TWI641383B - 碳水化合物疫苗之化合物及組成物以及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明涵蓋包括Globo H-KLH共軛及/或治療抗體的治療組成物、以及製造與使用該治療組成物以治療增殖性疾病像是癌症的方法。治療共軛物包括連接至載體的抗原。特別是治療共軛物包括Globo H部分及替選地透過連接物連接的KLH部分及/或衍生化的KLH部分次單元。治療組成物一部分係設想作為癌症疫苗用於促效身體的自然能力透過免疫系統以保護自己免於藉由損傷或異常細胞像是癌細胞所造成之危險。有效的免疫反應是一種減少疾病嚴重性的免疫反應，包括但不限於，疾病的防止、疾病發病之延緩、症狀嚴重性之減少、降低之發病率以及延緩之死亡率。

Description

碳水化合物疫苗之化合物及組成物以及其用途
本發明一般而言包含癌症免疫療法之組成物及方法，且特別是能夠引出抗癌免疫反應之免疫性醣共軛物(glycoconjugate)。
合成碳水化合物共軛以引出抗體的用途首先被Goebel與Avery於1929年演示。(Goebel,W.F.及Avery,O.T.,J.實驗醫學期刊(Exp.Med.)，1929年，50，521；Avery,O.T.及Goebel,W.F.,J.實驗醫學期刊，1929年，50，533)碳水化合物透過醣苷重氯苯(benzenediazonium glycosides)被連接至載體蛋白。施以合成抗原的兔子的免疫反應產生多株抗體。其他研究者(Allen,P.Z.及Goldstein,I.J.，生物化學(Biochemistry)，1967年，6，3029；Rude,E.及Delius,M.M.，碳水化合物研究(Carbohydr.Res.)，1968年，8，219；Himmelspach,K.等人，歐洲免疫學期刊(Eur.J.Immunol.)，1971年，1，106；Fielder,R.J.等人，免疫學期刊(J.Immunol.)，1970年，105，265)發展相似的技術用於碳水化合物對蛋白載體的共軛作用。
醣共軛物可被使用在從疫苗接種以特異地定位腫瘤細胞上習知的標靶介質所產生的主動免疫療法。對碳水化合物抗原的反應通常不網羅T細胞的使用，其有助於體內對腫瘤的排斥。而作為施以共軛物的疫苗接種之結果之完全腫瘤排斥之概率被認為是不太可能的，這樣的治療將促進免疫監控且新腫瘤集落的復發可得以減少。(Dennis,J.，《牛津醣系統醣新知第二版(Oxford Glycosystems Glyconews Second)》，1992年；Lloyd,K.O.於《施以疫苗的癌症特異免疫療法(Specific Immunotherapy of Cancer with Vaccines)》，1993年，紐約科學研究院(New York Academy of Sciences)，50-58)。Toyokuni與Singhal描述一種激發可測量之IgG效價的合成醣共軛物(Toyokuni,T.等人，美國化學學會期刊(J.Am.Chem.Soc.)，1994年，116，395)，其為顯著結果，因為IgG反應通常與輔助T細胞的徵募(enlistment)相關聯。
碳水化合物抗原Globo H(Fucα1→2 Galβ1→3 GalNAcβ1→3 Galα1→4 Galβ1→4 Glc)被第一個分離，作為神經醯胺連接的醣脂質，且被Hakomori等人在1984年從乳癌MCF-7細胞中鑑定。(Bremer E G等人(1984年)，生物化學期刊(J Biol Chem)，259：14773-14777)。進一步研究抗-Globo H單株抗體顯示Globo H出現在許多其他癌症，包括前列腺癌、胃癌、胰臟癌、肺癌、卵巢癌以及結腸癌，且在免疫系統非輕易可及的正常分泌組織的腔內表面僅有最小表現。(Ragupathi G等人，(1997年)，應用化學國際版(Angew Chem Int Ed)，36：125-128)。此外，被建立的是乳癌病患的血清中含有抗-Globo H抗體的高濃度。(Gilewski T等人，(2001年)，美國國家科學研究院論文集(Proc Natl Acad Sci USA)，98：3270-3275；Huang C-Y，等人，(2006年)，美國國家科學研究院論文集，103：15-20；Wang C-C，等人，(2008年)，美國國家科學研究院論文集，105(33)： 11661-11666)。Globo H-陽性腫瘤的病患顯示較短的存活率，相比於有Globo H-陰性腫瘤的病患。(Chang,Y-J等人，(2007年)，美國國家科學研究院論文集，104(25)：10299-10304)。這些發現呈現Globo H-為六醣類(hexasaccharide)表位，具吸引力的腫瘤標記與用於癌症免疫接種發展之可行標靶。
與免疫佐劑結合之合成Globo H疫苗係顯示為在前列腺及轉移性乳癌病患中誘導主要為IgM以及較少程度的IgG抗體。在第一期臨床試驗中，疫苗也顯示最小的毒性以及在疫苗接種部位之短暫局部皮膚反應。(Gilewski T等人，(2001年)，美國國家科學研究院論文集，98：3270-3275；Ragupathi G等人，(1997年)，應用化學國際版，36：125-128；Slovin S F等人(1997年)，美國國家科學研究院論文集，96：5710-5715)。在某些病患中觀察到的輕度類流感症狀大概是與QS-21的副作用有關聯。含有五個前列腺癌與乳癌相關聯的碳水化合物抗原──Globo-H、GM2、STn、TF以及Tn──共軛至經順丁烯二醯亞胺(maleimide)修飾的載體蛋白KLH的五價疫苗被報告以生產在ELISA測定中有著高於IgM之較高效價的IgG的抗Globo H血清。(Zhu J.等人，(2009年)，美國化學學會期刊，131(26)：9298-9303)。
應當被理解的是KLH含有集合以形成十聚體的(decameric)(10-mer)、二十聚體的(didecameric)(20-mer)、以及更大顆粒的醣基化多肽次單元。這些多聚體結構係藉由產生沉澱係數為11-19S之分離次單元以及沉澱係數為92-107S之二十聚體多聚體的超高速離心技術來定性。進一步已知的是多種因素可影響軟體動物血藍蛋白(mollusca hemocyanin)的尺寸分布，包括KLH。這些因素包括離子強度、pH、溫度、pO2、以及特定二價陽離子的可用性， 特別是鈣和鎂。目前發明人已經開發了主要包含KLH連接至複數個Globo H部分的二聚體和三聚體並有著增加功效的組成物。
雖然已經開發了疫苗以針對Globo H引出抗體反應，其抗癌功效由於Globo H的低抗原性是不能令人滿意的。能夠引出標靶Globo H之高度免疫反應的新疫苗是有需要的。
本發明通常涵蓋治療的及/或預防的組成物，包括Globo H，以及，免疫治療劑、疫苗、劑型、套組、及製造方法、以及其治療。
在一個實施例中，本發明涵蓋分離治療共軛物，其包含連接至鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)部分次單元的Globo H部分。在某些實施例中，所述鍵聯是共價鍵。
在另一個實施例中，本發明涵蓋分離治療共軛物，其包含共價地連接至鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)部分次單元的Globo H部分，其中KLH是衍生化的KLH。當指稱Globo-H以及KLH時，如本文所使用的術語「共價地連接(covalently linked)」表示：Globo-H係直接共價地連接至KLH、或Globo-H共價地連接至衍生化KLH(如本文所闡述)、或Globo-H係透過一連接物基團共價地連接至KLH(如本文所述)、或是Globo-H透過連接物基團和衍生化KLH兩者共價地連接至KLH。
在特定繪示的實施例中，本發明的衍生化KLH具有以下結構：
在另一個實施例中，本發明涵蓋分離治療共軛物，其包含透過連接物分子共價地連接至鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)部分次單元之Globo H部分。
在較佳實施例中，Globo H部分結合至KLH部分次單元的離胺酸殘基。
在一實施例中，每KLH部分次單元有總共全部確切為或是大約145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160的離胺酸殘基，其可用於實質上直接或間接地結合Globo H部分。
在另一個實施例中，本發明涵蓋分離治療共軛物，其包含透過4-(4-N-順丁烯二醯亞胺甲基)環己烷-1-羧醯肼(4-(4-N-maleimjdomethyl)cyclohexane-1-carboxyl hydrazide，MMCCH)連接物基團共價地連接至鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)部分次單元之Globo H部分。本發明的MMCCH連接物具有下列結構：
在另一個說明實施例中，本發明涵蓋具有以下一般結構的分離治療共軛物： 其中n是從約1至約160的整數。在特定實施例中，單體的KLH部分可包括約1至約160個Globo H部分。所屬領域具有通常知識者將辨識所繪示的結構為亞胺的(iminium)氫氯化物鹽類，但也可作為亞胺形式存在或共存在。因此，本發明涵蓋亞胺以及其包括亞胺的氫氯化物鹽類的鹽類兩者。在特定實施例中，單體的KLH部分可包括約1至約125個Globo H部分。在特定實施例中，單體的KLH部分可包括約1至約100個Globo H部分。在特定實施例中，單體的KLH部分可包括約1至約75個Globo H部分。在特定實施例中，單體的KLH部分可包括約1至約50個Globo H部分。在特定實施例中，單體的KLH部分可包括約1至約25個Globo H部分。在特定實施例中，單體的KLH部分可包括約1至約10個Globo H部分。
在特定實施例中，Globo H部分在鹼性胺基酸殘基上被共價地共軛至KLH部分。在特定實施例中，鹼性胺基酸殘基是精胺酸(arginine)、離胺酸、組胺酸(histidine)、或其組合。
在另一個實施例中，Globo H部分被結合至單體的KLH部分次單元上的離胺酸共軛位點。
在另一個實施例中，在各個單體的KLH部分次單元上有確切為或大約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、 93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109或110個可用於結合至或準確地結合至Globo H部分的離胺酸共軛位點。在另一個實施例中，在各個KLH部分次單元上有62、66、67、68、70、72、76、86、87、88、90、92、93、100個這樣的離胺酸共軛位點。
在包含部分次單元的混合物(例如，KLH1及KLH2或其變異型)之特定的治療組成物實施例中，全部可用的離胺酸(對於兩者次單元而言)，如橫跨不同次單元類型被一起計算且數目可為或確切為是大約290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309或310。在這樣的實施例中，橫跨不同次單元(例如，KLH1和KLH2或其變異型)一起有或可為確切為或大約130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159或160個離胺酸共軛位點。在其他這樣的實施例中，有136、137、141、140、143、147或155個離胺酸共軛位點。
在另一個繪示實施例中，本發明涵蓋具有下列一般結構的分離治療共軛物： 其中n獨立地為約1至約3000的整數，且m獨立地為約1至約20的整數。在特定實施例中，當m大於1，KLH部分可聚集以形成多聚體結構。在特定實施例中，所述聚集作用是共價鍵結。在特定其他實施例中，聚集作用非為共價鍵結(例如，聚集作用是藉由H-鍵結或疏水交互作用所形成)。在特定實施例中，單體的KLH 部分(即，其中m=1)可包括約1至約160個Globo H部分。在特定實施例中，二聚體的KLH部分(即，其中m=2)可包括約1至約300個Globo H部分。在特定實施例中，三聚體的KLH部分(即，其中m=3)可包括約1至約450個Globo H部分。在特定實施例中，四聚體的KLH部分(即，其中m=4)可包括約1至約600個Globo H部分。在特定實施例中，五聚體的KLH部分(即，其中m=5)可包括約1至約750個Globo H部分。
在另一個圖示的實施例中，本發明涵蓋具有以下一般結構的分離治療共軛物：
其中n獨立地為約1至約150的整數且m獨立地為約1至約20的整數。
在另一個實施例中，本發明涵蓋具有下列一般結構的分離治療共軛物： 其中n獨立地為約1至約160的整數，且其中m獨立地為約1至約20的整數。在特定實施例中，m為約1至約5的整數。在特定實施例中，m為約1至約3的整數。在特定實施例中，m是1。在特定實施例中，m是2。在特定實施例中，m是3。在特定實施例中，m是4。在特定實施例中，m是5。在特定實施例中，m是6。在特定實 施例中，m是7。在特定實施例中，m是8。在特定實施例中，m是9。在特定實施例中，m是10。在特定實施例中，m是11。在特定實施例中，m是12。在特定實施例中，m是13。在特定實施例中，m是14。在特定實施例中，m是15。在特定實施例中，m是16。在特定實施例中，m是17。在特定實施例中，m是18。在特定實施例中，m是19。在特定實施例中，m是20。在特定實施例中，對於任何上述實施例，當m是1至20，各個n分別是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、或160。
在特定實施例中，有一個以上的Globo H部分附著至各個單體的KLH部分。在特定說明實施例中，附著至各個KLH部分之一個以上的Globo H部分係透過一連接物附著。在其他說明實施例中，附著至各個KLH部分的一個以上的Globo H部分係透過連接物附著且被附著至衍生化的KLH部分。
在另一個實施例中，Globo H部分比KLH部分次單元的比值是至少1。在另一個實施例中，Globo H部分比KLH部分次單元的比值是至少10。在 另一個實施例中，Globo H部分比KLH部分的比值是至少25。在另一個實施例中，Globo H部分比KLH部分次單元的比值是至少50。在進一步實施例中，Globo H部分比KLH部分次單元的比值是至少100。在進一步實施例中，Globo H部分比KLH部分次單元的比值是至少150。在又另一個實施例中，Globo H部分比KLH部分次單元的比值是至少500。在又另一個實施例中，Globo H部分比KLH部分次單元的比值是至少750。在仍另一個實施例中，Globo H部分比KLH部分次單元的比值是至少1000。在仍另一個實施例中，Globo H部分比KLH部分次單元的比值是至少1500。在仍另一個實施例中，Globo H部分比KLH部分次單元的比值是至少2000。
在多種實施例中，本發明涵蓋KLH之單一單體比各具有附接的多個Globo H部分的多個KLH次單元(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20)。在特定實施例中，Globo H部分比KLH部分的比值是相同的。在其他實施例中，Globo H部分比KLH部分的比值是不同的。
本發明的另一個實施例涵蓋組成物，其包含至少兩個KLH部分。舉例來說，衍生化的KLH部分為二聚體的形式。在另一個實施例中，至少兩個KLH部分是相同的。在另一個實施例中，至少兩個KLH部分是相異的。在進一步實施例中，至少兩個KLH部分具有相同的Globo H部分比KLH部分次單元比值。在仍進一步實施例中，至少兩個KLH部分具有不同的Globo H部分比KLH部分次單元比值。
本發明的另一個實施例涵蓋包含至少三個KLH部分之治療組成物，舉例來說，衍生化KLH部分為三聚體的形式。在特定實施例中，至少三個KLH部分是相同的。在另一個實施例中，至少三個KLH部分是不相同的。在進 一步實施例中，至少三個KLH部分具有相同的Globo H部分比KLH部分次單元比值。在仍進一步實施例中，至少三個KLH部分具有不同的Globo H部分比KLH部分次單元比值。
本發明的另一個實施例涵蓋包含至少四個KLH部分之治療組成物，舉例來說，衍生化的KLH部分為四聚體的形式。在特定實施例中，至少四個KLH部分是相同的。在另一個實施例中，至少四個KLH部分是不相同的。在進一步實施例中，至少四個KLH部分具有相同的Globo H部分比KLH部分次單元比值。在仍進一步實施例中，至少四個KLH部分具有不同的Globo H部分比KLH部分次單元比值。
