积，排除溶剂峰，洗脱程序包含在11分钟中流动相A：B 95％：5％至75％：25％，所述流动相A为含有0.1％三氟乙酸的蒸馏水，而流动相B为乙腈与0.1％三氟乙酸，流速为1ml/min。
在一个实施方案中，药物组合物包含式(I)化合物，
式(I)
其中，
R1是β-D-芹糖或β-D-木糖；并且
R2和R3独立是H、烷基、或
(1857化合物的脂肪酰基部分)和药学可接受载体。
疫苗可以包含糖抗原或其免疫原性片段和OBI-821皂苷。在又一个实施方案中，疫苗包含糖抗原或其免疫原性片段；载体蛋白和OBI-821皂苷。在另一个实施方案中，疫苗包含选自Globo H、KLH和OBI-821皂苷的糖抗原。载体蛋白的非限制性实例包括KLH。
术语“a-半乳糖基-神经酰胺”和“a-GalCer”指刺激天然杀伤T细胞以产生T辅助1(TH1)和TH2细胞因子的糖脂，如记载于美国专利No.8,268,969，其内容通过引用整体并入。在某些实施方案中，OBI-834(称为C34)佐剂的特征在于以下示例性结构：
如本文中使用，术语“细胞因子”指许多小分泌性蛋白之任一种，其通过影响免疫细胞分化过程来调节免疫应答的强度和持续时间，所述免疫细胞分化过程通常涉及前体细胞变成不同特化细胞类型的基因表达的变化。细胞因子已经基于它们的假定功能、分泌细胞或作用目标广泛命名为淋巴因子、白介素和趋化因子。例如，一些常见的白介素包括但不限于IL-2、IL-12、IL-18、IL-2、IFN-γ、TNF、IL-4、IL-10、IL-13、IL-21、GM-CSF和TGF-β。
如本文中使用，术语“趋化因子”指在感染部位处释放的各种小的趋化细胞因子之任一种，其提供用于动员和激活淋巴细胞的手段。趋化因子吸引白细胞到感染部位。趋化因子具有保守的半胱氨酸残基，所述残基允许将其分配到四组。具有代表性趋化因子的组是C-C趋化因子(RANTES，MCP-1，MIP-1α，和MIP-1β)、C-X-C趋化因子(IL-8)、C趋化因子(淋巴细胞趋化蛋白(Lymphotactin))、和CXXXC趋化因子(Fractalkine)。
本发明的治疗性组合物可进一步包括PD-1/PD-L1抑制剂(细胞毒性T细胞淋巴细胞(CTL)免疫疗法)、CTLA-4免疫疗法、CDK4/6抑制剂(靶疗法)、PI3K抑制剂(靶疗法)、mTOR抑制剂(靶疗法)、AKT抑制剂(靶疗法)、Pan-Her抑制剂(靶疗法)。也可以修饰这些抑制剂以产生相应的单克隆抗体。这种抗体可以包括在本发明的治疗性组合物中。
治疗性组合物可以包括其他抗癌/抗增殖或化疗剂。在一些实施方案中，此类药剂的实例见于Cancer Principles and Practice of Oncology，V.T.Devita and S.Hellman(编)，第6版(February 15，2001)，Lippincott Williams&Wilkins Publishers。此类抗癌剂包括但不限于以下：激素治疗剂(例如选择性雌激素受体调节剂，雄激素受体调节剂)、单克隆抗体疗法、化学疗法、类视色素受体调节剂、细胞毒性/细胞抑制剂、抗肿瘤剂、抗增殖剂、异戊二烯基-蛋白转移酶抑制剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、氮芥、亚硝基脲、血管生成抑制剂(例如贝伐单抗)、细胞增殖和存活信号传导途径抑制剂、凋亡诱导剂、干扰细胞循环检查点的药剂、干扰受体酪氨酸激酶(RTK)的药剂、雷帕霉素哺乳动物靶物(mammalian targetof rapamycin)(mTOR)抑制剂、人表皮生长因子受体2(HER2)抑制剂、表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂、整联蛋白阻断剂、NSAID、PPAR激动剂、固有多药物抗性(MDR)抑制剂、止吐剂、可用于治疗贫血的药物、可用于治疗嗜中性粒细胞减少症的药物、免疫增强药物、双膦酸盐、芳香酶抑制剂、诱导新生细胞终末分化的药剂、γ-分泌酶抑制剂、癌症疫苗、以及其任何组合。
本发明的配制剂
治疗性组合物(本文中也称为药物组合物)通常包括药学可接受载体。如本文中使用，语言“药学可接受载体”包括与药物施用相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。补充的活性化合物也可以掺入组合物中。将药物组合物配制为与其预期的施用途径相容。施用途径的实例包括肠胃外，例如静脉内、皮内、皮下、肌内、动脉内、口服(例如吸入)、透皮(局部)、经粘膜和直肠施用。用于胃肠外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、磷酸盐缓冲盐水、tris缓冲盐水、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇、或其它合成溶剂；抗细菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和用于调节张力的药剂如氯化钠或右旋糖。pH值可以用酸或碱如盐酸或氢氧化钠进行调节。肠胃外制剂可以封装在安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
适用于可注射用途的药物组合物包括无菌水溶液(在水溶性的情况下)或分散体，以及用于即时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor(BASF，Parsippany，N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物应是无菌的，并且应当在存在容易的注射性的程度上流动。它在制造和储存条件下应该是稳定的，并提供防护免于微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。例如，通过使用诸如卵磷脂的涂层，通过在分散体的情况下维持期望的粒度和通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。防止微生物的作用可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗坏血酸、硫柳汞等来实现。在许多情况下，优选在组合物中包括等张剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。可以通过在组合物中包括延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸铝和明胶来实现可注射组合物的延长吸收。
无菌可注射溶液可以通过在根据需要具有上文列举的成分之一或组合的适当的溶剂中掺入需要量的活性化合物，然后过滤灭菌来制备。通常，通过将活性化合物掺入无菌媒介物中制备分散体，所述无菌媒介物含有无碱基分散介质和来自上文列举的成分的需要的其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，其从其先前无菌过滤的溶液中产生活性成分的粉末和任何另外的期望成分。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。对于口服治疗性施用的目的，可以将活性化合物与赋形剂一起掺入，并且以片剂、锭剂或胶囊，例如明胶胶囊的形式使用。口服组合物也可以使用用作漱口水的流体载体制备。作为组合物的一部分，可以包括药学相容的粘合剂或佐剂材料。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可以含有以下成分或相似性质的化合物之任一种：粘合剂如微晶纤维素、黄蓍树胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖，崩解剂如藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或sterotes；助流剂如胶体二氧化硅等；甜味剂如蔗糖或糖精；或调味剂如薄荷，水杨酸甲酯或橙香精(orange flavoring)。
此外，对于口服施用，本发明的配制剂可以采取例如通过常规手段用下列各项制备的片剂或胶囊的形式：药学可接受赋形剂如粘合剂(例如预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(如马铃薯淀粉或淀粉羟乙酸钠)；或润湿剂(例如月桂硫酸钠)。片剂可以通过本领域熟知的方法进行包衣。本发明的组合物还可以引入微球或微胶囊中，例如由聚乙醇酸/乳酸(PGLA)制备(参见美国专利号5,814,344；5,100,669和4,849,222；PCT公开号WO 95/11010和WO 93/07861)。用于口服施用的液体制剂可以采取例如溶液、糖浆剂、乳剂或悬浮液的形式，或者它们可以作为干燥产品呈现，以在使用前用水或其它合适的媒介物重建。此类液体制剂可以通过常规手段用以下各项制备：药学可接受添加剂如悬浮剂(例如山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性媒介物(例如杏仁油、油酯、乙醇或分馏的植物油)；和防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)。在适当时，制剂还可以含有缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。口服施用的制剂可以适当地配制以给予活性化合物的受控释放。
对于通过吸入施用，化合物以含有合适推进剂(例如，诸如二氧化碳的气体)的加压容器或分配器或喷雾器以气溶胶喷雾的形式递送。
系统性施用也可以是经粘膜或透皮的。对于经粘膜或透皮施用，在配制剂中使用适合于要穿透的屏障的渗透剂。此类渗透剂在本领域中通常是已知的，并且包括例如用于经粘膜施用，去污剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。透粘膜施用可以通过使用鼻喷雾剂或栓剂来实现。对于透皮施用，将活性化合物配制成如本领域通常已知的软膏剂、油膏剂、凝胶或乳膏。化合物也可以以栓剂的形式制备(例如与常规栓剂基质如可可脂和其它甘油酯)或用于直肠递送的保留灌肠。
根据实施方案，用载体制备活性化合物，所述载体将保护化合物免于从身体快速消除，诸如受控释放配制剂，包括植入物和微胶囊递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯(polyorthoester)和聚乳酸。制备此类配制剂的方法对于本领域技术人员是显而易见的。材料也可以商购获得。脂质体悬浮液(包括用针对细胞特异性抗原的单克隆抗体靶向感染细胞的细胞的脂质体)也可以用作药学可接受载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法制备，例如，如记载于美国专利No.4,522,811，其通过引用并入本文。
有利的是以剂量单位形式配制口服或肠胃外组合物，以易于施用和剂量一致性。如本文中使用，剂量单位指物理上离散的单位，适合作为受治疗的受试者的单位剂量；每个单位含有活性化合物的预定量，其经过计算以与需要的药用载体结合产生期望的治疗效果。
本发明的免疫原性配制剂可以胃肠外，即通过静脉内(i.v.)、皮下(s.c.)、腹膜内(i.p.)、肌内(i.m.)、真皮下(s.d.)或皮内(i.d.)施用，通过经由例如推注、连续输注或基因枪(例如，对受试者施用载体疫苗，如裸DNA或RNA)直接注射来递送。用于注射的配制剂可以以单位剂量形式存在，例如在安瓿或多剂量容器中，具有添加的防腐剂。组合物可以采用诸如在油性或水性媒介物中的赋形剂、悬浮液、溶液或乳剂的形式，并且可以含有配制剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以是粉末形式，用于在使用前用合适媒介物(例如无菌无热原水)重建。
