ES2639555T3 - Ensayos de detección para identificación y validación de agentes que se direccionan a células madre de cáncer - Google Patents

Ensayos de detección para identificación y validación de agentes que se direccionan a células madre de cáncer Download PDF

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Abstract

Un método para identificar y validar un agente de prueba como un agente selectivo de células madre anticáncer, comprendiendo el método: i) poner en contacto una o más variantes de células madre neoplásicas con el agente de prueba y una o más células madre normales con el agente de prueba; ii) detectar un cambio en el recuento de células de las variantes de células madre neoplásicas en respuesta al agente de prueba, y detectar un cambio en el recuento de células de las células madre normales en respuesta al agente de prueba; iii) identificar el agente de prueba como un agente selectivo contra células madre de cáncer si el contacto con el agente de prueba induce una disminución en el recuento de células de las variantes de células madre neoplásicas sin inducir una disminución comparable en las células madre normales; y opcionalmente iv) poner en contacto las variantes de células madre neoplásicas y las células madre normales con el agente de prueba en una pluralidad de concentraciones de prueba y detectar un cambio en el recuento de células para una o más variantes de células madre neoplásicas y para las células madre normales en la pluralidad de las concentraciones de prueba; en donde el cambio en el recuento de células para las variantes de células madre neoplásicas se detecta entre aproximadamente 48 horas y 96 horas después de poner en contacto las células con el agente de prueba y se detecta el cambio en el recuento de células para las células madre normales entre aproximadamente 4 días y 6 días después de poner en contacto las células con el agente de prueba.

Description

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DESCRIPCION
Ensayos de deteccion para identificacion y validacion de agentes que se direccionan a celulas madre de cancer Campo de la divulgacion
La invencion se refiere a un metodo para identificar y validar un agente de prueba como un agente selectivo de celulas madre anticancer, comprendiendo el metodo: i) poner en contacto una o mas variantes de celulas madre neoplasicas con el agente de prueba y una o mas celulas madre normales con el agente de prueba; ii) detectar un cambio en el recuento de celulas de las variantes de celulas madre neoplasicas en respuesta al agente de prueba, y detectar un cambio en el recuento de celulas de las celulas madre normales en respuesta al agente de prueba; iii) identificar el agente de prueba como un agente selectivo contra celulas madre de cancer si el contacto con el agente de prueba induce una disminucion en el recuento de celulas de las variantes de celulas madre neoplasicas sin inducir una disminucion comparable en las celulas madre normales; y opcionalmente iv) poner en contacto las variantes de celulas madre neoplasicas y las celulas madre normales con el agente de prueba en una pluralidad de concentraciones de prueba y detectar un cambio en el recuento de celulas para una o mas variantes de celulas madre neoplasicas y para las celulas madre normales en la pluralidad de las concentraciones de prueba; en donde el cambio en el recuento de celulas para las variantes de celulas madre neoplasicas se detecta entre aproximadamente 48 horas y 96 horas despues de poner en contacto las celulas con el agente de prueba y se detecta el cambio en el recuento de celulas para las celulas madre normales entre aproximadamente 4 dfas y 6 dfas despues de poner en contacto las celulas con el agente de prueba. Tambien se discuten metodos para el pronostico o tratamiento de cancer y metodos de deteccion y particularmente metodos para el pronostico o tratamiento de cancer que se dirigen a receptores de dopamina y metodos de deteccion para la identificacion y validacion de agentes que se dirigen a celulas madre de cancer.