本發明的另一個實施例涵蓋包含至少五個KLH部分之治療組成物，舉例來說，衍生化的KLH部分為五聚體的形式。在特定實施例中，至少五個KLH部分是相同的。在另一個實施例中，至少五個KLH部分是不相同的。在進一步實施例中，至少五個KLH部分具有相同的Globo H部分比KLH部分次單元比值。在仍進一步實施例中，至少五個KLH部分具有不同的Globo H部分比KLH部分次單元比值。
本發明的另一個實施例涵蓋包含至少六個KLH部分之治療組成物，舉例來說，衍生化的KLH部分為六聚體的形式。在特定實施例中，至少六個KLH部分是相同的。在另一個實施例中，至少六個KLH部分是不相同的。在進一步實施例中，至少六個KLH部分具有相同的Globo H部分比KLH部分次單元比值。在仍進一步實施例中，至少六個KLH部分具有不同的Globo H部分比KLH部分次單元比值。
在一實施例中，Globo H部分包含(Fucα1→2 Galβ1→3 GalNAcβ1→3 Galα1→4 Galβ1→4 Glc)。在進一步實施例中，KLH部分次單元是KLH-1或KLH-2部分或其組合。當在本文所使用時，術語「KLH」指稱KLH-1、KLH-2及/或其組合。
在另一個實施例中，KLH部分次單元係至少99%相同於相應的天然KLH部分次單元。
在另一個實施例中，KLH部分次單元係至少95%相同於相應的天然KLH部分次單元。
在另一個實施例中，KLH部分次單元係至少90%相同於相應的天然KLH部分次單元。
在另一個實施例中，KLH部分次單元係至少80%相同於相應的天然KLH部分次單元。
在另一個實施例中，KLH部分次單元係至少70%相同於相應的天然KLH部分次單元。
在另一個實施例中，KLH部分次單元係至少60%相同於相應的天然KLH部分次單元。
在另一個實施例中，Globo H部分係透過連接物共價地連接至鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)部分次單元。在又進一步實施例中，Globo H部分係藉由4-(4-N-順丁烯二醯亞胺甲基)環己烷-1-羧醯肼(MMCCH)鍵聯共價地連接至鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)部分次單元。在另一個進一步實施例中，Globo H部分係共價地連接至衍生化的鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)部分次單元且係藉由4-(4-N-順丁烯二醯亞胺甲基)環己烷-1-羧醯肼(MMCCH)鍵聯連接。
在另一個實施例中，分離治療共軛物基於具有約350KDa至約400KDa的分子量的KLH單體，而具有至少或約150的表位比值。在另一個實施例中，分離治療共軛物具有至少或約100的表位比值。在進一步實施例中，分離治療共軛物具有至少或約75的表位比值。在仍進一步實施例中，分離治療共軛物具有至少或約50的表位比值。在又進一步實施例中，分離治療共軛物具有至少或約25的表位比值。在仍另一個實施例中，分離治療共軛物具有至少或約15的表位比值。在仍另一個實施例中，分離治療共軛物具有至少或約5的表位比值。在仍另一個實施例中，分離治療共軛物具有至少或約1的表位比值。
本發明的另一個實施例涵蓋包含KLH部分次單元的醫藥組成物，其中各個KLH部分次單元包含共價地連接至鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)部分次單元的一個或多個Globo H部分。在特定實施例中，醫藥組成物包含至少兩個KLH部分次單元的二聚體，其中各個KLH部分次單元包含共價地連接至KLH部分次單元的一個或多個Globo H部分。在特定實施例中，醫藥組成物包含至少三個KLH部分次單元的三聚體，其中各個KLH部分次單元包含共價地連接至KLH部分次單元的一個或多個Globo H部分。在特定實施例中，醫藥組成物包含至少四個KLH部分次單元，其中各個KLH部分次單元包含共價地連接至KLH部分次單元的一個或多個Globo H部分。在特定實施例中，醫藥的組成物包含KLH部分次單元的混合物(例如，單體、二聚體、三聚體、四聚體、五聚體等)，其中各個KLH部分次單元包含共價地連接至KLH部分次單元的多個Globo H部分。
本發明的另一個態樣關於包含KLH部分之單體、二聚體、三聚體、四聚體、或五聚體或其組合的醫藥組成物，其中各個KLH包含共價地連接至鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)部分次單元的一個或多個Globo H部分。
在本發明的實施例中，組成物內的治療共軛物的表位比值範圍從約1至3000。在進一步實施例中，組成物內的治療共軛物的表位比值範圍為約75至2000。在仍另一個實施例中，組成物內的治療共軛物的表位比值範圍為約100至1000。在又進一步實施例中，組成物內的治療共軛物的平均表位比值範圍為約150至500。
在另一個實施例中，在組成物內的治療共軛物的約1%至約99%是KLH單體。在進一步實施例中，在組成物內的治療共軛物的約0%至約99%是KLH二聚體。在仍另一個實施例中，在組成物內的治療共軛物的約0%至約99%是KLH三聚體。在又另一個實施例中，在組成物內的治療共軛物的約0%至約99%是KLH四聚體。在進一步實施例中，在組成物內的治療共軛物的約1%至約99%是KLH五聚體。在又另一個實施例中，在組成物內的治療共軛物的約0%至約99%包括6個KLH次單元。在又另一個實施例中，在組成物內的治療共軛物的約0%至約99%包括7個KLH次單元。在又另一個實施例中，在組成物內的治療共軛物的約0%至約99%包括8個KLH次單元。在又另一個實施例中，在組成物內的治療共軛物的約0%至約99%包括9個KLH次單元。在又另一個實施例中，在組成物內的治療共軛物的約0%至約99%包括10個KLH次單元。在又另一個實施例中，在組成物內的治療共軛物的約0%至約99%包括11個KLH次單元。在又另一個實施例中，在組成物內的治療共軛物的約0%至約99%包括12個KLH次單元。在又另一個實施例中，在組成物內的治療共軛物的約0%至約99%包括13個KLH次單元。在又另一個實施例中，在組成物內的治療共軛物的約0%至約99%包括14個KLH次單元。在又另一個實施例中，在組成物內的治療共軛物的約0%至約99%包括15個KLH次單元。在又另一個實施例中，在組成物內的治療共軛物的約0%至約99% 包括16個KLH次單元。在又另一個實施例中，在組成物內的治療共軛物的約0%至約99%包括17個KLH次單元。在又另一個實施例中，在組成物內的治療共軛物的約0%至約99%包括18個KLH次單元。在又另一個實施例中，在組成物內的治療共軛物的約0%至約99%包括19個KLH次單元。在又另一個實施例中，在組成物內的治療共軛物的約0%至約99%包括20個KLH次單元。在仍另一個實施例中，在組成物內的治療共軛物的約1%至約99%是單體、二聚體、三聚體、四聚體或其組合。在仍另一個實施例中，在組成物內的治療共軛物的約99%是單體、二聚體、三聚體、四聚體或其組合。
在另一個實施例中，醫藥組成物包含佐劑，其包括，但不限於，弗氏佐劑(Freund’s adjuvant)、類鐸受體分子(Toll-Like Receptor molecules)、LPS、脂蛋白、脂肽、鞭毛蛋白(flagellin)、雙股RNA、病毒DNA、未甲基化CpG島區(CpG island)、左旋咪唑(levamisole)、卡介苗(bacillus Calmette-Guerin)、異丙肌苷(Isoprinosine)、日達仙(Zadaxin)、PD-1拮抗劑、PD-1抗體、CTLA拮抗劑、CTLA抗體、介白素、細胞介素、GM-CSF、醣脂體、鋁鹽鹼基(aluminum salt based)、磷酸鋁(aluminum phosphate)、明礬、氫氧化鋁、脂質體、TLR2促效劑、脂肽、奈米粒子、單磷醯脂質A(monophosphoryl lipid A)、OBI-821皂素、QS-21皂素、水中油奈米乳液(oil in water nano-emulsions)、以及細菌樣顆粒。
在另一個實施例中，醫藥組成物包含選自由IL-2、IL-12、IL-18、IL-2、IFN-γ、TNF、IL-4、IL-10、IL-13、IL-21、GM-CSF以及TGF-β所組成的群組中的細胞介素。在進一步實施例中，醫藥組成物包含趨化介素。
在進一步實施例中，治療劑係作為醫藥組成物給藥。
在仍另一個實施例中，醫藥組成物包含單株抗體、化學療劑(chemotherapeutics)、荷爾蒙治療劑、類視色素(retinoid)受體調節子、細胞毒性/細胞生長抑制劑、抗癌劑(antineoplastic agent)、抗增生劑(antiproliferative agent)、抗-mTOR劑、抗-Her2劑、抗-EGFR劑、異戊二烯基-蛋白轉移酶抑制劑(prenyl-protein transferase inhibitors)、HMG-CoA還原酶抑制劑、氮芥類(nitrogen mustard)、亞硝基脲(nitroso urea)、血管生成抑制劑、必化思沃蜜(bevacizumab)、細胞增生和存活傳訊路徑的抑制劑、細胞凋亡誘導劑、干擾細胞週期檢查點的藥劑、干擾受體酪胺酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTKs)的藥劑、整合素阻斷劑、NSAIDs、PPAR促效劑、先天的多重抗藥性(MDR)的抑制劑、鎮吐劑、有用於貧血的治療的藥劑、有用於嗜中性球減少症(neutropenia)的治療的藥劑、免疫增強藥物、雙磷酸鹽、芳香酶抑制劑、誘導贅生細胞的最後分化的藥劑、γ-分泌酶抑制劑、癌症疫苗(例如，主動免疫療法)、單株抗體治療劑(例如，被動免疫療法)、以及任何其組合。
在另一個實施例中，本發明的治療組成物可進一步包括PD1/PD-L1抑制劑(細胞毒性T細胞淋巴球(CLTs)免疫療法)、CTLA-4免疫療法、CDK4/6抑制劑(標靶治療)、PI3K抑制劑(標靶治療)、mTOR抑制劑(標靶治療)、AKT抑制劑(標靶治療)、Pan-Her抑制劑(標靶治療)。這些抑制劑也可被修飾以產生個別的單株抗體。這樣的抗體可被包括進本發明的治療組成物中。
在另一個實施例中，醫藥組成物包含醫藥上可接受的載體。在進一步實施例中，醫藥組成物是癌症疫苗。在仍另一個實施例中，醫藥組成物被配制用於皮下給藥。在仍另一個實施例中，醫藥組成物被配製用於肌內給藥。 在仍另一個實施例中，醫藥組成物被配製用於動脈給藥。在仍另一個實施例中，醫藥組成物被配製用於靜脈內給藥。
本發明的另一個實施例涵蓋治療有需求的病患之方法，其包含施以病患包含Globo H與KLH的治療組成物的治療有效量。在一個實施例中，病患已經被診斷出或被懷疑患有癌症。在另一個實施例中，癌症是上皮癌症。在進一步實施例中，癌症是乳癌。在仍另一個實施例中，在醫藥/治療組成物內，Globo-H部分的治療有效量可介於約0.001μg/kg至約250mg/kg。在又進一步實施例中，在醫藥/治療組成物內，有效治療量Globo-H部分包含每劑量一個治療共軛物的約10μg/kg至約50μg/kg。在又進一步實施例中，在醫藥/治療組成物內，有效治療量Globo-H部分包含每劑量一個治療共軛物的約0.10μg/kg至約0.75μg/kg。
在仍另一個實施例中，在治療組成物中Globo-H-KLH複合物的治療有效量可介於約0.001μg/kg至約250mg/kg。在又進一步實施例中，在治療組成物中Globo-H-KLH複合物的治療有效量包含每劑量一個治療共軛物約10μg/kg至約50μg/kg。在又進一步實施例中，在治療組成物中Globo-H-KLH複合物的治療有效量包含每劑量一個治療共軛物的約0.60μg/kg至約4.50μg/kg。
在仍另一個實施例中，該方法能夠延展無進程存活期超過控制組安慰劑大約或至少1週。在仍另一個實施例中，該方法能夠延展無進程存活期超過控制組安慰劑大約或至少2週。在仍另一個實施例中，該方法能夠延展無進程存活期超過控制組安慰劑大約或至少1個月。在仍另一個實施例中，該方法能夠延展無進程存活期超過控制組安慰劑大約或至少3個月。在仍另一個實施例中， 該方法能夠延展無進程存活期超過控制組安慰劑大約或至少6個月。在又另一個實施例中，該方法能夠延展無進程存活期超過控制組安慰劑大約或至少12個月。
當與隨後的詳細描述搭配考量時，本發明的更完整理解可藉由參考附圖來獲得。在圖式中所繪示的實施例僅旨在舉例說明本發明且不應被解釋為限制本發明於所繪示的實施例。
第1A圖顯示化學結構Globo H以及幾個例示性Globo H類似物。Glc代表葡萄糖，Gal代表半乳糖，GalNAc代表N-乙醯半乳胺糖(N-acetylgalactosamine)，且Fuc代表海藻糖(fucose)。第1B圖顯示例示性Globo H-KLH次單元被MMCCH連接物的方式被共軛接合。
第2A圖顯示示例的Globo H-KLH次單元共軛作用合成路徑。第2B圖顯示本發明的Globo H-KLH二聚體和三聚體相比於被揭露於Slovin等人(1999年)，美國國家科學研究院論文集，96：5710-5以及Gilewski等人(2001年)，美國國家科學研究院論文集，98：3270-5之Globo H共軛物。
第3圖顯示天然KLH(8.3MDa)的多角度雷射散射光譜測定法(multi-angle laser scattering spectrometry，MALS)的結果。
第4圖顯示天然KLH(8.3MDa)的粒徑篩析層析法(size exclusion chromatography)的結果。
第5圖顯示以根據本發明的Globo H-KLH醣共軛物被免疫的Lewis大鼠內的B/CD3+T/CD4+T/CD8+T細胞族群的時序增生(chronological expansion)。分圖A-D分別表示B細胞、CD3 T細胞、CD4 T細胞、以及CD8 T細 胞族群。資料係以標準化為PBS群體的細胞數目的百分比的指示性群體內的細胞數目的百分比來呈現。多種比較係使用雙因子變異數(two-way ANOVA)，接續Bonferroni事後檢測(Bonferroni’s post hoc test)來分析。*：p<0.05，**：p<0.01，以及***：p<0.001相比於PBS。
第6圖顯示來自以本發明的醣共軛物(Globo H-KLH)被免疫的Lewis大鼠的血液內之(A)IgM抗體及(B)IgG抗體的交互效價(reciprocal titers)中的時序變化。
第7圖顯示在小鼠內反應於本發明的醣共軛物(Globo H-KLH)的IgM抗體效價。
第8圖繪示在第0天、第5天、以及第10天以PBS、僅佐劑、或Globo H-KLH加上佐劑免疫化的C57BL/6小鼠的免疫原性。在第14天收集血清用於ELISA分析以測定抗-Globo H IgG以及IgM產出。
第9圖繪示其中Globo H(+)或Globo H(-)TOV21G細胞被種在96-孔盤內的補體依賴性細胞毒性(complement dependent cytotoxicity)。抗-Globo H血清或控制組血清以1：50或1：100的稀釋度被加入。接著孔盤被加入或無添加補體。補體依賴性細胞毒性(CDC)係以LDH測試來測定。
第10圖繪示被種在96-孔盤內的Globo H(+)or Globo H(-)TOV21G細胞的細胞毒性。抗-Globo H血清或控制組血清以1：50或1：100的稀釋度被加入。從末梢血液單核球細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中分離以及以抗-CD3抗體活化的人類NK細胞被使用作為作用細胞(effector cell)。作用細胞接著於抗體依賴細胞媒介細胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)反應以4：1、2：1、或1：1的ET比值被添加或不被添加。細胞毒性在不同ET比值中以各個細胞的無小鼠血清控制組被標準化。
第11圖繪示在第0天以1x 106 Globo H-陽性TOV21G細胞作腹膜內注射的經照射NOD-SCID小鼠。抗血清分別地從在3個不同處理(PBS、僅佐劑、以及Globo H-KLH/佐劑)的3個疫苗接種之後的C57BL/6小鼠收集。NOD-SCID小鼠針對各個小鼠在第0、2、4、6、9、11、13、及16天腹膜內給予200μl的前述抗血清。腫瘤圖像以IVIS成像系統在第3天、第7天和第9天追蹤。
