CN101443359A - Egfl7抗体及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了抗EGFL7抗体、包含这些抗体的组合物、和使用这些抗体的方法。

Description

EGFL7抗体及其使用方法

发明领域

一般而言，本发明涉及可用于调控血管发育的组合物和方法。具体而言，本发明涉及能结合表皮生长因子样结构域7(EGFL7)多肽的抗体。本发明进一步涉及与血管发生有关的疾患和疾病的诊断和治疗。

发明背景

维管联结(vascular supply)的发育是许多生理性和病理性过程的基本要求。活跃生长中的组织诸如胚胎和肿瘤要求充足的血液供应。它们通过生成促血管发生因子来满足这一需要，所述促血管发生因子经由称为血管发生(angiogenesis)的过程促进新血管形成。血管的管形成是复杂但有序的生物学事件，牵涉所有或许多以下步骤：a)自已有的内皮细胞(EC)增殖出EC或自祖细胞分化出EC；b)EC迁移并接合以形成索样结构；c)血管索然后发生管发生(tubulogenesis)以形成具有中央内腔的血管；d)已有的索或血管伸出芽以形成次生血管；e)初级血管丛发生进一步重塑(remodeling)和整形(reshaping)；及f)内皮周细胞(peri-endothelial cell)被募集来包围内皮管，为血管提供维持和调控功能，此类细胞包括用于小毛细血管的周细胞、用于大血管的平滑肌细胞、和心脏中的心肌细胞。Hanahan，Science 277：48-50(1997)；Hogan & Kolodziej，Nat.Rev.Genet.3：513-23(2002)；Lubarsky & Krasnow，Cell 112：19-28(2003)。

现在完全确立了血管发生牵涉多种病症的发病机理。这些包括实体瘤和转移、动脉粥样硬化、晶状体后纤维组织增生、血管瘤、慢性炎症、眼内新血管疾病诸如增殖性视网膜病例如糖尿病性视网膜病、年龄相关黄斑变性(AMD)、新生血管性青光眼、移植角膜组织和其它组织的免疫排斥、类风湿性关节炎、和银屑病。Folkman et al.，J.Biol.Chem.267：10931-34(1992)；Klagsbrun et al.，Annu.Rev.Physiol.53：217-39(1991)；Garner A.，“Vasculardiseases”，于Pathobiology of Ocular Disease.A Dynamic Approach，Garner A和Klintworth GK编，第2版，Marcel Dekker，NY，1994，pp 1625-1710。

在肿瘤生长的情况中，血管发生对于自增生至瘤形成的转换，及为肿瘤的生长和转移提供营养似乎是至关重要的。Folkman et al.，Nature 339：58(1989)。新血管形成(neovascularization)让肿瘤细胞获得了与正常细胞相比的生长优势和增殖自治。肿瘤通常开始于单个异常细胞，由于与可利用毛细管床的距离，该细胞只能增殖至几立方毫米的尺寸，而且它能在较长的一段时间里保持“休眠”状态而不进一步生长和传播。有些肿瘤细胞然后转向血管发生表型以激活内皮细胞，所述内皮细胞增殖并成熟成新的毛细血管。这些新形成的血管不仅让原发性肿瘤继续生长，而且让转移性肿瘤细胞传播并再建群(recolonization)。因而，在肿瘤切片中的微血管密度与乳腺癌及数种其它肿瘤的患者存活之间观察到了相关性。Weidner et al.，N.Engl.J.Med.324：1-6(1991)；Horak et al.，Lancet 340：1120-24(1992)；Macchiarini et al.，Lancet 340：145-46(1992)。尚未完全了解控制血管发生转换的精确机制，但是认为肿瘤块的新血管形成源自众多血管发生刺激物与抑制物的净平衡。Folkman，Nat.Med.1(1)：27-31(1995)。

血管发育过程受到严密调节。迄今为止，多种分子，多为由周围细胞生成的分泌性因子，已显示出调节EC分化、增殖、迁移和接合成索样结构。例如，血管内皮生长因子(VEGF)已鉴定为牵涉刺激血管发生和诱导血管通透性的关键因子。Ferrara et al.，Endocr.Rev.18：4-25(1997)。甚至单个VEGF等位基因的遗失导致胚胎致死的发现指向此因子在血管系统的发育和分化中所发挥的不可代替的作用。此外，VEGF已显示为与肿瘤和眼内病症有关的新血管形成的关键介导物。Ferrara et al.，Endocr.Rev.见上文。VEGF mRNA在多数所检查的人肿瘤中过表达。Berkman et al.，J.Clin.Invest.91：153-59(1993)；Brown et al.，Human Pathol.26：86-91(1995)；Brown et al.，Cancer Res.53：4727-35(1993)；Mattern et al.，Brit.J.Cancer 73：931-34(1996)；Dvorak et al.，Am.J.Pathol.146：1029-39(1995)。

同样，眼部液体中VEGF的浓度水平与糖尿病性和其它缺血相关视网膜病患者中的活跃的血管增殖的存在高度相关。Aiello et al.，N.Engl.J.Med.331：1480-87(1994)。此外，研究证明了VEGF在AMD患者脉络膜新血管膜中的定位。Lopez et al.，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.37：855-68(1996)。

抗VEGF中和性抗体在裸鼠中遏制多种人肿瘤细胞系的生长(Kim et al.，Nature 362：841-44(1993)；Warren et al.，J.Clin.Invest.95：1789-97(1995)；

  et al.，Cancer Res.56：4032-39(1996)；Melnyk et al.，Cancer Res.56：921-24(1996))，而且在缺血性视网膜病症模型中还抑制眼内血管发生(Adamis et al.，Arch.Ophthalmol.114：66-71(1996))。因此，抗VEGF单克隆抗体或其它VEGF作用抑制剂是有希望用于治疗肿瘤和多种眼内新血管病症的候选物。此类抗体记载于例如1998年1月14日公开的EP 817,648和1998年10月15日公开的WO98/45331和WO98/45332。一种抗VEGF抗体，贝伐单抗(bevacizumab)，已获FDA批准与化疗方案联合用于治疗转移性结肠直肠癌(CRC)。而且，贝伐单抗正在许多进行中的治疗各种癌症适应证的临床试验中接受调查。

已知细胞外基质(ECM)在血管发生过程中发挥重要作用。Madri，Transpl.Immunol.5：179-83(1997)。EC在其迁移过程中由临时的ECM包围，并在形成内腔后粘附至新合成的血管基底膜。除了在毛细血管形态发生过程中提供支架之外，ECM已经显示出发挥对EC功能的复杂局部控制。例如，ECM能够调节可溶性血管发生介导物对EC的可用度和规定与整联蛋白和细胞粘附分子的相互作用的本质和类型。还提出了EC存活受到生长因子受体与整联蛋白间协作的调节，进而受到局部ECM组成的控制。Stupack & Cheresh，Oncogene22：9022-29(2003)。

尽管血管发生领域取得了许多进展，血管形成过程中的有些步骤仍然不是很清楚。具体而言，关于管发生如何受到调节-血管索如何进展而变成管，和什么因子调节这种转换知道的很少。鉴于血管发生在许多疾病和病症中的作用，希望有降低或抑制一种或多种引起这些过程的生物学效应的手段。还希望有测定致病多肽在正常和患病条件(尤其是癌)中的存在情况的手段。还存在对能增强现有抗血管发生疗法的疗效的组合物和方法的需要。

发明概述

本发明部分基于针对EGFL7的抗体的鉴定，这些抗体具有表明它们对治疗特别有益的特性。

一方面，本发明提供了由杂交瘤抗EGFL7鼠单抗4F11.1.8、抗EGFL7鼠单抗10G9.1.6、和抗EGFL7鼠单抗18F7.1.8生成的抗体。

一方面，本发明提供了包含一个或多个选自下组的互补决定区(CDR)的抗EGFL7抗体：(a)4F11 CDR-L1序列KASQSVDYDGDSYMS(SEQ ID NO：5)；(b)4F11 CDR-L2序列GASNLES(SEQ ID NO：6)；(c)4F11 CDR-L3序列QQNNEDPYT(SEQ ID NO：7)；(d)4F11 CDR-H1序列TYGMS(SEQ ID NO：8)；(e)4F11 CDR-H2序列WINTHSGVPTYADDFKG(SEQ ID NO：9)；和(f)4F11 CDR-H3序列LGSSA(SEQ ID NO：10)。在有些实施方案中，所述抗体的轻链包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下组的CDR序列：KASQSVDYDGDSYMS(SEQ ID NO：5)、GASNLES(SEQ ID NO：6)、和QQNNEDPYT(SEQ ID NO：7)。在有些实施方案中，所述抗体的重链包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下组的CDR序列：TYGMS(SEQ ID NO：8)、WINTHSGVPTYADDFKG(SEQ ID NO：9)、和LGSSA(SEQ ID NO：10)。在有些实施方案中，所述抗体的轻链包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下组的CDR序列：KASQSVDYDGDSYMS(SEQ ID NO：5)、GASNLES(SEQ ID NO：6)、和QQNNEDPYT(SEQ ID NO：7)；且所述抗体的重链包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下组的CDR序列：TYGMS(SEQ ID NO：8)、WINTHSGVPTYADDFKG(SEQ ID NO：9)、和LGSSA(SEQ ID NO：10)。在有些实施方案中，所述抗体的轻链包含序列：DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMSWYQQKPGQPPKLLIYGASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQNNEDPYTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO：1)。在有些实施方案中，所述抗体的重链包含序列：QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGHTFTTYGMSWVKQAPGKGLKWMGWINTHSGVPTYADDFKGRFAFSLETSASTAHLQINNLKNEDTATYFCARLGSSAVDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：2)。

一方面，本发明提供了包含一个或多个选自下组的互补决定区(CDR)的抗EGFL7抗体：(a)10G9 CDR-L1序列RSSQSLVHTNGITYLH(SEQ ID NO：11)；(b)10G9 CDR-L2序列KVSNRFS(SEQ ID NO：12)；(c)10G9 CDR-L3序列SQSTHVPLT(SEQ ID NO：13)；(d)10G9 CDR-H1序列DYYMNSDYYMN(SEQ ID NO：14)；(e)10G9 CDR-H2序列DINPKNGGTTYNQKFKG(SEQ IDNO：15)；和(f)10G9 CDR-H3序列ALGVFDY(SEQ ID NO：16)。在有些实施方案中，所述抗体的轻链包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下组的CDR序列：RSSQSLVHTNGITYLH(SEQ ID NO：11)、KVSNRFS(SEQ ID NO：12)、和SQSTHVPLT(SEQ ID NO：13)。在有些实施方案中，所述抗体的重链包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下组的CDR序列：DYYMNSDYYMN(SEQ ID NO：14)、DINPKNGGTTYNQKFKG(SEQ ID NO：15)、和ALGVFDY(SEQ ID NO：16)。在有些实施方案中，所述抗体的轻链包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下组的CDR序列：RSSQSLVHTNGITYLH(SEQ ID NO：11)、KVSNRFS(SEQ ID NO：12)、和SQSTHVPLT(SEQ ID NO：13)；且所述抗体的重链包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下组的CDR序列：DYYMNSDYYMN(SEQ ID NO：14)、DINPKNGGTTYNQKFKG(SEQ ID NO：15)、和ALGVFDY(SEQ ID NO：16)。在有些实施方案中，所述抗体的轻链包含序列：DIVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHTNGITYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPLTFGAGTKVEIKR(SEQ ID NO：3)。在有些实施方案中，所述抗体的重链包含序列：EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFSDYYMNSDYYMNWVKQSHGKSLEWIGDINPKNGGTTYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCAREADYDPIYYAMDYWGQGTTLTVSA(SEQ ID NO：4)。

在有些实施方案中，本发明提供了能特异性结合包含下述氨基酸序列之一的多肽的抗EGFL7抗体：CCP、TIY、和ACS。在有些实施方案中，本发明提供了能与本发明的其它抗体结合人EGFL7上相同表位的分离的抗体。在有些实施方案中，本发明提供了能与本发明的其它抗体竞争EGFL7结合的分离的抗体。

在有些实施方案中，本发明的抗体是单克隆抗体。在有些实施方案中，本发明的抗体是嵌合抗体、人源化抗体、亲和力成熟抗体、人抗体、或双特异性抗体。在有些实施方案中，抗体指抗体片段。

在有些实施方案中，本发明提供了包含本发明的抗EGFL7抗体的药用组合物。在有些实施方案中，所述药用组合物进一步包含抗血管发生剂。在有些实施方案中，所述抗血管发生剂是贝伐单抗(bevacizumab)或ranibizumab。

在有些实施方案中，本发明提供了编码本发明抗体的多核苷酸。在有些实施方案中，本发明提供了包含这些多核苷酸的载体。在有些实施方案中，所述载体是表达载体。在有些实施方案中，本发明提供了包含这些载体的宿主细胞，包括原核细胞和真核细胞(包括哺乳动物细胞)。在有些实施方案中，本发明提供了制备抗EGFL7抗体的方法，包括：(a)在合适的宿主细胞中表达表达载体，并(b)回收抗体。

在有些实施方案中，本发明提供了降低或抑制具有与血管发生有关的病理疾患的受试者中的血管发生的方法，包括对受试者施用有效量的本发明抗EGFL7抗体或包含本发明抗EGFL7抗体的药用组合物。在有些实施方案中，所述病理疾患是肿瘤(neoplasm)，例如癌瘤(carcinoma)。在有些实施方案中，所述病理疾患是与眼有关的，例如眼内新血管疾病(intraocular neovasculardisease)。在有些实施方案中，在本发明的抗EGFL7抗体之外，还对受试者施用抗血管发生剂(anti-angiogenic agent)。在有些实施方案中，所述抗血管发生剂是血管内皮生长因子(VEGF)的拮抗剂，例如抗VEGF抗体(包括贝伐单抗和ranibizumab)。在有些实施方案中，所述抗血管发生剂是在施用抗EGFL7抗体之前或之后施用的。在有些实施方案中，所述抗血管发生剂是与抗EGFL7抗体同时施用的。

在有些实施方案中，本发明提供了增强抗血管发生剂在具有与血管发生有关的病理疾患的受试者中的疗效的方法，包括对受试者施用本发明的抗EGFL7抗体或包含本发明抗EGFL7抗体的药用组合物。在有些实施方案中，所述病理疾患是肿瘤，例如癌瘤。在有些实施方案中，所述病理疾患是与眼有关的，例如眼内新血管疾病。在有些实施方案中，在本发明的抗EGFL7抗体之外，还对受试者施用抗血管发生剂。在有些实施方案中，所述抗血管发生剂是血管内皮生长因子(VEGF)的拮抗剂，例如抗VEGF抗体(包括贝伐单抗和ranibizumab)。在有些实施方案中，所述抗血管发生剂是在施用抗EGFL7抗体之前或之后施用的。在有些实施方案中，所述抗血管发生剂是与抗EGFL7抗体同时施用的。在有些实施方案中，还施用其它治疗，例如皮质类固醇或光动力学疗法(photodynamic therapy)。

附图简述

图1显示了单抗4F11轻链可变域(SEQ ID NO：1)和HuKI(SEQ ID NO：17)的氨基酸序列。

图2显示了单抗4F11重链可变域(SEQ ID NO：2)和HuIII(SEQ ID NO：18)的氨基酸序列。

图3显示了单抗10G9轻链可变域(SEQ ID NO：3)和HuKI(SEQ ID NO：17)的氨基酸序列。

图4显示了单抗10G9重链可变域(SEQ ID NO：4)和HuIII(SEQ ID NO：18)的氨基酸序列。

图5显示了全长EGFL7及其截短形式用于抗体结合位点做图的结构域。

图6显示了转染了人肺癌的异种小鼠模型(NSCLC；H1299)在用抗VEGF和本发明的抗EGFL7抗体治疗的过程中的体内肿瘤体积。

图7显示了的转染了人肺癌的异种小鼠体内模型(NSCLC；H1299)在用抗VEGF和本发明的抗EGFL7抗体治疗的过程中的存活。

图8显示了转染了人乳腺癌的异种小鼠模型(MDA-MB231)在用抗VEGF和本发明的抗EGFL7抗体治疗的过程中的体内肿瘤体积。

图9显示了人乳腺癌转染了的异种小鼠模型(MDA-MB231)在用抗VEGF和本发明的抗EGFL7抗体单抗18F7治疗的过程中的体内肿瘤体积。

发明详述

本发明提供了抗EGFL7抗体，其可用于例如治疗或预防与EGFL7的表达和/或活性(诸如升高的表达和/或活性或者不想要的表达和/或活性)有关的疾病状态。在有些实施方案中，本发明的抗体用于治疗肿瘤、癌、和/或细胞增殖性病症。

另一方面，本发明的抗EGFL7抗体可作为试剂用于作检测和/或分离EGFL7，诸如检测各种组织和细胞类型中的EGFL7。

本发明进一步提供了制备抗EGFL7抗体、编码抗EGFL7抗体的多核苷酸、和包含编码抗EGFL7抗体的多核苷酸的细胞的方法。

通用技术

本文中描述或提到的技术和规程一般得到了本领域技术人员的充分理解，而且通常利用常规方法得以采用，诸如例如下列文献中记载的广泛应用的方法：Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual 3rd.edition(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel，et al.eds.，(2003))；丛书METHODS IN ENZYMOLOGY(Academic Press，Inc.)：PCR2：A PRACTICAL APPROACH(M.J.MacPherson，B.D.Hames and G.R.Taylor eds.(1995))；Harlow and Lane，eds.(1988)ANTIBODIES，ALABORATORY MANUAL；及ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney，ed.(1987))。

定义

“分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的一种成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指将会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在有些实施方案中，将抗体纯化至(1)根据Lowry法的测定，抗体重量超过95％，有时重量超过99％，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用考马斯蓝或银染色，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。

“分离的”核酸分子指已经鉴定且与抗体核酸的天然来源中通常与之关联的至少一种污染性核酸分子分开的核酸分子。分离的核酸分子不同于在自然界中发现它时的形式或背景。分离的核酸分子因此与存在于天然细胞中时的核酸分子有区别。然而，分离的核酸分子包括通常表达该抗体的细胞中所包含的核酸分子，例如当所述核酸分子在所述细胞中的染色体定位不同于它在天然细胞中的染色体定位时。

术语“依照Kabat的可变域残基编号”或“依照Kabat的氨基酸位置编号”及其变体指Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991)中的抗体编辑用于重链可变域或轻链可变域的编号系统。使用此编号系统，实际的线性氨基酸序列可包含较少或另外的氨基酸，对应于可变域FR或CDR的缩短或插入。例如，重链可变域可包含H2残基52后的单一氨基酸插入(依照Kabat为残基52a)及重链FR残基82后的插入残基(例如依照Kabat为残基82a、82b和82c等)。给定抗体的Kabat残基编号可通过将抗体序列与“标准”Kabat编号序列对比同源区来确定。

短语“基本上相似”或“基本上相同”在用于本文时表示两个数值(通常一个涉及本发明的抗体而另一个涉及参照/比较抗体)之间足够高的相似程度，以致本领域技术人员将认为在用所述数值(例如Kd值)所测量的生物学特性背景内两个数值之间的差异具有很小的或没有生物学显著性。作为参照/比较抗体该数值的函数，所述两个数值之间的差异优选小于约50％、约40％、约30％、约20％、或约10％。

“结合亲和力”通常指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的。低亲和力抗体通常缓慢的结合抗原且趋于容易解离，而高亲和力抗体通常更快速的结合抗原且趋于保持更长时间的结合。本领域知道测量结合亲和力的多种方法，其中任一种都可用于本发明的目的。下文描述了具体的示例性实施方案。

在一个实施方案中，依照本发明的“Kd”或“Kd值”是通过如下测定法所述使用Fab型式的目的抗体及其抗原进行的放射性标记抗原结合测定法(RIA)来测量的：通过在存在未标记抗原的滴定系列的条件下，用最小浓度的¹²⁵I标记抗原平衡，然后用抗Fab抗体包被的平板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(Chen，et al.，J Mol Biol 293：865-881(1999))。为了确定测定条件，用50mM碳酸钠(pH9.6)中的5μg/ml捕捉用抗Fab抗体(Cappel Labs)包被微量滴定板(Dynex)过夜，随后用PBS中的2％(w/v)牛血清清蛋白在室温(约23℃)封闭2-5小时。在非吸附平板(Nunc #269620)中，将100pM或26pM[¹²⁵I]-抗原与连续稀释的目的Fab混合(例如与Presta et al.，Cancer Res.57：4593-4599(1997)中抗VEGF抗体，Fab-12的评估一致)。然后将目的Fab保温过夜；不过，保温可持续更长时间(例如65个小时)以保证达到平衡。此后，将混合物转移至捕捉板以进行室温保温(例如1小时)。然后除去溶液，并用含0.1％ Tween-20的PBS洗板8次。平板干燥后，加入150μl/孔闪烁液(MicroScint-20；Packard)，然后在Topcount伽马计数器(Packard)上对平板计数10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20％的浓度用于竞争性结合测定法。依照另一实施方案，Kd或Kd值是通过表面等离振子共振测定法使用BIAcore^TM-2000或BIAcore^TM-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)在25℃使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简而言之，依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BIAcoreInc.)。用10mM乙酸钠pH4.8将抗原稀释至5μg/ml(约0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注入至获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，在25℃以约25μl/分钟的流速注入在含0.05％ Tween-20的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(BIAcoreEvaluation Software version 3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(k_on)和解离速率(k_off)。平衡解离常数(Kd)以比率k_off/k_on计算。参见例如Chen，Y.，et al.，J Mol Biol 293：865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过10⁶M^-1S^-1，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(a stop-flow equippedspectrophometer)(Aviv Instruments)或8000系列SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，在存在浓度渐增的抗原的条件下，测量PBS，pH7.2中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)在25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。