Antecedentes de la divulgacion
Las crecientes evidencias sugieren que el desarrollo de un cancer/tumor se debe a una rara poblacion de celulas, denominadas celulas madre de cancer (CMC) (Dick, Jordan, 2009, Reya et al., 2001) que son unicamente capaces de iniciar y sostener la enfermedad. Ademas, la evidencia experimental indica que los quimioterapeuticos convencionales, caracterizados por su capacidad para inhibir la proliferacion celular de lmeas celulares de cancer (Shoemaker, 2006) o reducir la carga tumoral en modelos murinos (Frese y Tuveson, 2007), son ineficaces contra CMC humanas (Guan et al. al., 2003, Li et al., 2008). Esta resistencia a los quimioterapeuticos esta acompanada de una citotoxicidad indiscriminada que a menudo afecta a las celulas madre y progenitoras sanas, lo que conduce a la restriccion de dosis y requiere un tratamiento de soporte (Smith et al., 2006). Ejemplos recientes a lo largo de estas lmeas incluyen la induccion selectiva de apoptosis (Gupta et al., 2009, Raj et al., 2011) que aun debe ser probada en SC normales y en el sistema humano. Por consiguiente, la identificacion de agentes que se dirigen solamente a las CMC es ahora cntica para proporcionar farmacos anticancengenos verdaderamente selectivos para las pruebas preclmicas.
Las SC normales y neoplasicas se definen funcionalmente mediante un equilibrio estrechamente controlado entre el potencial de autorrenovacion frente a la diferenciacion. En el caso de CMC, este equilibrio se desplaza hacia una autorrenovacion y supervivencia mejoradas que conduce a una limitada capacidad de diferenciacion que eventualmente permite el crecimiento de tumores. En contraste con los efectos toxicos directos que afectan igualmente a las SC normales, un enfoque alternativo para erradicar las CMC es mediante la modificacion de este equilibrio a favor de la diferenciacion en un esfuerzo por agotar la poblacion de CMC. La identificacion de moleculas que se dirigen selectivamente a CMC somaticas mientras se ahorra la capacidad de SC sanas sena por lo tanto util para el desarrollo de nuevos tratamientos diagnosticos y terapeuticos para dirigirse selectivamente a CMC humanas.
Se han descrito metodos para descubrir compuestos anticancengenos que tienen un efecto selectivo sobre celulas cancerosas en comparacion con el efecto de los compuestos sobre celulas normales (documento US 6.180.357) en los que se han descubierto farmacos anti-CMC. Sin embargo, la identificacion de las CMC requiere avances en tecnologfa. Se requieren diversos avances para descubrir compuestos selectivos anti-CMC. Algunos de ellos incluyen el crecimiento de un numero suficientemente alto tanto de CMC como de celulas madre normales (NSC), teniendo estas celulas que permanecer en estado no diferenciado, teniendo celulas madre que son suficientemente robustas para un cribado de alto rendimiento que incluye manipulacion robotica, dispensacion de soluciones, transporte y desarrollo de los puntos finales de celulas madre relevantes adecuados para el cribado de alto rendimiento. El numero de celdas disponibles para alto rendimiento es una limitacion tecnica importante. El aislamiento primario es desafiante ya que las celulas madre son raras in vivo y por lo tanto el cultivo de celulas madre permite la amplificacion del numero de celulas madre disponibles. Las celulas madre en cultivo tienden a diferenciarse y no conservan sus caractensticas de celulas madre en cultivo. Un ejemplo de la diferencia entre el cultivo de celulas madre y el cultivo de celulas en general es que el cultivo de celulas madre requiere condiciones libres de antibioticos para evitar la diferenciacion. La limitacion del numero de celulas es evidente en Kondo (WO2006051405A2) ya que la seleccion de poblaciones laterales (como sustituto de una CMC) por Hoechst 3334 es limitante, dado que este colorante es toxico para las celulas madre (Machalinski et al., 1998). En el cultivo a granel, como se describe en Kondo, una poblacion lateral forma dos poblaciones de celulas, una poblacion lateral y una
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poblacion no lateral de celulas. El cultivo no mantiene un grupo puro de celulas de poblacion lateral y requiere el reaislamiento de la poblacion lateral con Hoechst 3334 disminuyendo as^ el numero de celulas. Esta cuestion tambien impide la determinacion de los puntos finales de las celulas mixtas en el cultivo, ya que una poblacion pura no puede ser controlada directamente. Ademas, el subcultivo y el analisis de subpoblaciones no es posible porque el cultivo de celulas crea poblaciones mixtas. Aunque Kondo reivindica metodos para descubrir compuestos selectivos de CMC, la incapacidad para mantener poblaciones de celulas puras, la demostracion de los efectos celulares normales por los mismos compuestos y su comparacion con la poblacion lateral descrita como un modelo de CMC en forma de alto rendimiento es una limitacion del estado actual de la tecnica para descubrir farmacos selectivos de CMC.
