JP2014509323A - ドーパミン受容体遮断薬による癌の処置 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
癌の処置と予後のための新規の方法、とくに急性骨髄性白血病の処置と予後のための新規の方法に対するニーズが存在する。
ここでは「癌」は、隣接組織または体の他の部位に拡大する制御されない異常な細胞増殖により引き起こされる一群の疾病の1つを言う。癌細胞は癌細胞が一塊になる固形腫瘍を形成可能であり、または白血病のように分散した細胞として存在する。
選択肢として、チオリダジンのような1種類以上のフェノチアジン誘導体のラセミ体がここに記載される方法で使用される。
驚くべきことに、ドーパミン受容体(DR)遮断薬がAML系および原発性AMLに対して細胞毒性を有し、一方正常造血性幹細胞に対しては細胞毒性がそれより少ないことが発見された。事例2及び10に示されるように、ドーパミン受容体(DR)遮断薬チオリダジンは有意に白血病幹細胞(LSC)機能を減少させ、一方で正常造血性幹細胞の能力を維持した。
また、癌または前癌障害を処置するためのドーパミン受容体(DR)遮断薬の使用法が提供される。ある実施形態では、ここに記載される方法または使用法は骨髄増殖性疾病などの前癌障害を処置するのに有用である。ある実施形態では、癌はAML、または単球性白血病などの白血病である。ここに記載される方法または使用法は特にドーパミン受容体を発現する癌細胞に有用である。ある実施形態では、ここに記載される方法または使用法は単球マーカーCD14を発現する癌細胞の処置に有用である。ある実施形態では、ドーパミン受容体(DR)遮断薬は造血性幹細胞または正常幹細胞に比べて、優先的に被験者の癌幹細胞の分化を誘発する。ある実施形態では、癌幹細胞は白血病癌幹細胞である。ある実施形態では、被験者はAMLを罹患し、癌幹細胞はAML癌幹細胞である。
従って、本発明の1側面では、ドーパミン受容体(DR)遮断薬による処置に適した被験者を識別する方法が提供される。ある実施形態では、その方法は被験者からの癌細胞試料中に1種類以上のドーパミン受容体(DR)の発現を測定するステップを有する。1種類以上のドーパミン受容体(DR)を発現する癌細胞を有する被験者は、それによりドーパミン受容体(DR)遮断薬による処置に適した被験者と識別される。例えば、癌細胞試料中の1種類以上のドーパミン受容体(DR)の発現は、ドーパミン受容体(DR)に対しエンコードするポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して癌細胞を試験することにより測定可能である。ある実施形態では、方法は、被験者から癌細胞の試料を獲得または提供するステップと、および/または1種類以上のドーパミン受容体(DR)の発現について試料を試験するステップを有する。ある実施形態では、癌は白血病であり、癌細胞は白血病細胞である。ある実施形態では、癌はAMLである。選択肢として、方法は癌、血液系腫瘍、白血病、またはAMLに付随することが既知の追加のマーカー、または特定の処置レジームに付随するマーカーを測定するステップを有する。ある実施形態では、癌細胞は単球マーカーCD14に対しても試験される。
(事例1:チオリダジンは白血病細胞系に対し細胞毒性を有する)
正規化された細胞数に対するチオリダジンの効果が3つの白血病細胞系:HL−60、MV4−11及びOCI−AML3で評価された。3つの細胞系は全て白血病細胞系である。HL−60は前骨髄球性AML由来であり、一方MV4−11及びOCI−AML3はAMLの代表である。それぞれの化合物は細胞と共に72時間インキュベートされる。対照はジメチルスルホキシド(DMSO)(即ち化合物に使用される溶媒)に72時間。それぞれの条件は3度繰り返された。
AML細胞系における芽細胞形成に対するチオリダジンの効果が正常ヒト幹細胞におけるコロニー形成に対するチオリダジンの効果と比較された。
ドーパミン受容体遮断薬でありそしてフェノチアジン関連化合物であるクロルプロマジンもAML細胞系HL−60,MV4−11およびOCI−AML3に対する効果について調査された。試験は事例1に示されるように実施された。図4に示すように、10μMクロルプロマジンはAML細胞系に対して毒性を有する。
