序列表之參照 序列表之正式副本與說明書經由EFS-Web以ASCII格式之文本文件形式同時提交,文件名為「05384.005PV1.txt」,創建日期為2016年9月23日,且大小為60.5千字節。經由EFSWeb申請之序列表係說明書之一部分並以引用方式整體併入本文中。
各個實施例之概述
本發明提供以高親和力結合Globo H之抗體,且其經改造以針對可在高表現製造條件下發生之不期望化學修飾及大的聚集物形成具有增加之穩定性。具體而言,親代抗-Globo H抗體之CDR-H3中之不成對半胱胺酸殘基經其他殘基取代(例如,C100A、C100S、C100T及C100F)以提供Globo H結合親和力及ADCC活性極少損失或無損失且具有增加之穩定性之變體抗-Globo H抗體。本發明變體源自之親代抗體表示為「hMZ-2lw」,且揭示於WO2015/143123中。hMZ-2lw係同型IgG之人類化抗-Globo H抗體,其在卵巢、乳房及胰臟腫瘤之小鼠異種移植物模型中展現對於Globo H之高親和力且引起腫瘤大小顯著減小(例如,參見WO2015/143123)。本發明提供如表1中所揭示之抗-Globo H抗體變體在胺基酸方面之結構及各種抗體序列特徵(例如,CDR、HVR、V
H
及V
L
、輕鏈及重鏈)之編碼核苷酸序列及隨附序列表、及如實例中所揭示之功能特性(例如,結合親和力、蛋白質聚集物形成)。本揭示內容亦提供製造抗體變體之方法、包含抗體變體之醫藥組合物及調配物及使用抗體變體治療之方法。 對於本文中之說明及隨附申請專利範圍而言,除非上下文另有明確指示,否則單數形式「一」(「a」及「an」)包括複數個指示物。因此,例如,在提及「蛋白質」時包括一種以上蛋白質,且在提及「化合物」時係指一種以上化合物。「包含」(「comprise」、「comprises」、「comprising」)、「包括」(「include」、「includes」及「including」)之使用可互換且並不意欲具有限制性。應進一步理解,若各個實施例之說明使用術語「包含」,則熟習此項技術者將理解,在一些具體情況下,可以使用語言「基本上由......組成」或「由......組成」替代性闡述實施例。 若提供一定範圍之值,則除非上下文另有明確規定,否則應當理解,除非上下文另有明確規定,否則值之每一中間整數、及在該範圍之上限與下限之間之值之每一中間整數之每一十分之一、及該所述範圍內之任何其他所述值或中間值涵蓋在本發明內。該等較小範圍之上限及下限可獨立地包括於較小範圍內,且亦涵蓋在本發明內,受到在所述範圍內之任何明確排除的限制。若所述範圍包括限值中之一者或二者,則本發明中亦包括排除彼等所包括限值中之(i)任一者或(ii)二者的範圍。舉例而言,「1至50」包括「2至25」、「5至20」、「25至50」、「1至10」等。 本揭示內容中提及之所有出版物、專利、專利申請案及其他文件皆係出於所有目的全文以引用方式併入本文中,其併入程度如同出於所有目的將每一個別出版物、專利、專利申請案或其他文件個別指明以引用方式併入本文中一般。 應理解,前述一般說明(包括圖示)及以下詳細說明二者皆僅為實例性及解釋性且並不限制本揭示內容。
定義
除非另有明確定義,否則本文之說明中所用之技術及科學術語將具有熟習此項技術者通常所理解之含義。因此,以下術語意欲具有以下含義。 如本文所用之「Globo H」係指式Fucα1—>2Galβ1—>3GalNAcβ1—> 3Galα1—> 4Galβ1—>4Glcβ1—>
O
-cer之六醣,其具有以下結構:
。 Globo H係在多種細胞類型(包括癌細胞,尤其與乳癌、前列腺癌及肺癌相關之癌細胞)上表現之腫瘤相關抗原性碳水化合物之家族之成員(例如,參見Dube DH, Bertozzi CR, (2005) 「Glycans in cancer and inflammation. Potential for therapeutics and diagnostics,」
Nat Rev Drug Discov 4:477-488
)。 「Globo H陽性細胞」係指在其表面上表現Globo H之細胞。通常,可使用抗-Globo H抗體在諸如免疫組織化學、FACS等方法中測定Globo H在細胞表面上之表現。 「Globo H陽性癌症」係指包含Globo H陽性細胞之癌症。 如本文所用「抗體」係指包含一或多條與特定抗原特異性結合或免疫性反應之多肽鏈的分子。本發明之實例性抗體包括單株抗體、多株抗體、嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體、多特異性(或異源偶聯物)抗體(例如,雙特異性抗體)、單價抗體、多價抗體、抗原結合抗體片段(例如,Fab'、F(ab′)
2
、Fab、Fv、rIgG及scFv片段)、抗體融合物及合成抗體(或抗體模擬物)。 「抗-Globo H抗體」或「結合Globo H之抗體」係指以足夠親和力結合Globo H使得抗體在靶向Globo H中可用作診斷及/或治療劑的抗體。在一些實施例中,抗-Globo H抗體與無關、非Globo H抗原之結合程度係抗體與Globo H之結合之小於約10%,如(例如)藉由放射免疫分析(RIA)所量測。在一些實施例中,結合至Globo H之抗體具有< 1 μM、< 100 nM、< 10 nM、< 1 nM、< 0.1 nM、< 0.01 nM或< 0.001 nM (例如,10
-8
M或更小、10
-8
M至10
-13
M,例如10
-9
M至10
-13
M)之解離常數(Kd)。 「全長抗體」、「完整抗體」或「全抗體」在本文中可互換使用,且係指具有實質上與天然抗體結構相似之結構或具有含有如本文所定義Fc區之重鏈的抗體。 「抗體片段」係指全長抗體中能與全長抗體結合相同抗原之部分。抗體片段之實例包括(但不限於) Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')
2
;雙價抗體;直鏈抗體;單鏈抗體分子(例如scFv);及自抗體片段形成之多特異性抗體。 抗體之「種類」係指其重鏈所具有之恆定結構域或恆定區之類型。存在5大類抗體:IgA、IgD、IgE、IgG及IgM,且該等種類中之若干可進一步分成子類(同型),例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同種類之免疫球蛋白之重鏈恆定結構域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。 術語「可變區」或「可變結構域」係指抗體重鏈或輕鏈中參與抗體與抗原結合之結構域。天然抗體之重鏈及輕鏈之可變結構域(分別為VH及VL)通常具有相似結構,其中每一結構域包含4個保守框架區(FR)及三個超變區(HVR) (例如,參見Kindt等人,Kuby Immunology,第6版,W.H. Freeman and Co.,第91頁)。單一VH或VL結構域可足以賦予抗原結合特異性。此外,結合特定抗原之抗體可使用VH或VL結構域自結合抗原以分別篩選互補VL或VH結構域之文庫的抗體來分離(例如,參見Portolano等人,J. Immunol. 150:880-887 (1993);Clarkson等人, Nature 352:624-628 (1991))。 如本文所用「超變區」或「HVR」係指抗體可變結構域區域中序列具有超變性及/或形成結構上經界定之環(「超變環」)中的每一者。通常,天然抗體包含四條具有六個HVR之鏈;三個位於重鏈可變結構域中,VH (H1、H2、H3),且三個位於輕鏈可變結構域中,VL (L1、L2、L3)。HVR通常包含來自超變環及/或來自「互補決定區」 (CDR)之胺基酸殘基。實例性超變環出現於胺基酸殘基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)及96-101 (H3)。(Chothia及Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。除非另有指示,否則可變結構域中之HVR殘基及其他殘基(例如,FR殘基)在本文中係根據Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)編號。 如本文所用「互補決定區」或「CDR」係指可變結構域之超變區內具有最高序列可變性及/或參與抗原識別之區。通常,天然抗體包含四條具有六個CDR之鏈;三個位於重鏈可變結構域中,VH (H1、H2、H3),且三個位於輕鏈可變結構域中,VL (L1、L2、L3)。實例性CDR (CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)出現於L1之胺基酸殘基24-34、L2之50-56、L3之89-97、H1之31-35、H2之50-65及H3之95-102。(Kabat等人,見上文)。除VH中之CDR1外,CDR通常包含形成超變環之胺基酸殘基。 「框架」或「FR」係指除超變區(HVR)殘基外之可變結構域殘基。可變結構域之FR通常係由4個FR結構域:FR1、FR2、FR3及FR4組成。因此,HVR及FR序列通常出現於VH (或VL)中之下列序列中:FR1-H1 (L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。 「天然抗體」係指天然免疫球蛋白分子。舉例而言,天然IgG抗體係約150道爾頓(Dalton)之異源四聚體醣蛋白,其由二硫鍵鍵結之兩條相同輕鏈及兩條相同重鏈組成。自N末端至C末端,每一重鏈具有可變區(VH) (亦稱為可變重鏈結構域或重鏈可變結構域),之後為三個恆定結構域(CH1、CH2及CH3)。相似地,自N末端至C末端,每一輕鏈具有可變區(VL)(亦稱為可變輕鏈結構域或輕鏈可變結構域),之後為恆定輕鏈(CL)結構域。基於抗體恆定結構域之胺基酸序列,可將該抗體之輕鏈指派為兩種類型中之一者,稱為卡帕(κ)及拉姆達(λ)。 如本文所用之「單株抗體」係指自實質上同源之抗體群獲得之抗體,即構成該群之個別抗體相同及/或結合相同表位,但可能之變體抗體除外(例如,變體抗體含有天然發生或在產生單株抗體期間產生、且通常以少量存在的突變。與通常包括針對不同決定子(表位)之不同抗體之多株抗體製劑相比,單株抗體製劑之每一單株抗體針對抗原上之單一決定子。因此,術語「單株」指示如自抗體之實質上同源之群體獲得之抗體特徵,且不應解釋為需要藉由任一特定方法產生抗體。舉例而言,欲使用之單株抗體可藉由多種技術製得,包括但不限於雜交瘤方法、重組DNA方法、噬菌體展示方法及利用含有所有或一部分人類免疫球蛋白基因座之轉基因動物之方法,該等方法及用於製備單株抗體之其他實例性方法闡述於本文中。 「嵌合抗體」係指重鏈及/或輕鏈之一部分源自特定來源或物種、而重鏈及/或輕鏈之其餘部分源自不同來源或物種的抗體。 「人類化抗體」係指包含來自非人類HVR之胺基酸序列及來自人類FR之胺基酸序列的嵌合抗體。在某些實施例中,人類化抗體將包含實質上全部之至少一個、且通常兩個可變結構域,其中全部或實質上全部之FTVR (例如,CDR)對應於非人類之彼等HVR,且全部或實質上全部之FR對應於人類抗體之彼等FR。人類化抗體視情況可包含源自人類抗體之抗體恆定區的至少一部分。抗體之「人類化形式」(例如非人類抗體)係指已經受人類化之抗體。 「人類抗體」係指具有對應於如下抗體之胺基酸序列的胺基酸序列的抗體:其係由人類或人類細胞產生或源自利用人類抗體譜或其他編碼人類抗體之序列之非人類來源。此人類抗體之定義明確排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。 「人類共有框架」係表示在選擇人類免疫球蛋白VL或VH框架序列中最普遍存在之胺基酸殘基之框架。通常,人類免疫球蛋白VL或VH序列係來自可變結構域序列之亞組。通常,序列之亞組係如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,NIH公開案91- 3242, Bethesda MD (1991),第1-3卷中之亞組。在一個實施例中,對於VL而言,亞組係如Kabat等人(見上文)之亞組κI 。在一個實施例中,對於VH而言,該亞組係如Kabat等人(見上文)之亞組III。 如本文所用「受體人類框架」係包含源自人類免疫球蛋白框架或人類共有框架之輕鏈可變結構域(VL)框架或重鏈可變結構域(VH)框架之胺基酸序列之框架。「源自」人類免疫球蛋白框架或人類共有框架之受體人類框架可包含其相同胺基酸序列,或其可含有胺基酸序列變化。在一些實施例中,胺基酸變化之數目為10或更小、9或更小、8或更小、7或更小、6或更小、5或更小、4或更小、3或更小或2或更小。在一些實施例中,VL受體人類框架之序列與VL人類免疫球蛋白框架序列或人類共有框架序列一致。 「Fc區」係指包含免疫球蛋白重鏈之C-末端多肽序列之二聚物複合物,其中C-末端多肽序列係可藉由木瓜蛋白酶消化完整抗體獲得者。Fc區可包含天然或變體Fc序列。儘管免疫球蛋白重鏈之Fc序列之邊界可有所變化,但人類IgG重鏈Fc序列通常界定為自約位置Cys226之胺基酸殘基、或自約位置Pro230伸延至Fc序列之羧基-末端。然而,可存在或可不存在Fc序列之C-末端離胺酸(Lys447)。免疫球蛋白之Fc序列通常包含兩個恆定結構域、CH2結構域及CH3結構域,且視情況包含CH4結構域。 「Fc受體」或「FcR」係指與抗體之Fc區結合之受體。在一些實施例中,FcR係天然人類FcR。在一些實施例中,FcR係結合IgG抗體者(γ受體)且包括FcyRI、FcyRII及FcyRIII亞類之受體,包括彼等受體之對偶基因變體及選擇性剪接形式。FcyRII受體包括FcyRIIA (「活化受體」)及FcyRIIB (「抑制受體」),二者具有相似胺基酸序列,主要在其胞質結構域上有所不同。活化受體FcyRIIA在其胞質結構域中含有基於免疫受體酪胺酸之活化基序(IT AM)。抑制受體FcyRIIB在其細胞質結構域中含有基於免疫受體酪胺酸之抑制基序(ITIM) (例如,參見Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997))。如本文所用FcR亦包括新生受體FcRn,其負責將母體IgG轉移至胎中(Guyer等人,J. Immunol. 1 17:587 (1976)及Kim等人,J. Immunol. 24:249 (1994))及調節免疫球蛋白之穩態。FcR綜述於以下中:例如Ravetch及Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991);Capel等人,Immunomethods 4:25-34 (1994);及de Haas等人,J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)。 如本文所用「多價抗體」係包含三個或更多個抗原結合位點之抗體。多價抗體較佳經改造以具有三個或更多個抗原結合位點且通常不為天然序列IgM或IgA抗體。 「多特異性抗體」係具有至少兩個不同結合位點之抗體,每一位點具有不同結合特異性。多特異性抗體可為全長抗體或抗體片段,且不同結合位點可各自結合至不同抗原或不同結合位點可結合至相同抗原之兩個不同表位。 「Fv片段」係指含有完整抗原識別及結合位點之抗體片段。此區係由一個重鏈可變結構域與一個輕鏈可變結構域緊密締合之二聚體組成,其在自然界中(例如在scFv中)可係共價締合。每一可變結構域之三個HVR以此構形相互作用以界定V