本发明还涵盖各种粘膜疫苗接种策略。
剂量形式
此类治疗性组合物的毒性和治疗性功效可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药物规程(例如用于测定LD50(对群体的50％致死的剂量)和ED50(在群体的50％中治疗有效的剂量))来测定。毒性和治疗效应之间的剂量比率是治疗指数，并且它可以表示为LD50/ED50比率。表现出高治疗指数的治疗性组合物是优选的。尽管可以使用表现出毒性副作用的化合物，但应注意设计递送系统，所述递送系统将此类化合物靶向到受影响的位置的部位，以使对未感染细胞的潜在损伤最小化，从而减少副作用。
从细胞培养测定法和动物研究获得的数据可用于配制用于人的剂量范围。此类化合物的剂量优选位于在循环浓度范围内，所述循环浓度范围包括具有少量毒性或没有毒性的ED50。剂量可以在此范围内变化，这取决于所用的剂量形式和使用的施用途径。对于在本公开的方法中使用的任何化合物，可以首先从细胞培养测定法估计治疗性有效剂量。剂量可以在动物模型中制定，以达到循环血浆浓度范围，该浓度范围包括IC50(即实现症状的半最大抑制的测试化合物的浓度)，如在细胞培养物中测定。此类信息可用于更准确地测定对人有用的剂量。例如，可以通过高效液相层析测量血浆中的水平。
在公开的组合物中，抗原和佐剂两者均以免疫原性有效量存在。对于每种特定的抗原，最佳免疫原性有效量应通过实验测定(考虑给定患者的特定特征和/或治疗类型)。通常，此量在每kg体重0.01μg-250mg抗原的范围内。对于本发明的某些示例性佐剂，免疫原性有效量可以在每kg体重的10-250μg佐剂的范围内。
在某些实施方案中，治疗性组合物的治疗有效量(即有效剂量)范围可以为约0.001μg/kg至约250g/kg、0.01μg/kg至10g/kg、或0.1μg/kg至1g/kg或约或至少：0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009；0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09；0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、或250克或微克每千克患者体重，或本文列出的任何数目之间的任何范围，或明显的并且技术人员无需过度实验理解的其它范围。熟练技术人员将理解，某些因素可影响对患者进行有效治疗需要的剂量和时机，包括但不限于疾病或病症的严重性、先前治疗、受试者的一般健康或年龄以及存在的其它疾病。
在其它实施方案中，治疗性组合物中的Globo-H部分的治疗有效量(即有效剂量)范围可以是约0.001μg/kg至约250g/kg、0.01μg/kg至10g/kg、或0.1μg/kg至1g/kg或约或至少：0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009；0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09；0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、或250或微克每千克患者体重，或本文列出的任何数目之间的任何范围，或明显的并且技术人员无需过度实验理解的其它范围。熟练技术人员将理解，某些因素可影响对患者进行有效治疗需要的剂量和时机，包括但不限于疾病或病症的严重性、先前治疗、受试者的一般健康或年龄以及存在的其它疾病。
在某些实施方案中，本文中公开的治疗性组合物含有至少一种治疗性缀合物或治疗性抗体或与至少一种治疗性缀合物或治疗性抗体有关，其中至少一种治疗性缀合物或治疗性抗体中每种在单剂中以下述浓度存在：约、至少或超过：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99每次，10-9、10-8、10-7 10-7 10-6 10-5 10-4 10-3 10-2 10-1摩尔每剂。优选地，治疗性缀合物在单剂中以约1-100、2-60、3-50、4-40、5-30、6-20、7-15、8-10、2-18、3-16、4-14、5-12、6-10或7-8μM，或本文中列出的任何数目之间的任何范围之间的浓度存在。
在一些实施方案中，本文中公开的治疗性组合物含有至少一种治疗性缀合物或治疗性抗体或与至少一种治疗性缀合物或治疗性抗体有关，其中至少一种治疗性缀合物或治疗性抗体中每种在单剂中以下述浓度存在：约、至少或超过：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99每次，10-3、10-2、10-1或10微克。在某些实施方案中，每剂包含约或至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、250微克或更多的一种治疗性缀合物或治疗性抗体。
在某些实施方案中，以一定剂量以约或至少或超过：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24次每天、周或月在约或至少或超过：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24天、周、月或年的时间段里施用本文中公开的治疗性组合物。
有效剂量和安全性评估
根据本发明的方法，将本文所述的药物和疫苗组合物以免疫原性有效剂量对患者施用，优选在最小的毒性的情况下。如在标题为“定义”的节中所述，公开的配制剂的“免疫原性有效剂量”或“治疗性有效剂量”指足以在治疗的受试者中产生有效免疫应答并且因此足以导致对所述受试者的健康益处的抗原和/或佐剂的量。
试剂盒
根据另一方面，本领域技术人员可以设想一种或多种试剂盒，用于实施本文公开的至少一种方法的试剂盒，包含一种或多种治疗性缀合物、抗癌/抗增殖剂、佐剂、细胞因子和/或趋化因子的试剂盒。根据至少一种上文提及的方法，治疗性组合物单独或组合包含有效量的本文公开的治疗性组合物。上述药剂可以进入单个容器或试剂盒中的不同容器中。
如果期望的话，可以在可以含有一种或多种含有活性成分(即抗原和/或含鞘糖脂(GSL)的佐剂)的单位剂量形式的包装或分配器装置中呈现组合物。包装可以例如包括金属或塑料箔，如泡罩包装。包装或分配器装置可以附有施用说明书。也可以制备配制在相容的药物载体中的本发明的组合物，置于适当的容器中，并标记用于治疗指定的状况。
试剂盒可能还包括生物学事件的标识符或技术人员可在阅读本公开内容后鉴定的其它化合物。试剂盒还可以包含至少一种包含有效量的本文中公开的治疗性组合物的组合物。试剂盒的治疗性组合物实施根据本领域技术人员可鉴定的方法公开的至少一种方法。
本公开还包括利用本文公开的治疗性组合物治疗增殖性疾病的方法。在一个实施方案中，方法牵涉治疗癌症，例如乳腺癌。方法通常涉及以有效治疗增殖性病症的量对有此需要的患者提供本文中公开的治疗性组合物。
在一些实施方案中，在方法中对有此需要的受试者(例如具有癌症，如乳腺癌的受试者)施用本发明的治疗性组合物，所述方法平均而言相对于对照安慰剂，例如磷酸盐缓冲盐水安慰剂将无进展存活或总体存活延长约或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40天、周、月或年。
在一些实施方案中，在不存在不可接受的毒性或疾病进展的情况下，在0-2、6、14和26周皮下给予治疗性组合物。
在一些实施方案中，在方法中对有此需要的受试者(例如具有癌症，如乳腺癌的受试者)施用本发明的治疗性组合物，所述方法平均而言在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40天、周、月或年的过程中相对于对照安慰剂，例如磷酸盐缓冲盐水安慰剂将患者中的肿瘤体积缩小约或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51525354555657585960616263646566676869707172737474767778798081828384858687888990919293949596979899％或更多。
在一些实施方案中，可以通过CT扫描(推荐CT扫描切片厚度在2.5mm和5mm之间)以10mm的最小尺寸在至少一个维度(要记录测量的平面中最长直径)上准确测量肿瘤体积。
合成本发明组合物的方法
将本发明的治疗性组合物的Globo H六糖部分化学合成为烯丙基糖苷，然后制备用于与KLH缀合。
在一个例示性的实施方案中，Globo H的化学合成涉及以下一般步骤：
在水性缓冲液中用2-亚氨基硫烷处理KLH。然后，通过Sephadex G-15柱的大小排阻柱从未反应的2-亚氨基硫烷中分离硫醇化的KLH。在惰性气体(氮气或氩气)气氛中储存硫醇化KLH，并且立即用于与Globo H-MMCCH缀合。
实施例
实施例1：本发明的糖缀合物(Globo H-KLH)的制备
通过臭氧解将Globo H烯丙基糖苷(商品化)转化为醛。将Globo H醛与MMCCH接头和NaCNBH3起反应以给出Globo H-MMCCH。用柱纯化混合物以接收Globo H-MMCCH。通过高效液相层析(HPLC)证实具有Globo H-MMCCH阳性的级分，然后合并在一起。将KLH溶于硫醇化缓冲液中，并且按份将2-亚氨基硫烷添加到反应中。将反应物温育至完成，然后通过柱纯化KLH-SH。将Globo H-MMCCH和KLH-SH组合。搅拌反应物至完成。然后将Globo H-KLH糖缀合物纯化以提供终产物。
实施例2：糖缀合物中Globo H与KLH的重量比率的分析
通过高效阴离子交换层析及脉冲安培计检测(HPAEC-PAD)确认了如制备的糖缀合物中Globo H和KLH的重量比率。表3中显示了结果。
表3：糖缀合物中Globo H和KLH的重量比率
实施例3：糖缀合物中Globo H与KLH的表位比率的分析
如文献(如Micron 30(1999)597-623)中所述，KLH二-十聚体(天然聚集形式)的分子量为约7.5MDa-8.6MDa。通过大小排阻层析法和多角度激光散射光谱法(MALS)确认天然KLH，其具有约8.6MDa的分子量(参见图3)。
通过使用多角度激光散射光谱仪(SEC-MALS)的大小排阻层析评估和得出KLH和Globo H-KLH糖缀合物(OBI-822，批号14001)的质量分布。基于蛋白质含量(ε＝1.39)计算分子量(见图4)。在图4A中，观察到KLH的二十聚体(n＝20)和多十聚体(multi-decamer)(n＞20)。图4B显示二十聚体的峰面积为74.3％，而多十聚体为25.7％。在图4C中，观察到Globo H-KLH糖缀合物(OBI-822)的单体至六聚体(n＝1-6)和多聚体(n＞7-20)。图4D显示单体至六聚体(n＝1-6)的峰面积是主要成分(＞97％)，而如表4中显示了多聚体(n＞7-20)仅为少量(2.2％)。KLH和OBI-822寡聚体的质量分布分析总结显示如表4中。
表4：KLH和OBI-822寡聚体的质量分布分析总结
*MW开始/停止：以kDa计的分子量(MW)范围
**对于KLH，单体评估为约350-400kDa
***对于OBI-822，单体评估为约400-500kDa
结果显示了与天然聚集的KLH二十聚体相比，本发明的糖缀合物表现出分子量的降低质量。如表5中一样计算分子比率。
表5：Globo H与KLH的分子比率的计算
