KR20230109783A - 면역원성/치료적 당접합체 조성물 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 개시내용은 글로보 H-KLH 당접합체 (OBI-822) 및/또는 치료 아주반트 (OBI-821/OBI-834)를 포함하는 면역원성/치료 조성물 뿐만 아니라, 암과 같은 증식성 질환을 치료하기 위한 그의 제조 방법 및 사용 방법을 포함한다. 치료 접합체는 담체와 결합된 항원을 포함한다. 특히, 치료 접합체는, 임의로 링커를 통해 결합된 글로보 H 모이어티 및 KLH 모이어티 및/또는 유도체화된 KLH 모이어티 서브유닛을 포함한다. 치료 조성물은 부분적으로, 손상된 또는 비정상적인 세포, 예컨대 암 세포에 의해 부과된 위험으로부터, 면역계를 통해 자신을 보호하는 신체의 고유 능력을 증대시키기 위한 암 백신으로서 작용할 것이라 예상된다. 예시 면역 반응은 질환의 예방, 질환 발병의 지연, 증상의 중증도 감소, 이환율 감소 및 사망 지연을 비제한적으로 포함하는, 질환의 중증도 감소에 의해 특징화될 수 있다.
[대표도]
도 6a

Description

면역원성/치료적 당접합체 조성물 및 그의 용도 {IMMUNOGENIC/THERAPEUTIC GLYCOCONJUGATE COMPOSITIONS AND USES THEREOF}

본 개시내용은 암 면역요법을 위한 조성물 및 방법, 및 특히 항암 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원성/치료적 당접합체에 관한 것이다.

탄수화물 항원 글로보 H(Globo H) (Fucα1 → 2Galβ1 → 3GalNAcβ1 → 3Galα1 → 4Galβ1 → 4Glc)는 1984년에 하코모리(Hakomori) 등에 의해 유방암 MCF-7 세포로부터 세라미드-결합 당지질로서 최초로 단리되고 동정되었다 (Bremer E G, et al. (1984) J Biol Chem 259:14773-14777). 항-글로보 H 모노클로날 항체에 대한 추가 연구로, 글로보 H가 전립선암, 위암, 췌장암, 폐암, 난소암 및 결장암을 비롯한 수많은 다른 암에도 존재하며, 또한 면역계에 용이하게 접근할 수 없는 정상 분비 조직의 관강 표면 상에서 단지 최소한으로 발현됨이 확인되었다 (Ragupathi G, et al. (1997) Angew Chem Int Ed 36:125-128). 또한, 유방암 환자의 혈청이 높은 수준의 항-글로보 H 항체를 함유한다는 것이 밝혀졌다 (Gilewski T et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:3270-3275; Huang C-Y, et al. (2006) Proc Natl Acad Sci USA 103:15-20; Wang C-C, et al. (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105(33):11661-11666). 글로보 H-양성 종양을 갖는 환자는 글로보 H-음성 종양을 갖는 환자에 비해 짧은 생존을 보였다 (Chang, Y-J, et al. (2007) Proc Natl Acad Sci USA 104(25):10299-10304). 이러한 발견들은 육당류 에피토프인 글로보 H를 매력적인 종양 표지자로 만들었고, 또한 암 백신 개발을 위한 실현가능한 표적이 되도록 하였다.

글로보 H에 대한 항체 반응을 유도하기 위한 백신이 개발되었지만, 그의 항암 효능은 글로보 H의 낮은 항원성 때문에 만족스럽지 않다. 글로보 H를 표적으로 하여 높은 수준의 면역 반응을 유도할 수 있는 신규한 백신이 요구된다.

KLH는 당화된 폴리펩티드 서브유닛을 함유하고, 이들은 어셈블리되어 십량체 (10량체), 이십량체 (20량체), 및 이들보다 큰 입자를 형성할 수 있다. 이러한 다량체 구조는 해리된 서브유닛에 대해서는 11-19S의 침강 계수를 제공하고, 이십량체 다량체에 대해서는 92-107S의 침강 계수를 제공하는 초원심분리 기술에 의해 특징화되었다. 다양한 인자가 KLH를 비롯한 연체동물 헤모시아닌의 크기 분포에 영향을 줄 수 있다. 그러한 인자에는 이온 강도, pH, 온도, pO₂, 및 특정 2가 양이온, 특히 칼슘 및 마그네슘의 이용가능성이 포함된다.

본 발명자들은 복수 개의 글로보 H 모이어티와 결합된 KLH의 이량체, 삼량체 뿐만 아니라, 그의 다른 다량체로 주로 구성되는, 놀랍게 증가한 효능을 갖는 조성물을 개발하였다.

따라서, 본 개시내용은 일반적으로 글로보 H를 포함하는 치료적 및/또는 예방적 조성물 뿐만 아니라, 면역요법제, 백신, 투여 형태, 키트, 및 그의 제조 방법 및 치료 방법을 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 키홀 림펫 헤모시아닌 (keyhole limpet hemocyanin; KLH) 모이어티 서브유닛과 결합된 글로보 H 모이어티를 포함하는, 단리된 치료 접합체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 결합은 공유 결합이다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) 모이어티 서브유닛과 공유 결합된 글로보 H 모이어티를 포함하고, 여기서 KLH는 유도체화된 KLH인, 단리된 치료 접합체를 포함한다. 글로보-H와 KLH를 언급할 때 본원에 사용된 용어 "공유 결합"은 글로보-H가 KLH와 직접 공유 결합하거나, 또는 글로보-H가 유도체화된 KLH (본원에 서술된 것)와 공유 결합하거나, 또는 글로보-H가 링커(linker) 기 (본원에 서술된 것)를 통해 KLH와 공유 결합하거나, 또는 글로보-H가 링커 기 및 유도체화된 KLH 둘다를 통해 KLH와 공유 결합하는 것을 의미한다.

특정 예시 실시양태에서, 본 발명의 유도체화된 KLH는 하기 구조를 갖는다:

한 실시양태에서, 본 발명은 링커 분자를 통해 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) 모이어티 서브유닛과 공유 결합된 글로보 H 모이어티를 포함하는, 단리된 치료 접합체를 포함한다.

한 실시양태에서, 글로보 H 모이어티는 KLH 모이어티 서브유닛의 리신 잔기와 결합한다.

한 실시양태에서, KLH 모이어티 서브유닛 당 정확히 또는 대략 총 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160개의 리신 잔기가 글로보 H 모이어티와 직접적으로 또는 간접적으로 결합하기 위해 이용가능하거나 또는 실제로 결합한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 4-(4-N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실 히드라지드 (MMCCH) 링커 기를 통해 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) 모이어티 서브유닛과 공유 결합된 글로보 H 모이어티를 포함하는, 단리된 치료 접합체를 포함한다. 본 발명의 MMCCH 링커는 하기 구조를 갖는다:

또 다른 예시 실시양태에서, 본 발명은 하기 일반 구조를 갖는 단리된 치료 접합체를 포함한다:

상기 식에서, n은 약 1 내지 약 160의 정수이다. 특정 실시양태에서, 단량체 KLH 모이어티는 약 1 내지 약 160개의 글로보 H 모이어티를 포함할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자라면 상기 구조가 이미늄 히드로클로라이드 염으로서 예시되었으나, 또한 이민 형태로도 존재하거나 또는 공존할 수 있음을 알 것이다. 따라서, 본 발명은 이민 뿐만 아니라, 예를 들어 이미늄 히드로클로라이드 염을 비롯한 그의 염을 모두 포함한다. 특정 실시양태에서, 단량체 KLH 모이어티는 약 1 내지 약 125개의 글로보 H 모이어티를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 단량체 KLH 모이어티는 약 1 내지 약 100개의 글로보 H 모이어티를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 단량체 KLH 모이어티는 1 내지 약 75개의 글로보 H 모이어티를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 단량체 KLH 모이어티는 약 1 내지 약 50개의 글로보 H 모이어티를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 단량체 KLH 모이어티는 약 1 내지 약 25개의 글로보 H 모이어티를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 단량체 KLH 모이어티는 약 1 내지 약 10개의 글로보 H 모이어티를 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서, 글로보 H 모이어티는 KLH 모이어티와 특정 아미노산 잔기에서 공유적으로 접합된다. 특정 실시양태에서, 아미노산 잔기는 아르기닌, 리신, 히스티딘, 아스파라긴, 프롤린, 글루타민 또는 이들의 조합을 포함할 수 있거나 또는 제외할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 글로보 H 모이어티는 단량체 KLH 모이어티 서브유닛 상의 리신 접합 자리와 결합한다.

또 다른 실시양태에서, 각각의 단량체 KLH 모이어티 서브유닛 상의 정확히 또는 대략 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 또는 110개의 리신 접합 자리가 글로보 H 모이어티와 결합하기 위해 이용가능하거나 또는 실제로 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 KLH 모이어티 서브유닛 상에 이러한 리신 접합 자리가 62, 66, 67, 68, 70, 72, 76, 86, 87, 88, 90, 92, 93, 100개 존재한다.

모이어티 서브유닛 (예를 들어, KLH1 및 KLH2 또는 이들의 변이체)의 혼합물을 함유하는 특정한 치료 조성물 실시양태에서, 이용가능한 총 리신 (상기 두 서브유닛 모두에 대해서)은 상이한 서브유닛 유형 전체에 대해서 함께 카운팅한 것이고, 그 개수가 정확히 또는 대략 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309 또는 310개일 수 있거나 또는 이러한 개수이다. 이러한 실시양태에서, 상이한 서브유닛 (예를 들어, KLH1 및 KLH2 또는 이들의 변이체) 전체에 대해서 함께 정확히 또는 대략 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159 또는 160개의 리신 접합 자리가 존재한다. 다른 이러한 실시양태에서, 136, 137, 141, 140, 143, 147 또는 155개의 리신 접합 자리가 존재한다.

또 다른 예시 실시양태에서, 본 발명은 하기 일반 구조를 갖는 단리된 면역원성/치료 접합체를 포함한다:

상기 식에서, n은 독립적으로 약 1 내지 약 3000의 정수이고, m은 독립적으로 약 1 내지 약 20의 정수이다. 특정 실시양태에서, m이 1보다 크면, KLH 모이어티는 응집되어 다량체 구조를 형성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 응집은 공유 결합이다. 특정한 다른 실시양태에서, 응집은 공유 결합이 아니다 (예를 들어, 응집이 H-결합 또는 소수성 상호작용에 의해 형성됨). 특정 실시양태에서, 단량체 KLH 모이어티 (즉, m=1)는 약 1 내지 약 160개의 글로보 H 모이어티를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이량체 KLH 모이어티 (즉, m=2)는 약 1 내지 약 300개의 글로보 H 모이어티를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 삼량체 KLH 모이어티 (즉, m=3)는 약 1 내지 약 450개의 글로보 H 모이어티를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 사량체 KLH 모이어티 (즉, m=4)는 약 1 내지 약 600개의 글로보 H 모이어티를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 오량체 KLH 모이어티 (즉, m=5)는 약 1 내지 약 750개의 글로보 H 모이어티를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 육량체 KLH 모이어티 (즉, m=6)는 약 1 내지 약 900개의 글로보 H 모이어티를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이십량체 KLH 모이어티 (즉, m=20)는 약 1 내지 약 3000개의 글로보 H 모이어티를 포함할 수 있다.

또 다른 예시 실시양태에서, 본 발명은 하기 일반 구조를 갖는 단리된 면역원성/치료 접합체를 포함한다:

상기 식에서, n은 독립적으로 약 1 내지 약 150의 정수이고, m은 독립적으로 약 1 내지 약 20의 정수이다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 하기 일반 구조를 갖는 단리된 치료 접합체를 포함한다:

상기 식에서, n은 독립적으로 약 1 내지 약 160의 정수이고, m은 독립적으로 약 1 내지 약 20의 정수이다. 특정 실시양태에서, m은 약 1 내지 약 5의 정수이다. 특정 실시양태에서, m은 약 1 내지 약 3의 정수이다. 특정 실시양태에서, m은 1이다. 특정 실시양태에서, m은 2이다. 특정 실시양태에서, m은 3이다. 특정 실시양태에서, m은 4이다. 특정 실시양태에서, m은 5이다. 특정 실시양태에서, m은 6이다. 특정 실시양태에서, m은 7이다. 특정 실시양태에서, m은 8이다. 특정 실시양태에서, m은 9이다. 특정 실시양태에서, m은 10이다. 특정 실시양태에서, m은 11이다. 특정 실시양태에서, m은 12이다. 특정 실시양태에서, m은 13이다. 특정 실시양태에서, m은 14이다. 특정 실시양태에서, m은 15이다. 특정 실시양태에서, m은 16이다. 특정 실시양태에서, m은 17이다. 특정 실시양태에서, m은 18이다. 특정 실시양태에서, m은 19이다. 특정 실시양태에서, m은 20이다. 특정 실시양태에서, 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, m이 1 내지 20이면, n은 각각 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 또는 160이다.

특정 실시양태에서, 각각의 단량체 KLH 모이어티에 부착된 1개 초과의 글로보 H 모이어티가 존재한다. 특정한 예시 실시양태에서, 각각의 KLH 모이어티에 부착된 1개 초과의 글로보 H 모이어티는 링커를 통해 부착된다. 다른 예시 실시양태에서, 각각의 KLH 모이어티에 부착된 1개 초과의 글로보 H 모이어티는 링커를 통해 부착되고, 또한 유도체화된 KLH 모이어티에 부착된다.

또 다른 실시양태에서, 글로보 H 모이어티 대 KLH 모이어티 서브유닛의 비율은 적어도 1이다. 또 다른 실시양태에서, 글로보 H 모이어티 대 KLH 모이어티 서브유닛의 비율은 적어도 10이다. 또 다른 실시양태에서, 글로보 H 모이어티 대 KLH 모이어티의 비율은 적어도 25이다. 또 다른 실시양태에서, 글로보 H 모이어티 대 KLH 모이어티 서브유닛의 비율은 적어도 50이다. 추가 실시양태에서, 글로보 H 모이어티 대 KLH 모이어티 서브유닛의 비율은 적어도 100이다. 추가 실시양태에서, 글로보 H 모이어티 대 KLH 모이어티 서브유닛의 비율은 적어도 150이다. 또 다른 실시양태에서, 글로보 H 모이어티 대 KLH 모이어티 서브유닛의 비율은 적어도 500이다. 또 다른 추가 실시양태에서, 글로보 H 모이어티 대 KLH 모이어티 서브유닛의 비율은 적어도 750이다. 또 다른 실시양태에서, 글로보 H 모이어티 대 KLH 모이어티 서브유닛의 비율은 적어도 1000이다. 또 다른 실시양태에서, 글로보 H 모이어티 대 KLH 모이어티 서브유닛의 비율은 적어도 1500이다. 또 다른 실시양태에서, 글로보 H 모이어티 대 KLH 모이어티 서브유닛의 비율은 적어도 2000이다.

다양한 실시양태에서, 본 발명은 단일의 KLH 단량체 내지 다수의 KLH 서브유닛 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20)을 포함하며, 이들은 각각 부착된 다수의 글로보 H 모이어티를 갖는다. 특정 실시양태에서, 글로보 H 모이어티 대 KLH 모이어티의 비율은 동일하다. 다른 실시양태에서, 글로보 H 모이어티 대 KLH 모이어티의 비율은 상이하다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 적어도 2개의 KLH 모이어티, 예를 들어 이량체 형태의 유도체화된 KLH 모이어티를 포함하는 조성물을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 적어도 2개의 KLH 모이어티는 동일하다. 또 다른 실시양태에서, 적어도 2개의 KLH 모이어티는 상이하다. 추가 실시양태에서, 적어도 2개의 KLH 모이어티는 동일한 글로보 H 모이어티 대 KLH 모이어티 서브유닛의 비율을 갖는다. 또 다른 추가 실시양태에서, 적어도 2개의 KLH 모이어티는 상이한 글로보 H 모이어티 대 KLH 모이어티 서브유닛의 비율을 갖는다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 적어도 3개의 KLH 모이어티, 예를 들어 삼량체 형태의 유도체화된 KLH 모이어티를 포함하는 치료 조성물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 3개의 KLH 모이어티는 동일하다. 또 다른 실시양태에서, 적어도 3개의 KLH 모이어티는 동일하지 않다. 추가 실시양태에서, 적어도 3개의 KLH 모이어티는 동일한 글로보 H 모이어티 대 KLH 모이어티 서브유닛의 비율을 갖는다. 또 다른 추가 실시양태에서, 적어도 3개의 KLH 모이어티는 상이한 글로보 H 모이어티 대 KLH 모이어티 서브유닛의 비율을 갖는다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 적어도 4개의 KLH 모이어티, 예를 들어 사량체 형태의 유도체화된 KLH 모이어티를 포함하는 치료 조성물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 4개의 KLH 모이어티는 동일하다. 또 다른 실시양태에서, 적어도 4개의 KLH 모이어티는 동일하지 않다. 추가 실시양태에서, 적어도 4개의 KLH 모이어티는 동일한 글로보 H 모이어티 대 KLH 모이어티 서브유닛의 비율을 갖는다. 또 다른 추가 실시양태에서, 적어도 4개의 KLH 모이어티는 상이한 글로보 H 모이어티 대 KLH 모이어티 서브유닛의 비율을 갖는다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 적어도 5개의 KLH 모이어티, 예를 들어 오량체 형태의 유도체화된 KLH 모이어티를 포함하는 치료 조성물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 5개의 KLH 모이어티는 동일하다. 또 다른 실시양태에서, 적어도 5개의 KLH 모이어티는 동일하지 않다. 추가 실시양태에서, 적어도 5개의 KLH 모이어티는 동일한 글로보 H 모이어티 대 KLH 모이어티 서브유닛의 비율을 갖는다. 또 다른 추가 실시양태에서, 적어도 5개의 KLH 모이어티는 상이한 글로보 H 모이어티 대 KLH 모이어티 서브유닛의 비율을 갖는다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 적어도 6개의 KLH 모이어티, 예를 들어 육량체 형태의 유도체화된 KLH 모이어티를 포함하는 치료 조성물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 6개의 KLH 모이어티는 동일하다. 또 다른 실시양태에서, 적어도 6개의 KLH 모이어티는 동일하지 않다. 추가 실시양태에서, 적어도 6개의 KLH 모이어티는 동일한 글로보 H 모이어티 대 KLH 모이어티 서브유닛의 비율을 갖는다. 또 다른 추가 실시양태에서, 적어도 6개의 KLH 모이어티는 상이한 글로보 H 모이어티 대 KLH 모이어티 서브유닛의 비율을 갖는다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 적어도 20개의 KLH 모이어티, 예를 들어 이십량체 형태의 유도체화된 KLH 모이어티를 포함하는 치료 조성물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 20개의 KLH 모이어티는 동일하다. 또 다른 실시양태에서, 적어도 20개의 KLH 모이어티는 동일하지 않다. 추가 실시양태에서, 적어도 20개의 KLH 모이어티는 동일한 글로보 H 모이어티 대 KLH 모이어티 서브유닛의 비율을 갖는다. 또 다른 추가 실시양태에서, 적어도 20개의 KLH 모이어티는 상이한 글로보 H 모이어티 대 KLH 모이어티 서브유닛의 비율을 갖는다.

한 실시양태에서, 글로보 H 모이어티는 (Fucα1 → 2Galβ1 → 3GalNAcβ1 → 3Galα1 → 4Galβ1 → 4Glc)를 포함한다. 추가 실시양태에서, KLH 모이어티 서브유닛은 KLH-1 또는 KLH-2 모이어티 또는 이들의 조합이다. 본원에 사용된 용어 "KLH"는 KLH-1, KLH-2, 및/또는 이들의 조합을 말한다.

또 다른 실시양태에서, KLH 모이어티 서브유닛은 상응하는 천연 KLH 모이어티 서브유닛과 적어도 99% 동일하다.

또 다른 실시양태에서, KLH 모이어티 서브유닛은 상응하는 천연 KLH 모이어티 서브유닛과 적어도 95% 동일하다.

또 다른 실시양태에서, KLH 모이어티 서브유닛은 상응하는 천연 KLH 모이어티 서브유닛과 적어도 90% 동일하다.

또 다른 실시양태에서, KLH 모이어티 서브유닛은 상응하는 천연 KLH 모이어티 서브유닛과 적어도 80% 동일하다.

또 다른 실시양태에서, KLH 모이어티 서브유닛은 상응하는 천연 KLH 모이어티 서브유닛과 적어도 70% 동일하다.

또 다른 실시양태에서, KLH 모이어티 서브유닛은 상응하는 천연 KLH 모이어티 서브유닛과 적어도 60% 동일하다.

또 다른 실시양태에서, 글로보 H 모이어티는 링커를 통해 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) 모이어티 서브유닛과 공유 결합한다. 또 다른 추가 실시양태에서, 글로보 H 모이어티는 4-(4-N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실 히드라지드 (MMCCH) 결합에 의해 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) 모이어티 서브유닛과 공유 결합한다. 또 다른 추가 실시양태에서, 글로보 H 모이어티는 유도체화된 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) 모이어티 서브유닛과 공유 결합하고, 또한 4-(4-N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실 히드라지드 (MMCCH) 결합에 의해 결합한다.

또 다른 실시양태에서, 단리된 치료 접합체는 약 350 KDa 내지 약 400 KDa의 분자량을 갖는 KLH 단량체를 기준으로, 적어도 또는 약 150의 에피토프비를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 치료 접합체는 적어도 또는 약 100의 에피토프비를 갖는다. 추가 실시양태에서, 단리된 치료 접합체는 적어도 또는 약 75의 에피토프비를 갖는다. 또 다른 추가 실시양태에서, 단리된 치료 접합체는 적어도 또는 약 50의 에피토프비를 갖는다. 또 다른 추가 실시양태에서, 단리된 치료 접합체는 적어도 또는 약 25의 에피토프비를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 치료 접합체는 적어도 또는 약 15의 에피토프비를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 치료 접합체는 적어도 또는 약 5의 에피토프비를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 치료 접합체는 적어도 또는 약 1의 에피토프비를 갖는다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 KLH 모이어티 서브유닛을 포함하고, 여기서 각각의 KLH 모이어티 서브유닛은 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) 모이어티 서브유닛과 공유 결합된 1개 이상의 글로보 H 모이어티를 포함하는 것인 제약 조성물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 적어도 2개의 KLH 모이어티 서브유닛의 이량체를 포함하고, 여기서 각각의 KLH 모이어티 서브유닛은 KLH 모이어티 서브유닛과 공유 결합된 1개 이상의 글로보 H 모이어티를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 적어도 3개의 KLH 모이어티 서브유닛의 삼량체를 포함하고, 여기서 각각의 KLH 모이어티 서브유닛은 KLH 모이어티 서브유닛과 공유 결합된 1개 이상의 글로보 H 모이어티를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 적어도 4개의 KLH 모이어티 서브유닛을 포함하고, 여기서 각각의 KLH 모이어티 서브유닛은 KLH 모이어티 서브유닛과 공유 결합된 1개 이상의 글로보 H 모이어티를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 KLH 모이어티 서브유닛의 혼합물 (예를 들어, 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체 등)을 포함하고, 여기서 각각의 KLH 모이어티 서브유닛은 KLH 모이어티 서브유닛과 공유 결합된 다수의 글로보 H 모이어티를 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면은 KLH 모이어티의 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체 또는 이들의 조합을 포함하고, 여기서 각각의 KLH는 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) 모이어티 서브유닛과 공유 결합된 1개 이상의 글로보 H 모이어티를 포함하는 것인 제약 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 한 실시양태에서, 조성물 중 치료 접합체의 에피토프비는 약 1 내지 3000의 범위이다. 추가 실시양태에서, 조성물 중 치료 접합체의 에피토프비는 약 75 내지 2000의 범위이다. 또 다른 실시양태에서, 조성물 중 치료 접합체의 에피토프비는 약 100 내지 1000의 범위이다. 또 다른 추가 실시양태에서, 조성물 중 치료 접합체의 평균 에피토프비는 약 150 내지 500의 범위이다.

