KR102630294B1 - 암 마커 및 이를 사용하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 글로보계열 글리코스핑고지질 합성을 조절할 수 있는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 생합성 경로에서 글로보계열 글리코스핑고지질 SSEA-3/SSEA-4/GloboH의 합성을 조절할 수 있는 당효소 억제제 화합물 및 조성물 및 이를 사용하는 방법에 관한 것이다. 특히, 당효소 억제제는 글로보계열 합성 경로에서 알파-4GalT; 베타-4GalNAcT-I; 또는 베타-3GalT-V 효소를 타겟화한다. 추가적으로, 본 발명은 또한, 글로보계열 글리코스핑고지질 합성을 조절하기 위해 유용한 항체 및/또는 결합 단편 생산을 유도하는 SSEA-3/SSEA-4/GloboH 관련 에피토프(천연 및 개질됨)를 타겟화하는 백신, 항체, 및/또는 면역원성 콘주게이트 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 또한, 과증식성 질병 및/또는 질환의 치료 또는 검출을 위해 본원에 기술된 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 또한 진단 용도 및 치료 용도를 위한 암 줄기 세포 바이오마커에 관한 것이다.

Description

암 마커 및 이를 사용하는 방법
관련 출원
본 출원은 2015년 1월 24일에 출원된 USSN 62/107378호 및 2015년 12월 11일에 출원된 USSN 62/266514호에 대한 우선권의 이점을 청구한다. 이러한 문헌 각각의 내용은 본원에 포함된다.
분야
본 발명은 글로보계열 글리코스핑고지질(globoseries glycosphingolipid) 합성을 조절하는데 유용한 방법 및 조성물, 뿐만 아니라, 암 줄기 세포를 선택하는데 유용한 마커(marker)에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 생합성 경로에서 글로보계열 글리코스핑고지질 SSEA-3/SSEA-4/GloboH의 합성을 조절할 수 있는 당효소 억제제 화합물 및 조성물 및 이의 사용 방법에 관한 것이다. 특히, 당효소 억제제는 글로보계열 합성 경로에서 알파-4GalT; 베타-4GalNAcT-I; 또는 베타-3GalT-V 효소들을 타겟화한다. 추가적으로, 본 발명은 또한, 글로보계열 글리코스핑고지질 합성을 조절하는데 유용한 항체 및/또는 결합 단편 생산을 유도할 수 있는 SSEA-3/SSEA-4/GloboH 관련 에피토프(천연 및 개질됨)를 타겟화하는 백신, 항체, 및/또는 면역원성 콘주게이트 조성물(immonogenic conjugate composition)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 또한, 과증식성 질병(hyperproliferative disease) 및/또는 질환(condition)의 치료 또는 검출을 위해 본원에 기술된 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 또한 진단 및/또는 치료 적용에서 암 줄기 세포를 선택하는데 유용한 마커에 관한 것이다.
탄수화물 항원 GloboH, 단계-특이적 배아 항원-3(SSEA-3; stage-specific embryonic antigen-3), 및 단계-특이적 배아 항원-4(SSEA-4; stage-specific embryonic antigen-4)는 구조 또는 기능 중 어느 하나에 있어서 서로 밀접하게 관련이 있다. GloboH, SSEA-3 및 SSEA-4는 글로보계열 글리코스핑고지질1 - 3로서, SSEA-3은 GloboH의 비-푸코실화된 오당류 전구체 구조이며, SSEA-4는 SSEA-3의 갈락토오스의 비-환원 단부에 시알산 α2-3 연결을 갖는 시알릴화된 SSEA-3이다.
단계-특이적 배아 항원-3(SSEA-3)은 4- 내지 8-세포 단계 마우스 배아로 면역화된 랫트에서 발생된 IgM 모노클로날 항체의 반응성에 의해 최초로 확인되고 정의되었다. 이러한 모노클로날 항체는 착상(implantation) 후 원시 내배엽에서, 난모세포 내지 최대 이의 발현이 더욱 제한되게 되는 초기 배반포 단계까지의 모든 마우스 착상전 배아와 반응한다. SSEA-3 항원 결정인자는 당지질 및 당단백질 상에 존재하는 탄수화물인 것으로 결정되었으며, 이는 또한, 인간 기형암종 세포 및 인간 적혈구에서 발견되었다4. 2102Ep 인간 기형암종 세포주로부터 단리된 구조물들의 패널에서, SSEA-3 항체는 Galβ(1-3)GalNAcβ(1-3)Galα(1-4)Galβ(1-4)Glcβ(1)Cer에 대해 가장 높은 친화력을 갖는다5. 이러한 구조는 또한 Gb5,6 갈락토실-글로보사이드, 또는 글로보펜타오실세라마이드1로서 알려져 있다.
SSEA-3의 합성은 β1,3-갈락토오스전달효소 V(β3GalT-V)가 Gb5 또는 갈락토실-글로보사이드를 형성시키기 위해 갈락토오스를 글로보사이드의 GalNAc로 전달할 때 일어난다. 보다 최근의 연구들에서, SSEA-3이 제대혈에서 줄기 세포들을 동정하기 위해 마커로서 사용될 수 있는지를 결정하기 위한 시도가 이루어졌다. SSEA-3이 조혈 또는 중간엽 줄기 세포에서 발현되지 않고 이에 따라, 좋은 다능성 세포의 마커가 아닌 것으로 결정되었다. Schrump 등은 원발성 폐암 환자들로부터 림프절 림프구들이 무한증식되고, 융합 세포(hybridoma)가 발생되고, 항체 분비 클론(antibody secreting clone)을 선택하는 것을 기술하고 있다. 모노클로날 항체는 이후에, 이러한 클론들 중 두 개, 즉 J309 및 D579로부터 발생되었는데, 이는 SSEA-3 항원 결정인자를 인식하였다. 이러한 항체들은 폐암 및 유방암 세포주, 및 기형암종 세포주를 포함하는 여러 종양 세포주들 상에서 SSEA-3을 인식하였다. 면역 부착 검정(immune adherence assay)에서, MC631로서도 지칭되는 설치류 모노클로날 SSEA-3 항체는 J309 및 D579 항체와 동일한 세포주들에 대해 반응하였다8. SSEA-3은 또한, 고환 생식 세포 종양9 상, 뿐만 아니라, 유방암 및 BCSC(breast cancer stem cell(유방암 줄기 세포))에서 발견되었다.
Chang 등은 암의 외측에서의 이의 위치 및 발달이 거의 알려져 있지 않기 때문에, 조직 마이크로어레이를 이용하여 정상 조직 상에서 SSEA-3 발현을 검토하였다. 이러한 그룹은 결장, 식도, 작은 창자, 신장, 전립선, 직장, 피부, 고환, 흉선, 및 자궁 경부의 정상 상피 상에서 발현되는 SSEA-3을 발견하였다. 발현은 오로지 상피 세포의 선단 상에 또는 세포질에 위치되었는데, 이는 면역계 제한되거나 접근 가능하지 않은 부위로 여겨진다1. 마우스에서 KLH 콘주게이팅된 GloboH 1가 백신을 사용한 실험에서, 항체 반응은 오로지 GloboH 항원에 대해 이루어졌다. α-GalCer가 애주번트(adjuvant)로서 첨가되었을 때, 전체 항체 생산량이 증가하였으며, 마우스는 GloboH, SSEA-3 및 SSEA-4 항원 구조 모두에 대한 폴리클로날 항체를 만들었는데, 백신화(vaccination)는 애주번트의 부재 하에 발생할 수 없었다1. 이러한 결과는, SSEA-3, GloboH 및 SSEA-4가 암 백신에 대한 유망한 타겟을 만들 수 있고, 동시에 타겟화될 수 있음을 나타내었다.
그러나, 대부분의 종양 관련 탄수화물 항원들은 불량한 면역원성을 가지며, 비천연의 글리코시드 연결, 클러스터화된 항원, 일분자 다가 백신 또는 헤테로-글리칸 다가 백신을 사용하여 면역학적 애주번트와 함께 운반 단백질 투여와의 콘주게이션(conjugation)을 포함하는, 탄수화물-기반 백신의 면역 반응을 증가시키기 위한 여러 방법들이 개발되었다. 이러한 전략들을 사용하여, 타겟 글리칸 구조에 상당한 면역 반응을 유도할 수 있는 수 개의 탄수화물-기반 백신이 암 치료법을 위해 디자인되었고 임상 시험에 들어갔다. 이러한 것들 중에서, 애주번트 QS-21을 갖는 테라토프(Theratope) 및 GMK의 임상 시험은 시간-대-질병(time-to-disease)과 전체 생존율 간의 통계학적으로 유의미한 차이를 형성시키는데 실패하였다. 아마도, 이러한 두 가지 백신은 환자에서 강력한(robust) T 세포-의존적 면역 반응을 유도하지 못할 수 있다. 상세하게, 테라토프 및 GMK는 환자에서 보다 높은 수준의 IgM을 유발시켰지만, 강한 면역 IgG 반응을 유발시키지 못할 수 있는데, 이는 탄수화물-기반 백신 개발에서 주된 문제점이다.
종래 연구들에서는, 탄수화물 항원 구조의 개질(MCAS; modification of carbohydrate antigen structure)이 보다 높은 수준의 면역 반응을 효과적으로 유도할 수 있다는 것을 나타내었다. 예를 들어, 그룹 B 메닝고코칼(meningococci)의 캡슐형 다당류의 개질 연구에서, α-(2,8)-연결된 폴리시알산(PSA; polysialic acid)의 N-아세틸 기들은 N-프로피오닐 기로 대체되었으며, 이러한 개질은 N-프로피오닐 PSA, 뿐만 아니라 천연 N-아세틸 PSA를 인식하기 위해 높은 항체 반응을 유도하였다20. 개질된 형태 및 천연 형태에 대해 높은 항체 적가를 형성시키기 위한 유사한 방법들이 STn21 및 GM323 항원에 적용되었다. 이러한 결과는, 글리칸 항원에 대한 N-페닐아세틸, N-플루오로아세틸, 또는 N-디플루오로아세틸 개질이 면역원성을 개선시킬 수 있다는 것을 지시하였다. 또한, Schultz 그룹에서는 종양 괴사 인자-α(TNF-α; tumor necrosis factor-α)에 p-니트로페닐알라닌의 도입이 면역 관용(immune tolerance)을 파괴하고 TNF-α에 대한 보다 큰 항체 반응을 유발시킬 수 있다고 보고하였다23. 항원으로서 글리칸을 사용하여, 약간의 진전이 달성되었지만, 대부분의 경우들은 이당류(STn), 삼당류(GM3) 및 폴리시알산(PSA)의 N-개질이며, 일부는 플루오르화된 MUC1 당펩티드 항원을 기반으로 한 것이다.
이종 암 조직(heterogeneous cancer tissue)들에서 자기-재생 및 종양-성장의 원인이 되는 암 줄기 세포(CSC; cancer stem cell)의 발견은 신규한 암 치료법 및 조기 진단을 개발하는데 있어서 관심을 자극하였다. 그러나, CSC의 단리를 위한 현재 사용되는 마커들은 종종, 이러한 특별한 세포 집단의 연구를 위해 CSC를 풍부하게 하는데 충분히 선택적이지 않다.
본 발명은 암 줄기 세포를 포함하는 암 및 관련된 질병들의 치료를 위한, 종양-관련 탄수화물 항원(들) 및/또는 경로를 특이적으로 타겟화하여 그러한 타겟들을 조절하는 작용제의 사용을 기초로 한 치료 방법에 관한 것이다. 또한, 암 줄기 세포를 위한 마커로서 하나 이상의 종양-관련 탄수화물 항원들을 사용하는 진단 및 예후 방법이 제공된다.
일 양태에서, 상기 하나 이상의 종양-관련 탄수화물 항원들을 발현시키는 암 줄기 세포들을 포함하는 암의 치료에서 사용하기 위한 하나 이상의 종양-관련 탄수화물 항원들에 특이적으로 결합하는 결합제가 제공된다. 또한, 상기 하나 이상의 종양-관련 탄수화물 항원들을 발현시키는 암 줄기 세포들을 포함하는 암의 치료에서 사용하기 위한 개개 결합제를 포함하는 약제 조성물이 제공된다. 결합제는 SSEA3, SSEA4, 및 GloboH 항원, 이들의 임의 조합을 타겟화하는 작용제, 및/또는 관련된 경로 타겟들을 타겟화하는 작용제를 포함한다.
제2 양태에서, 각각이 하나 이상의 종양-관련 탄수화물 항원들에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 결합제들로 치료하기 쉬운 암 줄기 세포들을 포함하는 암을 동정하기 위한 방법으로서, 상기 치료가 암 줄기 세포에 영향을 미치며, 이러한 방법은 환자로부터 획득된 암 샘플이 하나 이상의 결합제들에 대해 특이적인 하나 이상의 종양-관련 탄수화물 항원들을 발현시키는 암 줄기 세포를 포함하는 지의 여부를 결정하는 것을 포함하며, 암 줄기 세포 상에 상기 종양-관련 탄수화물 항원(들)의 존재는 암이 상기 종양-관련 탄수화물 항원과 특이적으로 결합하는 결합제(들)로 치료하기 쉽다는 것을 나타내며, 상기 치료가 암 줄기 세포에 영향을 미치는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 종양-관련 탄수화물 항원은 SSEA3, SSEA4, 및 GloboH 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제3 양태에서, 암 줄기 세포의 집단을 동정하는 방법으로서,
a) 암 세포들의 출발 집단(starting population)을 제공하고,
b) 하나 이상의 종양-관련 탄수화물 항원들의 발현 수준을 결정하고,
c) 단계 b)에서 결정된 바와 같은 상기 하나 이상의 종양-관련 탄수화물 항원들의 발현 수준이 대조 세포와 비교할 때 증가되는 세포들의 집단을 선택하되, 상기 선택된 세포들의 집단이 암 줄기 세포이고,
d) 선택적으로, 단계 c)에서 선택된 상기 세포들의 집단을 단리시키고/거나 농화(enrich)시키는 것을 포함하며,
상기 대조 세포들이 상기 하나 이상의 종양-관련 탄수화물 항원들을 발현시키지 못하거나 보다 낮은 수준으로 발현시키는 동일한 출발 암 세포 집단으로부터의 세포인 방법이 제공된다.
일부 구현예에서, 종양-관련 탄수화물 항원들은 SSEA3, SSEA4, 및 GloboH 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, b)에서의 결정 단계는 하나 이상의 추가적인 종양 관련 항원들의 발현 수준을 결정하는 것을 추가로 포함하며, c) 및 d)에서의 선택 단계 및 단리 단계는 각각 또한, 상기 하나 이상의 추가적인 종양 관련 항원들의 발현 수준의 고려사항을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 종양-관련 항원들은 CD24, CD44, PROCR, ESA, CD176, CD175, CD175s, CD174, CD173 및 CA19-9 항원을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, b)에서의 결정 단계 및/또는 d)에서의 단리 단계는 FACS를 이용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 종양-관련 탄수화물 항원들의 발현 수준은 대조 세포와 비교할 때 높거나 크게 증가된다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 종양-관련 탄수화물 항원들의 발현 수준은 대조 세포와 비교할 때 낮거나 적게 증가된다.
제4 양태에서, 암을 진단하고/거나 단계화하고/거나 예측하고/거나, 치료에 대한 감수성(susceptibility)을 모니터링하는 방법으로서, 환자로부터 단리된 샘플에서의 세포 상에 하나 이상의 종양-관련 탄수화물 항원들의 발현을 분석하는 단계를 포함하며, 하나 이상의 종양-관련 탄수화물 항원들을 발현시키는 세포들의 존재가 상기 샘플 중에 암 줄기 세포들의 존재를 지시하는 방법이 제공된다.
다른 양태에서, 본 발명에 따른 방법에서 사용하기 위한 키트로서, 하나 이상의 종양-관련 탄수화물 항원들에 특이적으로 결합하는 결합제, 및 본 발명에 따른 방법에서 사용하기 위한 설명서를 포함하는 키트가 제공된다.
다른 양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 종양-관련 탄수화물 항원들을 발현시키는 세포들을 포함하는 암에 대한 유효성(effectiveness)에 대해 후보 치료제, 예를 들어, 화학치료제 또는 다른 항암 약물을 스크리닝하는 방법으로서,
a. 하나 이상의 종양-관련 탄수화물 항원들을 발현시키는 세포들을 포함하는 암 샘플을 제공하고,
b. 상기 작용제를 세포와 접촉시키고,
c. 상기 종양-관련 탄수화물 항원 양성 암 세포들에 대해 상기 작용제의 유효성을 결정하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명은 또한, 글로보계열 글리코스핑고지질 합성을 조절할 수 있는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 생합성 경로에서 글로보계열 글리코스핑고지질 SSEA-3/SSEA-4/GloboH의 합성을 조절할 수 있는 당효소 억제제 화합물 및 조성물 및 이의 사용 방법에 관한 것이며, 특히, 당효소 억제제는 글로보계열 합성 경로에서 알파-4GalT; 베타-4GalNAcT-I; 또는 베타-3GalT-V 효소를 타겟화한다. 추가적으로, 본 발명은 또한, 글로보계열 글리코스핑고지질 합성을 조절하는데 유용한 항체 및/또는 결합 단편 생성을 유도할 수 있는 SSEA-3/SSEA-4/GloboH 관련 에피토프(epitope)(천연 및 개질됨)를 타겟화하는 백신, 항체, 및/또는 면역원성 콘주게이트 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 또한, 과증식성 질병 및/또는 질환의 치료 또는 검출을 위해 본원에 기술된 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 또한, 진단 및/또는 치료 적용에서 암 줄기 세포(예를 들어, 유방암)를 선택하는데 유용한 암 줄기 세포 마커에 관한 것이다.
본 발명은 또한, SSEA3의 생합성을 위한 갈락토실 트랜스퍼라아제(galactosyl transferase)(베타3GalT5)의 억제 또는 침묵화(silencing)가 암 줄기 세포의 성장을 폐지한다는 놀라운 발견을 기초로 한 것이다. 이러한 발견은 단계-특이적 배아 항원(stage-specific embryonic antigen) SSEA-3이 치료제 및 백신의 개발을 위한 타겟으로서 역할을 할 수 있음을 시사한다. 또한, SSEA-3의 생합성에서 수반되는 3개의 효소, 즉 알파4GalT, 베타4GalNAcT-I, 및 베타3GalT-V는 억제제 개발을 위한 타겟일 수 있다.
본 발명은 또한, 본원에 기술된 특정 그룹들로 단계-특이적 배아 항원들(SSEA3 및 SSEA4)의 개질이 SSEA3 및 SSEA4를 각각 특이적으로 인식하기 위해 강력한 IgG 항체 반응을 유도한다는 발견을 기초로 한 것이다. 이러한 비천연 글리칸 모이어티(unnatural glycan moiety)를 포함하는 면역원성 조성물에 의해 유발된 항체들은 종양 세포들에 대한 보체-의존성 세포독성(complement-dependent cell cytotoxicity)을 매개할 수 있다.
이에 따라, 본 발명은 암을 치료하기 위한 SSEA-3에 대한 항체들의 디자인을 특징으로 한다. 본 발명은 또한, 개질된 탄수화물 항원들(SSEA3, SSEA4)로 이루어진 신규한 화합물들, 이러한 것을 포함하는 글리칸 콘주게이트들, 및 이의 면역원성 조성물 및 백신을 특징으로 한다.
본 발명은 글로보계열 합성 경로를 조절하는 억제제 화합물, 및 선택적으로 증식성 질병, 특히, 글로보계열 경로가 부수적으로 이상조절되는 증식성 질병의 치료를 위한 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체; 이러한 조성물을 포함하는 약제 조성물; 증식성 질병의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 이러한 조성물의 용도; 이러한 제조물을 포함하는 상용 패키지(commercial package) 또는 제품; 및 온혈 동물, 특히 인간의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 SSEA3의 생합성을 위한 갈락토실 트랜스퍼라아제(β3GalT5), 알파-4GalT, 및 베타-4GalNAcT-I과 같은 당효소의 억제 또는 침묵화가 암 세포 및 암 줄기 세포의 성장을 폐지한다는 놀라운 발견을 기초로 한 것이다. 이러한 발견은 단계-특이적 배아 항원 SSEA-3 및/또는 SSEA4 및/또는 Globo-H가 치료제 및 백신의 개발을 위한 타겟으로서 역할을 수 있음을 시사한다.
본 발명은 또한, 본원에 기술된 특정 그룹들로 단계-특이적 배아 항원들(SSEA3 및 SSEA4)의 개질이 SSEA3 및 SSEA4를 각각 특이적으로 인식하는 강력한 IgG 항체 반응을 유도한다는 발견을 기초로 한 것이다. 이러한 비천연 글리칸 모이어티를 포함하는 면역원성 조성물에 의해 유발된 항체들은 종양 세포에 대한 보체-의존성 세포독성을 매개할 수 있다.
이에 따라, 본 발명은 암을 치료하기 위한 SSEA-3 및/또는 SSEA4에 대한 항체들의 디자인을 특징으로 한다. 본 발명은 또한, 개질된 탄수화물 항원들(SSEA3 및 SSEA4)로 이루어진 신규한 화합물들, 이를 포함하는 글리칸 콘주게이트, 및 이의 면역원성 조성물 및 백신을 특징으로 한다.
일 양태에서, 본 발명은 하기 화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 염을 제공한다:
Figure 112017081613999-pct00001
상기 식에서, X1, R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 L은 본원에 기술된 바와 같다. 특정 구현예에서, 화학식 (I)의 화합물은 암을 치료하기 위한 면역원성 조성물을 제조하는데 유용하다.
다른 양태에서, 본 발명은 하기 화학식 (II)의 화합물, 또는 이의 염을 제공한다:
Figure 112017081613999-pct00002
상기 식에서, X1, R1, R2, R3, R8, R9, R10, R11 및 RN은 본원에 기술된 바와 같다. 특정 구현예에서, 화학식 (II)의 화합물은 암을 치료하기 위한 면역원성 조성물을 제조하는데 유용하다.
다른 양태에서, 본 발명은 (a) 담체 및 하나 이상의 글리칸을 포함하는 글리칸 콘주게이트, 및 선택적으로 (b) 애주번트를 포함하는 면역원성 조성물로서, 하나 이상의 글리칸들 각각은 하기 화학식 (III) 또는 화학식 (IV)를 갖는 링커(linker)를 통해 담체와 콘주게이팅되는 면역원성 조성물을 제공한다:
Figure 112017081613999-pct00003
상기 식에서, X1, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R8, R9, R10, R11, L 및 RN은 본원에 기술된 바와 같다.
특정 양태에서, 임의 비율로 세 가지 글리칸들(SSEA3, SSEA4 및 Globo-H) 및 이들의 유사체들 중 임의 하나 이상의 조합물을 함유하는 임의 백신 작제물이 담체에 연결될 수 있다는 것이 고려된다.
Figure 112017081613999-pct00004
상기 식에서, n은 1 내지 10의 정수일 수 있으며,
글리칸은 화학식 I, II, III, 및 IV로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며,
n이 2 이상인 경우에, 각 글리칸은 아스파르틸 펩티드 상의 다른 글리칸과 동일하거나 아스파르틸 펩티드 상의 상이한 글리칸일 수 있다.
일부 구현예에서, 글리칸은 SSEA-3, SSEA-4, 및 Globo-5로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 예시적인 다가 작제물은 하기와 같은 것일 수 있다:
Figure 112017081613999-pct00005
Figure 112017081613999-pct00006
Figure 112017081613999-pct00007
상기 식에서, 각 글리칸 모이어티 상에서 R1, R2, R3, R4, R5, R6, 및 L은 동일하거나 상이할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 애주번트(adjuvant)를 포함한다. 본 발명에 적합한 애주번트는 본원에 기술된 바와 같다.
특정 구현예에서, 면역원성 조성물은 피검체에서 암 세포에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다. 특정 구현예에서, 암 세포는 뇌암 세포, 폐암 세포, 유방암 세포, 구강암 세포, 식도암 세포, 위암 세포, 간암 세포, 담도암 세포, 췌장암 세포, 결장암 세포, 신장암 세포, 골암 세포, 피부암 세포, 자궁경부암 세포, 난소암 세포, 및 전립선암 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 면역 반응은 GloboH, SSEA-3 및 SSEA-4로 이루어진 군으로부터 선택된 항원들 중 하나 이상에 특이적으로 결합하는 항체들의 생성을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체들은 암 세포 또는 암 줄기 세포의 표면 상에서 발현된 GloboH, SSEA-3 및 SSEA-4 중 하나 이상을 중성화시키기 위해 개발된다. 특정 구현예에서, 항체는 주로 IgG 항체를 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 면역원성 조성물은 주로 IgGl, IgG2b, IgG2c 및 IgG3을 유발시킨다.
또한, 본 발명은 본원에 기술된 면역원성 조성물에 대해 상승된 모노클로날 항체 및 결합 단편을 특징으로 한다.
일 구현예에서, 항체는 인간 항체이다.
일 구현예에서, 항체는 인간화된 항체이다.
일 구현예에서, 항체는 SSEA4, SSEA3, 또는 Globo-H 중 하나 이상에 대해 특이적으로 타겟화된다.
일 구현예에서, 항체는 SSEA3에 대해 특이적으로 타겟화된다.
일 구현예에서, 항체는 SSEA4에 대해 특이적으로 타겟화된다.
일 구현예에서, 항체는 알파-2,5-연결에서 두 개의 시알산에 의해 종결된 바이안테너리(biantennary) 글리칸을 갖는 동종의 항체이다.
일 양태에서, 본 발명은 유효량의, SSEA4, SSEA3, 또는 Globo-H 중 하나 이상에 대해 특이적으로 타겟화된 항체 또는 항원-결합 단편, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제 조성물을 제공한다.
일 구현예에서, 약제 조성물은 SSEA4, SSEA3, 또는 Globo-H 글리칸 중 하나 이상을 각각 독립적으로 타겟화하는 항체들 및/또는 이들의 결합 단편의 조합을 포함한다.
일 구현예에서, 약제 조성물은 암, 감염성 질병들, 및/또는 항염증성 질병(anti-inflammatory disease)들의 치료에 유용하다.
일 구현예에서, 약제 조성물은 알파-2,6-연결에서 시알산으로 종결된 유니버셜(universal) 바이안테너리 n-글리칸을 갖는 항체 또는 이의 결합 단편을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 면역원성 조성물 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 암 백신을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 암을 치료하고/거나 암에 대한 위험성을 감소시키는 것을 필요로 하는 피검체에 치료학적 유효량의 본원에 기술된 바와 같은 면역원성 조성물 또는 암 백신을 투여하는 것을 포함하는 피검체에서 암을 치료하고/거나 암에 대한 위험성을 감소시키는 방법을 제공한다.
이러한 치료는 종양 크기의 감소, 악성 세포의 제거, 전이의 방지, 재발의 방지, 파종성 암(disseminated cancer)의 감소 또는 사멸, 생존의 연장 및/또는 종양 암 진행에 대한 시간의 연장을 야기시킨다.
일부 구현예에서, 이러한 치료는 본원에 기술된 면역원성 조성물 또는 암 백신의 상기 투여 이전, 동안, 또는 후속하여 상기 피검체에 추가적인 요법을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 추가적인 요법은 화학치료제로의 치료이다. 일부 구현예에서, 추가적인 요법은 방사선 요법이다.
본 발명의 다른 양태는 포유동물에 약리학적 유효량의 본원에 기술된 면역원성 조성물 또는 암 백신을 투여하는 것을 포함하는, 암에 대해 포유동물을 백신접종하는 방법을 특징으로 한다.
일부 구현예에서, 포유동물은 인간이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 면역원성 조성물 또는 암 백신은 피하로 투여된다.
암의 예들은 뇌암, 폐암, 유방암, 구강암, 식도암, 위암, 간암, 담도암, 췌장암, 결장암, 신장암, 자궁경부암, 난소암 및 전립선암을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 암은 뇌암, 폐암, 유방암, 난소암, 전립선암, 결장암, 또는 췌장암이다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 화합물들을 합성하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 면역원성 조성물 또는 암 백신을 제조하는 방법을 특징으로 한다.
본 발명의 특정 구현예들의 세부사항들은 본원에 기술되어 있다. 본 발명의 다른 특징들, 목적들, 및 장점들은 상세한 설명, 도면, 실시예, 및 특허청구범위로부터 명백하게 될 것이다.
도 1은 통상적인 마커들 및 SSEA-3을 수반하는 세포의 종양 형성이 다른 서브집단(subpopulation) 보다 더욱 높다는 것을 도시한 것이다. A, C는 MCF-7 또는 MDA-MB-231 각각에서의 현탁 배양물 또는 연질 아가 검정에 대한 선택된 마커(들)에 의해 단리된 서브집단의 세포 콜로니 또는 맘모스피어(mammosphere) 형성 백분율이다. 그래프는 하나의 예시적인 실험을부터의 3개의 샘플에 대한 것이다. B, D는 유방암 세포주 MDA-MB-231 및 MCF-7로부터의 선택된 마커-발현 세포 서브집단이 주입된 NS의 유선(mammary gland)에서 형성된 종양의 수이다. 상응하는 제한 희석 검정은 생체 내에서 수행되었다. E, F는 상이한 서브집단의 MDA-MB-231(2500개 세포/주사) 및 MCF-7(500개 세포/주사)로부터의 종양 용적을 모니터링하고 비교한 것이다(그룹 당 n=4 종양). #는 전체 세포 집단에서 분류된 SSEA-3+ 세포의 백분율이다. 데이타는 평균 및 표준 편차(S.D.)를 나타낸다. 별표는 통계적 유의성, p< 0.05을 명시한 것이다.
도 2. MCF-7 및 MDA-MB-231 세포 배양물에서 β3GalT5의 녹다운(knockdown) 또는 과발현은 FACS 분석에 의한 세포 표면 상의 SSEA-3의 수준 및 줄기세포성 성질을 감소시키거나 증가하였다. 모세포에서 암 줄기 세포 마커 및 SSEA-3의 발현. 과발현된 β3GalT5 그룹에서 게이팅된 서브집단 CD44+CD24-/10 및 ESAhiPROCRhi에서의 SSEA-3의 수준이 또한 결정되었다. A: β3GalT5의 과발현, 녹다운, 또는 이의 상응하는 벡터 대조군을 갖는 MCF-7에서의 CD24, CD44 및 SSEA-3의 발현. B: β3GalT5의 과발현, 녹다운, 또는 이의 상응하는 벡터 대조군을 갖는 MDA-MB-231에서의 ESA, PROCR 및 SSEA-3의 발현. 모든 실험은 삼중으로부터의 대표적인 샘플이다.
도 3 - β3GalT5 녹다운 세포주에서 아폽토시스(apoptosis)의 유도. A. 각각의 유전자들을 녹다운한(knocking down) 후 유전자 발현(MCF-7에서 β3GalT5, MDA-MB-231에서 β3GalT5, FUT1, FUT2 및 ST3Gal2)의 상대 백분율. 벡터 대조 세포에서 유전자 발현의 백분율을 100으로 정규화하였다. B. 3회 실험으로부터의 유방 정상 세포주(hTERT-HME1, MCF-10A) 및 암 세포주(MCF-7, MDA-MB-231)에서 아폽토시스의 평균 백분율. C. 유방암 세포주 MDA-MB-231, MCF-7, 및 유방 비-암 세포주 hTERT-HME1 및 MCF-10A에서 아폽토시스 백분율의 유세포측정 분석(flow cytometric analysis)을 4일 동안 베타3GalT5의 녹다운 후 시험하였다. 아폽토시스성 세포(apoptotic cell)를 염색되지 않은 세포와 비교하고, 게이팅하였다. D. 유전자 FUT1, FUT2, ST3Gal2 또는 베타3GalT5 및 벡터 대조군의 녹다운으로의 MDA-MB-231 세포에서의 아폽토시스의 백분율. 아폽토시스성 세포의 평균은 3회 실험으로부터 얻어진 것이다. 별표는 통계적 유의성, p< 0.05을 명시한 것이며, n.s.는 유의미하지 않은 것이다.
도 4 - β3GalT5의 녹다운은 암 세포 배양물에서 증식 속도의 감소 및 아폽토시스의 증가를 야기시켰지만, 정상 유방 세포 배양물에서는 효과를 나타내지 않았다. A-D. 암 세포 배양물 MCF-7 및 MDA-231, 뿐만 아니라 유방 정상 세포 배양물 MCF-10A 및 hTERT-HME1에서의 증식 속도. 증식 속도는 흡광도(A450 nm-A690 nm)의 측면에서, 예시적인 샘플에서 3배이다. E. shRNA 베타3GalT5 또는 shRNA 벡터로 감염된 MDA-MB-231 세포를 용리시키고, 전체-세포 추출물, 세포질 분획 및 핵 분획을 제조하였다. 상단(Top), 항-카스파아제-3 항체의 웨스턴-블롯 분석; 중앙(middle), 분열된 카스파아제-3 항체의 웨스턴-블롯 분석; 하단(bottom), β-액틴의 웨스턴-블롯 분석(로딩 대조군(loading control)의 역할을 함). F, G. β3GalT5 녹다운으로의 아폽토시스성 MDA-MB-231 세포의 백분율. MDA-MB-231 세포를 상이한 농도의 카스파아제-3 억제제 Z-DEVD, 또는 카스파아제-8, 9 또는 12에 대한 억제제로 처리하였다. 여기에서 데이타는 평균 및 표준 편차(S.D.)를 나타낸다. 별표는 통계적 유의성, p< 0.05을 명시한 것이며, n.s.는 유의미하지 않은 것이다.
도 5 - 유세포분석 및 질량분석에 의한 세포주에서의 글로보-계열 에피토프의 존재비(abundance)의 비교. A. 형광 라벨링 및 LC-MS 분석을 위한 세포 상의 당지질로부터의 글리칸의 추출 계획. B-G. 유방암 세포주 MCF-7 및 MDA-MB-231, 정상 세포주 hTERT-HME1 및 MCF-10A, 배아 줄기 세포(ESC), 뿐만 아니라, 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)에서의 글로보-계열 에피토프 SSEA-3, SSEA-4, 및 globo-H의 상대 존재비를 FACS 및 질량분석에 의해 검출하였다. 유세포분석의 도면에 대하여, 항-글리칸 항체(적색, 청색 또는 녹색) 및 이의 상응하는 항체 아이소타입 대조군(회색)으로 염색된 세포의 히스토그램(histogram)이 도시되어 있다. 형광(fluorescence)의 기하 평균은 괄호 안에 나타내었다. MS에 대하여, m/z의 체류 시간(SSEA-3=1008.3667, SSEA-4=1299.4621 및 Globo-H=1154.4246)은 그래프에 나타내었다.
도 6(도 S1)- 시험관내 및 생체내 검정을 위한 분류화(sorting)에 의해 얻어진 세포주에서의 서브집단. A. CD44+ CD24hi, CD44+ CD24-/lo, CD44+ CD24-/lo SSEA-3+, CD44+ CD24/lo SSEA-3-, MCF-7 중 다양한 백분율의 SSEA-3+(상단 1, 5, 10%), 및 SSEA-3-, 뿐만 아니라, B. ESAloPROCRlo, ESAhiPROCRhi, ESAhiPROCRhiSSEA-3+, ESAhiPROCRhiSSEA-3-, MDA-MB-231 중 다양한 백분율의 SSEA-3+(상단 1, 5, 10%), 및 SSEA-3-를 포함하는 서브집단은 추가 분석을 위해 세포 염색(방법 및 물질로서) 및 유세포분석에 의해 농화되었다.
도 7(도 S2)- BCSC는 시험관내 검정에 의해 글로보-계열 에피토프 SSEA-4 및 Globo-H로 농화되지 않았다. A-D. 유방암 세포주 MCF-7 및 MDA-MB-231로부터 세포 서브집단을 발현시키는 분류되지 않은 세포 또는 선택된 마커(SSEA-4 또는 Globo-H와 함께, 공지된 마커 세트 CD24/CD44, 또는 ESA/PROCR)의 세포 콜로니 형성의 백분율. 그래프는 하나의 예시적인 실험으로부터의 3개의 샘플들이다. 데이타는 평균 및 표준 편차(S.D.)를 나타낸다. 별표는 통계적 유의성, p< 0.05을 명시한 것이며, n.s.는 유의미하지 않은 것이다.
도 8(도 S3)- 인간에서 글로보-계열 경로. 상응하는 글리코트랜스퍼라아제로의 Gb4로부터 글리보-계열 에피토프 SSEA-3, SSEA-4 및 Globo-H의 생합성 경로.
도 9(도 S4) - iPSC5의 특징분석. A. 줄기 세포 단백질 TRAl-60 및 Nanog. Nuclei의 면역형광 염색을 DAPI로 염색하였다. B. 줄기 유전자 OCT4, SOX2, NANOG 및 c-Myc의 qPCR. C. iPSC5의 삼배엽 계통(three germ layer lineage)으로의 시험관내 분화 능력. D. 기형종에서 삼배엽 계통에 대한 iPSC5의 H&E 염색.
도 10(도 S5) - 유방암 세포 배양물 중 베타3GalT5의 mRNA 수준은 정상 세포 배양물 중의 수준 보다 더 높다. 정상 세포 배양물 MCF-10A 및 hTERT-HME1, 뿐만 아니라 유방암 세포 배양물 MCF-7 및 MDA-MB-231 중 베타3GalT5 유전자의 GAPDH-정규화된 qPCR 수준. 하나의 예시적인 실험으로부터의 3개의 샘플들을 도시한 것이다. 데이타는 평균 및 표준 편차(S.D.)를 나타낸다. 별표는 통계적 유의성, p< 0.05을 명시한 것이며, n.s.는 유의미하지 않은 것이다.
도 11은 글로보 계열의 글리코스핑고지질의 생합성 경로이다.
도 12는 상이한 에피토프 비율의 SSE4-DT 또는 SSEA4-Gc-DT 면역화로부터 수집된 유도된 GH-IgG이다.
본 발명은 종양-관련 탄수화물 항원들이 적합한 암 줄기 세포 마커라는 발견을 기초로 한 것이다.
본 발명은 종양-관련 탄수화물 항원이 암 줄기 세포 상에서 발현된다는 놀라운 발견을 기초로 한 것이다. 이에 따라, 이러한 종양-관련 탄수화물 항원은 암 줄기 세포에 대한 적합한 마커이고, 또한, 암 줄기 세포를 공격하는 요법에 대한 적합한 치료 타겟을 제공한다.
정상 줄기 세포와 발암성 세포(tumorigenic cell) 둘 모두는 광범위한 증식 가능성 및 새로운(정상 또는 비정상) 조직을 일으키는 능력을 갖는다. 발암성 세포들은 정상 줄기 세포와 유사한 기관형성(organogenesis)의 비정상적이고 잘 조절되지 않는 과정을 격는 암 줄기 세포(CSC; cancer stem cell) 또는 암 개시 세포(CIC; cancer initiating cell - 용어 CSC 및 CIC는 본원에서 동의어로서 사용됨)로서 사료될 수 있다. 종양 및 정상 조직 둘 모두는 상이한 표현형 특징 및 상이한 증식 가능성을 갖는, 세포들의 이종 조합으로 이루어진다.
암 줄기 세포는 줄기 세포 유사 성질들을 갖는 종양 세포의 특정 분획인 것으로 여겨지며, 이는 신생물 클론(neoplastic clone)을 개시하고 유지시킨다. 이러한 세포들은 자기-재생하는 능력을 가지지만, 또한, 보다 낮은 종양형성 가능성을 가지면서 표현형적으로 다양한 암 세포를 수득하는 선조세포(progenitor)을 형성시킨다. 줄기 세포-유사 세포의 이러한 서브집단은 암 줄기 세포가 아닌 종양 세포와 비교하여 종양 형성 및 전이성 종양 확산에서 효율적인 것이다.
암 줄기 세포(CSC)는 현재 백혈병, 교모세포종, 수모세포종, 및 거의 모든 타입의 상피 종양들(암종들)을 포함하는 광범위한 암들에서 동정되었다. 암 줄기 세포는 원발성 종양 내에서 별개의 표면 마커 패턴의 조사를 기초로 하여 특징될 수 있다. CD44는 암 줄기 세포의 강력한 마커로서 보고되었다. 대장 종양으로부터의 단일 CD44+ 세포는 시험관 내에서 구체를 형성할 수 있고, 원발성 종양의 성질들과 닮은 이종 종양(xenograft tumor)를 생성시킬 수 있다. CD133은 또한 암 줄기 세포의 마커이다.
암 줄기 세포의 존재는 암 치료법에 대해 상당한 영향을 갖는다. 존재하는 치료법은 주로 종양 세포의 벌크 집단에 대해 개발된 것인데, 왜냐하면, 이러한 치료법이 종양 물질을 줄어들게 하는 이의 능력에 의해 식별되기 때문이다. 그러나, 암 줄기 세포는 종종 화학치료법에 대해 내성적이고, 화학치료법 실패를 설명할 수 있다. (또한) 암-개시 세포(본원에서 또한 암 줄기 세포로서 지칭됨)를 타겟화하는 새로운 치료제를 디자인하기 위해, 바람직하게 양성 종양 및/또는 정상 비-종양 세포 상에 존재하지 않는 암 줄기 세포의 분자 타겟을 탐색하고, 동시에, 암 줄기 세포에 대해 특이적으로 관련되는 것이 요망될 것이다. 이러한 작용제는 종양, 및 특히 전이성 종양의 더욱 내구성있는 반응 및 치료를 야기시킬 것으로 예측된다. 이에 따라, 신규한 암 줄기 세포 마커는 치료법을 개선시키기 위한 신규한 치료 타겟을 제공하고자 한다. 대부분의 공지된 줄기-세포 마커는 단백질이다. 이러한 것들 중 다수는 또한, 정상 줄기 세포 마커이고, 이에 따라, 비-종양 줄기 세포 상에서 발현되는 것으로 확인되었다. 이는 치료 타겟으로서 이러한 것을 치료 타겟으로서 적합하지 않거나 적어도 덜 적합하게 만든다. 현재, 정상 및 암 줄기 세포 마커 간에 명확하게 구별되지 않는다.
"결합제"는 종양-관련 탄수화물 항원 및/또는 탄수화물 및 비-탄수화물 특이적 항원들의 조합물과 같은 타겟 물질을 개별적으로 또는 조합하여(예를 들어, 패널) 결합시킬 수 있는 임의 화합물 또는 화합물들의 착물(complex)일 수 있다. 바람직하게, 결합제는 타겟 물질을 특이적으로 결합시킬 수 있다. 적합한 결합제는 타겟 물질에 결합하는 결합제들을 식별/수득하기 위해 결합제 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻어질 수 있다. 개개 결합제에 대한 예는 글리코항체, 예를 들어, SSEA3, SSEA4, 및/또는 globoH에 대한 항체를 포함한다. 결합제는, 이러한 것이 타겟 물질, 여기에서, 종양-관련 탄수화물 항원을 특이적으로 인식하고 결합할 수 있는 한, 임의 구조를 가질 수 있다. 결합제는 항체, 항원-결합 단편 또는 이의 유도체, 또는 예를 들어, 안티칼린(anticalin) 또는 렉틴(lectin)과 같은 결합 기능을 제공하는 단백질 스캐폴드를 갖는 결합제들로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 결합제는 또한, 결합 기능을 제공하는 펩티드 또는 융합 단백질일 수 있다. 항체와 유사한 결합 기능을 갖는 결합제의 개론은 문헌[Hey, et al. (Hey et al. (2005) "Artificial, non-antibody binding proteins for pharmaceutical and industrial application", Trends in Biotechnology 23(10), 514-522)]에 제공된다. 항체 유도체는 또한, 동일한 결합 기능을 가지만, 예를 들어, 변형된 아미노산 서열(altered amino acid sequence)을 갖는 항체 또는 항체 단편을 포함한다.
본원에서 사용되는 SSEA3 마커를 타겟화하는 예시적인 결합제는 USSN 14/599,174호에 보고되어 있으며, 이러한 문헌의 내용은 전문이 본원에 포함된다.
본 발명에 따르면, 암의 "단계화(staging)"는 바람직하게, 암의 진행 및 범위의 분류화를 지칭한다. 바람직한 암 단계화 시스템은 악성 종양의 TNM 분류화이며, 여기서, T는 종양의 크기, 및 조직 부근에 침입되었는 지의 여부를 기술하는 것이며, N은 관련된 국부적 림프절을 기술하는 것이며, M은 원위 전이(distant metastasis)를 기술하는 것이다. 이러한 파라미터들 각각은 환자의 상황에 따른 특정 값을 제공하며, 여기서, 일반적으로, 보다 높은 숫자는 더욱 심각한 상황을 지시하는 것이다(T(0-4), N(0-3), M(0/1)). 추가적으로, 더욱 상세한 분류화에 대하여, 추가의 파라미터들이 결정될 수 있고/거나 접두어가 사용될 수 있다. 추가로, TNM 분류화는 단계 O 내지 단계 IV의 암을 지칭하는, UICC에 따른 암 단계화 시스템에서 요약될 수 있다.
본 발명에 따르면, "샘플"은 특히, 조직 샘플, 체액 및/또는 세포 샘플을 지칭하지만, 이로 제한되지 않고, 펀치 생검(punch biopsy)을 포함하는 조직 생검에 의한 것과 같은 통상적인 방식에 의해, 또는 암 세포를 함유하거나 함유하는 것으로 의심되는, 혈액, 기관지 흡입물, 타액, 소변, 배설뭉 또는 다른 체액 또는 조직 섹션을 취득함으로써 수득될 수 있다. 본 발명에 따르면, 용어 "샘플"은 또한 개개 샘플의 분획 또는 구성성분들을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "세포 증식" 및 "증식하기 위해"는 특히, 세포 분열에 의한 세포의 증폭을 지칭한다. 용어 "암 줄기 세포"는 특히, 시험관내의 적합한 조건 하에서, 미분화 세포의 응집물, 소위 종양 구체를 생성시킬 수 있는 세포들에 관한 것이지만, 이로 제한되지 않는다. 구체를 형성시키는 세포는 자기-재생 가능하며, 이러한 것이 동일한 조건 하에서 분리되고 성장될 때, 이러한 것은 다시 구체를 형성할 것이다. 생체 내에서, 암 줄기 세포는 예를 들어, CD44와 같은 줄기 세포 마커의 전이 및 발현을 형성시키는 이의 가능성에 의해 특징된다. 이러한 것은 또한, 약물 내성을 제공할 수 있다. 용어 "암 줄기 세포" 및 "암 개시 세포"는 본원에서 동의어로서 사용된다.
용어 "종양-관련 탄수화물 항원"은 특히, 암 및/또는 종양 세포 상에서, 특히, 악성 암 및/또는 악성 종양 세포 상에서 발현되는 탄수화물 항원을 지칭한다.
용어 "종양-특이적 탄수화물 항원"은 특히, 주로 또는 심지어 배타적으로 암 및/또는 종양 세포 상에서 발현되고, 이에 따라, 비-암 각각 비-종양 세포들 상에서 발현되지 않거나 단지 낮은 정도로 발현되는 탄수화물 항원을 지칭한다. 바람직하게, 용어 "종양-특이적 탄수화물 항원"은 악성 암 및/또는 악성 종양 세포 상에서 주로 또는 바람직하게 배타적으로 발현되고 이에 따라 비-암의 각각 비-종양 세포 상에서, 양성 암 및/또는 양성 종양 세포 상에서, 및/또는 동일한 환자의 건강한 조직 상에서 발현되지 않거나 단지 낮은 정도로 발현되는 탄수화물 항원을 지칭한다. 우선적으로, 종양-특이적 탄수화물 항원은 대부분의 정상 세포 상에서 발현되지 않으며, 더욱더 바람직하게, 이는 수 개의 정상 세포 또는 세포 타입 상에서만 발현되며, 더욱더 바람직하게, 이러한 정상 세포 상에서의 발현은 특별한 국소화, 예를 들어, 엄격하게 설청음(apical)이거나 또는 융합막(tight junction) 사이에서의 국소화를 가지며, 이에 따라, 전신으로 및 특히, i.v.로 투여되는 결합 분자가 이러한 정상 세포 상에 항원을 도달하지 못할 수 있거나 거의 도달하지 않을 수 있으며, 더욱더 바람직하게, 이는 정상 상피 세포 상에서 발현되지 않으며, 가장 바람직하게, 이는 정상 세포 상에서 발현되지 않는다. 특정 구현예에서, 종양-특이적인 탄수화물 항원은 발현될 때 담체 분자에 부착될 수 있다. 이러한 담체 분자는 특히, 단백질, 펩티드 또는 탄수화물일 수 있다.
"CD44"는 다양한 분자량의 부착 분자(H-CAM, Pgp-1)이다. 이는 세포 표면 히알루로난 수용체이고, 기질 금속프로테이나아제와 상호작용하고, 세포 이동에서 중요한 역할을 한다. CD44는 유방, 난소, 췌장, 전립선, 결장, 위 및 다른 암 타입에서의 암 줄기 세포 마커로서 기술되었다[참조, 문헌[Li et al, 2007, and Takaishi et al, 2009]]. 이는 또한, 정상 다능성 줄기 세포의 마커이다.
본 발명자들은 CD24, CD44, SSEA3, PROCR, ESA와 같은 여러 종양-관련 항원들은 암 줄기 세포 상에서 발현되고, 이에 따라, 신규한 암 줄기 세포 마커임을 나타낸다. 암 줄기 세포 마커로서의 종양-관련 탄수화물 항원의 동정은 상기 종양-관련 탄수화물 항원들 중 하나 이상에 특이적으로 결합하는 작용제들에 대한 신규한 치료학적 적용을 제공한다. 하나 이상의 개개 종양-관련 탄수화물 항원에 특이적으로 결합하는 작용제는 현재 상기 종양-관련 탄수화물 항원을 발현시키는 암 줄기 세포를 타겟화하기 위해 치료학적으로 사용될 수 있다. 이는 암 줄기 세포를 타겟화하고 바람직하게 이러한 세포를 사멸시키는 치료학적 치료의 기회를 제공한다. 개개 치료제는 예를 들어, 보통의 화학요법(regular chemotherapy)에 대해 내성적인 암 줄기 세포를 타겟화하고 이에 따라 암 줄기 세포를 파괴하기 위해 사용될 수 있다. 이에 의해, 개선된 암 치료법이 본 발명과 함께 제공된다. 일 구현예에 따르면, 종양-관련 탄수화물 항원은 주로 또는 심지어 배타적으로 유방암 줄기 세포 상에서 발현된다. 다른 구현예에 따르면, 종양-관련 탄수화물 항원은 암 줄기 세포, 뿐만 아니라, 암 줄기 세포가 아닌 암 세포 상에서 발현된다. 종양-관련 탄수화물 항원이 두 세포 집단들 모두 상에서 발현되는 경우에, 이는 종양-관련 탄수화물 항원을 특이적으로 결합하는 결합제로의 처리가 두 세포 집단 모두를 타겟화한다는 장점을 갖는다.
