JP7329006B2 - 乳がん幹細胞の腫瘍原性を予測する方法 - Google Patents

乳がん幹細胞の腫瘍原性を予測する方法 Download PDF

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Description

関連出願
この出願は、２０１５年１月２４日に出願されたＵＳＳＮ６２／１０７３７８および２０１５年１２月１１日に出願されたＵＳＳＮ６２／２６６５１４への優先権の利益を主張する。これら各々の内容は、本明細書に援用される。
本開示は、グロボ系スフィンゴ糖脂質合成を調節するのに有用な方法および組成物、ならびにがん幹細胞を選択するのに有用なマーカーに関する。特に本開示は、生合成経路においてグロボ系スフィンゴ糖脂質ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧｌｏｂｏＨの合成を調節することができる、糖酵素（ｇｌｙｃｏｅｎｚｙｍｅ）阻害剤化合物および組成物ならびにそれらの使用方法を対象とする。特に糖酵素阻害剤は、グロボ系合成経路においてアルファ－４ＧａｌＴ、ベータ－４ＧａｌＮＡｃＴ－Ｉまたはベータ－３ＧａｌＴ－Ｖ酵素を標的化する。またさらに、本開示は、グロボ系スフィンゴ糖脂質合成を調節するのに有用な抗体および／または結合性断片の産生を誘発し得る、ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ関連エピトープ（天然および修飾）を標的化するワクチン、抗体、および／または免疫原性コンジュゲート組成物を対象とする。またさらに、本開示は、過剰増殖疾患および／または状態の処置または検出のために本明細書に記載の組成物を使用する方法を対象とする。またさらに、本開示は、診断および／または治療上の適用において、がん幹細胞を選択するのに有用なマーカーを対象とする。
糖鎖抗原Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ステージ特異的胚抗原（ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）－３（ＳＳＥＡ－３）、およびステージ特異的胚抗原－４（ＳＳＥＡ－４）は、構造または機能のいずれかが互いに密接に関係している。Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ－３およびＳＳＥＡ－４は、グロボ系スフィンゴ糖脂質であり１～３、ＳＳＥＡ－３は、Ｇｌｏｂｏ Ｈの非フコシル化五糖前駆体構造であり、ＳＳＥＡ－４は、ＳＳＥＡ－３の非還元末端のガラクトースにシアル酸α２－３連結を有する、シアリル化ＳＳＥＡ－３である。
ステージ特異的胚抗原－３（ＳＳＥＡ－３）は、４～８細胞期のマウス胚によって免疫化されたラットにおいて生成されたＩｇＭモノクローナル抗体の反応性によって最初に同定され、定義付けられた。このモノクローナル抗体は、着床後の原始内胚葉ではその発現がより制限された、卵母細胞から胚盤胞の初期段階までのすべての着床前マウス胚と反応した。ＳＳＥＡ－３抗原決定基は、糖脂質および糖タンパク質上に存在する糖質であることが決定付けられ、ヒト奇形癌細胞およびヒト赤血球上にも見出された４。２１０２Ｅｐヒト奇形癌細胞株から単離された構造のパネルでは、ＳＳＥＡ－３抗体は、Ｇａｌβ（１－３）ＧａｌＮＡｃβ（１－３）Ｇａｌα（１－４）Ｇａｌβ（１－４）Ｇｌｃβ（１）Ｃｅｒに対してアフィニティーが最も高かった５。この構造は、Ｇｂ５６、ガラクトシル－グロボシド、またはグロボペンタオシルセラミド（ｇｌｏｂｏｐｅｎｔａｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ）としても公知である１。
β１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼＶ（β３ＧａｌＴ－Ｖ）が、ガラクトースをグロボシドのＧａｌＮＡｃに移動させて、Ｇｂ５またはガラクトシル－グロボシドを形成すると、ＳＳＥＡ－３の合成が生じる。より最近の研究では、ＳＳＥＡ－３が、臍帯血中の幹細胞を同定するマーカーとして使用できるかどうかを決定する試みがなされた。ＳＳＥＡ－３は、造血系または間葉系の幹細胞には発現されず、したがって、多能性細胞の良好なマーカーではないと決定付けられた。Ｓｃｈｒｕｍｐらは、原発性肺がん患者由来
のリンパ節リンパ球を不死化し、ハイブリドーマを生成し、抗体分泌クローンのために選択した。次に、モノクローナル抗体を、ＳＳＥＡ－３抗原決定基を認識したこれらのクローンのうちの２つ、Ｊ３０９およびＤ５７９から生成した。この抗体は、肺がんおよび乳がん細胞株を含むいくつかの腫瘍細胞株、ならびに奇形癌細胞株上のＳＳＥＡ－３を認識した。免疫接着アッセイでは、ＭＣ６３１とも呼ばれるげっ歯類モノクローナルＳＳＥＡ－３抗体は、Ｊ３０９およびＤ５７９抗体と同じ細胞株に対して反応した８。ＳＳＥＡ－３は、精巣胚細胞性腫瘍９、ならびに乳がんおよびＢＣＳＣ（乳がん幹細胞）においても見出された。
Ｃｈａｎｇらは、がんの外側にあるＳＳＥＡ－３の発現位置および発達がほとんど不明であることから、組織マイクロアレイを使用して正常組織上のＳＳＥＡ－３の発現を調査した。Ｃｈａｎｇらのグループは、結腸、食道、小腸、腎臓、前立腺、直腸、皮膚、精巣、胸腺、および子宮頸部の正常な上皮上にＳＳＥＡ－３が発現されることを見出した。発現は、免疫系が制限されているか、または接近不能な部位であるとみなされている、上皮細胞の頂端側表面または細胞質だけにあった１。マウスにおいて、ＫＬＨとコンジュゲートしたＧｌｏｂｏ Ｈ一価ワクチンを使用した実験では、抗体の応答は、Ｇｌｏｂｏ Ｈ抗原だけに対して得られた。α－ＧａｌＣｅｒがアジュバントとして添加された場合、全体的な抗体産生量は増大し、マウスはＧｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ－３およびＳＳＥＡ－４抗原構造の両方に対してポリクローナル抗体を作製し、そのワクチン接種は、アジュバントなしには生成できなかった１。この結果は、ＳＳＥＡ－３、Ｇｌｏｂｏ ＨおよびＳＳＥＡ－４が、がんワクチンの有望な標的を作製することができ、同時に標的化され得ることを示した。
しかし、ほとんどの腫瘍関連糖鎖（ｃａｒｂｏｈｙｄａｒｔｅ）抗原は、免疫原性が低く、非天然グリコシド連結、クラスター化抗原、単分子多価ワクチンまたはヘテロ－グリカン多価ワクチンを使用する免疫アジュバントを伴う担体タンパク質の投与を用いるコンジュゲーションを含む、糖質ベースのワクチンの免疫応答を増大するための多くの手法が開発されてきた。これらの戦略を使用して、著しい免疫応答を誘発してグリカン構造を標的化し得る数種の糖質ベースのワクチンが、がん治療に対して設計され、臨床治験に入った。その中でも、アジュバントＱＳ－２１を用いるＴｈｅｒａｔｏｐｅおよびＧＭＫの臨床治験では、発症までの時間（ｔｉｍｅ ｔｏ ｄｉｓｅａｓｅ）と、全体的な生存率との間に統計的に有意な差異は得られなかった。おそらく、これらの２種のワクチンは、患者において堅固なＴ細胞依存性の免疫応答を誘発できなかった。ＴｈｅｒａｔｏｐｅおよびＧＭＫは、特異的に、患者においてより高レベルのＩｇＭを誘導したが、強力な免疫ＩｇＧ応答を誘導することができなかった。このことは、糖質ベースのワクチン開発において大きな問題である。
過去の研究では、糖鎖抗原構造の修飾（ＭＣＡＳ）によって、より高いレベルの免疫応答が有効に誘発され得ることが示された。例えば、Ｂ群髄膜炎菌の莢膜多糖類の修飾研究では、α－（２，８）－連結ポリシアル酸（ＰＳＡ）のＮ－アセチル基が、Ｎ－プロピオニル（ｐｒｏｐｉｎｏｙｌ）基で置き換えられ、このような修飾により、Ｎ－プロピオニルＰＳＡだけでなく天然Ｎ－アセチルＰＳＡを認識する高い抗体応答が誘発された２０。同様の手法を、ＳＴｎ２１およびＧＭ３２２抗原に適用すると、修飾形態および天然形態に対して高い抗体力価が得られた。この結果は、グリカン抗原上のＮ－フェニルアセチル、Ｎ－フルオロアセチルまたはＮ－ジフルオロアセチルの修飾によって、免疫原性が改善され得ることを示した。さらに、Ｓｃｈｕｌｔｚらのグループは、ｐ－ニトロフェニルアラニンを腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）に組み込むことにより、免疫寛容を破綻し、ＴＮＦ－αに対してより高い抗体応答を誘導し得ることを報告した２３。グリカンを抗原として使用していくらかの進展が達成されたが、ほとんどの場合、二糖（ＳＴｎ）、三糖（ＧＭ３）およびポリシアル酸（ＰＳＡ）のＮ修飾であり、いくつかはフッ素化ＭＵＣ１グ
リコペプチド抗原に基づくものである。
不均質ながん組織において自己再生および腫瘍成長の原因となるがん幹細胞（ＣＳＣ）の発見は、新しいがん治療および早期診断の開発への関心を促進してきた。しかし、現在ＣＳＣの単離に使用されているマーカーは、しばしば、この特別な細胞集団の研究のためにＣＳＣを富化するのに十分に選択的ではない。
本開示は、がん幹細胞を含むがんおよび関連疾患の処置のための、腫瘍関連糖鎖抗原（複数可）および／またはそれらの標的を制御する経路を特異的に標的化する薬剤の使用に基づく治療方法に関する。また、がん幹細胞のためのマーカーとして１つまたは複数の腫瘍関連糖鎖抗原を使用する診断方法および予後診断方法が提供される。
一態様では、１つまたは複数の腫瘍関連糖鎖抗原を発現するがん幹細胞を含むがんの処置に使用するための、前記１つまたは複数の腫瘍関連糖鎖抗原に特異的に結合する結合剤が提供される。また、前記１つまたは複数の腫瘍関連糖鎖抗原を発現するがん幹細胞を含むがんの処置に使用するための、それぞれの結合剤を含む医薬組成物が提供される。結合（ｂｉｎｄｉｇｎ）剤には、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４およびＧｌｏｂｏＨ抗原、それらの任意の組合せを標的化する薬剤、ならびに／または関係する経路標的を標的化する薬剤が含まれる。
第２の態様では、１つまたは複数の腫瘍関連糖鎖抗原にそれぞれが特異的に結合する１種または複数の結合剤を用いる処置に対して感受性であるがん幹細胞を含むがんを同定する方法であって、前記処置が、がん幹細胞に作用をもたらし、前記方法が、患者から得られたがん試料が、１種または複数の結合剤が特異的である１つまたは複数の腫瘍関連糖鎖抗原を発現するがん幹細胞を含むかどうかを決定するステップを含み、がん幹細胞上の前記腫瘍関連糖鎖抗原（複数可）の存在が、がんが前記腫瘍関連糖鎖抗原に特異的に結合する結合剤（複数可）を用いる処置に対して感受性であることを示し、前記処置が、がん幹細胞に作用をもたらす方法が提供される。一部の実施形態では、腫瘍関連糖鎖抗原は、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、およびＧｌｏｂｏＨ抗原からなる一覧から選択される。
第３の態様では、がん幹細胞の集団を同定する方法であって、
ａ）がん細胞の出発集団を提供するステップと、
ｂ）１つまたは複数の腫瘍関連糖鎖抗原の発現レベルを決定するステップと、
ｃ）ステップｂ）で決定された前記１つまたは複数の腫瘍関連糖鎖抗原の発現レベルが、対照細胞と比較して増大している細胞の集団を選択するステップと（前記選択された細胞の集団は、がん幹細胞である）、
ｄ）任意選択で、ステップｃ）で選択された前記細胞の集団を単離および／または富化するステップと
を含み、前記対照細胞が、前記１つまたは複数の腫瘍関連糖鎖抗原を発現しないか、または低レベルの前記１つまたは複数の腫瘍関連糖鎖抗原を発現する、同じ出発がん細胞集団由来の細胞である、方法が提供される。一部の実施形態では、腫瘍関連糖鎖抗原は、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、およびＧｌｏｂｏＨ抗原からなる一覧から選択される。一部の実施形態では、ｂ）の決定するステップは、１つまたは複数の追加の腫瘍関連抗原の発現レベルを決定することをさらに含み、また、ｃ）およびｄ）の選択するステップおよび単離するステップは、それぞれ、前記１つまたは複数の追加の腫瘍関連抗原の発現レベルを検討することを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の腫瘍関連抗原には、ＣＤ２４、ＣＤ４４、ＰＲＯＣＲ、ＥＳＡ、ＣＤ１７６、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７４、ＣＤ１７３およびＣＡ１９－９抗原が含まれるが、それらに限定されない。一部の実施形
態では、ｂ）の決定するステップおよび／またはｄ）の単離するステップは、ＦＡＣＳを使用して実施される。一部の実施形態では、前記１つまたは複数の腫瘍関連糖鎖抗原の発現レベルは、対照細胞と比較して高いか、または高く増大されている。一部の実施形態では、前記１つまたは複数の腫瘍関連糖鎖抗原の発現レベルは、対照細胞と比較して低いか、またはそれほど増大していない。
第４の態様では、がんを診断、病期分類および／もしくは予後診断し、かつ／または処置に対する感受性をモニターするための方法であって、患者から単離された試料中の細胞上の１つまたは複数の腫瘍関連糖鎖抗原の発現を分析するステップを含み、前記１つまたは複数の腫瘍関連糖鎖抗原を発現する細胞の存在が、前記試料中のがん幹細胞の存在を示す、方法が提供される。
別の態様では、１つまたは複数の腫瘍関連糖鎖抗原に特異的に結合する結合剤、および本発明による方法で使用するための指示を含む、本発明による方法で使用するためのキットが提供される。
別の態様では、本明細書に記載の１つまたは複数の腫瘍関連糖鎖抗原を発現する細胞を含むがんに対する有効性について、候補治療剤、例えば化学療法剤または別の抗がん薬物をスクリーニングする方法であって、
ａ．１つまたは複数の腫瘍関連糖鎖抗原を発現する細胞を含むがん試料を提供するステップと、
ｂ．前記治療剤を細胞と接触させるステップと、
ｃ．前記腫瘍関連糖鎖抗原に陽性であるがん細胞に対する前記治療剤の有効性を決定するステップと
を含む方法が提供される。
本開示は、グロボ系スフィンゴ糖脂質合成を調節することができる方法および組成物にも関する。特に本開示は、生合成経路においてグロボ系スフィンゴ糖脂質ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧｌｏｂｏＨの合成を調節することができる、糖酵素（ｇｌｙｃｏｅｎｚｙｍｅ）阻害剤化合物および組成物ならびにそれらの使用方法を対象とする。特に糖酵素阻害剤は、グロボ系合成経路においてアルファ－４ＧａｌＴ、ベータ－４ＧａｌＮＡｃＴ－Ｉまたはベータ－３ＧａｌＴ－Ｖ酵素を標的化する。またさらに、本開示は、グロボ系スフィンゴ糖脂質合成を調節するのに有用な抗体および／または結合性断片の産生を誘発し得る、ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／Ｇｌｏｂｏ Ｈ関連エピトープ（天然および修飾）を標的化するワクチン、抗体、および／または免疫原性コンジュゲート組成物を対象とする。またさらに、本開示は、過剰増殖疾患および／または状態の処置または検出のために本明細書に記載の組成物を使用する方法を対象とする。さらに、本開示は、診断および／または治療上の適用において、がん幹細胞（例えば、乳がん）を選択するのに有用ながん幹細胞マーカーを対象とする。
本開示はまた、ＳＳＥＡ３の生合成のためのガラクトシルトランスフェラーゼ（ベータ３ＧａｌＴ５）を阻害またはサイレンシングすると、がん幹細胞の成長が停止するという驚くべき発見に基づく。この知見は、ステージ特異的胚抗原ＳＳＥＡ－３が、治療薬およびワクチンの開発の標的として働くことができることを意味している。さらに、ＳＳＥＡ－３の生合成に関与する３種の酵素、アルファ４ＧａｌＴ、ベータ４ＧａｌＮＡｃＴ－Ｉ、およびベータ３ＧａｌＴ－Ｖは、阻害剤の開発の標的となり得る。
本開示はまた、本明細書に開示のある特定の基でステージ特異的胚抗原（ＳＳＥＡ３およびＳＳＥＡ４）を修飾すると、それぞれＳＳＥＡ３およびＳＳＥＡ４を特異的に認識する堅固なＩｇＧ抗体の応答が誘発されたという発見に基づく。このような非天然グリカン
部分を含む免疫原性（ｉｍｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ）組成物によって誘導された抗体は、腫瘍細胞に対する補体依存性細胞傷害を媒介することができる。
したがって、本発明は、がんを処置するためのＳＳＥＡ－３に対する抗体の設計を特徴とする。本発明はまた、修飾された糖鎖抗原（ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４）からなる新規な化合物、このような化合物を含むグリカンコンジュゲート、ならびにそれらの免疫原性組成物およびワクチンを特徴とする。
本開示は、増殖性疾患、特にグロボ系経路が同時に制御不全となる増殖性疾患を処置するための、グロボ系合成経路を調節する阻害剤化合物および任意選択で少なくとも１種の薬学的に許容される担体、このような組成物を含む医薬組成物、増殖性疾患を処置する医薬を調製するためのこのような組成物の使用、このような調製物を含む商業用パッケージまたは製品、ならびに温血動物、特にヒトを処置する方法を提供する。
本開示は、ＳＳＥＡ３の生合成のためのガラクトシルトランスフェラーゼ（β３ＧａｌＴ５）、アルファ－４ＧａｌＴおよびベータ－４ＧａｌＮＡｃＴ－Ｉを阻害またはサイレンシングすると、がん細胞およびがん幹細胞の成長が停止するという驚くべき発見に基づく。この知見は、ステージ特異的胚抗原ＳＳＥＡ－３および／またはＳＳＥＡ４および／またはＧｌｏｂｏ－Ｈが、治療薬およびワクチンの開発の標的として働くことができることを意味している。
本開示はまた、本明細書に開示のある特定の基でステージ特異的胚抗原（ＳＳＥＡ３およびＳＳＥＡ４）を修飾すると、それぞれＳＳＥＡ３およびＳＳＥＡ４を特異的に認識する堅固なＩｇＧ抗体の応答が誘発されたという発見に基づく。このような非天然グリカン部分を含む免疫原性（ｉｍｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ）組成物によって誘導された抗体は、腫瘍細胞に対する補体依存性細胞傷害を媒介することができる。
したがって、本発明は、がんを処置するためのＳＳＥＡ－３および／またはＳＳＥＡ４に対する抗体の設計を特徴とする。本発明はまた、修飾された糖鎖抗原（ＳＳＥＡ３およびＳＳＥＡ４）からなる新規な化合物、このような化合物を含むグリカンコンジュゲート、ならびにそれらの免疫原性組成物およびワクチンを特徴とする。
一態様では、本発明は、式（Ｉ）：
の化合物、またはその塩を提供し、式中、Ｘ１、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＬは、本明細書に記載の通りである。ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、がんを処置するための免疫原性組成物を作製するのに有用である。
別の態様では、本発明は、式（ＩＩ）：
の化合物、またはその塩を提供し、式中、Ｘ１、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲＮは、本明細書に記載の通りである。ある特定の実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は、がんを処置するための免疫原性組成物を作製するのに有用である。
別の態様では、本発明は、（ａ）担体および１つまたは複数のグリカンを含むグリカンコンジュゲート、ならびに任意選択で（ｂ）アジュバントを含む免疫原性組成物を提供し、ここで１つまたは複数のグリカンのそれぞれは、リンカーを介して担体とコンジュゲートし、式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）：
を有し、式中、Ｘ１、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、ＬおよびＲＮは、本明細書に記載の通りである。
ある特定の態様では、任意の比での３種のグリカン（ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４およびＧｌｏｂｏ－Ｈ）およびそれらの類似体のうちの任意の１つまたは複数の組合せを含有するワクチンの任意の構築物は、担体に連結し得ることが企図される。
式中、ｎは、１～１０の整数であってよく、
グリカンは、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶからなる群より選択することができ、
式中、ｎが２またはそれを超える場合、各グリカンは、アスパルチルペプチド上の別のグリカンと同じであるか、またはアスパルチルペプチド上の異なるグリカンであり得る。
一部の実施形態では、グリカンは、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、およびＧｌｏｂｏ－５からなる群より選択され得る。
一部の実施形態では、例示的な多価構築物は、
であり得、式中、各グリカン部分上のＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＬは、同じでも異なっていてもよい。
ある特定の実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、アジュバントを含む。本発明に適したアジュバントは、本明細書に記載の通りである。
ある特定の実施形態では、免疫原性組成物は、対象においてがん細胞に対する免疫応答を誘発することができる。ある特定の実施形態では、がん細胞は、脳がん細胞、肺がん細胞、乳がん細胞、口腔がん細胞、食道がん細胞、胃がん細胞、肝臓がん細胞、胆管がん細胞、膵臓がん細胞、結腸がん細胞、腎臓がん細胞、骨がん細胞、皮膚がん細胞、子宮頚がん細胞、卵巣がん細胞、および前立腺がん細胞からなる群より選択される。
ある特定の実施形態では、免疫応答は、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ－３およびＳＳＥＡ－４からなる群より選択される抗原の１つまたは複数に特異的に結合する抗体の生成を含
む。ある特定の実施形態では、がん細胞またはがん幹細胞の表面上に発現されたＧｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ－３およびＳＳＥＡ－４の１つまたは複数を中和する抗体が開発される。ある特定の実施形態では、抗体は、主にＩｇＧ抗体を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される免疫原性組成物は、主にＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃおよびＩｇＧ３を誘導する。
さらに本開示は、本明細書に記載の免疫原性組成物に対して惹起されたモノクローナル抗体および結合性断片を特徴とする。
一実施形態では、抗体は、ヒト抗体である。
一実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。
一実施形態では、抗体は、ＳＳＥＡ４、ＳＳＥＡ３、またはＧｌｏｂｏ－Ｈの１つまたは複数に対して特異的に標的化される。
一実施形態では、抗体は、ＳＳＥＡ３に対して特異的に標的化される。
一実施形態では、抗体は、ＳＳＥＡ４に対して特異的に標的化される。
一実施形態では、抗体は、アルファ－２，６－連結に２つのシアル酸末端をもつ二分岐グリカンを有する均質な抗体である。
一態様では、本開示は、ＳＳＥＡ４、ＳＳＥＡ３またはＧｌｏｂｏ－Ｈの１つまたは複数に対して特異的に標的化された有効量の抗体または抗原結合性断片、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
一実施形態では、医薬組成物は、ＳＳＥＡ４、ＳＳＥＡ３またはＧｌｏｂｏ－Ｈグリカンの１つまたは複数をそれぞれ独立に標的化する抗体および／またはその結合性断片の組合せを含む。
一実施形態では、医薬組成物は、がん、感染性疾患、および／または炎症性（ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）疾患の処置に有用である。
一実施形態では、医薬組成物は、アルファ－２，６－連結にシアル酸末端をもつ普遍的二分岐ｎ－グリカンを有する抗体またはその結合性断片を含む。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の免疫原性組成物および薬学的に許容される賦形剤を含むがんワクチンを提供する。
別の態様では、本発明は、対象のがんを処置し、かつ／またはがんの危険性を低減する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の本明細書に記載の免疫原性組成物またはがんワクチンを投与するステップを含む方法を提供する。
処置は、腫瘍サイズの低減、悪性細胞の消失、転移の防止、再発の防止、播種性がんの軽減もしくは殺滅、生存の延長、および／または腫瘍のがんへの進行までの時間の延長を結果としてもたらす。
一部の実施形態では、処置は、本明細書に記載の免疫原性組成物またはがんワクチンの前記投与の前、その最中、またはその後に、前記対象に追加の治療を投与するステップを
さらに含む。一部の実施形態では、追加の治療は、化学療法剤を用いる処置である。一部の実施形態では、追加の治療は、放射線治療である。
本開示の別の態様は、がんに対して哺乳動物をワクチン接種する方法であって、哺乳動物に、薬理学的に有効な量の本明細書に記載の免疫原性組成物またはがんワクチンを投与するステップを含む方法を特徴とする。
一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。一部の実施形態では、本明細書に記載の免疫原性組成物またはがんワクチンは、皮下投与される。
がんの例として、脳がん、肺がん、乳がん、口腔がん、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆管がん、膵臓がん、結腸がん、腎臓がん、子宮頚がん、卵巣がんおよび前立腺がんが挙げられるが、それらに限定されない。一部の実施形態では、がんは、脳がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、結腸がん、または膵臓がんである。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の本発明の化合物を合成する方法を提供する。
さらに別の態様では、本開示は、本明細書に記載の免疫原性組成物またはがんワクチンを作製する方法を特徴とする。
本発明のある特定の実施形態の詳細については、本明細書に示す。本発明の他の特徴、目的および利点は、詳細な説明、図面、実施例、および特許請求の範囲から明らかである。
図１は、従来のマーカーおよびＳＳＥＡ－３を保有する細胞の腫瘍形成性は他の亜集団よりも高かったことを示す図である。Ａ、Ｃ ＭＣＦ－７またはＭＤＡ－ＭＢ－２３１においてそれぞれ懸濁培養または軟寒天アッセイのために選択されたマーカーによって単離された亜集団の細胞コロニーまたは腫瘍様塊の形成の百分率。グラフは、１つの代表的実験からの三重試料である。Ｂ、Ｄ 乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１およびＭＣＦ－７から選択されたマーカー発現細胞亜集団を注射した、ＮＳの乳腺中に形成された腫瘍の数。対応する限界希釈アッセイをｉｎ ｖｉｖｏで行った。Ｅ、Ｆ ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（２５００細胞／注射）およびＭＣＦ－７（５００細胞／注射）の異なる亜集団に由来する腫瘍体積をモニターし、比較した（１群当たりの腫瘍数ｎ＝４）。＃総細胞集団に分類されたＳＳＥＡ－３＋細胞の百分率。データは、平均および標準偏差（Ｓ．Ｄ．）を表す。アスタリスクは統計学的有意性ｐ＜０．０５を示す。 同上 同上 同上 同上 同上
図２は、ＭＣＦ－７およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞培養物においてβ３ＧａｌＴ５をノックダウンまたは過剰発現させると、細胞表面上のＳＳＥＡ－３のレベルおよび幹細胞特性（ｓｔｅｍｎｅｓｓ ｐｒｏｐｅｒｔｙ）が低下または上昇することをＦＡＣＳ分析によって示す図である。親細胞におけるがん幹細胞マーカーおよびＳＳＥＡ－３の発現。過剰発現β３ＧａｌＴ５群においてゲートをかけた亜集団ＣＤ４４＋ＣＤ２４－／ｌｏおよびＥＳＡｈｉＰＲＯＣＲｈｉにおけるＳＳＥＡ－３のレベルも決定した。Ａ β３ＧａｌＴ５の過剰発現、ノックダウン、またはそれらの対応するベクター対照を伴うＭＣＦ－７におけるＣＤ２４、ＣＤ４４、およびＳＳＥＡ－３の発現。Ｂ ベータ－３ＧａｌＴ５の過剰発現、ノックダウン、またはそれらの対応するベクター対照を伴うＭＤＡ－ＭＢ－２３１におけるＥＳＡ、ＰＲＯＣＲ、およびＳＳＥＡ－３の発現。すべての実験は、三連のものからの代表的試料である。 図２は、ＭＣＦ－７およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞培養物においてβ３ＧａｌＴ５をノックダウンまたは過剰発現させると、細胞表面上のＳＳＥＡ－３のレベルおよび幹細胞特性（ｓｔｅｍｎｅｓｓ ｐｒｏｐｅｒｔｙ）が低下または上昇することをＦＡＣＳ分析によって示す図である。親細胞におけるがん幹細胞マーカーおよびＳＳＥＡ－３の発現。過剰発現β３ＧａｌＴ５群においてゲートをかけた亜集団ＣＤ４４＋ＣＤ２４－／ｌｏおよびＥＳＡｈｉＰＲＯＣＲｈｉにおけるＳＳＥＡ－３のレベルも決定した。Ａ β３ＧａｌＴ５の過剰発現、ノックダウン、またはそれらの対応するベクター対照を伴うＭＣＦ－７におけるＣＤ２４、ＣＤ４４、およびＳＳＥＡ－３の発現。Ｂ ベータ－３ＧａｌＴ５の過剰発現、ノックダウン、またはそれらの対応するベクター対照を伴うＭＤＡ－ＭＢ－２３１におけるＥＳＡ、ＰＲＯＣＲ、およびＳＳＥＡ－３の発現。すべての実験は、三連のものからの代表的試料である。
図３は、β３ＧａｌＴ５ノックダウン細胞株におけるアポトーシスの誘導を示す図である。Ａ それぞれの遺伝子をノックダウンした後の遺伝子発現（ＭＣＦ－７におけるβ３ＧａｌＴ５、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１におけるβ３ＧａｌＴ５、ＦＵＴ１、ＦＵＴ２、およびＳＴ３Ｇａｌ２）の相対的百分率。ベクター対照細胞における遺伝子発現の百分率を１００に正規化した。Ｂ 乳房正常細胞株（ｈＴＥＲＴ－ＨＭＥ１、ＭＣＦ－１０Ａ）および乳がん細胞株（ＭＣＦ－７、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）における、３回の実験からのアポトーシスの平均百分率。Ｃ 乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＣＦ－７ならびに乳房非がん株ｈＴＥＲＴ－ＨＭＥ１およびＭＣＦ－１０Ａにおけるアポトーシスの百分率のフローサイトメトリー分析を、ベータ３ＧａｌＴ５を４日間ノックダウンした後に検討した。アポトーシス性細胞を非染色細胞と比較し、ゲートにかけた。Ｄ 遺伝子ＦＵＴ１、ＦＵＴ２、ＳＴ３Ｇａｌ２、またはベータ３ＧａｌＴ５をノックダウンしたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞、およびベクター対照を含むＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞におけるアポトーシスの百分率。アポトーシス性細胞の平均は、３回の実験からである。アスタリスクは統計学的有意性ｐ＜０．０５を示す。ｎ．ｓ． 有意ではない。 同上 同上 同上
図４は、β３ＧａｌＴ５をノックダウンすると、がん細胞培養物において増殖速度が減少し、かつアポトーシスが増加するが、正常乳房細胞培養物に対する効果がないことを示す図である。Ａ～Ｄ がん細胞培養物ＭＣＦ－７およびＭＤＡ－２３１ならびに乳房正常細胞培養物ＭＣＦ－１０ＡおよびｈＴＥＲＴ－ＨＭＥ１における増殖速度。吸光度（Ａ４５０ｎｍ～Ａ６９０ｎｍ）を単位とする増殖速度は、代表的試料からの三連のものである。Ｅ ｓｈＲＮＡベータ３ＧａｌＴ５またはｓｈＲＮＡベクターに感染したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を溶解し、全細胞抽出物、細胞質、および核の画分を調製した。上部 抗カスパーゼ－３抗体のウエスタンブロット分析、中央部 開裂カスパーゼ－３抗体のウエスタンブロット分析、下部 β－アクチン（ローディング対照となる）のウエスタンブロット分析、Ｆ、Ｇ β３ＧａｌＴ５をノックダウンしたアポトーシス性ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の百分率。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞は、異なる濃度のカスパーゼ－３阻害剤Ｚ－ＤＥＶＤ、またはカスパーゼ－８、９、もしくは１２に対する阻害剤で処理した。ここで示されるデータは、三連の試料からの平均および標準偏差（Ｓ．Ｄ．）である。アスタリスクは統計学的有意性ｐ＜０．０５を示す。ｎ．ｓ． 有意ではない。 同上 同上 同上 同上 同上 同上
図５は、フローサイトメトリーおよび質量分析による、細胞株におけるグロボ系エピトープのアバンダンスの比較を示す図である。Ａ 蛍光標識およびＬＣ－ＭＳ分析のために、細胞上の糖脂質からのグリカンの抽出のスキームである。Ｂ～Ｇ 乳がん細胞株ＭＣＦ－７およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１、正常細胞株ｈＴＥＲＴ－ＨＭＥ１およびＭＣＦ－１０Ａ、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、ならびに誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）におけるグロボ系エピトープＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、およびｇｌｏｂｏ－Ｈの相対的アバンダンスを、ＦＡＣＳおよび質量分析によって検出した。フローサイトメトリーの図に関しては、抗グリカン抗体（赤色、青色、または緑色）およびそれらの対応する抗体のアイソタイプ対照（灰色）で染色された細胞のヒストグラムを示した。蛍光の幾何平均を括弧内に示した。ＭＳに関して、ｍ／ｚの保持時間（ＳＳＥＡ－３＝１００８．３６６７、ＳＳＥＡ－４＝１２９９．４６２１、およびｇｌｏｂｏ－Ｈ＝１１５４．４２４６）をグラフに示した。 同上 同上 同上 同上 同上 同上
図６（図Ｓ１）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏアッセイのために分類することによって得られる細胞株における亜集団を示す図である。Ａ ＭＣＦ－７におけるＣＤ４４＋ＣＤ２４ｈｉ、ＣＤ４４＋ＣＤ２４－／ｌｏ、ＣＤ４４＋ＣＤ２４－／ｌｏＳＳＥＡ－３＋、ＣＤ４４＋ＣＤ２４／ｌｏＳＳＥＡ－３－、種々の百分率のＳＳＥＡ－３＋（上位１、５、１０％）、およびＳＳＥＡ－３－、ならびにＢ ＭＤＡ－ＭＢ－２３１におけるＥＳＡｌｏＰＲＯＣＲｌｏ、ＥＳＡｈｉＰＲＯＣＲｈｉ、ＥＳＡｈｉＰＲＯＣＲｈｉＳＳＥＡ－３＋、ＥＳＡｈｉＰＲＯＣＲｈｉＳＳＥＡ－３－、種々の百分率のＳＳＥＡ－３＋（上位１、５、１０％）、およびＳＳＥＡ－３－を含む亜集団は、さらなる分析のための細胞染色（方法および材料のとおり）およびフローサイトメトリーによって富化された。
図７（図Ｓ２）は、ＢＣＳＣが、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、グロボ系エピトープＳＳＥＡ－４およびｇｌｏｂｏ－Ｈで富化されていなかったことを示す図である。Ａ～Ｄ 乳がん細胞株ＭＣＦ－７およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１に由来する、未分類細胞または選択されたマーカー（ＳＳＥＡ－４またはｇｌｏｂｏ－Ｈを加えた、公知のマーカーセットＣＤ２４／ＣＤ４４またはＥＳＡ／ＰＲＯＣＲ）を発現する細胞亜集団の細胞コロニー形成の百分率。グラフは、１つの代表的実験からの三重試料である。データは、平均および標準偏差（Ｓ．Ｄ．）を表す。アスタリスクは統計学的有意性ｐ＜０．０５を示す。ｎ．ｓ． 有意ではない。 図７（図Ｓ２）は、ＢＣＳＣが、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、グロボ系エピトープＳＳＥＡ－４およびｇｌｏｂｏ－Ｈで富化されていなかったことを示す図である。Ａ～Ｄ 乳がん細胞株ＭＣＦ－７およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１に由来する、未分類細胞または選択されたマーカー（ＳＳＥＡ－４またはｇｌｏｂｏ－Ｈを加えた、公知のマーカーセットＣＤ２４／ＣＤ４４またはＥＳＡ／ＰＲＯＣＲ）を発現する細胞亜集団の細胞コロニー形成の百分率。グラフは、１つの代表的実験からの三重試料である。データは、平均および標準偏差（Ｓ．Ｄ．）を表す。アスタリスクは統計学的有意性ｐ＜０．０５を示す。ｎ．ｓ． 有意ではない。 図７（図Ｓ２）は、ＢＣＳＣが、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、グロボ系エピトープＳＳＥＡ－４およびｇｌｏｂｏ－Ｈで富化されていなかったことを示す図である。Ａ～Ｄ 乳がん細胞株ＭＣＦ－７およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１に由来する、未分類細胞または選択されたマーカー（ＳＳＥＡ－４またはｇｌｏｂｏ－Ｈを加えた、公知のマーカーセットＣＤ２４／ＣＤ４４またはＥＳＡ／ＰＲＯＣＲ）を発現する細胞亜集団の細胞コロニー形成の百分率。グラフは、１つの代表的実験からの三重試料である。データは、平均および標準偏差（Ｓ．Ｄ．）を表す。アスタリスクは統計学的有意性ｐ＜０．０５を示す。ｎ．ｓ． 有意ではない。 図７（図Ｓ２）は、ＢＣＳＣが、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、グロボ系エピトープＳＳＥＡ－４およびｇｌｏｂｏ－Ｈで富化されていなかったことを示す図である。Ａ～Ｄ 乳がん細胞株ＭＣＦ－７およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１に由来する、未分類細胞または選択されたマーカー（ＳＳＥＡ－４またはｇｌｏｂｏ－Ｈを加えた、公知のマーカーセットＣＤ２４／ＣＤ４４またはＥＳＡ／ＰＲＯＣＲ）を発現する細胞亜集団の細胞コロニー形成の百分率。グラフは、１つの代表的実験からの三重試料である。データは、平均および標準偏差（Ｓ．Ｄ．）を表す。アスタリスクは統計学的有意性ｐ＜０．０５を示す。ｎ．ｓ． 有意ではない。
図８（図Ｓ３）は、ヒトにおけるグロボ系経路を示す図である。対応する糖転移酵素（ｇｌｙｃｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を含む、Ｇｂ４に由来するグロボ系エピトープＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、およびｇｌｏｂｏ－Ｈの生合成経路。
図９（図Ｓ４）は、ｉＰＳＣ５の特徴付けを示す図である。Ａ 幹細胞タンパク質ＴＲＡ１－６０およびＮａｎｏｇの免疫蛍光染色。核は、ＤＡＰＩで染色した。Ｂ 幹遺伝子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびｃ－ＭｙｃのｑＰＣＲ。Ｃ ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｉＰＳＣ５の、３つの胚葉系列への分化能。Ｄ 奇形腫における３つの胚葉系列に対するｉＰＳＣ５のＨ＆Ｅ染色。 図９（図Ｓ４）は、ｉＰＳＣ５の特徴付けを示す図である。Ａ 幹細胞タンパク質ＴＲＡ１－６０およびＮａｎｏｇの免疫蛍光染色。核は、ＤＡＰＩで染色した。Ｂ 幹遺伝子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびｃ－ＭｙｃのｑＰＣＲ。Ｃ ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｉＰＳＣ５の、３つの胚葉系列への分化能。Ｄ 奇形腫における３つの胚葉系列に対するｉＰＳＣ５のＨ＆Ｅ染色。 図９（図Ｓ４）は、ｉＰＳＣ５の特徴付けを示す図である。Ａ 幹細胞タンパク質ＴＲＡ１－６０およびＮａｎｏｇの免疫蛍光染色。核は、ＤＡＰＩで染色した。Ｂ 幹遺伝子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびｃ－ＭｙｃのｑＰＣＲ。Ｃ ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｉＰＳＣ５の、３つの胚葉系列への分化能。Ｄ 奇形腫における３つの胚葉系列に対するｉＰＳＣ５のＨ＆Ｅ染色。 図９（図Ｓ４）は、ｉＰＳＣ５の特徴付けを示す図である。Ａ 幹細胞タンパク質ＴＲＡ１－６０およびＮａｎｏｇの免疫蛍光染色。核は、ＤＡＰＩで染色した。Ｂ 幹遺伝子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびｃ－ＭｙｃのｑＰＣＲ。Ｃ ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｉＰＳＣ５の、３つの胚葉系列への分化能。Ｄ 奇形腫における３つの胚葉系列に対するｉＰＳＣ５のＨ＆Ｅ染色。
図１０（図Ｓ５）は、乳がん細胞培養物におけるベータ３ＧａｌＴ５のｍＲＮＡレベルは正常細胞培養物のものより高いことを示す図である。正常細胞培養物ＭＣＦ－１０ＡおよびｈＴＥＲＴ－ＨＭＥ１における、ならびに乳がん細胞培養物ＭＣＦ－７およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１におけるベータ３ＧａｌＴ５遺伝子のＧＡＰＤＨ－正規化ｑＰＣＲレベル。１つの代表的実験からの三連の試料を示す。データは、平均および標準偏差（Ｓ．Ｄ．）を表す。アスタリスクは統計学的有意性ｐ＜０．０５を示す。ｎ．ｓ． 有意ではない。
図１１はスフィンゴ糖脂質のグロボ系の生合成経路を示す図である。
図１２は、異なるエピトープ比のＳＳＥ４－ＤＴ、またはＳＳＥＡ４－Ｇｃ－ＤＴ免疫化から収集された誘導ＧＨ－ＩｇＧを示す図である。
本発明は、腫瘍関連糖鎖抗原が、適切ながん幹細胞マーカーであるという知見に基づく。
本開示は、腫瘍関連糖鎖抗原が、がん幹細胞上に発現されるという驚くべき発見に基づく。したがって、これらの腫瘍関連糖鎖抗原は、がん幹細胞の適切なマーカーとなり、さらに、がん幹細胞を攻撃する治療に適した治療標的を提供する。
正常幹細胞および腫瘍形成細胞はともに、広範な増殖潜在能力、および新しい（正常または異常）組織を生じる能力を有する。腫瘍形成細胞は、正常幹細胞が経るものと類似する器官形成の異常かつ乏しく制御されたプロセスを経るがん幹細胞（ＣＳＣ）またはがん始原細胞（ＣＩＣ－ＣＳＣおよびＣＩＣという用語は、本明細書では同義語として使用される）と考えることができる。腫瘍および正常組織はともに、細胞の不均質な組合せから構成され、異なる表現型の特徴および異なる増殖潜在能力を有する。
がん幹細胞は、新生物性クローンを始原させ、維持する、幹細胞に類似の特性を有する腫瘍細胞のうちのある特定の一部であると考えられる。これらの細胞は、自己再生能を有しており、さらに、腫瘍形成潜在能力はより低いが表現型的に多様ながん細胞をもたらす前駆細胞を生じる。幹細胞様の細胞のこの亜集団は、がん幹細胞ではない腫瘍細胞と比較して、腫瘍形成および転移性腫瘍の拡大において効率的である集団である。
がん幹細胞（ＣＳＣ）は、今や、白血病、神経膠芽腫、髄芽細胞腫、およびほぼすべてのタイプの上皮性腫瘍（癌腫）を含む多種多様ながんにおいて同定されている。がん幹細胞は、原発腫瘍内の別個の表面マーカーパターンの調査に基づいて特徴付けることができる。ＣＤ４４は、がん幹細胞の堅固なマーカーとして報告された。結腸直腸腫瘍由来の単一ＣＤ４４＋細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで塊を形成することができ、原発腫瘍の特性に似ている異種移植腫瘍を生成することができた。ＣＤ１３３も、がん幹細胞のマーカーである。
がん幹細胞の存在は、がん治療にとって大きな意味を有する。既存の治療は、腫瘍体積を縮小する能力によって同定されるので、主に腫瘍細胞のバルクの集団に対して開発されてきた。しかし、がん幹細胞は、化学療法に対してしばしば抵抗性があり、化学療法の不成功の原因となり得る。がん始原細胞（本明細書ではがん幹細胞とも呼ばれる）を（も）標的化する新規な治療剤を設計するために、好ましくは良性腫瘍および／または正常な非腫瘍細胞上には存在しないと同時に、がん幹細胞を特異的に対象とする、がん幹細胞の分子標的を探索することが望ましい。このような薬剤は、腫瘍、特に転移性腫瘍の、より持続的な応答および治癒をもたらすことが期待される。したがって、新しいがん幹細胞マーカーは、治療を改善するための新規な治療標的を提供することが望まれる。公知の幹細胞マーカーのほとんどは、タンパク質である。これらの多くは、正常幹細胞マーカーであることが見出されており、したがって非腫瘍幹細胞上にも発現される。このため、それらのタンパク質は治療標的としては適切でないか、または少なくともあまり適切ではない。現在のところ、正常幹細胞マーカーとがん幹細胞マーカーとの明確な区別はない。
「結合剤」は、腫瘍関連糖鎖抗原、ならびに／または糖質および非糖質特異的抗原の組
合せなどの標的物質に個々にまたは組合せ（例えば、パネル）で結合することができる、任意の化合物または化合物複合体であり得る。好ましくは、結合剤は、標的物質に特異的に結合することができる。適切な結合剤は、標的物質に結合する結合剤を同定し／得るために、結合剤ライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。それぞれの結合剤の例として、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、および／またはｇｌｏｂｏＨに対する抗体などの、糖質抗体（ｇｌｙｃｏａｎｔｉｂｏｄｙ）が挙げられる。結合剤は、標的物質、ここでは腫瘍関連糖鎖抗原を特異的に認識し、結合することができるならば、いかなる構造であってもよい。結合剤は、抗体、その抗原結合性断片もしくは誘導体、または例えばアンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）もしくはレクチンなどの結合機能を提供するタンパク質足場を有する結合剤からなる群より選択することができる。結合剤は、結合機能を提供するペプチドまたは融合タンパク質であってもよい。抗体と類似の結合機能を有する結合剤の概要は、Ｈｅｙら（Ｈｅｙら（２００５年）「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ， ｎｏｎ－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３巻（１０号）、５１４～５２２頁）に記載されている。抗体誘導体には、同じ結合機能を有するが、例えば変化したアミノ酸配列を有する抗体または抗体断片も含まれる。
本明細書で使用される場合、ＳＳＥＡ３マーカーを標的化する例示的な結合剤は、内容全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第１４／５９９，１７４号により報告されている。
本発明によれば、がんの「病期分類」は、好ましくは、がんの進行および程度の分類を指す。好ましいがん病期分類系は、悪性腫瘍のＴＮＭ分類であり、ここでＴは、腫瘍のサイズ、および腫瘍が近くの組織に侵入しているかどうかを表し、Ｎは、関与する所属リンパ節を表し、Ｍは、遠隔転移を表す。これらのパラメーターのそれぞれは、患者の状況に応じた特定の値を示しており、一般に数値が高いほど、より重症度が高い状況を示す（Ｔ（０～４）、Ｎ（０～３）、Ｍ（０／１））。さらに、より詳細な分類については、さらなるパラメーターを決定することができ、かつ／または接頭辞を使用することができる。さらに、ＴＮＭ分類は、病期０から病期ＩＶのがんを参照する、ＵＩＣＣによるがん病期分類系にまとめることができる。
本発明によれば、「試料」は、特に、それらに限定されるものではないが、組織試料、体液および／または細胞試料を指し、例えばパンチ生検を含む組織生検による、またはがん細胞を含有するもしくは含有すると疑われる、血液、気管支吸引液、痰、尿、糞便もしくは他の体液もしくは組織切片、スライド等による従来の方式によって得ることができる。本発明によれば、用語「試料」はまた、それぞれの試料の画分または構成成分を含む。
本明細書で使用される用語「細胞増殖」および「増殖する」は、特に細胞分裂による細胞の増幅を指す。用語「がん幹細胞」は、特にそれに限定されるものではないが、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて適切な条件下で未分化細胞の凝集体、いわゆる腫瘍塊を生成する能力がある細胞に関する。塊を形成する細胞は、自己再生することができ、同条件下で解離し、成長すると、再び塊を形成する。ｉｎ ｖｉｖｏでは、がん幹細胞は、転移を形成するそれらの潜在能力および例えばＣＤ４４などの幹細胞マーカーの発現によって特徴付けられる。がん幹細胞は、薬物耐性を付与するおそれもある。用語「がん幹細胞」および「がん始原細胞」は、本明細書では同義語として使用される。
用語「腫瘍関連糖鎖抗原」は、特に、がんおよび／または腫瘍細胞、特に悪性がんおよび／または悪性腫瘍細胞上に発現される糖鎖抗原を指す。
用語「腫瘍特異的な糖鎖抗原」は、特にがんおよび／または腫瘍細胞上に、主にまたはさらには排他的に発現され、したがって非がん性の、それぞれ非腫瘍性の細胞上には発現されず、または低い程度にしか発現されない糖鎖抗原を指す。好ましくは、用語「腫瘍特異的な糖鎖抗原」は、悪性がんおよび／または悪性腫瘍細胞上に、主にまたは好ましくは排他的に発現され、したがって同じ患者の非がん性の、それぞれ非腫瘍性の細胞上、良性がんおよび／もしくは良性腫瘍細胞上、ならびに／または健康な組織上には発現されず、または低い程度にしか発現されない糖鎖抗原を指す。優先的に、腫瘍特異的な糖鎖抗原は、ほとんどの正常細胞上には発現されず、さらにより好ましくは、わずかな正常細胞または細胞型上にしか発現されず、さらにより好ましくは、これらの正常細胞上の発現は、特別な局在性を有し、例えば厳密に頂端にあるか、または密着結合間にあり、したがって全身投与され、特にｉ．ｖ．投与された結合分子は、これらの正常細胞上の抗原には到達できず、またはほとんど到達できず、さらにより好ましくは、正常な上皮細胞上には発現されず、最も好ましくは、正常細胞上には発現されない。ある特定の実施形態では、腫瘍特異的な糖鎖抗原は、発現されると担体分子に付着することができる。このような担体分子は、特にタンパク質、ペプチドまたは糖質であってよい。
「ＣＤ４４」は、様々な分子量の接着分子（Ｈ－ＣＡＭ、Ｐｇｐ－１）である。ＣＤ４４は、細胞表面のヒアルロナン受容体であり、マトリックスメタロプロテアーゼと相互作用し、細胞遊走において非常に重要な役割を果たす。ＣＤ４４は、乳房、卵巣、膵臓、前立腺、結腸、胃、および他のがん型におけるがん幹細胞マーカーとして説明されている（Ｌｉら、２００７年およびＴａｋａｉｓｈｉら、２００９年参照）。ＣＤ４４は、正常な多能性幹細胞のマーカーでもある。
本発明者らは、ＣＤ２４、ＣＤ４４、ＳＳＥＡ３、ＰＲＯＣＲ、ＥＳＡなどのいくつかの腫瘍関連抗原が、がん幹細胞上に発現され、したがって新規ながん幹細胞マーカーとなることを示した。腫瘍関連糖鎖抗原をがん幹細胞マーカーとして同定することにより、前記腫瘍関連糖鎖抗原の１つまたは複数に特異的に結合する薬剤の、新規な治療上の適用が提供される。ここで、１つまたは複数のそれぞれの腫瘍関連糖鎖抗原に特異的に結合する薬剤は、前記腫瘍関連糖鎖抗原を発現するがん幹細胞を標的化するために、治療的に使用され得る。これにより、がん幹細胞を標的化し、好ましくは死滅させる治療的な処置の機会が提供される。それぞれの治療剤を使用して、例えば、標準的な化学療法に抵抗性を有するがん幹細胞を標的化し、したがって破壊することができる。その結果、本発明により、改善されたがん治療が提供される。一実施形態によれば、腫瘍関連糖鎖抗原は、乳がん幹細胞上に、主にまたはさらには排他的に発現される。別の実施形態によれば、腫瘍関連糖鎖抗原は、がん幹細胞、ならびにがん幹細胞ではないがん細胞上に発現される。このことには、腫瘍関連糖鎖抗原が両方の細胞集団上に発現される場合、腫瘍関連糖鎖抗原に特異的に結合する結合剤を用いる処置が両方の細胞集団を標的化できるという利点がある。
一実施形態によれば、１つまたは複数の腫瘍関連糖鎖抗原に特異的に結合する結合剤は、治療的に活性である。それぞれの実施形態の一例は、治療的に活性な抗体またはその抗原結合性断片または誘導体の、結合剤としての使用である。治療的に活性な抗体またはその抗原結合性断片または誘導体は、好ましくは、標的細胞、特に腫瘍関連糖鎖抗原を発現するがん幹細胞を好ましくは溶解させる、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および／または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導することができる。さらなる一実施形態によれば、腫瘍関連糖鎖抗原に特異的に結合する結合剤は、標的化分子として機能し、少なくとも１種の治療剤にカップリングされる。カップリングは、共有結合的または非共有結合的な手段によって達成され得る。腫瘍関連糖鎖抗原に特異的に結合する結合剤が標的化分子として機能する場合、その結合剤自体が治療的に活性であってよく、または治療的に活性でなくてもよい。結合剤は、治療的に活性でない場合、基本的に、実際の治療剤（例えば、放射性医薬品、化学療法剤または毒素）を所望の標的作用側（ｔａｒｇｅｔ ｓｉｄｅ
ｏｆ ａｃｔｉｏｎ）、すなわち腫瘍関連糖鎖抗原を発現するがん幹細胞にもたらす分子担体として機能する。腫瘍関連糖鎖抗原に特異的に結合する結合剤にカップリングした治療剤は、例えば化学療法剤または他の抗がん薬物であり得る。前記カップリングした治療剤は、好ましくは標的化されたがん幹細胞を破壊もしくは死滅させ、またはがん幹細胞の増殖を阻害する。このことは、カップリングした治療剤によって直接達成され、または標的化されたがん幹細胞および／もしくは処置を受ける対象の適切な生物学的機構を誘導することによって間接的に達成され得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の腫瘍関連糖鎖抗原は、ＣＤ２４、ＣＤ４４、ＰＲＯＣＲ、ＥＳＡ、ＣＤ１７６、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７４、ＣＤ１７３およびＣＡ１９－９からなる群より選択されるマーカーの任意の１つまたは複数とさらに組み合わせることができる。
本発明のさらなる態様によれば、腫瘍関連糖鎖抗原に特異的に結合する結合剤を用いる処置に対して感受性であるがん幹細胞を含むがんを同定する方法であって、前記処置が、がん幹細胞に作用をもたらし、前記方法が、患者から得られたがん試料が、結合剤が特異的である腫瘍関連糖鎖抗原を発現するがん幹細胞を含むかどうかを決定するステップを含み、がん幹細胞上の前記腫瘍関連糖鎖抗原の存在が、がんが前記腫瘍関連糖鎖抗原に特異的に結合する結合剤を用いる処置に対して感受性であることを示し、前記処置が、がん幹細胞にも作用をもたらす方法が提供される。
本発明によるこの方法により、がんのがん幹細胞が、腫瘍関連糖鎖抗原に特異的に結合する結合剤を用いる処置に対して感受性であるかどうかを試験することができる。この方法の結果は、有益な診断情報を医師に提供する。例えば、がんが前記腫瘍関連糖鎖抗原を発現しないがん幹細胞を含み得る場合、前記腫瘍関連糖鎖抗原に特異的に結合する結合剤を用いる処置は、がん幹細胞に影響を与えない場合があり、したがってがん幹細胞に対して役に立たない可能性がある。しかし前記方法によって、がん幹細胞が、結合剤が特異的な前記腫瘍関連糖鎖抗原を発現することが示される場合、前記結合剤を用いる処置が、がん幹細胞を標的化し、したがってがん幹細胞に影響を及ぼす可能性も高い。したがって、本発明による方法は、医師が、患者にとって最良の治療を選択し、ある特定の処置ががんのがん幹細胞に影響を及ぼすかどうかを推定するための有益な助けを提供する。
関係する診断態様によれば、がんを診断、病期分類および／もしくは予後診断し、かつ／または処置に対する感受性をモニターする方法であって、患者から単離された試料中の細胞上の腫瘍関連糖鎖抗原の発現を分析するステップを含み、腫瘍関連糖鎖抗原を発現する細胞の存在が、前記試料中のがん幹細胞の存在を示す方法が提供される。
本発明のさらなる態様によれば、がん幹細胞の集団を同定する方法であって、ａ）がん細胞の出発集団を提供するステップと、ｂ）１つまたは複数の腫瘍関連糖鎖抗原の発現レベルを決定するステップと、ｃ）ステップｂ）で決定された前記１つまたは複数の腫瘍関連糖鎖抗原の発現レベルが、対照細胞と比較して増大している細胞の集団を選択するステップと（前記選択された細胞の集団は、がん幹細胞である）、ｄ）任意選択で、ステップｃ）で選択された前記細胞の集団を単離および／または富化するステップとを含み、前記対照細胞が、前記１つまたは複数の腫瘍関連糖鎖抗原を発現しないか、または低レベルの前記１つまたは複数の腫瘍関連糖鎖抗原を発現する、同じ出発がん細胞集団由来の細胞である、方法が提供される。一部の実施形態では、腫瘍関連糖鎖抗原は、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、およびＧｌｏｂｏＨ抗原からなる一覧から選択される。一部の実施形態では、ｂ）の決定するステップは、１つまたは複数の追加の腫瘍関連抗原の発現レベルを決定することをさらに含み、また、ｃ）およびｄ）の選択するステップおよび単離するステップは、それぞれ、前記１つまたは複数の追加の腫瘍関連抗原の発現レベルを検討することを含
む。一部の実施形態では、１つまたは複数の腫瘍関連抗原には、ＣＤ２４、ＣＤ４４、ＰＲＯＣＲ、ＥＳＡ、ＣＤ１７６、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７４、ＣＤ１７３およびＣＡ１９－９抗原が含まれるが、それらに限定されない。一部の実施形態では、ｂ）の決定するステップおよび／またはｄ）の単離するステップは、ＦＡＣＳを使用して実施される。一部の実施形態では、前記１つまたは複数の腫瘍関連糖鎖抗原の発現レベルは、対照細胞と比較して高いか、または高く増大されている。一部の実施形態では、前記１つまたは複数の腫瘍関連糖鎖抗原の発現レベルは、対照細胞と比較して低いか、またはそれほど増大していない。
患者試料中のがん幹細胞の存在は、がんの病期を示し得る。さらに、がん幹細胞の検出を使用して、治療への応答をモニターし、予後診断の助けとすることができる。本発明による方法によって得られた情報は、疾患の加速に対する感受性の分析、疾患の能動的モニタリングによる分析を含む予後診断および診断において有用であり、その場合、がんが進行しているかどうか、例えば処置が必要であるかどうか、病状の状況、環境変化、例えば時間経過への応答、選択された治療剤、特に前述の結合剤を用いる処置、または他のモダリティが分析される。試料に含有されている細胞が、腫瘍関連糖鎖抗原を発現するかどうか、したがって試料ががん幹細胞を含むかどうかを分析することによって、細胞を、治療剤および処置に応答するそれらの能力に関して分類することもできる。さらに、得られた情報は、がんの転移挙動を決定し、かつ／または予測するのに有用である。
本発明による診断方法の一態様によれば、がん幹細胞上に発現された１つまたは複数の腫瘍関連糖鎖抗原に特異的に結合する本発明による結合剤は、ｉｎ ｖｉｖｏ診断、特にｉｎ ｖｉｖｏイメージングのために使用される。それぞれの方法は、診断目的にも有用である。例えば、がん幹細胞上に発現された腫瘍関連糖鎖抗原を発現するがん細胞が、患者において同定され、かつ／または位置し得るかどうかを決定することができる。この場合、がん幹細胞が存在する危険性がある。本明細書を通して説明される通り、がん幹細胞の性質を確認および／または決定するための第２の幹細胞マーカーがさらに検出されることが好ましい。さらに、例えば腫瘍サイズが縮小しているかどうか、または転移（ｍｅｔａｓｅｓ）が発症しているかどうかを決定することができるので、治療に対する応答をモニターすることができる。さらに、それぞれの方法は、患者にとって適切な投与量を同定するのに有利である。一実施形態によれば、結合剤は標識化され、例えば放射性核種を含む放射性医薬品となる。しかし結合剤は、例えばｉｎ ｖｉｖｏイメージングを可能にするＰＥＴトレーサーなどの他の薬剤／化合物にカップリングすることもできる。適切な化合物は、従来技術で公知であり、したがって、ここでさらなる説明は必要ない。結合剤、腫瘍関連糖鎖抗原、さらなるがん幹細胞マーカーおよびがん型に関する詳細は、本明細書を通して説明されており、ｉｎ ｖｉｖｏイメージングの実施形態にも適用される。それぞれの開示を参照のこと。
一実施形態によれば、がん細胞を含有するまたは含有すると疑われる試料は、腫瘍関連糖鎖抗原、好ましくは腫瘍特異的な糖鎖抗原に特異的に結合する少なくとも１つの薬剤、したがって糖質がん幹細胞マーカー、および任意選択でＣＤ４４などの少なくとも１つの第２のがん幹細胞マーカーに特異的に結合する少なくとも１つのさらなる薬剤と接触させられ、好ましくは染色される。これにより、試料中のがん幹細胞の存在が検出される。一実施形態によれば、腫瘍関連糖鎖抗原に対する結合剤の結合、好ましくは第２のがん幹細胞マーカーに対する結合剤の結合は、当技術分野で公知の、本明細書に記載されている適切な検出方法によって検出される。適切な検出方法は、例えばＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、蛍光顕微鏡法等である。
本発明の方法によって分析される試料は、様々な供給源から、特に生検試料から得ることができる。このような試料の細胞は、遠心分離、水ひ、密度勾配分離、アフェレーシス
、アフィニティー選択、パニング、ＦＡＣＳ、ハイパックを用いる遠心分離等によって、分析前に分離することができる。試料が得られたら、直接使用し、凍結し、もしくは短期間の間、適切な培養培地中で維持することができ、または適切な固定化溶液で固定化し、または組織学的（ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｇａｌ）もしくは免疫組織学的試験に適した媒体で固定化し、それに包埋することができる。様々な培地を用いて、細胞を維持することができる。試料は、生検などの任意の好都合な手順によって、または外科的標本から得ることができる。通常、試料は、少なくとも約１０２個の細胞、さらに通常は少なくとも約１０３個の細胞、好ましくは１０４個、１０５個またはそれを超える細胞を含む。一実施形態では、試料は、１０個の細胞を含む。一実施形態では、試料は、細胞１０～１００個の任意の数の細胞を含む。一実施形態では、試料は、細胞１０～１０００個の任意の数の細胞を含む。一実施形態では、試料は、細胞１～１０個の任意の数の細胞を含む。典型的に、試料は、ヒト患者から得られるが、動物モデル、例えばウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、げっ歯類、例えばマウス、ラット、ハムスター、霊長類等を使用することができる。
試料は、凍結し、包埋し、固定化し、組織マイクロアレイ等中に存在することができる。腫瘍関連糖鎖抗原に結合し、それらを検出し、特に染色するために使用される薬剤、および任意選択でさらなるがん幹細胞マーカーは、例えば抗体などのがん幹細胞マーカーに特異的に結合する、例えば結合剤であってよい。適切な例は、前述されている。これらの薬剤は、検出可能に標識化することができ、または染色手順で間接的に標識化することができる。一実施形態によれば、標識は、腫瘍関連糖鎖抗原陽性細胞を分離するために使用することもできる。適切な標識ならびに染色手順は、従来技術で公知であり、したがって、いくつかの例が本明細書に記載されているが、ここではさらなる説明は必要ない。分析のための標準手順は、例えば実施例に記載されている通り、試料の組織学的固定化（例えばホルマリンによる）、およびその後の染色を含み得る。得られたデータにより、試料中のがん幹細胞の数および分布を決定することができる。
腫瘍関連糖鎖抗原を発現する細胞の検出および／または定量化に適した方法には、例えば免疫アッセイ、例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウエスタンブロットおよび免疫組織化学、フローサイトメトリー、免疫組織化学等が含まれる。
候補治療剤のスクリーニングアッセイでは、通常、目的の腫瘍関連糖鎖抗原を発現するがん幹細胞を含む培養物を、目的の結合剤と接触させ、薬剤の効果を、出力パラメーター、例えばマーカーの発現、細胞生存度等をモニターすることによって評価する。スクリーニングは、候補治療剤の非存在下での細胞の成長、増殖、生存度、および／または分化状況と比較して、候補治療剤の存在下での細胞の成長、増殖、生存度、および／または分化状況の調節を決定することを含むこともできる。