또 다른 실시양태에서, 조성물 중 치료 접합체의 약 1% 내지 99%는 KLH 단량체이다. 추가 실시양태에서, 조성물 중 치료 접합체의 약 0% 내지 99%는 KLH 이량체이다. 또 다른 실시양태에서, 조성물 중 치료 접합체의 약 0% 내지 99%는 KLH 삼량체이다. 또 다른 실시양태에서, 조성물 중 치료 접합체의 약 0% 내지 99%는 KLH 사량체이다. 추가 실시양태에서, 조성물 중 치료 접합체의 약 1% 내지 99%는 KLH 오량체이다. 또 다른 실시양태에서, 조성물 중 치료 접합체의 약 0% 내지 99%는 6개의 KLH 서브유닛을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물 중 치료 접합체의 약 0% 내지 99%는 7개의 KLH 서브유닛을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물 중 치료 접합체의 약 0% 내지 99%는 8개의 KLH 서브유닛을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물 중 치료 접합체의 약 0% 내지 99%는 9개의 KLH 서브유닛을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물 중 치료 접합체의 약 0% 내지 99%는 10개의 KLH 서브유닛을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물 중 치료 접합체의 약 0% 내지 99%는 11개의 KLH 서브유닛을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물 중 치료 접합체의 약 0% 내지 99%는 12개의 KLH 서브유닛을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물 중 치료 접합체의 약 0% 내지 99%는 13개의 KLH 서브유닛을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물 중 치료 접합체의 약 0% 내지 99%는 14개의 KLH 서브유닛을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물 중 치료 접합체의 약 0% 내지 99%는 15개의 KLH 서브유닛을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물 중 치료 접합체의 약 0% 내지 99%는 16개의 KLH 서브유닛을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물 중 치료 접합체의 약 0% 내지 99%는 17개의 KLH 서브유닛을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물 중 치료 접합체의 약 0% 내지 99%는 18개의 KLH 서브유닛을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물 중 치료 접합체의 약 0% 내지 99%는 19개의 KLH 서브유닛을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물 중 치료 접합체의 약 0% 내지 99%는 20개의 KLH 서브유닛을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물 중 치료 접합체의 약 1% 내지 99%는 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체 또는 이들의 조합이다. 또 다른 실시양태에서, 조성물 중 치료 접합체의 약 99%는 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체 또는 이들의 조합이다.

특정 실시양태에서, 특정한 예시 조성물 실시양태 및 그의 사용 방법은 본원에 기재된 다른 대표 화합물 및/또는 조성물 실시양태 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있거나 또는 제외할 수 있다 (예를 들어, 조건부).

또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 아주반트를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "면역적 아주반트"는 면역원에 대한 면역 반응을 증강 또는 변화시키는, 면역원과 함께 사용되는 물질을 말한다. 구체적으로, 용어 "아주반트"와 "면역아주반트"는 본 발명에서 상호교환하여 사용되며, 단독으로 숙주에게 투여되었을 때는 비-면역원성일 수 있지만, 항원과 공동으로 투여되면 또 다른 항원에 대한 숙주의 면역 반응을 증가시키는 화합물 또는 혼합물을 말한다. 면역 반응의 아주반트-매개 증강 및/또는 지속기간 연장은 하기 중 하나 이상을 비제한적으로 포함하는, 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 평가될 수 있다: (i) 단독의 항원에 의한 면역화에 대한 반응으로 생성된 항체 수와 비교하여 아주반트/항원 조합에 의한 면역화에 대한 반응으로 생성된 항체 수의 증가; (ii) 항원 또는 아주반트를 인식하는 T 세포 수의 증가; 및 (iii) 1종 이상의 I형 시토카인 수준의 증가.

아주반트는 항원을 포함하는 제약 또는 백신 조성물의 일부로서 또는 항원을 함유하는 제2 조성물과 공동으로 투여되는 별도의 제제로서 투여될 수 있다. 임의의 이들 조성물에서 스핑고당지질 (GSL)은 다른 아주반트 및/또는 부형제/담체와 조합될 수 있다. 그러한 다른 아주반트에는 오일-유화액 및 유화제-기재 아주반트, 예컨대 완전 프로인트(Freund) 아주반트, 불완전 프로인트 아주반트, MF59, 또는 SAF; 광물 겔, 예컨대 수산화알루미늄 (알럼), 인산알루미늄 또는 인산칼슘; 미생물-유래 아주반트, 예컨대 콜레라 독소 (CT), 백일해 독소, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 이열성 독소 (LT), 돌연변이 독소 (예를 들어, LTK63 또는 LTR72), 칼메트-게랑 균 (Bacille Calmette-Guerin; BCG), 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum), DNA CpG 모티프, 뮤라밀 디펩티드, 또는 모노포스포릴 지질 A; 미립자 아주반트, 예컨대 면역자극성 복합체 (ISCOM), 리포솜, 생분해성 미소구체, 또는 사포닌 (예를 들어, QS-21); 시토카인, 예컨대 IFN-γ, IL-2, IL-12 또는 GM-CSF; 합성 아주반트, 예컨대 비이온성 블록 공중합체, 뮤라밀 펩티드 유사체 (예를 들어, N-아세틸-뮤라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민 [thr-MDP], N-아세틸-노르-뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타민, N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-[1'-2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시]-에틸아민), 폴리포스파젠, 또는 합성 폴리뉴클레오티드, 및 표면 활성 물질, 예컨대 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 다중음이온, 펩티드, 탄화수소 유화액, 또는 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 톨(Toll)-유사 수용체 분자, LPS, 지단백질, 지질펩티드, 플라젤린, 이중 가닥 RNA, 바이러스 DNA, 비메틸화 CpG 섬, 레바미솔, 칼메트-게랑 균, 이소프리노신, 자닥신, PD-1 길항제, PD-1 항체, CTLA 길항제, CTLA 항체, 인터류킨, 시토카인, GM-CSF, 당지질, 알루미늄 염 기재물, 인산알루미늄, 알럼, 수산화알루미늄, 리포솜, TLR2 효능제, 지질펩티드, 나노입자, 모노포스포릴 지질 A, OBI-821 사포닌, 사포닌, OBI-834 아주반트, C34 아주반트, 수중유 나노-유화액, 및 박테리아-유사 입자가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 이러한 추가 아주반트는 또한 인간에게의 사용에 대하여 제약상 허용된다.

또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 IL-2, IL-12, IL-18, IL-2, IFN-γ, TNF, IL-4, IL-10, IL-13, IL-21, GM-CSF 및 TGF-β로 이루어진 군으로부터 선택된 시토카인을 포함한다. 추가 실시양태에서, 제약 조성물은 케모카인을 포함한다.

추가 실시양태에서, 면역원성/치료적 작용제는 제약 조성물로서 투여된다.

또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 모노클로날 항체, 화학요법제, 호르몬 요법제, 레티노이드 수용체 조정제, 세포독성/세포증식억제 작용제, 항신생물제, 항증식제, 항-mTOR 작용제, 항-Her2 작용제, 항-EGFR 작용제, 프레닐-단백질 전이효소 억제제, HMG-CoA 환원효소 억제제, 질소 머스타드(nitrogen mustard), 니트로소 우레아, 혈관신생 억제제, 베바시주맙, 세포 증식 및 생존 신호전달 경로의 억제제, 아폽토시스 유도제, 세포 주기 체크포인트를 방해하는 작용제, 수용체 티로신 키나제 (RTK)를 방해하는 작용제, 인테그린 차단제, NSAID, PPAR 효능제, 내재적 다중약물 내성 (MDR)의 억제제, 구토방지제, 빈혈 치료에 유용한 작용제, 호중구 감소증 치료에 유용한 작용제, 면역-증강 약물, 비포스포네이트, 방향화효소 억제제, 신생 세포의 최종 분화를 유도하는 작용제, γ-세크레타제 억제제, 암 백신 (예를 들어, 능동적 면역요법), 모노클로날 항체 치료제 (예를 들어, 수동적 면역요법), 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 치료 조성물은 PD-1/PD-L1 억제제 (세포독성 T 세포 림프구 (CTL) 면역요법제), CTLA-4 면역요법제, CDK4/6 억제제 (표적 요법제), PI3K 억제제 (표적 요법제), mTOR 억제제 (표적 요법제), AKT 억제제 (표적 요법제), Pan-Her 억제제 (표적 요법제)를 추가로 포함할 수 있다. 이들 억제제는 개질되어 각각의 모노클로날 항체를 또한 생성할 수 있다. 이러한 항체가 본 발명의 치료 조성물에 포함될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 추가 실시양태에서, 제약 조성물은 암 백신이다. 또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 피하 투여용으로 제제화된다. 또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 근육내 투여용으로 제제화된다. 또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 동맥내 투여용으로 제제화된다. 또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 정맥내 투여용으로 제제화된다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 글로보 H 및 KLH를 포함하는 치료 조성물의 치료 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, 환자는 암 진단을 받았거나 또는 암에 걸린 것으로 의심된다. 또 다른 실시양태에서, 암은 상피암이다. 추가 실시양태에서, 암은 유방암이다. 또 다른 실시양태에서, 제약/치료 조성물 중 글로보-H 모이어티의 치료 유효량은 약 0.001 ㎍/kg 내지 약 250 mg/kg의 범위일 수 있다. 또 다른 추가 실시양태에서, 제약/치료 조성물 중 글로보-H 모이어티의 치료 유효량은 투여량 당 약 10 ㎍/kg 내지 약 50 ㎍/kg의 1종의 치료 접합체를 포함한다. 또 다른 추가 실시양태에서, 제약/치료 조성물 중 글로보-H 모이어티의 치료 유효량은 투여량 당 약 0.10 ㎍/kg 내지 약 0.75 ㎍/kg의 1종의 치료 접합체를 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 치료 조성물 중 글로보-H-KLH 복합체의 치료 유효량은 약 0.001 ㎍/kg 내지 약 250 mg/kg의 범위일 수 있다. 또 다른 추가 실시양태에서, 치료 조성물 중 글로보-H-KLH 복합체의 치료 유효량은 투여량 당 약 10 ㎍/kg 내지 약 50 ㎍/kg의 1종의 치료 접합체를 포함한다. 또 다른 추가 실시양태에서, 치료 조성물 중 글로보-H-KLH 복합체의 치료 유효량은 투여량 당 약 0.60 ㎍/kg 내지 약 4.50 ㎍/kg의 1종의 치료 접합체를 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 방법은 무진행 생존기간을, 대조 위약에 비해 대략 또는 적어도 1주 연장시킬 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 무진행 생존기간을, 대조 위약에 비해 대략 또는 적어도 2주 연장시킬 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 무진행 생존기간을, 대조 위약에 비해 대략 또는 적어도 1개월 연장시킬 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 무진행 생존기간을, 대조 위약에 비해 대략 또는 적어도 3개월 연장시킬 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 무진행 생존기간을, 대조 위약에 비해 대략 또는 적어도 6개월 연장시킬 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 전체 생존기간을, 대조 위약에 비해 대략 또는 적어도 12개월 연장시킬 수 있다.

하기의 상세한 설명과 함께, 첨부 도면을 참조하여 고려하면 본 발명을 더욱 완전히 이해할 수 있다. 도면에 도시된 실시양태는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명을 도시된 실시양태로 제한하는 것으로 해석해서는 안된다.
도 1a는 글로보 H의 화학 구조 뿐만 아니라, 다수의 예시 글로보 H 유사체를 도시한다. Glc는 글루코스를 의미하고, Gal은 갈락토스를 의미하며, GalNAc는 N-아세틸갈락토사민을 의미하며, Fuc는 푸코스를 의미한다. 도 1b는 MMCCH 링커에 의해 접합된 예시 글로보 H-KLH 서브유닛을 도시한다.
도 2a는 글로보 H-KLH 서브유닛의 접합 합성 경로의 예를 도시한다. 도 2b는 문헌 [Slovin et al (1999), Proc Natl Acad Sci USA 96:5710-5] 및 [Gilewski et al (2001), Proc Natl Acad Sci USA 98:3270-5]에 개시된 글로보 H 접합체와 비교하여, 본 발명의 글로보 H-KLH 이량체 및 삼량체를 도시한다.
도 3은 천연 KLH (8.3 MDa)의 다각도 레이저 산란 분광법 (MALS) 결과를 도시한다.
도 4a는 검출기로서 다각도 레이저 산란 분광법 (MALS)을 사용하는 KLH의 크기 배제 크로마토그래피 결과를 도시한다. 도 4b는 KLH의 질량 분포 분석을 도시한다. 도 4c는 검출기로서 다각도 레이저 산란 분광법 (MALS)을 사용하는 글로보 H-KLH 당접합체 (OBI-822 로트 번호 14001)의 크기 배제 크로마토그래피 결과를 도시한다. 도 4d는 글로보 H-KLH 당접합체의 질량 분포 분석을 도시한다.
도 5a는 예시 글로보 H-KLH 당접합체 (7.5 ㎍ 및 25 ㎍)로 면역화된 루이스 래트(Lewis rat)에서의 B 세포 집단의 시간순 증식을 도시한다. 도 5b는 예시 글로보 H-KLH 당접합체 (7.5 ㎍ 및 25 ㎍)로 면역화된 루이스 래트에서의 CD3 T 세포 집단의 시간순 증식을 도시한다. 도 5c는 예시 글로보 H-KLH 당접합체 (7.5 ㎍ 및 25 ㎍)로 면역화된 루이스 래트에서의 CD4 T 세포 집단의 시간순 증식을 도시한다. 도 5d는 예시 글로보 H-KLH 당접합체 (7.5 ㎍ 및 25 ㎍)로 면역화된 루이스 래트에서의 CD8 T 세포 집단의 시간순 증식을 도시한다. 데이터는 PBS 그룹의 세포수 백분율에 대하여 정규화된 지시된 그룹의 세포수 백분율로서 제시되었다. 2원 ANOVA에 이어서, 본페로니(Bonferroni) 사후 검정을 이용하여 다중 비교 분석하였다. PBS와 비교하였을 때, *, p<0.05, **, p<0.01, 및 ***, p<0.001이다.
도 6a는 예시 글로보 H-KLH 당접합체 (7.5 ㎍ 및 25 ㎍)로 면역화된 루이스 래트의 혈액 중 IgM 항체의 역수 역가에 있어서의 시간순 변화를 도시한다. 도 6b는 예시 글로보 H-KLH 당접합체 (7.5 ㎍ 및 25 ㎍)로 면역화된 루이스 래트의 혈액 중 IgG 항체의 역수 역가에 있어서의 시간순 변화를 도시한다.
도 7은 글로보 H와 KLH 사이의 접합 비율 (0.17:1 및 0.07:1)에 대하여 반응하는 마우스에서의 IgM 항체 역가를 도시한다.
도 8은 PBS, 글로보 H-KLH 당접합체 + 사포닌 아주반트 (OBI-822 + OBI-821) 및 글로보 H-KLH 당접합체 + C34 아주반트 (OBI-822 + OBI-834)로 면역화된 C57BL/6 마우스의 면역원성을 도시한다. ELISA 분석을 위해 혈청을 제42일에 수집하여, 항-글로보 H IgM 및 IgG 항체의 생성을 결정하였다. 도 8a는 IgM의 생성을 도시한다. 도 8b는 IgG의 생성을 도시한다. 글로보 H-KLH 당접합체의 피하 (SC) 투여는 2 ㎍이고 아주반트는 20 ㎍이었다.
도 9는 제16일에 면역적격성의 (6-8주령) 무병원체 (SPF) C57BL/6 암컷 마우스 6개 그룹에, C57BL/6 마우스와 동계의 루이스 폐 암종 (LL/2, ATCC CRL-1642) 세포 5.0x10⁶개/0.1 mL를 실험용 마우스의 복부 부위에 측방쪽으로 피하 주사한 것을 도시한다. 3개의 시험 조건 (단독의 PBS, OBI-822 + OBI-821 아주반트 및 OBI-822 + OBI-834 아주반트)을 제0일, 제5일, 제11일, 제19일, 제29일, 제34일 및 제39일에 0.2 mL/마우스 (좌측 및 우측 복부 부위 양쪽에, 0.1 mL/부위)로 피하 투여하거나 또는 10 mL/kg의 투여 부피로 복강내 투여하였다. 희생 후 제42일에 종양을 포함하는 전신 사진을 촬영하였다.
도 10은 제0일, 제5일, 제11일, 제19일, 제29일, 제34일 및 제39일에 PBS, OBI-822 + OBI-821 아주반트 및 OBI-822 + OBI-834 아주반트로 피하 백신접종된, 글로보 H-KLH 당접합체 면역화 C57BL/6 마우스에서의 LL/2 (루이스 폐 암종 세포주) 종양 성장을 도시한다. LL/2 세포 (5.0x10⁶개/0.1 mL)를 각각의 마우스에 제16일에 피하 주사하였다. 종양 크기를 제16일, 제19일, 제23일, 제26일, 제30일, 제34일, 제37일, 제40일 및 제42일에 모니터링하였다.
도 11은 글로보 H 유도체의 화학 구조를 도시한다. 도 11a는 글로보 H 유도체 [화학식: C(56) H(91) N(5) O(33) S(1), 단일동위원소 MW 가중: 1393.5317 Da]를 도시한다. 도 11b는 글로보 H 유도체의 중성종 상실 형태를 도시한다. 화학식 1: C(18) H(28) N(4) O(4) S(1), 단일동위원소 MW 가중: 396.1831 Da; 화학식 2: C(24) H(38) N(4) O(9) S(1), 단일동위원소 MW 가중: 558.2360 Da; 화학식 3: C(30) H(48) N(4) O(14) S(1), 단일동위원소 MW 가중: 720.2888 Da; 화학식 4: C(36) H(58) N(4) O(19) S(1), 단일동위원소 MW 가중: 882.3416 Da; 화학식 5: C(44) H(71) N(5) O(24) S(1), 단일동위원소 MW 가중: 1085.4210 Da.
도 12는 MMCCH 유도체의 화학 구조를 도시한다. 도 12a는 MMCCH 유도체의 화학 구조 [화학식: C(16) H(24) N(4) O(3) S(1), 단일동위원소 MW 가중: 352.1569 Da]를 도시한다. 도 12b는 탈아미드화된 MMCCH 유도체 [화학식: C(16) H(22) N(2) O(4) S(1), 단일동위원소 MW 가중: 338.1300 Da]를 도시한다.
도 13은 리신 잔기 상의 글로보 H 및 MMCCH 유도체 펩티드의 동정에 관한 요약을 도시한다.
도 14는 샘플 1 (1^st LC-MS/MS)에 대하여 KLH1 (a) 및 KLH2 (b)의 리신 잔기 상의 글로보-H 접합 펩티드의 동정 세부사항을 도시한다.
도 15는 샘플 2 (1^st LC-MS/MS)에 대하여 KLH1 (a) 및 KLH2 (b)의 리신 잔기 상의 글로보-H 접합 펩티드의 동정 세부사항을 도시한다.
도 16은 샘플 3 (1^st LC-MS/MS)에 대하여 KLH1 (a) 및 KLH2 (b)의 리신 잔기 상의 글로보-H 접합 펩티드의 동정 세부사항을 도시한다.
도 17은 샘플 4 (1^st LC-MS/MS)에 대하여 KLH1 (a) 및 KLH2 (b)의 리신 잔기 상의 글로보-H 접합 펩티드의 동정 세부사항을 도시한다.
도 18은 샘플 1 (2^nd LC-MS/MS)에 대하여 KLH1 (a) 및 KLH2 (b)의 리신 잔기 상의 글로보-H 접합 펩티드의 동정 세부사항을 도시한다.
도 19는 샘플 2 (2^nd LC-MS/MS)에 대하여 KLH1 (a) 및 KLH2 (b)의 리신 잔기 상의 글로보-H 접합 펩티드의 동정 세부사항을 도시한다.
도 20은 샘플 3 (2^nd LC-MS/MS)에 대하여 KLH1 (a) 및 KLH2 (b)의 리신 잔기 상의 글로보-H 접합 펩티드의 동정 세부사항을 도시한다.
도 21은 샘플 4 (2^nd LC-MS/MS)에 대하여 KLH1 (a) 및 KLH2 (b)의 리신 잔기 상의 글로보-H 접합 펩티드의 동정 세부사항을 도시한다.
도 22는 샘플 1 (1^st LC-MS/MS)에 대하여 KLH1 (a) 및 KLH2 (b)의 리신 잔기 상의 MMCCH-접합 펩티드의 동정 세부사항을 도시한다.
도 23은 샘플 2 (1^st LC-MS/MS)에 대하여 KLH1 (a) 및 KLH2 (b)의 리신 잔기 상의 MMCCH-접합 펩티드의 동정 세부사항을 도시한다.
도 24는 샘플 3 (1^st LC-MS/MS)에 대하여 KLH1 (a) 및 KLH2 (b)의 리신 잔기 상의 MMCCH-접합 펩티드의 동정 세부사항을 도시한다.
도 25는 샘플 4 (1^st LC-MS/MS)에 대하여 KLH1 (a) 및 KLH2 (b)의 리신 잔기 상의 MMCCH-접합 펩티드의 동정 세부사항을 도시한다.
도 26은 샘플 1 (2^nd LC-MS/MS)에 대하여 KLH1 (a) 및 KLH2 (b)의 리신 잔기 상의 MMCCH-접합 펩티드의 동정 세부사항을 도시한다.
도 27은 샘플 2 (2^nd LC-MS/MS)에 대하여 KLH1 (a) 및 KLH2 (b)의 리신 잔기 상의 MMCCH-접합 펩티드의 동정 세부사항을 도시한다.
도 28은 샘플 3 (2^nd LC-MS/MS)에 대하여 KLH1 (a) 및 KLH2 (b)의 리신 잔기 상의 MMCCH-접합 펩티드의 동정 세부사항을 도시한다.
도 29는 샘플 4 (2^nd LC-MS/MS)에 대하여 KLH1 (a) 및 KLH2 (b)의 리신 잔기 상의 MMCCH-접합 펩티드의 동정 세부사항을 도시한다.
도 30은 (1^st LC-MS/MS)에서의 KLH1 (a) 및 KLH2 (b); (2^nd LC-MS/MS)에서의 KLH1 (c) 및 KLH2 (d)의 글로보-H 접합 리신 자리의 동정 요약을 도시한다.
도 31은 (1^st LC-MS/MS)에서의 KLH1 (a) 및 KLH2 (b); 및 (2^nd LC-MS/MS)에서의 KLH1 (c) 및 KLH2 (d)의 MMCCH-접합 리신 자리의 동정 요약을 도시한다.
도 32는 1차 (a) 및 2차 (b) LC-MS/MS 전개에 의한 글로보-H 접합 분석에 관한 요약을 도시한다.
도 33은 히스티딘 (H), 아스파라긴 (N), 프롤린 (P), 글루타민 (Q) 및 아르기닌 (R) 잔기 상의 예시 글로보 H 및 MMCCH 유도체 펩티드의 동정 요약을 도시한다.
도 34는 샘플 1 (LC-MS/MS)에 대하여 KLH1 (a) 및 KLH2 (b)의 HNPQR 잔기 상의 글로보 H 및 MMCCH-접합 펩티드의 동정 세부사항을 도시한다.
도 35는 샘플 2 (LC-MS/MS)에 대하여 KLH1 (a) 및 KLH2 (b)의 HNPQR 잔기 상의 글로보 H 및 MMCCH-접합 펩티드의 동정 세부사항을 도시한다.
도 36은 샘플 3 (LC-MS/MS)에 대하여 KLH1 (a) 및 KLH2 (b)의 HNPQR 잔기 상의 글로보 H 및 MMCCH-접합 펩티드의 동정 세부사항을 도시한다.
도 37은 샘플 4 (LC-MS/MS)에 대하여 KLH1 (a) 및 KLH2 (b)의 HNPQR 잔기 상의 글로보 H 및 MMCCH-접합 펩티드의 동정 세부사항을 도시한다.
도 38은 히스티딘 (H), 아스파라긴 (N), 프롤린 (P), 글루타민 (Q) 및 아르기닌 (R) 잔기 상의 예시 글로보 H 및 MMCCH 유도체 분석에 관한 요약을 도시한다.