依照本发明的“结合速率”(on-rate，rate of association，association rate)或“k_on”也可通过上文所述相同的表面等离振子共振技术使用BIAcore^TM-2000或BIAcore^TM-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)在25℃使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)来测定。简而言之，依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BIAcore Inc.)。用10mM乙酸钠pH4.8将抗原稀释至5μg/ml(约0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注入至获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，在25℃以约25μl/分钟的流速注入在含0.05％Tween-20的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(BIAcore Evaluation Software version 3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(k_on)和解离速率(k_off)。平衡解离常数(Kd)以比率k_off/k_on计算。参见例如Chen，Y.，et al.，J Mol Biol 293：865-881(1999)。然而，如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过10⁶M^-1S^-1，那么结合速率一般使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，在存在浓度渐增的抗原的条件下，测量PBS，pH7.2中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)在25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。

术语“载体”在用于本文时意指能够运输与其连接的其它核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，指其中可连接另外的DNA区段的环状双链DNA环。另一类载体是噬菌体载体。另一类载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在其所导入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如非附加型哺乳动物载体)可在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，由此随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“重组载体”)。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体常常是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。

“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，指任何长度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经过修饰的核苷酸或碱基、和/或其类似物，或者是可通过DNA或RNA聚合酶或者通过合成反应掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含经过修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。如果有的话，对核苷酸结构的修饰可以在装配聚合物之前或之后进行。核苷酸序列可以由非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在合成后进一步修饰，诸如通过与标记物偶联。其它类型的修饰包括例如“帽”，将一个或多个天然存在的核苷酸用类似物替代，核苷酸间修饰诸如例如具有不带电荷连接(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)和具有带电荷连接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修饰，含有悬垂模块(pendant moiety)诸如例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)的修饰、具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的修饰、含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的修饰、含有烷化剂的修饰、具有经修饰连接(例如α端基异构核酸(anomeric nucleic acid)等)的修饰、以及未修饰形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖类中的任何羟基可以用例如膦酸(phosphonate)基团、磷酸(phosphate)基团替换，用标准保护基团保护，或活化以制备与别的核苷酸的别的连接，或者可偶联至固体和半固体支持物。5′和3′末端OH可磷酸化或者用胺或1-20个碳原子的有机加帽基团模块取代。其它羟基也可衍生成标准保护基团。多核苷酸还可含有本领域普遍知道的核糖或脱氧核糖糖类的类似物形式，包括例如2′-氧-甲基、2′-氧-烯丙基、2′-氟-或2′-叠氮-核糖，碳环糖类似物，α-端基异构糖，差向异构糖诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，无环类似物及脱碱基核苷类似物诸如甲基核糖核苷。可用备选连接基团替换一个或多个磷酸二酯连接。这些备选连接基团包括但不限于以下实施方案，其中磷酸酯用P(O)S(“硫代酸酯”(thioate))、P(S)S(“二硫代酸酯”(dithioate))、(O)NR₂(“酰胺酯”(amidate))、P(O)R、P(O)OR′、CO或CH₂(“甲缩醛”(formacetal))替代，其中R或R′各自独立为H或者取代或未取代的烷基(1-20个C)，任选含有醚(-O-)连接、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有连接都必需是相同的。前述描述适用于本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。

“寡核苷酸”在用于本文时一般指短的多核苷酸，一般是单链，一般是合成的，长度一般但不是必需小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”与“多核苷酸”并不互相排斥。上文关于多核苷酸的描述平等且完全适用于寡核苷酸。

术语“EGFL7”(可互换地称为“表皮生长因子样7”)，在用于本文时，除非另有明确说明或者上下文另有说明，指任何天然的或变异的(无论是天然的或合成的)EGFL7多肽，例如WO 2005/117968中所记载的，其公开内容完整收入本文用于所有目的。术语“天然序列”明确涵盖天然存在的截短或分泌形式(例如胞外结构域序列)、天然存在的变异形式(例如可变剪接形式)和天然存在的等位变体。术语“野生型EGFL7”一般指包含天然存在EGFL7蛋白的氨基酸序列的多肽。术语“野生型EGFL7序列”一般指在天然存在EGFL7中发现的氨基酸序列。

术语“抗体”和“免疫球蛋白”以最广义互换使用，包括单克隆抗体(例如全长或完整单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体，只要它们展现出期望的生物学活性)，而且还可以包括某些抗体片段(如本文中更为详细描述的)。抗体可以是人的、人源化的和/或亲和力成熟的。

“可变的”指可变域中的某些部分在抗体序列间差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变域。它集中于轻链和重链可变域中称作互补决定区(CDR)或高变区的三个区段。可变域中较保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR，它们大多采取β-折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠片结构一部分的三个CDR连接。每条链中的CDR通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的CDR一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al.，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，National Institute of Health，Bethesda，MD.(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体依赖性细胞的(细胞)毒性中抗体的参与。

用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有一个抗原结合位点，及一个剩余的“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab′)₂片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。

“Fv”是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。在双链Fv种类中，此区由紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。在单链Fv种类中，一个重链可变域和一个轻链可变域可以通过柔性肽接头共价相连，使得轻链和重链在与双链Fv种类类似的“二聚体”结构中相结合。正是在这种构造中，各可变域的三个CDR相互作用而在V_H-V_L二聚体表面上确定了抗原结合位点。六个CDR共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或只包含对抗原特异的三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。

Fab片段还包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于重链CH1结构域的羧基末端增加了少数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab′的称谓。F(ab′)₂抗体片段最初是作为在Fab′片段之间有铰链半胱氨酸的成对Fab′片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联。

根据其恒定域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可归入两种截然不同的型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。

根据其重链恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白可归入不同的类。免疫球蛋白有五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。将与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的。

“抗体片段”只包含完整抗体的一部分，其中所述部分优选保留该部分存在于完整抗体中时通常与之有关的至少一项、优选大多数或所有功能。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)₂和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。在一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点，如此保留结合抗原的能力。在另一个实施方案中，抗体片段，例如包含Fc区的抗体片段，保留通常与Fc区存在于完整抗体中时通常与之有关的至少一项生物学功能，诸如FcRn结合、抗体半衰期调控、ADCC功能和补体结合。在一个实施方案中，抗体片段是体内半衰期与完整抗体基本上相似的单价抗体。例如，这样的抗体片段可包含一个抗原结合臂且其与能够赋予该片段以体内稳定性的Fc序列相连。

术语“高变区”、“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体可变域中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个高变区：三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。本文中使用且涵盖许多高变区的叙述。Kabat互补决定区(CDR)是以序列变异性为基础的，而且是最常用的(Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5thEd.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。Chothia改为指结构环的位置(Chothia and Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。AbM高变区代表Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷，而且得到Oxford Molecular的AbM抗体建模软件的使用。“接触(contact)”高变区是以对可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。

高变区可包括如下“延伸的高变区”：VL中的24-36(L1)、46-56(L2)和89-97(L3)及VH中的26-35(H1)、49-65或50-65(H2)和93-102(H3)。对于这些定义中的每一个，可变区残基是依照Kabat等，见上文编号的。

“框架”或“FR”残基指可变域中除本文中所定义的高变区残基外的那些残基。

非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变域，其中整个或基本上整个高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且整个或基本上整个FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones et al.，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature 332：323-329(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。还可参见以下综述及其引用的参考文献：Vaswani andHamilton，Ann.Allergy，Asthma & Immunol.1：105-115(1998)；Harris，Biochem.Soc.Transactions 23：1035-1038(1995)；Hurle and Gross，Curr.Op.Biotech.5：428-433(1994)。

“嵌合”抗体(免疫球蛋白)中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No.4,816,567；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。本文中所使用的人源化抗体是嵌合抗体的一个子集。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的V_H和V_L结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。一般而言，scFv多肽在V_H与V_L结构域之间还包含多肽接头，使得scFv能够形成结合抗原所需的结构。关于scFv的综述参见Plückthun，在Rosenburg and Moore编的《The Pharmacology of MonoclonalAntibodies》第113卷中，Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994)。

“抗原”指抗体可选择性结合的预定抗原。靶抗原可以是多肽、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其它天然存在的或合成的化合物。一般而言，靶抗原是多肽。

“表位”指抗原中受到抗体选择性结合的部分。对于多肽抗原，表位一般是大约4-10个氨基酸的肽区段。

术语“双抗体(diabody)”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一条多肽链(V_H-V_L)中包含相连的重链可变域(V_H)和轻链可变域(V_L)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。双抗体更完整的记载于例如EP 404,097；WO 93/11161；Hollinger等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。

“人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

“亲和力成熟的”抗体指在抗体的一个或多个CDR中具有一处或多处改变、导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的抗体。优选的亲和力成熟的抗体将具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可通过本领域已知规程来生成。Marks et al.，Bio/Technology 10：779-783(1992)记载了通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。以下文献记载了CDR和/或框架残基的随机诱变：Barbas et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91：3809-3813(1994)；Schier et al.，Gene 169：147-155(1995)；Yelton et al.，J.Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson et al.，J.Immunol.154(7)：3310-9(1995)；Hawkins et al.，J.Mol.Biol.226：889-896(1992)。

抗体“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：Clq结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。

“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指其中结合到某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上的分泌型Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。该抗体“武装”(arm)细胞毒性细胞，而且是此类杀伤作用绝对要求的。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetchand Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利No.5,500,362或5,821,337或Presta美国专利No.6,737,056中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)中所披露的。

“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应器功能的白细胞。优选的是，该细胞至少表达FcγRIII并行使ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞，优选PBMC和NK细胞。效应细胞可以从其天然来源例如血液分离。

“Fc受体”或“FcR”描述结合抗体Fc区的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在其胞质结构域中。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见综述，Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。FcR的综述参见Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)；Capel et al.，Immunomethods 4：25-34(1994)；de Haas et al.，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR，包括那些未来将会鉴定的。该术语还包括新生儿受体，FcRn，它负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer et al.，J.Immunol.117：587(1976)和Kim et al.，J.Immunol.24：249(1994))并调节免疫球蛋白的动态平衡。WO00/42072(Presta)记载了对FcR的结合提高或降低的抗体变体。在此明确收入该专利出版物的内容作为参考。还可参见Shields et al.，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)。

测量对FcRn的结合的方法是已知的(参见例如Ghetie and Ward，Immunol.Today 18：592-8(1997))。可测定人FcRn高亲和力结合多肽与人FcRn的体内结合和血清半衰期，例如在表达人FcRn的转基因小鼠或经转染的人细胞系中，或者在施用了Fc变体多肽的灵长类动物中。

“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指存在补体时对靶细胞的溶解。经典补体途径的激活是由补体系统第一组分(C1q)结合其关联抗原所结合的抗体(适宜亚类的)起始的。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所记载的。

具有更改的Fc区氨基酸序列及提高或降低的C1q结合能力的多肽变体记载于美国专利No.6,194,551 B1和WO 99/51642。在此明确收入那些专利出版物的内容作为参考。还可参见Idusogie et al.，J.Immunol.164：4178-4184(2000)。

“阻断性”抗体或“拮抗性”抗体指抑制或降低其所结合的抗原的生物学活性的抗体。优选的阻断性抗体或拮抗性抗体实质或完全抑制抗原的生物学活性。

“病症”或“疾病”指任何会受益于本发明的物质/分子或方法的治疗的疾患。这包括慢性和急性病症或疾病，包括那些使哺乳动物倾向于所讨论病症的病理状况。本文中待治疗的病症的非限制性例子包括恶性和良性肿瘤；癌瘤、母细胞瘤和肉瘤。

术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”指与一定程度的异常细胞增殖有关的病症。在一个实施方案中，细胞增殖性病症指癌症。

“肿瘤”在用于本文时指所有肿瘤性细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性紊乱”、“增殖性紊乱”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。

术语“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长/增殖不受调控的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、脑垂体癌、食管癌、星形细胞瘤、软组织肉瘤、非小细胞肺癌、肺的腺癌、肺的鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、脑癌、子宫内膜癌、睾丸癌、胆管癌、胆囊癌、胃癌、黑素瘤、及各种类型的头和颈癌。

血管发生失调可导致可通过本发明的组合物和方法来治疗的许多病症。这些病症包括非赘生性的和赘生性的疾患。赘生性疾患包括但不限于上文所描述的那些。非赘生性病症包括但不限于不想要的或异常的肥大、关节炎、类风湿性关节炎(RA)、银屑病、银屑病斑块、结节病、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化斑块、糖尿病性和其它增殖性视网膜病包括早产儿视网膜病、晶状体后纤维组织增生、年龄相关黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、角膜新血管形成、角膜移植片新血管形成、角膜移植片排斥、视网膜/脉络膜新血管形成、眼角的新血管形成(发红)、眼新血管疾病、血管再狭窄、动静脉畸形(AVM)、脑脊膜瘤、血管瘤、血管纤维瘤、甲状腺增生(包括格雷夫斯氏(Graves)病)、角膜和其它组织移植、慢性炎症、肺炎、急性肺损伤/ARDS、败血症、原发性肺动脉高压、恶性肺积液(malignant pulmonary effusion)、脑水肿(例如与急性中风/闭合性头部外伤/创伤有关的)、滑液炎症、RA中的血管翳形成、骨化性肌炎、肥大性骨形成、骨关节炎(OA)、顽固性腹水、多囊卵巢病、子宫内膜异位症、第三空间流体病(3rd spacing of fluid diseases)(胰腺炎、间隔综合征、烧伤、肠病)、子宫纤维瘤(uterine fibroids)、早产、慢性炎症诸如IBD(克罗恩氏(Crohn)病和溃疡性结肠炎)、肾同种异体移植物排斥、炎性肠病、肾病综合征、不想要的或异常的组织块生长(非癌性的)、血友病性关节、肥厚性瘢痕、毛发生长的抑制、奥-韦二氏(Osler-Weber)综合征、脓性肉芽肿晶状体后纤维组织增生、硬皮病、沙眼、血管粘连、滑膜炎、皮炎、先兆子痫、腹水、心包积液(诸如与心包炎有关的)和胸腔积液。

术语“消耗性/衰竭性”病症(例如衰竭综合征、恶病质、肌肉减少症(sarcopenia))指由不希望的和/或不健康的体重减轻或体细胞质量减轻引起的病症。在老年人中以及在AIDS和癌症患者中，消耗性疾病可导致不希望的体重减轻，包括脂肪和无脂肪隔室二者。消耗性疾病可以由不当摄食和/或与不适和/或衰老过程有关的代谢变化所致。癌症患者和AIDS患者，以及接受大量手术或具有慢性感染、免疫学疾病、甲状腺功能亢进、克罗恩氏病、心理性疾病、慢性心力衰竭或其它严重创伤的患者经常遭受消耗性疾病，有时也称为恶病质、代谢障碍、和进食障碍。恶病质还表现为高代谢和分解代谢过度。尽管恶病质和消耗性疾病经常互换使用，指消耗性疾患，但是至少有一项研究将恶病质与衰竭综合征区分开，即丧失无脂肪物质，特别是体细胞物质(Mayer，J.Nutr.129(1S Suppl.)：256S-59S(1999))。肌肉减少症，另一种影响衰老个体的此类病症，通常表现为丧失肌肉物质。如上所述末期消耗性疾病可以在患有恶病质或肌肉减少症的个体中发生。

在用于本文时，“治疗”或“处理”指试图改变所治疗个体或细胞的自然进程的临床干预，可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括预防疾病的发生或复发、缓解症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、减缓疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态、及免除或改善预后。在有些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病或病症的发生/发展。

“个体”、“受试者”或“患者”指脊椎动物，例如哺乳动物，尤其包括人。哺乳动物包括但不限于人，家畜和牲畜(domestic and farm animals)，及动物园动物、运动用动物、宠物(zoo，sports，or pet animals)，诸如犬、马、猫、牛等。

“有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的治疗或预防效果的量。

本发明的物质/分子、拮抗剂或激动剂的“治疗有效量”可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重及该物质/分子、激动剂或拮抗剂在个体中引发期望应答的能力等因素而变化。治疗有效量还指该物质/分子、激动剂或拮抗剂的治疗有益效果胜过任何有毒或有害后果的量。

“预防有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的预防效果的量。由于预防剂量是在疾病发作之前或在疾病的早期用于受试者的，因此预防有效量通常而非必然低于治疗有效量。

术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括：放射性同位素，例如At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²和Lu的放射性同位素；化疗剂，例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、长春花生物碱类(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；和毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素，包括其片段和/或变体；及下文披露的各种抗肿瘤药或抗癌药。下文记载了其它细胞毒剂。杀肿瘤药引起肿瘤细胞的破坏。

“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和

环磷酰胺(cyclophosphamide)；磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol)，

)；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinicacid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan)CPT-11(伊立替康(irinotecan)，

乙酰喜树碱、东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.33：183-186(1994))；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、

多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和美登醇(maytansinol)；安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2＂-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)(

)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoids)，例如

紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)、ABRAXANE^TM不含克列莫佛(Cremophor)，清蛋白改造的纳米颗粒剂型紫杉醇(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)和

多西他塞(doxetaxel)(-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine)

6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)

奥沙利铂(oxaliplatin)；亚叶酸(leucovorin)；长春瑞滨(vinorelbine)

能灭瘤(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维A酸(retinoids)，诸如维A酸(retinoic acid)；卡培他滨(capecitabine)

任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物；以及两种或多种上述物质的组合，诸如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙联合疗法的缩写)和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATIN^TM)联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写)。

该定义还包括作用为调节、降低、阻断、或抑制可促进癌生长的激素效果的抗激素剂，且常常是系统或全身治疗的形式。它们自身可以是激素。实例包括抗雌激素类和选择性雌激素受体调节剂类(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括

他莫昔芬)、

雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和

托瑞米芬(toremifene)；抗孕酮类；雌激素受体下调剂类(ERD)；功能为抑制或关闭卵巢的药剂，例如促黄体生成激素释放激素(LHRH)激动剂，诸如

和

醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)、醋酸戈舍瑞林(goserelinacetate)、醋酸布舍瑞林(buserelin acetate)和曲普瑞林(triptorelin)；其它抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；及抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、

醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、

伏罗唑(vorozole)、

来曲唑(letrozole)和

阿那曲唑(anastrozole)。另外，化疗剂的这种定义包括二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)(例如

或

)、依替膦酸钠(etidronate)、NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronic acid/zoledronate)、阿伦膦酸盐(alendronate)、

帕米膦酸盐(pamidronate)、

替鲁膦酸盐(tiludronate)或

利塞膦酸盐(risedronate)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制牵涉粘着细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如

疫苗和基因疗法疫苗，例如疫苗、

疫苗和

疫苗；拓扑异构酶1抑制剂；

；lapatinib ditosylate(ErbB-2和EGFR双重酪氨酸激酶小分子抑制剂，也称为GW572016)；及任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物。

“生长抑制剂”在用于本文时指在体外或在体内抑制细胞(诸如表达EGFL7的细胞)生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是显著降低处于S期的细胞(诸如表达EGFL7的细胞)百分比的药剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进(处于S期以外的位置)的药剂，诸如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春药类(vincas)(长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))、紫杉烷类(taxanes)、和拓扑异构酶II抑制剂诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可参见《The Molecular Basis of Cancer》，Mendelsohn和Israel编，第1章，题为“Cellcycle regulation，oncogenes，and antieioplastic drugs”，Murakaini等人，WBSaunders，Philadelphia，1995，尤其是第13页。紫杉烷类(紫杉醇(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel))是衍生自紫杉树的抗癌药。衍生自欧洲紫杉的多西他赛(，Rhone-Poulenc Rorer)是紫杉醇(

，Bristol-MyersSquibb)的半合成类似物。紫杉醇和多西他赛促进由微管蛋白二聚体装配成微管并通过防止解聚使微管稳定，导致对细胞中有丝分裂的抑制。

“多柔比星(Doxorubicin)”是蒽环类抗生素。多柔比星的完整化学名是(8S-顺式)-10-[(3-氨基-2，3，6-三脱氧-α-L-来苏-吡喃己糖基)氧基]-7，8，9，10-四氢-6，8，11-三羟基-8-(羟基乙酰基)-1-甲氧基-5，12-萘二酮。

(8S-cis)-10-[(3-amino-2，3，6-trideoxy-α-L-lyxo-hexapyranosyl)oxy]-7，8，9，10-tetrahydro-6，8，11-trihydroxy-8-(hydroxyacetyl)-1-methoxy-5，12-naphthacenedione