１つまたは複数の腫瘍関連糖鎖抗原を発現するがん幹細胞が高度に富化された、単離される細胞集団は、これらのマーカーを使用して単離し、富化／精製することができる。一部の実施形態では、前記がん幹細胞集団は、血液などの循環から単離される。一部の実施形態では、前記がん幹細胞集団は、腫瘍試料から単離され、またはがん患者から得られた胸水もしくは他の体液から単離される。
化学的定義
特定の官能基および化学用語の定義を以下により詳細に説明する。化学元素は、ｔｈｅ
Ｐｅｒｉｏｄｉｃ Ｔａｂｌｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ， ＣＡＳ ｖｅｒｓｉｏｎ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ、７５版、内表紙に従って識別され、特定の官能基は一般に、その中に記載されているように定義される。さらに、有機化学の一般的原理、ならびに特定の機能性部分および反応性は、Ｔｈｏｍａｓ Ｓｏｒｒｅｌｌ、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｏｏｋｓ、Ｓａｕｓａｌｉｔｏ、１９９９年；ＳｍｉｔｈおよびＭａｒｃｈ、Ｍａｒｃｈ’ｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２００１年；Ｌａｒｏｃｋ、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ、ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９年；ならびにＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ、Ｓｏｍｅ Ｍｏｄｅｒｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、３版、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、１９８７年に記載されている。さらに、例示的なグリカンおよび抗体方法論は、Ｗｏｎｇら、ＵＳ２０１００１３６０４２、ＵＳ２００９０３１７８３７、およびＵＳ２０１４００５１１２７に記載されており、それらの各々の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載の化合物は、１つまたは複数の不斉中心を含むことができ、したがって、様々な立体異性体、例えば、異性体および／またはジアステレオマーで存在し得る。例えば、本明細書に記載の化合物は、個々の鏡像異性体、ジアステレオマー、もしくは幾何異性体の形態であり得、またはラセミ混合物および１種または複数の立体異性体に富む混合物を含めた、立体異性体の混合物の形態であり得る。異性体は、キラル高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ならびにキラル塩の形成および結晶化を含めた当業者に公知の方法によって混合物から単離することができ、または好適な異性体を不斉合成によって調製することができる。例えば、Ｊａｃｑｕｅｓら、Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ， Ｒａｃｅｍａｔｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８１年）；Ｗｉｌｅｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、３３巻：２７２５頁（１９７７年）；Ｅｌｉｅｌ、Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｃａｒｂｏｎ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ、ＮＹ、１９６２年）；およびＷｉｌｅｎ、Ｔａｂｌｅｓ ｏｆ Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、２６８頁（Ｅ．Ｌ． Ｅｌｉｅｌ編、Ｕｎｉｖ．
ｏｆ Ｎｏｔｒｅ Ｄａｍｅ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｏｔｒｅ Ｄａｍｅ、ＩＮ、１９７２年）を参照。本発明は、他の異性体を実質的に含まない個々の異性体としての化合物、および代わりに、様々な異性体の混合物としての本明細書に記載の化合物をさらに包含する。
値の範囲が列挙されている場合、これは、その範囲内の各値およびサブ範囲を包含するように意図されている。例えば、「Ｃ１～６」は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ１～６、Ｃ１～５、Ｃ１～４、Ｃ１～３、Ｃ１～２、Ｃ２～６、Ｃ２～５、Ｃ２～４、Ｃ２～３、Ｃ３～６、Ｃ３～５、Ｃ３～４、Ｃ４～６、Ｃ４～５、およびＣ５～６を包含するように意図されている。
「アルキル」は、１～２０個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖飽和炭化水素基のラジカル（「Ｃ１～２０アルキル」）を指す。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１～１０個の炭素原子を有する（「Ｃ１～１０アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１～９個の炭素原子を有する（「Ｃ１～９アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１～８個の炭素原子を有する（「Ｃ１～８アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１～７個の炭素原子を有する（「Ｃ１～７アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１～６個の炭素原子を有する（「Ｃ１～６アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１～５個の炭素原子を有する（「Ｃ１～５アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１～４個の炭素原子を有する（「Ｃ１～４アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１～３個の炭素原子を有する（「Ｃ１～３アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１～２個の炭素原子を有する（「Ｃ１～２アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１個の炭素原子を有する（「Ｃ１アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、２～６個の炭素原子を有する（「Ｃ２～６アルキル」）。Ｃ１～６アルキ
ル基の例としては、メチル（Ｃ１）、エチル（Ｃ２）、ｎ－プロピル（Ｃ３）、イソプロピル（Ｃ３）、ｎ－ブチル（Ｃ４）、ｔｅｒｔ－ブチル（Ｃ４）、ｓｅｃ－ブチル（Ｃ４）、ｉｓｏ－ブチル（Ｃ４）、ｎ－ペンチル（Ｃ５）、３－ペンタニル（Ｃ５）、アミル（Ｃ５）、ネオペンチル（Ｃ５）、３－メチル－２－ブタニル（Ｃ５）、３級アミル（Ｃ５）、およびｎ－ヘキシル（Ｃ６）がある。アルキル基の追加の例としては、ｎ－ヘプチル（Ｃ７）、ｎ－オクチル（Ｃ８）などがある。別段の指定のない限り、アルキル基の各事例は独立に、任意選択で置換されており、すなわち、非置換であるか（「非置換アルキル」）、または１つもしくは複数の置換基で置換されている（「置換アルキル」）。ある特定の実施形態では、アルキル基は、非置換Ｃ１～１０アルキル（例えば、－ＣＨ３）である。ある特定の実施形態では、アルキル基は、置換Ｃ１～１０アルキルである。
「アルケニル」は、２～２０個の炭素原子、および１つまたは複数の炭素間二重結合を有し、三重結合を有しない直鎖または分岐鎖炭化水素基のラジカル（「Ｃ２～２０アルケニル」）を指す。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、２～１０個の炭素原子を有する（「Ｃ２～１０アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、２～９個の炭素原子を有する（「Ｃ２～９アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、２～８個の炭素原子を有する（「Ｃ２～８アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、２～７個の炭素原子を有する（「Ｃ２～７アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、２～６個の炭素原子を有する（「Ｃ２～６アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、２～５個の炭素原子を有する（「Ｃ２～５アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、２～４個の炭素原子を有する（「Ｃ２～４アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、２～３個の炭素原子を有する（「Ｃ２～３アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基は、２個の炭素原子を有する（「Ｃ２アルケニル」）。１つまたは複数の炭素間二重結合は、内部（２－ブテニル中など）または末端（１－ブテニル中など）であり得る。Ｃ２～４アルケニル基の例としては、エテニル（Ｃ２）、１－プロペニル（Ｃ３）、２－プロペニル（Ｃ３）、１－ブテニル（Ｃ４）、２－ブテニル（Ｃ４）、ブタジエニル（Ｃ４）などがある。Ｃ２～６アルケニル基の例としては、上述のＣ２～４アルケニル基、およびペンテニル（Ｃ５）、ペンタジエニル（Ｃ５）、ヘキセニル（Ｃ６）などがある。アルケニルの追加の例としては、ヘプテニル（Ｃ７）、オクテニル（Ｃ８）、オクタトリエニル（Ｃ８）などがある。別段の指定のない限り、アルケニル基の各事例は独立に、任意選択で置換されており、すなわち、非置換であるか（「非置換アルケニル」）、または１つもしくは複数の置換基で置換されている（「置換アルケニル」）。ある特定の実施形態では、アルケニル基は、非置換Ｃ２～１０アルケニルである。ある特定の実施形態では、アルケニル基は、置換Ｃ２～１０アルケニルである。
「アルキニル」は、２～２０個の炭素原子、１つまたは複数の炭素間三重結合、および任意選択で１つまたは複数の二重結合を有する直鎖または分岐鎖炭化水素基のラジカル（「Ｃ２～２０アルキニル」）を指す。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、２～１０個の炭素原子を有する（「Ｃ２～１０アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、２～９個の炭素原子を有する（「Ｃ２～９アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、２～８個の炭素原子を有する（「Ｃ２～８アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、２～７個の炭素原子を有する（「Ｃ２～７アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、２～６個の炭素原子を有する（「Ｃ２～６アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、２～５個の炭素原子を有する（「Ｃ２～５アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、２～４個の炭素原子を有する（「Ｃ２～４アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、２～３個の炭素原子を有する（「Ｃ２～３アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基は、２個の炭素原子を有する（「Ｃ２アルキニル」）。１つまたは複数の炭素間三重結合は、内部（２－ブチニル中など）または末端（１－ブチニル
中など）にあり得る。Ｃ２～４アルキニル基の例としては、限定することなく、エチニル（Ｃ２）、１－プロピニル（Ｃ３）、２－プロピニル（Ｃ３）、１－ブチニル（Ｃ４）、２－ブチニル（Ｃ４）などがある。Ｃ２～６アルケニル基の例としては、上述のＣ２～４アルキニル基、およびペンチニル（Ｃ５）、ヘキシニル（Ｃ６）などがある。アルキニルの追加の例としては、ヘプチニル（Ｃ７）、オクチニル（Ｃ８）などがある。別段の指定のない限り、アルキニル基の各事例は独立に、任意選択で置換されており、すなわち、非置換であるか（「非置換アルキニル」）、または１つもしくは複数の置換基で置換されている（「置換アルキニル」）。ある特定の実施形態では、アルキニル基は、非置換Ｃ２～１０アルキニルである。ある特定の実施形態では、アルキニル基は、置換Ｃ２～１０アルキニルである。
「ヘテロシクリル」または「複素環式」は、環炭素原子、ならびに各ヘテロ原子が独立に、窒素、酸素、硫黄、ホウ素、リンおよびケイ素から選択される、１～４個の環ヘテロ原子を有する３～１０員非芳香族環系のラジカル（「３～１０員ヘテロシクリル」）を指す。ある特定の実施形態では、ヘテロ原子は、独立に、窒素、硫黄および酸素から選択される。１つまたは複数の窒素原子を含有するヘテロシクリル基では、付着点は、結合価が許容する場合、炭素または窒素原子であり得る。ヘテロシクリル基は、単環式（「単環式ヘテロシクリル」）または縮合環系、架橋環系、もしくはスピロ環系、例えば、二環系（「二環式ヘテロシクリル」）であり、飽和または部分的に不飽和であり得る。ヘテロシクリル二環式環系は、一方または両方の環中に１つまたは複数のヘテロ原子を含むことができる。また「ヘテロシクリル」には、先に定義の複素環が、１つもしくは複数のカルボシクリル基と縮合しており、その付着点が、カルボシクリルもしくは複素環のいずれかの上にある環系、または先に定義の複素環が、１つもしくは複数のアリールもしくはヘテロアリール基と縮合しており、その付着点が、複素環上にある環系が含まれ、このような場合、環員の数は、継続して複素環系中の環員の数を示す。別段の指定のない限り、ヘテロシクリルの各事例は独立に、任意選択で置換されており、すなわち、非置換であるか（「非置換ヘテロシクリル」）、または１つもしくは複数の置換基で置換されている（「置換ヘテロシクリル」）。ある特定の実施形態では、ヘテロシクリル基は、非置換３～１０員ヘテロシクリルである。ある特定の実施形態では、ヘテロシクリル基は、置換３～１０員ヘテロシクリルである。
「アリール」は、６～１４個の環炭素原子を有し、芳香族環系内のヘテロ原子がゼロである単環式または多環式（例えば、二環式もしくは三環式）４ｎ＋２芳香族環系（例えば、環アレイ内に６、１０、または１４個のπ電子が共有された）のラジカル（「Ｃ６～１４アリール」）を指す。いくつかの実施形態では、アリール基は、６個の環炭素原子を有する（「Ｃ６アリール」；例えば、フェニル）。いくつかの実施形態では、アリール基は、１０個の環炭素原子を有する（「Ｃ１０アリール」；例えば、１－ナフチルおよび２－ナフチルなどのナフチル）。いくつかの実施形態では、アリール基は、１４個の環炭素原子を有する（「Ｃ１４アリール」；例えば、アントラシル）。「アリール」は、上記に定義したアリール環が１つもしくは複数のカルボシクリルもしくはヘテロシクリル基と縮合されており、ラジカルもしくは付着点がアリール環上にある環系も含み、このような事例では、炭素原子の番号は、アリール環系の炭素原子の数を指定するように続く。別段の指定のない限り、アリール基の各事例は独立に、任意選択で置換されており、すなわち、非置換であるか（「非置換アリール」）、または１つもしくは複数の置換基で置換されている（「置換アリール」）。ある特定の実施形態では、アリール基は、非置換Ｃ６～１４アリールである。ある特定の実施形態では、アリール基は、置換Ｃ６～１４アリールである。
二価の架橋基である本明細書で定義のアルキル、アルケニル、アルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリール基は、さらに、接尾辞－エンを
使用して、例えばアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、カルボシクリレン、ヘテロシクリレン、アリーレン、およびヘテロアリーレンを指す。
用語「アルコキシ」または「アルキルオキシ」は、－Ｏ－アルキルラジカルを指し、ここでアルキルは、本明細書で定義の任意選択で置換されているアルキルである。アルコキシの例として、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ－ブトキシ、イソ－ブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシ、およびｔｅｒｔ－ブトキシが挙げられるが、それらに限定されない。
用語「アリールオキシ」は、－Ｏ－アリールを指し、ここでアリールは、本明細書で定義の任意選択で置換されているアリールである。
本明細書で使用される用語「任意選択で置換されている」は、置換または非置換部分を指す。
本明細書に定義されるアルキル、アルケニル、アルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリール基は、任意選択で置換されている（例えば、「置換」もしくは「非置換」アルキル、「置換」もしくは「非置換」アルケニル、「置換」もしくは「非置換」アルキニル「置換」もしくは「非置換」カルボシクリル、「置換」もしくは「非置換」ヘテロシクリル、「置換」もしくは「非置換」アリール、または「置換」もしくは「非置換」ヘテロアリール基）。一般に、用語「置換された」は、用語「任意選択で」が前に付くかどうかによらず、基（例えば、炭素原子または窒素原子）に存在する少なくとも１個の水素が、許容できる置換基、例えば、置換すると安定化合物、例えば、転位、環化、脱離、または他の反応などによる変換を自発的に起こさない化合物をもたらす置換基と置き換えられていることを意味する。別段の指定のない限り、「置換された」基は、その基の１つまたは複数の置換可能な位置で置換基を有し、任意の所与の構造中で１つを超える位置が置換されている場合、置換基は、各位置で同じであり、または異なっている。用語「置換された」は、有機化合物のすべての許容できる置換基、安定化合物の形成をもたらす本明細書に記載の置換基のいずれかとの置換を含むように企図されている。本発明は、安定化合物に到達するための任意かつすべてのこのような組合せを企図する。本発明の目的のために、窒素などのヘテロ原子は、水素置換基および／またはヘテロ原子の原子価を満たし、安定部分の形成をもたらす本明細書に記載の任意の適当な置換基を有し得る。
「ハロ」または「ハロゲン」は、フッ素（フルオロ、－Ｆ）、塩素（クロロ、－Ｃｌ）、臭素（ブロモ、－Ｂｒ）、またはヨウ素（ヨード、－Ｉ）を指す。
本明細書で使用される「アシル」は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ、－ＣＨＯ、－ＣＯ２Ｒａａ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、－Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｒａａ、－Ｃ（＝ＮＲｂｂ）ＯＲａａ、－Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｂｂＳＯ２Ｒａａ、－Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、－Ｃ（＝Ｏ）ＳＲａａ、および－Ｃ（＝Ｓ）ＳＲａａからなる群より選択される部分を指し、ここでＲａａおよびＲｂｂは、本明細書で定義の通りである。
窒素原子は、価数によって可能な限り、置換または非置換であってよく、窒素原子には、第一級、第二級、第三級、および第四級窒素原子が含まれる。例示的な窒素原子置換基として、水素、－ＯＨ、－ＯＲａａ、－Ｎ（Ｒｃｃ）２、－ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、－ＣＯ２Ｒａａ、－ＳＯ２Ｒａａ、－Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｒａａ、－Ｃ（＝ＮＲｃｃ）ＯＲａａ、－Ｃ（＝ＮＲｃｃ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、－ＳＯ２Ｎ（Ｒｃｃ）２、－ＳＯ２Ｒｃｃ、－ＳＯ２ＯＲｃｃ、－ＳＯＲａａ、－Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、－Ｃ（＝Ｏ）ＳＲｃｃ、－Ｃ（＝Ｓ）ＳＲｃｃ、－Ｐ（＝Ｏ）２Ｒａａ、－Ｐ（
＝Ｏ）（Ｒａａ）２、－Ｐ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒｃｃ）２、－Ｐ（＝Ｏ）（ＮＲｃｃ）２、Ｃ１～１０アルキル、Ｃ１～１０ペルハロアルキル、Ｃ２～１０アルケニル、Ｃ２～１０アルキニル、Ｃ３～１０カルボシクリル、３～１４員ヘテロシクリル、Ｃ６～１４アリール、および５～１４員ヘテロアリールが挙げられるが、これらに限定されず、または窒素原子に結合した２個のＲｃｃ基は、接合されて３～１４員ヘテロシクリルもしくは５～１４員ヘテロアリール環を形成し、各アルキル、アルケニル、アルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールは独立に、０、１、２、３、４、もしくは５個のＲｄｄ基と置換されており、ここで、Ｒａａ、Ｒｂｂ、ＲｃｃおよびＲｄｄは、上で定義された通りである。
ある特定の実施形態では、酸素原子上に存在する置換基は、酸素保護基（ヒドロキシル保護基とも呼ばれる）である。酸素保護基としては、それだけに限らないが、－Ｒａａ、－Ｎ（Ｒｂｂ）２、－Ｃ（＝Ｏ）ＳＲａａ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ、－ＣＯ２Ｒａａ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、－Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｒａａ、－Ｃ（＝ＮＲｂｂ）ＯＲａａ、－Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、－Ｓ（＝Ｏ）Ｒａａ、－ＳＯ２Ｒａａ、－Ｓｉ（Ｒａａ）３、－Ｐ（Ｒｃｃ）２、－Ｐ（Ｒｃｃ）３、－Ｐ（＝Ｏ）２Ｒａａ、－Ｐ（＝Ｏ）（Ｒａａ）２、－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲｃｃ）２、－Ｐ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒｂｂ）２、および－Ｐ（＝Ｏ）（ＮＲｂｂ）２があり、式中、Ｒａａ、Ｒｂｂ、およびＲｃｃは、本明細書で定義した通りである。酸素保護基は、当技術分野で周知であり、本明細書に組み込まれているＰｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｔ． Ｗ． ＧｒｅｅｎｅおよびＰ． Ｇ． Ｍ． Ｗｕｔｓ、３版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９９年に記載されたものを含む。
例示的な酸素保護基としては、それだけに限らないが、メチル、メトキシルメチル（ＭＯＭ）、メチルチオメチル（ＭＴＭ）、ｔ－ブチルチオメチル、（フェニルジメチルシリル）メトキシメチル（ＳＭＯＭ）、ベンジルオキシメチル（ＢＯＭ）、ｐ－メトキシベンジルオキシメチル（ＰＭＢＭ）、（４－メトキシフェノキシ）メチル（ｐ－ＡＯＭ）、グアイアコルメチル（ｇｕａｉａｃｏｌｍｅｔｈｙｌ）（ＧＵＭ）、ｔ－ブトキシメチル、４－ペンテニルオキシメチル（ＰＯＭ）、シロキシメチル、２－メトキシエトキシメチル（ＭＥＭ）、２，２，２－トリクロロエトキシメチル、ビス（２－クロロエトキシ）メチル、２－（トリメチルシリル）エトキシメチル（ＳＥＭＯＲ）、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、３－ブロモテトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、１－メトキシシクロヘキシル、４－メトキシテトラヒドロピラニル（ＭＴＨＰ）、４－メトキシテトラヒドロチオピラニル、４－メトキシテトラヒドロチオピラニルＳ，Ｓ－ジオキシド、１－［（２－クロロ－４－メチル）フェニル］－４－メトキシピペリジン－４－イル（ＣＴＭＰ）、１，４－ジオキサン－２－イル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフラニル、２，３，３ａ，４，５，６，７，７ａ－オクタヒドロ－７，８，８－トリメチル－４，７－メタノベンゾフラン－２－イル、１－エトキシエチル、１－（２－クロロエトキシ）エチル、１－メチル－１－メトキシエチル、１－メチル－１－ベンジルオキシエチル、１－メチル－１－ベンジルオキシ－２－フルオロエチル、２，２，２－トリクロロエチル、２－トリメチルシリルエチル、２－（フェニルセレニル）エチル、ｔ－ブチル、アリル、ｐ－クロロフェニル、ｐ－メトキシフェニル、２，４－ジニトロフェニル、ベンジル（Ｂｎ）、ｐ－メトキシベンジル、３，４－ジメトキシベンジル、ｏ－ニトロベンジル、ｐ－ニトロベンジル、ｐ－ハロベンジル、２，６－ジクロロベンジル、ｐ－シアノベンジル、ｐ－フェニルベンジル、２－ピコリル、４－ピコリル、３－メチル－２－ピコリルＮ－オキシド、ジフェニルメチル、ｐ，ｐ’－ジニトロベンズヒドリル、５－ジベンゾスベリル、トリフェニルメチル、α－ナフチルジフェニルメチル、ｐ－メトキシフェニルジフェニルメチル、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル、トリ（ｐ－メトキシフェニル）メチル、４－（４’－ブロモフェナシルオキシフェニル）ジフェニルメチル、４，４’，４”－トリス（４，５－ジクロロフタルイミドフェニル）メチル、４，４’，４”－ト
リス（レブリノイルオキシフェニル）メチル、４，４’，４”－トリス（ベンゾイルオキシフェニル）メチル、３－（イミダゾール－１－イル）ビス（４’，４”－ジメトキシフェニル）メチル、１，１－ビス（４－メトキシフェニル）－１’－ピレニルメチル、９－アントリル、９－（９－フェニル）キサンテニル、９－（９－フェニル－１０－オキソ）アントリル、１，３－ベンゾジチオラン－２－イル、ベンゾイソチアゾリルＳ，Ｓ－ジオキシド、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、トリエチルシリル（ＴＥＳ）、トリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）、ジメチルイソプロピルシリル（ＩＰＤＭＳ）、ジエチルイソプロピルシリル（ＤＥＩＰＳ）、ジメチルテキシルシリル、ｔ－ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、ｔ－ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）、トリベンジルシリル、トリ－ｐ－キシリルシリル、トリフェニルシリル、ジフェニルメチルシリル（ＤＰＭＳ）、ｔ－ブチルメトキシフェニルシリル（ＴＢＭＰＳ）、ホルメート、ベンゾイルホルメート、アセテート、クロロアセテート、ジクロロアセテート、トリクロロアセテート、トリフルオロアセテート、メトキシアセテート、トリフェニルメトキシアセテート、フェノキシアセテート、ｐ－クロロフェノキシアセテート、３－フェニルプロピオネート、４－オキソペンタノエート（レブリネート）、４，４－（エチレンジチオ）ペンタノエート（レブリノイルジチオアセタール）、ピバロエート、アダマントエート、クロトネート、４－メトキシクロトネート、ベンゾエート、ｐ－フェニルベンゾエート、２，４，６－トリメチルベンゾエート（メシトエート）、炭酸メチル、９－フルオレニルメチルカーボネート（Ｆｍｏｃ）、炭酸エチル、２，２，２－トリクロロエチルカーボネート（Ｔｒｏｃ）、２－（トリメチルシリル）エチルカーボネート（ＴＭＳＥＣ）、２－（フェニルスルホニル）エチルカーボネート（Ｐｓｅｃ）、２－（トリフェニルホスホニオ）エチルカーボネート（Ｐｅｏｃ）、炭酸イソブチル、炭酸ビニル、炭酸アリル、ｔ－ブチルカーボネート（ＢＯＣ）、ｐ－ニトロフェニルカーボネート、炭酸ベンジル、ｐ－メトキシベンジルカーボネート、３，４－ジメトキシベンジルカーボネート、ｏ－ニトロベンジルカーボネート、ｐ－ニトロベンジルカーボネート、Ｓ－ベンジルチオカーボネート、４－エトキシ－１－ナフチル（ｎａｐｔｈｔｈｙｌ）カーボネート、メチルジチオカーボネート、２－ヨードベンゾエート、４－アジドブチレート、４－ニトロ－４－メチルペンタノエート、ｏ－（ジブロモメチル）ベンゾエート、２－ホルミルベンゼンスルホネート、２－（メチルチオメトキシ）エチル、４－（メチルチオメトキシ）ブチレート、２－（メチルチオメトキシメチル）ベンゾエート、２，６－ジクロロ－４－メチルフェノキシアセテート、２，６－ジクロロ－４－（１，１，３，３－テトラメチルブチル）フェノキシアセテート、２，４－ビス（１，１－ジメチルプロピル）フェノキシアセテート、クロロジフェニルアセテート、イソブチレート、モノスクシノエート、（Ｅ）－２－メチル－２－ブテノエート、ｏ－（メトキシアシル）ベンゾエート、α－ナフトエート、ニトレート、アルキルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルホスホロジアミデート、アルキルＮ－フェニルカルバメート、ボレート、ジメチルホスフィノチオイル、アルキル２，４－ジニトロフェニルスルフェネート、スルフェート、メタンスルホネート（メシレート）、ベンジルスルホネート、およびトシレート（Ｔｓ）がある。
他の定義
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、状況によって別段明示されない限り、複数の参照物を含むことに留意しなければならない。同様に、用語「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）、「１つまたは複数の」および「少なくとも１つの」は、本明細書では交換可能に使用することができる。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」も、交換可能に使用することができる。
本発明の実施では、そうでないことが指し示されない限りにおいて、当該分野の技量の範囲内にある、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技法を使用
する。このような技法については、文献中で十分に説明されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．，１９８５）；Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；論文、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｓ．１５４
ａｎｄ １５５（Ｗｕら、ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｂｙ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ ｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８８）；およびＨａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ
Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）を参照のこと。
本明細書で使用される「グリカン」という用語は、多糖またはオリゴ糖を指す。本明細書では、グリカンはまた、糖タンパク質、糖脂質、グリコペプチド、糖プロテオーム、ペプチドグリカン、リポ多糖、またはプロテオグリカンなど、複合糖質の炭水化物部分を指すのにも使用される。グリカンは通例、単糖間のＯ－グリコシド連結だけからなる。例えば、セルロースとは、β－１，４連結Ｄ－グルコースから構成されるグリカン（または、より具体的には、グルカン）であり、キチンとは、β－１，４連結Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンから構成されるグリカンである。グリカンは、単糖残基のホモポリマーの場合も、ヘテロポリマーの場合もあり、直鎖状の場合も、分枝状の場合もある。グリカンは、糖タンパク質内およびプロテオグリカン内の場合と同様に、タンパク質に付着して見出される場合もある。グリカンは一般に、細胞の外部表面上で見出される。真核生物では、Ｏ連結型グリカンおよびＮ連結型グリカンが非常に一般的であるが、原核生物でも、それほど一般的ではないが、見出されうる。Ｎ連結型グリカンは、シークオン（ｓｅｑｕｏｎ）内のアスパラギンのＲ基窒素（Ｎ）に付着して見出される。シークオンとは、Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ配列またはＡｓｎ－Ｘ－Ｔｈｒ配列［配列中、Ｘは、プロリン（ｐｒａｌｉｎｅ）を除く任意のアミノ酸である］である。
本明細書で使用される「抗原」という用語は、免疫応答を誘発することが可能な任意の物質と定義される。
本明細書で使用される「免疫原性」という用語は、免疫原、抗原、またはワクチンが、免疫応答を刺激する能力を指す。
本明細書で使用される「ＣＤ１ｄ」という用語は、多様なヒト抗原提示細胞の表面上で発現する、糖タンパク質のＣＤ１（表面抗原分類（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）１）ファミリーのメンバーを指す。ＣＤ１ｄを提示した脂質抗原は、ナチュラルキラーＴ細胞を活性化させる。ＣＤ１ｄは、糖脂質抗原が結合する、深い抗原結合溝を有する。樹状細胞上で発現するＣＤ１ｄ分子は、Ｃ３４など、アルファＧａｌ
Ｃｅｒ類似体を含む糖脂質に結合し、これらを提示しうる。
本明細書で使用される「エピトープ」という用語は、抗体またはＴ細胞受容体の抗原結合性部位に接触する、抗原分子の部分と定義される。
本明細書で使用される「ワクチン」という用語は、全病原生物（死滅させるかまたは弱毒化した）、またはこのような生物の構成要素であって、生物が引き起こす疾患に対する免疫を付与するのに使用される、タンパク質、ペプチド、または多糖などの構成要素からなる抗原を含有する調製物を指す。ワクチン調製物は、天然、合成、または組換えＤＮＡ技術により導出される場合がある。
本明細書で使用される「抗原特異的」という用語は、特定の抗原または抗原の断片を供給する結果として、特異的細胞増殖がもたらされるような細胞集団の特性を指す。
本明細書で使用される「特異的に結合すること」という用語は、結合対（例えば、抗体および抗原）の間の相互作用を指す。多様な場合において、特異的に結合することは、約１０～６モル／リットル、約１０～７モル／リットル、もしくは約１０～８モル／リットル、またはそれ未満のアフィニティー定数により具体化することができる。
本明細書で使用される用語「フローサイトメトリー」または「ＦＡＣＳ」は、流体のストリームに懸濁した粒子または細胞の物理特性および化学特性を、光学的および電子的な検出デバイスによって調査するための技術を意味する。
本明細書で使用される糖酵素という用語は、グロボ系生合成経路における酵素を少なくとも部分的に指す。例示的な糖酵素として、アルファ－４ＧａｌＴ、ベータ－４ＧａｌＮＡｃＴ－Ｉ、またはベータ－３ＧａｌＴ－Ｖ酵素が挙げられる。
本明細書で使用される用語「グロボ系経路」は、図１に記載の生化学経路を指す。
「単離」抗体とは、その天然環境の構成要素から同定および分離ならびに／または回収された抗体である。その天然環境の夾雑構成要素は、抗体の研究的使用、診断的使用、または治療的使用に干渉する物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性溶質または非タンパク質性溶質を含みうる。一実施形態では、抗体を（１）例えば、ローリー法により決定される通り、抗体の９５重量％超まで精製し、一部の実施形態では、９９重量％超まで精製するか（２）例えば、スピニングカップ型シークェネーターを使用することにより、Ｎ末端のアミノ酸配列もしくは内部アミノ酸配列のうちの少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで精製するか、または（３）例えば、クーマシーブルーもしくは銀染色を使用して、還元条件下もしくは非還元条件下で、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより、均質性まで精製する。抗体の天然環境の少なくとも１つの構成要素が存在しないので、単離抗体は、組換え細胞内のｉｎ ｓｉｔｕの抗体を含む。しかし、通常、単離抗体は、少なくとも１つの精製ステップにより調製する。
本明細書で使用される「実質的に同様」、「実質的に同じ」、「同等」、または「実質的に同等」という語句は、当業者が、その値（例えば、Ｋｄ値、抗ウイルス効果など）により測定される生物学的特徴の文脈内では、２つの値の間の差違を、生物学的有意性および／または統計学的有意性がほとんどないかまたはないと考えるような、２つの数値（例えば、一方は、分子と関連し、他方は、基準／比較分子と関連する）の間の、十分に高度の類似性を描示する。前記２つの値の間の差違は、例えば、基準／比較分子についての値の関数として、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、および／または約１０％未満である。
本明細書で使用される「実質的に低減された」または「実質的に異なる」という語句は、当業者が、その値（例えば、Ｋｄ値）により測定される生物学的特徴の文脈内では、２つの値の間の差違を、統計学的有意性があると考えるような、２つの数値（一般に、一方は、分子と関連し、他方は、基準／比較分子と関連する）の間の、十分に高度の差違を描示する。前記２つの値の間の差違は、例えば、基準／比較分子についての値の関数として、約１０％超、約２０％超、約３０％超、約４０％超、および／または約５０％超である。
「結合アフィニティー」とは一般に、分子（例えば、抗体）の単一の結合性部位と、その結合パートナー（例えば、抗原）との非共有結合的相互作用の総合計の強さを指す。そうでないことが指し示されない限りにおいて、本明細書で使用される「結合アフィニティー」とは、結合対のメンバー（例えば、抗体および抗原）の間の１：１の相互作用を反映する、固有の結合アフィニティーを指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対するアフィニティーは一般に、解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。アフィニティーは、本明細書で記載される方法を含む、当技術分野で公知の一般的な方法により測定することができる。低アフィニティー抗体は一般に、抗原への結合が緩徐であり、たやすく解離する傾向があるのに対し、高アフィニティー抗体は一般に、抗原への結合が迅速であり、結合を長く維持する傾向がある。当技術分野では、結合アフィニティーを測定する様々な方法が公知であり、これらのうちのいずれかを、本発明の目的で使用することができる。具体的な例示的実施形態について、以下で記載する。
一実施形態では、本発明に従う「Ｋｄ」または「Ｋｄ値」は、以下に記載される通りに、目的の抗体およびその抗原のＦａｂバージョンにより実施される、放射性標識型抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）により測定する。Ｆａｂの、抗原に対する、溶液中の結合アフィニティーは、Ｆａｂを、未標識抗原の滴定系列の存在下、最小濃度の（１２５Ｉ）標識抗原で平衡化し、次いで、結合した抗原を、抗Ｆａｂ抗体コーティングプレートで捕捉する（Ｃｈｅｎら（１９９９年）、Ｊ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２９３巻：８６５～８８１頁）ことにより測定する。アッセイのための条件を確立するには、マイクロタイタープレート（Ｄｙｎｅｘ）を、一晩、５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中に５μｇ／ｍｌの捕捉用抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ）でコーティングし、その後、ＰＢＳ中に２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンで、室温（約２３℃）で２～５時間ブロックする。非吸着性プレート（Ｎｕｎｃ；型番２６９６２０）内では、１００ｐＭまたは２６ｐＭの［１２５Ｉ］－抗原を、目的のＦａｂの系列希釈液と混合する（例えば、Ｐｒｅｓｔａら（１９９７年）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５７巻：４５９３～４５９９頁における、抗ＶＥＧＦ抗体であるＦａｂ－１２の評価と符合する）。次いで、目的のＦａｂを、一晩インキュベートするが、インキュベーションを長時間（例えば、６５時間）持続させて、平衡への到達を確実にすることができる。その後、室温におけるインキュベーション（例えば、１時間）のために、混合物を、捕捉用プレートに移す。次いで、溶液を除去し、プレートを、８回、ＰＢＳ中に０．１％のＴｗｅｅｎ－２０で洗浄する。プレートを乾燥させたら、１５０μｌ／ウェルのシンチレーション剤（ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ－２０；Ｐａｃｋａｒｄ）を添加し、プレートを、Ｔｏｐｃｏｕｎｔガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）上で、１０分間カウントする。最大結合の２０％未満またはそれと等しい結合をもたらす各Ｆａｂ濃度を、競合的結合アッセイにおける使用のために選択する。別の実施形態によれば、ＫｄまたはＫｄ値は、約１０応答単位（ＲＵ）において固定化した抗原ＣＭ５チップをもちいて、２５℃でＢＩＡｃｏｒｅ（商標）－２０００またはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）－３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用する、表面プラズモン共鳴アッセイを使用することにより測定する。略述すると、供給元の指示書に従い、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５；ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｃ．）を、Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボ
ジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化させる。５μｌ／分の流量での注射の前に、抗原を、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で、５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）に希釈して、約１０応答単位（ＲＵ）のカップリングタンパク質を達成する。抗原を注射した後、１Ｍのエタノールアミンを注射して、未反応基を遮断する。各実験では、１つのスポットを、タンパク質を固定化させずに活性化させ、エタノールアミンで遮断して、基準の減算のために使用した。動態の測定のために、Ｆａｂの２倍の系列希釈液（０．７８ｎＭ～５００ｎＭ）を、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を伴うＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中、２５℃、約２５μｌ／分の流量で注射する。会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）は、単純な一対一のラングミュア結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．２）を使用して、会合センサーグラムと解離センサーグラムとを同時に当てはめることにより計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）は、比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算する。例えば、Ｃｈｅｎ， Ｙ．ら（１９９９年）、Ｊ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２９３巻：８６５～８８１頁を参照されたい。オン速度が、上記の表面プラズモン共鳴アッセイによる１０６Ｍ－１秒－１を超える場合、オン速度は、ストップフロー装備型分光光度計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、または撹拌式キュベットを伴う８０００シリーズＳＬＭ－Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計で測定される、漸増濃度の抗原の存在下、２５℃で、ＰＢＳ、ｐＨ７．２中に２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）の、蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍのバンドパス）の増大または減少を測定する、蛍光クエンチング技法を使用することにより決定することができる。
また、本発明に従う「オン速度」または「会合速度（ｒａｔｅ ｏｆ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）」または「会合速度（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ）」または「ｋｏｎ」も、約１０応答単位（ＲＵ）において固定化した抗原ＣＭ５チップをもちいて、２５℃でＢＩＡｃｏｒｅ（商標）－２０００またはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）－３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用する、上で記載した表面プラズモン共鳴法により決定することができる。略述すると、供給元の指示書に従い、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５；ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｃ．）を、Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化させる。５μｌ／分の流量での注射の前に、抗原を、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で、５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）に希釈して、約１０応答単位（ＲＵ）のカップリングタンパク質を達成する。抗原を注射した後、１Ｍのエタノールアミンを注射して、未反応基を遮断する。動態の測定のために、Ｆａｂの２倍の系列希釈液（０．７８ｎＭ～５００ｎＭ）を、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を伴うＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中、２５℃、約２５μｌ／分の流量で注射する。会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）は、単純な一対一のラングミュア結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．２）を使用して、会合センサーグラムと解離センサーグラムとを同時に当てはめることにより計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）は、比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算した。例えば、Ｃｈｅｎ， Ｙ．ら（１９９９年）Ｊ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２９３巻：８６５～８８１頁を参照されたい。しかし、オン速度が、上記の表面プラズモン共鳴アッセイによる１０６Ｍ－１秒－１を超える場合、オン速度は、ストップフロー装備型分光光度計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、または撹拌式キュベットを伴う８０００シリーズＳＬＭ－Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計で測定される、漸増濃度の抗原の存在下、２５℃で、ＰＢＳ、ｐＨ７．２中に２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）の、蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍのバンドパス）の増大または減少を測定する、蛍光クエンチング技法を使用することにより決定することができる。
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指すことを意図する。１つの種類のベクターは、さらなるＤＮＡセグメントをライゲーションしうる、環状の二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」である。別の種類のベクターは、ファージベクターである。別の種類のベクターは、さらなるＤＮＡセグメントを、ウイルスゲノムにライゲーションしうる、ウイルスベクターである。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内の自律複製が可能である（例えば、細菌性複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、これにより、宿主ゲノムと共に複製されうる。さらに、ある特定のベクターは、それらが作動的に連結される遺伝子の発現を誘導することが可能である。本明細書では、このようなベクターを、「組換え発現ベクター」（または、単に、「組換えベクター」）と称する。一般に、組換えＤＮＡ技法において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。プラスミドは、最も一般に使用されるベクターの形態であるので、本明細書では、「プラスミド」と「ベクター」とを、互換的に使用する場合がある。
本明細書で互換的に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」とは、任意の長さのヌクレオチドポリマーを指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは修飾塩基、および／またはそれらの類似体、あるいはＤＮＡポリメラーゼもしくはＲＮＡポリメラーゼ、または合成反応によりポリマーに組み込まれうる任意の基質、がある。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびそれらの類似体などの修飾ヌクレオチドを含みうる。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーのアセンブリーの前または後で施すことができる。ヌクレオチドの配列は、ヌクレオチド以外の構成要素により中断されうる。ポリヌクレオチドは、標識とのコンジュゲーションによるなど、合成の後でさらに修飾することができる。他の種類の修飾は、例えば、「キャップ」、天然に存在するヌクレオチドのうちの１つまたは複数の、類似体による置換、例えば、非荷電連結（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄａｔｅ）、カルバメートなど）を伴うもの、および荷電連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を伴うもの、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ｐｌｙ－Ｌ－リシンなど）などのペンダント部分を含有するもの、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を伴うもの、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾連結（例えば、アルファアノマー核酸など）を伴うものなどのヌクレオチド間修飾のほか、ポリヌクレオチドの非修飾形態を含む。さらに、通常糖内に存在するヒドロキシル基のうちのいずれかを、例えば、ホスホネート基、ホスフェート基により置きかえる、標準的な保護基により保護する、またはさらなるヌクレオチドへのさらなる連結を調製するように活性化させることができ、あるいは固体支持体または半固体支持体にコンジュゲートさせることができる。５’末端および３’末端のＯＨは、リン酸化する、またはアミンもしくは１～２０個の炭素原子による有機キャッピング基部分で置換することができる。他のヒドロキシルはまた、標準的な保護基に誘導体化することもできる。ポリヌクレオチドはまた、例えば、２’－Ｏ－メチルリボース、２’－Ｏ－アリルリボース、２’－フルオロリボース、または２’－アジドリボース、炭素環式の糖類似体、α－アノマー糖、アラビノース、キシロース、またはリキソースなどのエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、アクリル類似体、およびメチルリボシドなどの塩基性ヌクレオシド類似体を含む、当技術分野で一般に公知の、リボース糖またはデオキシリボース糖の類似の形態も含有しうる。１つまたは複数のホスホジエステル連結を、代替的な連結基で置きかえることができる。これらの代替的な連結基は、ホスフェートを、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ、またはＣＨ２（「ホルムアセター
ル」）［式中、各ＲまたはＲ’は、独立に、Ｈであるか、または、任意選択で、エーテル（－Ｏ－）連結、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、もしくはアラルジルを含有する、置換もしくは非置換アルキル（１～２０個のＣ）である］で置きかえた実施形態を含むがこれらに限定されない。ポリヌクレオチド内の全ての連結は、同一である必要がない。前出の記載は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む、本明細書で言及される全てのポリヌクレオチドに当てはまる。
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」とは一般に短く、一般に一本鎖であり、一般に、約２００ヌクレオチド未満の長さであるが必ずしもそうではない、一般に合成のポリヌクレオチドを指す。「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語は、相互に除外的ではない。ポリヌクレオチドについての上記の記載は、オリゴヌクレオチドにも同等かつ十分に適用可能である。
「抗体」（Ａｂ）および「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、同じ構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体が、特異的抗原に対する結合特異性を呈示するのに対し、免疫グロブリンは、抗体および抗原特異性を一般に欠く他の抗体様分子の両方を含む。後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系により産生されるレベルは低く、骨髄腫により産生されるレベルは高い。
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、最も広い意味で、互換的に使用され、モノクローナル抗体（例えば、全長または無傷のモノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、一価抗体、多価抗体、多特異性抗体（それらが、所望の生物学的活性を呈示する限りにおいて、例えば、二特異性抗体）を含み、また、ある特定の抗体断片（本明細書でより詳細に記載される）も含みうる。抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、および／またはアフィニティー成熟抗体でありうる。
抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。これらのドメインは一般に、抗体の最も可変的な部分であり、抗原結合性部位を含有する。
「可変」という用語は、可変ドメインのある特定の部分は、抗体間で配列が大幅に異なり、各特定の抗体の、その特定の抗原に対する結合および特異性において使用されるという事実を指す。しかし、可変性は、抗体の可変ドメイン全体に、均等に配分されているわけではない。可変性は、軽鎖可変ドメイン内および重鎖可変ドメイン内の両方で相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる、３つのセグメント内に濃縮されている。可変ドメインのうちの、より高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれている。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは各々、大部分、ベータシート構造を接続し、場合によって、ベータシート構造の一部を形成するループを形成する、３つのＣＤＲにより接続されたベータシート構成を採用する、４つのＦＲ領域を含む。各鎖内のＣＤＲは、ＦＲ領域により、一体に近接して保持され、他の鎖に由来するＣＤＲと共に、抗体の抗原結合性部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１年）を参照されたい）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合には直接関わらないが、抗体の、抗体依存性細胞傷害への関与など、多様なエフェクター機能を呈示する。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる、各々が、単一の抗原結合性部位と、その名称がたやすく結晶化するその能力を反映する残りの「Ｆｃ」断片とを伴う、２つ
の同一の抗原結合性断片を生じさせる。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、抗原を架橋することがやはり可能な、Ｆ（ａｂ’）２断片をもたらす。
「Ｆｖ」とは、完全な抗原認識部位および抗原結合性部位を含有する、最小の抗体断片である。２つの鎖によるＦｖ分子種では、この領域は、緊密な非共有結合的会合下にある、１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。単鎖によるＦｖ分子種では、１つの重鎖可変ドメインと、１つの軽鎖可変ドメインとは、軽鎖と、重鎖とが、２つの鎖によるＦｖ分子種におけるものと類似の「二量体」構造内で会合しうるように、可撓性のペプチドリンカーにより共有結合的に連結されうる。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ－ＶＬ二量体の表面上で、抗原結合性部位を規定するのは、この構成においてである。併せて、６つのＣＤＲは、抗原結合特異性を、抗体に付与する。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲだけを含むＦｖの半分）でもなお、結合性部位全体より小さなアフィニティーではあるが、抗原を認識し、抗原に結合する能力を有する。
Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片は、重鎖のＣＨ１ドメインのカルボキシ末端において、抗体のヒンジ領域に由来する１つまたは複数のシステインを含むいくつかの残基の付加により、Ｆａｂ断片と異なる。Ｆａｂ’－ＳＨとは、定常ドメインのシステイン残基が、遊離チオール基を保有するＦａｂ’のための、本明細書における呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元は、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として作製された。また、抗体断片の他の化学的カップリングも公知である。
任意の脊椎動物種に由来する抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる、２つの顕著に異なる種類のうちの１つに割り当てることができる。
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体（免疫グロブリン）は、異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元構成は周知であり、一般に、例えば、Ａｂｂａｓら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、４版（２０００年）において記載されている。抗体は、抗体の、１つまたは複数の他のタンパク質またはペプチドとの共有結合的会合または非共有結合的会合により形成される、より大型の融合分子の一部でありうる。
本明細書では、「全長抗体」、「無傷抗体」、および「全抗体」という用語は、互換的に使用されて、下記で規定される抗体断片ではなく、その実質的な無傷形態にある抗体を指す。用語は特に、Ｆｃ領域を含有する重鎖を伴う抗体を指す。
「抗体断片」は、無傷抗体の一部分だけを含み、この場合、部分は、無傷抗体内に存在する場合にその部分と通常関連する機能のうちの少なくとも１つであり、多ければ、これらの大半または全てを保持する。一実施形態では、抗体断片は、無傷抗体の抗原結合性部位を含み、これにより、抗原に結合する能力を保持する。別の実施形態では、抗体断片、例えば、Ｆｃ領域を含む抗体断片は、ＦｃＲｎへの結合、抗体半減期のモジュレーション、ＡＤＣＣ機能、および補体への結合など、無傷抗体内に存在する場合にＦｃ領域と通常関連する生物学的機能のうちの少なくとも１つを保持する。一実施形態では、抗体断片は