ドーパミン受容体DR1,DR2,DR3,DR4およびDR5の発現が、AML細胞系(HL−60,MV4−11,AML−OCI2およびAML−OCI3)、AML患者から単離された原発性AML細胞(AML22101、AML29428、AML22174、AML29560)、正常血液単核細胞(MNC)(MPB21471およびMPB28137;健常患者血液)およびStemSep(登録商標)ヒト造血性前駆体細胞エンリッチメントキット(http://www.stemcell.com/en/Products/All−Products/StemSep−Human−Hematopoietic−Progenitor−Cell−Enrichment−Kit.aspx)を使用し、HSC/ヒト前駆体細胞のエンリッチメントレベルがフローサイトメトリで確認された、正常ヒト幹細胞または前駆体を豊富に含んだへその緒臍帯血原発性細胞(CB107、CB108およびCB109)に対して分析された。アイソタイプ発現が背景として計測された。アイソタイプピークの右側のピークはドーパミン受容体(DR)マーカーのポジティブ発現を意味する。
一連のドーパミン受容体刺激薬、D3−遮断薬、DR1&5−遮断薬および多重受容体遮断薬が3つのAML細胞系HL−60、OCI−AML2、OCI−AML3に対する細胞毒性に関して試験された。試験は事例1の設定に従って実行された。
原発性AML細胞においてドーパミン受容体サブタイプの発現が分析された。AML患者から得られた原発性AML細胞はDRサブタイプおよびCD14に特異な抗体を、フローサイトメトリを使用した分析の前に含んだ。大多数のDR+細胞はCD14ポジティブであることが判った。
正常な幹細胞(SC)に影響することなく癌幹細胞(CSC)を標的にする薬剤の識別は、将来の癌治療にとって理想的であるが、しかし膨大な生物学的スクリーンを受容できるヒトの癌幹細胞(CSC)及び正常な幹細胞の両方の検定法がないため、制限されている。以下の事例で述べるように、腫瘍性vs正常ヒト多能性幹細胞(hPSC)分化プラットフォームを使用して、非毒性であり、癌幹細胞(CSC)の腫瘍性自己再生に打ち勝つための分化を誘発する、化合物が識別される。識別された抗癌幹細胞(CSC)薬剤の幾つかの候補の内、承認された抗精神病薬であるチオリダジンは、生体内(in vivo)で白血病を開始する能力のあるヒト体細胞系癌幹細胞(CSC)を選択的に標的とすることができ、一方で正常血液幹細胞(SC)の能力には影響を与えなかった。チオリダジンによるドーパミン受容体(DR)シグナリングの遮断は癌幹細胞(CSC)の選択的標的化の基礎をなし、そしてドーパミン受容体(DR)が造血性腫瘍および乳癌由来の癌幹細胞(CSC)のバイオマーカーであることを明らかにした。
(腫瘍性ヒト多能性幹細胞(hPSC)EOS−GFP系の生成)
腫瘍性v1H9またはv2H9ヒト多能性幹細胞(hPSC)(Werbowetski−Ogilvie他、2009)がDr James Ellisにより提供されたEOS−C3+EOS−S4+ベクタ−を運ぶレンチウィルスを形質導入された(Hotta他、2009)。レンチウィルス形質導入の後、細胞はピューロマイシンを使用して選択され、そしてその後FASCAria II(Becton−Dickinson)を使用した緑色蛍光タンパク質(GFP)発現に基づき、単一細胞として96ウェルプレートにソートされた。単一細胞クローンから形成されたコロニーは、v1H9−Oct4−GFP(EOS−C3+),v2H9−Oct4−GFP(EOS−C3+)およびv1H9−Sox2−GFP(EOS−S4+)系を確立するのに使用された。
H9ヒト胚性幹細胞(hESC),v1H9,v1H9−Oct4−GFP,v2H9−Oct4−GFP,v1H9−Sox2−GFPおよび線維芽細胞由来人工多能性幹細胞(iPSC)は前述のように培養された。(Chadwick他2003;Werbowetski−Ogilvie他、2009)
AML標本のため、末梢血および/または骨髄が臨床的プレゼンテーション時に収集された。健康な造血性細胞がへその緒の臍帯血試料から得られた。全ての試料は研究倫理委員会(Research Ethics Board)承認済みプロトコルに従うインフォームドコンセントに従い、マックマスター大学(McMaster University)およびロンドン健康科学センターで採取された。ヒト乳癌試料は、乳房縮小手術から、研究倫理委員会承認済みプロトコルに従うインフォームドコンセントに従い、マックマスター大学で採取された。