*基于如下文的公式计算上述分子比率：
**KLH的分子量取决于二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体至二十聚体的形式
根据上文，在本发明的某些糖缀合物实施方案中，KLH单体单元在与Globo H缀合后形成单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体和/或六聚体。
实施例4：疫苗组合物的制备和大鼠中的免疫
将如实施例1中制备的糖缀合物(Globo H-KLH)的不同样品在4℃下储存，并在层流通风橱下与皂苷佐剂混合。将得到的疫苗组合物置于冰上并运送至动物房以进行随后的免疫。
将三组路易鼠用各种疫苗组合物免疫，如表6中所示。
表6：经免疫的大鼠的组
*Globo H∶KLH＝0.17∶1(w/w)
在第0、7、14和21天免疫大鼠。在第0、3、10、17、24和31天收集外周血单核细胞(PBMC)和血浆。在第31天收获脾脏、淋巴结和腹膜清洗物。
实施例5：用于诱导大鼠中的体液和细胞免疫应答的测定法
实施例5.1：通过流式细胞术分析免疫效应细胞亚群
从动物中分离外周血单核细胞(PBMC)，然后通过使用针对细胞标志物的特异性抗体的流式细胞术鉴定PBMC中的各种免疫效应细胞亚群。用缀合有荧光(FITC)的不同抗体染色第0、3、10、17、24和31天从经免疫的大鼠中分离的PBMC，并置于冰上30分钟。温育后，用清洗缓冲液(磷酸缓冲盐水(UniRegionBiotech)中的1％牛血清白蛋白(Sigma)和0.1％NaN3(Sigma))清洗细胞，并以350g离心5分钟。将细胞重悬于清洗缓冲液中用于测定通过FACSCanto(BD Bioscience)测定荧光。用BD FACSDiva(BD Bioscience)软件分析数据。结果显示了在本发明的糖缀合物免疫的大鼠中，当与PBS对照组相比时，B细胞和T细胞显著扩充。具体地，在第3天首先出现B细胞群体，随后在第24天出现CD3T、CD4T和CD8T细胞。参见图5A至图5D。
实施例5.2：通过ELISA进行的Globo H特异性抗体测试
通过ELISA测定法测定来自经免疫的大鼠的血浆中Globo H特异性抗体的产生。结果显示，Globo H特异性IgG的滴度在10天时开始上升，并且在免疫后17天时达到峰值。在Globo H特异性IgM抗体的产生中观察到类似的模式。参见图6A至图6B。在仅用PBS处理的大鼠中没有Globo H特异性IgG和IgM抗体的应答。
总之，在经免疫的大鼠中，在第3天出现B细胞产生，随后在第10天出现了针对Globo H的IgM和IgG抗体的产生以及随后在第24天出现了CD3T、CD4T和CD8T细胞。本发明的糖缀合物(Globo H-KLH)有效诱导体液和细胞应答两者。
实施例6：小鼠中的免疫和通过ELISA的抗体测试
糖缀合物(Globo H-KLH)的不同样品在4℃下储存，并在层流通风橱下与皂苷佐剂混合。将所得的疫苗组合物置于冰上并运送至动物房以进行随后的免疫。
通过皮下注射每周一次对约8周龄的Balb/c小鼠给予具有不同糖与蛋白质(GloboH：KLH)比率的Globo H-KLH糖缀合物，持续四周(第0、7、14和21天)。在免疫前或第0天，以及每次疫苗接种(第10，17和24天)后3天在无抗凝剂的情况下经由眶内或面部静脉收集血液样品。然后，将样品离心以分离血清和红细胞。收集血清并在-20℃保存，随后通过ELISA分析。Mann-Whitney t检验用于统计学分析。
如图7中所示，已证明与PBS对照组相比，根据本发明的与皂苷佐剂组合的糖缀合物(Globo H-KLH)在动物模型中显著诱导了Globo H特异性IgM抗体应答。具体地，具有重量比率0.17∶1(Globo H∶KLH)的糖缀合物比具有重量比0.07∶1(Globo H∶KLH)的糖缀合物诱导更好的抗体效价。
总之，已证明根据本发明的与适当的佐剂组合的Globo H-KLH糖缀合物(OBI-822)在动物模型中引起卓越得出乎意料的体液和细胞免疫应答，特别是B细胞的扩增和T细胞(包括CTL)的扩充和IgM和IgG应答，其在癌症免疫疗法中是重要的。
实施例7：小鼠中具有不同佐剂的Globo H-KLH的免疫原性研究
已经进行本发明的Globo H组合物在与不同的佐剂(OBI-821/OBI-834)配对时在小鼠中引发免疫应答的能力。在第16天将存活的Lewis肺癌(LL/2，ATCC CRL-1642)细胞(由Eurofins Panlabs Taiwan Ltd.提供，0.1mL中的5.0×106)(对于C57BL/6小鼠而言同基因)对实验小鼠的侧面皮下注射到腹部区域中。用Globo H-KLH(OBI-822)和不同的佐剂皮下免疫6组6-8周龄雌性C57BL/6小鼠。OBI-822剂量水平相当于每组中的量。每次注射含有相当于以0.2mL/小鼠皮下(在左和右腹部位两者，0.1mL/部位)施用的2.0μg疫苗(OBI-822)和20μg佐剂(OBI-82I/OBI-834)的剂量。免疫在第0、5、11、19、29、34和39天发生，并且在第0天(注射前)和第42天收集血清用于通过ELISA比较分析。通过ELISA测量血清学应答，以测定针对Globo H的IgM和IgG抗体的滴度。
如图8中显示，在用磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理的小鼠中没有响应。相比之下，用OBI-822+OBI821和OBI-822+OBI-834处理的小鼠以相当大的IgM抗Globo H效价响应(图8A)。然而，平均IgG滴度低于IgG(图8B)。它指示OBI-821和OBI-834佐剂均可诱导Globo H-KLH(OBI-822)的免疫原性。用Globo H-KLH和佐剂的疫苗接种已证明在雌性C57BL/6小鼠中引起IgG和IgM抗Globo H应答两者。
如图9中显示，在第16、19、23、26、30、34、37、40和42天监测6组C57BL/6小鼠的体重和肿瘤大小。在第42天处死后拍摄包括肿瘤的全身照片。如图10中显示，根据长椭球的以下公式估计肿瘤体积(mm3)：长度(mm)×[宽度(mm)]2x0.5。经化合物处理的动物中的肿瘤生长计算为T/C(处理/对照)×100％；使用单因素ANOVA，然后进行Dunnetts检验或未配对Student t检验来测定表明抗肿瘤活性的肿瘤生长的显著抑制。OBI-822+OBI-821的第42天的肿瘤抑制率约为35％，而OBI-822+OBI-834是约22％。OBI-821和OBI-834佐剂两者可以与Globo H-KLH(OBI-822)一起抑制肿瘤生长。
实施例8：KLH上Globo-H缀合位点(赖氨酸)的LC-MS/MS分析
使用多个酶消化和LC-MS/MS鉴定在四个KLH样品中的Globo H缀合位点。首先用四种不同的酶消化四个缀合有Globo H的KLH样品，然后通过LC-MS/MS和Mascot数据库检索进行分析。鉴定出两种类型的衍生物：GloboH衍生物(Globo H+MMCCH)和MMCCH衍生物(仅MMCCH)。对Globo H缀合位点鉴定考虑了Globo H衍生物和其中性丧失形式。对MMCCH缀合位点鉴定考虑了MMCCH形式及其脱酰胺形式。只考虑了具有高质量MS/MS谱和Mascot得分的那些肽。对于Globo H缀合分析，从OBI-822-13001-DP(样品1)的两个重复LC-MS/MS分析中观察到31和28个缀合赖氨酸。从OBI-822-13002-DP的两个重复LC-MS/MS分析中观察到19和21个缀合赖氨酸(样品2)；从OBI-822-13003-DP的两个重复LC-MS/MS分析中观察到10和11个缀合赖氨酸(样品3)；从OBI-822-13004-DS(样品4)的两个重复LC-MS/MS分析中观察到18和19个缀合赖氨酸。对于MMCCH缀合分析，从OBI-822-13001-DP(样品1)的两个重复LC-MS/MS分析中发现了155和141个缀合赖氨酸。从OBI-822-13002-DP(样品2)的两个重复LC-MS/MS分析中发现了143和137个缀合赖氨酸；从OBI-822-13003-DP(样品3)的两个重复LC-MS/MS分析中发现147和143个缀合赖氨酸；从OBI-822-13004-DS(样品4)的两个重复LC-MS/MS分析中发现了140和136个缀合赖氨酸。
实施例8材料和方法：
如下列出缩写：
K＝赖氨酸；LC-MS/MS＝液相层析-串联质谱术；
DTT＝二硫苏糖醇；IAM＝碘乙酰胺；ACN＝乙腈；FA＝甲酸；Glu-C＝内蛋白酶Glu-C；ABC＝碳酸氢铵；RT＝室温；MW＝分子量。
首先将四个KLH样品(样品1-4)进行处理，用于通过100kDa截留AmiconUltraCentrifugal滤器进行缓冲液交换至50mM碳酸氢铵缓冲溶液中，并用6M尿素变性。然后，将样品用10mM DTT在37℃下还原1小时，在RT下用50mM IAM在黑暗中烷基化30分钟，并在RT下用50mM DTT淬灭5分钟。将所得蛋白质稀释直到尿素浓度为1M，并用不同酶进行溶液中消化，如下面的部分中描述。
用以下消化条件进行用不同酶的溶液中消化：(1)在37℃下胰蛋白酶消化24小时(蛋白质∶酶＝40∶1)；(2)37℃下Glu-C消化24小时(蛋白质∶酶＝25∶1)；(3)在RT胰凝乳蛋白酶消化24小时(蛋白质∶酶＝25∶1)；(4)在37℃下嗜热菌蛋白酶消化24小时(蛋白质∶酶＝25∶1)。
通过添加甲酸终止消化反应，并将所有四个消化样品进行LC-MS/MS分析。使用与Ultimate 3000RSLC系统(Dionex)偶联的Q Exactive质谱仪(Thermo Scientific)进行分析。用表7中显示的梯度使用C18柱(Acclaim PepMap RSLC，75μm x 150mm，2μm，)进行LC分离。
表7：LC分离梯度
时间(min) 流动相A＊％ 流动相B＊＊％ 流速(μL/min)
0 99 1 0.25
5 99 1 0.25
35 90 10 0.25
67 65 35 0.25
77 15 85 0.25
82 99 1 0.25
90 99 1 0.25
*流动相A：5％乙腈/0.1％甲酸
**流动相B：95％乙腈/0.1％甲酸
源内(In-source)CID设置为45eV。以m/z 350-2000的范围进行全MS扫描，并且来自MS扫描的10种最强烈的离子进行碎片化，用于MS/MS谱。原始数据由ProteomeDiscoverer1.4处理成峰列表，用于Mascot数据库搜索。
使用Mascot版本2.4.1和Thermo ProteomeDiscoverer 1.4版本针对KLH1序列(SEQ ID NO.1)和KLH2序列(SEQ ID NO.2)进行数据库搜索。使用的参数如下：
酶：根据消化法，胰蛋白酶，Glu-C，胰凝乳蛋白酶和嗜热菌蛋白酶；固定改性：脲基甲基(Carbamidomethyl，C)；
MMCCH衍生物(单独的MMCCH)的可变修饰；脱酰胺的(NQ)，氧化(M)，dK_MMCCH-1(K)，dK_MMCCH-2(K)；
Globo H衍生物(Globo H+MMCCH)的可变修饰：脱酰胺的(NQ)，氧化(M)，Globo_H_MMCCH(K)，dK_MMCCH_NL997(K)，dK_MMCCH_NL835(K)，dK_MMCCH_NL673(K)，dK_MMCCH_NL511(K)，dK_MMCCH_NL308(K)；
肽质量公差：±10ppm；片段质量公差：±0.05Da；最大缺少切割：5；仪器类型：ESI-TRAP；离子截留得分：13.