일 구현예에 따르면, 하나 이상의 종양-관련 탄수화물 항원에 특이적으로 결합하는 결합제는 치료학적으로 활성적이다. 개개 구현예의 하나의 예는 결합제로서 치료학적 활성 항체 또는 항원-결합 단편 또는 이의 유도체의 용도이다. 치료학적 활성 항체 또는 항원-결합 단편 또는 이의 유도체는 바람직하게, 타겟 세포, 특히, 종양-관련 탄수화물 항원을 발현시키는 암 줄기 세포의 용해를 바람직하게 야기시키는, 보체-의존성 세포독성(CDC) 및/또는 항체-의존 세포독성(ADCC)을 유발시킬 수 있다. 추가의 구현예에 따르면, 종양-관련 탄수화물 항원과 특이적으로 결합하는 결합제는 타겟화 분자로서 기능하고, 적어도 하나의 치료제에 결합된다. 결합(coupling)은 공유 또는 비-공유 수단에 의해 달성될 수 있다. 종양-관련 탄수화물 항원을 특이적으로 결합하는 결합제가 타겟화 분자로서 기능할 때, 이는 그 자체가 치료학적으로 활성적일 수 있거나, 이는 치료학적으로 활성적이지 않을 수 있다. 이러한 것이 치료학적으로 활성적이지 않은 경우에, 이는 기본적으로 작용의 요망되는 타겟 측면, 즉, 종양-관련 탄수화물 항원을 발현시키는 암 줄기 세포로 실제 치료제(예를 들어, 방사성약물, 화학치료제 또는 독소)를 가지고 오는 분자 담체로서 기능한다. 종양-관련 탄수화물 항원을 특이적으로 결합하는 결합제에 결합된 치료제는 예를 들어, 화학치료제 또는 다른 항암 약물일 수 있다. 상기 결합된 치료제는 바람직하게, 타겟화된 암 줄기 세포를 파괴하거나 사멸시키거나, 이의 증식을 억제한다. 이는 결합된 치료제에 의해 직접적으로, 또는 타겟화된 암 줄기 세포 및/또는 치료될 피검체의 적합한 생물학적 메카니즘의 유발을 통해 간접적으로 달성될 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 종양-관련 탄수화물 항원은 CD24, CD44, PROCR, ESA, CD176, CD175, CD175s, CD174, CD173 및 CA19-9로 이루어진 군으로부터 선택된 마커들 중 임의 하나 이상과 추가로 조합될 수 있다.
본 발명의 추가의 양태에 따르면, 종양-관련 탄수화물 항원을 특이적으로 결합시키는 결합제로의 치료되기 쉬운 암 줄기 세포를 포함하는 암을 동정하기 위한 방법으로서, 이러한 치료가 암 줄기 세포에 영향을 미치며, 환자로부터 얻어진 암 샘플이 결합제에 대해 특이적인 종양-관련 탄수화물 항원을 발현시키는 암 줄기 세포를 포함하는 지의 여부를 결정하는 것을 포함하며, 여기서, 암 줄기 세포 상에 상기 종양-관련 탄수화물 항원의 존재는 암이 종양-관련 탄수화물 항원을 특이적으로 결합시키는 결합제로 치료받기 쉬운 것을 지시하며, 상기 치료가 또한 암 줄기 세포에 영향을 주는 방법이 제공된다.
본 발명에 따른 이러한 방법은 암의 암 줄기 세포가 종양-관련 탄수화물 항원을 특이적으로 결합시키는 결합제로 치료받기 쉬운 지의 여부를 시험할 수 있다. 본 방법의 결과는 의사에게 가치 있는 진단 정보를 제공한다. 예를 들어, 암이 상기 종양-관련 탄수화물 항원을 발현시키지 못하는 암 줄기 세포를 포함하는 경우에, 상기 종양-관련 탄수화물 항원에 특이적으로 결합하는 결합제로의 치료는 암 줄기 세포에 영향을 미치지 않을 것이고, 이에 따라, 암 줄기 세포에 대해 쓸모가 없을 것이다. 그러나, 암 줄기 세포가 결합제에 대해 특이적인 상기 종양-관련 탄수화물 항원을 발현시키는 상기 방법에 의해 나타낸 경우에, 상기 결합제로의 치료가 또한 타겟화하고 이에 따라 암 줄기 세포에 영향을 미치는 기회가 좋다. 이에 따라, 본 발명에 따른 방법은 환자에 대한 최상의 치료법을 선택하고 특정 치료가 암의 암 줄기 세포에 영향을 미치는 지의 여부를 추정하기 위해 의사에서 가치있는 보조물을 제공한다.
관련된 진단 양태에 따르면, 환자로부터 단리된 샘플에서의 세포 상의 종양-관련 탄수화물 항원의 발현을 분석하는 단계를 포함하며, 종양-관련 탄수화물 항원을 발현시키는 세포의 존재가 상기 샘플에서 암 줄기 세포의 존재를 지시하는, 암을 진단하고/거나 단계화하고/거나 치료에 대한 감수성을 모니터링하기 위한 방법이 제공된다.
본 발명의 추가의 양태에 따르면, 암 줄기 세포의 집단을 동정하기 위한 방법으로서, a) 암 세포의 출발 집단을 제공하고, b) 하나 이상의 종양-관련 탄수화물 항원의 발현 수준을 결정하고, c) 단계 b)에서 결정된 바와 같은 상기 하나 이상의 종양-관련 탄수화물 항원의 발현 수준이 대조 세포와 비교할 때 증가되는 세포의 집단을 선택하되, 상기 선택된 세포의 집단이 암 줄기 세포이고, d) 선택적으로, 단계 c)에서 선택된 상기 세포의 집단을 단리시키고/거나 농화시키는 것을 포함하며, 상기 대조 세포는 상기 하나 이상의 종양-관련 탄수화물 항원을 발현시키지 않거나 낮은 수준으로 발현시키는 동일한 출발 암 세포 집단으로부터의 세포인 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 종양-관련 탄수화물 항원은 SSEA3, SSEA4, 및 GloboH 항원으로 이루어진 리스트로부터 선택된다. 일부 구현예에서, b)의 결정 단계는 하나 이상의 추가적인 종양 관련 항원의 발현 수준을 결정하는 것을 추가로 포함하며, c) 및 d)의 선택 단계 및 단리 단계 각각은 또한, 상기 하나 이상의 추가적인 종양 관련 항원의 발현 수준의 고려사항을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 종양-관련 항원은 CD24, CD44, PROCR, ESA, CD176, CD175, CD175s, CD174, CD173 및 CA19-9 항원을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, b)의 결정 단계 및/또는 d)의 단리 단계는 FACS를 이용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 종양-관련 탄수화물 항원의 발현 수준은 대조 세포와 비교할 때 높거나 고도로 증가된다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 종양-관련 탄수화물 항원의 발현 수준은 대조 세포와 비교할 때 낮거나 낮게 증가된다.
환자 샘플에 암 줄기 세포의 존재는 암의 단계의 나타낼 수 있다. 또한, 암 줄기 세포의 검색은 치료법에 대한 반응을 모니터링하고 예후를 돕기 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 방법에 의해 얻어진 정보는 예후 및 진단에서 유용한데, 이는 질병의 활성 모니터링에 의해 질병의 가속화에 대한 감수성을 분석하는 것을 포함하며, 여기서, 이는 암이 진행하고 예를 들어, 치료, 질병 상태의 상황, 환경 변화에 대한 반응, 예를 들어, 시간의 흐름, 선택된 치료제, 특히 상기 기술된 바와 같은 결합제로의 치료, 또는 다른 양상들을 필요로 하는 지의 여부를 분석한다. 샘플에 함유된 세포가 종양-관련 탄수화물 항원을 발현시키고 이에 따라 샘플이 암 줄기 세포를 포함하는 지의 여부를 분석함으로써, 세포는 또한, 치료제 및 치료에 대해 반응하는 이의 능력으로서 분류될 수 있다. 또한, 유도된 정보는 암의 전이 거동을 결정하고/거나 예측하는데 유용하다.
본 발명에 따른 진단 방법의 일 양태에 따르면, 암 줄기 세포 상에서 발현된 하나 이상의 종양-관련 탄수화물 항원에 특이적으로 결합하는 본 발명에 따른 결합제는 생체내 진단, 특히, 생체내 영상화를 위해 유용하다. 개개 방법은 또한, 진단 목적을 위해 유용하다. 예를 들어, 이는, 암 줄기 세포 상에서 발현된 종양-관련 탄수화물 항원을 발현시키는 암 세포가 환자에서 동정되고/거나 위치화될 수 있는 지의 여부를 결정할 수 있다. 이러한 것이 그러한 경우인 경우에, 암 줄기 세포가 존재할 위험이 존재한다. 상기 및 하기에 기술되는 바와 같이, 제2 줄기 세포 마커가 추가적으로, 암 줄기 세포의 특성을 확인하고/거나 결정하기 위해 검출되는 것이 바람직하다. 또한, 치료법에 대한 반응은 예를 들어, 종양 크기가 감소하는 지의 여부 또는 전이가 발달하는 지의 여부를 결정할 수 있는 바, 모니터링될 수 있다. 또한, 개개 방법은 환자에 대한 적합한 투여량을 동정하는데 유리하다. 일 구현예에 따르면, 결합제는 표지되는데, 이는 예를 들어, 방사성핵을 포함한 방사성 의약품(radiopharmaceutical)이다. 그러나, 결합제는 또한, 다른 작용제/화합물, 예를 들어, 생체내 영상화를 가능하게 하는 PET 트레이서(PET tracer)에 결합될 수 있다. 적합한 화합물들은 종래 기술에 알려져 있고, 이에 따라, 본원에서 추가 설명을 필요로 하지는 않는다. 결합제, 종양-관련 탄수화물 항원, 추가의 암 줄기 세포 마커 및 암 타입과 관련한 세부사항은 상기 및 하기에 기술되어 있고, 또한, 생체내 영상화 구현예에 적용한다. 이는 개개 설명에 언급된다.
일 구현예에 따르면, 암 세포를 함유하거나 함유가 의심되는 샘플은 종야-관련, 바람직하게, 종양-특이적 탄수화물 항원에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 작용제, 및 이에 따라, 탄수화물 암 줄기 세포 마커 및 선택적으로, CD44와 같은 적어도 하나의 제2 암 줄기 세포 마커에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 추가의 작용제와 접촉되고, 바람직하게, 이로 염색된다. 이는 샘플에 암 줄기 세포의 존재를 검출하는 것을 가능하게 한다. 일 구현예에 따르면, 종양-관련 탄수화물 항원에 대한 결합제의 결합, 및 바람직하게, 제2 암 줄기 세포 마커에 대한 결합제의 결합은 당해 분야에 공지되고 본원에 기술된 바와 같이 적절한 검출 방법들에 의해 검출된다. 적합한 검출 방법에는 예를 들어, ELISA, FACS, 형광 현미경, 등이 있다.
본 발명의 방법에 의해 분석되는 샘플은 다양한 소스로부터, 특히, 생검 샘플로부터 얻어질 수 있다. 이러한 샘플의 세포들은 분석 이전에, 원심분리, 수형, 밀도 구배 분리, 성분채집(apheresis), 친화력 선택, 패닝(panning), FACS, 하이페이크(Hypaque)와 함께 원심분리, 등에 의해 분리될 수 있다. 샘플이 얻어진 직후에, 이는 직접적으로 사용되거나, 냉동되거나, 짧은 시간 동안 적절한 배양 배지 중에 유지되거나, 적합한 고정 용액 중에서 고정되거나, 조직학적 또는 면역조직학적 시험을 위해 적합한 배지에 고정되고 엠베딩될 수 있다. 다양한 배지는 세포를 유지시키기 위해 사용될 수 있다. 샘플은 임의 통상적인 절차, 예를 들어, 생검에 의해 또는 수술 시편으로부터 얻어질 수 있다. 일반적으로, 샘플은 적어도 약 102개의 세포, 더욱 일반적으로, 적어도 약 103개의 세포, 및 바람직하게, 104, 105개 이상의 세포를 포함할 것이다. 일 구현예에서, 샘플은 10개의 세포를 포함하다. 일 구현예에서, 샘플을 10 내지 100개의 세포의 임의 수의 세포를 포함한다. 일 구현예에서, 샘플은 10 내지 1000개의 세포의 임의 수의 세포를 포함한다. 일 구현예에서, 샘플은 1 내지 10개의 세포의 임의 수의 세포를 포함한다. 통상적으로, 샘플은 인간 환자일 것이지만, 동물 모델, 예를 들어, 말, 소, 돼지, 개, 고양이, 설치류, 예를 들어, 마우스, 랫트, 햄스터, 영장류, 등이 사용될 수 있다.
샘플은 냉동되고, 엠베딩되고, 고정되고, 조직 마이크로어레이에 존재하는 것 등일 수 있다. 종양-관련 탄수화물 항원, 및 선택적으로, 추가의 암 줄기 세포 마커를 결합하고, 검출하고, 특히 염색하기 위해 사용되는 작용제는 예를 들어, 항체와 같은 암 줄기 세포 마커를 특이적으로 결합하는 결합제일 수 있다. 적합한 예는 상기 기술되어 있다. 이러한 작용제는 탈착 가능하게 표지될 수 있거나, 염색 절차에서 간접적으로 표지될 수 있다. 일 구현예에 따르면, 라벨은 또한, 종양-관련 탄수화물 항원 양성 세포를 분리시키기 위해 사용될 수 있다. 적합한 라벨, 뿐만 아니라, 염색 절차는 당해 분야 공지되어 있고, 이에 따라, 비록 일부 예들이 본원에 기술되어 있지만, 본원에서 추가의 설명을 필요로 하지는 않는다. 분석을 위한 표준 절차는 예를 들어, 실시예에 기술되어 있는 바와 같이, 샘플의 조직학적 고정화(예를 들어, 포르말린에 의함) 및 후속 염색을 포함할 수 있다. 얻어진 데이타는 샘플에서 암 줄기 세포의 수 및 분포를 결정할 수 있게 한다.
종양-관련 탄수화물 항원을 발현시키는 세포를 검출하고/거나 정량화하는데 적합한 방법들은, 예를 들어, 면역학적 검정, 예를 들어, ELISA, RIA, 웨스턴 블롯 및 면역조직화학, 유세포분석, 면역조직화학, 등을 포함한다.
후보 치료제에 대한 스크리닝 검정에서, 일반적으로, 고려되는 종양-관련 탄수화물 항원을 발현시키는 암 줄기 세포를 포함하는 배양물은 고려되는 결합제와 접촉되며, 작용제의 효과는 출력 파라미터, 예를 들어, 마커의 발현, 세포 생존능, 등을 모니터링함으로써 평가된다. 이러한 스크리닝은 또한, 후보 치료제의 부재 하에 세포의 성장, 증식, 생존능, 및/또는 분화 상태와 비교하여, 후보 치료제의 존재 하에 세포의 성장, 증식, 생존능, 및/또는 분화 상태의 조절을 결정하는 것을 포함할 수 있다.
하나 이상의 종양-관련 탄수화물 항원을 발현시키는 암 줄기 세포에 대해 고도로 농화된 단리된 세포 집단은 이러한 마커를 사용하여 단리되고, 농화/정제될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 암 줄기 세포 집단은 순환계로부터, 예를 들어, 혈액으로부터 단리된다. 일부 구현예에서, 상기 암 줄기 세포 집단은 종양 샘플로부터, 또는 암 환자로부터 수득된 흉막 삼출(pleural effusion) 또는 다른 유체로부터 단리된다.
화학적 정의
특정 작용기 및 화학적 용어의 정의는 하기에서 보다 상세히 기술된다. 화학 원소는 원소 주기율표, CAS 버전, "Handbook of Chemistry and Physics, 75th Ed.", 안쪽 커버에 따라 식별되며, 특정 작용기는 일반적으로 그 안에 기술된 바와 같이 정의된다. 추가적으로, 유기 화학의 일반적인 원리, 뿐만 아니라, 특정 작용성 모이어티 및 반응성은 문헌[Thomas Sorrell, Organic Chemistry, University Science Books, Sausalito, 1999; March's Advanced Organic Chemistry, 5th Edition, John Wiley & Sons, Inc., New York, 2001; Larock , Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, Inc., New York, 1989; 및 Carruthers, Some Modern Methods of Organic Synthesis, 3rd Edition, Cambridge University Press, Cambridge, 1987]에 기술되어 있다. 또한, 예시적인 글리칸 및 항체 방법들은 US20100136042호, US20090317837호, 및 US20140051127호(Wong et al)에 기재되어 있으며, 이러한 문헌 각각의 내용들은 본원에 참고로 포함된다.
본원에 기술된 화합물은 하나 이상의 비대칭 중심을 포함할 수 있고, 이에 따라, 다양한 이성체 형태, 예를 들어, 거울상 이성질체 및/또는 부분 입체 이성질체로 존재할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 화합물은 개별적인 거울상 이성질체, 부분 입체 이성질체 또는 기하 이성질체의 형태일 수 있거나, 라세미 혼합물 및 하나 이상의 입체 이성질체가 풍부한 혼합물을 포함하는 입체 이성질체의 혼합물 형태일 수 있다. 이성질체는 키랄 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC) 및 키랄 염의 형성 및 결정화를 포함하는, 당업자에게 공지된 방법에 의해 혼합물로부터 단리될 수 있거나, 바람직한 이성질체는 비대칭 합성에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Jacques et al., Enantiomers , Racemates and Resolutions (Wiley Interscience, New York, 1981); Wilen et al., Tetrahedron 33:2725 (1977); Eliel, Stereochemistry of Carbon Compounds (McGraw-Hill, NY, 1962); 및 Wilen, Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions p. 268 (E.L. Eliel, Ed., Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, IN 1972] 참조. 본 발명은 실질적으로 다른 이성질체가 없는 개별적 이성질체로서, 그리고 대안적으로 다양한 이성질체들의 혼합물로서 본원에 기술된 화합물을 추가적으로 포함한다.
값들의 범위를 열거하는 경우, 그러한 범위 내에 각각의 값 및 하위 범위를 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, "C1-6"은 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C1-6, C1-5, C1-4, C1-3, C1-2, C2-6, C2-5, C2-4, C2-3, C3-6, C3-5, C3-4, C4-6, C4-5, 및 C5-6을 포함하는 것으로 의도된다.
"알킬"은 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지된 포화 탄화수소 기의 라디칼을 언급한다("C1-20 알킬"). 일부 구현예에서, 알킬 기는 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는다("C1-10 알킬"). 일부 구현예에서, 알킬 기는 1 내지 9개의 탄소 원자를 갖는다("C1-9 알킬"). 일부 구현예에서, 알킬 기는 1 내지 8개의 탄소 원자를 갖는다("C1-8 알킬"). 일부 구현예에서, 알킬 기는 1 내지 7개의 탄소 원자를 갖는다("C1-7 알킬"). 일부 구현예에서, 알킬 기는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는다("C1-6 알킬"). 일부 구현예에서, 알킬 기는 1 내지 5개의 탄소 원자를 갖는다("C1-5 알킬"). 일부 구현예에서, 알킬 기는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는다("C1-4 알킬"). 일부 구현예에서, 알킬 기는 1 내지 3개의 탄소 원자를 갖는다("C1-3 알킬"). 일부 구현예에서, 알킬 기는 1 내지 2개의 탄소 원자를 갖는다("C1-2 알킬"). 일부 구현예에서, 알킬 기는 1개의 탄소 원자를 갖는다("C1 알킬"). 일부 구현예에서, 알킬 기는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는다("C2-6 알킬"). C1-6 알킬 기의 예는 메틸(C1), 에틸(C2), n-프로필(C3), 이소-프로필(C3), n-부틸(C4), 3급-부틸(C4), 2차-부틸(C4), 이소-부틸(C4), n-펜틸(C5), 3-펜타닐(C5), 아밀(C5), 네오펜틸(C5), 3-메틸-2-부타닐(C5), 3차 아밀(C5), 및 n-헥실(C6)을 포함한다. 알킬 기의 추가의 예는 n-헵틸(C7), n-옥틸(C8) 등을 포함한다. 달리 기술하지 않는 한, 알킬 기의 각각의 예는 독립적으로 선택적으로 치환되는데, 즉, 치환되지 않거나("치환되지 않은 알킬") 1개 이상의 치환체로 치환된다("치환된 알킬"). 특정 구현예에서, 알킬 기는 치환되지 않은 C1-10 알킬(예를 들어, -CH3)이다. 특정 구현예에서, 알킬 기는 치환된 C1-10 알킬이다.
"알케닐"은 2 내지 20개의 탄소 원자, 1개 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 가지며 3중 결합을 갖지 않은 직쇄 또는 분지된 탄화수소 기의 라디칼을 언급한다("C2-20 알케닐"). 일부 구현예에서, 알케닐 기는 2 내지 10개의 탄소 원자를 갖는다("C2-10 알케닐"). 일부 구현예에서, 알케닐 기는 2 내지 9개의 탄소 원자를 갖는다("C2-9 알케닐"). 일부 구현예에서, 알케닐 기는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는다("C2-8 알케닐"). 일부 구현예에서, 알케닐 기는 2 내지 7개의 탄소 원자를 갖는다("C2-7 알케닐"). 일부 구현예에서, 알케닐 기는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는다("C2-6 알케닐"). 일부 구현예에서, 알케닐 기는 2 내지 5개의 탄소 원자를 갖는다("C2-5 알케닐"). 일부 구현예에서, 알케닐 기는 2 내지 4개의 탄소 원자를 갖는다("C2-4 알케닐"). 일부 구현예에서, 알케닐 기는 2 내지 3개의 탄소 원자를 갖는다("C2-3 알케닐"). 일부 구현예에서, 알케닐 기는 2개의 탄소 원자를 갖는다("C2 알케닐"). 1개 이상의 탄소-탄소 이중 결합은 내부에 있을 수 있거나(2-부테닐에서와 같이) 또는 말단에 있을 수 있다(1-부테닐에서와 같이). C2-4 알케닐 기의 예는 에테닐(C2), 1-프로페닐(C3), 2-프로페닐(C3), 1-부테닐(C4), 2-부테닐(C4), 부타디에닐(C4) 등을 포함한다. C2-6 알케닐 기의 예는 상기 언급된 C2-4 알케닐 기, 뿐만 아니라, 펜테닐(C5), 펜타디에닐(C5), 헥세닐(C6) 등을 포함한다. 알케닐의 추가적인 예는 헵테닐(C7), 옥테닐(C8), 옥타트리에닐(C8) 등을 포함한다. 달리 기술하지 않는 한, 알케닐 기의 각각의 경우는 독립적으로 선택적으로 치환되는데, 즉, 치환되지 않거나("치환되지 않은 알케닐") 1개 이상의 치환체로 치환된다("치환된 알케닐"). 특정 구현예에서, 알케닐 기는 치환되지 않은 C2-10 알케닐이다. 특정 구현예에서, 알케닐 기는 치환된 C2-10 알케닐이다.
"알키닐"은 2 내지 20개의 탄소 원자, 1개 이상의 탄소-탄소 삼중 결합, 및 선택적으로 1개 이상의 이중 결합을 갖는 직쇄 또는 분지된 탄화수소 기의 라디칼을 언급한다("C2-20 알키닐"). 일부 구현예에서, 알키닐 기는 2 내지 10개의 탄소 원자를 갖는다("C2-10 알키닐"). 일부 구현예에서, 알키닐 기는 2 내지 9개의 탄소 원자를 갖는다("C2-9 알키닐"). 일부 구현예에서, 알키닐 기는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는다("C2-8 알키닐"). 일부 구현예에서, 알키닐 기는 2 내지 7개의 탄소 원자를 갖는다("C2-7 알키닐"). 일부 구현예에서, 알키닐 기는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는다("C2-6 알키닐"). 일부 구현예에서, 알키닐 기는 2 내지 5개의 탄소 원자를 갖는다("C2-5 알키닐"). 일부 구현예에서, 알키닐 기는 2 내지 4개의 탄소 원자를 갖는다("C2-4 알키닐"). 일부 구현예에서, 알키닐 기는 2 내지 3개의 탄소 원자를 갖는다("C2-3 알키닐"). 일부 구현예에서, 알키닐 기는 2개의 탄소 원자를 갖는다("C2 알키닐"). 1개 이상의 탄소-탄소 삼중 결합은 내부에 있을 수 있거나(2-부티닐에서와 같이) 또는 말단에 있을 수 있다(1-부티닐에서와 같이). C2-4 알키닐 기의 예는, 비제한적으로, 에티닐(C2), 1-프로피닐(C3), 2-프로피닐(C3), 1-부티닐(C4), 2-부티닐(C4) 등을 포함한다. C2-6 알케닐 기의 예는 상기 언급된 C2-4 알키닐 그룹 뿐만 아니라 펜티닐(C5), 헥시닐(C6) 등을 포함한다. 알키닐의 추가적인 예는 헵티닐(C7), 옥티닐(C8) 등을 포함한다. 달리 기술하지 않는 한, 알키닐 기의 각각의 경우는 독립적으로 임의로 치환되는데, 즉, 치환되지 않거나("치환되지 않은 알키닐") 1개 이상의 치환체로 치환된다("치환된 알키닐"). 특정 구현예에서, 알키닐 기는 치환되지 않은 C2-10 알키닐이다. 특정 구현예에서, 알키닐 기는 치환된 C2-10 알키닐이다.
"헤테로시클릴"또는 "헤테로시클릭"은 고리 탄소 원자 및 1개 내지 4개의 고리 헤테로원자를 갖는 3원 내지 10원 비-방향족 고리 시스템의 라디칼을 지칭하며, 여기서 각 헤테로 원자는 질소, 산소, 황, 붕소, 인 및 실리콘("3-10원 헤테로시클릴")으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 구현예에서, 헤테로 원자는 질소, 황 및 산소로부터 독립적으로 선택된다. 하나 이상의 질소 원자를 함유하는 헤테로시클릴 기에서, 부착점은 원자가가 허용하는 것처럼 탄소 또는 질소 원자일 수 있다. 헤테로시클릴 기는 모노시클릭("모노시클릭 헤테로시클릴")이거나 또는 바이시클릭 시스템("바이시클릭 헤테로시클릴")과 같은 융합, 브릿징, 또는 스피로 고리 시스템일 수 있고, 포화되거나 부분적으로 불포화될 수 있다. 헤테로시클릴 바이시클릭 고리 시스템은 하나 또는 두 개의 고리에 하나 이상의 헤테로 원자를 포함할 수있다. "헤테로시클릴"은 또한, 헤테로시클릭 고리가, 부착점이 카보시클릴 또는 헤테로시클릭 고리 상에 있는 하나 이상의 카보시클릴기와 융합된 고리 시스템, 또는 상기에서 정의된 바와 같이 헤테로시클릭 고리가, 부착점이 카보시클릴 또는 헤테로시클릭 고리 상에 있는 하나 이상의 아릴 또는 헤테로 아릴기와 융합된 고리 시스템을 포함하며, 이러한 경우, 고리원의 수는 헤테로시클릭 고리 시스템에서 고리원의 수를 계속 지정한다. 달리 기술하지 않는 한, 헤테로시클릴의 각 경우는 독립적으로 선택적으로 치환되거나, 즉 비치환("비치환된 헤테로시클릴") 또는 하나 이상의 치환체에 의해 치환된("치환된 헤테로시클릴")다. 특정 구현예에서, 헤테로시클릴 기는 비치환된 3-10원 헤테로시클릴이다. 특정 구현예에서, 헤테로시클릴 기는 치환된 3-10원 헤테로시클릴이다.
"아릴"은 6 내지 14개의 고리 탄소 원자 및 방향족 고리 시스템에서 0개의 헤테로 원자를 가지는, 모노시클릭 또는 폴리시클릭(예를 들어, 바이시클릭 또는 트리시클릭) 4n+2 방향족 고리 시스템(예를 들어, 6, 10 또는 14 π 전자가 환형 배열에서 공유됨)의 라디칼을 나타낸다("C6-14 아릴"). 일부 구현예에서, 아릴 기는 6개의 고리 탄소 원자("C6 아릴", 예를 들어, 페닐)를 갖는다. 일부 구현예에서, 아릴 기는 10개의 고리 탄소 원자("C10 아릴", 예를 들어 1- 나프틸 및 2-나프틸과 같은 나프틸)를 갖는다. 일부 구현예에서, 아릴 기는 14개의 고리 탄소 원자("C14 아릴"; 예를 들어, 안트라실)를 갖는다. "아릴"은 또한 상기에서 정의된 바와 같은 아릴 고리가 하나 이상의 카보시클릴 또는 헤테로시클릴 기와 융합된 고리 시스템을 포함하며, 여기서 라디칼 또는 부착점은 아릴 고리 상에 존재하며, 이러한 경우에 탄소 원자의 수는 아릴 고리 시스템의 탄소 원자의 수를 계속해서 지정한다. 달리 기술하지 않는 한, 아릴 기의 각 경우는 독립적으로 선택적으로 치환되고, 즉 비치환된("비치환 아릴") 또는 하나 이상의 치환체로 치환("치환된 아릴")된다. 특정 구현예에서, 아릴 기는 비치환된 C6-14 아릴이다. 특정 구현예에서, 아릴 기는 치환된 C6-14 아릴이다.
2가 브릿징 기인, 본원에서 정의된 바와 같은 알킬, 알케닐, 알키닐, 카보시클릴, 헤테로시클릴, 아릴 및 헤테로아릴 기는 추가로 접미사 -엔(ene)을 이용하여, 예를 들어 알킬렌, 알케닐렌, 알키닐렌, 카보시클릴렌, 헤테로시클릴렌, 아릴렌 및 헤테로아릴렌으로 나타낸다.
용어 "알콕시" 또는 "알킬옥시"는 -O-알킬 라디칼을 의미하며, 여기서 알킬은 본원에서 정의된 바와 같은 선택적으로 치환된 알킬이다. 알콕시의 예는 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, 이소-부톡시, sec-부톡시 및 3차-부톡시를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
용어 "아릴옥시"는 -O-아릴을 의미하며, 아릴은 본원에서 정의된 바와 같은 선택적으로 치환된 아릴이다.
본원에서 사용되는 용어 "선택적으로 치환된"은 치환되거나 비치환된 모이어티를 지칭한다.
본원에서 정의된 바와 같은 알킬, 알케닐, 알키닐, 카보시클릴, 헤테로시클릴, 아릴 및 헤테로아릴 기는 선택적으로 치환된다(예를 들어, "치환된" 또는 "비치환된" 알킬", "치환된" 또는 "비치환된" 알케닐, "치환된" 또는 "비치환된" 알키닐, "치환된" 또는 "비치환된" 카르보시클릴, "치환된" 또는 "비치환된" 헤테로시클릴, "치환된" 또는 "비치환된" 아릴, 또는 "치환된" 또는 "비치환된" 헤테로아릴 기). 일반적으로, 용어 "선택적으로"에 선행하는지 여부와 무관하게, 용어 "치환된"은 기(예를 들어, 탄소 또는 질소 원자) 상에 존재하는 적어도 하나의 수소가 허용되는 치환체, 예를 들어, 치환에 기반하여 안정한 화합물, 예를 들어 재배열, 고리화, 제거 또는 다른 반응과 같은 구조 변형을 자발적으로 겪지 않는 화합물을 야기시키는 치환체로 대체됨을 의미한다. 달리 명시하지 않는 한, "치환된" 기는 상기 기의 하나 이상의 치환 가능한 위치에 치환체를 갖고, 임의 주어진 구조에서 하나 이상의 위치가 치환되는 경우, 상기 치환체는 각 위치에서 동일하거나 상이하다. 용어 "치환된"은 유기 화합물의 모든 허용 가능한 치환체로의 치환, 즉 안정한 화합물의 형성을 초래하는 본원에 기재된 임의의 치환체로의 치환을 포함하는 것으로 고려된다. 본 발명은 안정한 화합물에 도달하기 위해 임의 및 모든 이러한 조합을 고려한다. 본 발명의 목적을 위해, 질소와 같은 헤테로원자는 헤테로원자의 원자가를 충족시키고 안정한 모이어티를 형성하는, 본원에 기술된 바와 같은 수소 치환체 및/또는 임의의 적합한 치환체를 가질 수 있다.
"할로" 또는 "할로겐"은 불소(플루오로, -F), 염소(클로로, -Cl), 브롬(브로모, -Br) 또는 요오드(요오드, -I)를 지칭한다.
"아실"은 -C(=O)Raa,-CHO, -CO2Raa, -C(=O)N(Rbb)2, -C(=NRbb)Raa, -C(=NRbb)ORaa, -C(=NRbb)N(Rbb)2, -C(=O)NRbbSO2Raa, -C(=S)N(Rbb)2, -C(=O)SRaa, 및-C(=S)SRaa로 이루어진 군으로부터 선택된 모이어티를 지칭하며, 여기서 Raa및 Rbb는 본원에서 정의된 바와 같다.
질소 원자는 원자가가 허용하는 대로 치환되거나 비치환될 수 있고, 1 차, 2 차, 3 차 및 4 차 질소 원자를 포함한다. 예시적인 질소 원자 치환체는, 비제한적으로, 수소, -OH, -ORaa, -N(Rcc)2, -CN, -C(=O)Raa, -C(=O)N(Rcc)2, -CO2Raa, -SO2Raa, -C(=NRbb)Raa, -C(=NRcc)ORaa, -C(=NRcc)N(Rcc)2, -SO2N(Rcc)2, -SO2Rcc, -SO2ORcc, -SORaa, -C(=S)N(Rcc)2, -C(=O)SRcc, -C(=S)SRcc, -P(=O)2Raa, -P(=O)(Raa)2, -P(=O)2N(Rcc)2, -P(=O)(NRcc)2, C1-10 알킬, C1-10 퍼할로알킬, C2-10 알케닐, C2-10 알키닐, C3-10 카보시클릴, 3-14원 헤테로시클릴, C6-14 아릴, 및 5-14원 헤테로아릴을 포함하거나, 이로 제한되지 않거나, 질소 원자에 부착된 2개의 Rcc 기가 결합되어 3-14원 헤테로시클릴 또는 5-14원 헤테로 아릴 고리를 형성하고, 여기서 각 알킬, 알케닐, 알키닐, 카르보시클릴, 헤테로시클릴, 아릴 및 헤테로아릴은 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 Rdd 기로 치환되고, Raa, Rbb, Rcc 및 Rdd는 상기 정의된 바와 같다.
특정 구현예에서, 산소 원자 상에 존재하는 치환체는 산소 보호기(또한, 히드록실 보호기로 지칭됨)이다. 산소 보호기는, 비제한적으로 -Raa, -N(Rbb)2, -C(=O)SRaa, -C(=O)Raa, -CO2Raa, -C(=O)N(Rbb)2, -C(=NRbb)Raa, -C(=NRbb)ORaa, -C(=NRbb)N(Rbb)2, -S(=O)Raa, -SO2Raa, -Si(Raa)3, -P(Rcc)2, -P(Rcc)3, -P(=O)2Raa, -P(=O)(Raa)2, -P(=O)(ORcc)2, -P(=O)2N(Rbb)2, 및 -P(=O)(NRbb)2를 포함하지만, 이로 제한되지 않으며, 여기서, Raa, Rbb 및 Rcc는 본원에서 정의된 바와 같다. 산소 보호기는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며 본원에 참고로 인용된 문헌[Protective Groups in Organic Synthesis, T. W. Greene 및 P. G. M. Wuts, 3rd edition, John Wiley & Sons, 1999]에 기재된 것들을 포함한다.
예시적인 산소 보호기는, 비제한적으로, 메틸, 메톡시메틸(MOM), 메틸티오메틸(MTM), t-부틸티오메틸, (페닐디메틸실릴)메톡시메틸(SMOM), 벤질옥시메틸(BOM), p-메톡시벤질 옥시메틸(PMBM), (4-메톡시페녹시)메틸(p-AOM), 구아이아콜메틸(GUM), t-부톡시메틸, 4-펜테닐옥시메틸(POM), 실옥시메틸, 2-메톡시에톡시메틸(MEM), 2,2,2-트리클로로에톡시메틸, 비스(2-클로로에톡시)메틸, 2-(트리메틸실릴)에톡시메틸(SEMOR), 테트라히드로피라닐(THP), 3-브로모테트라히드로피라닐, 테트라히드로티오피라닐, 1-메톡시사이클로헥실, 4-메톡시테트라히드로피라닐(MTHP), 4-메톡시테트라히드로티오피라닐, 4-메톡시테트라히드로티오피라닐 S,S-디옥사이드, 1-[(2-클로로-4-메틸)페닐]-4-메톡시피페리딘-4-일(CTMP), 1,4-디옥산-2-일, 테트라히드로푸라닐, 테트라히드로티오퓨란일, 2,3,3a,4,5,6,7,7a-옥타히드로-7,8,8-트리메틸-4,7-메타노벤조푸란-2-일, 1-에톡시에틸, 1-(2-클로로에톡시)에틸, 1-메틸-1-메톡시에틸, 1-메틸-1-벤질옥시에틸, 1-메틸-1-벤질옥시-2-플루오로에틸, 2,2,2-트리클로로에틸, 2-트리메틸실릴에틸, 2-(페닐셀레닐)에틸, t-부틸, 알릴, p-클로로페닐, p-메톡시페닐, 2,4-디 니트로페닐, 벤질(Bn), p-메톡시벤질, 3,4-디메톡시벤질, o-니트로벤질, p-니트로벤질, p-할로벤질, 2,6-디클로로벤질, p-시아노벤질, p-페닐벤질, 2-피콜릴, 4-피콜릴, 3-메틸-2-피콜릴 N-옥사이도, 디페닐메틸, p,p'-디니트로벤지드릴, 5-디벤조설베릴, 트리페닐메틸, α-나프틸디페닐메틸, p-메톡시페닐디페닐메틸, 디(p-메톡시페닐)페닐메틸, 트리(p-메톡시페닐)메틸, 4-(4'-브로모페나실옥시페닐)디페닐메틸, 4,4',4"-트리스(4,5-디클로로프탈이미도페닐)메틸, 4,4',4"-트리스(레불리노일옥시페닐)메틸, 4,4',4"-트리스(벤조일옥시페닐)메틸, 3-(이미다졸-1-일) 비스(4',4"-디메톡시페닐)메틸, 1,1-비스(4-메톡시페닐)-1'-피레닐메틸 , 9-안트릴, 9-(9-페닐)크산테닐, 9-(9-페닐-10-옥소)안트릴, 1,3-벤조디티오란-2-일, 벤즈이소티아졸릴 S,S-디옥시도, 트리메틸실릴(TMS), 트리에틸실릴(TES), 트리이소프로필실릴(TIPS), 디메틸이소프로필실릴(IPDMS), 디에틸이소프로필실릴(DEIPS), 디메틸헵실실릴, t-부틸디메틸실릴(TBDMS), t-부틸디페닐실릴(TBDPS), 트리벤질실릴, 트리-p-크실릴실릴, 트리페닐실릴, 디페닐메틸실릴(DPMS), t-부틸메톡시페닐실릴(TBMPS), 포르메이트, 벤조일포르메이트, 아세테이트, 클로로아세테이트, 디클로로아세테이트, 트리클로로아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 메톡시아세테이트, 트리페닐메톡시 아세테이트, 페녹시아세테이트, p-클로로페녹시아세테이트, 3-페닐프로피오네이트, 4-옥소 펜타노에이트(레불리네이트), 4,4-(에틸렌디티오)펜타노에이트(레불리노일디티오아세탈), 피발로에이트, 아다만토에이트, 크로토네이트, 4-메톡시크로토네이트, 벤조에이트, p-페닐벤조 에이트, 2,4,6-트리메틸벤조에이트(메시토에이트), 메틸 카르보네이트, 9-플루오레닐메틸 카보네이트(Fmoc), 에틸 카보네이트, 2,2,2-트리클로로에틸 카보네이트(Troc), 2-(트리메틸실릴)에틸 카보네이트(TMSEC), 2-(페닐술포닐)에틸 카보네이트(Psec), 2-(트리페닐포스포니오)에틸 카보네이트(Peoc), 이소부틸 카보네이트, 비닐 카보네이트, 알릴 카보네이트, t-부틸 카보네이트(BOC), p-니트로페닐 카보네이트, 벤질 카보네이트, p-메톡시벤질 카보네이트, 3,4-디메톡시벤질 카보네이트, o-니트로벤질 카보네이트, p-니트로벤질 카보네이트, S-벤질티오 카보네이트, 4-에톡시-1-나프틸 카보네이트, 메틸 디티오카보네이트, 2-요오도벤조에이트, 4-아지도부티레이트, 4-니트로-4-메틸펜타노에이트, o-(디브로모메틸)벤조에이트, 2-포르밀 벤젠술포네이트, 2-(메틸티오메톡시)에틸, 4-(메틸티오메톡시)부티레이트, 2-(메틸티오메톡시메틸)벤조 에이트, 2,6-디클로로-4-메틸페녹시아세테이트, 2,6-디클로로-4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸) 페녹시아세테이트, 2,4-비스(1,1-디메틸프로필)페녹시아세테이트, 클로로디페닐아세테이트, 이소부티레이트, 모노숙시네이트, (E)-2-메틸-2-부테노에이트, o-(메톡시아실)벤조에이트, α-나프토에이트, 나이트레이트, 알킬 N,N,N',N'-테트라메틸포스포로디아미데이트, 알킬 N-페닐카르바메이트, 보레이트, 디메틸포스피노티올, 알킬 2,4-디니트로페닐설페네이트, 설페이트, 메탄설포네이트 (메실레이트), 벤질술포네이트 및 토실레이트(Ts)를 포함한다.
다른 정의들
본원에서 그리고 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태 및 "상기"는 문맥상 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수 인용 문헌을 포함하는 것으로 주지되어야 한다. 또한, 단수 형태의 용어, "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 여기서 상호 교환하여 사용할 수 있다. 또한 "포함하는", "함유하는" 및 "갖는"이라는 용어는 서로 상호 교환하여 사용할 수 있는 것으로 주지되어야 한다.
본 발명의 실시는 달리 지시되지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기술을 사용하며, 이는 당업계의 기술 범위 내에 있다. 이러한 기술은 문헌에서 충분히 설명되어 있다[예를 들어, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Antibodies: A Laboratory Manual, by Harlow and Lane s (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988); 및 Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986].
본원에서 사용되는 용어 "글리칸"은 다당류 또는 올리고당을 의미한다. 본원에서, 글리칸은 또한 당단백질, 당지질, 당펩티드, 당단백질펩티드(glycoproteome), 펩티도글리칸, 지질다당류(lipopolysaccharid) 또는 프로테오글리칸과 같은 글리코콘주게이트의 탄수화물 부분을 지칭하기 위해 사용된다. 글리칸은 대개 단당류(monosaccharide)들 사이의 O-글리코시드 연결(O-glycosidic linkages)으로만 구성된다. 예를 들어, 셀룰로오스는 β-1,4-연결된 D-글루코오스로 구성된 글리칸(또는 보다 구체적으로 글루칸)이고, 키틴은 β-1,4-연결된 N-아세틸-D-글루코사민으로 구성된 글리칸이다. 글리칸은 단당류 잔기의 호모 또는 헤테로폴리머일 수 있고 선형 또는 분지형일 수 있다. 글리칸은 당단백질과 프로테오글리칸과 같은 단백질에 부착되어 발견된다. 그들은 일반적으로 세포의 외부 표면에서 발견된다. O- 및 N-연결된 글리칸은 진핵 생물에서 매우 흔하지만 원핵 생물에서는 덜 일반적으로 발견될 수 있다. N-결합된 글리칸은 시퀸(sequon)에서 아스파라긴의 R-그룹 질소(N)에 부착되어 발견된다. 상기 시퀸은 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr 서열이며, 여기서 X는 프랄린(praline)을 제외한 임의 아미노산이다.
본원에서 사용되는 용어 "항원"은 면역 반응을 유도할 수 있는 임의 물질로 정의된다.
본원에서 사용되는 용어 "면역원성"은 면역 반응을 자극하는 면역원, 항원 또는 백신의 능력을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "CD1d"는 다양한 인간 항원-제시 세포의 표면 상에서 발현되는 당단백질의 CD1(분화의 클러스터 1) 패밀리의 구성원을 의미한다. CD1d 존재 지질 항원은 자연 살해 T 세포를 활성화시킨다. CD1d는 당지질 항원이 결합하는 깊은 항원-결합 그루브를 갖는다. 수지상 세포 상에서 발현되는 CD1d 분자는 당지질과 결합하여 존재할 수 있고, 이는 C34와 같은 α-GalCer 유사체를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "에피토프"는 항체 또는 T 세포 수용체의 항원 결합 부위와 접촉하는 항원 분자의 부분으로 정의된다.
본원에서 사용되는 용어 "백신"은 유기체가 야기하는 질병에 대한 면역성을 부여하는 데 사용되는 단백질, 펩티드 또는 다당류와 같은, 전체 질병-유발 유기체 (사망하거나 약화된) 또는 그러한 유기체의 성분으로 구성된 항원을 포함하는 제제를 의미한다. 백신 제제는 천연, 합성 또는 재조합 DNA 기술에 의해 유래될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항원 특이성"은 특정 세포 증식을 일으키는 특정 항원 또는 항원 단편을 공급하도록 하는 세포 집단의 특성을 말한다.
본원에서 사용되는 용어 "특이적 결합"은 결합 쌍(예를 들어, 항체 및 항원) 간의 상호작용을 나타낸다. 다양한 경우에 있어서, 특이적 결합은 약 10-6 mole/liter, 약 10-7 mole/liter, 또는 약 10-8 mole/liter 이하의 친화력 상수에 의해 구현될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "유동 세포 계측법(Flow cytometry)"또는 "FACS"는 광학 및 전자 검출 장치를 통해 액체 흐름에 현탁된 된 입자 또는 세포의 물리적 및 화학적 특성을 검사하는 기술을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 당효소는 글리보계열 생합성 경로에서 효소를 적어도 일부 지칭하며, 예시적인 당효소는 알파-4GalT; 베타-4GalNAcT-I; 또는 베타-3GalT-V 효소를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "글로보계열 경로"는 도 1에 도시된 생화학적 경로를 지칭한다.
"단리된" 항체는 이의 천연 환경의 성분으로부터 동정되고 분리되고/되거나 회수된 항체이다. 이의 천연 환경의 오염 성분들은 항체에 대한 연구, 진단학적 또는 치료학적 사용을 방해하고 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있는 물질이다. 일 구현예에서, 항체는 (1) 예를 들어, 로우리 방법에 의한 측정시 98 중량% 초과의 항체 및 일부 구현예에서 99 중량% 초과, (2) 예를 들어, 회전 컵 분리기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 수득하기에 충분한 정도로 또는 (3) 예를 들어, 코마시블루 또는 은 염색을 사용한 환원 또는 비환원 조건하에 SDS-PAGE에 의한 균질물로 정제된다. 단리된 항체는 항체의 천연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않기 때문에 재조합 세포내 동일계 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "실질적으로 유사한", "실질적으로 동일한", "동등한", 또는 "실질적으로 동등한"은 2개의 수치 값(예를 들어, 분자와 관련된 하나 및 참조/비교 분자와 관련된 다른 하나) 간의 충분히 고도의 유사성을 지칭하여 당업자가 2개의 값 간의 차이가 상기 값(예를 들어, Kd 값, 항-바이러스 효과 등)에 의해 측정된 생물학적 특성과 관련하여 거의 없거나 부재인 생물학적 및/또는 통계학적 유의성을 고려하게 한다. 상기 2개의 값 간의 차이는 예를 들어, 참조/비교 분자에 대한 값의 함수로서 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만 및/또는 약 10% 미만이다.
본원에 사용된 바와 같은 구 "실질적으로 감소된" 또는 "실질적으로 상이한"은 2개의 수치 값(일반적으로 분자와 관련된 하나 및 참조/비교 분자와 관련된 다른 하나) 간의 충분한 고도의 차이를 지칭하여 당업자가 상기 값(예를 들어, Kd 값)에 의해 측정된 생물학적 특성과 관련하여 통계학적 유의성인지를 고려하게 한다. 상기 2개의 값 간의 차이는 예를 들어, 참조/비교 분자에 대한 값의 함수로서 약 10% 초과, 약 20% 초과, 약 30% 초과, 약 40% 초과 및/또는 약 50% 초과이다.