含“Fc区多肽”指包含Fc区的多肽，诸如抗体或免疫粘附素(见本文中定义)。Fc区的C-末端赖氨酸(依照EU编号系统的残基447)可以消除，例如在纯化多肽的过程中或者通过重组改造编码多肽的核酸。因此，依照本发明包含具有Fc区的多肽的组合物可包含具有K447的多肽、消除了所有K447的多肽、或具有与没有K447残基的多肽的混合物。

本发明的组合物及其制备方法

本发明涵盖包含抗EGFL7抗体的组合物，包括药用组合物；及包含抗EGFL7抗体编码序列的多核苷酸。在用于本文时，组合物包含一种或多种结合EGFL7的抗体，和/或一种或多种包含编码一种或多种结合EGFL7的抗体的序列的多核苷酸。这些组合物可进一步包含合适的载体，诸如药学可接受的赋形剂，包括缓冲剂，它们是本领域众所周知的。

本发明还涵盖分离的抗体和多核苷酸的实施方案。本发明还涵盖基本上纯的抗体和多核苷酸的实施方案。

本发明的抗EGFL7抗体优选是单克隆的。本发明的范围还涵盖本文中所提供的抗EGFL7抗体的Fab、Fab′、Fab′-SH和F(ab′)₂。这些抗体片段可通过常规方法来制备，诸如酶促消化，或者可以通过重组技术来生成。此类抗体片段可以是嵌合的或人源化的。这些片段可用于下文所列的诊断和治疗目的。

单克隆抗体是由一群基本上同质的抗体获得的，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变。由此，修饰语“单克隆”指明抗体的特征，即不是不同抗体的混合物。

本发明的抗EGFL7单克隆抗体可使用最初由Kohler et al.，Nature256：495(1975)记载的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法(美国专利No.4,816,567)来制备。

在杂交瘤方法中，免疫小鼠或其它适宜的宿主动物，诸如仓鼠，以引发生成或能够生成如下抗体的淋巴细胞，所述抗体将特异性结合用于免疫的蛋白质。EGFL7的抗体一般通过在动物中多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射EGFL7和佐剂来生成。EGFL7可以使用本领域众所周知的方法来制备，其中有些方法在本文中有描述。例如，EGFL7的重组生产在下文中有描述。在一个实施方案中，将动物用包含EGFL7胞外结构域(ECD)且其融合至免疫球蛋白重链Fc部分的EGFL7衍生物免疫。在一个实施方案中，将动物用EGFL7-IgG1融合蛋白免疫。通常将动物针对EGFL7的免疫原性偶联物或衍生物和单磷酰脂质A(MPL)/海藻糖trehalose dicrynomycolate(TDM)(Ribi Immunochem.Research，Inc.，Hamilton，MT)进行免疫，将溶液皮内注射于多个部位。2周后，对动物进行加强免疫。7-14天后，对动物采血，并测定抗EGFL7滴度。对动物进行加强免疫，直到滴度达到平台(plateaus)。

或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后，使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，MonoclonalAntibodies：Principlesand Practice，pp.59-103，Academic Press，1986)。

将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，所述培养基优选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。例如，若亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基典型的将含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。

优选的骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持所选抗体生成细胞稳定的高水平生成抗体、并对诸如HAT培养基样培养基敏感的。在这些细胞中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，诸如那些可从索尔克研究所细胞分配中心(SalkInstitute Cell Distribution Center，San Diego，California，USA)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤及可从美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，Rockville，Maryland，USA)获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞所衍生的。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已描述用于生成人单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.133：3001(1984)；Brodeur et al.，Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications，pp.51-63，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，1987)。

可对杂交瘤细胞正在其中生长的培养液测定针对EGFL7的单克隆抗体的生成。优选的是，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。

单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munson et al.，Anal.Biochem.107：220(1980)的Scatchard分析来测定。

在鉴定得到生成具有期望特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，该克隆可通过有限稀释规程进行亚克隆并通过标准方法进行培养(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103，AcademicPress，1986)。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可在动物中作为腹水瘤进行体内培养。

可通过常规免疫球蛋白纯化规程，诸如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养液、腹水或血清适当分开。

本发明的抗EGFL7抗体可以通过使用组合库筛选具有期望活性的合成抗体克隆来制备。在原理上，通过筛选噬菌体文库来选择合成抗体克隆，所述噬菌体文库含有展示融合至噬菌体外壳蛋白的各种抗体可变区片段(Fv)的噬菌体。通过针对所需抗原的亲和层析淘选此类噬菌体文库。表达能够结合所需抗原的Fv片段的克隆被吸附至抗原，从而与文库中不结合的克隆分开。然后将结合的克隆从抗原上洗脱，而且可以通过额外的抗原吸附/洗脱循环进一步富集。本发明的有些抗EGFL7抗体可以如下获得，即设计合适的抗原筛选规程来选择感兴趣的噬菌体克隆，接着使用来自感兴趣的噬菌体克隆的Fv序列和Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，FifthEdition，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，vols.1-3中记载的合适的恒定区(Fc)序列构建全长抗EGFL7抗体克隆。

抗体的抗原结合域由两个约110个氨基酸的可变(V)区形成，分别来自重链(VL)和轻链(VH)，都呈现三个高变环或互补决定区(CDR)。可变域可以功能性的展示在噬菌体上，或是作为单链Fv(scFv)片段(其中VH和VL通过短的、柔性的接头共价相连)，或者作为Fab片段(其中它们各自与恒定域融合且非共价相互作用)，如Winter et al.，Ann.Rev.Immunol.，12：433-455(1994)所述。在用于本文时，编码scFv的噬菌体克隆和编码Fab的噬菌体克隆统称为“Fv噬菌体克隆”或“Fv克隆”。

VH和VL基因的全集可以通过聚合酶链式反应(PCR)分开克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以搜索抗原结合克隆，如Winter et al.，Ann.Rev.Immunol.，12：433-455(1994)所述。来自经免疫来源的文库能提供对免疫原有高亲和力的抗体，无需构建杂交瘤。或者，可以克隆未免疫的全集，用于为广泛的非自身的及自身的抗原提供单一人抗体来源，无需任何免疫，如Griffiths et al.，EMBO J，12：725-734(1993)所述。最后，未免疫的文库还可以以合成方式来构建，即从干细胞克隆未重排的V基因片段，使用包含随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排，如Hoogenboomand Winter，J.Mol.Biol.，227：381-388(1992)所述。

通过与次要外壳蛋白pIII融合，使用丝状噬菌体来展示抗体片段。抗体片段可以展示为单链Fv片段，其中VH与VL结构域通过柔性多肽间隔物在同一多肽链上相连，例如如Marks et al.，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)所述，或者展示为Fab片段，其中一条链与pIII融合，另一条链分泌到细菌宿主细胞周质中，在此装配Fab-外壳蛋白结构，其通过取代一些野生型外壳蛋白而展示在噬菌体表面上，例如如Hoogenboom et al.，Nucl.Acids Res.，19：4133-4137(1991)所述。

一般而言，从收获自人或动物的免疫细胞获得编码抗体基因片段的核酸。如果希望文库偏向抗EGFL7克隆，那么可以给受试者免疫EGFL7以产生抗体应答，并回收脾细胞和/或循环B细胞或其它外周血淋巴细胞(PBL)用于文库构建。在一个优选的实施方案中，如下得到了偏向抗人EGFL7克隆的人抗体基因片段文库，即在携带功能性人免疫球蛋白基因阵列(且缺乏功能性内源抗体生成系统)的转基因小鼠中产生抗人EGFL7抗体应答，使得EGFL7免疫产生生成针对EGFL7的人抗体的B细胞。制备人抗体的转基因小鼠的生成在下文中有描述。

可以如下获得抗EGFL7反应性细胞群的进一步富集，即使用合适的筛选规程来分离表达EGFL7特异性膜结合抗体的B细胞，例如通过用EGFL7亲和层析进行的细胞分离或者细胞对荧光标记的EGFL7的吸附及后续的荧光激活细胞分选(FACS)。

或者，来自未免疫供体的脾细胞和/或B细胞或其它PBL的使用提供了可能的抗体全集的更佳展现，而且还容许使用EGFL7在其中没有抗原性的动物(人或非人的)物种构建抗体文库。为了构建掺入体外抗体基因的文库，从受试者收获干细胞以提供编码未重排抗体基因区段的核酸。可以从多种动物物种(诸如人、小鼠、大鼠、兔类、luprine、犬、猫、猪、牛、马、和禽类等)获得感兴趣的免疫细胞。

从感兴趣的细胞回收编码抗体可变基因区段(包括VH和VL区段)的核酸并扩增。就重排的VH和VL基因文库而言，可以如下获得所需DNA，即从淋巴细胞分离基因组DNA或mRNA，接着用与重排的VH和VL基因的5′和3′末端匹配的引物进行聚合酶链式反应(PCR)，如Orlandi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：3833-3837(1989)所述，由此构建多样性V基因全集供表达。可以从cDNA和基因组DNA扩增V基因，反向引物位于编码成熟V结构域的外显子的5′末端，正向引物基于J区段内部，如Orlandi et al.(1989)和Ward et al.，Nature，341：544-546(1989)所述。然而，为了从cDNA进行扩增，反向引物还可基于前导外显子内，如Jones et al.，Biotechnol.，9：88-89(1991)所述，正向引物基于恒定区内，如Sastry et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，86：5728-5732(1989)所述。为了使互补性最大化，引物中可以掺入简并性，如Orlandi et al.(1989)或Sastry et al.(1989)所述。优选的是，如下将文库多样性最大化，即使用靶向每个V基因家族的PCR引物来扩增免疫细胞核酸样品中存在的所有可获得的VH和VL重排，例如如Marks et al.，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)或Orum et al.，Nucl.Acids Res.，21：4491-4498(1993)所述。为了将所扩增的DNA克隆到表达载体中，可以在PCR引物的一端引入罕见的限制性位点作为标签，如Orlandi et al.(1989)所述，或者用带标签的引物进行进一步的PCR扩增，如Clackson et al.，Nature，352：624-628(1991)所述。

人工合成的重组的V基因全集可以在体外从V基因区段衍生。大多数人VH基因区段已经克隆和测序(Tomlinson et al.，J.Mol.Biol.，227：776-798(1992))，并定位(Matsuda et al.，Nature Genet.，3：88-94(1993))；这些克隆的区段(包括H1和H2环的所有主要构型)可用于生成多样性VH基因全集，用到编码序列和长度多样性的H3环的PCR引物，如Hoogenboom and Winter，J.Mol.Biol.，227：381-388(1992)所述。VH全集还可如下生成，所有序列多样性集中于单一长度的长H3环，如Barbas et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4457-4461(1992)所述。人Vκ和Vλ区段已经克隆和测序(Williams and Winter，Eur.J.Immunol.，23：1456-1461(1993))，而且可用于生成合成的轻链全集。基于一系列VH和VL折叠的范围及L3和H3长度的合成的V基因全集将编码具有可观结构多样性的抗体。扩增编码V基因的DNA后，依照Hoogenboomand Winter，J.Mol.Biol.，227：381-388(1992)的方法，可以在体外重排种系V基因区段。

抗体片段全集可以如下构建，即以数种方式将VH与VL基因全集联合在一起。可以在不同载体中创建各个全集，并在体外重组载体，例如如Hogrefeet al.，Gene，128：119-126(1993)所述，或者在体内外通过组合感染来重组载体，例如Waterhouse et al.，Nucl.Acids Res.，21：2265-2266(1993)中记载的loxP系统。体内重组方法利用Fab片段的双链性质来克服因大肠杆菌转化效率施加的库容量限制。分别克隆未免疫的VH和VL全集，一个克隆入噬菌粒，另一个克隆入噬菌体载体。然后通过用噬菌体感染含噬菌粒的细菌使得每个细胞包含不同的组合来联合两种文库，库容量只受细胞存在数的限制(约10¹²个克隆)。两种载体都包含体内重组信号，使得VH与VL基因重组到单一复制子上，并共包装成噬菌体病毒粒。这些巨型文库提供了大量的具有优良亲和力(Kd^-1为约10^-8M)的多样性抗体。

或者，可以将全集依次克隆入同一载体，例如如Barbas et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：7978-7982(1991)所述，或者通过PCR装配到一起，然后克隆，如Clackson et al.，Nature，352：624-628(1991)所述。PCR装配还可用于将VH和VL DNA与编码柔性肽间隔物的DNA连接以形成单链Fv(scFv)全集。在另一种技术中，“细胞内PCR装配”用于通过PCR在淋巴细胞内联合VH与VL基因，然后克隆所连接基因的全集，如Embleton et al.，Nucl.Acids Res.，20：3831-3837(1992)所述。

未免疫文库(naive library)(天然的或合成的)生成的抗体可具有中等亲和力(Kd^-1为约10⁶-10⁷M^-1)，但还可以如下在体外模拟亲和力成熟，即构建和再次选择次生文库，如Winter et al.(1994)，见上文所述。例如，在Hawkinset al.，J.Mol.Biol.，226：889-896(1992)的方法或Gram et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA，89：3576-3580(1992)的方法中，使用易错聚合酶在体外随机引入突变(Leung et al.，Technique，1：11-15(1989))。另外，可以通过随机突变一个或多个CDR来进行亲和力成熟，例如在选定的个别Fv克隆中使用携带跨越感兴趣CDR的随机序列的引物进行PCR并筛选更高亲和力的克隆。WO 96/07754(公开于1996年3月14日)记载了用于在免疫球蛋白轻链的互补决定区中诱导诱变以创建轻链基因文库的方法。另一种高效方法是将通过噬菌体展示选出的VH或VL结构域与得自未免疫供体的天然存在V结构域变体组合，并在数轮链改组中筛选更高亲和力，如Marks et al.，Biotechnol.，10：779-783(1992)所述。此技术容许生成亲和力在10^-9M范围的抗体和抗体片段。

编码EGFL7的核酸序列可以使用所需EGFL7区域的氨基酸序列来设计。或者，可以使用cDNA序列(或其片段)。别的EGFL7序列进一步披露于例如NM_022963和Xie et al.，Cytokine 11：729-35(1999)。编码EGFL7的DNA可以通过本领域已知的多种方法来制备。这些方法包括但不限于通过Engels et al.，Agnew.Chem.Int.Ed.Engl.，28：716-734(1989)中记载的任何方法，诸如三酯、亚磷酸酯、氨基磷酸酯(phosphoramidite)和H-膦酸酯法进行的化学合成。在一个实施方案中，编码EGFL7的DNA的设计中使用表达宿主细胞所优选的密码子。或者，编码EGFL7的DNA可以从基因组或cDNA文库分离。

构建编码EGFL7的DNA分子后，将该DNA分子与表达载体，诸如质粒中的表达控制序列可操作连接，其中所述控制序列受到该载体转化的宿主细胞的识别。一般而言，质粒载体包含复制和控制序列，其衍生自与宿主细胞相容的物种。载体通常携带复制位点，以及编码能够在转化细胞中提供表型选择的蛋白质的序列。适于在原核和真核宿主细胞中表达的载体是本领域已知的，有些在本文中有进一步描述。可以使用真核生物体，诸如酵母或衍生自多细胞生物体诸如哺乳动物的细胞。

任选的是，编码EGFL7的DNA与分泌前导序列可操作连接，导致表达产物被宿主细胞分泌到培养基中。分泌前导序列的例子包括stII、ecotin、lamB、疱疹GD、lpp、碱性磷酸酶、转化酶、和α-因子。适用于此处的还有蛋白A的36个氨基酸的前导序列(Abrahmsen et al.，EMBO J.，4：3901(1985))。

宿主细胞用上文所述本发明的表达或克隆载体转染，优选转化，并在常规营养培养基中培养，培养基可以为了诱导启动子、选择转化子、或扩增编码所需序列的基因而适当修改。

转染指宿主细胞摄取表达载体，无论编码序列事实上是否表达。本领域普通技术人员直到许多转染方法，例如CaPO₄沉淀和电穿孔。若宿主细胞内存在此载体运转的任何指示，则认为转染成功。用于转染的方法是本领域众所周知的，有些在本文中有描述。

转化指将DNA导入生物体，使得DNA可进行复制，或是作为染色体外元件，或是通过染色体整合。根据所用宿主细胞，使用适于所述细胞的标准技术进行转化。用于转化的方法是本领域众所周知的，有些在本文中有描述。

用于生成EGFL7的原核宿主细胞可以如Sambrook et al.，见上文一般所述进行培养。

用于生成EGFL7的哺乳动物宿主细胞可以在多种培养基中培养，所述培养基是本领域众所周知的，有些在本文中有描述。

本发明公开的宿主细胞涵盖体外培养的细胞以及宿主动物体内的细胞。

EGFL7的纯化可以使用本领域公认的方法来实现。

纯化的EGFL7可以附着于合适的基质，诸如琼脂糖珠、丙烯酰胺珠、玻璃珠、纤维素、各种丙烯酸共聚物、羟基甲基丙烯酸酯凝胶、聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸共聚物、尼龙、中性和离子载体、诸如此类，用于噬菌体展示克隆的亲和层析分离。EGFL7蛋白对基质的附着可以通过Meth.Enzymol.，vol.44(1976)中记载的技术来实现。将蛋白质配体附着于多糖基质，例如琼脂糖、右旋糖苷或纤维素的常用技术牵涉用卤化氰活化载体，随后将肽配体的脂肪族伯胺或芳香族伯胺偶联至活化后的基质。

或者，EGFL7可用于包被吸附板的孔，在附着至吸附板的宿主细胞上表达，或用于细胞分选，或者偶联至生物素以用链霉亲合素包被的珠捕捉，或者用于本领域已知的用于淘选噬菌体展示库的任何其它方法。

在适于至少部分噬菌体颗粒结合吸附剂的条件下，使噬菌体文库样品接触固定化的EGFL7。正常情况下，选择包括pH、离子强度、温度等等的条件来模拟生理学条件。对结合至固相的噬菌体进行清洗，然后用酸洗脱，例如如Barbas et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA，88：7978-7982(1991)所述，或者用碱洗脱，例如如Marks et al.，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)所述，或者通过EGFL7抗原竞争洗脱，例如在与Clackson et al.，Nature，352：624-628(1991)的抗原竞争法类似的规程中。噬菌体在单轮选择中可以富集20-1,000倍。此外，富集的噬菌体可以在细菌培养物中进行培养，并进行更多轮选择。

选择的效率取决于许多因素，包括清洗过程中解离的动力学，及单个噬菌体上的多个抗体片段是否能同时结合抗原。具有较快解离动力学(和弱结合亲和力)的抗体可以通过使用短时间的清洗、多价噬菌体展示、及固相中的高抗原包被密度来保留。高密度不仅通过多价相互作用而稳定了噬菌体，而且有利于已解离的噬菌体的再结合。具有较慢解离动力学(和强结合亲和力)的抗体的选择可以通过使用长时间的清洗和单价噬菌体展示(如Bass etal.，Proteins，8：309-314(1990)和WO 92/09690所述)及低抗原包被密度(如Marks et al.，Biotechnol.，10：779-783(1992)所述)来促进。

有可能在对EGFL7具有不同亲和力的噬菌体抗体之间进行选择，甚至是亲和力略有差异的。然而，选定抗体的随机诱变(例如如有些上文所述亲和力成熟技术进行)有可能产生许多突变体，多数结合抗原，少数具有更高的亲和力。通过限制EGFL7，罕见的高亲和力噬菌体能竞争胜出。为了保留所有较高亲和力的突变体，可以将噬菌体与过量的生物素化EGFL7一起温育，但是生物素化EGFL7的摩尔浓度低于EGFL7的目标摩尔亲和常数。然后用链霉亲合素包被的顺磁珠捕捉高亲和力的结合噬菌体。此类“平衡捕捉”容许依照结合亲和力来选择抗体，其灵敏性容许从大大过量的低亲和力噬菌体中分离出亲和力只有原值2倍的突变体克隆。还可以操作清洗结合至固相的噬菌体的条件来进行基于解离动力学的区分。抗EGFL7克隆可以进行活性选择。

编码本发明杂交瘤衍生单克隆抗体或噬菌体展示Fv克隆的DNA易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用设计成自杂交瘤或噬菌体DNA模板特异性扩增感兴趣的重链和轻链编码区的寡核苷酸引物)。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染到原本不生成免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞中，诸如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得所需单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述性论文包括Skerra et al.，Curr.Opinion in Immunol.，5：256(1993)及Plückthun，Immunol.Rev.，130：151(1992)。

编码本发明Fv克隆的DNA可以联合编码重链和/或轻链恒定区的已知DNA序列(例如适宜的DNA序列可得自Kabat et al.，见上文)以形成编码全长或部分重链和/或轻链的克隆。应当领会，任何同种型的恒定区都可用于此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，而且此类恒定区可以得自任何人或动物物种。衍生自一种动物(诸如人)物种的可变域DNA，然后与另一动物物种的恒定区DNA融合以形成“杂合的”全长重链和/或轻链的编码序列的Fv克隆包括在本文所用“嵌合”和“杂合”抗体的定义中。在一个优选的实施方案中，衍生自人可变DNA的Fv克隆与人恒定区DNA融合以形成完全人的、全长或部分重链和/或轻链的编码序列。