第12圖繪示在第0、5、及11天時以PBS、僅佐劑、以及Globo H-KLH/佐劑作皮下疫苗接種之Globo H KLH免疫化的C57BL/6小鼠上之LLC1(肺癌上皮癌細胞株(lung cancer epithelial cancer cell line))腫瘤生長。1x105 LLC1細胞於第16天被皮下注射進入各個小鼠。該處理接著在第29天和第34天被皮下給藥。腫瘤尺寸在第16、21、25、29、32、34、37天被監測。
第13圖顯示胜肽鑑定的一覽表。
第14圖繪示樣本1(1st LC-MS/MS)對於KLH1(a)及KLH2(b)的Globo-H共軛胜肽的鑑定細節。
第15圖繪示樣本2(1st LC-MS/MS)對於KLH1(a)及KLH2(b)的Globo-H共軛胜肽的鑑定細節。
第16圖繪示樣本3(1st LC-MS/MS)對於KLH1(a)及KLH2(b)的Globo-H共軛胜肽的鑑定細節。
第17圖繪示樣本4(1st LC-MS/MS)對於KLH1(a)及KLH2(b)的Globo-H共軛胜肽的鑑定細節。
第18圖繪示樣本1(2nd LC-MS/MS)對於KLH1(a)及KLH2(b)的Globo-H共軛胜肽的鑑定細節。
第19圖繪示樣本2(2st LC-MS/MS)對於KLH1(a)及KLH2(b)的Globo-H共軛胜肽的鑑定細節。
第20圖繪示樣本3(2st LC-MS/MS)對於KLH1(a)及KLH2(b)的Globo-H共軛胜肽的鑑定細節。
第21圖繪示樣本4(1st LC-MS/MS)對於KLH1(a)及KLH2(b)的Globo-H共軛胜肽的鑑定細節。
第22圖繪示樣本1(1st LC-MS/MS)對於KLH1(a)及KLH2(b)的MMCCH-共軛胜肽的鑑定細節。
第23圖繪示樣本2(1st LC-MS/MS)對於KLH1(a)及KLH2(b)的MMCCH-共軛胜肽的鑑定細節。
第24圖繪示樣本3(1st LC-MS/MS)對於KLH1(a)及KLH2(b)的MMCCH-共軛胜肽的鑑定細節。
第25圖繪示樣本4(1st LC-MS/MS)對於KLH1(a)及KLH2(b)的MMCCH-共軛胜肽的鑑定細節。
第26圖繪示樣本1(2nd LC-MS/MS)對於KLH1(a)及KLH2(b)的MMCCH-共軛胜肽的鑑定細節。
第27圖繪示樣本2(2nd LC-MS/MS)對於KLH1(a)及KLH2(b)的MMCCH-共軛胜肽的鑑定細節。
第28圖繪示樣本3(2nd LC-MS/MS)對於KLH1(a)及KLH2(b)的MMCCH-共軛胜肽的鑑定細節。
第29圖繪示樣本4(1st LC-MS/MS)對於KLH1(a)及KLH2(b)的MMCCH-共軛胜肽的鑑定細節。
第30圖繪示對(1st LC-MS/MS)對於KLH1(a)及KLH2(b)，以及對(2nd LC-MS/MS)對於KLH1(a)及KLH2(b)的Globo-H共軛離胺酸鑑定之總結。
第31圖繪示對(1st LC-MS/MS)對於KLH1(a)及KLH2(b)，以及對(2nd LC-MS/MS)對於KLH1(c)及KLH2(d)的MMCCH-共軛離胺酸鑑定之總結。
第32圖繪示Globo-H共軛分析在第一(a)和第二(b)LC-MS/MS行程的總結。
第33圖繪示化學式：C(56)H(91)N(5)O(33)S(1)，單同位素的(Monoisotopic)MW附加：1393.5317Da以及圖示化學式：1. C(18)H(28)N(4)O(4)S(1)，單同位素的MW附加：396.1831Da；2.化學式：C(24)H(38)N(4)O(9)S(1)，單同位素的MW附加：558.2360Da；3.化學式：C(30)H(48)N(4)O(14)S(1)，單同位素的MW附加：720.2888Da；4.化學式：C(36)H(58)N(4)O(19)S(1)，單同位素的MW附加：882.3416Da；5.化學式：C(44)H(71)N(5)O(24)S(1)，單同位素的MW附加：1085.4210Da。
第34圖繪示MMCCH衍生物的化學結構。化學式：C(16)H(24)N(4)O(3)S(1)，單同位素的MW附加：352.1569Da以及圖示去醯胺基的MMCCH衍生物，化學式：C(16)H(22)N(2)O(4)S(1)，單同位素的MW附加：338.1300Da。
本發明的實踐將應用於所屬領域的技術範圍之分子生物學、微生物學和免疫學的常規技術，除非另有說明。這樣的技術在文獻中完整地被解釋。 參閱，舉例來說，《分子選殖實驗室手冊，第二版》(Molecular Cloning A Laboratory Manual,2nd Ed.)，Sambrook,Fritsch以及Maniatis編輯，冷泉港實驗室出版(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，1989年；《DNA選殖，第一冊和第二冊》(DNA Cloning,Volumes I and II)(D.N.Glover編著，1985年)；《動物細胞的培養》(Culture Of Animal Cells)(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987年)；《固定化細胞和酵素》(Immobilized Cells And Enzymes)(IRL出版，1986年)；B.Perbal，《對分子選殖的實踐引導》(A Practical Guide To Molecular Cloning)(1984年)；論著，《酵素學方法》(Methods In Enzymology)(科學院出版公司，紐約)；《用於哺乳動物細胞的基因轉移載體》(Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells)(J.H.Miller及M.P.Calos編著，1987年，冷泉港實驗室出版)；《酵素學方法》，卷154及155(Wu等人，編著)；《細胞與分子生物學的免疫化學方法》(Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology)(Mayer及Walker，編著，科學院出版，倫敦，1987年)；《抗體：實驗室手冊》(Antibodies：A Laboratory Manual)，Harlow及Lanes(冷泉港實驗室出版，1988年)；以及《實驗免疫學講義》(Handbook Of Experimental Immunology)，第一冊至第四冊(D.M.Weir以及C.C.Blackwell編，1986年)。
字詞「一(a)」或「一(an)」的使用當與術語「包含」一同使用時，在發明申請專利範圍內及/或說明書內可表示「一個」，但是也與「一個或多個」、「至少一個」、及「一個或一個以上」的含義相符。
本申請全文中，術語「約」用於指明一數值包括，例如，測量裝置的誤差的內在變異、被執行以測定值的方法、或者存在於研究對象之間的變異。典型地該術語是指涵蓋大約或小於1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、 9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%的變異性，視情況而定。
如本文所使用，術語「烷基」指稱含有，除另有說明，1-20個碳原子，例如，C1-C8或C1-C4，其可經取代或未經取代的直鏈或支鏈單價碳氫化合物。烷基的實例包括，但不限於，甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、和第三丁基(t-butyl)。
在發明申請專利範圍中所使用的術語「或」，除非明確指明以僅指稱替代物或替代品物係為相互排斥的，否則係被用於表示「及/或」，儘管揭露內容支持指稱僅替代品和「及/或」的定義。
如在本說明書和發明申請專利範圍內所使用的，字詞「包含(comprising)」(以及包含的任何形式，像是「包含(comprise)」和「包含(comprises)」)、「具有(having)」(以及具有的任何形式，像是「具有(have)」和「具有(has)」)、「包括(including)」(以及包括的任何形式，像是「包括(includes)」和「包括(include)」)或「含有(containing)」(以及含有的任何形式，像是「含有(contains)」和「含有(contain)」)是廣容性或開放式的且不排除額外的、未陳述的元素或方法步驟。可以思考的是，在本說明書中所討論的任何實施例可相對於任何方法或本發明的組成物來實現，反之亦然。更甚，本發明的組成物可被用以達成本發明的方法。
「治療」或「治療」在本文中被稱為治療組成物的給藥至受試者，目的在於治愈、緩和、解除、醫治、預防或改善病症、該病症的症狀、繼發病症的疾病狀態、或傾向病症的素因(predisposition)。
「有效量」是能夠產生醫學上期望的結果，如本文界定在治療的受試者內的治療組成物之量。醫學上期望的結果可以是客觀的(即，藉由一些測試或標記物測量)或主觀的(即，受試者給出的指示或感覺效果)。
在本文所指稱的「疾病適用於治療組成物之治療」表示任何程序、狀態、病症、疾病及/或發病，其可藉由本文所揭露的治療組成物的施用而被治療。
「增殖性病症(proliferative disorder)」是其中細胞的某些類型太多被產生而導致健康的惡化。增殖性病症可為良性或惡性。增殖性病症能包括，例如，癌症。
可藉由本文所揭露的治療組成物被治療的「癌症」，是細胞的異常生長。癌症細胞已失去正常控制機制，從而能夠連續地增殖、侵入鄰近組織、遷移至身體的遠處部位、以及促進藉以使細胞得到營養物質之新血管的生長。如本文所使用的，癌症可是惡性或良性。癌症可從身體內的任何組織發展。隨著細胞生長和繁殖，其形成一巨量的組織，稱為腫瘤。術語腫瘤指稱異常生長或異常質量。腫瘤可為癌性(惡性)或非癌性(良性)。癌性腫瘤可能侵犯鄰近組織，並擴散到整個身體(轉移)。良性腫瘤，然而，一般不侵犯鄰近組織且不傳遍整個身體。癌症可分為血液和血液形成組織的癌症(白血病和淋巴瘤)以及「實體」腫瘤。「實體」腫瘤可為癌或肉瘤。
可藉由本發明的治療組成物所治療的癌症包括以部位分類之包括口腔及咽(唇、舌、唾腺、口腔底、牙齦及其它口腔、鼻咽、扁桃腺、口咽、下咽(hypopharynx)、其他口腔/咽)的癌症；消化系統(食道、胃、小腸、結腸及直腸、肛門、肛管、及肛門直腸(anorectum)、肝、肝內膽管、膽囊、其他膽道等、 胰腺、腹膜後腔(retroperitoneum)、腹膜、繫膜(omentum)、及腸繫膜(mesentery)、其他消化系統)的癌症；呼吸系統(鼻腔、中耳、及鼻竇、喉、肺及支氣管、胸膜、氣管、縱膈(mediastinum)、以及其他呼吸系統)的癌症；間皮瘤(mesothelioma)的癌症；骨骼和關節的癌症；以及軟組織的癌症，包括心臟；皮膚癌，包括黑色素瘤以及其它非上皮皮膚癌；卡波西氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma)和乳癌；女性生殖系統(子宮頸、子宮體、子宮、卵巢、陰道、外陰(vulva)、及其他女性生殖器的)的癌症；男性生殖系統(前列腺、睾丸、陰莖、及其他男性生殖器官的)的癌症；泌尿系統(膀胱、腎及腎盂、輸尿管、及其他泌尿系統)的癌症；眼球和眼眶的癌症；腦和神經系統(腦、及其他神經系統)的癌症；內分泌系統(甲狀腺和其他內分泌，包括胸腺)的癌症；淋巴瘤(霍奇金氏病(Hodgkin’s disease)和非霍奇金氏病)、多發性骨髓瘤(multiple myeloma)、及白血病(淋巴球性白血病、骨髓性白血病、單核球白血病、及其它白血病)。
其他的癌症，依照組織學類型分類，可為根據本發明之治療性組成物適用的標的，包括，但不限於，腫瘤(neoplasm)，惡性的；癌，未另作規定(NOS)；癌，未分化，未另作規定；巨細胞和梭狀細胞癌；小細胞癌，未另作規定；乳頭狀癌，未另作規定；鱗狀細胞癌，未另作規定；淋巴上皮癌；基底細胞癌，未另作規定；毛髮基質癌(Pilomatrix carcinoma)；移行細胞癌，未另作規定；乳頭狀移行細胞癌；腺癌，未另作規定；胃泌素瘤，惡性的；膽管癌；肝細胞癌，未另作規定；合併肝細胞癌和膽管細胞癌；小梁状腺癌(Trabecular adenocarcinoma)；腺樣囊性癌(Adenoid cystic carcinoma)；腺瘤性息肉內腺癌(Adenocarcinoma in adenomatous polyp)；腺癌，家族性結腸息肉(polyposis coli)；實體瘤，未另作規定；類癌瘤(Carcinoid tumor)，惡性的；細支氣管肺泡腺癌； 乳頭狀腺癌，未另作規定；嫌色細胞癌(chromophobe carcinoma)；嗜酸細胞癌；嗜酸性腺癌；嗜鹼性球癌；透明細胞腺癌，未另作規定；顆粒細胞癌；濾泡腺癌，未另作規定；乳頭狀和濾泡狀腺癌；非被囊性硬化性癌(nonencapsulating sclerosing carcinoma)；腎上腺皮質腺癌；子宮內膜癌(Endometrioid carcinoma)；皮膚附器(Skin appendage)癌；頂泌腺腺癌(apocrine adenocarcinoma)；皮脂腺腺癌；耳垢腺腺癌；黏液性表皮樣癌(Mucoepidermoid carcinoma)；囊腺癌(cystadenocarcinoma)，未另作規定；乳頭狀囊腺癌(papillary cystadenocarcinoma)，未另作規定；乳頭狀漿液性(serous)囊腺癌；黏液性囊狀腺癌，未另作規定；黏液素腺癌；戒環細胞癌；浸潤性導管癌(Infiltrating duct carcinoma)；髓樣癌(medullary carcinoma)，未另作規定；小葉癌；炎性癌；佩吉特氏病(Paget's disease)，乳腺的；腺泡細胞(Acinar cell carcinoma)癌；腺鱗狀癌(adenosquamous carcinoma)；腺癌與鱗狀轉移瘤(adenocarcinoma w/squamous metaplasia)；胸腺瘤(thymoma)，惡性的；卵巢基質腫瘤，惡性的；卵泡膜細胞瘤(thecoma)，惡性的；粒層細胞腫瘤(Granulosa cell tumor)，惡性的；雄胚瘤(Androblastoma)，惡性的；塞特利氏細胞(Sertoli cell)癌；萊迪希氏細胞(Leydig cell)腫瘤，惡性的；脂質細胞腫瘤，惡性的；副神經節瘤，惡性的；外乳腺副神經節瘤(extra-mammary paraganglioma)，惡性的；嗜鉻細胞瘤(Pheochromocytoma)；皮膚絲球肉瘤(glomangiosarcoma)；惡性黑色素瘤(malignant melanoma)，未另作規定；非黑色素瘤(amelanotic melanoma)；表淺擴散性黑色素瘤；巨大色素痣內的惡性黑色素瘤(Malig melanoma in giant pigmented nevus)；上皮樣細胞黑色素瘤；藍色痣，惡性的；肉瘤，未另作規定；纖維肉瘤，未另作規定；纖維性組織細胞瘤，惡性的；黏液肉瘤；脂肪肉瘤，未另作規定；平滑肌肉瘤，未另作規定；橫紋肌肉 瘤，未另作規定；胚胎型橫紋肌肉瘤；肺泡橫紋肌肉瘤；基質惡性肉瘤，未另作規定；混合瘤，惡性的，未另作規定；密拉氏混合瘤(Mullerian mixed tumor)；腎胚細胞瘤；肝母細胞瘤(hepatoblastoma)；癌肉瘤，未另作規定；間葉瘤，惡性的；布蓮約瘤(Brenner tumor)，惡性的；葉狀腫瘤(Phyllodes tumor)，惡性的；滑液肉瘤，未另作規定；間皮瘤，惡性的；惡性胚胎瘤；胚胎性癌，未另作規定；畸胎瘤，惡性的，未另作規定；甲狀腺腫樣卵巢瘤，惡性的；絨毛膜癌；中腎瘤，惡性的；血管肉瘤；血管內皮瘤，惡性的；卡波西氏肉瘤；血管外皮細胞瘤，惡性的；淋巴管肉瘤(Lymphangiosarcoma)；骨肉瘤，未另作規定；近皮質骨肉瘤；軟骨肉瘤，未另作規定；軟骨胚細胞瘤，惡性的；間葉性軟骨肉瘤；骨巨細胞瘤；尤恩氏肉瘤(Ewing’s sarcoma)；齒源性腫瘤，惡性的；釉質母細胞齒源性瘤(Ameloblastic odontosarcoma)；釉質母細胞瘤，惡性的；釉質母細胞纖維瘤；松果體瘤，惡性的；脊索瘤；神經膠質瘤，惡性的；室管膜瘤，未另作規定；星細胞瘤，未另作規定；原漿性星形細胞瘤；原纖維性星形細胞瘤；星芽細胞瘤；神經膠質母細胞瘤，未另作規定；寡樹突神經膠細胞瘤，未另作規定；寡樹突神經膠母細胞瘤；原始神經外胚層；小腦肉瘤，未另作規定；神經節母細胞瘤；神經母細胞瘤，未另作規定；視網膜胚細胞瘤，未另作規定；嗅覺神經源性腫瘤；腦脊髓膜瘤，惡性的；神經纖維肉瘤；神經鞘瘤，惡性的；顆粒細胞腫瘤，惡性的；惡性淋巴瘤，未另作規定；何杰金氏淋巴癌(Hodgkin’s disease)，未另作規定；何杰金氏；類肉芽腫，未另作規定；惡性淋巴瘤，小淋巴球的；惡性淋巴瘤，大細胞，瀰漫；惡性淋巴瘤，濾泡的，未另作規定；蕈樣肉芽腫；其他指定的非何杰金氏淋巴癌；惡性組織細胞增生症；多發性骨髓瘤；肥大細胞肉瘤；免疫增生小腸疾病；白血病，未另作規定；淋巴性白血病， 未另作規定；漿細胞白血病；紅血球性白血病；淋巴肉瘤細胞白血病；骨髓白血病，未另作規定；嗜鹼性白血病；嗜酸性白血病；單核球性白血病，未另作規定；肥大細胞白血病；巨核胚細胞白血病；骨髓細胞肉瘤；及毛細胞白血病。