搜索参数中的“dK_MMCCH-1”指示具有352.1569Da的MW添加的缀合有MMCCH的赖氨酸。
搜索参数中的“dK_MMCCH-2”指示具有338.1300Da的MW添加的缀合有MMCCH的赖氨酸的脱酰胺形式。
搜索参数中的“Globo_H_MMCCH(K)”指示具有1393.5317Da的MW添加的缀合有Globo H的赖氨酸。
搜索参数中的“dK_MMCCH_NL997”指示具有396.1831Da的MW添加的缀合有Globo H的赖氨酸的中性丧失形式。
搜索参数中的“dK_MMCCH_NL835”指示具有558.2360Da的MW添加的缀合有Globo H的赖氨酸的中性丧失形式。
搜索参数中的“dK_MMCCH_NL673”指示具有720.2888Da的MW添加的缀合有Globo H的赖氨酸的中性丧失形式。
搜索参数中的“dK_MMCCH_NL511”指示具有882.3416Da的MW添加的缀合有Globo H的赖氨酸的中性丧失形式。
搜索参数中的“dK_MMCCH_NL308”指示具有1085.4210Da的MW添加的缀合有GloboH的赖氨酸的中性丧失形式。
“MW添加”暗示与完整赖氨酸残基相比分子量添加。
实施例8结果：
基于LC-MS/MS的技术已经成为鉴定蛋白质和表征氨基酸修饰的重要工具。可以通过分配由MS/MS谱提供的片段离子获得关于肽序列和修饰位点的详细信息。Mascot是一种搜索引擎，并且其基于概率的评分算法已被广泛接受。本研究采用Mascot评分作为蛋白质测序和Globo H或MMCCH缀合位点鉴定的置信度参照。为了广泛分析样品1-4中Globo H或MMCCH缀合位点的分布，将这些样品用多种酶消化，然后进行LC-MS/MS分析。
在图11A中显示了Globo H衍生物(Globo H+MMCCH)的预期化学结构，并且可以在结果间观察到在含赖氨酸的肽上相应的MW添加1393.53Da。此外，在LC-MS分析中电喷雾离子化期间，不稳定多糖倾向于通过中性丧失下降。因此，如图11B中所示，对于糖缀合的肽，也可以观察到由中性丧失引起的396.18Da、558.24Da、720.29Da、882.34Da和1085.42Da的分子量添加。考虑所有的衍生化形式用于鉴定Globo H缀合位点。
此外，在这些缀合有Globo H的KLH样品中也观察到MMCCH衍生物(单独的MMCCH)。图12A和图12B中显示了MMCCH衍生物及其脱酰胺形式的预期化学结构，并且可以在结果间分别观察到在含赖氨酸的肽上352.16Da和338.13Da的相应MW添加。考虑了这两种衍生化形式用于鉴定MMCCH缀合位点。从Globo H衍生物至MMCCH的转化不是清楚的，但提出在样品处理过程中发生。
用于前体离子的±10ppm的质量精度和用于片段离子的±0.05Da的质量精度用作蛋白质鉴定和谱解释的标准。选择Globo H衍生物及其中性丧失形式作为Globo H缀合位点鉴定的可变修饰，并选择MMCCH衍生物及其脱酰胺形式作为MMCCH缀合位点鉴定的可变修饰。针对KLH1(SEQ ID NO.1)和KLH2(SEQ ID NO.2)的序列进行数据库搜索。报告中仅列出了具有高质量MS/MS谱(离子评分≥13，p＜0.05)的肽。
为了证明可重复的结果，将LC-MS/MS分析进行两次，接着进行单独的Mascot数据库搜索，用于Globo H缀合位点鉴定和MMCCH缀合位点鉴定两者，如图13A和图13B中汇总。
在Globo H缀合位点分析中，分别在样品1的第一次LC-MS/MS和第二次LC-MS/MS中发现31和28个赖氨酸；分别在样品2的第一次LC-MS/MS和第二次LC-MS/MS中发现19和21个赖氨酸；分别在样品3的第一次LC-MS/MS和第二次LC-MS/MS中发现10和11个赖氨酸；分别在样品4的第一次LC-MS/MS和第二次LC-MS/MS中发现18和19个赖氨酸。图14至21中列出了鉴定详情。在MMCCH缀合分析中，分别在样品1的第一次LC-MS/MS和第二次LC-MS/MS中发现155和141个赖氨酸；分别在样品2的第一次LC-MS/MS和第二次LC-MS/MS中发现143和137个赖氨酸；分别在样品3的第一次LC-MS/MS和第二次LC-MS/MS中发现147和143个赖氨酸；分别在样品4的第一次LC-MS/MS和第二次LC-MS/MS中发现140和136个赖氨酸。图22至29中列出了鉴定详情。
在图30中总结来自多个酶实验的Globo H缀合位点，并且在图31中总结MMCCH缀合位点。在图32中总结缀合有Globo H的样品的总体缀合位点分析结果。
实施例8结论：
由于多重中性丧失形式和多糖的较低的离子化效率，缀合有Globo H衍生物的肽的质谱信号低于缀合有MMCCH的肽的质谱信号，这使得Globo H缀合的直接鉴定更加困难。这就是为何鉴定的肽数目对于MMCCH缀合分析更高。因此，MMCCH结果可用于表示Globo H缀合。
缀合位点分析提示，样品1-4的KLH1/KLH2中的总共306个赖氨酸残基中分别有鉴定的155、143、147和140个赖氨酸缀合位点。在重复分析中，分别对样品1-4鉴定出141、137、143和136个缀合位点。
实施例9：在KLH上的Globo-H缀合位点(组氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺和精氨酸)的LC-MS/MS分析
检测了五种残基H、N、P、Q、R上的两类衍生物：GMd(Globo H+MMCCH接头+赖氨酸衍生物)和Md(MMCCH接头+赖氨酸衍生物)。
对HNPQR(GMd和Md)的修饰分析对于OBI-822-13001-DP(样品1)分别在KLH1和KLH2中产生6和13个缀合HNPQR位点；对于OBI-822-13002-DP(样品2)，在KLH1和KLH2中产生11和10个缀合HNPQR位点；对于OBI-822-13003-DP(样品3)，在KLH1和KLH2中产生13和9个缀合的HNPQR位点；并且对于OBI-822-13004-DS(样品4)，在KLH1和KLH2中产生8和10个缀合HNPQR位点。
实施例9材料和方法：
如下列出缩写：
K＝赖氨酸；H＝组氨酸；N＝天冬酰胺；P＝脯氨酸；Q＝谷氨酰胺；R＝精氨酸；LC-MS/MS＝液相层析-串联质谱术；MW＝分子量。
使用Mascot版本2.4.1针对KLH1序列(SEQ ID NO.1)和KLH2序列(SEQ ID NO.2)进行数据库搜索。使用的参数如下：
酶：根据消化方法，胰蛋白酶、Glu-C、胰凝乳蛋白酶和嗜热菌蛋白酶；
固定修饰：脲基甲基(C)；
可变修饰：氧化(M)，脱酰胺(NQ)；
1.OBI822_GMd(HKNPQR)，GMd_NL997(HKNPQR)；
2.OBI822_Md(HKNPQR)，Md_脱酰胺(HKNPQR)；
肽质量公差：±10ppm；片段质量公差：±0.05Da；最大缺少切割：5；仪器类型：ESI-TRAP；离子截留得分：13。
搜索参数中的“OBI822_GMd”指示具有1393.5317Da的MW添加的缀合有GMd的残基(HKNPQR)。
搜索参数中的“GMd_NL997”指示具有396.1831Da的MW添加的缀合有GMd的残基(HKNPQR)的中性丧失形式。
搜索参数中的“OBI822_Md”指示具有352.1569Da的MW添加的缀合有Md的残基(HKNPQR)。
搜索参数中的“Md_脱酰胺”指示具有338.1300Da的MW添加的缀合有Md的残基(HKNPQR)的脱酰胺形式。
实施例9结果：
已经出现基于LC-MS/MS的技术，作为蛋白质鉴定和氨基酸修饰表征的重要工具。通过分配由MS/MS谱提供的碎片离子可以获得关于肽序列和修饰位点的详细信息。Mascot目前是最受欢迎的搜索引擎，拥有广泛接受的基于概率的评分算法。为了鉴定样品1-4中赖氨酸(K)和其他特异性残基(HNPQR)的不同修饰，所有的检索结果都进行了随后的手动检查，只筛选出具有高质量MS/MS光谱法的那些肽。
在MASCOT中，在HNPQR残基上寻找GMd(Globo H+MMCCH接头+赖氨酸衍生物)和Md(MMCCH接头+赖氨酸衍生物)修饰，鉴定出假肽。如果指定的修饰位点接近赖氨酸残基，则赖氨酸可能是实际的修饰位点。这些肽被从识别列表中排除。如果没有附近的赖氨酸残留物可以观察到，可以确认HNPQR的修饰。如图38所示，GMd修饰位点分析在KLH1中分别为样品1-4分别产生1，2，2和3个缀合的HNPQR位点，分别为KLH2中的4个，4个，2个和3个缀合的HNPQR位点，分别为样品1-4。Md修饰位点分析在KLH1中分别产生5，9，11和5个缀合的HNPQR位点，分别为样品1-4，KLH2中的9，6，7和7个缀合的HNPQR位点为样品1-4。
实施例9结论：
在这四个样品中，对特定残基(HNPQR)的GMd和Md修饰分析提示，样品1-4中KLH1中分别有6、11、13和8个缀合HNPQR位点，并且样品1-4中KLH2分别有13、10、9和10个缀合HNPQR位点。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语以及任何首字母缩略词具有与本发明领域中本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然与本文的描述相似或等同的任何组合物、方法、试剂盒和用于通信信息的手段可以用来实践本发明，但是本文描述了优选的组合物、方法、试剂盒和用于通信信息的手段。
本文引用的所有参考文献通过引用在法律允许的全部程度上并入本文。对那些参考文献的讨论仅仅是为了总结其作者做出的主张。不承认任何参考文献(或任何参考文献的部分)是相关现有技术。申请人保留质疑任何引用参考文献的准确性和适当性的权利。
序列表
<110> 台湾浩鼎生技股份有限公司
<120> 免疫原性/治疗性糖缀合物组合物及其用途
<130> G3004-00401
<140> TBD
<141> 2015-09-15
<150> US 62/050,567
<151> 2014-09-14
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3125
<212> PRT
<213> Megathura crenulata
<400> 1
Met Thr Pro Glu Glu Leu Lys Thr Tyr Leu Asp Glu Arg Ser Ser Arg
1 5 10 15
Ala Arg Ala Phe Ala Ser Phe Arg Leu Lys Gly Phe Gly Gly Ser Ala
20 25 30
Asn Val Phe Val Tyr Val Cys Ile Pro Asp Asp Asn Asp Arg Asn Asp
35 40 45
Asp His Cys Glu Lys Ala Gly Asp Phe Phe Val Leu Gly Gly Pro Ser
50 55 60
Glu Met Lys Trp Gln Phe Tyr Arg Pro Tyr Leu Phe Asp Leu Ser Asp
65 70 75 80
Thr Val His Lys Met Gly Met Lys Leu Asp Gly His Tyr Thr Val Lys
85 90 95
Ala Glu Leu Phe Ser Val Asn Gly Thr Ala Leu Pro Asp Asp Leu Leu
100 105 110
Pro His Pro Val Val Val His His Pro Glu Lys Gly Phe Thr Asp Pro
115 120 125
Pro Val Lys His His Gln Ser Ala Asn Leu Leu Val Arg Lys Asn Ile
130 135 140
Asn Asp Leu Thr Arg Glu Glu Val Leu Asn Leu Arg Glu Ala Phe His
145 150 155 160
Lys Phe Gln Glu Asp Arg Ser Val Asp Gly Tyr Gln Ala Thr Ala Glu
165 170 175
Tyr His Gly Leu Pro Ala Arg Cys Pro Arg Pro Asp Ala Lys Asp Arg
180 185 190
Tyr Ala Cys Cys Val His Gly Met Pro Ile Phe Pro His Trp His Arg
195 200 205
Leu Phe Val Thr Gln Val Glu Asp Ala Leu Val Gly Arg Gly Ala Thr
210 215 220
Ile Gly Ile Pro Tyr Trp Gly Leu Pro Tyr Trp Asp Trp Thr Glu Pro
225 230 235 240
Met Thr His Ile Pro Gly Leu Ala Gly Asn Lys Thr Tyr Val Asp Ser
245 250 255
His Gly Ala Ser His Thr Asn Pro Phe His Ser Ser Val Ile Ala Phe
260 265 270
Glu Glu Asn Ala Pro His Thr Lys Arg Gln Ile Asp Gln Arg Leu Phe
275 280 285
Lys Pro Ala Thr Phe Gly His His Thr Asp Leu Phe Asn Gln Ile Leu
290 295 300
Tyr Ala Phe Glu Gln Glu Asp Tyr Cys Asp Phe Glu Val Gln Phe Glu
305 310 315 320
Ile Thr His Asn Thr Ile His Ala Trp Thr Gly Gly Ser Glu His Phe
325 330 335
Ser Met Ser Ser Leu His Tyr Thr Ala Phe Asp Pro Leu Phe Tyr Phe
340 345 350
His His Ser Asn Val Asp Arg Leu Trp Ala Val Trp Gln Ala Leu Gln