H
-V
L
二聚體之表面上之抗原結合位點。6個HVR或其亞群共同賦予抗體以抗原結合特異性。然而,即使單一可變結構域(或Fv之一半,其僅包含三個對抗原具有特異性之HVR)亦具有識別並結合抗原之能力,但其親和力低於完整結合位點。 「Fab片段」係指含有輕鏈之可變及恆定結構域以及重鏈之可變結構域及第一恆定結構域(CH1)的抗體片段。「F(ab’)
2
抗體片段」包含Fab片段對,其通常在其羧基末端附近藉由介於其間之鉸鏈半胱胺酸共價連接。抗體片段之其他化學偶合亦為業內已知。 如本文所用「抗原結合臂」係指抗體片段之具有特異性結合所關注靶分子之能力的組成部分。通常,抗原結合臂係免疫球蛋白多肽序列(例如,免疫球蛋白輕鏈及重鏈之HVR及/或可變結構域序列)之複合物。 「單鏈Fv」或「scFv」係指包含抗體之V
H
及V
L
結構域之抗體片段,其中該等結構域係以單一多肽鏈存在。通常,Fv多肽進一步包含VH結構域與VL結構域之間之多肽連接體,其使得scFv能夠形成期望抗原結合結構。 術語「雙價抗體」係指具有兩個抗原結合位點之小抗體片段,該等片段包含在同一多肽鏈(VH及VL)中與輕鏈可變結構域(VL)連接之重鏈可變結構域(VH)。藉由使用過短而不容許在同一鏈上之兩個結構域之間配對之連接體,迫使該等結構域與另一鏈之互補結構域配對並產生兩個抗原結合位點。 「線性抗體」係指闡述於Zapata等人, Protein Eng., 8(10): 1057-1062 (1995)中之抗體。簡言之,該等抗體包含隨機Fd區段對(VH-CH1-VH-CH1),其與互補輕鏈多肽一起形成抗原結合區對。線性抗體可為雙特異性或單特異性抗體。 「裸抗體」係指不與異源部分(例如,細胞毒性部分)或放射性標記偶聯之抗體。 「親和力」係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合配偶體(例如抗原)間之非共價相互作用之總強度。「結合親和力」係指反映結合對之成員(例如,抗體及抗原)間之1:1相互作用的固有結合親和力。分子X對於其配偶體Y之親和力通常可表示為解離常數(Kd)。可藉由業內已知之常用方法(包括闡述於本文中之彼等)來量測親和力。用於量測結合親和力之具體闡釋性及實例性實施例闡述於下文中。 「特異性結合」(「binds specifically」或「specific binding」)係指抗體與抗原以不超過約1 × 10
-7
M之親和力值結合。 「親和力成熟」抗體係指與不具有改變之親代抗體相比,在一或多個HVR中具有一或多個改變之抗體,該等改變可改良抗體對抗原之親和力。 抗體之「功能抗原結合位點」係能結合靶抗原者。抗原結合位點之抗原結合親和力不必與抗原結合位點源自之親代抗體一樣強,但結合抗原之能力必須可使用已知用於評估抗體與抗原之結合之多種方法中之任一者量測。 「經分離」抗體係指自其天然環境之組分分離的抗體。在一些實施例中,將抗體純化至大於95%或99%之純度,如藉由(例如)電泳(例如,SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如,離子交換或反相HPLC)所測定。關於評估抗體純度之方法之綜述,例如,參見Flatman等人,J. Chromatogr. B 848:79-87。 如本文所用「實質上相似」或「實質上相同」係指兩個數值(例如,一者與測試抗體相關且另一者與參考抗體相關)之間之足夠高相似度,使得熟習此項技術者認為該兩個值間之差異在藉由該等值(例如,Kd值)所量測之生物特性之背景下具有較小或不具有生物學及/或統計學顯著性。 如本文所用「實質上不同」係指兩個數值(通常一者與分子相關且另一者與參考分子相關)之間具有足夠高差異度,使得熟習此項技術者將認為該兩個值之間之差異在藉由該等值(例如Kd值)所量測生物學特性之背景下具有統計學顯著性。 「效應物功能」係指可歸因於抗體之Fc區之彼等生物活性,其可隨抗體同型而有所變化。抗體效應物功能之實例包括:C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC);Fc受體結合;抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC);吞噬作用;細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調;及B細胞活化。 「免疫偶聯物」係指偶聯至一或多個異源分子(包括(但不限於)細胞毒性劑)之抗體。 如本文所用之「細胞毒性劑」係指抑制或防止細胞功能及/或引起細胞死亡或破壞之物質。細胞毒性劑包括(但不限於)放射性同位素;化學治療劑或藥物;生長抑制劑;酶及其片段,例如核溶解酶;抗生素;毒素,例如細菌、真菌、植物或動物來源之小分子毒素或酶促活性毒素,包括其片段及/或變體;及下文所揭示之各種抗腫瘤劑或抗癌劑。 「病症」係將受益於本文所述物質/分子或方法治療之任何病況。 「細胞增殖性病症」及「增殖性病症」係指與一定程度之異常細胞增殖相關之病症。 「癌症」及「癌性」係指或闡述哺乳動物中通常特徵在於細胞增殖病症之生理學病況。癌症通常可包括(但不限於)癌瘤、淋巴瘤(例如霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)及非霍奇金氏淋巴瘤)、母細胞瘤、肉瘤及白血病。癌症之更具體實例可包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀癌瘤、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、胰臟癌、膠質母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜或子宮癌瘤、唾液腺癌瘤、腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌瘤、白血病及其他淋巴組織增殖性病症及各種類型之頭頸癌。 「腫瘤」係指所有贅瘤性細胞生長及增殖(無論惡性抑或良性)以及所有癌前期及癌性細胞及組織。本文中所提及之術語「癌症」、「癌性」、「細胞增殖性病症」、「增殖性病症」及「腫瘤」並不相互排斥。 「轉移」係指癌症及/或腫瘤自其原發性位點擴散至個體身體中之其他位置。 「治療」(「treatment」、「treat」或「treating」)係指試圖改變所治療個體之自然病程之臨床干預,且可出於預防性目的或在臨床病理學病程期間實施。治療之期望結果可包括(但不限於)預防病症發生或復發、減輕症狀、減弱病症之任何直接或間接病理結果、預防轉移、降低進展速率、改善或緩和疾病況態及緩解或改良預後。舉例而言,治療可包括向個體投與治療有效量之包含抗-Globo H抗體之醫藥調配物以延遲Globo H陽性癌症之發生或減緩其進展。 「醫藥調配物」係指製劑呈活性成分之生物學活性有效之形式且不含對投與該調配物之個體有毒之其他組分。 「醫藥上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除活性成分外對其所投與之個體無毒之成分。醫藥上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝液、賦形劑、穩定劑或防腐劑。 「治療有效量」係指活性成分或藥劑(例如醫藥調配物)可達成期望治療或預防結果(例如治療或預防個體之疾病或病症)之量。在癌症情形中,治療劑之治療有效量係如下量:減少癌細胞數;減小原發性腫瘤大小;抑制(即減慢至一定程度且較佳停止)癌細胞浸潤至周圍器官中;抑制(即減慢至一定程度且較佳停止)腫瘤轉移;抑制腫瘤生長至一定程度;及/或減輕一或多種與癌症相關之症狀至一定程度。就藥物可預防現有癌細胞之生長及/或殺死現有癌細胞之程度而言,其可為細胞生長抑制性及/或細胞毒性。對於癌症療法而言,可例如藉由評估存活持續時間、疾病進展時間(TTP)、反應率(RR)、反應持續時間及/或生活品質來量測活體內效能。 如本文所用,「同時」係指兩種或更多種治療劑之投與,其中至少一部分投與在時間上重疊。因此,同時投與包括在中斷一或多種其他藥劑之投與後持續投與一或多種藥劑之給藥方案。 「個體」(「individual」或「subject」)係指哺乳動物,包括(但不限於)家畜動物(例如牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物,例如猴)、兔及齧齒類動物(例如小鼠及大鼠)。 「抗癌治療劑」係指可用於治療癌症之藥劑。實例性抗癌治療劑包括(但不限於)化學治療劑、生長抑制劑、細胞毒性劑、用於放射療法中之藥劑、抗血管生成劑、細胞凋亡劑、抗微管蛋白劑,及用於治療癌症之其他藥劑、抗CD20抗體、血小板源生長因子抑制劑(例如Gleevec
™
(甲磺酸伊馬替尼(Imatinib Mesylate)))、COX-2抑制劑(例如塞來昔布(celecoxib))、干擾素、細胞介素,結合至以下靶PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA受體、TRAIL/Apo2中一或多者之拮抗劑(例如中和抗體),其他生物活性及有機化學劑,及其組合。 「化學治療劑」係指可用於治療癌症之化學化合物。實例性化學治療劑包括(但不限於)烷基化劑,例如噻替派(thiotepa)及環磷醯胺(CYTOXAN®);磺酸烷基酯,例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan);氮丙啶,例如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)及烏瑞替派(uredopa);次乙亞胺及甲基三聚氰胺,包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙烯三聚氰胺、三乙烯磷醯胺、三乙烯硫代磷醯胺及三羥甲基三聚氰胺;番荔枝內酯(尤其係布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone));δ-9-四氫大麻酚(屈大麻酚(dronabinol),MARINOL®);β-拉帕醌(β-lapachone);拉帕醇(lapachol);秋水仙鹼(colchicine);白樺脂酸(betulinic acid);喜樹鹼(camptothecin) (包含合成類似物托泊替康(topotecan) (HYC AMTIN®)、CPT-11 (伊立替康(irinotecan),CAMPTOSAR®)、乙醯基喜樹鹼(acetylcamptothecin)、莨菪素(scopolectin)及9-胺基喜樹鹼(9-aminocamptothecin));苔蘚蟲素(bryostatin);卡利斯他汀(callystatin);CC-1065 (包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)及比折來新(bizelesin)合成類似物);鬼臼毒素(podophyllotoxin);鬼臼酸(podophyllinic acid);替尼泊苷(teniposide);念珠藻素(cryptophycin) (尤其係念珠藻素1及念珠藻素8);尾海兔素汀(dolastatin);倍癌黴素(duocarmycin)(包括合成類似物:KW-2189及CB1-TM1);艾榴塞洛素(eleutherobin);水鬼蕉鹼(pancratistatin);匍枝珊瑚醇(sarcodictyin);海綿抑制素(spongistatin);氮芥(nitrogen