如本文所定義「上皮癌」指稱從在皮膚內、中空內臟、和其他器官的上皮或相關組織所發展的癌症。上皮癌包括但不限於乳癌、肺癌、肝癌、口腔癌、胃癌、結腸癌、鼻咽癌、皮膚癌、腎癌、腦腫瘤、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、腸癌、胰腺癌及膀胱癌。
如本文所用的「病患」或「受試者」指稱被診斷有或懷疑患有或發展增殖性疾病像是癌症的哺乳動物受試者。例示性的病患可為可能適合於(benefit)發展增殖性疾病像是癌症的人、猿、狗、豬、牛、貓、馬、山羊、綿羊、囓齒動物及其它哺乳動物。
如本文所使用，「基本上純化」或「基本上分離」指稱分子(例如，化合物)在一狀態下與通常與其在其天然狀態相關聯的基本上所有其他分子分離。較佳地，基本上純化的分子是存在於製劑的主要種類。特定地，基本上純化的分子可大於60%不含、較佳地75%不含、更較佳90%不含，且最較佳95%不含存在於天然混合物內之其它分子(不包括溶劑)。術語「基本上純化」或「基本上分離」非旨在包括分子或物質存在於其天然狀態中。在特定實施例中，術語「基本上純化」或「基本上分離」包括從另一個KLH部分純化一個KLH部分(例如，從KLH三聚體部分基本上純化或基本上分離KLH二聚體部分)。在另一個實施例中，術語「基本上純化」或「基本上分離」不包括從另一個KLH部分純化一個KLH部分(例如，KLH二聚體和KLH三聚體被包括在基本上純化或基本上分離的組成物內)，但雜質基本上是去除的。
「給藥」在本文中是指稱如提供本發明的治療組成物給病患。藉由示例的方式且非限制，組成物給藥，例如，注射，可藉由靜脈內(i.v.)注射、皮下(s.c.)注射、皮內(i.d.)注射、腹膜內(i.p.)注射、或肌內(i.m.)注射來執行。一個或多個這樣的途徑可被執行。非口服給藥可為，例如，藉由一次大量注射(bolus injection)或藉由時間推移的緩慢灌流。替選地，或同時地，給藥可藉由口服途徑。另外，給藥也可以藉由一次大量之外科沉積(surgical deposition)或醫療裝置的定位。
「有需求的病患」在本文中被稱為作為被診斷患有或被懷疑具有增殖性病症的病患。在一個實施例中，所述病患具有或有可能發展癌症。
如本文所使用的，術語「抗原」是定義為能夠引出免疫反應的任何物質，其可具有或不具有蛋白載體及/或佐劑的輔助。較佳地本發明組成物的抗原包括碳水化合物，且更較佳地為聚醣抗原，且最較佳地為Globo H部分。
如本文所使用的，術語「免疫原性」是指免疫原、抗原、或疫苗以刺激免疫反應的能力。
如本文所使用的，術語「免疫療法」指稱是基於調節免疫系統以達成預防及/或治療目標的概念之治療策略的部署。
如本文所使用的，術語「表位」被定義為抗原分子接觸抗體或T細胞受體的抗原結合位的部分。
本發明中的「治療組成物」較佳地包括「治療共軛物」及/或「治療抗體」。治療共軛物包括至少一種抗原連接到載體。較佳地，治療共軛物的鍵聯是共價的。在治療共軛物的一個實施例中，抗原是聚醣，像是Globo H部分，且載體是KLH部分及/或KLH部分次單元。因此，術語治療共軛物涵蓋連接至一 個或多個Globo H部分的一個或多個KLH部分次單元。在一個實施例中，術語治療共軛物涵蓋連接至大約或至少1、10、102或103個Globo H部分的一個或多個KLH部分。在另一個實施例中，術語治療共軛物涵蓋連接至約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160個、或更多個Globo H部分的一個或多個KLH部分。另一個實施例涵蓋這樣的Globo H連接的KLH部分次單元的分離二聚體、三聚體、四聚體、五聚體或六聚體，或其組合。
在一個實施例中，治療共軛物是：Fucα(1→2)Galβ(1→3)GalNAcβ(1→3)Galα(1→4)Galβ(1→4)Gluβ(1-O-乙基肼-1-羰基-環己基-4-(甲基-N-順丁烯二醯亞基)-3-(硫代丁基-亞胺基)-鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)(Fucα(1→2)Galβ(1→3)GalNAcβ(1→3)Galα(1→4)Galβ(1→4)Gluβ(1-O-ethylhydrazyl-1-carbonyl-cyclohexyl-4-(methyl-N-maleimido)-3-(thiobutyl-imidyl)-Keyhole Limpet Haemocyanin)，也被稱為OBI-822。
「治療抗體」被定義為特異性結合本發明的治療共軛物且較佳地為治療共軛物的Globo H部分之抗體(如下文進一步定義的)。
如本文中所使用的，術語「疫苗」指稱含有被使用以賦予抗與該抗原相關的疾病的免疫力的治療共軛物的一治療組成物。癌症疫苗被設計透過免疫系統以提高身體保護本身的天然能力，免於受損或異常細胞諸如癌細胞所帶來的危險。保護性免疫反應是一種減低疾病的嚴重程度的反應，包括但不限於，疾病的預防、延遲疾病發作、減少症狀的嚴重程度、減少發病率、以及延遲死亡率。較佳地，疫苗能夠活化體液免疫反應(例如，藉著B淋巴球之抗體生成的刺激)以及細胞免疫反應(例如，由T淋巴球及/或其它細胞所媒介的免疫反應，諸如NK細胞和巨噬細胞)。發展標準測試以確定免疫反應，例如酵素結合免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、流式細胞檢測(flow cytometry)、細胞增殖測試(cell proliferation assay)、CTL測定、及ADCC/CDC測試。
如本文所使用的，術語「聚醣」指稱多醣、或寡醣。聚醣也用於本文中以指稱醣共軛物的碳水化合物部分，諸如醣蛋白、醣脂質、醣肽、醣蛋白質體(glycoproteome)、肽聚醣、脂多醣或蛋白多醣(proteoglycan)。聚醣通常只由單糖之間的O-醣苷鍵聯組成。舉例來說，纖維素是一種由β-1,4-連接D-葡萄糖(β-1,4-linked D-glucose)構成的聚醣(或更具體地葡聚醣)，且幾丁質是一種由β-1,4-連接N-乙醯基-D-葡糖胺(β-1,4-linked N-acetyl-D-glucosamine)構成的聚醣。聚醣可為單糖殘基之同聚物(homopolymer)或異聚物(heteropolymer)，並且可為直鏈或支鏈的。聚醣可被發現附著於蛋白如醣蛋白和蛋白多醣中。其一般在細胞的外部表面上被找到。O-和N-連接的聚醣在真核生物中很普遍，但也可在 原核生物中被發現，儘管較不普遍。N-連接的聚醣被發現附著到在序列子(sequon)中之天門冬醯胺酸的R-基團氮(N)。該序列子是Asn-X-Ser或Asn-X-Thr序列，其中X是任何胺基酸，除了脯氨酸之外。較佳聚醣是Globo H部分。
Globo H是六糖類，其係為高度表現在各種類型的癌症上，特別是乳癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、結腸癌和肺癌，的抗原性碳水化合物的家族的成員。在說明實施例中，特定病患在時間零時展現沒有抗-Globo H抗體量，且在以本發明的治療組成物進行免疫作用之後，偵測到了高效價。在其他說明實施例中，某些病患在時間零時展現出抗Globo H抗體量，且在以本發明的治療組成物免疫作用之後，偵測到了高效價。在特定實施例中，抗Globo H抗體表現於癌細胞表面作為醣脂質且可能作為醣蛋白。在其他實施例中，乳癌病患的血清含有針對Globo H表位的高量抗體。在特定實施例中，在免疫組織化學研究中表位也藉由單株抗體Mbr1、VK9和抗SSEA-3來標的。雖然特定正常組織也與Mbr1反應，包括正常乳腺、胰腺、小腸、以及前列腺組織，然而這些組織中的抗原係主要定位在取得免疫系統受限的分泌邊界(secretary border)。
在本文中「Globo H部分」被定義為聚醣(即，含有糖部分的分子)，其為Globo H或其片段或其類似物。Globo H是含有六糖類表位(Fucα1→2Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glc)、以及任選地，非糖部分的聚醣。其片段是含有六糖類表位的片段以及、如果可適用的話，非糖部分的聚醣。這些寡糖可藉由常規方法被製備。(參見Huang等人，美國國家科學研究院論文集，103：15-20(2006年))。如果需要的話，其可被連接至非糖部分。美國專利申請號12/485546係關於一種藉由給藥非人類哺乳動物(例如：小鼠、兔、山 羊、綿羊、或馬)如上所述的免疫組成物，以及藉由從哺乳動物分離結合至Globo H或其片段的抗體，來生產特異性對Globo H或其片段的抗體的方法。
Globo H的類似物可使用聚醣微陣列來產生，並且包括在Wang等人，美國國家科學研究院論文集，2008年8月19；105(33)：11661-11666中所描述及於第1圖中所顯示者。
Globo H類似物較佳地結合抗體VK-9、Mbr1以及抗SSEA-3。較佳地，Globo H類似物以特定解離常數(KD，surf)結合。朗繆耳等溫線(Langmuir isotherm)可被使用於分析結合曲線以產生在表面上的解離常數(KD，surf)。在培養過程中的平衡條件下，複製點(Fobs)的平均螢光可被描述為： F obs =F max [P]/(K D,surf +[P])其中Fmax是最大螢光強度，在表面上活性碳水化合物的量的測度，[P]是總抗體濃度，而KD，surf是針對表面碳水化合物和抗體的平衡解離常數。如描述在Wang等人中。在一些實施例中，Globo H類似物的較佳(KD，surf)相對於在Wang等人中所描述的VK-9、Mbr1、及抗-SSEA-3抗體是至少，大約或洽好0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5或1.6nM。
「鎖孔蟲戚血藍蛋白」(KLH)是被發現在巨大鎖孔蟲戚，Megathura crenulata，的血淋巴內的大、多次單元、攜氧的金屬蛋白。KLH是異質的醣苷化蛋白質，由有著約350,000至約390,000的分子量與具有約400kDa(例如，KLH單體)至約8000kDa(例如，KLH二十聚體)的分子量聚集的次單元組成。KLH次單元的每個結構域含有一起結合單一氧分子的兩個銅原子。當氧氣被結合到血藍蛋白時，分子呈現出獨特的透明度、乳光藍色。在特定實施例中， KLH蛋白是強效免疫原性，但對人類是安全的。在某些實施例中，KLH可從Megathura crenulata的血淋巴中，藉由一系列的步驟來純化，其典型地包括硫酸銨沉澱和透析，且可涉及層析純化以獲得最高純度。在特定實施例中，KLH純化也可包括內毒素移除，但此步驟可為非必要的，因為當用於抗體產生注射時，內毒素可作為佐劑。較佳地，具清澈乳光藍色之高質量KLH製備是KLH溶解性的最佳指標。在某些實施例中，KLH單體單元集合成具有約4,000kDa至8,000kDa的總分子量之大多聚體(十聚體或二十聚體)。「鑰孔蟲戚血藍蛋白部分」或「KLH部分」是在本文中被定義為KLH1(SEQ ID NO：1)或KLH2(SEQ ID NO：2)蛋白或基本上相同的蛋白或其混合物。在這種情況下基本上相同表示每個KLH部分具有至少，大約或洽好：100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76或75百分比的胺基序列，相同於自然野生型KLH。在特定實施例中，本發明的KLH具有增強的免疫原活性，特別是增強的抗腫瘤活性。在某些實施例中，KLH在本發明的組成物中包含完整的、非降解的，大約400,000分子量的次單元。在其他實施例中，本發明的KLH包含更高的KLH多聚體。
在某些實施例中，較高KLH多聚體具有大約8-10百萬分子量，有著約92-107S之沉降係數。更高的KLH多聚物存在的量是基於沉降平衡及/或沉降速度超速離心分析(sedimentation-velocity ultracentrifugation analyses)。在其他實施例中，本發明的KLH演示增強的免疫原活性，特別是增強的抗腫瘤活性。增強的免疫活性被視為，例如，但不限於，(a)注射KLH(無佐劑)，(b)以KLH使用作為佐劑，(c)以KLH使用作為半抗原或弱免疫原性抗原的載體免疫原，以及(d)以KLH使用作為抗腫瘤劑。本發明的KLH組成物針對許多腫瘤展現增強的抗腫 瘤活性，包括但不限於，膀胱癌、乳癌、卵巢腫瘤等。在某些實施例中，兩個KLH部分可透過KLH單體之間的共價鍵聯形成二聚體。不受理論所限制，據信KLH部分之間的共價鍵聯是通過雙硫鍵。在某些實施例中，兩個或更多的KLH部分，透過KLH單體、二聚體、三聚體等之間的共價鍵聯可形成二聚體、三聚體、四聚體、五聚體等。不受理論所限制，據信KLH部分之間的共價鍵聯是透過雙硫鍵。
有用於KLH部分對抗原的連接的多種方法，其包括直接共軛作用以及與雙功能連接物基團，像是4-(4-N-順丁烯二醯亞胺甲基)環己烷-1-羧醯肼(MMCCH)共軛。這樣鍵聯的技術被揭露在美國專利號6,544,952中。在一些實施例中，為了製備本發明的治療共軛物，例如，Globo H烯丙基醣苷藉由臭氧分解被轉化為醛類且該醛基被附接到交聯劑MMCCH上的NH基團，呈現Globo H-MMCCH；載體蛋白，KLH受到硫醇化以產生KLH-SH；然後在硫醇化KLH上的巰基被附接到MMCCH上的順丁烯二醯亞胺基，產生Globo H-KLH共軛物。
在一個實施例中，Globo H烯丙基醣苷通過化學合成來製備。一硫醇化試劑，2-亞胺基四氫噻吩(2-iminothiolane)和cGMP-級KLH以及4-(4-N-順丁烯二醯亞胺甲基)環己烷-1-羧醯肼(MMCCH)連接物也可被使用。在一些實施例中，進行以下步驟：1)Globo H烯丙基醣苷至Globo H-醛類的轉化作用；2)分別耦合Globo H-醛類與MMCCH為Globo H-MMCCH；3)KLH的化學硫醇化；4)Globo H-MMCCH對硫醇化KLH之共軛作用；以及5)Globo H-KLH共軛物(OBI-822)的純化作用。參閱例如第2a圖。
在某些實施例中，在Globo H部分蛋白質與KLH部分的共軛作用期間，相較於較佳地完整分子，某些實施例中的KLH部分蛋白由於Globo H部分 次單元的解離而顯示分子量的降低。在其他實施例中，本文所揭露的共軛作用方法導致先前未曾報導的KLH次單元解離。雖然不希望受限於任何特定的理論，可以預料的到的是發明的Globo H部分-KLH部分次單元共軛物的高醣苷化量導致Globo H部分之間氫鍵鍵結的形成。如此一來，在特定實施例中，KLH部分次單元之間的凡德瓦力(Van Der Waals force)及疏水性相互作用係藉由Globo H氫鍵鍵結被替換，且這導致KLH部分次單元的分離。以下共軛作用，Globo H部分-KLH部分共軛物的KLH部分次單元較佳聚集以形成新穎單體、二聚體、三聚體、四聚體、五聚體或六聚體或其任何組合。所產生的治療Globo H部分-KLH部分共軛物具有致使意外優越的免疫原性屬性的意外大表位比值。在特定實施例中，Globo H部分被共軛至KLH1及KLH2上的離胺酸。在其他實施例中，Globo H部分非共軛至KLH1和KLH2上的離胺酸。在特定實施例中，Globo H-共軛的離胺酸部位被發現在肽圖分析(peptide mapping analysis)中為保守的，其暗示Globo H-KLH組成物在其結構中是獨特的。
在一個實施例中，本發明的治療組成物包括一種或多種KLH部分次單元，其中至少一個這樣的次單元共軛於至少、大約或確切為1、10、102或103倍：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、 118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159或160或更多的Globo H部分。
本發明人使用質譜分析發現Globo H部分係共軛至KLH的離胺酸殘基。在特定實施例中，因此較佳是Globo H部分共軛至離胺酸殘基。