Del mismo modo, Tyers (documento US 8.058.243), ilustra otras limitaciones en el estado actual de la tecnica. Tyers divulga un ensayo de neuroesferas clonogenicas para identificar moduladores potentes y/o selectivos de proliferacion, diferenciacion y/o renovacion de celulas precursoras neurales, celulas progenitoras neurales y/o celulas madre neurales autorrenovables y multipotentes. El cribado se dirigio a compuestos activos en un ensayo de celulas madre, y no necesariamente dirigidos a CMC. El cribado opuesto fue una lmea de celulas de astrocitos en lugar de una lmea de celulas madre normales, de modo que el cribado opuesto detecta celulas madre frente a la actividad celular diferenciada en lugar de una actividad selectiva de CMC frente a NSC. A partir de los compuestos activos, se divulgaron ensayos de un subconjunto de doce (12) celulas contra celulas precursoras de meduloblastoma que se enriquecen para CMC, pero no son una poblacion pura de CMC. El descubrimiento de compuestos anti-CMC se baso en la busqueda de compuestos activos contra celulas neuroesferas y pruebas adicionales. Dado que las neuroesferas contienen celulas madre y celulas progenitoras del linaje neural, la facilidad para descubrir compuestos selectivos anti-CMC se excluye porque el primer paso de su cribado esta dirigido a celulas madre normales. Por lo tanto, en Tyers el desaffo de descubrir compuestos anti-CMC a traves de alto rendimiento es evidente ya que ensenan a identificar compuestos de celulas madre activas primero mediante un cribado de alto rendimiento, probando luego un subconjunto sobre celulas enriquecidas con CMC.
Las neoplasias malignas hematologicas son tipos de cancer que afectan a la sangre, la medula osea y los ganglios linfaticos. Las neoplasias malignas hematologicas pueden derivarse de cualquiera de los dos principales linajes de celulas sangumeas: las lmeas celulares mieloides y linfoides. Ejemplos de neoplasias malignas mieloides incluyen leucemia mieloide aguda y leucemia mieloide cronica.
Aunque las neoplasias malignas mieloides generalmente se consideran que todas surgen de precursores del linaje mieloide en la medula osea, son altamente divergentes en su presentacion, patologfa y tratamiento. Por ejemplo, la clasificacion de la Organizacion Mundial de la Salud de 2008 para las neoplasias mieloproliferativas (vease Tefferi et al., Cancer, 1 de septiembre, pp. 3842-3847 (2009); tambien Vannucchi et al., Advances in Understanding and Management of Myeloproliferative Neoplasms CA Cancer J. Clin. 2009, 59: 171-191), identifica 5 esquemas de clasificacion diferentes para neoplasias mieloides y coloca la leucemia mieloide aguda (LMA) en una categona separada de la leucemia mielogena cronica (LMC) y otras neoplasias mieloproliferativas. Ademas, la LMC se caracteriza a menudo por contener la translocacion de BCR-Abl que esta ausente en la LMA. Los tratamientos preferidos para leucemias, tales como neoplasias malignas mieloides, apuntanan a celulas leucemicas sin afectar indebidamente a las poblaciones de celulas madre hematopoyeticas.
La tioridazina es un antagonista del receptor de dopamina que pertenece al grupo de farmacos de fenotiazina y se utiliza como un antisicotico. Ha estado en uso clmico desde 1959, sin embargo, debido a preocupaciones sobre cardiotoxicidad y retinopatfa en dosis altas, este farmaco no se prescribe comunmente, y esta reservado para pacientes que no han respondido o tienen contraindicaciones para los antisicoticos mas ampliamente utilizados. Se ha informado que los pacientes esquizofrenicos que reciben medicacion antagonista del receptor de dopamina en dosis consideradas eficaces para la esquizofrenia tienen una incidencia reducida de cancer de recto, colon y prostata en comparacion con la poblacion general.