还可以修饰编码衍生自本发明杂交瘤的抗EGFL7抗体的DNA，例如通过替代，即用人重链和轻链恒定区的编码序列代替衍生自杂交瘤抗体的同源鼠源序列(例如如Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984)中的方法)。可以进一步修饰编码杂交瘤或Fv克隆衍生抗体或片段的DNA，通过共价接合免疫球蛋白编码序列或非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列。可以以该方式制备具有本发明的Fc克隆或杂交瘤克隆衍生抗体的结合特异性的“嵌合”或“杂合”抗体。

抗体片段

本发明涵盖抗体片段。在某些情况中，使用抗体片段，而不是完整抗体有优势。片段的较小尺寸容许快速清除，而且可导致更易于接近实体瘤。

已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto et al.，J.Biochem.Biophys.Meth.24：107-117(1992)；Brennan et al.，Science 229：81(1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。Fab、Fv和scFv抗体片段都可在大肠杆菌中表达及由大肠杆菌分泌，如此容许容易的生成大量的这些片段。可从上文讨论的噬菌体抗体库中分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段并化学偶联以形成F(ab′)₂片段(Carter et al.，Bio/Technology10：163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab′)₂片段。包含补救受体结合表位残基、具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab′)₂片段记载于美国专利No.5,869,046。用于生成抗体片段的其它技术对于熟练从业人员将是显而易见的。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利No.5,571,894；及5,587,458。Fv和sFv是具有完整结合位点、缺少恒定区的唯一类型；如此，它们适于在体内使用时降低非特异性结合。可构建sFv融合蛋白以生成效应物蛋白质在sFv的氨基或羧基末端的融合。参见Antibody Engineering，Borrebaeck编，W.H.Freeman and Company(1992)。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如如美国专利No.5,641,870中所记载的。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。

人源化抗体

本发明涵盖人源化抗体。本领域知道用于人源化非人抗体的多种方法。例如，人源化抗体可具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称为“输入”残基，它们通常取自“输入”可变区。基本上可遵循Winter及其同事的方法进行人源化(Jones et al.，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen et al.，Science239：1534-1536(1988))，即用非人高变区序列替代人抗体的对应序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567)，其中显著少于完整的人可变区用非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是如下人抗体，其中有些高变区残基和可能的有些FR残基用啮齿类抗体类似位点的残基替代。

用于制备人源化抗体的人轻链和重链可变区的选择对于降低抗原性是非常重要的。依照所谓的“最适(best-fit)”方法，用啮齿类抗体的可变区序列对已知人可变区序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类最接近的人序列作为人源化抗体的人框架(Sims et al.，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia et al.，J.Mol.Biol.196：901(1987))。另一种方法使用由特定轻链或重链亚类(subgroup)的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架。相同框架可用于几种不同的人源化抗体(Carter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4285(1992)；Presta et al.，J.Immunol.151：2623(1993))。

更为重要的是，抗体在人源化后保留对抗原的高亲和力和其它有利的生物学特性。为了达到此目的，依照一种方法，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程来制备人源化抗体。通常可获得免疫球蛋白三维模型，这是本领域技术人员所熟悉的。还可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。通过检查这些显示图像能分析残基在候选免疫球蛋白序列发挥功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可以从受体序列和输入序列中选出FR残基并组合，从而得到期望的抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力升高。一般而言，高变区残基直接且最实质的涉及对抗原结合的影响。

人抗体

本发明的人抗EGFL7抗体可以通过如上所述联合选自人衍生噬菌体展示库的Fv克隆可变域序列与已知的人恒定域序列来构建。或者，可以通过杂交瘤方法来生成本发明的人单克隆抗EGFL7抗体。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系已有记载，例如Kozbor J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur et al.，Monoclonal Antibody Production Techniquesand Applications，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)；及Boerneret al.，J.Immunol.，147：86(1991).

例如，现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫后生成人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经记载了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移大量人种系免疫球蛋白基因将导致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovits et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：2551(1993)；Jakobovits et al.，Nature 362：255-258(1993)；Bruggermann etal.，Year in Immunol.7：33(1993)。

基因改组也可用于在体外自非人(例如啮齿类)抗体衍生人抗体，其中人抗体具有与起始非人抗体相似的亲和力和特异性。依照此方法，它也称为“表位印记”(epitope imprinting)，如上所述通过噬菌体展示技术得到的非人抗体片段的重链或轻链可变区用人V结构域基因全集替换，产生非人链-人链scFv或Fab嵌合物群。用抗原进行的选择导致非人链/人链嵌合scFv或Fab的分离，其中人链在一级噬菌体展示克隆中消除相应的非人链后恢复了抗原结合位点，即表位决定(印记，imprint)人链配偶体的选择。在重复该过程以替换剩余非人链时，得到人抗体(参见PCT WO 93/06213，公开于1993年4月1日)。与传统的通过CDR移植进行的非人抗体的人源化不同，此技术提供完全人的抗体，它们不含非人起源的FR架或CDR残基。

双特异性抗体

双特异性抗体指对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体，优选人抗体或人源化抗体。在本案中，结合特异性之一针对EGFL7，另一结合特异性针对任何其它抗原。例示性的双特异性抗体可结合EGFL7蛋白质的两种不同表位。双特异性抗体还可用于将细胞毒剂定位于表达EGFL7的细胞。这些抗体拥有EGFL7结合臂和结合细胞毒剂(例如肥皂草毒蛋白、抗干扰素-α、长春花生物碱类、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab′)₂双特异性抗体)。

用于构建双特异性抗体的方法是本领域已知的。在传统上，双特异性抗体的重组生产基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两种重链具有不同的特异性(Millstein and Cuello，Nature 305：537(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦且产物产量低。类似的规程披露于WO 93/08829，公开于1993年5月13日及Traunecker et al.，EMBO J.10：3655(1991)。

依照一种不同且更优选的方法，将具有期望结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。优选的是，与包含至少部分铰链、C_H2和C_H3区的免疫球蛋白重链恒定域进行融合。优选在至少一种融合物中存在包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(C_H1)。将编码免疫球蛋白重链融合物和，在需要时，免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体，并共转染到合适的宿主生物体中。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了极大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比例表达导致高产量时或在该比例没有特别意义时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入一个表达载体。

在该方法的有些实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了便利的分离途径，因此发现这种不对称结构便于将期望的双特异性复合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法披露于WO94/04690。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh et al.，Meth.Enzymol.121：210(1986)。

依照另一种方法，可改造一对抗体分子间的界面，以将从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面包含至少部分抗体恒定域CH3结构域。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通过将大氨基酸侧链用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换，在第二抗体分子的界面上产生与大侧链相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。

双特异性抗体包括交联或“异源偶联”抗体。例如，异源偶联物中的一种抗体可与亲合素偶联，另一种抗体与生物素偶联。例如，此类抗体已经建议用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利No.4,676,980)，及用于治疗HIV感染(WO 91/00360和WO 92/00373)。可使用任何便利的交联方法来制备异源偶联抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的，连同许多交联技术一起披露于美国专利No.4,676,980。

文献中还记载了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan et al.，Science 229：81(1985)记载了通过蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab′)₂片段的规程。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠的情况下还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab’片段转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab′-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab′-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab′-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。

最新的进展便于从大肠杆菌直接回收Fab′-SH片段，这些片段可化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby et al.，J.Exp.Med.175：217-225(1992)记载了完全人源化的双特异性抗体F(ab′)₂分子的生成。由大肠杆菌分开分泌每种Fab′片段，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。如此形成的双特异性抗体能够结合过表达HER2受体的细胞和正常人T细胞，以及触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳腺肿瘤靶物的溶解活性。

还记载了从重组细胞培养物直接生成和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelny et al.，J.Immunol.148(5)：1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab′部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原以形成单体，然后重新氧化以形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)记载的“双抗体”技术提供了构建双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头相连的重链可变域(V_H)和轻链可变域(V_L)，所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因此，迫使一个片段上的V_H和V_L结构域与另一个片段上的互补V_L和V_H结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体构建双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber et al.，J.Immunol.152：5368(1994)。

还设想了具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt etal.，J.Immunol.147：60(1991)。

多价抗体

多价抗体可以比二价抗体更快的受到表达该抗体所结合抗原的细胞的内在化(和/或异化)。本发明的抗体可以是可容易地通过编码抗体多肽链的核酸的重组表达而生成的、具有三个或更多抗原结合位点(例如四价抗体)的多价抗体(IgM类别以外的)。多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多抗原结合位点。优选的二聚化结构域包含(或由其组成)Fc区或铰链区。在这种情况中，抗体将包含Fc区及Fc区氨基末端的三个或更多抗原结合位点。本文中优选的多价抗体包含(或由其组成)三个至约八个，但优选四个抗原结合位点。多价抗体包含至少一条多肽链(且优选两条多肽链)，其中所述多肽链包含两个或多个可变域。例如，多肽链可包含VD1-(X1)_n-VD2-(X2)_n-Fc，其中VD1是第一可变域，VD2是第二可变域，Fc是Fc区的一条多肽链，X1和X2代表氨基酸或多肽，而n是0或1。例如，多肽链可包含：VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文中的多价抗体优选进一步包含至少两条(且优选四条)轻链可变域多肽。本文中的多价抗体可包含例如约两条至约八条轻链可变域多肽。本文设想的轻链可变域多肽包含轻链可变域，且任选进一步包含CL结构域。

抗体变体

在有些实施方案中，设想了本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改进抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。抗体的氨基酸序列变体是通过将适宜的核苷酸变化引入抗体核酸或通过肽合成制备的。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基删除和/或插入和/或替代。可进行任何删除、插入和替代组合以获得最终的构建物，倘若最终的构建物具有期望的特征。可在制备序列时将氨基酸改变引入抗体氨基酸序列。

可用于鉴定抗体中作为优选诱变位置的某些残基或区域的方法有“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham and Wells，Science 244：1081-1085(1989)中所述。这里，鉴定一个残基或一组靶残基(如带电荷的残基，诸如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸)并用中性或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或多聚丙氨酸)替代，以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在或对替代位点引入更多或其它变体，推敲对替代展示出功能敏感性的氨基酸位置。由此，尽管用于引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，然而突变本身的本质不必预先决定。例如，为了分析指定位点处突变的后果，在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机诱变，并对所表达免疫球蛋白筛选期望的活性。

氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合，长度范围由一个残基至包含上百或更多残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰残基的抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗体分子的其它插入变体包括将抗体的N或C端与酶(如用于ADEPT)或延长抗体血清半衰期的多肽融合。

抗体的另一类氨基酸变体改变了抗体的原始糖基化样式。改变包括删除在抗体中发现的一个或多个碳水化合物模块，和/或添加抗体中不存在的一个或多个糖基化位点。

多肽的糖基化典型的或是N-连接的或是O-连接的。N-连接指碳水化合物模块附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是将碳水化合物模块酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。如此，多肽中这些三肽序列任一的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指将糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。

向抗体中添加糖基化位点可通过改变氨基酸序列使其包含一个或多个上述三肽序列而便利的完成(用于N-连接的糖基化位点)。所述改变还可通过向原始抗体的序列中添加或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行(用于O-连接的糖基化位点)。

若抗体包含Fc区，则可改变附着其上的碳水化合物。例如，美国专利申请US 2003/0157108(Presta，L.)中记载了有缺乏岩藻糖的成熟碳水化合物结构附着于抗体Fc区的抗体。还可参见US 2004/0093621(Kyowa Hakko KogyoCo.，Ltd.)。WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)和美国专利第6,602,684号(

等人)中提到了在附着于抗体Fc区的碳水化合物中有等分N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的抗体。WO 97/30087(Patel等人)中报告了在附着于抗体Fc区的寡糖中有至少一个半乳糖残基的抗体。关于有更改碳水化合物附着于其Fc区的抗体还可参见WO 98/58964(Raju，S.)和WO 99/22764(Raju，S.)。关于具有改良糖基化的抗原结合分子还可参见US 2005/0123546(

 et al.)。

本文中的优选糖基化变体包含Fc区，其中附着于Fc区的碳水化合物结构缺乏岩藻糖。此类变体具有改进的ADCC功能。任选的是，Fc区还包含进一步改进ADCC的一个或多个氨基酸替代，例如Fc区位置298、333和/或334处的替代(Eu残基编号方式)。涉及“脱岩藻糖型”或“岩藻糖缺乏型”抗体的出版物的例子包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742；Okazakiet al.J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki et al.Biotech.Bioeng.87：614(2004)。生成脱岩藻糖化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖化缺陷的Lec 13 CHO细胞(Ripka et al.Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美国专利申请号US 2003/0157108 A1，Presta，L；及WO 2004/056312 A1，Adams et al.，尤其是实施例11)和敲除细胞系，诸如α-1，6-岩藻糖转移酶基因，FUT8，敲除的CHO细胞(Yamane-Ohnuki et al.Biotech.Bioeng.87：614(2004))。

另一类变体是氨基酸替代变体。这些变体在抗体分子中有至少一个氨基酸残基用不同残基替代。最有兴趣进行替代诱变的位点包括高变区，但是也设想了FR改变。表1中“优选替代”栏显示了保守替代。如果此类替代导致生物学活性变化，那么可导入表1中称为“例示替代”的更实质变化，或如下文参照氨基酸分类进一步所述，并筛选产物。

表1

 

原始残基	例示替代	优选替代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Asp，Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu；Asn	Glu
			Cys(C)	Ser；Ala	Ser
Gln(Q)	Asn；Glu	Asn
			Glu(E)	Asp；Gln	Asp
Gly(G)	Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸	Leu
			Leu(L)	正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Tyr
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Val；Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸	Leu

对抗体生物学特性的实质性修饰可通过选择对维持以下方面的效果差异显著的替代来实现：(a)替代区域中多肽主链的结构，例如(折叠)片或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。

根据共同的侧链特性，天然存在残基可如下分组：

(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

(2)中性、亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

(3)酸性的：Asp、Glu；

(4)碱性的：His、Lys、Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；

(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。

非保守替代需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。

一类替代变体牵涉替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体将具有改良的生物学特性。用于生成此类替代变体的一种便利方法涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。简而言之，将数个高变区位点(例如6-7个位点)突变，在各个位点产生所有可能的氨基酸替代。如此生成的抗体展示在丝状噬菌体颗粒上，作为与各个颗粒内包装的M13基因III产物的融合物。然后如本文所公开的对噬菌体展示的变体筛选其生物学活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合具有重要贡献的高变区残基。或者/另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点可能是有益的。所述接触残基及邻近残基是依照本文详述的技术进行替代的候选位点。一旦产生这样的变体，如本文所述对该组变体进行筛选，可选择在一种或多种相关测定法中具有优良特性的抗体用于进一步的开发。

编码抗体氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域知道的多种方法来制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然发生氨基酸序列变体的情况中)，或者通过对较早制备的变体或非变异型式的抗体进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。

可能希望在本发明免疫球蛋白多肽的Fc区中引入一处或多处氨基酸修饰，由此生成Fc区变体。Fc区变体可包括在一个或多个氨基酸位置(包括铰链半胱氨酸)包含氨基酸修饰(如替代)的人Fc区序列(如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。

依照此描述和本领域的教导，设想了在有些实施方案中，本发明方法中所使用的抗体与野生型对应抗体相比可在例如Fc区中包含一处或多处改变。与它们的野生型对应物相比，这些抗体仍将基本上保留治疗功效所需要的相同特性。例如，认为可在Fc区中进行将会导致Clq结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)改变(即或是增强或是削弱)的某些改变，例如WO99/51642中所述。还可参见关注Fc区变体其它实例的Duncan and Winter，Nature 322：738-40(1988)；美国专利5,648,260；美国专利5,624,821；及WO94/29351。WO00/42072(Presta)和WO 2004/056312(Lowman)记载了对FcR的结合提高或降低的抗体变体。在此明确收入这些专利出版物的内容作为参考。还可参见Shields et al.J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)。半衰期延长且对新生儿Fc受体(FcRn)(它负责将母体IgG转移给胎儿)(Guyer et al.，J.Immunol.117：587(1976)及Kim et al.，J.Immunol.24：249(1994))的结合改良的抗体记载于US2005/0014934A1(Hinton et al.)。这些抗体包含具有一处或多处改进Fc区与FcRn结合的替代的Fc区。具有改变的Fc区氨基酸序列且Clq结合能力升高或降低的多肽变体记载于美国专利No.6,194,551B1，WO99/51642。在此明确收入这些专利出版物的内容作为参考。还可参见Idusogie et al.J.Immunol.164：4178-4184(2000)。

抗体衍生物

可进一步修饰本发明的抗体以包含本领域知道的且易于获得的额外非蛋白质性质部分。优选的是，适于抗体衍生化的部分是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)、和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着到抗体上的聚合物数目可以变化，而且如果附着了超过一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于待改进抗体的具体特性或功能、抗体衍生物是否将用于指定条件下的治疗等。

筛选具有所需性质的抗体

本发明的抗体能结合EGFL7，而且在有些实施方案中，可以调控EGFL7相关效应的一个或多个方面，包括但不限于对任何在生物学上重要的EGFL7生物学途径的破坏；和/或对肿瘤、细胞增殖性病症或癌症的治疗和/或预防；和/或对与EGFL7表达和/或活性(诸如升高的EGFL7表达和/或活性)有关的病症的治疗和/或预防。例如，可以如本文所述对本发明的抗体筛选其阻断HUVEC细胞结合EGFL7、HUVEC在EGFL7蛋白包被板上迁移的能力。

纯化的抗体还可以通过一系列测定法进行表征，包括但不限于N端测序、氨基酸分析、非变性大小排阻高压液相层析(HPLC)、质谱、离子交换层析和木瓜蛋白酶消化。

在本发明的某些实施方案中，对此处制备的抗体分析它们的生物学活性。在有些实施方案中，对本发明的抗体检验它们的抗原结合活性。本领域已知的并且可以在本文中使用的抗原结合测定法包括但不限于利用以下技术的任何直接的或竞争性的结合测定法：Western印迹、放射免疫测定法、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、“夹心式/三明治式”免疫测定法、免测沉淀测定法、荧光免疫测定法和蛋白A免疫测定法。在下面的实施例部分提供例示性的抗原结合测定法。

在有些实施方案中，本发明提供了能与抗体(即其包含的轻链可变域包含选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的序列且包含的重链可变域包含选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的序列的抗体)竞争结合EGFL7的抗EGFL7抗体。这种竞争性抗体可以通过对抗EGFL7杂交瘤上清液筛选与带标记物的抗体(即其包含的轻链可变域包含选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的序列且包含的重链可变域包含选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的序列的抗体)竞争结合固定化EGFL7来获得。这种竞争性抗体包括所识别的EGFL7表位与抗体(即其包含的轻链可变域包含选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的序列且包含的重链可变域包含选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的序列的抗体)所结合的EGFL7表位相同或交叠的抗体。与包含无关(或者无)抗体的对照结合混合物中检测到的发生结合的、带标记物的抗体的量相比，包含竞争性抗体的杂交瘤上清液将降低受试竞争结合混合物中检测到的发生结合的、带标记物的抗体的量。此处描述的任何竞争性结合测定法均适用于上述规程。

具有此处所述性质的本发明抗EGFL7抗体可以利用任何方便的方法通过对抗EGFL7杂交瘤克隆筛选所需性质而获得。例如，如果想要与抗体(即其包含的轻链可变域包含选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的序列且包含的重链可变域包含选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的序列的抗体)竞争或不竞争EGFL7结合的抗EGFL7单克隆抗体，那么可以在结合竞争测定法中检验候选抗体。竞争测定法是本领域众所周知的。

测定抗EGFL7抗体抑制能力的其它功能测定法是本领域已知的，其中一些在本文中有例示。

在有些实施方案中，本发明设想了具有一些但不是全部效应器功能已有变化的抗体，这使其成为许多应用的期望候选物，其中抗体在体内的半衰期很重要但某些效应器功能(诸如补体和ADCC)不是必需的或者是有害的。在某些实施方案中，测量所生成的免疫球蛋白的Fc活性以确保只有所需性质得到保留。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法以证实CDC和/或ADCC活性的较低/消减。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺失FcγR结合(因此可能缺失ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)第464页的表3概述了造血细胞上的FcR表达。美国专利5,500,362或5,821,337描述了用于评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的一个例子。可用于这些测定法的有用效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在诸如Clynes etal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)中公开的动物模型中。也可以进行C1q结合测定法以证实抗体不能结合C1q从而缺失CDC活性。为了评估补体激活，可以进行CDC测定法，例如Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Meth.202：163(1996)所述。也可以利用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定。