、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期が無傷抗体と実質的に同様の一価抗体である。例えば、このような抗体断片は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける安定性を断片に付与することが可能なＦｃ配列に連結された抗原結合性アームを含みうる。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体集団から得られた抗体を指す、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在しうる可能な天然に存在する変異を除き、同一である。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、個別の抗体の混合物ではない抗体の性格を指し示す。このようなモノクローナル抗体は、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、この場合、標的結合性ポリペプチド配列は、単一の標的結合性ポリペプチド配列の、複数のポリペプチド配列からの選択を含む工程により得られたものであることが典型的である。例えば、選択工程は、固有のクローンの、ハイブリドーマクローン、ファージクローン、または組換えＤＮＡクローンのプールなどの複数のクローンからの選択でありうる。選択された標的結合性配列は、例えば、標的に対するアフィニティーを改善し、標的結合性配列をヒト化し、細胞培養物中のその産生を改善し、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるその免疫原性を低減し、多特異性抗体を創出するなどするように、さらに改変させることができ、改変させた標的結合性配列を含む抗体もまた、本発明のモノクローナル抗体であることを理解されたい。異なる決定基（エピトープ）に指向される異なる抗体を含むことが典型的なポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に指向される。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は典型的に、他の免疫グロブリンが夾雑していないという点でも有利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体集団から得られるものとしての抗体の性格を指し示すものであり、任意の特定の方法による抗体の作製を必要とするとはみなされないものとする。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、例えば、以下が挙げられる、種々の技術によって作製され得る；ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）；Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ－Ｃｅｌｌ ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３－６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１））、リコンビナントＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）、ファージディスプレイ技術（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７（１９９２）；Ｓｉｄｈｕら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９－３１０（２００４）；Ｌｅｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３－１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１（３４）：１２４６７－１２４７２（２００４）；およびＬｅｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
２８４（１－２）：１１９－１３２（２００４）を参照のこと）、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座、またはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部または全部を有する動物においてヒトまたはヒト様抗体を生成するための技術（例えば、ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；ＷＯ９１／１０７４１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５－２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３（１９９３）；米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号；Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９－７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６－８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８１２－８１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５－８５１（１９９６）；Ｎｅｕｂ
ｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８２６（１９９６）、およびＬｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５－９３（１９９５）を参照のこと。
本明細書のモノクローナル抗体は具体的に、重鎖および／または軽鎖の一部分が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体内の対応する配列と同一または相同である一方で、鎖の残りの部分は、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体内の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体のほか、それらが、所望の生物学的活性を呈示する限りにおいて、このような抗体の断片（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８１巻：６８５１～６８５５頁（１９８４年））も含む。
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態とは、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。一実施形態では、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域に由来する残基を、所望の特異性、アフィニティー、および／または能力を有する、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長動物など、非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域に由来する残基で置きかえた、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によって、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基を、対応する非ヒト残基で置きかえる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体内またはドナー抗体内で見出されない残基を含みうる。これらの修飾は、抗体の性能をさらに精緻化するように施す。一般に、ヒト化抗体は、超可変ループのうちの全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、ＦＲのうちの全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインのうちの実質的に全てを含む。ヒト化抗体はまた、任意選択で、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンのＦｃの少なくとも一部分も含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ， Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３－５９６（１９９２）を参照のこと。また、以下の総説記事およびその中の参考文献を参照のこと：Ｖａｓｗａｎｉ ａｎｄ Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ ＆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５－１１５（１９９８）；Ｈａｒｒｉｓ， Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ２３：１０３５－１０３８（１９９５）；Ｈｕｒｌｅ
ａｎｄ Ｇｒｏｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８－４３３（１９９４）。
本明細書で使用される「超可変領域」、「ＨＶＲ」、または「ＨＶ」という用語は、配列が超可変的であり、かつ／または構造的に規定されたループを形成する、抗体可変ドメインの領域を指す。一般に、抗体は、６つの超可変領域：ＶＨ内の３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）およびＶＬ内の３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。多くの超可変領域の描写が本明細書において使用され、包含される。Ｋａｂａｔによる相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列可変性に基づき、最も一般に使用されている（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ
ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１年））。これとは別に、Ｃｈｏｔｈｉａは、構造ループの位置に言及する（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、１９６巻：９０１～９１７頁（１９８７年））。ＡｂＭによる超可変領域は、ＫａｂａｔによるＣＤＲと、Ｃｈｏｔｈｉａによる構造ループとの折衷を表し、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ製のＡｂＭ抗体モデル作製ソフトウェアで使用されている。「ｃｏｎｔａｃｔ」超可変領域は、利用可能な複合体結晶構造の解析に基づく
。これらの超可変領域の各々に由来する残基を、下記に記述する。
ループ Ｋａｂａｔ ＡｂＭ Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃｏｎｔａｃｔ
Ｌ１ Ｌ２４－Ｌ３４ Ｌ２４－Ｌ３４ Ｌ２６－Ｌ３２ Ｌ３０－Ｌ３６
Ｌ２ Ｌ５０－Ｌ５６ Ｌ５０－Ｌ５６ Ｌ５０－Ｌ５２ Ｌ４６－Ｌ５５
Ｌ３ Ｌ８９－Ｌ９７ Ｌ８９－Ｌ９７ Ｌ９１－Ｌ９６ Ｌ８９－Ｌ９６
Ｈ１ Ｈ３１－Ｈ３５Ｂ Ｈ２６－Ｈ３５Ｂ Ｈ２６－Ｈ３２ Ｈ３０－Ｈ３５Ｂ
（Ｋａｂａｔ番号付け）
Ｈ１ Ｈ３１－Ｈ３５ Ｈ２６－Ｈ３５ Ｈ２６－Ｈ３２ Ｈ３０－Ｈ３５
（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け）
Ｈ２ Ｈ５０－Ｈ６５ Ｈ５０－Ｈ５８ Ｈ５３－Ｈ５５ Ｈ４７－Ｈ５８
Ｈ３ Ｈ９５－Ｈ１０２ Ｈ９５－Ｈ１０２ Ｈ９６－Ｈ１０１ Ｈ９３－Ｈ１０１
超可変領域は、以下の通り：ＶＬ内の２４～３６または２４～３４（Ｌ１）、４６～５６または５０～５６または４９～５６（Ｌ２）、および８９～９７または８９～９６（Ｌ３）、ならびにＶＨ内の２６～３５（Ｈ１）、５０～６５または４９～６５（Ｈ２）、および９３～１０２、９４～１０２、または９５～１０２（Ｈ３）の「拡張超可変領域」を含みうる。可変ドメイン残基は、Ｋａｂａｔら、前出に従い、これらの定義の各々について番号付けされる。
「フレームワーク」残基または「ＦＲ」残基とは、本明細書で規定される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
「Ｋａｂａｔによる可変ドメイン残基の番号付け」または「Ｋａｂａｔによるアミノ酸位置の番号付け」という用語、およびこれらの変化形は、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１年）で集成された抗体の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインについて使用されている番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを使用すると、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＨＶＲの短縮またはこれらへの挿入に対応する、より少ないアミノ酸またはさらなるアミノ酸を含有する場合がある。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後における単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔに従う残基５２ａ）と、重鎖ＦＲの残基８２の後における残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔに従う残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃなど）を含みうる。Ｋａｂａｔによる残基の番号付けは、所与の抗体について、抗体の配列相同性領域における、「標準的な」Ｋａｂａｔ番号付け配列とのアラインメントにより決定することができる。
「単鎖Ｆｖ」抗体断片または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、この場合、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖内に存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これにより、ｓｃＦｖが、抗原への結合に所望の構造を形成することが可能である。ｓｃＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２６９～３１５頁（１９９４年）を参照されたい。
「ダイアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）」という用語は、２つの抗原結合性部位を伴う小型の抗体断片であって、同じポリペプチド鎖内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む断片（ＶＨ－ＶＬ）を指す。同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能とするには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは、別の鎖の相補性ドメインと対合し、２つの抗原結合性部位を創出するように強いられる。ダイアボディーについては、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９０巻：６４４４～６４４８頁（１９９３年）においてより十全に記載されている。
「ヒト抗体」とは、ヒトにより産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有し、かつ／または本明細書で開示される、ヒト抗体を作製するための技法のうちのいずれかを使用して作製された抗体である。ヒト抗体についてのこの定義は具体的に、非ヒト抗原結合性残基を含むヒト化抗体を除外する。
「アフィニティー成熟」抗体とは、その１つまたは複数のＨＶＲ内の１つまたは複数の改変であって、これらの改変を保有しない親抗体と比較して、抗体の抗原に対するアフィニティーの改善を結果としてもたらす改変を伴う抗体である。一実施形態では、アフィニティー成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル濃度、またはさらにはピコモル濃度のアフィニティーを有する。アフィニティー成熟抗体は、当技術分野で公知の手順により作製される。Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻：７７９～７８３頁（１９９２年）は、ＶＨドメインシャフリングおよびＶＬドメインシャフリングによるアフィニティー成熟について記載している。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダム変異は、Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３８０９－３８１３（１９９４）；Ｓｃｈｉｅｒら、Ｇｅｎｅ １６９：１４７－１５５（１９９５）；Ｙｅｌｔｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４－２００４（１９９５）；Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０－９（１９９５）；およびＨａｗｋｉｎｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９－８９６（１９９２）によって記載されている。
「遮断」抗体または「アンタゴニスト」抗体とは、それが結合する抗原の生物学的活性を阻害または低減する抗体である。ある特定の遮断抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を実質的または完全に阻害する。
本明細書で使用される「アゴニスト抗体」とは、目的のポリペプチドの機能的活性のうちの少なくとも１つを模倣する抗体である。
「障害」とは、本発明の抗体による処置から利益を得る任意の状態である。これは、哺乳動物に、問題の障害への素因を与える病理学的状態を含む、慢性障害および急性障害または慢性疾患および急性疾患を含む。本明細書で処置される障害の非限定的な例は、がんを含む。
「細胞増殖性障害」および「増殖性障害」という用語は、ある程度の異常な細胞増殖と関連する障害を指す。一実施形態では、細胞増殖性障害は、がんである。
本明細書で使用される「腫瘍」とは、悪性であれ、良性であれ、全ての新生物性細胞成長および増殖を指し、全ての前がん性細胞および前がん性組織ならびにがん性細胞およびがん性組織を指す。本明細書で言及される通り、「がん」、「がん性」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」、および「腫瘍」という用語は、相互に除外的ではない。
「がん」および「がん性」という用語は、典型的には、未調節の細胞成長／増殖によって特徴付けられる哺乳動物における生理学的状態を指すか、またはこれについて記載する。がんの例は、癌腫、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫、および白血病を含むがこれらに限定されない。このようながんのより具体的な例は、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺がん、肺扁平上皮癌、腹膜がん、肝細胞がん、消化器がん、膵臓がん、神経膠芽腫、子宮頸がん（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、ヘパトーマ、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓がん、肝臓がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝癌、白血病、および他のリンパ増殖性障害、ならびに多様な種類の頭頸部がんを含む。
用語「筋肉障害」は、正常な筋肉機能が著しく低下するような骨格および／または平滑筋の悪化または衰弱によって典型的に特徴付けられる、筋肉を有する動物の生理状態を指し、または説明する。筋肉障害の例として、筋ジストロフィー、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、アイザックス症候群、全身硬直症候群、家族性（ｆａｍｉｌｉａｒ）周期性四肢麻痺、ミオパチー、筋緊張症、横紋筋融解症、筋萎縮症、ならびに様々なタイプの筋力低下および筋硬直が挙げられるが、それらに限定されない。
用語「グロボ系に関係する障害」は、典型的に、経路の異常な機能または提示によって特徴付けられる、またはそれらが起因する障害を指し、または説明する。このような障害の例として、がんを含む過剰増殖疾患が挙げられるが、それらに限定されない。
用語「神経障害」または「神経疾患」は、典型的に、神経組織の悪化または神経組織の細胞間連絡の悪化によって特徴付けられる、哺乳動物の中枢および／または末梢神経系の疾患または障害を指し、または説明する。神経障害の例として、神経変性疾患（レビー小体病、ポリオ後症候群、シャイ－ドレーガー症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、パーキンソン病、多系統萎縮症、線条体黒質変性症が含まれるが、それらに限定されない）、タウオパチー（アルツハイマー病および核上性麻痺が含まれるが、それらに限定されない）、プリオン病（ウシ海綿状脳症、スクレイピー、クロイツフェルト－ヤコブ症候群、クールー病、ゲルストマン－シュトロイスラー－シャインカー病、慢性消耗性疾患、および致死性家族性不眠症が含まれるが、それらに限定されない）、球麻痺、運動ニューロン疾患、ならびに神経系異種変性（ｈｅｔｅｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ）障害（カナバン病、ハンチントン病、神経セロイドリポフスチノーシス、アレキサンダー病、トゥーレット症候群、メンケス縮れ毛症候群、コケイン症候群、ハラーホルデン（Ｈａｌｅｒｖｏｒｄｅｎ）－スパッツ症候群、ラフォラ病、レット症候群、肝レンズ核変性症、レッシュ－ナイハン症候群、およびウンフェルリヒト－ルントボルク症候群が含まれるが、それらに限定されない）、認知症（ピック病、および脊髄小脳失調症が含まれるが、それらに限定されない）が挙げられるが、それらに限定されない。
用語「炎症性障害」および「免疫障害」は、異常な免疫機構および／または異常なサイトカインシグナル伝達によって引き起こされた障害を指し、または説明する。炎症性障害
および免疫性障害の例として、自己免疫疾患、免疫不全症候群、および過敏症が挙げられるが、それらに限定されない。「自己免疫疾患」は、本明細書では個体自体の組織から生じ、その組織に向かう、非悪性の疾患または障害である。自己免疫疾患は、本明細書では、悪性またはがん性疾患または状態を特に排除し、特にＢ細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリーセル白血病および慢性骨髄芽球性白血病を排除する。自己免疫疾患または障害の例として、炎症応答、例えば乾癬および皮膚炎（例えばアトピー性皮膚炎）を含む炎症性皮膚疾患；全身性強皮症および硬化症；炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）と関連する応答；呼吸促迫症候群（成人呼吸窮迫症候群；ＡＲＤＳを含む）；皮膚炎；髄膜炎；脳炎；ぶどう膜炎；大腸炎；糸球体腎炎；アレルギー状態、例えば湿疹および喘息、ならびにＴ細胞の浸潤および慢性炎症応答を伴う他の状態；アテローム性動脈硬化症；白血球接着不全；関節リウマチ；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）（ループス腎炎、皮膚狼瘡が含まれるが、それらに限定されない）；真性糖尿病（例えばＩ型真性糖尿病またはインスリン依存性真性糖尿病）；多発性硬化症；レイノー症候群；自己免疫性甲状腺炎；橋本甲状腺炎；アレルギー性脳脊髄炎；シェーグレン症候群；若年発症型糖尿病；ならびに典型的に結核、サルコイドーシス、多発性筋炎、肉芽腫症および血管炎に見出される、サイトカインおよびＴ－リンパ球によって媒介される急性および遅延型過敏症と関連する免疫応答；悪性貧血（アジソン病）；白血球血管外漏出を伴う疾患；中枢神経系（ＣＮＳ）炎症性障害；多臓器傷害症候群；溶血性貧血（クリオグロブリン血症（ｃｒｙｏｇｌｏｂｉｎｅｍｉａ）またはクームス陽性貧血が含まれるが、それらに限定されない）；重症筋無力症；抗原－抗体複合体によって媒介される疾患；抗糸球体基底膜抗体病（ａｎｔｉ－ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ ｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ）；抗リン脂質症候群；アレルギー性神経炎；グレーブス病；ランバート－イートン筋無力症候群；水疱性類天疱瘡；天疱瘡；自己免疫性多発性内分泌腺症；ライター病；全身硬直症候群；ベーチェット病；巨細胞性動脈炎；免疫複合体腎炎；ＩｇＡ腎症；ＩｇＭ多発ニューロパチー；免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）または自己免疫性血小板減少症等が挙げられるが、それらに限定されない。
免疫不全症候群の例として、毛細血管拡張性運動失調症、白血球接着不全症候群、リンパ球減少症、異常ガンマグロブリン血症、ＨＩＶまたはデルタレトロウイルス感染症、分類不能免疫不全症、重症複合免疫不全症、貪食殺菌機能障害、無ガンマグロブリン血症、ディジョージ症候群、およびウィスコット－アルドリッチ症候群が挙げられるが、それらに限定されない。過敏症の例として、アレルギー、喘息、皮膚炎、蕁麻疹、アナフィラキシー、ヴィスラー症候群、および血小板減少性紫斑病が挙げられるが、それらに限定されない。
本明細書で使用される「処置」とは、処置される個体または細胞の自然経過を改変しようとする試みにおける臨床的介入を指し、予防のために、または臨床病理の経過中に実施することができる。処置の望ましい効果は、疾患の発症または再発の防止、症状の緩和、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的帰結の減殺、炎症および／または組織／器官損傷の防止または低減、疾患の進行速度の低減、疾患状態の回復または軽減、および寛解または予後の改善を含む。一部の実施形態では、本発明の抗体を使用して、疾患または障害の発症を遅延させる。
「個体」または「対象」は、脊椎動物である。ある特定の実施形態では、脊椎動物は、哺乳動物である。哺乳動物は、農場動物（ウシなど）、競技動物、ペット（ネコ、イヌ、およびウマなど）、霊長動物、マウス、およびラットを含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、脊椎動物は、ヒトである。
処置を目的とする「哺乳動物」とは、ヒト、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなど、飼育動物お
よび農場動物、ならびに動物園の動物、競技動物、またはペット動物を含む、哺乳動物として分類される任意の動物を指す。ある特定の実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。
「有効量」とは、所望の治療的結果または予防的結果を達成するための、投与量において、かつ必要な時間にわたる、有効な量を指す。
本発明の物質／分子の「治療有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する物質／分子の能力などの因子に従い変化しうる。治療有効量はまた、物質／分子の任意の毒性効果または有害効果を、治療的に有益な効果が凌駕するときの量でもある。「予防有効量」とは、所望の予防的結果を達成するための、投与量において、かつ必要な時間にわたる、有効な量を指す。予防用量は、対象において、疾患の発症の前またはその早期に使用されるので、予防有効量は、治療有効量未満となることが典型的であろうが、必ずしもそうではない。
本明細書で使用される「細胞傷害剤」という用語は、細胞の機能を阻害もしくは防止し、かつ／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。用語は、放射性同位元素（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、およびＬｕの放射性同位元素）、化学療法剤（例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロランブシル、ダウノルビシン、または他の挿入剤、核酸分解酵素などの酵素およびその断片、抗生剤、ならびに細菌由来、真菌由来、植物由来、または動物由来の低分子毒素または酵素的に活性な毒素などの毒素であって、それらの断片および／または改変体を含む毒素、ならびに下記で開示される多様な抗腫瘍剤または抗がん剤を含むことを意図する。他の細胞傷害剤については、下記に記載する。殺腫瘍剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
「化学療法剤」とは、がんの処置において有用な化学化合物である。化学療法剤の例は、チオテパおよびシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）であるＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファンなどのアルキルスルホネート；ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、およびウレドーパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド（ｔｒｉｅｔｈｉｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、およびトリメチロールメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含めたエチレンイミンおよびメチルメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）；アセトゲニン（とりわけ、ブラタシンおよびブラタシノン（ｂｕｌｌａｔａｃｉｎｏｎｅ））；デルタ－９－テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；ベータ－ラパコン（ｌａｐａｃｈｏｎｅ）；ラパコール（ｌａｐａｃｈｏｌ）；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成類似体であるトポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ－１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレチン（ｓｃｏｐｏｌｅｃｔｉｎ）、および９－アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ－１０６５（そのアドゼレシン合成類似体、カルゼレシン合成類似体、およびビゼレシン合成類似体を含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体である、ＫＷ－２１８９およびＣＢ１－ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンジスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）；クロランブシル、クロルナファジン（ｃｈｌｏｍａｐｈａｚｉｎｅ）、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンビキン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファ
ミド、ウラシルマスタードなどの窒素マスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ）などのニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａｓ）；エンジイン抗生剤（例えば、カリケアマイシン、とりわけ、カリケアマイシンガンマ１ＩおよびカリケアマイシンオメガＩ１（例えば、Ａｇｎｅｗ、Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔｌ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ．、３３巻：１８３～１８６頁（１９９４年）を参照されたい）；ジネミシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）Ａを含むジネミシン；エスペラミシン；ならびにネオカルチノスタチン発色団、および関連の色素タンパク質である、エンジイン抗生剤（ａｎｔｉｏｂｉｏｔｉｃ）発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシンであるＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）（モルホリノ－ドキソルビシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、２－ピロリノ－ドキソルビシン、およびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生剤；メトトレキセートおよび５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）などの代謝拮抗剤；デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤（ａｎｔｉ－ａｄｒｅｎａｌ）；フォリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキセート；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン；ジアジクオン；エフロルニチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；メイタンシンおよびアンサミトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎ）などのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラクリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ．）；ラゾキサン；リゾキシン（ｒｈｉｚｏｘｉｎ）；シゾフラン（ｓｉｚｏｆｕｒａｎ）；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（とりわけ、Ｔ－２毒素、ベルカリンＡ（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ Ａ）、ロリジンＡ（ｒｏｒｉｄｉｎ Ａ）、およびアングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ））；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセルであるＴＡＸＯＬ（登録商標）（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、パクリタキセルのＣｒｅｍｏｐｈｏｒ非含有アルブミン操作ナノ粒子製剤であるＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ、Ｉｌｌ．）、およびドセタキセル（ｄｏｘｅｔａｘｅｌ）であるＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）（Ｒｈｏｎｅ－Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）；クロラ
ンブシル；ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；オキサリプラチン；ロイコボリン（ｌｅｕｃｏｖｏｖｉｎ）；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ノバントロン；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤であるＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））；上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体；ならびにシクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾロンによる組み合わせ療法の略号であるＣＨＯＰ、ならびにオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））を５－ＦＵおよびロイコボリンと組み合わせた処置レジメンの略号であるＦＯＬＦＯＸなど、上記のうちの２つまたはそれ超の組み合わせを含む。
この定義には、がんの成長を促進し得るホルモンの作用を制御し、低減し、遮断し、または阻害するように作用し、しばしば全身性または全身処置の形態である抗ホルモン剤も含まれる。抗ホルモン剤は、ホルモン自体であってよい。抗エストロゲン薬および選択的エストロゲン受容体調節因子（ＳＥＲＭ）の例として、例えばタモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェンを含む）、ＥＶＩＳＴＡ（登録商標）ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン（ｔｒｉｏｘｉｆｅｎｅ）、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）トレミフェン；抗プロゲステロン；エストロゲン受容体下方制御因子（ＥＲＤ）；卵巣を抑制または活動停止させるように機能する薬剤、例えば黄体ホルモン（ｌｅｕｔｉｎｉｚｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト、例えばＬＵＰＲＯＮ（登録商標）およびＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標）酢酸ロイプロリド、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリンおよびトリプトレリン（ｔｒｉｐｔｅｒｅｌｉｎ）；他の抗アンドロゲン薬、例えばフルタミド、ニルタミドおよびビカルタミド；ならびに副腎におけるエストロゲン産生を制御する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば４（５）－イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）酢酸メゲストロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）エキセメスタン、ホルメスタン（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｉｅ）、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）レトロゾール、およびＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）アナストロゾールなどが挙げられる。さらに、このような化学療法剤の定義には、ビスホスフォネート、例えばクロドロネート（例えば、ＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）またはＯＳＴＡＣ（登録商標））、ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標）エチドロネート、ＮＥ－５８０９５、ＺＯＭＥＴＡ（登録商標）ゾレドロン酸／ゾレドロネート、ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標）アレンドロネート、ＡＲＥＤＩＡ（登録商標）パミドロネート、ＳＫＥＬＩＤ（登録商標）チルドロネート、またはＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標）リセドロネート；ならびにトロキサシタビン（１，３－ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常な細胞増殖に関与するシグナル伝達経路における遺伝子発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ－アルファ、Ｒａｆ、Ｈ－Ｒａｓ、および上皮成長因子受容体（ＥＧＦ－Ｒ）など；ワクチン、例えばＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチンおよび遺伝子治療ワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、およびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；二トシル酸ラパチニブ（ＧＷ５７２０１６としても公知の、ＥｒｂＢ－２およびＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ小分子阻害剤）；ならびにそれらのいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が含まれる。
そうでないと定義されない限りにおいて、本明細書で使用される全ての技術用語および
科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で記載される方法および材料と類似または同等な任意の方法および材料が、本発明の実施および検査において使用されうるが、好ましい方法および材料が本明細書に記載される。本明細書中で具体的に言及される全ての刊行物および特許は、本発明に関連して使用されうる刊行物中で報告されている化学物質、細胞株、ベクター、動物、機器、統計解析および方法論を記載および開示することを含む全ての目的のために、参照により組み込まれる。本明細書中で引用される全ての参考文献は、当該分野の技量レベルを示すものと解釈すべきである。先行発明を理由として、本発明がそのような開示に先行する資格がないことの承認として解釈すべきものは、本明細書中には存在しない。
より最近になって、Ｗｏｎｇら２５は、ワクチンの免疫原性の改善を試み、彼らの研究チームは、糖質の還元末端または非還元末端のいずれかに修飾を含有する様々なＧＨ誘導体を合成し、還元末端におけるフルオロ、アジドもしくはフェニル基、または非還元末端におけるアジド基で修飾したＧＨを含有するワクチンが、ＧＨ、ＳＳＥＡ３、およびＳＳＥＡ４を標的化する抗体の産生を刺激することができ、後者のワクチンが、抗がんワクチンにおいて通常達成されない特に好ましい高い比のＩｇＧ：ＩｇＭ抗体を誘発することを見出した。心強いことに、これらのワクチンに応答して産生された抗体は、培養したＧＨ陽性ヒト乳がん細胞に対する補体依存性細胞傷害を媒介した。
本開示は、ステージ特異的胚抗原（ＳＳＥＡ３およびＳＳＥＡ４）を、ある特定の基で修飾すると、それぞれＳＳＥＡ３およびＳＳＥＡ４を特異的に認識する堅固なＩｇＧ抗体応答が誘発されたという驚くべき発見に基づく。
いくつかの例では、ＳＳＥＡ－３の修飾は、ＳＳＥＡ－３のグルコースの１つまたは複数の位置にフルオロ、アジドまたはＯ－フェニル基を含む。いくつかの例では、ＳＳＥＡ－３の修飾は、非還元末端のガラクトースの１つまたは複数の位置にフルオロ、アジドまたはＯ－フェニル基を含む。いくつかの例では、ＳＳＥＡ－４の修飾は、ＳＳＥＡ－４のグルコースの１つまたは複数の位置にフルオロ、アジドまたはＯ－フェニル基を含む。いくつかの例では、ＳＳＥＡ－４の修飾は、シアル酸残基の１つまたは複数の位置にフルオロ、アジドまたはＯ－フェニル基を含む。
本明細書では、還元および／または非還元末端において修飾を有するＳＳＥＡ３誘導体およびＳＳＥＡ４誘導体が記載される。このようなＳＳＥＡ３誘導体およびＳＳＥＡ４誘導体は、天然のＳＳＥＡ３およびＳＳＥＡ４と比較して、より強力な免疫応答を誘発し得る（例えば、ＳＳＥＡ３および／またはＳＳＥＡ４に対するＩｇＧ抗体の誘導）。このような非天然グリカン部分を含む免疫原性組成物によって誘導された抗体は、腫瘍細胞に対する補体依存性細胞傷害を媒介することができる。
化合物
したがって、本発明はまた、修飾された糖鎖抗原（ＳＳＥＡ３およびＳＳＥＡ４）からなる新規な化合物、このような化合物を含むグリカンコンジュゲート、ならびにそれらの免疫原性組成物およびワクチンを特徴とする。
一態様では、本発明は、式（Ｉ）：
の化合物、またはその塩を提供し、式中、
Ｘ１は、－ＯＲまたは－ＳＲであり、Ｒは、水素、酸素もしくは硫黄保護基、任意選択で置換されているＣ１～１０アルキル、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているアシル、または任意選択で置換されているイミドイルであり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＬの各事例は独立に、水素、ハロゲン、任意選択で置換されているアルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、任意選択で置換されているアリール、－Ｎ３、－ＮＯ２、－Ｎ（ＲＢ）２、－Ｎ（ＲＡ）Ｃ（Ｏ）ＲＡ、－ＯＲＡ、－ＯＣ（Ｏ）ＲＡ、－ＳＲＡ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）ＲＡ、－Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ、－Ｓ（Ｏ）ＲＡ、－ＳＯ２ＲＡ、－ＳＯ２Ｎ（ＲＢ）２、および－ＮＨＳＯ２ＲＢから選択され、
ＲＡの各事例は独立に、水素、任意選択で置換されているアルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、および任意選択で置換されているアリールから選択され、
ＲＢの各事例は独立に、水素、任意選択で置換されているアルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、および任意選択で置換されているアリールから選択され、
ただし化合物は、次式：
のものではないことを条件とする。
ある特定の実施形態では、Ｘ１は、アルファ立体配置である。ある特定の実施形態では、Ｘ１は、ベータ立体配置である。
一部の実施形態では、Ｘ１は、－ＯＲＡである。一部の実施形態では、Ｘ１は、－ＯＨである。一部の実施形態では、Ｘ１は、－Ｏ（保護基）である。一部の実施形態では、Ｘ１は－ＯＲＡであり、ここで、ＲＡは、非置換Ｃ１－１０アルキルである。一部の実施形態では、Ｘ１は－ＯＲＡであり、ここで、ＲＡは、置換されているＣ１－１０アルキルである。一部の実施形態では、Ｘ１は－ＯＲＡであり、ここで、ＲＡは、非置換アリールである。一部の実施形態では、Ｘ１は－ＯＲＡであり、ここで、ＲＡは、置換されているアリールである。一部の実施形態では、Ｘ１は－ＯＲＡであり、ここで、ＲＡは、非置換アシルである。一部の実施形態では、Ｘ１は－ＯＲＡであり、ここで、ＲＡは、置換されているアシルである。一部の実施形態では、Ｘ１は－ＯＲＡであり、ここで、ＲＡは、非置
換イミドイルである。一部の実施形態では、Ｘ１は－ＯＲＡであり、ここで、ＲＡは、置換されているイミドイルである。
一部の実施形態では、Ｘ１は、－ＳＲＡである。一部の実施形態では、Ｘ１は、－ＳＨである。一部の実施形態では、Ｘ１は、－Ｓ（保護基）である。一部の実施形態では、Ｘ１は－ＳＲＡであり、ここで、ＲＡは、非置換Ｃ１－１０アルキルである。一部の実施形態では、Ｘ１は－ＳＲＡであり、ここで、ＲＡは、置換されているＣ１－１０アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｘ１は、－ＳＣＨ３である。一部の実施形態では、Ｘ１は－ＳＲＡであり、ここで、ＲＡは、非置換アリールである。一部の実施形態では、Ｘ１は－ＳＲＡであり、ここで、ＲＡは、置換されているアリールである。一部の実施形態では、Ｘ１は－ＳＲＡであり、ここで、ＲＡは、非置換アシルである。一部の実施形態では、Ｘ１は－ＳＲＡであり、ここで、ＲＡは、置換されているアシルである。一部の実施形態では、Ｘ１は－ＳＲＡであり、ここで、ＲＡは、非置換イミドイルである。一部の実施形態では、Ｘ１は－ＳＲＡであり、ここで、ＲＡは、置換されているイミドイルである。
一部の実施形態では、Ｘ１は、Ｃ１－１０アルコキシである。一部の実施形態では、Ｘ１は、Ｃ１－３アルコキシである。ある特定の実施形態では、Ｘ１は、メトキシである。ある特定の実施形態では、Ｘ１は、アルファ－メトキシである。
一部の実施形態では、Ｘ１は、アルファ－チオメチル、ベータ－チオメチル、アルファ－チオクレシル、ベータ－チオクレシル、アルファ－ｔ－ブチルジフェニルシリルオキシ、ベータ－ｔ－ブチルジフェニルシリルオキシおよびアルファ－メトキシからなる群から選択される。
一部の実施形態では、Ｒ１は－Ｎ３または－Ｎ（ＲＷ）２であり、ここで、各ＲＷは、独立に、水素または窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、－Ｎ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ１は－Ｎ（ＲＷ）２であり、ここで、各ＲＷは、独立に、水素または窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、－ＮＨ２である。ある特定の実施形態では、Ｒ１は－ＮＨＲＷであり、ここで、ＲＷは、窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ１は－Ｎ（ＲＷ）２であり、ここで、各ＲＷは、窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、－Ｎ３、－ＮＨ（Ｃｂｚ）、－ＮＨ（Ｂｏｃ）、－ＮＨ（Ｆｍｏｃ）、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＣｌ３、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３、および－Ｎ（Ｃ（Ｏ）ＣＨ３）２からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、－ＮＨ（Ｃｂｚ）である。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、－ＮＨ（Ｆｍｏｃ）である。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＣｌ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、－Ｎ（Ｃ（Ｏ）ＣＨ３）２である。
一部の実施形態では、Ｒ２は－Ｎ３または－Ｎ（ＲＷ）２であり、ここで、各ＲＷは、独立に、水素または窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、－Ｎ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ２は－Ｎ（ＲＷ）２であり、ここで、各ＲＷは、独立に、水素または窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、－ＮＨ２である。ある特定の実施形態では、Ｒ２は－ＮＨＲＷであり、ここで、ＲＷは、窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ２は－Ｎ（ＲＷ）２であり、ここで、各ＲＷは、窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、－Ｎ３、－ＮＨ（Ｃｂｚ）、－ＮＨ（Ｂｏｃ）、－ＮＨ（Ｆｍｏｃ）、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＣｌ３、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３、および－Ｎ（Ｃ（Ｏ）ＣＨ３）２からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、－ＮＨ（Ｃｂｚ）である。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、－ＮＨ（Ｆｍｏｃ）である。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＣｌ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、－Ｎ（Ｃ
（Ｏ）ＣＨ３）２である。
一部の実施形態では、Ｒ３は－Ｎ３または－Ｎ（ＲＷ）２であり、ここで、各ＲＷは、独立に、水素または窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ３は、－Ｎ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ３は－Ｎ（ＲＷ）２であり、ここで、各ＲＷは、独立に、水素または窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ３は、－ＮＨ２である。ある特定の実施形態では、Ｒ３は－ＮＨＲＷであり、ここで、ＲＷは、窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ３は－Ｎ（ＲＷ）２であり、ここで、各ＲＷは、窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ３は、－Ｎ３、－ＮＨ（Ｃｂｚ）、－ＮＨ（Ｂｏｃ）、－ＮＨ（Ｆｍｏｃ）、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＣｌ３、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３、および－Ｎ（Ｃ（Ｏ）ＣＨ３）２からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、Ｒ３は、－ＮＨ（Ｃｂｚ）である。ある特定の実施形態では、Ｒ３は、－ＮＨ（Ｆｍｏｃ）である。ある特定の実施形態では、Ｒ３は、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＣｌ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ３は、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ３は、－Ｎ（Ｃ（Ｏ）ＣＨ３）２である。
一部の実施形態では、Ｒ４は－Ｎ３または－Ｎ（ＲＷ）２であり、ここで、各ＲＷは、独立に、水素または窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ４は、－Ｎ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ４は－Ｎ（ＲＷ）２であり、ここで、各ＲＷは、独立に、水素または窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ４は、－ＮＨ２である。ある特定の実施形態では、Ｒ４は－ＮＨＲＷであり、ここで、ＲＷは、窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ４は－Ｎ（ＲＷ）２であり、ここで、各ＲＷは、窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ４は、－Ｎ３、－ＮＨ（Ｃｂｚ）、－ＮＨ（Ｂｏｃ）、－ＮＨ（Ｆｍｏｃ）、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＣｌ３、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３、および－Ｎ（Ｃ（Ｏ）ＣＨ３）２からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、Ｒ４は、－ＮＨ（Ｃｂｚ）である。ある特定の実施形態では、Ｒ４は、－ＮＨ（Ｆｍｏｃ）である。ある特定の実施形態では、Ｒ４は、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＣｌ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ４は、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ４は、－Ｎ（Ｃ（Ｏ）ＣＨ３）２である。
一部の実施形態では、Ｒ５は－Ｎ３または－Ｎ（ＲＷ）２であり、ここで、各ＲＷは、独立に、水素または窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ５は、－Ｎ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ５は－Ｎ（ＲＷ）２であり、ここで、各ＲＷは、独立に、水素または窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ５は、－ＮＨ２である。ある特定の実施形態では、Ｒ５は－ＮＨＲＷであり、ここで、ＲＷは、窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ５は－Ｎ（ＲＷ）２であり、ここで、各ＲＷは、窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ５は、－Ｎ３、－ＮＨ（Ｃｂｚ）、－ＮＨ（Ｂｏｃ）、－ＮＨ（Ｆｍｏｃ）、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＣｌ３、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３、および－Ｎ（Ｃ（Ｏ）ＣＨ３）２からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、Ｒ５は、－ＮＨ（Ｃｂｚ）である。ある特定の実施形態では、Ｒ５は、－ＮＨ（Ｆｍｏｃ）である。ある特定の実施形態では、Ｒ５は、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＣｌ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ５は、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ５は、－Ｎ（Ｃ（Ｏ）ＣＨ３）２である。
一部の実施形態では、Ｒ６は－Ｎ３または－Ｎ（ＲＷ）２であり、ここで、各ＲＷは、独立に、水素または窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ６は、－Ｎ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ６は－Ｎ（ＲＷ）２であり、ここで、各ＲＷは、独立に、水素または窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ６は、－ＮＨ２である。ある特定の実施形態では、Ｒ６は－ＮＨＲＷであり、ここで、ＲＷは、窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ６は－Ｎ（ＲＷ）２であり、ここで、各ＲＷは、窒素保護基で
ある。ある特定の実施形態では、Ｒ６は、－Ｎ３、－ＮＨ（Ｃｂｚ）、－ＮＨ（Ｂｏｃ）、－ＮＨ（Ｆｍｏｃ）、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＣｌ３、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３、および－Ｎ（Ｃ（Ｏ）ＣＨ３）２からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、Ｒ６は、－ＮＨ（Ｃｂｚ）である。ある特定の実施形態では、Ｒ６は、－ＮＨ（Ｆｍｏｃ）である。ある特定の実施形態では、Ｒ６は、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＣｌ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ６は、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ６は、－Ｎ（Ｃ（Ｏ）ＣＨ３）２である。
一部の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は同じである。一部の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は－ＯＨである。一部の実施形態では、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６同じである。一部の実施形態では、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は－ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｌは、－ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｌは、－ＯＨであり、Ｒ１は－Ｎ３である。ある特定の実施形態では、Ｌは－ＯＨであり、Ｒ１は－Ｎ３であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の各事例は、－ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｌは－ＯＨであり、Ｒ２は、－Ｎ３である。ある特定の実施形態では、Ｌは－ＯＨであり、Ｒ２は－Ｎ３、であり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の各事例は、－ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｌは－ＯＨであり、Ｒ３は、－Ｎ３である。ある特定の実施形態では、Ｌは－ＯＨであり、Ｒ３は－Ｎ３であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の各事例は、－ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｌは－ＯＨであり、Ｒ４は、－Ｎ３である。ある特定の実施形態では、Ｌは－ＯＨであり、Ｒ４は－Ｎ３であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６の各事例は、－ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｌは－ＯＨであり、Ｒ５は－Ｎ３である。ある特定の実施形態では、Ｌは－ＯＨであり、Ｒ５は－Ｎ３であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ６の各事例は、－ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｌは－ＯＨであり、Ｒ６は、－Ｎ３である。ある特定の実施形態では、Ｌは－ＯＨであり、Ｒ６は－Ｎ３であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の各事例は、－ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＬの各事例は、－Ｆである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、－Ｆである。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、－Ｆである。ある特定の実施形態では、Ｒ３は、－Ｆである。ある特定の実施形態では、Ｒ４は、－Ｆである。ある特定の実施形態では、Ｒ５は、－Ｆである。ある特定の実施形態では、Ｒ６は、－Ｆである。ある特定の実施形態では、Ｌは、－Ｆである。
ある特定の実施形態では、Ｌは、以下の構造である：
式中、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１の各事例は、独立に、水素、ハロゲン、任意選択で置換されているアルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、任意選択で置換されているアリール、－Ｎ３、－ＮＯ２、－Ｎ（ＲＢ）２、－Ｎ（ＲＡ）Ｃ（Ｏ）ＲＡ、－ＯＲＡ、－ＯＣ（Ｏ）ＲＡ、－ＳＲＡ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）ＲＡ、－Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ、－Ｓ（Ｏ）ＲＡ、－ＳＯ２ＲＡ、－ＳＯ２Ｎ（ＲＢ）２、および－ＮＨＳＯ２ＲＢから選択され；
ＲＮは、－Ｎ３、－ＮＯ２、－Ｎ（ＲＢ）２、－Ｎ（ＲＡ）Ｃ（Ｏ）ＲＡ、－ＯＲＡ、－ＯＣ（Ｏ）ＲＡ、－ＳＲＡ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）ＲＡ、－Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ、－Ｓ（Ｏ）ＲＡ、－ＳＯ２ＲＡ、－ＳＯ２Ｎ（ＲＢ）２、および－ＮＨＳＯ２ＲＢから選択され；
ＲＡの各事例は、独立に、水素、任意選択で置換されている
アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリルおよび任意選択で置換されているアリールから選択され；
ＲＢの各事例は、独立に、水素、任意選択で置換されているアルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、および任意選択で置換されているアリールから選択される。
一部の実施形態では、化合物は、式（ＩＩ）：
のものであり、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲＮおよびＸ１は、本明細書に記載の通りであり、
ただし化合物は、次式：
のものではないことを条件とする。