355 360 365
Met Arg Arg His Lys Pro Tyr Arg Ala His Cys Ala Ile Ser Leu Glu
370 375 380
His Met His Leu Lys Pro Phe Ala Phe Ser Ser Pro Leu Asn Asn Asn
385 390 395 400
Glu Lys Thr His Ala Asn Ala Met Pro Asn Lys Ile Tyr Asp Tyr Glu
405 410 415
Asn Val Leu His Tyr Thr Tyr Glu Asp Leu Thr Phe Gly Gly Ile Ser
420 425 430
Leu Glu Asn Ile Glu Lys Met Ile His Glu Asn Gln Gln Glu Asp Arg
435 440 445
Ile Tyr Ala Gly Phe Leu Leu Ala Gly Ile Arg Thr Ser Ala Asn Val
450 455 460
Asp Ile Phe Ile Lys Thr Thr Asp Ser Val Gln His Lys Ala Gly Thr
465 470 475 480
Phe Ala Val Leu Gly Gly Ser Lys Glu Met Lys Trp Gly Phe Asp Arg
485 490 495
Val Phe Lys Phe Asp Ile Thr His Val Leu Lys Asp Leu Asp Leu Thr
500 505 510
Ala Asp Gly Asp Phe Glu Val Thr Val Asp Ile Thr Glu Val Asp Gly
515 520 525
Thr Lys Leu Ala Ser Ser Leu Ile Pro His Ala Ser Val Ile Arg Glu
530 535 540
His Ala Arg Gly Lys Leu Asn Arg Val Lys Phe Asp Lys Val Pro Arg
545 550 555 560
Ser Arg Leu Ile Arg Lys Asn Val Asp Arg Leu Ser Pro Glu Glu Met
565 570 575
Asn Glu Leu Arg Lys Ala Leu Ala Leu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Ala
580 585 590
Gly Gly Phe Gln Gln Leu Gly Ala Phe His Gly Glu Pro Lys Trp Cys
595 600 605
Pro Ser Pro Glu Ala Ser Lys Lys Phe Ala Cys Cys Val His Gly Met
610 615 620
Ser Val Phe Pro His Trp His Arg Leu Leu Thr Val Gln Ser Glu Asn
625 630 635 640
Ala Leu Arg Arg His Gly Tyr Asp Gly Ala Leu Pro Tyr Trp Asp Trp
645 650 655
Thr Ser Pro Leu Asn His Leu Pro Glu Leu Ala Asp His Glu Lys Tyr
660 665 670
Val Asp Pro Glu Asp Gly Val Glu Lys His Asn Pro Trp Phe Asp Gly
675 680 685
His Ile Asp Thr Val Asp Lys Thr Thr Thr Arg Ser Val Gln Asn Lys
690 695 700
Leu Phe Glu Gln Pro Glu Phe Gly His Tyr Thr Ser Ile Ala Lys Gln
705 710 715 720
Val Leu Leu Ala Leu Glu Gln Asp Asn Phe Cys Asp Phe Glu Ile Gln
725 730 735
Tyr Glu Ile Ala His Asn Tyr Ile His Ala Leu Val Gly Gly Ala Gln
740 745 750
Pro Tyr Gly Met Ala Ser Leu Arg Tyr Thr Ala Phe Asp Pro Leu Phe
755 760 765
Tyr Leu His His Ser Asn Thr Asp Arg Ile Trp Ala Ile Trp Gln Ala
770 775 780
Leu Gln Lys Tyr Arg Gly Lys Pro Tyr Asn Val Ala Asn Cys Ala Val
785 790 795 800
Thr Ser Met Arg Glu Pro Leu Gln Pro Phe Gly Leu Ser Ala Asn Ile
805 810 815
Asn Thr Asp His Val Thr Lys Glu His Ser Val Pro Phe Asn Val Phe
820 825 830
Asp Tyr Lys Thr Asn Phe Asn Tyr Glu Tyr Asp Thr Leu Glu Phe Asn
835 840 845
Gly Leu Ser Ile Ser Gln Leu Asn Lys Lys Leu Glu Ala Ile Lys Ser
850 855 860
Gln Asp Arg Phe Phe Ala Gly Phe Leu Leu Ser Gly Phe Lys Lys Ser
865 870 875 880
Ser Leu Val Lys Phe Asn Ile Cys Thr Asp Ser Ser Asn Cys His Pro
885 890 895
Ala Gly Glu Phe Tyr Leu Leu Gly Asp Glu Asn Glu Met Pro Trp Ala
900 905 910
Tyr Asp Arg Val Phe Lys Tyr Asp Ile Thr Glu Lys Leu His Asp Leu
915 920 925
Lys Leu His Ala Glu Asp His Phe Tyr Ile Asp Tyr Glu Val Phe Asp
930 935 940
Leu Lys Pro Ala Ser Leu Gly Lys Asp Leu Phe Lys Gln Pro Ser Val
945 950 955 960
Ile His Glu Pro Arg Ile Gly His His Glu Gly Glu Val Tyr Gln Ala
965 970 975
Glu Val Thr Ser Ala Asn Arg Ile Arg Lys Asn Ile Glu Asn Leu Ser
980 985 990
Leu Gly Glu Leu Glu Ser Leu Arg Ala Ala Phe Leu Glu Ile Glu Asn
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Asp Gly Thr Tyr Glu Ser Ile Ala Lys Phe His Gly Ser Pro Gly
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Leu Cys Gln Leu Asn Gly Asn Pro Ile Ser Cys Cys Val His Gly
1025 1030 1035
Met Pro Thr Phe Pro His Trp His Arg Leu Tyr Val Val Val Val
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Arg Asp Pro Lys Asp Ser Leu Phe His Ser Asp Tyr Phe Tyr Glu
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Phe Asp Lys Ser Asp Asn Asn Asp Glu Ala Thr Lys Thr His Ala
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Thr Pro His Asp Gly Phe Glu Tyr Gln Asn Ser Phe Gly Tyr Ala
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His Met Leu Gln Glu Arg Lys Arg His Asp Arg Val Phe Ala Gly
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Val Cys Leu Pro Thr Gly Glu His Thr Lys Asp Cys Ser His Glu
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1430 1435 1440
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2015 2020 2025
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2660 2665 2670
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2840 2845 2850
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2930 2935 2940
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2990 2995 3000
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3005 3010 3015
Ile Val Arg Arg Pro Asn Asn Ala Val Phe Asp Ile Ile Glu Ile
3020 3025 3030
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3050 3055 3060
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3065 3070 3075
Lys Val Pro Pro Phe Ser Phe His Ala Phe Glu Leu Gly Lys Met
3080 3085 3090
Tyr Ser Val Glu Ser Gly Asp Tyr Phe Met Thr Ala Ser Thr Thr
3095 3100 3105
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Asp Glu
3125
<210> 2
<211> 3421
<212> PRT
<213> Megathura crenulata
<400> 2
Met Trp Thr Ile Leu Ala Leu Leu Thr Ala Thr Leu Leu Phe Glu Gly
1 5 10 15
Ala Phe Ser Val Asp Thr Val Val Arg Lys Asn Val Asp Ser Leu Ser
20 25 30
Ser Asp Glu Val Leu Ala Leu Glu Lys Ala Leu Asp Asp Leu Gln Gln
35 40 45
Asp Asp Ser Asn Gln Gly Tyr Gln Ala Ile Ala Gly Tyr His Gly Val
50 55 60
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85 90 95
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100 105 110
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
Thr Asn Pro Leu Asp Leu Thr Arg Glu His Ala Lys Pro Ala Asp Ser
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
Ala Asn Val Val Val Tyr Val Cys Arg Pro Ala His Asp Glu Ile Ser
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Asp Ser Val Ala Ser Ile Asp Asp Asp Gly His Gly His Tyr Tyr Val
385 390 395 400
Lys Ser Glu Leu Phe Ser Val Asn Gly Ser Ala Leu Ser Asn Asp Ile
405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
Glu Phe His Ala Leu Pro Ala Arg Cys Pro Arg Pro Asp Ala Lys Asp
485 490 495
Arg Phe Ala Cys Cys Val His Gly Met Ala Thr Phe Pro His Trp His
500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
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595 600 605