在一個實施例中，每KLH部分次單元總共確切為或大約有145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160個總離胺酸殘基。在另一個實施例中，每KLH部分次單元確切為有或大約有150或156個離胺酸殘基。在另一個實施例中，在每個KLH部分次單元上確切為有或大約有60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109或110個離胺酸共軛位點可用於結合至或實際結合到Globo H部分。在另一個實施例中，有62、66、67、68、70、72、76、86、87、88、90、92、93、100個這樣的離胺酸共軛位點在各KLH部分次單元上。離胺酸共軛位點是在KLH部分內可用於結合或實際上結合至Globo H部分之那些離胺酸殘基、及/或至Globo H部分之連接物，諸如例如MMCCH連接物。
在含有部分次單元的混合物(例如，KLH1和KLH2或其變異型)之特定治療實施例中，總共可用離胺酸(對於次單元兩者)係以不同次單元類型被計算在一起且數目可以是或確切為大約為290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309或310。 在這樣的實施例中，共同整個不同次單元(例如，KLH1和KLH2或其變異型)中有或可以是確切為或大約為130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159或160個離胺酸共軛位點。在其它這類實施例中，有136、137、141、140、143、147或155離胺酸共軛位點。
在最佳實施例中在KLH1/KLH2內全部306個離胺酸殘基之中有136、137、140、141、143、147或155個以及的離胺酸共軛位點。
在某些實施例中，本發明的治療組成物含有KLH部分次單元-Globo H部分共軛物的混合物，其中這樣的共軛物保持單體或形成二聚體、三聚體、四聚體、五聚體或六聚體或其任意組合。在另一個實施例中，本發明的治療組成物包括分離的KLH部分次單元-Globo H部分共軛物單體、二聚體、三聚體或四聚體或其組合。在進一步實施例中，本發明的治療組成物僅包括KLH部分次單元-Globo H部分共軛物二聚體和三聚體。
在另一個實施例中，治療組成物含有至少兩個KLH部分次單元，其中兩個KLH-部分次單元的每個被連接到不同的聚醣。可連接到KLH部分次單元的其它腫瘤相關的聚醣抗原可包括但不限於GM2、GD2、GD3、岩藻糖基(fucosyl)、GM1、sTn、唾液酸化的路易斯寡糖X(sialyl-Lewisx)、路易斯寡糖X(Lewisx)、唾液酸化的路易斯寡糖a(sialyl Lewisa)、路易斯寡糖a(Lewisa)、sTn、TF、聚唾液酸(polysialic acid)、路易斯寡糖y(Lewisy)、黏蛋白、T抗原、及類似物。在一些實施例中，在治療組成物中KLH部分次單元的至少或大約10、20、30、40、50、60、70、80、90或100百分比被連接到Globo H部分，而在治療組成物中剩餘的KLH部分次單元被連接至其它腫瘤相關的聚醣抗原。
如本文所使用的，相關於本文所揭露的治療共軛物「表位比值」是指，例如，治療共軛物的抗原表位對載體分子之關係。較佳地，其指稱Globo H部分對KLH部分的關係。最佳治療共軛物的表位比值是使用下列公式=(實際Globo H部分重量/Globo H部分分子量)/(實際KLH部分重量/KLH部分分子量)來算出。表位比值由所屬領域的技術人員是可輕易測定的。較佳地，Globo H的重量是例如以高效能陰離子交換層析與脈衝安培檢測法(HPAEC-PAD)來測定。
較佳地，本發明的治療共軛物的表位比值是大約、至少或確切為：1、10、25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1025、1050、1075、1100、1125、1150、1175、1200、1225、1250、1275、1300、1325、1350、1375、1400、1425、1450、1475、1500、1525、1550、1575、1600、1625、1650、1675、1700、1725、1750、1775、1800、1825、1850、1875、1900、1925、1950、1975、2000、2025、2050、2075、2100、2125、2150、2175、2200、2225、2250、2275、2300、2325、2350、2375、2400、2425、2450、2475、2500、2525、2550、2575、2600、2625、2650、2675、2700、2725、2750、2775、2800、2825、2850、2875、2900、2925、2950、2975或3000。
在一個實施例中，本發明的治療組成物包括具有一範圍的表位比值的治療共軛物的混合物。在一個實施例中，在治療組成物中的治療共軛物的範圍、平均值或中位數表位比值為約10至約3200、約800至約2500、約1000至約2000、約1250至約1750或約1400至約1600。在另一個實施例中，在治療組成物中的治療共軛物的範圍、平均值或中位數表位比值為約10至約150、約40至約 125、約50至約100、約62至約87或約70至約80。在另一個實施例中，在治療組成物中的治療共軛物的範圍、平均值或中位數表位比值為約20至約300、約80至約250、約100至約200、約125至約175或約140至約160。在另一個實施例中，在治療組成物中的治療共軛物的範圍、平均值或中位數表位比值為約30至約450、約120至約375、約150至約300、約185至約260或約210至約240。在一些醫藥組成物中，治療共軛物的至少或大約30、40、50、60、70、80、90、95、98、99、或100%存在作為單體、或如二聚體、三聚體、四聚體、五聚體、或其組合。
對治療共軛物的抗體
在某些例示性實施例中，本發明也涵蓋分離的治療抗體，其具親和力地特異性結合本文所揭露的治療共軛物，以及其在增殖性疾病的治療及/或診斷中的用途。
如本文所使用的，術語「抗體(antibody)」和「抗體(antibodies)」(免疫球蛋白)涵蓋單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、從至少兩個完整抗體形成的多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、人類抗體、人源化抗體、駱駝源化抗體、嵌合抗體、單鏈Fvs(scFv)、單鏈抗體、單結構域抗體、結構域抗體、Fab片段、F(ab')2片段，展現出所需生物活性的抗體片段、雙硫鍵連接的Fvs(sdFv)、以及抗特應(抗-Id)抗體(包括，例如，抗-Id抗體對本發明的抗體)、內抗體、以及上述任何的表位結合片段。特別是，抗體包括免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子的免疫活性片段，亦即，含有抗原結合位點的分子。免疫球蛋白分子可為任何類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)，級別(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或子類型。
在本文中所描述的治療中被使用的對於表位的抗體的「親和力」，例如，治療共軛物的Globo H部分，是所屬技術領域習知的術語，且意指抗體對表位結合的程度、或強度。親和力可以所屬技術領域中習知的若干方式測量及/或表現，包括，但不限於，平衡解離常數(KD或Kd)、表觀平衡解離常數(KD'或Kd’)、以及IC 50(在競爭測試中所需以影響50%抑制的量)。被理解的是，對於本發明的目的，親和力是針對結合至表位的給定量抗體的平均親和力。本文中報告以每mL幾mg IgG或mg/mL論述的KD’值表示血清的每mL有幾mg Ig，雖然血漿亦可被使用。當抗體親和力被使用作為本文所描述的治療方法、或用於本文所述的治療方法的選擇的給藥基礎上時，抗體親和力可在治療之前及/或治療期間被測量，且所獲得的值可被臨床人員使用以評估是否人類病患是治療的適當候選者。
如本文所使用的，術語「特異地結合」，是指結合對之間的相互作用(例如，抗體和抗原)。在各種情況中，特異性結合可藉由至少或大約10-6莫耳/升、約10-7莫耳/升、或大約10-8莫耳/升，或更小的親和力常數來體現。
生物學測定
在一個實施例中，當給藥於病患時，包含本發明的治療共軛物的治療組成物能夠誘導抗Globo H抗體效價至少或大約為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、100、250、500、1000、1500、2000、2500、3000、4000、5000倍或更大倍於在相同實驗中給藥之前(亦即，前置處理基線效價)之相同抗Globo H抗體效價。在特定實施例中，抗Globo H抗體是IgM抗體。在另一個實施例中，抗Globo H抗體是IgG抗體。
本發明的治療組成物能夠在受試者中誘導體液和細胞反應兩者。在某些實施例中，本發明的疫苗組成物誘導Globo H部分特異性IgG和IgM抗體的生成以及和B細胞和T細胞的增殖(例如，CD3+ T細胞，CD4+ T細胞及/或CD8+ T細胞)。典型地，這些免疫反應在給藥後依照時間順序地發生。在一個特定範例中，給藥後，B細胞的生產出現在大約第3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、或60天，接續IgG和IgM抗體的生成在大約第10、20、30、60、或90天，且隨後T細胞生成大約在第24、30、40、50、60、90、120、150、或180天。本發明的疫苗組成物潛在地提供了長期的免疫保護作用，其能阻止少量癌細胞的生長，因而理想於最小化殘留疾病從而達到疾病穩定和生存改善。
「抗體依賴細胞媒介細胞毒性」及「ADCC」指稱細胞媒介的反應，其中非特異性細胞毒性細胞(例如，自然殺手(NK)細胞、嗜中性球、和巨噬細胞)辨識標靶細胞上的結合抗體，且隨後造成標靶細胞的裂解。在一個實施例中，這樣的細胞是人類細胞。雖然不希望被限定於任何特定的作用機制，這些介導ADCC的細胞毒性細胞通常表現Fc受體(FcRs)。用於媒介ADCC的初代細胞、NK細胞，表現FcγRIII，然而單核球表現FcγRI、FcγRII、FcγRIII及/或FcγRIV。造血細胞上的FcR表現總結於Ravetch及Kinet，免疫學年鑑(Annu.Rev.Immunol.)，9：457-92(1991年)。為了評估分子ADCC活性，體外ADCC測定，諸如在美國專利號5,500,362或5,821,337中描述的可被執行。對於這樣測定的有用作用細胞包括末梢血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)和自然殺手(Natural Killer，NK)細胞。可替換地，或另外地，本發明的治療共軛物的ADCC活性可在體內進行評估，例如，在動物模型中，諸如被揭露在Clynes等人，美國國家科學研究院論文集，95：652-656(1998年)。
「補體依賴細胞毒性」或「CDC」指稱治療共軛物以初始化補體活性並在補體的存在下裂解標靶的能力。補體活化路徑係藉由補體系統的第一成份(C1q)對有著同族抗原複雜化的分子(例如，抗體)的結合來活化起始。為了評估補體活化，CDC測定法，例如，可執行被描述在Gazzano--Santaro等人，免疫學方法期刊(J.Immunol.Methods)，202：163(1996年)中者。
在另一個實施例中，當給藥予病患含有本發明的治療共軛物的治療組成物時，能夠誘導在病患/受試者內抗Globo H免疫血清的產生，其特異性結合至Globo H陽性癌細胞株，例如，MCF-7細胞。
組合
治療組成物可包括其它抗癌/抗增殖藥物，以及佐劑和其它免疫調節分子，諸如細胞介素或趨化介素。這些試劑可全部在套組中被遞送一起在分開的容器內或單一容器內。試劑可在給藥時，或給藥前至少或大約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24分鐘、小時或天時結合。
佐劑是修飾其他試劑的效果的醫藥或免疫學試劑。其可為無機的或有機的化學、巨分子或全部癌細胞或其部分，其增進對給定抗原的免疫反應。佐劑包括完全和不完全弗氏佐劑，類鐸受體分子以及其模擬物、LPS、脂蛋白、脂肽、鞭毛蛋白、雙股RNA、未甲基化CpG島區、左旋咪唑、卡介苗、體抑素胜肽(octreotide)、異丙肌苷和日達仙、藉由細菌和病毒經典地釋放的DNA及RNA的各種形式、PD-1拮抗劑和CTLA拮抗劑。在一個實施例中，佐劑是皂素佐劑。
在某些實施例中，皂素佐劑是OBI-821皂素，其大致上是純的。在其它實施例中，OBI-821皂素是其生物活性片段。佐劑也可涵蓋OBI-821皂素 的不純形式。當以本文描述的疫苗或與其他大致上純的皂素或非皂素佐劑混合施用時，純化的OBI-821皂素展現增強的佐劑效果。
OBI-821皂素是天然存在的醣苷，從石鹼木(Quillaja saponaria Molina)的樹皮藉由高壓液相層析法(HPLC)、低壓液相矽膠層析法、以及親水的交互式層析(hydrophilic interactive chromatography，HILIC)以高純化萃取，如描述於美國專利號5,057,540和美國專利號6,524,584者般，其內容藉由引用全部併入。高壓液相層析法分析顯示，OBI-821是結構上相關的異構化合物的混合物。OBI-821皂素的不同純化的異構化合物已被鑑定並在此揭露。
在某些實施例中，OBI-821皂素包括化學式I的至少一種分離的化合物如下：
其中，R1是β-D-洋芹糖(β-D-Apiose)或β-D-木糖(β-D-Xylose)；以及R2與R3獨立地為H、烷基，
(用於化合物1989之脂肪醯部分)，或
(用於化合物1857之脂肪醯部分)。
OBI-821皂素也可包含化學式I的分離化合物，其中(i)R1是β-D-洋芹糖，R2是用於上述的1989化合物之脂肪醯部分，且R3是H(1989化合物V1A)；(ii)R1是β-D-洋芹糖，R2是H，且R3是用於上述的1989化合物的脂肪醯部分(1989化合物V1B)；(iii)R1是β-D-木糖，R2是用於上述的1989化合物的脂肪醯部分，且R3是H(1989化合物V2A)；或 (iv)R1是β-D-木糖，R2是H，且R3是用於上述的1989化合物的脂肪醯部分(1989化合物V2B)。總結地，1989化合物V1A、1989化合物V1B、1989化合物V2A以及1989化合物V2B被稱為「1989化合物混合物」。
表1總結1989化合物的功能性基團以及各個1989化合物在該1989化合物混合物中的莫耳%。
OBI-821皂素可包含化學式I的分離化合物，其中(i)R1是β-D-洋芹糖，R2是用於上述的1857化合物的脂肪醯部分，且R3是H(1857化合物V1A)；(ii)R1是β-D-洋芹糖，R2是H，且R3是用於上述的1857化合物的脂肪醯部分(1857化合物V1B)；(iii)R1是β-D-木糖，R2是用於上述的1857化合物的脂肪醯部分，以及R3是H(1857化合物V2A)；或 (iv)R1是β-D-木糖，R2是H，且R3是用於上述的1857化合物的脂肪醯部分(1857化合物V2B)。總結地，1857化合物V1A、1857化合物V1B、1857化合物V2A以及1857化合物V2B被稱為「1857化合物混合物」。
表2總結1857化合物的功能性基團以及各個1857化合物在該1857化合物混合物中的莫耳%。HPLC。
OBI-821皂素包含一個或多個下列化合物：(i)1857化合物V1A；(ii)1857化合物V1B；(ii)1857化合物V2A；(iii)1857化合物V2B；(iv)1989化合物V1A；(v)1989化合物V1B；(vi)1989化合物V2A；或(vii)1989化合物V2B。
1857化合物混合物和1989化合物混合物在OBI-821皂素中的百分比可範圍如下：(i)包含1857化合物混合物的OBI-821的大約1莫耳%至約15莫耳%；以及(ii)包含1989化合物混合物的OBI-821的大約85莫耳%至約99莫耳%。
莫耳%的全部可藉由0.1%增量(例如，大約87%至大約90%、大約90.5%至大約97%、大約3.5%至大約11%、大約10%至大約14%)而變化。