"결합 친화력"은 일반적으로 분자(예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 이의 결합 파트너(예를 들어, 항원) 간의 비공유 상호작용 총합의 강도를 언급한다. 달리 지적되지 않는 경우, 본원에 사용된 바와 같은, "결합 친화력"은 결합 쌍(예를 들어, 항체와 항원)의 구성원 간의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화력을 언급한다. 이의 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화성은 일반적으로 해리 상수(Kd)로 나타낼 수 있다. 친화력은 본원에 기재된 것들을 포함하는 당업계에 공지된 통상의 방법에 의해 측정될 수 있다. 낮은 친화력 분자는 일반적으로 항원에 느리게 결합하고 신속히 해리하는 경향이 있는 반면, 고친화력 항체는 일반적으로 항원에 신속하게 결합하고 장기간 결합된 채로 유지되는 경향이 있다. 결합 친화력을 측정하는 다양한 방법은 당업계에 공지되어 있고, 이중 어느 하나는 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 특정의 예시적인 구현예는 하기에 기재된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 "Kd" 또는 "Kd 값"은 하기의 검정에 의해 기재된 바와 같은 목적하는 항체의 Fab 버젼 및 이의 항원과 함께 수행되는 방사선표지된 항원 결합 검정(RIA)에 의해 측정된다. 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화력은 적정된 일련의 비표지된 항원의 존재하에 (125I)-표지된 항원의 최소 농도로 Fab를 평형화시킴에 이어서 항-Fab 항체-코팅된 플레이트와 함께 결합된 항원을 포획함에 의해 측정된다[Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881]. 검정 조건을 확립하기 위해, 미세역가 플레이트(Dynex)는 50 mM 탄산나트륨(pH 9.6) 중에서 5 ㎍/ml의 포획 항-Fab 항체(Cappel Lab)로 밤새 코팅시키고 후속적으로 실온(대략 23℃)에서 2 내지 5시간 동안 PBS 중에서 2%(w/v) 소 혈청 알부민으로 차단시킨다. 비-흡착 플레이트(Nunc #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I] -항원을 목적하는(예를 들어, 문헌[Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599]에서 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치하는) Fab의 연속 희석물과 혼합한다. 목적하는 Fab는 이어서 밤새 항온처리하지만; 상기 항온처리는 보다 오랜 기간 동안 계속(예를 들어, 65시간) 하여 평형에 확실히 도달하도록 한다. 이후, 상기 혼합물은 실온에서 항온처리(예를 들어, 1시간 동안)를 위해 포획 플레이트로 이전시킨다. 이어서, 상기 용액을 제거하고 플레이트는 PBS 중에서 0.1% Tween-20으로 8회 세척하였다. 플레이트가 건조된 경우, 150 ㎕/웰의 신틸란트(MicroScint-20; Packard)를 첨가하고 플레이트는 10분 동안 탑카운트 감마 카운터(Packard) 상에서 계수한다. 20% 이하의 최대 결합을 부여하는 각각의 Fab의 농도는 경쟁 결합 검정에 사용하기 위해 선택한다. 또 다른 양태에 따라, Kd 또는 Kd 값은 약 10 반응 유니트(RU)에서 고정화된 항원 CM5 칩과 함께 25℃에서 BIAcore™-2000 또는 BIAcore™-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.)을 사용하는 표면 플라스몬 공명 검정을 사용하여 측정한다. 간략하게, 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, BIAcore Inc.)은 공급업체의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원은 커플링된 단백질의 대략 10 반응 유니트(RU)를 성취하기 위해 5 ㎕/분의 유속으로 주사하기 전에 10mM 나트륨 아세테이트 (pH 4.8)를 사용하여 5 ㎍/ml(~ 0.2 μM)로 희석시킨다. 항원 주사 후, 1M 에탄올아민을 주사하여 미반응된 그룹을 차단시킨다. 각각의 실험에서, 스팟을 활성화시키고 에탄올아민을 표준 공제를 위해 사용될 고정화 단백질 없이 차단시킨다. 역학적 측정을 위해, 2배-연속 희석물의 Fab(0.78 nM 내지 500 nM)는 대략 25 ㎕/분의 유속으로 25℃에서 0.05% Tween 20(PBST)과 함께 PBS 중에서 주사한다. 결합 속도(kon) 및 해리 속도(koff)는 결합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅함에 의해 단순한 1 대 1 랑무이르 결합 모델(BIAcore Evaluation Software version 3.2)을 사용하여 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 비율 koff/kon로서 계산한다. 예를 들어, 문헌[Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881]을 참조한다. 온-레이트(on-rate)가 상기 표면 플라스몬 공명 검정에 의해 106 M-1s-1을 초과하는 경우, 상기 온-레이트는 분광측정기, 예를 들어, 정지-흐름 장착된 분광측정기(Aviv Instruments) 또는 교반 큐벳을 갖는 8000-시리즈 SLM-Aminco 분광측정기(ThermoSpectronic)와 같은 분광측정기에서 측정된 바와 같은 증가하는 농도의 항원의 존재하에 PBS(pH 7.2)에서 25℃에서 20nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 형광 방출 강도(여기=295 nm; 방출=340 nm, 16 nm 밴드-패스)에서 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 사용함에 의해 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 "온-레이트" 또는 "결합의 속도" 또는 "결합 속도" 또는 "kon"은 또한 약 10 반응 유니트 (RU)에서 고정화된 항원 CM5 칩과 함께 25℃에서 BIAcore™-2000 또는 BIAcore™-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.)을 사용하여 상기된 동일한 표면 플라스몬 공명 기술로 측정될 수 있다. 간략하게, 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, BIAcore Inc.)은 공급업자의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)로 활성화시킨다. 항원은 커플링된 단백질의 대략 10 반응 유니트(RU)를 성취하기 위해 5 ㎕/분의 유속으로 주사 전에 10mM 나트륨 아세테이트(pH 4.8)를 사용하여 5 ㎍/ml(~ 0.2 μM)까지 희석시킨다. 항원 주사 후, 1M 에탄올아민을 주사하여 미반응된 그룹을 차단한다. 역학적 측정을 위해, 2배 연속 희석물의 Fab(0.78 nM 내지 500 nM)을 대략 25 ㎕/분의 유속으로 25℃에서 0.05% Tween 20(PBST)과 함께 PBS 중에서 주사한다. 결합 속도(kon) 및 해리 속도(koff)는 결합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅함에 의해 단순한 1 대 1 랑무이르 결합 모델(BIAcore Evaluation Software version 3.2)을 사용하여 계산한다. 평형 해리 상수(Kd)는 비율 koff/kon로서 계산하였다. 예를 들어, 문헌[Chen, Y., et al., (1999)J. Mol Biol 293:865-881]을 참조한다. 그러나, 온-레이트가 상기 표면 플라스몬 공명 검정에 의해 106 M-1s-1을 초과하는 경우, 상기 온-레이트는 정지-흐름 장착된 분광측정기(Aviv Instruments) 또는 교반 큐벳을 갖는 8000-시리즈 SLM-Aminco 분광측정기(ThermoSpectronic)와 같은 분광측정기에서 측정된 바와 같은 증가하는 농도의 항원의 존재하에 PBS(pH 7.2)에서 25℃에서 20nM 항-항원 항체(Fab 형태)의 형광 방출 강도(여기=295 nm; 방출=340 nm, 16 nm 밴드-패스)에서의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 사용함에 의해 측정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 이것이 연결되어 있는 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 언급한다. 한 가지 타입의 벡터는 여기에 추가의 DNA 분절이 연결될 수 있는 환형 이중 가닥 DNA 루프를 언급하는 "플라스미드"이다. 또 다른 타입의 벡터는 파아지 벡터이다. 또 다른 타입의 벡터는 바이러스 벡터이고, 여기서, 추가의 DNA 분절은 바이러스 게놈에 연결될 수 있다. 특정 벡터는 이들이 도입된 숙주 세포에서 자가 복제(예를 들어, 세균 복제 오리진을 갖는 세균 벡터 및 에피좀 포유동물 벡터)할 수 있다. 다른 벡터(예를 들어, 비-에피좀 포유동물 벡터)는 숙주 세포로의 도입시 숙주 세포의 게놈으로 통합될 수 있고 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 특정 벡터는 이들이 작동적으로 연결된 유전자들의 발현을 지시할 수 있다. 상기 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 단순히 "재조합 벡터")로서 언급된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 활용되는 발현 벡터는 흔히 플라스미드 형태이다. 본원 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 가장 통상적으로 사용되는 형태의 벡터이므로 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본원에 상호교환적으로 사용된 바와 같은 "폴리누클레오타이드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 누클레오타이드 폴리머를 언급하고 DNA 및 RNA를 포함한다. 누클레오타이드는 데옥시리보누클레오타이드, 리보누클레오타이드, 변형된 누클레오타이드 또는 염기 및/또는 이들의 유사체 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라아제에 의해 또는 합성 반응에 의해 폴리머로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리누클레오타이드는 변형된 누클레오타이드, 예를 들어, 메틸화된 누클레오타이드 및 이들의 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 누클레오타이드 구조에 대한 변형은 폴리머의 어셈블리 전후에 부여될 수 있다. 누클레오타이드의 서열은 비-누클레오타이드 성분에 의해 비연속적일 수 있다. 폴리누클레오타이드는 예를 들어, 표지와의 접합에 의해 합성 후 추가로 변형될 수 있다. 다른 타입의 변형은 예를 들어, 비하전된 연결(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카바메이트 등)을 갖는 것들 및 하전된 연결(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)을 갖는 것들, 예를 들어, 단백질 (예를 들어, 누클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩티드, ply-L-라이신 등)과 같은 펜던트 잔기를 함유하는 것들, 삽입체 (예를 들어, 아크리딘, 프소랄렌 등)를 갖는 것들, 킬레이터(예를 들어, 금속, 방사성활성 금속, 붕소, 산화 금속 등)를 함유하는 것들, 알킬레이터를 함유하는 것들, 변형된 연결 (예를 들어, 알파 아노머 핵산 등)을 갖는 것들, 및 비변형된 형태의 폴리누클레오타이드(들)과 같은 유사체로서 누클레오타이드간 변형을 갖는 하나 이상의 천연의 누클레오타이드의 "캡" 치환을 포함한다. 추가로, 당에 통상적으로 존재하는 임의의 하이드록실 그룹은 예를 들어, 포스포네이트 그룹, 포스페이트 그룹에 의해 대체될 수 있거나 표준 보호 그룹에 의해 보호되거나 추가의 누클레오타이드로의 추가의 연결체를 제조하기 위해 활성화되거나 고체 또는 반-고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 인산화되거나 아민 또는 1 내지 20개의 탄소 원자의 유기 캡핑 그룹 잔기로 치환될 수 있다. 다른 하이드록실은 또한 표준 보호 그룹으로 유도체화될 수 있다. 폴리누클레오타이드는 또한 예를 들어, 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카복실릭 당 유사체, α-아노머 당, 에피머 당, 예를 들어, 아라비노스, 크실로스 또는 리속스, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 아실 유사체 및 염기성 누클레오사이드 유사체, 예를 들어, 메틸리보사이드를 포함하는 당업계에 일반적으로 공지된 유사 형태의 리보스 또는 데옥시리보스 당을 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포디에스테르 연결체는 또 다른 연결 그룹에 의해 대체될 수 있다. 이들 또 다른 연결 그룹은 포스페이트가 P(0)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), "(0)NR2 ("아미데이트"), P(0)R, P(0)OR', CO 또는 CH2 ("포르마세탈")로 대체되거나, 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H이거나 임의로 에테르(-O-) 연결체를 함유하는 치환되거나 비치환된 알킬(1-20C), 아릴, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐 또는 아르알딜인, 양태를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 폴리누클레오타이드에서 모든 연결체가 동일할 필요는 없다. 이전의 기재는 RNA 및 DNA를 포함하는 본원에 언급된 모든 폴리누클레오타이드에 적용된다.
본원에 사용된 바와 같은 "올리고누클레오타이드"는 일반적으로 짧은, 일반적으로 반드시 그럴 필요는 없지만 길이가 약 200개 미만의 누클레오타이드인 일반적으로 단일 가닥의 일반적으로 합성 폴리누클레오타이드를 언급한다. 상기 용어 "올리고누클레오타이드" 및 "폴리누클레오타이드"는 상호적으로 배타적이지 않다. 폴리누클레오타이드에 대한 상기 기재는 균등하게 그리고 완전하게 올리고누클레오타이드에 적용될 수 있다.
"항체"(Ab) 및 "면역글로불린"(Ig)은 동일한 구조적 특성을 갖는 당단백질이다. 항체는 특이적 항원에 대해 결합 특이성을 나타내면서, 면역글로불린은 항체, 및 일반적으로 항원 특이성이 없는 다른 항체 유사 분자 둘 다를 포함한다. 후자 종류의 폴리펩티드는 예를 들어, 림프계에 의해 낮은 수준으로 생성되고 골수종에 의해 증가된 수준으로 생성된다.
용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 가장 광범위한 의미에서 상호교환적으로 사용되고 모노클로날 항체 (예를 들어, 완전한 길이 또는 온전한 모노클로날 항체), 폴리클로날 항체, 1가, 다가 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이들이 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이중특이적 항체)를 포함하고 또한 특정 항체 단편(본원에서 보다 상세하게 기재된 바와 같이)을 포함할 수 있다. 항체는 키메라, 인간, 인간화된 및/또는 친화성 성숙된 것일 수 있다.
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 언급한다. 이들 도메인은 일반적으로 항체의 가장 가변 부분이고 항원 결합 부위를 함유한다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체 중 서열내에서 매우 상이하고 이의 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다는 사실을 언급한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인에 걸쳐 균등하게 분포되어 있지 않다. 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 내 둘 다에서 상보성-결정 영역(CDR) 또는 초가변 영역으로 불리우는 3개의 분절에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크(FR)로 불리운다. 천연 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인은 루프 연결을 형성하고 일부 경우에 베타-시트 구조의 일부를 형성하는, 3개의 CDR에 의해 연결된 베타-시트 형태를 대부분 채택하는 4개의 FR 영역을 포함한다. 각각의 쇄에서 CDR은 FR 영역에 의해 가깝게 인접하게 함께 연결되어 있고 다른 쇄로부터의 CDR과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (문헌참조: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)). 불변 도메인은 항체가 항원에 결합하는데 직접 관여하지 않지만 다양한 이펙터 기능, 예를 들어, 항체-의존성 세포 독성에서 항체의 관여를 나타낸다.
항체의 파파인 분해는 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 "Fab" 단편으로 불리우는 2개의 동일한 항원-결합 단편, 및 이의 이름이 용이하게 결정화하는 이의 능력을 반영하는 잔여 "Fc" 단편을 생성시킨다. 펩신 처리는 2개의 항원-조합 부위를 갖고 여전히 항원과 가교-결합할 수 있는 F(ab')2 단편을 생성시킨다.
"Fv"는 완전한 항원-인지 및 -결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 2개의 쇄 Fv 종에서, 상기 영역은 단단한 비-공유 결합된 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 단일쇄 Fv 종에서, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인은 유연성 펩티드 링커에 의해 공유적으로 연결되어 상기 경쇄 및 중쇄는 2개의 쇄 Fv 종의 구조와 유사한 "이량체" 구조로 연합할 수 있다. 상기 형태에서, 각각의 가변 도메인의 3개의 CDR은 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상에서 항원-결합 부위를 한정한다. 총체적으로, 6개의 CDR은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 반쪽)도 전체 결합 부위 보다는 낮은 친화성이지만 항원을 인지하고 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역 기원의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에 여러 잔기들이 첨가되어 Fab 단편과는 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리된 티올 기를 함유하는 Fab'에 대한 본원의 지칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래에 이들 간에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편들의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.
임의의 척추동물 종 기원의 항체의 "경쇄"(면역글로불린)는 이들의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 소위 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리우는 2개의 명백히 구분되는 타입 중 하나에 할당될 수 있다.
이들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 의존하여, 항체 (면역글로불린)는 상이한 부류에 할당될 수 있다. 5개의 주요 부류의 면역글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있고, 이들 중 여러개는 서브부류(이소형), 예를 들어, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 호칭된다. 상이한 부류의 면역글로불린의 서브유니트 구조 및 3차원 형태는 널리 공지되어 있고 일반적으로 예를 들어, 문헌[참조: Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (2000)]에 기재되어 있다. 항체는 항체와 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티드의 공유 또는 비-공유 결합에 의해 형성된 보다 큰 융합 분자의 일부일 수 있다.
용어 "전장 항체", "온전한 항체" 및 "전체 항체"는 하기 정의된 바와 같은 항체 단편이 아닌 본원에서 이의 실질적으로 온전한 형태의 항체를 언급하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는 특히, Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 언급한다.
"항체 단편"은 온전한 항체의 일부만을 포함하고, 여기서, 상기 일부는 온전한 항체내 존재하는 경우 상기 부분과 정상적으로 관련된 기능들의 적어도 하나 및 대부분의 많은 또는 모든 기능들을 보유한다. 일 구현예에서, 항체 단편은 온전한 항체의 항원 결합 부위를 포함하고 따라서 항원에 결합하는 능력을 보유한다. 또 다른 구현예에서, 항체 단편, 예를 들어, Fc 영역을 포함하는 단편은 온전한 항체에 존재하는 경우 Fc 영역과 정상적으로 관련된 생물학적 기능들, 예를 들어, FcRn 결합, 항체 반감기 조절, ADCC 기능 및 보체 결합 중 적어도 하나를 보유한다. 일 구현예에서, 항체 단편은 온전한 항체와 실질적으로 유사한 생체내 반감기를 갖는 1가 항체이다. 예를 들어, 상기 항체 단편은 상기 단편에 생체내 안정성을 부여할 수 있는 Fc 서열에 결합된 항원 결합 아암을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균일한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 언급하고, 즉, 상기 집단을 포함하는 개별 항체들은 최소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 변형어 "모노클로날"은 구분되는 항체의 혼합물이 아닌 항체의 특성을 지적한다. 상기 모노클로날 항체는 통상적으로 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하고, 여기서, 상기 표적-결합 폴리펩티드 서열은 다수의 폴리펩티드 서열로부터 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열의 선택을 포함하는 공정에 의해 수득되었다. 예를 들어, 상기 선택 공정은 하이브리도마 클론, 파아지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀과 같은 다수의 클론으로부터 유일한 클론의 선택일 수 있다. 상기 선택된 표적 결합 서열은 예를 들어, 표적에 대한 친화력을 개선시키고, 상기 표적 결합 서열을 인간화시키고, 세포 배양에서 이의 생성을 개선시키고, 이의 생체내 면역원성을 감소시키고, 다중특이적 항체를 제조하기 위해서 등을 위해 추가로 변형될 수 있고 상기 변형된 표적 결합 서열을 포함하는 항체는 또한 본 발명의 모노클로날 항체인 것으로 이해되어야만 한다. 상이한 결정인자 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 통상적으로 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 대조적으로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원상의 단일 결정인자에 대해 지시된다. 이들의 특이성 뿐만 아니라, 모노클로날 항체 제제는 이들이 통상적으로 다른 면역글로불린에 의해 오염되어 있지 않다는 점에서 유리하다. 변형어 "모노클로날"은 실질적으로 균일한 항체 집단으로부터 수득된 것으로서 항체의 특성을 지적하고 임의의 특정 방법에 의해 항체의 생성을 요구하는 것으로서 해석되지 말아야한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 예를 들어, 하이브리도마 방법(문헌참조: 예를 들어, Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), 재조합 DNA 방법(문헌참조: 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호), 파아지 디스플레이 기술(문헌참조: 예를 들어, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al, J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); and Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)), 및 인간 면역글로불린 서열을 암호화하는 인간 면역글로불린 유전자좌 또는 유전자들의 일부 또는 모두를 갖는, 동물에서의 인간 또는 인간형 항체를 제조하기 위한 기술(문헌참조: 예를 들어, W098/24893; WO96/34096; W096/33735; WO91/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); U.S. Pat. Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016; Marks et al., Bio. Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851(1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996) and Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995))을 포함하는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
본원에서 모노클로날 항체는 구체적으로 "키메라" 항체, 및 이들이 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 상기 항체의 단편을 포함하고, 여기서, 중쇄 및/또는 경쇄 부분은 특정 종으로부터 유래된 항체에서 또는 특정 항체 부류 또는 서브부류에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 이와 유사하지만 쇄(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유래된 항체 또는 또 다른 항체 부류 또는 서브클래스에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 유사하다 (미국 특허 제4,816,567; 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).
"인간화된" 형태의 비-인간(예를 들어, 쥐) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 일 구현예에서, 인간화된 항체는 인간 면역글로불린(수용자 항체)이고, 여기서, 수용자의 초가변 영역 기원의 잔기는 목적하는 특이성, 친화성 및/또는 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비-인간 종(공여자 항체)의 초가변 영역 기원의 잔기에 의해 대체된다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 추가로, 인간화된 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 수행능을 추가로 개선하기 위해 수행된다. 일반적으로, 인간화된 항체는 실질적으로 적어도 하나, 및 통상적으로 2개의 가변 도메인 모두를 포함하고, 여기서, 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린의 루프에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 루프이다. 상기 인간화된 항체는 임의로 또한 통상적으로 인간 면역글로불린의 것인 면역글로불린 불면 영역(Fc)의 적어도 일부를 포함한다. 추가의 세부사항에 대해, 문헌[Jones et al., Nature 321 :522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다. 또한 하기의 검토 문헌 및 참조문헌을 참조한다: Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23: 1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994).
본원에 사용되는 경우 용어 "초가변 영역", "HVR", 또는 "HV"는 서열에서 초가변적이고/이거나 구조적으로 한정된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 언급한다. 일반적으로, 항체는 6개의 초가변 영역; VH 내 3개(H1, H2, H3), 및 VL내 3개(LI, L2, L3)를 포함한다. 다수의 초가변 영역 도해가 사용중에 있고 본원에 포함된다. 캐뱃(Kabat) 상보성 결정 영역(CDR)은 서열 가변성을 기초로 하고 가장 공통적으로 사용된다 (문헌참조: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). 초티아(Chothia)는 대신 구조적 루프의 위치를 언급한다 (문헌 참조: Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). AbM 초가변 영역은 캐뱃 CDR과 초티아 구조 루프 간의 절충사항을 나타내고 옥스포드 분자 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다. "접촉" 초가변 영역은 허용가능한 복합체 결정 구조의 분석을 기준으로 한다. 이들 초가변 영역 각각으로부터 기원하는 잔기는 하기에 나타낸다.
루프 캐뱃 AbM 초티아 접촉
L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B
(캐뱃 넘버링)
H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35
(초티아 넘버링)
H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
초가변 영역은 다음과 같이 "연장된 초가변 영역"을 포함할 수 있다: VL내 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 50-56 또는 49-56 (L2) 및 89-97 또는 89-96 (L3) 및 VH 내 26-35 (H1), 50-65 또는 49-65 (H2) 및 93-102, 94-102, 또는 95-102 (H3). 가변 도메인 잔기는 이들 정의 각각에 대해 상기 캐뱃 등에 따라 넘버링된다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 바와 같은 초가변 영역이 아닌 다른 상기 가변 도메인 잔기들이다.
용어 "캐뱃에서와 같은 가변 도메인 잔기 넘버링" 또는 "캐뱃에서와 같은 아미노산 위치 넘버링" 및 이의 변형은 문헌[참조: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에서의 항체의 컴파일링의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인을 위해 사용되는 넘버링 시스템을 언급한다. 상기 넘버링 시스템을 사용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 단축 또는 여기로의 삽입에 상응하는 소수 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 이후 단일 아미노산 삽입(캐뱃에 따르면 잔기 52a) 및 중쇄 FR 잔기 82 이후 삽입된 잔기 (예를 들어, 캐뱃에 따르면 잔기 82a, 82b, 및 82c 등)을 포함할 수 있다. 잔기의 캐뱃 넘버링은 항체의 서열의 상동성 영역에서 "표준" 캐뱃 넘버링된 서열과 정렬시킴에 의해 소정의 항체에 대해 결정될 수 있다.
"단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄내에 존재한다. 일반적으로, scFv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성하게 하는 VH 및 VL 도메인 간의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 검토를 위해, 문헌[ Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.
용어 "디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 언급하고 상기 단편들은 동일한 폴리펩티드 쇄(VH-VL)에서 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 동일한 쇄 상에서 2개의 도메인 간에 쌍 형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함에 의해, 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 형성하여 2개의 항원-결합 부위를 생성하도록 강제된다. 디아바디는 예를 들어, 문헌[EP 404,097; W093/1161; 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]에 보다 완전하게 기재되어 있다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체의 것과 상응하는 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖고/갖거나 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체를 제조하기 위한 임의의 기술을 사용하여 제조된 항체이다. 상기 인간 항체의 정의는 구체적으로 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 배제한다.
"친화성 성숙된" 항체는 변형(들)을 갖지 않는 모 항체와 비교하여 항원에 대한 항체의 친화성을 개선시키는 하나 이상의 HVR에서 하나 이상의 변형을 갖는 항체이다. 일 구현예에서, 친화성 성숙된 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어 피코몰 친화성을 갖는다. 친화성 성숙된 항체는 당업계에 공지된 과정에 의해 생성된다. 문헌[Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992)]은 VH 및 VL 도메인 셔플링에 의한 친화성 성숙화를 기재하고 있다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이화는 문헌[참조: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); and Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)]에 기재되어 있다.
"블록킹" 항체 또는 "길항제" 항체는 이것이 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 항체이다. 특정 블록킹 항체 또는 길항제 항체는 실질적으로 또는 완전하게 항원의 생물학적 활성을 억제한다.
본원에 사용된 바와 같은 "효능제 항체"는 목적하는 폴리펩티드의 기능적 활성 중 적어도 하나를 모방하는 항체이다.
"장애"는 본 발명의 항체를 사용한 치료로부터 이득을 얻는 임의의 병태이다. 이것은 포유동물이 미지의 장애에 대한 성향을 갖는 병리학적 병태들을 포함하는 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다. 본원에서 치료될 장애의 비제한적인 예는 암을 포함한다.
용어 "세포 증식성 장애" 및 "증식성 장애"는 일부 정도의 비정상적 세포 증식과 관련된 장애를 언급한다. 하나의 양태에서, 세포 증식성 장애는 암이다.
본원에 사용된 바와 같은 "종양"은 악성이든 양성이든 모든 신생물 세포 성장 및 증식을 언급하고 모든 예비-암성 및 암성 세포 및 조직을 언급한다. 용어 "암", "암성", "세포 증식 장애", "증식성 장애" 및 "종양"은 본원에 언급된 바와 같이 상호 배타적이지 않다.
용어 "암" 및 "암성"은 통상적으로 비조절된 세포 성장/증식을 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 병태를 언급하거나 기재한다. 암의 예는 암종, 림프종(예를 들어, 호지킨 및 비-호지킨 림프종), 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 상기 암의 보다 특정 예는 편평 세포 암, 소세포 폐 암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평 세포 암종, 배막의 암, 간세포 암, 위장암, 췌장암, 교모세포종, 자궁암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁암종, 침샘 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간암종, 백혈병 및 다른 림프증식성 장애 및 다양한 타입의 두경부암을 포함한다.
용어 "근육 장애(muscular disorder)"는 정상 근육 기능이 현저하게 감소되도록 골격 및/또는 평활근의 퇴화 또는 약화에 의해 통상적으로 특징되는 근육-함유 동물의 생리학적 조건을 지칭하거나 이를 기술한다. 근육 장애의 예는 근육위축병, 다발성 경화증, 근위측성 측상 경화증, 이삭 증후군; 강직인간 증후군; 가족성 주기성 사지마비, 근육병증, 근긴장, 횡문근융해, 근 위축증, 및 다양한 타입의 근력저하 및 근경직을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
용어 "글로보계열-관련 장애"는 통상적으로 경로의 비정상적인 기능화 또는 제시에 의해 특징되거나 이에 의해 기여되는 장애를 기술하는 것으로 지칭된다. 이러한 장애의 예는 암을 포함하는 과증식성 질병을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
용어 "신경 장애" 또는 "신경 질병"은 통상적으로 신경 조직의 퇴화 또는 신경 조직에서의 세포들 간의 소통의 퇴화에 의해 특징되는 포유동물에서 중추신경계 및/또는 말초신경계의 질병 또는 장애를 지칭하거나 이를 기술하는 것이다. 신경 장애의 예는 신경퇴행성 질병(루이소체 질병(Lewy body disease), 척수신경마비성 회백수염 증후군(postpoliomyelitis syndrome), 샤이-드레거 증후군(Shy-Draeger syndrome), 올리브교소뇌위축(olivopontocerebellar atrophy), 파킨슨병, 다계통 위축, 선상체흑질 변성증을 포함하지만, 이로 제한되지 않음), 타우병증(tauopathies)(알츠하이머병 및 핵상마비를 포함하지만, 이로 제한되지 않음), 프리온 질병(소해면상뇌병증, 스크래피(scrapie), 크로이츠펠트-야콥 증후군((reutzfeldt-Jakob syndrome), 쿠르병(kuru), 게르스트만-슈트라우슬러-샤인커병(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease), 만성 소모성 질병 및 치명적 가족성 불면증을 포함하지만, 이로 제한되지 않음), 연수 마비, 운동 신경세포 질병, 및 신경계 헤테로퇴행성 장애(카나반 질병, 헝팅턴 질병, 신경원성 세로이드 리포푸신증, 알렉산더 질병, 투렛 증후군, 멘키스 곱슬머리 증후군(Menkes kinky hair syndrome), 코케인 증후군(Cockayne syndrome), 할러보든-슈파쯔 증후군(Halervorden-Spatz syndrome), 라포라 증후군, 레트 증후군, 간렌즈핵변성증(hepatolenticular degeneration), 레시나이헌 증후군(Lesch-Nyhan syndrome), 및 운베리히트-룬드보그 증후군(Unverricht-Lundborg syndrome)을 포함하지만, 이로 제한되지 않음), 치매(픽 질병, 및 척수소뇌실조증을 포함하지만, 이로 제한되지 않음)를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
용어 "염증 장애" 및 "면역 장애"는 비정상적인 면역학적 메카니즘 및/또는 비정상적인 시토카인 신호전달에 의해 야기된 장애를 지칭하거나 기술한다. 염증 및 면역 장애의 예는 자기면역 질병, 면역학적 결핍 증후군, 및 과민증을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 본원에서 "자기면역 질병"은 개체의 조직으로부터 발생하고 이에 대해 지향되는 비-악성 질병 또는 질환이다. 본원에서 자가면역 질병은 상세하게, 악성 또는 암성 질병 또는 질환을 배재하고, 특히, B 세포 림프종, 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 모발 세포 백혈병 및 만성 골수모구 백혈병을 배제한다. 자가면역 질병 또는 장애의 예는 염증 반응, 예를 들어, 건선 및 피부염(예를 들어, 아토피성 피부염)을 포함하는 염증 피부 질병; 전신 경피증 및 경화증; 염증성 장 질병과 관련된 반응(예를 들어, 크론씨병 및 궤양성 대장염); 호흡곤란 증후군(성인 호흡곤란 증후군; ARDS를 포함함); 피부염; 수막염; 뇌염; 포도막염; 대장염; 사구체 신염; 알레르기성 질환, 예를 들어, 습진 및 천식 및 T 세포의 침입 및 만성 염증 반응을 수반하는 다른 질환들; 아테롬성 동맥경화증; 백혈구 부착 결핍증; 류머티스성 관절염; 전신 홍반성 낭창(SLE)(홍반성 신염, 피부 낭창을 포함하지만, 이로 제한되지 않음); 진성 당뇨병(예를 들어, 제I형 진성 당뇨병 또는 인슐린 의존 진성 당뇨병); 다발성 경화증; 레이노이드 증후군; 자가면역 갑상선염; 하시모토 갑상선염; 알레르기성 뇌척수염; 쇼그렌 증후군; 소아 당뇨병; 및 폐결핵, 유육종증, 다발근육염, 육아종증 및 맥관염에서 통상적으로 발견되는 시토카인 및 T-림프구에 의해 매개된 급성 및 지연 과민증과 관련된 면역 반응; 악성 빈혈(애디슨 질병); 백혈구 유출을 수반하는 질병; 중추신경계(CNS) 염증 장애; 다중 장기 손상 증후군; 용혈성 빈혈(한랭글로불린혈증 또는 쿰 양성 빈혈(Coombs positive anemia)을 포함하지만 이로 제한되지 않음); 중중근무력증; 항원-항체 복합체 매개된 질병; 항-사구체 기저막 질병; 항인지질 증후군; 알레르기 신경염; 그레이브스병; 중증근무력증후군(Lambert-Eaton myasthenic syndrome); 수포성 유천포창(pemphigoid bullous); 천포창; 자가면역 다발성 신경병증; 라이터병; 근강직 증후군(stiff-man syndrome); 베체트 질병(Behcet disease); 거대 세포 동맥염(giant cell arteritis); 면역 복합 신염; IgA 신장병; IgM 다발성신경병증; 면역성 저혈소판 자반증(ITP) 또는 자가면역 혈소판감소증, 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
면역 결핍 증후군의 예는 혈관확장성 운동실조증(ataxia telangiectasia), 백혈구-접합 결핍 증후군(leukocyte-adhesion deficiency syndrome), 림프구 감소증, 이상면역글로불린혈증(dysgammaglobulinemia), HIV 또는 델타레트로바이러스 감염증(deltaretrovirus infection), 공통 가변 면역결핍증(common variable immunodeficiency), 중증 복합형 면역결핍증(severe combined immunodeficiency), 포식세포 살균 기능장애(phagocyte bactericidal dysfunction), 무감마글로불린혈증(agammaglobulinemia), 디조지 증후군(DiGeorge syndrome), 및 비스코트-올드리치 증후군(Wiskott-Aldrich syndrome)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 과민증의 예는 알레르기, 천식, 피부염, 두드러기, 아나필락시스, 위슬러 증후군(Wissler's syndrome), 및 혈소판감소성 자반병(thrombocytopenic purpura)를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 "치료"는 치료받는 개체 또는 세포의 천연 과정을 변형시키는 시도에서의 임상적 중재를 언급하고 임상적 병리의 예방 또는 과정 동안에 수행될 수 있다. 치료의 목적하는 효과는 질환의 발병 또는 재발의 방지, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적이거나 간접적인 병리학적 결과의 감소, 염증 및/또는 조직/기관 손상을 예방하거나 감소시키거나, 질환 진행율을 감소시키거나, 질환 상태를 개선 또는 완화시키고 예후의 개선 또는 차도를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 질환 또는 장애의 발병을 지연시키기 위해 사용된다.
"개체" 또는 "피검체"는 척추동물이다. 특정 구현예에서, 척추동물은 포유동물이다. 포유동물은 농장 동물(예를 들어, 소), 스포츠 동물, 애완동물(예를 들어, 고양이, 개 및 말), 영장류, 마우스 및 랫트를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 양태에서, 척추동물은 인간이다.
치료 목적을 위한 "포유동물"은 인간, 가정용 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예를 들어, 개, 말, 고양이, 소 등을 포함하는 포유동물로서 분류되는 임의의 동물을 언급한다. 특정 구현예에서, 포유동물은 인간이다.
"유효량"은 목적하는 치료학적 또는 예방학적 결과를 성취하기 위해 필요한 기간 동안 및 투여에서 효과적인 양을 언급한다.
본 발명의 물질/분자의 "치료학적 유효량"은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중 및 상기 개체에서 목적하는 반응을 유발하는 물질/분자의 능력과 같은 인자들에 따라 다양할 수 있다. 치료학적 유효량은 또한 치료학적으로 이로운 효과가 물질/분자의 임의의 독성 또는 해로운 효과를 능가하는 양이다. "예방학적 유효량"은 목적하는 예방학적 결과를 성취하기 위해 필요한 기간 동안 및 용량에서 효과적인 양을 언급한다. 전형적이지만 반드시 그럴 필요가 없이, 예방학적 용량은 질환의 발병 전 또는 조기 단계에서 대상체에 사용되기 때문에, 예방학적 유효량은 치료학적 유효량 미만이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제하거나 예방하고/하거나 세포의 파괴를 유발하는 물질을 언급한다. 상기 용어는 방사능활성 동위원소(예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사능활성 동위원소), 화학치료학적 제제(예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포사이드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입 제제, 효소 및 이의 단편, 예를 들어, 핵산용해 효소, 항생제 및 독소, 예를 들어, 소분자 독소 또는 이의 단편 및/또는 변이체를 포함하는 세균, 진균류, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소, 및 하기에서 논의되는 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함하는 것으로 의도된다. 다른 세포독성제는 하기에 기재된다. 종양살생제는 종양 세포의 파괴를 유발한다.
"화학치료학적 제제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학치료학적 제제의 예는 티오테파 및 CYTOXAN® 사이클로포스파미드와 같은 알킬화제; 부설판, 임프로설판 및 피포설판과 같은 알킬 설포네이트; 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파 및 우레도파와 같은 아지리딘; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸롤로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 아세토게닌스(특히, 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라하이드로카나비놀 (드로나비놀, MARINOL®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜키신; 베툴린산; 캄프토테신(합성 유사체 토포테칸 (HYC AMTIN®), CPT-11 (이리노테칸, CAMPTOSAR®), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴 및 9-아미노캄프토테신을 포함하는); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (이의 아도젤레신, 카젤레신 및 비젤레신 합성 유사체를 포함하는); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포사이드; 크립토피신(특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1을 포함하는); 엘레우트레오빈; 판크라티스타틴; 사코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예를 들어, 클로람부실, 클로마파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비신, 펜에스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로우레아, 예를 들어, 카무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라니무스틴; 항생제, 예를 들어, 에네디인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 가말 및 칼리케아미신 오메갈 (문헌참조: 예를 들어, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); 디네미신 A를 포함하는 디네미신; 에스페라미신; 및 네오카지노 스타틴 발색단 및 관련 크로모단백질 에네디인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, ADRIAMYCIN® 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시 독소루비신을 포함하는), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예를 들어, 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투버시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물, 예를 들어, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 폴산 유사체, 예를 들어, 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어, 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘; 안드로겐, 예를 들어, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스탄올, 메피티오스탄, 테스톨락톤; 항-아드레날, 예를 들어, 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 첨가액, 예를 들어, 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에니루라실; 아마사크린; 베스트라부실; 비스안트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예를 들어, 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸하이드라지드; 프로카바진; PSK® 폴리사카라이드 복합체 (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); 라족산; 리족신; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테세네스(특히, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신(ELDISINE®, FILDESIN®); 다카바진; 마노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, TAXOL® 파클리탁셀(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE™ 크레모포르-부재, 파클리탁셀의 알부민-가공된 나노입자 제형 (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, 111.), 및 TAXOTERE® 도세탁셀 (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로란부실; 겜시타빈(GEMZAR®); 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예를 들어, 시스플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴(VELBAN®); 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴 (ONCOVIN®); 옥살리플라틴; 류코보빈; 비노렐빈(NAVELBINE®); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸로르니틴(DMFO); 레티노이드, 예를 들어, 레티노산; 카페시타빈 (XELODA®); 상기 중 어느 하나의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체; 및 사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 병용 치료요법을 위한 약어인 CHOP, 및 5-FU 및 류코보빈과 조합된 옥살리플라틴(ELOXATIN™)과의 치료 용법을 위한 약어인 FOLFOX와 같은 상기 중 2개 이상의 병용제를 포함한다.
또한, 상기 정의에는 암의 성장을 촉진할 수 있는 호르몬의 효과를 조절하거나 [0315] 감소시키거나 차단하거나 억제하는 작용을 하고, 종종 전신 또는 신체-전반 치료의 형태인 항호르몬제도 포함된다. 이들은 그 자체가 호르몬일 수 있다. 그의 예는, 항에스트로겐 및 선택적인 에스트로겐 수용체 조절제 (SERM), 예를 들어 타목시펜 (예를 들어, 놀바덱스(NOLVADEX)® 타목시펜), 에비스타(EVISTA)® 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 파레스톤(FARESTON)® 토레미펜; 항프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향-조절제 (ERD); 난소를 저해하거나 또는 그의 기능을 정지시키는 기능을 하는 작용제, 예를 들어 황체화 호르몬-방출 호르몬 (LHRH) 효능제, 예컨대 루프론(LUPRON)® 및 엘리가드(ELIGARD)® 류프롤리드 아세테이트, 고세렐린 아세테이트, 부세렐린 아세테이트 및 트리프테렐린; 다른 항안드로겐, 예컨대 플루타미드, 닐루타미드 및 비칼루타미드; 및 부신에서 에스트로겐 생산을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예를 들어, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메가세(MEGASE)® 메게스트롤 아세테이트, 아로마신(AROMASIN)® 엑세메스탄, 포르메스타니, 파드로졸, 리비소르(RIVISOR)® 보로졸, 페마라(FEMARA)® 레트로졸 및 아리미덱스(ARIMIDEX)® 아나스트로졸을 포함한다. 또한, 화학요법제의 이러한 정의는 비스포스포네이트, 예를 들어, 클로드로네이트 (예를 들어, 보네포스(BONEFOS)® 또는 오스탁(OSTAC)®), 디드로칼(DIDROCAL)® 에티드로네이트, NE-58095, 조메타(ZOMETA)® 졸레드론산/졸레드로네이트, 포사막스(FOSAMAX)® 알렌드로네이트, 아레디아(AREDIA)® 파미드로네이트, 스켈리드(SKELID)® 틸루드로네이트 또는 악토넬(ACTONEL)® 리세드로네이트; 뿐만 아니라 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 누클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고누클레오티드, 특히 이상 세포 증식에 연루된 신호전달 경으로 중의 유전자의 발현을 억제하는 것, 예컨대 예를 들어 PKC-알파, Raf, H-Ras 및 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R); 백신, 예컨대 테라토프(THERATOPE)® 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들어 알로벡틴(ALLOVECTIN)® 백신, 류벡틴(LEUVECTIN)® 백신 및 백시드(VAXID)® 백신; 루르토테칸(LURTOTECAN)® 토포이소머라제 1 억제제; 아바렐릭스(ABARELIX)® rmRH; 라파티닙 디토실레이트 (GW572016이라고도 공지된, ErbB-2 및 EGFR 이중 티로신 키나제 소분자 억제제); 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 이제 설명된다. 본 명세서에 구체적으로 언급된 모든 간행물 및 특허는 본 발명과 관련하여 사용될 수있는 출판물에 보고된 화학 물질, 세포주, 벡터, 동물, 도구, 통계 분석 및 방법론의 기술 및 개시를 포함하여 모든 목적을 위해 참고 문헌으로 통합된다. 본 명세서에 인용 된 모든 참고 문헌은 당해 기술 분야의 숙련도를 나타내는 것으로 간주된다. 본 발명이 선행 발명에 의해 그러한 개시보다 시기 적절할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되지 않는다.
가장 최근에, 왕(Wong)등은 백신의 면역원성을 개선시키고자 하였는데, 이러한 연구팀은 탄수화물의 환원 단부에 또는 비-환원 단부에 개질을 함유한 다양한 GH-유도체를 합성하였고, 환원 단부에 플루오로, 아지도, 또는 페닐기로 또는 비-환원 단부에 아지도 기로 개질된 GH를 함유한 백신이 GH, SSEA3, 및 SSEA4-타겟화 항체의 생성을 자극할 수 있다는 것을 발견하였으며, 특히 바람직한 높은 IgG:IgM 항체의 비율을 유도하는 후속 백신은 일반적으로 항암 백신에서 달성되지 않는 것이다. 고무적으로, 이러한 백신에 대해 반응하여 생성된 항체는 배양된 GH-양성 인간 유방암 세포에 대한 백신 매개 보체-의존성 세포독성을 매개하였다.
본 발명은 SSEA3 및 SSEA4를 각각 특이적으로 인식하기 위해 단계-특이적 배아 항원(SSEA3 및 SSEA4)의 특정 기로의 개질이 강력한 IgG 항체 반응을 유도하였다는 놀라운 발견을 기초로 한 것이다.
일부 예에서, SSEA-3의 개질은 SSEA-3의 글루코오스의 하나 이상의 위치에 플루오로, 아지도 또는 O-페닐 기를 포함한다. 일부 예에서, SSEA-3의 개질은 비-환원 단부 갈락토오스의 하나 이상의 위치에 플루오로, 아지도 또는 O-페닐 기를 포함한다. 일부 예에서, SSEA-4의 개질은 SSEA-4의 글루코오스의 하나 이상의 위치에 플루오로, 아지도 또는 O-페닐 기를 포함한다. 일부 예에서, SSEA-4의 개질은 시알산 잔기의 하나 이상의 위치에 플루오로, 아지도 또는 O-페닐 기를 포함한다.
본원에는 환원 및/또는 비-환원 단부에 개질을 갖는 SSEA3 및 SSEA4 유도체가 기재되어 있다. 이러한 SSEA3 및 SSEA4 유도체는 천연 SSEA3 및 SSEA4와 비교하여 보다 강력한 면역 반응(예를 들어, SSEA3 및/또는 SSEA4에 대해 IgG 항체의 유도)을 유도할 수 있다. 이러한 비천연 글리칸 모이어티를 포함하는 면역원성 조성물에 의해 유도된 항체는 종양 세포에 대한 보체-의존성 세포독성을 매개할 수 있다.
화합물
이에 따라, 본 발명은 또한, 개질된 탄수화물 항원(SSEA3 및 SSEA4)으로 이루어진 신규한 화합물들, 이를 포함하는 글리칸 콘주게이트, 및 이의 면역원성 조성물 및 백신을 특징으로 한다.
일 양태에서, 본 발명은 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 염을 제공한다:
Figure 112017081613999-pct00008
상기 식에서,
X1은 -OR 또는 -SR이며, 여기서, R은 수소, 산소 또는 황 보호기, 선택적으로 치환된 C1-10 알킬, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 아실, 또는 선택적으로 치환된 이미도일이며;
R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 L의 각 경우는 독립적으로, 수소, 할로겐, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로시클릴, 선택적으로 치환된 아릴, -N3, -N02, -N(RB)2, -N(RA)C(0)RA, -ORA, -OC(0)RA, -SRA, -C(0)N(RB)2, -CN, -C(0)RA, -C(0)ORA, -S(0)RA, -S02RA, -S02N(RB)2, 및 -NHS02RB로부터 선택되며;
RA의 각 경우는 독립적으로, 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로시클릴, 및 선택적으로 치환된 아릴로부터 선택되며;
각 경우의 RB는 독립적으로, 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로시클릴, 및 선택적으로 치환된 아릴로부터 선택되며;
단, 화합물은 하기 화학식은 아니다:
Figure 112017081613999-pct00009
특정 구현예에서, X1은 알파 배치로 존재한다. 특정 구현예에서, X1은 베타 배치로 존재한다.
일부 구현예에서, X1은 -ORA이다. 일부 구현예에서, X1은 -OH이다. 일부 구현예에서, X1은 -0(보호기)이다. 일부 구현예에서, X1은 -ORA이며, 여기서, RA는 비치환된 C1-10 알킬이다. 일부 구현예에서, X1은 -ORA이며, 여기서, RA는 치환된 C1-10 알킬이다. 일부 구현예에서, X1은 -ORA이며, 여기서, RA는 비치환된 아릴이다. 일부 구현예에서, X1은 -ORA이며, 여기서, RA는 치환된 아릴이다. 일부 구현예에서, X1은 -ORA,이며 여기서, RA는 비치환된 아실이다. 일부 구현예에서, X1은 -ORA이며, 여기서, RA는 치환된 아실이다. 일부 구현예에서, X1은 -ORA이며, 여기서, RA는 비치환된 이미도일이다. 일부 구현예에서, X1은 -ORA이며, 여기서, RA는 치환된 이미도일이다.
일부 구현예에서, X1은 -SRA이다. 일부 구현예에서, X1은 -SH이다. 일부 구현예에서, X1은 -S(보호기)이다. 일부 구현예에서, X1은 -SRA이며, 여기서, RA는 비치환된 C1-10 알킬이다. 일부 구현예에서, X1은 -SRA이며, 여기서, RA는 치환된 C1-10 알킬이다. 특정 구현예에서, X1은 -SCH3이다. 일부 구현예에서, X1은 -SRA이며, 여기서, RA는 비치환된 아릴이다. 일부 구현예에서, X1은 -SRA이며, 여기서, RA는 치환된 아릴이다. 일부 구현예에서, X1은 -SRA이며, 여기서, RA는 비치환된 아실이다. 일부 구현예에서, X1은 -SRA이며, 여기서, RA는 치환된 아실이다. 일부 구현예에서, X1은 -SRA이며, 여기서, RA는 비치환된 이미도일이다. 일부 구현예에서, X1은 -SRA이며, 여기서, RA는 치환된 이미도일이다.
일부 구현예에서, X1은 C1 -10 알콕시이다. 일부 구현예에서, X1은 C1-3 알콕시이다. 특정 구현예에서, X1은 메톡시이다. 특정 구현예에서, X1은 알파-메톡시이다.
일부 구현예에서, X1은 알파-티오메틸, 베타-티오메틸, 알파-티오크레실, 베타-티오크레실, 알파-t-부틸디페닐실록시, 베타-t-부틸디페닐실록시, 및 알파-메톡시로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, R1은 -N3 또는 -N(RW)2이며, 여기서, 각 Rw는 독립적으로, 수소 또는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R1은 -N3이다. 특정 구현예에서, R1은 -N(RW)2이며, 여기서, 각 Rw는 독립적으로, 수소 또는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R1은 -NH2이다. 특정 구현예에서, R1은 -NHRW이며, 여기서, Rw는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R1은 -N(RW)2이며, 여기서, 각 RW는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R1은 -N3, -NH(Cbz), -NH(Boc), -NH(Fmoc), -NHC(0)CCl3, -NHC(0)CH3, 및 -N(C(0)CH3)2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, R1은 -NH(Cbz)이다. 특정 구현예에서, R1은 -NH(Fmoc)이다. 특정 구현예에서, R1은 -NHC(0)CCl3이다. 특정 구현예에서, R1은 -NHC(0)CH3이다. 특정 구현예에서, R1은 -N(C(0)CH3)2이다.
일부 구현예에서, R2는 -N3 또는 -N(RW)2이며, 여기서, 각 Rw는 독립적으로, 수소 또는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R2는 -N3이다. 특정 구현예에서, R2는 -N(RW)2이며, 여기서, 각 Rw는 독립적으로, 수소 또는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R2는 -NH2이다. 특정 구현예에서, R2는 -NHRW이며, 여기서, Rw는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R2는 -N(RW)2이며, 여기서, 각 RW는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R2는 -N3, -NH(Cbz), -NH(Boc), -NH(Fmoc), -NHC(0)CCl3, -NHC(0)CH3, 및 -N(C(0)CH3)2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, R2는 -NH(Cbz)이다. 특정 구현예에서, R2는 -NH(Fmoc)이다. 특정 구현예에서, R2는 -NHC(0)CCl3이다. 특정 구현예에서, R2는 -NHC(0)CH3이다. 특정 구현예에서, R2는 -N(C(0)CH3)2이다.
일부 구현예에서, R3은 -N3 또는 -N(RW)2이며, 여기서, 각 Rw는 독립적으로, 수소 또는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R3은 -N3이다. 특정 구현예에서, R3은 -N(RW)2이며, 여기서, 각 Rw는 독립적으로, 수소 또는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R3은 -NH2이다. 특정 구현예에서, R3은 -NHRW이며, 여기서, Rw는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R3은 -N(RW)2이며, 여기서, 각 Rw는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R3은 -N3, -NH(Cbz), -NH(Boc), -NH(Fmoc), -NHC(0)CCl3, -NHC(0)CH3, 및 -N(C(0)CH3)2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, R3은 -NH(Cbz)이다. 특정 구현예에서, R3은 -NH(Fmoc)이다. 특정 구현예에서, R3은 -NHC(0)CCl3이다. 특정 구현예에서, R3은 -NHC(0)CH3이다. 특정 구현예에서, R3은 -N(C(0)CH3)2이다.
일부 구현예에서, R4는 -N3 또는 -N(RW)2이며, 여기서, 각 Rw는 독립적으로, 수소 또는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R4는 -N3이다. 특정 구현예에서, R4는 -N(RW)2이며, 여기서, 각 Rw는 독립적으로, 수소 또는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R4는 -NH2이다. 특정 구현예에서, R4는 -NHRW이며, 여기서, Rw는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R4는 -N(RW)2이며, 여기서, 각 Rw는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R4는 -N3, -NH(Cbz), -NH(Boc), -NH(Fmoc), -NHC(0)CCl3, -NHC(0)CH3, 및 -N(C(0)CH3)2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, R4는 -NH(Cbz)이다. 특정 구현예에서, R4는 -NH(Fmoc)이다. 특정 구현예에서, R4는 -NHC(0)CCl3이다. 특정 구현예에서, R4는 -NHC(0)CH3이다. 특정 구현예에서, R4는 -N(C(0)CH3)2이다.
일부 구현예에서, R5는 -N3 또는 -N(RW)2이며, 여기서, 각 Rw는 독립적으로, 수소 또는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R5는 -N3이다. 특정 구현예에서, R5는 -N(RW)2이며, 여기서, 각 Rw는 독립적으로, 수소 또는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R5는 -NH2이다. 특정 구현예에서, R5는 -NHRW이며, 여기서, Rw는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R5는 -N(RW)2이며, 여기서, 각 Rw는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R5는 -N3, -NH(Cbz), -NH(Boc), -NH(Fmoc), -NHC(0)CCl3, -NHC(0)CH3, 및 -N(C(0)CH3)2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, R5는 -NH(Cbz)이다. 특정 구현예에서, R5는 -NH(Fmoc)이다. 특정 구현예에서, R5는 -NHC(0)CCl3이다. 특정 구현예에서, R5는 -NHC(0)CH3이다. 특정 구현예에서, R5는 -N(C(0)CH3)2이다.