mustard),例如氮芥苯丁酸、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷醯胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、甲基二氯乙基胺(mechlorethamine)、甲基二氯乙基胺氧化物鹽酸鹽、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、膽甾醇對苯乙酸氮芥(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥;亞硝基脲,例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及雷莫司汀(ranimnustine);抗生素,例如烯二炔抗生素(例如,卡奇黴素(calicheamicin),尤其係卡奇黴素γII及卡奇黴素ωII (例如,參見,Nicolaou等人,Angew. Chem Intl. Ed. Engl, 33: 183-186 (1994));CDP323,一種口服α-4整聯蛋白抑制劑;達內黴素(dynemicin),包括達內黴素A;埃斯波黴素(esperamicin);以及新制癌菌素髮色團及相關色蛋白烯二炔抗生素發色團)、阿克拉黴素(aclacinomysin)、放線菌素(actinomycin)、安麯黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸、博來黴素(bleomycin)、放線菌素C (cactinomycin)、卡拉黴素(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌黴素(carzinophilin)、色黴素(chromomycin)、放線菌素D (dactinomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-側氧基-L-正白胺酸;多柔比星(doxorubicin) (包括ADRIAMYCIN®、嗎啉基-多柔比星、氰嗎啉基-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星、鹽酸多柔比星脂質體注射物(DOXIL®)、多柔比星脂質體TLC D-99 (MYOCET®)、聚乙二醇化多柔比星脂質體(CAELYX®)及去氧多柔比星)、泛艾黴素(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycin) (例如絲裂黴素C)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾拉黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、泊非黴素(porfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑黴素(streptonigrin)、鏈脲黴素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代謝物,例如胺甲喋呤(methotrexate)、吉西他濱(gemcitabine) (GEMZAR®)、替加氟(tegafur) (UFTORAL®)、卡培他濱(capecitabine) (XELODA®)、埃坡黴素(epothilone)及5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil) (5-FU);葉酸類似物,例如二甲葉酸(denopterin)、胺甲喋呤、蝶羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate);嘌呤類似物,例如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine);嘧啶類似物,例如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-氮雜尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二去氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine);雄激素,例如卡普睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內酯(testolactone);抗腎上腺素,例如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);葉酸補充劑,例如亞葉酸;醋葡醛內酯(aceglatone);醛磷醯胺醣苷(aldophosphamide glycoside);胺基乙醯丙酸(aminolevulinic acid);恩尿嘧啶(eniluracil);安吖啶(amsacrine);雌二醇-瘤克寧錠複合物(bestrabucil);比生群(bisantrene);依達曲沙(edatraxate);地磷醯胺(defofamine);秋水仙胺(demecolcine);地吖醌(diaziquone);依氟鳥胺酸(eflornithine);依利醋銨(elliptinium acetate);埃博黴素;依託格魯(etoglucid);硝酸鎵;羥基脲;蘑菇多醣;氯尼達明(lonidainine);類美登素(maytansinoid),例如美登素(maytansine)及安絲菌素(ansamitocin);米托胍腙(mitoguazone);米托蒽醌(mitoxantrone);莫哌達醇(mopidanmol);硝胺丙吖啶(nitraerine);噴司他汀(pentostatin);蛋胺氮芥(phenamet);吡柔比星(pirarubicin);洛索蒽醌(losoxantrone);2-乙基醯肼;丙卡巴肼(procarbazine);PSK®多糖複合物(JHS Natural Products, Eugene, OR);雷佐生(razoxane);利索新(rhizoxin);西左非蘭(sizofiran);鍺螺胺(spirogermanium);替奴佐酸(tenuazonic acid);三亞胺醌(triaziquone);2,2’,2’-三氯三乙胺;單端孢黴烯(trichothecene) (尤其係T-2毒素、疣皰菌素A (verracurin A)、桿孢菌素(roridin A)及蛇形菌素(anguidine));烏拉坦(urethan);長春地辛(vindesine) (ELDISINE®、FILDESIN®);達卡巴嗪(dacarbazine);甘露莫司汀(mannomustine);二溴甘露醇(mitobronitol);二溴衛矛醇(mitolactol);哌泊溴烷(pipobroman);加賽特辛(gacytosine);阿糖胞苷(arabinoside) (「Ara-C」);噻替派;類紫杉醇,例如太平洋紫杉醇(paclitaxel) (TAXOL®)、太平洋紫杉醇之經白蛋白改造之奈米粒子調配物(ABRAXANE
TM
)及多西他賽(docetaxel) (TAXOTERE®);瘤克寧錠(chloranbucil);6-硫鳥嘌呤;巰嘌呤;胺甲喋呤;鉑藥劑,例如順鉑(cisplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin) (例如,ELOXATIN®)及卡鉑(carboplatin);長春花胺(vincas),其可防止微管蛋白聚合形成微管,包括長春鹼(VELBAN®)、長春新鹼(ONCOVIN®)、長春地辛(ELDISINE®、FILDESIN®)及長春瑞濱(vinorelbine) (NAVELBINE®);依託泊苷(VP-16);異環磷醯胺;米托蒽醌;甲醯四氫葉酸(leucovorin);能滅瘤(novantrone);依達曲沙(edatrexate);道諾黴素(daunomycin);胺喋呤(aminopterin);伊班膦酸鹽(ibandronate);拓樸異構酶抑制劑RFS 2二氟甲基鳥胺酸(DMFO);類視色素,例如視黃酸,包括貝沙羅汀(bexarotene) (TARGRETIN®);雙膦酸鹽,例如氯膦酸(clodronate) (例如,BONEFOS®或OSTAC®)、依替膦酸鹽(etidronate) (DIDROCAL®)、NE-58095、唑來膦酸(zoledronic acid)/(唑來膦酸鹽) (ZOMETA®)、阿侖膦酸鹽(alendronate) (FOSAMAX®)、帕米膦酸鹽(pamidronate) (AREDIA®)、替魯膦酸鹽(tiludronate) (SKELID®)或利塞膦酸鹽(risedronate) (ACTONEL®);曲沙他濱(troxacitabine) (1,3-二氧戊環核苷胞嘧啶類似物);反義寡核苷酸,尤其係抑制信號傳導路徑中與異常細胞增殖有關之基因表現之彼等,例如PKC-α、Raf、H-Ras及表皮生長因子受體(EGF-R);疫苗,例如THERATOPE®疫苗及基因療法疫苗,例如,ALLOVECTIN®疫苗、LEUVECTIN®疫苗及VAXID®疫苗;拓樸異構酶1抑制劑(例如,LURTOTECAN®);rmRH (例如,ABARELIX®);BAY439 (索拉非尼(sorafenib);Bayer);SU-1 1248 (舒尼替尼(sunitinib),SUTENT®,Pfizer);哌立福辛(perifosine)、COX-2抑制劑(例如塞來昔布或依託昔布(etoricoxib))、蛋白體抑制劑(例如PS341);硼替佐米(bortezomib) (VELCADE®);CCI-779;替吡法尼(tipifarnib) (R1 1577);索拉非尼(orafenib)、ABT510;Bcl-2抑制劑,例如奧利默森納(oblimersen sodium) (GENASENSE®);匹杉瓊(pixantrone);EGFR抑制劑(參見下文定義);酪胺酸激酶抑制劑(參見下文定義);絲胺酸-蘇胺酸激酶抑制劑,例如雷帕黴素(rapamycin) (西羅莫司(sirolimus),RAPAMUNE®);法尼基轉移酶抑制劑,例如洛那法尼(lonafarnib) (SCH 6636, SARASAR
TM
);及上述任一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物;以及兩種或兩種以上上述藥劑之組合,例如CHOP,其係環磷醯胺、多柔比星、長春新鹼及普賴蘇濃(prednisolone)之組合療法的縮寫;及FOLFOX,其係奧沙利鉑(ELOXATIN
TM
)與5-FU及甲醯四氫葉酸之組合的治療方案的縮寫。 化學治療劑亦可包括用於調節、減小、阻斷或抑制可促進癌症生長之激素之效應的抗激素藥劑或內分泌治療劑。該等治療劑可為激素本身,包括(但不限於):具有混合之激動劑/拮抗劑特性之抗雌激素,包括他莫昔芬(tamoxifen) (NOLVADEX®)、4-羥基他莫昔芬、托瑞米芬(toremifene) (FARESTON®)、艾多昔芬(idoxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、雷洛昔芬(raloxifene) (EVISTA®)、曲沃昔芬(trioxifene)、可莫昔芬(keoxifene);及選擇性雌激素受體調節劑(SERM),例如SERM3;無激動劑性質之純抗雌激素,例如氟維司群(fulvestrant) (FASLODEX®)及EM8 (此等藥劑可阻斷雌激素受體(ER)之二聚作用,抑制DNA結合,增加ER更新,及/或抑制ER含量);芳香酶抑制劑,包括類固醇芳香酶抑制劑(例如福美坦(formestane)及依西美坦(exemestane) (AROMASIN®))及非類固醇芳香酶抑制劑(例如阿那曲唑(anastrazole) (ARIMIDEX®)、來曲唑(letrozole) (FEMARA®)及胺魯米特)及其他芳香酶抑制劑(包括伏氯唑(vorozole) (RIVISOR®)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate) (MEGASE®)、法倔唑(fadrozole)及4(5)-咪唑);黃體化激素釋放激素激動劑,包括亮丙瑞林(leuprolide) (LUPRON®及ELIGARD®)、戈舍瑞林(goserelin)、布舍瑞林(buserelin)及曲普瑞林(tripterelin);性類固醇,包括妊娠素(例如乙酸甲地孕酮及乙酸甲羥孕酮(medroxyprogesterone acetate))、雌激素(例如已烯雌酚(diethylstilbestrol)及普雷馬林(premarin))及雄激素/類視色素(例如氟甲睪酮(fluoxymesterone)、全反式視黃酸及芬維a胺(fenretinide));奧那司酮(onapristone);抗孕酮;雌激素受體下調劑(ERD);抗雄激素,例如氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)及比卡魯胺(bicalutamide);及上述任一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物;以及兩種或兩種以上上述藥劑之組合。
各個實施例之詳細說明 I. 抗 -Globo H 抗體
在一些實施例中,本發明提供在胺基酸方面具有增加之穩定性之抗-Globo H抗體變體的結構及各種熟知免疫球蛋白特徵(例如,CDR、HVR、V
H
及V
L
、重鏈及重鏈)之編碼核苷酸序列。下表1提供本發明之抗-Globo H抗體序列之概述說明及其序列標識符(SEQ ID NO: )。該等序列包括於隨附序列表中。
表 1
1.