在有些实施方案中，本发明提供了具有提高的效应器功能和/或延长的半衰期的改良抗体。

载体、宿主细胞和重组方法

为了重组生产本发明的抗体，分离编码它的核酸，并将其插入可复制载体，用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。可使用常规流程容易的分离编码抗体的DNA并测序(例如使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异结合的寡核苷酸探针)。可利用许多载体。载体的选择部分取决于将要使用的宿主细胞。通常，优选的宿主细胞是原核或真核(通常是哺乳动物)起源的。应当领会，任何同种型的恒定区可用于此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，而且此类恒定区可以从任何人或动物物种获得。

a.使用原核宿主细胞生成抗体：

i.载体构建

可使用标准重组技术来获得编码本发明抗体多肽构件的多核苷酸序列。可从抗体生成细胞诸如杂交瘤细胞分离期望的多核苷酸序列并测序。或者，可使用核苷酸合成仪或PCR技术合成多核苷酸。一旦得到，将编码多肽的序列插入能够在原核宿主中复制并表达异源多核苷酸的重组载体。为了本发明，可使用本领域可获得的且知道的许多载体。适宜载体的选择将主要取决于将要插入载体的核酸的大小和将要用载体转化的具体宿主细胞。根据其功能(扩增或表达异源多核苷酸，或二者兼之)及其与它在其中驻留的具体宿主细胞的相容性，每种载体含有多种构件。载体构件通常包括但不限于复制起点、选择标志基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入片段、和转录终止序列。

一般而言，与宿主细胞一起使用的质粒载体包含衍生自与这些宿主相容物种的复制子和控制序列。载体通常携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标志序列。例如，通常用衍生自大肠杆菌物种的质粒pBR322转化大肠杆菌。pBR322包含编码氨苄青霉素(Amp)和四环素(Tet)抗性的基因，由此提供轻松鉴定转化细胞的手段。pBR322、其衍生物、或其它微生物质粒或噬菌体还可包含或经修饰而包含可被微生物生物体用于表达内源蛋白质的启动子。Carter等人，美国专利5,648,237中详细记载了用于表达特定抗体的pBR322衍生物的实例。

另外，可将包含与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体用作这些宿主的转化载体。例如，可使用噬菌体诸如λGEM.TM.-11来构建可用于转化易感宿主细胞诸如大肠杆菌LE392的重组载体。

本发明的表达载体可包含两种或多种启动子-顺反子对，它们编码每一种多肽构件。启动子是位于顺反子上游(5′)的非翻译调控序列，它调控顺反子的表达。原核启动子通常分成两类，诱导型的和组成性的。诱导型启动子指响应培养条件的变化(如营养物的存在与否或温度变化)而启动受其控制的顺反子的升高水平转录的启动子。

众所周知受到多种潜在宿主细胞识别的大量启动子。通过限制酶消化切下源DNA中的启动子并将分离的启动子序列插入本发明的载体，由此可将选择的启动子与编码轻链或重链的顺反子DNA可操作连接。天然启动子序列和许多异源启动子都可用于指导靶基因的扩增和/或表达。在有些实施方案中，使用异源启动子，因为与天然靶多肽启动子相比，它们通常容许所表达靶基因的更高转录和更高产量。

适用于原核宿主的启动子包括PhoA启动子、β-半乳糖苷酶和乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、和杂合启动子诸如tac或trc启动子。然而，在细菌中有功能的其它启动子(诸如其它已知的细菌或噬菌体启动子)也是合适的。它们的核苷酸序列已经发表，由此熟练工作人员能够使用提供任何所需限制位点的接头或衔接头将它们与编码靶轻链和重链的顺反子可操作连接(Siebenlist et al.，Cell 20：269(1980))。

在本发明的一个方面，重组载体内的每个顺反子都包含指导所表达多肽穿膜转运的分泌信号序列构件。一般而言，信号序列可以是载体的构件，或者它可以是插入载体的靶多肽DNA的一部分。为了本发明而选择的信号序列应当是受到宿主细胞识别并加工(即被信号肽酶切除)的信号序列。对于不识别并加工异源多肽的天然信号序列的原核宿主细胞，将信号序列用选自例如下组的原核信号序列替代：碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp、或热稳定的肠毒素II(STII)前导序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP。在本发明的一个实施方案中，表达系统的两个顺反子中都使用的信号序列是STII信号序列或其变体。

在另一方面，依照本发明的免疫球蛋白的生成可在宿主细胞的细胞质中发生，因此不需要在每个顺反子内存在分泌信号序列。在那点上，免疫球蛋白轻链和重链在细胞质内表达、折叠和装配而形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株(如大肠杆菌trxB-菌株)提供有利于二硫键形成的细胞质条件，从而容许所表达蛋白质亚基的正确折叠和装配。Proba and Plückthun，Gene 159：203(1995))。

适于表达本发明抗体的原核宿主细胞包括古细菌(Archaebacteria)和真细菌(Eubacteria)，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体。有用细菌的实例包括埃希氏菌属(Escherichia)(如大肠埃希氏菌E.coli)、芽孢杆菌属(Bacillus)(如枯草芽孢杆菌B.subtilis)、肠杆菌属(Enterobacteria)、假单胞菌属(Pseudomonas)(如铜绿假单胞菌P.aeruginosa)物种、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、志贺氏菌属(Shigella)、根瘤菌属(Rhizobium)、透明颤菌属(Vitreoscilla)、或副球菌属(Paracoccus)。在有些实施方案中，使用革兰氏阴性细胞。在有些实施方案中，使用大肠杆菌细胞作为本发明的宿主。大肠杆菌菌株的实例包括菌株W3110(Bachmann，Cellular and Molecular Biology，第2卷，Washington，D.C.，美国微生物学学会，1987，第1190-1219页；

保藏号27,325)及其衍生物，包括具有基因型W3110 ΔfhuA(ΔtonA)ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41kanR的菌株33D3(美国专利号5,639,635)。其它菌株及其衍生物，诸如大肠杆菌294(

 31,446)、大肠杆菌B、大肠杆菌λ1776(

 31,537)和大肠杆菌RV308(

 31,608)也是合适的。这些实例只是例示而非限制。本领域知道用于构建具有指定基因型的任何上述细菌衍生物的方法，参见例如Bass et al.，Proteins 8：309-314(1990)。通常必需考虑复制子在细菌细胞中的可复制性来选择适宜的细菌。例如，在使用众所周知的质粒诸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410来提供复制子时，大肠杆菌、沙雷氏菌属、或沙门氏菌属物种可能适于用作宿主。通常，宿主细胞应当分泌最小量的蛋白水解酶，而且可能希望在细胞培养中掺入额外的蛋白酶抑制剂。

ii.抗体生成

用上述表达载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当改动的常规营养培养基中进行培养。

转化即将DNA导入原核宿主，使得DNA能够进行复制，或是作为染色体外元件或是通过染色体成分。根据所用宿主细胞，使用适于这些细胞的标准技术进行转化。采用氯化钙的钙处理通常用于具有坚固细胞壁屏障的细菌细胞。另一种转化方法采用聚乙二醇/DMSO。使用的还有一种技术是电穿孔。

在本领域知道的且适于培养选定宿主细胞的培养基中培养用于生成本发明多肽的原核细胞。合适培养基的实例包括添加了必需营养补充物的LB培养基(Luria broth)。在有些实施方案中，培养基还含有根据表达载体的构建而选择的选择剂，以选择性容许包含表达载体的原核细胞生长。例如，向用于培养表达氨苄青霉素抗性基因的细胞的培养基中添加氨苄青霉素。

除了碳、氮、和无机磷酸盐来源以外，还可含有适当浓度的任何必需补充物，或是单独加入或是作为与另一种补充物或培养基的混合物，诸如复合氮源。任选的是，培养基可含有一种或多种选自下组的还原剂：谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巯基乙酸盐/酯、二硫赤藓糖醇和二硫苏糖醇。

在合适的温度培养原核宿主细胞。例如，对于培养大肠杆菌，一般使用约20℃至约39℃的温度范围，通常是约25℃至约37℃，例如约30℃。主要取决于宿主生物体，培养基的pH可以是范围为约5至约9的任何pH。对于大肠杆菌，pH一般是约6.8至约7.4，通常是约7.0。

如果本发明的表达载体中使用诱导型启动子，那么在适于激活启动子的条件下诱导蛋白质表达。在本发明的一个方面，使用PhoA启动子来控制多肽的转录。因此，为了诱导，在磷酸盐限制培养基中培养经过转化的宿主细胞。磷酸盐限制培养基一般是C.R.A.P培养基(参见例如Simmons et al.，J.Immunol.Meth.263：133-147(2002))。根据所采用的载体构建物，可采用多种其它诱导物，正如本领域所知道的。

在一个实施方案中，所表达的本发明多肽分泌到宿主细胞的周质中并从中回收。蛋白质回收通常牵涉破坏微生物，通常通过诸如渗压震扰(osmoticshock)、超声处理或裂解等手段。一旦细胞遭到破坏，可通过离心或过滤清除细胞碎片或整个细胞。可以通过例如亲和树脂层析进一步纯化蛋白质。或者，蛋白质可能转运到培养液中并从中分离。可从培养液清除细胞，并将培养物上清液过滤和浓缩，用于进一步纯化所生成蛋白质。可使用普遍知道的方法诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western印迹分析进一步分离和鉴定所表达蛋白质。

在本发明的一个方面，通过发酵过程大量进行抗体生产。多种大规模补料-分批发酵流程可用于生产重组蛋白。大规模发酵具有至少1000升的容量，优选约1,000至100,000升的容量。这些发酵罐使用搅拌器叶轮来分配氧和养分，尤其是葡萄糖(常用的碳源/能源)。小规模发酵通常指在体积容量不超过约100升的发酵罐中进行的发酵，范围可以是约1升至约100升。

在发酵过程中，通常在将细胞在合适条件下培养至期望密度(如OD550约180-220，在此阶段细胞处于早期稳定期)后启动蛋白质表达的诱导。根据所采用的载体构建物，可使用多种诱导物，正如本领域知道的和上文描述的。可在诱导前将细胞培养更短的时间。通常将细胞诱导约12-50小时，但是可使用更长或更短的诱导时间。

为了提高本发明多肽的产量和质量，可修改多项发酵条件。例如，为了改善所分泌抗体多肽的正确装配和折叠，可使用过度表达伴侣蛋白诸如Dsb蛋白(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和/或DsbG)或FkpA(具有伴侣活性的一种肽基脯氨酰-顺式，反式-异构酶)的额外载体来共转化宿主原核细胞。已经证明伴侣蛋白促进在细菌宿主细胞中生成的异源蛋白质的正确折叠和溶解度。Chen et al.，J.Biol.Chem.274：19601-19605(1999)；Georgiou等人，美国专利6,083,715；Georgiou等人，美国专利6,027,888；Bothmann and Plückthun，J.Biol.Chem.275：17100-17105(2000)；Ramm and Plückthun，J.Biol.Chem.275：17106-17113(2000)；Arie et al.，Molec.Microbiol.39：199-210(2001))。

为了将所表达异源蛋白质(尤其是对蛋白水解敏感的异源蛋白质)的蛋白水解降至最低，可将蛋白水解酶缺陷的某些宿主菌株用于本发明。例如，可修饰宿主细胞菌株，在编码已知细菌蛋白酶的基因中进行遗传突变，诸如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其组合。可以获得有些大肠杆菌蛋白酶缺陷菌株，参见例如Joly et al.，(1998)见上文；Georgiou等人，美国专利5,264,365；Georgiou等人，美国专利5,508,192；Hara et al.，Microbial Drug Resistance 2：63-72(1996)。

在一个实施方案中，在本发明的表达系统中使用蛋白水解酶缺陷且经过过度表达一种或多种伴侣蛋白的质粒转化的大肠杆菌菌株作为宿主细胞。

iii.抗体纯化

可采用本领域知道的标准蛋白质纯化方法。下面的流程是合适纯化流程的例示：免疫亲和或离子交换柱上的分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土或阳离子交换树脂诸如DEAE上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、和使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤。

在一个方面，将固定在固相上的蛋白A用于本发明全长抗体产物的免疫亲和纯化。蛋白A是来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)的41kD细胞壁蛋白质，它以高亲和力结合抗体Fc区。Lindmark et al.，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。蛋白A固定其上的固相优选具有玻璃或石英表面的柱子，更优选可控孔径玻璃柱或硅酸柱。在有些应用中，柱子以诸如甘油等试剂包被，试图防止污染物的非特异粘附。

作为纯化的第一步，将衍生自如上所述细胞培养物的制备物施加到蛋白A固定化固相上，使得目的抗体特异结合蛋白A。然后清洗固相以清除与固相非特异结合的污染物。最后通过洗脱从固相回收目的抗体。

b.使用真核宿主细胞生成抗体：

载体构件通常包括但不限于如下一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标志基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列。

(i)信号序列构件

在真核宿主细胞中使用的载体还可在目的成熟蛋白质或多肽的N端包含信号序列或具有特异切割位点的其它多肽。优选受到宿主细胞识别并加工(即被信号肽酶切除)的异源信号序列。在哺乳动物细胞表达中，可利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导，例如单纯疱疹病毒gD信号。

将这些前体区的DNA连接到编码抗体的DNA的读码框中。

(ii)复制起点

通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点构件。例如，SV40起点通常可能只因包含早期启动子才使用。

(iii)选择基因构件

表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白质：(a)赋予对抗生素或其它毒素的抗性，如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素；(b)补足相应的营养缺陷；或(c)提供不能从复合培养基获得的关键营养物。

选择方案的一个实例利用药物来阻滞宿主细胞的生长。经异源基因成功转化的那些细胞生成赋予药物抗性的蛋白质，因而幸免于选择方案。此类显性选择的实例使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。

适于哺乳动物细胞的选择标志的另一个实例是能够鉴定有能力摄取抗体核酸的细胞的选择标志，诸如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白I和II优选灵长类金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。

例如，首先通过将所有转化子在含有甲氨蝶呤(Mtx，DHFR的一种竞争性拮抗剂)的培养基中进行培养来鉴定经DHFR选择基因转化的细胞。在采用野生型DHFR时，适宜的宿主细胞是DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(如

 CRL-9096)。

或者，可通过在含有针对选择标志的选择剂诸如氨基糖苷抗生素如卡那霉素、新霉素或G418的培养基中培养细胞来选择经编码抗体、野生型DHFR蛋白、和另一种选择标志诸如氨基糖苷3′-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是包含内源DHFR的野生型宿主)。参见美国专利4,965,199。

(iv)启动子构件

表达和克隆载体通常包含受到宿主生物体识别的启动子，且与抗体多肽核酸可操作连接。已知真核细胞的启动子序列。事实上，所有真核基因都具有富含AT区，它位于起始转录的位点上游约25至30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处发现的另一种序列是CNCAAT区(SEQ ID NO：19)，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3′端是AATAAA序列(SEQ ID NO：20)，它可能是向编码序列的3′端添加聚腺苷酸(polyA)尾的信号。所有这些序列合适的插入真核表达载体中。

在哺乳动物宿主细胞中由载体转录抗体多肽受到例如从病毒(诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如2型腺病毒)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒、和猿猴病毒40(SV40))基因组获得的、来自异源哺乳动物启动子(如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)的、来自热休克启动子的启动子的控制，倘若这些启动子与宿主细胞系统相容的话。

方便的以SV40限制性片段的形式获得SV40病毒的早期和晚期启动子，该片段还包含SV40病毒复制起点。方便的以HindIII E限制性片段的形式获得人巨细胞病毒的立即早期启动子。美国专利4,419,446中公开了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利4,601,978中记载了该系统的一种修改或者，可使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。

(v)增强子元件构件

常常通过在载体中插入增强子序列来提高高等真核细胞对编码本发明抗体多肽的DNA的转录。现在知道来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、α-胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括SV40复制起点晚期侧的增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期侧的增强子、和腺病毒增强子。关于激活真核启动子的增强元件还可参见Yaniv，Nature 297：17-18(1982)。增强子可剪接到载体中，位于抗体多肽编码序列的5′或3′位置，但是优选位于启动子的5′位点。

(vi)转录终止构件

在真核宿主细胞中使用的表达载体通常还包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5′端和偶尔的3′端获得。这些区域包含在编码抗体的mRNA的非翻译区中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止构件是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见WO94/11026及其中公开的表达载体。

(vii)宿主细胞的选择和转化

适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞包括本文描述的高等真核细胞，包括脊椎动物宿主细胞。脊椎动物细胞在培养(组织培养)中的繁殖已经成为常规流程。有用哺乳动物宿主细胞系的实例有经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，

 CRL 1651)、人胚肾系(293细胞或为悬浮培养而亚克隆的293细胞，Graham et al.，J.Gen.Virol.36：59(1977))、幼仓鼠肾细胞(BHK， CCL 10)、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))、小鼠塞托利(Sertoli)细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))、猴肾细胞(CV1，

 CCL 70)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76，

 CRL 1587)、人宫颈癌细胞(HELA， CCL 2)、犬肾细胞(MDCK， CCL 34)、牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A，

 CRL 1442)、人肺细胞(W138，

 CCL 75)、人肝细胞(Hep G2，HB 8065)、小鼠乳瘤(MMT 060562，

 CCL 51)、TRI细胞(Mather et al.，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))、MRC 5细胞、FS4细胞和人肝细胞瘤(hepatoma)系(Hep G2)。

为了生成抗体，用上文所述表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当改动的常规营养培养基中进行培养。

(viii)宿主细胞的培养

可在多种培养基中培养用于生成本发明抗体的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10(Sigma)、极限必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏修改Eagle氏培养基(DMEM，Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham et al.，Meth.Enzymol.58：44(1979)；Barnes et al.，Anal.Biochem.102：255(1980)；美国专利4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利复审30,985。任何这些培养基可根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCIN^TM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等效能源。还可以适宜浓度含有本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。培养条件诸如温度、pH等即为表达而选择的宿主细胞先前所用的，这对于普通技术人员是显然的。

(ix)抗体的纯化

在使用重组技术时，可在细胞内生成抗体，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内生成抗体，那么首先需要通过例如离心或超滤清除微粒碎片，或是宿主细胞或是裂解片段。如果抗体分泌到培养基中，那么通常首先使用商品化蛋白质浓缩滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)浓缩来自这些表达系统的上清液。可在任何上述步骤中包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF以抑制蛋白水解，而且可包括抗生素以防止外来污染物的生长。

可使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析(优选的纯化技术是亲和层析)来纯化从细胞制备的抗体组合物。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2、或γ4重链的抗体(Lindmark et al.，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss et al.，EMBOJ.5：1567-1575(1986))。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是可使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。若抗体包含CH3结构域，则可使用Bakerbond ABX^TM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术诸如离子交换柱上的分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层析、肝素SEPHAROSE^TM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。

在任何初步纯化步骤之后，可将含有目的抗体和污染物的混合物进行低pH疏水相互作用层析，使用pH约2.5-4.5的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度(如约0-0.25M盐)进行。

免疫偶联物

本发明还提供了包含偶联有细胞毒剂的本文所述任何抗EGFL7抗体的免疫偶联物(也可互换的称为“抗体-药物偶联物”或“ADC”)，所述细胞毒剂诸如化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射偶联物)。

抗体-药物偶联物在癌症治疗中用于局部投递细胞毒剂或细胞抑制剂(即用于杀死或抑制肿瘤细胞的药物)的用途(Syrigos and Epenetos，Anticancer Research 19：605-614(1999)；Niculescu-Duvaz and Springer，Adv.Drug Del.Rev.26：151-172(1997)；美国专利4,975,278)能将药物部分靶向投递至肿瘤，并在那儿进行细胞内积累，而系统施用这些未经偶联的药物试剂可能在试图消除的肿瘤细胞以外导致不可接受的对正常细胞的毒性水平(Baldwin et al.，Lancet 603-05(1986年5月15日)；Thorpe，“Antibody CarriersOf Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review”，在《Monoclonal Antibodies′84：Biological And Clinical Applications》中，A.Pinchera等人编，第475-506页，1985)。由此试图获得最大功效及最小毒性。多克隆抗体和单克隆抗体皆有报道可用于这些策略(Rowland et al.，Cancer Immunol.Immunother.21：183-87(1986))。这些方法中所使用的药物包括道诺霉素(daunomycin)、多柔比星(doxorubicin)、甲氨蝶呤(methotrexate)和长春地辛(vindesine)(Rowland etal.，1986，见上文)。抗体-毒素偶联物中所使用的毒素包括细菌毒素诸如白喉毒素、植物毒素诸如蓖麻毒蛋白、小分子毒素诸如格尔德霉素(geldanamycin)(Mandler et al.，J.Nat.Cancer Inst.92(19)：1573-1581(2000)；Mandler et al.，Bioorganic & Med.Chem.Letters 10：1025-1028(2000)；Mandler et al.，Bioconjugate Chem.13：786-791(2002))、美登木素生物碱类(EP 1391213；Liuet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623(1996))、和加利车霉素(Lodeet al.，Cancer Res.58：2928(1998)；Hinman et al.，Cancer Res.53：3336-3342(1993))。毒素可通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制在内的机制发挥其毒害细胞和抑制细胞的效果。有些细胞毒药物在与大的抗体或蛋白质受体配体偶联时趋于失活或活性降低。