일부 구현예에서, R6은 -N3 또는 -N(RW)2이며, 여기서, 각 Rw는 독립적으로, 수소 또는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R6은 -N3이다. 특정 구현예에서, R6은 -N(RW)2이며, 여기서, 각 Rw는 독립적으로, 수소 또는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R6은 -NH2이다. 특정 구현예에서, R6은 -NHRW이며, 여기서, Rw는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R6은 -N(RW)2이며, 여기서, 각 Rw는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R6은 -N3, -NH(Cbz), -NH(Boc), -NH(Fmoc), -NHC(0)CCl3, -NHC(0)CH3, 및 -N(C(0)CH3)2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, R6은 -NH(Cbz)이다. 특정 구현예에서, R6은 -NH(Fmoc)이다. 특정 구현예에서, R6은 -NHC(0)CCl3이다. 특정 구현예에서, R6은 -NHC(0)CH3이다. 특정 구현예에서, R6은 -N(C(0)CH3)2이다.
일부 구현예에서, R1, R2 및 R3은 동일하다. 일부 구현예에서, R1, R2 및 R3은 -OH이다. 일부 구현예에서, R4, R5 및 R6은 동일하다. 일부 구현예에서, R4, R5 및 R6은 -OH이다.
특정 구현예에서, L은 -OH이다.
특정 구현예에서, L은 -OH이며, R1은 -N3이다. 특정 구현예에서, L은 -OH이며, R1은 -N3이며, 각 경우의 R2, R3, R4, R5 및 R6은 -OH이다.
특정 구현예에서, L은 -OH이며, R2는 -N3이다. 특정 구현예에서, L은 -OH이며, R2는 -N3이며, 각 경우의 R1, R3, R4, R5 및 R6은 -OH이다.
특정 구현예에서, L은 -OH이며, R3은 -N3이다. 특정 구현예에서, L은 -OH이며, R3은 -N3이며, 각 경우의 R1, R2, R4, R5 및 R6은 -OH이다.
특정 구현예에서, L은 -OH이며, R4는 -N3이다. 특정 구현예에서, L은 -OH이며, R4는 -N3이며, 각 경우의 R1, R2, R3, R5 및 R6은 -OH이다.
특정 구현예에서, L은 -OH이며, R5는 -N3이다. 특정 구현예에서, L은 -OH이며, R5는 -N3이며, 각 경우의 R1, R2, R3, R4 은 R6은 -OH이다.
특정 구현예에서, L은 -OH이며, R6은 -N3이다. 특정 구현예에서, L은 -OH이며, R6은 -N3이며, 각 경우의 R1, R2, R3, R4 및 R5는 -OH이다.
특정 구현예에서, 각 경우의 R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 L은 -F이다. 특정 구현예에서, R1은 -F이다. 특정 구현예에서, R2는 -F이다. 특정 구현예에서, R3은 -F이다. 특정 구현예에서, R4는 -F이다. 특정 구현예에서, R5는 -F이다. 특정 구현예에서, R6은 -F이다. 특정 구현예에서, L은 -F이다.
특정 구현예에서, L은 하기 구조를 갖는다:
Figure 112017081613999-pct00010
상기 식에서,
각 경우의 R8, R9, R10 및 R11은 독립적으로, 수소, 할로겐, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로시클릴, 선택적으로 치환된 아릴, -N3, -N02, -N(RB)2, -N(RA)C(0)RA, -ORA, -OC(0)RA, -SRA, -C(0)N(RB)2, -CN, -C(0)RA, -C(0)ORA, -S(0)RA, -S02RA, -S02N(RB)2, 및 -NHS02RB로부터 선택되며;
RN은 -N3, -N02, -N(RB)2, -N(RA)C(0)RA, -ORA, -OC(0)RA, -SRA, -C(0)N(RB)2, -CN, -C(0)RA, -C(0)ORA, -S(0)RA, -S02RA, -S02N(RB)2, 및 -NHS02RB로부터 선택되며;
각 경우의 RA는 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로시클릴, 및 선택적으로 치환된 아릴로부터 선택되며;
각 경우의 RB는 독립적으로, 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로시클릴, 및 선택적으로 치환된 아릴로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 화합물은 하기 화학식 (II)이다:
Figure 112017081613999-pct00011
상기 식에서, R1, R2, R3, R8, R9, R10, R11 및 RN 및 X1은 본원에 기술된 바와 같으며, 단, 화합물은 하기 화학식은 아니다:
Figure 112017081613999-pct00012
일부 구현예에서, R8은 -N3 또는 -N(RW)2이며, 각 R은 독립적으로 수소 또는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R8은 -N3이다. 특정 구현예에서, R8은 -N(RW)2이며, 여기서, 각 Rw는 독립적으로, 수소 또는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R8은 -NH2이다. 특정 구현예에서, R8은 -NHRW이며, 여기서, Rw은 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R8은 -N(RW)2이며, 여기서, 각 Rw는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R8은 -N3, -NH(Cbz), -NH(Boc), -NH(Fmoc), -NHC(0)CCl3, -NHC(0)CH3, 및 -N(C(0)CH3)2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, R8은 -NH(Cbz)이다. 특정 구현예에서, R8은 -NH(Fmoc)이다. 특정 구현예에서, R8은 -NHC(0)CCl3이다. 특정 구현예에서, R8은 -NHC(0)CH3이다. 특정 구현예에서, R8은 -N(C(0)CH3)2이다.
일부 구현예에서, R9는 -N3 또는 -N(RW)2이며, 여기서, 각 Rw는 독립적으로, 수소 또는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R9는 -N3이다. 특정 구현예에서, R9는 -N(RW)2이며, 여기서, 각 Rw는 독립적으로, 수소 또는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R9는 -NH2이다. 특정 구현예에서, R9는 -NHRW이며, 여기서, Rw는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R9는 -N(RW)2이며, 여기서, 각 Rw는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R9는 -N3, -NH(Cbz), -NH(Boc), -NH(Fmoc), -NHC(0)CCl3, -NHC(0)CH3, 및 -N(C(0)CH3)2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, R9는 -NH(Cbz)이다. 특정 구현예에서, R9는 -NH(Fmoc)이다. 특정 구현예에서, R9는 -NHC(0)CCl3이다. 특정 구현예에서, R9는 -NHC(0)CH3이다. 특정 구현예에서, R9는 -N(C(0)CH3)2이다.
일부 구현예에서, R10은 -N3 또는 -N(RW)2이며, 여기서, 각 Rw는 독립적으로, 수소 또는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R10은 -N3이다. 특정 구현예에서, R10은 -N(RW)2이며, 여기서, 각 Rw는 독립적으로, 수소 또는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R10은 -NH2이다. 특정 구현예에서, R10은 -NHRW이며, 여기서, Rw는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R10은 -N(RW)2이며, 여기서, 각 Rw는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R10은 -N3, -NH(Cbz), -NH(Boc), -NH(Fmoc), -NHC(0)CCl3, -NHC(0)CH3, 및 -N(C(0)CH3)2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, R10은 -NH(Cbz)이다. 특정 구현예에서, R10은 -NH(Fmoc)이다. 특정 구현예에서, R10은 -NHC(0)CCl3이다. 특정 구현예에서, R10은 -NHC(0)CH3이다. 특정 구현예에서, R10은 -N(C(0)CH3)2이다.
일부 구현예에서, R11은 -N3 또는 -N(RW)2이며, 여기서, 각 Rw는 독립적으로, 수소 또는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R11은 -N3이다. 특정 구현예에서, R11은 -N(RW)2이며, 여기서, 각 Rw는 독립적으로, 수소 또는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R11은 -NH2이다. 특정 구현예에서, R11은 -NHRW이며, 여기서, RW는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R11은 -N(RW)2이며, 여기서, 각 Rw는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R11은 -N3, -NH(Cbz), -NH(Boc), -NH(Fmoc), -NHC(0)CCl3, -NHC(0)CH3, 및 -N(C(0)CH3)2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, R11은 -NH(Cbz)이다. 특정 구현예에서, R11은 -NH(Fmoc)이다. 특정 구현예에서, R11은 -NHC(0)CCl3이다. 특정 구현예에서, R11은 -NHC(0)CH3이다. 특정 구현예에서, R11은 -N(C(0)CH3)2이다.
일부 구현예에서, R12는 -N3 또는 -N(RW)2이며, 여기서, 각 Rw는 독립적으로, 수소 또는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R12는 -N3이다. 특정 구현예에서, R12는 -N(RW)2이며, 여기서, 각 Rw는 독립적으로, 수소 또는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R12는 -NH2이다. 특정 구현예에서, R12는 -NHRW이며, 여기서, RW는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R12는 -N(RW)2이며, 여기서, 각 Rw는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, R12는 -N3, -NH(Cbz), -NH(Boc), -NH(Fmoc), -NHC(0)CCl3, -NHC(0)CH3, 및 -N(C(0)CH3)2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, R12는 -NH(Cbz)이다. 특정 구현예에서, R12는 -NH(Fmoc)이다. 특정 구현예에서, R12는 -NHC(0)CCl3이다. 특정 구현예에서, R12는 -NHC(0)CH3이다. 특정 구현예에서, R12는 -N(C(0)CH3)2이다.
일부 구현예에서, RN은 -N3 또는 -N(RW)2이며, 여기서, 각 Rw는 독립적으로, 수소 또는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, RN은 -N3이다. 특정 구현예에서, RN은 -N(RW)2이며, 여기서, 각 Rw는 독립적으로, 수소 또는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, RN은 -NH2이다. 특정 구현예에서, RN은 -NHRW이며, 여기서, RW는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, RN은 -N(RW)2이며, 여기서, 각 Rw는 질소 보호기이다. 특정 구현예에서, RN은 -N3, -NH(Cbz), -NH(Boc), -NH(Fmoc), -NHC(0)CCl3, -NHC(0)CH3, 및 -N(C(0)CH3)2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, RN은 -NH(Cbz)이다. 특정 구현예에서, RN은 -NH(Fmoc)이다. 특정 구현예에서, RN은 -NHC(0)CCl3이다. 특정 구현예에서, RN은 -NHC(0)CH3이다. 특정 구현예에서, RN은 -N(C(0)CH3)2이다.
면역원성 조성물(immunogenic composition)
다른 양태에서, 본 발명은 (a) 담체 및 하나 이상의 글리칸을 포함하는 글리칸 콘주게이트, 및 선택적으로 (b) 애주번트를 포함하는 면역원성 조성물을 제공하며,
여기서, 하나 이상의 글리칸 각각은 하기 화학식 (III) 또는 (IV)를 갖는, 링커를 통해 담체와 콘주게이팅된다:
Figure 112017081613999-pct00013
상기 식에서, X1, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R8, R9, R10, R11, L 및 RN은 본원에 기술된 바와 같다.
특정 구현예에서, 링커는 헤테로- 또는 호모-이작용성 링커이다.
특정 구현예에서, 링커는 적어도 하나의 황 원자, 카복실레이트 기, 아미드 기, 카바메이트 기, 카보네이트 기, 티오카바메이트 기, 티오카보네이트 기, 티오에테르 기, 숙신아미드 기, n-하이드록시 숙신아미드 기, 또는 이들의 임의 조합을 포함한다.
특정 구현예에서, 링커는 -L1-L2-이며, 여기서, L1은 결합, -0-, -S-, -NRL1a- -C(=0)-, -NRL1aC(=0)-, -NRL1aC(=0)0-, -C(=0)NRL1a-, -OC(=0)NRL1a-, -SC(=0)-, -C(=0)S-, -OC(=0)-, -C(=0)0-, -NRL1aC(=S)-, -C(=S)NRL1a-, 트랜스-CRL1b=CRL1b-, 시스-CL1b=CRL1b-, -C≡C-, -OC(RL1b)2-, -C(RL1b)20-, -NRL1aC(RL1b)2-, -C(RL1b)2NRL1a-, -SC(RL1b)2-, -C(RL1b)2S-, -S(=0)20-, -OS(=0)2-, -S(=0)2NRL1a-, -NRL1aS(=0)2- 또는 선택적으로 치환된 C1-20 탄화수소 사슬이며, 선택적으로, 여기서, 탄화수소 사슬의 탄소 단위는 -0-, -S-, -NRL1a- -C(=0)-, NRL1aC(=0)-, -NRL1aC(=0)0-, -C(=0)NRL1a-, -OC(=0)NRL1a-, -SC(=0)-, -C(=0)S-, -OC(=0)-, -C(=0)0-, -NRL1aC(=S)-, -C(=S)NRL1a-, 트랜스-CRL1b=CRL1b-, 시스-CRL1b=CRL1b-, -C≡C-, -S(=0)20-, -OS(=0)2-, -S(=0)2NRL1a- 또는 -NRL1aS(=0)2-로 대체되며, 여기서, RL1a는 수소, 선택적으로 치환된 C1-6 알킬, 또는 질소 보호기이거나, RL1a는 선택적으로 치환된 헤테로시클릭 고리를 형성시키기 위해 인접한 탄소 원자와 결합하며, RL1b의 각 경우는 독립적으로, 수소, 할로겐, 선택적으로 치환된 C1-10 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 카보시클릴, 선택적으로 치환된 헤테로시클릴, 선택적으로 치환된 아릴, 및 선택적으로 치환된 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되거나, RL1b는 선택적으로 치환된 카보시클릭 또는 헤테로시클릭 고리를 형성시키기 위해 인접한 탄소 또는 질소 또는 산소 원자와 결합되거나, 두 개의 RL1b 기는 선택적으로 치환된 카보시클릭 또는 선택적으로 치환된 헤테로시클릭 고리를 형성시키기 위해 결합되며; L2는 담체 및 L1을 가교시킬 수 있는 가교 작용제로부터 유래된 모이어티이다.
담체는 단백질, 지질, 지질화된 단백질, 바이러스, 펩티드, 또는 당펩티드의 덴드리머일 수 있다. 특정 구현예에서, 담체는 T 세포 에피토프를 포함하는 펩티드이다.
본 발명에서 사용될 수 있는 담체 단백질의 예에는 파상풍 톡소이드(TT), 디프테리아 톡소이드(DT), 디프테리아 독소 교차-반응 물질 197(CRM 197), TT의 단편, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 소 혈청 알부민(BSA), 단백질 D, 외막 단백질(OMP) 및 폐렴구균용혈소, 디프테리아 독소 교차-반응 물질 197(CRM197) 또는 다른 DT 포인트 돌연변이, 예를 들어, CRM176, CRM228, CRM45(Uchida et al J. Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973); CRM9, CRM45, CRM102, CRM103 및 CRM107 및 당해 분야에 기술된 다른 돌연변이들이 있다.
특정 구현예에서, 글리칸 콘주게이트는 하기 화학식 (IV-a) 또는 (IV-b)이다:
Figure 112017081613999-pct00014
상기 식에서, m은 1 내지 40의 정수이며, 경계값은 포함한다.
특정 구현예에서, m은 1 내지 30의 정수(경계값 포함)이다. 본원에서 일반적으로 규정되는 바와 같이, m은 1 내지 20의 정수(경계값 포함)이다. 특정 구현예에서, m은 1이다. 특정 구현예에서, m은 2이다. 특정 구현예에서, m은 4이다. 특정 구현예에서, m은 6이다. 특정 구현예에서, m은 8이다. 특정 구현예에서, m은 10이다. 특정 구현예에서, m은 15이다. 특정 구현예에서, m은 20이다. 특정 구현예에서, m은 30이다. 특정 구현예에서, m은 40이다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 글리칸 콘주게이트들 중 적어도 두 개를 포함하는 글리칸 콘주게이트 혼합물을 제공한다. 특정 구현예에서, 글리칸 혼합물에서 w의 평균값은 약 1.0 내지 약 40.0이다. 특정 구현예에서, 글리칸 혼합물에서 w의 평균값은 약 1.0 내지 10.0이다. 특정 구현예에서, 글리칸 혼합물에서 w의 평균값은 약 5.7, 4.9, 2.9, 2.8, 또는 3.1이다. 특정 구현예에서, 글리칸 혼합물에서 w의 평균값은 약 4.9, 2.9, 2.8, 또는 3.1이다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 면역원성 조성물은 면역학적 유효량의 본 발명의 글리칸 콘주게이트를 포함한다.
본 발명의 화합물은 당해 분야에 공지되거나 본원에 기술된 절차를 이용하여 합성될 수 있다. 또한, US20140051127호 참조.
본 발명의 면역원성 콘주게이트는 동일하거나 상이한 SSEA-3 및/또는 SSEA-4 유도체의 하나 이상의 분자(예를 들어, 1-40, 1-20, 1-25, 1-30, 5-20, 5-25, 5-30, 또는 5-35)를 포함할 수 있다. 글리칸 콘주게이트를 생성시키기 위한 절차는 당해 분야에 공지되어 있고, 하기에 기술된다. 또한, 미국특허번호 제8,268,969호 참조.
특정 구현예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 하나 이상의 애주번트를 포함할 수 있다. 적합한 애주번트는 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들어, C34, 7DW8-5, C17, C23, 글루코-C34, 알루미늄 염, 스쿠알렌, MF59, 및 QS-21).
본원에서 사용되는 용어 "알룸 애주번트(alum adjuvant)"는 면역 애주번트 활성을 갖는 알루미늄 염을 지칭한다. 이러한 제제는 용액 중에 단백질 항원을 흡수하고 침전시키며, 얻어진 침전물은 접종 부위에서 형성된 백신 데폿으로부터 항원의 서방출을 촉진시킴으로써 백신 면역원성을 개선시킨다.
본원에서 사용되는 용어 "면역학적 애주번트"는 면역원에 대한 면역 반응을 향상시키거나 개질시키는 면역원과 함께 사용되는 물질을 지칭한다. 본 발명의 α-GalCer 유사체는 백신에 더욱 격렬하게 반응하기 위해 백신이 투여된 환자의 면역계를 자극시킴으로써 백신의 효과를 개질시키거나 증가시키기 위해 면역학적 애주번트로서 사용된다. 예시적인 실행에서, 유사체 C34는 애주번트로서 사용된다. C34 및 다른 알파-갈락토실 세라미드 유사체의 구조, 및 애주번트로서의 이의 용도는 미국특허번호 제7,928,077호에서 상세히 기술되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "당지질"은 세포 인식을 위한 마커로 역할을 하는 탄수화물-부착된 지질을 지칭한다.
당지질 C34, 글루코-C34, C23 및 7DW8-5는 하기 구조들을 갖는다:
Figure 112017081613999-pct00015
면역원성 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 면역원성 조성물은 약제학적 유효량의 본 발명의 글리칸 콘주게이트를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 면역원성 조성물, 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 암 백신을 제공한다.
본 발명의 암 백신은 단일 용량 또는 다중 용량의 본 발명의 글리칸 콘주게이트, 이들의 글리칸 콘주게이트 혼합물, 또는 이들의 면역원성 조성물을 포함할 수 있다. 제공된 암 백신은 암을 치료하거나 암의 위험을 감소시키는데 유용할 수 있다. 암 백신은 또한, 피검체 또는 건강 케어 전문가를 위한 용도를 기술하거나 정보를 처방하는 패키징 정보를 포함할 수 있다. 이러한 정보는 미국 식품의약국(U.S. Food and Drug Administration; FDA)과 같은 규제 기관(regulatory agency)에 의해 요구될 수 있다. 암 백신은 또한, 선택적으로, 화합물 또는 조성물의 투여를 위한 디바이스, 예를 들어, 비경구 투여를 위한 시린지를 포함할 수 있다.
약제 제형
면역 조성물은 투약 제형과 혼화 가능한 방식으로 그리고, 치료학적으로 유효하고 보호하고 면역원성인 양으로 투여된다. 투여되는 양은 예를 들어, 항체를 합성하는 개체의 면역계의 능력, 및 필요한 경우에, 세포-매개된 면역 반응을 형성시키는 개체의 면역계의 능력을 포함하는 치료될 피검체에 따른다. 투여되도록 요구되는 활성 성분의 정확한 양은 의사의 판단에 따른다. 그러나, 적합한 투여량 범위는 당업자에 의해 용이하게 결정 가능하다. 초기 투여 및 상승 용량을 위한 적합한 요법들이 또한 변경 가능하지만, 초기 투여 이후에 후속 투여를 포함할 수 있다. 백신의 투여량은 또한, 투여 경로에 따를 수 있고 숙주의 크기에 따라 달라진다.
본 발명의 면역 조성물은 또한, 항체의 생산을 위한 동물에서 항체들을 생성시키기 위해 사용될 수 있으며, 이는 암 치료 및 암 진단 둘 모두에서 사용될 수 있다. 동물(예를 들어, 마우스, 토끼, 염소, 양, 또는 말)에서 모노클로날 및 폴리클로날 항체 및 이의 단편을 제조하는 방법은 당해 분야에 널리 알려져 있다[예를 들어, 문헌[Harlow and Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York] 참조]. 용어 "항체"는 온전한 면역글로빈 분자, 뿐만 아니라, 이의 단편, 예를 들어, Fab, F(ab')2, Fv, scFv(단쇄 항체) 및 dAb(도메인 항체; Ward, et. al. (1989) Nature, 341, 544)를 포함한다.
본원에 기술된 조성물은 추가적인 활성제, 담체, 비히클, 부형제, 또는 본 발명의 독서 시에 당업자에 의해 식별될 수 있는 보조제와 함께 약제 조성물에 포함될 수 있다.
약제 조성물은 바람직하게, 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 이러한 약제 조성물에서, 본원에 기술된 조성물은 "활성제"로서도 지칭되는 "활성 화합물"을 형성시킨다. 본원에서 사용되는 언어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 약제학적 투여와 혼화 가능한, 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제, 등을 포함한다. 보충적 활성 화합물이 또한, 조성물에 도입될 수 있다. 약제 조성물은 이의 의도된 투여 경로와 상용화되도록 제형화된다. 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들어, 정맥내, 피부내, 피하, 경구(예를 들어, 흡입), 경피(국소), 점막경유, 및 직장 투여를 포함한다. 비경구, 피부내 또는 피하 적용을 위해 사용되는 용액 또는 현탁액은 하기 성분들을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예를 들어, 주사용 물, 염수 용액, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 또는 다른 합성 용매들; 항박테리아제, 예를 들어, 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예를 들어, 아스코르브산 또는 소듐 비설파이트; 킬레이트제, 예를 들어, 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제, 예를 들어, 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트, 및 긴장성의 조절을 위한 작용제, 예를 들어, 소듐 클로라이드 또는 덱스트로오스. pH는 산 또는 염기, 예를 들어, 염산 또는 소듐 히드록사이드로 조절될 수 있다. 비경구 제조물은 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰플, 일회성 시린지, 또는 다중 용량 바이알에 동봉될 수 있다.
임상 적용
본 발명은 피검체에서 증식성 질병, 예를 들어, 암(예를 들어, 폐암, 대장암, 췌장암, 담도암, 또는 자궁내막암), 양성 신생물, 또는 혈관신생(angiogenesis)의 치료를 위해 유용한 글리칸 콘주게이트, 면역원성 조성물, 또는 백신을 제공한다.
본원에 기술된 면역원성 조성물 또는 백신은 또한, 항체의 생산을 위한 인간 또는 동물에서 항체를 발생시키기 위해 사용될 수 있으며, 이는 암 치료 및 진단 둘 모두에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 면역원성 조성물 또는 백신은 또한, GloboH, SSEA-3 및/또는 SSEA-4 항체의 생산을 위한 항체를 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 인간 및/또는 동물(예를 들어, 마우스, 토끼, 염소, 양, 또는 말)에서 모노클로날 및 폴리클로날 항체 및 이의 단편을 제조하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Harlow and Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York] 참조. 용어 "항체"는 선천 면역글로불린 분자, 뿐만 아니라, 이의 단편, 예를 들어, Fab, F(ab')2, Fv, scFv (단쇄 항체), 및 dAb(도메인 항체; Ward, et. al. (1989) Nature, 341, 544)을 포함한다.
적어도 하나의 항-SSEA-3/SSEA-4/GloboH 항체 또는 항-SSEA-3/SSEA-4/GloboH 항체를 엔코딩하는 서열을 포함하는 적어도 하나의 폴리누클레오티드를 포함하는 조성물이 제공된다. 특정 구현예에서, 조성물은 약제 조성물일 수 있다. 본원에서 사용되는 조성물은 하나 이상의 SSEA-3/SSEA-4/GloboH에 결합하는 하나 이상의 항체 및/또는 하나 이상의 SSEA-3/SSEA-4/GloboH에 결합하는 하나 이상의 항체를 엔코딩하는 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리누클레오티드를 포함한다. 이러한 조성물은 적합한 담체, 예를 들어, 완충제를 포함하는 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이는 당해 분야에서 널리 알려져 있는 것이다.
단리된 항체 및 폴리누클레오티드가 또한 제공된다. 특정 구현예에서, 단리된 항체 및 폴리누클레오티드는 실질적으로 순수하다.
일 구현예에서, 항-SSEA-3/SSEA-4/GloboH 항체는 모노클로날이다. 다른 구현예에서, 항-SSEA-3/SSEA-4/GloboH 항체의 단편(예를 들어, Fab, Fab'-SH 및 F(ab')2 단편)이 제공된다. 이러한 항체 단편은 전통적인 수단, 예를 들어, 효소적 소화에 의해 생성될 수 있거나, 재조합 기술에 의해 발생될 수 있다. 이러한 항체 단편은 키메라, 인간화된, 또는 인간일 수 있다. 이러한 단편은 하기에 기술되는 진단 및 치료 목적을 위해 유용하다.
파지 디스플레이 라이브러리(Phage Display Library)를 이용한 항-SSEA-3/SSEA-4/GloboH 항체의 생성의 예
다양한 방법들은 고려되는 항체가 얻어질 수 있는 파지 디스플레이 라이브러리를 생성시키기 위해 당해 분야에 알려져 있다. 고려되는 항체를 생성시키는 하나의 방법은 문헌[Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93]에 기술된 바와 같이 파지 항체 라이브러리의 사용을 통한 것이다.
본 발명의 항-SSEA-3/SSEA-4/GloboH 항체는 목적하는 활성 또는 활성들을 갖는 합성 항체 클론을 스크리닝하기 위한 조합적 라이브러리를 사용함에 의해 제조될 수 있다. 원칙적으로, 합성 항체 클론은 파아지 코트 단백질에 융합된 항체 가변 영역(Fv)의 다양한 단편을 디스플레이하는 파아지를 함유하는 파아지 라이브러리를 스크리닝 함에 의해 선택된다. 상기 파아지 라이브러리는 목적하는 항원에 대한 친화성 크로마토그래피에 의해 패닝된다. 목적하는 항원에 결합할 수 있는 Fv 단편을 발현하는 클론은 항원에 흡착되고 따라서 라이브러리내 비-결합 클론으로부터 분리된다. 이어서 상기 결합 클론은 항원으로부터 용출되고 항원 흡착/용출의 추가의 사이클에 의해 추가로 집적될 수 있다. 본 발명의 임의의 항-SSEA-3/SSEA-4/GloboH 항체는 목적하는 파아지 클론을 선별하기 위해 적합한 항원 스크리닝 과정을 디자인하고 이어서 문헌[참조: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NTH Publication 91-3242, Bethesda Md. (1991), vols. 1-3]에 기재된 목적하는 파아지 클론으로부터 Fv 서열 및 적합한 불변 영역(Fc) 서열을 사용하여 완전한 길이의 항-SSEA-3/SSEA-4/GloboH 항체 클론을 작제하여 수득될 수 있다.
항체의 항원-결합 도메인은 약 110개 아미노산의 2개의 가변(V) 영역으로부터 형성되고 각각 하나는 경쇄(VL) 및 중쇄(VH)로부터 기원하고 상기 경쇄 및 중쇄 둘 다는 3개의 초가변 루프 또는 상보성-결정 영역(CDR)을 제공한다. 가변 도메인은 단일쇄 Fv(scFv) 단편으로서 파아지 상에 기능적으로 디스플레이될 수 있고, 여기서, VH 및 VL은 짧은 유연성 펩티드를 통해 또는 Fab 단편으로서 공유 결합되고, 여기서, 이들은 각각 불변 도메인에 융합되고 문헌[참조: Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이 비-공유적으로 상호작용한다. 본원에 사용된 바와 같이, scFv 암호화 파아지 클론 및 Fab 암호화 파아지 클론은 총체적으로 "Fv 파아지 클론" 또는 "Fv 클론"으로서 언급된다.
VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)에 의해 별도로 클로닝되고 파아지 라이브러리에 무작위로 재조합될수 있고 이는 이어서 문헌[참조: Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이 항원-결합 클론에 대해 검색될 수 있다. 면역화된 공급원 기원의 라이브러리는 하이브리도마를 작제할 필요 없이 면역원에 대한 고친화성 항체를 제공한다. 대안적으로, 순수 레퍼토리는 문헌[참조: Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 기재된 바와 같은 임의의 면역화 없이 광범위한 비자가 및 또한 자가 항원에 대한 인간 항체의 단일 공급원을 제공하기 위해 클로닝될 수 있다. 최종적으로, 순수 라이브러니는 또한 줄기 세포 기원의 비정렬된 V-유전자 분절을 클로닝하고 문헌[참조: Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이 고도로 가변성 CDR3 영역을 암호화하고 시험관내 재정렬을 성취하기 위해 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함에 의해 합성적으로 제조될 수 있다.
필라멘트 파아지는 최소 코트 단백질 환제에 융합시킴에 의해 항체 단편을 디스플레이하기 위해 사용된다. 상기 항체 단편은 단일쇄 Fv 단편으로서 디스플레이될 수 있고, 여기서, VH 및 VL 도메인은 예를 들어, 문헌[참조: Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]에 기재된 바와 같이 유연성 폴리펩티드 스페이서에 의해, 또는 Fab 단편으로서 동일한 폴리펩티드 쇄 상에 연결되고, 여기서, 하나의 쇄는 환제에 융합되고 다른 하나는 세균 숙주 세포 주변세포질로 분비되고 여기서, Fab-코트 단백질 구조의 어셈블리는 예를 들어, 문헌[참조: Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991)]에 기재된 바와 같이 야생형 코트 단백질 일부를 대체함에 의해 파아지 표면 상에 디스플레이된다.
일반적으로, 항체 유전자 단편을 암호화하는 핵산은 인간 또는 동물로부터 수거된 면역 세포로부터 수득된다. 항-SSEA-3/SSEA-4/GloboH 클론을 선호하여 편중된 라이브러리가 요구되는 경우, 상기 피검체는 SSEA-3/SSEA-4/GloboH로 면역화시켜 항체 반응을 생성하고, 비장 세포 및/또는 순환 B 세포 또는 다른 말초 혈액 림프구(PBL)는 라이브러리 작제를 위해 회수된다. 일 구현예에서, 항-인간 SSEA-3/SSEA-4/GloboH 클론을 선호하여 편중된 인간 항체 유전자 단편 라이브러리는 기능성 인간 면역글로불린 유전자 어레이(및 기능성 내인성 항체 생산 시스템이 없는)를 갖는 유전자전이 마우스에서 항-인간 SSEA-3/SSEA-4/GloboH 항체 반응을 생성시킴에 의해 수득되고 SSEA-3/SSEA-4/GloboH 면역화는 SSEA-3/SSEA-4/GloboH에 대한 인간 항체를 생성하는 B 세포를 유도한다. 인간 항체-생산 유전자전이 마우스의 생성은 하기에 기재되어 있다.
항-SSEA-3/SSEA-4/GloboH 반응성 세포 집단에 대한 추가의 농화(enrichment)은 SSEA-3/SSEA-4/GloboH-특이적 항체를 발현하는 B 세포를 분리하기 위한 적합한 스크리닝 과정을 사용함에 의해, 예를 들어, SSEA-3/SSEA-4/GloboH 친화성 크로마토그래피를 사용한 세포 분리 또는 세포의 플루오로크롬-표지된 SSEA-3/SSEA-4/GloboH로의 흡착에 이어서 유동-활성화된 세포 분류(FACS)에 희해 수득될 수 있다.
대안적으로, 비면역화된 공여자 기원의 비장 세포 및/또는 B 세포 또는 다른 PBL의 사용은 가능한 항체 레퍼토리를 보다 우수하게 제공하고 또한 SSEA-3/SSEA-4/GloboH가 항원성이 아닌 임의의 동물 (인간 또는 비-인간)을 사용하는 항체 라이브러리의 작제를 허용한다. 시험관내 항체 유전자 작제물을 혼입한 라이브러리를 줄기 세포는 비정렬된 항체 유전자 분절을 암호화하는 핵산을 제공하기 위해 대상체로부터 수거된다. 목적하는 면역 세포는 다양한 동물 종, 예를 들어, 인간, 마우스, 래트, 토끼목, 루프린, 개, 고양이, 돼지, 소, 말 및 조류 종 등으로부터 수득될 수 있다.
항체 가변 유전자 분절(VH 및 VL 분절을 포함하는)을 암호화하는 핵산은 목적하는 세포로부터 회수되고 증폭된다. 재정렬된 VH 및 VL 유전자 라이브러리의 경우에, 목적하는 DNA는 림프구로부터 게놈 DNA 또는 mRNA를 분리함에 이어서 문헌[참조: Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989)]에 기재된 바와 같이 재정렬된 VH 및 VL 유전자의 5' 말단 및 3' 말단과 매칭하는 프라이머와 함께 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)에 의해 발현용의 다양한 V 유전자 레퍼토리를 제조하여 수득될 수 있다. V 유전자는 문헌[참조: Orlandi et al. (1989) and in Ward et al., Nature, 341 : 544-546 (1989)]에 기재된 바와 같이 성숙한 V 도메인을 암호화하는 엑손의 5' 말단에서 역 프라이머 및 J-분절 내 기반을 둔 정배향 프라이머를 사용하여 cDNA 및 게놈 DNA로부터 증폭될 수 있다. 그러나, cDNA로부터 증폭시키기 위해, 역 프라이머는 또한 문헌[참조: Jones et al., Biotechnol., 9: 88-89 (1991)]에 기재된 바와 같이 리더 엑손 내 기반을 둘 수 있고 정배향 프라이머는 문헌[참조: Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 5728-5732 (1989)]에 기재된 바와 같은 불변영역 내 기반을 둘 수 있다. 상보성을 최대화하기 위해, 축퇴성은 문헌[참조: Orlandi et al. (1989) or Sastry et al. (1989)]에 기재된 바와 같이 프라이머에 혼입될 수 있다. 특정 양태에서, 라이브러리 다양성은 예를 들어, 문헌[참조: Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]의 방법 또는 문헌[참조: Oram et al., Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993)]의 방법에 기재된 바와 같이 면역 세포 핵산 샘플에 존재하는 모든 가용한 VH 및 VL 정렬을 증폭시키기 위해 각각의 V-유전자 계열에 표적화된 PCR 프라이머를 사용함에 의해 최대화된다. 증폭된 DNA의 발현 벡터로의 클로닝을 위해, 희귀 제한 부위는 문헌[참조: Orlandi et al. (1989)]에 기재된 바와 같은 하나의 말단에 태그로서 또는 문헌[참조: Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]에 기재된 바와 같이 태그된 프라이머와 함께 추가의 PCR 증폭에 의해 PCR 프라이머 내 도입될 수 있다.
합성적으로 재정렬된 V 유전자들의 레퍼토리는 V 유전자 분절로부터 시험관내 유래될 수 있다. 인간 VH-유전자 분절의 대부분은 클로닝되고 서열분석되고 (문헌(참조: Tomlinson et al., J. Mol. Biol., 227: 776-798 (1992)에 보고된 바와 같이), 맵핑되고 (문헌(참조: Matsuda et al, Nature Genet., 3: 88-94 (1993)에 보고된 바와 같이); 이들 클로닝된 분절(H1 및 H2 루프의 모든 주요 형태를 포함하는)을 사용하여 문헌[참조: Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이 다양한 서열 및 길이의 H3 루프를 암호화하는 PCR 프라이머와 함께 다양한 VH 유전자 레퍼토리를 생성할 수 있다. VH 레퍼토리는 또한 문헌[참조: Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461 (1992)]에 기재된 바와 같은 단일 길이의 긴 H3 루프에 집중된 모든 서열 다양성과 함께 제조될 수 있다. 인간 ｖk 및 Vλ 분절은 클로닝되고 서열 분석되었고 (문헌(참조: Williams and Winter,Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461 (1993)에 보고된 바와 같이) 합성 경쇄 레퍼토리를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 합성 V 유전자 레퍼토리는 VH 및 VL 폴드의 범위 및 L3 및 H3 길이 범위를 기반으로 하고 상당한 구조적 다양성의 항체를 암호화한다. V-유전자 암호화 DNA의 증폭 후, 생식선 V-유전자 분절은 문헌[참조: Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]의 방법에 따라 시험관내 재정렬될 수 있다.
항체 단편의 레퍼토리는 다양한 방식으로 VH 및 VL 유전자 레퍼토리를 함께 조합함에 의해 작제할 수 있다. 각각의 레퍼토리는 상이한 벡터에 생성될 수 있고 예를 들어, 문헌[참조: Hogrefe et al., Gene, 128: 119-126 (1993)]에 기재된 바와 같이 시험관내 재조합된 벡터 또는 조합 감염에 의한 생체내 재조합된 벡터, 예를 들어, 문헌[참조: Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993)]에 기재된 loxP 시스템에서 생성될 수 있다. 생체내 재조합 방법은 이. 콜라이 형질전환 효율에 의해 부과된 라이브러리 크기에 대한 한계를 극복하기 위해 Fab 단편의 2개 쇄 성질을 사용한다. 순수 VH 및 VL 레퍼토리는 별도로 클로닝되어 하나는 플라스미드에 클로닝되고 다른 하나는 파아지 벡터에 클로닝된다. 이어서 2개의 라이브러리는 파지미드-함유 세균의 파아지 감염에 의해 조합되어 각각의 세포는 상기한 조합을 함유하고 라이브러리 크기는 단지 존재하는 세포의 수(약 1012 클론)에 의해서만 제한된다. 2개의 벡터는 생체내 재조합 시그날을 함유하여 VH 및 VL 유전자들은 단일 레플리콘 상에 재조합되고 파아지 비리온으로 동시 팩키징된다. 이들 거대한 라이브러리는 양호한 친화성(약 10-8 M의 Kd-1)의 다수의 다양한 항체를 제공한다.
대안적으로, 상기 레퍼토리는 후속적으로 예를 들어, 문헌[참조: Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991)]에 기재된 바와 같이 동일한 벡터에 클로닝될 수 있거나, 예를 들어, 문헌[참조: Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991)]에 기재된 바와 같이 PCR에 의해 함께 어셈블리되고 이어서 클로닝된다. PCR 어셈블리를 또한 사용하여 단일쇄 Fv(scFv) 레퍼토리를 형성하도록 유연성 펩티드 스페이서를 암호화하는 DNA와 VH 및 VL DNA를 연결할 수 있다. 또 다른 기술에서, "세포 PCR 어셈블리 내"에서는 문헌[참조: Embleton et al., Nucl. Acids Res., 20: 3831-3837 (1992)]에 기재된 바와 같이 PCR에 의해 림프구내 VH 및 VL 유전자를 조합하여 연결된 유전자들의 레퍼토리를 클로닝하기 위해 사용된다.
라이브러리의 스크리닝은 임의의 당업계 공지된 기술에 의해 성취될 수 있다. 예를 들어, SSEA-3/SSEA-4/GloboH 표적을 사용하여 흡착 플레이트에 고정되거나 세포 분류에 사용되거나 스트렙타비딘-코팅된 비드를 사용한 포획을 위해 비오틴에 접합되거나 파아지 디스플레이 라이브러리를 패닝하기 위한 임의의 다른 당업계 공지된 방법에 사용되는 숙주 세포 상에 발현되는 흡착 플레이트의 웰을 코팅시킬 수 있다.
파아지 라이브러리 샘플은 흡착제와 파아지 입자의 적어도 일부의 결합을 위해 적합한 조건하에서 고정화된 SSEA-3/SSEA-4/GloboH와 접촉시킨다. 정상적으로 pH, 이온 강도, 온도 등을 포함하는 조건은 생리학적 조건을 모방하기 위해 선택된다. 고체상에 결합된 파아지를 세척하고 이어서 예를 들어, 문헌[참조: Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991)]에 기재된 바와 같은 산에 의해 또는 문헌[참조: Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]에 기재된 바와 같은 알칼리에 의해 또는 예를 들어, 문헌[참조: Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]의 항원 경쟁 방법과 유사한 과정에서 SSEA-3/SSEA-4/GloboH 항원 경쟁에 의해 용출시킨다. 파아지는 단일 라운드의 선택에서 20 내지 1,000배 농화될 수 있다. 더욱이, 농화된 파아지는 세균 배양에서 성장시키고 추가 라운드 선택에 적용될 수 있다.
선택의 효율은 세척 동안에 해리 역학 및 단일 파아지 상에 다중 항체 단편이 동시에 항원과 결합할 수 있는지를 포함하는 많은 인자들에 의존한다. 신속한 해리 역학(및 약한 결합 친화력)을 갖는 항체는 고체상에서 짧은 세척, 다가 파아지 디스플레이 및 높은 코팅 밀도를 사용하여 보유될 수 있다. 높은 밀도는 다가 상호작용을 통해 파아지를 안정화시키는 것 뿐만 아니라 해리된 파아지의 재결합을 호전시킨다. 느린 해리 역학(및 우수한 결합 친화력)을 갖는 항체의 선택은 문헌[참조: Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990) 및 WO 92/09690]에 기재된 바와 같이 긴 세척 및 1가 파아지 디스플레이 및 문헌[참조: Marks et al, Biotechnol., 10: 779-783 (1992)]에 기재된 바와 같은 항원의 낮은 코팅 밀도를 사용하여 촉진될 수 있다.
SSEA-3/SSEA-4/GloboH에 대한 상이한 친화력의, 심지어 약간 차이가 나는 친화력을 갖는 파지 항체들 간을 선택하는 것이 가능하다. 그러나, 선택된 항체의 랜덤 돌연변이(예를 들어, 상술된 친화력 성숙 기술들 중 일부에서 수행되는 바와 같음)는 주로 항원에 결합하고, 몇몇은 보다 높은 친화력을 갖는 여러 돌연변이들을 일으킬 가능성이 있다. SSEA-3/SSEA-4/GloboH를 제한하면서, 드문 높은 친화력 파지가 경쟁을 벌일 수 있다. 전부 보다 높은 친화력 돌연변이들을 보유하기 위하여, 파지들은 과량의 바이오닐화된 SSEA-3/SSEA-4/GloboH와 함께 인큐베이션될 수 있지만, SSEA-3/SSEA-4/GloboH에 대한 타겟 몰 친화력 보다 낮은 몰 농도의 바이오티닐화된 SSEA-3/SSEA-4/GloboH와 함께 인큐베이션될 수 있다. 고친화성-결합 파아지는 이어서 스트렙타비딘-코팅된 상자성 비드에 의해 포획될 수 있다. 상기 "평형 포획"은 보다 낮은 친화성을 갖는 과량의 파아지로부터의 2배 높은 친화성 정도로 적게 돌연변이체 클론의 분리를 가능하게 하는 민감성과 함께 이들의 결합 친화력에 따라 항체가 선택되도록 한다. 고체상에 결합된 파아지를 세척하는데 사용되는 조건은 또한 해리 역학을 기준으로 구분되도록 조작될 수 있다.
항-SSEA-3/SSEA-4/GloboH 클론은 선택된 활성일 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명은 SSEA-3/SSEA-4/GloboH 리간드와 SSEA-3/SSEA-4/GloboH 간의 결합을 차단하지만 SSEA-3/SSEA-4/GloboH 리간드와 제2 단백질 간의 결합을 차단하지 않는 항-SSEA-3/SSEA-4/GloboH 항체를 제공한다. 상기 항-SSEA-3/SSEA-4/GloboH 항체에 상응하는 Fv 클론은 (1) 상기 섹션 B(I)(2)에 기재된 바와 같이 파아지 라리브러리로부터 항-SSEA-3/SSEA-4/GloboH 클론을 분리하고 임의로 적합한 세균 숙주에서 집단을 성장시킴에 의해 단리된 파아지 클론 집단을 임의로 증폭시키고; (2) SSEA-3/SSEA-4/GloboH 및 경우에 따라 이에 대해 차단 및 비-차단 활성의 제2 단백질을 선택하고; (3) 고정화된 SSEA-3/SSEA-4/GloboH에 항-SSEA-3/SSEA-4/GloboH 파아지 클론을 흡착시키고; (4) 과량의 제2 단백질을 사용하여 상기 제2 단백질의 결합 결정 인자와 중첩하거나 이와 공유되는 SSEA-3/SSEA-4/GloboH-결합 결정인자를 인지하는 임의의 목적하지 않은 클론을 용출시키고; (5) 하기 단계 (4)에 따라 흡착된 채로 유지된 클론을 용출시킴에 의해 선택될 수 있다. 임의로, 목적하는 차단/비-차단 성질을 갖는 클론은 추가로 본원에 기재된 선택 과정을 1회 이상 반복함에 의해 집적될 수 있다.
본 발명의 Fv 클론을 암호화하는 DNA는 통상의 과정(예를 들어, 하이브리도마 또는 파아지 DNA 주형으로부터 목적하는 중쇄 및 경쇄 암호화 영역을 특이적으로 증폭시키도록 디자인된 올리고누클레오타이드 프라이머를 사용함에 의해)을 사용하여 용이하게 단리되고 서열분석된다. 일단 단리된 경우, DNA는 발현 벡터에 위치할 수 있고 이는 이어서 이. 콜라이 세포, 시미안 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 면역글로불린 단백질을 달리 생성하지 않는 골수종 세포와 같은 숙주 세포에 형질감염시켜 재조합 숙주 세포에서 목적하는 모노클로날 항체의 합성을 수득한다. 세균에서 항체-암호화 DNA의 재조합 발현에 대한 검토 문헌은 문헌[Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256 (1993) and Pluckthun, Immunol. Revs, 130: 151 (1992)]을 포함한다.
본 발명의 Fv 클론을 암호화하는 DNA는 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 암호화하는 공지된 DNA 서열(예를 들어, 적당한 DNA 서열들은 상기 캐뱃 등으로부터 수득될 수 있다)과 조합하여 완전하거나 부분적인 길이의 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 클론을 형성할 수 있다. IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 불변 영역을 포함하는 임의의 이 소형의 불변 영역이 상기 목적을 위해 사용될 수 있고 상기 불변 영역이 임의의 인간 또는 동물 종으로부터 수득될 수 있음을 인지할 것이다. 완전한 길이의 중쇄 및/또는 경쇄의 "하이브리드"에 대한 암호화 서열(들)을 형성하기 위해 하나의 동물 (예를 들어, 인간) 종의 가변 도메인 DNA로부터 유래되고 이어서 또 다른 동물 종의 불변 영역 DNA에 융합되는 Fv 클론은 본원에 사용된 바와 같은 "키메라" 및 "하이브리드" 항체의 정의에 포함된다. 일 구현예에서, 인간 가변 DNA로부터 유래된 Fv 클론은 모든 인간, 완전한 또는 부분적 길이의 중쇄 및/또는 경쇄에 대한 암호화 서열(들)을 형성하기 위해 인간 불변 영역 DNA에 융합된다.
순수 라이브러리(천연 또는 합성)에 의해 생성된 항체는 적당한 친화성(약 106 내지 107 M-1의 Kd-1)일 수 있지만 친화성 성숙화는 또한 문헌[참조: Winter et al. (1994), supra]에 기재된 바와 같이 2차 라이브러리로부터 작제하고 재선택함에 의해 시험관내 모방될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 문헌[참조: Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992)]의 방법에서 또는 문헌[참조: Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3576-3580 (1992)]의 방법에서 에러 경향(error-prone) 폴리머라아제 (문헌(Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989)에 보고된 바와 같은)를 사용함에 의해 무작위로 도입될 수 있다. 추가로, 친화성 성숙화는 예를 들어, 선택된 개체 Fv 클론에서 목적하는 CDR에 걸쳐있는 무작위 서열 스패닝을 갖는 프라이머를 사용한 PCR을 사용하고 보다 높은 친화성 클론을 스크리닝하여 하나 이상의 CDR을 무작위로 돌연변이시킴에 의해 수행될 수 있다. WO 9607754호(1996년 3월 14일자로 공개됨)는 경쇄 유전자 라이브러리를 생성하기 위한 면역글로불린 경쇄의 상보성 결정 영역에서 돌연변이 유발을 유도하기 위한 방법을 기재하였다. 또 다른 효과적인 방법은 비면역화된 공여자로부터 수득된 천연의 V 도메인 변이체의 레퍼토리와 함께 파아지 디스플레이함에 의해 선택된 VH 또는 VL 도메인을 재조합하고 문헌[참조: Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992)]에 기재된 바와 같이 수회 라운드의 쇄 재셔플링에서 보다 높은 친화성을 스크리닝하는 것이다. 이러한 기술은 10-9M 범위의 친화성을 갖는 항체 및 항체 단편의 생성을 가능하게 한다.
항-SSEA-3/SSEA-4/GloboH 항체를 생산하기 위한 다른 방법
항체의 친화성을 생성하고 평가하는 다른 방법은 당업계에서 널리 공지되어 있고 예를 들어, 문헌[참조: Kohler et al., Nature 256: 495 (1975); U.S. Pat. No. 4,816,567; Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986; Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987; Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980); Engels et al., Agnew. Chem.Tnt. Ed. Engl., 28: 716-734 (1989); Abrahmsen et al., EMBO J., 4: 3901 (1985); Methods in Enzymology, vol. 44 (1976); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)]에 기재되어 있다.
일반 방법
일반적으로, 본 발명은 친화성-성숙화된 SSEA-3/SSEA-4/GloboH 항체를 제공한다. 이들 항체는 SSEA-3/SSEA-4/GloboH에 대해 증가된 친화성 및 특이성을 갖는다. 친화성 및 민감성에서 이러한 증가는 본 발명의 분자가 (a) 본 발명의 분자의 증가된 민감성 및/또는 (b) 본 발명의 분자에 의한 SSEA-3/SSEA-4/GloboH의 단단한 결합에 의해 이득이 되는 응용 및 방법을 위해 사용되도록 한다.
일 구현예에서, SSEA-3/SSEA-4/GloboH 항체는 하나 이상의 SSEA-3/SSEA-4/GloboH 활성의 부분적 또는 전체 차단이 요망되는 SSEA-3/SSEA-4/GloboH-매개된 장애의 치료를 위해 유용하다. 일 구현예에서, 본 발명의 항-SSEA-3/SSEA-4/GloboH 항체는 암을 치료하기 위해 사용된다.