Sean et al. (Blood, vol. 119, no. 5, pp. 1200-1207) describe una estrategia de cribado de moleculas pequenas (2011) que descubre la eficacia terapeutica del ribosido de kinetina. Guzman et al. (Blood, vol. 105, no. 11, pp 4163-4169, 2005) indica que la lactona sesquiterpenica partenolido induce la apoptosis de las celulas madre y progenitoras de la leucemia mielogena aguda humana.
Existe una necesidad de nuevos metodos para la identificacion y validacion de agentes que se dirigen a celulas madre de cancer.
Resumen de la divulgacion
El alcance de la invencion esta definido por las reivindicaciones y cualquier objeto que no cae dentro del alcance de las reivindicaciones no forma parte de la invencion, sino que solo sirve como informacion de los antecedentes para comprender mejor la invencion.
En un aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para identificar y validar un agente de prueba como un agente selectivo de celulas madre anticancer, comprendiendo el metodo: i) poner en contacto una o mas variantes
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Convenientemente, el metodo puede comprender ademas antes de la etapa i) detectar un cambio en la pluripotencia y un cambio en el recuento de celulas de variantes de celulas madre neoplasicas en respuesta al contacto con el agente y seleccionar un agente como agente de prueba si el agente induce una perdida de pluripotencia y/o una disminucion en el recuento de celulas de las variantes de celulas madre neoplasicas.
Convenientemente, la pluralidad de concentraciones de prueba puede variar en al menos aproximadamente 3, 4 o 5 ordenes de magnitud, o la pluralidad de concentraciones puede variar al menos desde aproximadamente 0,01 pM a 2 pM, o al menos de aproximadamente 10 nM hasta aproximadamente 20 pM, o la pluralidad de concentraciones de prueba puede comprender al menos una serie de diluciones de 8 puntos.
De manera adecuada, la etapa de identificar el agente de prueba como un agente selectivo contra celulas madre de cancer puede comprender comparar una curva de respuesta a la dosis para el cambio en el recuento de celulas de las variantes de celulas madre neoplasicas en respuesta al contacto con el agente de prueba a la pluralidad de concentraciones de prueba a una curva de respuesta a la dosis para el cambio en el recuento de celulas de las celulas madre normales en respuesta al contacto con el agente de prueba a la pluralidad de concentraciones de prueba, opcionalmente puede comprender ademas determinar para el agente de prueba un valor concentracion efectiva maxima para el 50% (CE50) para la disminucion en el recuento de celulas para las variantes de celulas madre neoplasicas y un valor de CE50 para la disminucion en el recuento de celulas en las celulas madre normales, opcionalmente puede comprender ademas la determinacion de una relacion del valor de CE50 para la disminucion en el recuento de celulas para las celulas madre normales en relacion con el valor de CE50 para la disminucion en el recuento de celulas para las variantes de celulas madre neoplasicas, opcionalmente en donde el agente de prueba puede identificarse como un agente selectivo contra celulas madre de cancer si la relacion de los valores de CE50 es mayor que 3.
Adecuadamente, las variantes de celulas madre neoplasicas pueden sembrarse en un primer receptaculo a razon de aproximadamente 3.000 a 7.000 celulas por receptaculo y las celulas madre normales pueden sembrarse en un segundo receptaculo a razon de aproximadamente 8.000 a 12.000 celulas por receptaculo, opcionalmente en donde las variantes de celulas madre neoplasicas pueden ser sembradas a razon de aproximadamente 4.000 a 6.000 celulas por receptaculo, opcionalmente alrededor de 5.000 celulas por receptaculo, opcionalmente en donde las celulas madre normales pueden ser sembradas a razon de aproximadamente 9.000 a 11.000 celulas por receptaculo, opcionalmente alrededor de 10.000 celulas por receptaculo.
Convenientemente, el primer receptaculo y el segundo receptaculo pueden ser pozos en la misma placa de microtitulacion o en pozos en placas de microtitulacion separadas, opcionalmente en donde la placa de microtitulacion puede ser una placa de microtitulacion de 96 pozos, opcionalmente una placa de microtitulacion recubierta de 96 pozos.