化学スクリーンは,ウェル当り5,000細胞で8ng/mlの塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)を追加されたマウス胚性線維芽細胞条件培地(MEFCM)内に植えつけられたv1H9−Oct4−GFP細胞を含んだ。24時間後、培地は化合物10μMおよび0.1%DMSO,0.1%DMSO(−BMP4)またはBMP4100ng/mlおよび0.1%DMSO(+BMP4)を含むMEFCMと48時間に亘って交換され、その後化合物を含む新鮮な培地に24時間に亘って交換された(合計化合物処置72時間)。その後固定され自動画像化及びプレート読み取り機分析のために調製された。コンフルエントなH9及び線維芽細胞由来人工多能性幹細胞(iPSC)が10,000細胞/ウェルで8ng/mlの塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)を追加されたMEFCM内に植えつけられた。24時間後細胞は化合物10μMおよび0.1%DMSO,0.1%DMSO(−BMP4)またはBMP4100ng/mlおよび0.1%DMSO(+BMP4)で処置された。化合物を加えられた新鮮なMEFCMが毎日5日間にわたって交換された。5日目にヒト多能性幹細胞(hPSC)は固定され、自動画像化及びプレート読み取り機分析のために調製された。更なる詳細は補足的実験手順参照。
400,000のH9ヒト多能性幹細胞(hPSC)またはv1H9−Oct4−GFPがオス非肥満糖尿病(NOD)/重症複合免疫不全(SCID)マウスの精巣内に注入され、そして奇形腫がOct4について前述のように(Werbowetski−Ogilvie他、2009)分析された。
NOD.Cg−PrkdcScidIl2rgtm1wjl/SzJ成体マウス(NSGマウス)が移植24時間前に315ラドで亜致死性に放射線照射された。化合物またはDMSO溶媒で24時間処置された0.8−1.0x107AML単球細胞(MNC)または1.5−1.8x105系統枯渇へその緒臍帯血(CB lin−)造血性細胞が尾静脈経由で注入された(静脈内注射(IV))。6−10週間後、動物は殺傷され、そして骨髄と脾臓がヒト細胞の存在についてフローサイトメトリで分析され(LSRII、BD)そしてデータはFlowJoソフトウェア(Tree Star Inc) を使用して分析された。2次的ヒト多能性幹細胞(hPSC)移植に対しては、系統枯渇へその緒臍帯血(CB lin−)生着からの同一数の移植ヒト細胞が、前述のように成体放射線照射NSGマウスに静脈内注射(IV)で注入された。
データは平均値±平均値の標準誤差または平均値±標準偏差で表わされる。グループ間の有意の差異は独立2方向または1方向t検定を使用して決定された。
H9ヒト胚性幹細胞(hESC),v1H9,v1H9−Oct4−GFP,v2H9−Oct4−GFP,v1H9−Sox2−GFPおよび線維芽細胞由来人工多能性幹細胞(iPSC)は8ng/mlのbFGF(GIBCO 13256−02)を追加されたマウス胚性線維芽細胞条件培地(MEFCM)を有するMatrigel(登録商標)コートされた(BD Bioscience 353234)プレート上で培養された。MEFCMはKO−DMEM(GIBCO10829−018),20%KO−血清代替(GIBCO10828−028),1%非必須アミノ酸(GIBCO11140−050)、1mM L−グルタミン、0.11mM βメルカプトエタノール(Sigma Aldrich M7522)から構成される。細胞系は100ユニット/mLのCollagenase IV(GIBCO17104−019)を2−3分間使用して7日ごとに継代された。細胞蒔き密度、検定法継続期間、および96ウェル内のDMSO溶媒濃度は、v1H9−Oct4−GFP細胞および正常H9ヒト胚性幹細胞(hESC)に対して最適化された。v1H9−Oct4−GFPに対しては、最適初期細胞蒔き密度は72時間処置に対し5,000細胞/ウェルがGFP最大レベルと±BMP4対照間のz’識別に基づいて選択された。正常ヒト胚性幹細胞(hESC)に対しては、最適細胞蒔き密度10,000細胞/ウェルが最大z’―プライム識別に基づいて選択された。
単核細胞がFicoll−Paqueプレミアム(GEヘルスケア)を使用して調製された。造血性細胞に対しては、EasySep(StemCell テクノロジーズ)を使用して系統枯渇化がメーカーの推奨に従って実施された。