본 발명의 항-SSEA-3/SSEA-4/GloboH 항체는 질량 분광측정기 또는 유전학적 조작 필요 없이 면역침전, ELISA 또는 면역현미경과 같은 간단하고 통상의 생분자 검정에서 에피토프의 민감하고 특이적인 검출을 가능하게 한다. 이어서, 이것은 이들 경로의 정상적 기능을 관찰하고 설명하며 경로가 비정상적으로 기능하는 경우 검출하는데 상당한 이점을 제공한다.
본 발명의 SSEA-3/SSEA-4/GloboH 항체를 또한 사용하여 질환의 발달 및 발병에서의 역할을 결정할 수 있다. 예를 들어, 상기된 바와 같이, 본 발명의 SSEA-3/SSEA-4/GloboH 항체를 사용하여 하나 이상의 질환 상태와 상호관련될 수 있는 TACA가 정상적으로 일시적으로 발현되는지를 결정할 수 있다.
본 발명의 SSEA-3/SSEA-4/GloboH 항체는 본 발명의 항-SSEA-3/SSEA-4/GloboH 항체가 특이적이지 않은 SSEA-3/SSEA-4/GloboH의 정상 활성을 방해하는 것 없이 하나 이상의 SSEA-3/SSEA-4/GloboH가 비정상적으로 조절되거나 비정상적으로 기능하는 질환을 치료하기 위해 추가로 사용될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명의 항-SSEA-3/SSEA-4/GloboH 항체는 다양한 세포 타입 및 조직에서 암 상태의 검출을 위한 시약으로서의 용도를 모색한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항-SSEA-3/SSEA-4/GloboH 항체는 본 발명의 대상 항체의 것들과 유사한 차단 활성 패턴을 갖는 SSEA-3/SSEA-4/GloboH 길항제의 개발을 위해 유용하다. 예를 들어, 본 발명의 항-SSEA-3/SSEA-4/GloboH 항체를 사용하여 동일한 SSEA-3/SSEA-4/GloboH 결합 특성 및/또는 SSEA-3/SSEA-4/GloboH-경로를 차단하는 능력을 갖는 다른 항체를 결정하고 동정할 수 있다.
추가의 예로서, 본 발명의 항-SSEA-3/SSEA-4/GloboH 항체를 사용하여 선형 및 형태적 에피토프를 포함하는 본원에 예시된 항체와 SSEA-3/SSEA-4/GloboH의 동일한 항원성 결정인자(들)에 실질적으로 결합하는 다른 항-SSEA-3/SSEA-4/GloboH 항체를 동정할 수 있다.
본 발명의 항-SSEA-3/SSEA-4/GloboH 항체는 SSEA-3/SSEA-4/GloboH가, 항체가 하는바와 같이 하나 이상의 결합 파트너의 SSEA-3/SSEA-4/GloboH로의 결합을 차단하는데 유사한 약리학적 효과를 나타내는 SSEA-3/SSEA-4/GloboH의 소분자 길항제를 스크리닝하기 위해 포함되는 생리학적 경로를 기준으로 하는 검정에 사용될 수 있다.
항체의 생성은 하이브리도마 기술 및 결합제 분자의 파아지 디스플레이된 라이브러리의 스크리닝과 같이 본원에 기재된 것들을 포함하는 당업계의 통상적 기술을 사용하여 성취될 수 있다. 이들 방법은 당업계에서 널리 확립되어 있다.
간략하게, 본 발명의 항-SSEA-3/SSEA-4/GloboH 항체는 목적하는 활성 또는 활성들을 갖는 합성 항체 클론을 스크리닝하기 위한 조합적 라이브러리를 사용함에 의해 제조될 수 있다. 원칙적으로, 합성 항체 클론은 파아지 코트 단백질에 융합된 항체 가변 영역(Fv)의 다양한 단편을 디스플레이하는 파아지를 함유하는 파아지 라이브러리를 스크리닝함에 의해 선택된다. 상기 파아지 라이브러리는 목적하는 항원에 대한 친화성 크로마토그래피에 의해 패닝된다. 목적하는 항원에 결합할 수 있는 Fv 단편을 발현하는 클론은 항원에 흡착되고 따라서 라이브러리에서 비-결합 클론으로부터 분리된다. 결합 클론은 이어서 항원으로부터 용출되고 항원 흡착/용출의 추가의 사이클에 의해 추가로 집적될 수 있다. 본 발명의 임의의 항-SSEA-3/SSEA-4/GloboH 항체는 목적하는 파아지 클론을 선택하기 위해 적합한 항원 스크리닝 과정을 디자인함에 이어서 문헌[참조: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md. (1991), vols. 1-3]에 기재된 목적하는 파아지 클론 및 적합한 불변 영역(Fc) 서열 기원의 Fv 서열을 사용하여 완전한 길이의 항-SSEA-3/SSEA-4/GloboH 항체 클론을 작제하여 수득될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 항-SSEA-3/SSEA-4/GloboH 항체는 모노클로날이다. 또한 본원에 제공된 항-SSEA-3/SSEA-4/GloboH 항체의 Fab, Fab', Fab'-SH 및 F(ab')2 단편, 및 이의 변이체와 같은 항체 단편이 본 발명의 범위 내에 포함된다. 이들 항체 단편들은 효소적 분해와 같은 통상적 수단에 의해 생성될 수 있거나, 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다. 상기 항체 단편들은 키메라, 인간 또는 인간화된 것일 수 있다. 이들 단편들은 본원에 제시된 실험적, 진단학적 및 치료학적 목적을 위해 유용하다.
모노클로날 항체는 실질적으로 균일한 항체의 집단으로부터 수득될 수 있고, 즉, 개별 항체 함유 집단은 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 변형어구 "모노클로날"은 구분되는 항체의 혼합물이 아닌 항체의 특성을 지적한다.
본 발명의 항-SSEA-3/SSEA-4/GloboH 모노클로날 항체는 문헌[참조: Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 의해 기재된 제1 하이브리도마 방법을 포함하는 당업계에 공지된 다양한 방법을 사용하여 제조될 수 있거나 대안적으로 이들은 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호)에 의해 제조될 수 있다.
벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법
본 발명의 항체의 재조합 생산을 위해, 이를 암호화하는 핵산이 단리되고 추가의 클로닝(DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터에 삽입된다. 항체를 암호화하는 DNA는 용이하게 단리되고 통상적인 과정(예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자들에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고누클레오타이드 프로브를 사용함에 의해)을 사용하여 서열분석된다. 많은 벡터가 가용하다. 벡터의 선택은 부분적으로 사용될 숙주 세포에 의존한다. 숙주 세포는 원핵세포 또는 진핵세포 (일반적으로 포유동물) 기원의 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 불변 영역을 포함하는 임의의 이소형의 불변 영역이 상기 목적을 위해 사용될 수 있고 상기 불변 영역은 임의의 인간 또는 동물 종으로부터 수득될 수 있는 것으로 인지된다.
원핵 숙주 세포를 사용한 항체 생성
벡터 작제
본 발명의 항체의 폴리펩티드 성분들을 암호화하는 폴리누클레오타이드 서열은 표준 재조합 기술을 사용하여 수득될 수 있다. 목적하는 폴리누클레오타이드 서열은 하이브리도마 세포와 같은 항체 생산 세포로부터 단리되고 서열분석될 수 있다. 대안적으로, 폴리누클레오타이드는 누클레오타이드 합성기 또는 PCR 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 일단 수득되면, 폴리펩티드를 암호화하는 서열은 원핵세포 숙주에서 이종성 폴리누클레오타이드를 복제하고 발현할 수 있는 재조합 벡터에 삽입된다. 당업계에서 가용하고 공지된 많은 벡터들은 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 적당한 벡터의 선택은 주로 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 특정 숙주 세포로 삽입될 핵산의 크기에 의존한다. 각각의 벡터는 이의 기능 (이종성 폴리누클레오타이드의 증폭 또는 발현 또는 둘 다) 및 이것이 잔류하는 특정 숙주 세포와의 상용성에 의존하여 다양한 성분들을 함유한다. 상기 벡터 성분들은 일반적으로 복제 오리진, 선택 마커 유전자, 프로모터, 리보솜 결합 부위(RBS), 시그날 서열, 이종성 핵산 삽입체 및 전사 종결 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일반적으로, 숙주 세포와 상용할 수 있는 종으로부터 유래된 레플리콘 및 제어 서열을 함유하는 플라스미드 벡터는 이들 숙주와 연계하여 사용된다. 상기 벡터는 형질전환된 세포에서 표현형 선택을 제공할 수 있는 마킹 서열 뿐만 아니라 복제 부위를 갖고 있다. 예를 들어, 이. 콜라이는 통상적으로 이. 콜라이 종으로부터 유래된 플라스미드인 pBR322를 사용하여 형질전환된다. pBR322는 앰피실린(Amp) 및 테트라사이클린(Tet) 내성을 암호화하는 유전자를 함유하고 따라서 형질전환된 세포를 동정하기 위한 용이한 수단을 제공한다. pBR322, 이의 유도체 또는 다른 미생물 플라스미드 또는 박테리오파아지는 또한 내인성 단백질의 발현을 위해 미생물 유기체에 의해 사용될 수 있는 프로모터를 함유할 수 있거나 함유하도록 변형될 수 있다. 특정 항체의 발현을 위해 사용되는 pBR322 유도체의 예는 문헌[참조: Carter et al., 미국 특허 제5,648,237호]에 상세히 기재되어 있다.
추가로, 숙주 미생물과 적격할 수 있는 레플리콘 및 제어 서열을 함유하는 파아지 벡터는 이들 숙주와 연계하여 형질전환 벡터로서 사용될 수 있다. 예를 들어, λ GEM™-11과 같은 박테리오파아지는 이. 콜라이 LE392와 같은 민감성 숙주 세포를 형질전환시키기 위해 사용될 수 있는 재조합 벡터를 제조하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 2개 이상의 프로모터-시스트론 쌍을 포함할 수 있고 이는 각각 폴리펩티드 성분들을 암호화한다. 프로모터는 이의 발현을 조절하는 시스트론의 업스트림 (5')에 위치한 비해독되는 조절 서열이다. 원핵세포 프로모터는 통상적으로 2개의 부류, 유도성 및 항상성에 속한다. 유도성 프로모터는 배양 조건에서의 변화, 예를 들어, 영양물의 존재 또는 부재 또는 온도 변화에 응답하여 이의 제어하에 증가된 수준의 시스트론 전사를 개시하는 프로모터이다.
다양한 잠재적 숙주 세포에 의해 인지되는 다수의 프로모터는 널리 공지되어있다. 선택된 프로모터는 제한 효소 분해를 통해 공급원 DNA로부터 프로모터를 제거하고 단리된 프로모터 서열을 본 발명의 벡터에 삽입함에 의해 경쇄 또는 중쇄를 암호화하는 시스트론 DNA에 작동적으로 연결될 수 있다. 천연 프로모터 서열 및 많은 이종성 프로모터 둘 다를 사용하여 표적 유전자의 증폭 및/또는 발현을 지시할 수 있다. 일부 구현예에서, 이종성 프로모터는 이들이 일반적으로 천연 표적 폴리펩티드 프로모터와 비교하여 보다 큰 전사 및 발현된 표적 유전자의 보다 높은 수율을 가능하게 하기 때문에 사용된다.
원핵세포 숙주와 함께 사용하기에 적합한 프로모터는 PhoA 프로모터, β -갈락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 트립토판(trp) 프로모터 시스템 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어, tac 또는 trc 프로모터를 포함한다. 그러나, 세균에서 기능하는 다른 프로모터 (예를 들어, 다른 공지된 세균 또는 파아지 프로모터)가 또한 적합하다. 이들의 누클레오타이드 서열은 공개되었고 당업자는 이들을 임의의 요구되는 제한 부위를 공급하도록 링커 또는 어댑터를 사용하여 표적 경쇄 및 중쇄 (문헌참조: Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269)를 암호화하는 시스트론에 작동적으로 연결시킬 수 있게 한다.
본 발명의 하나의 측면에서, 재조합 벡터 내 각각의 시스트론은 막을 거쳐 발현된 폴리펩티드의 전좌를 지시하는 분비 시그날 서열 성분을 포함한다. 일반적으로, 상기 시그날 서열은 벡터의 성분일 수 있거나 이것은 벡터로 삽입되는 표적 폴리펩티드 DNA의 일부일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 선택된 시그날 서열은 숙주 세포에 의해 인지되고 가공되는 (즉 시그날 펩티다제에 의해 절단되는) 하나 이어야 한다. 이종성 폴리펩티드에 고유한 시그날 서열을 인지하지 않고 소유하지 않는 원핵 숙주 세포에 대해, 상기 시그날 서열은 예를 들어, 알칼린 포스파타제, 페니실리나제, Ipp, 또는 열-안정성 장독소 II (STII) 리더, LamB, PhoE, PelB, OmpA 및 MBP로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 원핵 세포 시그날 서열로 대체된다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 발현 시스템의 양 시스트론에 사용되는 시그날 서열은 STII 시그날 서열 또는 이의 변이체이다.
또 다른 측면에서, 본 발명에 따른 면역글로불린의 생산은 숙주 세포의 세포질에서 일어날 수 있고 따라서 각각의 시스트론 내에 분비 시그날 서열의 존재를 요구하지 않는다. 그와 관련하여, 면역글로불린 경쇄 및 중쇄는 세포질내 기능성 면역글로불린을 형성하기 위해 발현되고 폴딩되고 어셈블리된다. 특정 숙주 균주(예를 들어, 이. 콜라이 trxB-균주)는 디설파이드 결합 형성을 위해 호전적일 수 있는 세포질 조건을 제공하여, 발현된 단백질 서브유니트의 적당한 폴딩 및 어셈블리를 가능하게 한다 (문헌참조: Proba and Pluckthun Gene, 159:203 (1995).
본 발명의 항체는 또한 발현된 폴리펩티드 성분의 정량 비율이 본 발명의 분비되고 적당히 어셈블리된 항체의 수율을 최대화하기 위해 조절될 수 있는 발현 시스템을 사용함에 의해 생산될 수 있다. 상기 조절은 적어도 부분적으로 폴리펩티드 성분에 대한 해독 강도를 동시에 조절함에 의해 성취된다.
해독 강도를 조절하기 위한 한가지 기술은 문헌[참조: Simmons et al., 미국 특허 제5,840,523호]에 기재되어 있다. 이것은 시스트론내 해독 개시 영역(TIR)의 변이체를 사용한다. 소정의 TIR에 대해, 일련의 아미노산 또는 핵산 서열 변이체는 일정 범위의 해독 강도와 함께 제조될 수 있고 이로써 이에 의해 특정 쇄의 목적하는 발현 수준에 대해 상기 인자를 보정하는 간편한 수단을 제공한다. TIR 변이체는 아미노산 서열을 변형시킬 수 있는 코돈 변화를 유도하는 통상적인 돌연변이유발 기술에 의해 생성될 수 있다. 특정 양태에서, 누클레오타이드 서열의 변화는 사일런트하다. TIR에서의 변화는 예를 들어, 시그날 서열에서의 변화와 함께 샤인-달가노 서열의 수 또는 간격에서의 변화를 포함할 수 있다. 돌연변이 시그날 서열을 생성시키기 위한 한가지 방법은 시그날 서열의 아미노산 서열을 변화시키지 않는(즉, 변화는 사일런트하다) 코딩 서열의 개시부에 "코돈 뱅크"의 생성이다. 이것은 각각의 코돈의 3번째 누클레오타이드 위치를 변화시킴에 의해 성취될 수 있고; 추가로, 류신, 세린 및 아르기닌과 같은 일부 아미노산은 뱅크를 제조하는데 복잡성을 부가할 수 있는 다중의 제1 및 제2 위치를 갖는다. 이러한 돌연변이유발 방법은 문헌[참조: Yansura et al. (1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol. 4:151-158]에 상세히 기재되어 있다.
일 구현예에서, 벡터 세트는 여기에 각각의 시스트론에 일정 범위의 TIR 강도와 함께 생성된다. 이러한 제한된 세트는 다양한 TIR 강도 조합하에 목적하는 항체 생성물의 수율 뿐만 아니라 각각의 쇄의 발현 수준의 비교를 제공한다. TIR 강도는 문헌[참조: Simmons et al. 미국 특허 제5,840,523호]에 상세히 기재된 바와 같은 리포터 유전자의 발현 수준을 정량함에 의해 결정될 수 있다. 해독 강도 비교를 기준으로, 목적하는 개별 TIR은 본 발명의 발현 벡터 작제물에서 조합되도록 선택된다.
본 발명의 항체를 발현시키는데 적합한 원핵 숙주 세포는 그람-음성 또는 그람-양성 유기체와 같은 아키박테리아(Archaebacteria) 및 유박테리아(Eubacteria)를 포함한다. 유용한 박테리아의 예는 에스케리치아(Escherichia) (예를 들어, 이. 콜라이(E. coli)), 바실리(Bacilli) (예를 들어, 비. 서브틸리스(B. subtilis)), 엔테로박테리아(Enterobacteria), 슈도모나스 계열(예를 들어, 피. 아에루기노사(P. aeruginosa)), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 쉬겔라(Shigella), 리조비아(Rhizobia), 비트레오실라(Vitreoscilla), 또는 파라코커스(Paracoccus)를 포함한다. 하나의 양태에서, 그람-음성 세포를 사용한다. 하나 의 양태에서, 이. 콜라이 세포는 발명을 위한 숙주로서 사용된다. 이. 콜라이 균주의 예는 균주 W3110(Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; ATCC Deposit No. 27,325) 및 이의 유도체를 포함하고 이는 유전자형 W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 Δomp ΤΔ(nmpc-fepE) degP41 kanR (미국 특허 제5,639,635호)를 갖는 균주 33D3을 포함한다. 다른 균주 및 이의 유도체, 예를 들어, 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446), 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 λ1776 (ATCC 31,537) 및 이. 콜라이 RV308 (ATCC 31,608)이 또한 적합하다. 이들 실시예는 제한이기 보다는 설명을 위한 것이다. 한정된 유전자형을 갖는 상기 언급된 임의의 세균의 유도체를 작제하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[참조: Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990)]에 기재되어 있다. 일반적으로, 세균 세포에서 레플리콘의 복제성을 고려하여 적당한 세균을 선택할 필요가 있다. 예를 들어, 이. 콜라이, 세라티아 또는 살모넬라 종은 pBR322, pBR325, pACYC177, 또는 pKN410과 같은 널리 공지된 플라스미드가 레플리콘을 공급하기 위해 사용되는 경우 숙주로서 적합하게 사용될 수 있다. 통상적으로, 숙주 세포는 최소량의 단백질분해 효소를 분비해야만 하고 추가의 프로테아제 억제제는 바람직하게 세포 배양에 혼입될 수 있다.
항체 생산
숙주 세포는 상기된 발현 벡터로 형질전환되고 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 목적하는 서열을 암호화하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절히 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양된다.
형질전환은 원핵세포 숙주로 DNA를 도입하여 DNA가 염색체외 요소 또는 염색체 통합체로서 복제가능하도록 된 것을 의미한다. 사용되는 숙주 세포에 의존하여, 형질전환은 상기 세포에 적당한 표준 기술을 사용하여 수행된다. 염화칼슘을 사용하는 칼슘 처리는 일반적으로 실질적 세포-벽 배리어를 함유하는 세균 세포에 대해 사용된다. 형질전환을 위한 또 다른 방법은 폴리에틸렌 글리콜/DMSO를 사용한다. 사용되는 또 다른 기술은 전기천공이다.
본 발명의 폴리펩티드를 생산하기 위해 사용되는 원핵 세포는 당업계에 공지된 배지에서 성장시키고 선택된 숙주 세포의 배양을 위해 적합하다. 적합한 배지의 예는 루리아 (luria) 브로쓰(LB) + 필요한 영양 보충물을 포함한다. 일부 양태에서, 배지는 또한 발현 벡터를 함유하는 원핵 세포의 성장을 선택적으로 허용하기 위해 발현 벡터의 구성물을 기준으로 선택되는 선택 제제를 함유한다. 예를 들어, 앰피실린은 앰피실린 내성 유전자를 발현하는 세포의 성장을 위해 배지에 첨가된다.
탄소, 질소 및 무기 포스페이트 공급원 뿐만 아니라 임의의 필요한 보충물은 또한 단독으로 도입되거나 복합 질소 공급원과 같은 또 다른 보충물 또는 배지와의 혼합물로서 적당한 농도로 포함될 수 있다. 선택적으로, 배양 배지는 글루타티온, 시스테인, 시스타민, 티오글리콜레이트, 디티오에리트리톨 및 디티오트레이톨로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 환원제를 함유할 수 있다.
원핵 숙주 세포는 적합한 온도에서 배양한다. 이. 콜라이 성장을 위해, 예를 들어, 성장은 약 20℃ 내지 약 39℃, 약 25℃ 내지 약 37℃, 및 약 30℃를 포함하지만 이에 제한되지 않는 온도 범위에서 수행한다. 배지의 pH는 주로 숙주 유기체에 의존하여 약 5 내지 약 9 범위의 임의의 pH일 수 있다. 이. 콜라이를 위해, pH는 약 6.8 내지 약 7.4, 또는 약 7.0일 수 있다.
유도성 프로모터가 본 발명의 발현 벡터에 사용되는 경우, 단백질 발현은 프로모터의 활성화에 적합한 조건하에서 유도된다. 본 발명의 하나의 측면에서, PhoA 프로모터는 폴리펩티드의 전사를 제어하기 위해 사용된다. 따라서, 형질전환된 숙주 세포는 유도를 위해 포스페이트-제한 배지에서 배양한다. 일 구현예에서, 포스페이트-제한 배지는 C.R.A.P 배지이다 (문헌참조: 예를 들어, Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263: 133-147). 다양한 다른 유도제가, 당업계에 공지된 바와 같이, 사용되는 벡터 작제물에 따라 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 발현된 폴리펩티드는 숙주 세포의 주변 세포질로 분비되고 이로부터 회수된다. 단백질 회수는 일반적으로 삼투압 쇼크, 초음파 처리 또는 용해와 같은 수단에 의해 통상적으로 미생물을 파쇄시킴을 포함한다. 일단 세포가 파괴되면, 세포 파쇄물 또는 전체 세포는 원심분리 또는 여과에 의해 제거할 수 있다. 단백질은 예를 들어, 친화성 수지 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다. 대안적으로, 단백질은 배양 배지로 수송되고 여기에서 단리될 수 있다. 세포는 배양물로부터 제거될 수 있고 배양 상등액을 여과하고 생산된 단백질의 추가의 정제를 위해 농축시킨다. 상기 발현된 폴리펩티드는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 및 웨스턴 블롯 검정과 같은 통상적으로 공지된 방법을 사용하여 추가로 단리되고 동정될 수 있다.
발명의 하나의 양태에서, 항체 생산은 발효 공정에 의해 대량으로 수행된다. 다양한 대규모 유가식(fedbatch) 발효 과정이 재조합 단백질의 생산을 위해 가용하다. 대규모 발효는 적어도 1000 리터의 용량, 예를 들어 약 1,000 내지 100,000 리터의 용량을 갖는다. 이들 발효기는 산소 및 영양소, 특히 글루코스(통상의 탄소/에너지원)를 분포시키기 위해 교반기 임펠러를 사용한다. 소규모 발효는 일반적으로 볼륨 용량이 대략 100 리터 이하이고 약 1 리터 내지 약 100 리터 범위일 수 있는 발효기에서의 발효를 언급한다.
발효 공정에서, 단백질 발현의 유도는 통상적으로 세포가, 이 단계에서 세포가 초기 성장 정지 상태로 있는 목적하는 밀도에 대한 적합한 조건, 예를 들어, 약 180 내지 220의 OD550에서 성장된 후 개시된다. 다양한 유도제는 당업계에 공지되고 상기된 바와 같이, 사용된 벡터 작제물에 따라 사용될 수 있다. 세포는 유도 전 짧은 기간 동안 성장할 수 있다. 세포는 일반적으로 약 12 내지 50시간 동안 유도되도지만 보다 길거나 짧은 유도 시간이 사용될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 생산 수율 및 품질을 개선하기 위해, 다양한 발효 조건이 변형될 수 있다. 예를 들어, 분비된 항체 폴리펩티드의 적당한 어셈블리 및 폴딩을 개선하기 위해, 예를 들어, Dsb 단백질 (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD 및/또는 DsbG) 또는 FkpA (차페론 활성을 갖는 펩티딜프롤릴 시스,트랜스-이소머라제)와 같은 차페론 단백질을 과발현하는 추가의 벡터를 사용하여 숙주 원핵 세포를 동시 형질전환시킬 수 있다. 차페론 단백질은 세균 숙주 세포에서 생산되는 이종성 단백질의 적당한 폴딩 및 가용성을 촉진시키는 것으로 입증되었다[Chen et al. (1999) J Bio Chem 274: 19601-19605; Georgiou et al., U.S. Pat. No. 6,083,715; Georgiou et al, U.S. Pat. No. 6,027,888; Bothmann and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275: 17100-17105; Ramm and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275: 17106-17113; Arie et al. (2001) Mol. Microbiol. 39: 199-210].
발현된 이종성 단백질 (특히 단백질분해에 민감한 것들)의 단백질 분해를 최소화하기 위해, 단백질 분해 효소가 결핍된 특정 숙주 균주가 본 발명을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포 균주는 프로테아제 III, OmpT, DegP, Tsp, 프로테아제 I, 프로테아제 Mi, 프로테아제 V, 프로테아제 VI 및 이의 배합물과 같은 공지된 세균 프로테아제를 암호화하는 유전자에서 유전학적 돌연변이(들)을 수행하기 위해 변형시킬 수 있다. 일부 이. 콜라이 프로테아제-결핍 균주가 가용하고 예를 들어, 문헌[참조: Joly et al. (1998), supra; Georgiou et al, 미국특허 제5,264,365호; Georgiou et al., 미국 특허 제5,508,192호; Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996)]에 기재되어 있다.
일 구현예에서, 단백질분해 효소가 결핍되고 하나 이상의 차페론 단백질을 과발현하는 플라스미드로 형질전환된 이. 콜라이 균주는 본 발명의 발현 시스템에서 숙주 세포로서 사용된다.
항체 정제
일 구현예에서, 본원에서 생산된 항체 단백질은 추가의 검정 및 사용을 위해 실질적으로 균일성인 제제를 수득하기 위해 추가로 정제된다. 당업계에 공지된 표준 단백질 정제 방법을 사용할 수 있다. 하기의 과정들은 적합한 정제 과정들을 예시한다: 면역친화성 또는 이온-교환 칼럼상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 또는 DEAE와 같은 양이온-교환 수지 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전, 및 예를 들어, 세파덱스 G-75를 사용하는 겔 여과.
일 양태에서, 고체상에 고정화된 단백질 A는 본 발명의 항체 생성물의 면역친화성 정제를 위해 사용된다. 단백질 A는 항체의 Fc 영역에 고친화성으로 결합하는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureas) 기원의 41kD 세포벽 단백질이다[Lindmark et al (1983) J. Immunol. Meth. 62: 1-13]. 단백질 A가 고정화된 고체상은 유리 또는 실리카 표면을 포함하는 칼럼 또는 제어된 공극 유리 칼럼 또는 규산 칼럼일 수 있다. 일부 적용에서, 상기 칼럼은 오염물의 비특이적 부착을 가능하게는 차단하기 위해 글리세롤과 같은 시약으로 코팅된다.
정제의 제1 단계로서, 상기된 바와 같은 세포 배양물로부터 유래된 제제는 단백질 A 고정화된 고체상으로 적용하여 목적하는 항체가 단백질 A에 특이적으로 결합하도록 한다. 고체상은 이어서 세척하여 고체상에 비특이적으로 결합된 오염물을 제거한다. 최종적으로 본 발명의 항체는 용출에 의해 고체상으로부터 회수한다.
진핵 숙주 세포를 사용한 항체의 생산
벡터 성분은 일반적으로 하기 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 시그날 서열. 복제 오리진, 하나 이상의 마커 유전자, 증진제 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열.
(i) 시그날 서열 성분
진핵 숙주 세포에 사용하기 위한 벡터는 또한 시그날 서열, 또는 성숙한 단백질 또는 목적하는 폴리펩티드의 N-말단에서 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 일반적으로 선택된 이종성 시그날 서열은 숙주 세포에 의해 인지되고 가공되는 (즉 시그날 펩티다제에 의해 절단되는) 서열이다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 시그날 서열 및 바이러스 분비 리더, 에를 들어, 헤르페스 심플렉스 gD 시그날이 가용하다.
상기 전구체 영역에 대한 DNA는 판독 프레임내 항체를 암호화하는 DNA로 연결된다.
(ii) 복제 오리진
일반적으로, 복제 오리진 성분은 포유동물 발현 벡터를 위해 요구되지 않는다. 예를 들어, SV40 오리진은 통상적으로, 단지 이것이 어얼리 프로모터를 함유하기 때문에 사용될 수 있다.
(iii) 선택 유전자 성분
발현 및 클로닝 벡터는 선택성 마커로서도 호칭되는 선택 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어, 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대해 내성을 부여하거나 (b) 경우에 따라 영양요구성 결핍을 보충하거나 (c) 복합 배지로부터 가용하지 않은 중요한 영양물을 공급하는 단백질을 암호화한다.
선택 계획의 하나의 예는 숙주 세포의 성장을 정지시키기 위해 약물을 사용하는 것이다. 이종성 유전자로 성공적으로 형질전환된 상기 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생산하고 따라서 선택 용법에서 생존한다. 상기 우성 선택의 예는 약물로서 네오마이신, 마이코페놀산 및 하이그로마이신을 사용하는 것이다.
포유동물 세포에 대해 적합한 선택가능한 마커의 또 다른 예는 DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II(예를 들어, 영장류 메탈로티오네인 유전자), 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카복실라제 등과 같이 항체 핵산을 취득하기 위해 적격인 세포의 동정을 가능하게 하는 것들이다.
예를 들어, DHFR 선택 유전자로 형질전환된 세포는 먼저 모든 형질전환체를, DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트 (Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 배양함에 의해 동정될 수 있다. 야생형 DHFR이 사용되는 경우 적당한 숙주 세포는 예를 들어, DHFR 활성이 결핍된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주(예를 들어, ATCC CRL-9096)를 포함한다.
대안적으로, 항체, 야생형 DHFR 단백질 및 또 다른 선택가능한 마커, 예를 들어, 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제(APH)를 암호화하는 DNA 서열로 형질전환되거나 동시 형질전환된 숙주 세포 (특히 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)가 아미노글리코시드 항생제, 예를 들어, 가나마이신, 네오마이신 또는 G418과 같은 선택가능한 마커에 대한 선택 제제를 함유하는 배지에서 세포 성장에 의해 선택될 수 있다[문헌참조: 미국 특허 제4,965,199호].
(iv) 프로모터 성분
발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 숙주 유기체에 의해 인지되고 목적하는 폴리펩티드 (예를 들어, 항체)를 암호화하는 핵산으로 작동적으로 연결된 프로모터를 함유한다. 프로모터 서열은 진핵 세포에 대해 공지되어 있다. 실제로 모든 진핵세포 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 대략 25 내지 30개 염기 업스트림에 위치한 AT-풍부 영역을 갖는다. 많은 유전자들의 전사 개시로부터 70 내지 80개 염기 업스트림에서 밝혀진 또 다른 서열은 N이 임의의 누클레오타이드일 수 있는 CNCAAT 영역이다. 대부분의 진핵세포 유전자의 3' 말단에는 암호화 서열의 3' 말단으로 폴리 A 테일의 부가를 위한 시그날일 수 있는 AATAAA 서열이 있다. 모든 이들 서열들은 진핵세포 발현 벡터로 적합하게 삽입된다.
포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터 항체 폴리펩티드 전사는 예를 들어, 숙주 세포 시스템과 적격인 경우 폴리오마 바이러스, 파울폭스 바이러스, 아데노바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 2), 소 파필로마 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 시미안 바이러스 40(SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터 수득된 프로모터, 이종성 포유동물 프로모터, 예를 들어, 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터 또는 열 쇼크 프로모터에 의해 제어될 수 있다.
SV40 바이러스의 어얼리 및 레이트 프로모터는 또한 SV40 바이러스 복제 오리진을 함유하는 SV40 제한 단편으로서 간편하게 수득된다. 인간 사이토메갈로바이러스의 이메디에이트 어얼리 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 간편하게 수득된다. 벡터로서 소 파필로마 바이러스를 사용하는 포유동물 숙주에서 DNA를 발현하기 위한 시스템은 문헌[참조: 미국 특허제4,419,446호]에 기재되어 있다. 상기 시스템의 변형은 문헌[참조: 미국 특허 제4,601,978호]에 기재되어 있다. 또한, 헤르페스 심플렉스 바이러스로부터의 티미딘 키나제 프로모터의 제어하에 마우스 세포에서 인간 β-인터페론 cDNA의 발현에 대해 문헌[Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982)]을 참조한다. 대안적으로, 라우스 육종 바이러스의 긴 말단 반복체가 프로모터로서 사용될 수 있다.
(v) 인핸서 요소 성분
고등 진핵 세포에 의한 본 발명의 항체 폴리팝테아드를 암호화하는 DNA의 전사는 흔히 인핸서 서열을 벡터에 삽입함에 의해 증가될 수 있다. 많은 인핸서 서열은 포유동물 유전자(글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토프로테인 및 인슐린)로부터 공지되어 있다. 그러나, 통상적으로, 당업자는 진핵 세포 바이러스 기원의 인핸서를 사용한다. 이의 예는 복제 오리진의 레이트 측면상의 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 어얼리 프로모터 인핸서, 복제 오리진 레이트 측면 상의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 또한 진핵세포 프로모터의 활성화를 위한 증진 요소들에 대해 문헌[Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982)]을 참조한다. 상기 인핸서는 항체 펩티드-암호화 서열에 5' 또는 3' 위치에서 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 일반적으로 프로모터로부터 5' 부위에 위치한다.
(vi) 전사 종결 성분
진핵 숙주 세포에서 사용되는 발현 벡터는 통상적으로 또한 전사 종결을 위해 필요하고 mRNA를 안정화시키기 위해 필요한 서열을 함유한다. 상기 서열은 통상적으로 진핵 세포 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 비해독 영역인 5' 및 때로는 3'로부터 가용하다. 이들 영역은 항체를 암호화하는 mRNA의 비해독 부분에서 폴리아데닐화된 단편으로서 전사되는 누클레오타이드 분절을 함유한다. 하나의 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. 문헌[W094/11026] 및 본원에 기재된 발현 벡터를 참조한다.
(vii) 숙주 세포의 선택 및 형질전환
본원의 벡터 내 DNA에서 DNA를 클로닝하거나 발현시키기 위해 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 고등 진핵 세포를 포함하고, 이는 척추동물 숙주 세포를 포함한다. 배양 중 척추동물 세포의 증식(조직 배양)은 일상적인 과정이 되어버렸다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651)에 의해 형질전환된 몽키 신장 CV1 세포주; 인간 배아 신장 세포주(현탁 배양에서의 증식을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 마우스 세르톨리 세포(mouse Sertoli cells) (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); 몽키 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리칸 그린 몽키 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암종 세포주 (Hep G2)이다.
숙주 세포는 상기된 항체 생산용 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 목적하는 서열을 암호화하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절히 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양한다.
(viii) 숙주 세포의 배양
본 발명의 항체를 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. Ham's F10 (Sigma), 최소 필수 배지((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma), 및 듈베코 변형된 이글스 배지 ((DMEM), Sigma)와 같은 시판되는 배지가 숙주 세포를 배양하기에 적합하다. 추가로, 문헌[참조: Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), 미국 특허 제4,767,704호; 제4,657,866호; 제4,927,762호; 제4,560,655호; 또는 제5,122,469호; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re. 30,985]에 기재된 임의의 배지가 숙주 세포용 배양 배지로서 사용될 수 있다. 이들 임의의 배지에는 필요한 만큼 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예를 들어, 인슐린, 트랜스페린 또는 상피 성장 인자), 염 (예를 들어, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제 (예를 들어 HEPES), 누클레오타이드 (예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예를 들어 GENTAMYCIN™ 약물), 미량 성분 요소 (일반적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의되는), 및 글루코스 또는 균등 에너지원이 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충물은 또한 당업자에게 공지된 적당한 농도로 포함될 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현용으로 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것들이고 당업자에게 자명하다.
(ix) 항체의 정제
재조합 기술을 사용하는 경우, 상기 항체는 세포내에서 생산되거나, 배지로 직접 분비될 수 있다. 항체가 제1 단계로서 세포내에서 생산되는 경우, 미립자 파쇄물, 숙주 세포 또는 용해된 단편들은 일반적으로 예를 들어, 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 항체가 배지로 분비되는 경우, 상기 발현 시스템으로부터의 상등액은 일반적으로 먼저, 시판되는 단백질 농축 필터, 예를 들어, 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘 한외여과 유니트를 사용하여 농축된다. 프로테아제 억제제, 예를 들어 PMSF는 단백질분해를 억제하기 위해 임의의 이전의 단계에 포함될 수 있고 항생제는 우발적 오염물의 성장을 방지하기 위해 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은 예를 들어, 하이드록시애퍼타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있고 친화성 크로마토그래피는 일반적으로 허용되는 정제 기술이다. 친화성 리간드로서 단백질 A와 같은 친화성 시약의 적합성은 항체에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 의존한다. 단백질 A를 사용하여 인간 γ 1, γ 2, 또는 γ 4 중쇄를 기초로 하는 항체를 정제할 수 있다 (문헌참조: Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 γ 3을 위해 추천된다 (문헌참조: Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). 친화성 리간드가 부착된 매트릭스는 가장 흔하게 아가로스이지만 다른 매트릭스가 가용하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예를 들어, 조절된 공극 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스로 성취될 수 있는 것 보다 신속한 유동 속도 및 보다 짧은 가공 시간을 가능하게 한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABX™ 수지(J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)는 정제를 위해 유용하다. 이온-교환 칼럼상의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지(예를 들어, 폴리아스파르트산 칼럼) 상의 헤파린 SEPHAROSE™ 크로마토그래피상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전과 같은 단백질 정제를 위한 다른 기술이 또한 회수될 항체에 의존하여 가용하다.
임의의 예비 정제 단계(들) 후, 목적하는 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물은 경우에 따라, 예를 들어, 일반적으로 저염 농도 (예를 들어, 약 0 내지 0.25M 염)에서 수행되는 약 2.5 내지 4.5 사이의 pH에서 용출 완충액을 사용한 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의한 추가의 정제 단계에 적용될 수 있다.
일반적으로, 연구, 시험 및 임상 용도에 사용하기 위한 항체를 제조하기 위한 기술 및 방법은 당업계에 널리 확립되어 있는 것으로 주지되어야 하고 이는 상기된 바와 일치하고/하거나 목적하는 특정 항체에 대해 당업자에 의해 적정한 것으로 간주된다.
활성 검정
본 발명의 항체는 당업계에 공지된 다양한 검정에 의해 이들의 물리적/화학적 성질 및 생물학적 기능에 대해 특징 분석될 수 있다.
정제된 항체는 N-말단 서열 분석, 아미노산 분석, 비-변성 크기 배제 고압 액체 크로마토그패리(HPLC), 잘량 분광측정기, 이온 교환 크로마토그래피 및 파파인 분해를 포함하지만 이에 제한되지 않는 일련의 검정에 의해 추가로 특징 분석될 수 있다.
필요한 경우, 항체는 이들의 생물학적 활성에 대해 분석된다. 일부 양태에서, 본 발명의 항체는 이들의 항원 결합 활성에 대해 시험된다. 당업계에 공지되고 본원에 사용될 수 있는 항원 결합 검정은 제한 없이 웨스턴 블롯, 방사선면역검정, ELISA (효소 결합된 면역흡착 검정), "샌드위치" 면역검정, 면역침전 검정, 형광 면역검정, 화학발광 면역검정, 나노입자 면역검정, 아프타머 면역검정 및 단백질 A 면역검정과 같은 기술을 사용하는 임의의 적접적이거나 경쟁적 결합 검정을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일 구현예에서, 본 발명은 모두가 아닌 일부의 이펙터 기능을 지닌 변형된 항체를 고려하며, 이는 생체내에서 항체의 반감기가 중요하지만 특정 이펙터 기능(예를 들어, 보체 및 ADCC)이 필수적이지 않거나 유해한 다수의 적용에 대한 요망되는 후보물질을 만든다. 특정 구현예에서, 단지 요망되는 성질들이 유지되는 것을 보장하기 위해 항체의 Fc 활성이 측정된다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정은 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체(FcR) 결합 검정은 항체가 FcyR 결합이 부족하지만(이에 따라, ADCC 활성의 부족이 가능함), FcRn 결합 능력을 보유하는 것을 보장하기 위해 수행될 수 있다. ADCC, NK 세포를 매개하기 위한 일차 세포는 단지 FcyRIII을 발현시키는 반면, 단핵구는 FcyRI, FcyRII 및 FcyRIII을 발현시킨다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 464쪽의 표 3에 요약되어 있다. 고려되는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 일 예는 미국특허번호 제5,500,362호 또는 미국특허번호 제5,821,337호에 기재되어 있다. 이러한 검정을 위한 유용한 이펙터 세포는 말초혈액 단핵 세포(PBMC) 및 자연 킬러(NK) 세포를 포함한다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 고려되는 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어, 문헌[Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 기재된 것과 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다. Clq 결합 검정은 또한, 항체가 Clq를 결합하지 못하고 이에 따라 CDC 활성이 부족함을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 보체 활성을 평가하기 위하여, 예를 들어, 문헌[Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 검정이 수행될 수 있다. FcRn 결합 및 생체내 제거율/반감기 결정이 또한, 당해 분야에 공지된 방법들을 이용하여 수행될 수 있다.
항체 단편
본 발명은 항체 단편을 포함한다. 특정 상황에서, 전체 항체 보다는 항체 단편을 사용하는 이점이 있다. 보다 작은 크기의 단편들은 신속한 제거를 가능하게 하고 고형 종양으로의 개선된 접근을 유도할 수 있다.
항체 단편을 생산하기 위한 다양한 기술이 개발되었다. 통상적으로, 이들 단편은 온전한 항체의 단백질 분해를 통해 유래하였다(문헌참조: 예를 들어, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992); 및 Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). 그러나, 이들 단편은 현재 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생산될 수 있다. Fab, Fv 및 ScFv 항체 단편은 모두 이. 콜라이에서 발현되고 이로부터 분비될 수 있어 대량의 상기 단편들의 용이한 생산을 가능하게 한다. 항체 단편은 상기 논의된 항체 파아지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수될 수 있고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다 (문헌참조: Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). 또다른 방법에 따라, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 분리될 수 있다. 살비지(salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하는 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')2 단편은 미국 특허 제5,869,046호에 기재되어 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술은 당업자에게 자명하다. 다른 양태에서, 선택된 항체는 단일쇄 Fv 단편(scFv)이다. 문헌[WO 93/16185; 미국 특허 제5,571,894호; 및 제5,587,458호]을 참조한다. Fv 및 sFv는 불변 영역이 없는 온전한 조합 부위를 갖는 유일한 종이고; 따라서, 이들은 생체내 사용 동안에 감소된 비특이적 결합에 적합하다. sFv 융합 단백질은 sFv의 아미노 또는 카복시 말단에서 이펙터 단백질의 융합을 생산하도록 작제될 수 있다. 문헌[Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra]을 참조한다. 항체 단편은 또한 예를 들어, 미국 특허 제5,641,870호에 기재된 바와 같이 "선형 항체"일 수 있다. 상기 선형 항체 단편들은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
인간화된 항체
본 발명은 인간화된 항체를 포함한다. 비-인간 항체를 인간화하기 위한 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 인간화된 항체는 비-인간의 공급원으로부터 여기에 도입되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 흔히 "임포트" 잔기로서 언급되고 이는 통상적으로 "임포트" 가변 도메인으로부터 취해진다. 인간화는 필수적으로 문헌[참조: Winter and co-workers (Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536)]의 방법에 따라. 초가변 영역 서열을 인간 항체의 상응하는 서열로 대체함에 의해 수행될 수 있다. 따라서, 상기 "인간화된" 항체는 키메라 항체 (미국 특허 제4,816,567호)이고 여기서, 실질적으로 온전한 인간 가변 도메인 일부가 비-인간 종 기원의 상응하는 서열에 의해 대체되어 있다. 실제로, 인간화된 항체는 통상적으로, 일부 초가변 영역 잔기 및 능히 일부 FR 잔기가 설치류 항체에서 유사한 부위 기원의 잔기들에 의해 대체되어 있는 전형적 인간 항체이다.
인간화된 항체를 제조하는데 사용될 경쇄 및 중쇄 둘 다의 인간 가변 도메인의 선택은 항원성을 감소시키기 위해 중요할 수 있다. 소위 "베스트-피트(best-fit)" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열은 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 설치류 서열에 가장 밀접한 인간 서열은 이어서 인간화된 항체에 대한 인간 프레임워크로서 수용된다 (문헌참조: Sims et al. (1993) J. Immunol. 151:2296; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 서브그룹의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정 프레임워크를 사용한다. 동일한 프레임워크는 여러 상이한 인간화된 항체에 대해 사용될 수 있다 (문헌참조: Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285; Presta et al. (1993) J. Immunol., 151 :2623).
항체가 항원에 대해 높은 친화성을 보유하고 다른 호전적 생물학적 성질을 보유하도록 인간화되는 것이 추가로 일반적으로 요구될 수 있다. 이러한 목적을 성취하기 위해, 하나의 방법에 따라, 인간화된 항체는 모 서열, 모 서열 및 인간화된 서열의 3차원 모델을 사용한 다양한 개념적 인간화된 생성물의 분석 공정에 의해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상적으로 가용하고 당업자에게 친숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 형태적 구조를 도해하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 가용하다. 이들 디스플레이의 조사는 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기들의 가능한 역할의 분석, 즉, 이의 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기들의 분석을 가능하게 한다. 상기 방식으로, FR 잔기들은 수용자 및 임포트 서열로부터 선택되고 조합될 수 있어 목적하는 항체 특성, 예를 들어, 표적 항원(들)에 대해 증가된 친화성을 성취될 수 있다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기는 항원 결합에 영향을 미치는데 직접적으로 및 가장 실질적으로 관여한다.
인간 항체
본 발명의 인간 항-SSEA-3/SSEA-4/GloboH 항체는, 인간-유래된 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열(들)을 상기된 바와 같은 공지된 인간 불변 도메인 서열(들)과 조합함에 의해 작제될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 인간 모노클로날 항-SSEA-3/SSEA-4/GloboH 항체는 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주는 예를 들어, 문헌[참조: Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); and Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)]에 기재되어 있다.
현재, 면역화시, 내인성 면역글로불린 생산의 부재하에 인간 항체의 완전한 레퍼토리를 생산할 수 있는 유전자 전이 동물 (예를 들어, 마우스)을 제조할 수 있다. 예를 들어, 키메라 및 생식선 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역(JH) 유전자의 동종접합성 결실이 내인성 항체 생산을 완전히 억제시키는 것으로 보고되었다. 상기 생식선 돌연변이 마우스에서 인간 생식선 면역글로불린 유전자 어레이의 전달은 항원 챌린지시 인간 항체의 생산을 유도한다. 예를 들어, 문헌[Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol., 7: 33 (1993)]을 참조한다.
유전자 셔플링은 또한 비-인간, 예를 들어, 설치류, 항체로부터 인간 항체를 유도하기 위해 사용될 수 있고, 여기서, 상기 인간 항체는 출발 비-인간 항체와 유사한 친화성 및 특이성을 갖는다. "에피토프 임프린팅"으로도 불리우는 상기 방법에 따라서, 상기된 바와 같은 파아지 디스플레이 기술에 의해 수득된 비-인간 항체 단편의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역은 인간 V 도메인 유전자 레퍼토리로 대체되어 비-인간 쇄/인간 쇄 scFv 또는 Fab 키메라 집단을 생성시킨다. 항원과의 선택은 비-인간 쇄/인간 쇄 키메라 scFv 또는 Fab의 단리를 유도하고 여기서, 상기 인간 쇄는 1차 파아지 디스플레이 클론에서 상응하는 비-인간 쇄의 제거시 파괴된 항원 결합 부위를 복구하고, 즉 에피토프는 인간 쇄 파트너의 선택을 지배한다 (임프린트). 상기 공정이 나머지 비-인간 쇄를 대체하기 위해 반복되는 경우, 인간 항체가 수득된다[문헌참조: 1993년 4월 1일자로 공개된 PCT WO 93/06213]. CDR 그래프팅에 의한 비-인간 항체의 통상적 인간화같지 않게, 상기 기술은 비-인간 쇄의 FR 또는 CDR 잔기를 갖지 않는 완전한 인간 항체를 제공한다.
이중특이적 항체
이중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 항원들에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 특정 구현예에서, 이중특이적 항체는 인간 또는 인간화된 항체이다. 특정 구현예에서, 결합 특이성 중 하나는 특이적 라이신 연결을 포함하는 SSEA-3/SSEA-4/GloboH에 대한 것이고 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 구현예에서, 이중특이적 항체는 2개의 상이한 라이신 연결을 갖는 2개의 상이한 SSEA-3/SSEA-4/GloboH에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 완전한 길이의 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')2 이중특이적 항체)으로서 제조될 수 있다.
이중특이적 항체를 제조하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 통상적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 동시 발현을 기초로 하고, 여기서, 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다(문헌참조: Milstein and Cuello, Nature, 305: 537 (1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류 때문에, 이들 하이브리도마(쿠아드로마)는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생산하고 이중에서 유일한 하나가 올바른 이중특이적 구조를 갖는다. 일반적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 수행된 올바른 분자의 정제는 차라리 복잡하고 생성물 수율은 낮다. 유사한 과정은 문헌[참조: WO 93/08829 published May 13, 1993, and in Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655 (1991)]에 기재되어 있다.
상이한 양태에 따라, 목적하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인 (항체-항원 조합 부위)은 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 융합체는 예를 들어, 힌지, CH2, 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 갖는다. 특정 양태에서, 경쇄 결합을 위해 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역(CH1)은 융합체 중 적어도 하나에 존재한다. 면역글로불린 중쇄 융합체 및 경우에 따라 면역글로불린 경쇄를 암호화하는 DNA는 별도의 발현 벡터에 삽입되고 적합한 숙주 유기체 내로 동시 형질감염된다. 이것은 작제에 사용되는 3개의 폴리펩티드 쇄의 불균등 비율이 최적의 수율을 제공하는 경우의 양태에서 3개의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 큰 유동성을 제공한다. 그러나, 균등한 비율의 적어도 2개의 폴리펩티드 쇄의 발현이 고수율을 유도하거나 상기 비율이 특정 유의성을 갖지 않는 경우 하나의 발현 벡터에서 2개 또는 모든 3개의 폴리펩티드 쇄를 위해 암호화 서열을 삽입할 수 있다.