一部の実施形態では、Ｒ８は－Ｎ３または－Ｎ（ＲＷ）２であり、ここで、各ＲＷは、独立に、水素または窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ８は、－Ｎ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ８は－Ｎ（ＲＷ）２であり、ここで、各ＲＷは、独立に、水素または窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ８は、－ＮＨ２である。ある特定の実施形態では、Ｒ８は－ＮＨＲＷであり、ここで、ＲＷは、窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ８は－Ｎ（ＲＷ）２であり、ここで、各ＲＷは、窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ８は、－Ｎ３、－ＮＨ（Ｃｂｚ）、－ＮＨ（Ｂｏｃ）、－ＮＨ（Ｆｍｏｃ）、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＣｌ３、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３、および－Ｎ（Ｃ（Ｏ）ＣＨ３）２からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、Ｒ８は、－ＮＨ（Ｃｂｚ）である。ある特定の実施形態では、Ｒ８は、－ＮＨ（Ｆｍｏｃ）である。ある特定の実施形態では、Ｒ８は、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＣｌ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ８は、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ８は、－Ｎ（Ｃ（Ｏ）ＣＨ３）２である。
一部の実施形態では、Ｒ９は－Ｎ３または－Ｎ（ＲＷ）２であり、ここで、各ＲＷは、独立に、水素または窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ９は、－Ｎ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ９は－Ｎ（ＲＷ）２であり、ここで、各ＲＷは、独立に、水素または窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ９は、－ＮＨ２である。ある特定の実施形態では、Ｒ９は－ＮＨＲＷであり、ここで、ＲＷは、窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ９は－Ｎ（ＲＷ）２であり、ここで、各ＲＷは、窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ９は、－Ｎ３、－ＮＨ（Ｃｂｚ）、－ＮＨ（Ｂｏｃ）、－ＮＨ（Ｆｍｏｃ）、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＣｌ３、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３、および－Ｎ（Ｃ（Ｏ）ＣＨ３）２からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、Ｒ９は、－ＮＨ（Ｃｂｚ）である。ある特定の実施形態では、Ｒ９は、－ＮＨ（Ｆｍｏｃ）である。ある特定の実施形態では、Ｒ９は、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＣｌ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ９は、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ９は、－Ｎ（Ｃ（Ｏ）ＣＨ３）２である。
一部の実施形態では、Ｒ１０は－Ｎ３または－Ｎ（ＲＷ）２であり、ここで、各ＲＷは、独立に、水素または窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、－Ｎ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ１０は－Ｎ（ＲＷ）２であり、ここで、各ＲＷは、独立に、水素または窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、－ＮＨ２である。ある特定の実施形態では、Ｒ１０は－ＮＨＲＷであり、ここで、ＲＷは、窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ１０は－Ｎ（ＲＷ）２であり、ここで、各ＲＷは、窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、－Ｎ３、－ＮＨ（Ｃｂｚ）、－ＮＨ（Ｂｏｃ）、－ＮＨ（Ｆｍｏｃ）、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＣｌ３、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３、および－Ｎ（Ｃ（Ｏ）ＣＨ３）２からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、－ＮＨ（Ｃｂｚ）である。ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、－ＮＨ（Ｆｍｏｃ）である。ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＣｌ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ１０は、－Ｎ（Ｃ（Ｏ）ＣＨ３）２である。
一部の実施形態では、Ｒ１１は－Ｎ３または－Ｎ（ＲＷ）２であり、ここで、各ＲＷは、独立に、水素または窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、－Ｎ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ１１は－Ｎ（ＲＷ）２であり、ここで、各ＲＷは、独立に、水素または窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、－ＮＨ２である。ある特定の実施形態では、Ｒ１１は－ＮＨＲＷであり、ここで、ＲＷは、窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ１１は－Ｎ（ＲＷ）２であり、ここで、各ＲＷは、
窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、－Ｎ３、－ＮＨ（Ｃｂｚ）、－ＮＨ（Ｂｏｃ）、－ＮＨ（Ｆｍｏｃ）、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＣｌ３、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３およびＮ（Ｃ（Ｏ）ＣＨ３）２からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、－ＮＨ（Ｃｂｚ）である。ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、－ＮＨ（Ｆｍｏｃ）である。ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＣｌ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ１１は、－Ｎ（Ｃ（Ｏ）ＣＨ３）２である。
一部の実施形態では、Ｒ１２は－Ｎ３または－Ｎ（ＲＷ）２であり、ここで、各ＲＷは、独立に、水素または窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、－Ｎ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ１２は－Ｎ（ＲＷ）２であり、ここで、各ＲＷは、独立に、水素または窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、－ＮＨ２である。ある特定の実施形態では、Ｒ１２は－ＮＨＲＷであり、ここで、ＲＷは、窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ１２は－Ｎ（ＲＷ）２であり、ここで、各ＲＷは、窒素保護基である。ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、－Ｎ３、－ＮＨ（Ｃｂｚ）、－ＮＨ（Ｂｏｃ）、－ＮＨ（Ｆｍｏｃ）、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＣｌ３、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３、および－Ｎ（Ｃ（Ｏ）ＣＨ３）２からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、－ＮＨ（Ｃｂｚ）である。ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、－ＮＨ（Ｆｍｏｃ）である。ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＣｌ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ１２は、－Ｎ（Ｃ（Ｏ）ＣＨ３）２である。
一部の実施形態では、ＲＮは－Ｎ３または－Ｎ（ＲＷ）２であり、ここで、各ＲＷは、独立に、水素または窒素保護基である。ある特定の実施形態では、ＲＮは、－Ｎ３である。ある特定の実施形態では、ＲＮは－Ｎ（ＲＷ）２であり、ここで、各ＲＷは、独立に、水素または窒素保護基である。ある特定の実施形態では、ＲＮは、－ＮＨ２である。ある特定の実施形態では、ＲＮは－ＮＨＲＷであり、ここで、ＲＷは、窒素保護基である。ある特定の実施形態では、ＲＮは－Ｎ（ＲＷ）２であり、ここで、各ＲＷは、窒素保護基である。ある特定の実施形態では、ＲＮは、－Ｎ３、－ＮＨ（Ｃｂｚ）、－ＮＨ（Ｂｏｃ）、－ＮＨ（Ｆｍｏｃ）、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＣｌ３、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３、および－Ｎ（Ｃ（Ｏ）ＣＨ３）２からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ＲＮは、－ＮＨ（Ｃｂｚ）である。ある特定の実施形態では、ＲＮは、－ＮＨ（Ｆｍｏｃ）である。ある特定の実施形態では、ＲＮは、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＣｌ３である。ある特定の実施形態では、ＲＮは、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３である。ある特定の実施形態では、ＲＮは、－Ｎ（Ｃ（Ｏ）ＣＨ３）２である。
免疫原性組成物
別の態様では、本発明は、（ａ）担体および１つまたは複数のグリカンを含むグリカンコンジュゲート、ならびに任意選択で（ｂ）アジュバントを含む免疫原性組成物を提供し、
ここで１つまたは複数のグリカンのそれぞれは、リンカーを介して担体とコンジュゲートし、式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）：
を有し、式中、Ｘ１、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、ＬおよびＲＮは、本明細書に記載の通りである。
ある特定の実施形態では、リンカーは、ヘテロ二官能性またはホモ二官能性リンカーである。
ある特定の実施形態では、リンカーは、少なくとも１つの硫黄原子、カルボキシレート基、アミド基、カルバメート基、カーボネート基、チオカルバメート基、チオカーボネート基、チオエーテル基、スクシンアミド基、ｎ－ヒドロキシスクシンアミド基、またはそれらの任意の組合せを含む。
ある特定の実施形態では、リンカーは、－Ｌ１－Ｌ２－であり、Ｌ１は、結合、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＲＬ１ａ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＮＲＬ１ａＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲＬ１ａＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲＬ１ａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲＬ１ａ－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＮＲＬ１ａＣ（＝Ｓ）－、－Ｃ（＝Ｓ）ＮＲＬ１ａ－、ｔｒａｎｓ－ＣＲＬ１ｂ＝ＣＲＬ１ｂ－、ｃｉｓ－ＣＲＬ１ｂ＝ＣＲＬ１ｂ－、－Ｃ≡Ｃ－、－ＯＣ（ＲＬ１ｂ）２－、－Ｃ（ＲＬ１ｂ）２Ｏ－、－ＮＲＬ１ａＣ（ＲＬ１ｂ）２－、－Ｃ（ＲＬ１ｂ）２ＮＲＬ１ａ－、－ＳＣ（ＲＬ１ｂ）２－、－Ｃ（ＲＬ１ｂ）２Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｏ－、－ＯＳ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲＬ１ａ－、－ＮＲＬ１ａＳ（＝Ｏ）２－、または任意選択で置換されているＣ１～２０炭化水素鎖であり、任意選択で炭化水素鎖の１つまたは複数の炭素単位は、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＲＬ１ａ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、ＮＲＬ１ａＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲＬ１ａＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲＬ１ａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲＬ１ａ－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＮＲＬ１ａＣ（＝Ｓ）－、－Ｃ（＝Ｓ）ＮＲＬ１ａ－、ｔｒａｎｓ－ＣＲＬ１ｂ＝ＣＲＬ１ｂ－、ｃｉｓ－ＣＲＬ１ｂ＝ＣＲＬ１ｂ－、－Ｃ≡Ｃ－、－Ｓ（＝Ｏ）２Ｏ－、－ＯＳ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲＬ１ａ－、または－ＮＲＬ１ａＳ（＝Ｏ）２－で置き換えられており、ＲＬ１ａは、水素、任意選択で置換されているＣ１～６アルキル、もしくは窒素保護基であり、またはＲＬ１ａは、隣接する炭素原子と接合して、任意選択で置換されてい
る複素環を形成し、ＲＬ１ｂは、出現するごとに独立に、水素、ハロゲン、任意選択で置換されているＣ１～１０アルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、任意選択で置換されているカルボシクリル、任意選択で置換されているヘテロシクリル、任意選択で置換されているアリール、および任意選択で置換されているヘテロアリールからなる群より選択され、またはＲＬ１ｂは、隣接する炭素もしくは窒素もしくは酸素原子と接合して、任意選択で置換されている炭素環もしくは複素環を形成し、または２つのＲＬ１ｂ基は、接合して、任意選択で置換されている炭素環もしくは任意選択で置換されている複素環を形成し、Ｌ２は、担体およびＬ１を架橋することができる架橋試薬から導出された部分である。
担体は、タンパク質、脂質、脂肪分解された（ｌｉｐｏｌｉｚｅｄ）タンパク質、ウイルス、ペプチド、またはグリコペプチドのデンドリマーであり得る。ある特定の実施形態では、担体は、Ｔ細胞エピトープを含むペプチドである。
本発明で使用され得る担体タンパク質の例は、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、ジフテリア毒素交差反応性材料１９７（ＣＲＭ１９７）、ＴＴの断片Ｃ、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、タンパク質Ｄ、外膜タンパク質（ＯＭＰ）およびニューモリシン、ジフテリア毒素交差反応性材料１９７（ＣＲＭ１９７）または他のＤＴ点変異体、例えばＣＲＭ１７６、ＣＲＭ２２８、ＣＲＭ４５（Ｕｃｈｉｄａら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２１８巻；３８３８～３８４４頁、１９７３年）；ＣＲＭ９、ＣＲＭ４５、ＣＲＭ１０２、ＣＲＭ１０３およびＣＲＭ１０７、ならびに当技術分野で説明されている他の変異である。
ある特定の実施形態では、グリカンコンジュゲートは、式（ＩＶ－ａ）または（ＩＶ－ｂ）：
のものであり、式中、ｍは、両端を含み１～４０の整数である。
ある特定の実施形態では、ｍは、両端を含み１～３０の整数である。本明細書で一般に定義されている通り、ｍは、両端を含み１～２０の整数である。ある特定の実施形態では、ｍは、１である。ある特定の実施形態では、ｍは、２である。ある特定の実施形態では、ｍは、４である。ある特定の実施形態では、ｍは、６である。ある特定の実施形態では、ｍは、８である。ある特定の実施形態では、ｍは、１０である。ある特定の実施形態では、ｍは、１５である。ある特定の実施形態では、ｍは、２０である。ある特定の実施形態では、ｍは、３０である。ある特定の実施形態では、ｍは、４０である。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のグリカンコンジュゲートの少なくとも２つを含むグリカンコンジュゲート混合物を提供する。ある特定の実施形態では、グリカン混合物のｗの平均値は、約１．０～約４０．０である。ある特定の実施形態では、グリカン混合物のｗの平均値は、約１．０～１０．０である。ある特定の実施形態では、グリカン混合物のｗの平均値は、約５．７、４．９、２．９、２．８、または３．１である。ある特定の実施形態では、グリカン混合物のｗの平均値は、約４．９、２．９、２．８、または３．１である。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の免疫原性組成物は、免疫原性的に（ｉｍｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃａｌｌｙ）有効な量の本発明のグリカンコンジュゲートを含む。
本発明の化合物は、当技術分野で公知の、または本明細書に記載の手順を使用して合成することができる。米国特許出願第２０１４００５１１２７号も参照のこと。
本発明の免疫原性コンジュゲートは、同じまたは異なるＳＳＥＡ－３３誘導体および／またはＳＳＥＡ－４誘導体の１つまたは複数の分子（例えば１～４０個、１～２０個、１～２５個、１～３０個、５～２０個、５～２５個、５～３０個、または５～３５個）を含むことができる。グリカンコンジュゲートを生成する手順は、当技術分野で公知であり、以下に説明される。米国特許第８，２６８，９６９号も参照のこと。
ある特定の実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、１種または複数のアジュバントを含むことができる。適切なアジュバントは、当技術分野で公知である（例えば、Ｃ３４、７ＤＷ８－５、Ｃ１７、Ｃ２３、Ｇｌｕｃｏ－Ｃ３４、アルミニウム塩、スクアレン、ＭＦ５９、およびＱＳ－２１）。
本明細書で使用される用語「ミョウバン（ａｌｕｍ）アジュバント」は、免疫アジュバント活性を有するアルミニウム塩を指す。この薬剤は、溶液中でタンパク質抗原に吸着し、沈殿させる。得られた沈殿物は、接種部位において形成されたワクチンデポーからの抗原の徐放を容易にすることによって、ワクチン免疫原性を改善する。
本明細書で使用される用語「免疫アジュバント」は、免疫原に対する免疫応答を増強または改変する、免疫原と併用される物質を指す。本開示のα－ＧａｌＣｅｒ類似体は、ワクチンにより激しく応答するように、ワクチンを投与される患者の免疫系を刺激することによって、ワクチンの効果を改変または増強する免疫アジュバントとして使用される。例示的な実施では、類似体Ｃ３４は、アジュバントとして使用される。Ｃ３４および他のアルファ－ガラクトシルセラミド類似体の構造、ならびにアジュバントとしてのそれらの使用は、米国特許第７，９２８，０７７号に詳細に開示されている。
本明細書で使用される用語「糖脂質」は、細胞を認識するためのマーカーとして働く、糖質に付着した脂質を指す。
糖脂質Ｃ３４、Ｇｌｕｃｏ－Ｃ３４、Ｃ２３および７ＤＷ８－５は、以下の構造：
を有する。
免疫原性組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含むことができる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の免疫原性組成物は、薬学的に有効な量の本発明のグリカンコンジュゲートを含む。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の免疫原性組成物および薬学的に許容される賦形剤を含むがんワクチンを提供する。
本発明のがんワクチンは、単回用量または複数回用量の本発明のグリカンコンジュゲー
ト、それらのグリカンコンジュゲート混合物、またはそれらの免疫原性組成物を含み得る。提供されるがんワクチンは、がんを処置し、またはがんの危険性を低減するのに有用となり得る。がんワクチンはまた、対象または医療従事者のために使用または処方情報を説明するパッケージ情報を含み得る。このような情報は、米国食品医薬局（ＦＤＡ）などの規制当局によって必要とされる場合がある。またがんワクチンは、任意選択で、化合物または組成物を投与するためのデバイス、例えば非経口投与のためのシリンジを含むことができる。
医薬製剤
免疫組成物は、投与製剤と適合性の様式で、治療有効量、保護的量および免疫原性量で、投与される。投与される量は、例えば抗体を合成し、必要に応じて細胞媒介性の免疫応答をもたらす個体の免疫系の能力を含めて、処置される対象に応じて決まる。投与が必要な有効成分の正確な量は、実施者の判断に依存する。しかし、適切な投与量範囲は、当業者により容易に決定可能である。初回投与および追加免疫用量に適したレジメンもまた可変的であるが、その後の投与が後に続く初回投与を含みうる。ワクチンの投与量もまた、投与経路に依存しえ、宿主サイズにしたがって変動する。
また、本発明の免疫組成物を、動物において抗体を産生するために使用して、抗体を生成することができ、それらの抗体は、がんの処置および診断の両方に使用することができる。当技術分野では、動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、またはウマ）においてモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体ならびにこれらの断片を作製する方法が周知である。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８年）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。「抗体」という用語は、無傷の免疫グロブリン分子のほか、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖抗体）、およびｄＡｂ（ドメイン抗体；Ｗａｒｄら（１９８９年）、Ｎａｔｕｒｅ、３４１巻、５４４頁）など、これらの断片を含む。
本明細書で開示される組成物は、本開示を読んだ当業者に同定可能な、さらなる活性剤、担体、ビヒクル、賦形剤、または補助剤と併せて、医薬組成物中に含むことができる。
医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含むことが好ましい。このような医薬組成物中で、本明細書で開示される組成物は、「活性剤」とも称する「活性化合物」を形成する。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という表現は、医薬品の投与と適合性の、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。また、補助的な活性化合物も、組成物に組み込むことができる。医薬組成物は、その意図された投与経路と適合性となるように製剤化する。投与経路の例は、非経口投与、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、経口（例えば、吸入）投与、経皮（局所）投与、経粘膜投与、および直腸投与を含む。非経口適用、皮内適用、または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の構成要素：注射用水、食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒などの滅菌希釈液；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤；アセテート、シトレート、またはホスフェートなどの緩衝剤；および塩化ナトリウムまたはテキストロースなど、張度を調整するための薬剤を含みうる。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整することができる。非経口調製物は、アンプル内、使い捨て型のシリンジ内、またはガラス製もしくはプラスチック製の複数用量バイアル内に封入することができる。
臨床適用
本発明は、対象における増殖性疾患、例えば、がん（例えば、肺がん、大腸がん、膵臓がん、胆管がん、または子宮内膜がん）、良性新生物、または血管新生の処置のために有用なグリカンコンジュゲート、免疫原性組成物またはワクチンを提供する。
また、本明細書に記載の免疫原性組成物またはワクチンを、ヒトまたは動物において抗体を産生するために使用して、抗体を生成することができ、それらの抗体は、がんの処置および診断の両方に使用することができる。また、一部の実施形態では、本明細書に記載の免疫原性組成物またはワクチンを、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ－３および／またはＳＳＥＡ－４抗体を産生するために使用して、抗体を生成することができる。当技術分野では、ヒトおよび／または動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、またはウマ）においてモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体ならびにこれらの断片を作製する方法が周知である。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８年）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。「抗体」という用語は、無傷の免疫グロブリン分子のほか、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖抗体）、およびｄＡｂ（ドメイン抗体；Ｗａｒｄら（１９８９年）、Ｎａｔｕｒｅ、３４１巻、５４４頁）など、これらの断片を含む。
少なくとも１つの抗ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ抗体、または抗ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ抗体をコードする配列を含む、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む組成物が提供される。ある特定の実施形態では、組成物は、医薬組成物でありうる。本明細書で使用される、組成物は、１つもしくは複数のＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈに結合する１つもしくは複数の抗体、および／または１つもしくは複数のＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈに結合する１つもしくは複数の抗体をコードする配列を含む、１つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む。これらの組成物は、当技術分野で周知の緩衝剤を含む、薬学的に許容される賦形剤などの適切な担体もさらに含みうる。
単離抗体ならびにポリヌクレオチドもまた提供される。ある特定の実施形態では、単離抗体およびポリヌクレオチドは、実質的に純粋である。
一実施形態では、抗ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ抗体は、モノクローナル抗体である。別の実施形態では、抗ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ抗体の断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’－ＳＨ断片、およびＦ（ａｂ’）２断片）が提供される。これらの抗体断片は、酵素的消化など、従来の手段により創出することもでき、組換え技法により作り出すこともできる。このような抗体断片は、キメラ抗体断片、ヒト化抗体断片、またはヒト抗体断片の場合がある。これらの断片は、下記に示される診断目的および治療目的に有用である。
ファージディスプレイライブラリーを使用した抗ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ抗体の作製の例
当技術分野では、目的の抗体を得られうる、ファージディスプレイライブラリーを作り出すための様々な方法が公知である。目的の抗体を作り出す１つの方法は、Ｌｅｅら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．（２００４年）、３４０巻（５号）：１０７３～９３頁において記載されている、ファージ抗体ライブラリーの使用を介する。
本発明の抗ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ抗体は、コンビナトリアルライブラリーを使用して、１つまたは複数の所望の活性を伴う合成抗体クローンについてスクリーニングすることにより作製することができる。原則として、合成抗体クローンは、
ファージコートタンパク質に融合させた、抗体可変領域の多様な断片（Ｆｖ）をディスプレイするファージを含有するファージライブラリーをスクリーニングすることにより選択する。このようなファージライブラリーを、所望の抗原に対するアフィニティークロマトグラフィーによりパニングする。所望の抗原に結合することが可能なＦｖ断片を発現させるクローンを、抗原に吸着させ、これにより、ライブラリー内の非結合性クローンから分離する。次いで、結合性クローンを抗原から溶出させ、さらなる抗原吸着／溶出サイクルにより、さらに富化することができる。本発明の抗ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ抗体のいずれも、適切な抗原スクリーニング手順をデザインして、目的のファージクローンについて選択した後で、目的のファージクローンに由来するＦｖ配列と、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ第９１－３２４２号、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．（１９９１年）、１～３巻において記載されている、適切な定常領域（Ｆｃ）配列とを使用して、全長抗ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ抗体クローンを構築することにより得ることができる。
抗体の抗原結合性ドメインは、約１１０アミノ酸の２つの可変（Ｖ）領域であって、１つずつが軽（ＶＬ）鎖および重（ＶＨ）鎖に由来し、いずれもが、３つの超可変ループまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）を提示する、Ｖ領域から形成される。Ｗｉｎｔｅｒら、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２巻：４３３～４５５頁（１９９４年）において記載される通り、可変ドメインは、ＶＨとＶＬとが、短い可撓性ペプチドを介して共有結合的に連結された、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として、またはそれらの各々が、定常ドメインに融合し、非共有結合的に相互作用する、Ｆａｂ断片として、ファージ上に機能的にディスプレイされ得る。本明細書で使用される、ｓｃＦｖをコードするファージクローンおよびＦａｂをコードするファージクローンを、まとめて、「Ｆｖファージクローン」または「Ｆｖクローン」と称する。
ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により個別にクローニングし、ファージライブラリー内でランダムに組み換えることができ、次いで、これを、Ｗｉｎｔｅｒら、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２巻：４３３～４５５頁（１９９４年）において記載されている通り、抗原結合性クローンについて検索することができる。免疫化供給源に由来するライブラリーは、ハイブリドーマの構築を必要とせずに、免疫原に対する高アフィニティー抗体を提供する。代替的に、ナイーブレパートリーをクローニングして、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、ＥＭＢＯ Ｊ、１２巻：７２５～７３４頁（１９９３年）により記載される通り、免疫化を伴わずに、広範にわたる、非自己抗原に対するヒト抗体と、また自己抗原に対するヒト抗体とによる、単一の供給源を提供することもできる。最後に、ナイーブライブラリーはまた、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２２７巻：３８１～３８８頁（１９９２年）により記載されている通り、幹細胞に由来する、再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、高度に可変性のＣＤＲ３領域をコードするランダムな配列を含有するＰＣＲプライマーを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける再配列を達成することにより、合成で作製することもできる。
糸状ファージを、マイナーコートタンパク質ｐＩＩＩへの融合により抗体断片をディスプレイするのに使用する。抗体断片は、例えば、Ｍａｒｋｓら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２２２巻：５８１～５９７頁（１９９１年）により記載されている通り、ＶＨドメインとＶＬドメインとが、同じポリペプチド鎖上で、可撓性のポリペプチドスペーサーにより接続される、単鎖Ｆｖ断片として、または、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９巻：４１３３～４１３７頁（１９９１年）において記載されている通り、一方の鎖が、ｐＩＩＩに融合し、他方の鎖が、細菌宿主細胞ペリプラズムに分泌され、ここで、Ｆａｂ－コートタンパク質構造のアセンブリーが、野生型コ
ートタンパク質の一部を取り換えることにより、ファージ表面上にディスプレイされる、Ｆａｂ断片としてディスプレイすることができる。
一般に、抗体遺伝子断片をコードする核酸は、ヒトまたは動物から採取された免疫細胞から得られる。抗ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈクローンに好適なバイアスのかかったライブラリーが所望される場合、対象を、ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈで免疫化して、抗体応答を発生させ、脾臓細胞および／もしくは循環Ｂ細胞、または他の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、ライブラリー構築のために回収する。一実施形態では、抗ヒトＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈクローンに好適なバイアスのかかったヒト抗体遺伝子断片ライブラリーは、ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈによる免疫化から、ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈに対するヒト抗体を産生するＢ細胞がもたらされるように、機能的なヒト免疫グロブリン遺伝子アレイを保有する（かつ、機能的な内因性抗体産生系を欠く）トランスジェニックマウスにおいて、抗ヒトＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ抗体応答を発生させることにより得る。ヒト抗体産生トランスジェニックマウスの作製については、下記に記載する。
抗ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ反応性細胞集団についてのさらなる富化は、例えば、ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈアフィニティークロマトグラフィーによる細胞の分離、または蛍光色素標識されたＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈへの細胞の吸着に続く、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）による、ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ特異的抗体を発現させるＢ細胞を単離するのに適するスクリーニング手順を使用することにより得ることができる。
代替的に、非免疫化ドナーに由来する、脾臓細胞および／もしくはＢ細胞、または他のＰＢＬの使用から、可能な抗体レパートリーの、より良好な表示がもたらされ、また、ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈが抗原性でない任意の動物（ヒトまたは非ヒト）種を使用する、抗体ライブラリーの構築も可能となる。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける抗体遺伝子の構築を組み込むライブラリーのためには、幹細胞を対象から採取して、再配列されていない抗体遺伝子セグメントをコードする核酸を得る。目的の免疫細胞は、ヒト種、マウス種、ラット種、ウサギ目種、オオカミ科（ｌｕｐｒｉｎｅ）種、イヌ種、ネコ種、ブタ種、ウシ種、ウマ種、およびトリ種など、様々な動物種から得ることができる。
抗体可変遺伝子セグメント（ＶＨセグメントおよびＶＬセグメントを含む）をコードする核酸を、目的の細胞から回収し、増幅した。再配列されたＶＨ遺伝子ライブラリーおよびＶＬ遺伝子ライブラリーの場合、所望のＤＮＡは、Ｏｒｌａｎｄｉら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、８６巻：３８３３～３８３７頁（１９８９年）において記載される通り、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡを、リンパ球から単離した後で、再配列されたＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子の５’末端および３’末端にマッチするプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を施し、これにより、発現のための、多様なＶ遺伝子レパートリーを作製することにより得ることができる。Ｖ遺伝子は、Ｏｒｌａｎｄｉら（１９８９年）およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３４１巻：５４４～５４６頁（１９８９年）において記載されている通り、成熟Ｖドメインをコードするエクソンの５’末端におけるバックプライマーと、Ｊセグメントに基づくフォワードプライマーとにより、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡから増幅することができる。しかし、ｃＤＮＡから増幅するためには、バックプライマーはまた、Ｊｏｎｅｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、９巻：８８～８９頁（１９９１年）において記載されている通り、リーダーエクソン、およびＳａｓｔｒｙら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、８６巻：５７２８～５７３２頁（１９８９年）において記載されている通り、定常領域内のフォワードプライマーに基づく場合がある。相補性を最大化するため、Ｏｒｌａｎｄｉら（１９８９年）、またはＳａｓｔｒｙら（１９８９年）において記載されている通り、プライ
マー内に縮重を組み込むことができる。ある特定の実施形態では、例えば、Ｍａｒｋｓら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２２２巻：５８１～５９７頁（１９９１年）による方法において記載されている通り、またはＯｒｕｍら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２１巻：４４９１～４４９８頁（１９９３年）による方法において記載されている通り、免疫細胞の核酸試料中に存在する、全ての利用可能なＶＨ配置およびＶＬ配置を増幅するために、各Ｖ遺伝子ファミリーにターゲティングされたＰＣＲプライマーを使用することにより、ライブラリーの多様性を最大化する。増幅されたＤＮＡを、発現ベクターにクローニングするために、Ｏｒｌａｎｄｉら（１９８９年）において記載されている通り、まれな制限部位を、ＰＣＲプライマー内に、一方の端部におけるタグとして、または、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻：６２４～６２８頁（１９９１年）において記載されている通り、タグ付けされたプライマーを伴う、さらなるＰＣＲ増幅により導入することができる。
合成により再配列されたＶ遺伝子のレパートリーは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、Ｖ遺伝子セグメントから導出することができる。ヒトＶＨ遺伝子セグメントの大半は、クローニングおよびシークェンシングされ（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２２７巻：７７６～７９８頁（１９９２年）において報告されている）、マッピングされており（Ｍａｔｓｕｄａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．、３巻：８８～９４頁（１９９３年）において報告されている）；ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．
Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２２７巻：３８１～３８８頁（１９９２年）において記載されている通り、これらのクローニングされたセグメント（Ｈ１ループおよびＨ２ループの全ての主要なコンフォメーションを含む）を使用して、多様な配列および長さのＨ３ループをコードするＰＣＲプライマーにより、多様なＶＨ遺伝子レパートリーを作り出すことができる。また、Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８９巻：４４５７～４４６１頁（１９９２年）において記載される通り、単一の長さの長いＨ３ループに焦点を当てた、全ての配列多様性を伴うＶＨレパートリーを作製することもできる。ヒトＶκセグメントおよびＶλセグメントは、クローニングおよびシークェンシングされており（ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２３巻：１４５６～１４６１頁（１９９３年）において報告されている）、合成軽鎖レパートリーを作製するのに使用することができる。ＶＨおよびＶＬのフォールド（ｆｏｌｄ）の範囲、ならびにＬ３およびＨ３の長さに基づく、合成によるＶ遺伝子レパートリーは、大幅な構造的多様性を有する抗体をコードする。Ｖ遺伝子をコードするＤＮＡの増幅の後、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２２７巻：３８１～３８８頁（１９９２年）による方法に従い、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、生殖細胞系列のＶ遺伝子セグメントを再配列することができる。
抗体断片のレパートリーは、ＶＨ遺伝子レパートリーと、ＶＬ遺伝子レパートリーとを、いくつかの方式で一体に組み合わせることにより構築することができる。各レパートリーは、異なるベクター内で創出することができ、ベクターは、例えば、Ｈｏｇｒｅｆｅら、Ｇｅｎｅ、１２８巻：１１９～１２６頁（１９９３年）において記載されている通り、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、またはｉｎ ｖｉｖｏにおけるコンビナトリアル感染、例えば、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２１巻：２２６５～２２６６頁（１９９３年）において記載されているｌｏｘＰ系により組み換えることができる。ｉｎ ｖｉｖｏにおける組換え手法では、Ｆａｂ断片の２本鎖としての性質を利用して、Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換効率により付与される、ライブラリーサイズに対する制限を克服する。ナイーブＶＨレパートリーと、ナイーブＶＬレパートリーとは、一方はファージミドへ、他方はファージベクターに、個別にクローニングする。次いで、各細胞が、異なる組み合わせを含有し、ライブラリーサイズが、存在する細胞の数（クローン約１０１２個）だけにより制限されるように、２つのライブラリーを、ファージミド含有細菌へのファージ感染により組み合わせる。ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子が、単一のレプリコンに組み
換えられ、ファージビリオンに共パッケージングされるように、いずれのベクターも、ｉｎ ｖｉｖｏにおける組換えシグナルを含有する。これらの巨大ライブラリーは、アフィニティーの良好な（約１０－８ＭのＫｄ－１）多数の多様な抗体をもたらす。
代替的に、レパートリーは、例えば、Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８８巻：７９７８～７９８２頁（１９９１年）において記載されている通り、同じベクターに逐次的にクローニングする、または、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻：６２４～６２８頁（１９９１年）において記載されている通り、ＰＣＲにより一体にアセンブルし、次いで、クローニングすることができる。また、ＰＣＲアセンブリーも、ＶＨ ＤＮＡおよびＶＬ ＤＮＡを、可撓性のペプチドスペーサーをコードするＤＮＡと接合して、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）レパートリーを形成するのに使用することができる。さらに別の技法では、Ｅｍｂｌｅｔｏｎら、Ｎｕｃｌ．
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０巻：３８３１～３８３７頁（１９９２年）において記載されている通り、「インセルＰＣＲアセンブリー」を使用して、ＶＨ遺伝子とＶＬ遺伝子とを、リンパ球内で、ＰＣＲにより組み合わせ、次いで、連結された遺伝子のレパートリーをクローニングする。
ライブラリーのスクリーニングは、当技術分野で公知の任意の技法により達成することができる。例えば、ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ標的は、吸着プレートのウェルをコーティングし、吸着プレートに固定された宿主細胞上で発現させるのに使用することも、細胞分取で使用することも、ストレプトアビジンコーティングビーズによる捕捉のために、ビオチンにコンジュゲートさせることも、ファージディスプレイライブラリーをパニングするための当技術分野で公知の、他の任意の方法において使用することもできる。
ファージライブラリー試料は、ファージ粒子のうちの少なくとも一部分と吸着剤との結合に適する条件下で、固定化されたＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈと接触させる。通常、ｐＨ、イオン強度、温度などを含む条件は、生理学的条件を模倣するように選択する。固相に結合したファージは、洗浄し、次いで、例えば、Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８８巻：７９７８～７９８２頁（１９９１年）において記載されている通り、酸により、または、例えば、Ｍａｒｋｓら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２２２巻：５８１～５９７頁（１９９１年）において記載されている通り、アルカリにより、または、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻：６２４～６２８頁（１９９１年）による抗原競合法と類似の手順における、ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ抗原の競合により溶出させる。ファージは、単一のラウンドの選択で２０～１，０００倍に富化することができる。さらに、富化されたファージは、細菌培養物中で成長させ、さらなるラウンドの選択にかけることができる。
選択の効率は、洗浄時における解離動態、および単一のファージ上の複数の抗体断片が、抗原と同時に係合しうるのかどうかを含む多くの因子に依存する。解離動態が速く（かつ、結合アフィニティーが弱い）抗体は、短い洗浄、多価ファージディスプレイ、および固相内の抗原の高いコーティング密度を使用することにより保持することができる。高密度は、多価相互作用を介してファージを安定化させるだけでなく、解離したファージの再結合に好適でもある。解離動態が遅く（かつ、結合アフィニティーが良好な）抗体の選択は、Ｂａｓｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、８巻：３０９～３１４頁（１９９０年）およびＷＯ９２／０９６９０において記載されている通り、長い洗浄および一価ファージディスプレイ、ならびにＭａｒｋｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１０巻：７７９～７８３頁（１９９２年）において記載されている通り、抗原の低コーティング密度を使用することにより促進することができる。
ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈに対するアフィニティーがわずかに異なる場合でもなお、アフィニティーの異なるファージ抗体の間で選択することは可能である。しかし、選択された抗体のランダム変異（例えば、上で記載したアフィニティー成熟技法の一部において実施される）は、大半が抗原に結合し、少数はより高いアフィニティーを有する多くの変異体をもたらす可能性が高い。ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈを制限すると、まれに、高アフィニティーのファージも競合に耐えない可能性がある。全てのより高いアフィニティーの変異体を保持するため、ファージは、過剰なビオチン化ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈと共にインキュベートすることもできるが、ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈの標的モル濃度アフィニティー定数より低いモル濃度のビオチン化ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈと共にインキュベートすることもできる。次いで、高アフィニティー結合性ファージは、ストレプトアビジンコーティング常磁性ビーズにより捕捉することができる。このような「平衡捕捉」により、抗体を、それらの結合アフィニティーに従い、低アフィニティーの極過剰なファージから、アフィニティーの高さがわずか２倍の変異体クローンの単離を可能とする感度で選択することが可能となる。また、固相に結合したファージの洗浄で使用される条件も、解離動態に基づき弁別するように操作することができる。
抗ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈクローンは、活性が選択されたクローンでありうる。一実施形態では、本発明は、ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈリガンドと、ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈとの結合は遮断するが、ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈリガンドと、第２のタンパク質との結合は遮断しない、抗ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ抗体を提供する。このような抗ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ抗体に対応するＦｖクローンは、（１）抗ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈクローンを、上記のセクションＢ（Ｉ）（２）で記載した通りファージライブラリーから単離し、任意選択で、単離されたファージクローン集団を、適切な細菌宿主内で成長させることにより増幅し；（２）それぞれ遮断活性および非遮断活性が所望される、ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈおよび第２のタンパク質を選択し；（３）抗ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈファージクローンを、固定化されたＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈに吸着させ；（４）過剰な第２のタンパク質を使用して、第２のタンパク質の結合決定基と重複するかまたは共有される、ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ結合性決定基を認識する、任意の所望されないクローンを溶出させ；（５）ステップ（４）の後で吸着を維持したクローンを溶出させることにより選択することができる。任意選択で、本明細書で記載される選択手順を、１回または複数回繰り返すことにより、所望の遮断／非遮断特性を伴うクローンをさらに富化することもできる。
本発明のＦｖクローンをコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、ハイブリドーマまたはファージＤＮＡ鋳型から、重鎖および軽鎖の目的のコード領域を特異的に増幅するようにデザインされたオリゴヌクレオチドプライマーを使用することにより）、たやすく単離およびシークェンシングされる。単離されたら、ＤＮＡを、発現ベクター内に入れ、次いで、これを、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または別途免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞内の所望のモノクローナル抗体の合成を得ることができる。抗体コードＤＮＡの、細菌内の組換え発現についての総説論文は、Ｓｋｅｒｒａら、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５巻：２５６頁（１９９３年）およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖｓ、１３０巻：１５１頁（１９９２年）を含む。
本発明のＦｖクローンをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域および／または軽鎖定常領
域をコードする公知のＤＮＡ配列（例えば、適切なＤＮＡ配列は、Ｋａｂａｔら、前出から得ることができる）と組み合わせて、全長重鎖および／もしくは全長軽鎖または部分長重鎖および／もしくは部分長軽鎖をコードするクローンを形成することができる。ＩｇＧ定常領域、ＩｇＭ定常領域、ＩｇＡ定常領域、ＩｇＤ定常領域、およびＩｇＥ定常領域を含む、任意のアイソタイプの定常領域を、この目的のために使用することができ、このような定常領域を、任意のヒト種または動物種から取得し得ることを理解されたい。１つの動物（ヒトなど）種の可変ドメインＤＮＡから導出され、次いで、「ハイブリッド」の全長重鎖および／または全長軽鎖のためのコード配列を形成するように、別の動物種の定常領域ＤＮＡに融合させたＦｖクローンは、本明細書で使用される「キメラ」抗体および「ハイブリッド」抗体の定義に含まれる。一実施形態では、ヒト可変ＤＮＡから導出されたＦｖクローンを、ヒト定常領域ＤＮＡに融合させて、全てのヒト全長重鎖および／もしくはヒト全長軽鎖またはヒト部分長重鎖および／もしくはヒト部分長軽鎖のコード配列を形成する。
ナイーブライブラリーにより産生される抗体（天然または合成）は、中程度のアフィニティー（約１０６～１０７Ｍ－１のＫｄ－１）のものでありうるが、また、Ｗｉｎｔｅｒら（１９９４年）、前出において記載されている通り、アフィニティー成熟も、二次ライブラリーを構築し、ここから再選択することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏで模倣することができる。例えば、エラープローンポリメラーゼ（Ｌｅｕｎｇら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、１巻：１１～１５頁（１９８９年）において報告されている）を、Ｈａｗｋｉｎｓら、Ｊ．
Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２２６巻：８８９～８９６頁（１９９２年）による方法、またはＧｒａｍら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８９巻：３５７６～３５８０頁（１９９２年）による方法で使用することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ランダムに、変異を導入することができる。加えて、アフィニティー成熟は、例えば、目的のＣＤＲにわたり、ランダムな配列を保有するプライマーを伴うＰＣＲを、選択された個々のＦｖクローン内で使用して、１つまたは複数のＣＤＲをランダムに変異させ、より高いアフィニティーのクローンについてスクリーニングすることにより実施することもできる。ＷＯ９６０７７５４（１９９６年３月１４日公開）は、免疫グロブリン軽鎖の相補性決定領域内で変異誘発を誘導して、軽鎖遺伝子のライブラリーを創出するための方法について記載した。別の有効な手法は、Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１０巻：７７９～７８３頁（１９９２年）において記載されている通り、非免疫化ドナーから得られた天然に存在するＶドメイン改変体のレパートリーを伴うファージディスプレイにより選択されたＶＨドメインまたはＶＬドメインを組み換え、数回のラウンドにわたる鎖リシャフリングにより、より高いアフィニティーについてスクリーニングすることである。この技法は、アフィニティーが１０－９Ｍの範囲の抗体および抗体断片の作製を可能とする。
抗ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ抗体を作り出す他の方法
抗体のアフィニティーを生成し評価する他の方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）；米国特許第４，８１６，５６７号；Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９－１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６；Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７；Ｍｕｎｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）；Ｅｎｇｅｌｓら、Ａｇｎｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，２８：７１６－７３４（１９８９）；Ａｂｒａｈｍｓｅｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．，４：３９０１（１９８５）；Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．４４（１９７６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５（１９８４）において記載されている。
一般的な方法
一般に、本発明は、アフィニティー成熟させたＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ抗体を提供する。これらの抗体は、ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈに対するアフィニティーおよび特異性を増大させている。このアフィニティーおよび感受性の増大により、本発明の分子を、（ａ）本発明の分子の感受性の増大、および／または（ｂ）本発明の分子の、ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈへの緊密な結合により利益を得る適用および方法のために使用することが可能となる。
一実施形態では、ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ抗体は、１つまたは複数のＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ活性の部分的または全面的な遮断が所望される、ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ媒介性障害の処置に有用である。一実施形態では、本発明の抗ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ抗体を使用して、がんを処置する。
本発明の抗ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ抗体は、質量分析も遺伝子操作も必要とせずに、単純で慣用的な生体分子アッセイ、例えば、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ、または免疫顕微鏡法における、高感度で特異的なエピトープの検出を可能とする。これにより、これらの経路の正常な機能の観察および解明のいずれにおいても、ならびに経路の機能が異常な場合の検出にも、著明な利点がもたらされる。
本発明のＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ抗体はまた、疾患の発生および発症機序における役割を決定するのにも使用することができる。例えば、上で記載した通り、本発明のＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ抗体を使用して、１つまたは複数の疾患状態と相関しうるＴＡＣＡが通常一過性で発現するのかどうかを決定することができる。
本発明のＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ抗体を使用して、さらに、本発明の抗ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ抗体が特異的でない、ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈの正常な活性には干渉せずに、１つまたは複数のＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈの調節が異常であるか、または機能が異常である疾患を処置することができる。