ZEVALIN^TM(ibritumomab tiuxetan，Biogen/Idec)是由针对在正常和恶性B淋巴细胞表面上发现的CD20抗原的鼠IgG1 κ单克隆抗体与通过硫脲接头-螯合剂所结合的¹¹¹In或⁹⁰Y放射性同位素构成的抗体-放射性同位素偶联物(Wiseman et al.，Eur.Jour.Nucl.Med.27(7)：766-77(2000)；Wiseman et al.，Blood 99(12)：4336-42(2002)；Witzig et al.，J.Clin.Oncol.20(10)：2453-63(2002)；Witzig et al.，J.Clin.Oncol.20(15)：3262-69(2002))。尽管ZEVALIN具有针对B细胞非何杰金氏(Hodgkin)淋巴瘤(NHL)的活性，然而施药在大多数患者中导致严重且长时间的血细胞减少。MYLOTARG^TM(gemtuzumabozogamicin，Wyeth Pharmaceuticals)，即由人CD33抗体与加利车霉素连接而构成的抗体-药物偶联物，在2000年批准用于经注射治疗急性骨髓性白血病(Drugs of the Future 25(7)：686(2000)；美国专利4970198；5079233；5585089；5606040；5693762；5739116；5767285；5773001)。Cantuzumab mertansine(Immunogen Inc.)，即由huC242抗体经二硫化物接头SPP与美登木素生物碱药物部分DM1连接而构成的抗体-药物偶联物，正在进行用于治疗表达CanAg的癌症诸如结肠癌、胰腺癌、胃癌和其它癌的II期试验。MLN-2704(Millennium Pharm.，BZL Biologics，Immunogen Inc.)，即由抗前列腺特异性膜抗原(PSMA)单克隆抗体与美登木素生物碱药物部分DM1连接而构成的抗体-药物偶联物，正在进行用于前列腺肿瘤潜在治疗的开发。将多拉司他汀(dolastatin)的合成类似物auristatin肽、auristatin E(AE)和单甲基auristatin(MMAE)与嵌合单克隆抗体cBR96(对癌上的Lewis Y特异)和cAC10(对恶性血液肿瘤上的CD30特异)偶联(Doronina et al.，Nature Biotech.21(7)：778-784(2003))，且正在进行治疗性开发。

本文(例如上文)描述了可用于生成免疫偶联物的化疗剂。可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolacaamericana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公开的WO 93/21232。多种放射性核素可用于生成放射偶联抗体。实例包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。抗体和细胞毒剂的偶联物可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)己二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta et al.，Science 238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO 94/11026。

本文还设想了抗体与一种或多种小分子毒素诸如加利车霉素(calicheamicin)、美登木素生物碱类(maytansinoids)、多拉司他汀类(dolostatins)、aurostatins、单端孢霉素(trichothecene)和CC1065及这些毒素具有毒素活性的片段的偶联物。

i.美登素和美登木素生物碱类

在有些实施方案中，免疫偶联物包含偶联有一个或多个美登木素生物碱分子的本发明抗体(全长或片段)。

美登木素生物碱类是通过抑制微管蛋白多聚化来发挥作用的有丝分裂抑制剂。美登素最初从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)分离得到(美国专利3,896,111)。随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱类，诸如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利4,151,042)。例如下列美国专利公开了合成美登醇及其衍生物和类似物：4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；及4,371,533。

美登木素生物碱类药物模块在抗体药物偶联物中是有吸引力的药物模块，因为它们：(i)相对易于通过发酵或发酵产物的化学修饰、衍生化来制备；(ii)易于用适于通过非二硫化物接头的偶联的官能基衍生化；(iii)在血浆中稳定；且(iv)有效针对多种肿瘤细胞系。

例如下列专利公开了包含美登木素生物碱类的免疫偶联物及其制备和治疗用途：美国专利5,208,020；5,416,064；及欧洲专利EP 0 425 235 B1，明确将其公开内容收入本文作为参考。Liu et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623(1996)记载了包含与针对人结肠直肠癌的单克隆抗体C242连接的称为DM1的美登木素生物碱的免疫偶联物。发现该偶联物具有针对培养的结肠癌细胞的高度细胞毒性，而且在体内肿瘤生长测定法中显示抗肿瘤活性。Chari et al.，Cancer Research 52：127-131(1992)记载了其中美登木素生物碱经二硫化物接头与结合人结肠癌细胞系上抗原的鼠抗体A7或结合HER-2/neu癌基因的另一种鼠单克隆抗体TA.1偶联的免疫偶联物。在体外在人乳癌细胞系SK-BR-3上测试了TA.1-美登木素生物碱偶联物的细胞毒性，该细胞系每个细胞表达3 x 10⁵个HER-2表面抗原。药物偶联物达到了与游离美登木素生物碱药物相似的一定程度的细胞毒性，这可通过增加每个抗体分子偶联的美登木素生物碱分子数目来提高。A7-美登木素生物碱偶联物在小鼠中显示低系统性细胞毒性。

抗体-美登木素生物碱偶联物可通过将抗体与美登木素生物碱分子化学连接且不显著削弱抗体或美登木素生物碱分子的生物学活性来制备。参见例如美国专利No.5,208,020，明确将其公开内容收入本文作为参考。每个抗体分子偶联平均3-4个美登木素生物碱分子在增强针对靶细胞的细胞毒性中显示功效，且对抗体的功能或溶解度没有负面影响，尽管预计甚至一个分子的毒素/抗体也将较之裸抗体的使用增强细胞毒性。美登木素生物碱类在本领域是众所周知的，而且可通过已知技术合成或从天然来源分离。例如美国专利5,208,020和上文提及的其它专利及非专利发表物中公开了合适的美登木素生物碱类。优选的美登木素生物碱类是美登醇和美登醇分子的芳香环或其它位置经过修饰的美登醇类似物，诸如各种美登醇酯。

本领域知道许多连接基团可用于制备抗体-美登木素生物碱偶联物，包括例如美国专利5,208,020或欧洲专利0 425 235 B1；Chari et al.，CancerResearch 52：127-131(1992)；US2005/0169933A1中所公开的，明确将其公开内容收入本文作为参考。包含接头构件SMCC的抗体-美登木素生物碱类偶联物可以如US2005/0169933A1中所披露的来制备。连接基团包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团、或酯酶不稳定基团，正如上文所述专利中所公开的，优选二硫化物和硫醚基团。本文中描述和例示了别的连接基团。

可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和美登木素生物碱的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。特别优选的偶联剂包括N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson et al.，Biochem.J.173：723-737(1978))和N-琥珀酰亚氨基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，由此提供二硫键连接。

根据连接的类型，可将接头附着于美登木素生物碱分子的多个位置。例如，可使用常规偶联技术通过与羟基的反应来形成酯键。反应可发生在具有羟基的C-3位置、经羟甲基修饰的C-14位置、经羟基修饰的C-15位置、和具有羟基的C-20位置。在一个优选的实施方案中，在美登醇或美登醇类似物的C-3位置形成键连接。

ii.Auristatin和多拉司他汀

在有些实施方案中，免疫偶联物包含与多拉司他汀类(dolastatins)或多拉司他汀肽类似物及衍生物、auristatin类偶联的本发明抗体(美国专利No.5,635,483；5,780,588)。多拉司他汀类和auristatin类已经显示出干扰微管动力学、GTP水解、及核和细胞分裂(Woyke et al(2001)Antimicrob.AgentsChemother.45(12)：3580-3584)且具有抗癌(US 5,663,149)和抗真菌活性(Pettitet al(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42：2961-2965)。多拉司他汀或auristatin药物模块可经由肽药物模块的N(氨基)末端或C(羧基)末端附着于抗体(WO 02/88172)。

例示性的auristatin实施方案包括N-末端连接的单甲基auristatin药物模块DE和DF，披露于“Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation toLigands”，US2005/0238649，明确将其公开内容完整收入本文作为参考。

典型的是，基于肽的药物模块可通过在两个或多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备。此类肽键可依照例如肽化学领域众所周知的液相合成法来制备(参见E.

 and K.Lübke，The Peptides，volume 1，pp 76-136，1965，Academic Press)。auristatin/多拉司他汀药物模块可依照以下文献中的方法来制备：US 5,635,483；US 5,780,588；Pettit et al(1989)J.Am.Chem.Soc.111：5463-5465；Pettit et al(1998)Anti-Cancer Drug Design 13：243-277；Pettit etal.Synthesis，1996，719-725；Pettit et al(1996)J.Chem.Soc.Perkin Trans.15：859-863；及Doronina(2003)Nature Biotechnol.21(7)：778-784；“Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands”，US2005/0238649，将其完整收入本文作为参考(披露了例如制备诸如MMAE和MMAF偶联至接头的单甲基缬氨酸化合物的接头和方法)。

iii.加利车霉素

在其它实施方案中，免疫偶联物包含偶联有一个或多个加利车霉素分子的本发明抗体。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度生成双链DNA断裂。关于加利车霉素家族偶联物的制备参见美国专利5,712,374；5,714,586；5,739,116；5,767,285；5,770,701；5,770,710；5,773,001；5,877,296(都授予美国Cyanamid公司)。可用的加利车霉素结构类似物包括但不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙酰基-γ1I、PSAG和θI1(Hinman et al.，Cancer Research 53：3336-3342(1993)；Lode et al.，Cancer Research 58：2925-2928(1998)；及上述授予美国Cyanamid公司的美国专利)。可与抗体缀合的另一种抗肿瘤药物是QFA，它是一种抗叶酸药物。加利车霉素和QFA都具有胞内作用位点，且不易穿过质膜。因此，这些试剂经由抗体介导的内在化的细胞摄取大大增强了它们的细胞毒效果。

iv.其它细胞毒剂

可与本发明抗体偶联的其它抗肿瘤剂包括BCNU、链佐星(streptozoicin)、长春新碱(vincristine)、5-氟尿嘧啶、美国专利5,053,394、5,770,710中记载的统称为LL-E33288复合物的试剂家族、及埃斯波霉素类(esperamicins)(美国专利5,877,296)。

可用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordicacharantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公布的WO 93/21232。

本发明还设想了抗体和具有核酸降解活性的化合物(如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶，诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)之间形成的免疫偶联物。

为了选择性破坏肿瘤，抗体可包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用于生成放射偶联抗体。实例包括At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、p³²、pb²¹²和Lu的放射性同位素。在将偶联物用于检测时，可包含放射性原子用于闪烁照相研究，例如Tc^99m或I¹²³，或是包含自旋标记物用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)，诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。

可以已知方式将放射性或其它标记物掺入偶联物。例如，可生物合成肽，或是通过化学氨基酸合成法合成肽，其中使用牵涉例如氟-19代替氢的合适氨基酸前体。可经肽中的半胱氨酸残基来附着标记物，诸如Tc99m或I123、Re186、Re188和In111。可以经赖氨酸残基来附着钇-90。IODOGEN法(Frakeret al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.80：49-57(1978))可用于掺入碘-123。《Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy》(Chatal，CRC Press，1989)详细记载了其它方法。

可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒剂的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异硫氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta et al.，Science 238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物接头(Chari et al.，Cancer Research 52：127-131(1992)；美国专利5,208,020)。

本发明的化合物明确涵盖但不限于用下列交联剂制备的ADC：商品化(如购自Pierce Biotechnology Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC和sulfo-SMPB、和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。见2003-2004年度应用手册和产品目录(Applications Handbookand Catalog)第467-498页。

v.抗体-药物偶联物的制备

在本发明的抗体-药物偶联物(ADC)中，将抗体(Ab)经接头(L)与一个或多个药物部分(D)缀合，例如每个抗体偶联约1个至约20个药物部分。可采用本领域技术人员知道的有机化学反应、条件和试剂通过数种路径来制备通式I的ADC，包括：(1)抗体的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应，形成Ab-L，随后与药物部分D反应；和(2)药物部分的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应，形成D-L，随后与抗体的亲核基团反应。本文中描述了用于制备ADC的别的方法。

Ab-(L-D)p             I

接头可以由一种或多种接头构件构成。例示性的接头构件包括6-马来酰亚胺己酰基(＂MC＂)、马来酰亚胺丙酰基(＂MP＂)、缬氨酸-瓜氨酸(＂val-cit＂)、丙氨酸-苯丙氨酸(＂ala-phe＂)、对氨基苄氧羰基(＂PAB＂)、4-(2-吡啶基硫代)戊酸N-琥珀酰亚氨基酯(＂SPP＂)、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1羧酸N-琥珀酰亚氨基酯(＂SMCC′)、和(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸N-琥珀酰亚氨基酯(＂SIAB＂)。本领域知道别的接头构件，本文也描述了一些。还可参见“MonomethylvalineCompounds Capable of Conjugation to Ligands”，US2005/0238649，将其完整内容收入本文作为参考。

在有些实施方案中，接头可包含氨基酸残基。例示性的氨基酸接头构件包括二肽、三肽、四肽或五肽。例示性的二肽包括：缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)。例示性三肽包括：甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。构成氨基酸接头构件的氨基酸残基包括那些天然存在的氨基酸，以及次要的氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物，诸如瓜氨酸。氨基酸接头构件可以在它们的特定酶(例如肿瘤相关蛋白酶，组织蛋白酶B、C和D，或纤溶酶蛋白酶)的酶促切割的选择性方面进行设计和优化。

抗体的亲核基团包括但不限于：(i)N末端氨基；(ii)侧链氨基，如赖氨酸；(iii)侧链巯基，如半胱氨酸；和(iv)糖基化抗体中糖的羟基或氨基。氨基、巯基、和羟基是亲核的，能够与接头部分上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烷基和苯甲基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫键，即半胱氨酸桥。可通过还原剂诸如DTT(二硫苏糖醇)处理使抗体具有与接头试剂缀合的反应活性。每个半胱氨酸桥理论上将形成两个反应性硫醇亲核体。可经由赖氨酸与2-亚氨基硫烷(Traut氏试剂)的反应，导致胺转变为硫醇，从而将额外亲核基团引入抗体。可以通过导入一个、两个、三个、四个、或更多个半胱氨酸残基(例如制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的突变型抗体)而将反应性硫醇基导入抗体(或其片段)。

还可通过修饰抗体来生成本发明的抗体-药物偶联物，即引入可与接头试剂或药物上的亲核取代基反应的亲电子部分。可用例如高碘酸盐氧化剂氧化糖基化抗体的糖，从而形成可与接头试剂或药物部分的胺基团反应的醛或酮基团。所得亚胺Schiff碱基可形成稳定的键，或者可用例如硼氢化物试剂还原而形成稳定的胺连接。在一个实施方案中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可在蛋白质中生成羰(醛和酮)基团，它可与药物上的适宜基团反应(Hermanson，Bioconjugate Techniques)。在另一个实施方案中，包含N末端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白质可与偏高碘酸钠反应，导致在第一个氨基酸处生成醛(Geoghegan & Stroh，Bioconjugate Chem.3：138-146(1992)；US 5,362,852)。此类醛可与药物部分或接头亲核体反应。

同样，药物部分上的亲核基团包括但不限于：胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯、和芳基酰肼基团，它们能够与接头部分上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烷基和苯甲基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基、和马来酰亚胺基团。

或者，可通过例如重组技术或肽合成来制备包含抗体和细胞毒剂的融合蛋白。DNA的长度可包含各自编码偶联物两个部分的区域，或是彼此毗邻或是由编码接头肽的区域分开，该接头肽不破坏偶联物的期望特性。

在又一个实施方案中，可将抗体与“受体”(诸如链霉亲和素)偶联从而用于肿瘤预先靶向，其中对患者施用抗体-受体偶联物，接着使用清除剂由循环中清除未结合的偶联物，然后施用与细胞毒剂(如放射性核苷酸)偶联的“配体”(如亲合素)。

药用配制剂

可通过将具有期望纯度的抗体与任选的生理学可接受载体、赋形剂或稳定剂混合来制备包含本发明抗体的治疗用配制剂，以水溶液、冻干或其它干燥剂型的形式贮存(Remington：The Science and Practice of Pharmacy 20thedition(2000))。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物(如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。

本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性化合物，优选活性互补且彼此没有不利影响的。合适的是，此类分子以对于预定目的有效的量组合。

活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、在胶状药物传递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于例如Remington：The Scienceand Practice of Pharmacy 20th edition(2000)。

用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易的通过使用无菌滤膜过滤来实现。

可制备持续释放配制剂。持续释放配制剂的合适例子包括含有本发明免疫球蛋白的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质以定型产品的形式存在，如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯共聚物、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够持续释放分子100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当胶囊化抗体在体内长时间维持时，它们可能由于暴露于37℃的潮湿环境而变性或聚集，导致生物学活性损失和免疫原性可能改变。可根据相关机制来设计合理的稳定化策略。例如，如果发现聚集机制是经由硫醇-二硫化物互换而形成分子间S-S键，那么可通过修饰巯基残基、由酸性溶液冻干、控制湿度、采用适宜添加剂和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定。

用途

本发明的抗体可用于，例如，体外(in vitro)、离体(ex vivo)和体内(in vivo)治疗方法。

在有些实施方案中，本发明提供了降低或抑制具有与血管发生有关的病理疾患的受试者中的血管发生的方法，包含给受试者施用有效量的本发明抗EGFL7抗体。这些疾患包括例如肿瘤(包括癌瘤)和某些眼疾。

适于通过本发明治疗的癌症包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、和白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更具体例子包括乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、肾癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞癌)、鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌(liver caner)、膀胱癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、头颈癌、成胶质细胞瘤、成视网膜细胞瘤、星形细胞瘤、泡膜细胞瘤、(卵巢)男性细胞瘤(arrhenoblastoma)、肝瘤(hepatoma)、血液学恶性肿瘤(包括非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤和急性血液学恶性肿瘤、子宫内膜癌或子宫癌、子宫内膜异位症、纤维肉瘤、绒毛膜癌、唾液腺癌、外阴癌、甲状腺癌、食管癌、肝癌(hepatic carcinoma)、肛门癌、阴茎癌、鼻咽癌、喉癌、卡波西氏肉瘤(Kaposi′s sarcoma)、黑素瘤、皮肤癌、许旺氏细胞瘤(Schwannoma)、少突神经胶质瘤、成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨源性肉瘤(osteogenic sarcoma)、平滑肌肉瘤、尿道癌、甲状腺癌、维尔姆斯氏肿瘤(Wilm’s tumor)、以及与瘢痣病有关的异常血管增殖、水肿(诸如与脑肿瘤有关的)、和梅格斯氏综合征(Meigs′syndrome)。优选的是，癌症选自乳腺癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、肾癌、前列腺癌、肝癌、头颈癌、黑素瘤、卵巢癌、间皮瘤、和多发性骨髓瘤。更优选的是，癌症是结肠直肠癌。适于通过本发明治疗的癌性疾患包括转移癌。本发明特别适于血管化肿瘤的治疗。

适于通过本发明治疗的眼疾包括眼的新血管疾病，包括但不限于年龄相关黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、增殖性糖尿病性视网膜病变、视网膜中央静脉阻塞(伴有囊样黄斑水肿)、视网膜静脉分支阻塞(伴有囊样黄斑水肿)、虹膜发红、病理性近视/CNV、[冯]希-林综合征(Von Hippel Lindau syndrome)、翼状胬肉、POHS(组织胞浆菌病)/CNV、脉络膜血管瘤、早产儿视网膜病变(ROP)、辐射性视网膜病变、眼内肿瘤(例如黑素瘤、成视网膜细胞瘤、转移、和眼眶的海绵状血管瘤)、息肉脉络膜病变(polypoidal choroidopathy)、特发性近中心凹毛细管扩张(idiopathic juxtafoveal telangiectasis)、伊尔斯病(Eales’disease)、眼眶的海绵状血管瘤、眼眶淋巴管瘤、眼睑毛细血管血管瘤、角膜移植片血管形成、角膜移植片新血管形成、科茨病(Coats disease)、和与青光眼手术有关的伤口愈合问题。

此外，本发明的至少一些抗体能够结合其它种属的抗原。因此，可使用本发明的抗体结合特异抗原的活性，例如，在包含抗原的细胞培养物中，在具有与本发明抗体交叉反应的抗原的人类受试者或者其它哺乳动物中(例如黑猩猩，狒狒，狨，短尾猴和恒河猴，猪或者小鼠)结合抗原。在有些实施方案中，本发明的抗体可用于通过将抗原与抗体接触抑制抗原的活性以使抗原活性被抑制。优选的，所述抗原是人蛋白分子。

在有些实施方案中，可以在结合患者体内抗原的方法中使用本发明的抗体，包括给受试者施用本发明的抗体以使受试者体内的抗原被结合，所述受试者患有与增加的抗原表达和/或活性有关的病症。优选的，抗原是人蛋白分子，受试者是人受试者。或者，受试者可以是表达与本发明的抗体结合的抗原的哺乳动物。此外，受试者可以是已经导入抗原的哺乳动物(例如，通过抗原给药或者通过抗原转基因表达)。本发明的抗体可以给药人类受试者用于治疗目的。此外，本发明的抗体可以给药非人哺乳动物用于兽医目的或者作为人类疾病的动物模型，所述非人哺乳动物(例如，灵长类动物，猪或者小鼠)表达与所述免疫球蛋白交叉反应的抗原。对于后者，这种动物模型可用于评价本发明抗体的治疗效果(例如，剂量和给药时程的试验)。