상기 방법의 일 구현예에서, 이중특이적 항체는 하나의 아암에서 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄 및 다른 아암에서 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍(제2 결합 특이성을 제공하는)으로 구성된다. 상기 비대칭 구조는 이중특이적 분자의 단지 절반에서 면역글로불린 경쇄의 존재가 용이한 분리 방법을 제공하기 때문에 원치않는 면역글로불린 쇄 조합으로부터 목적하는 이중특이적 화합물의 분리를 촉진시키는 것으로 밝혀졌다. 이러한 방법은 문헌[참조: WO 94/04690]에 기재되어 있다. 이중특이적 항체를 생성시키는 추가의 세부 사항에 대해 예를 들어, 문헌[Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]을 참조한다.
또 다른 방법에 따라, 항체 분자 쌍 간의 계면은 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 %를 최대화하기 위해 가공될 수 있다. 상기 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 상기 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄는 대형 측쇄(예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 대형 측쇄(들)과 동일하거나 유사한 크기의 보상적 "공간"은 대형 아미노산 측소를 보다 작은 하나(예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함에 의해 제2 항체 분자의 계면 상에 생성된다. 이것은 동종이량체와 같은 다른 원치 않는 최종 생성물 이상으로 이종이량체의 수율을 증가시키기 위한 기작을 제공한다.
이중특이적 항체는 가교결합되거나 "헤테로콘주게이트" 항체를 포함한다. 예를 들어, 헤테로콘주게이트 중 항체의 하나는 아비딘에 커플링될 수 있고 다른 하나는 비오틴에 커플링될 수 있다. 상기 항체는 예를 들어, 면역계 세포를 원치않는 세포로 표적화하기 위해 제안되었고 (미국 특허 제4,676,980호), HIV 감염의 치료를 위해 제안되었다 (WO 91/00360, WO 92/00373, 및 EP 03089). 헤테로콘주게이트 항체는 임의의 간편한 가교 결합 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 적합한 가교 결합제는 당업계에 널리 공지되어 있고 다수의 가교결합 기술과 함께 미국 특허 제4,676,980호에 기재되어 이다.
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성시키기 위한 기술은 또한 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 화학적 연결을 사용하여 제조될 수 있다. 문헌[참조: Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)]은 온전한 항체가 F(ab')2 단편을 생성시키기 위해 단백질분해적으로 절단되는 과정을 기재한다. 이들 단편들은 인접한 디티올을 안정화시키고 분자간 디설파이드 형성을 차단하기 위해 디티올 착화제 아비산 나트륨의 존재하에 환원시킨다. 생성된 Fab' 단편들은 이어서 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 이어서 Fab'-TNB 유도체 중 하나는 머캅토에틸아민을 사용한 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환되고 이중특이적 항체를 형성하기 위해 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합한다. 생성된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 제제로서 사용될 수 있다.
최근 진행은 이중특이적 항체를 형성하기 위해 화학적으로 커플링될 수 있는 이. 콜라이로부터 Fab'-SH 단편의 직접적인 회수를 촉진시켰다. 문헌[참조: Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)]은 완전히 인간화된 이중특이적 항체 F(ab')2 분자의 생산을 기재한다. 각각의 Fab' 단편은 이. 콜라이로부터 분비되었고 이중특이적 항체를 형성하기 위해 시험관내 직접적인 화학적 커플링에 적용하였다. 이와 같이 형성된 이중특이적 항체는 인간 유방 종양 표적에 대해 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 유발할 뿐만 아니라 HER2 수용체를 과발현하는 세포 및 정상 인간 T 세포에 결합할 수 있었다.
재조합 세포 배양물로부터 직접적으로 이중특이적 항체 단편을 제조하고 단리시키기 위한 다양한 기술은 또한 기재되어 있다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 류신 지퍼를 사용하여 생산하였다. 문헌[Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)]을 참조한다. Fos 및 Jun 단백질로부터 류신 지퍼 펩티드는 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결시켰다. 상기 항체 동종이량체는 힌지 영역에서 환원시켜 단량체를 형성하고 이어서 재산화시켜 항체 이종이량체를 형성한다. 상기 방법은 또한 항체 동종이량체의 생산을 위해 사용될 수 있다. 문헌[참조: The "diabody" technology described by Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 대안적 메카니즘을 제공하였다. 상기 단편은 동일한 쇄 상에서 2개의 도메인 간에 쌍 형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 따라서, 하나의 단편의 VH 및 VL 도메인은 또 다른 단편의 상보적 VL 및 VH 도메인과 쌍을 형성하도록 하였다. 따라서, 하나의 단편의 VH 및 VL 도메인은 또 다른 단편의 상보적 VL 및 VH 도메인과 쌍을 형성하여 2개의 항원 결합 부위를 형성하도록 하였다. 단일쇄 Fv(sFv) 이량체를 사용함에 의해 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또 다른 전략은 또한 보고되었다. 문헌[Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)]을 참조한다.
2가 초과의 항체가 고려된다. 예를 들어, 3특이적 항체가 제조될 수 있다[문헌참조: Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)].
다가 항체(multivalent antibody)
다가 항체는, 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 2가 항체보다 신속하게 내재화 (및/또는 동화)될 수 있다. 본 발명의 항체는 3개 이상의 항원 결합 부위(예를 들어, 4가 항체)를 갖는 다가 항체 (이는 IgM 부류와는 다른)일 수 있고 이는 항체의 폴리펩티드 쇄를 암호화하는 핵산의 재조합 발현에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 다가 항체는 이량체화 도메인 및 3개 이상이 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 상기 이량체화 도메인은 예를 들어, Fc 영역 또는 힌지 영역을 포함한다 (또는 이루어진다). 상기 시나리오에서, 상기 항체는 Fc 영역에 대한 아미노-말단에 Fc 영역 및 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함한다. 하나의 양태에서, 다가 항체는 예를 들어, 3개 내지 약 8개, 또는 4개의 항원 결합 부위를 포함한다 (또는 이루어진다). 다가 항체는 적어도 하나의 폴리펩티드 쇄(예를 들어, 2개의 폴리펩티드 쇄)를 포함하고, 여기서, 상기 폴리펩티드 쇄(들)는 2개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 상기 폴리펩티드 쇄(들)는 VDl-(Xl)n-VD2-(X2)n-Fc를 포함할 수 있고, 여기서, VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, Fc는 Fc 영역의 하나의 폴리펩티드 쇄이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩티드를 나타내고, n은 0 또는 1이다. 예를 들어, 폴리펩티드 쇄(들)는 다음을 포함할 수 있다: VH-CH1-유연성 링커-VH-CHl-Fc 영역 쇄; 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역 쇄. 본원에서 다가 항체는 적어도 2개(예를 들어, 4개)의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 본원의 다가 항체는 예를 들어, 약 2 내지 약 8개 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 여기서 고려되는 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드는 경쇄 가변 도메인을 포함하고 임의로 CL 도메인을 추가로 포함한다. 항체 변이체
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항체의 아미노산 서열 변형(들)이 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화력 및/또는 다른 생물학적 성질을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 적당한 누클레오타이드 변화를 항체 핵산으로 도입함에 의해 또는 펩티드 합성에 의해 제조된다. 상기 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열내 잔기들로부터 결실, 및/또는 이들로의 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합은 최종 작제물에 이르도록 만들어질 수 있고 단, 최종 작제물은 목적하는 특성을 갖는다. 아미노산 변형은 서열이 만들어진 시점에서 대상 항체 아미노산 서열에 도입될 수 있다.
돌연변이 유발을 위해 바람직한 위치인 항체의 특정 잔기 또는 영역의 동정을 위해 유용한 방법은 문헌[참조: Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이 유발"로 불리운다. 여기서, 잔기 또는 표적 잔기들 그룹은 동정되고 (예를 들어, arg, asp, his, lys, 및 glu와 같은 하전된 잔기들) 항원과 아미노산의 상호작용에 영향을 미치는 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 대체된다. 상기 치환에 대한 기능적 민감성을 입증하는 상기 아미노산 위치는 이어서 추가로 또는 다른 변이체를 치환 부위에서 또는 상기 부위에 대해 도입함에 의해 개량한다. 따라서, 아미노산 서열 변화를 도입하기 위한 부위를 미리 결정하지만, 돌연변이 자체의 성질은 미리 결정할 필요는 없다. 예를 들어, 소정의 부위에서 돌연변이의 수행능을 분석하기 위해, ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이 유발은 표적 코돈 또는 영역에서 수행되고 발현된 면역글로불린은 목적하는 활성에 대해 스크리닝한다.
아미노산 서열 삽입은 단일 또는 다중 아미노산 잔기들의 내부서열 삽입 뿐만 아니라 1개 잔기 내지 100개 이상의 잔기들을 함유하는 폴리펩티드까지 길이의 범위에 이르는 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합체를 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 세포독성 폴리펩티드에 융합된 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 (예를 들어, ADEPT에 대해) 또는 폴리펩티드로의 항체의 N- 또는 C-말단의 융합을 포함한다.
또 다른 타입의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는 상이한 잔기에 의해 대체된 항체 분자에서 적어도 하나의 아미노산 잔기를 갖는다. 치환적 돌연변이 유발을 위해 가장 큰 목적하는 부위는 초가변 영역을 포함하지만 FR 변형이 또한 고려된다. 보존성 치환은 "바람직한 치환"의 표제하에 표 A에 나타낸다. 상기 치환이 생물학적 활성에서의 변화를 유도하는 경우, 표 A에서 "예시적 치환"으로 지칭된 보다 실질적 변화 또는 아미노산 부류를 참조하여 하기에 추가로 기재된 바와 같은 변화가 도입될 수 있고 생성물을 스크리닝한다.
[표 A]
바람직한 본래의 예
잔기 치환 치환
Ala (A) Val; Leu; Ile Val
Arg (R) Lys; Gin; Asn Lys
Asn (N) Gin; His; Asp, Lys; Arg Gin
Asp (D) Glu; Asn Glu
Cys (C) Ser; Ala Ser
Gin (Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp; Gin Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn; Gin; Lys; Arg Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Leu
Phe; 노르류신
Leu (L) 노르류신; Ile; Val; Ile
Met; Ala; Phe
Lys (K) Arg; Gin; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; lie Leu
Phe (F) Trp; Leu; Val; lie; Ala; Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val; Ser Ser
Trp (W) Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Leu
Ala; 노르류신
항체의 생물학적 성질에서 실질적 변형은 (a) 예를 들어, 시트 또는 나선 형태로서 치환의 분야에 폴리펩티드 골격의 구조, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는 것에 대한 이들의 효과가 상당히 상이한 치환을 선택함에 의해 성취된다. 아미노산은 이들의 측쇄의 성질에서 유사성에 따라 분류될 수 있다 (문헌참조: A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)):
(1) 비극성: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(2) 하전되지 않은 극성: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gin (O)
(3) 산성: Asp (D), Glu (E)
(4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His (H)
대안적으로, 천연의 잔기들은 통상의 측쇄 성질을 기준으로 그룹으로 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, He;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 주는 잔기들: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존성 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환시킴을 필요로 한다. 상기 치환된 잔기들은 또한 보존성 치환 부위로 또는 나머지(비-보존성) 부위로 도입될 수 있다.
치환 변이체의 하나의 타입은 모 항체 (예를 들어, 인간화된 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기들을 치환시킴을 포함한다. 일반적으로, 추가의 개발을 위해 선택된 수득한 변이체(들)는 이들 생성되는 모 항체에 비하여 변형된 (예를 들어, 개선된) 생물학적 성질을 갖는다. 상기 치환 변이체를 생성하기 위한 간편한 방법은 파아지 디스플레이를 사용하는 친화성 성숙화를 포함한다. 간략하게, 여러 초가변 영역 부위(예를 들어, 6 내지 7개 부위)는 각각의 부위에서 모든 가능한 아미노산 치환을 생성하도록 돌연변이된다. 이와 같이 생성된 항체는 각각의 입자내 팩키징된 파아지 코트 단백질 (예를 들어, M13의 유전자 III 생성물)의 적어도 일부와의 융합체로서 필라멘트 파아지 입자로부터 디스플레이된다. 이어서 파아지-디스플레이된 변이체는 본원에 기재된 바와 같이 이들의 생물학적 활성(예를 들어, 결합 친화력)에 대해 스크리닝한다. 변형시키기 위한 후보 초가변영역 부위를 동정하기 위해, 스캐닝 돌연변이 유발 (예를 들어, 알라닌 스캐닝)은 항원 결합에 상당히 기여하는 초가변 영역 잔기들을 동정하기 위해 수행될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항체와 항원 간의 접촉점을 동정하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 이로울 수 있다. 상기 접촉 잔기들 및 이웃하는 잔기는 당업계에 공지된 기술에 따른 치환을 위한 후보이고, 이것은 본원에서 설명된 것들을 포함한다. 일단 상기 변이체가 생성되면, 변이체 패널은 당업계에 공지된 기술을 사용한 스크리닝에 적용하고 이는 본원에 기재된 것들을 포함하고, 하나 이상의 관련 검정에서 우수한 성질을 갖는 항체는 추가의 개발을 위해 선택될 수 있다.
항체의 아미노산 서열 변이체를 암호화하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 이들 방법은 천연 공급원으로부터의 단리(천연의 아미노산 서열 변이체의 경우) 또는 항체의 초기 제조된 변이체 또는 비-변이체 버젼의 올리누클레오타이드-매개된(또는 부위-지시된) 돌연변이 유발, PCR 돌연변이 유발 및 카세트 돌연변이 유발에 의해 제조를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
발명의 항체의 Fc 영역에서 하나 이상의 아미노산 변형을 도입함으로써 Fc 영역 변이체를 생성시키는 것이 요구될 수 있다. Fc 영역 변이체는 힌지 시스테인의 것을 포함하는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형(예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열(예를 들어, 인간 IgGl, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
이러한 설명 및 당해 분야의 교시에 따르면, 일부 구현예에서, 본 발명의 항체가 예를 들어, Fc 영역에서, 야생형 상대 항체와 비교하여, 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다는 것이 고려된다. 그렇더라도, 이러한 항체는 이의 야생형 상대와 비교하여 치료 유용성에 대해 요구되는 실질적으로 동일한 특징을 보유할 것이다. 예를 들어, 특정 변형이 예를 들어, W099/51642호에 기술된 바와 같이 변형된(즉, 개선되거나 축소된) Clq 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC)을 야기시키는 Fc 영역에서 이루어질 수 있을 것으로 사료된다[문헌 [Duncan & Winter Nature 322:738-40 (1988); 미국특허번호 제5,648,260호; 제5,624,821호; 및 Fc 영역 변이체의 다른 예에 관해 W094/29351호] 참조].
일 양태에서, 본 발명은 Fc 영역을 포함하는 Fc 폴리펩티드의 계면에서의 개질을 포함하는 항체를 제공하며, 여기서, 개질은 헤테로다이머화(heterodimerization)를 촉진시키고/거나 증진시킨다. 이러한 개질은 제1 Fc 폴리펩티드에 돌기의 도입 및 제2 Fc 폴리펩티드에 공동의 도입을 포함하며, 여기서, 돌기는 제1 및 제2 Fc 폴리펩티드의 복합화를 증진시키기 위해 공동에 정위 가능하다. 이러한 개질을 갖는 항체를 생성시키는 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국특허 제5,731,168호에 기술된 바와 같다.
면역콘주게이트(immunoconjugate)
또 다른 양태에서, 본 발명은 화학치료학적 제제, 약물, 성장 억제 제제, 독소(예를 들어, 세균, 진균류, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 이의 단편) 또는 방사선활성 동위원소(즉, 방사선콘주게이트)와 같은 세포독성제에 콘주게이팅된 항체를 포함하는, 면역콘주게이트, 또는 항체-약물 콘주게이트(ADC)를 제공한다.
세포독성 또는 세포성장 억제제, 즉, 암의 치료에서 종양 세포를 사멸시키거나 억제하는 약물의 국소 전달을 위한 항체-약물 콘주게이트의 사용 (문헌참조: Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26: 151-172; 미국 특허 제4,975,278호)은 약물 잔기의 종양으로의 표적화된 전달 및 세포내 축적을 가능하게 하고, 여기서, 이들 비콘주게이팅된 약물 제제의 전신 투여는 제거되어야 하는 종양 세포 뿐만 아니라 정상 세포에 대해 수용 가능하지 않은 수준의 독성을 유발할 수 있다 (문헌참조: Baldwin et al., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), pp. 475-506). 이로써 최소 독성을 갖는 최대 효능이 모색된다. 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체 둘 다는 이들 전략에서 유용한 것으로 보고되었다 (문헌참조: Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21: 183-87). 이들 방법에 사용되는 약물은 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 및 빈데신을 포함한다 (문헌참조: Rowland et al., (1986) supra). 항체-독소 콘주게이트에 사용되는 독소는 디프테리아 독소와 같은 세균 독소, 리신과 같은 식물 독소, 겔다나마이신과 같은 작은 분자(문헌참조: Mandler et al (2000) Jour, of the Nat. Cancer Inst. 92(19): 1573-1581 ; Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), 마이탄시노이드 (문헌참조: EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623), 및 칼리케아미신(문헌참조: Lode et al (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al (1993) Cancer Res. 53:3336-3342)을 포함한다. 독소는 투부틴 결합, DNA 결합 또는 토포이소머라제 억제를 포함하는 메카니즘에 의해 이들의 세포독성 및 세포성장 억제 효과에 영향을 줄 수 있다. 일부 세포독성 약물은 대형 항체 또는 단백질 수용체 리간드에 접합되는 경우 불활성이거나 덜 활성인 경향이 있다.
ZEVALIN®(이브리투모맙 티욱세탄, Biogen/Idec)은 티오우레아 링커-킬레이터에 의해 결합된 111In 또는 90Y 방사성 동위원소 및 정상 및 악성 B 림프구의 표면 상에 발견된 CD20 항원에 대해 유도된 뮤린 IgG1 카파 모노클로날 항체로 이루어진 항체-방사성 동위원소 콘주게이트이다[Wiseman et al (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77; Wiseman et al (2002) Blood 99(12):4336-42; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69]. ZEVALIN이 B-세포 비-호지킨 림프종(NHL; non-Hodgkin's Lymphoma)에 대한 활성을 갖지만, 투여는 대부분의 환자에서 중증의 그리고 장기 혈구감소증을 야기시킨다. MYLOTARG™(겜투주맙 오조가마이신, Wyeth Pharmaceuticals), 즉 칼리케아마이신에 연결된 hu CD33 항체로 이루어진 항체 약물 콘주게이트는 2000년에 주사에 의한 급성 골수성 백혈병의 치료를 위해 승인된 것이다[Drugs of the Future (2000) 25(7):686; 미국특허번호 제4,970,198호; 제5,079,233호; 제5,585,089호; 제5,606,040호; 제5,693,762호; 제5,739,116호; 제5,767,285호; 제5,773,001호]. 칸투주맙 메르탄신(Immunogen, Inc.), 즉, 마이탄시노이드 약물 모이어티, DM1에 디설파이드 링커 SPP를 통해 연결된 huC242 항체로 이루어진 항체 약물 콘주게이트는 결장, 췌장, 위, 등과 같은, CanAg를 발현시키는 암의 치료를 위해 시험된다. MLN-2704[Millennium Pharm., BZL Biologies, Immunogen Inc.], 즉, 마이탄시노이드 약물 모이어티, DM1에 연결된 항-전립선 특이적 막 항원(PSMA)으로 이루어진 항체 약물 콘주게이트는 전립선 종양의 잠재적 치료를 위해 시험된다. 아우리스타틴 펩티드, 아우리스타틴 E(AE) 및 모노메틸아우리스타틴(MMAE), 돌라스타틴의 합성 유사체들은 키메라 모노클로날 항체 cBR96(암종 상에 루이스 Y에 대해 특이적) 및 cAC1O(혈액성 악성 종양 상의 CD30에 대해 특이적)[Doronina et al (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784]에 콘주게이팅되고 치료제 개발 중에 있다.
면역콘주게이트의 생성에서 유용한 화학치료제는 본원(상기)에 기술되어 있다. 사용될 수 있는 효소적 활성 독소 및 이의 단편은 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 엑소독소 A 사슬(슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테센을 포함한다[예를 들어, 1993년 10월 28일에 공개된 WO 93/21232호 참조]. 다양한 방사성 핵종은 방사성 콘주게이팅된 항체의 생산을 위해 이용 가능하다. 예는 212Bi, 131I, 131In, 90Y, 및 186Re를 포함한다. 항체와 세포독성제의 콘주게이트는 다양한 이작용성 단백질-결합제, 예를 들어, N-숙신이디밀-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트(SPDP), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이작용성 유도체(예를 들어, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르(예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데하이드(예를 들어, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물(예를 들어, 비스-(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예를 들어, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물(예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조된다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌[Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987)]에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 항체에 방사성 누클레오티드의 콘주게이션을 위한 대표적인 킬레이트제이다[W0 94/11026호 참조].
항체 및 하나 이상의 소분자 독서, 예를 들어, 칼리케아마이신, 마이탄시노이드, 돌로스타틴, 아우로스타틴, 트리코테센, 및 CC1065, 및 독소 활성을 갖는 이러한 독소의 유도체의 콘주게이트가 또한 본원에서 고려된다.
마이탄신(Maytansine) 및 마이탄시노이드(Maytansinoid)
일부 구현예에서, 면역콘주게이트는 하나 이상의 마이탄시노이드 분자에 콘주게이팅된 본 발명의 항체를 포함한다.
마이탄시노이드는 튜불린 중합을 억제함으로써 작용하는 유사분열 억제제이다. 마이탄신은 동아프리카 스루브 마이테누스 세라타(east African shrub Maytenus serrata)로부터 최초로 단리되었다[미국특허번호 제3,896,111호]. 후속하여, 특정 미생물이 또한 마이탄시노이드, 예를 들어, 마이탄시놀 및 C-3 마이탄시놀 에스테르를 생산한다는 것을 발견하였다[미국특허번호 제4,151,042호]. 합성 마이탄시놀 및 이의 유도체 및 유사체는 예를 들어, 미국특허번호 제4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; 및 4,371,533호에 기재되어 있다.
마이탄시노이드 약물 모이어티는 이러한 것이 (i) 발효 또는 화학적 개질, 발효 산물의 유도체화에 의해 제조하는데 비교적 접근 가능하고, (ii) 비-디설파이드 링커를 통한 항체로의 콘주게이션을 위해 적합한 작용기로의 유도체화할 수 있고, (iii) 혈장에서 안정적이고, (iv) 다양한 종양 세포주에 대해 효과적이기 때문에, 항체 약물 콘주게이트에서 매력적인 약물 모이어티이다.
마이탄시노이드 약물 모이어티의 예시적인 구현예는 DM1; DM3; 및 DM4를 포함한다. 마이탄시노이드를 함유한 면역콘주게이트, 이를 제조하는 방법, 및 이의 치료 용도는 예를 들어, 미국특허번호 제5,208,020호, 제5,416,064호 및 유럽특허 EP 0 425 235 B1호에 기재되어 있다. 문헌[Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)]에는 인간 대장암에 관한 모노클로날 항체 C242에 연결된 DM1으로 명시된 마이탄시노이드를 포함하는 면역콘주게이트가 기재되어 있다. 이러한 콘주게이트는 배양된 결장암 세포에 대해 고도의 세포독성적인 것으로 확인되었고, 생체내 종양 성장 검정에서 항종양 활성을 나타내었다. 문헌[Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992)]에는 마이탄시노이드가 인간 결장암 세포 상의 항원에 결합하는 뮤린 항체 A7에 또는 HER-2/neu 종양 유전자를 결합시키는 다른 뮤린 모노클로날 항체 TA.1에 디설파이드 링커를 통해 콘주게이팅된 면역콘주게이트가 기재되어 있다. TA.1-마이탄소노이드 콘주게이트의 세포독성은 시험관 내에서 인간 유방암 세포주 SK-BR-3 상에서 시험되었으며, 이는 세포 당 3×105 HER-2 표면 항원을 발현시킨다. 약물 콘주게이트는 자유 마이탄시노이드 약물과 유사한 정도의 세포독성을 달성하였으며, 이는 항체 분자 당 마이탄시노이드 분자의 수를 증가시킴으로써 증가될 수 있다. A7-마이탄시노이드 콘주게이트는 마우스에서 전신 세포독성을 나타내었다.
항체-마이탄시노이드 콘주게이트는 항체 또는 마이탄시노이드 분자 중 어느 하나의 생물학적 활성을 현저하게 감소시키지 않으면서 마이탄시노이드 분자에 항체를 화학적으로 연결시킴으로써 제조될 수 있다[예를 들어, 미국특허번호 제5,208,020호 참조]. 항체 분자 당 평균 3 내지 4개의 콘주게이팅된 마이탄시노이드 분자는 항체의 기능 또는 용해도에 악영향을 미치지 않으면서 타겟 세포의 세포독성을 향상시키는데 효능을 나타내었으나, 심지어 하나의 독소/항체의 분자는 네이키드 항체(naked antibody)의 사용에 대해 세포독성을 향상시킬 것으로 예상될 것이다. 마이탄시노이드는 당해 분야에 널리 알려져 있고, 공지된 기술에 의해 합성되거나 천연 소스로부터 단리될 수 있다. 적합한 마이탄시노이드는 예를 들어, 미국특허번호 제5,208,020호에 그리고 상기에 언급된 다른 특허 및 비특허 공개문에 기재되어 있다. 마이탄시노이드는 마이탄시놀 및 방향족 고리에 또는 마이탄시놀 분자의 다른 위치에서 개질된 마이탄시놀 유사체, 예를 들어, 다양한 마이탄시놀 에스테르를 포함한다.
예를 들어, 미국특허번호 제5,208,020호 또는 EP 특허 제0 425 235 B1호, 문헌[Chan et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992)], 및 미국특허출원번호 제10/960,602호(2004년 10월 8일에 출원됨)에 기술된 것들을 포함하는 항체-마이탄시노이드 콘주게이트를 제조하기 위해 당해 분야에 공지된 여러 연결 기들이 존재하며, 이러한 문헌들의 내용은 본원에 참고로 명확하게 포함된다. 링커 성분 SMCC를 포함하는 항체-마이탄시노이드 콘주게이트는 미국특허출원번호 제10/960,602호(2004년 10월 8일에 출원됨)에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 연결 기는 상술된 특허들에 기재되어 있는 바와 같은, 디설파이드 기, 티오에테르 기, 산 불안정 기, 광불안정 기, 펩티다아제 불안정 기, 또는 에스테라아제 불안정 기를 포함한다. 추가적인 연결 기는 본원에 기술되고 예시되어 있다.
항체 및 마이탄시노이드의 콘주게이트는 다양한 이작용성 단백질 결합제, 예를 들어, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이작용성 유도체(예를 들어, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르(예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데하이드(예를 들어, 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예를 들어, 비스-(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예를 들어, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물(예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조될 수 있다. 결합제는 디설파이드 연결을 제공하기 위해 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP)[Carlsson et al., Biochem. J. 173 :723-737 (1978)] 및 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트(SPP)를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
링커는 링크의 타입에 따라, 다양한 위치에서 마이탄시노이드 분자에 부착될 수 있다. 예를 들어, 에스테르 연결은 통상적인 결합 기술을 이용하여 히드록실 기와의 반응에 의해 형성될 수 있다. 이러한 반응은 히드록실 기를 갖는 C-3 위치, 히드록시메틸로 개질된 C-14 위치, 히드록실 기로 개질된 C-15 위치, 및 히드록실 기를 갖는 C-20 위치에서 일어날 수 있다. 일 구현예에서, 연결은 마이탄시놀 또는 마이탄시놀 유사체의 C-3 위치에서 형성된다.
아우리스타틴(Auristatin) 및 돌로스타틴(Dolostatin)
일부 구현예에서, 면역콘주게이트는 돌라스타틴 또는 돌로스타틴 펩티드 유사체 및 유도체, 아우리스타틴에 콘주게이팅된 본 발명의 항체를 포함한다[미국특허번호 제5,635,483호; 제5,780,588호]. 돌라스타틴 및 아우리스타틴은 미소관 동력학, GTP 가수분해, 및 핵 및 세포 분화를 방해하고[Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584], 항암[미국특허 제5663149호] 및 항진균 활성[Pettit et al (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965]을 갖는 것으로 나타내었다. 돌라스타틴 또는 아우리스타틴 약물 모이어티는 펩티드 약물 모이어티의 N(아미노) 말단 또는 C(카복실) 말단을 통해 항체에 부착될 수 있다[WO 02/088172호].
예시적인 아우리스타틴 구현예는 문헌["Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", 미국일련번호 제10/983,340호(2004년 11월 5일에 출원됨)]에 기재된, N-말단 연결된 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티를 포함하며, 이러한 문헌의 내용은 전문이 명확하게 참고로 포함된다.
예시적인 아우리스타틴 구현예는 MMAE 및 MMAF를 포함한다. MMAE 또는 MMAF 및 다양한 링커 성분(본원에 추가로 기술됨)들을 포함하는 추가적인 예시적인 구현예는 Ab-MC-vc-PAB-MMAF, Ab-MC-vc-PAB-MMAE, Ab-MC-MMAE 및 Ab-MC-MMAF를 포함한다.
통상적으로, 펩티드-기반 약물 모이어티는 둘 이상의 아미노산들 및/또는 펩티드 단편들 사이에 펩티드 결합을 형성시킴으로써 제조될 수 있다. 이러한 펩티드 결합은 예를 들어, 펩티드 화학의 분야에서 널리 알려진 액상 합성 방법에 따라 제조될 수 있다[문헌[E. Schroder and K. Liibke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press] 참조]. 아우리스타틴/돌라스타틴 약물 모이어티는 문헌[미국특허번호 제5,635,483호; 제5,780,588호; "Pettit et al (1989) J. Am. Chem. Soc. 111 :5463-5465; Pettit et al (1998) Anti-Cancer Drug Design 13 :243-277; Pettit, G. R., et al. Synthesis, 1996, 719-725; 및 Pettit et al (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863, 및 또한 Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7):778-784; "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", 미국일련번호 제10/983,340호(2004년 11월 5일에 출원됨)]의 방법들에 따라 제조될 수 있으며, 이러한 문헌들은 이의 전문이 본원에 참고로 포함된다(예를 들어, 링커, 및 링커에 콘주게이팅된 MMAE 및 MMAF와 같은 모노메틸발린 화합물을 제조하는 방법이 기재됨).
칼리케아마이신(Calicheamicin)
다른 구현예에서, 면역콘주게이트는 하나 이상의 칼리케마이신 분자에 콘주게이팅된 본 발명의 항체를 포함한다. 항생제의 칼리케아마이신 패밀리는 서브-피코몰 농도에서 이중가닥 DNA 파괴(break)를 형성시킬 수 있다. 칼리케아마이신 패밀리의 콘주게이트의 제조를 위하여, 미국특허번호 제5,712,374, 5,714,586, 5,739, 116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 및 5,877,296호가 참조된다(모두는 American Cyanamid Company임). 사용될 수 있는 칼리케아마이신의 구조적 유사체는 γ1 I, a2 I, a3 I, N-아세틸-γ1 I, PSAG 및 θΙ 1을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다[Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998) 및 American Cyanamid의 상기 언급된 미국특허들]. 항체가 콘주게이팅될 수 있는 다른 항-종양 약물은 QFA인데, 이는 항폴레이트이다. 칼리케아마이신 및 QFA 둘 모두는 세포내 작용 부위를 가지고, 혈장막을 가로질러 용이하게 이루어지지 않는다. 이에 따라, 항체 매개 내부화를 통해 이러한 작용제의 세포 섭취는 이의 세포독성 효과를 크게 향상시킨다.
다른 세포독성제
본 발명의 항체에 콘주게이팅될 수 있는 다른 항종양제는 BCNU, 스트렙토조이신, 빈크리스틴 및 5-플루오로우라실, 미국특허번호 제5,053,394, 5,770,710호에 기재된 총괄적으로 LL-E33288 착물로 알려진 작용제의 패밀리, 뿐만 아니라 에스페라마이신(미국특허번호 제5,877,296호)을 포함한다.
사용될 수 있는 효소적 활성 독소 및 이의 단편은 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 엑소독소 A 사슬(슈도모나스 에루기노사로부터), 리신 A 사실, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알레우리트 폴르디 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테센을 포함한다[예를 들어, WO 93/21232호 참조(1993년 10월 28일에 공개됨)].
본 발명은 항체와 핵산분해 활성(nucleolytic activity)을 갖는 화합물(예를 들어, 리보누클레아제 또는 DNA 엔도누클레아제, 예를 들어, 데옥시리보누클레아제; DNase) 간에 형성된 면역콘주게이트를 추가로 고려한다.
종양의 선택적 파괴를 위하여, 항체는 고도의 방사성 원자를 포함할 수 있다. 다양한 방사성 동위원소는 방사콘주게이팅된 항체의 생산을 위해 이용 가능하다. 예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 콘주게이트가 검색을 위해 사용될 때, 이는 신티그래프 연구(scintigraphic study)를 위한 방사성 원자, 예를 들어, Tc99m 또는 I123, 또는 핵자기공명(NMR) 영상화(또한, 자기 공명 영상화(MRI)로서 알려짐)를 위한 스핀 라벨, 예를 들어, 다시, 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
방사성- 또는 다른 라벨은 공지된 방식으로 콘주게이트에 도입될 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 생합성될 수 있거나, 예를 들어, 수소 대신에 불소-19를 포함하는 적합한 아미노산 전구체를 사용하여 화학적 아미노산 합성에 의해 합성될 수 있다. 라벨, 예를 들어, Tc99m 또는 I123, Re186, Re188 및 In111은 펩티드에서 시스테인 잔기를 통해 부착될 수 있다. 이트륨-90은 라이신 잔기를 통해 부착될 수 있다. IODOGEN 방법[Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57]은 요오드-123을 도입하기 위해 사용될 수 있다. 문헌["Monoclonal Antibody in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989)]에는 다른 방법들이 상세히 기재되어 있다.
항체 및 세포독성제의 콘주게이트는 다양한 이작용성 단백질 결합제, 예를 들어, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이작용성 유도체(예를 들어, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르(예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데하이드(예를 들어, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물(예를 들어, 비스-(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예를 들어, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물(예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌[Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987)]에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 항체에 방사성 핵종의 콘주게이션을 위한 예시적인 킬레이트제이다[W0 94/11026 참조]. 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 촉진시키는 "분열 가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정 링커, 펩티다아제-민감한 링커, 광불안정 링커, 디메틸 링커 또는 디설파이드-함유 링커[Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992); 미국특허번호 제5,208,020호]가 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물은 가교제 시약으로 제조된 ADC를 명확하게 고려하지만, 이로 제한되지 않는다: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, 및 상업적으로 입수 가능한 SVSB(숙신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트)(예를 들어, 문헌[Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, 111., U.S.A]으로부터)[문헌[pages 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog] 참조].
항체 약물 콘주게이트의 제조
본 발명의 항체 약물 콘주게이트(ADC)에서, 항체(Ab)는 링커(L)를 통해, 하나 이상의 약물 모이어티(D), 예를 들어, 항체 당 약 1 내지 약 20개의 약물 모이어티에 콘주게이팅된다. 화학식 I의 ADC는 당업자에게 공지된 유기 화학 반응, 조건, 및 시약을 사용하여, (1) Ab-L을 형성시키기 위해 공유 결합을 통한 항체의 친핵체 기와 2가 링커 시약의 반응, 이후, 약물 모이어티 D와의 반응; 및 (2) D-L을 형성시키기 위해 공유 결합을 통한 약물 모이어티의 친핵체 기와 2가 링커 시약의 반응, 이후, 항체의 친핵체 기와의 반응을 포함하는 여러 경로에 의해 제조될 수 있다. ADC를 제조하는 추가적인 방법들이 본원에 기재된다.
Ab-(L-D)p I
링커는 하나 이상의 링커 성분들로 이루어질 수 있다. 예시적인 링커 성분들은 6-말레이미도카프로일("MC"), 말레이미도프로파노일("MP"), 발린-시트룰린("val-cit"), 알라닌-페닐알라닌("ala-phe"), p-아미노벤질옥시카보닐("PAB"), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오)펜타노에이트("SPP"), N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카복실레이트("SMCC"), 및 N-숙신이미딜(4-요오도-아세틸)아미노벤조에이트("SIAB")를 포함한다. 추가적인 링커 성분들은 당해 분야에 공지되어 있고 일부는 본원에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 링커는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 예시적인 아미노산 링커 성분은 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드 또는 펜타펩티드를 포함한다. 예시적인 디펩티드는 발린-시트룰린(vc 또는 val-cit), 알라닌-페닐알라닌(af 또는 ala-phe)을 포함한다. 예시적인 트리펩티드는 글리신-발린-시트룰린(gly-val-cit) 및 글리신-글리신-글리신(gly-gly-gly)을 포함한다. 아미노산 링커 성분을 포함하는 아미노산 잔기는 천연으로 발생하는 것, 뿐만 아니라, 마이너 아미노산 및 비-천연 발생 아미노산 유사체, 예를 들어, 시트룰린을 포함한다. 아미노산 링커 성분은 특정 효소, 예를 들어, 종양-관련 프로테아제, 카텝신 B, C 및 D, 또는 플라스민 프로테아제에 의한 효소적 분열에 대한 이의 선택성에 있어서 디자인되고 최적화될 수 있다.
예시적인 링커 성분 구조는 하기에 나타내어 있다(여기서, 파형선은 ADC의 다른 성분에 대한 공유 부착의 사이트를 지시한다):
도 US08133488-20120313-C00006
추가적인 예시적 링커 성분 및 약어가 포함된다(여기서, 항체(Ab) 및 링커가 도시되며, p는 1 내지 약 8이다):
도 US08133488-20120313-C00007
항체 상의 친핵체 기는 (i) N-말단 아민 기, (ii) 측쇄 아민 기, 예를 들어, 라이신, (iii) 측쇄 티올 기, 예를 들어, 시스테인, 및 (iv) 항체가 글리코실화되는 당 히드록실 또는 아미노 기를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 아민, 티올, 및 히드록실 기는 친핵성이고, 링커 모이어티 상의 친전자체 기 및 (i) 활성 에스테르, 예를 들어, NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트, 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예를 들어, 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카복실, 및 말레이미드 기를 포함하는 링커 시약과의 공유 결합을 형성할 수 있다. 특정 항체는 환원 가능한 사슬간 디설파이드, 즉, 시스테인 브릿지를 갖는다. 항체는 DTT(디티오트레이톨)와 같은 환원제로의 처리에 의해 링커 시약과 콘주게이션을 위해 반응적일 수 있다. 이에 따라, 각각의 시스테인 브릿지는 이론상 2개의 반응성 티올 친핵체를 형성할 것이다. 추가의 친핵성 기는 아민의 티올로의 전환으로 이어지는 라이신과 2-이미노티올란 (트라우트(Traut's) 시약)의 반응을 통해서 항체 내로 도입될 수 있다. 반응성 티올 기는 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 시스테인 잔기를 도입시킴으로써 (예를 들어, 하나 이상의 비-천연 시스테인 아미노산 잔기를 포함하는 돌연변이체 항체를 제조함으로써) 항체 (또는 그의 단편) 내로 도입될 수 있다.
링커 시약 또는 약물 상의 친핵성 치환체와 반응할 수 있는 친전자성 부분을 도입하도록 항체를 변형시킴으로써, 항체 약물 콘주게이트를 또한 생성시킬 수 있다. 당화 항체의 당을, 예를 들어 퍼요오데이트 산화 시약으로 산화시켜 링커 시약 또는 약물 부분의 아민기와 반응할 수 있는 알데히드 또는 케톤기를 형성할 수 있다. 이로써 생성된 이민 쉬프(Schiff) 염기 기는 안정한 연쇄를 형성할 수 있거나, 또는 예를 들어, 수소화붕소 시약에 의해 환원시켜 안정한 아민 연쇄를 형성시킬 수 있다. 일 구현예에서는, 당화 항체의 탄수화물 부분을 갈락토스 옥시다제 또는 소듐 메타-퍼요오데이트와 반응시키면, 약물 상의 적당한 기와 반응할 수 있는 단백질 내에 카보닐 (알데히드 및 케톤) 기가 생성될 수 있다 [참고: Hermanson, G. T. (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press: New York, p234-242]. 다른 구현예에서는, N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기를 함유하는 단백질을 나트륨 메타-퍼요오데이트와 반응시키면, 제1 아미노산 대신 알데히드가 생성될 수 있다[참고: Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3: 138-146; 미국특허 제5,362,852호]. 이러한 알데히드는 약물 부분 또는 링커 친핵체와 반응할 수 있다.
마찬가지로, 약물 부분 상의 친핵기에는 링커 부분 및 링커 시약 상의 친전자기, 예를 들어 (i) 활성 에스테르, 예를 들면, NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예를 들면, 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카복실 및 말레이미드기와 공유 결합을 형성하기 위해 반응할 수 있는, 아민, 티올, 히드록실, 히드라지드, 옥심, 히드라진, 티오세미카바존, 히드라진 카복실레이트, 및 아릴히드라지드기가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
대안적으로, 항체 및 세포독성제를 포함하는 융합 단백질은 예를 들어, 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. DNA의 길이는 콘주게이트의 목적하는 특성을 파괴하지 않는 링커 펩티드를 코딩하는 영역에 의해 분리되거나 또는 서로 인접해 있는 콘주게이트의 두 부분을 코딩하는 각각의 영역을 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 항체는 종양 예비-타겟화에 활용하기 위해 "수용체" (상기, 스트렙타비딘)에 콘주게이팅될 수 있고, 항체-수용체 접합체를 환자에게 투여한 다음, 소실제(clearing agent)를 사용하여 결합되지 않은 콘주게이트를 순환계로부터 제거하고, 이어서 세포독성제(예를 들어, 방사성 누클레오티드)에 콘주게이팅된 "리간드" (예를 들어, 아비딘)를 투여한다.
항체 (Ab)-MC-MMAE는 하기와 같이 MC-MMAE와 본원에 제공된 임의 항체의 콘주게이션에 의해 제조될 수 있다. pH 8.0에서 500 mM 소듐 보레이트 및 500 mM 소듐 크롤라이드에 용해된 항체는 과량의 100 mM 디티오트레이톨(DTT)로 처리된다. 37℃에서 약 30분 동안 인큐베이션 후, 완충제는 Sephadex G25 수지로의 용리에 의해 교환되고, 1 mM DTPA와 함께 PBS로 용리된다. 용액에 대한 280 nm에서의 흡광도로부터 감소된 항체 농도 및 DTNB(Aldrich, Milwaukee, WI)과의 반응에 의한 티올 농도를 측정하고 412 nm에서 흡광도를 측정함으로써 티올/Ab 값에 체크된다. PBS 중에 용해된 환원된 항체는 얼음 상에서 냉각된다. DMSO 중에 용해된 약물 링커, 말레이미도카프로일-모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE), 즉 MC-MMAE는 아세토니트릴 및 물 중에 공지된 농도로 희석되고, PBS 중 냉각된 환원된 항체 2H9에 첨가된다. 약 1시간 후에, 반응을 켄칭하고 임의 미반응된 항체 티올 기를 캡핑하기 위해 과량의 말레이미드가 첨가된다. 반응 혼합물은 원심 한외여과에 의해 농축되고, 2H9-MC-MMAE는 PBS 중의 G25 수지를 통한 용리에 의해 정제되고 탈염되고, 멸균 조건 하에 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과되고, 저장을 위해 냉동된다.
항체-MC-MMAF는 Ab-MC-MMAE의 제조를 위해 제공된 프로토콜에 따라 MC-MMAF와 본원에 제공된 임의 항체의 콘주게이션에 의해 제조될 수 있다.
항체-MC-val-cit-PAB-MMAE는 Ab-MC-MMAE의 제조를 위해 제공된 프로토콜에 따라 MC-val-cit-PAB-MMAE와 본원에 제공된 임의 항체의 콘주게이션에 의해 제조될 수 있다.
항체-MC-val-cit-PAB-MMAF는 Ab-MC-MMAE의 제조를 위해 제공된 프로토콜에 따라 MC-val-cit-PAB-MMAF와 본원에 제공된 임의 항체의 콘주게이션에 의해 제조될 수 있다.
항체-SMCC-DM1은 하기와 같이 SMCC-DM1과 본원에 제공된 임의 항체의 콘주게이션에 의해 제조된다. SMCC 링커를 도입하기 위해 정제된 항체는 (숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카복실레이트(SMCC, Pierce Biotechnology, Inc)로 유도체화된다. 상세하게, 항체는 7.5 몰 당량의 SMCC(DMSO 중 20 mM, 6.7 mg/mL)를 갖는 50 mM 칼륨 포스페이트/50 mM 소듐 클로라이드/2 mM EDTA, pH 6.5에서 20 mg/mL로 처리된다. 아리곤 하, 주변 온도에서 2시간 동안 교반한 후에, 반응 혼합물은 50 mM 칼륨 포스페이트/50 mM 소듐 클로라이드/2 mM EDTA, pH 6.5로 평형화된 Sephadex G25 컬럼을 통해 여과된다. 항체-함유 분획은 풀링되고 검정된다.
이에 따라 제조된 항체-SMCC는 50 mM 칼륨 포스페이트/50 mM 소듐 클로라이드/2 mM EDTA, pH 6.5로 약 10 mg/ml의 최종 농도로 희석되고, 디메틸아세트아미드 중 DM1의 10 mM 용액과 반응된다. 반응은 아르곤 하 실온에서 16.5시간 동안 교반된다. 콘주게이션 반응 혼합물은 pH 6.5에서 1×PBS로 Sephadex G25 겔 여과 컬럼(1.5×4.9 cm)을 통해 여과된다. 항체에 대한 DM1 약물 비율(p)은 252 nm 및 280 nm에서 흡광도에 의해 측정하는 경우, 약 2 내지 5일 수 있다.
Ab-SPP-DM1은 하기와 같이 SPP-DM1과 본원에 제공된 임의 항체의 콘주게이션에 의해 제조된다. 정제된 항체는 디티오피리딜 기를 도입하기 위해 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트로 유도체화된다. NaCl(50 mM) 및 EDTA(1 mM)를 함유한 44.7 mL의 50 mM 칼륨 포스페이트 완충제(pH 6.5) 중 항체(376.0 mg, 8 mg/mL)는 SPP(2.3 mL 에탄올 중 5.3 몰 당량)로 처리된다. 아르곤 하, 주변 온도에서 90분 동안 인큐베이션한 후에, 반응 혼합물은 35 mM 소듐 시트레이트, 154 mM NaCl, 2 mM EDTA 완충제로 평형화된 Sephadex G25 컬럼을 통해 겔 여과된다. 항체-함유 분획은 풀링되고 검정된다. 항체의 개질도는 상기에 기술된 바와 같이 결정된다.
항체-SPP-Py(약 10 μmol의 방출 가능한 2-티오피리딘 기)는 상기 35 mM 소듐 시트레이트 완충제, pH 6.5로 약 2.5 mg/mL의 최종 농도까지 희석된다. 이후에, 3.0 mM 디메틸아세트아미드(DMA, 최종 반응 혼합물 중 3% v/v) 중 DM1(1.7 당량, 17 μmol)은 항체 용액에 첨가된다. 반응은 아르곤 하 주변 온도에서 약 20시간 동안 진행한다. 반응은 35 mM 소듐 시트레이트, 154 mM NaCl, pH 6.5로 평형화된 Sephacryl S300 겔 여과 컬럼(5.0 cm×90.0 cm, 1.77 L) 상에 로딩된다. 유량은 약 5.0 mL/min일 수 있으며, 65개의 분획(각각 20.0 mL)이 수집된다. 항체 분자 당 연결된 DM1 약물 분자의 수(p')는 252 nm 및 280 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 결정되고, 2H9 항체 당 약 2 내지 4개의 DM1 약물 모이어티일 수 있다.
항체-BMPEO-DM1은 하기와 같이 BMPEO-DM1로 본원에 제공된 임의 항체의 콘주게이션에 의해 제조된다. 항체는 비스-말레이미도 시약 BM(PEO)4(Pierce Chemical)에 의해 개질되어, 항체의 표면 상에 미반응된 말레이미도 기를 잔류시킨다. 이는 50% 에탄올/물 혼합물 중에 BM(PEO)4를 10 mM의 농도로 용해시키고 대략 1.6 mg/ml(10 마이크로몰)의 농도에서 포스페이트 완충된 염수 중 항체를 함유한 용액에 10배 몰 과량을 첨가하고, 이를 1시간 동안 반응시켜 항체-링커 중간체, 2H9-BMPEO를 형성시킴으로써 달성될 수 있다. 과량의 BM(PEO)4는 150 mM NaCl 완충제를 함유한 30 mM 시트레이트, pH 6에서 겔 여과(HiTrap column, Pharmacia)에 의해 제거된다. 대략 10배 몰 과량의 DM1은 디메틸 아세트아미드(DMA)에 용해되고, 2H9-BMPEO 중간체에 첨가된다. 디메틸 포름아미드(DMF)는 또한, 약물 모이어티 시약을 용해시키기 위해 사용될 수 있다. 반응 혼합물은 미반응된 DM1을 제거하기 위해 PBS에 겔 여과 또는 투석 이전에 밤새 반응된다. PBS 중 S200 컬럼 상의 겔 여과는 고분자량 응집물을 제거하고 정제된 2H9-BMPEO-DM1을 제공하기 위해 사용된다.
항체 유도체
본 발명의 항체는 당업계에 공지되어 이고 용이하게 가용한 추가의 비단백질성 잔기를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 일 구현예에서, 항체의 유도체화를 위해 적합한 잔기들은 수용성 폴리머가다. 수용성 폴리머의 비제한적인 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 코폴리머, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 폴리머, 폴리아미노산 (동종폴리머 또는 무작위 코폴리머), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 동종폴리머, 프폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 코폴리머, 폴리옥시에틸화된 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 및 이의 혼합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 물에서의 이의 안정성으로 인해 제조에 있어서 이점을 가질 수 있다. 상기 폴리머는 임의의 분자량을 가질 수 있고, 측쇄 또는 비측쇄일 수 있다. 항체에 부착된 폴리머의 수는 다양할 수 있고, 하나 이상의 폴리머가 부착된 경우, 상기 폴리머는 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화를 위해 사용되는 폴리머의 수 및/또는 타입은 항체 유도체가 한정된 조건 등하에서 사용되는 상관 없이 개선될 항체의 특정 성질 또는 기능을 포함하지만 이에 제한되지 않는 고려 사항을 기준으로 결정될 수 있다.