別の態様では、本発明の抗ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ抗体は、多様な細胞型内および組織内のがん状態を検出するための試薬としても有用性を見出す。
さらに別の態様では、本抗ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ抗体は、活性遮断パターンが、本発明の対象の抗体の活性遮断パターンと類似する、ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈアンタゴニストを開発するのに有用である。例えば、本発明の抗ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ抗体を使用して、同じＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈへの結合特徴、および／またはＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ経路の遮断能を有する他の抗体を決定および同定することができる。
さらなる例として、本発明の抗ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ抗体を使用して、直鎖状エピトープおよびコンフォメーショナルエピトープを含む、本明細書で例示される抗体と実質的に同じ、ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈの抗原決定
基に結合する、他の抗ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ抗体を同定することができる。
本発明の抗ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ抗体を、ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈが関与する生理学的経路に基づくアッセイで使用して、１つまたは複数の結合パートナーの、ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈへの結合を遮断するのに、抗体と同様の薬理学的効果を呈示する、ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈの低分子アンタゴニストについてスクリーニングすることができる。
抗体の作製は、ハイブリドーマ技法、および結合剤分子についてのファージディスプレイライブラリーのスクリーニングなど、本明細書で記載される方法を含む当技術分野における日常的な技術を使用して達成することができる。当技術分野では、これらの方法が十分に確立されている。
略述すると、本発明の抗ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ抗体は、コンビナトリアルライブラリーを使用して、１つまたは複数の所望の活性を伴う合成抗体クローンについてスクリーニングすることにより作製することができる。原則として、合成抗体クローンは、ファージコートタンパク質に融合させた、抗体可変領域の多様な断片（Ｆｖ）をディスプレイするファージを含有するファージライブラリーをスクリーニングすることにより選択する。このようなファージライブラリーを、所望の抗原に対するアフィニティークロマトグラフィーによりパニングする。所望の抗原に結合することが可能なＦｖ断片を発現させるクローンを、抗原に吸着させ、これにより、ライブラリー内の非結合性クローンから分離する。次いで、結合性クローンを抗原から溶出させ、さらなる抗原吸着／溶出サイクルにより、さらに富化することができる。本発明の抗ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ抗体のうちのいずれかは、適切な抗原スクリーニング手順をデザインして、目的のファージクローンについて選択した後で、目的のファージクローンに由来するＦｖ配列と、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ第９１－３２４２号、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．（１９９１年）、１～３巻において記載されている、適切な定常領域（Ｆｃ）配列とを使用して、全長抗ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ抗体クローンを構築することにより得ることができる。
一実施形態では、本発明の抗ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ抗体は、モノクローナル抗体である。本発明の範囲内にはまた、本明細書で提供される抗ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ抗体の、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’－ＳＨ断片、およびＦ（ａｂ’）２断片、ならびにこれらの変化形などの抗体断片も包含される。これらの抗体断片は、酵素的消化など、従来の手段により創出することもでき、組換え技法により作り出すこともできる。このような抗体断片は、キメラ抗体断片、ヒト抗体断片、またはヒト化抗体断片でありうる。これらの断片は、本明細書で示される実験目的、診断目的、および治療目的に有用である。
モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体の集団から得ることができる、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在しうる、考えられる天然に存在する変異を除き同一である。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、個別の抗体の混合物ではないものとしての抗体の性格を指し示す。
本発明の抗ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５頁（１９７５年）により初めて記載されたハイブリドーマ法を含む当技術分野で公知の様々な方法を使用して作製することもでき、代替的に、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号）により作製する
こともできる。
ベクター、宿主細胞、および組換え法
本発明の抗体を組換えにより作製するには、本発明の抗体をコードする核酸を単離し、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために、複製可能なベクターに挿入する。抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）、たやすく単離およびシークェンシングされる。多くのベクターが、利用可能である。ベクターの選択は、使用される宿主細胞に部分的に依存する。宿主細胞は、原核生物由来の細胞または真核生物（一般に、哺乳動物）由来の細胞のいずれかを含むがこれらに限定されない。ＩｇＧ定常領域、ＩｇＭ定常領域、ＩｇＡ定常領域、ＩｇＤ定常領域、およびＩｇＥ定常領域を含む、任意のアイソタイプの定常領域を、この目的のために使用することができ、このような定常領域を、任意のヒト種または動物種から取得し得ることを理解されたい。
原核宿主細胞を使用する抗体の作製
ベクターの構築
本発明の抗体のポリペプチド構成要素をコードするポリヌクレオチド配列は、標準的な組換え技法を使用して得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列は、ハイブリドーマ細胞などの抗体産生細胞から単離およびシークェンシングすることができる。代替的に、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド合成器またはＰＣＲ技法を使用して合成することもできる。得られたら、ポリペプチドをコードする配列を、原核宿主内で異種ポリヌクレオチドを複製し、発現させることが可能な組換えベクターに挿入する。利用可能であり、当技術分野で公知の多くのベクターは、本発明の目的で使用することができる。適切なベクターの選択は、ベクターに挿入される核酸のサイズ、およびベクターで形質転換される特定の宿主細胞に主に依存する。各ベクターは、その機能（異種ポリヌクレオチドの増幅もしくは発現、またはこれらの両方）、およびそれが存在する特定の宿主細胞に対するその適合性に応じて、多様な構成要素を含有する。ベクターの構成要素は一般に、複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合性部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種核酸インサート、および転写終結配列を含むがこれらに限定されない。
一般に、宿主細胞に適合性の種に由来するレプリコンおよび制御配列を含有するプラスミドベクターは、これらの宿主と関連させて使用する。ベクターは通常、複製部位のほか、形質転換された細胞内の表現型による選択を提供することが可能なマーキング配列も保有する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉは、Ｅ．ｃｏｌｉ種に由来するプラスミドであるｐＢＲ３２２を使用して形質転換することが典型的である。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン（Ａｍｐ）耐性およびテトラサイクリン（Ｔｅｔ）耐性をコードする遺伝子を含有し、これにより、形質転換された細胞を同定するための容易な手段を提供する。ｐＢＲ３２２、その誘導体、または他の微生物性プラスミドもしくはバクテリオファージはまた、微生物が内因性タンパク質を発現させるために使用しうるプロモーターも含有しうるか、またはこれを含有するように修飾することができる。特定の抗体を発現させるために使用されるｐＢＲ３２２誘導体の例については、Ｃａｒｔｅｒら、米国特許第５，６４８，２３７号において詳細に記載されている。
加えて、宿主微生物に適合性のレプリコンおよび制御配列を含有するファージベクターも、形質転換ベクターとして、これらの宿主と関連させて使用することができる。例えば、λＧＥＭ（商標）１１などのバクテリオファージを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＥ３９２など、
易感染性の宿主細胞を形質転換するのに使用しうる組換えベクターの作製において活用することができる。
本発明の発現ベクターは、ポリペプチド構成要素の各々をコードする、２つまたはこれを超えるプロモーター－シストロン対を含みうる。プロモーターとは、シストロンに対して上流（５’）に位置する非翻訳の調節配列であって、その発現をモジュレートする。原核生物プロモーターは、誘導的プロモーターと構成的プロモーターとの２つのクラスに分けられることが典型的である。誘導的プロモーターとは、培養条件の変化、例えば、栄養物質の存在もしくは非存在、または温度の変化に応答して、シストロンの高レベルの転写をその制御下で開始するプロモーターである。
様々な潜在的宿主細胞により認識される多数のプロモーターが周知である。選択されたプロモーターは、制限酵素消化を介して、供給源ＤＮＡから取り出し、単離されたプロモーター配列を、本発明のベクターに挿入することにより、軽鎖または重鎖をコードするシストロンＤＮＡに作動可能に連結することができる。天然のプロモーター配列および多くの異種プロモーターの両方を使用して、標的遺伝子の増幅、および／または発現を誘導することができる。一部の実施形態では、異種プロモーターは一般に、天然の標的ポリペプチドのプロモーターと比較して、発現させる標的遺伝子の転写の増大および収量の上昇を可能とするので活用される。
原核宿主を伴う使用に適するプロモーターは、ＰｈｏＡプロモーター、β－ガラクタマーゼプロモーター系およびラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ならびにｔａｃプロモーターまたはｔｒｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターを含む。しかし、細菌内で機能的な他のプロモーター（他の公知の細菌プロモーターまたはファージプロモーターなど）も同様に適する。それらのヌクレオチド配列は公表されており、これにより、当業者が、リンカーまたはアダプターを使用して、それらを、標的軽鎖および標的重鎖をコードするシストロンに、作動可能にライゲーションして、必要とされる任意の制限部位を供給することが可能となる（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔら（１９８０年）、Ｃｅｌｌ、２０巻：２６９頁）。
本発明の一態様では、組換えベクター内の各シストロンは、発現させたポリペプチドの、膜を横切るトランスロケーションを誘導する、分泌シグナル配列構成要素を含む。一般に、シグナル配列は、ベクターの構成要素の場合もあり、ベクターに挿入された標的ポリペプチドＤＮＡの一部の場合もある。本発明の目的で選択されたシグナル配列は、宿主細胞により認識およびプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される）シグナル配列であるものとする。異種ポリペプチドにとって天然のシグナル配列を認識およびプロセシングしない原核宿主細胞のためには、シグナル配列を、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、およびＭＢＰからなる群より選択される、原核生物シグナル配列で置換する。本発明の一実施形態では、発現系のシストロンの両方で使用されるシグナル配列は、ＳＴＩＩシグナル配列またはその改変体である。
別の態様では、本発明に従う免疫グロブリンの産生は、宿主細胞の細胞質内で生じることが可能であり、したがって、各シストロン内の分泌シグナル配列の存在を必要としない。この点で、免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は、細胞質内で機能的免疫グロブリンを形成するように、発現され、フォールドされ、アセンブルされる。ある特定の宿主株（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ｔｒｘＢ株）は、ジスルフィド結合形成に好適な細胞質条件をもたらし、これにより、発現したタンパク質サブユニットの適正なフォールディングおよびアセンブリーを可能とする（ＰｒｏｂａおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｇｅｎｅ、１５９巻：２
０３頁（１９９５年））。
本発明の抗体はまた、分泌され、適正にアセンブルされた、本発明の抗体の収量を最大化するために、発現するポリペプチド構成要素の定量的な比をモジュレートしうる発現系を使用することによって作製することもできる。このようなモジュレーションは、ポリペプチド構成要素について、翻訳強度を同時にモジュレートすることにより、少なくとも一部達成する。
翻訳強度をモジュレートするための１つの技法は、Ｓｉｍｍｏｎｓら、米国特許第５，８４０，５２３号において開示されている。この技法では、シストロン内の翻訳開始領域（ＴＩＲ）の改変体を活用する。所与のＴＩＲについて、翻訳強度がある範囲にある、一連のアミノ酸配列改変体または核酸配列改変体を創出し、これにより、特異的な鎖の所望の発現レベルについて、この因子を調整するための簡便な手段をもたらすことができる。ＴＩＲ改変体は、アミノ酸配列を改変させうるコドン変化を結果としてもたらす、従来の変異誘発技法により作り出すことができる。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列の変化は、サイレントである。ＴＩＲ内の改変は、例えば、シグナル配列の改変と共に、シャイン－ダルガーノ配列の数または間隔の改変を含みうる。変異体のシグナル配列を作り出すための１つの方法は、シグナル配列のアミノ酸配列を変化させない（すなわち、変化がサイレントである）コード配列の起始部における「コドンバンク」の作製である。これは、各コドンの第３のヌクレオチド位置を変化させることにより達成することができ；加えて、ロイシン、セリン、およびアルギニンなど、一部のアミノ酸が、第１の位置および第２の位置を複数有し、これにより、バンクの作製に複雑性を付加しうる。変異誘発のこの方法については、Ｙａｎｓｕｒａら（１９９２年）、ＭＥＴＨＯＤＳ： Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、４巻：１５１～１５８頁において詳細に記載されている。
一実施形態では、その中の各シストロンのＴＩＲ強度がある範囲にあるベクターのセットを作り出す。この限定的なセットにより、各鎖の発現レベルについての比較のほか、多様なＴＩＲ強度の組み合わせの下における、所望の抗体産物の収量についての比較ももたらされる。ＴＩＲ強度は、Ｓｉｍｍｏｎｓら、米国特許第５，８４０，５２３号において詳細に記載されている通り、レポーター遺伝子の発現レベルを定量化することにより決定することができる。翻訳強度の比較に基づき、所望の個々のＴＩＲが、本発明の発現ベクター構築物内で組み合わされるように選択される。
本発明の抗体を発現させるのに適する原核宿主細胞は、古細菌およびグラム陰性菌またはグラム陽性菌などの真正細菌を含む。有用な細菌の例は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）種、Ｂａｃｉｌｌｉ（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）種、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｒｈｉｚｏｂｉａ、Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ、またはＰａｒａｃｏｃｃｕｓを含む。一実施形態では、グラム陰性細胞を使用する。一実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、本発明のための宿主として使用する。Ｅ．ｃｏｌｉ株の例は、Ｗ３１１０株（Ｂａｃｈｍａｎｎ、Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２巻（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．： Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９８７年）、１１９０～１２１９頁；ＡＴＣＣ寄託番号：２７，３２５）、および、遺伝子型Ｗ３１１０ ΔｆｈｕＡ （ΔｔｏｎＡ） ｐｔｒ３ ｌａｃ Ｉｑ ｌａｃＬ８ ΔｏｍｐＴΔ（ｎｍｐｃ－ｆｅｐＥ） ｄｅｇＰ４１ ｋａｎＲ（米国特許第５，６３９，６３５号）を有する３３Ｄ３株を含むその派生株を含む。Ｅ．ｃｏｌｉ ２９４（ＡＴＣＣ：３１，４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ λ１７７６（ＡＴＣ
Ｃ：３１，５３７）およびＥ．ｃｏｌｉ ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ：３１，６０８）など、他の株およびそれらの派生株もまた、適する。これらの例は、限定的なものではなく、例示的なものである。当技術分野では、規定された遺伝子型を有する上述の細菌のうちのいずれかの派生株を構築するための方法が公知であり、例えば、Ｂａｓｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、８巻：３０９～３１４頁（１９９０年）において記載されている。細菌の細胞内のレプリコンの複製能力を考慮して、適切な細菌を選択することが、一般に必要である。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種は、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、またはｐＫＮ４１０など、周知のプラスミドを使用して、レプリコンを供給する場合に、宿主として使用するのに適しうる。典型的には、宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素を分泌するべきあり、望ましくは、さらなるプロテアーゼ阻害剤を細胞培養物中に組み込みうる。
抗体の作製
宿主細胞を、上で記載した発現ベクターで形質転換し、プロモーターを誘導するか、形質転換体を選択するか、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように改変された、従来の栄養培地中で培養する。
形質転換とは、ＤＮＡが、染色体外エレメントとして、または染色体への組込み体により複製可能となるように、ＤＮＡを、原核宿主に導入することを意味する。使用される宿主細胞に応じて、形質転換は、このような細胞に適切な標準的技法を使用してなされる。細胞壁による実質的な障壁を含有する細菌細胞には、塩化カルシウムを使用するカルシウム処理を一般に使用する。形質転換のための別の方法では、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを使用する。さらに別の技法では、電気穿孔が使用される。
本発明のポリペプチドを作製するのに使用される原核細胞は、当技術分野で公知であり、選択された宿主細胞の培養に適する培地中で成長させる。適切な培地の例は、必要な栄養補充物質を加えたルリアブロス（ＬＢ）を含む。一部の実施形態では、培地はまた、発現ベクターを含有する原核細胞の増殖を選択的に可能とするように、発現ベクターの構築に基づき選び出される、選択用薬剤も含有する。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を発現させる細胞を成長させるために、アンピシリンを、培地に添加する。
炭素供給源、窒素供給源、および無機ホスフェート供給源のほかに、また、任意の必要な補充物質も、適切な濃度で、単独、または複合窒素供給源など、別の補充物質または培地との混合物として、含むことができる。任意選択で、培養培地は、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオエリトリトール、およびジチオトレイトールからなる群より選択される、１つまたは複数の還元剤を含有しうる。
原核宿主細胞は、適切な温度で培養する。Ｅ．ｃｏｌｉを成長させるには、例えば、成長は、約２０℃～約３９℃、約２５℃～約３７℃、および約３０℃を含むがこれらに限定されない温度範囲で行う。培地のｐＨは、主に宿主生物に応じて、約５～約９の範囲の任意のｐＨでありうる。Ｅ．ｃｏｌｉでは、ｐＨは、約６．８～約７．４、または約７．０でありうる。
誘導的プロモーターを、本発明の発現ベクター内で使用する場合、タンパク質発現は、プロモーターの活性化に適する条件下で誘導する。本発明の一態様では、ＰｈｏＡプロモーターを、ポリペプチドの転写を制御するために使用する。したがって、形質転換された宿主細胞は、誘導のためのホスフェート制限培地中で培養する。一実施形態では、ホスフェート制限培地は、Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地である（例えば、Ｓｉｍｍｏｎｓら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００２年）、２６３巻：１３３～１４７頁を参照され
たい）。当技術分野で公知の通り、使用されるベクター構築物に従い、他の様々な誘導剤を使用することができる。
一実施形態では、発現した本発明のポリペプチドは、宿主細胞のペリプラズムに分泌され、ここから回収される。タンパク質の回収は、一般に、浸透圧ショック、超音波処理、または溶解などの手段による微生物の破壊を伴うことが典型的である。細胞を破壊したら、細胞残渣または全細胞は、遠心分離または濾過により除去することができる。タンパク質は、例えば、アフィニティー樹脂クロマトグラフィーにより、さらに精製することができる。代替的に、タンパク質を、培養培地に輸送し、その中で単離することもできる。細胞は、培養物から除去し、産生されたタンパク質のさらなる精製のために、培養上清を、濾過および濃縮することができる。発現させたポリペプチドは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）およびウェスタンブロットアッセイなど、一般に公知の方法を使用して、さらに単離および同定することができる。
本発明の一態様では、抗体の作製を、発酵工程により大量に行う。組換えタンパク質の作製のためには、多様な大スケールの流加発酵手順が利用可能である。大スケールの発酵容量は、少なくとも１０００リットル、例えば、約１，０００～１００，０００リットルである。これらの発酵槽では、撹拌用インペラーを使用して、酸素および栄養物質、とりわけ、グルコース（一般的な炭素／エネルギー供給源）を分配する。小スケールの発酵とは一般に、容積が約１００リットルを超えず、約１リットル～約１００リットルの範囲にありうる発酵槽内の発酵を指す。
発酵工程では、タンパク質発現の誘導は、細胞を、適切な条件下で、所望の密度、例えば、ＯＤ５５０で約１８０～２２０（この段階では、細胞は、早期定常相にある）まで成長させた後で、開始することが典型的である。当技術分野で公知であり、上で記載した通り、使用されるベクター構築物に従い、様々な誘導剤を使用することができる。細胞は、誘導前に、より短い期間で成長させることができる。細胞は通例、約１２～５０時間誘導するが、より長い誘導時間も、より短い誘導時間も、使用することができる。
本発明のポリペプチドの作製収量および作製品質を改善するために、多様な発酵条件を改変することができる。例えば、分泌される抗体ポリペプチドの適正なアセンブリーおよびフォールディングを改善するために、Ｄｓｂタンパク質（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ、および／またはＤｓｂＧ）、またはＦｋｐＡ（シャペロン活性を伴う、ペプチジルプロリルｃｉｓ，ｔｒａｎｓ－イソメラーゼ）など、シャペロンタンパク質を過剰発現させる、さらなるベクターを使用して、宿主原核細胞を共形質転換することができる。シャペロンタンパク質は、適正なフォールディングおよび細菌宿主細胞内で産生される異種タンパク質の溶解度を促進することが裏付けられている。Ｃｈｅｎら、（１９９９） Ｊ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ ２７４：１９６０１－１９６０５；Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、米国特許第６，０８３，７１５号；Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、米国特許第６，０２７，８８８号；Ｂｏｔｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１００－１７１０５；Ｒａｍｍ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１０６－１７１１３；Ａｒｉｅら、（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：１９９－２１０。
発現させた異種タンパク質（とりわけ、タンパク質分解に対して感受性の異種タンパク質）のタンパク質分解を最小化するため、タンパク質分解酵素について欠損する、ある特定の宿主株を、本発明のために使用することができる。例えば、宿主細胞株は、Ｐｒｏｔｅａｓｅ ＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｍｉ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｖ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ ＶＩ、およびこれらの組み合わせなど、公知の細菌プロテアーゼをコードする遺伝子内に、遺伝子変異を施すように改変
することができる。一部のＥ．ｃｏｌｉプロテアーゼ欠損株が利用可能であり、例えば、Ｊｏｌｙら（１９９８年）、前出；Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、米国特許第５，２６４，３６５号；Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、米国特許第５，５０８，１９２号；Ｈａｒａら、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ、２巻：６３～７２頁（１９９６年）において記載されている。
一実施形態では、タンパク質分解酵素について欠損し、１つまたは複数のシャペロンタンパク質を過剰発現させるプラスミドで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株を、本発明の発現系内の宿主細胞として使用する。
抗体の精製
一実施形態では、本明細書で作製される抗体タンパク質をさらに精製して、さらなるアッセイのための、実質的に均質な調製物を得、使用する。当技術分野で公知の、標準的なタンパク質精製法を使用することができる。以下の手順：免疫アフィニティーカラム上またはイオン交換カラム上の分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のまたはＤＥＡＥなどカチオン交換樹脂上のクロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、および例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５を使用するゲル濾過は、適切な精製手順を例示するものである。
一態様では、固相上に固定化されたプロテインＡを、本発明の抗体産物の免疫アフィニティー精製のために使用する。プロテインＡとは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅａｓに由来する、４１ｋＤの細胞壁タンパク質であって、抗体のＦｃ領域に、高アフィニティーで結合する（Ｌｉｎｄｍａｒｋら（１９８３年）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ．、６２巻：１～１３頁）。プロテインＡを固定化する固相は、ガラス表面もしくはシリカ表面を含むカラム、またはＣＰＧ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）カラムもしくはケイ酸カラムでありうる。一部の適用では、カラムを、グリセロールなどの試薬でコーティングすると、夾雑物の非特異的付着を防止する可能性が高い。
精製の第１のステップとして、上で記載した細胞培養物に由来する調製物を、プロテインＡを固定化した固相に適用して、目的の抗体の、プロテインＡへの特異的結合を可能とすることができる。次いで、固相を洗浄すると、固相に非特異的に結合した夾雑物が除去される。最後に、目的の抗体を、固相から、溶出により回収する。
真核宿主細胞を使用する抗体の作製
ベクターの構成要素は一般に、以下：シグナル配列、複製起点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列のうちの１つまたは複数を含むがこれらに限定されない。
（ｉ）シグナル配列構成要素
真核宿主細胞における使用のためのベクターはまた、シグナル配列、または、目的の成熟タンパク質もしくは成熟ポリペプチドのＮ末端において特異的切断部位を有する、他のポリペプチドも含有しうる。選択される異種シグナル配列は一般に、宿主細胞により認識およびプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される）異種シグナル配列である。哺乳動物細胞の発現では、哺乳動物シグナル配列のほか、ウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルも利用可能である。
このような前駆体領域のＤＮＡを、リーディングフレーム内で、抗体をコードするＤＮ
Ａにライゲーションする。
（ｉｉ）複製起点
一般に、複製起点構成要素は、哺乳動物の発現ベクターに必要とされない。例えば、ＳＶ４０起点は、初期プロモーターを含有するというだけで使用されうることが典型的である。
（ｉｉｉ）選択遺伝子構成要素
発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択用マーカーとも称する、選択遺伝子を含有しうる。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生剤または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、またはテトラサイクリンに対する耐性を付与する、（ｂ）該当する場合、栄養要求性欠損を補完する、または（ｃ）複合培地から得られない必須の栄養物質を供給する、タンパク質をコードする。
選択スキームの１つの例では、宿主細胞の成長を止める薬物を活用する。異種遺伝子による形質転換に成功した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を産生し、これにより、選択レジメンを生き残る。このような優性選択の例では、薬物である、ネオマイシン、ミコフェノール酸、およびハイグロマイシンを使用する。
哺乳動物細胞に適する選択用マーカーの別の例は、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩおよびＩＩ（例えば、霊長動物メタロチオネイン遺伝子）、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなど、抗体核酸を取り込む能力のある細胞の同定を可能とする選択用マーカーである。
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞はまず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストである、メトトレキセート（Ｍｔｘ）を含有する培養培地中で、形質転換体の全てを培養することにより同定することができる。野生型ＤＨＦＲを使用する場合に適切な宿主細胞は、例えば、ＤＨＦＲ活性を欠損させたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系（例えば；ＡＴＣＣ：ＣＲＬ－９０９６）を含む。
代替的に、抗体、野生型ＤＨＦＲタンパク質、およびアミノグリコシド３’－ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）など、別の選択用マーカーをコードするＤＮＡ配列で形質転換または共形質転換された宿主細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含有する野生型宿主）は、アミノグリコシド抗生剤、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、またはＧ４１８など、選択用マーカーのための選択用薬剤を含有する培地中の細胞成長により選択することができる。米国特許第４，９６５，１９９号を参照されたい。
（ｉｖ）プロモーター構成要素
発現ベクターおよびクローニングベクターは通例、宿主生物により認識され、目的のポリペプチド（例えば、抗体）をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含有する。真核生物のプロモーター配列は、公知である。事実上全ての真核生物遺伝子は、転写が開始される部位から約２５～３０塩基上流に位置する、ＡＴに富む領域を有する。多くの遺伝子の転写の始点から７０～８０塩基上流に見出される別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域［配列中、Ｎは、任意のヌクレオチドでありうる］である。大半の真核生物遺伝子の３’末端は、ポリＡテールの、コード配列の３’末端への付加のシグナルでありうる、ＡＡＴＡＡＡ配列である。これらの配列の全ては、真核生物発現ベクターに挿入するのに適する。
哺乳動物宿主細胞内のベクターからの抗体ポリペプチドの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、およびサルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られたプロモーター、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーターもしくは免疫グロブリンプロモーターに由来するプロモーター、または熱ショックプロモーターに由来するプロモーターにより制御することができるが、このようなプロモーターが、宿主細胞系に適合性があることを条件とする。
ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターおよび後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点もまた含有する、ＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限断片として簡便に得られる。ウシパピローマウイルスをベクターとして使用して、哺乳動物宿主内でＤＮＡを発現させるための系は、米国特許第４，４１９，４４６号において開示されている。この系の改変については、米国特許第４，６０１，９７８号において記載されている。また、単純ヘルペスウイルスに由来するチミジンキナーゼプロモーターの制御下、マウス細胞内の、ヒトβ－インターフェロンｃＤＮＡの発現についての、Ｒｅｙｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、２９７巻：５９８～６０１頁（１９８２年）も参照されたい。代替的に、ラウス肉腫ウイルスの長い末端リピートも、プロモーターとして使用することができる。
（ｖ）エンハンサーエレメント構成要素
高等真核生物による、本発明の抗体ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列を、ベクターに挿入することにより増大させうることが多い。今や、哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α－フェトプロテイン、およびインスリン）に由来する、多くのエンハンサー配列が、公知である。しかし、真核細胞ウイルスに由来するエンハンサーを使用することが典型的である。例は、複製起点の後期側（１００～２７０ｂｐ）にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを含む。真核生物プロモーターの活性化のための増強エレメントについては、また、Ｙａｎｉｖ、Ｎａｔｕｒｅ、２９７巻：１７～１８頁（１９８２年）も参照されたい。エンハンサーは、ベクターに、抗体ポリペプチドコード配列の５’または３’の位置にスプライスされる場合もあるが、一般に、プロモーターの５’の部位に位置する。
（ｖｉ）転写終結構成要素
真核宿主細胞内で使用される発現ベクターはまた、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含有することが典型的である。このような配列は一般に、真核生物ＤＮＡもしくは真核生物ｃＤＮＡ、またはウイルスＤＮＡもしくはウイルスｃＤＮＡの５’非翻訳領域、場合によって、３’非翻訳領域から得られる。これらの領域は、抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分内のポリアデニル化断片として転写される、ヌクレオチドセグメントを含有する。１つの有用な転写終結構成要素は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６およびその中で開示されている発現ベクターを参照されたい。
（ｖｉｉ）宿主細胞の選択および形質転換
本明細書のベクター内でＤＮＡをクローニングするかまたは発現させるのに適する宿主細胞は、脊椎動物宿主細胞を含む本明細書で記載される高等真核細胞を含む。培養物（組
織培養物）中の脊椎動物細胞の繁殖は、日常的な手順となっている。有用な哺乳動物宿主細胞系の例は、ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１細胞系（ＣＯＳ－７；ＡＴＣＣ：ＣＲＬ１６５１）；ヒト胎児腎臓細胞系（２９３細胞または懸濁培養で成長させるためにサブクローニングされた２９３細胞；Ｇｒａｈａｍら、Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．、３６巻：５９頁（１９７７年））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ；ＡＴＣＣ：ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／ＤＨＦＲ－（ＣＨＯ；Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、７７巻：４２１６頁（１９８０年））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４；Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ．、２３巻：２４３～２５１頁（１９８０年））；サル腎臓細胞（ＣＶ１；ＡＴＣＣ：ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６；ＡＴＣＣ：ＣＲＬ－１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ；ＡＴＣＣ：ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；ＡＴＣＣ：ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ；ＡＴＣＣ：ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８；ＡＴＣＣ：ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２；ＡＴＣＣ：ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、３８３巻：４４～６８頁（１９８２年））；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒトヘパトーマ細胞系（Ｈｅｐ Ｇ２）である。
宿主細胞は、抗体の作製のための、上で記載した発現ベクターまたはクローニングベクターで形質転換し、プロモーターを誘導するか、形質転換体を選択するか、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように改変された、従来の栄養培地中で培養する。
（ｖｉｉｉ）宿主細胞の培養
本発明の抗体を作製するのに使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養することができる。ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地は、宿主細胞の培養に適する。加えて、Ｈａｍら、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚ．、５８巻：４４頁（１９７９年）、Ｂａｒｎｅｓら、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０２巻：２５５頁（１９８０年）、米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；同第４，５６０，６５５号；もしくは同第５，１２２，４６９号；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；または米国特許再交付第３０，９８５号において記載されている培地のうちのいずれかを、宿主細胞のための培養培地として使用することもできる。これらの培地のうちのいずれかには、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の増殖因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびホスフェートなど）、緩衝剤（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生剤（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬など）、微量元素（通例マイクロモル濃度範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、ならびにグルコースもしくは同等のエネルギー供給源を補充することができる。また、他の任意の必要な補充物質も、当業者に公知の適切な濃度で含むことができる。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞に対して既に使用された培養条件であり、当業者に明らかである。
（ｉｘ）抗体の精製
組換え技法を使用する場合、抗体は、細胞内で産生させること、または培地に直接分泌させることができる。抗体を細胞内で産生させる場合、最初のステップとして、宿主細胞または溶解させた断片のいずれかである粒子状残渣は一般に、例えば、遠心分離または限
外濾過により除去する。抗体を培地に分泌させる場合、このような発現系に由来する上清は一般に、まず、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、Ａｍｉｃｏｎ限外濾過ユニットまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を前出のステップのうちのいずれかに含み、タンパク質分解を阻害することができ、偶発性の夾雑物の成長を防止するために抗生剤が含まれ得る。
細胞から調製される抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、およびアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーは一般に、許容可能な精製技法である。プロテインＡなどのアフィニティー試薬の、アフィニティーリガンドとしての適性は、抗体内に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡを使用して、ヒトγ１重鎖、ヒトγ２重鎖、またはヒトγ４重鎖に基づく抗体を精製することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ．、６２巻：１～１３頁（１９８３年））。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプおよびヒトγ３のために推奨される（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．、５巻：１５６７～１５７５頁（１９８６年））。アフィニティーリガンドを付着させるマトリックスは大部分、アガロースであることが多いが、他のマトリックスも利用可能である。ＣＰＧ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）またはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなど、力学的に安定的なマトリックスは、アガロースに対して達成しうる流量より大きな流量およびアガロースに対して達成しうる加工時間より短い加工時間を可能とする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合は、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ． Ｔ． Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、Ｎ．Ｊ．）が精製のために有用である。また、イオン交換カラム上の分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のクロマトグラフィー、ヘパリン上のクロマトグラフィー、アニオン交換樹脂上またはカチオン交換樹脂上（ポリアスパラギン酸カラムなど）のＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿など、タンパク質精製のための他の技法も、回収される抗体に応じて利用可能である。
任意の予備的精製ステップの後、目的の抗体と夾雑物とを含む混合物を、必要に応じて、例えば、ｐＨを約２．５～４．５の間とする溶出緩衝液を使用し、一般に低塩濃度（例えば、約０～０．２５Ｍの塩）で実施される、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーにより、さらなる精製ステップにかけることができる。
当技術分野では、一般に、研究、検査、および臨床使用における使用のための抗体を調製するための技法および方法論が十分に確立されており、上記とも符合し、かつ／または目的の特定の抗体に適切であると当業者にみなされていることに留意されたい。
活性アッセイ
本発明の抗体は、それらの物理的特性／化学的特性および生物学的機能について、当技術分野で公知の多様なアッセイにより特徴付けることができる。
精製された抗体は、Ｎ末端シークェンシング、アミノ酸解析、非変性サイズ除外高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析、イオン交換クロマトグラフィー、およびパパイン消化を含むがこれらに限定されない、一連のアッセイによりさらに特徴付けることができる。
必要な場合は、抗体を、それらの生物学的活性について解析する。一部の実施形態では、本発明の抗体を、それらの抗原結合活性について調べる。当技術分野で公知であり、本
明細書で使用しうる抗原結合性アッセイは、限定せずに述べると、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光イムノアッセイ、およびプロテインＡイムノアッセイなどの技法を使用する、任意の直接的結合アッセイまたは競合的結合アッセイを含む。
一実施形態では、本発明は、全てではないが一部のエフェクター機能を有する改変された抗体を想定しており、このことが、この抗体を、抗体のｉｎ ｖｉｖｏ半減期が重要であるがある特定のエフェクター機能（例えば、補体およびＡＤＣＣ）が不要または有害である多くの適用に望ましい候補にしている。ある特定の実施形態では、抗体のＦｃ活性は、所望の特性だけが維持されることを確実にするために測定される。ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害アッセイおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏ細胞傷害アッセイが、ＣＤＣ活性および／またはＡＤＣＣ活性の低減／枯渇を確認するために実施されうる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイは、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（したがって、ＡＤＣＣ活性をおそらくは欠く）がＦｃＲｎ結合能を保持することを確実にするために実施されうる。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲ発現は、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ ９巻：４５７～９２頁（１９９１年）の４６４頁の表３にまとめられている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの例は、米国特許第５，５００，３６２号または米国特許第５，８２１，３３７号に記載されている。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。代替的に、または加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら、ＰＮＡＳ （ＵＳＡ） ９５巻：６５２～６５６頁（１９９８年）に開示されたものなどの動物モデルにおいて評価されうる。Ｃ１ｑ結合アッセイもまた、抗体がＣ１ｑに結合できず、したがってＣＤＣ活性を欠くことを確認するために実行されうる。補体活性化を評価するために、例えばＧａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２巻：１６３頁（１９９６年）に記載されるようなＣＤＣアッセイが実施されうる。ＦｃＲｎ結合およびｉｎ ｖｉｖｏクリアランス／半減期の決定もまた、当技術分野で公知の方法を使用して実施されうる。
抗体断片
本発明は、抗体断片を包含する。ある特定の状況では、全抗体ではなく、抗体断片を使用することが有利である。より小サイズの断片は、急速なクリアランスを可能とし、充実性腫瘍への接近の改善をもたらしうる。
抗体断片を産生するための多様な技法が開発されている。従来、これらの断片は、無傷抗体のタンパク質分解性消化を介して導出した（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４巻：１０７～１１７頁（１９９２年）；およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻：８１頁（１９８５年）を参照されたい）。しかし、今やこれらの断片は、組換え宿主細胞に直接産生させることができる。Ｆａｂ抗体断片、Ｆｖ抗体断片、およびＳｃＦｖ抗体断片は全て、Ｅ．ｃｏｌｉ内で発現し、Ｅ．ｃｏｌｉから分泌され、このため、これらの断片の大量の作製が容易に可能となりうる。抗体断片は、上で論じた抗体ファージライブラリーから単離することができる。代替的に、Ｆａｂ’－ＳＨ断片は、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収し、化学的にカップリングさせて、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成することもできる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻：１６３～１６７頁（１９９２年））。別の手法に従い、Ｆ（ａｂ’）２断片を、組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含む、ｉｎ
ｖｉｖｏ半減期を延長したＦａｂ断片およびＦ（ａｂ’）２断片については、米国特許第５，８６９，０４６号において記載されている。当業者には、抗体断片を作製するための他の技法も明らかであろう。他の実施形態では、選択した抗体は、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；および同第５，５８７，４５８号を参照されたい。ＦｖおよびｓＦｖは、定常領域を欠く無傷の結合部位を伴う唯一の分子種であり、このため、ｉｎ ｖｉｖｏにおける使用時に非特異的結合を低減するのに適する。ｓＦｖ融合タンパク質を構築して、ｓＦｖのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかにおけるエフェクタータンパク質の融合をもたらすことができる。Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編、前出を参照されたい。例えば、抗体断片はまた、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載の通り、「直鎖状抗体」でもありうる。このような直鎖状抗体断片は、一特異性であっても二特異性であってもよい。
ヒト化抗体
本発明は、ヒト化抗体を包含する。当技術分野では、非ヒト抗体をヒト化するための多様な方法が公知である。例えば、ヒト化抗体は、非ヒト供給源から導入された１つまたは複数のアミノ酸残基を有しうる。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「移入」残基と称することが多く、これは、「移入」可変ドメインから採取されることが典型的である。ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者らによる方法（Ｊｏｎｅｓら（１９８６年）、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻：５２２～５２５頁；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８年）、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３～３２７頁；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻：１５３４～１５３６頁）に従い、超可変領域配列で、ヒト抗体の対応する配列を置換することにより、本質的に実施することができる。したがって、このような「ヒト化」抗体とは、実質的に無傷に満たないヒト可変ドメインが、非ヒト種に由来する対応する配列で置換されているキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際は、ヒト化抗体は、一部の超可変領域残基と、おそらく、一部のＦＲ残基とが、齧歯動物抗体内の類似の部位に由来する残基で置換されているヒト抗体であることが典型的である。
ヒト化抗体を作製するのに使用される、軽鎖ヒト可変ドメインおよび重鎖ヒト可変ドメインのいずれの選択も、抗原性を低減するのに重要でありうる。いわゆる「ベストフィット」法に従い、齧歯動物抗体の可変ドメイン配列を、公知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに照らしてスクリーニングする。次いで、齧歯動物の配列に最も近接するヒト配列を、ヒト化抗体のためのヒトフレームワークとして受容する（Ｓｉｍｓら（１９９３年）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻：２２９６頁；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８７年）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、１９６巻：９０１頁）。別の方法では、軽鎖または重鎖の特定の亜群についての、全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを、いくつかの異なるヒト化抗体のために使用することができる（Ｃａｒｔｅｒら（１９９２年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８９巻：４２８５頁；Ｐｒｅｓｔａら（１９９３年）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻：２６２３頁）。
抗原に対する高アフィニティーおよび他の好適な生物学的特性を保持するように抗体をヒト化することがさらに一般に望ましい。この目標を達成するために、１つの方法に従い、ヒト化抗体を、親配列およびヒト化配列についての三次元モデルを使用する、親配列および多様な概念上のヒト化産物についての解析工程により調製する。三次元免疫グロブリンモデルは、一般に利用可能であり、当業者は、これに精通している。選択された候補免疫グロブリン配列についての、あり得る三次元コンフォメーション構造を例示および表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示について検討することによ
り、候補免疫グロブリン配列の機能において推定される残基の役割についての解析、すなわち、候補免疫グロブリンが、その抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基についての解析が可能となる。このようにして、標的抗原に対するアフィニティーの増大など、所望の抗体特徴を達成するように、ＦＲ残基は、レシピエント配列および移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般に、超可変領域の残基は、抗原への結合に対する影響に、直接、かつ、極めて実質的に関与する。
ヒト抗体
本発明のヒト抗ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ抗体は、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローンの可変ドメイン配列を、上で記載した、公知のヒト定常ドメイン配列と組み合わせることにより構築することができる。代替的に、本発明のヒトモノクローナル抗ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ抗体は、ハイブリドーマ法により作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の作製のための、ヒト骨髄腫細胞株およびマウス－ヒトヘテロ骨髄腫細胞株については、例えば、Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３巻：３００１頁（１９８４年）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１～６３頁（Ｍａｒｃｅｌ
Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７年）；およびＢｏｅｒｎｅｒら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７巻：８６頁（１９９１年）により記載されている。
今や、免疫化されると、内因性免疫グロブリン産生の非存在下で、ヒト抗体の完全なレパートリーを産生することが可能なトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することができる。例えば、キメラおよび生殖細胞系列の変異体マウスにおける、抗体重鎖接合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性の欠失の結果として、内因性抗体産生の完全な阻害がもたらされることが記載されている。ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子アレイを、このような生殖細胞系列変異体マウスに導入する結果として、抗原チャレンジの際にヒト抗体の産生がもたらされる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９０巻：２５５１頁（１９９３年）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２巻：２５５頁（１９９３年）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７巻：３３頁（１９９３年）を参照されたい。
遺伝子シャフリングはまた、ヒト抗体を、非ヒト抗体、例えば、齧歯動物抗体から導出するのにも使用することができ、この場合、ヒト抗体は、非ヒト出発抗体と同様のアフィニティーおよび特異性を有する。「エピトープインプリンティング」とも呼ばれるこの方法に従い、上で記載したファージディスプレイ技法により得られる、非ヒト抗体断片の重鎖可変領域または軽鎖可変領域のいずれかを、ヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置きかえ、非ヒト鎖／ヒト鎖のｓｃＦｖキメラまたはＦａｂキメラの集団を創出する。抗原による選択の結果として、非ヒト鎖／ヒト鎖のキメラｓｃＦｖまたはキメラＦａｂが単離され、ここで、ヒト鎖は、初代ファージディスプレイクローン内で、対応する非ヒト鎖を除去したときに破壊された抗原結合性部位を回復する、すなわち、エピトープにより、ヒト鎖パートナーの選択が支配される（刷り込まれる）。残存する非ヒト鎖を置きかえるために工程を繰り返すと、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日に公開された、ＰＣＴ
ＷＯ９３／０６２１３を参照されたい）。従来の、非ヒト抗体の、ＣＤＲグラフティングによるヒト化と異なり、この技法は、非ヒト由来のＦＲ残基もＣＤＲ残基も有さない、完全ヒト抗体をもたらす。
二特異性抗体