본 발명의 실시는, 달리 지시되지 않는 한, 관련 기술분야의 기술 범위 내에 있는 분자 생물학, 미생물학 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2^nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Antibodies: A Laboratory Manual, by Harlow and Lanes (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988); and Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986)]을 참조한다.

항체를 유도하기 위해 합성 탄수화물 접합체를 사용하는 것은 1929년에 괴벨(Goebel)과 에이버리(Avery)에 의해 최초로 입증되었다 (Goebel, W. F., and Avery, O. T., J. Exp. Med., 1929, 50, 521; Avery, O. T., and Goebel, W. F., J. Exp. Med., 1929, 50, 533). 탄수화물을 벤젠디아조늄 글리코시드를 통해 담체 단백질과 결합시켰다. 합성 항원에 의한 토끼의 면역화는 폴리클로날 항체를 생성하였다. 다른 연구원 (Allen, P. Z., and Goldstein, I. J., Biochemistry, 1967, 6, 3029; Rude, E., and Delius, M. M., Carbohydr. Res., 1968, 8, 219; Himmelspach, K., et al., Eur. J. Immunol., 1971, 1, 106; Fielder, R. J., et al., J. Immunol., 1970, 105, 265)도 탄수화물을 단백질 담체와 접합시키기 위한 유사한 기술을 개발하였다.

당접합체는 종양 세포 상의 공지된 표적 작용제를 특이적으로 표적화하는 백신접종으로부터 유발되는 능동적 면역요법에 사용될 수 있다. 탄수화물 항원에 대한 반응은 보통 종양의 신체 거부를 도울 T 세포의 사용을 참여시키지 않는다. 접합체에 의한 백신접종의 결과로서 완전한 종양 거부의 가능성은 낮을 것이라 생각되지만, 이러한 치료법은 면역 감시를 증대시킬 것이고 새로운 종양 콜로니의 재발을 감소시킬 수 있다 (Dennis, J., Oxford Glycosystems Glyconews Second, 1992; Lloyd, K. O., in Specific Immunotherapy of Cancer with Vaccines, 1993, New York Academy of Sciences, 50-58). 토요쿠니(Toyokuni)와 싱할(Singhal)이 측정가능한 IgG 역가를 자극하는 합성 당접합체를 개시하였는데 (Toyokuni, T., et al., J. Am. Chem. Soc., 1994, 116, 395), IgG 반응은 헬퍼 T 세포의 참여와 일반적으로 연관있으므로 이러한 결과는 중요하다.

면역적 아주반트와 조합된 합성 글로보 H 백신은 전립선암과 전이성 유방암 환자 모두에게서 주로는 IgM을 유도하고, 또한 보다 낮은 정도로 IgG 항체를 유도하는 것으로 나타났다. I상 임상 실험에서, 백신은 또한 백신접종 부위에서 일시적인 국부 피부 반응으로 최소한의 독성을 나타냈다 (Gilewski T et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:3270-3275; Ragupathi G, et al. (1997) Angew Chem Int Ed 36:125-128; Slovin S F et al (1997) Proc Natl Acad Sci USA 96:5710-5715). 일부 환자에게서 관찰되는 가벼운 독감-유사 증상은 아마도 QS-21의 부작용과 연관있다. 말레이미드-개질된 담체 단백질 KLH와 접합된, 5종의 전립선암 및 유방암 연관 탄수화물 항원, 즉 글로보-H, GM2, STn, TF 및 Tn을 함유하는 5가 백신은 ELISA 분석에서 IgM보다 더 높은 역가의 IgG를 갖는 항-글로보 H 혈청을 생산하는 것으로 보고되었다 (Zhu J. et al. (2009) J. Am. Chem. Soc. 131(26):9298-9303).

따라서, 본 개시내용은 글로보 H 표적/매개의 면역원성/치료적 화합물, 조성물, 및/또는 제약 제제 조성물 뿐만 아니라, 면역요법제, 백신, 투여 형태, 키트, 및 그의 제조 방법 및 치료 방법에 관한 것이다.

"하나의" 또는 "한"이라는 단어의 사용은, 청구범위 및/또는 명세서에서 "포함하는"이라는 용어와 함께 사용될 때, "하나"를 의미할 수 있지만, 이는 또한 "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 하나 초과"의 의미와 일치한다.

본 출원 전체에서, 용어 "약"은 어떤 값이 예를 들어, 측정 장치, 값을 결정하는데 사용되는 방법, 또는 연구 대상체 중에 존재하는 변동에 대한 오차의 내재적 변동을 포함함을 나타내기 위해 사용된다. 전형적으로, 상기 용어는 상황에 따라 대략 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 20%의 또는 상기 값 미만의 변동성을 포함하는 것으로 여겨진다.

본원에 사용된 용어 "알킬"은, 달리 명시되지 않는 한, 1-20개의 탄소 원자를 함유하는, 예를 들어 C1-C8 또는 C1-C4의 선형 또는 분지형 1가 탄화수소를 말하는 것이며, 이들은 치환 또는 비치환될 수 있다. 알킬의 예는 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, i-부틸, 및 t-부틸을 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다.

청구범위에서 "또는"이라는 용어의 사용은 오직 양자택일만을 나타내거나 또는 양자택일이 상호 배타적임을 명백하게 지시하지 않는 한, "및/또는"을 의미하기 위해 사용되지만, 본 개시내용은 오직 양자택일만을 나타내는 정의와 "및/또는"을 나타내는 정의를 지지한다.

본 명세서 및 청구범위(들)에서 사용된 "포함하는" (또한 "포함하는"의 어느 한 형태, 예컨대 "포함하다" 및 "포함한다"), "갖는" (또한 "갖는"의 어느 한 형태, 예컨대 "가지다" 및 "갖다"), "비롯한" (또한 "비롯한"의 어느 한 형태, 예컨대 "비롯하여 포함한다" 및 "비롯하여 포함하다") 또는 "함유하는" (또한 "함유하는"의 어느 한 형태, 예컨대 "함유한다" 및 "함유하다")이라는 단어는 포괄적이거나 또는 개방형이며, 추가의 필수적이지 않은 요소들 또는 방법 단계들을 제외하지 않는다. 본 명세서에서 논의된 임의의 실시양태는 본 발명의 임의의 방법 또는 조성물과 관련하여 실행될 수 있는 것으로 고려되며, 그 반대도 고려된다. 또한, 본 발명의 조성물은 본 발명의 방법을 달성하기 위해 사용될 수 있다.

본원에서 "치료하는"이란 장애, 장애의 증상, 장애의 이차적인 질환 상태, 또는 장애에 대한 소인을 치유, 완화, 경감, 구제, 예방, 또는 개선하기 위한 목적으로 대상체에게 치료 조성물을 투여하는 것을 말한다.

"유효량"은 치료하는 대상체에서 본원에 기술된 의학적으로 바람직한 결과를 도출할 수 있는 치료 조성물의 양이다. 의학적으로 바람직한 결과는 객관적일 수 있거나 (즉, 일부 시험 또는 표지자에 의해 측정가능함) 또는 주관적일 수 있다 (즉, 대상체가 효과를 표시하거나 또는 효과를 느낌).

본원에 언급된 "치료 조성물을 이용한 치료를 받아들일 수 있는 질환"은 본원에 개시된 치료 조성물의 투여에 의해 치료가능한 임의의 과정, 병태, 장애, 병 및/또는 질병을 의미한다.

"증식성 장애"는 일부 유형의 세포가 너무 많이 생산되어 건강을 악화시키는 것이다. 증식성 장애는 양성 또는 악성일 수 있다. 증식성 장애는 예를 들어, 암을 포함할 수 있다.

본원에 개시된 치료 조성물로 치료가능한, 본원에 사용된 "암"은 비정상적인 성장 상태를 갖는 세포를 포함한다. 암 세포는 정상적인 제어 메카니즘의 상실을 특징으로 할 수 있으므로, 연속적으로 증식하고, 인접 조직에 침윤되며, 체내 원위부까지 이동하며, 또한 세포가 영양분을 획득하는 신생 혈관의 성장을 촉진할 수 있다. 본원에 사용된 암은 악성 또는 양성일 수 있다. 암은 체내 임의의 조직으로부터 발생할 수 있다. 세포가 성장하고 증식함에 따라, 이들 세포는 종양이라 불리는 조직 덩어리를 형성한다. 종양이라는 용어는 비정상적인 성장 또는 덩어리를 포함할 수 있다. 종양은 암성 (악성) 또는 비-암성 (양성)일 수 있다. 암성 종양은 이웃하는 조직에 침윤되어 전신으로 확산될 수 있다 (전이). 그러나, 양성 종양은 일반적으로 이웃하는 조직에 침윤되지 않으며 전신으로 확산되지 않는다. 암은 혈액 및 혈액-형성 조직의 암 (백혈병 및 림프종)과 "고형" 종양으로 분류될 수 있다. "고형" 종양은 암종 또는 육종을 포함할 수 있다.

본 발명의 치료 조성물로 치료가능한 암은 부위에 의해 분류되는 암, 예를 들어 구강 및 인두 (입술, 혀, 타액선, 구강 저부, 잇몸 및 다른 입 부위, 비인두, 편도선, 구강인두, 하인두, 다른 구강/인두 부위)의 암; 소화계 (식도; 위; 소장; 결장 및 직장; 항문, 항문관, 및 항문직장; 간; 간내 담도; 쓸개; 다른 담낭; 췌장; 복막후강; 복막, 장막, 및 장간막; 다른 소화기)의 암; 호흡계 (비강, 중이, 및 부비강; 후두; 폐 및 기관지; 흉막; 기관, 종격, 및 다른 호흡기)의 암; 중피종; 뼈 및 관절; 및 연조직, 예를 들어 심장의 암; 흑색종 및 다른 비-상피 피부암을 포함하는 피부암; 카포시 육종(Kaposi's sarcoma) 및 유방암; 여성 생식계 (자궁경관; 자궁체; 자궁, 난소; 질; 외음부; 및 다른 여성 생식기)의 암; 남성 생식계 (전립선; 고환; 음경; 및 다른 남성 생식기)의 암; 비뇨계 (방광; 신장 및 신우; 요관; 및 다른 비뇨기)의 암; 눈 및 안와의 암; 뇌 및 신경계 (뇌; 및 다른 신경계)의 암; 내분비계 (갑상선, 및 흉선을 포함한 다른 내분비선)의 암; 림프종 (호지킨병(Hodgkin's disease) 및 비-호지킨 림프종), 다발성 골수종, 및 백혈병 (림프구성 백혈병; 골수성 백혈병; 단핵구성 백혈병; 및 다른 백혈병)을 포함한다.

본 발명에 따른 치료 조성물에 대하여 적합한 표적일 수 있는, 조직 유형에 의해 분류되는 다른 암은 신생물, 악성 종양; 암종, NOS; 미분화 암종, NOS; 거대 세포 및 방추 세포 암종; 소세포 암종, NOS; 유두상 암종, NOS; 편평 세포 암종, NOS; 림프상피 암종; 기저 세포 암종, NOS; 섬모기질 암종; 이행상피 암종, NOS; 유두상 이행상피 암종; 선암종, NOS; 악성 가스트린종; 담관암종; 간세포 암종, NOS; 복합 간세포 암종 및 담관암종; 육주상의 선암종; 선양 낭포암종; 선종성 폴립 내의 선암종; 선암종, 가족성 결장 폴립증; 고형 암종, NOS; 악성 유암종; 세기관지폐포 선암종; 유두상 선암종, NOS; 혐색소성 암종; 호산성 암종; 호산세포성 선암종; 호염기성 암종; 투명 세포 선암종, NOS; 과립 세포 암종; 여포성 선암종, NOS; 유두상 및 여포성 선암종; 비캡슐화 경화성 암종; 부신 피질 암종; 자궁내막 암종; 피부 부속물 암종; 아포크린 선암종; 피지성 선암종; 귀지 선암종; 점액표피양 암종; 낭선암종, NOS; 유두상 낭선암종, NOS; 유두상 장액 낭선암종; 점액성 낭선암종, NOS; 점액성 선암종; 인환 세포 암종; 침윤성 관암종; 수질 암종, NOS; 소엽 암종; 염증성 암종; 유방의 파제트병(Paget's disease, mammary); 샘꽈리 세포 암종; 선편평 세포 암종; 편평세포 화생을 동반한 선암종; 악성 흉선종; 악성 난소 기질 종양; 악성 협막세포종; 악성 과립막 세포종; 악성 남성모세포종; 세르톨리 세포 암종; 악성 라이디히 세포종; 악성 지질 세포종; 악성 부신경절종; 악성 유방외 부신경절종; 갈색세포종; 사구맥관육종; 악성 흑색종, NOS; 무색소성 흑색종; 표재성 확산성 흑색종; 거대 색소모반 내의 악성 흑색종; 상피 세포 흑색종; 악성 청색 모반; 육종, NOS; 섬유육종, NOS; 악성 섬유성 조직구종; 점액육종; 지방육종, NOS; 평활근육종, NOS; 횡문근육종, NOS; 배아 횡문근육종; 포상 횡문근육종; 기질 육종, NOS; 악성 혼합 종양, NOS; 뮐러의 혼합 종양; 신아세포종; 간모세포종; 암육종, NOS; 악성 간엽종; 악성 브레너 종양; 악성 엽상 종양; 활막 육종, NOS; 악성 중피종; 미분화배세포종; 배아 암종, NOS; 악성 기형종, NOS; 악성 난소갑상선종; 융모막암종; 악성 중신종; 혈관종; 악성 혈관내피종; 카포시 육종; 악성 혈관주위세포종; 림프관육종; 골육종, NOS; 피질주위 골육종; 연골육종, NOS; 악성 연골모세포종; 중간엽 연골육종; 뼈의 거대 세포 종양; 유잉 육종(Ewing's sarcoma); 악성 치원성 종양; 법랑아세포 치아육종; 악성 법랑아세포종; 법랑아세포성 섬유육종; 악성 송과체종; 척색종; 악성 신경교종; 상의세포종, NOS; 성상세포종, NOS; 원형질성 성상세포종; 섬유성 성상세포종; 성상모세포종; 교모세포종, NOS; 핍지교종, NOS; 핍지모세포종; 원시신경외배엽성 종양; 소뇌육종, NOS; 신경절신경모세포종; 신경모세포종, NOS; 망막모세포종, NOS; 후각 신경원성 종양; 악성 뇌수막종; 신경섬유육종; 악성 신경초종; 악성 과립 세포 종양; 악성 림프종, NOS; 호지킨병, NOS; 호지킨병; 부육아종, NOS; 소림프구성 악성 림프종; 대세포 확산성 악성 림프종; 여포성 악성 림프종, NOS; 균상 식육종; 다른 특정된 비-호지킨 림프종; 악성 조직구증; 다발성 골수종; 비만 세포 육종; 면역증식성 소장 질환; 백혈병, NOS; 림프구성 백혈병, NOS; 혈장 세포 백혈병; 적백혈병; 림프육종 세포 백혈병; 골수성 백혈병, NOS; 호염기성 백혈병; 호산구성 백혈병; 단핵구성 백혈병, NOS; 비만 세포 백혈병; 거대핵모세포성 백혈병; 골수성 육종; 및 모세포 백혈병을 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다.

본원에 정의된 "상피암"은 피부, 중공 내장 및 다른 기관의 상피 또는 관련 조직으로부터 발생하는 암(들)을 말한다. 상피암은 유방암, 폐암, 간암, 구강암, 위암, 결장암, 비인두암, 피부암, 신장암, 뇌종양, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 장암, 췌장암, 및 방광암을 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다.

본원에 사용된 "환자" 또는 "대상체"는 암과 같은 증식성 질환의 진단을 받았거나 또는 그러한 질환에 걸렸거나 그러한 질환이 발병한 것으로 의심되는 포유류 대상체를 말한다. 예시 환자는 인간, 원숭이, 개, 돼지, 소, 고양이, 말, 염소, 양, 설치류 및 암과 같은 증식성 질환의 발병에 유용할 수 있는 다른 포유류일 수 있다.

본원에 사용된 "실질적으로 정제된" 또는 "실질적으로 단리된"이란 그의 천연 상태에서는 정상적으로 회합되어 있는 실질적으로 모든 다른 분자로부터 분리된 상태의 분자 (예를 들어, 화합물)를 말한다. 바람직하게는, 실질적으로 정제된 분자는 제제 중에 존재하는 우세한 화학종이다. 특히, 실질적으로 정제된 분자는 천연 혼합물 중에 존재하는 다른 분자 (용매 제외)가 60%를 초과하여 존재하지 않고, 바람직하게는 75%, 보다 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95% 존재하지 않을 수 있다. "실질적으로 정제된" 또는 "실질적으로 단리된"이라는 용어는 그의 천연 상태에서 존재하는 분자 또는 물질을 포함시키지 않고자 한다. 특정 실시양태에서, "실질적으로 정제된" 또는 "실질적으로 단리된"이라는 용어는 1종의 KLH 모이어티를 또 다른 KLH 모이어티로부터 정제하는 것을 포함한다 (예를 들어, KLH 이량체 모이어티를 KLH 삼량체 모이어티로부터 실질적으로 정제하거나 또는 실질적으로 단리함). 또 다른 실시양태에서, "실질적으로 정제된" 또는 "실질적으로 단리된"이라는 용어는 1종의 KLH 모이어티를 또 다른 KLH 모이어티로부터 정제하는 것을 포함하지 않지만 (예를 들어, KLH 이량체 및 KLH 삼량체가 실질적으로 정제된 또는 실질적으로 단리된 조성물 중에 포함됨), 불순물이 실질적으로 제거된다.

본원에서 "투여"란 본 발명의 치료 조성물을 환자에게 제공하는 것을 말한다. 비제한적으로 예를 들어, 조성물의 투여, 예를 들어 주사는 정맥내 (i.v.) 주사, 피하 (s.c.) 주사, 피내 (i.d.) 주사, 복강내 (i.p.) 주사, 또는 근육내 (i.m.) 주사에 의해 수행될 수 있다. 하나 이상의 이러한 경로가 이용될 수 있다. 비경구 투여는 예를 들어, 볼루스 주사에 의해 또는 일정 시간에 걸쳐서의 점진적인 관류에 의한 것일 수 있다. 별법으로 또는 공동으로, 투여는 경구 경로에 의한 것일 수 있다. 추가로, 투여는 또한 볼루스의 외과적 침적 또는 의료 장치의 배치에 의한 것일 수 있다.

본원에서 "치료를 필요로 하는 환자"란 증식성 장애의 진단을 받았거나 또는 증식성 장애에 걸린 것으로 의심되는 환자를 말한다. 한 실시양태에서, 환자는 암에 걸렸거나 또는 암의 발병 가능성이 있다.

본원에 사용된 용어 "항원"은 단백질 담체 및/또는 아주반트의 도움 하에 또는 그러한 도움 없이, 면역 반응을 유도할 수 있는 임의의 물질로서 정의된다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물의 항원은 탄수화물 및 보다 바람직하게는 글리칸-항원 및 가장 바람직하게는 글로보 H 모이어티를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "면역원성"은 면역 반응을 자극하는 면역원, 항원 또는 백신의 능력을 말한다.

본원에 사용된 용어 "면역요법"은 예방적 및/또는 치료적 목적을 달성하기 위해 면역계를 조정하는 개념에 기반한 다수의 치료 전략을 말한다.

본원에 사용된 용어 "에피토프"는 항체 또는 T 세포 수용체의 항원 결합 자리와 접촉하는 항원 분자의 부분으로서 정의된다.

본 발명의 "치료 조성물"은 "면역원성 접합체 및/또는 치료 접합체" 및/또는 "치료적 항체"를 포함한다. 치료 접합체는 담체와 결합된 적어도 1종의 항원을 포함한다. 바람직하게는, 치료 접합체의 결합은 공유 결합이다. 치료 접합체의 한 실시양태에서, 항원은 글리칸, 예컨대 글로보 H 모이어티이고, 담체는 KLH 모이어티 및/또는 KLH 모이어티 서브유닛이다. 그러므로, 치료 접합체라는 용어는 1개 이상의 글로보 H 모이어티와 결합된 1개 이상의 KLH 모이어티 서브유닛을 포함한다. 한 실시양태에서, 치료 접합체라는 용어는 대략 또는 적어도 1, 10, 10² 또는 10³개의 글로보 H 모이어티와 결합된 1개 이상의 KLH 모이어티를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 치료 접합체라는 용어는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160개, 또는 그 초과의 글로보 H 모이어티와 결합된 1개 이상의 KLH 모이어티를 포함한다. 또 다른 실시양태는 이러한 글로보 H 결합 KLH 모이어티 서브유닛의 단리된 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체 또는 육량체, 또는 이들의 조합을 포함한다.

한 실시양태에서, 치료 접합체는 Fucα(1→2)Galβ(1→3)GalNAcβ(1→3)Galα(1→4)Galβ(1→4)Gluβ(1-O-에틸히드라질-1-카르보닐-시클로헥실-4-(메틸-N-말레이미도)-3-(티오부틸-이미딜)-키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH)이며, 이를 또한 OBI-822라고도 한다.

"치료적 항체"는 본 발명의 치료 접합체 및 바람직하게는 치료 접합체의 글로보 H 모이어티 부분과 특이적으로 결합하는 항체 (하기에서 추가로 정의됨)로서 정의된다.

본원에 사용된 용어 "백신"은 항원과 연관된 질환에 대한 면역을 부여하는데 사용되는 치료 접합체를 함유하는 치료 조성물을 말한다. 암 백신은 손상된 또는 비정상적인 세포, 예컨대 암 세포에 의해 부과된 위험으로부터, 면역계를 통해 자신을 보호하는 신체의 고유 능력을 증대시키도록 고안된다. 방어 면역 반응은 질환의 예방, 질환 발병의 지연, 증상의 중증도 감소, 이환율 감소, 및 사망 지연을 비제한적으로 포함하여, 질환의 중증도를 감소시키는 것이다. 바람직하게는, 백신은 체액성 면역 반응 (예를 들어, B 림프구에 의한 항체 생산의 자극)과 세포성 면역 반응 (예를 들어, T-림프구 및/또는 다른 세포, 예컨대 NK 세포 및 대식세포에 의해 매개되는 면역 반응)을 둘다 활성화할 수 있다. 면역 반응을 결정하기 위한 표준 분석법, 예컨대 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA), 유세포 분석법, 세포 증식 분석법, CTL 분석법, 및 ADCC/CDC 분석법이 개발되었다.

본원에 사용된 용어 "글리칸"은 다당류 또는 올리고당류를 말한다. 본원에서 글리칸은 또한 당접합체, 예컨대 당단백질, 당지질, 글리코펩티드, 글리코프로테옴, 펩티도글리칸, 지질다당류 또는 프로테오글리칸의 탄수화물 부분을 나타내기 위해 사용된다. 글리칸은 보통 단당류 사이의 O-글리코시드 결합만으로 이루어진다. 예를 들어, 셀룰로스는 β-1,4-결합된 D-글루코스로 구성된 글리칸 (또는 보다 구체적으로는 글루칸)이고, 키틴은 β-1,4-결합된 N-아세틸-D-글루코사민으로 구성된 글리칸이다. 글리칸은 단당류 잔기의 단일중합체 또는 이종중합체일 수 있으며, 선형 또는 분지형일 수 있다. 글리칸은 당단백질 및 프로테오글리칸에서와 같이 단백질에 부착되어 존재할 수 있다. 이들은 일반적으로 세포의 외부 표면 상에서 발견된다. O- 및 N-결합된 글리칸은 진핵생물에서 매우 일반적이나, 또한 원핵생물에서도, 덜 일반적이긴 하지만, 발견될 수 있다. N-결합된 글리칸은 시퀀(sequon)에서의 아스파라긴의 R-기 질소 (N)에 부착되어 존재한다. 시퀀은 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr 서열이며, 여기서 X는 프랄린을 제외한 임의의 아미노산이다. 바람직한 글리칸은 글로보 H 모이어티이다.