1989化合物混合物可包含1989化合物V1A的大約60-70莫耳%；1989化合物V1B的大約1-5莫耳%；1989化合物V2A的大約30-40莫耳%；以及 1989化合物V2B的大約0.1-3莫耳%。全部的莫耳%可藉由0.1增量(例如，65%、2.5%、35.6%)而變化。
1857化合物混合物可包含1857化合物V1A的大約60-70莫耳%；1857化合物V1B的大約1-5莫耳%；1857化合物V2A的大約30-40莫耳%；以及1857化合物V2B的大約0.1-3莫耳%。全部的莫耳%可藉由0.1增量(例如，65%、2.5%、35.6%)而變化。
在其他的實施例中，大致上純的OBI-821是從原態的石鹼木萃取物純化，其中所述的OBI-821藉由單一主要峰值，其包含除了溶劑峰值之外層析圖的所有峰值的全部面積的90%或更多而定性，當分析於逆相-HPLC，於具有5um顆粒尺寸、100Å孔洞、4.6mm IDx25cm L與包含A：B95%：5%至75%：25%的移動相之溶析程序的Symmetry C18管柱裡11分鐘時，其移動相A是有著0.1%三氟乙酸的蒸餾水，且移動相B是有著0.1%三氟乙酸在1ml/min的流速的乙腈(acetonitrile)。
在一個實施例中，醫藥組成物包含化學式(I)的化合物
其中， R1是β-D-洋芹糖或β-D-木糖；以及R2與R3獨立地為H、烷基、或 (用於化合物1857之脂肪醯部分)， 以及醫藥上可接受的載體。
疫苗可包含碳水化合物抗原或其免疫原性片段以及OBI-821皂素。在又另一個實施例中，疫苗包含碳水化合物抗原或其免疫原性片段；載體蛋白以及OBI-821皂素。在另一個實施例中，疫苗包含選自Globo H、KLH、以及OBI-821皂素的碳水化合物抗原。載體蛋白的非限制性範例包括KLH。
如本文所使用的，術語「細胞介素」指稱藉由影響免疫細胞分化過程而調控免疫反應的強度和持續時間的任何許多小分泌蛋白質，免疫細胞分化過程通常涉及基因表現中前驅細胞變成獨特特化細胞類型的變化。細胞介素基於其推定功能、分泌的細胞、或作用的目標，而被不同地命名為淋巴介質(lymphokine)、白細胞介素、和趨化介素。舉例來說，一些常見的白細胞介素包括，但不限於、IL-2、IL-12、IL-18、IL-2、IFN-γ、TNF、IL-4、IL-10、IL-13、IL-21、GM-CSF和TGF-β。
如本文所使用的，術語「趨化介素」指稱在感染部位提供用於淋巴球的動員和活化的手段所釋放的任何各種小的趨化性細胞介素。趨化介素吸引白血球至感染部位。趨化介素具有保守半胱胺酸殘基，其允許其被分配成四 組。分組，有著代表性的趨化介素，是C-C趨化介素(RANTES、MCP-1、MIP-1α和MIP-1β)、C-X-C趨化介素(IL-8)、C趨化介素(淋巴細胞趨化因子(Lymphotactin))以及CXXXC趨化介素(分形介素(fractalkine))。
本發明的治療組成物可進一步包括PD-1/PD-L1抑制劑(細胞毒性T細胞淋巴球(CTLs)免疫療法)、CTLA-4免疫療法、CDK4/6抑制劑(標靶治療)、PI3K抑制劑(標靶治療)、mTOR抑制劑(標靶治療)、AKT抑制劑(標靶治療)、Pan-Her抑制劑(標靶治療)。這些抑制劑也可被修飾以產生各自的單株抗體。這樣的抗體可被包含在本發明的治療組成物中。
治療組成物可包括其它抗癌/抗增殖或化學治療劑。在一些實施例中，這樣試劑的範例被發現在《癌症原理和腫瘤學的實踐》(Cancer Principles and Practice of Oncology)中，V.T.Devita以及S.Hellman(編者)，第六版(2001年2月15日)，Lippincott Williams & Wilkins出版社。這樣的抗癌劑包括，但不限於，以下：荷爾蒙治療劑(例如，選擇的雌性激素受體調節子、雄性激素受體調節子)、單株抗體治療、化學治療、類視色素受體調節子、細胞毒性/細胞生長抑制劑、抗腫瘤劑、抗增殖劑、異戊二烯基-蛋白轉移酶抑制劑、HMG-CoA還原酶抑制劑、氮芥類、亞硝基脲、血管生成抑制劑(例如，必化思沃蜜)、細胞增殖和存活傳訊路徑的抑制劑、細胞凋亡誘導劑、干擾細胞週期檢查點的藥劑、干擾受體酪胺酸激酶(RTKs)的藥劑、雷帕黴素的哺乳動物標靶(mTOR)抑制劑、人類表皮生長因子受體2(HER2)抑制劑、表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑、整合素阻斷劑、NSAIDs、PPAR促效劑、先天的多重抗藥性(MDR)的抑制劑、鎮吐劑、用於貧血治療的藥劑、用於嗜中性球減少症的治療的藥劑、免疫增強藥物、二磷酸鹽、 芳香酶抑制劑、誘導贅生細胞的最後分化的藥劑、γ-分泌酶抑制劑、癌症疫苗、以及其任何組成物。
本發明的製劑配方
治療組成物(本文中也稱為醫藥組成物)通常包含醫藥上可接受的載體。如本文中所使用的語詞「醫藥上可接受的載體」包括與醫藥施用相容的溶劑、分散媒介、塗層、抗菌劑和抗真菌劑、等滲透和吸收延遲劑、以及類似物。補充的活性化合物也可被併入到組成物中。醫藥組成物被製劑配方成與其給藥的預期途徑相容。給藥途徑的實例包括非口服的(parenteral)，例如，靜脈內、皮內、皮下、肌內、動脈、口服(例如，吸入)、經皮(局部)、經黏膜、和直腸給藥。使用於非口服的、皮內、或皮下應用的溶液或懸浮液可包括以下成分：無菌稀釋劑諸如注射用水、鹽水溶液、磷酸鹽緩衝鹽水、tris緩衝鹽水、不揮發油(fixed oil)、聚乙二醇、甘油、丙二醇、或其它合成溶劑；抗菌劑像是苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯(methyl paraben)；抗氧化劑像是抗壞血酸(ascorbic acid)或亞硫酸氫鈉(sodium bisulfite)；螯合劑(chelating agent)如乙二胺四醋酸(ethylenediaminetetraacetic acid)；緩衝劑像是醋酸鹽、檸檬酸鹽、或磷酸鹽和用於調整張力的藥劑像是氯化鈉或右旋糖(dextrose)。pH可以用酸或鹼，像是鹽酸或氫氧化鈉來調整。非口服製劑可封裝在玻璃或塑膠製的安瓿瓶、拋棄式注射器、或多劑量小瓶中。
適合用於可注射用途的醫藥組成物包括無菌水溶液(其中水可溶)或分散體和無菌粉末用於無菌注射溶液或分散體的臨時製備。針對靜脈內給藥，合適的載體包括生理鹽水、抑菌水(bacteriostatic water)、Cremophor EL®(BASF，帕西帕尼，紐澤西州)、或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中。在所有情況下，組 成物應當是無菌的，並且應當是輕易可注射性(syringability)存在程度的流體。其應在製造和貯存的條件下是穩定的，且防止針對諸如細菌和真菌的微生物的污染作用。載體可是含有，例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、和液體聚乙二醇、及類似物)的溶劑或分散體、及其合適的混合物。適當的流動性可被維持，例如，藉由塗層諸如卵磷脂的使用、藉由在分散體的條件下對所需顆粒尺寸的維持以及藉由表面活性劑的使用。防止微生物的作用可藉由各種抗菌劑和抗真菌劑來達成，例如對羥苯甲酸(paraben)、氯丁醇(chlorobutanol)、酚、抗壞血酸、硫柳汞(thimerosal)、和類似物。在許多情況下，其將較佳為包括等滲透劑，例如糖、多元醇諸如甘露醇(mannitol)、山梨醇(sorbitol)或氯化鈉在組成物中。可注射組成物的延長吸收可藉由被包含在延遲吸收之藥劑的組成物內來實現，例如，單硬脂酸酯鋁(aluminum monostearate)和明膠。
無菌可注射溶液可藉由在一適當溶劑中與以上列舉之一個或組合之成分的併入所需量之活性化合物來製備，如果需要，接續進行過濾滅菌。一般地，分散體藉由併入活性化合物進入含有基本分散媒介和來自上述列舉的所需其它成分的無菌載體來製備。在用於無菌注射溶液的製備之無菌粉末情況中，製備的方法包括真空乾燥和冷凍乾燥，其從先前無菌過濾溶液產生活性成分加上任何另外期望成分的粉末。
口服組成物一般包括惰性稀釋劑或可食用載體。針對口服治療給藥的目的，活性化合物可與賦形劑合併並以片劑、錠劑或膠囊，例如，明膠膠囊的形式被使用。口服組成物也可使用流體載體被製備用於漱口水的用途。醫藥上可相容的結合劑，或佐劑材料可被包含作為組成物的一部分。片劑、丸劑、膠囊、錠劑和類似物可含有任何下列成分或類似性質的化合物：黏合劑諸如微 晶型纖維素、黃蓍膠(gum tragacanth)或明膠；賦形劑諸如澱粉或乳糖；崩散劑(disintegrating agent)如海藻酸(alginic acid)、初生凝膠(Primogel)、或玉米澱粉；潤滑劑諸如硬脂酸鎂或氫化植物油(Sterotes)；助流劑(glidant)如膠體(colloidal)二氧化矽(silicon dioxide)；甜味劑如蔗糖或糖；或調味劑如薄荷、柳酸甲酯或柑橘香料。
對於藉由吸入給藥，化合物係以氣溶膠噴霧形式，自含有合適推進劑，例如氣體諸如二氧化碳的加壓容器或分配器，或噴霧器被遞送。
全身性給藥也可經黏膜或經皮。對於經黏膜或經皮給藥，對待滲透之阻隔適用的滲透劑被使用於製劑中。這樣的滲透劑通常是所屬技術領域所習知的，且包括，例如，用於經黏膜給藥之清潔劑、膽鹽、以及梭鏈孢酸(fusidic acid)衍生物。經黏膜給藥可透過鼻腔噴霧劑或栓劑的使用來完成。對於經皮給藥，活性化合物被配製成軟膏、藥膏、凝膠或乳膏劑，如通常為所屬技術領域所習知的。化合物也能以栓劑的形式製備(例如，用常規的栓劑基質，像是可可脂和其它甘油酯)或用於直腸遞送的保留灌腸。
根據實作，活性化合物與將保護該化合物免於從身體快速消除的載體一起製備，諸如控釋製劑(controlled release formulation)，包括植入物和微膠囊化遞送系統。生物分解的、生物相容的聚合物可被使用，諸如乙烯-醋酸乙烯酯(ethylene vinyl acetate)、聚酐(polyanhydride)、聚乙醇酸(polyglycolic acid)、膠原、聚原酸酯(polyorthoester)、和聚乳酸(polylactic acid)。用於這類製劑製備的方法將對那些所屬技術領域具有通常知識者而言為顯而易見的。材料還可以商業購得。脂質體懸浮液(包括對感染細胞以單株抗體對細胞特異性抗原標的之脂質體)也可被用作醫藥上可接受的載體。根據所屬技術領域所習知的方法，例如， 描述於美國專利號4,522,811中的方法，這些可被製備，其藉由引用的方式併入本文中。
為了給藥之容易以及劑量的均勻有優勢的是製劑成劑量單位形式的口服或非口服組成物。本文所使用的劑量單位形式指稱作為適於待治療的受試者的單一劑量的物理上離散的單位；每個單位含有經計算以產生與所需的醫藥上載體相關聯的預期治療效果之活性化合物的預定量。
劑量形式
這類治療組成物的毒性和治療功效可藉由標準醫藥程序在細胞培養物或實驗動物中來測定，例如，用於測定LD50(致使群體50%死亡的劑量)和ED50(在群體50%中治療有效的劑量)。毒性和治療效果之間的劑量比值是治療指數(therapeutic indices)，且其可表達為比值LD50/ED50。展現高治療指數的治療組成物是較佳的。雖然展現出毒性副作用的化合物可被使用，應當小心設計標的此類化合物至受影響位置的遞送系統，以最小化對未感染細胞的潛在損害，並且，由此減少副作用。
從細胞培養試驗和動物研究中獲得的數據可被使用於配製劑用於人類中的劑量範圍。這類化合物的劑量降佳位於包括具有很少或沒有毒性的ED50的循環濃度的範圍內。劑量可在基於執行的劑量形式以及所利用的給藥途徑而定之範圍內變化。對於在本公開的方法中使用的任何化合物，治療有效劑量能最初以從細胞培養測定來估計。劑量可在動物模型中配製以達到包括IC50的循環血漿濃度範圍(亦即，達到症狀的最大半抑制的測試化合物的濃度)，如在細胞培養中被測定。此類資訊可被使用於更精確地確定在人類中有用的劑量。血漿中的量可被測量，例如，藉由高效液相層析法。
在一些實施例中，治療組成物的治療有效量(亦即，有效劑量)可介於約0.001μg/kg至大約250g/kg、0.01μg/kg至10g/kg、或0.1μg/kg至1g/kg或大約或至少為：0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009；0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09；0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、或250克或微克每公斤病患體重、或其它範圍，其對技術人員而言在無須過度實驗下將是顯而易見且明瞭的。本領域具有通常知識者將理解的是，某些因素可影響所需有效治療受試者的劑量和時間，包括但不限於疾病或病症的嚴重性、先前的治療、受試者的一般健康狀況或年齡、以及存在的其他疾病。
在其他實施例中，在治療組成物中Globo-H部分的治療有效量(亦即，有效劑量)可介於大約0.001μg/kg至大約250g/kg、0.01μg/kg至10g/kg、或0.1μg/kg至1g/kg或大約或至少為：0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009；0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09；0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、 46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、或250克或微克每公斤病患體重、或其它範圍，其對技術人員而言在無須過度實驗下將是顯而易見且明瞭的。本領域具有通常知識者將理解，某些因素可影響所需有效治療受試者的劑量和時間，包括但不限於疾病或病症的嚴重性、先前治療、受試者的一般健康狀況或年齡、以及存在的其他疾病。
在特定實施例中，本文所揭露的治療組成物含有或相關於，至少一種治療共軛物或治療抗體，其中至少一種治療共軛物或治療抗體係各存在於單一劑量內，為大約、至少或多於0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99的濃度，每次每劑量為10-9、10-8、10-7、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1莫耳。較佳地，治療共軛物係存在於單劑量內為大約：1-100、2-60、3-50、4-40、5-30、6-20、7-15、8-10、2-18、3-16、4-14、5-12、6-10或7-8μM之間的濃度。
在一些實施例中，本文揭露的治療組成物含有或相關於，至少一種治療共軛物或治療抗體，其中至少一種治療共軛物或治療抗體係各存在於單 一劑量中為大約、至少或高於：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99的濃度，每次10-3、10-2、10-1、或10微克。在某些實施例中，每劑量中包括大約或至少為10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150或更多微克的一種治療共軛物或治療抗體。
在某些實施例中，本文所揭露的治療組成物係給藥於一劑量為每天每週或每月大約或至少或超過1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24次，歷經大約或至少或超過：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24天、週、月或年之期間。
套組
根據另一個態樣，部件的一個或多個套組可由所屬技術領域具有通常知識者設想，部件的套組以執行本文揭露的方法的至少一種，部件的套組包括一個或多個治療共軛物、抗癌/抗增殖劑、佐劑、細胞介素及/或趨化介素。根據上述方法的至少一個，治療組成物包含單獨或搭配之本文所揭露的治療組成物的有效量。前述試劑可在套組內於單一容器中或不同的容器中。
套組可能地也包括對生物事件的識別物、或藉由所屬技術領域具有通常知識者在參閱本揭露內容下可識別的其他化合物。套組也可包含至少一種組成物，其包含本文所揭露的治療組成物的有效量。根據所屬技術領域具有通常知識者可識別的程序，套組的治療組成物用以執行本文所揭露的至少一種方法。
本揭露也包括利用本文揭露的治療組成物治療增殖性疾病的方法。在一個實施例中，該方法涉及癌症的治療，例如，乳(腺)癌。該方法一般涉及以有效量提供本文所揭露的治療組成物給有需求的病患以治療增殖性疾病。