다른 구현예에서, 방사선으로의 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 항체 및 비단백질성 잔기의 콘주게이트가 제공된다. 일 구현예에서, 비단백질성 잔기는 탄소 나노튜브이다 (문헌참조: Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 102: 11600-11605 (2005)). 방사선은 임의의 파장을 가질 수 있고 정상 세포에는 무해하지만 항체-비단백질성 잔기에 인접한 세포가 사멸되는 온도로 비단백질성 잔기를 가열하는 파장을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
약제학적 제형
본 발명의 항체를 포함하는 치료학적 제형은 수용액, 동결건조되거나 다른 건조된 제형 형태로 임의의 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 목적하는 정도의 순도를 갖는 항체를 혼합함에 의해 저장을 위해 제조된다 (문헌참조: Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)). 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 용량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고 포스페이트, 시트레이트, 히스티딘 및 다른 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 잔기 미만)의 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어, 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염-형성 카운터 이온; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.
본원의 제형은 또한 치료될 특정 징후에 필요한 하나 이상의 활성 화합물을 포함하고, 서로 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 상기 분자는 의도된 목적을 위해 효과적인 양으로 조합적으로 적합하게 존재한다.
활성 성분들은 예를 들어, 코아세르베이션(coacervation) 기술 또는 계면 중합화에 의해 제조된 마이크로캡술 중에 포집될 수 있고, 예를 들어, 각각 콜로이드 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 중에서 또는 마크로에멀젼 중에 하이드록시메틸셀룰로스, 또는 겔라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐이 있다. 상기 기술은 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기재되어 있다.
생체내 투여를 위해 사용되어야 하는 제형은 멸균되어야 한다. 이것은 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 성취된다.
지연 방출 제제를 제조할 수 있다. 지연 방출 제제의 적합한 예는 본 발명의 면역글로불린을 함유하는 고체 소수성 폴리머의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 상기 매트릭스는 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐의 성형 제품 형태로 있다. 지연 방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 하이드로겔 (예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산 및 γ 에틸-L-글루타메이트의 코폴리머, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 코폴리머, 예를 들어, LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 코폴리머 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 미소구), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 폴리머 100일 이상 동안 분자를 방출시킬 수 있고, 특정 하이드로겔은 보다 짧은 기간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 면역글로불린이 장시간 동안 체내에 유지되어 있는 경우, 이들은 37℃에서 수분에 노출 결과로서 변성되거나 응집할 수 있어 생물학적 활성이 상실되고 면역원성에서의 가능한 변화가 유도될 수 있다. 이상적인 전략은 관련된 메카니즘에 의존하여 안정화를 위해 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디설파이드 상호교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀진 경우, 안정화는 설프하이드릴 잔기를 변형시키고, 산성 용액으로부터 동결건조시키고, 수분 함량을 조절하고, 적당한 첨가제를 사용하고 특이적 폴리머 매트릭스 조성물을 개발함에 의해 성취될 수 있다.
용도
본 발명의 항체는 예를 들어, 시험관내, 생체외 및 생체내 치료학적 방법에 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는 시험관내, 생체외 및/또는 생체내에서 특이적 항원 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단시키기 위한 길항제로서 사용될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 항체의 적어도 일부는 다른 종 기원의 항원 활성을 중성화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 예를 들어, 항원을 함유하는 세포 배양물, 인간 대상체 또는 본 발명의 항체가 교차 반응하는 항원을 갖는 다른 포유동물 대상체 (예를 들어, 침팬지, 비비, 마모셋, 시노몰구스 및 레서스, 돼지 또는 마우스)에서 특정 항원 활성을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 항원 활성이 억제되도록 항체를 항원과 접촉시켜 항원 활성을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 항원은 인간 단백질 분자이다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체는 항원 활성이 해로운 장애를 앓는 대상체에서 항원을 억제하기 위한 방법에 사용될 수 있고, 상기 방법은 대상체에서 항원 활성이 억제되도록 본 발명의 항체를 대상체에게 투여함을 포함한다. 일 구현예에서, 항원은 인간 단백질 분자이고 상기 대상체는 인간 대상체이다. 대안적으로, 상기 대상체는 본 발명의 항체가 결합하는 항원을 발현하는 포유동물일 수 있다. 여전히 추가로, 상기 대상체는 항원이 도입된(예를 들어, 항원의 투여에 의해 또는 항원 전이유전자의 발현에 의해) 포유동물일 수 있다. 본 발명의 항체는 치료학적 목적을 위해 인간 대상체에 투여될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 항체는 수의과 목적을 위해 또는 인간 질환의 동물 모델로서 항체가 교차 반응하는 항원을 발현하는 비인간 포유동물 (예를 들어, 영장류, 돼지 또는 마우스)에 투여될 수 있다. 후자에 관하여, 상기 동물 모델은 본 발명의 항체의 치료학적 효능(예를 들어, 투여 용량 및 시간 과정의 시험)을 평가하기 위해 유용할 수 있다. 본 발명의 항체는 암, 근육 장애, 유비퀴틴-경로 관련 유전학적 장애, 면역/염증 장애, 신경학적 장애 및 다른 유비퀴틴 경로 관련 장애를 포함하지만 이에 제한되지 않는 SSEA-3/SSEA-4/GloboH 및 SSEA-3/SSEA-4/GloboH 관련 단백질의 비정상적 발현 및/또는 활성과 관련된 질환, 장애 또는 병태를 치료하거나, 억제하거나 이의 진행을 지연시키거나, 이의 재발을 예방하고/지연시키거나, 완화시키거나, 예방하기 위해 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 차단 항체는 SSEA-3/SSEA-4/GloboH에 대해 특이적이다.
다른 구현예에서, 세포독성제와 콘주게이팅된 본 발명의 항체를 포함하는 면역콘주게이트는 상기 환자에게 투여된다. 일부 구현예에서, 면역콘주게이트 및/또는 이것이 결합된 항원은 SSEA-3/SSEA-4/GloboH와 관련된 이들의 세포 표면 상의 하나 이상의 단백질을 발현하는 세포에 의해 내재화되고 이는 이것이 관련된 표적 세포를 사멸시키는데 면역콘주게이트의 증가된 치료학적 효능을 유도한다. 일 구현예에서, 세포독성제는 표적 세포에서 핵산을 표적화하고 이를 방해한다. 상기 세포독성제의 예는 본원에 주지된 임의의 화학적 치료학적 제제(예를 들어, 마이탄시노이드 또는 칼리케아마이신), 방사능 동위원소, 리보누클레아제 또는 DNA 엔도누클레아제를 포함한다.
본 발명의 항체는 치료요법에서 단독으로 또는 다른 조성물과 배합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 또 다른 항체 및/또는 보조제/치료학적 제제(예를 들어, 스테로이드)와 함께 동시 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 치료 계획, 예를 들어, 암, 근육 장애, 유비퀴틴 경로 관련 유전학적 장애, 면역/염증 장애, 신경학적 장애 및 다른 유비퀴틴 경로 관련 장애를 포하하는 임의의 질환을 치료하는데 있어서 소염제 및/또는 소독제와 배합될 수 있다. 상기된 그러한 배합 치료제는 배합 투여(2개 이상의 제제가 동일하거나 별도의 제형으로 포함된다) 및 별도의 투여(이 경우에 본 발명의 항체의 투여는 보조 투여요법 또는 치료요법들의 투여 전, 및/또는 투여 후에 일어날 수 있다)를 포함한다.
본 발명의 항체 (및 보조 치료학적 제제)는 비경구, 피하, 복강내, 폐내 및 비강내 및 국소 투여를 위해 요구되는 경우, 병변내 투여를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 추가로, 상기 항체는 특히 감소하는 항체 용량과 함께 적합하게 펄스 주입에 의해 투여된다. 투여는 부분적으로 투여가 간략하거나 만성인지에 의존하여 예를 들어, 정맥내 또는 피하 주사와 같은 주사에 의한 임의의 적합한 경로에 의한 것일 수 있다.
본 발명의 항체의 결합 표적의 위치는 항체 제조 및 투여에서 고려될 수 있다. 결합 표적이 세포내 분자인 경우, 본 발명의 특정 양태는 결합 표적이 위치하는 세포로 도입될 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 항체는 인트러바디로서 세포내 발현될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "인트러바디"는 세포내 발현되고 문헌[참조: Marasco, Gene Therapy 4: 11-15 (1997); Kontermann, Methods 34: 163-170 (2004); U.S. Pat. Nos. 6,004,940 and 6,329,173; U.S. Patent Application Publication No. 2003/0104402, and PCT Publication No. WO2003/077945]에 기재된 바와 같이 표적 분자에 선택적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 언급한다. 인트러바디의 세포내 발현은 목적하는 항체 또는 이의 항원 결합부 (상기 항체 또는 항원 결합 단편과 통상적으로 관련된 야생형 리더 서열 및 분비 시그날이 없는)를 표적 세포로 도입함에 의해 수행된다. 미세주사, 탄도 주사, 전기천공, 인산칼슘 침전, 리포좀 및 목적하는 핵산을 함유하는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스 및 백시니아 벡터로의 형질감염을 포함하지만 이에 제한되지 않는 핵산을 세포로 도입하는 임의의 표준 방법이 사용될 수 있다. 본 발명의 항-SSEA-3/SSEA-4/GloboH 항체 모두 또는 일부를 암호화하는 하나 이상의 핵산은 표적 세포 전달되어 SSEA-3/SSEA-4/GloboH에 세포내 결합할 수 있고 하나 이상의 SSEA-3/SSEA-4/GloboH-매개된 세포 경로를 조절할 수 있다.
다른 구현예에서, 내재화 항체가 제공된다. 항체는 항체의 세포로의 전달을 증진시키는 특정 특성을 소유할 수 있거나 상기 특성을 갖도록 변형될 수 있다. 이를 성취하기 위한 기술은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 항체의 양이온화는 세포로의 이의 흡수를 촉진시키는 것으로 공지되어 있다 (문헌참조: 예를 들어, 미국 특허 제6,703,019호). 리포펙션 또는 리포좀을 사용하여 항체를 세포로 전달할 수 있다. 항체 단편이 사용되는 경우, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 최소 억제 단편은 일반적으로 유리하다. 예를 들어, 항체의 가변 영역 서열을 기초로, 표적 단백질 서열에 결합하는 능력을 보유하는 펩티드 분자를 디자인할 수 있다. 상기 펩티드는 화학적으로 합성될 수 있고/있거나 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다. 문헌[예를 들어, Marasco et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)]을 참조한다.
조절제 폴리펩티드의 표적 세포로의 진입은 당업계에 공지된 방법에 의해 증진될 수 있다. 예를 들어, HIV Tat 또는 안테나페디아 호메오도메인 단백질로부터 유래된 것들과 같은 특정 서열은 세포막을 거치는 이종성 단백질의 효율적인 흡수를 지시할 수 있다. 문헌[예를 들어, Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), 96:4325-4329]을 참조한다.
결합 표적이 뇌에 위치하는 경우, 본 발명의 특정 양태는 혈뇌 장벽을 횡단하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 특정 신경퇴행성 질환은 혈뇌 장벽의 투과성의 증가와 관련되고 항체 또는 항원 결합 단편은 뇌에 용이하게 도입될 수 있다. 혈뇌 장벽이 온전한게 유지된 경우, 이를 관통하여 분자를 수송하기 위한 여러 당업계에 공지된 방법이 존재하고 물리적 방법, 지질 기반 방법 및 수용체 및 채널-기반 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
혈뇌 장벽을 관통하는 항체 또는 항원 결합 단편을 수송하는 물리적 방법은 전반적으로 혈뇌 장벽을 우회하거나 혈뇌 장벽에 구멍을 생성시킴에 의한 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 우회 방법은 뇌로의 직접적인 주사 (문헌참조: 예를 들어, Papanastassiou et al., Gene Therapy 9: 398-406 (2002)), 간질 주입/대류 증진된 전달(문헌참조: 예를 들어, Bobo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 : 2076-2080 (1994)), 및 뇌에 전달 장치의 이식(문헌참조: 예를 들어, Gill et al., Nature Med. 9: 589-595 (2003); and Gliadel Wafers™, Guildford Pharmaceutical)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 장벽에 구멍을 생성시키는 방법은 초음파 처리(문헌참조: 예를 들어, 미국 특허 공보 제2002/0038086호), 삼투압(문헌참조: 예를 들어, 고장성 만니톨의 투여에 의해 (Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 & 2, Plenum Press, N.Y. (1989))), 예를 들어, 브라디키닌 또는 투과제 A-7에 의한 투과화 (문헌참조: 예를 들어, 미국 특허 제5,112,596호, 제5,268,164호, 제5,506,206호, 및 제5,686,416호), 및 항체 또는 항원 결합 단편을 암호화하는 유전자를 함유하는 벡터를 사용한 혈뇌 장벽에 걸쳐있는 뉴런의 형질감염(문헌참조: 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 제2003/0083299호)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
혈뇌 장벽을 거쳐 항체 또는 항원 결합 단편을 수송시키는 지질 기반 방법은 혈뇌 장벽의 혈관 내피상의 수용체에 결합하는 항체 결합 단편에 커플링된 리포좀에 항체 또는 항원 결합 단편을 캡슐화시키고 (문헌참조: 예를 들어, 미국 특허원 공개 번호 제20020025313호), 저밀도 지질단백질 입자 (문헌참조: 예를 들어, 미국 특허원 제20040204354호) 또는 아포지질단백질 E (문헌참조: 예를 들어, 미국 특허원 공보 제20040131692호)로 항체 또는 항원 결합 단편을 코팅시킴을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
혈뇌 장벽을 거쳐 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 수송하는 수용체 및 채널-기반 방법은 혈뇌 장벽의 투과성을 증가시키기 위해 글루코코르티코이드 차단제를 사용하고 (문헌참조: 예를 들어, 미국 특허원 공보 제2002/0065259호, 제2003/0162695호, 및 제2005/0124533호); 칼륨 채널을 활성화시키고 (문헌참조: 예를 들어, 미국 특허원 공보 제2005/0089473호), ABC 약물 수송체를 억제하고 (문헌참조: 예를 들어, 미국 특허원 공보 제2003/0073713호); 항체를 트랜스페린으로 코팅시키고 하나 이상의 트랜스페린 수용체의 활성을 조절하고[예를 들어, 미국 특허원 공보 제2003/0129186호], 및 항체를 양이온화시킴[예를 들어, 미국 특허 제5,004,697호]을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항체 조성물은 양호한 의학적 수행과 일치하는 양상으로 제형화되고 용량화되고 투여된다. 이와 관련하여 고려할 인자들은 치료될 특정 장애, 치료될 특정 포유동물, 개별 환자의 임상적 조건, 장애의 원인, 제제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄 및 의학적 수행자에게 공지된 다른 인자들을 포함한다. 항체는 그럴 필요는 없지만 미지의 장애를 예방하거나 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 제제와 임의로 제형화된다. 상기 다른 제제의 유효량은 제형에 존재하는 발명의 항체의 양, 장애 또는 치료의 타입 및 상기 논의된 인자에 의존한다. 이들은 일반적으로 본원에 기재된 바와 같은 동일한 용량으로 및 투여 경로로 사용되거나 본원에 기재된 용량의 1 내지 99% 또는 적당히 경험적으로/임상적으로 결정된 임의의 경로로 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체의 적당한 용량(단독으로 사용되거나 화학치료학적 제제와 같은 다른 제제와 배합하여 사용되는 경우)은 치료될 질환의 타입, 항체의 타입, 질환의 중증도 및 과정, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지, 이전의 치료요법, 환자의 임상적 병력 및 항체에 대한 반응 및 담당의의 판단에 의존한다. 상기 항체는 1회째 또는 일련의 치료 동안 환자에게 적합하게 투여된다. 질환의 타입 및 중증도에 의존하여, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.1 mg/kg - 10 mg/kg)의 항체는 예를 들어, 하나 이상의 별도의 투여 또는 연속 주입에 의해서든 상관 없이 환자에게 투여하기 우한 초기 후보 용량일 수 있다. 하나의 전형적인 하루 용량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1㎍/kg 내지 100 mg/kg 이상 범위일 수 있다. 수일 이상 동안 반복적인 투여를 위해, 조건에 따라 치료는 일반적으로 질환 증상의 억제가 일어날 때까지 지연된다. 항체의 하나의 예시적 용량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 범위이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 이이 조합)중 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 상기 용량은 간헐적으로, 예를 들어, 매주 또는 3주마다 (예를 들어, 환자가 항체의 약 2 내지 약 20회 용량 또는 예를 들어, 약 6회 용량을 수용하도록) 투여될 수 있다. 초기에 높은 로딩 용량에 이어서 하나 이상의 적은 용량이 투여될 수 있다. 예시적 투여 용법은 약 4 mg/kg의 초기 로딩 용량을 투여함에 이어서 주마다 약 2mg/kg의 항체 용량을 유지시킴을 포함한다. 그러나, 다른 투여 계획이 유용할 수 있다. 상기 치료요법의 진행은 통상적인 기술 및 검정에 의해 모니터링된다.
제품
발명의 다른 구현예에서, 상기된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단을 위해 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 제품은 컨테이너 및 컨테이너 상에 또는 연합된 표지 또는 팩키지 삽입체를 포함한다. 적합한 컨테이너는 예를 들어, 병, 바이엘, 시린지 등을 포함한다. 컨테이너는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 컨테이너는 그 자체로 또는 병태의 치료, 예방 및/또는 진단을 위해 효과적인 또 다른 조성물과 배합되는 조성물을 유지하고 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 컨테이너는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 스토퍼를 갖는 바이엘일 수 있다). 조성물 중 적어도 하나의 활성제는 본 발명의 항체이다. 표지 또는 팩키지 삽입체는 조성물이 선택 병태를 치료하기 위해 사용됨을 지적한다. 더욱이, 제품은 (a) 여기에 함유된 조성물을 갖는 제1 컨테이너 (여기서, 상기 조성물은 본 발명의 항체를 포함한다); 및 (b) 여기에 함유된 조성물을 갖는 제2 컨테이너 (여기서, 상기 조성물은 추가의 세포독성 또는 다른 치료학적 제제를 포함한다)를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 양태에서 제품은 조성물이 특정 병태를 치료하기 위해 사용될 수 있음을 지적하는 팩키지 삽입체를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 제품은 세균 증식 억제성 주사용수(BWFI), 표스페이트 완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액과 같은 약제학적으로 허용되는 완충액을 포함하는 제2 (또는 제3) 컨테이너를 추가로 포함할 수 있다. 다른 완충제, 희석제, 여과제, 니들 및 시린지를 포함하는 상업적 및 사용자 견지로부터 바람직할 수 있는 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
하기는 본 발명의 방법 및 조성물의 예이다. 다양한 다른 구현예들이 실행될 수 있는 것으로 이해되며, 단, 일반적인 설명은 상기에 제공된 바와 같다.
일부 구현예에서, 제공된 글리칸 콘주게이트, 면역원성 조성물 또는 백신은 음향 신경종, 선암, 부신암, 항문암, 혈관 육종 (예를 들어, 림프관 육종, 림프관 종양 육종, 혈관육종), 충수암, 양성 단클론성 간질병증, 담도암 (예를 들어, 담도암), 방광암, 유방암(예를 들어, 유방선암, 유두암, 유방암, 유암종), 뇌암(예를 들어 수막종(meningioma), 신경아 교종, 예를 들어 성상 세포종, 희소 돌기 종, 수 모세포종), 기관지암, 유암종, 자궁경부암(예를 들어, 자궁 경부 선암종), 융모막암종(choriocarcinoma), 척삭종 (chordoma), 두개 인두종(craniopharyngioma), 결장 직장암(예를 들어, 대장암, 직장암, 결장 직장 선암), 상피 암종, 상피 세포종, 내피 육종 피종(예를 들어, 카포시 육종, 다발성 특발성 난소 암종), 자궁 내막암(자궁암, 자궁 육종), 식도암(예를 들어, 식도 선암, 바렛 선암), 유익 육종(Ewing sarcom), 안암(예를 들어, 안구 흑색 종, 망막 모세포종), 익숙한 과호산구증가증, 담낭암, 위암(위 선암), 위장관 간질 종양(GIST), 두경부암(예를 들어, 두경부 편평 상피암), 구강암(예를 들어, 경구 편평 세포 암종(OSCC), 인후암(예를 들어, 후두암, 인두암, 비 인두암, 구강 인두암)), 조혈암(예를 들어, 급성 림프 구성 백혈병(ALL)와 같은 백혈병(예를 들어, B 세포 ALL, T 세포 ALL), 급성 골수성 백혈병(AML)(예를 들어, B 세포 AML, T 세포 AML), 만성 골수성 백혈병(CML)(예를 들어, B 세포 CML, T 세포 CML) 및 만성 림프구성 백혈병(CLL)(예를 들어, B 세포 CLL, T 세포 CLL), 호지킨 림프종(HL)(예를 들어, B 세포 HL, T 세포 HL) 및 비호 지킨 림프종 (NHL) (예를 들어, 확산성 대세포 림프종 (DLCL) 같은 B 세포NHL (예를 들어, 광범위큰B세포림프종 (DLBCL)), 여포성 림프종, 만성 림프구성 백혈병 / 소 림프구성 림프종(CLL/SLL), 맨틀 세포 림프종 (MCL), 변연부(marginal zone) B 세포 림프종 (예를 들어, 점막 관련 림프성 조직(MALT) 림프종, 마디 변연부 B 세포 림프종, 비성의 변연부(splenic marginal zone) B세포 림프종, 일차 종격동(primary mediastinal) B-세포 림프종, 버킷 림프종, 림프성 세포성(lymphoplasmacytic) 림프종 (예를 들어, "월데스트 럼의 매크로 글로블린 혈증(Waldenstrom 's macroglobulinemia)), 털세포 백혈병 (HCL), 면역 모세포성 대형세포 림프종 (immunoblastic large cell lymphoma), 전구체 B- 림프모 종양 림프종 및 원발 중심부(primary central) 신경계 (CNS) 림프종; 및 전구체 T 세포 림프모 림프종/백혈병, 말초 T 세포 림프종 (PTCL)(예를 들어, 피부T세포 림프종 (CTCL)(예를 들어, 사상균병(mycosis fungiodes), Sezary 증후군), 혈관 면역모구 T 세포 림프종, 외안핵 자연 살해 세포 T 림프종, 장 질환 T 세포 림프종, 피하 지방층염 유사 T 세포 림프종, 역형성 큰 세포 림프종)과 같은 T 세포 NHL; 상기 서술한 바와 같은 하나 이상의 백혈병/림프종의 혼합; 다발성 골수종(MM), 중쇄 질환 (예를 들어, 알파 사슬 질환, 감마 연쇄 질환, 뮤 체인병), 혈관모 세포종, 염증성 근섬유 아세포종, 면역세포성 아밀로이드증, 신장암 (예를 들어, 월름즈종양으로 알려진 신장 모세포종, 신세포 암종), 폐암(예를 들어, 기관지 암종, 소세포 폐암 (SCLC), 비소 세포 폐암 (NSCLC), 폐의 선암종), 평활근 육종 (LMS), 비만 세포증 (예를 들어, 전신성 비만 세포증), 골수이 형성 증후군 (MDS), 중피종, 골수 증식 성 질환 (MPD), (예를 들어, 진성다혈구증 (polycythemia Vera) (PV), 특발성 혈소판 증가증 (ET), 원인불명골수화생 (agnogenic myeloid metaplasia), 골수 섬유증 (myelofibrosis) (MF), 만성 특발성 골수 섬유증 (chronic idiopathic myelofibrosis), 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 호 중성 백혈병 (CNL), 호산 증가 증후군 (HES), 신경 섬유종 (neurofibroma) (예를 들어, 신경 섬유종증 (NF) 1 형 또는 2 형, 슈뇌 노마즘), 신경내분비 암 (예를 들어, 위장관 췌 신경 내분비 종양 (GEP-NET), 카르시노이드 종양), 골육종, 난소암 (예를 들어, 낭선암종, 난소 배아 암종, 난소 선암), 유두 선암, 췌장암 (예를 들어, 췌장 선암종, 유두상 점액성 종양 유관 (IPMN), 췌도 세포 종양), 음경암 (예를 들어, 음경과 음낭의 파제트 병), 송과체종(pinealoma), 원시 신경 외배엽 종양 (PNT), 전립선암 (예를 들어, 전립선 선암종), 직장암, 횡문근 육종, 타액선암, 피부암 (예를 들어, 편평 상피 세포 암 (SCC)), 다발각질가시세포종 (keratoacanthoma, KA), 흑색 종, 기저 세포 암 (BCC)), 소장 암 (예를 들어, 충수암), 연조직 육종 (예를 들어, 악성 섬유성 조직 구종 (MFH), 지방 육종, 악성말초신경초종양 (MPNST), 연골 육종, 섬유 육종, 점액 육종), 피지선 암종, 땀샘 암종, 윤활막종(synovioma), 고환암 (예를 들어, 정상피종, 고환 태생성 암종), 갑상선암(예를 들어, 갑상선의 유두암, 유두 갑상선암 (PTC), 갑상선 수질암), 요도암, 질암 및 외음부 암 (예를 들어, 외음부의 패제병(Paget's disease)을 포함하지만 이에 한정되지 않는 암을 치료하거나 진단하는데 유용할 수있다. 특정 실시 양태에서, 제공된 글리칸 콘주게이트, 면역원성 조성물 또는 백신은 뇌암, 폐암, 유방암, 구강암, 식도암, 위암, 간암, 담도암, 췌장암, 대장암, 신장암 , 골암, 피부암, 자궁 경부암, 난소 암 및 전립선암의 치료에 유용하다.
본원에 기술된 치료 방법을 수행하기 위하여, 유효량의 본 발명의 글리칸 콘주게이트 또는 면역원성 조성물 또는 백신은 상기 전술한 바와 같은 적절한 경로를 통한 치료를 필요로 하는 대상에게 투여될 수 있다. 사람과 같은 대상은 암을 앓고 있거나, 암에 걸린 것으로 의심되거나 암에 걸리기 쉬운 환자일 수 있다. 유효량은 콘주게이트 또는 조성물에서 글리칸 모이어티에 특이적인 면역 반응을 유도하는데 효과적 일 수 있거나, 암 성장 억제 및/또는 종양 질량 감소를 유도하는 면역 반응을 유도하기에 충분할 수 있거나, 또는 암의 발병을 지연시키거나 암 발달 위험을 감소시키는데 효과적일 수 있다. 필요한 정확한 양은 예를 들어, 대상의 종, 연령 및 일반적인 상태, 부작용 또는 장애의 중증도, 특정 화합물(들)의 동일성, 투여 방식 등에 따라, 개체마다 다를 것이다. 바람직한 용량은 하루 3 회, 하루 2 회, 하루에 한 번, 격일마다, 매 3 일마다, 매주, 매 2 주마다, 매 3 주마다 또는 매 4 주마다 전달될 수 있다. 다중 투여(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 그 이상 투여)를 사용하여 전달될 수 있다.
특정 구현예에서, 70 kg 성인 인간에 대한 본 발명의 글리칸 콘주게이트, 면역원성 조성물 또는 백신의 유효량은 약 0.0001 mg 내지 약 3000 mg, 약 0.0001 mg 내지 약 2000 mg, 약 0.0001 mg 내지 약 1000 mg, 약 0.001 mg 약 1000 mg, 약 0.01 mg 내지 약 1000 mg, 약 0.1 mg 내지 약 1000 mg, 약 1 mg 내지 약 1000 mg, 약 1 mg 내지 약 100 mg, 약 10 mg 내지 약 1000 mg 또는 약 100 mg 내지 약 1000 mg의 단위 투약 형태 당 화합물을 함유 할 수 있다.
특정 구현예에서, 제공된 글리칸 콘주게이트, 면역원성 조성물 또는 백신은 원하는 치료 효과를 얻기 위해 하루에 1 회 이상, 하루에 대상 체중의 약 0.001 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 바람직하게는 약 0.1 mg/kg 내지 약 40 mg/kg, 바람직하게는 약 0.5 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 보다 바람직하게는 약 1 mg/kg 내지 약 25 mg/kg 투여할 수 있다
본원에 기재된 투여량 범위는 성인에게 본 발명의 글리칸 콘주게이트, 면역원성 조성물 또는 백신의 투여에 대한 지침을 제공함을 알 것이다. 어린이 또는 청소년에게 투여되는 양은 의사 또는 당업자가 결정할 수 있으며, 성인에게 투여되는 양보다 낮거나 동일할 수 있다.
본 발명의 글리칸 콘주게이트, 면역원성 조성물 또는 백신은 하나 이상의 추가의 치료학적 활성제와 조합하여 투여될 수 있다. 이들은 그들의 생체 이용률을 개선시키고, 그들의 대사를 감소 및/또는 변형시키며, 그들의 배설을 억제하고, 및/또는 신체 내의 분포를 변형시키는 추가의 치료학적 활성제와 조합하여 투여될 수 있다. 또한, 사용된 치료법은 동일한 질환에 대해 원하는 효과를 달성할 수 있고, 및/또는 상이한 효과를 달성할 수 있음을 이해할 것이다.
제공된 글리칸 콘주게이트, 면역원성 조성물 또는 백신은 하나 이상의 추가의 치료학적 활성제와 동시에, 투여하기 전에 또는 투여 후에 투여될 수 있다. 일반적으로, 각각의 약제는 그 약제에 대해 결정된 투여량 및/또는 시간 스케쥴로 투여 될 것이다. 조합에서 이용되는 추가의 치료적 활성제는 단일 조성물로 함께 투여되거나 상이한 조성물로 개별적으로 투여될 수 있다. 치료 요법에서 사용하는 특정 조합은 본 발명의 화합물과 추가의 치료적 활성 약제와의 양립가능성 및/또는 달성되는 바람직한 치료 효과를 고려할 것이다. 병용 요법에서 추가적인 치료적 활성제는 이들이 개별적으로 이용되는 수준을 초과하지 않는 수준에서 이용될 것으로 예상된다. 어떤 경우에는 조합하여 활용되는 수준이 개별적으로 활용되는 수준보다 낮을 수 있다.
특정 구현예에서, 제공된 글리칸 콘주게이트, 면역원성 조성물 또는 백신은 하나 이상의 본원에 기술된 추가적인 약제학적 제제와 함께 투여된다. 특정 구현예에서, 추가적인 약제학적 제제는 항암제이다. 항암제는 생물학적 치료용 항암제 뿐만 아니라 화학적 치료제를 포함한다.
생물학적 치료용 항암제에는 인터페론, 사이토카인 (예를 들어, 종양 괴사 인자, 인터페론 α, 인터페론 γ), 백신, 조혈 성장 인자, 단일 클론 혈청 치료제, 면역 자극제 및/또는 면역 조절제(예를 들어, IL-1, 2, 4, 6, 또는 12), 면역 세포 성장 인자(예를 들어, GM-CSF) 및 항체 (예를 들어, HERCEPTIN(trastuzumab), T-DM1, AVASTIN(bevacizumab), ERBITUX(cetuximab), VECTIBIX(panitumumab), RITUXAN(rituximab), BEXXAR(tositumomab))를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
화학적 치료제는 항-에스트로겐(예를 들어, 타목시펜, 랄록시펜 및 메게스트롤), LHRH 아고니스트 (예를 들어, 고세 렐린 및 루프로라이드), 항-안드로겐 (예를 들어, 플루타미드 및 비칼루타미드), 광역학요법 (예를 들어, 베르토포르핀(vertoporfin, BPD-MA), 프탈로시아닌, 감광제 Pc4, 및 데메톡시-하이포클린 A (2BA-2-DMHA)), 질소 머스터드 (예를 들어, 시클로포스파미드, 이포스파마이드, 트로포스파미드, 클로람부실, 에스트라스무스틴 및 멜팔란), 니트로소 요소(예를 들어, 카르무스틴(BCNU) 및 로무스틴(CCNU)), 알킬설포네이트(예를 들어, 부설판 및 트레오설판), 트리아젠(예를 들어, 다카르바진, 테모졸로미드), 백금 함유 화합물(예를 들어, 시스플라틴, 카르보플라틴, 옥살리플라틴), 빈카 알칼로이드(예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 및 비노렐빈), 탁소이드(예를 들어, 파클리탁셀 또는 파클리탁셀 균등물, 예를 들어, 나노 입자 알부민-결합 파클리탁셀(Abraxane) 도코사 헥사엔산 결합-파클리탁셀(DHA-파클리탁셀, Taxoprexin),　 폴리글루타메이트 결합-파클리탁셀(PG-파클리탁셀, 파클리탁셀 폴리글루멕스, CT-2103, XYOTAX), 종양 활성화된 프로드러그(tumor-activated prodrug, TAP) ANG1005 (파클리탁셀의 3분자에 결합된 안지오펩-2), 파클리탁셀-EC-1(erbB2-인지 펩티드EC-1에 결합된 파클리탁셀), 및 글루코스-컨쥬게이트된 파클리탁셀, 예를 들어, 2'-파클리탁셀 메틸- 2-글루코피라노실 숙시네이트; 도세탁셀, 탁솔), 에피포도필린(예를 들어, 에토포사이드, 에토포사이드 포스페이트, 테니포사이드, 토포테칸, 9-아미노캄토테신(aminocamptothecin), 캄토이리노테칸, 이리노테칸, 크리스타놀, 마이토마이신 C), 항 대사제, DHFR 억제제 (예를 들어, 메토트렉세이트, 디클로로메토 트렉세이트, 트리메트렉세이트, 에다트렉세이트), IMP 탈수소 효소 억제제(예를 들어, 미코페놀산, 티아조퓨린, 리바비린 및 EICAR), 리보누클레오티드 환원 효소 저해제(예를 들어, 히드록시우레아 및 데페록사민), 우라실 유사체(예를 들어, 5-플루오로우라실(5-FU), 플록스우리딘, 독시플루리딘, 라티트렉세드(ratitrexed), 테가푸르-우라실, 카페시타빈), 시토신 유사체 (예를 들어, 시타라빈 (araC), 시토신 아라비노사이드 및 플루다라빈), 퓨린 유사체(예를 들어, 머캅토퓨린 및 티오구아닌), 비타민 D3 유사체(예를 들어, EB 1089, CB 1093, 및 KH 1060), 단백지질화(isoprenylation) 억제제 (예를 들어, 로바스타틴), 도파민성 신경독(dopaminergic neurotoxins) (예를 들어, 1-메틸-4-페닐피리디니움 이온), 세포 주기 억제제 (예를 들어, 스타우로스포린), 액티노마이신(예를 들어, 액티노마이신 D, 닥티노마이신), 블레오마이신(예를 들어, 블레오마이신 A2, 블레오마이신 B2, 페폴로마이신), 안트라사이클린(예를 들어, 다우노루비신, 독소루비신, 페길화 리포좀성 독소루비신, 이데루비신, 에피루비신, 피라루비 신, 조루비신, 미톡산트론), MDR 억제제 (예를 들어, 베라파밀), Ca2+ ATPase 억제제 (예를 들어, 탑시가르긴(thapsigargin)), 이마티닙, 탈리도미드, 레나리도미드, 티로신 키나아제 억제제 (예,, 액시티닙(AG013736), 보수티닙 (SKI-606), 세디라닙 (RECENTINTM, AZD2171), 다사티닙(SPRYCEL®, BMS-354825), 얼로티닙(TARCEVA®), 제피티닙(IRESSA®), 이마티닙(Gleevec®, CGP57148B, STI-571), 라파티닙(TYKERB®, TYVERB®), 레스타우르티닙(CEP-701), 네라티닙 (HKI-272), 닐로티닙 (TASIGNA®), 세마키닙 (세마키닙, SU5416), 수니티닙(SUTENT®, SU11248), 토세라닙 (PALLADIA®), 반데타닙(ZACTIMA®, ZD6474), 바타라닙(PTK787, PTK/ZK), 트라스투주맙(HERCEPTIN®),　 베바시주맙 (AVASTIN®), 리툭시맙(RITUXAN®), 세툭시맙(ERBITUX®), 파니투무맙(VECTIBIX®), 라니비주맙(Lucentis®), 닐로티닙(TASIGNA®), 소라페닙(NEXAVAR®), 에베로니무스(AFINITOR®), 알렘투주맙(CAMPATH®), 젬투주맙 오조가마이신 (MYLOTARG®), 템시로리무스(TORISEL®), ENMD-2076, PCI-32765, AC220, 도비티닙 락테이트(TKI258, CHIR-258), BIBW 2992 (TOVOKTM), SGX523, PF-04217903, PF-02341066, PF-299804, BMS-777607, ABT-869, MP470, BIBF 1120 (VARGATEF®), AP24534, JNJ-26483327, MGCD265, DCC-2036, BMS-690154, CEP-11981, 티보자닙(AV-951), OSI-930, MM-121, XL-184, XL-647, 및/또는 XL228), 프로테아좀 억제제(예,, 보르테조닙(Velcade)), mTOR 억제제(예,, 라파마이신, 템시로리무스(CCI-779), 에베로리무스(RAD-001), 리다포로리무스, AP23573 (Ariad), AZD8055 (AstraZeneca), BEZ235 (Novartis), BGT226 (Norvartis), XL765 (Sanofi Aventis), PF-4691502 (Pfizer), GDC0980 (Genetech), SF1126 (Semafoe) 및 OSI-027 (OSI)), 오블리메르센(oblimersen), 젬시타빈(gemcitabine), 카르미노마이신, 류코보린, 페메트렉스트(pemetrexed), 시클로포스파미드, 다카르바진, 프로카르비진, 프레드니솔론, 덱사메타손, 캠파테신, 필카마이신(plicamycin), 아스파라기나아제, 아미노프 테린(aminopterin), 메토프테린(methopterin), 포르피로마이신(porfiromycin), 멜파란(melphalan), 류로시딘(leurosidine), 류로신(leurosine), 클로람부실(chlorambucil), 트라벡테딘(trabectedin), 프로카바진(procarbazine), 디스코데몰라이드(discodermolide), 카르미노마이신(carminomycin), 아미노프테린(aminopterin), 및 헥사메틸 멜라민(hexamethyl melamine)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
특정 구현예에서, 치료되는 피검체는 포유동물이다. 특정 구현예에서, 피검체는 인간이다. 특정 구현예에서, 피검체는 가축화된 동물, 예를 들어, 개, 고양이, 소, 돼지, 말, 양, 또는 염소이다. 특정 구현예에서, 피검체는 반려 동물, 예를 들어, 개 또는 고양이이다. 특정 구현예에서, 피검체는 가축 동물, 예를 들어, 소, 돼지, 말, 양 또는 염소이다. 특정 구현예에서, 피검체는 동물원 동물이다. 다른 구현예에서, 피검체는 연구 동물, 예를 들어, 설치류, 개, 또는 비-인간 영장류이다. 특정 구현예에서, 피검체는 비-인간 형질전환 동물, 예를 들어, 형질전환 마우스 또는 형질전환 돼지이다.
암 줄기 세포 바이오마커
이종 암 조직에서 자기-재생 및 종양-성장의 원인이 되는 암 줄기 세포(CSC)의 발견은 신규한 암 치료법 및 조기 진단을 개발하는데 자극화된 이해를 갖는다. 그러나, CSC의 단리를 위해 현재 사용되는 마커는 종종 이러한 특별한 세포 집단의 연구를 위해 CSC를 농화시키기에 충분히 선택되지 않는다. 여기에서, 본 발명자는 CD44+CD24-/l0SSEA-3+ 또는 ESAhiPROCRhiSSEA-3+ 마커로 단리된 유방암 줄기 세포(BCSC)가 시험관내 및 생체내에서 통상적인 마커 보다 더 높은 종양 형성을 갖는다는 것을 나타낸다. D44+CD24-/l0SSEA-3+ 를 갖는 10개 정도의 세포는 D44+CD24-/l0을 갖는 100개 초과의 세포와 비교하여, 마우스에서 종양을 형성하였다. 글로보-계열 경로에서 유전자 엔코딩 β-1,3-갈락토오스전달효소 5(β3GalT5)의 녹다운에 의한 SSEA-3 발현의 억제는 특이적으로 암 세포에서 아폽토시스를 야기시키지만, 정상 세포에 대한 효과를 가지지 않는다. 이러한 발견은 줄기 세포(ESC 및 iPSC) 및 다양한 정상 세포 및 암 세포에서 SSEA-3 및 두 개의 관련된 글로보-계열 에피토프 SSEA4 및 Globo-H의 분석에 의해, 및 유방암 백신의 글로보-계열 글리칸 및 후기 임상 시험을 타겟화하기 위한 항체 방법에 의해 추가로 지지된다.
암 줄기 세포는 자기-재생 및 종양-성장 성질을 갖는 암 세포의 특별한 집단이고, 항-암 요법의 개발을 위한 중요한 타겟이다. 본 발명자들은 유방암 줄기 세포의 표면 상에서 배타적으로 발현된 단계-특이적 배아 항원 3(SSEA-3)으로 불리워지는 당지질을 발견하였으며, 공지된 단백질 마커(CD24 및 CD44)와 조합할 때, 유방암 줄기 세포는 크게 농화될 수 있고, 10개 정도의 이러한 농화된 세포가 종양을 성장시키기 위해 사용될 수 있다. 또한, SSEA3의 합성에서 수반되는 효소 갈락토오스전달효소(β3GalT5)는 정상 세포에서가 아닌 유방암 줄기 세포 및 암 세포에서 특이적으로 발현되며, SSEA3 및 β3GalT5 둘 모두는 암 세포 생존을 위해 필수적인 것으로 발견된다. 이러한 발견은 신규한 항-암 전략의 발달을 유도할 수 있다.
암 줄기 세포(CSC)는 자기-재생 및 종양 개시의 능력을 갖는 드문 세포로서, 이는 효과적인 치료법 및 조기 진단을 위해 암 진행 및 특정 타겟에 매우 관련되어 있다(1-5). 지금까지, 여러 암 줄기 세포는 단백질 마커에 의해 동정되고 특징분석되었다. 유방암 줄기 세포(BCSC)는 클라크(Clarke) 등에 의해 2003년에 최초로 발견되었다. CD44+CD24-/l0 발현을 갖는 유방암 세포가 다른 것 보다 더 높은 수준의 종양 형성을 가지고 ~100의 이러한 세포를 갖는 동물에서 종양을 형성할 수 있다는 것이 입증되었다(6). 또한, 다른 단백질, 예를 들어, ALDH-1, CD133, CD326(ESA), CD201(PROCR), 및 이들의 조합은 또한, BCSC 바이오마커로서 보고되어 있다(7-9). 그러나, 이러한 마커를 기초로 한 농화 공정으로부터 얻어진 BCSC는 여전히 다수의 비-암 줄기 세포를 함유하며, 이러한 세포의 연구는 암 줄기 세포의 비특이적 특징을 제공할 것이다. 이에 따라, 신규한 마커는 분석 및 연구를 위해 보다 잘 규정된 BCSC를 농화시키고 수득하기 위해 요구된다.
당지질은 암 발달 동안 변형되는 것으로 알려져 있다(10-15). 본 발명자의 이전 연구에서, 글로보-계열 글리칸 SSEA-3(Gb5), SSEA-4(시알릴-Gb5) 및 Globo-H(푸코실-Gb5)는 배타적으로 유방암 및 BCSC를 포함하는 여러 암들의 세포 표면 상에서만 발견된다(16-18). 본 발명자들은 또한, ESAhiPROCRhi 또는 CD44+CD24-/l0 중 어느 하나를 지닌 BCSC가 이러한 글로보-계열 에피토프의 높은 발현을 나타낸다는 것을 보고하였다(19). SSEA-3은 β3GalT5에 의해 Gb4로부터 합성되며(20), Globo-H 및 SSEA-4는 푸코실트랜스퍼라아제 1, 2(FUT1, FUT2)(21, 22) 및 ST3 β-갈락토사이드 α-2,3-시알릴트랜스퍼라아제 2(ST3Gal2)(23) 각각에 의해 SSEA-3으로부터 합성된다.
본 발명자들은 본원에서 SSEA=3에 관한 것이며, 글로보-계열 경로에서 관련된 글리칸 및 효소는 암 특이적이고 BCSC 마커이다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 입증하기 위해 포함된다. 하기 실시예에 기재된 기술들이 본 발명의 실행에서 잘 기능하도록 본 발명자들에 의해 발견된 기술을 나타내고, 이에 따라, 이의 실행을 위한 바람직한 모드를 구성하는 것으로 고려될 수 있다는 것이 당업자에 의해 인식되어야 한다. 그러나, 당업자는, 본 발명을 고려하여, 여러 변형들이 기재된 특정 구현예에서 이루어질 수 있고 또한, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 같은 또는 유사한 결과를 얻을 수 있다는 것을 인식하여야 한다.
실시예 1: SSEA3 유사체의 예시적인 합성
반응식 1.
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용액 중 조합된 화합물들 Gb4 유사체, ATP, UTP, 갈락토오스 유사체, 포스포에놀피루베이트, 효소 갈락토키나아제(GalK)를 갖는 MgCl2, UDP-당 피로포스포릴라아제(AtUSP), β-1,3-갈락토오스전달효소(LgtD,), 피루베이트 키나아제(PK), 및 무기 피로포스파타아제(PPA), 및 반응을 7.0에서 조절된 pH로 실온에서 개시하고, 반응을 더 많은 산물이 관찰되지 못할 수 있을 때까지 TLC에 의해 모니터링하였다. 반응을 완료한 후에, 30분 동안 가열하고 이후에 원심분리하고 0.22 μM 필터로 여과함으로써 반응 혼합물 중의 단백질을 제거하였다. 이후에, 여액을 C-18 겔 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 분획들을 수집하고 TLC에 의해 모니터링하였다.
실시에 2: SSEA4 유사체의 예시적인 합성
방법 1 : SSEA4-Gc의 화학적 합성
화합물 1-6을 문헌 보고된 방법에 의해 제조하였다. 6 mL의 디클로로메탄(CH2Cl2) 중 수용체(3)(93 mg, 0.045 mmol) 및 이미데이트(6)(76 mg, 0.068 mmol)의 용액에, 분말화된 분자체(4A, 0.5 g)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. -10℃로 냉각시킨 후에, TMSOTf(5 ㎕, 0.03 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 5℃(냉장실)에서 밤새 교반하였다. CH2Cl2로 희석된 트리에틸아민(0.5 mL)의 첨가에 의해 반응 혼합물을 켄칭하고, 셀라이트 패드를 통해 여과하였다. 여액을 소듐 비카보네이트(NaHC03) 포화수용액으로 세척하고, 소듐 설페이트(Na2SO4) 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축하였다. 잔부를 플래시 실리카 크로마토그래피(헥산 중 50 내지 100% EtOAc)에 의해 정제하여 이당류 이미데이트(6)로부터 불순물로 오염된 육탕류(7)를 수득하였다. 수율은 NMR에 의해 추정되었다(90 mg, 68%).
빙초산(5.0 mL) 중 육당류(7)(90 mg, 0.03 mmol)의 용액에 아연 더스트(zinc dust)(1 g)를 첨가하고, 혼합물을 1 내지 2시간 동안, 화합물(6)이 TLC 분석에 의해 소비될 때까지 교반하였다. 반응 혼합물을 CH2Cl2로 희석시키고, 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 감압 하에 농축하였다. 잔부를 피리딘/Ac20(1:1, 2.0 mL)에 용해시키고, 1시간 동안 교반하고, 농축하였다. 잔부를 플래시 실리카겔 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 아실화된 물질을 무수 CH2Cl2 및 MeOH(2:8, 10 mL)에 용해시키고, NaOMe(45 mg)로 처리하였다. 실온에서 4시간 동안 교반한 후에, 물(0.2 mL)을 첨가하고, 얻어진 혼합물을 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 amberlyst IR-120로 중성화시키고, 여과하고, 농축하였다. 잔부를 역상 크로마토그래피(RP-18)에 의해 정제하였다.
메탄올/물/아세트산(10:10:0.5, 6 mL)의 혼합물 중의 부가물에 팔라듐 히드록사이드(차콜 중 20%, 50 mg)를 첨가하고, 반응 혼합물을 수소의 양압 하, 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 농축하였다. 잔부를 역상 크로마토그래피에 의해 정제하여 8을 수득하였다(17 mg, 43%).
반응식 2.
Figure 112017081613999-pct00017
방법 2: SSEA4 유사체의 화학효소적 합성의 일반적 전략
출발 물질로서 ManNAc를 사용하여 3개의 효소적(ManNAc-6-키나아제, NeuAc-9-P-신타아제, 및 NeuAc-9-P-포스파아제) 반응에 의해 CMP-시알산 유사체를 합성하였다. CMP-Neu5AC 재생과 조합된 □ 2,3-시알릴트랜스퍼라아제 반응 하에서의 Gb5 유사체와 반응된 CMP-시알산 유사체는 SSEA4 유사체를 수득할 수 있다. ref2
반응식 3
Figure 112017081613999-pct00018
실시예 3 : SSEA-3/SSEA-4 유도체 DT-콘주게이트의 합성
일반적인 방법: SSEA3 유사체-NH2 또는 SSEA4 유사체-NH2를 SSEA3 유사체-SH 또는 SSEA4-유사체-SH로 개질시킴
SSEA3/4 유사체 DT-콘주게이트를 합성하기 위해, 아민-종결된 SSEA3/4 유사체를 실온에서 PBS 완충제(pH 7.4) 중에서 DTSSP 링커와 반응하였다. pH 페이퍼에 의해 용액의 pH 값을 모니터링하고, 용액이 중성 또는 산이 되었을 때, 용액에 약간의 NaOH 용액을 첨가하였다. 반응을 실온에서 12시간 동안 교반한 후에, DTT를 실온에서 용액에 첨가하였다. 용액을 40℃에서 교반한 채로 유지시키고, 이후에, 용매를 감압 하에 제거하였다. 잔부를 LH20 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 SSEA3/4 유사체-SH를 수득하였다.
단계 B: CRM197을 CRM197-말레이미드로 개질시킴
상업적 CRM197의 염(1.0 mg)을 교대로 수중 용해 및 투석(Amicon Ultra-0.5, 10 kDa,)을 통해 제거한 후에, 잔부를 PBS 완충제(pH 6.5, 1.0 mL)에 용해시키고, 샘플 바이알로 전달하였다. 설포-EMCS(1.0 mg, 8.22×10- 6 mol)를 용액에 첨가하고, 이후에, 반응을 실온에서 2시간 동안 교반한 채로 유지시켰다. 혼합물을 Amicon Ultra-0.5(10 kDa)에 의해 정제하였다. 분자량을 체크하기 위해 MALDI-TOF를 사용하고 단백질의 양을 계산하기 위해 BCA 검정을 이용한 후에, CRM197-말레이미드를 다음 단계를 위해 PBS 완충제(pH 7.2, 1.0 mg/mL)에 저장하였다. MALDI-TOF의 데이타에 따르면, 말레이미드 작용기의 양을 계산할 수 있다. 예를 들어, CRM197-말레이미드의 분자량이 61841일 때, CRM197-말레이미드 상의 말레이미드 작용기의 수는 (61841-58326)/193 = 18.2이었다.