AML細胞系、即ち、OCI−AML2(M4),OCI−AML3(M4),HL−60(M2)およびMV−4−11(M5)は5%過熱―非活性ウシ胎児血清(FBS)(HyClone)を加えたロズウェルパーク記念研究所培地(RPMI)(Gibco)内で培養された。R(+)−7−ヒドロキシ−DPATハイドロブロマイド(Sigma)でのドーパミン受容体(DR)刺激薬研究に対しては、ウシ胎児血清(FBS)内のドーパミンの蔓延のため(Little他,2002)、無血清条件が適用された。AML患者芽細胞が5%過熱非活性化ウシ胎児血清(FBS)(HyClone)、5ng/mL IL3(R&D systems),5x10−5M βメルカプトエタノール(Sigma)およびBIT(StemCell タクノロジーズ)を加えたイスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)内で培養された。ヒト幹細胞(HSC)培地は1%ウシ血清アルブミン(BSA)(Sigma)、100ng/mL Flt−3L(R&D systems) 20ng/mL トロンボポエチン(TPO)(R&D systems)を加えたイスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)を含んだ。患者のヒト多能性幹細胞(hPSC)および急性骨髄性白血病(AML)試料は化合物またはDMSO溶媒(0.1%)で24時間処置され、その後コロニー形成単位(CFU)プレーティングや異種移植研究が実施された。
免疫細胞化学に使用された抗体は以下の通り:Oct3/4(BD Trunsduction Laboratories,cat#611203),Sox2(R&D, cat#AF2018)。ヒト造血性細胞を検知するため、Pacific Blue−,フィコエリトリン(PE)−,アロフィコシアニン(APC)−またはフルオレセインイソチオシアネート(FITC)ラベル付きの抗ヒトCD45が使用された(BD Bioscience)。FITC抗CD33、PE抗CD13、FITC抗CD41a,FITC抗ヒト白血球抗原(HLA)ドーパミン受容体(DR),PE抗CD19抗体はBD Pharmingenより入手した。PE抗CD14,PE抗CD15およびPE抗GlyAはImmunotech Beckman Coulterより入手した。多能性を測定するため、PE抗SSEA2(BD Bioscience)およびPE−またはAlexaFluor488抗Oct4(BD Bioscience)が使用された。ウサギ抗ヒトドーパミン受容体抗体DRD1(Cat#324390),DRD2(Cat#324393),DRD3(Cat#324402),DRD4(Cat#324405),DRD5(Cat#324408),はEMD Chemicalより入手した。抗ウサギAlexa−Fluor−488(Molecular Probes)は2次抗体として使用された。Cell Signalling Technologyより入手した原発性抗p53(Cat#2527)および抗p21(Cat#2947)ウサギ免疫グロブリンG(IgG)は固定され透過処理された細胞を染色するのに使用された。抗ウサギAlexa−Fluor−546(Molecular Probes)は2次抗体として使用された。乳癌染色のため、APC抗CD44およびPE−CD24がBD Pharmingenより入手された。
(腫瘍性ヒト多能性幹細胞(hPSC)の画像化)
細胞は2%パラホルムアルデヒドで固定され、そして10μg/mLヘキスト33342(Invitogen)でCombi Multidrop Dispenser(Thermo)を使用して染色された。Oct4免疫細胞学に関する実験のためには、Oct4用モノクローナル抗体(BD)がAlexs−Fluor−6472次抗体(Invitogen)と共に使用された。免疫細胞学的染色はJanus自動液体ハンドラー(Perkin Elmer)を使用した。画像は10xN.AでArrayscan HCS VTIリーダー(Cellomics)を使用して、落射蛍光照明および標準フィルターセットの手段により獲得された。
細胞は2%パラホルムアルデヒドで固定され、そして10μg/mLヘキスト33342(Invitrogen)で染色された。標準的蛍光発光免疫細胞化学技術が、細胞をOct4用モノクローナル抗体(BD)およびAlexs−Fluor−647 2次抗体(Invitogen)で染色するのに使用された。全ての工程はJanus 自動液体ハンドラー(Perkin Elmer)を使用して実施された。画像は5xでArrayscan HCS VTIリーダー(Cellomics)を使用して、落射蛍光照明および標準フィルターセットの手段により獲得された。
画像分析はAcapellaソフトウェア(Perkin Elmer)のカスタムスクリプトを使用して実施された。細胞核物質はヘキスト信号から区分された。腫瘍性細胞系に関しては物体輝度分析が緑色蛍光タンパク質(GFP)ポジティブ細胞に対してのみ実施された。正常細胞系に関しては、Alexs−Fluor−647ポジティブ細胞が定量された。画像およびウェルレベルのデータはColumbusデータベース(Perkin Elmer)で保存されそして分析され、さらにActivityBase(IDBS)でデータ分析、化合物登録、およびヒット識別が実施された。