在一些實施例中，本發明的治療組成物於一方法中被給藥給有需求的受試者(例如，具有癌症者，例如乳癌)，其平均延伸進展無疾病存活或整體存活超過控制組安慰劑，例如，磷酸鹽緩衝鹽水安慰劑，大約或至少為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40天、週、月、或年。
在一些實施例中，治療組成物被皮下給予於第0-2、6、14、以及26週，在不可接受毒性或疾病進展的缺乏下。
在一些實施例中，本發明的治療組成物於一方法中給予有需求的受試者(例如，具有癌症者，如乳癌)，其在病患中相對於控制組安慰劑，例如，磷酸鹽緩衝鹽水安慰劑，平均收縮腫瘤的體積為大約或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、 59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或更多百分比，在超過1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40天、週，月或年的過程中。
在一些實施例中，腫瘤體積可在至少一個維度上(待紀錄的測量平面上之最長直徑)以10mm的最小尺寸藉由CT掃描(建議的CT掃描切片厚度為2.5mm及5mm)被精確地測量。
合成本發明的組成物之方法
本發明的治療組成物的Globo H六醣類部分被化學地合成如烯丙基醣苷且接著被製備用於與KLH共軛作用。
在一說明實施例中，Globo H的化學合成涉及下列概略步驟：
KLH以2-亞胺基四氫噻吩在水溶液緩衝液中處理。硫醇化的KLH接著透過Sephadex G-15管柱的粒徑篩析管柱從未反應的2-亞胺基四氫噻吩中分 離。硫醇化的KLH被貯存於惰性氣體(氮氣或氬氣)環境下，且立即被使用於與Globo H MMCCH的共軛作用中。
實例
實例1：本發明之醣共軛物的製備(Globo H-KLH)
Globo H烯丙基醣苷(市售可得)藉由臭氧分解被轉化成醛類。Globo H醛類與M2C2H(連接物)及NaCNBH3反應以得到Globo H-MMCCH。混合物以管柱純化以獲得Globo H-MMCCH。Globo H-MMCCH陽性的部分係藉由高效液相層析(HPLC)來確定且接著集中在一起。KLH溶解在硫醇化緩衝劑中且2-亞胺基四氫噻吩依比例被添加至反應中。反應作用被培養以完整且接著KLH-SH藉由管柱來純化。Globo H-MMCCH與KLH-SH結合。將反應攪拌至完成。Globo H-KLH接著純化以提供最終產物。
實例2：Globo H對KLH在醣共軛物中之重量比之分析
如在醣共軛物中製備的Globo H和KLH的重量比藉由高效能陰離子交換層析與脈衝安培檢測法(HPAEC-PAD)來確定。結果顯示在表3。
實例3：Globo H對KLH在醣共軛物中之表位比值的分析
KLH二十聚體(天然聚集的形式)的分子量是大約7.5MDa~8.6Mda，如在文獻中所描述的，諸如美光期刊30(Micron 30)(1999年)597-623。天然的KLH藉由粒徑篩析層析法以及多角度雷射散射光譜測定(laser scattering spectrometry，MALS)來確定，其具有大約8.6MDa的分子量(參閱第3圖和第4圖)。本發明的醣共軛物(樣本號碼5，Globo H對KLH的重量比值為0.17：1)係以粒徑篩析層析法來分析。結果顯示本發明的醣共軛物當相比於天然聚集的KLH二十聚體時展現分子量上的質量減少。參閱第4圖。接著計算分子量，如表4。
*上述分子比值基於下列方程式被計算：
**KLH的分子量取決於單體、二聚體或二十聚體的形式
根據上述，可以總結的是在本發明的醣共軛物中，KLH單體的單元在與Globo H共軛之後形成單體、二聚體及/或三聚體。
實例4：在大鼠中疫苗組成物和免疫作用的製備
如在實例1中所製備的醣共軛物(Globo H-KLH)的不同樣品被貯存在4℃，並與皂素佐劑混合於層流通風櫥(laminar flow hood)。所生成之疫苗組成物為了隨後的免疫作用被置放在冰上且運送到動物設施。
Lewis大鼠的三個組別以如表5所示之多種疫苗組成物來免疫作用。
大鼠在第0、7、14、以及21天被免疫化。末梢血液單核球細胞(PBMC)以及血漿在第0、3、10、17、24、以及31天被收集。脾臟、淋巴結、以及腹膜灌洗在第31天進行收集。
實例5：用於在大鼠內之體液及細胞免疫反應的誘導的測定
實例5.1 藉由流式細胞儀對免疫作用性細胞亞群的分析
末梢血液單核球(PBMCs)係從動物中分離且接著在PBMC中之多種免疫作用性細胞亞群係藉由流式細胞儀使用特異抗體針對不同細胞標記物來鑑定。從免疫的大鼠在第0、3、10、17、24、以及31天中所分離之PBMCs係以不同的螢光(FITC)-共軛的抗體染色，且放置在冰上30分鐘。培養之後，細胞以洗滌緩衝劑(1%牛血清白蛋白)(Sigma)以及0.1% NaN3(Sigma)在磷酸鹽緩衝鹽水(UniRegion Biotech)中洗滌，且以350g離心5分鐘。細胞在洗滌緩衝中被重新懸浮用以由FACS Canto(BD生物科學事業(BD Bioscience))之螢光測定。資料以BD FACSDiva(BD生物科學事業)軟體分析。顯示在被本發明的醣共軛物免疫化的大鼠內之結果，當相比於PBS控制組時，T細胞、B細胞、CD4+T細胞、以及CD8+T細胞係顯著地增殖。特異地，B細胞族群首先出現在第3天且隨後CD3+T細胞、CD4+T細胞以及CD8+T細胞出現在第24天。參閱第5圖(A)-(D)。
實例5.2 以ELISA測試Globo H特異性抗體
Globo H特異性抗體在來自免疫大鼠的血漿內的生成係以ELISA檢測來測定。結果顯示Globo H特異抗IgG的效價在免疫作用之後第10天開始上升且在第17天達到峰值。相似的模式在Globo H特異IgM抗體的生成中也被觀察到。參閱第5(A)圖-第5(B)圖。以PBS或僅僅KLH加佐劑所處理之大鼠，則沒有Globo H特異IgG和IgM抗體的反應(數據未顯示)。
總結來說，在免疫的大鼠中，B細胞生成出現在第3天，接續為出現在第10天之針對Globo H的IgM和IgG抗體的產生，且接續為在第24天出現之CD3+ T、CD4+ T、及CD8+ T。本發明的醣共軛物(Globo H-KLH)對於誘導體液和細胞反應兩者是有效的。
實例6：在小鼠內的免疫作用及以ELISA作抗體測試
醣共軛物(Globo H-KLH)的不同樣本被貯存在4℃，且在層流通風櫥中與皂素佐劑混合。所生成之產物疫苗組成物為了隨後的免疫作用被放置在冰上且運送至動物設施內。
大約八週大的Balb/c小鼠係透過皮下注射每週一次以不同的碳水化合物-比-蛋白質(Globo H：KLH)比值來給予Globo H-KLH，給予四週(第0天、第7天、第14天和第21天)。血液樣本在無抗凝血劑下於免疫前或者第0天、以及在每次疫苗接種之後三天(第10、17及24天)透過眼窩(retro-orbital)或面部靜脈收集。樣本接著離心以分離血清和紅血球。血清被收集並貯存在-20℃，其之後以ELISA分析。曼-懷特尼t檢定(Mann-Whitney t-test)被使用於統計分析。
如第6圖顯示，根據本發明，相比於PBS控制組，與皂素佐劑組合之醣共軛物(Globo H-KLH)係展示得以在動物模型內顯著地誘導Globo H特異IgM抗體反應。特別地，有著0.17：1(Globo H：KLH)的重量比值的醣共軛物比起有著0.07：1(Globo H：KLH)的重量比值的醣共軛物得以誘導較佳的抗體效價。
總結來說，根據本發明，與適當之佐劑組合之醣共軛物(Globo H-KLH)係在動物模型內展示得以誘導意想不到的優異體液及細胞免疫反應，特別是包括CTLs及IgM和IgG反應的B細胞及T細胞的增殖，其在癌症免疫療法中是重要的。
實例7：小鼠內Globo H-KLH有或無佐劑疫苗的免疫原性研究
本發明的Globo H組成物在與佐劑搭配時得以在小鼠內引出免疫反應的能力係被研究。被免疫療法誘導的Globo H特異抗體的量係藉由ELISA及FACS來量化。
六週大的C57BL/6雌性小鼠的組別以Globo H-KLH及佐劑皮下給藥來免疫化。Globo H-KLH劑量是在Globo H-KLH內Globo-H(以μg)的量的當量。每次注射在Globo H-KLH以及20μg佐劑中含有劑量當量的範圍於0.6μg至5.0μg Globo-H。免疫作用發生在第0天、第8天和第14天，且血清在第0天(注射前)和第24天被收集，以藉由ELISA和FACS作比較性分析。血清學反應係以ELISA測量，以測定抗Globo H神經醯胺抗體的效價，且FACS用以測定細胞表面對Globo H陽性MCF-7細胞的反應活性。
透過免疫作用，疫苗接種之後在行為、食慾、總體外觀、以及梳理行為(grooming)上並無可觀察到的改變。第三次免疫作用之後的十天，血清被收集用於藉由ELISA進行之IgG和IgM抗Globo H抗體效價的測定，使用處理前值的八倍效價作為陽性反應的標準。如在第2圖中顯示的，在以僅Globo H、Globo H KLH共軛物、或僅佐劑處理之小鼠內並無反應。相比之下，以Globo H-KLH+佐劑處理的小鼠有14/15反應出顯著的IgG抗Globo H效價，其在0.6至5μg的Globo H-KLH劑量下並無出現劑量依賴性。針對每個劑量之平均IgG效價以13至17.5倍增加超過處理前的值。至於IgM抗Globo H，在以佐劑+Globo H-KLH進行免疫作用之後，15隻小鼠的一隻顯示8倍的效價增加。然而，5/15隻小鼠具有免疫前血清的4倍之IgM效價，且總共6/15隻小鼠具有2倍的效價。用於每個劑量的平均IgM效價係以2.5倍增加超過處理前的值。
免疫血清與Globo H表現乳癌細胞株的結合能力，MCF-7於1：25血清稀釋下以FACS分析測定。為處理前值30%以上的處理後值(亦即，1.3倍增加)在此測試中被視為陽性。如在第3圖中顯示的，來自佐劑+Globo H-KLH處理的組別的免疫血清含有與MCF-7細胞反應的IgM抗體，其為超過處理前基線的5~6倍。更甚者，來自五分之三以0.6μg或2μg Globo H-KLH+佐劑處理的小鼠的免疫血清，以及五分之二以5μg Globo H-KLH+佐劑處理的小鼠的免疫血清，係顯示出可結合至MCF-7細胞之IgG抗體。平均結合能力增加1.3至2倍超過處理前基線。
以Globo H-KLH及佐劑的免疫接種展示出在C57BL/6雌性小鼠內引出抗Globo H反應之IgG和IgM兩者。免疫血清具有表現乳癌MCF-7細胞的結合Globo H的能力。
實例8：在KLH上之Globo-H共軛位點的LC-MS/MS分析
在四個KLH樣本上的Globo H共軛位點係使用多種酵素分解及LC-MS/MS來鑑定。四個Globo H共軛的KLH樣本被首先以四個不同酵素分解且接著以LC-MS/MS及Mascot資料庫搜索來分析。衍生物的兩種類型被鑑定：Globo H衍生物(Globo H+MMCCH)以及MMCCH衍生物(僅MMCCH)。Globo H衍生物以及其中性缺失形式被算進Globo H共軛位點鑑定。MMCCH形式及其去醯胺基形式被計算進入MMCCH共軛位點鑑定。只有那些有著高品質MS/MS光譜和Mascot分數的胜肽被算進去。對於Globo H共軛分析，31及28共軛的離胺酸係從OBI-822-13001-DP(樣本1)的兩次重複LC-MS/MS分析被觀察到；19和21共軛的離胺酸從OBI-822-13002-DP(樣本2)的兩次重複LC-MS/MS分析被觀察到；10和11共軛的離胺酸係從OBI-822-13003-DP(樣本3)的兩次重複LC-MS/MS分析 被觀察到；18和19共軛的離胺酸係從OBI-822-13004-DP(樣本4)的兩次重複LC-MS/MS分析被觀察到。對於MMCCH共軛分析，155和141共軛的離胺酸係從OBI-822-13001-DP(樣本1)的兩次重複LC-MS/MS分析被發現；143及137共軛的離胺酸係從OBI-822-13002-DP(樣本2)的兩次重複LC-MS/MS分析被發現；147及143共軛的離胺酸係從OBI-822-13003-DP(樣本3)的兩次重複LC-MS/MS分析被發現；140及136共軛的離胺酸係從OBI-822-13004-DS(樣本4)的兩次重複LC-MS/MS分析被發現。
實例8：材料和方法
在本段落的縮寫如下：K=離胺酸；LC-MS/MS=液相層析-串聯式質譜法(Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry)；DTT=二硫蘇醣醇(Dithiolthreitol)；IAM=碘乙醯胺(Iodoacetamide)；ACN=乙腈；FA=甲酸(Formic Acid)；Glu-C=內蛋白酶(Endoproteinase)Glu-C；ABC=碳酸氫銨(Ammonium bicarbonate)；RT=室溫(Room temperature)；MW=分子量。
四個KLH樣本，樣本1-4，被首先以100kDa為臨界(cut-off)的Amicon超離心過濾器(Ultra Centrifugal Filter)處理以緩衝交換進入50mM碳酸氫銨緩衝溶液內並且以6M尿素變性。樣本接著以10mM DTT於37℃減少1hr，於黑暗中在室溫下使用50mM IAM烷基化30分鐘，且以50mM DTT於室溫下焠火(quenched)5分鐘。所生成之蛋白質被稀釋直到尿素濃度為1M，且以不同酵素來經受溶液內分解(in-solution digestion)，如下列段落中描述的。
以不同的酵素作溶液內分解係以下列分解條件來執行：(1)胰蛋白酶於37℃進行分解，24小時(蛋白質：酵素=40：1)；(2)Glu-C於37℃進行分解，24小時(蛋白質：酵素=25：1)；(3)胰凝乳蛋白酶於室溫進行分解，24小時 (蛋白質：酵素=25：1)；(4)嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)於37℃進行分解，24小時(蛋白質：酵素=25：1)。
分解作用藉由添加甲酸來終止且所有四個分解樣本經受LC-MS/MS分析。
樣本以耦合Q Exactive質譜儀(熱學科學(Thermo Scientific))與Ultimate 3000 RSLC系統(戴安(Dionex))來分析。LC分隔使用C18管柱(Acclaim PepMap RSLC，75μm x 150mm，2μm，100Å)於下列顯示的梯度執行：
在源內CID(In-source CID)被設在45eV。全MS掃描在m/z 350-2000的範圍內被執行，且來自MS掃描中最強烈的十個離子係為了MS/MS光譜經受裂解化。原始資料藉由Proteome Discoverer 1.4於Mascot資料庫搜索被處理為峰值列表。
資料庫搜索以Mascot版本2.4.1以及Thermo Proteome Discoverer版本1.4針對KLH1和KLH2來執行[KLH1，EMBL登錄號CAG28307.1；KLH2，EMBL登錄號CAG28308.1]。使用的參數如下：酵素：根據分解方法的胰蛋白酶、Glu-C、 胰凝乳蛋白酶以及嗜熱菌蛋白酶；固定的修飾：半胱氨酸碘乙醯胺化(Carbamidomethyl，C)。
對於MMCCH衍生物的多種修飾(僅MMCCH)：去醯胺基(NQ)、氧化作用(M)、dK_MMCCH-1(K)、dK_MMCCH-2(K)。
對於Globo H衍生物的多種修飾(Globo H+MMCCH)：去醯胺基(NQ)、氧化作用(M)、Globo_H_MMCCH(K)、dK_MMCCH_NL997(K)、dK_MMCCH_NL835(K)、dK_MMCCH_NL673(K)、dK_MMCCH_NL511(K)、dK_MMCCH_NL308(K)、去醯胺基(NQ)、氧化作用(M)、胜肽質量公差(Peptide Mass Tolerance)：±10ppm；片段質量公差：±0.05Da；最大漏切位點數(Max Missed Cleavages)：5；儀器類型：ESI-TRAP；離子臨界值(Ion cut-off score)：13。
「dK_MMCCH-1」在搜索參數內指明MMCCH-共軛離胺酸有著352.1569Da的MW附加。
「dK_MMCCH-2」在搜索參數內指明MMCCH-共軛離胺酸的去醯胺基形式有著338.1300Da的MW附加。
「Globo_H_MMCCH(K)」在搜索參數內指明Globo H共軛離胺酸有著1393.5317Da的MW附加。
「dK_MMCCH_NL997」在搜索參數內指明Globo H共軛離胺酸的中性缺失形式有著396.1831Da的MW附加。