글로보 H는 다양한 유형의 암, 특히 유방암, 전립선암, 췌장암, 위암, 난소암, 결장암 및 폐암에서 고도로 발현되는 항원성 탄수화물 패밀리의 구성원인 육당류이다. 예시 실시양태에서, 특정 환자는 0 시점에서 항-글로보 H 항체 수준을 나타내지 않으며, 본 발명의 치료 조성물에 의한 면역화 후에 높은 역가가 검출된다. 다른 예시 실시양태에서, 특정 환자는 0 시점에서 항-글로보 H 항체 수준을 나타내며, 본 발명의 치료 조성물에 의한 면역화 후에 높은 역가가 검출된다. 특정 실시양태에서, 항-글로보 H 항체는 당지질 및 가능하게는 당단백질로서, 암 세포 표면 상에서 발현된다. 다른 실시양태에서, 유방암 환자의 혈청은 글로보 H 에피토프에 대한 항체를 높은 수준으로 함유한다. 특정 실시양태에서, 이러한 에피토프는 또한 면역조직화학 연구에서 모노클로날 항체 Mbr1, VK9 및 항-SSEA-3에 의해 표적화된다. 정상 유방, 췌장, 소장 및 전립선 조직을 비롯한, 특정 정상 조직이 또한 Mbr1과 반응하지만, 이들 조직에서의 항원은 면역계로의 접근이 제한되는 분비 경계부에 우세하게 편재화된다.

본원에서 "글로보 H 모이어티"는 글로보 H, 또는 그의 단편 또는 유사체인 글리칸 (즉, 당류 모이어티를 함유하는 분자)인 것으로 정의된다. 글로보 H는 육당류 에피토프 (Fucα1 → 2Galβ1 → 3GalNAcβ1 → 3Galα1 → 4Galβ1 → 4Glc), 및 임의로 비-당류 모이어티를 함유하는 글리칸이다. 그의 단편은 육당류 에피토프의 단편, 및 적용가능한 경우, 비-당류 모이어티를 함유하는 글리칸이다. 이러한 올리고당류는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다 (문헌 [Huang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:15-20 (2006)] 참조). 필요에 따라, 이들은 비-당류 모이어티와 결합할 수 있다. 미국 특허 출원 12/485,546은 비-인간 포유동물 (예를 들어, 마우스, 토끼, 염소, 양 또는 말)에 상기에 기재된 면역 조성물을 투여하고 포유류로부터 글로보 H 또는 그의 단편과 결합한 항체를 단리시킴으로써, 글로보 H 또는 그의 단편에 대하여 특이적인 항체를 생산하는 방법에 관한 것이다.

글로보 H의 유사체는 글리칸 마이크로어레이를 사용하여 생성할 수 있으며, 문헌 [Wang et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 August 19; 105(33): 11661- 11666]에 개시되고 도 1에 도시된 것들을 포함한다.

글로보 H 유사체는 바람직하게는 항체 VK-9, Mbr1, 및 항-SSEA-3과 결합한다. 바람직하게는, 글로보 H 유사체는 특정한 해리 상수 (K_D,_surf)로 결합한다. 표면에서의 해리 상수 (K_D,_surf)를 얻기 위해 결합 곡선을 분석하는데 있어서 랭뮤어 등온식(Langmuir isotherm)이 사용될 수 있다. 인큐베이션 중의 평형 조건에서, 복제 스팟의 평균 형광 (F_obs)이 하기에 의해 기술될 수 있다:

여기서, F_max는 표면 상의 활성 탄수화물 양의 척도인 최대 형광 강도이고, [P]는 총 항체 농도이며, K_D,_surf는 표면 탄수화물 및 항체에 대한 평형 해리 상수이다. 왕(Wang) 등에 의해 개시된 바와 같이, 일부 실시양태에서 글로보 H 유사체의 바람직한 (K_D,_surf)는 왕 등에 의해 개시된 VK-9, Mbr1, 및 항-SSEA-3 항체와 관련하여, 적어도, 대략 또는 정확히 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5 또는 1.6 nM이다.

"키홀 림펫 헤모시아닌" (KLH)은 거대 키홀 림펫인 메가투라 크레눌라타(Megathura crenulata)의 혈액림프에서 발견되는, 다수의 서브유닛을 갖는 산소-운반 대형 금속단백질이다. KLH는 약 400 kDa (예를 들어, KLH 단량체) 내지 약 8000 kDa (예를 들어, KLH 이십량체)의 분자량을 갖는 응집체 중의 약 350,000 내지 약 390,000의 분자량을 갖는 서브유닛으로 이루어진 이종성 당화 단백질이다. KLH 서브유닛의 각각의 도메인은 단일 산소 원자와 함께 결합된 2개의 구리 원자를 함유한다. 산소가 헤모시아닌과 결합되면, 분자는 특유의 투명한 유백광 청색을 띤다. 특정 실시양태에서, KLH 단백질은 인간에서 강력한 면역원성을 갖지만, 안전하다. 특정 실시양태에서, KLH는 암모늄 술페이트 침전 및 투석을 전형적으로 포함하고, 또한 최고 순도를 달성하기 위해서는 크로마토그래피 정제를 포함할 수 있는 일련의 단계에 의해, 메가투라 크레눌라타의 혈액림프로부터 정제될 수 있다. 특정 실시양태에서, KLH 정제는 또한 내독소 제거를 포함할 수 있지만, 항체 생산을 위해 주사될 때 내독소가 아주반트로서 작용할 수 있기 때문에 이 단계가 불필요할 수도 있다. 바람직하게는, 투명한 유백광 청색을 갖는 고급 KLH 제제가 KLH 용해도의 최상의 지표이다. 특정 실시양태에서, KLH 단량체 유닛은 약 4,000 kDa 내지 8,000 kDa의 총 분자량을 갖는 대형 다량체 (십량체 또는 이십량체)로 어셈블리된다. 본원에서 "키홀 림펫 헤모시아닌 모이어티" 또는 "KLH 모이어티"는 KLH1 (서열식별번호(SEQ ID NO.) 1) 또는 KLH2 (서열식별번호 2) 단백질 또는 이들과 실질적으로 동일한 단백질 또는 이들의 혼합물인 것으로 정의된다. 상기 문맥에서 실질적으로 동일하다는 것은 각각의 KLH 모이어티가 천연 야생형 KLH와 적어도, 대략 또는 정확히 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 77, 76 또는 75% 동일한 아미노 서열을 가짐을 의미한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 KLH는 증강된 면역원 활성, 특히 증강된 항-종양 활성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 중 KLH는 분자량이 대략 400,000인, 분해되지 않은 무손상 서브유닛을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 KLH는 보다 고차의 KLH 다량체를 포함한다.

특정 실시양태에서, 보다 고차의 KLH 다량체는 대략 8백만 내지 1천만의 분자량을 가지며, 침강 계수는 약 92-107S이다. 존재하는 보다 고차의 KLH 다량체의 양은 침강-평형 및/또는 침강-속도 초원심분리 분석에 기반한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 KLH는 증강된 면역원 활성, 특히 증강된 항-종양 활성을 나타낸다. 증강된 면역원 활성은 예를 들어, 비제한적으로 (a) KLH의 주사 (아주반트 부재), (b) 아주반트로서 사용되는 KLH, (c) 합텐 또는 약한 면역원성의 항원을 위한 담체 면역원으로서 사용되는 KLH, 및 (d) 항-종양 작용제로서 사용되는 KLH에 의해 관찰된다. 본 발명의 KLH 조성물은 방광, 유방, 난소 종양 등을 비제한적으로 포함하는, 수많은 종양에 대하여 증강된 항-종양 활성을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 2개의 KLH 모이어티가 KLH 단량체 사이의 공유 결합을 통해 이량체를 형성할 수 있다. 이론에 구애됨이 없이, KLH 모이어티 사이의 공유 결합은 디술피드 결합을 통한 것이라 생각된다. 특정 실시양태에서, 2개 이상의 KLH 모이어티는 KLH 단량체, 이량체, 삼량체 등 사이의 공유 결합을 통해 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체 등을 형성할 수 있다. 이론에 구애됨이 없이, KLH 모이어티 사이의 공유 결합은 디술피드 결합을 통한 것이라 생각된다.

직접적인 접합 및 이관능성 링커 기, 예컨대 4-(4-N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실 히드라지드 (MMCCH)를 이용하는 접합을 비롯하여, KLH 모이어티를 항원과 결합시키는 다양한 방법이 존재한다. 이러한 결합 기술이 미국 특허 6,544,952에 개시되어 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 치료 접합체를 제조하기 위해, 예를 들어 글로보 H 알릴 글리코시드가 오존분해에 의해 알데히드로 전환되고 알데히드 기가 크로스링커 MMCCH 상의 NH 기에 부착되어, 글로보 H-MMCCH를 제공하고; 담체 단백질 KLH가 티올화에 적용되어 KLH-SH를 생성하고; 티올화된 KLH 상의 술프히드릴 기가 그 후에 MMCCH 상의 말레이미드 기에 부착되어, 글로보 H-KLH 접합체를 생성한다.

한 실시양태에서, 글로보 H 알릴 글리코시드는 화학 합성을 통해 제조된다. 티올화 시약인, 2-이미노티올란 및 cGMP-등급 KLH 및 4-(4-N-말레이미도메틸)-시클로헥산-1-카르복실 히드라지드 (MMCCH) 링커가 또한 사용된다. 일부 실시양태에서, 하기 단계가 수행된다: (1) 글로보 H 알릴 글리코시드의 글로보 H-알데히드로의 전환; (2) 별도로, 글로보 H-알데히드와 MMCCH의 커플링에 의한 글로보 H-MMCCH의 제공; (3) KLH의 화학적 티올화; (4) 글로보 H-MMCCH와 티올화된 KLH의 접합; 및 (5) 글로보 H-KLH 당접합체 (OBI-822)의 정제. 글로보 H-KLH 서브유닛의 접합 경로가 도 2a에 도시되어 있다.

특정 실시양태에서, 글로보 H 모이어티 단백질과 KLH 모이어티의 접합 중에, 특정 실시양태에서의 KLH 모이어티 단백질은, 바람직하게는 글로보 H 모이어티 서브유닛의 해리 때문에 무손상 분자와 비교하여 분자량의 감소를 나타낸다. 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 접합 방법은 이전에 보고되지 않았던 KLH 서브유닛의 해리를 초래한다. 임의의 특정 이론에 구애됨이 없이, 본 발명의 글로보 H 모이어티-KLH 모이어티 서브유닛 접합체의 높은 당화 수준이 글로보 H 모이어티 사이의 수소 결합 형성을 초래하는 것으로 예상된다. 그러므로, 특정 실시양태에서, KLH 모이어티 서브유닛 사이의 반데르발스력 및 소수성 상호작용이 글로보 H 수소 결합에 의해 대체되고, 이는 KLH 모이어티 서브유닛의 분리를 유도한다. 접합 후에, 글로보 H 모이어티-KLH 모이어티 접합체의 KLH 모이어티 서브유닛은 바람직하게는 응집되어 새로운 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체 또는 이들의 임의의 조합을 형성한다. 그에 따른, 예상밖의 큰 에피토프비를 갖는 예시적인 치료적 글로보 H 모이어티-KLH 모이어티 접합체는 놀라운 예상밖의 우수한 면역원 속성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 글로보 H 모이어티는 KLH1 및 KLH2 상의 리신에 접합된다. 다른 실시양태에서, 글로보 H 모이어티는 KLH1 및 KLH2 상의 리신에 접합되지 않는다. 특정 실시양태에서, 글로보 H-접합된 리신 자리는 펩티드 맵핑 분석에서 보존되어 확인되며, 이는 글로보 H-KLH 당접합체 조성물이 그의 구조에 있어서 독특함을 시사한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 치료 조성물은 1개 이상의 KLH 모이어티 서브유닛을 포함하고, 여기서 적어도 1개의 이러한 서브유닛은 적어도, 대략 또는 정확히 1, 10, 100 또는 1000배로: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159 또는 160개 또는 그 초과의 글로보 H 모이어티와 접합된다.

본 발명자들은 질량 분광 분석법을 이용하여, 글로보 H 모이어티가 KLH의 리신 잔기에 접합됨을 발견하였다. 따라서, 특정 실시양태에서, 글로보 H 모이어티가 리신 잔기에 접합되는 것이 바람직하다.

한 실시양태에서, KLH 모이어티 서브유닛 당 정확히 또는 대략 총 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160개의 리신 잔기가 존재한다. 또 다른 실시양태에서, KLH 모이어티 서브유닛 당 정확히 또는 대략 150 또는 156개의 리신 잔기가 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 KLH 모이어티 서브유닛 상에 정확히 또는 대략 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 또는 110개의 리신 접합 자리가 글로보 H 모이어티와 결합하기 위해 이용가능하거나 또는 실제로 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 KLH 모이어티 서브유닛 상에 62, 66, 67, 68, 70, 72, 76, 86, 87, 88, 90, 92, 93, 100개의 이러한 리신 접합 자리가 존재한다. 리신 접합 자리는 글로보 H 모이어티 및/또는 글로보 H 모이어티와의 링커, 예컨대 MMCCH 링커와 결합하기 위해 이용가능하거나 또는 이들과 실제로 결합하는, KLH 모이어티에서의 리신 잔기이다.

모이어티 서브유닛 (예를 들어, KLH1 및 KLH2 또는 이들의 변이체)의 혼합물을 함유하는 특정한 치료적 실시양태에서, 이용가능한 총 리신 (상기 두 서브유닛 모두에 대해서)은 상이한 서브유닛 유형 전체에 대해서 함께 카운팅한 것이고, 그 개수가 정확히 또는 대략 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309 또는 310개일 수 있거나 또는 이러한 개수이다. 이러한 실시양태에서, 상이한 서브유닛 (예를 들어, KLH1 및 KLH2 또는 이들의 변이체) 전체에 대해서 함께 정확히 또는 대략 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159 또는 160개의 리신 접합 자리가 존재하거나 또는 존재할 수 있다. 다른 이러한 실시양태에서, 136, 137, 141, 140, 143, 147 또는 155개의 리신 접합 자리가 존재한다.

가장 바람직한 실시양태에서, KLH1/KLH2에서의 총 306개의 리신 잔기 중에서 136, 137, 140, 141, 143, 147 또는 155개의 리신 접합 자리가 존재한다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 치료 조성물은 KLH 모이어티 서브유닛-글로보 H 모이어티 접합체의 혼합물을 함유하고, 여기서 이러한 접합체는 단량체로 남아있거나 또는 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체 또는 이들의 임의의 조합을 형성한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 치료 조성물은 단리된 KLH 모이어티 서브유닛-글로보 H 모이어티 접합체 단량체, 이량체, 삼량체 또는 사량체, 또는 이들의 조합을 포함한다. 추가 실시양태에서, 본 발명의 치료 조성물은 KLH 모이어티 서브유닛-글로보 H 모이어티 접합체 이량체 및 삼량체만을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 치료 조성물은 적어도 2개의 KLH 모이어티 서브유닛을 함유하고, 여기서 2개의 KLH-모이어티 서브유닛은 각각 상이한 글리칸과 결합한다. KLH 모이어티 서브유닛과 결합가능한 다른 종양-연관 글리칸 항원은 GM2, GD2, GD3, 푸코실, GM1, sTn, 시알릴-루이스^x, 루이스^x, 시알릴 루이스^a, 루이스^a, sTn, TF, 폴리시알산, 루이스^y, 뮤신, T 항원 등을 포함할 수 있으나, 이들로 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 치료 조성물 중 KLH 모이어티 서브유닛의 단지 적어도 또는 대략 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100%가 글로보 H 모이어티와 결합하며, 치료 조성물 중의 나머지 KLH 모이어티 서브유닛은 다른 종양-연관 글리칸 항원과 결합한다.

본원에 개시된 치료 접합체와 관련하여, 본원에 사용된 "에피토프비"는 예를 들어, 치료 접합체에서의 항원 에피토프 대 담체 분자의 관계를 나타낸다. 바람직하게는, 상기 용어는 글로보 H 모이어티 대 KLH 모이어티의 관계를 나타낸다. 가장 바람직하게는, 치료 접합체의 에피토프비는 하기 식을 이용하여 계산된다 = (실제 글로보 H 모이어티 중량/글로보 H 모이어티 분자량)/(실제 KLH 모이어티 중량/KLH 모이어티 분자량)조합. 에피토프비는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정가능하다. 바람직하게는, 글로보 H의 중량은 예를 들어, 고성능 음이온 교환 크로마토그래피 및 펄스식 전류측정 검출 (HPAEC-PAD)에 의해 결정된다.

바람직하게는, 본 발명의 치료 접합체의 에피토프비는 대략, 적어도 또는 정확히: 1, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1025, 1050, 1075, 1100, 1125, 1150, 1175, 1200, 1225, 1250, 1275, 1300, 1325, 1350, 1375, 1400, 1425, 1450, 1475, 1500, 1525, 1550, 1575, 1600, 1625, 1650, 1675, 1700, 1725, 1750, 1775, 1800, 1825, 1850, 1875, 1900, 1925, 1950, 1975, 2000, 2025, 2050, 2075, 2100, 2125, 2150, 2175, 2200, 2225, 2250, 2275, 2300, 2325, 2350, 2375, 2400, 2425, 2450, 2475, 2500, 2525, 2550, 2575, 2600, 2625, 2650, 2675, 2700, 2725, 2750, 2775, 2800, 2825, 2850, 2875, 2900, 2925, 2950, 2975 또는 3000이다.

한 실시양태에서, 본 발명의 치료 조성물은 다양한 에피토프비를 갖는 치료 접합체의 혼합물을 포함한다. 한 실시양태에서, 치료 조성물 중 치료 접합체의 에피토프비의 범위, 평균 또는 중앙값은 약 10 내지 약 3200, 약 800 내지 약 2500, 약 1000 내지 약 2000, 약 1250 내지 약 1750, 또는 약 1400 내지 약 1600이다. 또 다른 실시양태에서, 치료 조성물 중 치료 접합체의 에피토프비의 범위, 평균 또는 중앙값은 약 10 내지 약 150, 약 40 내지 약 125, 약 50 내지 약 100, 약 62 내지 약 87, 또는 약 70 내지 약 80이다. 또 다른 실시양태에서, 치료 조성물 중 치료 접합체의 에피토프비의 범위, 평균 또는 중앙값은 약 20 내지 약 300, 약 80 내지 약 250, 약 100 내지 약 200, 약 125 내지 약 175, 또는 약 140 내지 약 160이다. 또 다른 실시양태에서, 치료 조성물 중 치료 접합체의 에피토프비의 범위, 평균 또는 중앙값은 약 30 내지 약 450, 약 120 내지 약 375, 약 150 내지 약 300, 약 185 내지 약 260, 또는 약 210 내지 약 240이다. 일부 제약 조성물에서 치료 접합체의 적어도 또는 대략 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98, 99, 또는 100%가 단량체로서 존재하거나, 또는 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체 또는 이들의 조합으로서 존재한다.

치료 접합체 에 대한 항체

특정한 예시 실시양태에서, 본 발명은 또한 친화도를 갖는 본원에 개시된 치료 접합체와 특이적으로 결합하는, 단리된 치료적 항체 뿐만 아니라, 증식성 질환의 치료 및/또는 진단에서의 그의 용도를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "항체" 및 "항체들" (면역글로불린)은 모노클로날 항체 (전장 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 적어도 2개의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이성 항체 (예를 들어, 이중특이성 항체), 인간 항체, 인간화 항체, 카멜화(camelised) 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fv (scFv), 단쇄 항체, 단일 도메인 항체, 도메인 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편, 디술피드-결합 Fv (sdFv), 및 항-유전자형 (항-Id) 항체 (예를 들어, 본 발명의 항체에 대한 항-Id 항체 포함), 인트라바디(intrabody), 및 상기 중 어느 하나의 에피토프-결합 단편을 포함한다. 특히, 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역 활성 단편, 즉 항원-결합 자리를 함유하는 분자를 포함한다. 면역글로불린 분자는 임의의 타입 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스의 것일 수 있다.

본원에 기재된 치료법(들)에 사용되는 에피토프, 예를 들어 치료 접합체의 글로보 H 모이어티에 대한 항체의 "친화도"는 관련 기술분야에서 널리 이해되고 있는 용어이며, 항체의 에피토프에 대한 결합 정도 또는 강도를 의미한다. 친화도는 평형 해리 상수 (KD 또는 Kd), 겉보기 평형 해리 상수 (KD' 또는 Kd'), 및 IC50 (경쟁 분석에서 50%의 억제를 발휘하는데 필요한 양)을 비제한적으로 포함하는, 관련 기술분야에 공지된 수많은 방식으로 측정 및/또는 표시될 수 있다. 본 발명의 목적상, 친화도는 에피토프와 결합하는 주어진 항체 집단에 대한 평균 친화도임이 이해된다. mL 당 IgG의 mg 또는 mg/mL 단위로 본원에 보고된 KD' 값은 혈청 1 mL 당 Ig의 mg을 나타내는 것이나, 혈장이 사용될 수도 있다. 항체 친화도가 본원에 기재된 치료 방법의 투여, 또는 본원에 기재된 치료 방법의 선택을 위한 기준으로서 사용되는 경우에, 항체 친화도는 치료 전 및/또는 치료 동안에 측정될 수 있고, 얻어진 값은 임상의에 의해 인간 환자가 치료법에 대한 적절한 후보자인지를 평가하는데 사용될 수 있다.

본원에 사용된 "특이적 결합"이라는 용어는 결합 짝 (예를 들어, 항체와 항원) 사이의 상호작용을 말한다. 다양한 경우에, 특이적 결합은 적어도 또는 대략 10-6 몰/리터, 대략 10-7 몰/리터, 또는 대략 10-8 몰/리터 또는 그 미만의 친화 상수에 의해 구현될 수 있다.

글로보 H에 대한 예시 항체는 목적하는 항체의 증가에 대하여 검사하는 면역화된 대상체의 체액, 예컨대 혈청을 수집함으로써, 또한 임의의 통상의 방법에 의해 혈액으로부터 혈청을 분리함으로써 제조될 수 있다.

항체는 일반적으로 관련 항원과 아주반트를 여러 번 주사함으로써 상승한다. 면역화된 종에서 면역원성을 갖는 단백질, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌에 관련 항원을 접합시키는 것이 유용할 수 있다.

항원에 의한 동물의 면역화 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 항원의 복강내 주사 또는 피하 주사가 포유동물의 면역화를 위한 표준 방법이다. 보다 구체적으로는, 항원이 적절한 양의 포스페이트 완충 염수 (PBS), 생리 염수 등에 희석되고 현탁될 수 있다. 필요에 따라, 항원 현탁액이 적절한 양의 아주반트와 혼합된 다음, 대상체에게 투여될 수 있다.

특정 실시양태에서, 대상체는 역가가 정체 상태를 유지할 때까지 적절한 양의 아주반트와 혼합된 항원을 여러 번 투여함으로써 증대될 수 있다. 적절한 담체가 또한 면역화를 위해 사용될 수 있다. 상기와 같이 면역화 후에, 혈청이 목적하는 항체 양의 증가에 대하여 임의의 방법에 의해 검사된다.