特定の条件下の細胞が集められそしてRNAがRNeasyキット(Qiagen)を使用して抽出され,相補DNA(cDNA)がSuperScript III(登録商標)cDNA合成キット(Invitrogen)を使用して生成され、事前増幅およびTaqMan(登録商標)アレイ反応(Applied Biosystems)がメーカー指示通りに実施された。それぞれの処置済み細胞集団の遺伝子発現プロファイルはTaqMan(登録商標)幹細胞多能性アレイカードを使用して、ViiA 7 リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems)上で分析された。各反応試料はアレイカード上のウェルに搭載され、そして336Xgで各1分間2度遠心分離され、密封され、サーマルサイクラーに置かれた。以下のサイクル条件が全てのアレイカードの使用に適用された:45℃で10分間、84℃で10分間、そして(94℃で30秒その後60℃で1分間)のサイクルを40回。アレイデータは18S RNA及びグリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素(GAPDH)に対して正規化され、そしてデータ分析2.0ソフトウェア(Applied Biosystems)を使用して比較された。
AML患者および系統枯渇へその緒臍帯血(CBlin−)細胞が化合物存在下またはDMSO溶媒(0.1%)対照で24時間培養された。AML細胞は50,000細胞/mLでMethocult GF H4434(Stem Cell Technologies)内にプレートされた。系統枯渇へその緒臍帯血(CBlin−)細胞は1,000細胞/mLでMethocult GF H4434(Stem Cell Technologies)内にプレートされた。コロニーは14日間の培養後、標準形態基準を使用してスコア付けされた。
ドーパミン受容体遮断薬(図16B)とドーパミン受容体刺激薬(図16C,D)による72時間処置後のAML−OCI2とAML−OCI3細胞の存在数は、前方散乱および側方散乱クラスタリングにより定義される格子ストラタジーに従って固定容積内のイベントの数を測定することによりカウントされる、7AAD−およびヘキスト+。
ヒト乳癌試料は、乳房縮小手術から、研究倫理委員会承認済みプロトコルに従うインフォームドコンセントに従い、マックマスター大学で採取された。乳癌肉片はハサミおよびメスで小さな断片(1ミリ以下)に切断された。その後、3mLのバーゼン液(0.5Mのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)1mLを1Lの1Xリン酸緩衝食塩水(PBS)に溶解させたもの)および7mLのトリプシン−コラーゲン分解酵素溶液が腫瘍組織1gに対して添加され、そして37℃で30分間恒温放置された。トリプシン−コラーゲン分解酵素溶液はRPMI 1640培地(gibco #11875093),2%ペニシリン/ストレプトマイシン(Invitrogen #15140163),1%ファンギゾン抗真菌薬(Invitrogen #15290018),2%ウシ胎児血清(FBS),3mg/mLコラーゲン分解酵素A(Roche Diagnostics #11088793001)および0.1%の2.5%トリプシン(Gibco #15090)から構成される。その後2%ウシ胎児血清(FBS)を有する同じ容積のRPMI 1640が組織懸諾液に添加された。組織懸諾液は40ミクロンナイロンストレーナー(Falcon#352340)でフィルターされた。上澄みが廃棄されそして細胞ペレットが2%ペニシリン/ストレプトマイシンおよび1%ファンギゾン抗真菌薬を加えた10mL F−12+GlutaMAX Nutrient Mixture Ham 1X(Gibco #31765)に再懸濁された。生存可能細胞が血球計数器およびトリパン(Trypan)ブルー溶液を使用してカウントされ、そしてフローサイトメトリ用に調製された。抗体染色はウサギ抗ヒトドーパミン受容体抗体を含んだ;DRD1(Cat#324390),DRD2(Cat#324393),DRD3(Cat#324402),DRD4(Cat#324405)およびDRD5(Cat#324408)はEMD Chemicalより入手した。そして抗ウサギAlexa−Fluor−488(Molecular Probes)は、2次抗体として、BD Pharmingenから入手したアロフィコシアニン(APC)抗CD44およびフィコエリトリン(PE)−CD24と共に使用された。