De manera adecuada, el cambio en el recuento de celulas para las variantes de celulas madre neoplasicas puede detectarse entre aproximadamente 72 horas despues de ponerse en contacto las celulas con el agente de prueba y el cambio en el recuento de celulas para las celulas madre normales puede detectarse entre aproximadamente 5 dfas despues poner en contacto las celulas con el agente de prueba; o adecuadamente el cambio en el recuento de celulas para las variantes de celulas madre neoplasicas puede detectarse entre aproximadamente 48 horas y 96 horas despues de ponerse en contacto las celulas con el agente de prueba, opcionalmente aproximadamente 72 horas, y el cambio en el recuento de celulas para las celulas madre normales puede ser detectada entre aproximadamente 4 dfas y 6 dfas despues de poner en contacto las celulas con el agente de prueba, opcionalmente aproximadamente 5 dfas, y el cambio en la pluripotencia para las variantes de celulas madre neoplasicas puede detectarse entre 48 y 96 horas despues de ponerse en contacto las variantes de celulas madre neoplasicas con el agente de prueba, opcionalmente, aproximadamente 72 horas despues de poner en contacto las variantes de celulas madre neoplasicas con el agente de prueba.
Convenientemente, las variantes de celulas madre neoplasicas pueden ser celulas madre pluripotentes humanas transformadas (CMPht), opcionalmente celulas v1 H9-Oct4-GFP o celulas madre pluripotentes inducidas
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transformadas, (CMPit).
Convenientemente, las celulas madre normales pueden ser celulas madre pluripotentes, o celulas madre pluripotentes inducidas, o celulas madre pluripotentes inducidas derivadas de fibroblastos.
Convenientemente, el metodo puede comprender ademas el cribado del agente de prueba identificado como un agente selectivo contra celulas madre de cancer para la actividad en una lmea celular de cancer derivada de un sujeto con cancer, opcionalmente en donde la lmea celular de cancer es una lmea celular leucemica, opcionalmente una lmea celular de leucemia mieloide aguda (LMA).
Convenientemente, la actividad puede ser citotoxicidad, induccion de apoptosis, perdida de pluripotencia, induccion de diferenciacion, o combinaciones de los mismos.
Convenientemente, el metodo puede comprender adicionalmente antes de la etapa i) cribar uno o mas agentes para identificar uno o mas agentes de prueba que inducen perdida de pluripotencia y una disminucion en el recuento de celulas de variantes de celulas madre neoplasicas, que comprende opcionalmente antes de la etapa i) poner en contacto las variantes de celulas madre neoplasicas con el agente, detectar un cambio en la pluripotencia y un cambio en el recuento de celulas de las variantes de celulas madre neoplasicas en respuesta al agente y seleccionar un agente como agente de prueba si el agente induce una perdida de pluripotencia y una disminucion en el recuento de celulas de las variantes de celulas madre neoplasicas, opcionalmente en donde las variantes de celulas madre neoplasicas se ponen en contacto con el agente a aproximadamente 10 pM.
Adecuadamente, la pluralidad de agentes se puede cribar en una placa de microtitulacion e identificarse como agentes de prueba basandose en una desviacion estandar umbral respecto a la media, opcionalmente un umbral de una puntuacion Z de al menos 3 desviaciones estandar respecto a la media, opcionalmente de la media en toda la placa para el cambio en la pluripotencia y el cambio en el recuento de celulas.
Convenientemente, las variantes de celulas madre neoplasicas pueden tratarse con la protema morfogenica osea 4 (BMP4) para inducir la perdida de pluripotencia se usan como un control positivo, opcionalmente en donde las celulas se tratan con al menos 100 ng/mL de BMP4.
De manera adecuada, el cambio en la pluripotencia de las variantes de celulas madre neoplasicas puede detectarse detectando un cambio en el nivel de expresion de uno o mas marcadores de pluripotencia, opcionalmente en donde la deteccion de la expresion de uno o mas marcadores de pluripotencia comprende el uso de anticuerpos selectivos para los uno o mas marcadores de pluripotencia, opcionalmente en donde la expresion de uno o mas marcadores de pluripotencia en una o mas variantes de celulas madre neoplasicas esta unida operativamente a un gen informador, opcionalmente en donde el marcador de pluripotencia se selecciona de Oct4 y Sox2, opcionalmente en donde el marcador de pluripotencia se selecciona de Oct4, Sox2, Nanog, SSEA3, SSEA4, TRA-1 -60, TRA-1-81, receptor de IGF1, conexina 43, E-cadherina, fosfatasa alcalina, REX1, CRIPTO, CD24, CD90, CD29, CD9 y CD49f, y mezclas de los mismos.