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835 840 845
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850 855 860
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865 870 875 880
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885 890 895
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900 905 910
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915 920 925
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930 935 940
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945 950 955 960
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965 970 975
Trp His His Gly His Ile Asp Ser Val Gly His Asp Thr Thr Arg Asp
980 985 990
Val Arg Asp Asp Leu Tyr Gln Ser Pro Gly Phe Gly His Tyr Thr Asp
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Ile Ala Lys Gln Val Leu Leu Ala Phe Glu Gln Asp Asp Phe Cys
1010 1015 1020
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1055 1060 1065
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1070 1075 1080
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1085 1090 1095
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1100 1105 1110
Thr Arg Glu His Ser Val Pro Phe Arg Val Phe Asp Tyr Lys Asn
1115 1120 1125
Asn Phe Asp Tyr Glu Tyr Glu Ser Leu Ala Phe Asn Gly Leu Ser
1130 1135 1140
Ile Ala Gln Leu Asp Arg Glu Leu Gln Arg Arg Lys Ser His Asp
1145 1150 1155
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Leu His Asp Leu Asp Leu His Val Gly Asp Asn Phe Phe Leu Lys
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Gln Ala Asp Glu Tyr Arg Glu Ala Val Thr Ser Ala Ser His Ile
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Arg Lys Asn Ile Arg Asp Leu Ser Glu Gly Glu Ile Glu Ser Ile
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Arg Ser Ala Phe Leu Gln Ile Gln Lys Glu Gly Ile Tyr Glu Asn
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Leu Trp Asp Asn Lys Asp Phe Tyr Glu Asn Val Met Leu Ala Leu
1415 1420 1425
Glu Gln Asp Asn Phe Cys Asp Phe Glu Ile Gln Leu Glu Leu Ile
1430 1435 1440
His Asn Ala Leu His Ser Arg Leu Gly Gly Arg Ala Lys Tyr Ser
1445 1450 1455
Leu Ser Ser Leu Asp Tyr Thr Ala Phe Asp Pro Val Phe Phe Leu
1460 1465 1470
His His Ala Asn Val Asp Arg Ile Trp Ala Ile Trp Gln Asp Leu
1475 1480 1485
Gln Arg Tyr Arg Lys Lys Pro Tyr Asn Glu Ala Asp Cys Ala Val
1490 1495 1500
Asn Glu Met Arg Lys Pro Leu Gln Pro Phe Asn Asn Pro Glu Leu
1505 1510 1515
Asn Ser Asp Ser Met Thr Leu Lys His Asn Leu Pro Gln Asp Ser
1520 1525 1530
Phe Asp Tyr Gln Asn Arg Phe Arg Tyr Gln Tyr Asp Asn Leu Gln
1535 1540 1545
Phe Asn His Phe Ser Ile Gln Lys Leu Asp Gln Thr Ile Gln Ala
1550 1555 1560
Arg Lys Gln His Asp Arg Val Phe Ala Gly Phe Ile Leu His Asn
1565 1570 1575
Ile Gly Thr Ser Ala Val Val Asp Ile Tyr Ile Cys Val Glu Gln
1580 1585 1590
Gly Gly Glu Gln Asn Cys Lys Thr Lys Ala Gly Ser Phe Thr Ile
1595 1600 1605
Leu Gly Gly Glu Thr Glu Met Pro Phe His Phe Asp Arg Leu Tyr
1610 1615 1620
Lys Phe Asp Ile Thr Ser Ala Leu His Lys Leu Gly Val Pro Leu
1625 1630 1635
Asp Gly His Gly Phe Asp Ile Lys Val Asp Val Arg Ala Val Asn
1640 1645 1650
Gly Ser His Leu Asp Gln His Ile Leu Asn Glu Pro Ser Leu Leu
1655 1660 1665
Phe Val Pro Gly Glu Arg Lys Asn Ile Tyr Tyr Asp Gly Leu Ser
1670 1675 1680
Gln His Asn Leu Val Arg Lys Glu Val Ser Ser Leu Thr Thr Leu
1685 1690 1695
Glu Lys His Phe Leu Arg Lys Ala Leu Lys Asn Met Gln Ala Asp
1700 1705 1710
Asp Ser Pro Asp Gly Tyr Gln Ala Ile Ala Ser Phe His Ala Leu
1715 1720 1725
Pro Pro Leu Cys Pro Ser Pro Ser Ala Ala His Arg His Ala Cys
1730 1735 1740
Cys Leu His Gly Met Ala Thr Phe Pro Gln Trp His Arg Leu Tyr
1745 1750 1755
Thr Val Gln Phe Glu Asp Ser Leu Lys Arg His Gly Ser Ile Val
1760 1765 1770
Gly Leu Pro Tyr Trp Asp Trp Leu Lys Pro Gln Ser Ala Leu Pro
1775 1780 1785
Asp Leu Val Thr Gln Glu Thr Tyr Glu His Leu Phe Ser His Lys
1790 1795 1800
Thr Phe Pro Asn Pro Phe Leu Lys Ala Asn Ile Glu Phe Glu Gly
1805 1810 1815
Glu Gly Val Thr Thr Glu Arg Asp Val Asp Ala Glu His Leu Phe
1820 1825 1830
Ala Lys Gly Asn Leu Val Tyr Asn Asn Trp Phe Cys Asn Gln Ala
1835 1840 1845
Leu Tyr Ala Leu Glu Gln Glu Asn Tyr Cys Asp Phe Glu Ile Gln
1850 1855 1860
Phe Glu Ile Leu His Asn Gly Ile His Ser Trp Val Gly Gly Ser
1865 1870 1875
Lys Thr His Ser Ile Gly His Leu His Tyr Ala Ser Tyr Asp Pro
1880 1885 1890
Leu Phe Tyr Ile His His Ser Gln Thr Asp Arg Ile Trp Ala Ile
1895 1900 1905
Trp Gln Ala Leu Gln Glu His Arg Gly Leu Ser Gly Lys Glu Ala
1910 1915 1920
His Cys Ala Leu Glu Gln Met Lys Asp Pro Leu Lys Pro Phe Ser
1925 1930 1935
Phe Gly Ser Pro Tyr Asn Leu Asn Lys Arg Thr Gln Glu Phe Ser
1940 1945 1950
Lys Pro Glu Asp Thr Phe Asp Tyr His Arg Phe Gly Tyr Glu Tyr
1955 1960 1965
Asp Ser Leu Glu Phe Val Gly Met Ser Val Ser Ser Leu His Asn
1970 1975 1980
Tyr Ile Lys Gln Gln Gln Glu Ala Asp Arg Val Phe Ala Gly Phe
1985 1990 1995
Leu Leu Lys Gly Phe Gly Gln Ser Ala Ser Val Ser Phe Asp Ile
2000 2005 2010
Cys Arg Pro Asp Gln Ser Cys Gln Glu Ala Gly Tyr Phe Ser Val
2015 2020 2025
Leu Gly Gly Ser Ser Glu Met Pro Trp Gln Phe Asp Arg Leu Tyr
2030 2035 2040
Lys Tyr Asp Ile Thr Lys Thr Leu Lys Asp Met Lys Leu Arg Tyr
2045 2050 2055
Asp Asp Thr Phe Thr Ile Lys Val His Ile Lys Asp Ile Ala Gly
2060 2065 2070
Ala Glu Leu Asp Ser Asp Leu Ile Pro Thr Pro Ser Val Leu Leu
2075 2080 2085
Glu Glu Gly Lys His Gly Ile Asn Val Arg His Val Gly Arg Asn
2090 2095 2100
Arg Ile Arg Met Glu Leu Ser Glu Leu Thr Glu Arg Asp Leu Ala
2105 2110 2115
Ser Leu Lys Ser Ala Met Arg Ser Leu Gln Ala Asp Asp Gly Val
2120 2125 2130
Asn Gly Tyr Gln Ala Ile Ala Ser Phe His Gly Leu Pro Ala Ser
2135 2140 2145
Cys His Asp Asp Glu Gly His Glu Ile Ala Cys Cys Ile His Gly
2150 2155 2160
Met Pro Val Phe Pro His Trp His Arg Leu Tyr Thr Leu Gln Met
2165 2170 2175
Asp Met Ala Leu Leu Ser His Gly Ser Ala Val Ala Ile Pro Tyr
2180 2185 2190
Trp Asp Trp Thr Lys Pro Ile Ser Lys Leu Pro Asp Leu Phe Thr
2195 2200 2205
Ser Pro Glu Tyr Tyr Asp Pro Trp Arg Asp Ala Val Val Asn Asn
2210 2215 2220
Pro Phe Ala Lys Gly Tyr Ile Lys Ser Glu Asp Ala Tyr Thr Val
2225 2230 2235
Arg Asp Pro Gln Asp Ile Leu Tyr His Leu Gln Asp Glu Thr Gly
2240 2245 2250
Thr Ser Val Leu Leu Asp Gln Thr Leu Leu Ala Leu Glu Gln Thr