생물학적 분석법

한 실시양태에서, 환자에게 투여되었을 때, 본 발명의 치료 접합체를 함유하는 치료 조성물은 동일한 실험에서 투여 전의 동일한 항-글로보 H 항체 역가 (즉, 처리 전 기준선 역가)보다 적어도 또는 대략 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 50, 100, 250, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000, 또는 5000배 증가한 항-글로보 H 항체 역가를 유도할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항-글로보 H 항체는 IgM 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 항-글로보 H 항체는 IgG 항체이다.

본 발명의 치료 조성물은 대상체에서 체액성 반응과 세포성 반응을 둘다 유도할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 백신 조성물은 글로보 H 모이어티-특이적 IgG 및 IgM 항체의 생산, 및 B 세포 및 T 세포 (예를 들어, CD3⁺T 세포, CD4⁺T 세포 및/또는 CD8⁺T 세포)의 증식을 유도한다. 전형적으로, 이러한 면역 반응은 투여 후 시간순으로 발생한다. 특정한 예로, 투여 후에, B 세포 생산은 대략 제3일, 제4일, 제5일, 제6일, 제7일, 제8일, 제9일, 제10일, 제20일, 제30일, 또는 제60일에 나타나고, 그 후에 대략 제10일, 제20일, 제30일, 제60일, 또는 제90일에 IgG 및 IgM 항체의 생산이 이어지고, 대략 제24일, 제30일, 제40일, 제50일, 제60일, 제90일, 제120일, 제150일, 또는 제180일에 T 세포 생산이 후속된다. 본 발명의 백신 조성물은 장기적인 면역 방어 효과를 잠재적으로 제공하는데, 이는 소량의 암 세포 성장을 예방하므로, 질환 안정화 및 생존 개선을 달성하는데 있어서 미세 잔존 질환에 대하여 이상적이다.

"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 및 "ADCC"는 비-특이적 세포독성 세포 (예를 들어, 자연 살해 (NK) 세포, 호중구, 및 대식세포)가 표적 세포 상에 결합된 항체를 인식하고, 후속적으로 표적 세포의 용해를 초래하는 세포-매개 반응을 말한다. 한 실시양태에서, 이러한 세포는 인간 세포이다. 임의의 특정 작용 메카니즘에 구애됨이 없이, ADCC를 매개하는 이러한 세포독성 세포는 일반적으로 Fc 수용체 (FcR)를 발현한다. ADCC를 매개하는 1차 세포로서, NK 세포는 FcγRIII을 발현하고, 반면에 단핵구는 FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및/또는 FcγRIV를 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991)]에 요약되어 있다. 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 시험관내 ADCC 분석, 예컨대 미국 특허 5,500,362 또는 5,821,337에 개시된 분석이 수행될 수 있다. 이러한 분석을 위한 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 살해 (NK) 세포를 포함한다. 별법으로 또는 추가적으로, 본 발명의 치료 접합체의 ADCC 활성이 생체내에서, 예를 들어 동물 모델에서, 예컨대 문헌 [Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같이 평가될 수 있다.

특정 실시양태에서, 제약 조성물의 투여는 글로보 H와 특이적으로 결합하는 항체의 생성을 비롯하여, 면역 반응을 유발할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 암 세포의 표면 상에 발현된 1개 이상의 글로보H를 표적화하고 CDC 및/또는 ADCC를 촉발시켜 이들 세포를 사멸시키도록 발달된다. 특정 실시양태에서, 항체는 주로 IgG 항체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 면역원성 조성물은 주로 IgG1, IgG2b, IgG2c 및 IgG3을 유도한다.

"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체 활성화를 개시하고 보체의 존재 하에 표적을 용해시키는 치료 접합체의 능력을 말한다. 보체 활성화 경로는 보체 시스템의 제1 요소 (C1q)가, 동족 항원과 복합체를 형성한 분자 (예를 들어, 항체)와 결합함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santaro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996)]에 개시된 바와 같은 CDC 분석이 수행될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 환자에게 투여되었을 때, 본 발명의 치료 접합체를 함유하는 치료 조성물은 환자/대상체에서 글로보 H 양성 암 세포주, 예를 들어 MCF-7 세포와 특이적으로 결합하는 항-글로보 H 면역 혈청의 생산을 유도할 수 있다.

조합

치료 조성물은 다른 항암/항증식성 약물 뿐만 아니라, 아주반트 및 다른 면역조정 분자, 예컨대 시토카인 또는 케모카인을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 조합은 별도의 작용제/조성물의 공동-투여 또는 복합-제제일 수 있다. 이러한 작용제는 별도의 용기 또는 단일 용기에 넣어 함께 키트로 전달될 수 있다. 작용제는 투여 시에 또는 투여 전 적어도 또는 대략 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24분, 시간 또는 일에 조합될 수 있다.

아주반트는 다른 작용제의 효과를 변화시키는 약리적 또는 면역적 작용제이다. 이들은 주어진 항원에 대한 면역 반응을 증강시키는 무기 또는 유기 화학물질, 거대분자 또는 전체 암 세포 또는 그의 일부일 수 있다. 아주반트는 완전 및 불완전 프로인트 아주반트, 톨-유사 수용체 분자 및 그의 모방체, LPS, 지단백질, 지질펩티드, 플라젤린, 이중 가닥 RNA, 비메틸화 CpG 섬, 레바미솔, 칼메트-게랑 균, 옥트레오티드, 이소프리노신 및 자닥신, 박테리아 및 바이러스에 의해 전형적으로 방출되는 다양한 형태의 DNA 및 RNA, PD-1 길항제 및 CTLA 길항제를 포함한다. 한 실시양태에서, 아주반트는 사포닌 아주반트이다.

특정 실시양태에서, 사포닌 아주반트는 실질적으로 순수한 OBI-821 사포닌이다. 다른 실시양태에서, OBI-821 사포닌은 그의 생물학적 활성 단편이다. 아주반트는 또한 순수하지 않은 형태의 OBI-821 사포닌을 포함할 수 있다. 정제된 OBI-821 사포닌은 본원에 기재된 백신과 함께 투여되거나 또는 다른 실질적으로 순수한 사포닌 또는 비-사포닌 아주반트와 혼합되었을 때 증강된 아주반트 효과를 나타낸다.

OBI-821 사포닌은 퀼라자 사포나리아 몰리나 나무(Quillaja saponaria Molina tree) 껍질로부터, 예를 들어 미국 특허 5,057,540 및 미국 특허 6,524,584에 개시된 바와 같이 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC), 저압 액체 실리카 크로마토그래피, 및 친수성 상호작용 크로마토그래피 (HILIC)에 의해 높은 순도로 추출되는 천연 글리코시드이며, 상기 특허의 내용은 그 전문이 참조로 포함된다. 고압 액체 크로마토그래피 분석은, OBI-821이 구조적으로 관련된 이성질체 화합물의 혼합물임을 보여준다. OBI-821 사포닌의 정제된 상이한 이성질체 화합물이 동정되고 본원에 기재된다.

특정 실시양태에서, OBI-821 사포닌은 하기와 같은 화학식 I의 적어도 1종의 단리된 화합물을 포함한다:

<화학식 I>

상기 식에서,

R1은 β-D-아피오스 또는 β-D-크실로스이고;

R2 및 R3은 독립적으로 H, 알킬,

(화합물 1989에 대한 지방 아실 모이어티), 또는

(화합물 1857에 대한 지방 아실 모이어티)이다.

OBI-821 사포닌은 또한

(i) R¹이 β-D-아피오스이고, R²가 상기에 도시된 1989 화합물에 대한 지방 아실 모이어티이며, R³이 H이거나 (1989 화합물 V1A);

(ii) R¹이 β-D-아피오스이고, R²가 H이며, R³이 상기에 도시된 1989 화합물에 대한 지방 아실 모이어티이거나 (1989 화합물 V1B);

(iii) R¹이 β-D-크실로스이고, R²가 상기에 도시된 1989 화합물에 대한 지방 아실 모이어티이며, R³이 H이거나 (1989 화합물 V2A); 또는

(iv) R¹이 β-D-크실로스이고, R²가 H이며, R³이 상기에 도시된 1989 화합물에 대한 지방 아실 모이어티인 (1989 화합물 V2B), 화학식 I의 단리된 화합물을 포함할 수 있다. 집합적으로, 1989 화합물 V1A, 1989 화합물 V1B, 1989 화합물 V2A 및 1989 화합물 V2B를 "1989 화합물 혼합물"이라 한다.

표 1에 1989 화합물의 관능기 및 1857 화합물 혼합물 중의 각각의 1857 화합물의 몰%가 요약되어 있다.

<표 1>

OBI-821 사포닌은

(i) R¹이 β-D-아피오스이고, R²가 상기에 도시된 1857 화합물에 대한 지방 아실 모이어티이며, R³이 H이거나 (1857 화합물 V1A);

(ii) R¹이 β-D-아피오스이고, R²가 H이며, R³이 상기에 도시된 1857 화합물에 대한 지방 아실 모이어티이거나 (1857 화합물 V1B);

(iii) R¹이 β-D-크실로스이고, R²가 상기에 도시된 1857 화합물에 대한 지방 아실 모이어티이며, R³이 H이거나 (1857 화합물 V2A); 또는

(iv) R¹이 β-D-크실로스이고, R²가 H이며, R³이 상기에 도시된 1857 화합물에 대한 지방 아실 모이어티인 (1857 화합물 V2B), 화학식 I의 단리된 화합물을 포함할 수 있다. 집합적으로, 1857 화합물 V1A, 1857 화합물 V1B, 1857 화합물 V2A 및 1857 화합물 V2B를 "1857 화합물 혼합물"이라 한다.

표 2에 1857 화합물의 관능기 및 1857 화합물 혼합물 중의 각각의 1857 화합물의 몰%가 요약되어 있다 (HPLC).

<표 2>

OBI-821 사포닌은 하기 화합물 중 1종 이상을 포함한다:

(i) 1857 화합물 V1A;

(ii) 1857 화합물 V1B;

(iii) 1857 화합물 V2A;

(iv) 1857 화합물 V2B;

(v) 1989 화합물 V1A;

(vi) 1989 화합물 V1B;

(vii) 1989 화합물 V2A; 또는

(viii) 1989 화합물 V2B.

OBI-821 사포닌 중 1857 화합물 혼합물 및 1989 화합물 혼합물의 백분율은 하기와 같은 범위일 수 있다:

(i) 1857 화합물 혼합물을 포함하는 OBI-821 약 1 몰% 내지 약 15 몰%; 및

(ii) 1989 화합물 혼합물을 포함하는 OBI-821 약 85 몰% 내지 약 99 몰%.

모든 몰%는 0.1%의 증분으로 달라질 수 있다 (예를 들어, 약 87% 내지 약 90%, 약 90.5% 내지 약 97%, 약 3.5% 내지 약 11%, 약 10% 내지 약 14%).

1989 화합물 혼합물은 약 60-70 몰%의 1989 화합물 V1A; 약 1-5 몰%의 1989 화합물 V1B; 약 30-40 몰%의 1989 화합물 V2A; 및 약 0.1-3 몰%의 1989 화합물 V2B를 포함할 수 있다. 모든 몰%는 0.1의 증분으로 달라질 수 있다 (예를 들어, 65%, 2.5%, 35.6%).

1857 화합물 혼합물은 약 60-70 몰%의 1857 화합물 V1A; 약 1-5 몰%의 1857 화합물 V1B; 약 30-40 몰%의 1857 화합물 V2A; 및 약 0.1-3 몰%의 1857 화합물 V2B를 포함할 수 있다. 모든 몰%는 0.1의 증분으로 달라질 수 있다 (예를 들어, 65%, 2.5%, 35.6%).

또 다른 실시양태에서, 실질적으로 순수한 OBI-821은 조질 퀼라자 사포나리아 추출물로부터 정제되고, 여기서 상기 OBI-821은 11분 동안 1 ml/분의 유량으로 A:B 95%:5% → 75%:25%의 이동상을 포함하는 용리 프로그램을 가지며, 여기서 이동상 A는 0.1% 트리플루오로아세트산이 함유된 증류수이고, 이동상 B는 0.1 % 트리플루오로아세트산이 함유된 아세토니트릴인, 5 um의 입자 크기, 100 Å의 기공, 4.6 mm의 ID x 25 cm의 L을 갖는 시메트리(Symmetry) C18 컬럼 상의 역상-HPLC로 분석하였을 때, 크로마토그램의 용매 피크를 제외한 모든 피크의 총 면적의 90% 이상을 차지하는 단일 우세 피크를 특징으로 한다.

한 실시양태에서, 제약 조성물은 화학식 I의 화합물 및 제약상 허용되는 담체를 포함한다.

<화학식 I>

상기 식에서,

R¹은 β-D-아피오스 또는 β-D-크실로스이고;

R² 및 R³은 독립적으로 H, 알킬, 또는

(1857 화합물에 대한 지방 아실 모이어티)이다.

백신은 탄수화물 항원 또는 그의 면역원성 단편 및 OBI-821 사포닌을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 백신은 탄수화물 항원 또는 그의 면역원성 단편; 담체 단백질 및 OBI-821 사포닌을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 백신은 글로보 H로부터 선택된 탄수화물 항원, KLH 및 OBI-821 사포닌을 포함한다. 담체 단백질의 비제한적 예는 KLH를 포함한다.

용어 "a-갈락토실-세라미드" 및 "a-GalCer"은 미국 특허 8,268,969에 개시된 바와 같이, 자연 살해 T 세포를 자극하여 T 헬퍼 1 (TH1)과 TH2 시토카인을 모두 생산하는 당지질을 말하고, 상기 특허의 내용은 그 전문이 참조로 포함된다. 특정 실시양태에서, OBI-834 (C34로서 공지됨) 아주반트는 하기 예시 구조에 의해 특징화된다:

본원에 사용된 용어 "시토카인"은 전구 세포가 특유의 분화된 세포 유형이 되는, 유전자 발현에서의 변화를 보통 포함하는 면역 세포 분화 과정에 영향을 주어 면역 반응의 강도 및 지속기간을 조절하는 다수의 소형 분비 단백질 중 어느 하나를 지칭한다. 시토카인은 그의 추정되는 기능, 분비 세포, 또는 작용 표적에 근거하여, 림포카인, 인터류킨 및 케모카인으로서 다양하게 명명된다. 예를 들어, 일부 일반적인 인터류킨은 IL-2, IL-12, IL-18, IL-2, IFN-γ, TNF, IL-4, IL-10, IL-13, IL-21, GM-CSF, 및 TGF-β를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다.

본원에 사용된 용어 "케모카인"은 림프구의 동원 및 활성화 수단을 제공하는, 감염 부위에서 방출되는 다양한 소형 화학주성 시토카인 중 어느 하나를 지칭한다. 케모카인은 감염 부위로 백혈구를 유인한다. 케모카인은 보존된 시스테인 잔기를 가져, 그에 따라 4개의 그룹으로 지정된다. 대표적인 케모카인에 의하면 이들 그룹은 C-C 케모카인 (RANTES, MCP-1, MIP-1α 및 MIP-1β), C-X-C 케모카인 (IL-8), C 케모카인 (림포탁틴), 및 CXXXC 케모카인 (프랙탈카인)이다.

본 발명의 치료 조성물은 PD-1/PD-L1 억제제 (세포독성 T 세포 림프구 (CTL) 면역요법제), CTLA-4 면역요법제, CDK4/6 억제제 (표적 요법제), PI3K 억제제 (표적 요법제), mTOR 억제제 (표적 요법제), AKT 억제제 (표적 요법제), Pan-Her 억제제 (표적 요법제)를 추가로 포함할 수 있다. 이들 억제제는 개질되어 각각의 모노클로날 항체를 또한 생성할 수 있다. 이러한 항체가 본 발명의 치료 조성물에 포함될 수 있다.

치료 조성물은 다른 항암/항증식성 또는 화학요법 작용제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 작용제의 예는 문헌 [Cancer Principles and Practice of Oncology by V.T. Devita and S. Hellman (editors), 6th edition (February 15, 2001), Lippincott Williams & Wilkins Publishers]에서 확인된다. 이러한 항암 작용제는 하기를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다: 호르몬 요법제 (예를 들어, 선택적 에스트로겐 수용체 조정제, 안드로겐 수용체 조정제), 모노클로날 항체 요법제, 화학요법제, 레티노이드 수용체 조정제, 세포독성/세포증식억제 작용제, 항신생물제, 항증식제, 프레닐-단백질 전이효소 억제제, HMG-CoA 환원효소 억제제, 질소 머스타드, 니트로소 우레아, 혈관신생 억제제 (예를 들어, 베바시주맙), 세포 증식 및 생존 신호전달 경로의 억제제, 아폽토시스 유도제, 세포 주기 체크포인트를 방해하는 작용제, 수용체 티로신 키나제 (RTK)를 방해하는 작용제, 포유류 라파마이신 표적 (mTOR) 억제제, 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2) 억제제, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 억제제, 인테그린 차단제, NSAID, PPAR 효능제, 내재적 다중약물 내성 (MDR)의 억제제, 구토방지제, 빈혈 치료에 유용한 작용제, 호중구 감소증 치료에 유용한 작용제, 면역-증강 약물, 비포스포네이트, 방향화효소 억제제, 신생 세포의 최종 분화를 유도하는 작용제, γ-세크레타제 억제제, 암 백신, 및 이들의 임의의 조합.

본 발명의 제제

치료 조성물 (본원에서 제약 조성물이라고도 함)은 일반적으로 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "제약상 허용되는 담체"는 제약 투여와 상용성인, 용매, 분산 매체, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 보충의 화성 화합물이 또한 조성물에 혼입될 수 있다. 제약 조성물은 그의 의도하는 투여 경로와 상용성이도록 제제화된다. 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들어 정맥내, 피내, 피하, 근육내, 동맥내, 경구 (예를 들어, 흡입), 경피 (국소), 경점막, 및 직장 투여를 포함한다. 비경구, 피내 또는 피하 적용을 위해 사용되는 용액 또는 현탁액은 하기 요소를 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예컨대 주사용수, 염수 용액, 포스페이트 완충 염수, 트리스-완충 염수, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 또는 다른 합성 용매; 항박테리아제, 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 소듐 비술파이트; 킬레이트제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제, 예컨대 아세테이트, 시트레이트, 또는 포스페이트, 및 장성 조정제, 예컨대 소듐 클로라이드 또는 덱스트로스. pH 값은 산 또는 염기, 예컨대 염산 또는 소듐 히드록시드로 조정가능하다. 비경구 제제는 앰플, 일회용 주사기, 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다회 용량 바이알에 밀봉될 수 있다.

주사용으로 적합한 제약 조성물은 멸균 수용액 (수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 조제를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여에 적합한 담체는 생리 염수, 정균수, 크레모포어(Cremophor) EL® (바스프(BASF), 미국 뉴저지주 팔시파니 소재), 또는 포스페이트 완충 염수 (PBS)를 포함한다. 모든 경우에, 조성물은 멸균성이어야 하며, 용이한 주사성이 존재할 정도로 유동성이어야 한다. 조성물은 제조 및 보관 조건 하에 안정해야 하며, 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용으로부터 보호되어야 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매체일 수 있다. 적절한 유동성이 예를 들어, 코팅제, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에는 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 또한 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 여러 경우에, 조성물에 등장화제, 예를 들어 당류, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 솔비톨 또는 소듐 클로라이드를 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 조성물에 흡수 지연제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 발생할 수 있다.

멸균 주사용 용액은 요구되는 양의 활성 화합물을, 필요에 따라 상기 열거된 성분 중 어느 하나 또는 이들의 조합과 함께 적절한 용매에 혼입시킨 다음, 여과 멸균하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 염기성 분산 매체 및 상기 열거된 것들 중 요구되는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사용 용액의 조제를 위한 멸균 분말의 경우에는, 제조 방법은 이미 멸균-여과된 용액으로부터의 진공 건조 및 동결-건조를 포함하여, 활성 성분과 임의의 추가적인 목적하는 성분의 분말을 제공한다.

경구 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 치료적 경구 투여를 위해, 활성 화합물은 부형제와 함께 혼입되어, 정제, 트로키제 또는 캡슐제, 예를 들어 젤라틴 캡슐제 형태로 사용될 수 있다. 경구 조성물은 또한 구강세정제로 사용되는 유동성 담체를 사용하여 제조할 수 있다. 제약상 상용성인 결합제, 또는 아주반트 물질이 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 정제, 환제, 캡슐제, 트로키제 등은 하기 성분 및 유사한 성질의 화합물 중 어느 하나를 함유할 수 있다: 결합제, 예컨대 미정질 셀룰로스, 검 트라가칸트 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대 전분 또는 락토스, 붕해제, 예컨대 알긴산, 프리모젤(Primogel), 또는 옥수수 전분; 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로테스(sterotes); 활택제, 예컨대 콜로이드성 실리콘 디옥시드; 감미제, 예컨대 수크로스 또는 사카린; 또는 향미제, 예컨대 페퍼민트, 메틸 살리실레이트, 또는 오렌지향 향미제.

추가로, 경구 투여를 위한 본 발명의 제제는 제약상 허용되는 부형제, 예컨대 결합제 (예를 들어, 전호화 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로스); 충전제 (예를 들어, 락토스, 미정질 셀룰로스 또는 인산수소칼슘); 윤활제 (예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 활석 또는 실리카); 붕해제 (예를 들어, 감자 전분 또는 전분 글리콜산 나트륨); 또는 습윤제 (예를 들어, 소듐 라우릴 술페이트)를 이용하여 통상의 수단에 의해 제조된, 예를 들어 정제 또는 캡슐제의 형태를 취할 수 있다. 정제는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 방법에 의해 코팅될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한, 예를 들어 폴리-글리콜산/락트산 (PGLA)으로부터 가공된 미소구체 또는 마이크로캡슐에 도입될 수 있다 (미국 특허 5,814,344; 5,100,669 및 4,849,222; PCT 공보 WO 95/11010 및 WO 93/07861 참조). 경구 투여를 위한 액체 제제는 예를 들어, 용액, 시럽, 유화액 또는 현탁액의 형태를 취할 수 있거나, 또는 사용 전에 물 또는 다른 적합한 비히클로 재구성되는 건조한 제품으로서 제공될 수 있다. 이러한 액체 제제는 제약상 허용되는 첨가제, 예컨대 현탁제 (예를 들어, 소르비톨 시럽, 셀룰로스 유도체 또는 수소화된 식용 지방); 유화제 (예를 들어, 레시틴 또는 아카시아); 비-수성 비히클 (예를 들어, 아몬드유, 유성 에스테르, 에틸 알콜 또는 분별화 식물유); 및 보존제 (예를 들어, 메틸 또는 프로필-p-히드록시벤조에이트 또는 소르브산)를 이용하여 통상의 수단에 의해 제조될 수 있다. 제제는 또한 필요에 따라 완충 염, 향미제, 착색제 및 감미제를 함유할 수 있다. 경구 투여를 위한 제제는 활성 화합물의 제어 방출을 제공하도록 적합하게 제제화될 수 있다.

흡입에 의한 투여를 위해, 화합물은 적합한 추진제, 예를 들어 이산화탄소와 같은 가스를 함유하는 가압 용기 또는 분배기, 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이의 형태로 전달된다.

전신성 투여는 또한 경점막 또는 경피를 통한 것일 수 있다. 경점막 또는 경피 투여의 경우에, 침투시켜야 할 장벽에 적절한 침투제가 제형에 사용된다. 이러한 침투제는 관련 기술분야에 일반적으로 공지되어 있으며, 예를 들어 경점막 투여의 경우에는 디터전트, 담즙염 및 푸시딘산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 코 스프레이 또는 좌약의 사용을 통해 수행될 수 있다. 경피 투여의 경우에, 활성 화합물은 관련 기술분야에 일반적으로 공지되어 있는 바와 같이 연고, 고약, 젤 또는 크림으로 제제화된다. 화합물은 또한 직장 전달을 위해 좌약 (예를 들어, 통상의 좌약 베이스, 예컨대 코코아 버터 및 다른 글리리드 이용) 또는 관장약의 형태로 제조될 수 있다.