二特異性抗体とは、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態では、二特異性抗体は、ヒトまたはヒト化抗体である。ある特定の実施形態では、結合特異性のうちの一方は、特異的リシン連結を含む、ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈに対するものであり、他方は、他の任意の抗原に対するものである。ある特定の実施形態では、二特異性抗体は、２つの異なるリシン連結を有する、２つの異なるＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈに結合しうる。二特異性抗体は、全長抗体として、または抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二特異性抗体）として調製することができる。
当技術分野では、二特異性抗体を作製するための方法が公知である。従来、二特異性抗体の組換えによる作製は、２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の共発現に基づき、この場合、２つの重鎖は、異なる特異性を有する（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ、３０５巻：５３７頁（１９８３年））。免疫グロブリン重鎖と免疫グロブリン軽鎖とのランダムな取合せのために、これらのハイブリドーマ（クァドローマ）は、そのうちの１つだけが正確な二特異性構造を有する、１０の異なる抗体分子の潜在的な混合物を産生する。通例、アフィニティークロマトグラフィーステップによりなされる、正確な分子の精製は、いくぶん煩瑣であり、産物の収量も低い。同様の手順は、１９９３年５月１３日に公開されたＷＯ９３／０８８２９、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１０巻：３６５５頁（１９９１年）において開示されている。
異なる実施形態に従い、所望の結合特異性（抗体－抗原結合部位）を伴う抗体の可変ドメインを、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合させる。融合は、例えば、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域のうちの少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。ある特定の実施形態では、軽鎖の結合に必要な部位を含有する、第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）は、融合体のうちの少なくとも１つの中に存在する。免疫グロブリン重鎖融合体と、所望の場合、免疫グロブリン軽鎖とをコードするＤＮＡを、別個の発現ベクターに挿入し、適切な宿主生物に共トランスフェクトする。構築において使用される、等しくない比の３つのポリペプチド鎖から、最適の収量を得る実施形態では、これにより、３つのポリペプチド断片の相互の比率を調整するのに大きな柔軟性がもたらされる。しかし、少なくとも２つの、等しい比のポリペプチド鎖を発現させる結果として、高収量がもたらされる場合、または比が特段の重要性を有さない場合は、ポリペプチド鎖の２つまたは３つ全てのコード配列を、１つの発現ベクター内に挿入することが可能である。
この手法の一実施形態では、二特異性抗体は、一方のアームにおける、第１の結合特異性を伴う、ハイブリッドの免疫グロブリン重鎖と、他方のアームにおける、ハイブリッドの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対（第２の結合特異性をもたらす）とから構成される。免疫グロブリン軽鎖が、二特異性分子の半分だけに存在することにより、容易な分離の方途がもたらされるので、この非対称性構造により、所望の二特異性化合物の、望ましくない免疫グロブリン鎖の組み合わせからの分離が容易となることが見出された。この手法は、ＷＯ９４／０４６９０において開示されている。二特異性抗体を作り出すことのさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１２１巻：２１０頁（１９８６年）を参照されたい。
別の手法に従い、抗体分子対の間の界面を操作して、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の百分率を最大化することができる。界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の界面に由来する、１つまたは複数の小型のアミノ酸側鎖を、より大型の側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置きかえる。大型のアミノ酸側鎖を、より小型の側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置きかえることにより、大型の側鎖と相補的な、同一または同様なサイ
ズの「空隙」を、第２の抗体分子の界面上に創出する。これにより、ホモ二量体など、他の望ましくない最終生成物に対する、ヘテロ二量体の収量を増大させるための機構がもたらされる。
二特異性抗体は、架橋抗体または「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲート内の抗体のうちの一方をアビジンへ、他方をビオチンにカップリングさせることができる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を、望ましくない細胞に標的化するため（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染の処置のため（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／００３７３、およびＥＰ０３０８９）に提起されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋法を使用して作製することができる。当技術分野では、適切な架橋剤が周知であり、多数の架橋技法と共に、米国特許第４，６７６，９８０号において開示されている。
また、二特異性抗体を、抗体断片から作り出すための技法も、文献に記載されている。例えば、二特異性抗体は、化学連結を使用して調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻：８１頁（１９８５年）は、無傷抗体を、タンパク質分解により切断して、Ｆ（ａｂ’）２断片を作り出す手順について記載している。これらの断片を、ジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して、近接のジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィドの形成を防止する。次いで、作り出されたＦａｂ’断片を、チオニトロ安息香酸（ＴＮＢ）誘導体に転換する。次いで、Ｆａｂ’－ＴＮＢ誘導体のうちの一方を、メルカプトエチルアミンによる還元によって、Ｆａｂ’－チオールに再転換し、等モル量である他方のＦａｂ’－ＴＮＢ誘導体と混合して、二特異性抗体を形成する。作製された二特異性抗体は、酵素を選択的に固定化するための薬剤として使用することができる。
近年の進展は、二特異性抗体を形成するように、化学的にカップリングさせうる、Ｆａｂ’－ＳＨ断片の、Ｅ．ｃｏｌｉからの直接的回収を容易としている。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１７５巻：２１７～２２５頁（１９９２年）は、完全ヒト化二特異性抗体であるＦ（ａｂ’）２分子の作製について記載している。各Ｆａｂ’断片を、Ｅ．ｃｏｌｉから個別に分泌させ、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、指向性化学的カップリングにかけて、二特異性抗体を形成する。このようにして形成された二特異性抗体は、ＨＥＲ２受容体を過剰発現する細胞、および正常ヒトＴ細胞に結合すること、ならびにヒト細胞傷害性リンパ球の、ヒト乳房腫瘍標的に対する溶解活性を誘発することが可能であった。
また、二特異性抗体断片を、組換え細胞培養物から直接、作製および単離するための多様な技法も記載されている。例えば、二特異性抗体は、ロイシンジッパーを使用して作製されている（Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８巻（５号）：１５４７～１５５３頁（１９９２年））。Ｆｏｓタンパク質およびＪｕｎタンパク質に由来するロイシンジッパーペプチドを、２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に、遺伝子融合により連結した。抗体のホモ二量体を、ヒンジ領域において還元して、単量体を形成し、次いで、これを再度酸化して、抗体のヘテロ二量体を形成した。この方法はまた、抗体のホモ二量体を作製するためにも活用することができる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９０巻：６４４４～６４４８頁（１９９３年）により記載されている「ダイアボディー」技術は、二特異性抗体断片を作製するための代替的な機構を提供している。断片は、同じ鎖上の２つのドメインの間の対合を可能とするには短すぎるリンカーにより、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、１つの断片のＶＨドメインおよびＶＬドメインは、別の断片の相補的なＶＬドメインおよびＶＨドメインと対合することを強いられ、これにより、２つの抗原結合性部位を形成する。また、単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用により、二
特異性抗体断片を作製するための別の戦略も、報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５２巻：５３６８頁（１９９４年）を参照されたい。
二価を超える抗体が想定されている。例えば、三特異性抗体を調製することができる（Ｔｕｔｔら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７巻：６０頁（１９９１年））。
多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現させる細胞により、二価抗体より速く内部化（および／または異化）されうる。本発明の抗体は、３つまたはこれを超える抗原結合性部位を伴う多価抗体（ＩｇＭクラス以外の抗体である）（例えば、四価抗体）の可能性があり、これは、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により、たやすく作製することができる。多価抗体は、二量体化ドメインおよび３つまたはこれを超える抗原結合性部位を含みうる。二量体化ドメインは、例えば、Ｆｃ領域またはヒンジ領域を含む（またはこれらからなる）。この状況では、抗体は、Ｆｃ領域と、Ｆｃ領域に対してアミノ末端側にある、３つまたはこれを超える抗原結合性部位とを含む。一実施形態では、多価抗体は、例えば、３つ～約８つ、または４つの抗原結合性部位を含む（またはこれらからなる）。多価抗体は、少なくとも１つのポリペプチド鎖（例えば、２つのポリペプチド鎖）を含み、ここで、ポリペプチド鎖は、２つまたはこれを超える可変ドメインを含む。例えば、ポリペプチド鎖は、ＶＤ１－（Ｘ１）ｎ－ＶＤ２－（Ｘ２）ｎ－Ｆｃ［配列中、ＶＤ１は、第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の可変ドメインであり、Ｆｃは、Ｆｃ領域の１つのポリペプチド鎖であり、Ｘ１およびＸ２は、アミノ酸またはポリペプチドを表し、ｎは、０または１である］を含みうる。例えば、ポリペプチド鎖は、ＶＨ－ＣＨ１－可撓性リンカー－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ領域鎖；またはＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ領域鎖を含みうる。本明細書の多価抗体は、少なくとも２つ（例えば、４つ）の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに含みうる。本明細書の多価抗体は、例えば、約２つ～約８つの軽鎖可変ドメインポリペプチドを含みうる。本明細書で想定される軽鎖可変ドメインポリペプチドは、軽鎖可変ドメインを含み、任意選択で、ＣＬドメインをさらに含む。
一部の実施形態では、本明細書で記載される抗体のアミノ酸配列修飾が想定される。例えば、アミノ酸配列修飾は、抗体の結合アフィニティーおよび／または他の生物学的特性を改善するのに望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列改変体は、適切なヌクレオチド変化を抗体核酸に導入することにより、またはペプチド合成により調製する。このような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／または抗体のアミノ酸配列内の残基への挿入、および／または抗体のアミノ酸配列内の残基の置換を含む。最終構築物が、所望の特徴を保有するという条件で、欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせを作製して、最終的な構築物に到達することができる。アミノ酸改変は、配列を作製するときに、対象抗体のアミノ酸配列内に導入することができる。
変異誘発に好ましい位置である、抗体のある特定の残基または領域の同定に有用な方法は、ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ （１９８９年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４巻：１０８１～１０８５頁により記載されている通り、「アラニン走査変異誘発」と呼ばれる。本明細書では、標的残基の残基または基を同定し（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕなどの荷電残基）、アミノ酸の抗原との相互作用に影響を及ぼすように、中性アミノ酸または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）で置きかえる。次いで、置換の部位において、または置換の部位に代えて、さらなる改変体または他の改変体を導入することにより、置換に対する機能的な感受性を実証するアミノ酸位置を精緻化する。したがって、アミノ酸配列の変化形を導入するための部位は、あらかじめ決定するが、変異自体の性質は、あらかじめ決定する必要がない。例えば
、所与の部位における変異の性能を解析するには、アラニン走査またはランダム変異誘発を、標的コドンまたは標的領域において施し、発現させた免疫グロブリンを、所望の活性についてスクリーニングする。
アミノ酸配列の挿入は、長さが１残基～１００またはこれを超える残基を含有するポリペプチドの範囲の、アミノ末端融合体および／またはカルボキシル末端融合体のほか、単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例は、Ｎ末端メチオニル残基を伴う抗体、または細胞傷害性ポリペプチドに融合させた抗体を含む。抗体分子の他の挿入改変体は、抗体のＮ末端またはＣ末端の、酵素への融合体（例えば、ＡＤＥＰＴの場合）、または抗体の血清中半減期を延長するポリペプチドへの融合体を含む。
別の種類の改変体は、アミノ酸置換改変体である。これらの改変体は、抗体分子内の少なくとも１つのアミノ酸残基を、異なる残基で置きかえている。置換変異誘発のために、最も大きな関心の対象となる部位は、超可変領域を含むが、また、ＦＲの改変も想定される。保存的置換を、「好ましい置換」の表題の下に、表Ａに示す。このような置換が、生物学的活性の変化を結果としてもたらす場合は、表Ａで「例示的置換」と名指されるか、またはアミノ酸クラスに言及して、下記でさらに記載される、より実質的な変化を導入し、産物をスクリーニングすることができる。
表Ａ
元来の例示的な好ましい
残基置換置換
Ａｌａ （Ａ） Ｖａｌ； Ｌｅｕ； Ｉｌｅ Ｖａｌ
Ａｒｇ （Ｒ） Ｌｙｓ； Ｇｌｎ； Ａｓｎ Ｌｙｓ
Ａｓｎ （Ｎ） Ｇｌｎ； Ｈｉｓ； Ａｓｐ， Ｌｙｓ； Ａｒｇ Ｇｌｎ
Ａｓｐ （Ｄ） Ｇｌｕ； Ａｓｎ Ｇｌｕ
Ｃｙｓ （Ｃ） Ｓｅｒ； Ａｌａ Ｓｅｒ
Ｇｌｎ （Ｑ） Ａｓｎ； Ｇｌｕ Ａｓｎ
Ｇｌｕ （Ｅ） Ａｓｐ； Ｇｌｎ Ａｓｐ
Ｇｌｙ （Ｇ） Ａｌａ Ａｌａ
Ｈｉｓ （Ｈ） Ａｓｎ； Ｇｌｎ； Ｌｙｓ； Ａｒｇ Ａｒｇ
Ｉｌｅ （Ｉ） Ｌｅｕ； Ｖａｌ； Ｍｅｔ； Ａｌａ； Ｌｅｕ
Ｐｈｅ； ノルロイシン
Ｌｅｕ （Ｌ） ノルロイシン； Ｉｌｅ； Ｖａｌ； Ｉｌｅ
Ｍｅｔ； Ａｌａ； Ｐｈｅ
Ｌｙｓ （Ｋ） Ａｒｇ； Ｇｌｎ； Ａｓｎ Ａｒｇ
Ｍｅｔ （Ｍ） Ｌｅｕ； Ｐｈｅ； Ｉｌｅ Ｌｅｕ
Ｐｈｅ （Ｆ） Ｔｒｐ； Ｌｅｕ； Ｖａｌ； Ｉｌｅ； Ａｌａ； Ｔｙｒ Ｔｙｒ
Ｐｒｏ （Ｐ） Ａｌａ Ａｌａ
Ｓｅｒ （Ｓ） Ｔｈｒ Ｔｈｒ
Ｔｈｒ （Ｔ） Ｖａｌ； Ｓｅｒ Ｓｅｒ
Ｔｒｐ （Ｗ） Ｔｙｒ； Ｐｈｅ Ｔｙｒ
Ｔｙｒ （Ｙ） Ｔｒｐ； Ｐｈｅ； Ｔｈｒ； Ｓｅｒ Ｐｈｅ
Ｖａｌ （Ｖ） Ｉｌｅ； Ｌｅｕ； Ｍｅｔ； Ｐｈｅ； Ｌｅｕ
Ａｌａ； ノルロイシン
抗体の生物学的特性の実質的な修飾は、（ａ）例えば、シートコンフォメーションもしくはヘリックスコンフォメーションとしての置換エリア内のポリペプチド骨格の構造；（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性；または（ｃ）側鎖のかさを維持することに対するそれらの効果が著明に異なる置換を選択することにより達成する。アミノ酸は、それらの側鎖の特性の類似性（Ａ． Ｌ． Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２版、７３～７５頁、Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７５年））：
（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）
（２）非荷電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｏ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）
に従い群分けすることができる。
代替的に、天然に存在する残基は、一般的な側鎖特性に基づく群：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の配向性に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
に分けることができる。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを、別のクラスのメンバーと交換することを伴う。また、このような置換残基を、保存的置換部位へ、または残りの（非保存的な）部位に導入することもできる。
１つの種類の置換改変体は、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１つまたは複数の超可変領域残基の置換を伴う。一般に、さらなる開発のために選択される、結果として得られる改変体では、生物学的特性は、それらが作り出された親抗体と比べて修飾されている（例えば、改善されている）。このような置換改変体を作り出すための簡便な方途は、ファージディスプレイを使用するアフィニティー成熟を伴う。略述すると、いくつかの超可変領域部位（例えば、６～７カ所の部位）を変異させて、各部位における全ての可能なアミノ酸置換を作り出す。このようにして作り出された抗体は、糸状ファージ粒子から、各粒子内にパッケージングされたファージコートタンパク質（例えば、Ｍ１３の遺伝子ＩＩＩ産物）のうちの少なくとも一部との融合体としてディスプレイされる。次いで、ファージディスプレイされた改変体を、本明細書で開示される通り、それらの生物学的活性（例えば、結合アフィニティー）についてスクリーニングする。修飾のための候補超可変領域部位を同定するために、走査変異誘発（例えば、アラニン走査）を実施して、抗原への結合に著明に寄与する超可変領域残基を同定することができる。代替的に、または加えて、抗原－抗体複合体の結晶構造を解析して、抗体と抗原との接触点を同定することも有益でありうる。このような接触残基および隣接残基は、本明細書で詳述される技法を含む、当技術分野で公知の技法に従う置換のための候補である。このような改変体を作り出したら、改変体のパネルを、本明細書で記載される技法を含む、当技術分野で公知の技法を使用するスクリーニングにかけ、１つまたは複数の関連アッセイにおいて優れた特性を伴う抗体を、さらなる開発のために選択することができる。
抗体のアミノ酸配列改変体をコードする核酸分子は、当技術分野で公知の様々な方法により調製する。これらの方法は、天然供給源（天然に存在するアミノ酸配列改変体の場合）からの単離、またはオリゴヌクレオチド媒介型（または部位指向）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、および抗体の、以前に調製された改変体もしくは非バージョンに対する、カセット型変異誘発による調製を含むがこれらに限定されない。
１つまたは複数のアミノ酸修飾を、本発明の抗体のＦｃ領域内に導入し、これにより、Ｆｃ領域改変体を作り出すことが望ましい場合がある。Ｆｃ領域改変体は、ヒンジシステインのアミノ酸位置を含む、１つまたは複数のアミノ酸位置におけるアミノ酸修飾（例えば、置換）を含む、ヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＦｃ領域）を含みうる。
この説明および当技術分野の教示によれば、一部の実施形態では、本発明の抗体は、例えばＦｃ領域において、野生型の対応する抗体と比較して１つまたは複数の変化を含み得ることが企図される。それにもかかわらず、これらの抗体は、それらの野生型対応物と比較して、治療上の実用性に必要なものと実質的に同じ特徴を保持し得る。例えばＷＯ９９／５１６４２に記載されている通り、例えばＣ１ｑ結合および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の変化（すなわち、改善または低下）をもたらし得るある特定の変化が、Ｆｃ領域に生じ得ると考えられる。Ｄｕｎｃａｎ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ Ｎａｔｕｒｅ ３２２巻：７３８～４０頁（１９８８年）、米国特許第５，６４８，２６０号、同第５，６２
４，８２１号、およびＦｃ領域改変体の他の例に関するＷＯ９４／２９３５１も参照のこと。
一態様では、本発明は、Ｆｃ領域を含むＦｃポリペプチドの界面に修飾を含む抗体を提供し、その修飾によって、ヘテロ二量体化が容易になり、かつ／または促進される。これらの修飾は、第１のＦｃポリペプチドに隆起を導入し、第２のＦｃポリペプチドに空洞を導入することを含み、その隆起は、第１および第２のＦｃポリペプチドの複合化を促進するように、空洞内に位置付け可能である。これらの修飾を用いて抗体を生成する方法は、当技術分野で公知であり、例えば米国特許第５，７３１，１６８号に記載されている通りである。
イムノコンジュゲート
別の態様では、本発明は、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、細菌由来、真菌由来、植物由来、もしくは動物由来の酵素的に活性な毒素、またはこれらの断片）、または放射性同位元素（すなわち、放射性コンジュゲート）などの細胞傷害剤にコンジュゲートさせた抗体を含む、イムノコンジュゲートまたは抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を提供する。
細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤、すなわち、がんの処置において、腫瘍細胞を死滅させるかまたは阻害する薬物を局所送達するために、抗体－薬物コンジュゲートを使用すること（ＳｙｒｉｇｏｓおよびＥｐｅｎｅｔｏｓ（１９９９年）、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９巻：６０５～６１４頁；Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ－ＤｕｖａｚおよびＳｐｒｉｎｇｅｒ（１９９７年）、Ａｄｖ． Ｄｒｇ Ｄｅｌ． Ｒｅｖ．、２６巻：１５１～１７２頁；米国特許第４，９７５，２７８号）により、薬物部分の、腫瘍への標的化送達、および腫瘍細胞内の蓄積が可能となり、この場合、これらの薬剤（ｄｒｕｇ ａｇｅｎｔ）をコンジュゲートさせずに全身投与すれば、許容不可能なレベルの毒性が、消失が求められる腫瘍細胞のほか、正常細胞にも結果としてもたらされうる（Ｂａｌｄｗｉｎら（１９８６年）、Ｌａｎｃｅｔ（１９８６年３月１５日）：６０３～０５頁；Ｔｈｏｒｐｅ（１９８５年）、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ‘８４： Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ
Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａ． Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５～５０６頁）。こうして、毒性を最小としながら、有効性を最大とすることが探索される。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれも、これらの戦略において有用であると報告されている（Ｒｏｗｌａｎｄら（１９８６年）、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、２１巻：１８３～８７頁）。これらの方法で使用される薬物は、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキセート、およびビンデシンを含む（Ｒｏｗｌａｎｄら（１９８６年）、前出）。抗体－毒素コンジュゲート内で使用される毒素は、ジフテリア毒素などの細菌毒素、リシンなどの植物毒素、ゲルダナマイシンなどの低分子毒素（Ｍａｎｄｌｅｒら（２０００年）、Ｊｏｕｒ． ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．、９２巻（１９号）：１５７３～１５８１頁；Ｍａｎｄｌｅｒら（２０００年）、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔｅｒｓ、１０巻：１０２５～１０２８頁；Ｍａｎｄｌｅｒら（２００２年）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、１３巻：７８６～７９１頁）、メイタンシノイド（ＥＰ１３９１２１３；Ｌｉｕら（１９９６年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９３巻：８６１８～８６２３頁）、およびカリケアマイシン（Ｌｏｄｅら（１９９８年）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５８巻：２９２８頁；Ｈｉｎｍａｎら（１９９３年）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５３巻：３３３６～３３４２頁）を含む。毒素は、それらの細胞傷害効果および細胞増殖抑制効果を、チューブリンへの結合、ＤＮＡへの結
合、またはトポイソメラーゼの阻害を含む機構により及ぼしうる。一部の細胞傷害薬は、大型の抗体またはタンパク質受容体のリガンドにコンジュゲートさせると、不活性であるか活性がより低い傾向がある。
ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標）（イブリツモマブチウキセタン、Ｂｉｏｇｅｎ／Ｉｄｅｃ）は、正常Ｂリンパ球および悪性Ｂリンパ球の表面上に見出されたＣＤ２０抗原を対象とするマウスＩｇＧ１カッパモノクローナル抗体、ならびにチオ尿素リンカー－キレーターによって結合した１１１Ｉｎまたは９０Ｙ放射性同位体から構成された、抗体－放射性同位体のコンジュゲートである（Ｗｉｓｅｍａｎら（２０００年）Ｅｕｒ． Ｊｏｕｒ．Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． ２７巻（７号）：７６６～７７頁；Ｗｉｓｅｍａｎら（２００２年）Ｂｌｏｏｄ ９９巻（１２号）：４３３６～４２頁；Ｗｉｔｚｉｇら（２００２年）Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ２０巻（１０号）：２４５３～６３頁；Ｗｉｔｚｉｇら（２００２年）Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ２０巻（１５号）：３２６２～６９頁）。ＺＥＶＡＬＩＮは、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）に対して活性を有するが、その投与は、ほとんどの患者において重症の遷延性血球減少症をもたらす。ＭＹＬＯＴＡＲＧ（商標）（ゲムツズマブオゾガマイシン、Ｗｙｅｔｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）は、カリケアマイシンに連結したｈｕＣＤ３３抗体から構成された抗体薬物コンジュゲートであり、２０００年、注射による急性骨髄性白血病の処置に承認された（Ｄｒｕｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ（２０００年）２５巻（７号）：６８６頁；米国特許第４，９７０，１９８号、同第５，０７９，２３３号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６０６，０４０号、同第５，６９３，７６２号、同第５，７３９，１１６号、同第５，７６７，２８５号、同第５，７７３，００１号）。カンツズマブメルタンシン（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）は、ジスルフィドリンカーＳＰＰによってメイタンシノイド薬物部分ＤＭ１に連結したｈｕＣ２４２抗体から構成された抗体薬物コンジュゲートであり、結腸、膵臓、胃などの、ＣａｎＡｇを発現するがんの処置のために試験されている。ＭＬＮ－２７０４（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍ．、ＢＺＬ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ Ｉｎｃ．）は、メイタンシノイド薬物部分ＤＭ１に連結した抗前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）モノクローナル抗体から構成された抗体薬物コンジュゲートであり、前立腺腫瘍の潜在的に可能な処置のために試験されている。ドラスタチンの合成類似体である、オーリスタチンペプチド、オーリスタチンＥ（ＡＥ）およびモノメチルオーリスタチン（ＭＭＡＥ）は、キメラモノクローナル抗体ｃＢＲ９６（癌腫上のＬｅｗｉｓ Ｙに特異的）およびｃＡＣ１０（血液学的悪性疾患でのＣＤ３０に特異的）にコンジュゲートし（Ｄｏｒｏｎｉｎａら（２００３年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１巻（７号）：７７８～７８４頁）、治療開発中である。
免疫コンジュゲートの生成に有用な化学療法剤は、本明細書に記載されている（上述）。使用され得る酵素的に活性な毒素およびその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の活性な非結合性断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデッシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、アルファ－サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ－Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン、およびトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）が含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日出願のＷＯ９３／２１２３２を参照のこと。様々な放射性核種が、放射性コンジュゲート化（ｒａｄｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）抗体の産生に利用可能である。その例として、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、および１８６Ｒｅが挙げられる。抗体と細胞傷害剤のコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質－カップリング剤、例えばＮ－スクシンイ
ミジル－３－（２－ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチル（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ａｄｉｐｉｍｉｄａｔｅ）ＨＣｌ）、活性なエステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス－アジド化合物（例えば、ビス－（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６－ジイソシアネート）、およびビス－活性フッ素化合物（例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３８巻：１０９８頁（１９８７年）に記載されている通りに調製することができる。炭素－１４で標識化された１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチド（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を抗体とコンジュゲートするための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照のこと。
抗体と、１つまたは複数の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、ドロスタチン（ｄｏｌｏｓｔａｔｉｎ）、オーロスタチン（ａｕｒｏｓｔａｔｉｎ）、トリコテシン、およびＣＣ１０６５、ならびに毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体とのコンジュゲートも、本明細書で企図される。
メイタンシンおよびメイタンシノイド
一部の実施形態では、免疫コンジュゲートは、１つまたは複数のメイタンシノイド分子にコンジュゲートした本発明の抗体を含む。
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害することによって作用する有糸分裂阻害剤である。メイタンシンは、東アフリカの低木Ｍａｙｔｅｎｕｓ ｓｅｒｒａｔａから最初に単離された（米国特許第３，８９６，１１１号）。その後、ある特定の微生物が、メイタンシノイド、例えばメイタンシノールおよびＣ－３メイタンシノールエステルを産生することも発見された（米国特許第４，１５１，０４２号）。合成メイタンシノールならびにそれらの誘導体および類似体は、例えば、米国特許第４，１３７，２３０号、同第４，２４８，８７０号、同第４，２５６，７４６号、同第４，２６０，６０８号、同第４，２６５，８１４号、同第４，２９４，７５７号、同第４，３０７，０１６号、同第４，３０８，２６８号、同第４，３０８，２６９号、同第４，３０９，４２８号、同第４，３１３，９４６号、同第４，３１５，９２９号、同第４，３１７，８２１号、同第４，３２２，３４８号、同第４，３３１，５９８号、同第４，３６１，６５０号、同第４，３６４，８６６号、同第４，４２４，２１９号、同第４，４５０，２５４号、同第４，３６２，６６３号、および同第４，３７１，５３３号に開示されている。
メイタンシノイド薬物部分は、（ｉ）発酵または化学修飾、発酵産物の誘導体化によって相対的に調製されやすく、（ｉｉ）非ジスルフィドリンカーによって抗体にコンジュゲートするのに適した官能基を用いての誘導体化に適しており、（ｉｉｉ）血漿中で安定であり、（ｉｖ）様々な腫瘍細胞株に対して有効なので、抗体薬物コンジュゲートにおける魅力的な薬物部分である。
メイタンシノイド薬物部分の例示的な実施形態は、ＤＭ１、ＤＭ３、およびＤＭ４を含む。メイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲート、その作製方法、およびそれらの治療上の使用は、例えば米国特許第５，２０８，０２０号、同第５，４１６，０６４号および欧州特許０ ４２５ ２３５Ｂ１に開示されている。Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３巻：８６１８～８６２３頁（１９９６年）は、ヒト結腸直腸がんを対象としたモノクローナル抗体Ｃ２４２に連結しているＤＭ１と指定
されたメイタンシノイドを含む免疫コンジュゲートを記載している。このコンジュゲートは、培養結腸がん細胞に対して高い細胞傷害性を有することが見出され、ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍成長アッセイにおいて抗腫瘍活性を示した。Ｃｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２巻：１２７～１３１頁（１９９２年）は、メイタンシノイドが、ジスルフィドリンカーを介して、ヒト結腸がん細胞株上の抗原に結合するマウス抗体Ａ７、またはＨＥＲ－２／ｎｅｕ癌遺伝子に結合する別のマウスモノクローナル抗体ＴＡ．１とコンジュゲートされた免疫コンジュゲートを記載している。ＴＡ．１－メイタンシノイドコンジュゲートの細胞傷害は、細胞１個当たり３×１０５個のＨＥＲ－２表面抗原を発現するヒト乳がん細胞株ＳＫ－ＢＲ－３に対して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで試験された。薬物コンジュゲートは、遊離メイタンシノイド薬物に類似の細胞傷害の程度を達成し、その細胞傷害の程度は、抗体分子１個当たりのメイタンシノイド分子の数が増大することによって増大させることができた。Ａ７－メイタンシノイドコンジュゲートは、マウスにおいて低い全身細胞傷害を示した。
抗体－メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体またはメイタンシノイド分子のいずれの生物活性も著しく減少することなく、抗体をメイタンシノイド分子に化学的に連結することによって調製することができる。例えば、米国特許第５，２０８，０２０号を参照のこと。毒素／抗体分子１個でも、裸の抗体を使用するよりも細胞傷害を増強すると予測され得るが、抗体分子１個当たり平均３～４個のコンジュゲートしたメイタンシノイド分子は、抗体の機能または溶解度に負の影響を及ぼさずに、標的細胞の細胞傷害を増強するのに有効であることが示された。メイタンシノイドは、当技術分野で周知であり、公知の技術によって合成することができ、または天然供給源から単離することができる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第５，２０８，０２０号、ならびに本明細書で先に言及したその他の特許文書および非特許刊行物に開示されている。メイタンシノイドには、メイタンシノール、および芳香環またはメイタンシノール分子の他の位置において修飾されているメイタンシノール類似体、例えば様々なメイタンシノールエステルが含まれるが、それらに限定されない。
抗体－メイタンシノイドコンジュゲートを作製するための、例えばそれらの開示が参照によって本明細書に明確に組み込まれる米国特許第５，２０８，０２０号または欧州特許０ ４２５ ２３５Ｂ１、Ｃｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２巻：１２７～１３１頁（１９９２年）、および２００４年１０月８日出願の米国特許出願第１０／９６０，６０２号に開示の連結基を含む、当技術分野で公知の多くの連結基がある。リンカー構成成分ＳＭＣＣを含む、抗体－メイタンシノイドコンジュゲートは、２００４年１０月８日出願の米国特許出願第１０／９６０，６０２号に開示の通り調製することができる。連結基には、先に同定されている特許文書に開示されている、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸に不安的な基、感光性の基、ペプチダーゼに不安的な基、またはエステラーゼに不安的な基が含まれる。追加の連結基は、本明細書に記載され、例示されている。
抗体とメイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）のコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質－カップリング剤、例えばＮ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシニミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチル（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ａｄｉｐｉｍｉｄａｔｅ）ＨＣｌ）、活性なエステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス－アジド化合物（例えば、ビス－（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６－ジイソシアネート）、およびビス－活性フッ素化合物（例えば、１
，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）を使用して作製され得る。カップリング剤には、ジスルフィド連結を提供するための、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（Ｃａｒｌｓｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．
１７３巻：７２３～７３７頁（１９７８年））およびＮ－スクシンイミジル－４－（２－ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）が含まれるが、それらに限定されない。
リンカーは、連結のタイプに応じて、様々な位置でメイタンシノイド分子に付着し得る。例えばエステル連結は、従来のカップリング技術を使用して、ヒドロキシル基との反応によって形成することができる。反応は、ヒドロキシル基を有するＣ－３位置、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ－１４位置、ヒドロキシル基で修飾されたＣ－１５位置、およびヒドロキシル基を有するＣ－２０位置で生じ得る。一実施形態では、連結は、メイタンシノールまたはメイタンシノール類似体のＣ－３位置に形成される。
オーリスタチンおよびドラスタチン（ｄｏｌｏｓｔａｔｉｎ）
一部の実施形態では、免疫コンジュゲートは、ドラスタチンまたはドロスタチンペプチド類似体および誘導体、オーリスタチンにコンジュゲートした本発明の抗体を含む（米国特許第５，６３５，４８３号、同第５，７８０，５８８号）。ドラスタチンおよびオーリスタチンは、微小管ダイナミクス、ＧＴＰ加水分解、ならびに核および細胞の分裂を妨害し（Ｗｏｙｋｅら（２００１年）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４５巻（１２号）：３５８０～３５８４頁）、抗がん活性（米国特許第５６６３１４９号）および抗真菌活性を有する（Ｐｅｔｔｉｔら（１９９８年）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４２巻：２９６１～２９６５頁）ことが示されている。ドラスタチンまたはオーリスタチン薬物部分は、ペプチド性薬物部分のＮ（アミノ）末端またはＣ（カルボキシル）末端を介して抗体に付着し得る（ＷＯ０２／０８８１７２）。
例示的なオーリスタチン実施形態は、その開示全体が参照によって明確に組み込まれる、２００４年１１月５日出願の米国特許出願第１０／９８３，３４０号、「Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌｖａｌｉｎｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ Ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｔｏ Ｌｉｇａｎｄｓ」に開示の、Ｎ末端連結モノメチルオーリスタチン薬物部分ＤＥおよびＤＦを含む。
例示的なオーリスタチンの実施形態は、ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦを含む。ＭＭＡＥまたはＭＭＡＦおよび様々なリンカー構成成分（本明細書でさらに記載されている）を含む追加の例示的な実施形態は、Ａｂ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦ、Ａｂ－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ、Ａｂ－ＭＣ－ＭＭＡＥおよびＡｂ－ＭＣ－ＭＭＡＦを含む。
典型的に、ペプチドベースの薬物部分は、２つまたはそれを超えるアミノ酸および／またはペプチド断片の間にペプチド結合を形成することによって調製することができる。このようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学分野で周知の液相合成方法に従って調製することができる（Ｅ． ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＫ． Ｌｕｅｂｋｅ、「Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、第１巻、７６～１３６頁、１９６５年、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓを参照のこと）。オーリスタチン／ドラスタチン薬物部分は、米国特許第５，６３５，４８３号、第５，７８０，５８８号、Ｐｅｔｔｉｔら（１９８９年）Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１１巻：５４６３～５４６５頁、Ｐｅｔｔｉｔら（１９９８年）Ａｎｔｉ－Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ １３巻：２４３～２７７頁；Ｐｅｔｔｉｔ， Ｇ． Ｒ．ら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、１９９６年、７１９～７２５頁；およびＰｅｔｔｉｔら（１９９６年）Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．
１巻 ５号：８５９～８６３頁の方法に従って調製することができる。また、その全体
が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｄｏｒｏｎｉｎａ（２００３年）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２１巻（７号）：７７８～７８４頁；「Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌｖａｌｉｎｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ Ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｔｏ Ｌｉｇａｎｄｓ」、２００４年１１月５日出願の米国特許出願第１０／９８３，３４０号を参照のこと（例えば、リンカーにコンジュゲートしたＭＭＡＥおよびＭＭＡＦなどのモノメチルバリン化合物を調製するリンカーおよび方法を開示している）。
カリケアマイシン
他の実施形態では、免疫コンジュゲートは、１つまたは複数のカリケアマイシン分子にコンジュゲートした本発明の抗体を含む。カリケアマイシンファミリーの抗生物質は、ピコモル未満の濃度で二本鎖ＤＮＡ切断をもたらすことができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５，７１２，３７４号、同第５，７１４，５８６号、同第５，７３９，１１６号、同第５，７６７，２８５号、同第５，７７０，７０１号、同第５，７７０，７１０号、同第５，７７３，００１号、および同第５，８７７，２９６号を参照のこと（すべてＡｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ社）。使用され得るカリケアマイシンの構造的類似体には、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ－アセチル－γ１Ｉ、ＰＳＡＧおよびθＩ１が含まれるが、それらに限定されない（Ｈｉｎｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３巻：３３３６～３３４２頁（１９９３年）、Ｌｏｄｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８巻：２９２５～２９２８頁（１９９８年）およびＡｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄの前述の米国特許文書）。抗体がコンジュゲートすることができる別の抗腫瘍薬物は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシンとＱＦＡはともに、細胞内作用部位を有し、原形質膜を容易には横断しない。したがって、抗体媒介性の内部移行によるこれらの薬剤の細胞による取込みは、それらの細胞傷害作用を大幅に増強する。
他の細胞傷害剤
本発明の抗体にコンジュゲートすることができる他の抗腫瘍剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｉｃｉｎ）、ビンクリスチンおよび５－フルオロウラシル、米国特許第５，０５３，３９４号、同第５，７７０，７１０号に記載されている、まとめてＬＬ－Ｅ３３２８８複合体として公知の薬剤ファミリー、ならびにエスペラマイシン（米国特許第５，８７７，２９６号）が含まれる。
使用され得る酵素的に活性な毒素およびその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の活性な非結合性断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、アルファ－サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ－Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセンが含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日出願のＷＯ９３／２１２３２を参照のこと。
本発明はさらに、抗体と、核酸分解活性を有する化合物（例えば、リボヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮａｓｅ）との間で形成された免疫コンジュゲートを企図する。
腫瘍を選択的に破壊するために、抗体は、高度に放射性の原子を含むことができる。放射性コンジュゲート化抗体を産生するために、様々な放射性同位元素が利用可能である。
その例として、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２およびＬｕの放射性同位元素が挙げられる。コンジュゲートは、検出のために使用される場合、シンチグラフィー研究のための放射性原子、例えばＴｃ９９ｍもしくはＩ１２３、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴イメージング、ＭＲＩとしても公知）のためのスピン標識、例えばやはりヨウ素－１２３、ヨウ素－１３１、インジウム－１１１、フッ素－１９、炭素－１３、窒素－１５、酸素－１７、ガドリニウム、マンガンもしくは鉄を含むことができる。
放射性標識または他の標識は、公知の方式でコンジュゲートに組み込むことができる。例えば、ペプチドは、生合成することができ、または適切なアミノ酸前駆体を使用し、例えば水素の代わりにフッ素－１９を用いる化学的なアミノ酸合成によって合成することができる。Ｔｃ９９ｍまたはＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８およびＩｎ１１１などの標識は、ペプチドにおいてシステイン残基を介して付着し得る。イットリウム－９０は、リシン残基を介して付着し得る。ＩＯＤＯＧＥＮ方法（Ｆｒａｋｅｒら（１９７８年）Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ８０巻：４９～５７頁）を使用して、ヨウ素－１２３を組み込むことができる。「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ」（Ｃｈａｔａｌ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９８９年）は、他の方法を詳説している。
抗体と細胞傷害剤のコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質－カップリング剤、例えばＮ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシニミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチル（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ａｄｉｐｉｍｉｄａｔｅ）ＨＣｌ）、活性なエステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス－アジド化合物（例えば、ビス－（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６－ジイソシアネート）、およびビス－活性フッ素化合物（例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３８巻：１０９８頁（１９８７年）に記載されている通りに調製することができる。炭素－１４で標識化された１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチド（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を抗体とコンジュゲートするための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照のこと。リンカーは、細胞中において細胞傷害性薬物の放出を促進する「切断可能なリンカー」であってよい。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィドを含有するリンカー（Ｃｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２巻：１２７～１３１頁（１９９２年）；米国特許第５，２０８，０２０号）が使用され得る。
本発明の化合物は、それらに限定されるものではないが、市販されている以下の架橋試薬、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣおよびスルホ－ＳＭＰＢ、ならびにＳＶＳＢ（スクシンイミジル－（４－ビニルスルホン）ベンゾエート）を用いて調製されたＡＤＣを明確に企図する（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．製、米国イリノイ州、ロックフォード）。Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ａｎｄ Ｃａｔａｌｏｇ、２００３～２００４年、４６７～４９８頁を参照のこと。
抗体薬物コンジュゲートの調製
本発明の抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）では、抗体（Ａｂ）は、リンカー（Ｌ）によって、抗体１個当たり１つまたは複数の薬物部分（Ｄ）、例えば約１～約２０個の薬物部分にコンジュゲートされる。式ＩのＡＤＣは、当業者に公知の有機化学反応、条件、および試薬を用いるいくつかの経路によって調製することができ、その経路は、（１）抗体の求核基を、二価のリンカー試薬と反応させて、共有結合によってＡｂ－Ｌを形成し、その後、薬物部分Ｄと反応させること、および（２）薬物部分の求核基を、二価のリンカー試薬と反応させて、共有結合によってＤ－Ｌを形成し、その後、抗体の求核基と反応させることを含む。ＡＤＣを調製するための追加の方法は、本明細書に記載されている。
Ａｂ－（Ｌ－Ｄ）ｐ Ｉ
リンカーは、１つまたは複数のリンカー構成成分から構成され得る。例示的なリンカー構成成分として、６－マレイミドカプロイル（「ＭＣ」）、マレイミドプロパノイル（「ＭＰ」）、バリン－シトルリン（「ｖａｌ－ｃｉｔ」）、アラニン－フェニルアラニン（「ａｌａ－ｐｈｅ」）、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（「ＰＡＢ」）、Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルチオ）ペンタノエート（「ＳＰＰ」）、Ｎ－スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１カルボキシレート（「ＳＭＣＣ」）、およびＮ－スクシンイミジル（４－ヨード－アセチル）アミノベンゾエート（「ＳＩＡＢ」）が挙げられる。追加のリンカー構成成分は、当技術分野で公知であり、そのいくつかは、本明細書に記載されている。
一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸残基を含み得る。例示的なアミノ酸リンカー構成成分として、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドまたはペンタペプチドが挙げられる。例示的なジペプチドとして、バリン－シトルリン（ｖｃまたはｖａｌ－ｃｉｔ）、アラニン－フェニルアラニン（ａｆまたはａｌａ－ｐｈｅ）が挙げられる。例示的なトリペプチドとして、グリシン－バリン－シトルリン（ｇｌｙ－ｖａｌ－ｃｉｔ）およびグリシン－グリシン－グリシン（ｇｌｙ－ｇｌｙ－ｇｌｙ）が挙げられる。アミノ酸リンカー構成成分を構成するアミノ酸残基には、天然に存在するアミノ酸、ならびに微量アミノ酸および天然に存在しないアミノ酸類似体、例えばシトルリンが含まれる。アミノ酸リンカー構成成分は、特定の酵素、例えば腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、ＣおよびＤ、またはプラスミンプロテアーゼによる酵素的切断に合わせてそれらの選択性が設計され、最適化され得る。
例示的なリンカー構成成分構造は、以下に示される（波線は、ＡＤＣの他の構成成分との共有結合による付着部位を示す）。
図ＵＳ０８１３３４８８－２０１２０３１３－Ｃ００００６
追加の例示的なリンカー構成成分および略語を含む（抗体（Ａｂ）およびリンカーが図示されており、ｐは、１～約８である）。
図ＵＳ０８１３３４８８－２０１２０３１３－Ｃ００００７
抗体上の求核基には、（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えばリシン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えばシステイン、および（ｉｖ）糖ヒドロキシルまたはアミノ基（抗体は、グリコシル化される）が含まれるが、それらに限定されない。アミン、チオール、およびヒドロキシル基は、求核性であり、（ｉ）活性なエステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、および酸ハロゲン化物、（ｉｉ）ハロ
ゲン化アルキルおよびハロゲン化ベンジル、例えばハロアセトアミド、（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル、およびマレイミド基を含む、リンカー部分およびリンカー試薬上の求電子基と反応して、共有結合を形成することができる。ある特定の抗体は、還元可能な鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体は、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）などの還元剤を用いる処理によって、リンカー試薬とのコンジュゲーションに反応性となり得る。したがって、各システイン架橋は、理論的に２種の反応性チオール求核試薬を形成する。追加の求核基は、リシンが２－イミノチオラン（Ｔｒａｕｔ試薬）と反応して、アミンがチオールに変換されることによって、抗体に導入され得る。反応性チオール基は、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれを超えるシステイン残基を導入する（例えば、１つまたは複数の非天然システインアミノ酸残基を含む変異体抗体を調製する）ことによって、抗体（またはその断片）に導入され得る。
本発明の抗体薬物コンジュゲートは、抗体を修飾して、リンカー試薬または薬物上の求核置換基と反応することができる求電子部分を導入することによって産生することもできる。グリコシル化抗体の糖を、例えば過ヨウ素酸酸化試薬で酸化すると、リンカー試薬または薬物部分のアミン基と反応し得るアルデヒドまたはケトン基を形成することができる。得られたイミンシッフ塩基の基は、安定な連結を形成することができ、または例えば水素化ホウ素試薬によって還元されて、安定なアミン連結を形成することができる。一実施形態では、グリコシル化抗体の糖質部分と、ガラクトースオキシダーゼまたはメタ過ヨウ素酸ナトリウムのいずれかとの反応によって、薬物上の適切な基と反応し得るタンパク質中のカルボニル（アルデヒドおよびケトン）基を得ることができる（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）。別の実施形態では、Ｎ末端セリンまたはスレオニン残基を含有するタンパク質は、メタ過ヨウ素酸ナトリウムと反応して、第１のアミノ酸の代わりにアルデヒドを産生することができる（Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ ＆ Ｓｔｒｏｈ、（１９９２年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ３巻：１３８～１４６頁；米国特許第５，３６２，８５２号）。このようなアルデヒドは、薬物部分またはリンカー求核試薬と反応することができる。
同様に、薬物部分上の求核基には、（ｉ）活性なエステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、および酸ハロゲン化物、（ｉｉ）ハロゲン化アルキルおよびハロゲン化ベンジル、例えばハロアセトアミド、（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル、およびマレイミド基を含む、リンカー部分およびリンカー試薬上の求電子基と反応して、共有結合を形成することができるアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびアリールヒドラジド基が含まれるが、それらに限定されない。
あるいは、抗体および細胞傷害剤を含む融合タンパク質は、例えば組換え技術またはペプチド合成によって作製することができる。ＤＮＡの長さは、互いに隣接しているか、またはコンジュゲートの所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域によって分離されている、コンジュゲートの２つの部分をコードするそれぞれの領域を含み得る。
さらに別の実施形態では、抗体は、腫瘍の事前標的化に利用するために、「受容体」（このようなストレプトアビジン）にコンジュゲートすることができ、ここで抗体－受容体コンジュゲートは、患者に投与され、その後、浄化剤（ｃｌｅａｒｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を使用して循環から非結合コンジュゲートが除去され、次に細胞傷害剤（例えば、放射性ヌクレオチド）にコンジュゲートしている「リガンド」（例えば、アビジン）が投与される。