2255 2260 2265
Asp Phe Cys Asp Phe Glu Val Gln Phe Glu Val Val His Asn Ala
2270 2275 2280
Ile His Tyr Leu Val Gly Gly Arg Gln Val Tyr Ala Leu Ser Ser
2285 2290 2295
Gln His Tyr Ala Ser Tyr Asp Pro Ala Phe Phe Ile His His Ser
2300 2305 2310
Phe Val Asp Lys Ile Trp Ala Val Trp Gln Ala Leu Gln Lys Lys
2315 2320 2325
Arg Lys Arg Pro Tyr His Lys Ala Asp Cys Ala Leu Asn Met Met
2330 2335 2340
Thr Lys Pro Met Arg Pro Phe Ala His Asp Phe Asn His Asn Gly
2345 2350 2355
Phe Thr Lys Met His Ala Val Pro Asn Thr Leu Phe Asp Phe Gln
2360 2365 2370
Asp Leu Phe Tyr Thr Tyr Asp Asn Leu Glu Ile Ala Gly Met Asn
2375 2380 2385
Val Asn Gln Leu Glu Ala Glu Ile Asn Arg Arg Lys Ser Gln Thr
2390 2395 2400
Arg Val Phe Ala Gly Phe Leu Leu His Gly Ile Gly Arg Ser Ala
2405 2410 2415
Asp Val Arg Phe Trp Ile Cys Lys Thr Ala Asp Asp Cys His Ala
2420 2425 2430
Ser Gly Met Ile Phe Ile Leu Gly Gly Ser Lys Glu Met His Trp
2435 2440 2445
Ala Tyr Asp Arg Asn Phe Lys Tyr Asp Ile Thr Gln Ala Leu Lys
2450 2455 2460
Ala Gln Ser Ile His Pro Glu Asp Val Phe Asp Thr Asp Ala Pro
2465 2470 2475
Phe Phe Ile Lys Val Glu Val His Gly Val Asn Lys Thr Ala Leu
2480 2485 2490
Pro Ser Ser Ala Ile Pro Ala Pro Thr Ile Ile Tyr Ser Ala Gly
2495 2500 2505
Glu Gly His Thr Asp Asp His Gly Ser Asp His Ile Ala Gly Ser
2510 2515 2520
Gly Val Arg Lys Asp Val Thr Ser Leu Thr Ala Ser Glu Ile Glu
2525 2530 2535
Asn Leu Arg His Ala Leu Gln Ser Val Met Asp Asp Asp Gly Pro
2540 2545 2550
Asn Gly Phe Gln Ala Ile Ala Ala Tyr His Gly Ser Pro Pro Met
2555 2560 2565
Cys His Met His Asp Gly Arg Asp Val Ala Cys Cys Thr His Gly
2570 2575 2580
Met Ala Ser Phe Pro His Trp His Arg Leu Phe Val Lys Gln Met
2585 2590 2595
Glu Asp Ala Leu Ala Ala His Gly Ala His Ile Gly Ile Pro Tyr
2600 2605 2610
Trp Asp Trp Thr Ser Ala Phe Ser His Leu Pro Ala Leu Val Thr
2615 2620 2625
Asp His Glu His Asn Pro Phe His His Gly His Ile Ala His Arg
2630 2635 2640
Asn Val Asp Thr Ser Arg Ser Pro Arg Asp Met Leu Phe Asn Asp
2645 2650 2655
Pro Glu His Gly Ser Glu Ser Phe Phe Tyr Arg Gln Val Leu Leu
2660 2665 2670
Ala Leu Glu Gln Thr Asp Phe Cys Gln Phe Glu Val Gln Phe Glu
2675 2680 2685
Ile Thr His Asn Ala Ile His Ser Trp Thr Gly Gly His Thr Pro
2690 2695 2700
Tyr Gly Met Ser Ser Leu Glu Tyr Thr Ala Tyr Asp Pro Leu Phe
2705 2710 2715
Tyr Leu His His Ser Asn Thr Asp Arg Ile Trp Ala Ile Trp Gln
2720 2725 2730
Ala Leu Gln Lys Tyr Arg Gly Phe Gln Tyr Asn Ala Ala His Cys
2735 2740 2745
Asp Ile Gln Val Leu Lys Gln Pro Leu Lys Pro Phe Ser Glu Ser
2750 2755 2760
Arg Asn Pro Asn Pro Val Thr Arg Ala Asn Ser Arg Ala Val Asp
2765 2770 2775
Ser Phe Asp Tyr Glu Arg Leu Asn Tyr Gln Tyr Asp Thr Leu Thr
2780 2785 2790
Phe His Gly His Ser Ile Ser Glu Leu Asp Ala Met Leu Gln Glu
2795 2800 2805
Arg Lys Lys Glu Glu Arg Thr Phe Ala Ala Phe Leu Leu His Gly
2810 2815 2820
Phe Gly Ala Ser Ala Asp Val Ser Phe Asp Val Cys Thr Pro Asp
2825 2830 2835
Gly His Cys Ala Phe Ala Gly Thr Phe Ala Val Leu Gly Gly Glu
2840 2845 2850
Leu Glu Met Pro Trp Ser Phe Glu Arg Leu Phe Arg Tyr Asp Ile
2855 2860 2865
Thr Lys Val Leu Lys Gln Met Asn Leu His Tyr Asp Ser Glu Phe
2870 2875 2880
His Phe Glu Leu Lys Ile Val Gly Thr Asp Gly Thr Glu Leu Pro
2885 2890 2895
Ser Asp Arg Ile Lys Ser Pro Thr Ile Glu His His Gly Gly Asp
2900 2905 2910
His His Gly Gly Asp Thr Ser Gly His Asp His Ser Glu Arg His
2915 2920 2925
Asp Gly Phe Phe Arg Lys Glu Val Gly Ser Leu Ser Leu Asp Glu
2930 2935 2940
Ala Asn Asp Leu Lys Asn Ala Leu Tyr Lys Leu Gln Asn Asp Gln
2945 2950 2955
Gly Pro Asn Gly Tyr Glu Ser Ile Ala Gly Tyr His Gly Tyr Pro
2960 2965 2970
Phe Leu Cys Pro Glu His Gly Glu Asp Gln Tyr Ala Cys Cys Val
2975 2980 2985
His Gly Met Pro Val Phe Pro His Trp His Arg Leu His Thr Ile
2990 2995 3000
Gln Phe Glu Arg Ala Leu Lys Glu His Gly Ser His Leu Gly Ile
3005 3010 3015
Pro Tyr Trp Asp Trp Thr Lys Ser Met Ile Ala Leu Pro Ala Phe
3020 3025 3030
Phe Ala Asp Ser Ser Asn Ser Asn Pro Phe Tyr Lys Tyr His Ile
3035 3040 3045
Met Lys Ala Gly His Asp Thr Ala Arg Ser Pro Ser Asp Leu Leu
3050 3055 3060
Phe Asn Gln Pro Gln Leu His Gly Tyr Asp Tyr Leu Tyr Tyr Leu
3065 3070 3075
Ala Leu Ser Thr Leu Glu Glu Asp Asn Tyr Cys Asp Phe Glu Val
3080 3085 3090
His Tyr Glu Ile Leu His Asn Ala Val His Leu Trp Leu Gly Gly
3095 3100 3105
Thr Glu Thr Tyr Ser Met Ser Ser Leu Ala Phe Ser Ala Tyr Asp
3110 3115 3120
Pro Val Phe Met Ile Leu His Ser Gly Leu Asp Arg Leu Trp Ile
3125 3130 3135
Ile Trp Gln Glu Leu Gln Lys Leu Arg Lys Lys Pro Tyr Asn Ala
3140 3145 3150
Ala Lys Cys Ala Gly His Met Met Asp Glu Pro Leu His Pro Phe
3155 3160 3165
Asn Tyr Glu Ser Ala Asn His Asp Ser Phe Thr Arg Ala Asn Ala
3170 3175 3180
Lys Pro Ser Thr Val Phe Asp Ser His Lys Phe Asn Tyr His Tyr
3185 3190 3195
Asp Asn Pro Asp Val Arg Gly Asn Ser Ile Gln Glu Ile Ser Ala
3200 3205 3210
Ile Ile His Asp Leu Arg Asn Gln Pro Arg Val Phe Ala Gly Phe
3215 3220 3225
Val Leu Ser Gly Ile Tyr Thr Ser Ala Asn Val Lys Ile Tyr Leu
3230 3235 3240
Val Arg Glu Gly His Asp Asp Glu Asn Val Gly Ser Phe Val Val
3245 3250 3255
Leu Gly Gly Pro Lys Glu Met Pro Trp Ala Tyr Glu Arg Ile Phe
3260 3265 3270
Lys Tyr Asp Ile Thr Glu Val Ala Asn Arg Leu Asn Met His His
3275 3280 3285
Asp Asp Thr Phe Asn Phe Arg Leu Glu Val Gln Ser Tyr Thr Gly
3290 3295 3300
Glu Met Val Thr His His Leu Pro Glu Pro Leu Ile Ile Tyr Arg
3305 3310 3315
Pro Ala Lys Gln Glu Tyr Asp Val Leu Val Ile Pro Leu Gly Ser
3320 3325 3330
Gly His Lys Leu Pro Pro Lys Val Ile Val Lys Arg Gly Thr Arg
3335 3340 3345
Ile Met Phe His Pro Val Asp Asp Thr Val Asn Arg Pro Val Val
3350 3355 3360
Asp Leu Gly Ser His Thr Ala Leu Tyr Asn Cys Val Val Pro Pro
3365 3370 3375
Phe Thr Tyr Asn Gly Tyr Glu Leu Asp His Ala Tyr Ser Leu Arg
3380 3385 3390
Asp Gly His Tyr Tyr Ile Ala Gly Pro Thr Lys Asp Leu Cys Thr
3395 3400 3405
Ser Gly Asn Val Arg Ile His Ile His Ile Glu Asp Glu
3410 3415 3420

Claims (55)

1.组合物，其包含与1至20(n＝1至20)个匙孔虫戚血蓝蛋白(KLH)部分共价连接的多个Globo H部分，其中所述Globo H部分在一个或多个氨基酸残基上与所述KLH部分共价结合。
2.权利要求1的组合物，其中所述氨基酸残基是碱性氨基酸残基、中性氨基酸残基、疏水性氨基酸残基和/或其组合。
3.权利要求1的组合物，其中所述氨基酸残基是赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺和/或其组合。
4.权利要求1的组合物，其中所述KLH部分是单体(n＝1)。
5.权利要求1的组合物，其中所述KLH部分是二聚体(n＝2)。