실행에 따라, 활성 화합물은 화합물이 체내에서 급속 제거되는 것을 방지할 담체를 이용하여, 예컨대 이식물 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 조절 방출 제제로 제조된다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리산 무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제제의 제조 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 물질은 또한 시판되는 것일 수 있다. 리포솜 현탁액 (세포-특이적 항원에 대한 모노클로날 항체를 갖는 감염 세포에 표적화된 리포솜 포함)이 또한 제약상 허용되는 담체로서 사용될 수 있다. 이들은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있는 방법에 따라, 예를 들어 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 4,522,811에 개시된 바와 같이 제조될 수 있다.

경구 또는 비경구 조성물을 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 단위 투여 형태로 제제화하는 것이 유리하다. 본원에 사용된 단위 투여 형태는 치료하려는 대상체에 대하여 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 말하는 것으로; 각각의 단위는 요구되는 제약 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 유발하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 화합물을 함유한다.

본 발명의 면역원성 제제는 비경구적으로, 즉 정맥내 (i.v.), 피하 (s.c.), 복강내 (i.p.), 근육내 (i.m.), 진피하 (s.d.), 또는 피내 (i.d.) 투여에 의해, 예를 들어 볼루스 주사, 연속 주입, 또는 유전자총 (예를 들어, 벡터 백신, 예컨대 네이키드(naked) DNA 또는 RNA를 대상체에게 투여함)을 통한 직접 주사에 의해 전달될 수 있다. 주사용 제제는 단위 투여 형태, 예를 들어 앰플 또는 다회-용량 용기에, 첨가된 보존제와 함께 제공될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 부형제, 현탁액, 용액 또는 유화액과 같은 형태를 취할 수 있으며, 제제 작용제, 예컨대 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 별법으로, 활성 성분은 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어 멸균 발열물질 제거수로 재구성되는 분말 형태일 수 있다.

본 발명은 또한 다양한 점막 백신접종 전략도 고려한다.

투여 형태

이러한 치료 조성물의 독성 및 치료적 효능은, 예를 들어 LD₅₀ (집단의 50%에 치명적인 투여량) 및 ED₅₀ (집단의 50%에서 치료적으로 유효한 투여량)을 결정하기 위한 세포 배양물 또는 실험용 동물에서의 표준 제약 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성과 치료적 효과 사이의 투여량비가 치료 지수이며, 이는 LD₅₀/ED₅₀의 비율로서 표시될 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 치료 조성물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 화합물이 사용될 수 있지만, 이러한 화합물을 환부 부위에 대하여 표적화하여, 감염되지 않은 세포에 대한 잠재적인 손상을 최소화함으로써 부작용을 감소시키는 전달 시스템을 신중하게 고안해야 한다.

세포 배양물 분석 및 동물 연구로부터 얻어진 데이터는 인간에게 사용하기 위한 투여량 범위를 설정하는데 사용될 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 바람직하게는 독성 없이 또는 거의 독성 없이 ED₅₀을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 포함된다. 투여량은 사용되는 투여 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 상기 범위 내에서 달라질 수 있다. 본 개시내용의 방법에 사용되는 임의의 화합물에 대하여, 치료 유효 투여량은 세포 배양물 분석으로부터 초기에 추정될 수 있다. 세포 배양물에서 결정된 IC₅₀ (즉, 증상의 최대 억제의 절반을 달성하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하는 투여량이 동물 모델에서 설정될 수 있다. 이러한 정보는 인간에서 유용한 투여량을 보다 정확하게 결정하는데 사용될 수 있다. 혈장 중의 수준은 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.

개시된 조성물에서, 항원과 아주반트는 둘다 면역 유효량으로 존재한다. 각각의 특정 항원에 대하여, 최적의 면역 유효량이 실험에 의해 결정되어야 한다 (주어진 환자 및/또는 치료법 유형의 특별한 특징이 고려됨). 일반적으로, 그 양은 체중 kg 당 0.01 ㎍-250 mg 범위의 항원이다. 본 발명의 특정한 예시 아주반트에 대하여, 면역 유효량은 체중 kg 당 10-250 ㎍ 범위의 아주반트일 수 있다.

일부 실시양태에서, 치료 조성물의 치료 유효량 (즉, 유효 투여량)은 약 0.001 ㎍/kg 내지 약 250 g/kg, 0.01 ㎍/kg 내지 10 g/kg, 또는 0.1 ㎍/kg 내지 1 g/kg의 범위, 또는 대략 또는 적어도: 0.001, 0.002, 0.003, 0.004, 0.005, 0.006, 0.007, 0.008, 0.009; 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09; 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 또는 250 그램 또는 마이크로그램/환자 체중 (킬로그램), 또는 본원에 나열된 임의의 수치 사이의 임의의 범위, 또는 과도한 실험 없이 기술자에게 자명하고 이해될 다른 범위일 수 있다. 통상의 기술자라면, 질환 또는 장애의 중증도, 선행 치료법, 대상체의 일반적인 건강상태 또는 연령, 및 존재하는 다른 질환을 비제한적으로 포함하는, 특정 인자가 대상체를 효과적으로 치료하는데 요구되는 투여량 및 시기에 영향을 미칠 수 있음을 알 것이다.

다른 실시양태에서, 치료 조성물 중 글로보-H 모이어티의 치료 유효량 (즉, 유효 투여량)은 약 0.001 ㎍/kg 내지 약 250 g/kg, 0.01 ㎍/kg 내지 10 g/kg, 또는 0.1 ㎍/kg 내지 1 g/kg의 범위, 또는 대략 또는 적어도: 0.001, 0.002, 0.003, 0.004, 0.005, 0.006, 0.007, 0.008, 0.009; 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09; 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 또는 250 그램 또는 마이크로그램/환자 체중 (킬로그램), 또는 본원에 나열된 임의의 수치 사이의 임의의 범위, 또는 과도한 실험 없이 기술자에게 자명하고 이해될 다른 범위일 수 있다. 통상의 기술자라면, 질환 또는 장애의 중증도, 선행 치료법, 대상체의 일반적인 건강상태 또는 연령, 및 존재하는 다른 질환을 비제한적으로 포함하는, 특정 인자가 대상체를 효과적으로 치료하는데 요구되는 투여량 및 시기에 영향을 미칠 수 있음을 알 것이다.

특정 실시양태에서, 본원에 개시된 치료 조성물은 적어도 1종의 치료 접합체 또는 치료적 항체를 함유하거나 또는 그와 연관되므로, 적어도 1종의 치료 접합체 또는 치료적 항체가 각각 매회 투여량 당 10^-9, 10^-8, 10^-7, 10^-7, 10^-6, 10^-5, 10^-4, 10^-3, 10^-2, 10^-1 몰로, 대략, 적어도: 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99, 또는 이들 초과의 농도로 단회 투여량에 존재한다. 바람직하게는, 치료 접합체는 약: 1-100, 2-60, 3-50, 4-40, 5-30, 6-20, 7-15, 8-10, 2-18, 3-16, 4-14, 5-12, 6-10 또는 7-8 μM의 농도로, 또는 본원에 나열된 임의의 수치 사이의 임의의 범위로 단회 투여량에 존재한다.

일부 실시양태에서, 본원에 개시된 치료 조성물은 적어도 1종의 치료 접합체 또는 치료적 항체를 함유하거나 또는 그와 연관되므로, 적어도 1종의 치료 접합체 또는 치료적 항체가 각각 매회 10^-3, 10^-2, 10^-1, 또는 10 마이크로그램으로, 대략, 적어도: 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99, 또는 이들 초과의 농도로 단회 투여량에 존재한다. 특정 실시양태에서, 투여량 당 대략 또는 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 250 또는 그 초과의 마이크로그램의 1종의 치료 접합체 또는 치료적 항체가 포함된다.

특정 실시양태에서, 본원에 개시된 치료 조성물은 대략 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24일, 주, 개월, 또는 년, 또는 이들 초과의 기간에 걸쳐서, 1일, 1주 또는 1개월 당 대략 또는 적어도: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24회 또는 그 초과의 횟수로 투여량이 투여된다.

유효 투여량 및 안전성 평가

본 발명의 방법에 따라서, 본원에 기재된 제약 및 백신 조성물은, 바람직하게는 최소한의 독성을 나타내는 면역 유효 투여량으로 환자에게 투여된다. "정의" 단락에 언급된 바와 같이, 개시된 제제의 "면역 유효 투여량" 또는 "치료 유효 투여량"은 치료하는 대상체에서 유효한 면역 반응을 유발하는데 충분하여, 상기 대상체에서 건강에 좋은 이점을 초래하는데 충분한 항원 및/또는 아주반트의 양을 말한다.

키트

또 다른 측면에 따라서, 1개 이상의 부분의 키트가 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 구상될 수 있으며, 부분의 키트는 본원에 개시된 방법 중 적어도 하나를 수행하고, 1개 이상의 치료 접합체, 항암/항증식성 작용제, 아주반트, 시토카인 및/또는 케모카인을 포함한다. 치료 조성물은 상기에 언급된 방법 중 적어도 하나에 따라 본원에 개시된 치료 조성물의 유효량을 단독으로 또는 조합하여 포함한다. 상기에 언급된 작용제는 키트 내의 단일 용기에 또는 상이한 용기에 넣을 수 있다.

필요에 따라, 조성물은 활성 성분 (즉, 항원 및/또는 스핑고당지질 (GSL)-함유 아주반트)을 함유하는 1개 이상의 단위 투여 형태를 함유할 수 있는 팩 또는 분배기 장치로 제공될 수 있다. 팩은 예를 들어, 금속 또는 플라스틱 호일, 예컨대 블리스터 팩을 포함할 수 있다. 팩 또는 분배기 장치는 투여 설명서가 동반될 수 있다. 상용성 제약 담체 중에 제제화된 본 발명의 조성물은 또한 제조되어, 적절한 용기에 넣어지고, 지시된 조건의 치료법에 대하여 라벨링될 수 있다.

키트는 또한 생물학적 사건의 식별체, 또는 본 개시내용을 정독하였을 때 통상의 기술자가 알 수 있는 다른 화합물을 포함하는 것도 가능하다. 키트는 또한 본원에 개시된 치료 조성물의 유효량을 포함하는 적어도 1종의 조성물을 포함할 수 있다. 키트의 치료 조성물은 관련 기술분야의 통상의 기술자가 알 수 있는 절차에 따라 본원에 개시된 적어도 하나의 방법을 수행한다.

본 개시내용은 또한 본원에 개시된 치료 조성물을 사용하여 증식성 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 암, 예를 들어 유방암의 치료를 포함한다. 상기 방법은 일반적으로 본원에 개시된 치료 조성물을 증식성 장애를 치료하는 유효량으로 치료를 필요로 하는 환자에게 제공하는 것을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 치료 조성물은 그를 필요로 하는 대상체 (예를 들어, 유방암과 같은 암에 걸린 대상체)에게, 평균적으로 무진행 생존기간 또는 전체 생존기간을 대조 위약, 예를 들어 포스페이트 완충 염수 위약에 비해, 대략 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40일, 주, 개월, 또는 년 연장시키는 방법으로 투여된다.

일부 실시양태에서, 치료 조성물은 허용되지 않는 독성 또는 질환 진행의 부재 하에 0-2, 6, 14, 및 26주에 피하로 제공된다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 치료 조성물은 그를 필요로 하는 대상체 (예를 들어, 유방암과 같은 암에 걸린 대상체)에게, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40일, 주, 개월, 또는 년에 걸쳐서 평균적으로 환자에서의 종양 부피를 대조 위약, 예를 들어 포스페이트 완충 염수 위약에 비해, 대략 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 74, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 또는 그 초과의 백분율로 수축시키는 방법으로 투여된다.

일부 실시양태에서, 종양 부피는 CT 스캔 (CT 스캔 슬라이스 두께는 2.5 mm 내지 5 mm인 것이 권장됨)에 의해 10 mm의 최소 크기까지 적어도 하나의 치수 (측정면에서의 최장 직경이 기록되어야 함)가 정확하게 측정될 수 있다.

본 발명의 조성물의 합성 방법

본 발명의 치료 조성물의 글로보 H 육당류 부분은 알릴 글리코시드로서 화학 합성된 다음, KLH와의 접합을 위해 준비된다.

하나의 예시 실시양태에서, 글로보 H의 화학 합성은 하기의 일반적인 단계를 포함한다:

KLH는 수성 완충액 중에서 2-이미노티올란으로 처리된다. 티올화된 KLH는 이어서 세파덱스(Sephadex) G-15 컬럼의 크기 배제 컬럼을 통해 미반응 2-이미노티올란으로부터 단리된다. 티올화된 KLH는 불활성 가스 (질소 또는 아르곤) 분위기 하에 보관되고 글로보 H-MMCCH와의 접합을 위해 즉각적으로 사용된다.

실시예

실시예 1: 본 발명의 당접합체 (글로보 H-KLH)의 제조

글로보 H 알릴 글리코시드 (시판되고 있음)를 오존분해에 의해 알데히드로 전환시켰다. 글로보 H 알데히드를 MMCCH 링커 및 NaCNBH₃와 반응시켜 글로보 H-MMCCH를 제공하였다. 혼합물을 컬럼으로 정제하여 글로보 H-MMCCH를 수득하였다. 글로보 H-MMCCH 양성 분획을 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 확인한 다음, 함께 풀링하였다. KLH를 티올화 완충액에 용해시키고, 2-이미노티올란을 반응물에 나누어 첨가하였다. 반응이 완료되도록 인큐베이션한 다음, KLH-SH를 컬럼에 의해 정제하였다. 글로보 H-MMCCH와 KLH-SH를 합쳤다. 반응이 완료되도록 교반하였다. 그 후에 글로보 H-KLH 당접합체를 정제하여 최종 생성물을 제공하였다.

실시예 2: 당접합체 중의 글로보 H 대 KLH의 중량비 분석

제조된 당접합체 중의 글로보 H와 KLH의 중량비를 고성능 음이온 교환 크로마토그래피와 펄스식 전류측정 검출 (HPAEC-PAD)에 의해 확인하였다. 결과가 표 3에 나타나 있다.

<표 3>

당접합체 중의 글로보 H와 KLH의 중량비

실시예 3: 당접합체 중의 글로보 H 대 KLH의 에피토프비 분석

KLH 이십량체 (천연 응집 형태)의 분자량은 문헌, 예컨대 문헌 [Micron 30 (1999) 597-623]에 개시된 바와 같이, 대략 7.5 MDa 내지 8.6 MDa이다. 천연 KLH는 크기 배제 크로마토그래피 및 다각도 레이저 산란 분광법 (MALS)에 의해, 대략 8.6 MDa의 분자량을 갖는 것으로 확인되었다 (도 3 참조).

KLH 및 글로보 H-KLH 당접합체 (OBI-822, 로트 번호 14001)의 질량 분포가 다각도 레이저 산란 분광계를 사용하는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC-MALS)에 의해 추정되고 유도되었다. 분자량을 단백질 함량에 기반하여 계산하였다 (ε=1.39) (도 4 참조). 도 4a에서, KLH의 이십량체 (n=20) 및 멀티-데카머(multi-decamer) (n>20)가 관찰되었다. 도 4b는 이십량체의 피크 면적이 74.3%이고 멀티-데카머의 피크 면적이 25.7%임을 보여주었다. 도 4c에서, 글로보 H-KLH 당접합체 (OBI-822)의 단량체 내지 육량체 (n=1-6) 및 다량체 (n>7-20)가 관찰되었다. 도 4d는 단량체 내지 육량체 (n=1-6)의 피크 면적이 주요 요소 (>97%)이고 다량체 (n>7-20)는 단지 소량으로만 (2.2%) 존재함을 보여주었다. KLH 및 OBI-822 올리고머의 질량 분포 분석에 관한 요약이 표 4에 나타나 있다.

<표 4>

KLH 및 OBI-822 올리고머의 질량 분포 분석에 관한 요약

*MW 시작/끝: 분자량 (MW) 범위 (kDa)

**KLH의 경우, 단량체는 약 350-400 kDa으로 추정됨

***OBI-822의 경우, 단량체는 약 400-500 kDa으로 추정됨

이러한 결과는 본 발명의 당접합체가 천연 응집 KLH 이십량체와 비교하여 감소한 질량 분자량을 나타냄을 보여준다. 분자비는 표 5에서와 같이 계산되었다.

<표 5>

글로보 H 대 KLH의 분자비 계산

* 상기 분자비는 하기 식에 기반하여 계산되었음:

** KLH의 분자량은 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체 내지 이십량체의 형태에 따라 달라짐.

상기를 고려하면, 본 발명의 특정한 당접합체 실시양태에서, KLH 단량체 단위는 글로보 H와의 접합 후에 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체 및/또는 육량체를 형성한다.

실시예 4: 백신 조성물의 제조 및 래트에서의 면역화

실시예 1에서 제조된 당접합체 (글로보 H-KLH)의 상이한 샘플을 4℃에서 보관하고, 층류 후드 하에 사포닌 아주반트와 혼합하였다. 생성된 백신 조성물을 얼음 상에 위치시키고, 후속 면역화를 위해 동물 시설로 옮겼다.

3개 그룹의 루이스 래트를 표 6에 나타나 있는 바와 같이 다양한 백신 조성물로 면역화시켰다.

<표 6>

면역화된 래트 그룹

*글로보 H : KLH = 0.17 : 1 (w/w)

래트를 제0일, 제7일, 제14일, 및 제21일에 면역화시켰다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 혈장을 제0일, 제3일, 제10일, 제17일, 제24일, 및 제31일에 수집하였다. 비장, 림프절 및 복막 세척액을 제31일에 수거하였다.

실시예 5: 래트에서의 체액성 및 세포성 면역 반응의 유도에 관한 분석

실시예 5.1: 유세포 분석법에 의한 면역 이펙터 세포 아집단의 분석

말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 동물로부터 단리시키고, 이어서 PBMC 중의 다양한 면역 이펙터 세포 아집단을 상이한 세포 표지자에 대하여 특이적인 항체를 사용하여 유세포 분석법에 의해 동정하였다. 제0일, 제3일, 제10일, 제17일, 제24일, 및 제31일에 면역화된 래트로부터 단리된 PBMC를 상이한 형광 (FITC)-접합 항체로 염색하고 30분 동안 얼음 상에 두었다. 인큐베이션 후에, 세포를 세척 완충액 (포스페이트 완충 염수 (유니리젼 바이오테크(UniRegion Biotech)) 중의 1% 소 혈청 알부민 (시그마(Sigma)) 및 0.1% NaN₃ (시그마))으로 세척하고, 5분 동안 350 g로 원심분리하였다. 세포를 FACS 칸토(Canto) (BD 바이오사이언스(BD Bioscience))에 의한 형광 측정을 위해 세척 완충액에 재현탁시켰다. 데이터를 BD FACSDiva (BD 바이오사이언스) 소프트웨어로 분석하였다. 이러한 결과는 본 발명의 당접합체로 면역화된 래트에서, B 세포 및 T 세포가 PBS 대조군 그룹과 비교하여 유의하게 증식하였음을 보여준다. 구체적으로, B 세포 집단이 먼저 제3일에 나타났고, 후속적으로 CD3T, CD4T 및 CD8T 세포가 제24일에 나타났다. 도 5a 내지 도 5d를 참조한다.

실시예 5.2: ELISA에 의한 글로보 H-특이적 항체 시험

면역화된 래트의 혈장에서의 글로보 H-특이적 항체의 생산을 ELISA 분석법에 의해 결정하였다. 그 결과는 면역화 후에 글로보 H-특이적 IgG의 역가가 제10일에 상승하기 시작하였고 제17일에 최고치였음을 보여준다. 유사한 패턴이 글로보 H-특이적 IgM 항체의 생산에서도 관찰되었다. 도 6a 내지 도 6b를 참조한다. PBS만으로 처리한 래트에서는 글로보 H-특이적 IgG 및 IgM 항체의 반응이 나타나지 않았다.

요약하면, 면역화된 래트에서, B 세포 생산은 제3일에 나타나고, 이어서 글로보 H에 대한 IgM 및 IgG 항체의 생산이 제10일에 나타나며, 후속적으로 CD3T, CD4T, 및 CD8T 세포가 제24일에 나타났다. 본 발명의 당접합체 (글로보 H-KLH)는 체액성 반응과 세포성 반응을 둘다 유도하는데 있어서 효과적이었다.

실시예 6: 마우스에서의 면역화 및 ELISA에 의한 항체 시험

당접합체 (글로보 H-KLH)의 상이한 샘플을 4℃에서 보관하고, 층류 후드 하에 사포닌 아주반트와 혼합하였다. 생성된 백신 조성물을 얼음 상에 위치시키고, 후속 면역화를 위해 동물 시설로 옮겼다.

대략 8주령의 Balb/c 마우스에 상이한 탄수화물-대-단백질 (글로보 H : KLH) 비율을 갖는 글로보 H-KLH 당접합체를, 4주 동안 매주 1회 (제0일, 제7일, 제14일, 및 제21일) 피하 주사를 통해 제공하였다. 혈액 샘플을 면역 전 또는 제0일에, 또한 각각의 백신접종 후 3일째에 (제10일, 제17일 및 제24일) 항응고제 없이 후안와 또는 안면 정맥을 통해 수집하였다. 그 후에, 샘플을 원심분리하여 혈청 및 적혈구를 분리하였다. 혈청을 수집하여 -20℃에서 보관하였고, 이것을 ELISA에 의해 후속 분석하였다. 통계 분석을 위해 만-휘트니(Mann-Whitney) t-검정을 사용하였다.

도 7에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 사포닌 아주반트와 조합된 당접합체 (글로보 H-KLH)는 PBS 대조군 그룹과 비교하였을 때, 동물 모델에서 글로보 H-특이적 IgM 항체 반응을 유의하게 유도하는 것으로 입증되었다. 구체적으로, 0.17 : 1 (글로보 H : KLH)의 중량비를 갖는 당접합체가 0.07 : 1 (글로보 H : KLH)의 중량비를 갖는 당접합체보다 우수한 항체 역가를 유도하였다.

요약하면, 본 발명에 따른 적절한 아주반트와 조합된 글로보 H-KLH 당접합체 (OBI-822)는 동물 모델에서 예상밖의 우수한 체액성 및 세포성 면역 반응, 특히 CTL 및 IgM 및 IgG 반응을 포함하는 B 세포 및 T 세포의 증식을 유도하는 것으로 입증되었고, 이는 암 면역요법에서 중요하다.

실시예 7: 마우스에서의 상이한 아주반트를 갖는 글로보 H - KLH의 면역원성 연구

상이한 아주반트 (OBI-821/OBI-834)와 짝을 이루었을 때, 본 발명의 글로보 H 조성물이 마우스에서 면역 반응을 유도하는 능력이 시연되었다. C57BL/6 마우스와 동계의 루이스 폐 암종 (LL/2, ATCC CRL-1642) 생세포 (유로핀스 판랩스 타이완 리미티드(Eurofins Panlabs Taiwan Ltd.) 제공, 5.0x10⁶개/0.1 mL)를 제16일에 실험용 마우스의 복부 부위에 측방쪽으로 피하 주사하였다. 6-8주령의 암컷 C57BL/6 마우스 6개 그룹을 글로보 H-KLH (OBI-822)와 상이한 아주반트로 피하 면역화시켰다. OBI-822의 투여량 수준은 각각의 그룹에서 등가의 양이었다. 각각의 주사는 피하 투여되는 0.2 mL/마우스 (좌측과 우측 복부 부위 양쪽으로, 0.1 mL/부위) 중의 2.0 ㎍의 백신 (OBI-822) 및 20 ㎍의 아주반트 (OBI-821/OBI-834)와 등가의 투여량을 함유하였다. 면역화가 제0일, 제5일, 제11일, 제19일, 제29일, 제34일 및 제39일에 발생하였고, ELISA에 의한 비교 분석을 위해 혈청을 제0일 (주사 전) 및 제42일에 수집하였다. ELISA에 의해 혈청학적 반응을 측정하여, 글로보 H에 대한 IgM 및 IgG 항체의 역가를 결정하였다.