抗体（Ａｂ）－ＭＣ－ＭＭＡＥは、下記の通り、本明細書で提供される抗体のいずれか
をＭＣ－ＭＭＡＥとコンジュゲートすることによって調製することができる。ｐＨ８．０において５００ｍＭホウ酸ナトリウムおよび５００ｍＭ塩化ナトリウムに溶解させた抗体を、過剰の１００ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）で処理する。３７℃で約３０分間インキュベートした後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５樹脂で溶出することによって緩衝液を交換し、１ｍＭのＤＴＰＡを含むＰＢＳで溶出する。溶液の２８０ｎｍにおける吸光度から得られた還元型抗体の濃度、およびＤＴＮＢ（Ａｌｄｒｉｃｈ、ウィスコンシン州、ミルウォーキー）との反応および４１２ｎｍにおける吸光度の決定によるチオール濃度を決定することによって、チオール／Ａｂ値を調べる。ＰＢＳに溶解した還元型抗体を、氷上で冷やす。薬物リンカー試薬であるマレイミドカプロイル－モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、すなわちＭＣ－ＭＭＡＥを、ＤＭＳＯに溶解させ、アセトニトリルおよび水により公知の濃度で希釈し、ＰＢＳ中、冷やした還元型抗体２Ｈ９に添加する。約１時間後、過剰のマレイミドを添加して反応をクエンチし、未反応の任意の抗体チオール基をキャップする。反応混合物を、遠心限外濾過によって濃縮し、２Ｈ９－ＭＣ－ＭＭＡＥを、ＰＢＳ中Ｇ２５樹脂を介して溶出することによって精製し、脱塩し、無菌条件下で０．２μｍフィルターを介して濾過し、保存のために凍結させる。
抗体－ＭＣ－ＭＭＡＦは、Ａｂ－ＭＣ－ＭＭＡＥの調製について提供されているプロトコルに従って、本明細書で提供される抗体のいずれかをＭＣ－ＭＭＡＦとコンジュゲートすることによって調製することができる。
抗体－ＭＣ－ｖａｌ－ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥは、Ａｂ－ＭＣ－ＭＭＡＥの調製について提供されているプロトコルに従って、本明細書で提供される抗体のいずれかをＭＣ－ｖａｌ－ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥとコンジュゲートすることによって調製される。
抗体－ＭＣ－ｖａｌ－ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦは、Ａｂ－ＭＣ－ＭＭＡＥの調製について提供されているプロトコルに従って、本明細書で提供される抗体のいずれかをＭＣ－ｖａｌ－ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦとコンジュゲートすることによって調製される。
抗体－ＳＭＣＣ－ＤＭ１は、以下の通り、本明細書で提供される抗体のいずれかをＳＭＣＣ－ＤＭ１とコンジュゲートすることによって調製される。精製した抗体を、（スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）を用いて誘導体化して、ＳＭＣＣリンカーを導入する。具体的には、抗体を、５０ｍＭリン酸カリウム／５０ｍＭ塩化ナトリウム／２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．５中２０ｍｇ／ｍＬで、７．５モル当量のＳＭＣＣ（ＤＭＳＯ中２０ｍＭ、６．７ｍｇ／ｍＬ）で処理する。周囲温度においてアルゴン下で２時間撹拌した後、反応混合物を、５０ｍＭリン酸カリウム／５０ｍＭ塩化ナトリウム／２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．５で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラムを介して濾過する。抗体を含有する画分をプールし、アッセイする。
こうして調製した抗体－ＳＭＣＣを、５０ｍＭリン酸カリウム／５０ｍＭ塩化ナトリウム／２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．５で最終濃度約１０ｍｇ／ｍｌまで希釈し、ジメチルアセトアミド中１０ｍＭのＤＭ１溶液と反応させる。反応物を、アルゴン下において周囲温度で１６．５時間撹拌する。コンジュゲーション反応混合物を、１×ＰＢＳ、ｐＨ６．５を用いてＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲル濾過カラム（１．５×４．９ｃｍ）を介して濾過する。ＤＭ１薬物と抗体の比（ｐ）は、２５２ｎｍおよび２８０ｎｍにおける吸光度によって測定すると、約２～５となり得る。
Ａｂ－ＳＰＰ－ＤＭ１は、以下の通り、本明細書で提供される抗体のいずれかをＳＰＰ－ＤＭ１とコンジュゲートすることによって調製される。精製した抗体を、Ｎ－スクシンイミジル－４－（２－ピリジルチオ）ペンタノエートを用いて誘導体化して、ジチオピリ
ジル基を導入する。ＮａＣｌ（５０ｍＭ）およびＥＤＴＡ（１ｍＭ）を含有する５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）４４．７ｍＬ中、抗体（３７６．０ｍｇ、８ｍｇ／ｍＬ）を、ＳＰＰ（エタノール２．３ｍＬ中５．３モル当量）で処理する。周囲温度においてアルゴン下で９０分間インキュベートした後、反応混合物を、３５ｍＭクエン酸ナトリウム、１５４ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ緩衝液で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ
Ｇ２５カラムを介してゲル濾過する。抗体を含有する画分をプールし、アッセイした。抗体の修飾の程度を、前述の通り決定する。
抗体－ＳＰＰ－Ｐｙ（約１０μｍｏｌｅの放出可能な２－チオピリジン基）を、先の３５ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５で最終濃度約２．５ｍｇ／ｍＬまで希釈する。次に、３．０ｍＭジメチルアセトアミド（ＤＭＡ、最終的な反応混合物中３％ｖ／ｖ）中ＤＭ１（１．７当量、１７μｍｏｌｅ）を、抗体溶液に添加する。反応は、アルゴン下で周囲温度において約２０時間進行する。反応物を、３５ｍＭクエン酸ナトリウム、１５４ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ３００ゲル濾過カラム（５．０ｃｍ×９０．０ｃｍ、１．７７Ｌ）にローディングする。流量は、約５．０ｍＬ／分となり得、６５の画分（それぞれ２０．０ｍＬ）を収集する。抗体分子１個当たり連結したＤＭ１薬物分子の数（ｐ’）を、２５２ｎｍおよび２８０ｎｍにおける吸光度を測定することによって決定すると、２Ｈ９抗体１個当たり約２～４個のＤＭ１薬物部分となり得る。
抗体－ＢＭＰＥＯ－ＤＭ１は、以下の通り、本明細書で提供される抗体のいずれかをＢＭＰＥＯ－ＤＭ１とコンジュゲートすることによって調製される。抗体を、ビス－マレイミド試薬ＢＭ（ＰＥＯ）４（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）によって修飾すると、抗体表面上に未反応マレイミド基が残る。これは、ＢＭ（ＰＥＯ）４を濃度１０ｍＭまで５０％エタノール／水の混合物に溶解させ、１０倍モル過剰量を、濃度およそ１．６ｍｇ／ｍｌ（１０マイクロモル濃度）のリン酸緩衝食塩水中抗体を含有する溶液に添加し、それを１時間反応させて、抗体－リンカー中間体である２Ｈ９－ＢＭＰＥＯを形成することによって達成され得る。過剰のＢＭ（ＰＥＯ）４を、１５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液を用いる３０ｍＭシトレート、ｐＨ６におけるゲル濾過（ＨｉＴｒａｐカラム、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって除去する。およそ１０倍モル過剰量のＤＭ１を、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）に溶解させ、２Ｈ９－ＢＭＰＥＯ中間体に添加する。また、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を用いて、薬物部分試薬を溶解させることができる。反応混合物を、終夜反応させた後、ＰＢＳ中にゲル濾過または透析して、未反応ＤＭ１を除去する。ＰＢＳ中Ｓ２００カラム上によるゲル濾過を使用して、高分子量の凝集体を除去し、精製した２Ｈ９－ＢＭＰＥＯ－ＤＭ１を得る。
抗体の誘導体
本発明の抗体は、当技術分野で公知であり、たやすく利用可能な、さらなる非タンパク質性部分を含有するように、さらに修飾することができる。一実施形態では、抗体の誘導体化に適する部分は、水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、およびデキストランまたはポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、およびこれらの混合物を含むがこれらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中のその安定性のため
に、製造において有利でありうる。ポリマーは、任意の分子量であることが可能であり、分枝状であっても非分枝状であってもよい。抗体に付着させるポリマーの数は変更し得、１つを超えるポリマーを付着させる場合、ポリマーは、同じ、または、異なる分子の場合がある。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数および／または種類は、改善される抗体の特定の特性または機能、抗体の誘導体が規定された条件下の治療で使用されるのかどうかなどを含むがこれらに限定されない検討項目に基づき決定することができる。
別の実施形態では、放射線への曝露により選択的に加熱されうる、抗体と非タンパク質性部分とのコンジュゲートが提供される。一実施形態では、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブである（Ｋａｍら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、１０２巻：１１６００～１１６０５頁（２００５年））。放射線は、任意の波長のものであることが可能であり、通常の細胞には有害でないが、非タンパク質性部分を、抗体－非タンパク質性部分に近位の細胞が死滅する温度まで加熱する波長を含むがこれらに限定されない。
医薬製剤
本発明の抗体を含む治療用製剤は、所望の程度の純度を有する抗体を、任意選択の、生理学的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１６版、Ｏｓｏｌ， Ａ．編（１９８０年））と、水溶液、凍結乾燥製剤、または他の乾燥製剤の形態で混合することにより、保管用に調製する。許容可能な担体、賦形剤、または安定化剤は、使用される投与量および濃度で、レシピエントに対して非毒性であり、ホスフェート、シトレート、ヒスチジン、および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシンなどのアミノ酸；単糖、二糖、および、グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む、他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
本明細書の製剤はまた、処置される特定の適応症に対する必要に応じて、１つを超える活性化合物であって、互いに対して有害な影響を及ぼし合わない相補的活性を伴う活性化合物を含むがこれらに限定されない活性化合物も含有しうる。このような分子は、意図される目的に有効な量で組み合わせの中に適切に存在する。
有効成分はまた、例えば、コアセルベーション技法により、または界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）内、またはマクロエマルジョン中の、ヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル内またはゼラチンマイクロカプセル内およびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル内に捕らえることもできる。このような技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１６版、Ｏｓｏｌ， Ａ．編（１９８０年）において開示されている。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける投与のために使用される製剤は、滅菌製剤でなければならない。これは、滅菌濾過膜を介する濾過によりたやすく達成される。
持続放出調製物を調製することができる。適切な持続放出調製物の例は、本発明の免疫グロブリンを含有する固体の疎水性ポリマーによる半透性マトリックスを含み、このマトリックスは、成型品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態にある。持続放出マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ－グルタミン酸とγエチル－Ｌ－グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン－酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸－グリコール酸コポリマーと、酢酸ロイプロリドとから構成される注射用マイクロスフェア）などの分解性乳酸－グリコール酸コポリマー、およびポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸を含む。エチレン－酢酸ビニルおよび乳酸－グリコール酸などのポリマーが、１００日間超にわたり分子の放出を可能とするのに対し、ある特定のヒドロゲルは、タンパク質を放出する期間が短い。封入された免疫グロブリンは、長時間体内にとどまる場合、３７℃の水分に曝露される結果として、変性または凝集し、生物学的活性の喪失および可能な免疫原性の変化を結果としてもたらす場合がある。関与する機構に応じた、安定化のための妥当な戦略を案出することができる。例えば、凝集機構は、チオ－ジスルフィド交換を介する、分子間Ｓ－Ｓ結合の形成であることがわかっていれば、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥させ、水分含量を制御し、適切な添加剤を使用し、特異的なポリマーマトリックス組成物を開発することにより達成することができる。
使用
本発明の抗体は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、およびｉｎ ｖｉｖｏにおける治療法において使用することができる。本発明の抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、および／またはｉｎ ｖｉｖｏにおける特異的抗原活性を、部分的または完全に遮断するアンタゴニストとして使用することができる。さらに、本発明の抗体の少なくとも一部は、他の種に由来する抗原活性を中和しうる。したがって、本発明の抗体を使用して、例えば、抗原を含有する細胞培養物中、ヒト対象、または、本発明の抗体が交差反応する抗原を有する他の哺乳動物対象（例えば、チンパンジー、ヒヒ、マーモセット、カニクイザル、およびアカゲザル、ブタ、またはマウス）における特異的抗原活性を阻害することができる。一実施形態では、本発明の抗体は、抗原活性を阻害するように、抗体を抗原と接触させることにより、抗原活性を阻害するために使用することができる。一実施形態では、抗原は、ヒトタンパク質分子である。
一実施形態では、本発明の抗体は、抗原活性が有害である障害を患う対象において、抗原を阻害するための方法であって、対象における抗原活性を阻害するように、対象に、本発明の抗体を投与するステップを含む方法において使用することができる。一実施形態では、抗原は、ヒトタンパク質分子であり、対象は、ヒト対象である。代替的に、対象は、本発明の抗体が結合する抗原を発現させる哺乳動物でありうる。なおさらに、対象は、抗原を導入した（例えば、抗原の投与により、または抗原導入遺伝子の発現により）哺乳動物でありうる。本発明の抗体は、ヒト対象に、治療目的で投与することができる。さらに、本発明の抗体は、抗体が交差反応する抗原を発現させる非ヒト哺乳動物（例えば、霊長動物、ブタ、またはマウス）に、獣医学的目的で、またはヒト疾患の動物モデルとして、投与することもできる。後者に関して、このような動物モデルは、本発明の抗体の治療有効性の評価（例えば、投与量および投与の時間経過についての検査）に有用でありうる。本発明の抗体を使用して、ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ ＨおよびＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ化タンパク質（ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬ
ＯＢＯ Ｈａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）の異常な発現および／または活性と関連する疾患、障害、または状態であって、がん、筋障害、ユビキチン経路関連の遺伝子障害、免疫／炎症性障害、神経障害、および他のユビキチン経路関連障害を含むがこれらに限定されない疾患、障害、または状態を処置するか、阻害するか、進行を遅延させるか、再発を防止する／遅延させるか、回復させるか、または防止することができる。
一態様では、本発明の遮断抗体は、ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈに特異的である。
ある特定の実施形態では細胞傷害剤とコンジュゲートさせた本発明の抗体を含むイムノコンジュゲートを、患者に投与する。一部の実施形態では、イムノコンジュゲート、および／またはそれが結合する抗原は、それらの細胞表面上にＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈと関連する１つまたは複数のタンパク質を発現させる細胞により内部化され、結果として、それが会合する標的細胞の殺滅におけるイムノコンジュゲートの治療有効性の増大をもたらす。一実施形態では、細胞傷害剤は、標的細胞内の核酸を標的化するか、またはこれに干渉する。このような細胞傷害剤の例は、本明細書で言及される化学療法剤（メイタンシノイドまたはカリケアマイシンなど）、放射性同位元素、またはリボヌクレアーゼもしくはＤＮＡエンドヌクレアーゼのうちのいずれかを含む。
本発明の抗体は、治療において、単独で、または他の組成物と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明の抗体は、別の抗体および／またはアジュバント／治療剤（例えば、ステロイド）と共に共投与することができる。例えば、本発明の抗体は、処置スキームにおいて、例えば、がん、筋障害、ユビキチン経路関連の遺伝子障害、免疫／炎症性障害、神経障害、および他のユビキチン経路関連障害を含む、本明細書で記載される疾患のうちのいずれかの処置において、抗炎症剤および／または消毒薬と組み合わせることができる。上で言及された、このような組み合わせ療法は、組み合わせ投与（２つまたはこれを超える薬剤が、同じ製剤中または個別の製剤中に含まれる場合）と、個別投与とを含み、個別投与の場合、本発明の抗体の投与は、１つまたは複数の補助療法の投与の前、および／またはこれらの後で施すことができる。
本発明の抗体（および補助療法剤）は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、および鼻腔内、ならびに、局所的処置に所望の場合、病変内投与を含む任意の適切な手段により投与することができる。非経口注入は、筋内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、または皮下投与を含む。加えて、抗体は、特に、抗体の用量を減じるパルス注入により投与するのに適する。投薬は、任意の適切な経路によって、例えば、投与が短期であるのか、長期であるのかに部分的に応じて、静脈内または皮下注射などの注射を介することが可能である。
抗体の調製および投与では、本発明の抗体の結合標的の位置を考慮する場合がある。結合標的が、細胞内分子である場合、本発明のある特定の実施形態は、結合標的が位置する細胞に導入される抗体またはその抗原結合性断片を提供する。一実施形態では、本発明の抗体は、細胞内でイントラボディー（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）として発現させることができる。本明細書で使用される「イントラボディー」という用語は、Ｍａｒａｓｃｏ、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、４巻：１１～１５頁（１９９７年）；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３４巻：１６３～１７０頁（２００４年）；米国特許第６，００４，９４０号および同第６，３２９，１７３号；米国特許出願公開第２００３／０１０４４０２号；ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ２００３／０７７９４５号において記載されている通り、細胞内で発現し、標的分子に選択的に結合することが可能な、抗体またはその抗原結合性部分を指す。イントラボディーの細胞内発現は、所望の抗体またはその抗原結合性部分をコードする核酸（その抗体または抗原結合性断片をコードする遺伝子と通常関連する、野生型
のリーダー配列および分泌シグナルを欠く）を、標的細胞に導入することによりなされる。核酸を細胞に導入する、任意の標準的な方法であって、微量注射、遺伝子銃注射、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム、および、目的の核酸を保有するレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびワクシニアベクターによるトランスフェクションを含むがこれらに限定されない方法を使用することができる。ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈへの細胞内結合、および１つまたは複数のＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ媒介性細胞内経路のモジュレーションが可能な、１つまたは複数のイントラボディーを発現させるように、本発明の抗ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４／ＧＬＯＢＯ Ｈ抗体の全部または一部分をコードする、１つまたは複数の核酸を、標的細胞に送達することができる。
別の実施形態では、内部化抗体が提供される。抗体は、抗体の細胞への送達を増強するある特定の特徴を保有する場合もあり、このような特徴を保有するように修飾される場合もある。当技術分野では、これを達成するための技法が公知である。例えば、抗体のカチオン化は、その細胞への取込みを容易とすることが公知である（例えば、米国特許第６，７０３，０１９号を参照されたい）。また、リポフェクションまたはリポソームも、抗体を細胞に送達するのに使用することができる。抗体断片を使用する場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小の阻害性断片が一般に有利である。例えば、抗体の可変領域配列に基づき、標的タンパク質配列に結合する能力を保持するペプチド分子をデザインすることができる。このようなペプチドは、化学合成する、かつ／または組換えＤＮＡ技術により作製することができる。例えば、Ｍａｒａｓｃｏら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９０巻：７８８９～７８９３頁（１９９３年）を参照されたい。
モジュレーターポリペプチドの、標的細胞への侵入は、当技術分野で公知の方法により増強することができる。例えば、ＨＩＶ ＴａｔまたはＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオドメインタンパク質に由来する配列など、ある特定の配列は、異種タンパク質の、細胞膜を横切る効率的な取込みを誘導することが可能である。例えば、Ｃｈｅｎら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９９９年）、９６巻：４３２５～４３２９頁を参照されたい。
結合標的が脳内に位置する場合、本発明のある特定の実施形態は、血液脳関門を越える抗体またはその抗原結合性断片を提供する。ある特定の神経変性疾患は、抗体または抗原結合性断片が、脳にたやすく導入されうるような、血液脳関門の透過性の増大と関連する。血液脳関門が無傷を維持する場合は、物理的方法、脂質ベースの方法、ならびに受容体およびチャネルベースの方法を含むがこれらに限定されない、血液脳関門を横切って分子を輸送するための、当技術分野で公知のいくつかの手法が存在する。
抗体または抗原結合性断片を、血液脳関門を横切って輸送する、物理的方法は、血液脳関門を全体として迂回する方法、または血液脳関門内に開口部を創出する方法を含むがこれらに限定されない。迂回法は、脳への直接的注射（例えば、Ｐａｐａｎａｓｔａｓｓｉｏｕら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、９巻：３９８～４０６頁（２００２年）を参照されたい）、間質内注入／対流増強型送達（例えば、Ｂｏｂｏら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９１巻：２０７６～２０８０頁（１９９４年）を参照されたい）、および送達デバイスの脳内への植込み（例えば、Ｇｉｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．、９巻：５８９～５９５頁（２００３年）；およびＧｌｉａｄｅｌ Ｗａｆｅｒｓ（商標）、Ｇｕｉｌｄｆｏｒｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌを参照されたい）を含むがこれらに限定されない。関門内に開口部を創出する方法は、超音波（例えば、米国特許公開第２００２／００３８０８６号を参照されたい）、浸透圧（例えば、高張性マンニトールの投与による（Ｎｅｕｗｅｌｔ， Ｅ． Ａ．、Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
ｔｈｅ Ｂｌｏｏｄ－Ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ ａｎｄ ｉｔｓ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ、１および２巻、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年）））、例えば、ブラジキニンまたは透過剤Ａ－７による透過処理（例えば、米国特許第５，１１２，５９６号、同第５，２６８，１６４号、同第５，５０６，２０６号、および同第５，６８６，４１６号を参照されたい）、および血液脳関門を夾叉するニューロンの、抗体または抗原結合性断片をコードする遺伝子を含有するベクターによるトランスフェクション（例えば、米国特許公開第２００３／００８３２９９号を参照されたい）を含むがこれらに限定されない。
抗体または抗原結合性断片を、血液脳関門を横切って輸送する、脂質ベースの方法は、抗体または抗原結合性断片を、血液脳関門の血管内皮上の受容体に結合する抗体または抗原結合性断片にカップリングさせたリポソーム内に封入する方法（例えば、米国特許出願公開第２００２００２５３１３号を参照されたい）、および抗体または抗原結合性断片を、低密度リポタンパク質粒子（例えば、米国特許出願公開第２００４０２０４３５４号を参照されたい）またはアポリポタンパク質Ｅ（例えば、米国特許出願公開第２００４０１３１６９２号を参照されたい）でコーティングする方法を含むがこれらに限定されない。
抗体または抗原結合性断片を、血液脳関門を横切って輸送する、受容体およびチャネルベースの方法は、グルココルチコイド遮断剤を使用して、血液脳関門の透過性を増大させる方法（例えば、米国特許出願公開第２００２／００６５２５９号、同第２００３／０１６２６９５号、および同第２００５／０１２４５３３号を参照されたい）；カリウムチャネルを活性化させる方法（例えば、米国特許出願公開第２００５／００８９４７３号を参照されたい）、ＡＢＣ薬物輸送体を阻害する方法（例えば、米国特許出願公開第２００３／００７３７１３号を参照されたい）；抗体をトランスフェリンでコーティングし、１つまたは複数のトランスフェリン受容体の活性をモジュレートする方法（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１２９１８６号を参照されたい）、および抗体をカチオン化する方法（例えば、米国特許第５，００４，６９７号を参照されたい）を含むがこれらに限定されない。
本発明の抗体組成物は、「医薬品の製造および品質管理に関する基準（ｇｏｏｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ）」に準拠する方式で、製剤化、投薬および投与される。この文脈で検討される因子は、処置される特定の障害、処置される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与法、投与のスケジュール指定、および医療従事者に公知の他の因子を含む。抗体は、問題の障害を防止または処置するのに現在使用されている、１つまたは複数の薬剤と共に製剤化する必要はないが、任意選択で、これらと共に製剤化される。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する本発明の抗体の量、障害または処置の種類、および上で論じた他の因子に依存する。これらは、一般に、本明細書で記載される通り同じ投与量および投与経路で、または本明細書で記載される投与量の約１～９９％で、または経験的／臨床的に適切であると決定される任意の投与量および任意の経路で使用される。
疾患を防止または処置するために、本発明の抗体の適切な投与量（単独で、または、化学療法剤など、他の薬剤と組み合わせて使用する場合）は、処置される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度および経過、抗体が予防目的で投与されるのか、治療目的で投与されるのか、以前の治療、患者の臨床歴および抗体への応答、ならびに主治医の判断に依存する。抗体は、患者に一度に、または一連の処置にわたり投与するのに適する。疾患の種類および重症度に応じて、抗体約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）が、例えば、１回または複数回の個別投与によるのであれ、連続注入によるのであれ、患者に投与するための初期の候補投与量でありうる。典型的な毎日の１回分の投与量は、上で言及した因子に応じて、約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇま
たはこれを超える範囲でありうる。数日間またはこれを超えて長期にわたる繰返し投与では、状態に応じて、処置は一般に、疾患症状の所望される抑制が生じるまで持続される。１つの例示的な抗体の投与量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇのうちの１つまたは複数の用量（またはこれらの任意の組み合わせ）を、患者に投与することができる。このような用量は、間欠的に、例えば、毎週または３週間ごとに（例えば、患者が抗体の、約２～約２０用量、または例えば、約６用量を受けるように）投与することができる。初期の高負荷用量に続き、１回または複数回の低用量を投与することができる。例示的な投薬レジメンは、初期負荷用量約４ｍｇ／ｋｇに続いて、毎週の維持用量約２ｍｇ／ｋｇの抗体を投与することを含む。しかし、他の投与レジメンも、有用でありうる。この治療の進捗状況は、従来の技法およびアッセイにより、容易にモニタリングされる。
製品
本発明の別の態様では、上で記載した障害の処置、防止、および／または診断に有用な材料を含有する製品が提供される。製品は、容器、および容器上における標識もしくはパッケージ添付文書、または容器と関連する標識もしくはパッケージ添付文書を含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどを含む。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成することができる。容器は、それ自体で、または別の組成物と組み合わされると、状態を処置、防止、および／または診断するのに有効な組成物を保持し、滅菌アクセスポートを含みうる（例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針で穿刺可能な止栓を有するバイアルの場合がある）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明の抗体である。標識またはパッケージ添付文書は、組成物が、選択した状態を処置するために使用されることを指し示す。さらに、製品は、（ａ）組成物がその中に含有された第１の容器であって、組成物が本発明の抗体を含む、容器と；（ｂ）組成物がその中に含有された第２の容器であって、組成物がさらなる細胞傷害性またはこれ以外の治療剤を含む、容器とを含みうる。本発明のこの実施形態における製品は、組成物を使用して、特定の状態を処置しうることを指し示す、パッケージ添付文書もさらに含みうる。代替的に、または加えて、製品は、静菌性注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液、およびテキストロース溶液など、薬学的に許容される緩衝液を含む第２の（または第３の）容器もさらに含みうる。製品は、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジを含む、商業上のおよび使用者の観点から望ましい他の材料もさらに含む。
以下は、本発明の方法および組成物の例である。上で提供される一般記載を考慮して、種々の他の実施形態が実施され得ることが理解される。
一部の実施形態では、提供されたグリカンコンジュゲート、免疫原性組成物またはワクチンは、聴神経腫瘍、腺癌、副腎がん、肛門がん、血管肉腫（ａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ）（例えば、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、血管肉腫（ｈｅｍａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ））、虫垂がん、良性単クローン性高ガンマグロブリン血症、胆道がん（ｂｉｌｉａｒｙ ｃａｎｃｅｒ）（例えば、胆管癌）、膀胱がん、乳がん（例えば、乳房の腺癌、乳房の乳頭癌、乳腺がん（ｍａｍｍａｒｙ ｃａｎｃｅｒ）、乳房の髄様癌）、脳がん（例えば、髄膜腫；神経膠腫、例えば、星状細胞腫、希突起神経膠腫；髄芽腫）、気管支がん、カルチノイド腫瘍、子宮頸がん（例えば、子宮頸部腺癌）、絨毛癌、脊索腫、頭蓋咽頭腫、結腸直腸がん（例えば、結腸がん、直腸がん、結腸直腸腺癌）、上皮癌、上衣腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）（例えば、カポジ肉腫、多発性特発性出血性肉腫（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｓａｒｃｏｍａ））、子宮内膜
がん（例えば、子宮がん、子宮肉腫）、食道がん（例えば、食道の腺癌、バレット腺癌（Ｂａｒｒｅｔｔ’ｓ ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ））、ユーイング肉腫、眼がん（例えば、眼球内黒色腫、網膜芽細胞腫）、家族性過好酸球増加症、胆嚢がん、胃がん（例えば、胃腺癌）、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮癌、口腔がん（例えば、口腔扁平上皮癌（ＯＳＣＣ）、咽頭（ｔｈｒｏａｔ）がん（例えば、喉頭がん、咽頭（ｐｈａｒｙｎｇｅａｌ）がん、上咽頭がん、中咽頭がん））、造血性がん（例えば、白血病、例えば、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）（例えば、Ｂ細胞ＡＬＬ、Ｔ細胞ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）（例えば、Ｂ細胞ＡＭＬ、Ｔ細胞ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）（例えば、Ｂ細胞ＣＭＬ、Ｔ細胞ＣＭＬ）、および慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）（例えば、Ｂ細胞ＣＬＬ、Ｔ細胞ＣＬＬ）；リンパ腫、例えば、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）（例えば、Ｂ細胞ＨＬ、Ｔ細胞ＨＬ）および非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）（例えば、Ｂ細胞ＮＨＬ、例えば、びまん性大細胞型リンパ腫（ＤＬＣＬ）（例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ））、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ性白血病／小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（例えば、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）リンパ腫、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ｎｏｄａｌ ｍａｒｇｉｎａｌ ｚｏｎｅ Ｂ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、脾臓辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ｓｐｌｅｎｉｃ ｍａｒｇｉｎａｌ ｚｏｎｅ Ｂ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ））、縦隔原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫（ｐｒｉｍａｒｙ ｍｅｄｉａｓｔｉｎａｌ Ｂ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫（すなわち、「ワルデンシュトレームマクログロブリン血症」）、ヘアリーセル白血病（ＨＣＬ）、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫および原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫；ならびにＴ細胞ＮＨＬ、例えば、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ Ｔ－ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｙｍｐｈｏｍａ）／白血病、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）（例えば、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）（例えば、菌状息肉症（ｍｙｃｏｓｉｓ ｆｕｎｇｉｏｄｅｓ）、セザリー症候群）、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫（ｅｘｔｒａｎｏｄａｌ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ Ｔ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、腸症型Ｔ細胞リンパ腫（ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｙ ｔｙｐｅ Ｔ－ｃｅｌｌ
ｌｙｍｐｈｏｍａ）、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫）；上記１つまたは複数の白血病／リンパ腫の混合；ならびに多発性骨髄腫（ＭＭ））、重鎖病（例えば、アルファ鎖病、ガンマ鎖病、ミュー鎖病）、血管芽細胞腫、炎症性筋線維芽細胞性腫瘍（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｉｃ ｔｕｍｏｒ）、免疫球性アミロイドーシス（ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｉｃ ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ）、腎臓がん（例えば、ウィルムス腫瘍としても知られる腎芽腫、腎細胞癌）、肝臓がん（例えば、肝細胞がん（ＨＣＣ）、悪性へパトーマ）、肺がん（例えば、気管支原性癌、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、肺の腺癌）、平滑筋肉腫（ＬＭＳ）、肥満細胞症（例えば、全身性肥満細胞症）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、中皮腫、骨髄増殖性障害（ＭＰＤ）（例えば、真性赤血球増加症（ＰＶ）、本態性血小板増加症（ＥＴ）、骨髄線維症（ＭＦ）としても知られる原発性骨髄線維症（ＡＭＭ）、慢性特発性骨髄線維症、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性好中球性白血病（ＣＮＬ）、好酸球増加症候群（ＨＥＳ））、神経芽細胞腫、神経線維腫（例えば、神経線維腫症（ＮＦ）１型または２型、神経鞘腫症）、神経内分泌がん（例えば、胃腸膵神経内分泌腫瘍（ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｔｒｉｎｅ ｔｕｍｏｒ）（ＧＥＰ－ＮＥＴ）、カルチノイド腫瘍）、骨肉腫、卵巣がん（例えば、嚢胞腺癌、卵巣胎児性癌、卵巣腺癌）、乳頭腺癌、膵臓がん（例えば、膵臓腺癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ａｎｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）、島細胞腫瘍）、陰茎がん（例えば、陰茎および陰嚢のパジェット病）、松果体腫、未分化神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＴ）、前立腺がん（例えば、前立腺腺癌）、直腸がん、横紋筋肉腫、唾液腺がん、皮膚がん（例えば、扁平上皮癌（ＳＣＣ）、角化棘細胞腫（ＫＡ）、黒色腫、基底細胞癌（ＢＣＣ））、小腸がん（例えば、虫垂がん）、軟組織肉腫（例えば、悪性線維性組
織球腫（ＭＦＨ）、脂肪肉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ）、軟骨肉腫、線維肉腫、粘液肉腫）、皮脂腺癌、汗腺癌、滑膜腫、精巣がん（例えば、セミノーマ、精巣胎児性癌）、甲状腺がん（例えば、甲状腺の乳頭癌、甲状腺乳頭癌（ＰＴＣ）、甲状腺髄様がん）、尿道がん、膣がんおよび外陰部がん（例えば、外陰部のパジェット病）を含むがこれらに限定されないがんを処置または診断するのに有用である。ある特定の実施形態では、提供されたグリカンコンジュゲート、免疫原性組成物またはワクチンは、脳がん、肺がん、乳がん、口腔がん、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆管がん、膵臓がん、結腸がん、腎臓がん、骨がん、皮膚がん、子宮頸がん、卵巣がん、および前立腺がんを処置するために有用である。
本明細書で記載される処置方法を実施するために、本明細書で記載されるグリカンコンジュゲート、または免疫原性組成物またはワクチンのいずれかの有効量が、上記のように、適切な経路を介して処置を必要とする対象に投与されうる。ヒト対象などの対象は、がんを有するか、がんを有することが疑われるか、またはがんに対して感受性の患者でありうる。対象に投与されたグリカンコンジュゲートまたは免疫原性組成物の量は、コンジュゲートまたは組成物中のグリカン部分に対して特異的な免疫応答を誘発するのに有用となり得る。一部の実施形態では、グリカンコンジュゲートまたは免疫原性組成物の量は、がんの成長の阻害および／または腫瘍量（ｔｕｍｏｒ ｍａｓｓ）の低減をもたらす免疫応答を誘発するのに十分である。他の実施形態では、グリカンコンジュゲートまたは免疫原性組成物の量は、標的がんの発病を遅延させるまたはがんを発症する危険性を低減させるのに有効でありうる。有効量を達成するために必要な提供されたグリカンコンジュゲート、免疫原性組成物またはワクチンの正確な量は、例えば、対象の種、年齢、および全身状態、副作用または障害の重症度、特定の化合物の正体、投与様式などに依存して、対象ごとに変動する。所望の投与量は、１日３回、１日２回、１日１回、１日おき、３日ごと、毎週、２週間ごと、３週間ごと、または４週間ごとに、送達されうる。ある特定の実施形態では、所望の投与量は、複数回の投与（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、またはそれを超える回数の投与）を使用して送達されうる。
ある特定の実施形態では、７０ｋｇの成人への１日に１回または複数回の投与のための、提供されたグリカンコンジュゲート、免疫原性組成物またはワクチンの有効量は、単位剤形当たり、約０．０００１ｍｇ～約３０００ｍｇ、約０．０００１ｍｇ～約２０００ｍｇ、約０．０００１ｍｇ～約１０００ｍｇ、約０．００１ｍｇ～約１０００ｍｇ、約０．０１ｍｇ～約１０００ｍｇ、約０．１ｍｇ～約１０００ｍｇ、約１ｍｇ～約１０００ｍｇ、約１ｍｇ～約１００ｍｇ、約１０ｍｇ～約１０００ｍｇ、または約１００ｍｇ～約１０００ｍｇの化合物を含みうる。
ある特定の実施形態では、提供されたグリカンコンジュゲート、免疫原性組成物またはワクチンは、所望の治療効果を得るために、１日に１回または複数回で、１日当たり対象の体重１ｋｇ当たり約０．００１ｍｇ～約１００ｍｇ、約０．０１ｍｇ～約５０ｍｇ、好ましくは約０．１ｍｇ～約４０ｍｇ、好ましくは約０．５ｍｇ～約３０ｍｇ、約０．０１ｍｇ～約１０ｍｇ、約０．１ｍｇ～約１０ｍｇ、より好ましくは約１ｍｇ～約２５ｍｇを送達するのに十分な投与量レベルで、経口または非経口投与されうる。
本明細書で記載される用量範囲は、成体への提供されたグリカンコンジュゲート、免疫原性組成物またはワクチンの投与のためのガイダンスを提供することを理解されたい。例えば、小児または青年に投与すべき量は、医療従事者または当業者によって決定されえ、成体に投与される量よりも低いまたはそれと同じでありうる。
提供されたグリカンコンジュゲート、免疫原性組成物またはワクチンは、１つまたは複
数のさらなる治療的活性剤と組み合わせて投与されうることもまた理解されたい。提供されたグリカンコンジュゲート、免疫原性組成物またはワクチンは、それらのバイオアベイラビリティを改善する、それらの代謝を低減および／もしくは修飾する、それらの排泄を阻害する、ならびに／または体内でのそれらの分布を修飾するさらなる治療的活性剤と組み合わせて投与されうる。使用される治療は、同じ障害に対する所望の効果を達成しうる、および／または異なる効果を達成しうることもまた理解されたい。
提供されたグリカンコンジュゲート、免疫原性組成物またはワクチンは、１つまたは複数のさらなる治療的活性剤と同時発生的に、その前に、またはその後に投与されうる。一般に、各薬剤は、その薬剤について決定された用量でおよび／またはタイムスケジュールで投与される。この組み合わせにおいて活用されるさらなる治療的活性剤は、単一の組成物中で一緒に投与されうる、または異なる組成物中で別々に投与されうることをさらに理解されたい。レジメンにおいて使用する特定の組み合わせは、本発明の化合物と、さらなる治療的活性剤および／または達成すべき所望の治療効果との適合性を考慮に入れる。一般に、組み合わせ中で活用されるさらなる治療的活性剤は、それらが個々に活用されるときのレベルを超えないレベルで活用されると予測される。一部の実施形態では、組み合わせ中で活用されるレベルは、個々に活用されるレベルよりも低い。
ある特定の実施形態では、提供されたグリカンコンジュゲート、免疫原性組成物またはワクチンは、本明細書で記載される１つまたは複数のさらなる医薬品剤（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｇｅｎｔ）と組み合わせて投与される。ある特定の実施形態では、さらなる医薬品剤は、抗がん剤である。抗がん剤は、生物療法的抗がん剤（ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉ－ｃａｎｃｅｒ ａｇｅｎｔ）ならびに化学療法剤を包含する。
例示的な生物療法的抗がん剤は、インターフェロン、サイトカイン（例えば、腫瘍壊死因子、インターフェロンα、インターフェロンγ）、ワクチン、造血成長因子、モノクローナル血清療法、免疫賦活薬および／または免疫調節剤（例えば、ＩＬ－１、２、４、６、または１２）、免疫細胞増殖因子（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ）および抗体（例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（トラスツズマブ）、Ｔ－ＤＭ１、ＡＶＡＳＴＩＮ（ベバシズマブ）、ＥＲＢＩＴＵＸ（セツキシマブ）、ＶＥＣＴＩＢＩＸ（パニツムマブ）、ＲＩＴＵＸＡＮ（リツキシマブ）、ＢＥＸＸＡＲ（トシツモマブ））を含むがこれらに限定されない。
例示的な化学療法剤は、抗エストロゲン薬（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、およびメゲストロール）、ＬＨＲＨアゴニスト（例えば、ゴセレリン（ｇｏｓｃｒｃｌｉｎ）およびロイプロリド）、抗アンドロゲン薬（例えば、フルタミドおよびビカルタミド）、光線力学的治療（例えば、ベルテポルフィン（ｖｅｒｔｏｐｏｒｆｉｎ）（ＢＰＤ－ＭＡ）、フタロシアニン、光感受性物質Ｐｃ４、およびデメトキシ－ヒポクレリンＡ（ｄｅｍｅｔｈｏｘｙ－ｈｙｐｏｃｒｅｌｌｉｎ Ａ）（２ＢＡ－２－ＤＭＨＡ））、窒素マスタード（例えば、シクロホスファミド、イホスファミド、トロホスファミド、クロランブシル、エストラムスチン、およびメルファラン）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ））、アルキルスルホネート（例えば、ブスルファンおよびトレオスルファン）、トリアゼン（例えば、ダカルバジン、テモゾロミド）、白金含有化合物（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン）、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびビノレルビン）、タキソイド（例えば、パクリタキセルまたはパクリタキセル等価物、例えば、ナノ粒子アルブミン結合型パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ）、ドコサヘキサエン酸結合型パクリタキセル（ＤＨＡ－パクリタキセル、Ｔａｘｏｐｒｅｘｉｎ）、ポリグルタミン酸結合型パクリタキセル（ＰＧ－パクリタキセル、パクリタキセルポリグルメクス、ＣＴ－２１０３、ＸＹＯＴＡＸ）、腫瘍活性化プロドラッグ（ＴＡＰ）ＡＮＧ１００
５（３分子のパクリタキセルに結合したＡｎｇｉｏｐｅｐ－２）、パクリタキセル－ＥＣ－１（ｅｒｂＢ２認識ペプチドＥＣ－１に結合したパクリタキセル）、およびグルコース－コンジュゲート化パクリタキセル、例えば、２’－パクリタキセルメチル２－グルコピラノシルスクシネート（２’－ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ｍｅｔｈｙｌ ２－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）；ドセタキセル、タキソール）、エピポドフィリン（ｅｐｉｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎ）（例えば、エトポシド、リン酸エトポシド、テニポシド、トポテカン、９－アミノカンプトテシン、カンプトイリノテカン（ｃａｍｐｔｏｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、イリノテカン、クリスナトール（ｃｒｉｓｎａｔｏｌ）、マイトマイシンＣ（ｍｙｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ））、代謝拮抗剤、ＤＨＦＲ阻害剤（例えば、メトトレキセート、ジクロロメトトレキセート、トリメトレキセート、エダトレキセート）、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ阻害剤（例えば、ミコフェノール酸、チアゾフリン、リバビリン、およびＥＩＣＡＲ）、リボヌクレオチド（ｒｉｂｏｎｕｃｌｏｔｉｄｅ）レダクターゼ阻害剤（例えば、ヒドロキシウレアおよびデフェロキサミン）、ウラシル類似体（例えば、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、フロクスウリジン、ドキシフルリジン、ラルチトレキセド（ｒａｔｉｔｒｅｘｅｄ）、テガフール－ウラシル、カペシタビン）、シトシン類似体（例えば、シタラビン（ａｒａＣ）、シトシンアラビノシド、およびフルダラビン）、プリン類似体（例えば、メルカプトプリンおよびチオグアニン）、ビタミンＤ３類似体（例えば、ＥＢ １０８９、ＣＢ １０９３、およびＫＨ １０６０）、イソプレニル化阻害剤（例えば、ロバスタチン）、ドーパミン作動性神経毒（例えば、１－メチル－４－フェニルピリジニウムイオン）、細胞周期阻害剤（例えば、スタウロスポリン）、アクチノマイシン（例えば、アクチノマイシンＤ、ダクチノマイシン）、ブレオマイシン（例えば、ブレオマイシンＡ２、ブレオマイシンＢ２、ペプロマイシン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ペグ化リポソームドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ピラルビシン、ゾルビシン、ミトキサントロン）、ＭＤＲ阻害剤（例えば、ベラパミル）、Ｃａ２＋ ＡＴＰａｓｅ阻害剤（例えば、タプシガルジン）、イマチニブ、サリドマイド、レナリドミド、チロシンキナーセ阻害剤（例えば、アキシチニブ（ＡＧ０１３７３６）、ボスチニブ（ＳＫＩ－６０６）、セジラニブ（ＲＥＣＥＮＴＩＮ（商標）、ＡＺＤ２１７１）、ダサチニブ（ＳＰＲＹＣＥＬ（登録商標）、ＢＭＳ－３５４８２５）、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標））、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）、ＣＧＰ５７１４８Ｂ、ＳＴＩ－５７１）、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）、ＴＹＶＥＲＢ（登録商標））、レスタウルチニブ（ＣＥＰ－７０１）、ネラチニブ（ＨＫＩ－２７２）、ニロチニブ（ＴＡＳＩＧＮＡ（登録商標））、セマキサニブ（ｓｅｍａｘａｎｉｂ）（セマキシニブ、ＳＵ５４１６）、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）、ＳＵ１１２４８）、トセラニブ（ｔｏｃｅｒａｎｉｂ）（ＰＡＬＬＡＤＩＡ（登録商標））、バンデタニブ（ＺＡＣＴＩＭＡ（登録商標）、ＺＤ６４７４）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７、ＰＴＫ／ＺＫ）、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））、セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））、パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標））、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標））、ニロチニブ（ＴＡＳＩＧＮＡ（登録商標））、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標））、エベロリムス（ＡＦＩＮＩＴＯＲ（登録商標））、アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標））、ゲムツズマブオゾガマイシン（ＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標））、テムシロリムス（ＴＯＲＩＳＥＬ（登録商標））、ＥＮＭＤ－２０７６、ＰＣＩ－３２７６５、ＡＣ２２０、乳酸ドビチニブ（ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ ｌａｃｔａｔｅ）（ＴＫＩ２５８、ＣＨＩＲ－２５８）、ＢＩＢＷ ２９９２（ＴＯＶＯＫ（商標））、ＳＧＸ５２３、ＰＦ－０４２１７９０３、ＰＦ－０２３４１０６６、ＰＦ－２９９８０４、ＢＭＳ－７７７６０７、ＡＢＴ－８６９、ＭＰ４７０、ＢＩＢＦ １１２０（ＶＡＲＧＡＴＥＦ（登録商標））、ＡＰ２４５３４、ＪＮＪ－２６４８３３２７、ＭＧＣＤ２６５、ＤＣＣ－２０３６、ＢＭＳ－６９０１５４、ＣＥＰ－１１９８１、チボザニブ（ＡＶ－９５１）、ＯＳＩ－９３０、ＭＭ－１２１、ＸＬ－１８４、
ＸＬ－６４７、および／またはＸＬ２２８）、プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ））、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン、テムシロリムス（ＣＣＩ－７７９）、エベロリムス（ＲＡＤ－００１）、リダフォロリムス、ＡＰ２３５７３（Ａｒｉａｄ）、ＡＺＤ８０５５（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＢＥＺ２３５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＢＧＴ２２６（Ｎｏｒｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ７６５（Ｓａｎｏｆｉ Ａｖｅｎｔｉｓ）、ＰＦ－４６９１５０２（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＧＤＣ０９８０（Ｇｅｎｅｔｅｃｈ）、ＳＦ１１２６（Ｓｅｍａｆｏｅ）およびＯＳＩ－０２７（ＯＳＩ））、オブリメルセン、ゲムシタビン、カルミノマイシン、ロイコボリン、ペメトレキセド、シクロホスファミド、ダカルバジン、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂｉｚｉｎｅ）、プレドニゾロン、デキサメタゾン、カンパテシン（ｃａｍｐａｔｈｅｃｉｎ）、プリカマイシン、アスパラギナーゼ、アミノプテリン、メトプテリン（ｍｅｔｈｏｐｔｅｒｉｎ）、ポルフィロマイシン、メルファラン、ロイロシジン（ｌｅｕｒｏｓｉｄｉｎｅ）、ロイロシン（ｌｅｕｒｏｓｉｎｅ）、クロランブシル、トラベクテジン、プロカルバジン、ディスコデルモリド、カルミノマイシン、アミノプテリン、およびヘキサメチルメラミンを含むがこれらに限定されない。
ある特定の実施形態では、処置される対象は、哺乳動物である。ある特定の実施形態では、対象は、ヒトである。ある特定の実施形態では、対象は、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、またはヤギなどの家畜化された動物である。ある特定の実施形態では、対象は、イヌまたはネコなどのコンパニオン動物である。ある特定の実施形態では、対象は、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、またはヤギなどの家畜動物である。ある特定の実施形態では、対象は、動物園の動物である。別の実施形態では、対象は、齧歯動物、イヌ、または非ヒト霊長動物などの研究用動物である。ある特定の実施形態では、対象は、トランスジェニックマウスまたはトランスジェニックブタなどの非ヒトトランスジェニック動物である。
がん幹細胞バイオマーカー
不均質ながん組織の自己再生および腫瘍成長の原因となるがん幹細胞（ＣＳＣ）の発見は、新しいがん治療および早期診断の開発への関心を促進してきた。しかし、現在ＣＳＣの単離に使用されているマーカーは、しばしば、この特別な細胞集団の研究のためにＣＳＣを富化するのに十分に選択的ではない。ここで本発明者らは、ＣＤ４４＋ＣＤ２４－／ｌｏＳＳＥＡ－３＋またはＥＳＡｈｉＰＲＯＣＲｈｉＳＳＥＡ－３＋マーカーを有する単離された乳がん幹細胞（ＢＣＳＣ）が、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで従来のマーカーを用いるものよりも高い腫瘍形成性を有していたことを示す。ＣＤ４４＋ＣＤ２４－／ｌｏを有する１００個を超える細胞と比較して、ＣＤ４４＋ＣＤ２４－／ｌｏＳＳＥＡ－３＋を有するわずか１０個の細胞が、マウスにおいて腫瘍を形成した。グロボ系経路においてβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ５（β３ＧａｌＴ５）をコードする遺伝子のノックダウンによってＳＳＥＡ－３発現を抑制すると、がん細胞のアポトーシスが特異的にもたらされたが、正常細胞に対しては効果がなかった。この知見は、幹細胞（ＥＳＣおよびｉＰＳＣ）におけるＳＳＥＡ－３、ならびに２つの関係するグロボ系エピトープＳＳＥＡ４およびｇｌｏｂｏ－Ｈ、ならびに様々な正常な細胞およびがん細胞を分析することによって、ならびにグロボ系グリカンを標的化する抗体手法および乳がんワクチンの最終段階の臨床治験によってさらに裏付けられる。
がん幹細胞は、自己再生および腫瘍成長特性を有するがん細胞の特別な集団であり、抗がん治療の開発のための重要な標的である。本発明者らは、ステージ特異的胚抗原３（ＳＳＥＡ－３）と呼ばれる糖脂質が、乳がん幹細胞の表面上に排他的に発現したこと、および公知のタンパク質マーカー（ＣＤ２４およびＣＤ４４）と組み合わされると、乳がん幹細胞が著しく富化され、腫瘍を成長させるのに、わずか１０個のこのような富化細胞が使
用され得ることを見出した。さらに、ＳＳＥＡ３の合成に関与する酵素ガラクトシルトランスフェラーゼ（β３ＧａｌＴ５）は、乳がん幹細胞およびがん細胞に特異的に発現されるが、正常細胞には発現されず、がん細胞の生存に、ＳＳＥＡ３およびβ３ＧａｌＴ５の両方が必須であることが見出される。これらの知見は、新しい抗がん戦略の開発に至っている。
がん幹細胞（ＣＳＣ）は、自己再生および腫瘍始原の能力を有する希少細胞であり、がんの進行に密接に関係し、有効な治療および初期診断のための特異的な標的である（１～５）。現在まで、多くのがん幹細胞が同定され、タンパク質マーカーによって特徴付けられている。乳がん幹細胞（ＢＣＳＣ）は、最初、Ｃｌａｒｋｅらによって２００３年に発見され、ＣＤ４４＋ＣＤ２４－／ｌｏ発現を有する乳がん細胞が、他のものよりも高いレベルの腫瘍形成性を有し、このような細胞約１００個により、動物に腫瘍が形成され得ることが実証された（６）。さらに、ＡＬＤＨ－１、ＣＤ１３３、ＣＤ３２６（ＥＳＡ）、ＣＤ２０１（ＰＲＯＣＲ）、およびそれらの組合せなどの他のタンパク質も、ＢＣＳＣバイオマーカーとして報告されている（７～９）。しかし、これらのマーカーに基づいて富化プロセスから得られたＢＣＳＣは、まだ多数の非がん幹細胞を含有しており、このような細胞の研究によって、がん幹細胞の非特異的な特徴が提供されるはずである。したがって、分析および研究のためにより良好に定義されたＢＣＳＣを富化し、得るためには、新しいマーカーが必要である。
糖脂質は、がんの発生中に変わることが公知である（１０～１５）。本発明者らの以前の研究では、グロボ系グリカンＳＳＥＡ－３（Ｇｂ５）、ＳＳＥＡ－４（シアリル－Ｇｂ５）およびｇｌｏｂｏ－Ｈ（フコシル－Ｇｂ５）は、乳がんおよびＢＣＳＣを含む多くのがんの細胞表面上に排他的に見出される（１６～１８）。本発明者らはまた、ＥＳＡｈｉＰＲＯＣＲｈｉまたはＣＤ４４＋ＣＤ２４－／ｌｏのいずれかを担持しているＢＣＳＣが、これらのグロボ系エピトープの高度な発現を示すことを報告した（１９）。ＳＳＥＡ－３は、β３ＧａｌＴ５によってＧｂ４から合成され（２０）、ｇｌｏｂｏ－ＨおよびＳＳＥＡ－４は、それぞれフコシルトランスフェラーゼ１、２（ＦＵＴ１、ＦＵＴ２）（２１、２２）およびＳＴ３β－ガラクトシドα－２，３－シアリルトランスフェラーゼ２（ＳＴ３Ｇａｌ２）（２３）によって、ＳＳＥＡ－３から合成される。