発明者らは以前に、生体外(in vitro)および生体内(in vivo)において、末端分化能力の迷走的遮断と共に自己再生および生存の増大を含む腫瘍性の特徴を示す、変異形ヒト多能性幹細胞(hPSC)系について述べた(Werbowetski−Ogilvie他、2009)。体細胞系癌幹細胞(CSC)との機能的特徴の類似性に基づき、腫瘍性ヒト多能性幹細胞(hPSC)が生体外(in vitro)で高含有量高生産性のスクリーニングを許容する、体細胞系癌幹細胞(CSC)の代理物として試験された。スクリーニングプラットフォームは選択的に腫瘍性ヒト多能性幹細胞(hPSC)を標的とし、一方正常hPSCには殆ど影響しない小分子を識別するように開発された。この分化スクリーニングプラットフォームは、体細胞系癌幹細胞(CSC)を選択的に標的とし、一方正常幹細胞(SC)の能力を残す、強力な候補医薬を識別することができる。
Oct4の喪失を検知しそして分化の程度を明らかにするため、チオリダジンとメフロキンに対する応答が、正常(図10A)および腫瘍性(図10B)のヒト多能性幹細胞(hPSC)の両方で、3つの濃度で定量的フローサイトメトリを使用して評価された。乳癌幹細胞の既報告の選択的抑制薬(Gupta他,2009)のサリノマイシンが比較のため含まれた。10μMでは、全ての化合物が細胞数を減少させた。しかし、残存正常ヒト多能性幹細胞(hPSC)内のOct4レベルはBMP4処置で観察されたレベルを下回らなかった(図10A)。これと同一の応答が、明確な成体由来の追加の正常ヒト多能性幹細胞(hPSC)系を代表する線維芽細胞由来ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)で再現され(図11A)、このことは、効果が胚性起源に特異ではないことを示唆した。同じ化合物が腫瘍性ヒト多能性幹細胞(hPSC)の処置に使用された場合、チオリダジンとメフロキン処置は腫瘍性ヒト多能性幹細胞(hPSC)内の細胞数とOct14のレベルの減少をもたらした。チオリダジンだけがOct4のレベルをBMP4分化対照以下に減少させることができ(図10B)、これはチオリダジンが腫瘍性ヒト多能性幹細胞(hPSC)の分化阻害に打ち勝つ能力が有ることを示唆した。この応答を確認するため、全ての化合物の腫瘍性ヒト多能性幹細胞(hPSC)に対する網羅的な投与量応答が実施された(図11B)。
生体外(in vitro)で検知されたAML−芽細胞の抑制が、腫瘍性幹細胞区画に影響する化合物に起因するかを描写するため、機能的に白血病幹細胞(LSC)および造血性幹細胞(HSC)を定義する異種移植研究(Dick,2008)が実施された(図12)。造血性幹―前駆細胞(HSPC)のサリノマイシン(1μM)による処置は造血性生着をほぼ検知不能レベルにまで減少させ(図13A)、そのことはこの化合物がHSPCからの正常造血に干渉することを明示し、そしてこの化合物は所望の抗癌幹細胞(CSC)の選択的標的化を提供する可能性が低いため、さらなる評価から除外された。対照的に、メフロキン(10μM)処置は、僅かな、しかし有意とは言えない、造血性幹細胞(HSC)能力の減少を対照に比較して示した(図12A)。しかしメフロキンはAML白血病幹細胞(LSC)能力の減少には効果が無いことが判り、従って選択的効果が欠如しているため、さらなる評価を中断された(図12C)。
チオリダジンはドーパミン受容体(DR1−5)を介して作用することが知られている(BeaulieuおよびGainetdinov,2011;SeemanおよびLee,1975)。正常幹細胞に比較してヒト癌幹細胞(CSC)に選択的に干渉するチオリダジン作用のメカニズムがドーパミン受容体遮断性を介したものなのかを評価するため、ドーパミン受容体(DR)の細胞表面発現が分析された。現在までに、5つのドーパミン受容体(DR)が識別され、そしてD1ファミリー受容体(D1とD5)とD2ファミリー受容体(D2,D3およびD4)に分けられた(SibleyおよびMonsma,1992)。多能性マーカーSSEA3を発現する正常ヒト多能性幹細胞(hPSC)はドーパミン受容体(DR)発現を欠く(図14Aおよび図15A−B)。対照的に腫瘍性ヒト多能性幹細胞(hPSC)は5種類全てのドーパミン受容体(DR)を発現した(図14B)。観察された腫瘍性ヒト多能性幹細胞(hPSC)に対するドーパミン受容体(DR)の差別的な発現とチオリダジンの選択的抑制は、ドーパミン受容体(DR)シグナリングの抑制が、正常幹細胞(SC)と比較したヒト癌幹細胞(CSC)に対する選択的標的化に役割を果たしている可能性を示唆する。