本发明的抗体可用于治疗、抑制、延缓进展、预防/延缓复发、改善或者预防与一种或者多种抗原分子的表达和/或活性相关的疾病、紊乱或者状态。

在某些实施方案中，给患者施用免疫偶联物，所述免疫偶联物包括与一种或者多种细胞毒性剂偶联的抗体。在一些实施方案中，免疫偶联物和/或其结合的抗原被细胞内化，导致免疫偶联物在杀伤其结合的靶细胞方面治疗效力增强。在一个实施方案中，细胞毒性剂靶向或者干扰靶细胞中的核酸。在一个实施方案中，细胞毒性剂靶向或者干扰微管聚合。这种细胞毒性剂的实例包括此处记录的任意一种化疗剂(例如美登木素生物碱类(maytansinoid)，auristatin，多拉司他汀(dolastatin)或者加利车霉素(calicheamicin))，放射性同位素，或者核糖核酸酶或者DNA核酸内切酶。

在疗法中本发明的抗体可以单独使用与其它组合物组合使用。例如，本发明的抗体可以与化疗剂(包括化疗剂的混合物)、其它细胞毒性剂、抗血管生成剂、细胞因子和/或生长抑制剂共同给药。上面提及的这种组合疗法包括组合给药(其中两种或更多药剂被包括在相同或者分开的制剂中)和分别给药，在这种情况下，本发明抗体的给药可以发生在辅助疗法给药之前和/或之后。

本发明抗体(和辅助治疗剂)通过任意合适的方法给药，包括肠胃外的，皮下的，腹膜内的，肺内的和鼻内的，和，如果需要局部疗法，局部给药。肠胃外输注包括肌内的，静脉内的，动脉内的，腹膜内的或者皮下的给药。此外，通过脉冲输注适当给药抗体，尤其是逐渐降低剂量的抗体。可以通过任意合适的途径给药，例如通过注射，例如静脉内或者皮下注射，这部分取决于是短暂给药还是长期给药。

以符合良好医疗实践的方式配制(formulated)、设定剂量(dosed)和给药本发明的抗体组合物。该情况下考虑的因素包括待治疗的特定病症，待治疗的特定哺乳动物，个体患者的临床病症，病症起因，药剂输送位点，给药方法，给药时间表，和执业医生已知的其它因素。抗体不是必须，而是可选择地与一种或者多种目前用于预防或者治疗所述病症的药剂一起配制。这类其它药剂的有效量取决于制剂中存在的本发明抗体的量、病症或者治疗的类型和上面讨论的其它因素。这些通常使用与上文所用相同的剂量和给药途经，或者大约从1到99％的在此之前使用的剂量。

为了疾病的预防或者治疗，本发明抗体的合适剂量(当单独使用或者与其它药剂联合使用时)取决于待治疗疾病的类型，抗体类型，疾病的严重程度和病程，给药抗体是用于预防还是治疗目的，先前的疗法，患者临床病史和对抗体的应答，和主治医师的判断。将抗体一次性或者通过一系列治疗适当地给药患者。根据疾病的类型和严重程度，大约1μg/kg到15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)抗体是给药患者的初始候选剂量，例如，通过一次或者多次分别给药，或者通过连续的输注。一种典型的每日剂量可以从大约1μg/kg到100mg/kg或者更多，取决于如上所述的因素。为了在数天或者更长时间内重复给药，根据病症，维持治疗直到发生所期望的症状抑制。抗体的示范性剂量从大约0.05mg/kg到大约10mg/kg。因此，可以给药患者大约0.5mg/kg，2.0mg/kg，4.0mg/kg或者10mg/kg(或者其任意组合)的一种或者多种剂量。所述剂量可以间歇给药，例如每隔一周或者每隔三周(例如这样的话患者接受大约2到大约20，例如大约6个剂量的抗体)。可以给药更高的起始负载剂量(initial loading dose)，继之以一个或者多个更低的剂量。示范性的给药方式包括给药大约4mg/kg的起始负载剂量，继之以大约2mg/kg抗体的每周维持剂量。但是，也可以使用其它给药剂量方案。可以方便的通过常规技术和测定法监控这类疗法的进程。

本发明的抗EGFL7抗体可用于特定细胞或者组织中检测EGFL7表达的测定法(例如诊断或者预测测定法)，其中所述抗体按如下所述进行标记和/或固定在不溶基质上。

本发明提供用于EGFL7检测的方法，该方法包括检测样品中的EGFL7-抗EGFL7抗体复合物。本文使用的术语“检测”包括参考对照或者不参考对照的定性和/或定量检测(测量水平)。

本发明提供诊断与EGFL7表达和/或活性相关的病症的方法，该方法包括检测生物样品中的EGFL7-抗EGFL7抗体复合物，所述生物样品来自患有或者怀疑患有所述病症的患者。在一些实施方案中，EGFL7表达是增加的表达或者异常(不需要)的表达。

本发明提供任意一种本文描述的抗EGFL7抗体，其中抗EGFL7抗体包括可检测的标记。

本发明提供本文描述的任意一种抗EGFL7抗体和EGFL7的复合物。在一些实施方案中，所述复合物是体内或者体外的。在一些实施方案中，所述复合物包括癌细胞。在一些实施方案中，抗EGFL7抗体被可检测的标记。

抗EGFL7抗体可用于大量公知检测分析法中任意一种的EGFL7检测。例如，通过从目标来源获得样品用于对生物样品进行EGFL7的测定，将样品与抗EGFL7抗体混合以允许抗体与混合物中存在的任意EGFL7形成抗体/EGFL7复合物，检测所述混合物中存在的任意抗体/EGFL7复合物。可以通过本领域已知的适于特定样品的方法制备检测用生物样品。根据使用的测定法类型选择混合样品与抗体的方法和检测抗体/EGFL7复合物的方法。这类测定法包括免疫组织化学，竞争性和夹心测定法，和空间位阻测定法。

EGFL7分析方法均使用一种或者多种下列试剂：标记的EGFL7类似物，固定的EGFL7类似物，标记的抗EGFL7抗体，固定的抗EGFL7抗体和空间偶联物。标记的试剂还被称为“显迹物”。

使用的标记物是不干扰EGFL7和抗EGFL7抗体结合的任意可检测官能团。已知许多标记物可用于免疫测定法，实例包括可以直接检测的基团(moiety)，例如荧光染料、化学发光和放射性标记物以及基团，例如酶，它们必须进行反应或者衍生以便能够被检测。

使用的标记物是不干扰EGFL7和抗EGFL7抗体结合的任意可检测官能团。许多标记物已知可用于免疫测定法，实例包括可以直接检测的基团，例如荧光染料、化学发光和放射性标记物以及基团，例如酶，它们必须进行反应或者衍生以便能够被检测。这种标记物的实例包括放射性同位素³²P，¹⁴C，¹²⁵I，³H和¹³¹I，荧光团例如稀土螯合物或者荧光素和其衍生物，若丹明和其衍生物，丹酰，伞形酮，荧光素酶，例如，萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(美国专利4,737,456)，荧光素，2，3-dihydrophthalazinediones，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖类氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，与使用过氧化氢以氧化染料前体(例如HRP)的酶、乳过氧化物酶或者微过氧化物酶、生物素/抗生物素蛋白、自旋标记物、噬菌体标记物、稳定自由基，等等进行偶联。

已经有将这些标记物共价结合到蛋白或者多肽的常规方法。例如，偶联剂例如二醛，碳化二亚胺，双马来酰亚胺，双亚氨酸乙酯，双偶氮联苯胺和类似物可用于标记具有上述荧光、化学发光和酶标记物的抗体。参见，例如，美国专利3,940,475(荧光测定法)和3,645,090(酶)；Hunter等人，Nature，144：945(1962)；David等人，Biochemistry，13：1014-1021(1974)；Pain等人，J.Immunol.Meth.40：219-230(1981)；和Nygren，J.Histochem.and Cytochem.，30：407-412(1982)。此处优选的标记物是酶例如辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。包括酶的这种标记物与抗体的偶联对熟悉免疫测定技术的普通技术人员来说是一种标准操作步骤。参见，例如，O′Sullivan等人，＂Methods for thePreparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay，＂in Methods Enzymol.，ed.J.J.Langone and H.Van Vunakis，Vol.73(AcademicPress，New York，New York，1981)，147-166页。

某些测定法需要试剂的固定。固定需要将抗EGFL7抗体同仍然在溶液中游离的任意EGFL7分离。在测定步骤前通常伴随使抗EGFL7抗体或者EGFL7类似物不溶解，这通过吸附到不溶于水的基质或者表面(Bennich等人，U.S.3,720,760)，通过共价偶联(例如，利用戊二醛交联)，或者之后通过使EGFL7抗体或者EGFL7类似物不溶解(例如，通过免测沉淀法)实现。

可以利用免疫组织化学和染色实验步骤检测样品中蛋白的表达。组织切片的免疫组织化学染色已被证明是一种测定或者检测样品中蛋白存在的可靠方法。免疫组织化学(“IHC”)技术利用抗体探测并在原位观察细胞抗原，这通常通过生色或者荧光方法进行。对于样品制备，可以使用来自哺乳动物(通常是人类患者)的组织或者细胞样品。可以通过本领域已知的各种步骤获得样品，包括但不限于手术切割、抽吸或者活组织切片。组织可以是新鲜或者冷冻的。在一个实施方案中，样品被固定和埋入石蜡或者类似物中。可以通过常规方法固定(即保存)组织样品。本领域普通技术人员清楚固定剂的选择由样品是用于组织染色还是其它分析的目的来决定。本领域普通技术人员还清楚固定时长取决于组织样品的大小和使用的固定剂。

IHC可以与其它技术例如形态学染色和/或荧光原位杂交一起进行。现有两种常用的IHC方法；直接和间接测定法。根据第一种测定法，直接检测抗体与靶抗原(例如，EGFL7)的结合。这种直接测定法使用标记的试剂，例如荧光标签或者酶标记的第一抗体，其不需要进一步的抗体相互作用就能观察。在典型的间接测定法中，未偶联的第一抗体结合抗原，然后标记的第二抗体结合第一抗体。当第二抗体与酶标记物偶联时，添加生色或者荧光底物以观察抗原。因为若干种第二抗体可以与第一抗体上的不同表位反应而发生信号放大。

用于免疫组织化学的第一和/或第二抗体通常用可检测的基团标记。现有的许多标记物通常可以分成下列类型：

除了上述讨论到的样品制备步骤外，可能还需要在IHC之前、期间或者之后对组织切片进行处理，例如，表位恢复方法，例如在柠檬酸缓冲液中对组织样品进行加热(参见，例如，Leong等人Appl.Immunohistochem.4(3)：201(1996))。

在任选封闭步骤后，组织切片在合适条件下接触第一抗体足够长时间段以便第一抗体与组织样品中的靶蛋白抗原结合。实现这些的合适条件可以通过常规试验方法确定。抗体与样品的结合程度通过使用上述讨论到的任意一种可检测标记物来确定。优选的，标记物是酶标记物(例如HRPO)，其催化生色底物例如3，3′-二氨基联苯胺色原体的化学变化。优选的酶标记物被偶联到特异结合第一抗体的抗体(例如第一抗体是兔多克隆抗体，第二抗体是山羊抗兔抗体)。

如此制备的标本被固定和盖片。然后进行载玻片鉴定，例如利用显微镜，可以使用本领域常规使用的染色强度标准。

其它测定法，称为竞争性或者夹心测定法，已经被明确建立并被广泛用于商业诊断工业。

竞争分析法依赖于显迹物EGFL7类似物与待测样品EGFL7竞争有限量的抗EGFL7抗体抗原结合位点的能力。竞争前后抗EGFL7抗体通常是不溶解的，然后将结合抗EGFL7抗体的显迹物和EGFL7与未结合的显迹物和EGFL7分离。通过轻轻倒出(其中结合伴侣是预先不溶解的)或者通过离心(其中结合伴侣在竞争反应后沉淀)实现这种分离。待测样品EGFL7的量与结合的显迹物的量成反比，所述结合显迹物的量通过标记物质的量测定。绘制EGFL7已知量的剂量反应曲线，与试验结果进行比较以定量确定待测样品中存在的EGFL7的量。当使用酶作为可检测标记物时，这些测定法被称为ELISA系统。

另一种竞争分析法，称为“均相”测定法，不需要相分离。此处，制备并使用酶与EGFL7的偶联物，这样的话当抗EGFL7抗体结合EGFL7时，抗EGFL7抗体的存在改变酶活性。在这种情况下，EGFL7或者其免疫活性片段与双功能有机桥偶联到酶例如过氧化物酶上。选择偶联物以与抗EGFL7抗体一起使用以便抗EGFL7抗体的结合抑制或者增强标记物的酶活性。该方法本身被广泛使用，称作EMIT。

空间偶联物用于均相测定法的位阻方法。通过将低分子量半抗原共价连接到小EGFL7片段合成这些偶联物，以便针对半抗原的抗体基本上不会与抗EGFL7抗体同时结合偶联物。在此测定步骤下待测样品中存在的EGFL7将结合抗EGFL7抗体，从而允许抗-半抗原结合所述偶联物，导致偶联物的半抗原特性的变化，例如，当半抗原是荧光基团时荧光的变化。

夹心测定法尤其可用于EGFL7或者抗EGFL7抗体的测定。在顺次夹心测定法(sequential sandwich assays)中固定的抗EGFL7抗体用于吸附待测样品EGFL7，通过洗涤去除待测样品，结合的EGFL7用于吸附标记的第二抗EGFL7抗体，然后从残余显迹物中分离结合的材料。结合显迹物的量与待测样品EGFL7成正比。“平行”夹心测定法中在添加标记的抗EGFL7前不分离待测样品。使用抗EGFL7单克隆抗体作为一种抗体和多克隆抗EGFL7抗体作为另一种抗体的顺次夹心测定法可用于检测样品中的EGFL7。

上文仅仅是EGFL7的示范性检测分析法。现在或者此后发展的使用抗EGFL7抗体测定EGFL7的其它方法均包括在本发明范围内，包括此处描述的生物测定法。

制品

在本发明的另一个方面，提供了包含可用于治疗、预防和/或诊断上文所述紊乱的物质的制品。制品包括容器和贴在所述容器上或与其相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小管、注射器等。容器可用各种材料制成，诸如玻璃或塑料。容器中装有其自身或在联合其它组合物时有效治疗、预防和/或诊断疾患的组合物，而且可具有无菌存取口(例如容器可以是具有皮下注射针头可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小管)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体。标签或包装插页指示该组合物用于治疗选择的疾患，诸如癌症。此外，制品可包括(a)其中装有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体；和(b)其中装有组合物的第二容器，其中该组合物包含其它细胞毒剂。本发明此实施方案中的制品还可包括指示第一和第二抗体组合物可用于治疗特定疾患如癌症的包装插页。或者/另外，制品还可包括第二(或第三)容器，其中装有制药学可接受的缓冲剂，诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。它还可包括商业和用户立场上所需的其它物质，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。

下面是本发明方法和组合物的实施例。应当理解，根据上文提供的一般描述，可实施各种其它实施方案。

实施例

实施例1：EGFL7的单克隆抗体的生成和表征

单克隆抗体的生成

EGFL7是在一项旨在发现新的人分泌型和跨膜蛋白质，特别是那些牵涉血管发育调节的蛋白质的研究中鉴定和克隆的。人EGFL7的克隆和表达的详情披露于例如专利申请US2003/0224948A1(其中将EGFL7鉴定为PRO1449)。人EGFL7的

编号为NM_016215。

给Egfl7纯合敲除小鼠(在Genentech生成)免疫大肠杆菌生成的、带His6标签的重组人和小鼠EGFL7蛋白，其在Ribi佐剂(Corixia，Hamilton，MT)中稀释，每周两次，经足垫，8剂。自展现出高血清滴度的10只小鼠收获来自淋巴结的B细胞，并与小鼠骨髓瘤细胞(X63.Ag8.653；美国典型培养物保藏中心

融合。10-14天后，使用重组EGFL7蛋白通过直接ELISA对上清液筛选抗体生成。将阳性亚克隆两次以实现单克隆性。为了大规模生产纯化的抗体，将杂交瘤细胞腹膜内注射入新鲜致敏的(pristine-primed)BALB/c小鼠，或者在integra生物反应器中培养。通过蛋白A亲和层析(Pharmacia FastProtein Liquid Chromatography；Pharmacia，Uppsala，Sweden)纯化腹水或培养物上清液。选择这些单克隆抗体中称为4F11、10G9、和18F7的三个用于进一步分析。这些单克隆抗体在2006年1月保藏于

单克隆抗体阻断HUVEC细胞粘附和迁移

先前已经显示了包被在培养板上的EGFL7促进人脐静脉内皮细胞(HUVEC)粘附，尽管粘附的强度显著弱于其它细胞粘附分子诸如纤连蛋白和胶原(Parker et al.，Nature 428：754-58(2004))。因而，我们进行了实验来确定单抗4F11、10G9、和18F7是否能阻断细胞粘附至EGFL7包被的板。将板用5μg/ml纤连蛋白(Roche)和在大肠杆菌中生成的重组人EGFL7包被。PBS漂洗后，以5x10⁵/cm²的密度铺入在EGM2培养基(Cambrex)中的HUVEC(Cambrex)，并以140g离心5分钟以使细胞附着同步化，然后温育。为了分析抗体活性，在铺板前将EGM2培养基中的HUVEG与0.5、5或50μg/ml浓度的抗体在50mM Tris/125mM NaCl，pH8.6中预温育。单抗4F11、10G9、和18F7每一种都以浓度依赖性方式阻断细胞粘附至人或小鼠EGFL7蛋白包被的板，而且无一单抗阻断细胞粘附至纤连蛋白包被的板，证实了阻断是对EGFL7特异性的。

我们还检验了这些抗体是否能阻断HUVEC在EGFL7包被的板上迁移。将板用5μg/ml以下蛋白质之一包被：BSA(Sgima)、胶原(Upstate)、纤连蛋白(Roche)、和重组人EGFL7(在Genentech在大肠杆菌中生成)。PBS漂洗后，以5x10⁵/cm²的密度将在EGM2(Cambrex)中的HUVEC(Cambrex)铺板。让细胞附着2小时，并用移液器尖头对单层划痕。将孔用EGM2清洗两次，并分别加入含50μg/ml对照单抗或者4F11、10G9、18F7的新鲜培养基。以数个时间间隔在24小时里对孔照相以监测划痕闭合。单抗4F11、10G9、和18F7每一种都阻断细胞在EGFL7蛋白包被的板上迁移，但是用其它蛋白质包被的板不然。对照单抗对任何蛋白质没有阻断活性。这些结果指出所有这三种抗EGFL7单抗都特异性阻断HUVEC在EGFL7上迁移。

有趣的是，我们观察到单抗4F11的阻断作用依赖于配制剂。具体而言，该抗体在50mM Tris/125mM NaCl中制备抗体储液时在阻断HUVEC细胞粘附方面高度有效，但是在PBS中制备时展现极小功效。这种差异在其它两种单抗中没有观察到。

单抗4F11和10G9的序列的测定

使用

迷你试剂盒

Mini Kit，Qiagen，Germany)自生成小鼠抗人EGFL7单克隆抗体4F11和10G9的杂交瘤细胞提取总RNA。使用以下简并引物通过RT-PCR扩增4F11和10g9的轻链(VL)和重链(VH)可变域：

用于4F11：

轻链(LC)正向：5’-GTCAGATATCGTKCTSACMCARTCTCCWGC-3’(SEQID NO：21)

重链(HC)正向：5’-GATCGACGTACGCTCAGATHCARYTGGTGCARTCTGGGATCGACGTACGCTCAGATHCARYTGGTGCARTCTGG-3’(SEQ ID NO：22)

用于10G9：

轻链(LC)正向：5’-GATCGATATCGTGATGACBCARACTCCACT-3’(SEQ IDNO：23)

重链(HC)正向：5’-GATCGACGTACGCTGAGGTYCAGCTSCAGCAGTCTGG-3’(SEQ ID NO：24)

用于4F11和10G9二者：

轻链反向：5’-TTTDAKYTCCAGCTTGGTACC-3’(SEQ ID NO：25)

重链反向：5’-ACAGTGGGCCCTTGGTGGAGGCTGMRGAGACDGTGASHRDRGT-3’(SEQ ID NO：26)