도 8에 도시된 바와 같이, 포스페이트 완충 염수 (PBS)로 처리된 마우스에서는 반응이 일어나지 않았다. 이와 달리, OBI-822 + OBI-821 및 OBI-822 + OBI-834로 처리된 마우스는 유의한 IgM 항-글로보 H 역가로 반응하였다 (도 8a). 그러나, 평균 IgG 역가는 IgG보다 낮았다 (도 8b). OBI-821과 OBI-834 아주반트는 둘다 글로보 H - KLH (OBI-822)의 면역원성을 유도할 수 있음이 시사되었다. 글로보 H-KLH 및 아주반트에 의한 백신접종은 암컷 C57BL/6 마우스에서 IgG 및 IgM 항-글로보 H 반응을 둘다 유도하는 것으로 입증되었다.

도 9에 도시된 바와 같이, C57BL/6 마우스의 6개 그룹을 제16일, 제19일, 제23일, 제26일, 제30일, 제34일, 제37일, 제40일 및 제42일에 체중 및 종양 크기에 대하여 모니터링하였다. 희생 후 제42일에 종양을 포함하는 전신 사진을 촬영하였다. 도 10에 도시된 바와 같이, 종양 부피 (mm³)는 편장 타원체의 부피를 구하는 식에 따라 추정되었다: 길이 (mm) x [폭 (mm)]² x 0.5. 화합물로 처리된 동물에서의 종양 성장은 T/C (처리군/대조군) x 100%로서 계산되었고; 1원 ANOVA에 이어서, 던네트(Dunnett) 검정 또는 독립표본 스튜던트(Student) t-검정을 사용하여 항종양 활성을 입증하는 종양 성장에 있어서의 유의한 억제를 결정하였다. 제42일에 OBI-822 + OBI-821의 종양 억제율은 약 35%이고, OBI-822 + OBI-834의 종양 억제율은 약 22%였다. OBI-821 및 OBI-834 아주반트는 둘다 글로보 H-KLH (OBI-822)와 함께 종양 성장을 억제할 수 있는 것으로 보인다.

실시예 8: KLH 상의 글로보-H 접합 자리 (리신)의 LC-MS/MS 분석

4종의 KLH 샘플에서의 글로보 H 접합 자리를 다중 효소 소화 및 LC-MS/MS를 사용하여 동정하였다. 4종의 글로보 H-접합 KLH 샘플을 먼저 4종의 상이한 효소로 소화시킨 다음, LC-MS/MS 및 마스코트(Mascot) 데이터베이스 검색에 의해 분석하였다. 2가지 유형의 유도체가 동정되었다: 글로보 H 유도체 (글로보 H + MMCCH) 및 MMCCH 유도체 (단독의 MMCCH). 글로보 H 유도체 및 그의 중성종 상실 형태가 글로보 H 접합 자리 동정을 위해 고려되었다. MMCCH 형태 및 그의 탈아미드화된 형태가 MMCCH 접합 자리 동정을 위해 고려되었다. 고급 MS/MS 스펙트럼 및 마스코트 점수를 갖는 펩티드만이 고려되었다. 글로보 H 접합 분석에서, OBI-822-13001-DP (샘플 1)의 이중 반복 LC-MS/MS 분석으로부터 31 및 28개의 접합 리신이 관찰되었고; OBI-822-13002-DP (샘플 2)의 이중 반복 LC-MS/MS 분석으로부터 19 및 21개의 접합 리신이 관찰되었으며; OBI-822-13003-DP (샘플 3)의 이중 반복 LC-MS/MS 분석으로부터 10 및 11개의 접합 리신이 관찰되었으며; OBI-822-13004-DS (샘플 4)의 이중 반복 LC-MS/MS 분석으로부터 18 및 19개의 접합 리신이 관찰되었다. MMCCH 접합 분석에서, OBI-822-13001-DP (샘플 1)의 이중 반복 LC-MS/MS 분석으로부터 155 및 141개의 접합 리신이 확인되었고; OBI-822-13002-DP (샘플 2)의 이중 반복 LC-MS/MS 분석으로부터 143 및 137개의 접합 리신이 확인되었으며; OBI-822-13003-DP (샘플 3)의 이중 반복 LC-MS/MS 분석으로부터 147 및 143개의 접합 리신이 확인되었으며; OBI-822-13004-DS (샘플 4)의 이중 반복 LC-MS/MS 분석으로부터 140 및 136개의 접합 리신이 확인되었다.

실시예 8의 물질 및 방법:

약어는 하기와 같이 나열되었다:

K=리신; LC-MS/MS=액체 크로마토그래피-이중 질량 분광법;

DTT=디티올트레이톨; IAM=아이오도아세트아미드; ACN=아세토니트릴; FA=포름산; Glu-C=엔도프로테이나제 Glu-C; ABC=암모늄 비카르보네이트; RT=실온; MW=분자량.

4종의 KLH 샘플, 즉 샘플 1-4를 먼저 100 kDa 컷오프 아미콘(Amicon) 초원심분리 필터에 의해 50 mM 암모늄 비카르보네이트 완충액으로 완충제 교환 프로세싱하고 6 M 우레아로 변성시켰다. 그 후에, 샘플을 37℃에서 1시간 동안 10 mM DTT로 환원시키고, 30분 동안 RT의 암실에서 50 mM IAM을 사용하여 알킬화하고, 5분 동안 RT에서 50 mM DTT로 켄칭하였다. 우레아 농도가 1 M이 될 때까지 생성 단백질을 희석시키고, 하기 단락에 기재된 바와 같이 상이한 효소로 용액 중 소화에 적용하였다.

상이한 효소에 의한 용액 중 소화는 하기 소화 조건으로 수행하였다: (1) 37℃에서 24시간 동안 트립신 소화 (단백질:효소=40:1) (2) 37℃에서 24시간 동안 Glu-C 소화 (단백질:효소=25:1); (3) RT에서 24시간 동안 키모트립신 소화 (단백질:효소=25:1); (4) 37℃에서 24시간 동안 써모리신 소화 (단백질:효소=25:1).

포름산을 첨가하여 소화 반응을 종결시키고, 모든 4종의 소화 샘플을 LC-MS/MS 분석에 적용하였다. 샘플을 얼티메이트(Ultimate) 3000 RSLC 시스템 (디오넥스(Dionex))과 커플링된 Q 이그잭티브(Exactive) 질량 분광계 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))로 분석하였다. 표 7에 나타나 있는 구배로 C 18 컬럼 (어클레임(Acclaim) PepMap RSLC, 75 ㎛ x 150 mm, 2 ㎛, 100 Å)을 사용하여 LC 분리를 수행하였다.

<표 7>

LC 분리 구배

*이동상 A: 5% 아세토니트릴 / 0.1% 포름산

**이동상 B: 95% 아세토니트릴 / 0.1% 포름산

인소스 CID(in-source CID)를 45 eV로 설정하였다. m/z 350-2000의 범위에서 전체 MS 스캔을 수행하였고, MS 스캔으로부터의 10개의 가장 강력한 이온을 MS/MS 스펙트럼을 위해 단편화에 적용하였다. 미가공 데이터를 마스코트 데이터베이스 검색을 위해 프로테옴 디스커버러(Proteome Discoverer) 1.4에 의해 피크 목록으로 프로세싱하였다.

KLH1 서열 (서열식별번호 1) 및 KLH2 서열 (서열식별번호 2)에 대한 데이터베이스 검색을 마스코트 버전 2.4.1 및 써모 프로테옴 디스커버러 버전 1.4를 이용하여 수행하였다. 사용된 파라미터는 하기와 같았다:

효소: 소화 방법에 따라 트립신, Glu-C, 키모트립신 및 써모리신; 고정 개질: 카르바미도메틸 (C);

MMCCH 유도체 (단독의 MMCCH)에 대한 가변 개질: 탈아미드화 (NQ), 산화 (M), dK_MMCCH-1 (K), dK_MMCCH-2 (K);

글로보 H 유도체 (글로보 H + MMCCH)에 대한 가변 개질: 탈아미드화 (NQ), 산화 (M), 글로보_H_MMCCH (K), dK_MMCCH_NL997 (K), dK_MMCCH_NL835 (K), dK_MMCCH_NL673 (K), dK_MMCCH_NL511 (K), dK_MMCCH_NL308 (K);

펩티드 질량 허용 오차: ± 10 ppm; 단편 질량 허용 오차: ± 0.05 Da; 최대 미절단: 5; 기구 유형: ESI-TRAP; 이온 컷오프 점수: 13.

검색 파라미터에서 "dK_MMCCH-1"은 352.1569 Da의 MW 가중을 갖는 MMCCH-접합 리신을 나타낸다.

검색 파라미터에서 "dK_MMCCH-2"는 338.1300 Da의 MW 가중을 갖는 MMCCH-접합 리신의 탈아미드화된 형태를 나타낸다.

검색 파라미터에서 "글로보_H_MMCCH (K)"는 1393.5317 Da의 MW 가중을 갖는 글로보 H-접합 리신을 나타낸다.

검색 파라미터에서 "dK_MMCCH_NL997"은 396.1831 Da의 MW 가중을 갖는 글로보 H-접합 리신의 중성종 상실 형태를 나타낸다.

검색 파라미터에서 "dK_MMCCH_NL835"는 558.2360 Da의 MW 가중을 갖는 글로보 H-접합 리신의 중성종 상실 형태를 나타낸다.

검색 파라미터에서 "dK_MMCCH_NL673"은 720.2888 Da의 MW 가중을 갖는 글로보 H-접합 리신의 중성종 상실 형태를 나타낸다.

검색 파라미터에서 "dK_MMCCH_NL511"은 882.3416 Da의 MW 가중을 갖는 글로보 H-접합 리신의 중성종 상실 형태를 나타낸다.

검색 파라미터에서 "dK_MMCCH_NL308"은 1085.4210 Da의 MW 가중을 갖는 글로보 H-접합 리신의 중성종 상실 형태를 나타낸다.

"MW 가중"이란 무손상 리신 잔기와 비교하여 가중된 분자량을 의미한다.

실시예 8의 결과:

LC-MS/MS 기반 기술은 단백질의 동정 및 아미노산 개질의 특징화를 위한 중요한 도구로서 부각되었다. 펩티드 서열 및 개질 자리에 관한 상세한 정보가 MS/MS 스펙트럼에 의해 제공된 단편 이온의 지정에 의해 입수될 수 있었다. 마스코트는 검색 엔진으로서, 그의 확률 기반 점수 알고리즘이 널리 용인되었다. 이 연구에서 마스코트 점수는 단백질 서열분석 및 글로보 H 또는 MMCCH 접합 자리 동정을 위한 신뢰 기준으로서 채택되었다. 샘플 1-4에서의 글로보 H 또는 MMCCH 접합 자리의 분포를 철저히 분석하기 위해, 이들 샘플을 다수의 효소로 소화시킨 다음, LC-MS/MS 분석하였다.

글로보 H 유도체 (글로보 H + MMCCH)의 예상 화학 구조가 도 11a에 도시되어 있으며, 리신-함유 펩티드 상의 1393.53 Da의 상응하는 MW 가중이 결과에서 관찰될 수 있었다. 이외에도, LC-MS 분석에서 불안정한 다당류는 전기분무 이온화 동안에 중성종 상실을 통해 떨어져 나가는 경향이 있다. 따라서, 도 11b에 도시된 바와 같이, 중성종 상실로부터 초래되는 396.18 Da, 558.24 Da, 720.29 Da, 882.34 Da 및 1085.42 Da의 분자량 가중이 또한 당접합 펩티드에 대하여 관찰될 수 있었다. 모든 유도체화 형태가 글로보 H 접합 자리의 동정을 위해 고려되었다.

또한, MMCCH 유도체 (단독의 MMCCH)가 이러한 글로보 H 접합 KLH 샘플에서 관찰되었다. MMCCH 유도체 및 그의 탈아미드화된 형태의 예상 화학 구조가 도 12a 및 도 12b에 도시되어 있으며, 리신-함유 펩티드 상의 각각 352.16 Da 및 338.13 Da의 상응하는 MW 가중이 결과에서 관찰될 수 있었다. 두 유도체화 형태가 모두 MMCCH 접합 자리의 동정을 위해 고려되었다. 글로보 H 유도체로부터 MMCCH로의 전환은 분명하지 않지만, 샘플 처리 중에 발생하는 것으로 추측된다.

전구 이온에 대해서는 ± 10 ppm, 또한 단편 이온에 대해서는 ± 0.05 Da의 질량 정확도가 단백질 동정 및 스펙트럼 해석을 위한 기준으로서 사용되었다. 글로보 H 유도체 뿐만 아니라, 그의 중성종 상실 형태가 글로보 H 접합 자리 동정에서의 가변 개질로서 선택되었고, MMCCH 유도체 뿐만 아니라, 그의 탈아미드화된 형태가 MMCCH 접합 자리 동정에서의 가변 개질로서 선택되었다. KLH1 서열 (서열식별번호 1) 및 KLH2 서열 (서열식별번호 2)에 대한 데이터베이스 검색을 수행하였다. 고급 MS/MS 스펙트럼 (이온 점수 ≥ 13, p < 0.05)을 갖는 펩티드만이 보고서에 기록되었다.

반복가능한 결과를 입증하기 위해, 도 13a 및 도 13b에 요약되어 있는 바와 같이, LC-MS/MS 분석을 2회 수행한 다음, 글로보 H 접합 자리 동정 및 MMCCH 접합 자리 동정을 위해 개별 마스코트 데이터베이스 검색을 수행하였다.

글로보 H 접합 자리 분석에서, 샘플 1은 1차 LC-MS/MS 및 2차 LC-MS/MS에서 각각 31 및 28개의 리신이 확인되었고; 샘플 2는 1차 LC-MS/MS 및 2차 LC-MS/MS에서 각각 19 및 21개의 리신이 확인되었으며; 샘플 3은 1차 LC-MS/MS 및 2차 LC-MS/MS에서 각각 10 및 11개의 리신이 확인되었으며; 샘플 4는 1차 LC-MS/MS 및 2차 LC-MS/MS에서 각각 18 및 19개의 리신이 확인되었다. 동정의 세부사항이 도 14 내지 21에 나열되어 있다. MMCCH 접합 분석에서, 샘플 1은 1차 LC-MS/MS 및 2차 LC-MS/MS에서 각각 155 및 141개의 리신이 확인되었고; 샘플 2는 1차 LC-MS/MS 및 2차 LC-MS/MS에서 각각 143 및 137개의 리신이 확인되었으며; 샘플 3은 1차 LC-MS/MS 및 2차 LC-MS/MS에서 각각 147 및 143개의 리신이 확인되었으며; 샘플 4는 1차 LC-MS/MS 및 2차 LC-MS/MS에서 각각 140 및 136개의 리신이 확인되었다. 동정의 세부사항이 도 22 내지 29에 나열되어 있다.

다중 효소 실험으로부터의 글로보 H 접합 자리가 도 30에 요약되어 있고, MMCCH 접합 자리가 도 31에 요약되어 있다. 글로보 H 접합 샘플의 전체 접합 자리 분석 결과가 도 32에 요약되어 있다.

실시예 8의 결론:

글로보 H 유도체 접합 펩티드의 질량 분광 분석 신호는 다당류의 다수의 중성종 상실 형태 및 보다 낮은 이온화 효율 때문에 MMCCH 접합 펩티드보다 약하고, 이는 글로보 H 접합의 직접적인 동정을 더욱 어렵게 만든다. 이것이, 동정되는 펩티드 수가 MMCCH 접합 분석에서 더 많은 이유이다. 따라서, MMCCH 결과가 글로보 H 접합을 대표하는데 사용될 수 있다.

접합 자리 분석은, 각각 샘플 1-4에 대하여 KLH1/KLH2 중 총 306개의 리신 잔기 중에서 동정된 155, 143, 147 및 140개의 리신 접합 자리가 존재함을 시사한다. 이중 분석에서, 샘플 1-4에 대하여 각각 141, 137, 143 및 136개의 접합 자리가 동정되었다.

실시예 9: KLH 상의 글로보-H 접합 자리 (히스티딘, 아스파라긴, 프롤린, 글루타민 및 아르기닌)의 LC-MS/MS 분석

5종의 잔기, 즉 H, N, P, Q, R 상의 2가지 유형의 유도체가 검사되었다: GMd (글로보 H + MMCCH 링커 + 리신 유도체) 및 Md (MMCCH 링커 + 리신 유도체).

HNPQR (GMd 및 Md) 상의 개질 분석에서, OBI-822-13001-DP (샘플 1)는 KLH1 및 KLH2에서 각각 6 및 13개의 접합 HNPQR 자리를 제공하였고; OBI-822-13002-DP (샘플 2)는 KLH1 및 KLH2에서 각각 11 및 10개의 접합 HNPQR 자리를 제공하였으며; OBI-822-13003-DP (샘플 3)는 KLH1 및 KLH2에서 각각 13 및 9개의 접합 HNPQR 자리를 제공하였으며; OBI-822-13004-DS (샘플 4)는 KLH1 및 KLH2에서 각각 8 및 10개의 접합 HNPQR 자리를 제공하였다.

실시예 9의 물질 및 방법:

약어는 하기와 같이 나열되었다:

K=리신; H=히스티딘; N=아스파라긴; P=프롤린; Q=글루타민; R=아르기닌; LC-MS/MS=액체 크로마토그래피-이중 질량 분광법; MW=분자량.

KLH1 서열 (서열식별번호 1) 및 KLH2 서열 (서열식별번호 2)에 대한 데이터베이스 검색을 마스코트 버전 2.4.1을 이용하여 수행하였다. 사용된 파라미터는 하기와 같았다:

효소: 소화 방법에 따라 트립신, Glu-C, 키모트립신 및 써모리신;

고정 개질: 카르바미도메틸 (C);

가변 개질: 산화 (M), 탈아미드화 (NQ);

1. OBI822_GMd (HKNPQR), GMd_NL997 (HKNPQR);

2. OBI822_Md (HKNPQR), Md_탈아미드화 (HKNPQR);

펩티드 질량 허용 오차: ± 10 ppm; 단편 질량 허용 오차: ± 0.05 Da; 최대 미절단: 5; 기구 유형: ESI-TRAP; 이온 컷오프 점수: 13.

검색 파라미터에서 "OBI822_GMd"는 1393.5317 Da의 MW 가중을 갖는 GMd-접합 잔기 (HKNPQR)를 나타낸다.

검색 파라미터에서 "GMd_NL997"은 396.1831 Da의 MW 가중을 갖는 GMd-접합 잔기 (HKNPQR)의 중성종 상실 형태를 나타낸다.

검색 파라미터에서 "OBI822_Md"는 352.1569 Da의 MW 가중을 갖는 Md-접합 잔기 (HKNPQR)를 나타낸다.

검색 파라미터에서 "Md_탈아미드화"는 338.1300 Da의 MW 가중을 갖는 Md-접합 잔기 (HKNPQR)의 탈아미드화된 형태를 나타낸다.

실시예 9의 결과:

LC-MS/MS 기반 기술은 단백질의 동정 및 아미노산 개질의 특징화를 위한 중요한 도구로서 부각되었다. 펩티드 서열 및 개질 자리에 관한 상세한 정보가 MS/MS 스펙트럼에 의해 제공된 단편 이온의 지정에 의해 입수될 수 있었다. 마스코트는 현재 가장 대중적인 검색 엔진으로서, 널리 용인되는 확률 기반 점수 알고리즘을 가졌다. 샘플 1-4에서의 리신 (K) 및 다른 특정 잔기 (HNPQR) 상의 상이한 개질을 동정하기 위해, 모든 검색 결과는 고급 MS/MS 스펙트럼을 갖는 펩티드에 대해서만 스크리닝하기 위해 후속 수동 확인을 진행하였다.

HNPQR 잔기 상의 GMd (글로보 H + MMCCH 링커 + 리신 유도체) 및 Md (MMCCH 링커 + 리신 유도체) 개질에 대한 마스코트 검색 중에, 동정된 펩티드에 오류가 있었다. 지정된 개질 자리가 리신 잔기에 가까이 있다면, 리신이 실제 개질 자리일 가능성이 있다. 이러한 펩티드는 동정 목록에서 제외하였다. 가까이에 리신 잔기가 관찰될 수 없었다면, HNPQR 상의 개질이 확인될 수 있었다. 도 38에 도시된 바와 같이, GMd 개질 자리 분석에서, 샘플 1-4는 KLH1에서 각각 1, 2, 2 및 3개의 접합 HNPQR 자리를 제공하였고, 샘플 1-4는 KLH2에서 각각 4, 4, 2 및 3개의 접합 HNPQR 자리를 제공하였다. Md 개질 자리 분석에서, 샘플 1-4는 KLH1에서 각각 5, 9, 11 및 5개의 접합 HNPQR 자리를 제공하였고, 샘플 1-4는 KLH2에서 각각 9, 6, 7 및 7개의 접합 HNPQR 자리를 제공하였다.

실시예 9의 결론:

이들 4종의 샘플 중에서, 특정 잔기 (HNPQR) 상의 GMd 및 Md 개질 분석은 샘플 1-4가 KLH1에서 각각 6, 11, 13 및 8개의 접합 HNPQR 자리가 존재하고, 샘플 1-4가 KLH2에서 각각 13, 10, 9 및 10개의 접합 HNPQR 자리가 존재함을 시사하였다.