단계 C: SSEA3/4 유사체-CRM197 콘주게이트의 합성
CRM197-말레이미드를 PBS 완충제(pH 7.2, 농도는 1.0 mg/mL임) 중에 용해시키고, 이후에, 상이한 양의 SSEA3/4 유사체-SH(PBS 완충제 중 5.0 mg/mL, pH 7.2)를 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. SSEA3/4 유사체-CRM197 콘주게이트를 Amicon Ultra-0.5(10 kDa)를 이용함으로써 정제하여 비반응성 SSEA3/4 유사체-SH 및 소듐 포스페이트 염을 투석을 통해 제거하였다. 수득된 SSEA3/4 유사체-CRM 197 콘주게이트는 탄수화물 도입률을 결정하기 위해 MALDI-TOF 분석에 의해 특징될 수 있다. DTT와 반응하고 LH-20 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제한 후에 비반응성 SSEA3/4 유사체-SH는 회수될 수 있다.
실시예 4: SSEA4-Gc CRM197 콘주게이트의 합성
단계 A: SSEA4-Gc-NH2를 SSEA4-Gc-SH로 개질시킴
DTSSP(5.0 mg, 8.22×10- 6 mol)를 실온에서 PBS 완충제 (pH 7.4, 1.0 mL) 중의 SSEA4-Gc-NH2(5.0 mg, 4.01×10-6 mol)의 플라스크에 첨가하였다. pH 페이퍼에 의해 용액의 pH 값을 모니터링하고, 용액이 중성 또는 산이 될 때, 용액에 약간의 NaOH(1M/물)를 첨가하였다. 반응을 실온에서 12시간 동안 교반한 후에, DTT(5.0 mg, 32.41×10- 6 mol)를 실온에서 용액에 첨가하였다. 용액을 40℃에서 1시간 동안 교반한 채로 유지시키고, 이후에, 용매를 감압 하에 제거하였다. 잔부를 LH-20 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 SSEA4-Gc-SH를 수득하였다(5.0 mg, 93%).
단계 B: CRM197을 CRM197-말레이미드로 개질시킴
상업적 CRM197의 염(1.0 mg)을 교대로 수중 용해 및 투석(Amicon Ultra-0.5, 10 kDa,)을 통해 제거한 후에, 잔부를 PBS 완충제(pH 6.5, 1.0 mL)에 용해시키고, 샘플 바이알로 전달하였다. 설포-EMCS(1.0 mg, 8.22×10-6 mol)를 용액에 첨가하고, 이후에, 반응을 실온에서 2시간 동안 교반한 채로 유지시켰다. 혼합물을 Amicon Ultra-0.5(10 kDa)에 의해 정제하였다. 분자량을 체크하기 위해 MALDI-TOF를 사용하고 단백질의 양을 계산하기 위해 BCA 검정을 이용한 후에, CRM197-말레이미드를 다음 단계를 위해 PBS 완충제(pH 7.2, 1.0 mg/mL)에 저장하였다. MALDI-TOF의 데이타에 따르면, 말레이미드 작용기의 양을 계산할 수 있다. 예를 들어, CRM197-말레이미드의 분자량이 61841일 때, CRM197-말레이미드 상의 말레이미드 작용기의 수는 (61841-58326)/193 = 18.2이었다.
하기 표 1에 나타낸 바와 같이, CRM197-말레이미드를 PBS 완충제(pH 7.2, 농도는 1.0 mg/mL임) 중에 용해시키고, 이후에, 상이한 양의 SSE4Gc-SH(PBS 완충제 중 5.0 mg/mL, pH 7.2)를 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. SSEA4-Gc-CRM197 콘주게이트를 Amicon Ultra-0.5(10 kDa)를 이용함으로써 정제하여 비반응성 SSEA4-Gc-SH 및 소듐 포스페이트 염을 투석을 통해 제거하였다. 수득된 SSEA4-Gc-CRM197 콘주게이트는 표 1에 나타낸 바와 같이 탄수화물 도입률을 결정하기 위해 MALDI-TOF 분석에 의해 특징될 수 있다. DTT와 반응하고 LH-20 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제한 후에 비반응성 SSEA4-Gc-SH는 회수될 수 있다.
단계 C: CRM197-말레이미드의 비반응성 말레이미드를 트랩함
SSEA4-Gc-CRM197 콘주게이트를 PBS 완충제(pH 7.2, 농도는 1.0 mg/mL임)에 용해시키고, 10.0 당량의 2-머캅토에탄올(5 mg/mL, PBS 완충제, pH 7.2)을 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 투석을 통해 비반응성 2-머캅토에탄올 및 소듐 포스페이트 염을 제거하기 위해 Amicon Ultra-0.5(10 kDa)을 사용함으로써 SSEA4-Gc-CRM197 콘주게이트를 정제하고, 이후에, 백색 분말로 동결건조시켰다.
반응식 3
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표 1. 평균 탄수화물 도입의 MALDI-TOF 분석
Figure 112017081613999-pct00020
실시예 5: SSEA-4 유도체 DT-콘주게이트의 면역원성 연구
SSEA4 유사체 DT-콘주게이트(1-DT 내지 10-DT)의 면역원성을 조사하기 위해, 5마리의 암컷 BALB/c 마우스에 2 ㎍의 SSEA4 유사체 DT-콘주게이트 및 2 ㎍의 당지질 애주번트 C34를 격주 간격으로 3회 근육내 면역화하였다. 이전 연구에서, 항-GH 항체 역가는 어떠한 애주번트도 없는 SSEA4 유사체-단백질 콘주게이트 단독과 비교하여 낮았다. 각 면역원으로부터의 항혈청은 3주 면역화 후 10일째에 얻어졌고, 글로보 계열 글리칸 및 다른 종양-관련 탄수화물 항원을 포함하는 94개의 화학적으로 합성된 글리칸을 함유한 글리칸 마이크로어레이 상에서 시험하였다. 일부 화학적 개질이 글리칸 상에서 수행되었기 때문에, 교차 반응성을 체크하기 위해 글리칸 어레이에 일부 작용성 링커를 또한 포함시켰다.
SSEA4-Gc CRM197-콘주게이트에 의해 유도된 항체는 SSEA4-Gc, 천연 SSEA4 또는 SSEA4 사당류 단편에 의해 특이적으로 인식되었지만, 다른 TACA 및 작용성 링커에 의해 인식되지 않았다. 글리코콘주게이트로부터 수득된 혈청은 높은 IgG 항체 역가를 유도하였는데, 이는 T-세포-의존성 면역 반응을 지시하는 것이다. 흘미롭게도, SSEA4-Gc 또는 천연 SSEA4에 대하여 어떠한 현저한 IgM 생산도 관찰되지 않았다. GH에 대한 IgG 수준과 관련하여, SSEA4-Gc CRM197에 의해 유도된 항체의 역가는 천연 SSEA-CRM197 콘주게이트로부터의 특성 보다 훨씬 더 높았다. 이러한 것들 중에서, CRM197의 한 분자와 콘주게이팅된 SSEA4-Gc의 6.9 분자는 가장 높은 항체 역가를 유도할 수 있다[또한 도 12 참조].
마우스 복용량 및 면역화 스케줄
SSEA4 유사체 CRM197의 면역원성을 비교하기 위해, 5 마리 마우스(8 주령 암컷 Balb/c 마우스, BioLASCO, 대만)의 그룹을 당지질 C34로 근육 내 면역시켰다. 2주 간격으로 3 회의 면역화를 실시하였다. 각 백신 접종에는 2 ㎍ SSEA4 유사체 및 2 ㎍ C34를 포함하였다. 대조군 마우스에는 인산 완충 생리 식염수(PBS)를 주사하였다. 마우스는 첫 번째 면역화(면역전) 이전 및 세 번째 면역화 후 10 일째에 체혈하였다. 4,000×g에서 10분간 원심 분리하여 모든 혈청을 얻었다. 상기 혈청학적 반응은 글리칸 마이크로어레이로 분석하였다.
글리칸 어레이를 이용한 혈청학적 검사
마우스 혈청을 1% BSA/PBST 완충액(PBST 완충액: PBS 및 0.05 % Tween-20, pH 7.4)으로 희석시켰다. 상기 글리칸 마이크로어레이는 수퍼블럭 블로킹 버퍼(Superblock blocking buffer)(Pierce)로 4℃에서 1시간 동안 블로킹하고 사용하기 전에 PBST 완충액으로 3 번 세척하였다. 그런 다음, 혈청 희석액을 글리칸 마이크로어레이에 넣고 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 과량의 혈청 항체를 세척하고, Alexa Fluor 647- 콘주게이션된 염소 항-마우스 IgG 항체 또는 DyLight 649-콘주게이션된 염소 항-마우스 IgM 항체를 2차 항체로 4℃에서 암실에서 1 시간 동안 상기 마이크로어레이를 개별 배양하였다. 이어서, 상기 슬라이드를 PBST로 3 회 세척하고, 마이크로어레이 형광 칩 리더(GenePix 4300A; Molecular Devices Corporation)로 635 nm 파장에서 스캐닝하고, 스캐닝된 이미지를 GenePix Pro-6.0 분석 소프트웨어(Axon Instruments, Union City, CA, 미국)로 분석하였다.
실시예 6
단계-특이적 배아 항원-3(SSEA-3) 및 β3GalT5는 유방암 줄기 세포에 대한 암 특이적 및 중요한 마커이다
실시예: 세포 배양
유방암 세포주 MDA-MB-231, MCF-7 및 인간 유방암 관련 섬유아세포를 미국생물자원세터(ATCC; American Type Culture Collection)로부터 획득하였다. MDA-MB-231의 배양물을 10% 열-비활성화된 FBS 및 항생제-항진균제가 보충된 DMEM 중에 존재하였으며, MCF-7 배양물은 10%의 열-비활성화된 FBS, 비-필수 아미노산 및 항생제-항진균제가 보충된 RPMI 중에 존재하였다. CAF의 배양을 위하여, 이는 10%의 열-비활성화된 FBS, 비-필수 아미노산, 소듐 피루베이트, 글루타민, 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 DMEM/F12 중에 존재하였다. 이러한 것들을 5%의 CO2 및 습윤화된 대기 조절과 함께 37℃ 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 모든 세포 배양 배지 및 보충물은 Life Technologies로부터 구매한 것이다. 인간 ESC H9 및 유도된 다능성 줄기 세포 5(iPSC5)를 인간 ES 배지(녹아웃 혈청 보충물을 함유한 녹아웃 DMEM, GlutaMAX, 비-필수 아미노산, 2-머캅토에탄올, 페니실린/스트렙토마이슨 및 βFGFfmf 함유한 녹다운 DMEM) 중 미토마이신 C 처리된-마우스 배아 섬유아세포(MEF) 상에 유지시키고, 배양하고, 콜라게나아제 IV를 사용하여 주단위로 계대배양하였다.
실시예: 피부 섬유아세포로부터 iPCS의 유도체화
피부 생검으로부터 유래된 섬유아세포를 CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit(Life Technologies)를 이용하여 다능성 줄기 세포로 재프로그래밍하였다. 간단하게, 5×104 섬유아세포를 밤새 회수학하기 위해 계대배양 3에서 6-웰 디시에서 웰 당 시딩하였다. 다음 날에, 인간 전사 인자 OCT4, SOX2, Klf4, 및 c-Myc를 발현시키는 Sendai 바이러스를 섬유아세포 배지에서 혼합하여 제조업체 설명서에 따라 섬유아세포 세포를 감염시켰다. 2일 후에, 배지를 ALK5 억제제 SB431542(2 μM; Stemgent), MEK 억제제 PD0325901(0.5 μM; Stemgent), 및 티아조비빈(0.5 μM; Stemgent)이 보충된 인간 ES 배지로 교환하였다. 감염 후 7일 내지 10일에, 세포를 TrypLE(Life Technologies)를 이용하여 탈착시키고, 피드 세포 상에서 계대배양하였다. iPSC의 개개 콜로니를 감염 후 21일 및 28일에 피킹(pick)하고, 각 iPSC 라인을 단일 콜로니로부터 확장시켰다. 모든 iPSC 라인을 인간 ES 배지에서 마우스 배아 섬유아세포 상에서 배양하였다.
염색체 분석을 Cell Line Genetics Inc.에 의해 수행하였다. 기형종 분석에서, 각 iPSC 라인으로부터 1-2×107을 탈착시키고, TrypLE 처리 후에 수집하였다. 이러한 것들을 0.5 mL 인간 ES 배지 중에 현탁시켰다. 0.5 mL 마트리겔(BD Biosciences)과 혼합한 후에, 세포를 면역결핍 마우스(NOD.Cg-Prkdcscid I12rgtmlWjl/SzJ, stock no. 005557, The Jackson Laboratory)의 등측면(dorsal flank)에 피하로 주사하였다. 기형종을 수확하고, 4% 파라포름알데히드로 밤새 고정시키고, 파라핀 엠베딩을 위한 표준 절차에 따라 가공하였다. 샘플을 이후에 섹션화하고 H&E 염색하였다.
실시예: β3GalT5의 과발현 및 녹다운
인간 β3GalT5 과발현 안정한 세포주를 확립시키기 위해, 인간 β3GalT5를 엔코딩하는 전장 cDNA를 PCR 증폭시키고(정방향 프라이머-GCAGATCTATGGCTTTCCCGAAGATG; 역방향 프라이머-GTCTCGAGTCAGACA GGCGGACAAT), Bglll/Xhol cut pMSCVpuro 벡터(Clontech)에 서브클로닝하였다. 뮤린 줄기 세포 바이러스(MSCV)-대조군 및 MSCV-β3GalT5 수포성 구내염 바이러스 G 당단백질(VSV-G) 유사타입 레트로바이러스를 이후에, GP2-293 세포(Clontech)에서 발생시키고, MCF-7 및 MDA-MB-231 세포를 감염시키기 위해 사용하였다. 바이러스 감염 후 2일 째에, 대조군 및 β3GalT5 안정한 풀을 푸류마이신(2 ㎍/mL)과 함께 선택하였다. β3GalT5 녹다운 세포를 확립시키기 위해, 인간 β3ΓαλT5를 위한 렌티바이러스-shRNA 시스템은 National RNAi Core Facility Platform(Academia Sinica)로부터 구매된 것이고, β3GalT5-짧은 헤어핀 서열은 5'CCGGGCAAGTGGTTTGTCAGTAAATCTCGAGATTTACTGACAAACCACTTGCTTTTTG-3'이다. 간단하게, sh β3GalT5 및 shControl 렌티바이러스를 제조업체 설명서에 따라 MCF7 및 MDA-MB-231 세포와 함께 인큐베이션하였다. 감염된 세포를 감염후 48시간에 수확하거나 푸로마이신(2 ㎍/mL)으로 선택하고, 녹다운 효율을 정량 RT-PCR(qPCR)에 의해 결정하였다.
실시예: 세포 증식 검정
세포 증식을 제조업체 설명서(Roche)에 따라, 세포 침투성 테트라졸륨 염, WST-1 (4-[3-(4-요오도페닐)-2-(4-니트로페닐)-2H-5-테트라졸리오]-1,3-벤젠 디설포네이트)를 사용하여 분석하였다. 2×103 세포/웰을 96-웰 플레이트에서 배양하였다. 명시된 바와 같이 상이한 시점에,WST-1 (20 ㎕, 200 ㎕에 대해 웰 당, 배양 배지)을 첨가하고, 37℃ 인큐베이터에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 450 nm 및 690 nm(기준으로서)에서의 흡광도의 신호발생 검색은 SpectraMax M5 마이크로플레이트 스펙트럼 리더(Molecular Devices)에 의해 판독된다.
실시예: 아폽토시스 검정
세포를 β3GalT5 shRNA 렌티바이러스(MOI: 5), Z-DEVD-FMK(카스파아제-3 억제제)(50 μM 및 100 μM; R&D Systems), Z-IETD-FMK(카스파아제-8 억제제), Z-LEHD-FMK(카스파아제-9 억제제), 또는 Z-ATAD-FMK(카스파아제-12 억제제)(100 μM; R&D Systems)으로 또는 이의 없이, 이미 기술된 바와 같이 105 cell/mL로 처리하였다. 3일 후에, 세포를 PBS로 세척하고, 얼음 상에서 15분 동안 결합 완충제(0.01 M HEPES, 0.14 M NaCl, 2.5 mM CaC12) 중에서 알로피코시아니(APC)-콘주게이팅된 아넥신 V(1:40 희석; BD Biosciences)로 인큐베이션하고 유세포측정 분석을 수행하였다.
실시예: 웨스턴 블롯 분석
MCF-7 및 MDA-MB-231 세포의 단백질 용리물을 프로테아제 억제제(Roche)가 공급된 용리 완충제(150 mM NaCl2, 100 mM 포스페이트 완충제, pH 7.4, 1% NP40, 10% 글리세롤)를 사용하여 제조하였다. 세포 용리물로부터의 단백질을 4 내지 12% 구배 SDS/PAGE에 적용되기 전에 95℃에서 5분 동안 샘플 완충제에서 변성시키고, 수송 디바이스(Bio-Rad)를 이용하여 메탄올-세정된 PVDF 막 상으로 옮겼다. 막을 프로카스파아제-3 또는 분열된/활성 형태의 카스파아제-3(1:1,000 희석; Abeam) 중 어느 하나를 인식하는 항-카스파아제-3 항체로 프로빙하기 전에 30분 동안 5% 무지방 우유-공급 TBST로 블로킹한 후에, 90분 동안 HRP-콘주게이팅된 항-래빗 항체(1:5,000 희석; Jackson ImmunoResearch)와 함께 인큐베이션하였다. 신호를 ECL Substrate Kit (Millipore)를 이용하여 발달시키고, Fujifilm LAS-4000 이미징 시스템에 의해 검출하였다.
실시예: qPCR.
세포주로부터의 전체 mRNA를 GeneJET RNA Purification Kit(Thermo Scientific)를 이용하여 추출하고, 이를 고용량 cDNA 역전사 키트(Life Technologies)에 의해 cDNA로 역전사하였다. qPCR 반응을 제조업체 프로토콜에 의해 최적화된 2X SYBR 그린 마스터 믹스(Thermo Scientific)와 함께 2 ㎕의 시험 샘플 또는 대조 샘플의 cDNA를 함유한 총 20 ㎕ 부피로 제조하였다. cDNA를 Applied Biosy stems 7300 Real-Time PCR 시스템(Life Technologies)에 의해 B3GalT5 (정방향 프라이머: 5'AGCGGA AACGAA AGAGGTGGAC 3'; 역방향 프라이머: 5' CCTGAGGACAAA AGCGATGGAC 3')의 발현으로 시험하였다. 상대 유전자 발현을 7300 소프트웨어를 이용하여 Ct 값에 따란 내부 GAPDH 유전자 발현에 대한 B3GalT5의 비율로서 일반화하였다.
실시예: 글리코스핑고지질의 추출
세포를 수확하고, PBS로 세척하고, 수 중에서 균질화하였다. 메탄올 및 클로로포름을 균질물에 8:4:3(vol/vol/vol)의 비율로 첨가하고, 샘플을 베스 소니케이터에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 15분 동안 3,000×g으로 원심분리한 후에, 펠렛을 4:8:3(vol/vol/vol) 클로로포름/메탄올/물로 반복적으로 추출하고, 합쳐진 상청액을 질소의 스트림 하에서 건조시켰다.
실시예: 글리코스핑고지질(GSL)로부터 글리칸의 방출(26)
세포를 수집하고 일반화를 위한 총 단백질의 양에 대해 정량화하고, 1-3 × 106 세포를 균질화하였다. GSL로부터의 자유 글리칸의 방출을 위한 통상적인 절차에서, GSL을 청색이 발생할 때까지(10분), 유리 튜브에서 클로로포름/메탄올(2:1; 1.0 mg/mL) 중 오존으로 처리하였다. 얻어진 용액을 SpeedVac에서 건조시키고, GSL로부터의 글리칸의 방출을 위해 염기에 의해 처리하고, 간단하게, 소듐 히드록사이드 수용액(20-50 mM)을 첨거하고, 혼합물을 실온에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 얻어진 수용액을 NAIM 태그로의 표지화를 위해 동결건조시켰다.
실시예: NAIM 태그로의 글리칸의 표지화 및 LC-MS 분석
GSL로부터의 방출 후에, 글리칸 혼합물을 동결건조시키고, 하기 문헌 절차에 의해 표지하였다(27, 28). 간단하게, 글리칸 혼합물에 실온에서 AcOH(1.0 mL) 중 2,3-나프탈렌디아민(NAIM, 1.0 mg) 및 요오드(1.0 mg)를 첨가하고, 4시간 동안 교반하였다. 반응의 종료를 TLC 분석에 의해 체크하였다. 이후에, 반응 혼합물을 EtOAc(10.0 mL×2)로 분쇄하여 침전물(Globo-H-NAIM, SSEA-4-NAIM 및 SSEA-3-NAIM)을 수득하고, 이를 나일론 막 필터를 이용한 여과에 의해 수집하였다. NAIM-표지된 글리칸은 MS에서 향상된 이온화 능력을 나타내는 것으로서(29), 이를 고해상도 및 고질량 정확성 나노흐름 LC-MS/MS에 의해 분석하였다. 샘플을 예비컬럼(150 ㎛ ID. × 30 mm, 5 ㎛, 200Å)에 10 mL/min으로 주입하고, 이후에, 나노전기분무 이온 소스(New Objective)가 장착된 LTQ FT Ultra 질량 분광계(Thermo Fisher Scientific)에서 분석을 위해 역상 C18 나노-컬럼(75 ㎛ ID. × 200 mm, 2.5 ㎛, 100Å)에서 분리하였다. 분리를 이동상 A로서 수중 0.1% 포름산을 그리고 이동상 B로서 80% 아세토니트릴 중 0.1% 포름산을 사용하여 300 nL/min으로 수행하였다. Survey full scan MS 스펙트럼(m/z 320 내지 2,000)을 m/z 400에서 100,000의 질량 분해능을 갖는 FT에서 획득하였다.
실시예 9
단계-특이적 배아 항원-3(SSEA-3) 및 β3GalT5가 유방암 줄기 세포에 대한 암 특이적 및 중요한 마커임을 입증함
세포의 종양 발생 능력을 입증하기 위해, 암 세포를 세포 분류화(도 S1, 분류 1)를 위해, 유방암 세포주 MCF-7 및 MDA-MB-231 각각에서, 당지질 분자 SSEA-3, SSEA-4 및 Globo-H 및 공지된 마커 세트 CD44/CD24 및 ESA/PROCR에 대한 상응하는 항체로 염색하였다. 단리된 세포 집단을 다음으로 시험관내(24) 및 생체내(8) 검정 둘 모두에 의해 분석하였다(도 1). MCF-7에서, CD44+CD24-/ loSSEA-3+를 발현시키는 암 세포는 CD44+CD24-/ loSSEA-3- 또는 CD44+CD24-/lo 보다 더욱 높은 백분율의 맘모스피어(mammosphere)를 형성하였다(도 1a, 왼쪽 패널). 유사하게, MDA-MB-231에서, ESAhiPROCRhiSSEA-3+ 서브집단은 연질 아가 검정에서 ESAhiPROCRhiSSEA-3- 또는 ESAhiPROCRhi 세포에 비해 보다 높은 백분율의 세포 콜로니를 형성하였다. 그러나, 당지질 에피토프 SSEA-4 또는 Globo-H와 함께 공지된 마커 세트에 의해 단리된 세포를 사용한 세포 콜로니 및 맘모스피어의 형성에 있어서 유의미한 차이가 존재하지 않았다(도 S2). 공지된 BCSC 마커 및 SSEA-3을 수반하는 세포에서 종양 형성을 나타내기 위하여, 상이한 서브집단을 종양-성장을 위해 NOD-SCID 마이스의 유선에 접종하였다. 그 결과는, CD44+CD24-/loSSEA-3+ 및 ESAhiPROCRhiSSEA-3- 둘 모두가 다른 상응하는 서브집단과 비교하여, 낮은 세포 수와 함께 생체 내에서 종양을 효과적으로 발생하였음을 나타낸다(도 1b, d). 특히, CD44+CD24-/loSSEA-3+를 발현시키는 세포에 대하여, 10개 정도의 세포는 마우스에서 종양을 형성할 수 있었다(도 1b). 종양-성장의 측면에서, CD44+CD24-/loSSEA-3+ 세포의 종양 부피는 CD44+CD24-/loSSEA-3-의 종양 부피 보다 2배 컸다(도 1e, 왼쪽 패널). 또한, ESAhiPROCRhiSSEA-3+ 세포는 보다 일찍 종양을 발달시켰고 ESAhiPROCRhiSSEA-3- 세포 보다 큰 평균 부피의 종양을 형성하였다. 이러한 결과는 SSEA-3이 상이한 유방암 세포 모델에서 BCSC의 농화를 위한 특이적 마커임을 지시한다. 이러한 글리칸 분자들 중에서, SSEA-3 및 공지된 BCSC 마커를 수반하는 세포는 다른 서브집단 보다 더욱 높은 종양 형성을 갖는다.
본 발명자들은 다음으로 고도로 발현된 SSEA-3 및 SSEA-3이 없는 것을 갖는 암 세포의 줄기-유사 성질들을 비교하였다(도 S1, 분류 2). SSEA-3+MCF-7 세포에서, 전체 집단 내에서 고수준의 SSEA-3을 발현시키는 세포들 중 상위 1%는 벌크 집단 및 SSEA-3 및 CD44+CD24-/lo이 없는 것 보다 더욱 높은 백분율의 맘모스피어를 형성하였다(도 1a, 오른쪽 패널). 또한, 벌크 집단 내에서 고장 높은 SSEA-3 발현을 갖는 MDA-MB 231 세포들 중 상위 1%는 또한, 벌크 집단 및 다른 서브집단 보다 더욱 많은 세포 콜로니를 형성하였다(도 1c, 오른쪽 패널). 동물 연구에서, 이러한 연구는, 상위 1% SSEA-3 발현을 갖는 세포가 SSEA-3- 세포 보다 더 높은 종양을 형성할 가능성을 가지고(도 1b 및 d), SSEA-3+ 세포의 평균 종양 부피가 SSEA-3- 세포의 평균 종양 부피 보다 더욱 크다는 것을 나타내었다(도 1e, f, 오른쪽 패널). 이에 따라, 고수준의 SSEA-3을 발현시키는 암 세포는 세포 표면 상에서 SSEA-3이 없는 것 보다 더욱 높은 종양 형성을 갖는데, 이는 SSEA-3이 또한 유방암에 대한 독립적 CSC임을 지시한다.
SSEA-3의 기능을 이해하기 위하여, SSEA-3 생합성(도 S3)의 원인이 되는 β3GalT5의 유전자를 추가 연구를 위해 과발현시키거나 녹다운시켰다. β3GalT5의 과발현은 MCF-7 및 MDA-MB-231 세포 둘 모두에서 표면 SSEA-3의 발현 수준을 증가시켰다(도 2). 특히, MCF-7 세포에서, CD44+CD24-/lo 세포 집단의 백분율은 대조군과 비교하여 5배 증가를 나타내었다(도 2a). MDA-MB-231 세포에서, β3GalT5가 과발현되었을 때, ESAhiPROCRhi의 백분율의 변화가 존재하지 않았다(도 2b). 대조 세포와 비교하여, β3GalT5 녹다운을 갖는 MCF-7 세포에서, 표면 CD44의 발현 수준을 감소시켰으며, 이에 따라, CD44-CD24+ 세포 집단은 10배 증가하였다(도 2a). β3GalT5 녹다운을 갖는 MDA-MB-231 세포에서, 표면 PROCR의 수준은 감소하였으며, ESAhiPROCRhi BCSC 서브집단은 감소하였다(도 2b). 이러한 발견은, SSEA-3이 BCSC와 관련된 중요한 글리칸 분자임을 나타낸다.
유방암 및 정상 세포에서 SSEA-3의 역할을 입증하기 위하여, 세포 표현형을 β3GalT5 녹다운 세포에서 시험하였다. MDA-MB-231 및 MCF-7 세포 둘 모두에서, β3GalT5의 녹다운은 특히, >60%의 세포가 4일에 아폽토시스를 겪는 MDA-MB-231 세포에서(도 3b 및 c), 세포 아폽토시스의 출현과 함께 세포 성장을 억제하였다(도 4a 및 b). 대조적으로, 정상 유방 세포, MCF-10A 및 인간 텔로머라아제 역전사효소(hTERT)-고정된 인간 유선 상피 세포, hTERT-HME1에서, β3GalT5의 녹다운과 함께 동일한 성장률이 관찰되었으며, 아폽토시스가 전혀 관찰되지 않았다(도 3b, 3c, 4c 및 4d). 그러나, SSEA-3으로부터의 Globo-H의 합성을 위한 FUT1 및 FUT2, 또는 SSEA-3으로부터의 SSEA-4의 합성을 위한 ST3Gal2의 녹다운은 MDA-MB-231 세포에서 세포 아폽토시스를 유도하지 못하였다(도 3a, d).
□베타3GalT5에 의해 유도된 아폽토시스가 카스파아제-3의 활성화와 관련되어 있는지를 추가로 조사하기 위하여, 녹다운은 아폽토시스의 다운스트림 실행을 위한 대부분의 이펙터 카스파아제, 즉 카스파아제-3의 활성화와 관련되어 있다. 결과는 카스파아제-3이 □베타3GalT5의 녹다운과 함께 MDA-MB-231 세포에서 활성화됨을 나타내었다(도 4e). 카스파아제 3에 대한 억제제, 즉, Z-DEVD가 첨가되었을 때, □베타3GalT5 녹다운에 의해 유도된 아폽토시스의 백분율이 감소되었다(도 4f). □베타3GalT5 녹다운에 의해 유도된 아폽토시스에서 카스파아제-3의 관여는 또한, MCF-7, 카스파아제-3-결핍 세포주에서 확인되었다. MCF-7의 성장률이 □베타3GalT5의 녹다운에 의해 현저하게 감소되었지만, SSEA-3의 발현이 억제되었을 때, 단지 낮은 수준의 아폽토시스는 나타났다(도 3b 및 c). 업스트림 카스파아제(카스파아제-8, -9, 및 -12)의 추가 조사는 이후에, 특정 억제제로의 시험에 의해 연구되었으며, 그 결과는 카스파아제-8이 또한, □베타3GalT5 녹다운을 갖는 MDA-MB-231 세포에서 세포 아폽토시스의 백분율을 감소시킴을 예시하였다(도 3g). 이러한 결과는 SSEA-3, □베타3GalT5의 즉시 효소 산물이 암의 성장 및 생존을 위한 중요한 당지질임을 시사하는 것이다.
SSEA-3 또는 임의의 3가지 글로보-계열 글리칸이 암 세포에서만 발견되었음을 확인하기 위하여, 배아 줄기 세포(ESC)로부터의 당지질, 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC, 도 S4), MCF-7 및 MDA-MB-231 세포, 및 MCF-10A 및 hTERT-FDVIEl을 포함하는 정상 세포주를 방출시키고, 태그화하고, LC-MS 분석에 의해 시험하였다(도 5a). 데이타는 유세포측정 분석의 결과와 비교하였으며, 여기서, 세포 분류를 위해 사용되는 동일한 항체가 SSEA-3, SSEA-4, 및 Globo-H의 발현 수준을 검출하기 위해 사용되었다(도 5). 정상 세포주가 아닌, ESC, iPSC 및 암 세포주가 SSEA-3, SSEA-4 및 Globo-H를 발현시킨다는 것이 발견되었다. 이러한 연구로부터의 결과는 또한, 정상 및 암 세포주에서 □베타3GalT5 유전자 발현의 qPCR에 의해 지지되었다(도 S5). 상이한 정상 및 암 세포주 상에서의 글리코-계열 글리칸의 추가 분석이 수행될 것이다.
유세포분석에 의해 검출된 MCF-7 세포에서 SSEA-3의 발현 수준은 LC-MS 분석에 의한 것 보다 비교적 더 높으며, LC-MS에 의해 검출된 MDA-MB-231에서의 SSEA-3의 수준은 유세포분석에 의한 것 보다 훨씬 더 크다. LC-MS와 유세포분석 데이타 간의 차이는 항체의 특이성 및 세포 표면 상의 글리칸의 분포로 인한 것일 수 있다(25). SSEA-4에 대한 그리고 어느 정도까지 Gb4(14)에 대한 항-SSEA-3 항체(MC-631)의 교차-반응으로 인해, SSEA-4의 높은 발현 수준이 존재할 때, 유세포분석에 의해 검출된 SSEA-3의 수준을 과대평가하는 것이 가능하다. 다른 한편으로, SSEA-3의 수준은 세포 표면 상의 다른 생체분자에 의해 야기된 방해로 인하여 과소평가될 수 있으며, 이에 따라, 세포 상의 SSEA-3은 항체 염색에서 도달될 수 없다(26, 27). 이에 따라, 본 발명자들은, β3GalT5 유전자 발현의 qPCR 검출에 의해 지지된 LC-MS 결과(도 S5)가 더욱 정확하게, 이러한 당지질의 발현을 반영하는 것으로 사료된다.
BCSC 단리 공정에서, MC-631 염색을 기초로 하여 분류할 때 SSEA-3을 지니는 것을 제외하고 높은 수준의 SSEA-4 발현을 갖는 일부 세포가 농화된다는 것이 가능하다. 본 발명자들이 SSEA-3 및 이의 합성 효소 β3GalT5 둘 모두가 BCSC 마커임을 입증하였기 때문에, SSEA-3 음성 세포는 낮은 종양 형성이다. 세포 집단은 충분히 정제되지 않으며, 이에 따라, 항-SSEA-3 염색을 기초로 하여 분류된 세포의 종양 형성이 과소평가될 수 있다. 본 발명자들은 SSEA-3에 대해 고도로 특이적인 항체 또는 분자가 BCSC의 농화를 위해 발생될 수 있는 것으로 고려하였다. 다른 한편으로, 세포 표면 상에서의 SSEA-3이 유세포분석에 의해 특이적으로 검출되고 분류될 수 있는 경우에, 항체 염색 및 LC-MS 분석 둘 모두의 결과는 일관되어야 한다.
SSEA-3은 암 진행에서 중요한 역할을 하는 BCSC 마커이다. 실험으로부터, 본 발명자들은, 암 세포에서 β3GalT5의 발현을 조작하는 것이 SSEA-3, SSEA-4 및 Globo-H의 세포 표면 수준, 뿐만 아니라, 세포 생존 및 종양 형성을 조절함을 나타내었다. 흥미롭게도, 암 세포에서 β3GalT5의 녹다운은 상이한 메카니즘을 통해 세포 증식의 아폽토시스 및 억제 둘 모두를 촉발할 수 있는데, 왜냐하면, MCF-7, 카스파아제-3 null 세포주가 □베타3GalT5의 녹다운 후에 제한된 수준의 아폽토시스 및 세포 성장의 충분한 억제를 나타내기 때문이다. 대조적으로, SSEA-3 발현이 결여된 정상 유선 상피 세포에서, □베타3GalT5의 녹다운은 이러한 표현형에 영향을 미치지 않는다.
요약하면, 본 보고서는 SSEA-3이 BCSC의 농화를 위해 용이한 신규한 글리칸 마커이며, SSEA-3 및 □베타3GalT5 둘 모두가 유방암 치료제의 개발을 위한 잠재적인 신규한 타겟임을 입증하였다. 대부분의 암 줄기 세포 및 암 세포 상에서의 이의 특이적 발현 이외에, 글로보-계열 당지질 SSEA-3, SSEA-4 및 Globo-H는 또한, ESC 및 iPSC의 표면 상에 고도로 발현되지만, 이러한 것들은 ESC의 분화 후에 사라진다. 재생 의학에서 사용하기 위한 iPSC의 분화 후에 글로보-계열 당지질의 운명(fate)을 이해하는 것은 흥미로울 것이다.
실시예 물질 및 방법
세포 배양
유방암 세포주 MDA-MB-231, MCF-7 및 인간 유방암 관련 섬유아세포(CAF)를 미국생물자원세터(ATCC; American Type Culture Collection)로부터 획득하였다. MDA-MB-231의 배양물을 10% 열-비활성화된 FBS 및 항생제-항진균제가 보충된 DMEM 중에 존재하였으며, MCF-7 배양물은 10%의 열-비활성화된 FBS, 비-필수 아미노산 및 항생제-항진균제가 보충된 RPMI 중에 존재하였다. CAF의 배양을 위하여, 이는 10%의 열-비활성화된 FBS, 비-필수 아미노산, 소듐 피루베이트, 글루타민, 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 DMEM/F12 중에 존재하였다. 이러한 것들을 5%의 CO2 및 습윤화된 대기 조절과 함께 37℃ 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 모든 세포 배양 배지 및 보충물은 Life Technologies로부터 구매한 것이다. 인간 ESC H9 및 유도된 다능성 줄기 세포 5(iPSC5)를 인간 ES 배지(녹아웃 혈청 보충물을 함유한 녹아웃 DMEM, GlutaMAX, 비-필수 아미노산, 2-머캅토에탄올, 페니실린/스트렙토마이슨 및 βFGFfmf 함유한 녹다운 DMEM) 중 미토마이신 C 처리된-마우스 배아 섬유아세포(MEF) 상에 유지시키고, 배양하고, 콜라게나아제 IV를 사용하여 주단위로 계대배양하였다.
실시예
피부 섬유아세포로부터 iPSC의 유도체화
피부 생검으로부터 유래된 섬유아세포를 CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit(Life Technologies)를 이용하여 다능성 줄기 세포로 재프로그램화하였다. 간단하게, 5×104 섬유아세포를 밤새 회수를 위한 계대배양 3에서 6-웰 디시에 웰 당 시딩하였다. 다음 날에, 인간 전사 인자 OCT4, SOX2, Klf4, 및 c-Myc를 발현시키는 센다이(Sendai) 바이러스를 섬유아세포 배지에 혼합하여 제조업체 설명서에 따라 섬유아세포 세포를 감염시켰다. 2일 후에, 배지를 ALK5 억제제 SB431542(2 μM; Stemgent), MEK 억제제 PD0325901(0.5 μM; Stemgent), 및 티아조비빈(0.5 μM; Stemgent)이 보충된 인간 ES 배지로 교체하였다. 감염 후 7 내지 10일째에, 세포를 TrypLE(Life Technologies)를 이용하여 탈착시키고, 피더 세포(feeder cell) 상에서 계대배양하였다. iPSC의 개개 콜로니를 감염 후 21일 내지 28일에 피킹하고, 각 iPSC 라인을 단일 콜로니로부터 확장시켰다. 모든 iPSC 라인을 인간 ES 배지 중에서 마우스 배아 섬유아세포 세포 상에서 배양하였다.
염색체 분석을 Cell Line Genetics Inc.에 의해 수행하였다. 기형종 분석에서, 각 iPSC 라인으로부터 1-2×107을 탈착시키고, TrypLE 처리 후에 수집하였다. 이러한 것들을 0.5 mL 인간 ES 배지 중에 현탁시켰다. 0.5 mL 마트리겔(BD Biosciences)과 혼합한 후에, 세포를 면역결핍 마우스(NOD.Cg-Prkdcscid I12rgtmlWjl/SzJ, stock no. 005557, The Jackson Laboratory)의 등측면(dorsal flank)에 피하로 주사하였다. 기형종을 수확하고, 4% 파라포름알데히드로 밤새 고정시키고, 파라핀 엠베딩을 위한 표준 절차에 따라 가공하였다. 샘플을 이후에 섹션화하고 H&E 염색하였다.
실시예
유세포분석 및 세포 분류화(Cell Sorting)
1% FBS가 보충된 PBS로 이루어진 완충제 중에서 항체로 염색시킴으로써 세포 표지화를 수행하였다. 아쿠타아제(Accutase)(eBioscience, San Diego, CA) 탈착된 세포를 어두운 곳에서 얼음 상에 30분 동안 항체와 함께 (공급업체에 의해 제시된 항체 적정을 이용하여) 인큐베이션하였다. 이러한 연구에서 사용된 항체는 어두운 곳에서 4℃에서 30분 동안 바이오티닐화된 항-SSEA-3(MC-631; eBioscience)과 함께, PE-콘주게이팅된 항-PROCR(RCR-252; BD Biosciences, San Jose, CA), APC-콘주게이팅된 항-ESA(1B7; eBioscience), PE-콘주게이팅된 항-CD24(SN3 A5-2H10, eBioscience), APC-콘주게이팅된 항-CD44(JJVI-7, eBioscience) along with biotinylated 항-SSEA-3 (MC-631; eBioscience)이다. 2회 세척한 후에, 세포를 어두운 곳에서 4℃에서 30분 동안 Alexa Fluor 488-콘주게이팅된 스트렙타비딘으로 염색하였다. 적절한 아이소타입 대조군을 각 세포 표지화 실험을 위해 사용하였다. 동일한 항체를 본 연구에서 모든 염색 및 분류화 실험에서 사용하였다. 살아있는 세포 분류화를 제조업체의 설명서에 따라 100 Dm 노즐을 갖는 BD FACSAriaU를 이용하여 수행하였다. MDA-MB-231 세포에 대하여, 분류된 세포를 DMEM/10%FBS/항생제/항진균제와 함께 인큐베이션하여 추가 분석 이전에 습윤화된 37℃ 인큐베이터에서 초-저 부착 표면 플레이트에서 밤새 회수하였다. MCF-7 세포에 대하여, 이러한 것들을 분류화 후 추가 실험을 위해 용이하게 처리하였다. 상이한 마커 집단에서 세포의 백분율을 소프트웨어 Flow Jo를 이용하여 평가하였다.
실시예
연질 아가 검정
세포를 0.5% SeaPlaque 아가로오스/DMEM/FBS의 기저 층 위의 DMEM/FBS를 갖는 0.35% SeaPlaque 아가로오스(Lonza, Switzland)의 층에 시딩함으로써 연질 아가 콜로니 형성 검정을 수행하였다. 배양물을 습윤화된 37℃ 인큐베이터에서 유지시켰다. 추가적인 배지를 2 내지 3일 마다 첨가하여 세포에 성장 보충물을 연속적으로 공급하였다. 시딩한 후 21일째에, 세포를 0.05% 결정 바이올렛을 함유한 순수한 에탄올로 고정시키고, 콜로니 형성 효율을 광학 현미경법으로 정량화하였다.
실시예
맘모스피어 형성
맘모스피어 형성 검정에서, 세포를 100 cell/ml의 밀도로 96-웰 저-부착 플레이트(96-well low-attachment plate) 상에서 B27(Life Technologies) 및 10 ng/ml EGF가 보충된 DMEM/F12 중에 인큐베이션하였다. 배양물을 습윤화된 37℃ 인큐베이터에서 유지시켰다. 14일 후에, 맘모스피어의 수를 광학 현미경으로 계수하였다.
실시예
마우스 종양 형성 검정
인간 유방암 세포주로부터 잠재적인 줄기 세포 마커를 발현시키는 분류된 세포들의 줄기 세포 성질들을 평가하기 위해 NOD-SCID(NS) 마우스를 사용하였다. 동물 관리 및 실험은 아카데미아 시니카의 실험 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Utilization Committee of Academia Sinica)(IACUC#130-09-575)에 의해 승인되었다. 4주령 NS 마우스에 지방 패드 중에 CAF(1:1) 및 마트리겔(BD bioscience)(1:1)과 혼합된 분류된 암 세포를 주사하였다. MCF-7에 대하여, 마우스에 실험일 전에 에스트로겐 펠렛(0.18 mg/펠렛, 90일 방출, Innovative Research of America)을 추가적으로 주사하였다. 종양 용적을 최초 검출 후 5일 마다 평가하였다. 종양 형성 효율을 세포 주사 후 50일에 결정하였다.
실시예
β3GalT5의 과발현 및 녹다운(Knockdown)
인간 β3GalT5 발현 안정한 라인을 확립시키기 위해, 인간 β3GalT5를 엔코딩하는 전장 cDNA를 PCR 증폭시키고(정방향 프라이머-GCAGATCTATGGCTTTCCCGAAGATG; 역방향 프라이머-GTCTCGAGTCAGACAGGCGGACAAT), Bglll/Xhol cut pMSCVpuro 벡터(Clontech)로 서브클로닝하였다. 뮤린 줄기 세포 바이러스(MSCV)-대조군 및 MSCV-β3GalT5 수포성 구내염 바이러스 G 당단백질(VSV-G) 유사타입 레트로바이러스를 이후에 GP2-293 세포(Clontech)에서 발생시키고, MCF-7 및 MDA-MB-231 세포를 감염시키기 위해 사용하였다. 바이러스 감염하고 2일 후에, 대조군 및 β3GalT5 안정한 풀(pool)을 퓨로마이신(2 ㎍/mL)으로 선택하였다. β3GalT5 녹다운 세포를 수립하기 위하여, 인간 β3GalT5를 위한 렌티바이러스-shRNA 시스템을 National RNAi Core Facility Platform(Academia Sinica)으로부터 구매하였으며, β3GalT5-짧은 헤어핀 서열은 5'CCGGGCAAGTGGTTTGTCAGTAAATCTCGAGATTTACTGACAAACCACTTGCTTTTTG-3'이다. 간단하게, sh β3GalT5 및 shControl 렌티바이러스를 제조업체 설명서에 따라 MCF7 및 MDA-MB-231 세포와 함께 인큐베이션하였다. 감염된 세포를 감염 후 48시간에 수확하거나, 퓨로마이신(2 ㎍/mL)으로 선택하고, 녹다운 효율을 정량적 RT-PCR(qPCR)에 의해 결정하였다.
다른 구현예들
본 명세서에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 이 명세서에 개시된 각각의 특징은 동일하거나 동등하거나 유사한 목적을 위한 대안적인 특징으로 대체 될 수 있다. 따라서, 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 개시된 각 특징은 동등하거나 유사한 특징의 일반적인 계열의 예일 뿐이다.
전술한 설명으로부터, 당업자는 설명된 실시예의 본질적인 특성을 쉽게 확인할 수 있으며, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고, 실시예의 다양한 변화 및 변경으로 다양한 용도 및 조건에 적응시킬 수있다. 따라서, 다른 실시예도 또한 청구범위 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Academia Sinica <120> CANCER MARKERS AND METHODS OF USE THEREOF <130> G2112-01606 <140> PCT/US2016/014771 <141> 2016-01-25 <150> 62/107,378 <151> 2015-01-24 <150> 62/266,514 <151> 2015-12-11 <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide <400> 1 gcagatctat ggctttcccg aagatg 26 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide <400> 2 gtctcgagtc agacaggcgg acaat 25 <210> 3 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide <400> 3 ccgggcaagt ggtttgtcag taaatctcga gatttactga caaaccactt gctttttg 58 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide <400> 4 agcggaaacg aaagaggtgg ac 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: synthetic polynucleotide <400> 5 cctgaggaca aaagcgatgg ac 22

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  9. 환자에서의 ESAhiPROCRhiSSEA-3+ 또는 CD44+CD24-/loSSEA-3+ 유방암 줄기 세포를 검출하는 방법으로서,
    환자로부터 단리된 샘플을 암 줄기 세포 마커 SSEA-3에 결합하는 항체 및 유방암 줄기 세포 상의 암 줄기 세포 마커 ESA/PROCR 및/또는 CD44/CD24에 결합하는 항체와 접촉시킴으로써 유방암 줄기 세포가 샘플에 존재하는지를 검출하는 단계; 및
    유방암 줄기 세포에 대한 SSEA-3에 결합하는 항체에 의한 특이적 결합 및 유방암 줄기 세포 상의 PROCR, ESA, CD44, 및/또는 CD24에 결합하는 항체의 의한 특이적 결합을 검출하여, ESAhiPROCRhiSSEA-3+ 또는 CD44+CD24-/loSSEA-3+ 유방암 줄기 세포를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  10. 유방암을 진단하고/거나 단계화하고/거나 예측하고/거나 치료에 대한 감수성(susceptibiliyt)을 모니터링하는 방법으로서, 환자로부터 단리된 샘플에서의 세포 상에서 암 줄기 세포 마커의 발현을 분석하는 단계를 포함하며, 암 줄기 세포 마커가 세포 상의 SSEA-3, CD24, CD44, PROCR 및 ESA로 이루어진 군으로부터 선택되고, ESAhiPROCRhiSSEA-3+ 또는 CD44+CD24-/loSSEA-3+를 발현시키는 세포의 존재가 상기 샘플에서 유방암 줄기 세포의 존재를 지시하는, 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 샘플이 암 줄기 세포 마커에 특이적으로 결합하는 결합제로 염색되는 방법.
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  14. 제9항 또는 제10항에 있어서, SSEA4 및 GloboH로 이루어진 군으로부터 선택되는 암 줄기 세포 마커의 동시-발현을 시험함을 추가로 포함하는 방법.
  15. 제9항 또는 제10항에 있어서, 염색 패턴(staining pattern)의 분석이 유방암 줄기 세포의 상대적 분포를 제공하며, 이러한 분포가 유방암의 종양 유발성(tumorgenicity)을 예측하는 것인 방법.
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  17. 유방암 줄기 세포에 대한 유효성(effectiveness)에 대해 후보 작용제를 스크리닝하는 방법으로서,
    a) 상기 후보 작용제를 ESAhiPROCRhiSSEA-3+ 또는 CD44+CD24-/loSSEA-3+를 발현시키는 유방암 줄기 세포와 접촉시키고,
    b) 상기 유방암 줄기 세포에 대한 상기 후보 작용제의 유효성을 결정하는 것을 포함하는 방법.
  18. 환자로부터 획득된 샘플이 β-1,3-갈락토오스전달효소 5(β3GalT5)를 비정상 수준으로 발현시키는 줄기 세포를 포함하는 지를 결정하고, SSEA-3, CD24, CD44, PROCR 및 ESA로 이루어진 군으로부터 선택된 암 줄기 세포 마커의 존재를 검정하는 것을 포함하는 유방암을 식별하는 방법으로서, ESAhiPROCRhiSSEA-3+ 또는 CD44+CD24-/loSSEA-3+를 발현시키고 β-1,3-갈락토오스전달효소 5(β3GalT5)를 과발현시키는 줄기 세포가 유방암이 존재함을 지시하는 것인 방법.
  19. 유방암 줄기 세포의 집단을 식별하는 방법으로서,
    a) 암 세포의 출발 집단을 제공하는 단계,
    b) 암 세포의 출발 집단의 암 줄기 세포 마커의 발현 수준을 결정하는 단계,
    c) ESAhiPROCRhiSSEA-3+ 또는 CD44+CD24-/loSSEA-3+를 발현시키는 세포의 집단을 선택하는 단계로서, 상기 선택된 세포의 집단이 유방암 줄기 세포인 단계, 및
    d) 단계 c)에서 선택된 상기 세포의 집단을 단리시키고/거나 농화(enrich)시키는 단계를 포함하는 방법.
  20. 제9항, 제10항 및 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 체액 샘플인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 체액 샘플이 혈액 샘플인 방법.
  22. 제9항, 제10항, 및 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 결정하는 단계 또는 분석하는 단계가 유세포 분석을 이용하여 수행되는 방법.
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