El descubrimiento de farmacos dirigidos a CMC se puede abordar a traves de varias metodologfas. La maquinaria molecular que distingue una CMC de una celula madre normal no esta bien dilucidada. Hay marcadores que pueden estar asociados con CMC, pero hay una escasez de tales marcadores, y no necesariamente pueden ser objetivos para el descubrimiento de farmacos. Ademas, la seleccion de compuestos que se dirigen a celulas madre y potencialmente pueden agotar la combinacion de celulas madre a traves de la induccion de la diferenciacion o reducir su numero a traves de una variedad de mecanismos, necesita ser selectiva para evitar los mismos efectos sobre las celulas madre normales, resultando en toxicidad indebida de tratamiento. Por lo tanto, existe la necesidad de una metodologfa para descubrir farmacos que tengan diferentes efectos sobre las CMC en comparacion con otras celulas.
Se proporciona aqrn un metodo que se puede usar para identificar compuestos que exhiben un nivel diferente de actividad biologica o que tienen una selectividad por las CMC en comparacion con otros tipos de celulas tales como celulas madre normales. El metodo utiliza una lmea celular reproducible, que actua como un sustituto, que tiene caractensticas asociadas con la progresion neoplasica, permitiendo de este modo el ensayo de alto rendimiento de miles de compuestos para la actividad contra celulas madre de cancer y denominadas aqrn como celulas madre neoplasicas transformadas. Una lmea celular adecuada para esta prueba se proporciona en el documento PCT/CA2010/001340. El metodo proporcionado aqrn brinda un enfoque multifactorial al proceso de comparacion del efecto de un compuesto sobre una o mas CMC con mas de un valor o resultado predeterminado. Tales resultados pueden determinarse midiendo la muerte celular, la perdida de pluripotencia, morfologfa, recuento de celulas y la respuesta al estres celular, entre otros. Ademas, el presente metodo proporciona el calculo de una relacion de potencia de actividad selectiva (RPAS), definida como la relacion de la CE50 para una celula normal frente a la CE50 de la lmea celular sustituta, que permite al experto seleccionar compuestos objetivo con un nivel de precision mas alto que el permitido anteriormente. Se prefiere la utilizacion de una serie de comparaciones de rangos de dosis, ya que, en cualquier dosis unica o un pequeno intervalo de dosis, la diferencia entre el efecto de los compuestos sobre cada clase de celulas puede no ser evidente. El metodo comprende comparar el efecto de un
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compuesto sobre una o mas CMC tales como variantes de celulas madre neoplasicas con el efecto del compuesto sobre una o mas celulas madre normales. El efecto del compuesto sobre una o mas celulas madre normales se determina experimentalmente poniendo en contacto una o mas celulas madre con el compuesto y detectando el efecto del compuesto en una o mas de las SC, opcionalmente en donde el efecto es indicativo de la actividad biologica del compuesto.