6.权利要求1的组合物，其中所述KLH部分是三聚体(n＝3)。
7.权利要求1的组合物，其中所述KLH部分是四聚体(n＝4)。
8.权利要求1的组合物，其中所述KLH部分是五聚体(n＝5)。
9.权利要求1的组合物，其中所述KLH部分是六聚体(n＝6)。
10.权利要求1的组合物，其中所述KLH部分是七聚体(n＝7)。
11.权利要求1的组合物，其中所述KLH部分是八聚体(n＝8)。
12.权利要求1的组合物，其中所述KLH部分是九聚体(n＝9)。
13.权利要求1的组合物，其中所述KLH部分是十聚体(n＝10)。
14.权利要求1的组合物，其中所述KLH部分是十一聚体(n＝11)。
15.权利要求1的组合物，其中所述KLH部分是十二聚体(n＝12)。
16.权利要求1的组合物，其中所述KLH部分是十三聚体(n＝13)。
17.权利要求1的组合物，其中所述KLH部分是十四聚体(n＝14)。
18.权利要求1的组合物，其中所述KLH部分是十五聚体(n＝15)。
19.权利要求1的组合物，其中所述KLH部分是十六聚体(n＝16)。
20.权利要求1的组合物，其中所述KLH部分是十七聚体(n＝17)。
21.权利要求1的组合物，其中所述KLH部分是十八聚体(n＝18)。
22.权利要求1的组合物，其中所述KLH部分是十九聚体(n＝19)。
23.权利要求1的组合物，其中所述KLH部分是二十聚体(n＝20)。
24.权利要求1的组合物，其中所述KLH部分是相同的。
25.权利要求1的组合物，其中所述KLH部分是不同的。
26.权利要求1的组合物，其中每个KLH部分具有相同数目的Globo H部分。
27.权利要求1的组合物，其中每个KLH部分具有不同数目的Globo H部分。
28.权利要求1的组合物，其中所述Globo H部分包含(Fucα1→2Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glc)。
29.权利要求1的组合物，其中所述KLH部分亚基是SEQ ID NO.1的KLH部分亚基。
30.权利要求1的组合物，其中所述KLH部分亚基与SEQ ID NO.1的相应KLH部分是至少95％相同的。
31.权利要求1的组合物，其中所述KLH部分亚基与SEQ ID NO.1的相应KLH部分是至少90％相同的。
32.权利要求1的组合物，其中所述KLH部分亚基与SEQ ID NO.1的相应KLH部分是至少80％相同的。
33.权利要求1的组合物，其中所述KLH部分亚基是SEQ ID NO.2的KLH部分亚基。
34.权利要求1的组合物，其中所述KLH部分亚基与SEQ ID NO.2的相应KLH部分是至少95％相同的。
35.权利要求1的组合物，其中所述KLH部分亚基与SEQ ID NO.2的相应KLH部分是至少90％相同的。
36.权利要求1的组合物，其中所述KLH部分亚基与SEQ ID NO.2的相应KLH部分是至少80％相同的。
37.权利要求1的组合物，其中与匙孔虫戚血蓝蛋白(KLH)部分亚基共价结合的所述Globo H部分通过4-(4-N-马来酰亚胺甲基)环己胺-1-羟基酰肼(MMCCH)连接来连接。
38.权利要求1的分离的治疗性缀合物，其具有至少150:1的表位比率。
39.权利要求1的组合物，其具有至少125:1的表位比率。
40.权利要求1的分离的治疗性缀合物，其具有至少或约100:1的表位比率。
41.权利要求1的组合物，其具有至少75:1的表位比率。
42.权利要求1的组合物，其具有至少50:1的表位比率。
43.权利要求1的组合物，其具有至少25:1的表位比率。
44.权利要求1的组合物，其具有至少10:1的表位比率。
45.权利要求1的组合物，其具有至少1:1的表位比率。
46.治疗有此需要的患者中的癌症的方法，其包括对所述患者施用治疗有效量的权利要求1的组合物。
47.权利要求46的方法，其中所述癌症是乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、上皮癌或子宫内膜癌。
48.权利要求46的方法，其中所述癌症是表达Globo H的癌症。
49.在受试者中诱导抗体的方法，用于产生用于治疗或诊断用途的单克隆抗体的目的，所述方法包括对所述受试者施用有效量的权利要求1的组合物。
50.权利要求49的方法，其中所述受试者是动物或人。
51.药物组合物，其包含
(a)与一个或多个KLH部分亚基共价连接的多个Globo H部分；和
(b)α-半乳糖基-神经酰胺(α-GalCer)佐剂。
52.权利要求51的组合物，其中所述α-GalCer佐剂具有以下结构：
53.权利要求51的组合物，其中所述KLH部分可以形成单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体、十聚体、十一聚体、十二聚体、十三聚体、十四聚体、十五聚体、十六聚体、十七聚体、十八聚体、十九聚体或二十聚体。
54.在受试者中诱导抗体的方法，用于产生用于治疗或诊断用途的单克隆抗体的目的，所述方法包括对所述受试者施用有效量的权利要求51的组合物。
55.权利要求54的方法，其中所述受试者是动物或人。
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10935544B2 (en) 2015-09-04 2021-03-02 Obi Pharma, Inc. Glycan arrays and method of use
US10980894B2 (en) 2016-03-29 2021-04-20 Obi Pharma, Inc. Antibodies, pharmaceutical compositions and methods
BR112018070097A2 (pt) 2016-03-29 2019-02-12 Obi Pharma, Inc. anticorpo, hibridoma, composição farmacêutica, método para tratar câncer em um indivíduo, método para inibir a proliferação de células cancerígenas, método para diagnosticar o câncer em um indivíduo, método para tratar um paciente humano, método para fazer imagens de um indivíduo, conjugado de fármaco-anticorpo (adc), método para tratar câncer, anticorpo biespecífico e método para preparar uma população de anticorpos homogêneos
EP3445395A4 (en) * 2016-04-22 2019-12-25 OBI Pharma, Inc. ANTI-CANCER IMMUNOTHERAPY BY IMMUNO-ACTIVATION OR IMMUNOMODULATION THROUGH GLOBO SERIES ANTIGENS
TWI752988B (zh) * 2016-07-27 2022-01-21 台灣浩鼎生技股份有限公司 免疫性/治療性聚醣組合物及其用途
TWI786054B (zh) 2016-07-29 2022-12-11 台灣浩鼎生技股份有限公司 人類抗體、醫藥組合物、及其方法
AU2017361549B2 (en) 2016-11-21 2023-12-21 Obi Pharma, Inc. Conjugated biological molecules, pharmaceutical compositions and methods
WO2019217951A1 (en) * 2018-05-11 2019-11-14 Obi Pharma Inc. Method for predicting human immune response
TW202035444A (zh) 2018-06-27 2020-10-01 台灣浩鼎生技股份有限公司 用於糖蛋白工程的糖苷合成酶變體及其使用方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040208884A1 (en) * 1999-08-20 2004-10-21 Danishefsky Samuel J. Clustered multi-antigenic carbohydrate constructs, methods for their preparation, and uses thereof
EP1527081A1 (en) * 2002-07-31 2005-05-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Glyconjugates comprising carbohydrate epitopes, methods for theirsynthesis, and their use for the treatment or prophylaxis of cancer
US20100136042A1 (en) * 2008-06-16 2010-06-03 Chi-Huey Wong Globo h and related anti-cancer vaccines with novel glycolipid adjuvants
CN102215862A (zh) * 2009-06-16 2011-10-12 中央研究院 Globo h及含新颖糖脂质佐剂的相关抗癌疫苗
US20120237532A1 (en) * 2011-03-15 2012-09-20 Icon Genetics Gmbh Pharmaceutical formulation containing immunoglobulin
WO2014107652A2 (en) * 2013-01-04 2014-07-10 Obi Pharma Vaccines with higher carbohydrate antigen density and novel saponin adjuvant
TW201521766A (zh) * 2013-09-17 2015-06-16 Obi Pharma Inc 碳水化合物疫苗之化合物及組成物以及其用途

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2454853A1 (en) * 2001-08-14 2003-02-27 Biomira, Inc. Imunogenic conjugate of carbohydrate haptens and aggregated protein carrier

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040208884A1 (en) * 1999-08-20 2004-10-21 Danishefsky Samuel J. Clustered multi-antigenic carbohydrate constructs, methods for their preparation, and uses thereof
EP1527081A1 (en) * 2002-07-31 2005-05-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Glyconjugates comprising carbohydrate epitopes, methods for theirsynthesis, and their use for the treatment or prophylaxis of cancer
US20100136042A1 (en) * 2008-06-16 2010-06-03 Chi-Huey Wong Globo h and related anti-cancer vaccines with novel glycolipid adjuvants
CN102065868A (zh) * 2008-06-16 2011-05-18 中央研究院 诱发对于Globo H及SSEA3的特异免疫反应的组合物以及其在癌症治疗中的用途
CN102215862A (zh) * 2009-06-16 2011-10-12 中央研究院 Globo h及含新颖糖脂质佐剂的相关抗癌疫苗
US20120237532A1 (en) * 2011-03-15 2012-09-20 Icon Genetics Gmbh Pharmaceutical formulation containing immunoglobulin
WO2014107652A2 (en) * 2013-01-04 2014-07-10 Obi Pharma Vaccines with higher carbohydrate antigen density and novel saponin adjuvant
TW201429488A (zh) * 2013-01-04 2014-08-01 Obi Pharma Inc 具有較高碳水化合物抗原密度之疫苗及新穎皂素佐劑
TW201521766A (zh) * 2013-09-17 2015-06-16 Obi Pharma Inc 碳水化合物疫苗之化合物及組成物以及其用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIEB,B.等: "《GenBank》", 26 November 2013 *
TERESA GILEWSKI等: "Immunization of metastatic breast cancer patients with a fully synthetic globo H conjugate：A phase I trial", 《PNAS》 *

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