抗 - Globo H 抗體變體之親和力
在一些實施例中,本文提供之抗-Globo H抗體具有< 1 μM、< 100 nM、< 10 nM、< 1 nM、< 0.1 nM、< 0.01 nM或< 0.001 nM (例如,10
-8
M或更小、10
-8
M至10
-13
M,例如10
-9
M至10
-13
M)之解離常數(Kd)。配體與其受體之結合親和力可使用多種分析中之任一者測定,且以多種定量值來表示。可用於測定抗體之親和力之特異性Globo H結合分析揭示於本文實例中。另外,抗原結合分析為業內已知且可用於本文中,包括(但不限於)使用諸如以下等技術之任何直接或競爭性結合分析:西方墨點、放射免疫分析、酶聯免疫吸附分析(ELISA)、「三明治(sandwich)」免疫分析、基於表面電漿共振之分析(例如BIAcore分析,如WO2005/012359中所述)、免疫沈澱分析、螢光免疫分析及蛋白質A免疫分析。 因此,在一些實施例中,結合親和力係以Kd值表示且反映固有結合親和力(例如,具有最小化親合力效應)。本發明之抗-Globo H抗體變體通常將對Globo H具有足夠強之結合親和力,例如,抗體可以介於100 nM與1 pM之間之Kd值結合Globo H。 2.
抗體片段
在一些實施例中,本發明之抗-Globo H抗體可為抗體片段。抗體片段包括(但不限於) Fab、Fab'、Fab'- SH、F(ab')2、Fv、單臂抗體、scFv片段及本文所述且業內已知之其他片。關於某些抗體片段之綜述,例如,參見Hudson等人,Nat. Med. 9: 129-134 (2003)。關於scFv片段之綜述,例如,參見Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg及Moore編輯,(Springer-Verlag, New York),第269-315頁(1994);亦參見WO93/16185;及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。關於包含補救受體結合表位殘基且具有增加之活體內半衰期之Fab及F(ab')
2
片段之說明,參見美國專利第5,869,046號。其他單價抗體形式闡述於(例如) WO2007/048037、WO2008/145137、WO2008/145138及WO2007/059782中。單臂抗體闡述於(例如) WO2005/063816中。雙價抗體係具有兩個可為二價或雙特異性之抗原結合位點的抗體片段(例如,參見EP0404097;WO93/01161;Hudson等人,Nat. Med. 9: 129-134 (2003);及Hollinger等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993))。 在一些實施例中,抗體片段係包含抗體之重鏈可變結構域之全部或一部分或輕鏈可變結構域之全部或一部分的單一結構域抗體。在一些實施例中,單一結構域抗體係人類單一結構域抗體(Domantis, Inc., Waltham, MA;例如,參見美國專利第6,248,516號)。 可藉由各種技術來製備抗體片段,包括(但不限於)蛋白水解消化完整抗體以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌(
E. coli
)或噬菌體)來產生,如本文所述。 3.
嵌合及人類化抗體
在一些實施例中,本發明之抗-Globo H抗體可為嵌合抗體。(例如,參見如美國專利第4,816,567號;及Morrison等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 :6851-6855 (1984)中所述之嵌合抗體)。在一個實施例中,嵌合抗體包含非人類可變區(例如,源自小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類動物(例如猴子)之可變區)及人類恆定區。在另一實施例中,嵌合抗體係類別或亞類已自親代抗體發生改變之「類別轉換」抗體。預期嵌合抗體可包括其抗原結合片段。 在一些實施例中,本發明之抗-Globo H抗體係人類化抗體。通常,將非人類抗體人類化以降低對人類之免疫原性,而保留親代非人類抗體之特異性及親和力。通常,人類化抗體包含一或多個可變結構域,其中HVR (例如,CDR) (或其部分)係源自非人類抗體,且FR(或其部分)係源自人類抗體序列。人類化抗體視情況亦可包含人類恆定區之至少一部分。在一些實施例中,人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如,CDR殘基源自之抗體)之相應殘基取代以恢復或改良抗體特異性或親和力。 人類化抗體及其製備方法綜述於(例如) Almagro及Fransson,Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008)中,且進一步闡述於(例如)以下文獻中:Riechmann等人,Nature 332:323-329 (1988);Queen等人,Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989):美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號;Kashmiri等人,Methods 36:25-34 (2005) (闡述SDR (a-HVR)接枝);Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (闡述「表面重塑」);Dall’Acqua等人,Methods 36:43-60 (2005) (闡述「FR改組」);及Osbourn等人,Methods 36:61-68 (2005)及Klimka等人,Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (闡述FR改組之「引導選擇」方法)。 可用於人類化之人類框架區包括(但不限於):使用「最佳擬合」方法選擇之框架區(例如,參見,Sims等人,J. Immunol. 151:2296 (1993));源自輕鏈或重鏈可變區之特定亞組之人類抗體之共有序列的框架區(例如,參見Carter等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992);及Presta等人,J. Immunol, 151 :2623 (1993));人類成熟(經體突變)框架區或人類種系框架區(例如,參見,Almagro及Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008));及源自篩選FR文庫之框架區(例如,參見,Baca等人,J. Biol. Chem. 272: 10678-10684 (1997)及Rosok等人,J. Biol. Chem. 271: 22611-22618 (1996))。 4.
人類抗體
在一些實施例中,本發明之抗-Globo H抗體可為人類抗體。可使用業內已知之各種技術來產生人類抗體。人類抗體概述於van Dijk及van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001)及Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)中。可藉由向轉基因動物投與免疫原來製備人類抗體,該轉基因動物已經改良以產生完整人類抗體或具有因應抗原性攻擊之人類可變區的完整抗體。該等動物通常含有人類免疫球蛋白基因座之全部或一部分,該等基因座替代內源免疫球蛋白基因座或存在於染色體外或隨機整合至動物染色體中。在該等轉基因小鼠中,內源免疫球蛋白基因座通常已不活化。關於自轉基因動物獲得人類抗體之方法的綜述,參見Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)。亦參見(例如)美國專利第6,075,181號及第6,150,584號中之XENOMOUSE
TM
技術;美國專利第5,770,429號中之HUMAB®;美國專利第7,041,870號中之K-M MOUSE®技術;及美國專利申請公開案第US 2007/0061900號中之VELOCIMOUSE®技術)。可進一步(例如)藉由與不同人類恆定區組合來修飾由該等動物產生之完整抗體的人類可變區。 人類抗體亦可藉由基於雜交瘤之方法來製備。已闡述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類異源骨髓瘤細胞系。(例如,參見Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984);Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第51-63頁(Marcel Dekker公司,New York, 1987);及Boerner等人,J. Immunol., 147: 86 (1991)。經由人類B細胞雜交瘤技術產生之人類抗體亦闡述於Li等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)中。其他方法包括闡述於(例如)美國專利第7,189,826號(闡述自雜交瘤細胞系產生單株人類IgM抗體)中之彼等。人類雜交瘤技術(三源雜交瘤(Trioma)技術)亦闡述於Vollmers及Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937 (2005)以及Vollmers及Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)中。 人類抗體亦可藉由分離選自人類源噬菌體展示文庫之Fv純系可變結構域序列來生成。隨後,此等可變結構域序列可與期望之人類恆定結構域組合。自抗體文庫選擇人類抗體之技術闡述於下文中。 5.
文庫源抗體
在一些實施例中,本發明之抗-Globo H抗體可藉由自組合文庫篩選具有一或多種期望活性之抗體來分離。舉例而言,業內已知用於產生噬菌體展示文庫及自該等文庫篩選具有期望結合特性之抗體的各種方法。產生該等文庫源抗體之方法可參見(例如) Hoogenboom等人,Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien等人編輯,Human Press, Totowa, NJ, 2001);McCafferty等人,Nature 348:552-554;Clackson等人,Nature 352: 624-628 (1991);Marks等人,J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992);Marks及Bradbury, m Methods in Molecular Biology 248: 161-175 (Lo編輯,Human Press, Totowa, NJ, 2003);Sidhu等人,J. Mol. Biol. 338(2): 299- 310 (2004);Lee等人,J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004);Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (34): 12467-12472 (2004);及Lee等人,J. Immunol. Methods 284(1-2): 1 19- 132(2004)。 6.