ヒトAML内のドーパミン受容体(DR)の機能的役割をよりよく理解するため、患者由来の2種類のAML細胞系;AML−OCI2とAML−OCI3が使用された(Koistinen他,2001)。
Claims (40)
- 被験者における急性骨髄性白血病(AML)を処置する方法であって、前記被験者にドーパミン受容体遮断薬を投与するステップを有することを特徴とする方法。
- 前記ドーパミン受容体遮断薬がD2ファミリードーパミン受容体の遮断薬である、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ドーパミン受容体遮断薬がフェノチアジン誘導体または表1に記載される化合物である、ことを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 前記フェノチアジン誘導体がチオリダジンである、ことを特徴とする請求項3に記載の方法。
- 前記急性骨髄性白血病はDR1、DR2、DR3、DR4およびDR5から選択される1種類以上のドーパミン受容体(DR)を発現する細胞を有する、ことを特徴とする請求項1−4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1種類以上のドーパミン受容体(DR)を発現する細胞は、CD14も発現する、ことを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 前記ドーパミン受容体遮断薬が、造血性または正常な幹細胞に比較して優先的に、癌幹細胞の分化を誘発する、ことを特徴とする請求項1−6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記被験者は寛解にある、ことを特徴とする請求項1−7のいずれか1項に記載の方法。
- 癌細胞の増殖を減少させる方法であって、前記癌細胞にドーパミン受容体遮断薬を接触させるステップを有することを特徴とする方法。
- 前記癌細胞は癌幹細胞であり、そして前記癌幹細胞に前記ドーパミン受容体遮断薬を接触させるステップは前記癌幹細胞の分化を誘発する、ことを特徴とする請求項9に記載の方法。
- 前記癌細胞は急性骨髄性白血病(AML)細胞である、ことを特徴とする請求項9または10に記載の方法。
- 前記細胞は生体内(in vivo)または生体外(in vitro)にある、ことを特徴とする請求項9−11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ドーパミン受容体遮断薬がD2ファミリードーパミン受容体の遮断薬である、ことを特徴とする請求項9−12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ドーパミン受容体遮断薬がフェノチアジン誘導体または表1に記載される化合物である、ことを特徴とする請求項9−13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記フェノチアジン誘導体がチオリダジンである、ことを特徴とする請求項14に記載の方法。
- ドーパミン受容体遮断薬での処置に適した癌被験者を識別する方法であって、
前記方法は、前記被験者からの癌細胞試料内で1種類以上のドーパミン受容体の発現を測定するステップを有し、それにより1種類以上のドーパミン受容体を発現する癌細胞を有する被験者が、ドーパミン受容体遮断薬での処置に適していると識別される、
ことを特徴とする方法。 - 前記試料内で1種類以上のドーパミン受容体の発現を測定する前記ステップは、1種類以上のドーパミン受容体をコードするポリヌクレオチドまたはポリペプチドのレベルについて前記試料を試験するステップを有する、ことを特徴とする請求項16に記載の方法。
- 前記1種類以上のドーパミン受容体はDR1、DR2、DR3、DR4およびDR5から選択される、ことを特徴とする請求項16または17に記載の方法。
- 前記1種類以上のドーパミン受容体はD2ファミリードーパミン受容体を含む、ことを特徴とする請求項18に記載の方法。
- 前記癌は白血病または乳癌である、ことを特徴とする請求項16−19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記癌は急性骨髄性白血病(AML)または単球性白血病である、ことを特徴とする請求項20に記載の方法。