正向引物是对这两种抗体的VL和VH区的N端氨基酸序列特异性的。LC和HC反向引物分别设计成与轻链恒定域(CL)和重链第一恒定域1(CH1)退火，这两个恒定域对于这两种抗体是相同的且在物种间是高度保守的。将扩增得到的VL克隆入pRK哺乳动物细胞表达载体(Shields et al.，J.Biol.Chem.276：659-04(2000))。将扩增得到的VH插入pRK哺乳动物细胞表达载体。使用常规测序方法测定插入片段的多核苷酸序列。4F11轻链和重链(分别为SEQ ID NO：1和2)及10G9轻链和重链(分别为SEQ ID NO：3和4)的序列显示于图1-4。

同种型检验和结合亲和力

单抗4F11、10G9、和18F7的同种型经标准方法测定为IgG2b同种型。

单抗对人和小鼠二者EGFL7的结合亲和力于室温使用PharmaciaBIAcore

 3000(BIAcore AB，Uppsala，Sweden)通过表面等离振子共振来测定(参见例如Morton et al.，Meth.Enzymol.295：268-94(1998))。将抗EGFL7抗体经伯胺基团固定化至传感器芯片(CM5)。将羧甲基化传感器芯片表面基质(matrix)通过以5μl/min注射20μl 0.025M N-羟基琥珀酰亚胺和0.1M N-乙基-N′(二甲基氨基丙基)碳二亚胺的混合物来活化。以5μl/min注射5-10μl10μg/ml重组人或小鼠EGFL7蛋白在10mM乙酸钠pH4.5中的溶液。偶联后，通过注射20μl 1M乙醇胺pH8.5来封闭芯片上未被占据的位点。运行缓冲液是含0.05％聚山梨醇酯20的PBS。为了进行动力学测量，以30μl/min流速将在运行缓冲液中2倍连续稀释的带polyHis标签的EGFL7注射流过流动槽(flow cell)达3分钟，并让所结合的带polyhis标签的EGFL7解离20分钟。通过注射20μl10mM甘氨酸·HCl(pH1.5)来使结合表面再生。经过活化但是没有抗体固定化的流动槽1(flow cell one)用作参照槽。带polyHis标签的EGFL7对流动槽1没有显著的非特异性结合。为了计算表观结合亲和力，使用整体拟合(globalfitting)使用1:1结合模型分析数据。同时拟合结合和解离速率常数(BIAevaluation软件)。使用单抗储液50mM Tris/125mM NaCl中的这些实验的结果显示于表2。

            表2：单抗对人和小鼠EGFL7的K_D

单抗           KD(hEGFL7)           KD(mEGFL7)

4F11           0.473nM              0.756nM

10G9           1.10nM               1.83nM

18F7           0.411nM              0.191nM

单抗所识别的EGFL7表位的测定

我们测定了单克隆抗体所识别的表位。我们首先定位了EGFL7中由每一种单抗结合的区域。将293细胞用图5所示包含全长EGFL7或蛋白质截短形式的表达载体转染。然后用单抗4F11、10G9、和18F7探查来自转染细胞的细胞溶解物的Western印迹。我们观察到每一种单抗都结合至EGFL7的EMI部分。

为了缩小每种单抗所识别的特定区域，我们合成了跨越EMI结构域一部分的交叠多肽，并测试它们与全长EGFL7竞争结合单抗的能力。例如，用于单抗4F11的多肽的序列如下：

p1    RSPGLAPARPRYA                 (SEQ ID NO：27)

p2           RPRYACCPGWKRT          (SEQ ID N0：28)

p3                   GWKRTSGLPGACG  (SEQ ID NO：29)

我们将单抗4F11与EGFL7蛋白和10倍摩尔过量的每种多肽p1、p2和p3混合，将所得混合物免疫沉淀，并通过SDS-PAGE显现。对于单抗4F11，我们观察到只有p2与全长EGFL7竞争结合单抗4F11。结果指出单抗4F11识别EGFL7包含序列CCP的表位。

我们用其它两种单抗进行了类似的实验，其中使用具有如下序列的多肽：

p4  LTTCDGHRACSTY                (SEQ ID NO：30)

p5         RACSTYRTIYRTA         (SEQ ID NO：31)

p6               RTAYRRSPGVTPA   (SEQ ID NO：32)

我们确定了单抗10G9和18F7二者都识别包含序列RTIY(SEQ ID NO：33)的表位。

实施例2：抗EGFL7单抗抑制体内肿瘤生长

在此实施例中，在数种模型中检验了抗EGFL7单抗抑制体内肿瘤生长的能力。我们首先在Colo205模型(人结肠直肠癌)和A673模型(人横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)模型)中检验了在PBS中的单抗。我们在这些模型中没有观察到PBS中的单抗作为单一药剂的效应。

然后，我们检验了单独的单抗和/或联合抗VEGF抗体B20.4.1(记载于WO 2005/012359)的单抗。我们在三种模型中检验了抗体：Her2人乳腺癌模型(“Fo5模型”)、人肺癌(NSCLC)模型(“H1299”)和另一种人乳腺癌模型(“MDA-MB231”)。这些肿瘤模型都是已经完善建立的，记载于例如Lee et al.，Clin Cancer Res.11(16)：6065-74(2005)；Cameron et al.，Cancer Cell Int.5：23(2005)；Finkle et al.，Clinical Cancer Res.10：2499-251(2004)。每只动物用抗豚草单抗(对照)；单独的B20.4；单独的18F7；或B20.4加4F11、10G9、或18F7处理。简言之，对于H1299模型，给HRLN雌性nu/nu小鼠在侧面皮下注射1 x 10⁷个H1299肿瘤细胞；而对于MDA-MB231模型，给HRLN雌性nu/nu小鼠在侧面皮下注射5 x 10⁶个MDA-MB231肿瘤细胞。对于每种模型，在平均肿瘤大小达到100mm³时(对应于图6-9中的第0天)开始抗体治疗。抗豚草对照单抗和B20.4以10mg/kg施用，每周一次；而4F11、10G9、和18F7以10mg/kg施用，每周两次(在图6、8和9中以x轴下箭头标示)。

我们在Fo5模型中没有观察到效应。我们在其它两种模型中观察到显著的肿瘤抑制效应。如图6-7所示，在H1299模型中，单抗4F11联合B20.4.1显著比对照或单独的B20.4.1更有效。如图8所示，在MDA-MB231模型中，单抗4F11或单抗10G9联合B20.4.1都比对照或单独的B20.4.1更有效。如图9所示，在MDA-MB231模型中，单独的单抗18F7比对照更有效，而且在联合B20.4.1时显著比单独的单抗18F7或B20.4.1更有效。

有趣的是，我们还观察到单抗4F11处理在H1299模型中停止了抗VEGF疗法(B20.4.1)后的完全血管恢复(full vascular recovery)。在比较用单独的B20.4.1处理的肿瘤与用B20.4.1和4F11处理的肿瘤之间治疗停止后的肿瘤血管样式时，我们观察到肿瘤的血管重建(revascularization)有显著延迟。这些结果强烈说明抗EGFL7疗法在与抗VEGF疗法联合时可提供叠加或甚至协同效应。

我们也使用本领域可利用的其它肿瘤模型来检验抗EGFL7抗体的抗肿瘤活性，包括但不限于LS174T(结肠)、BXPC3(前列腺)、HCT116(结肠)、MV-522(NSCLC)、SKMES(NSCLC)、Colon26(结肠)、MDA-MB231(乳腺)、MCF7(乳腺)、H1299(NSCLC)、SW620(结肠)、LL(肺)、Fo5(乳腺)、4T1(乳腺)、HT29(结肠)、SW480(结肠)、786-0(肾)。

下述杂交瘤已经保藏于美国类型培养物保藏中心

(PO Box1549，Manassas，VA，20108，USA)：

细胞系                 

编号         保藏日期

抗EGFL7鼠单抗4F11.1.8  PTA-7343          2006年2月1日

抗EGFL7鼠单抗10G9.1.6  PTA-7344          2006年2月1日

抗EGFL7鼠单抗18F7.1.8  PTA-7345          2006年2月1日

这些保藏是依据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约(Budapest Treaty)及其(布达佩斯条约)实施细则的规定进行的。这保证了自保藏之日起保存存活保藏物30年。这些细胞系可根据布达佩斯条约的条款通过

获得，并服从Genentech公司与

之间的协议，它保证了在有关美国专利授权后或者在任何美国或外国专利申请向公众公开后，以两者中居先者为准，公众可永久且不受限制的获得这些细胞系，而且保证了依据35USC§122及依照它的管理章程(包括37CFR§1.14，特别要提及886 OG 638)由美国专利和商标局长批准的个人将有资格获得这些细胞系。

本申请的受让人已同意，若保藏的细胞系在合适条件下培养时丢失或遭到破坏，则他将在接到通知后迅速用同一细胞系的标本更换。所保藏细胞系的可获得性并不解释为对违反任何政府机构依据其专利法所授予的权利实施本发明的许可。

尽管为了清楚理解的目的已经通过举例说明的方式较为详细的描述了上述方面，说明书和实施例不应解释为限制本发明的范围。

序列表

<110>健泰科生物技术公司(Genentech，Inc.)

<120>EGFL7抗体及其使用方法

<130>P2327R1

<150>US 60/783,686

<151>2006-03-16

<150>US 60/812,569

<151>2006-06-09

<160>33

<210>1

<211>112

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>1

<210>2

<211>117

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>2

<210>3

<211>113

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>3

<210>4

<211>128

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>4

<210>5

<211>15

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>5

<210>6

<211>7

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>6

<210>7

<211>9

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>7

<210>8

<211>5

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>8

<210>9

<211>17

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>9

<210>10

<211>5

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>10

<210>11

<211>16

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>11

<210>12

<211>7

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>12

<210>13

<211>9

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>13

<210>14

<211>11

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>14

<210>15

<211>17

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>15

<210>16

<211>7

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>16

<210>17

<211>108

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>17

<210>18

<211>112

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>18

<210>19

<211>6

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>此序列是人工合成的

<220>

<221>修饰碱基

<222>2

<223>碱基是g，a，t或c

<220>

<221>CAAT信号修饰碱基

<222>完整

<223>CAAT盒

<400>19

<210>20

<211>6

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>此序列是人工合成的

<220>

<221>po1yA信号

<222>完整

<223>聚腺苷酸化信号

<400>20

<210>21

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>此序列是人工合成的

<220>

<221>修饰碱基

<222>完整

<223>用于扩增抗体序列的引物

<220>

<221>修饰碱基

<222>13

<223>碱基是g或t

<220>

<221>修饰碱基

<222>16

<223>碱基是g或c

<220>

<221>修饰碱基

<222>19

<223>碱基是a或c

<220>

<221>修饰碱基

<222>22

<223>碱基是g或a

<220>

<221>修饰碱基

<222>28

<223>碱基是a或t

<400>21

<210>22

<211>74

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>此序列是人工合成的

<220>

<221>修饰碱基

<222>完整

<223>用于扩增抗体序列的引物

<220>

<221>修饰碱基

<222>20，57

<223>碱基是a或c或t

<220>

<221>修饰碱基

<222>23，32，60，69

<223>碱基是g或a

<220>

<221>修饰碱基

<222>24，61

<223>碱基是t或c

<400>22

<210>23

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>此序列是人工合成的

<220>

<221>修饰碱基

<222>完整

<223>用于扩增抗体序列的引物

<220>

<221>修饰碱基

<222>19

<223>碱基是g或c或t

<220>

<221>修饰碱基

<222>22

<223>碱基是g或a

<400>23

<210>24

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>此序列是人工合成的

<220>

<221>修饰碱基

<222>完整

<223>用于扩增抗体序列的引物

<220>

<221>修饰碱基

<222>20

<223>碱基是t或c

<220>

<221>修饰碱基

<222>26

<223>碱基是g或c

<400>24

<210>25

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>此序列是人工合成的

<220>

<221>修饰碱基

<222>4

<223>碱基是a或g或t

<220>

<221>修饰碱基

<222>6

<223>碱基是g或t

<220>

<221>修饰碱基

<222>7

<223>碱基是t或c

<220>

<221>修饰碱基

<223>扩增抗体序列的引物

<400>25

<210>26

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>此序列是人工合成的

<220>

<221>修饰碱基

<222>完整

<223>用于扩增抗体序列的引物

<220>

<221>修饰碱基

<222>25

<223>碱基是a或c

<220>

<221>修饰碱基

<222>26，39

<223>碱基是g或a

<220>

<221>修饰碱基

<222>32，40

<223>碱基是a或g或t

<220>

<221>修饰碱基

<222>37

<223>碱基是g或c

<220>

<221>修饰碱基

<222>38

<223>碱基是a或c或t

<400>26

<210>27

<211>13

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>27

<210>28

<211>13

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>28

<210>29

<211>13

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>29

<210>30

<211>13

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>30

<210>31

<211>13

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>31

<210>32

<211>13

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>32

<210>33

<211>4

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>33

Claims (57)

1.一种抗体，其由选自下组的杂交瘤生成：抗EGFL7鼠单抗4F11.1.8、抗EGFL7鼠单抗10G9.1.6、和抗EGFL7鼠单抗18F7.1.8。

2.一种抗EGFL7抗体，其包含一个或多个选自下组的互补决定区(CDR)：

(a)4F11 CDR-L1序列KASQSVDYDGDSYMS(SEQ ID NO：5)；

(b)4F11 CDR-L2序列GASNLES(SEQ ID NO：6)；

(c)4F11 CDR-L3序列QQNNEDPYT(SEQ ID NO：7)；

(d)4F11 CDR-H1序列TYGMS(SEQ ID NO：8)；

(e)4F11 CDR-H2序列WINTHSGVPTYADDFKG(SEQ ID NO：9)；和

(f)4F11CDR-H3序列LGSSA(SEQ ID NO：10)。

3.权利要求2的抗EGFL7抗体，其中所述抗体的轻链包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下组的CDR序列：KASQSVDYDGDSYMS(SEQID NO：5)、GASNLES(SEQ ID NO：6)和QQNNEDPYT(SEQ ID NO：7)。

4.权利要求2的抗EGFL7抗体，其中所述抗体的重链包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下组的CDR序列：TYGMS(SEQ ID NO：8)、WINTHSGVPTYADDFKG(SEQ ID NO：9)和LGSSA(SEQ ID NO：10)。

5.权利要求2的抗EGFL7抗体，其中所述抗体的轻链包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下组的CDR序列：KASQSVDYDGDSYMS(SEQID NO：5)、GASNLES(SEQ ID NO：6)和QQNNEDPYT(SEQ ID NO：7)；且其中所述抗体的重链包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下组的CDR序列：TYGMS(SEQ ID NO：8)、WINTHSGVPTYADDFKG(SEQID NO：9)和LGSSA(SEQ ID NO：10)。

6.权利要求2的抗EGFL7抗体，其中所述抗体的轻链包含序列：DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMSWYQQKPGQPKLLIYGASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQNNEDPYTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO：1)。

7.权利要求2的抗EGFL7抗体，其中所述抗体的重链包含序列：QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGHTFTTYGMSWVKQAPGKGLKWMGWINTHSGVPTYADDFKGRFAFSLETSASTAHLQINNLKNEDTATYFCARLGS SAVDYWGQGTTVTVS S(SEQ ID NO：2)。

8.一种抗EGFL7抗体，其包含一个或多个选自下组的互补决定区(CDR)：

(a)10G9 CDR-L1序列RSSQSLVHTNGITYLH(SEQ ID NO：11)；

(b)10G9 CDR-L2序列KVSNRFS(SEQ ID NO：12)；

(c)10G9 CDR-L3序列SQSTHVPLT(SEQ ID NO：13)；

(d)10G9 CDR-H1序列DYYMNSDYYMN(SEQ ID NO：14)；

(e)10G9 CDR-H2序列DINPKNGGTTYNQKFKG(SEQ ID NO：15)；和

(f)10G9 CDR-H3序列ALGVFDY(SEQ ID NO：16)。

9.权利要求8的抗EGFL7抗体，其中所述抗体的轻链包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下组的CDR序列：RSSQSLVHTNGITYLH(SEQID NO：11)、KVSNRFS(SEQ ID NO：12)和SQSTHVPLT(SEQ ID NO：13)。

10.权利要求8的抗EGFL7抗体，其中所述抗体的重链包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下组的CDR序列：DYYMNSDYYMN(SEQ ID NO：14)、DINPKNGGTTYNQKFKG(SEQ ID NO：15)和ALGVFDY(SEQ IDNO：16)。

11.权利要求8的抗EGFL7抗体，其中所述抗体的轻链包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下组的CDR序列：RSSQSLVHTNGITYLH(SEQID NO：11)、KVSNRFS(SEQ ID NO：12)和SQSTHVPLT(SEQ ID NO：13)；且其中所述抗体的重链包含至少一个、至少两个、或所有三个选自下组的CDR序列：DYYMNSDYYMN(SEQ ID NO：14)、DINPKNGGTTYNQKFKG(SEQ ID NO：15)、和ALGVFDY(SEQ ID NO：16)。

12.权利要求8的抗EGFL7抗体，其中所述抗体的轻链包含序列：DIVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHTNGITYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPLTFGAGTKVEIKR(SEQ ID NO：3)。

13.权利要求8的抗EGFL7抗体，其中所述抗体的重链包含序列：EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFSDYYMNSDYYMNWVKQSHGKSLEWIGDINPKNGGTTYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCAREADYDPIYYAMDYWGQGTTLTVSA(SEQ ID NO：4)。

14.一种抗EGFL7抗体，其能特异性结合包含选自下组的氨基酸序列的多肽：CCP、RTIY(SEQ ID NO33)。

15.一种分离的抗体，其能与权利要求1-14任一项的抗体结合人EGFL7上的相同表位。

16.一种分离的抗体，其能与权利要求1-14任一项的抗体竞争EGFL7结合。

17.权利要求1-16任一项的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。

18.权利要求1-17任一项的抗体，其中所述抗体选自嵌合抗体、人源化抗体、亲和力成熟抗体、人抗体、和双特异性抗体。

19.权利要求1-18任一项的抗体，其中所述抗体是抗体片段。

20.一种药用组合物，其包含权利要求1-19任一项的抗EGFL7抗体。

21.权利要求20的药用组合物，进一步包含抗血管发生剂。

22.权利要求21的药用组合物，其中所述抗血管发生剂选自贝伐单抗和ranibizumab。

23.一种多核苷酸，其编码权利要求1-19任一项的抗体。

24.一种载体，其包含权利要求23的多核苷酸。

25.权利要求24的载体，其中所述载体是表达载体。

26.一种宿主细胞，其包含权利要求24或25的载体。

27.权利要求26的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核的。

28.权利要求26的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核的。

29.权利要求26的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物的。

30.制备抗EGFL7抗体的方法，所述方法包括：(a)在合适的宿主细胞中表达权利要求25的载体，并(b)回收抗体。

31.权利要求30的方法，其中所述宿主细胞是原核的。

32.权利要求30的方法，其中所述宿主细胞是真核的。

33.降低或抑制具有与血管发生有关的病理疾患的受试者中的血管发生的方法，包括对受试者施用有效量的权利要求1-19任一项的抗EGFL7抗体或权利要求20的药用组合物。

34.权利要求33的方法，其中所述病理疾患是肿瘤。

35.权利要求34的方法，其中所述肿瘤是癌瘤。

36.权利要求33的方法，其中所述病理疾患是与眼有关的。

37.权利要求36的方法，其中所述病理疾患是眼内新血管疾病。

38.权利要求33-35任一项的方法，进一步包括对受试者施用抗血管发生剂。

39.权利要求38的方法，其中所述抗血管发生剂是血管内皮生长因子(VEGF)的拮抗剂。

40.权利要求39的方法，其中所述拮抗剂是抗VEGF抗体。

41.权利要求40的方法，其中所述抗VEGF抗体是贝伐单抗。

42.权利要求36或37的方法，进一步包括对受试者施用抗血管发生剂。

43.权利要求42的方法，其中所述抗血管发生剂是血管内皮生长因子(VEGF)的拮抗剂。

44.权利要求43的方法，其中所述拮抗剂是抗VEGF抗体。

45.权利要求44的方法，其中所述抗VEGF抗体是ranibizumab。

46.权利要求38-45任一项的方法，其中所述抗血管发生剂是在施用抗EGFL7抗体之前或之后施用的。

47.权利要求38-45任一项的方法，其中所述抗血管发生剂是与抗EGFL7抗体同时施用的。

48.增强抗血管发生剂在具有与血管发生有关的病理疾患的受试者中的疗效的方法，包括对受试者施用权利要求1-19任一项的抗体或权利要求20或21的药用组合物。

49.权利要求38的方法，其中所述病理疾患是肿瘤。

50.权利要求39的方法，其中所述肿瘤是癌瘤。

51.权利要求48-50任一项的方法，其中所述抗血管发生剂是贝伐单抗。

52.权利要求48-51任一项的方法，进一步包括施用化疗剂。

53.权利要求48的方法，其中所述病理疾患是与眼有关的。

54.权利要求53的方法，其中所述病理疾患是眼内新血管疾病。

55.权利要求53或54的方法，其中所述抗血管发生剂是ranibizumab。

56.权利要求53-55任一项的方法，进一步包括施用皮质类固醇。

57.权利要求53-55任一项的方法，进一步包括施用光动力学疗法。

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