本発明者らは、ＳＳＥＡ－３に関して、グロボ系経路において関係するグリカンおよび酵素が、がん特異的であり、ＢＣＳＣマーカーとなることを本明細書において報告する。
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を裏付けるために含まれる。以下の実施例に開示される技法は、本発明者らが発見した技法が、本発明の実施において良好に機能することを示し、したがって、その実施のための好ましい様式を構成すると解釈されうることを、当業者は理解すべきである。しかし、本開示の観点から、当業者は、本発明の精神および範囲から逸脱することなしに、開示された特定の実施形態において多くの変化がなされ、類似または同様の結果がなおも得られうることを理解すべきである。
（実施例１）
ＳＳＥＡ３類似体の例示的合成
化合物Ｇｂ４類似体、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ガラクトース類似体、ホスホエノールピルベート、ＭｇＣｌ２を、酵素ガラクトキナーゼ（ＧａｌＫ）、ＵＤＰ－糖ピロホスホリラーゼ（ＡｔＵＳＰ）、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＬｇｔＤ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、および無機ピロホスファターゼ（ＰＰＡ）を溶液中で合わせ、反応を、ｐＨを７．０に制御しながら室温で開始し、反応を、それ以上の生成物が観察できなくなるまでＴＬＣによってモニターした。反応が完了した後、反応混合物中のタンパク質を３０分間加熱することによって除去し、続いて、遠心分離し、０．２２μＭフィルターで濾過した。次いで、濾液をＣ－１８ゲルクロマトグラフィーによって精製した。画分を収集し、ＴＬＣによってモニターした。
（実施例２）
ＳＳＥＡ４類似体の例示的合成
方法１：ＳＳＥＡ４－Ｇｃの化学的合成
化合物１～６を、文献で報告された方法によって調製した。ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）６ｍＬ中のアクセプター３（９３ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）およびイミデート６（７６ｍｇ、０．０６８ｍｍｏｌ）の溶液に、粉末モレキュラーシーブ（４Ａ、０．５ｇ）を添加した。混合物を室温で２時間撹拌した。－１０℃に冷却した後、ＴＭＳＯＴｆ（５μＬ、０．０３ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を５℃（冷蔵室）で一晩撹拌した。反応混合物を、トリエチルアミン（０．５ｍＬ）を添加することによってクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、セライトパットを通して濾過した。濾液を、飽和炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残留物を、フラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中の５０～１００％ＥｔＯＡｃ）によって精製し、二糖のイミデート６に由来する不純物が混入している六糖７を得た。収率はＮＭＲによって推定される（９０ｍｇ、６８％）。
氷酢酸（５．０ｍＬ）中の六糖７（９０ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）の溶液へ、亜鉛末（１ｇ）を添加し、混合物を、ＴＬＣ分析によって化合物７が消費されるまで、１～２時間撹拌した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、セライトパッドを通して濾過し、減圧下で濃縮した。残留物を、ピリジン／Ａｃ２Ｏ（１：１、２．０ｍＬ）中に溶解し、１時間撹拌し、濃縮した。残留物を、フラッシュシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し
た。アシル化材料を無水ＣＨ２Ｃｌ２およびＭｅＯＨ（２：８、１０ｍＬ）中に溶解し、ＮａＯＭｅ（４５ｍｇ）で処理した。室温で４時間撹拌した後、水（０．２ｍＬ）を添加し、得られた混合物を１６時間撹拌した。反応混合物をアンバーリストＩＲ－１２０で中和し、濾過し、濃縮した。残留物を逆相クロマトグラフィー（ＲＰ－１８）によって精製した。
メタノール／水／酢酸（１０：１０：０．５、６ｍＬ）の混合物中の付加物に、水酸化パラジウム（木炭中２０％、５０ｍｇ）を添加し、反応混合物を、水素陽圧下、室温で１６時間撹拌した。反応混合物を、セライトパッドを通して濾過し、濃縮した。残留物を逆相クロマトグラフィーによって精製して、８（１７ｍｇ、４３％）を得た。
方法２：ＳＳＥＡ４類似体の化学酵素的合成の一般的な戦略
ＣＭＰ－シアル酸類似体を、出発材料としてＭａｎＮＡｃを使用することによって、３種の酵素（ＭａｎＮＡｃ－６－キナーゼ、ＮｅｕＡｃ－９－Ｐ－シンターゼ、およびＮｅｕＡｃ－９－Ｐ－ホスフェース（ｐｈｏｓｐｈａｓｅ））的反応により合成した。ＣＭＰ－シアル酸類似体を、α２，３－シアリルトランスフェラーゼ反応下、ＣＭＰ－Ｎｅｕ５ＡＣの再生と組み合わせて、Ｇｂ５類似体と反応させると、ＳＳＥＡ４類似体を得ることができる。ｒｅｆ２。
（実施例３）
ＳＳＥＡ－３／ＳＳＥＡ－４誘導体ＤＴ－コンジュゲートの合成
一般的な方法
ステップＡ．ＳＳＥＡ３類似体－ＮＨ２またはＳＳＥＡ４類似体－ＮＨ２の、ＳＳＥＡ３類似体－ＳＨまたはＳＳＥＡ４－類似体－ＳＨへの修飾
ＳＳＥＡ３／４類似体ＤＴ－コンジュゲートを合成するために、アミン末端ＳＳＥＡ３／４類似体をＤＴＳＳＰリンカーと、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中、室温で反応させた。溶液のｐＨ値をｐＨ試験紙によってモニターし、溶液が中性または酸性になったときに、一部のＮａＯＨ溶液を溶液に添加した。反応物を室温で１２時間撹拌した後、ＤＴＴを、溶液に室温で添加した。溶液を４０℃で撹拌し続け、次いで、溶媒を減圧下で除去した。残留物をＬＨ－２０カラムクロマトグラフィーによって精製して、ＳＳＥＡ３／４類似体－ＳＨを得た。
ステップＢ：ＣＲＭ１９７のＣＲＭ１９７－マレイミドへの修飾
市販のＣＲＭ１９７（１．０ｍｇ）の塩を、水中への溶解および透析（Ａｍｉｃｏｎ
Ｕｌｔｒａ－０．５、１０ｋＤａ）を交互に行うことによって除去した後、残留物をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ６．５、１．０ｍＬ）中に溶解し、試料バイアル中に移した。Ｓｕｌｆｏ－ＥＭＣＳ（１．０ｍｇ、８．２２×１０－６ｍｏｌ）を溶液に添加し、次いで、反応物を室温で２時間撹拌し続けた。混合物をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５（１０ｋＤａ）によって精製した。分子量を点検するためにＭＡＬＤＩ－ＴＯＦを、かつタンパク質量を計算するためにＢＣＡアッセイを使用した後、次のステップのためにＣＲＭ１９７－マレイミドをＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２、１．０ｍｇ／ｍＬ）中に保存した。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦのデータに従って、マレイミド官能基の量を計算することができた。例えば、ＣＲＭ１９７－マレイミドの分子量が６１８４１のとき、ＣＲＭ１９７－マレイミドのマレイミド官能基の数は（６１８４１－５８３２６）／１９３＝１８．２であった。
ステップＣ：ＳＳＥＡ３／４類似体－ＣＲＭ１９７コンジュゲートの合成
ＣＲＭ１９７－マレイミドをＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２、濃度は１．０ｍｇ／ｍＬであった）に溶解し、次いで、異なる量のＳＳＥＡ３／４類似体－ＳＨ（ＰＢＳ緩衝液中５．０ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．２）を溶液に添加した。混合物を室温で２時間撹拌した。ＳＳＥＡ３／４類似体－ＣＲＭ１９７コンジュゲートを、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５（１０ｋＤａ）を使用し、非反応性のＳＳＥＡ３／４類似体－ＳＨおよびリン酸ナトリウム塩を透析により除去することによって、精製した。得られたＳＳＥＡ３／４類似体－ＣＲＭ１９７コンジュゲートは、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析によって特徴付けられ、糖質取込み率を決定することができた。非反応性のＳＳＥＡ３／４類似体－ＳＨは、ＤＴＴと反応させ、ＬＨ－２０カラムクロマトグラフィーによって精製した後に、回収することができた。
（実施例４）
ＳＳＥＡ４－Ｇｃ ＣＲＭ１９７コンジュゲートの合成
ステップＡ：ＳＳＥＡ４－Ｇｃ－ＮＨ２のＳＳＥＡ４－Ｇｃ－ＳＨへの修飾
ＤＴＳＳＰ（５．０ｍｇ、８．２２×１０－６ｍｏｌ）を、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４、１．０ｍＬ）中のＳＳＥＡ４－Ｇｃ－ＮＨ２（５．０ｍｇ、４．０１×１０－６ｍｏｌ）のフラスコに室温で添加した。溶液のｐＨ値をｐＨ試験紙によってモニターし、溶液が中性または酸性になったときに、一部のＮａＯＨ（１Ｍ／水）を溶液に添加した。反応物を室温で１２時間撹拌した後、ＤＴＴ（５．０ｍｇ、３２．４１×１０－６ｍｏｌ）を、溶液に室温で添加した。溶液を４０℃で１時間撹拌し続け、次いで、溶媒を減圧下で除去した。残留物をＬＨ－２０カラムクロマトグラフィーによって精製して、ＳＳＥＡ４－Ｇｃ－ＳＨ（５．０ｍｇ、９３％）を得た。
ステップＢ：ＣＲＭ１９７のＣＲＭ１９７－マレイミドへの修飾
市販のＣＲＭ１９７（１．０ｍｇ）の塩を、水中への溶解および透析（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５、１０ｋＤａ）を交互に行うことによって除去した後、残留物をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ６．５、１．０ｍＬ）中に溶解し、試料バイアル中に移した。Ｓｕｌｆｏ－ＥＭＣＳ（１．０ｍｇ、８．２２×１０－６ｍｏｌ）を溶液に添加し、次いで、反応物を室温で２時間撹拌し続けた。混合物をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５（１０ｋＤａ）によって精製した。分子量を点検するためにＭＡＬＤＩ－ＴＯＦを、かつタンパク質量を計算するためにＢＣＡアッセイを使用した後、次のステップのためにＣＲＭ１９７－マレイミドをＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２、１．０ｍｇ／ｍＬ）中に保存した。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦのデータに従って、マレイミド官能基の量を計算することができた。例えば、ＣＲＭ１９７－マレイミドの分子量が６１８４１のとき、ＣＲＭ１９７－マレイミドのマレイ
ミド官能基の数は（６１８４１－５８３２６）／１９３＝１８．２であった。
表１に従うように、ＣＲＭ１９７－マレイミドをＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２、濃度は１．０ｍｇ／ｍＬであった）に溶解し、次いで、異なる量のＳＳＥＡ４Ｇｃ－ＳＨ（ＰＢＳ緩衝液中５．０ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．２）を溶液に添加した。混合物を室温で２時間撹拌した。ＳＳＥＡ４－Ｇｃ－ＣＲＭ１９７コンジュゲートを、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５（１０ｋＤａ）を使用し、非反応性のＳＳＥＡ４－Ｇｃ－ＳＨおよびリン酸ナトリウム塩を透析により除去することによって、精製した。得られたＳＳＥＡ４－Ｇｃ－ＣＲＭ１９７コンジュゲートは、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析によって特徴付けられ、表１に示すように糖質取込み率を決定することができた。非反応性のＳＳＥＡ４－Ｇｃ－ＳＨは、ＤＴＴと反応させ、ＬＨ－２０カラムクロマトグラフィーによって精製した後に、回収することができた。
ステップＣ：ＣＲＭ１９７－マレイミドの非反応性マレイミドの捕捉
ＳＳＥＡ４－Ｇｃ－ＣＲＭ１９７コンジュゲートをＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２、濃度は１．０ｍｇ／ｍＬであった）に溶解し、２－メルカプトエタノール（５ｍｇ／ｍＬ、ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．２）１０．０当量を溶液に添加した。混合物を室温で２時間撹拌した。ＳＳＥＡ４－Ｇｃ－ＣＲＭ１９７コンジュゲートを、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５（１０ｋＤａ）を使用し、非反応性の２－メルカプトエタノールおよびリン酸ナトリウム塩を透析により除去することによって精製し、次いで凍結乾燥し、白色粉末にした。
表１．平均糖質取込みのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析
（実施例５）
ＳＳＥＡ－４誘導体ＤＴコンジュゲートの免疫原性試験
ＳＳＥＡ４類似体ＤＴ－コンジュゲート（１－ＤＴ～１０－ＤＴ）の免疫原性を調査するため、５匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＳＳＥＡ４類似体ＤＴ－コンジュゲート２μｇおよび糖脂質アジュバントＣ３４ ２μｇを用い、２週間に１回の間隔で３回、筋肉内に免疫化した。以前の試験において、抗ＧＨ抗体力価は、アジュバントを一切含まないＳＳＥＡ４類似体－タンパク質コンジュゲート単独では低かった。各免疫原に由来する抗血清を、３回目の免疫化から１０日後に得、グロボ系グリカンおよび他の腫瘍関連糖鎖抗原を含む９４個の化学的に合成されたグリカンを含有する、グリカンマイクロアレイ上で調べた。一部の化学的修飾がグリカンに行われたため、交差反応性を点検するために一部の官能性リンカーもグリカンアレイに含まれていた。
ＳＳＥＡ４－Ｇｃ ＣＲＭ１９７－コンジュゲートによって誘導された抗体は、ＳＳＥＡ４－Ｇｃ、天然のＳＳＥＡ４、またはＳＳＥＡ４四糖の断片によって特異的に認識されたが、他のＴＡＣＡおよび官能性リンカーによって認識されなかった。糖コンジュゲートから得られた血清は高ＩｇＧ抗体力価が誘導されており、Ｔ細胞依存性免疫応答を示した。興味深いことに、有意なＩｇＭ産生は、ＳＳＥＡ４－Ｇｃまたは天然のＳＳＥＡ４に関して観察されなかった。ＧＨに対するＩｇＧレベルに関しては、ＳＳＥＡ４－Ｇｃ ＣＲＭ１９７によって誘導された抗体の力価は、天然型の天然のＳＳＥＡ－ＣＲＭ１９７コンジュゲートよりもはるかに高かった。それらのうち、１分子のＣＲＭ１９７とコンジュゲートした６．９分子のＳＳＥＡ４－Ｇｃが、最も高い抗体力価を誘導することができる（図１２も参照のこと）。
マウス投与量および免疫化スケジュール
ＳＳＥＡ４類似体ＣＲＭ１９７の免疫原性を比較するために、５匹のマウスからなる１０群（８週齢雌Ｂａｌｂ／ｃマウス、ＢｉｏＬＡＳＣＯ、Ｔａｉｗａｎ）を、糖脂質Ｃ３４を用い、筋肉内に免疫化した。３回の免疫化を、２週間間隔で行った。各ワクチン接種
には、ＳＳＥＡ４類似体２μｇおよびＣ３４ ２μｇが含有されていた。対照マウスに、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を注射した。初回免疫化の前（免疫前）および３回目の免疫化から１０日後に、マウスから採血した。すべての血清を、４，０００×ｇで１０分間遠心分離することによって得た。血清学的応答は、グリカンマイクロアレイによって分析した。
グリカンアレイを用いた血清学的アッセイ
マウス血清を、１％のＢＳＡ／ＰＢＳＴ緩衝液（ＰＢＳＴ緩衝液：ＰＢＳおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４）で希釈した。グリカンマイクロアレイを、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて４℃で１時間ブロックし、ＰＢＳＴ緩衝液で３回洗浄してから使用した。次いで、血清希釈物をグリカンマイクロアレイに導入し、４℃で１時間インキュベートした。過剰な血清抗体を洗い流し、マイクロアレイを、２次抗体としてのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ抗体またはＤｙＬｉｇｈｔ ６４９－コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＭ抗体を用いて、暗所で、４℃で１時間、個々にインキュベートした。次いで、スライドをＰＢＳＴで３回洗浄し、マイクロアレイ蛍光チップリーダー（ＧｅｎｅＰｉｘ ４３００Ａ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて、６３５ｎｍの波長で走査し、走査された画像をＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ－６．０分析ソフトウェア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｕｎｉｏｎ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて分析した。
（実施例６）
ステージ特異的胚抗原－３（ＳＳＥＡ－３）およびβ３ＧａｌＴ５はがん特異的であり、かつ乳がん幹細胞に対する有意なマーカーである
例：細胞培養
乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＣＦ－７、およびヒト乳がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から得た。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１を、１０％熱不活性化ＦＢＳおよび抗生物質－抗真菌剤が補充されたＤＭＥＭ中で培養したが、ＭＣＦ－７は、１０％熱不活性化ＦＢＳ、非必須アミノ酸、および抗生物質－抗真菌剤が補充されたＲＰＭＩ中で培養した。ＣＡＦに関しては、１０％熱不活性化ＦＢＳ、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイシンが補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２中で培養した。それらを、５％ＣＯ２および加湿された雰囲気に制御された３７℃のインキュベーターでインキュベートした。すべての細胞培養培地および補充物質はＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。ヒトＥＳＣ Ｈ９および誘導多能性幹細胞５（ｉＰＳＣ５）を、ヒトＥＳ培地（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、ＧｌｕｔａＭＡＸ、非必須アミノ酸、２－メルカプトエタノール、ペニシリン／ストレプトマイシン、およびｂＦＧＦを含む、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ＤＭＥＭ）中、マイトマイシンＣで処理されたマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）上で維持し、培養し、コラゲナーゼＩＶを使用して継代を毎週行った。
例：皮膚線維芽細胞からのｉＰＳＣの導出
皮膚生検に由来する線維芽細胞を、ＣｙｔｏＴｕｎｅ－ｉＰＳ Ｓｅｎｄａｉ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して多能性幹細胞に再プログラムした。簡潔に述べると、６ウェルディッシュ中、１ウェル当たり
５×１０４個の線維芽細胞を、一晩で回収するために継代３で播種した。翌日、Ｓｅｎｄａｉウイルス発現ヒト転写因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、Ｋｌｆ４、およびｃ－Ｍｙｃを、製造業者の指示書に従って、線維芽細胞培地中で混合し、線維芽細胞を感染させた。２日後に、培地を、ＡＬＫ５阻害剤ＳＢ４３１５４２（２μＭ；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＭＥＫ阻害剤ＰＤ０３２５９０１（０．５μＭ；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、およびチアゾビビン（０．５μＭ；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）が補充されたヒトＥＳ培地と交換した。感染してから７～１０日後に、細胞を、ＴｒｙｐＬＥ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して剥がし、フィーダー細胞上で継代を行った。ｉＰＳＣの個々のコロニーを、感染してから２１から２８日の間に採取し、各ｉＰＳＣ株を単一コロニーから拡大増殖させた。すべてのｉＰＳＣ株を、ヒトＥＳ培地中のマウス胚線維芽細胞上で培養した。
核型分析（ｋａｒｙｏｔｙｐｉｎｇ）は、Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．によって行われた。奇形腫分析では、ＴｒｙｐＬＥ処理後に、各ｉＰＳＣ株から１～２×１０７個を剥がし、収集した。これらをヒトＥＳ培地０．５ｍＬ中に懸濁した。続いてＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）０．５ｍＬと混合し、細胞を、免疫不全マウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ、ストック番号００５５５７、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の背側側腹部へ皮下注射した。注射してから８週間後に、奇形腫を採取し、４％パラホルムアルデヒドを用いて一晩固定し、パラフィン包埋の標準手順に従って処理した。次いで、試料を切片にし、Ｈ＆Ｅ染色を行った。
例：β３ＧａｌＴ５の過剰発現およびノックダウン
ヒトβ３ＧａｌＴ５過剰発現安定株を樹立するために、ヒトβ３ＧａｌＴ５をコードする完全長ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し（フォワードプライマー－ＧＣＡＧＡＴＣＴＡＴＧＧＣＴＴＴＣＣＣＧＡＡＧＡＴＧ、リバースプライマー－ＧＴＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＡＣＡＧＧＣＧＧＡＣＡＡＴ）、ＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩ切断ｐＭＳＣＶｐｕｒｏベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にサブクローニングした。次いで、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）－対照およびＭＳＣＶ－β３ＧａｌＴ５水疱性口内炎ウイルスＧ糖タンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）偽型レトロウイルスを、ＧＰ２－２９３細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中に産生し、ＭＣＦ－７およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に感染させるために使用した。ウイルスに感染してから２日後に、対照およびβ３ＧａｌＴ５安定プールを、ピューロマイシン（２μｇ／ｍＬ）を用いて選択した。β３ＧａｌＴ５ノックダウン細胞を樹立するために、ヒトβ３ＧａｌＴ５に対するレンチウイルス－ｓｈＲＮＡシステムを、Ｎａｔｉｏｎａｌ ＲＮＡｉ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ Ｐｌａｔｆｏｒｍ、Ａｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａから購入した。β３ＧａｌＴ５－ショートペアピン配列は、５’ＣＣＧＧＧＣＡＡＧＴＧＧＴＴＴＧＴＣＡＧＴＡＡＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＴＴＡＣＴＧＡＣＡＡＡＣＣＡＣＴＴＧＣＴＴ ＴＴＴＧ－３’である。簡潔に述べると、ｓｈβ３ＧａｌＴ５およびｓｈ対照レンチウイルスを、製造業者の指示書に従って、ＭＣＦ７およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞とともにインキュベートした。感染細胞を、感染から４８時間後に採取するか、またはピューロマイシン（２μｇ／ｍＬ）を用いて選択し、ノックダウン効率を定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって決定した。
例：細胞増殖アッセイ
細胞増殖を、製造業者（Ｒｏｃｈｅ）の指示書に従って、細胞透過性テトラゾリウム塩、ＷＳＴ－１（４－［３－（４－ヨードフェニル）－２－（４－ニトロフェニル）－２Ｈ－５－テトラゾリオ］－１，３－ベンゼンジスルホネート）を使用して分析した。細胞２×１０３個／ウェルを、９６ウェルプレート中で培養した。示されているような異なる時点で、ＷＳＴ－１（培養培地２００μＬに対して１ウェル当たり２０μＬ）を添加し、３
７℃のインキュベーターで３時間インキュベートした。４５０ｎｍおよび６９０ｎｍ（基準として）における吸光度のシグナル伝達検出をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５マイクロプレートスペクトルリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって読み取った。
例：アポトーシスアッセイ
細胞を、細胞１０５個／ｍＬで、前述のように、β３ＧａｌＴ５ ｓｈＲＮＡレンチウイルス（ＭＯＩ：５）、Ｚ－ＤＥＶＤ－ＦＭＫ（カスパーゼ－３阻害剤）（５０μＭおよび１００μＭ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｚ－ＩＥＴＤ－ＦＭＫ（カスパーゼ－８阻害剤）、Ｚ－ＬＥＨＤ－ＦＭＫ（カスパーゼ－９阻害剤）、またはＺ－ＡＴＡＤ－ＦＭＫ（カスパーゼ－１２阻害剤）（１００μＭ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で処理するか、または処理しなかった。３日後、細胞をＰＢＳで洗浄し、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）－コンジュゲートアネキシンＶ（１：４０希釈物、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と、結合緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＣａＣｌ２）中、氷上で１５分間インキュベートし、次いで、フローサイトメトリー分析に供した。
例：ウエスタンブロット分析
ＭＣＦ－７およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞のタンパク質溶解物を、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）が供給された、溶解緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ２、ｐＨ７．４の１００ｍＭリン酸緩衝液、１％ＮＰ４０、１０％グリセロール）を使用して調製した。細胞溶解物に由来するタンパク質を、試料緩衝液中で、９５℃で５分間変性させてから、４～１２％勾配ＳＤＳ／ＰＡＧＥを適用し、転写装置（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用してメタノールですすいだＰＶＤＦ膜上に移した。膜を、５％脱脂乳が供給されたＴＢＳＴで３０分間ブロックし、プロカスパーゼ－３またはカスパーゼ－３の開裂／活性型のいずれかを認識する抗カスパーゼ－３抗体（１：１，０００希釈物、Ａｂｃａｍ）でプローブし、続いて、ＨＲＰ－コンジュゲート抗ウサギ抗体（１：５，０００希釈物、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とともに９０分間インキュベートした。シグナルをＥＣＬ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して生じさせ、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ ＬＡＳ－４０００イメージングシステムによって検出した。
例：ｑＰＣＲ
細胞株に由来する全ｍＲＮＡを、ＧｅｎｅＪＥＴ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して抽出し、その２μｇを、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって、ｃＤＮＡに逆転写した。ｑＰＣＲ反応物を、製造業者のプロトコルによって最適化された２×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、検査試料または対照試料のｃＤＮＡ２μｌを含有する総体積２０μｌに調製した。ｃＤＮＡを、Ｂ３ＧａｌＴ５（フォワードプライマー：５’ＡＧＣＧＧＡ ＡＡＣＧＡＡ ＡＧＡＧＧＴＧＧＡＣ３’；リバースプライマー：５’ＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＡＡ ＡＧＣＧＡＴＧＧＡＣ３’）の発現についてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７３００ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって検討した。相対的遺伝子発現は、Ｂ３ＧａｌＴ５遺伝子と内部ＧＡＰＤＨ遺伝子発現との比として、７３００ソフトウェアを使用したＣｔ値によって正規化された。
例：スフィンゴ糖脂質の抽出
細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄し、水中でホモジナイズした。メタノールおよびクロロホルムを８：４：３（ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｖｏｌ）の比でホモジネートに添加し、試料を、水浴型超音波処理器内で、３０分間インキュベートした。３，０００×ｇで１５分間遠心分離した後で、ペレットを、４：８：３（ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｖｏｌ）のクロロホルム／メタノール／水で繰り返し抽出し、合わせた上清を、窒素流下で乾燥させた。
例：スフィンゴ糖脂質（ＧＳＬ）からのグリカンの放出（２６）
細胞を収集し、正規化のために総タンパク質量を定量化し、細胞１～３×１０６個をホモジナイズした。遊離グリカンをＧＳＬから放出させるための典型的な手順では、ＧＳＬを、ガラス管中にて、クロロホルム／メタノール（２：１；１．０ｍｇ／ｍＬ）中、青色が生じるまで（１０分）オゾンで処理した。得られた溶液をＳｐｅｅｄＶａｃ中で乾燥させ、グリカンをＧＳＬから放出させるために塩基によって処理した；簡潔に述べると、水酸化ナトリウム水溶液（２０～５０ｍＭ）を添加し、混合物を室温で１６時間インキュベートした。得られた水溶液は、ＮＡＩＭタグで標識化するために凍結乾燥する。
例：ＮＡＩＭタグでのグリカンの標識化およびＬＣ－ＭＳ分析
ＧＳＬから放出させた後、グリカン混合物を凍結乾燥し、以下の文献手順によって標識化した（２７、２８）。簡潔に述べると、グリカン混合物を、ＡｃＯＨ（１．０ｍＬ）中の２，３－ナフタレンジアミン（ＮＡＩＭ、１．０ｍｇ）およびヨウ素（１．０ｍｇ）に室温で添加し、４時間撹拌した。反応が完了したことを、ＴＬＣ分析によって点検した。次いで、反応混合物を、ＥｔＯＡｃ（１０．０ｍＬ×２）ですりつぶし、沈殿物（ｇｌｏｂｏ－Ｈ－ＮＡＩＭ、ＳＳＥＡ－４－ＮＡＩＭ、およびＳＳＥＡ－３－ＮＡＩＭ）を得、それを、ナイロンメンブレンフィルターを使用した濾過によって収集した。ＭＳにおいて増強されたイオン化能を示すＮＡＩＭ－標識化グリカン（２９）を、高分解能高質量精度ナノフローＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。試料をプレカラム（１５０μｍ Ｉ．Ｄ．×３０ｍｍ、５μｍ、２００Å）に１０μＬ／分で注入し、次いで、ナノエレクトロスプレーイオン源（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）を備えたＬＴＱ ＦＴ Ｕｌｔｒａ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で分析するために、逆相Ｃ１８ナノ－カラム（７５μｍ Ｉ．Ｄ．×２００ｍｍ、２．５μｍ、１００Å）で分離した。分離は、移動相Ａとして水中の０．１％ギ酸を、移動相Ｂとして８０％アセトニトリル中の０．１％ギ酸を使用し、３００ｎＬ／分で行った。サーベイフルスキャンＭＳスペクトル（ｍ／ｚ ３２０～２，０００）を、ｍ／ｚ ４００で質量分解能１００，０００を有するＦＴで取得した。
（実施例９）
ステージ特異的胚抗原－３（ＳＳＥＡ－３）およびβ３ＧａｌＴ５はがん特異的であり、乳がん幹細胞に対する有意なマーカーであることの裏付け
細胞の腫瘍形成能を裏付けるために、乳がん細胞株ＭＣＦ－７およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１において、がん細胞を、糖脂質分子ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、およびｇｌｏｂｏ－Ｈに対して対応する抗体と公知のマーカーセットＣＤ４４／ＣＤ２４およびＥＳＡ／ＰＲＯＣＲとを用いて細胞分類のためにそれぞれ染色した（図Ｓ１、分類１）。次に、単離された細胞集団をｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ（２４）とｉｎ ｖｉｖｏアッセイ（８）の両方によって分析した（図１）。ＭＣＦ－７では、ＣＤ４４＋ＣＤ２４－／ｌｏＳＳＥＡ－３＋を発現するがん細胞が、ＣＤ４４＋ＣＤ２４－／ｌｏＳＳＥＡ－３－またはＣＤ４４＋ＣＤ２４－／ｌｏを発現するものよりも高い百分率で腫瘍様塊を形成した（図１Ａ、左パネル）。同様に、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１では、ＥＳＡｈｉＰＲＯＣＲｈｉＳＳＥＡ－
３＋亜集団が、軟寒天アッセイにおいて、ＥＳＡｈｉＰＲＯＣＲｈｉＳＳＥＡ－３－またはＥＳＡｈｉＰＲＯＣＲｈｉ細胞よりも高い百分率で細胞コロニーを形成した（図１Ｃ、左パネル）。しかし、糖脂質エピトープＳＳＥＡ－４またはｇｌｏｂｏ－Ｈとともに公知のマーカーセットによって単離された細胞を使用した細胞コロニーまたは腫瘍様塊の形成に、有意差はなかった（図Ｓ２）。公知のＢＣＳＣマーカーおよびＳＳＥＡ－３を保有する細胞における腫瘍形成性を示すために、異なる亜集団を、腫瘍成長のためにＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスの乳腺に接種した。結果より、ＣＤ４４＋ＣＤ２４－／ｌｏＳＳＥＡ－３＋とＥＳＡｈｉＰＲＯＣＲｈｉＳＳＥＡ－３－の両方が、他の対応する亜集団と比較して少ない細胞数で、腫瘍をｉｎ ｖｉｖｏで有効に産生することが示された（図１Ｂ、Ｄ）。特に、ＣＤ４４＋ＣＤ２４－／ｌｏＳＳＥＡ－３＋を発現する細胞に関して、わずか１０個の細胞が、マウスにおいて腫瘍を形成することが可能であった（図１Ｂ）。腫瘍成長の点から、ＣＤ４４＋ＣＤ２４－／ｌｏＳＳＥＡ－３＋細胞の腫瘍体積は、ＣＤ４４＋ＣＤ２４－／ｌｏＳＳＥＡ－３－細胞のものよりも２倍大きかった（図１Ｅ、左パネル）。さらに、ＥＳＡｈｉＰＲＯＣＲｈｉＳＳＥＡ－３＋細胞は、ＥＳＡｈｉＰＲＯＣＲｈｉＳＳＥＡ－３－細胞よりも、腫瘍を早く発生させ、かつ大きい平均体積の腫瘍を形成した。これらの結果より、ＳＳＥＡ－３は、異なる乳がん細胞モデルにおいてＢＣＳＣの富化に対する特異的なマーカーであることが示される。これらのグリカン分子のうち、ＳＳＥＡ－３および公知のＢＣＳＣマーカーを保有する細胞は、他の亜集団よりも高度な腫瘍形成性を有していた。
本発明者らは、次に、ＳＳＥＡ－３を高度に発現するがん細胞、およびＳＳＥＡ－３を発現しないがん細胞の幹様特性を比較した（図Ｓ１、分類２）。ＳＳＥＡ－３＋ＭＣＦ－７細胞では、総集団内において高レベルのＳＳＥＡ－３を発現する細胞の上位１％が、バルクの集団ならびにＳＳＥＡ－３およびＣＤ４４＋ＣＤ２４－／ｌｏを含まない集団よりも高い百分率で腫瘍様塊を形成した（図１Ａ、右パネル）。さらに、バルクの集団内において最も高度なＳＳＥＡ－３の発現を伴うＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞の上位１％も、バルクの集団および他の亜集団よりも多くの細胞コロニーを形成した（図１ｃ、右パネル）。動物試験では、結果より、上位１％のＳＳＥＡ－３発現を伴う細胞は、ＳＳＥＡ－３－細胞よりも、腫瘍を形成する高い可能性を有し（図１ＢおよびＤ）、ＳＳＥＡ－３＋細胞の平均腫瘍体積は、ＳＳＥＡ－３－細胞のものより大きかったことが示された（図１Ｅ、Ｆ、右パネル）。したがって、高レベルのＳＳＥＡ－３を発現するがん細胞は、細胞表面上にＳＳＥＡ－３を伴わないものよりも高度な腫瘍形成性を有し、ＳＳＥＡ－３は乳がんに対する独立したＣＳＣマーカーであることも示された。
ＳＳＥＡ－３の機能を理解するために、ＳＳＥＡ－３生合成に関与するβ３ＧａｌＴ５の遺伝子（図Ｓ３）を、さらなる試験のために過剰発現させるか、またはノックダウンした。β３ＧａｌＴ５を過剰発現させると、ＭＣＦ－７細胞とＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の両方において表面ＳＳＥＡ－３の発現レベルが増加した（図２）。とりわけ、ＭＣＦ－７細胞では、ＣＤ４４＋ＣＤ２４－／ｌｏ細胞集団の百分率は、対照と比較して５倍増加することが示され（図２Ａ）、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞では、β３ＧａｌＴ５を過剰発現させたときに、ＥＳＡｈｉＰＲＯＣＲｈｉの百分率に変化は無かった（図２Ｂ）。β３ＧａｌＴ５がノックダウンされたＭＣＦ－７細胞では、対照細胞と比較して、表面ＣＤ４４の発現レベルは低下し、したがって、ＣＤ４４－ＣＤ２４＋細胞集団は１０倍増加した（図２Ａ）。β３ＧａｌＴ５がノックダウンされたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞では、表面ＰＲＯＣＲのレベルは低下し、ＥＳＡｈｉＰＲＯＣＲｈｉ ＢＣＳＣ亜集団は減少した（図２Ｂ）。これらの知見により、ＳＳＥＡ－３はＢＣＳＣに関連する重要なグリカン分子であることが裏付けられる。
乳がん細胞および正常細胞におけるＳＳＥＡ－３の役割を裏付けるために、細胞表現型を、β３ＧａｌＴ５ノックダウン細胞において検討した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞とＭ
ＣＦ－７細胞の両方では、β３ＧａｌＴ５のノックダウンによって、細胞アポトーシスの出現とともに、細胞成長が抑制され（図４ＡおよびＢ）、特に、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞では４日目に＞６０％の細胞にアポトーシスが生じた（図３ＢおよびＣ）。対照的に、正常乳房細胞ＭＣＦ－１０Ａおよびヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）－不死化ヒト乳房上皮細胞、ｈＴＥＲＴ－ＨＭＥ１では、β３ＧａｌＴ５のノックダウンによって、同様の成長速度が観察され、かつアポトーシスが観察されなかった（図３Ｂ、３Ｃ、４Ｃ、および４Ｄ）。しかし、ＳＳＥＡ－３からｇｌｏｂｏ－Ｈを合成するためのＦＵＴ１およびＦＵＴ２、またはＳＳＥＡ－３からＳＳＥＡ－４を合成するためのＳＴ３Ｇａｌ２をノックダウンすると、細胞アポトーシスは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞において誘導されなかった（図３Ａ、Ｄ）。
□ベータ３ＧａｌＴ５のノックダウンによって誘導されるアポトーシスが、アポトーシスの下流の実行に対して最もエフェクター機能の高いカスパーゼである、カスパーゼ－３の活性化と関連するかどうかをさらに調査する。結果より、カスパーゼ－３は、□ベータ３ＧａｌＴ５がノックダウンされたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞において活性化されたことが示された（図４Ｅ）。カスパーゼ３の阻害剤、Ｚ－ＤＥＶＤを添加したときに、□ベータ３ＧａｌＴ５のノックダウンによって誘導されたアポトーシスの百分率が減少した（図４Ｆ）。□ベータ３ＧａｌＴ５のノックダウンによって誘導されたアポトーシスにおけるカスパーゼ－３の関与は、ＭＣＦ－７、カスパーゼ－３－欠損細胞株においても確認された。ＭＣＦ－７の成長速度は、□ベータ３ＧａｌＴ５のノックダウンによって有意に減少したが、ＳＳＥＡ－３の発現が抑制されたときにのみ、低レベルのアポトーシスが示された（図３ＢおよびＣ）。次いで、上流カスパーゼ（カスパーゼ－８、－９、および－１２）のさらなる調査を、特異的な阻害剤を用いて検査することによって試験し、結果により、カスパーゼ－８も、□ベータ３ＧａｌＴ５がノックダウンされたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞での細胞アポトーシスの百分率を減少させたことが示された（図３Ｇ）。これらの結果より、□ベータ３ＧａｌＴ５の直接の酵素生成物であるＳＳＥＡ－３は、がんの成長および生存のための重要な糖脂質であることが示唆される。
ＳＳＥＡ－３または３つのグロボ系グリカンのいずれかががん細胞のみに見出されるかどうかを確認するために、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ、図Ｓ４）、ＭＣＦ－７およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞、ならびにＭＣＦ－１０ＡおよびｈＴＥＲＴ－ＨＭＥ１を含む正常細胞株に由来する糖脂質を抽出し、グリカンを放出させ、タグ付けし、ＬＣ－ＭＳ分析によって検討した（図５Ａ）。データを、フローサイトメトリー分析の結果と比較し、ここでは、細胞分類のために使用された同一の抗体を使用してＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、およびｇｌｏｂｏ－Ｈの発現レベルを検出した（図５）。ＥＳＣ、ｉＰＳＣ、およびがん細胞株はＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、およびｇｌｏｂｏ－Ｈを発現したが、正常細胞株は発現しなかったことが見出された。この試験の結果は、正常およびがん細胞株における□ベータ３ＧａｌＴ５遺伝子発現のｑＰＣＲによっても支持された（図Ｓ５）。異なる正常およびがん細胞株のグリコール系グリカンのさらなる分析が行われる。
フローサイトメトリーによって検出されたＭＣＦ－７細胞におけるＳＳＥＡ－３の発現レベルは、ＬＣ－ＭＳ分析によるものよりも相対的に高く、同時にＬＣ－ＭＳによって検出されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１におけるＳＳＥＡ－３のレベルは、フローサイトメトリーによるものよりはるかに高かった。ＬＣ－ＭＳデータとフローサイトメトリーデータとの間の変動は、抗体の特異性および細胞表面上のグリカンの分布によるものであり得る（２５）。ＳＳＥＡ－４および程度は低いがＧｂ４に対する抗ＳＳＥＡ－３抗体（ＭＣ－６３１）の交差反応により（１４）、ＳＳＥＡ－４の発現レベルが高いときは、フローサイトメトリーによって検出されたＳＳＥＡ－３のレベルが過大評価されている可能性がある。一方、細胞表面上の他の生体分子によって障害され、それによって細胞上のＳＳＥＡ－３
が抗体染色に達することができない可能性があるため、ＳＳＥＡ－３のレベルが過小評価されることがある（２６、２７）。したがって、本発明者らは、β３ＧａｌＴ５遺伝子発現のｑＰＣＲ検出によって支持されるＬＣ－ＭＳの結果（図Ｓ５）は、これらの糖脂質の発現をより正確に反映すると考える。
ＢＣＳＣを単離するプロセスでは、ＭＣ－６３１染色に基づいて分類するときに、ＳＳＥＡ－４発現のレベルは高いがＳＳＥＡ－３を保有しない一部の細胞が富化される可能性がある。本発明者らは、ＳＳＥＡ－３とその合成酵素β３ＧａｌＴ５の両方がＢＣＳＣマーカーであることを証明したため、ＳＳＥＡ－３陰性細胞は腫瘍形成性が低い。細胞集団は十分に精製されておらず、したがって、抗ＳＳＥＡ－３染色に基づいて分類された細胞の腫瘍形成性は過小評価され得る。本発明者らは、ＳＳＥＡ－３に高度に特異的である抗体または分子は、ＢＣＳＣを富化するために産生され得ると考える。一方、細胞表面上のＳＳＥＡ－３を特異的に検出し、フローサイトメトリーによって分類できる場合、抗体染色とＬＣ－ＭＳ分析の両方の結果は一致するはずである。
ＳＳＥＡ－３は、がんの進行に主な役割を果たすＢＣＳＣマーカーである。本発明者らは、実験から、がん細胞中のβ３ＧａｌＴ５の発現を操作すると、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、およびｇｌｏｂｏ－Ｈの細胞表面レベルならびに細胞生存および腫瘍形成性が制御されたことを示した。興味深いことに、□ベータ３ＧａｌＴ５をノックダウンした後に、ＭＣＦ－７、カスパーゼ－３ヌル細胞株が、アポトーシスのレベルの制限および細胞成長の完全な抑制を受けたように、がん細胞中のβ３ＧａｌＴ５をノックダウンすると、異なるメカニズムによって、アポトーシスと細胞増殖の阻害の両方を誘発することができた。対照的に、ＳＳＥＡ－３発現を欠く正常な乳房上皮細胞では、□ベータ３ＧａｌＴ５をノックダウンすると、これらの表現型に影響を与えなかった。
要約すると、この報告により、ＳＳＥＡ－３は、ＢＣＳＣの富化に対して有用な新規のグリカンマーカーであり、ＳＳＥＡ－３と□ベータ３ＧａｌＴ５の両方が、乳がん治療薬の開発に対し可能性のある新しい標的であることが裏付けられた。大部分のがん幹細胞およびがん細胞上でのそれらの特異的な発現に加えて、グロボ系糖脂質ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、およびｇｌｏｂｏ－Ｈも、ＥＳＣおよびｉＰＳＣの表面上に高度に発現するが、これらはＥＳＣが分化した後に消失する。ｉＰＳＣが分化した後のグロボ系糖脂質の運命を、再生薬に使用するために理解することは興味深いことであろう。
実施例の材料および方法
細胞培養
乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＣＦ－７、およびヒト乳がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から得た。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１を、１０％熱不活性化ＦＢＳおよび抗生物質－抗真菌剤が補充されたＤＭＥＭ中で培養したが、ＭＣＦ－７は、１０％熱不活性化ＦＢＳ、非必須アミノ酸、および抗生物質－抗真菌剤が補充されたＲＰＭＩ中で培養した。ＣＡＦに関しては、１０％熱不活性化ＦＢＳ、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイシンが補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２中で培養した。それらを、５％ＣＯ２および加湿された雰囲気に制御された３７℃のインキュベーターでインキュベートした。すべての細胞培養培地および補充物質はＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。ヒトＥＳＣ Ｈ９および誘導多能性幹細胞５（ｉＰＳＣ５）を、ヒトＥＳ培地（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、ＧｌｕｔａＭＡＸ、非必須アミノ酸、２－メルカプトエタノール、ペニシリン／ストレプトマイシン、およびｂＦＧＦを含む、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ＤＭＥＭ）中、マイトマイシンＣで処
理されたマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）上で維持し、培養し、コラゲナーゼＩＶを使用して継代を毎週行った。
例
皮膚線維芽細胞からのｉＰＳＣの導出
皮膚生検に由来する線維芽細胞を、ＣｙｔｏＴｕｎｅ－ｉＰＳ Ｓｅｎｄａｉ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して多能性幹細胞に再プログラムした。簡潔に述べると、６ウェルディッシュ中、１ウェル当たり５×１０４個の線維芽細胞を、一晩で回収するために継代３で播種した。翌日、Ｓｅｎｄａｉウイルス発現ヒト転写因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、Ｋｌｆ４、およびｃ－Ｍｙｃを、製造業者の指示書に従って、線維芽細胞培地中で混合し、線維芽細胞を感染させた。２日後に、培地を、ＡＬＫ５阻害剤ＳＢ４３１５４２（２μＭ；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＭＥＫ阻害剤ＰＤ０３２５９０１（０．５μＭ；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、およびチアゾビビン（０．５μＭ；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）が補充されたヒトＥＳ培地と交換した。感染してから７～１０日後に、細胞を、ＴｒｙｐＬＥ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して剥がし、フィーダー細胞上で継代を行った。ｉＰＳＣの個々のコロニーを、感染してから２１から２８日の間に採取し、各ｉＰＳＣ株を単一コロニーから拡大増殖させた。すべてのｉＰＳＣ株を、ヒトＥＳ培地中のマウス胚線維芽細胞上で培養した。
核型分析は、Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．によって行われた。奇形腫分析では、ＴｒｙｐＬＥ処理後に、各ｉＰＳＣ株から１～２×１０７個を剥がし、収集した。これらをヒトＥＳ培地０．５ｍＬ中に懸濁した。続いてＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）０．５ｍＬと混合し、細胞を、免疫不全マウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ、ストック番号００５５５７、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の背側側腹部へ皮下注射した。注射してから８週間後に、奇形腫を採取し、４％パラホルムアルデヒドを用いて一晩固定し、パラフィン包埋の標準手順に従って処理した。次いで、試料を切片にし、Ｈ＆Ｅ染色を行った。
例
フローサイトメトリーおよび細胞分類
細胞標識化を、１％ＦＢＳが補充されたＰＢＳから構成される緩衝液中で抗体を用いて染色することによって行った。Ａｃｃｕｔａｓｅ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で剥がした細胞を、抗体（供給元によって推奨される抗体滴定（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）を使用）とともに、暗所にて、氷上で３０分間インキュベートした。この試験において使用した抗体は、暗所にて、４℃で３０分間ビオチン化抗ＳＳＥＡ－３（ＭＣ－６３１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と一緒にした、ＰＥ－コンジュゲート抗ＰＲＯＣＲ（ＲＣＲ－２５２、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）、ＡＰＣ－コンジュゲート抗ＥＳＡ（１Ｂ７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＰＥ－コンジュゲート抗ＣＤ２４（ＳＮ３ Ａ５－２Ｈ１０、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＡＰＣ－コンジュゲート抗ＣＤ４４（ＩＭ－７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）であった。２回洗浄した後、細胞を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８－コンジュゲートストレプトアビジンを用いて、暗所にて、４℃で３０分間染色した。適切なアイソタイプ対照を、各細胞標識化実験に使用した。同様の抗体を、この試験におけるすべての染色および分類実験で使用した。生存細胞の分類は、１００μｍノズルを備えたＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａＵを使用し、製造業者の指示書に従って行った。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に関しては、さ
らなる分析の前に、分類された細胞を、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／抗生物質／抗真菌剤とともに、加湿された３７℃のインキュベーター中で、一晩インキュベートし、超低付着表面プレート中に回収した。ＭＣＦ－７細胞に関しては、分類した後に、すぐにさらなる実験に供した。異なるマーカー集団中の細胞の百分率を、ソフトフェアＦｌｏｗＪｏを使用して評価した。
例
軟寒天アッセイ
軟寒天コロニー形成アッセイを、０．５％ＳｅａＰｌａｑｕｅアガロース／ＤＭＥＭ／ＦＢＳの基底層上の、ＤＭＥＭ／ＦＢＳを含む０．３５％ＳｅａＰｌａｑｕｅアガロース（Ｌｏｎｚａ、Ｓｗｉｔｚｌａｎｄ）層中に、細胞を播種することによって行った。培養物を、加湿された３７℃のインキュベーター中で維持した。さらなる培地を２～３日毎に添加し、成長補充物質を細胞に継続的に供給した。播種してから２１日後に、０．０５％クリスタルバイオレットを含有する純エタノールで細胞を固定し、コロニー形成効率を光学顕微鏡検査法によって定量化した。
例
腫瘍様塊の形成
腫瘍様塊形成アッセイでは、細胞を、サプリメントＢ２７（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および１０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中、９６ウェル低付着プレート上で、細胞１００個／ウェルの密度でインキュベートした。培養物を、加湿された３７℃のインキュベーター中で維持した。１４日後に、腫瘍様塊の数を光学顕微鏡下で数えた。
例
マウス腫瘍形成性アッセイ
ＮＯＤ－ＳＣＩＤ（ＮＳ）マウスを使用し、ヒト乳がん細胞株に由来し、潜在的な幹細胞マーカーを発現する、分類された細胞の幹細胞特性を評価した。動物飼育および実験は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ａｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａ（ＩＡＣＵＣ＃１３０－０９－５７５）によって認可された。ＣＡＦ（１：１）およびＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（１：１）と混合した分類されたがん細胞を、４週齢のＮＳマウスの脂肪パッドに注射した。ＭＣＦ－７に関しては、エストロゲンペレット（０．１８ｍｇ／ペレット、９０日放出、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）を、実験の前日にマウスにさらに注射した。腫瘍体積を、最初に検出してから５日毎に評価した。腫瘍形成効率を、細胞を注射してから５０日後に決定した。
例
β３ＧａｌＴ５の過剰発現およびノックダウン
ヒトβ３ＧａｌＴ５過剰発現安定株を樹立するために、ヒトβ３ＧａｌＴ５をコードする完全長ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し（フォワードプライマー－ＧＣＡＧＡＴＣＴＡＴＧＧＣＴＴＴＣＣＣＧＡＡＧＡＴＧ、リバースプライマー－ＧＴＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＡＣＡＧ
ＧＣＧＧＡＣＡＡＴ）、ＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩ切断ｐＭＳＣＶｐｕｒｏベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にサブクローニングした。次いで、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）－対照およびＭＳＣＶ－β３ＧａｌＴ５水疱性口内炎ウイルスＧ糖タンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）偽型レトロウイルスを、ＧＰ２－２９３細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中に産生し、ＭＣＦ－７およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に感染させるために使用した。ウイルスに感染してから２日後に、対照およびβ３ＧａｌＴ５安定プールを、ピューロマイシン（２μｇ／ｍＬ）を用いて選択した。β３ＧａｌＴ５ノックダウン細胞を樹立するために、ヒトβ３ＧａｌＴ５に対するレンチウイルス－ｓｈＲＮＡシステムを、Ｎａｔｉｏｎａｌ ＲＮＡｉ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ Ｐｌａｔｆｏｒｍ、Ａｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａから購入した。β３ＧａｌＴ５－ショートペアピン配列は、５’ＣＣＧＧＧＣＡＡＧＴＧＧＴＴＴＧＴＣＡＧＴＡＡＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＴＴＡＣＴＧＡＣＡＡＡＣＣＡＣＴＴＧＣＴＴ ＴＴＴＧ－３’である。簡潔に述べると、ｓｈβ３ＧａｌＴ５およびｓｈ対照レンチウイルスを、製造業者の指示書に従って、ＭＣＦ７およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞とともにインキュベートした。感染細胞を、感染から４８時間後に採取するか、またはピューロマイシン（２μｇ／ｍＬ）を用いて選択し、ノックダウン効率を定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって決定した。
他の実施形態
この明細書において開示されるすべての特徴は、任意の組合せで組み合わせてよい。この明細書において開示される各特徴は、同様の、等価の、または類似の目的を果たす代わりの特徴によって置き換えてよい。したがって、特に明示的な記載がない限り、開示される各特徴は、単に包括的な一連の等価のまたは類似の特徴の例にすぎない。
上述から、当業者であれば、記述された実施形態の必須の特性を容易に見極めることができ、その意図および範囲から逸脱することなく、実施形態の種々の変更および変形を行い、それを種々の用途および条件に適合させることができる。したがって、他の実施形態も特許請求の範囲の範囲内である。

Claims (12)

  1. 患者における乳がん幹細胞の腫瘍原性（ｔｕｍｏｒｇｅｎｉｃｉｔｙ）を予測する方法であって、
    前記患者から単離された試料と、がん幹細胞マーカーＳＳＥＡ－３と結合する抗体、および、前記乳がん幹細胞上のがん幹細胞マーカーＥＳＡ／ＰＲＯＣＲと結合する抗体、とを接触させることによって、前記試料に前記乳がん幹細胞が存在するか否かを検出すること、
    ＳＳＥＡ－３と結合する前記抗体による前記乳がん幹細胞への特異的結合、および、前記乳がん幹細胞上のＰＲＯＣＲおよび／またはＥＳＡと結合する前記抗体による特異的結合、を検出すること、
    ＥＳＡhiＰＲＯＣＲhiＳＳＥＡ－３+乳がん幹細胞を検出すること、
    前記ＥＳＡhiＰＲＯＣＲhiＳＳＥＡ－３+乳がん幹細胞の相対的分布を分析すること、および、
    前記相対的分布により腫瘍原性を予測すること、を含む方法。
  2. 患者から単離された試料中の乳がん幹細胞の腫瘍原性（ｔｕｍｏｒｇｅｎｉｃｉｔｙ）を予測する方法であって、
    （ｉ）前記乳がん幹細胞上のＳＳＥＡ－３、ＰＲＯＣＲ、および、ＥＳＡからなる群より選択されるがん幹細胞マーカーの発現を分析するステップ、
    （ｉｉ）前記乳がん幹細胞の相対的分布を分析するステップ、および、
    （ｉｉｉ）前記相対的分布により前記乳がん幹細胞の腫瘍原性を予測するステップを含み、
    ＥＳＡhiＰＲＯＣＲhiＳＳＥＡ－３+を発現する細胞の存在は、前記試料中の高い腫瘍原性を有する乳がん幹細胞の存在を示す、方法。
  3. 前記試料が、前記がん幹細胞マーカーに特異的に結合する結合剤で染色される、請求項１または２に記載の方法。
  4. 少なくとも１つの第２のがん幹細胞マーカーを同時発現する細胞の存在が、第２のがん幹細胞の存在を示す、請求項１または２に記載の方法。
  5. ＳＳＥＡ－４、および、ＧｌｏｂｏＨからなる群より選択されるがん幹細胞マーカーの同時発現を試験するステップをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
  6. 乳がん幹細胞に対する有効性について、候補剤をスクリーニングする方法であって、
    ａ）前記候補剤をＥＳＡhiＰＲＯＣＲhiＳＳＥＡ－３ + を発現する前記乳がん幹細胞と接触させるステップと、
    ｂ）前記乳がん幹細胞に対する前記候補剤の有効性を決定するステップとを含む、方法。
  7. 乳がんを同定するための方法であって、
    患者から得られた試料が、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ５（β３ＧａｌＴ５）を異常レベルで発現する幹細胞を含むかどうかを決定するステップと、
    ＳＳＥＡ－３、ＰＲＯＣＲ、および、ＥＳＡからなる群より選択されるがん幹細胞マーカーの存在をアッセイするステップと、を含み、
    ＥＳＡhiＰＲＯＣＲhiＳＳＥＡ－３+を発現する、および、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ５（β３ＧａｌＴ５）を過剰発現する前記幹細胞が前記乳がんの存在を示す方法。
  8. 乳がん幹細胞の集団の細胞原性を予測するための方法であって、
    ａ）がん細胞の出発集団を提供するステップと、
    ｂ）前記がん細胞の出発集団のがん幹細胞マーカーの発現レベルを決定するステップと、
    ｃ）ＥＳＡhiＰＲＯＣＲhiＳＳＥＡ－３ + を発現する細胞の集団を選択するステップであって、選択された前記細胞の集団は乳がん幹細胞である、ステップと、
    ｄ）ステップｃ）で選択された前記細胞の集団を単離および／または富化するステップと、
    ｅ）前記乳がん幹細胞の相対的分布を分析するステップ、および、
    ｆ）前記相対的分布により前記乳がん幹細胞の腫瘍原性を予測するステップを含む、方法。
  9. 前記試料は、体液試料である、請求項１から５および７のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記体液試料は、血液試料である、請求項９に記載の方法。
  11. 前記分析するステップは、フローサイトメトリーを用いて行われる、請求項２に記載の方法。
  12. 前記決定するステップは、フローサイトメトリーを用いて行われる、請求項６から８のいずれか一項に記載の方法。
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