多特異性抗體
在一些實施例中,本發明之抗-Globo H抗體係多特異性抗體,例如雙特異性抗體。在一些實施例中,多特異性抗體係具有至少兩個不同結合位點之單株抗體,該兩個不同結合位點對於不同抗原各自具有結合特異性,其中之至少一者特異性結合Globo H。在一些實施例中,結合位點中之至少一者特異性結合細胞毒性劑。在實例性實施例中,本發明之抗-Globo H抗體係雙特異性抗體且可用於將細胞毒性劑局域化至表現Globo H之細胞。 製備多特異性抗體之技術包括(但不限於)重組共表現兩個具有不同特異性之免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(參見Milstein及Cuello,
Nature
305: 537 (1983)、WO 93/08829及Traunecker等人,EMBOJ. 10: 3655 (1991))。亦可使用「隆凸於孔洞中」改造(例如,參見美國專利第5,731,168號)。 亦可藉由以下方式來製備多特異性抗體:改造有利於形成Fc-異源二聚抗體分子而非同源二聚物之「靜電牽引」效應(WO 2009/089004A1);使兩個或更多個抗體或片段交聯(例如,參見美國專利第4,676,980號及Brennan等人,Science 229: 81 (1985));使用白胺酸拉鍊產生雙特異性抗體(例如,參見Kostelny等人,J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992));使用用於製備雙特異性抗體片段之「雙價抗體」技術(例如,參見Hollinger等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993));使用單鏈Fv (scFv)二聚體(例如,參見Gruber等人,J. Immunol, 152:5368 (1994));或三特異性抗體(例如,參見Tutt等人,J. Immunol. 147: 60 (1991)。 7.
抗體變體
在一些實施例中,亦涵蓋本發明之抗-Globo H抗體之變體。舉例而言,具有抗體之改良之結合親和力及/或其他生物性質之抗體可藉由向編碼抗體之核苷酸序列中引入適當修飾或藉由肽合成來製備。 此等修飾包括(例如)抗體胺基酸序列內殘基之缺失及/或插入及/或取代。可實施缺失、插入及取代之任一組合以獲得最終構築體,前提為最終構築體具有Globo H抗原結合之期望特性。 A. 取代、插入及缺失變體 在一些實施例中,提供除本文所述彼等外亦具有一或多個胺基酸取代之抗-Globo H抗體變體。誘變之位點可包括HVR及FR。基於常見側鏈類別或性質之典型「保守」胺基酸取代及/或取代為業內所熟知且可用於本發明之實施例中。本發明亦涵蓋基於非保守胺基酸取代之變體,其中胺基酸側鏈類別中之一者之成員變為另一類別之胺基酸。 通常根據以下類別或常見性質對胺基酸側鏈進行分組:(1) 疏水:Met、Ala、Val、Leu、Ile、正白胺酸;(2) 中性親水:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;(3) 酸性:Asp、Glu;(4) 鹼性:His、Lys、Arg;(5) 影響鏈取向:Gly、Pro;及(6) 芳香族:Trp、Tyr、Phe。 業內所熟知至抗體中之胺基酸取代且隨後針對期望功能(例如,保留/改良之抗原結合、降低之免疫原性或改良之ADCC或CDC)進行篩選的技術。 胺基酸取代變體可包括取代親代抗體(例如人類化或人類抗體)之一或多個超變區殘基。通常,選擇用於進一步研究之所得變體相對於親代抗體在某些生物性質(例如,增加之親和力、降低之免疫原性)中具有修飾及/或實質上保留親代抗體之某些生物性質。實例性取代變體係親和力成熟抗體,其可便利地(例如)使用基於噬菌體展示之親和力成熟技術(例如闡述於本文中之彼等)生成。簡言之,使一或多個HVR殘基突變且將變體抗體展示於噬菌體上並篩選特定生物學活性(例如結合親和力)。 用於鑑別抗體上可靶向用於誘變之殘基或區的有用方法稱為「丙胺酸掃描誘變」(例如,參見Cunningham及Wells (1989) Science, 244: 1081-1085)。在此方法中,鑑別殘基或靶殘基組(例如,帶電殘基,例如Arg、Asp、His、Lys及Glu)並由中性或帶負電之胺基酸(例如,Ala或聚丙胺酸)替代以確定是否影響抗體與抗原之相互作用。可在對初始取代展現功能敏感性之胺基酸位置引入其他取代。或者或另外,使用抗原-抗體複合體之晶體結構以鑑別抗體與抗原間之接觸點。可靶向或消除該等接觸殘基及相鄰殘基作為取代候選物。可篩選變體以確定其是否含有期望性質。 胺基酸序列插入包括胺基-及/或羧基末端融合物(長度介於一個殘基至含有上百或更多殘基之多肽範圍內)、以及單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N-末端甲二磺醯殘基之抗體。抗體分子之其他插入變體包括抗體N-末端或C-末端與延長抗體血清半衰期之酶或多肽之融合物。 取代可在HVR中進行以改良抗體親和力。該等改變可在「熱點」(亦即,由在體細胞成熟過程期間以高頻率經歷突變之密碼子編碼的殘基)(例如,參見Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207: 179-196 (2008))中進行,其中測試所得變體V
H
或V
L
之結合親和力。在一個實施例中,可藉由自二級文庫構築及重新選擇來實施親和力成熟(例如,參見Hoogenboom等人,Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O'Brien等人編輯,Human Press, Totowa, NJ, (2001)。)引入多樣性之另一方法涉及HVR引導之方法,其中將若干HVR殘基(例如,一次4至6個殘基)隨機化。可特定鑑別(例如,使用丙胺酸掃描誘變或建模)參與抗原結合之HVR殘基。具體而言,通常靶向CDR-H3及CDR-L3。 在一些實施例中,取代、插入或缺失可發生於一或多個HVR內,只要該等改變不會實質上降低抗體結合抗原之能力即可。例如,可對HVR作出不實質上降低結合親和力之保守改變(例如,如本文所提供之保守取代)。該等改變可在HVR 「熱點」外。在上文所提供之變體V
H
及V
L
序列之一些實施例中,每一HVR未經改變,或含有不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。 B. 醣基化變體 在一些實施例中,改變本發明之抗-Globo H抗體以增加或降低抗體醣基化之程度。抗體醣基化位點之添加或缺失可藉由改變胺基酸序列以產生或移除一或多個醣基化位點來實施。 在抗體包含Fc區之實施例中,可改變附接至Fc區之碳水化合物。由哺乳動物細胞產生之天然抗體通常包含藉由N-連接附接至Fc區之CH2結構域的Asn297之支鏈、二分枝寡醣(例如,參見Wright等人,TIBTECH 15:26-32 (1997))。寡醣可包括多種碳水化合物,例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸以及附接至二分枝寡醣結構之「主幹」中之GlcNAc的岩藻糖。在一些實施例中,抗體之Fc區之寡醣的修飾可產生具有某些改良之性質之變體。 在一些實施例中,本發明之抗-Globo H抗體可為親代抗體之變體,其中變體包含無附接(直接或間接)至Fc區之岩藻糖的碳水化合物結構。舉例而言,該抗體中岩藻糖之量可為約1%至約80%、約1%至約65%、約5%至約65%或約20%至約40%。藉由計算相對於附接至Asn 297之所有糖結構(例如複合物、雜合體及高甘露糖結構)之總量Asn297之糖鏈內岩藻糖之平均量來測定岩藻糖的量,如藉由MALDI-TOF質譜所量測(例如,參見WO 2008/077546)。Asn297係指位於Fc區中大約位置297 (Fc區殘基之Eu編號)之天冬醯胺殘基;然而,因抗體中具有微小序列變化,故Asn297亦可位於位置297上游或下游之大約± 3個胺基酸處,亦即,介於位置294與位置300之間。 在一些實施例中,岩藻糖基化變體可具有改良之ADCC功能。參見(例如)美國專利公開案第US 2003/0157108號或第US 2004/0093621號。「去岩藻糖基化」或「岩藻糖缺乏」抗體及其相關製備方法的實例揭示於以下中:例如US2003/0157108;US2003/0115614;US2002/0164328;US2004/0093621;US2004/0132140;US2004/0110704;US2004/0110282;US2004/0109865;WO2000/61739;WO2001/29246;WO2003/085119;WO2003/084570;WO2005/035586;WO2005/035778;WO2005/053742;WO2002/031140;Okazaki等人,J. Mol. Biol. 336: 1239- 1249 (2004);Yamane-Ohnuki等人,Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)。 用於產生去岩藻糖基化抗體之細胞系包括缺乏蛋白質岩藻糖基化之Led 3 CHO細胞(例如,參見Ripka等人,Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986);US2003/0157108及WO2004/056312)及基因敲除細胞系,例如α-1 ,6-岩藻糖基轉移酶基因、FUT8、基因敲除CHO細胞(例如,參見Yamane-Ohnuki等人,Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004);Kanda, Y.等人,Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006);及WO2003/085107)。 C. Fc區變體 在一些實施例中,本發明之抗-Globo H抗體可包含Fc區中之一或多個胺基酸修飾(即,Fc區變體)。Fc區變體可包含在一或多個胺基酸位置包含胺基酸取代之人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。 在一些實施例中,作為Fc區變體之抗-Globo H抗體可具有親代抗體之一些(但非全部)效應物功能,藉此使其成為應用之合意候選物,抗體之活體內半衰期係重要的,但某些效應物功能(例如補體及ADCC)係不必要或有害的。 具有降低之效應物功能之Fc區變體抗體可包括以下Fc區位置中之一或多者之胺基酸取代:238、265、269、270、297、327及329。(例如,參見美國專利第6,737,056號)。該等Fc區變體可包括位置265、269、270、297及327中之兩者或更多者之胺基酸取代。該等Fc區變體亦可包括殘基265及297二者取代成丙胺酸(例如,參見美國專利第7,332,581號)。具有改良或減小之與FcR之結合之Fc區變體揭示於(例如)美國專利第6,737,056號;WO 2004/056312;及Shields等人, J. Biol. Chem. 9(2): 6591- 6604 (2001)中。具有改良之ADCC之Fc區變體可包含(例如) Fc區之位置298、333及/或334 (基於EU編號)之一或多個胺基酸取代。具有改變(亦即,改良或減小)之C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)之Fc區,如(例如)美國專利第6,194,551號、WO99/51642及Idusogie等人,J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)中所述。具有延長之半衰期及改良之與新生Fc受體(FcRn)之結合之Fc區變體揭示於(例如) US2005/0014934A1 (Hinton等人)中。該等Fc區變體包含以下位置中之一或多者之胺基酸取代:238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424及434。Fc區變體之其他實例可參見(例如)美國專利第5,648,260號及第5,624,821號;及WO94/29351。 通常,可實施活體外及/或活體內細胞毒性分析來確認Fc區變體中CDC及/或ADCC活性之降低/消耗。舉例而言,可實施Fc受體(FcR)結合分析以確保抗體缺少FcγR結合能力(因此可能缺少ADCC活性),但保留FcRn結合能力。用於介導ADCC之原代細胞(NK細胞)僅表現FcγRIII,而單核細胞球FcγRI、FcγRII及FcγRIII。用於評估所關注分子之ADCC活性之活體外分析的非限制性實例闡述於美國專利第5,500,362號中(例如,參見Hellstrom等人,Proc. Nat 'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986))及Hellstrom等人,Proc.Nat'l Acad. Sci. USA 82: 1499-1502 (1985);5,821,337 (參見Bruggemann, M.等人,J. Exp. Med. 166: 1351-1361 (1987))。或者,可採用非放射性分析方法(例如,參見用於流式細胞術之ACTI
TM
非放射性細胞毒性分析(CellTechnology, Inc.,Mountain View, CA);及CytoTox96
®
非放射性細胞毒性分析(Promega, Madison, WI))。可用於該等分析之效應細胞包括末梢血單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。或者或另外,例如可在諸如Clynes等人, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652- 656 (1998)中所揭示之動物模型中在活體內評估所關注分子之ADCC活性。亦可實施C1q結合分析來確認抗體不能與C1q結合且因此缺乏CDC活性。例如,參見WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為評估補體活化,可實施CDC分析(例如,參見Gazzano-Santoro等人,J. Immunol. Methods 202: 163 (1996);Cragg, M.S.等人,Blood 101 : 1045-1052 (2003);及Cragg, M.S.及M.J. Glennie, SW 103:2738-2743 (2004))。可使用業內已知之方法來實施FcRn結合及活體內清除/半衰期測定(例如,參見Petkova等人,Intl. Immunol. 18(12): 1759-1769 (2006))。 D. 半胱胺酸改造之抗體變體 在一些實施例中,預期本文所述抗-Globo H抗體可在特定非CDR位置經半胱胺酸殘基取代以便產生反應性硫醇基團。該等經改造之「硫代MAb」可用於將抗體偶聯至(例如)藥物部分或連接體-藥物部分且藉此產生如本文中別處所述之免疫偶聯物。半胱胺酸改造之抗體可如(例如)美國專利第7,521,541號中所述產生。在一些實施例中,以下抗體殘基中之任一或多者可經半胱胺酸取代:輕鏈之V205 (Kabat編號);重鏈之A118 (EU編號);及重鏈Fc區之S400 (EU編號)。 E. 抗體衍生物 在一些實施例中,本發明之抗-Globo H抗體可進一步經非蛋白質性部分修飾(即,衍生)。適於抗體衍生之非蛋白質性部分包括(但不限於)水溶性聚合物,例如:聚乙二醇(PEG)、乙二醇與丙二醇之共聚物、羧甲基纖維素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚-胺基酸均聚物或無規共聚物、及聚葡萄糖或聚(n-乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如,甘油)、聚乙烯醇及其混合物。在一些實施例中,可使用甲氧基-聚乙二醇丙醛實施抗體之修飾。聚合物可具有任何分子量,且可具支鏈或不具支鏈。附接至抗體之聚合物的數目可有所變化,且若附接一個以上聚合物,則其可為相同或不同分子。一般而言,用於衍生之聚合物之數目及/或類型可基於包括(但不限於)以下在內之考慮因素來確定:抗體之特定性質或功能,例如抗體衍生物是否將用於界定條件下之療法。 8.