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SEQUENCE LISTING <110> OBI PHARMA, INC. <120> IMMUNOGENIC/THERAPEUTIC GLYCOCONJUGATE COMPOSITIONS AND USES THEREOF <130> G3004-00401 <140> TBD <141> 2015-09-15 <150> US 62/050,567 <151> 2014-09-14 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3125 <212> PRT <213> Megathura crenulata <400> 1 Met Thr Pro Glu Glu Leu Lys Thr Tyr Leu Asp Glu Arg Ser Ser Arg 1 5 10 15 Ala Arg Ala Phe Ala Ser Phe Arg Leu Lys Gly Phe Gly Gly Ser Ala 20 25 30 Asn Val Phe Val Tyr Val Cys Ile Pro Asp Asp Asn Asp Arg Asn Asp 35 40 45 Asp His Cys Glu Lys Ala Gly Asp Phe Phe Val Leu Gly Gly Pro Ser 50 55 60 Glu Met Lys Trp Gln Phe Tyr Arg Pro Tyr Leu Phe Asp Leu Ser Asp 65 70 75 80 Thr Val His Lys Met Gly Met Lys Leu Asp Gly His Tyr Thr Val Lys 85 90 95 Ala Glu Leu Phe Ser Val Asn Gly Thr Ala Leu Pro Asp Asp Leu Leu 100 105 110 Pro His Pro Val Val Val His His Pro Glu Lys Gly Phe Thr Asp Pro 115 120 125 Pro Val Lys His His Gln Ser Ala Asn Leu Leu Val Arg Lys Asn Ile 130 135 140 Asn Asp Leu Thr Arg Glu Glu Val Leu 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Ser Gly Gly Phe Gln Gln Ile Ala Ala Phe His Gly Glu 885 890 895 Pro Lys Trp Cys Pro Ser Pro Glu Ala Glu Lys Lys Phe Ala Cys Cys 900 905 910 Val His Gly Met Ala Val Phe Pro His Trp His Arg Leu Leu Thr Val 915 920 925 Gln Gly Glu Asn Ala Leu Arg Lys His Gly Phe Thr Gly Gly Leu Pro 930 935 940 Tyr Trp Asp Trp Thr Arg Ser Met Ser Ala Leu Pro His Phe Val Ala 945 950 955 960 Asp Pro Thr Tyr Asn Asp Ala Ile Ser Ser Gln Glu Glu Asp Asn Pro 965 970 975 Trp His His Gly His Ile Asp Ser Val Gly His Asp Thr Thr Arg Asp 980 985 990 Val Arg Asp Asp Leu Tyr Gln Ser Pro Gly Phe Gly His Tyr Thr Asp 995 1000 1005 Ile Ala Lys Gln Val Leu Leu Ala Phe Glu Gln Asp Asp Phe Cys 1010 1015 1020 Asp Phe Glu Val Gln Phe Glu Ile Ala His Asn Phe Ile His Ala 1025 1030 1035 Leu Val Gly Gly Asn Glu Pro Tyr Ser Met Ser Ser Leu Arg Tyr 1040 1045 1050 Thr Thr Tyr Asp Pro Ile Phe Phe Leu His Arg Ser Asn Thr Asp 1055 1060 1065 Arg Leu Trp Ala Ile Trp Gln Ala Leu Gln Lys Tyr Arg Gly Lys 1070 1075 1080 Pro Tyr Asn Thr Ala Asn Cys Ala Ile Ala Ser Met Arg Lys Pro 1085 1090 1095 Leu Gln Pro Phe Gly Leu Asp Ser Val Ile Asn Pro Asp Asp Glu 1100 1105 1110 Thr Arg Glu His Ser Val Pro Phe Arg Val Phe Asp Tyr Lys Asn 1115 1120 1125 Asn Phe Asp Tyr Glu Tyr Glu Ser Leu Ala Phe Asn Gly Leu Ser 1130 1135 1140 Ile Ala Gln Leu Asp Arg Glu Leu Gln Arg Arg Lys Ser His Asp 1145 1150 1155 Arg Val Phe Ala Gly Phe Leu Leu His Glu Ile Gly Gln Ser Ala 1160 1165 1170 Leu Val Lys Phe Tyr Val Cys Lys His Asn Val Ser Asp Cys Asp 1175 1180 1185 His Tyr Ala Gly Glu Phe Tyr Ile Leu Gly Asp Glu Ala Glu Met 1190 1195 1200 Pro Trp Arg Tyr Asp Arg Val Tyr Lys Tyr Glu Ile Thr Gln Gln 1205 1210 1215 Leu His Asp Leu Asp Leu His Val Gly Asp Asn Phe Phe Leu Lys 1220 1225 1230 Tyr Glu Ala Phe Asp Leu Asn Gly Gly Ser Leu Gly Gly Ser Ile 1235 1240 1245 Phe Ser Gln Pro Ser Val Ile Phe Glu Pro Ala Ala Gly Ser His 1250 1255 1260 Gln Ala Asp Glu Tyr Arg Glu Ala Val Thr Ser Ala Ser His Ile 1265 1270 1275 Arg Lys Asn Ile Arg Asp Leu Ser Glu Gly Glu Ile Glu Ser Ile 1280 1285 1290 Arg Ser Ala Phe Leu Gln Ile Gln Lys Glu Gly Ile Tyr Glu Asn 1295 1300 1305 Ile Ala Lys Phe His Gly Lys Pro Gly Leu Cys Glu His Asp Gly 1310 1315 1320 His Pro Val Ala Cys Cys Val His Gly Met Pro Thr Phe Pro His 1325 1330 1335 Trp His Arg Leu Tyr Val Leu Gln Val Glu Asn Ala Leu Leu Glu 1340 1345 1350 Arg Gly Ser Ala Val Ala Val Pro Tyr Trp Asp Trp Thr Glu Lys 1355 1360 1365 Ala Asp Ser Leu Pro Ser Leu Ile Asn Asp Ala Thr Tyr Phe Asn 1370 1375 1380 Ser Arg Ser Gln Thr Phe Asp Pro Asn Pro Phe Phe Arg Gly His 1385 1390 1395 Ile Ala Phe Glu Asn Ala Val Thr Ser Arg Asp Pro Gln Pro Glu 1400 1405 1410 Leu Trp Asp Asn Lys Asp Phe Tyr Glu Asn Val Met Leu Ala Leu 1415 1420 1425 Glu Gln Asp Asn Phe Cys Asp Phe Glu Ile Gln Leu Glu Leu Ile 1430 1435 1440 His Asn Ala Leu His Ser Arg Leu Gly Gly Arg Ala Lys Tyr Ser 1445 1450 1455 Leu Ser Ser Leu Asp Tyr Thr Ala Phe Asp Pro Val Phe Phe Leu 1460 1465 1470 His His Ala Asn Val Asp Arg Ile Trp Ala Ile Trp Gln Asp Leu 1475 1480 1485 Gln Arg Tyr Arg Lys Lys Pro Tyr Asn Glu Ala Asp Cys Ala Val 1490 1495 1500 Asn Glu Met Arg Lys Pro Leu Gln Pro Phe Asn Asn Pro Glu Leu 1505 1510 1515 Asn Ser Asp Ser Met Thr Leu Lys His Asn Leu Pro Gln Asp Ser 1520 1525 1530 Phe Asp Tyr Gln Asn Arg Phe Arg Tyr Gln Tyr Asp Asn Leu Gln 1535 1540 1545 Phe Asn His Phe Ser Ile Gln Lys Leu Asp Gln Thr Ile Gln Ala 1550 1555 1560 Arg Lys Gln His Asp Arg Val Phe Ala Gly Phe Ile Leu His Asn 1565 1570 1575 Ile Gly Thr Ser Ala Val Val Asp Ile Tyr Ile Cys Val Glu Gln 1580 1585 1590 Gly Gly Glu Gln Asn Cys Lys Thr Lys Ala Gly Ser Phe Thr Ile 1595 1600 1605 Leu Gly Gly Glu Thr Glu Met Pro Phe His Phe Asp Arg Leu Tyr 1610 1615 1620 Lys Phe Asp Ile Thr Ser Ala Leu His Lys Leu Gly Val Pro Leu 1625 1630 1635 Asp Gly His Gly Phe Asp Ile Lys Val Asp Val Arg Ala Val Asn 1640 1645 1650 Gly Ser His Leu Asp Gln His Ile Leu Asn Glu Pro Ser Leu Leu 1655 1660 1665 Phe Val Pro Gly Glu Arg Lys Asn Ile Tyr Tyr Asp Gly Leu Ser 1670 1675 1680 Gln His Asn Leu Val Arg Lys Glu Val Ser Ser Leu Thr Thr Leu 1685 1690 1695 Glu Lys His Phe Leu Arg Lys Ala Leu Lys Asn Met Gln Ala Asp 1700 1705 1710 Asp Ser Pro Asp Gly Tyr Gln Ala Ile Ala Ser Phe His Ala Leu 1715 1720 1725 Pro Pro Leu Cys Pro Ser Pro Ser Ala Ala His Arg His Ala Cys 1730 1735 1740 Cys Leu His Gly Met Ala Thr Phe Pro Gln Trp His Arg Leu Tyr 1745 1750 1755 Thr Val Gln Phe Glu Asp Ser Leu Lys Arg His Gly Ser Ile Val 1760 1765 1770 Gly Leu Pro Tyr Trp Asp Trp Leu Lys Pro Gln Ser Ala Leu Pro 1775 1780 1785 Asp Leu Val Thr Gln Glu Thr Tyr Glu His Leu Phe Ser His Lys 1790 1795 1800 Thr Phe Pro Asn Pro Phe Leu Lys Ala Asn Ile Glu Phe Glu Gly 1805 1810 1815 Glu Gly Val Thr Thr Glu Arg Asp Val Asp Ala Glu His Leu Phe 1820 1825 1830 Ala Lys Gly Asn Leu Val Tyr Asn Asn Trp Phe Cys Asn Gln Ala 1835 1840 1845 Leu Tyr Ala Leu Glu Gln Glu Asn Tyr Cys Asp Phe Glu Ile Gln 1850 1855 1860 Phe Glu Ile Leu His Asn Gly Ile His Ser Trp Val Gly Gly Ser 1865 1870 1875 Lys Thr His Ser Ile Gly His Leu His Tyr Ala Ser Tyr Asp Pro 1880 1885 1890 Leu Phe Tyr Ile His His Ser Gln Thr Asp Arg Ile Trp Ala Ile 1895 1900 1905 Trp Gln Ala Leu Gln Glu His Arg Gly Leu Ser Gly Lys Glu Ala 1910 1915 1920 His Cys Ala Leu Glu Gln Met Lys Asp Pro Leu Lys Pro Phe Ser 1925 1930 1935 Phe Gly Ser Pro Tyr Asn Leu Asn Lys Arg Thr Gln Glu Phe Ser 1940 1945 1950 Lys Pro Glu Asp Thr Phe Asp Tyr His Arg Phe Gly Tyr Glu Tyr 1955 1960 1965 Asp Ser Leu Glu Phe Val Gly Met Ser Val Ser Ser Leu His Asn 1970 1975 1980 Tyr Ile Lys Gln Gln Gln Glu Ala Asp Arg Val Phe Ala Gly Phe 1985 1990 1995 Leu Leu Lys Gly Phe Gly Gln Ser Ala Ser Val Ser Phe Asp Ile 2000 2005 2010 Cys Arg Pro Asp Gln Ser Cys Gln Glu Ala Gly Tyr Phe Ser Val 2015 2020 2025 Leu Gly Gly Ser Ser Glu Met Pro Trp Gln Phe Asp Arg Leu Tyr 2030 2035 2040 Lys Tyr Asp Ile Thr Lys Thr Leu Lys Asp Met Lys Leu Arg Tyr 2045 2050 2055 Asp Asp Thr Phe Thr Ile Lys Val His Ile Lys Asp Ile Ala Gly 2060 2065 2070 Ala Glu Leu Asp Ser Asp Leu Ile Pro Thr Pro Ser Val Leu Leu 2075 2080 2085 Glu Glu Gly Lys His Gly Ile Asn Val Arg His Val Gly Arg Asn 2090 2095 2100 Arg Ile Arg Met Glu Leu Ser Glu Leu Thr Glu Arg Asp Leu Ala 2105 2110 2115 Ser Leu Lys Ser Ala Met Arg Ser Leu Gln Ala Asp Asp Gly Val 2120 2125 2130 Asn Gly Tyr Gln Ala Ile Ala Ser Phe His Gly Leu Pro Ala Ser 2135 2140 2145 Cys His Asp Asp Glu Gly His Glu Ile Ala Cys Cys Ile His Gly 2150 2155 2160 Met Pro Val Phe Pro His Trp His Arg Leu Tyr Thr Leu Gln Met 2165 2170 2175 Asp Met Ala Leu Leu Ser His Gly Ser Ala Val Ala Ile Pro Tyr 2180 2185 2190 Trp Asp Trp Thr Lys Pro Ile Ser Lys Leu Pro Asp Leu Phe Thr 2195 2200 2205 Ser Pro Glu Tyr Tyr Asp Pro Trp Arg Asp Ala Val Val Asn Asn 2210 2215 2220 Pro Phe Ala Lys Gly Tyr Ile Lys Ser Glu Asp Ala Tyr Thr Val 2225 2230 2235 Arg Asp Pro Gln Asp Ile Leu Tyr His Leu Gln Asp Glu Thr Gly 2240 2245 2250 Thr Ser Val Leu Leu Asp Gln Thr Leu Leu Ala Leu Glu Gln Thr 2255 2260 2265 Asp Phe Cys Asp Phe Glu Val Gln Phe Glu Val Val His Asn Ala 2270 2275 2280 Ile His Tyr Leu Val Gly Gly Arg Gln Val Tyr Ala Leu Ser Ser 2285 2290 2295 Gln His Tyr Ala Ser Tyr Asp Pro Ala Phe Phe Ile His His Ser 2300 2305 2310 Phe Val Asp Lys Ile Trp Ala Val Trp Gln Ala Leu Gln Lys Lys 2315 2320 2325 Arg Lys Arg Pro Tyr His Lys Ala Asp Cys Ala Leu Asn Met Met 2330 2335 2340 Thr Lys Pro Met Arg Pro Phe Ala His Asp Phe Asn His Asn Gly 2345 2350 2355 Phe Thr Lys Met His Ala Val Pro Asn Thr Leu Phe Asp Phe Gln 2360 2365 2370 Asp Leu Phe Tyr Thr Tyr Asp Asn Leu Glu Ile Ala Gly Met Asn 2375 2380 2385 Val Asn Gln Leu Glu Ala Glu Ile Asn Arg Arg Lys Ser Gln Thr 2390 2395 2400 Arg Val Phe Ala Gly Phe Leu Leu His Gly Ile Gly Arg Ser Ala 2405 2410 2415 Asp Val Arg Phe Trp Ile Cys Lys Thr Ala Asp Asp Cys His Ala 2420 2425 2430 Ser Gly Met Ile Phe Ile Leu Gly Gly Ser Lys Glu Met His Trp 2435 2440 2445 Ala Tyr Asp Arg Asn Phe Lys Tyr Asp Ile Thr Gln Ala Leu Lys 2450 2455 2460 Ala Gln Ser Ile His Pro Glu Asp Val Phe Asp Thr Asp Ala Pro 2465 2470 2475 Phe Phe Ile Lys Val Glu Val His Gly Val Asn Lys Thr Ala Leu 2480 2485 2490 Pro Ser Ser Ala Ile Pro Ala Pro Thr Ile Ile Tyr Ser Ala Gly 2495 2500 2505 Glu Gly His Thr Asp Asp His Gly Ser Asp His Ile Ala Gly Ser 2510 2515 2520 Gly Val Arg Lys Asp Val Thr Ser Leu Thr Ala Ser Glu Ile Glu 2525 2530 2535 Asn Leu Arg His Ala Leu Gln Ser Val Met Asp Asp Asp Gly Pro 2540 2545 2550 Asn Gly Phe Gln Ala Ile Ala Ala Tyr His Gly Ser Pro Pro Met 2555 2560 2565 Cys His Met His Asp Gly Arg Asp Val Ala Cys Cys Thr His Gly 2570 2575 2580 Met Ala Ser Phe Pro His Trp His Arg Leu Phe Val Lys Gln Met 2585 2590 2595 Glu Asp Ala Leu Ala Ala His Gly Ala His Ile Gly Ile Pro Tyr 2600 2605 2610 Trp Asp Trp Thr Ser Ala Phe Ser His Leu Pro Ala Leu Val Thr 2615 2620 2625 Asp His Glu His Asn Pro Phe His His Gly His Ile Ala His Arg 2630 2635 2640 Asn Val Asp Thr Ser Arg Ser Pro Arg Asp Met Leu Phe Asn Asp 2645 2650 2655 Pro Glu His Gly Ser Glu Ser Phe Phe Tyr Arg Gln Val Leu Leu 2660 2665 2670 Ala Leu Glu Gln Thr Asp Phe Cys Gln Phe Glu Val Gln Phe Glu 2675 2680 2685 Ile Thr His Asn Ala Ile His Ser Trp Thr Gly Gly His Thr Pro 2690 2695 2700 Tyr Gly Met Ser Ser Leu Glu Tyr Thr Ala Tyr Asp Pro Leu Phe 2705 2710 2715 Tyr Leu His His Ser Asn Thr Asp Arg Ile Trp Ala Ile Trp Gln 2720 2725 2730 Ala Leu Gln Lys Tyr Arg Gly Phe Gln Tyr Asn Ala Ala His Cys 2735 2740 2745 Asp Ile Gln Val Leu Lys Gln Pro Leu Lys Pro Phe Ser Glu Ser 2750 2755 2760 Arg Asn Pro Asn Pro Val Thr Arg Ala Asn Ser Arg Ala Val Asp 2765 2770 2775 Ser Phe Asp Tyr Glu Arg Leu Asn Tyr Gln Tyr Asp Thr Leu Thr 2780 2785 2790 Phe His Gly His Ser Ile Ser Glu Leu Asp Ala Met Leu Gln Glu 2795 2800 2805 Arg Lys Lys Glu Glu Arg Thr Phe Ala Ala Phe Leu Leu His Gly 2810 2815 2820 Phe Gly Ala Ser Ala Asp Val Ser Phe Asp Val Cys Thr Pro Asp 2825 2830 2835 Gly His Cys Ala Phe Ala Gly Thr Phe Ala Val Leu Gly Gly Glu 2840 2845 2850 Leu Glu Met Pro Trp Ser Phe Glu Arg Leu Phe Arg Tyr Asp Ile 2855 2860 2865 Thr Lys Val Leu Lys Gln Met Asn Leu His Tyr Asp Ser Glu Phe 2870 2875 2880 His Phe Glu Leu Lys Ile Val Gly Thr Asp Gly Thr Glu Leu Pro 2885 2890 2895 Ser Asp Arg Ile Lys Ser Pro Thr Ile Glu His His Gly Gly Asp 2900 2905 2910 His His Gly Gly Asp Thr Ser Gly His Asp His Ser Glu Arg His 2915 2920 2925 Asp Gly Phe Phe Arg Lys Glu Val Gly Ser Leu Ser Leu Asp Glu 2930 2935 2940 Ala Asn Asp Leu Lys Asn Ala Leu Tyr Lys Leu Gln Asn Asp Gln 2945 2950 2955 Gly Pro Asn Gly Tyr Glu Ser Ile Ala Gly Tyr His Gly Tyr Pro 2960 2965 2970 Phe Leu Cys Pro Glu His Gly Glu Asp Gln Tyr Ala Cys Cys Val 2975 2980 2985 His Gly Met Pro Val Phe Pro His Trp His Arg Leu His Thr Ile 2990 2995 3000 Gln Phe Glu Arg Ala Leu Lys Glu His Gly Ser His Leu Gly Ile 3005 3010 3015 Pro Tyr Trp Asp Trp Thr Lys Ser Met Ile Ala Leu Pro Ala Phe 3020 3025 3030 Phe Ala Asp Ser Ser Asn Ser Asn Pro Phe Tyr Lys Tyr His Ile 3035 3040 3045 Met Lys Ala Gly His Asp Thr Ala Arg Ser Pro Ser Asp Leu Leu 3050 3055 3060 Phe Asn Gln Pro Gln Leu His Gly Tyr Asp Tyr Leu Tyr Tyr Leu 3065 3070 3075 Ala Leu Ser Thr Leu Glu Glu Asp Asn Tyr Cys Asp Phe Glu Val 3080 3085 3090 His Tyr Glu Ile Leu His Asn Ala Val His Leu Trp Leu Gly Gly 3095 3100 3105 Thr Glu Thr Tyr Ser Met Ser Ser Leu Ala Phe Ser Ala Tyr Asp 3110 3115 3120 Pro Val Phe Met Ile Leu His Ser Gly Leu Asp Arg Leu Trp Ile 3125 3130 3135 Ile Trp Gln Glu Leu Gln Lys Leu Arg Lys Lys Pro Tyr Asn Ala 3140 3145 3150 Ala Lys Cys Ala Gly His Met Met Asp Glu Pro Leu His Pro Phe 3155 3160 3165 Asn Tyr Glu Ser Ala Asn His Asp Ser Phe Thr Arg Ala Asn Ala 3170 3175 3180 Lys Pro Ser Thr Val Phe Asp Ser His Lys Phe Asn Tyr His Tyr 3185 3190 3195 Asp Asn Pro Asp Val Arg Gly Asn Ser Ile Gln Glu Ile Ser Ala 3200 3205 3210 Ile Ile His Asp Leu Arg Asn Gln Pro Arg Val Phe Ala Gly Phe 3215 3220 3225 Val Leu Ser Gly Ile Tyr Thr Ser Ala Asn Val Lys Ile Tyr Leu 3230 3235 3240 Val Arg Glu Gly His Asp Asp Glu Asn Val Gly Ser Phe Val Val 3245 3250 3255 Leu Gly Gly Pro Lys Glu Met Pro Trp Ala Tyr Glu Arg Ile Phe 3260 3265 3270 Lys Tyr Asp Ile Thr Glu Val Ala Asn Arg Leu Asn Met His His 3275 3280 3285 Asp Asp Thr Phe Asn Phe Arg Leu Glu Val Gln Ser Tyr Thr Gly 3290 3295 3300 Glu Met Val Thr His His Leu Pro Glu Pro Leu Ile Ile Tyr Arg 3305 3310 3315 Pro Ala Lys Gln Glu Tyr Asp Val Leu Val Ile Pro Leu Gly Ser 3320 3325 3330 Gly His Lys Leu Pro Pro Lys Val Ile Val Lys Arg Gly Thr Arg 3335 3340 3345 Ile Met Phe His Pro Val Asp Asp Thr Val Asn Arg Pro Val Val 3350 3355 3360 Asp Leu Gly Ser His Thr Ala Leu Tyr Asn Cys Val Val Pro Pro 3365 3370 3375 Phe Thr Tyr Asn Gly Tyr Glu Leu Asp His Ala Tyr Ser Leu Arg 3380 3385 3390 Asp Gly His Tyr Tyr Ile Ala Gly Pro Thr Lys Asp Leu Cys Thr 3395 3400 3405 Ser Gly Asn Val Arg Ile His Ile His Ile Glu Asp Glu 3410 3415 3420

Claims (12)

1 내지 20개의 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 모이어티(들)와 공유 결합된 복수 개의 글로보 H 모이어티 및 α-갈락토실-세라미드 (α-GalCer) 아주반트를 포함하는 조성물로서, 여기서 글로보 H 모이어티는 1개 이상의 아미노산 잔기 상에서 KLH 모이어티에 공유 결합되고, KLH 모이어티 서브유닛에 공유 결합된 글로보 H 모이어티는 4-(4-N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실 히드라지드 (MMCCH) 결합에 의해 결합되며, 약 800 내지 약 3200 범위의 에피토프/담체 비율을 갖는, 조성물.

제1항에 있어서, 아미노산 잔기가 염기성, 중성, 소수성 아미노산 잔기 및/또는 이들의 조합인 조성물.

제1항 또는 제2항에 있어서, 아미노산 잔기가 리신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파라긴, 프롤린, 글루타민 및/또는 이들의 조합인 조성물.

제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, KLH 모이어티가 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체, 칠량체, 팔량체, 구량체, 십량체, 십일량체, 십이량체, 십삼량체, 십사량체, 십오량체, 십육량체, 십칠량체, 십팔량체, 십구량체 또는 이십량체인 조성물.

제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 글로보 H 모이어티가 (Fucα1→2 Galβ1→3 GalNAcβ1→3 Galα1→4 Galβ1→4 Glc)를 포함하는 것인 조성물.

제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, KLH 모이어티 서브유닛이 서열식별번호 1 또는 서열식별번호 2와 적어도 80% 동일한 것인 조성물.

환자의 암 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물.

제7항에 있어서, 암이 유방암, 폐암, 간암, 구강암, 위암, 결장암, 비인두암, 피부암, 신장암, 뇌종양, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 장암, 췌장암 또는 방광암인 조성물.

제8항에 있어서, 암이 글로보 H를 발현하는 암인 조성물.

제1항에 있어서, α-GalCer 아주반트가 하기 구조를 갖는 조성물:
.

제1항에 있어서, KLH 모이어티가 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체, 칠량체, 팔량체, 구량체, 십량체, 십일량체, 십이량체, 십삼량체, 십사량체, 십오량체, 십육량체, 십칠량체, 십팔량체, 십구량체 또는 이십량체를 형성할 수 있는 것인 조성물.

제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 제 1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 조성물을 유효량만큼 투여하는 것을 포함하는 상기 대상체에서 항체를 유도하는 방법에 사용하기 위한 조성물.

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