- 癌被験者の予後を判定する方法であって、
前記被験者からの試料において、ドーパミン受容体(DR)1、DR2、DR3、DR4およびDR5から選択される1種類以上のバイオマーカーの出現レベルを測定するステップと、そして
前記1種類以上のバイオマーカーの前記出現レベルを対照と比較するステップと、
を有し、
ここにおいて前記1種類以上のバイオマーカーの出現レベルが前記対照と比較して増大していることは、前記被験者が前記対照と比較してより重篤な癌の形態を有することを示唆する、
ことを特徴とする方法。 - 前記試料内で1種類以上のバイオマーカーの発現を測定する前記ステップは、1種類以上のドーパミン受容体をコードするポリヌクレオチドまたはポリペプチドのレベルについて前記試料を試験するステップを有する、ことを特徴とする請求項22に記載の方法。
- 前記バイオマーカーがDR3および/またはDR5である、ことを特徴とする請求項22または23に記載の方法。
- 前記癌は白血病であり、そして前記1種類以上のバイオマーカーの出現レベルが前記対照と比較して増大していることは、前記対照と比較してより重篤な白血病の形態を示唆する、ことを特徴とする請求項22−24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記白血病は急性骨髄性白血病(AML)または単球性白血病である、ことを特徴とする請求項25に記載の方法。
- 白血病被験者を識別する方法であって、
前記被験者からの白血球細胞の試料において、ドーパミン受容体(DR)1、DR2、DR3、DR4およびDR5から選択される1種類以上のバイオマーカーの出現レベルを測定するステップと、そして
前記1種類以上のバイオマーカーの出現レベルを対照と比較するステップと、
を有する、ことを特徴とする方法。 - 前記1種類以上のドーパミン受容体の出現レベルが前記対照と比較して増大していることは、前記被験者が白血病であることを示唆する、ことを特徴とする請求項27に記載の方法。
- 前記白血病は急性骨髄性白血病(AML)または単球性白血病である、ことを特徴とする請求項28に記載の方法。
- 抗癌活性について化合物をスクリーニングする方法であって、
1種類以上のドーパミン受容体を遮断する化合物を識別するステップを有し、
ここにおいてドーパミン受容体を遮断する化合物は抗癌活性を有するとして識別される、ことを特徴とする方法。 - 前記抗癌活性は、乳癌細胞、急性骨髄性白血病(AML)細胞または単球細胞の増殖の減少を含む、ことを特徴とする請求項30に記載の方法。
- 癌幹細胞を細胞集団から識別する方法であって、
細胞がドーパミン受容体(DR)1、DR2、DR3、DR4およびDR5から選択される1種類以上のバイオマーカーを出現するか否かを判定するステップを有し、
ここにおいて前記1種類以上のバイオマーカーの出現は前記細胞が癌幹細胞であることを示唆する、
ことを特徴とする方法。 - 前記細胞集団は哺乳類から単離された細胞か、または組織培養内の細胞である、ことを特徴とする請求項32に記載の方法。
- 前記細胞集団は多能性幹細胞を有する、ことを特徴とする請求項32または33に記載の方法。
- 前記細胞集団は白血病細胞または乳癌細胞のような癌細胞または前癌細胞を有する、ことを特徴とする請求項32−34のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞集団は血液系癌細胞を有する、ことを特徴とする請求項32−35のいずれか1項に記載の方法。
- 細胞が1種類以上のバイオマーカーを出現するか否かを判定するステップは、DR1、DR2、DR3、DR4またはDR5をコードするポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現について前記細胞を試験するステップを有する、ことを特徴とする請求項32−36のいずれか1項に記載の方法。
- DR1、DR2、DR3、DR4およびDR5を発現する細胞は、癌幹細胞と識別される、ことを特徴とする請求項32−37のいずれか1項に記載の方法。
- 前記癌幹細胞を前記細胞集団から単離するステップをさらに有する、ことを特徴とする請求項32−38のいずれか1項に記載の方法。
- 前記癌幹細胞を前記細胞集団から単離するステップは、フローサイトメトリ、蛍光標識細胞分取、パニング、親和性カラム分離、または磁気選別を有する、ことを特徴とする請求項39に記載の方法。
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