免疫偶聯物
在一些實施例中,本發明之抗-Globo H抗體亦可為免疫偶聯物,其中免疫偶聯物包含偶聯至一或多種細胞毒性劑之抗-Globo H抗體。本發明涵蓋之適宜細胞毒性劑包括化學治療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如,蛋白質毒素、細菌、真菌、植物或動物來源之酶促活性毒素或其片段)及放射性同位素。 在一些實施例中,免疫偶聯物係抗體-藥物偶聯物(ADC),其中如本文所述抗-Globo H抗體偶聯至一或多種藥物。可用於本發明之免疫偶聯物中之藥物可包括奧裡斯他汀(auristatin) (例如,參見美國專利第5,635,483號及第5,780,588號及第7,498,298號);尾海兔素;卡奇黴素或其衍生物(例如,參見美國專利第5,712,374號、第5,714,586號、第5,739,116號、第5,767,285號、第5,770,710號、第5,773,001號及第5,877,296號);蒽環,例如道諾黴素或多柔比星(例如,參見美國專利第6,630,579號;Kratz等人,Current Med. Chem. 13:477-523 (2006);Jeffrey等人,Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006);Torgov等人,Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005);Nagy等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829- 834 (2000);Dubowchik等人,Bioorg.& Med. Chem. Letters 12: 1529-1532 (2002);King等人,J. Med. Chem. 45:4336- 4343 (2002));類美登素(例如,參見美國專利第5,208,020號、第5,416,064號);胺甲喋呤;長春地辛;紫杉烷,例如多西他賽、太平洋紫杉醇、拉洛他賽(larotaxel)、替司他賽(tesetaxel)及奧他賽(ortataxel);單端孢黴烯(trichothecene);及CC1065。 在一些實施例中,本發明之免疫偶聯物包含偶聯至酶促活性毒素或其片段之如本文所述抗-Globo H抗體,該酶促活性毒素或其片段包括(但不限於)白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌(
Pseudomonas aeruginosa
))、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-八疊球菌、油桐(
Aleurites fordii
)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸(
Phytolaca americana
)蛋白、苦瓜(
Momordica charantia
)抑制劑、瀉果素、巴豆毒素、皂草(
Sapaonaria officinalis
)抑制劑、白樹毒素、有絲分裂素(mitogellin)、侷限麴菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、依諾黴素(enomycin)及新月毒素(tricothecene)。 在一些實施例中,本發明之免疫偶聯物包含偶聯至放射性同位素之如本文所述抗-Globo H抗體(即,放射性偶聯物)。多種放射性同位素可用於產生該等放射性偶聯物。實例包括
211
At、
131
I、
125
I、
90
Y、
186
Re、
188
Re、
153
Sm、
212
Bi、
32
P、
212
Pb及Lu之放射性同位素。在一些實施例中,免疫偶聯物可包含用於閃爍檢測之放射性同位素或用於NMR檢測或MRI之自旋標記。適宜放射性同位素或自旋標記可包括例如
123
I、
131
I、
111
In、
13
C、
19
F、
15
N、
17
O、Gd、Mn及Fe之各種同位素。 抗-Globo H抗體及細胞毒性劑之免疫偶聯物可使用適於偶聯至蛋白質之各種熟知雙功能試劑及化學來製得。該等試劑包括(但不限於):N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亞胺基四氫噻吩(IT)、亞胺酸酯之雙功能衍生物(例如,二亞胺代己二酸二甲酯HQ)、活性酯(例如,辛二酸二琥珀醯亞胺基酯)、醛(例如,戊二醛)、雙-疊氮基化合物(例如,雙-(對-疊氮基苯甲醯基)-己烷二胺)、雙-重氮衍生物(例如,雙-(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(例如,甲苯-2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(例如,1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。 用於製備本文之免疫偶聯物之試劑亦可包括市售「交聯」試劑,例如:BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LCSMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC及磺基-SMPB及SVSB ((4-乙烯基碸)苯甲酸琥珀醯亞胺基酯) (例如,參見Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A)。 9. 合成抗體 在一些實施例中,本發明之抗-Globo H抗體可為包含接枝至除免疫球蛋白支架或框架外之支架或框架(例如替代蛋白支架或人工聚合物支架)上抗-Globo H免疫球蛋白(例如,CDR-L1等)之CDR組的合成抗體。 預期製備本發明之合成抗體之實例性替代蛋白支架可包括(但不限於):纖連蛋白、新制癌菌素CBM4-2、脂質運載蛋白、T細胞受體、蛋白質-A結構域(蛋白質Z)、Im9、TPR蛋白、鋅指結構域、pVIII、鳥類胰臟多肽、GCN4、WW結構域、Src同源性結構域3、PDZ結構域、TEM-1 β-內醯胺酶、硫氧還蛋白、葡萄球菌核酸酶、PHD指結構域、CL-2、BPTI、APPI、HPSTI、歐克汀(ecotin)、LACI-D1、LDTI、MTI-II、全蠍毒素、昆蟲防衛素-A肽、EETI-II、Min-23、CBD、PBP、細胞色素b-562、Ldl受體結構域、γ-晶體蛋白、泛蛋白、運鐵蛋白及/或C型凝集素樣結構域。 可用於合成抗體之實例性人工聚合物(非蛋白)支架闡述於(例如) Fiedler等人, (2014) 「Non-Antibody Scaffolds as Alternative Therapeutic Agents」,Handbook of Therapeutic Antibodies (S. Dübel及J. M. Reichert編輯), Wiley-VCH Verlag GmbH & Co.;Gebauer等人, Curr. Opin. Chem. Biol, 13:245-255 (2009);Binz等人,Nat. Biotech., 23(10): 1257-1268 (2005)中。 II.重組方法及組合物 本發明之抗-Globo H抗體可使用抗體產生領域中熟知之重組方法及材料來產生。在一些實施例中,本發明提供經分離之編碼抗-Globo H抗體之核酸。該核酸可編碼該抗體之包含VL之胺基酸序列及/或包含VH之胺基酸序列(例如抗體之輕鏈及/或重鏈)。在一些實施例中,提供一或多種包含編碼本發明之抗-Globo H抗體之核酸序列的載體(例如表現載體)。在一些實施例中,提供包含編碼本發明之抗-Globo H抗體之核酸序列的宿主細胞。在一個實施例中,宿主細胞經包含編碼包含該抗體之VL之胺基酸序列及包含該抗體之VH之胺基酸序列的核酸之載體轉變。在另一實施例中,宿主細胞經包含編碼包含該抗體之VL之胺基酸序列之核酸的第一載體及包含編碼包含該抗體之VH之胺基酸序列之核酸的第二載體轉變。 在重組方法之一些實施例中,所用宿主細胞係真核細胞,例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴樣細胞(例如Y0、NS0、Sp20)。在一個實施例中,提供一種製備抗-Globo H抗體之方法,其中該方法包含培養包含編碼如上文所提供抗體之核酸的宿主細胞在適於該抗體表現之條件下,及視情況自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收抗體。 簡言之,藉由分離編碼抗體(例如如本文所述)之核酸及將此核酸插入一或多種載體用於在宿主細胞中進一步選擇及/或表現來實施抗-Globo H抗體之重組產生。該等核酸可使用業內熟知之習用程序輕易地分離及測序(例如,藉由使用能夠特異性結合至編碼期望抗體之重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)。用於選殖及表現編碼該抗體之載體之適宜宿主細胞及培養方法為業內所熟知且包括原核或真核細胞。通常,在表現後,該抗體可以可溶部分自細胞糊分離且進一步純化。除原核生物外,真核微生物(例如絲狀真菌或酵母菌)亦係用於編碼抗體之載體之適宜選殖或表現宿主,包括醣基化路徑已「經人類化」從而產生具有部分或完全人類醣基化型式之抗體的真菌及酵母菌株(參見例如Gerngross, Nat. Biotech. 22: 1409-1414 (2004)及Li等人, Nat. Biotech. 24:210-215 (2006))。 適於表現本發明之醣基化抗-Globo H抗體之宿主細胞亦可源自多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別多種桿狀病毒株,其可與昆蟲細胞聯合使用,特別用於轉染草地貪夜蛾(
Spodoptera frugiperda