「dK_MMCCH_NL835」在搜索參數內指明Globo H共軛離胺酸的中性缺失形式有著558.2360Da的MW附加。
「dK_MMCCH_NL673」在搜索參數內指明Globo H共軛的離胺酸的中性缺失形式有著720.2888Da的MW附加。
「dK_MMCCH_NL511」在搜索參數內指明Globo H共軛的離胺酸的中性缺失形式有著882.3416Da的MW附加。
「dK_MMCCH_NL308」在搜索參數內指明Globo H共軛的離胺酸的中性缺失形式有著1085.4210Da的MW附加。
「MW附加」意味著相較於完整的離胺酸殘基，該分子量的附加。
實例8：結果
基於LC-MS/MS的技術是用於蛋白質的鑑定以及胺基酸修飾定性的工具。關於胜肽序列與修飾位點的詳細資訊可藉由MS/MS光譜所提供的片段離子的分配來獲得。Mascot是一款搜索引擎且其基於計分演算法的概率係被廣泛採用。Mascot分數在本研究中被採用作為用於蛋白質定序與Globo H或MMCCH共軛位點鑑定的信賴參考。用以廣泛地分析樣本1-4內Globo H或MMCCH共軛位點的分佈，這些樣本以多種酵素被分解，隨後以LC-MS/MS分析。
對於Globo H衍生物(Globo H+MMCCH)的期望化學結構係顯示於第33A圖，且相對應的在含有胜肽的離胺酸上之1393.53Da之MW附加可在結果之中被觀察到。此外，不穩定的多醣在LC-MS分析中電灑游離(electrospray ionization)期間透過中性缺失趨向衰減(fall off)。因此，源自中性缺失造成的396.18Da、558.24Da、720.29Da、882.34Da以及1085.42Da的分子量附加也可由於醣共軛的胜肽被觀察到，如顯示在第33B圖內。所有的衍生化形式被考量用於Globo H共軛位點的鑑定。
另外，在這些Globo H共軛的KLH樣本內MMCCH衍生物也被觀察到(僅MMCCH)。用於MMCCH衍生物和其去醯胺基形式的期望化學結構被顯示在第34A圖以及第34B圖，且分別地在含有胜肽的離胺酸上相對應的352.16Da及 338.13Da的MW附加，可在結果之中被觀察到。兩者衍生化形式被考量用於MMCCH共軛位點的鑑定。從Globo H衍生物至MMCCH的轉換並不清楚，但其應該是在樣本處理期間發生。
對於前驅物離子為±10ppm而對於片段離子為±0.05Da的質量精確度係被採用作為蛋白質鑑定和光譜判讀的標準。Globo H衍生物以及其中性的缺失形式係針對Globo H共軛位點鑑定，而被選擇作為可變化修飾，且MMCCH衍生物以及其去醯胺基形式亦針對MMCCH共軛位點鑑定被選擇作為可變化修飾。資料庫搜索針對由主管者(sponsor)提供的KLH1和KLH2的序列來執行。只有這些有著高品質MS/MS光譜(離子分數13，p<0.05)的胜肽在報告中被列出。
為了展示可重複的結果，LC-MS/MS分析執行兩次，隨後由個別Mascot資料庫搜索Globo H共軛位點鑑定及MMCCH共軛位點鑑定，如總結於第17圖。
在Globo H共軛位點分析中，針對樣本1、31及28離胺酸分別在第一次LC-MS/MS和第二次LC-MS/MS中發現；針對樣本2，19及21離胺酸分別在第一次LC-MS/MS和第二次LC-MS/MS中發現；針對樣本3，10及11離胺酸分別在第一次LC-MS/MS和第二次LC-MS/MS中發現；針對樣本4，18及19離胺酸分別在第一次LC-MS/MS和第二次LC-MS/MS中發現。鑑定的細節被表列在第14-21圖。在MMCCH共軛分析中，針對樣本1，155及141離胺酸分別在第一次LC-MS/MS和第二次LC-MS/MS中發現；針對樣本2，143及137離胺酸分別在第一次LC-MS/MS和第二次LC-MS/MS中發現；針對樣本3，147及143離胺酸分別在第一次LC-MS/MS和第二次LC-MS/MS中發現；針對樣本4，140及136離胺酸 分別在第一次LC-MS/MS和第二次LC-MS/MS中發現。鑑定的細節被表列在第22-29圖。
來自多種酵素實驗的Globo H共軛位點總結在第30圖，且MMCCH共軛位點總結在第31圖。對於Globo H共軛的樣本之整體共軛位點分析結果總結在第32圖。
實例8：結論
由於多種中性缺失形式以及多醣之較低游離效率，Globo H衍生物共軛的胜肽之質譜儀訊號低於MMCCH共軛胜肽之訊號，其使得Globo H共軛的直接鑑定較為困難。這是為什麼鑑定的胜肽數目高於MMCCH共軛分析。因此，MMCCH結果可被使用於表示Globo H共軛。
共軛位點分析提出，針對樣本1-4，在KLH1/KLH2內全部306離胺酸殘基之中鑑定分別有155個、143個、147個及140個離胺酸共軛位點。在重複分析中，針對樣本1-4，分別有141個、137個、143以及136個共軛位點被鑑定。
除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語以及任何縮寫詞具有如同本發明的所屬技術領域具有通常知識者所普遍理解的相同含義。雖然類似或等同於那些本文所描述的任何組成物、方法、套組、以及用於溝通訊息的裝置可被用於實踐本發明，較佳組成物、方法、套組及用於溝通訊息的裝置在本文中被描述。
本文所引用的所有參考文獻於法律所允許的整個範圍內在本文中被併入作為參考。這些參考文獻的討論僅僅旨在總結其作者所做的主張。並不承認任何參考文獻(或任何參考文獻的一部分)是相關的先前技術。申請人保留挑戰任何引用參考文獻的準確性和適當性(pertinence)的權利。
<110> 台灣浩鼎生技股份有限公司
<120> 用於誘導免疫反應的碳水化合物疫苗組成物及其在癌症治療之用途
<150> US 61/828,798
<151> 2013-12-26
<160> 2
<210> 1
<211> 3125
<212> PRT
<213> Megathura crenulata
<400> 1
<210> 2
<211> 3421
<212> PRT
<213> Megathura crenulata
<400> 2

Claims (32)

  1. 一種化合物，其包含下列結構：
    Figure TWI641383B_C0001
    ，其中：n獨立地為300至1500的整數；m獨立地為1至5的整數；且其中於鹼性胺基酸殘基上一Globo H部分係共價地結合至一KLH部分，且該化合物的表位比值範圍為1200到3000，其中該化合物係在惰性氣體環境下進行共軛。
  2. 一種包含複數個Globo H部分共價地連接至一或多個鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)部分之治療組成物，其中一Globo H部分對一KLH部分的數目比值係為60：1至150：1，表示為對於一個單體KLH部分之Globo H分子的數目，且該組成物的表位比值範圍為1200到3000，其中該治療組成物係在惰性氣體環境下進行共軛。
  3. 一種包含複數個Globo H部分共價地連接至一個鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)部分之治療組成物，其中一Globo H部分的數目係為1至150，表示為對於一個單體KLH部分之Globo H分子的數目，其中該治療組成物係在惰性氣體環境下進行共軛。
  4. 一種包含複數個Globo H部分共價地連接至兩個鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)部分之治療組成物，其中一Globo H部分的數目係為150至300，表示為對於一個二聚體KLH部分之Globo H分子的數目，其中該治療組成物係在惰性氣體環境下進行共軛。
  5. 一種包含複數個Globo H部分共價地連接至三個鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)部分之治療組成物，其中一Globo H部分的數目係為300至450，表示為對於一個三聚體KLH部分之Globo H分子的數目，其中該治療組成物係在惰性氣體環境下進行共軛。
  6. 一種包含複數個Globo H部分共價地連接至四個鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)部分之治療組成物，其中一Globo H部分的數目係為450至600，表示為對於一個四聚體KLH部分之Globo H分子的數目，其中該治療組成物係在惰性氣體環境下進行共軛。
  7. 一種包含複數個Globo H部分共價地連接至五個鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)部分之治療組成物，其中一Globo H部分的數目係為600至750，表示為對於一個五聚體KLH部分之Globo H分子的數目，其中該治療組成物係在惰性氣體環境下進行共軛。
  8. 一種醫藥組成物，其包含下列結構之化合物：
    Figure TWI641383B_C0002
    其中，n獨立地為300至1500的整數，且其中m獨立地為1至5的整數，且該化合物的表位比值範圍為1200到3000；以及可選地之一醫藥上可接受載體，其中該醫藥組成物係在惰性氣體環境下進行共軛。
  9. 一種包含治療共軛物之醫藥組成物，該治療共軛物包含複數個Globo H部分共價地連接至一或多個鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)部分次單元，其中該Globo H部分的數目比該KLH部分次單元係為60：1至150：1，且該組成物的表位比值範圍為1200到3000，其中該醫藥組成物係在惰性氣體環境下進行共軛。
  10. 一種包含治療共軛物之醫藥組成物，該治療共軛物包含複數個Globo H部分共價地連接至一或多個鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)部分次單元，其中KLH部分存在為單體、二聚體、三聚體、四聚體、及五聚體，且該組成物的表位比值範圍為1200到3000，其中該醫藥組成物係在惰性氣體環境下進行共軛。
  11. 一種包含治療共軛物之醫藥組成物，該治療共軛物包含複數個Globo H部分共價地連接至一或多個鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)部分次單元，其中該Globo H部分的數目比該KLH部分次單元係為150：1至300：1，表示為對於一個二聚體KLH部分之Globo H分子的數目，其中該醫藥組成物係在惰性氣體環境下進行共軛。
  12. 一種包含分離治療共軛物之醫藥組成物，該分離治療共軛物包含複數個Globo H部分共價地連接至一或多個鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)部分次單元，其中該Globo H部分的數目比該KLH部分次單元係為300：1至450：1，表示為對於一個三聚體KLH部分之Globo H分子的數目，其中該醫藥組成物係在惰性氣體環境下進行共軛。
  13. 一種包含分離治療共軛物之醫藥組成物，該分離治療共軛物包含複數個Globo H部分共價地連接至一或多個鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)部分次單元，其中該Globo H部分的數目比該KLH部分次單元係為450：1至600：1，表示為對於一個四聚體KLH部分之Globo H分子的數目，其中該醫藥組成物係在惰性氣體環境下進行共軛。
  14. 一種包含分離治療共軛物之醫藥組成物，該分離治療共軛物包含複數個Globo H部分共價地連接至一或多個鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)部分次單元，其中該Globo H部分的數目比該KLH部分次單元，表示為Globo H分子的數目比一個五聚體KLH係為600：1至750：1，表示為對於一個五聚體KLH部分之Globo H分子的數目，其中該醫藥組成物係在惰性氣體環境下進行共軛。
  15. 一種包含KLH部分的單體、二聚體、三聚體、四聚體或五聚體或其組合之醫藥組成物，其中每個KLH部分包含一或多個Globo H部分共價地連接至該KLH部分，其中該組成物的表位比值範圍為1200到3000，其中該醫藥組成物係在惰性氣體環境下進行共軛。
  16. 如申請專利範圍第15項所述之醫藥組成物，其中在該組成物內的一治療共軛物的1%至99%是單體、二聚體、三聚體、四聚體或五聚體。
  17. 如申請專利範圍第15項所述之醫藥組成物，其進一步包含一佐劑，其中該佐劑是完全弗氏佐劑及不完全弗氏佐劑、類鐸受體分子、LPS、脂蛋白、脂肽、鞭毛蛋白、雙股RNA、病毒DNA、未甲基化CpG島區、左旋咪唑、卡介苗、異丙肌苷、日達仙、PD-1拮抗劑、PD-1抗體、CTLA拮抗劑、CTLA抗體、介白素、細胞介素、GM-CSF、醣脂體、鋁鹽鹼基、磷酸鋁、明礬、氫氧化鋁、脂質體、TLR2促效劑、脂肽、奈米粒子、單磷醯脂質A、OBI-821皂素、水中油奈米乳液、以及細菌樣顆粒。
  18. 如申請專利範圍第15項所述之醫藥組成物，其進一步包含選自由IL-2、IL-12、IL-18、IL-2、IFN-γ、TNF、IL-4、IL-10、IL-13、IL-21、GM-CSF以及TGF-β所組成的群組的一細胞介素。
  19. 如申請專利範圍第15項所述之醫藥組成物，其進一步包含一趨化介素。
  20. 如申請專利範圍第15項所述之醫藥組成物，其進一步包含選自由荷爾蒙治療劑、單株抗體治療、化學治療、類視色素受體調解子、細胞毒性/細胞生長抑制劑、抗癌劑、抗增殖劑、異戊二烯基-蛋白轉移酶抑制劑、HMG-CoA還原酶抑制劑、氮芥類、亞硝基脲、血管生成抑制劑、細胞增殖和存活傳訊路徑的抑制劑、細胞凋亡誘導劑、干擾細胞週期檢查點的藥劑、干擾受體酪胺酸激酶(RTKs)的藥劑、雷帕黴素的哺乳動物標靶(mTOR)抑制劑、人類表皮生長因子受體2(HER2)抑制劑、表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑、整合素阻斷劑、NSAIDs、PPAR促效劑、先天多重抗藥性(MDR)的抑制劑、鎮吐劑、有用於貧血的治療的藥劑、有用於嗜中性球減少症的治療的藥劑、免疫增強藥物、雙磷酸鹽、芳香酶抑制劑、誘導贅生細胞的最後分化的藥劑、γ-分泌酶抑制劑、癌症疫苗、PD1/PD-L1抑制劑、CTLA-4免疫療法、選自由CDK4/6抑制劑、PI3K抑制劑、mTOR抑制劑、AKT抑制劑、Pan-Her抑制劑之標靶治療物、以及任何其組合所組成的群組的一藥劑。
  21. 如申請專利範圍第15項所述之醫藥組成物，其包含一醫藥上可接受載體。
  22. 如申請專利範圍第21項所述之醫藥組成物，其中該醫藥組成物是癌症疫苗。
  23. 如申請專利範圍第15項所述之醫藥組成物，該醫藥組成物被製劑用於皮下注射、靜脈內給藥或肌內給藥。
  24. 一種如申請專利範圍第15項所述之組成物在製造用於治療癌症的藥劑之用途，其中該藥劑包含針對癌症之該組成物的一治療有效量。
  25. 如申請專利範圍第24項所述之用途，其中癌症為乳癌、肺癌、肝癌、口腔癌、胃癌、結腸癌、鼻咽癌、皮膚癌、腎癌、腦腫瘤、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、腸癌、胰腺癌及膀胱癌。
  26. 如申請專利範圍第24項所述之用途，其中癌症為一上皮癌症。
  27. 如申請專利範圍第24項所述之用途，其中癌症為一乳癌。
  28. 如申請專利範圍第24項所述之用途，其中在該組成物中該Globo-H部分的治療有效量包含約0.01μg/kg至約250mg/kg。
  29. 如申請專利範圍第24項所述之用途，其中在該組成物中該Globo-H部分的治療有效量包含約0.10μg/kg至約0.75μg/kg。
  30. 如申請專利範圍第24項所述之用途，其中在該組成物中一Globo-H-KLH複合物的治療有效量包含約0.01μg/kg至約250mg/kg。
  31. 如申請專利範圍第24項所述之用途，其中在該組成物中一Globo-H-KLH複合物的治療有效量包含約0.60μg/kg至約4.50μg/kg。
  32. 一種如申請專利範圍第15項所述之組成物在製造用於在動物或人類中誘導抗體以創造單株抗體的藥劑之用途，其中該藥劑包含在動物或人類中用於治療應用或診斷應用之該組合物的一有效量。
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