)細胞。植物細胞培養物亦可用作宿主(參見例如美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號及第7,125,978號)。 可用於產生本發明之抗-Globo H抗體之哺乳動物宿主細胞系的實例包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞,包括DHFR-CHO細胞(例如,參見Urlaub等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980));骨髓瘤細胞系,例如Y0、NS0及Sp2/0;由SV40轉變之猴腎CVl系(COS-7);人類胚腎系(293或293細胞,如(例如) Graham等人,J. Gen Virol.36:59 (1977)中所述);幼倉鼠腎細胞(BHK);小鼠支持細胞(TM4細胞,如(例如) Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)中所述);猴腎細胞(CV1);非洲綠猴腎細胞(VERO-76);人類子宮頸癌細胞(HELA);犬腎細胞(MDCK;水牛鼠肝細胞(buffalo rat liver cell) (BRL 3A);人類肺細胞(W138);人類肝細胞(Hep G2);小鼠乳房腫瘤(MMT 060562);TRI細胞(例如,參見Mather等人,Annals N Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982));MRC 5細胞;及FS4細胞。關於適於抗體產生之有用哺乳動物宿主細胞系之一般綜述,參見(例如) Yazaki及Wu, Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C. Lo編輯,Humana Press, Totowa, NJ),第255-268頁(2003)。 III. 抗-Globo H抗體之醫藥組合物及調配物 本發明亦提供包含抗-Globo H抗體之醫藥組合物及醫藥調配物。在一些實施例中,本發明提供包含如本文所述抗-Globo H抗體及醫藥上可接受之載劑之醫藥調配物。該等醫藥調配物可藉由混合具有期望純度之抗-Globo H抗體與一或多種醫藥上可接受之載劑來製備。通常,該等抗體調配物可製備為水溶液(例如,參見美國專利第6,171,586號及WO2006/044908)或凍乾調配物(例如,參見美國專利第6,267,958號)。 醫藥上可接受之載劑在所用劑量及濃度下通常對接受者無毒。寬範圍之該等醫藥上可接受之載劑為業內所熟知(例如,參見Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol, A.編輯(1980))。可用於本發明之調配物中之實例性醫藥上可接受之載劑可包括(但不限於):緩衝液,例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸;抗氧化劑,包括抗壞血酸及甲硫胺酸;防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨;氯化六羥季銨;氯化苄烷銨;氯化本索寧(benzethonium chloride);酚、丁醇或苄醇;對羥苯甲酸烷基酯,例如對羥苯甲酸甲基酯或對羥苯甲酸丙基酯;兒茶酚;間苯二酚;環己醇;3-戊醇;及間-甲酚);低分子量(小於約10個殘基)多肽;蛋白質,例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白;親水聚合物,例如聚乙烯基吡咯啶酮;胺基酸,例如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸;單醣、二醣及其他碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合劑,例如EDTA;糖,例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇;成鹽相對離子,例如鈉;金屬錯合物(例如,Zn-蛋白錯合物);及/或非離子型表面活性劑,例如聚乙二醇(PEG)。 可用於本發明之調配物中之醫藥上可接受之載劑亦可包括間質藥物分散藥劑,例如可溶性中性活性玻尿酸酶醣蛋白(sHASEGP) (例如,參見美國專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號),例如人類可溶性PH-20玻尿酸酶醣蛋白(例如,rHuPH20或HYLENEX
®
,Baxter International, Inc.)。 預期本文揭示之調配物除抗-Globo H外亦可含有對於投與調配物之個體中所治療特定適應症所需之活性成分。較佳地,任何另外活性成分具有與抗-Globo H抗體活性互補之活性且活性不會不利地影響彼此。 活性成分亦可分別裝入藉由(例如)凝聚技術或藉由界面聚合製備之微膠囊(例如,羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中、膠質藥物遞送系統(例如,脂質粒、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)或粗滴乳液中。此等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol, A.編輯(1980)中。 在一些實施例中,調配物可為抗體及/或其他活性成分之持續釋放製劑。持續釋放製劑之適宜實例包括含有抗體之固態疏水性聚合物之半滲透性基質,該等基質呈成形物件形式,例如膜或微膠囊。 通常,欲投與之本發明之調配物係無菌的。無菌調配物可使用熟知技術(例如,藉由經由無菌過濾膜過濾)容易地製備。 IV. 使用及治療方法 包含本發明之抗-Globo H抗體之組合物或調配物中之任一者可用於如本文揭示之治療方法中。 在一些實施例中,本發明提供治療及/或預防癌症之方法,其包含向有需要之個體投與治療有效量之抗-Globo H抗體或如本文所述包含抗-Globo H抗體之組合物或醫藥調配物。 根據治療方法投與抗體、組合物或醫藥調配物提供保護個體免於癌症之抗體誘導之治療效應,及/或治療個體之癌症、具體而言Globo H陽性癌症或類似碳水化合物表現之癌症的進展。在治療方法之一些實施例中,癌症係選自乳癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、結腸直腸癌及肺癌。在一些實施例中,治療方法可進一步包含投與一或多種另外治療劑或治療,例如血管生成抑制劑、化學療法、放射、手術或熟習此項技術者已知用以預防及/或治療癌症之其他治療。 包含投與一或多種另外藥劑之該等方法可涵蓋組合投與(其中相同或單獨調配物中包括兩種或更多種治療劑)及分開投與,在此情形下,抗體組合物或調配物之投與可在另外治療劑之投與之前、同時及/或之後發生。 在本發明治療方法之一些實施例中,藉由全身性遞送藥劑或遞送至期望靶組織之任何投與模式向個體投與抗-Globo H抗體或包含抗-Globo H抗體之醫藥調配物。全身投與通常係指將抗體投與至個體之位點而非直接至期望靶位點、組織或器官使得抗體或其調配物進入個體之循環系統且因此經受代謝及其他類似過程的任何模式。 因此,可用於本發明治療方法中之投與模式可包括(但不限於)注射、輸注、滴注及吸入。藉由注射投與可包括靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、心室內、囊內、眶內、心內、真皮內、腹膜內、經氣管、皮下、角質層下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊椎內、腦脊髓內及胸骨內注射及輸注。 在一些實施例中,抗-Globo H抗體之醫藥調配物經調配使得抗體免於在腸內部活化。因此,治療方法可包含經口投與該調配物。 在一些實施例中,亦提供包含本發明之抗-Globo H抗體之組合物或調配物作為藥劑的用途。另外,在一些實施例中,本發明亦提供包含抗-Globo H抗體之組合物或調配物之用途,其用於製造或製備藥劑、具體而言用於治療、預防或抑制癌症之藥劑。在另一實施例中,藥劑用於治療、預防或抑制癌症之方法中,該方法包含向患有癌症之個體投與有效量之藥劑。在某些實施例中,藥劑進一步包含有效量之至少一種另外治療劑或治療。 在另一實施例中,藥劑用於治療、抑制或預防個體之癌症,其包含向個體投與有效量之藥劑以治療、抑制或預防癌症。 對癌症之預防或治療而言,本發明之組合物及調配物中所包含之抗-Globo H抗體之適當劑量(當單獨使用或與一或多種其他另外治療劑組合使用時)將端視欲治療之癌症之類型、疾病之嚴重程度及病程、投與抗體係用於預防目的抑或治療目的、先前療法、患者之臨床病史及對抗體之反應以及主治醫師之判斷而定。本文所述組合物及調配物中包括之抗-Globo H抗體可一次性或在一系列治療中適宜地投與患者。本文涵蓋各種投藥方案,包括(但不限於)在各個時間點單次或多次投與、濃注投與及脈衝輸注。 端視疾病之類型及嚴重程度而定,不論係(例如)藉由一或多次分開投與或藉由連續輸注來投與,向人類個體投與之初始候選劑量為本發明調配物中約1 µg/kg至150 mg/kg (例如,0.1-20 mg/kg)之抗-Globo H抗體。在一些實施例中,抗-Globo H抗體之投與包含約1 mg/kg至約100 mg/kg之日劑量。在一些實施例中,抗-Globo H抗體之劑量包含至少約1 mg/kg、至少約5 mg/kg、至少約10 mg/kg、至少約20 mg/kg或至少約30 mg/kg之日劑量。 劑量投與可維持若干天或更長時間,此端視個體之狀況而定,例如,投與可繼續直至癌症經足夠治療,如藉由業內已知之方法所測定。
實例
本揭示內容之各種特徵及實施例闡釋於以下代表性實例中,其意欲具有闡釋性而不具有限制性。熟習此項技術者將容易地瞭解,具體實例僅闡釋本發明,如以下申請專利範圍中更詳細闡述。申請案中所述之每個實施例及特徵應理解為可與其內所含之每個實施例互換及組合。
實例 1 :
抗-Globo H抗體變體之製備、純化及表徵 此實例闡釋重組構築體之設計、基於細胞之產生方法、及人類化抗-Globo H抗體hMZ-2lw之一系列變體之分析表徵,其中位於CDR-H3內之胺基酸殘基半胱胺酸(成熟重鏈之C100)經胺基酸殘基A、S、T及F替代。
變體抗體之製備及純化
SEQ ID NO: 45及46之核苷酸序列分別編碼SEQ ID NO: 37及38之hMZ-2lw輕鏈(LC)及重鏈(HC)胺基酸序列。該等輕鏈及重鏈編碼核苷酸序列中之每一者在5’-端經SEQ ID NO: 44之核苷酸序列修飾,該SEQ ID NO: 44之核苷酸序列編碼SEQ ID NO: 43之人類信號肽(SP)序列。 變體核苷酸構築體之核苷酸序列係
使用以下材料及方法向基於細胞之表現系統中引入編碼hMZ-2lw及C100變體之前體SP-LC及SP-HC胺基酸序列之核苷酸序列構築體。
轉染 :
在具有HyCell TransFx-C培養基(HyClone,目錄號SH30941.02)之指數培養物中製備並維持CHO-K1-C6細胞。轉染之前24小時,將CHO-K1-C6細胞以7×10
5
個細胞/mL利用30 mL培養基在125 mL搖瓶中接種。在轉染當天,細胞培養之細胞密度係約1.2×10
6
個細胞/mL,存活率為97%。為製備轉染混合物,將50 µg線性化表現質體(12.5 µg pJH201-JHL2111-HC及37.5 µg pJH202-JHL2111-LC)稀釋於0.6 mL OptiPRO SFM (Life Technologies,目錄號12309-050)中;同時,將50 µL FreeStyle MAX (Life Technologies,目錄號94764)平行稀釋於0.6 mL OptiPRO SFM中。將FreeStyle MAX溶液與DNA溶液混合並培育10分鐘。培育後,將轉染混合物添加至期望CHO-K1-C6細胞中。
池選擇 :
轉染後48小時,使細胞進入池選擇。在池選擇中,藉由將批量轉染之池分成四個不同選擇培養基HT-200、HT-400、HT-800及HT-1000 (下文示於表2中)產生四個池。
表 2 :
選擇培養基
在選擇培養基池之存活率恢復至大於85%時,將每一池視為來自池選擇之細胞回收且低溫保存為研究細胞庫(「RCB」)。
抗體表現 :
使自(例如) HT-200選擇培養基回收之抗體池擴增,隨後在兩個3 L搖瓶(Corning)中接種。初始體積係800 mL HyCell-CHO培養基(GE Healthcare, Piscataway, NJ)與6 mM L麩醯胺酸及0.1% Pluronic-F68。接種密度係5 × 10
5
個細胞/mL,若pH小於6.8,則藉由添加鹼(Na
2
CO
3
)控制pH。將溫度維持於37℃,攪動速率係130 rpm且將CO
2
保持於5%。自第3天開始,向細胞每日進給2.0% ActiCHO進料A (GE Healthcare, Piscataway, NJ)及0.2% ActiCHO進料B (GE Healthcare, Piscataway, NJ)直至第12天。若葡萄糖濃度小於3 g/L,則向培養物中補充5 g/L葡萄糖。 使用以下材料及方法進一步純化含有成熟抗體之細胞萃取物。
親和層析 :
藉由以20 CV/hr之流速運行之MabSelect SuRe層析(GE Healthcare, Piscataway, NJ)親和力捕獲抗體。將管柱用25 mM Tris及25 mM NaCl (pH 7.2)平衡。藉由pH 2.8下之200 mM乙酸鹽緩衝液溶析蛋白質。藉由添加1 M Tris將溶析之蛋白質中和至pH約5.2且隨後使用0.2 µm PES過濾器過濾。
陽離子交換層析 (Poros 50HS) :
使來自親和層析步驟之中和材料通過第二管柱,該第二管柱係POROS 50HS (Life Technologies, Carlsbad, CA)。在裝載試樣之前,將管柱用緩衝液A (50 mM MES, pH 5.5)平衡。使用緩衝液B (50 mM MES、0.5 M NaCl,pH 5.5)梯度溶析蛋白質。
緩衝液更換 :
使用Pellicon 3 Ultracel 10 kDa超濾盒(EMD Millipore, Billerica, MA)、mini-TFF系統、TMP 1.2巴實施UF/DF過程。在10 mM乙酸鈉(pH 5.2)、9%蔗糖中將蛋白質濃縮至20 mg/mL。 上述純化步驟之結果示於表3中。
表 3 抗體變體之分析表徵 質譜分析 :
使用Acquity UPLC (Protein BEH C4管柱)與Synapt G2/Si MS系統(Waters Corp., Milford, MA)之組合實施純化抗體之超效液相層析(UPLC)與MS分析之組合。將1 mg/mL濃度之純化材料之緩衝液更換試樣於37℃下在10mM DTT中還原30 min並使用5% ACN/0.1%甲酸稀釋。將質譜儀之原始數據轉移至處理電腦以計算去卷積分子量。 表4中所示之MS結果確認,預計抗體變體係純合物質中存在之主要分子物質。
表 4 尺寸排除層析 (SEC) :
利用Waters Alliance 2695儀器(Waters Corp., Milford, MA)中30℃下之TOSOH管柱進行SEC。將純化材料試樣維持於2℃至8℃溫度。為溶析蛋白質,使用20 mM磷酸鈉、0.3 M氯化鈉,pH 6.8。於280 nm檢測下以0.5 mL/min之流速捕獲溶析曲線。 hMZ-2lw及每一變體之SEC曲線於約13.5-13.7滯留下具有佔總峰面積之0.3-0.7%之較小前伸峰、於約16.2 - 16.5滯留下具有佔總峰面積之98-99%較大主峰、及於約17.3下具有佔總峰面積之0.9%或更小之較小肩。該等SEC結果指示hMZ2-lw及類似地純化抗體變體係> 98%。 亦實施SEC (使用上述相同方法及材料)以測定在延長時間段(10-21天)內純化變體針對高溫應力(40℃)之穩定性。如
圖 1
中所示,C100A變體在21天之時段內顯示與親代hMZ-2lw抗體相當之針對熱應力之穩定性,而C100S對於此應力稍微較不穩定。 類似地,進行SEC量測(使用上述相同方法及材料)以測定於4℃之恆定儲存溫度下在21天之時段內hMZ-2lw、C100A及C100S變體之穩定性。如
圖 2
中所示,親代抗體顯示主SEC峰之顯著損失,指示在3週時段內抗體損失,而在相同條件下在相同時間段內,C100A變體不顯示抗體損失。於4℃下在3週內,C100S變體顯示抗體一些稍微損失,但少於親代抗體。
具有十二烷基硫酸鈉之非還原毛細管電泳 (nrCE-SDS) :
使用表5中所述之材料及參數實施純化抗體之nrCESDS。
表 5 圖 3
顯示親代抗體hMZ-2lw及變體C100A、C100T、C100F及C100S之nrCE-SDS溶析曲線。所有皆顯示大的主峰,其對應於完整抗體,佔總峰面積之94-95%。nrCE-SDS結果指示所有抗體變體之純度皆係94-95%。
差示掃描量熱法 (DSC) :
使用以下儀器及參數實施純化抗體之DSC。儀器:Nano DSC (TA Instruments, New Castle, Delaware, USA);掃描範圍:30℃至105℃;掃描速率:1℃/min;試樣濃度:2 mg/mL;緩衝液:10 mM乙酸鈉,pH 5.2,9%蔗糖。
圖 4
顯示C100A變體之典型DSC曲線以及用於估計完整抗體之CH2、CH3及Fab區之熔融溫度的擬合峰。表6中所示之DSC結果指示,抗體變體在其Fab區之熱穩定性係與親代hMZ-2lw抗體相當或更高 (例如,C100F)。
表 6 動態光散射 (DLS) :
使用以下儀器及參數實施純化抗體之DLS。儀器:Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Ltd., Malvern, UK);試樣濃度:20 mg/mL。表7中所示之DLS結果顯示,純化變體之大小與親代抗體hMZ-2lw極為類似。
表 7
亦對親代抗體及變體C100A及C100S實施DLS以確定於40℃下儲存21天後是否形成大的聚集物(> 1000nm)。與40℃下實施21天之SEC量測一致,於40˚C下21天後,對於C100A及C100S變體未觀察到大的聚集物形成。 另外,利用DLS如上文針對檢測大的聚集物形成所述使用相同儀器及參數表徵變體抗體對於重複冷凍-解凍循環之穩定性。如下將親代抗體及C100A及C100S變體之試樣冷凍並解凍至少三個循環。如
圖 5
中所示,在第一冷凍-解凍後對於親代hMZ2-lw抗體觀察到大的聚集物大量形成,且隨著每一重複冷凍-解凍循環形成繼續增加。相反,在兩個冷凍-解凍循環後,變體C100A及C100S未展現大的聚集物形成,且甚至在冷凍-解凍循環後,C100S變體未展現大的聚集物形成。
實例 2 :
抗-Globo H抗體變體之結合親和力及功能表徵 此實例闡釋抗-Globo H抗體變體之Globo H結合親和力及其他功能特性之量測。
ELISA :
使用以下方案實施純化抗體之ELISA分析以測定Globo H結合。1). 將鏈黴抗生物素蛋白(Jackson ImmunoResearch,目錄號016-000-14)在1× PBS (Gibco,目錄號1715681)中稀釋至10 μg/mL。2). 將100 μL稀釋鏈黴抗生物素蛋白之等份試樣添加至ELISA板(NUNC,MaxiSorplates,編號460124)之每一孔中。3). 將ELISA板用塑膠膜密封並於4℃下培育過夜。4). 棄去流體並向每一鏈黴抗生物素蛋白塗佈之孔中添加350 μL於1× PBS中之封阻試劑之等份試樣。5). 將板於室溫下培育1小時。6). 棄去流體並將板用1×PBS洗滌3次。7). 將Globo H-生物素在1×PBS中稀釋至0.02 μg/mL之最終濃度,向每一鏈黴抗生物素蛋白塗佈之孔中添加100μL稀釋Globo H-生物素之等份試樣,並於室溫下培育1小時。8). 棄去流體並將板用洗滌緩衝液洗滌6次。9). 將hMZ-2Lw抗體試樣在封阻溶液中稀釋至3 μg/mL,且實施2倍連續稀釋以產生介於3 μg/mL至0.001 μg/mL範圍內之12個稀釋物。向每一孔中添加100μL連續稀釋抗體之等份試樣並於室溫下培育1小時。使用人類IgG作為同型對照。10). 棄去流體並將板用洗滌緩衝液洗滌6次。11). 在封阻溶液中1:5000稀釋HRP偶聯之抗人類IgG-Fc抗體(Sigma編號A0170)。向每一孔中添加100μL稀釋抗體之等份試樣並於室溫下培育1小時。12). 棄去流體並將板用洗滌緩衝液洗滌6次。13). 向每一孔中添加100µL TMB過氧化酶受質(Sigma編號T0440- 100ML)之等份試樣並於室溫下培育3 min以顯色。14). 藉由向每一孔中添加50μL 2N H
2
SO
4
停止反應。藉由ELISA讀數儀(Molecular Device,M2分光光度計)於450 nm下檢測吸收,利用540 nm作為參照。洗滌緩衝液:1× PBS中之0.05% Tween-20。封阻溶液:1× PBS中之1% BSA (Calbiochem,目錄號8170721000)。 基於ELISA之純化抗體之相對結合親和力示於下表8中。
表 8 Biacore :
根據以下一般方案使用Biacore T200儀器實施純化抗體之Biacore分析以測定globo H結合。將生物素-globo-H (30RU)固定於鏈黴抗生物素蛋白(SA)晶片上。在2 min注射時對於每一濃度,使於五個不同濃度(7.5 nM至120 nM)下之hMZ2抗體材料流動。對於解離而言,遵循15 min注射。為了再生固定之生物素-globo-H,使用10mM甘胺酸-HCl (pH 1.5)並保持10秒。假定1:1結合模式實施數據分析。基於Biacore之兩組分析中針對純化抗體量測之各個結合參數示於表9中。
表 9
基於Biacore分析之純化抗體之相對結合親和力示於下表10中。
表 10 ADCC :
使用Promega報導基因生物分析提取熬煮遵循標準方案(Promega Corp., Madison WI, USA)實施純化抗體之ADCC分析。使用0.6×10
6
個細胞/mL密度之MCF7作為靶細胞。將效應物對靶細胞比率維持於2.5:1下。將50 µL細胞懸浮液/孔於37℃下培育過夜。將抗體溶液製備至20 µg/ml至150 µg/ml。遵循1:3稀釋以製備總共10個濃度。隨後將10 µL稀釋抗體之等份試樣轉移至每一孔,該孔具有培育之細胞懸浮液。隨後將25 µL效應細胞轉移至每一孔,之後於37℃下培育6小時。向每一孔中添加Bio-Glo螢光素酶分析試劑以能夠使用讀板儀進行發光量測。圖6及7繪示ADCC分析之結果之圖表。源自該等圖表之EC
50
值示於表11中。
表 11 結果
相對EC
50
值顯示C100A變體展現變體之最高ADCC活性,且活性僅比親代抗體MZ-2lw之活性低2.4倍。C100A變體亦展現變體抗體之最高Globo H結合親和力,親和力僅比hMZ-2lw低1.6倍。 儘管闡釋且闡述了各種具體實施例,但應瞭解,可在對其作出各種改變,此並不背離本發明之精神及範疇。