Los inventores han determinado que el uso de un metodo de cribado en dos etapas es particularmente util para identificar y validar agentes selectivos contra celulas madre de cancer. En una primera etapa, los agentes se criban para provocar un cambio tanto en la pluripotencia y/o en el recuento de celulas de variantes de celulas madre neoplasicas como opcionalmente para causar un cambio tanto en la pluripotencia como en el recuento de celulas para seleccionar agentes de prueba. En una segunda etapa, los agentes de prueba seleccionados en la primera etapa como causantes de una reduccion en la pluripotencia y/o conteo celular de variantes de celulas madre neoplasicas se prueban para causar un efecto diferencial en el recuento de celulas de variantes de celulas madre neoplasicas con respecto a celulas madre normales. El uso del metodo de dos etapas proporciona una serie de ventajas sobre los metodos de cribado convencionales y permite la identificacion de agentes selectivos contra celulas madre de cancer que de otro modo podnan clasificarse como no selectivos o no prometedores en metodos de cribado convencionales. Ademas, las celulas madre humanas normales son generalmente mas diffciles de cultivar en cultivo en comparacion con las variantes de celulas madre neoplasicas. Los agentes de cribado en una primera etapa que utilizan celulas madre neoplasicas antes de buscar actividad diferencial usando celulas madre humanas normales reduce el tiempo y los recursos necesarios para identificar y validar agentes selectivos contra celulas madre de cancer. La identificacion de agentes contra celulas madre de cancer que son selectivos aumenta la probabilidad de que aquellos agentes progresen a traves de las etapas de desarrollo de farmacos, ya que existe un menor riesgo de que los agentes afecten a celulas madre normales, disminuyendo asf la probabilidad de efectos secundarios en comparacion con agentes no selectivos.
Los inventores han determinado que la tioridazina es citotoxica para las celulas madre de cancer y en particular las que dan lugar a leucemia mieloide aguda (LMA). Ademas, a concentraciones toxicas para las celulas madre de cancer, se ha encontrado que la tioridazina tiene un efecto relativamente limitado sobre las celulas madre normales, tales como las celulas madre hematopoyeticas. La presente exposicion explora un procedimiento multifactorial para cuantificar la capacidad de compuestos similares a tioridazinas, caracterizados como aquellos que tienen una estructura similar a la tioridazina y que presentan un coeficiente de Tanimoto > 0,6, para tener efectos sobre CMC.
Se descubrio sorprendentemente que de 167 terapias de cancer conocidas o utilizadas actualmente solo el 5% exhibfa efectos contra las CMC. Por lo tanto, la presente invencion satisface una necesidad sentida en la tecnica de proporcionar un metodo para elucidar compuestos que nunca se han utilizado para tratar pacientes clmicamente con cancer, por tener potentes efectos sobre las CMC cuando incluso los compuestos clmicos para el cancer tienen una probabilidad tan baja de tener efectos contra las CMC.
Por consiguiente, en un aspecto de la descripcion se proporciona un metodo para identificar y validar un agente de prueba como un agente selectivo de celulas madre anticancer. El metodo comprende:
poner en contacto una o mas variantes de celulas madre neoplasicas con el agente de prueba y una o mas celulas madre normales con el agente de prueba;
detectar un cambio en el recuento de celulas de las variantes de celulas madre neoplasicas en respuesta al agente de prueba y detectar un cambio en el recuento de celulas de las celulas madre normales en respuesta al agente de prueba; e
identificar el agente de prueba como un agente selectivo contra celulas madre de cancer si el contacto con el agente de prueba induce una disminucion en el recuento de celulas de las variantes de celulas madre neoplasicas sin inducir una disminucion comparable en las celulas madre normales, donde el cambio en el recuento de celulas para las variantes de celulas madre neoplasicas se detecta entre aproximadamente 48 horas y 96 horas despues de poner en contacto las celulas con el agente de prueba y se detecta el cambio en el recuento de celulas para las celulas madre normales entre aproximadamente 4 dfas y 6 dfas despues de ponerse en contacto las celulas con el agente de prueba.
En una realizacion, el metodo comprende detectar un cambio en el recuento de celulas en respuesta al agente de prueba en un cierto numero de diferentes concentraciones de prueba. De acuerdo con esto, en una realizacion, el metodo incluye poner en contacto las variantes de celulas madre neoplasicas y las celulas madre normales con el agente de prueba en una pluralidad de concentraciones de prueba y detectar un cambio en el recuento de celulas para una o mas variantes de celulas madre neoplasicas y para las celulas madre normales a la pluralidad de concentraciones de prueba.
En un aspecto relacionado de la descripcion, se proporciona un metodo de dos etapas para identificar y validar un agente como un agente selectivo contra celulas madre de cancer. En una primera etapa, los agentes identificados como causantes de una perdida de pluripotencia y que provocan una reduccion en el recuento de celulas se
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identifican como agentes de prueba para un analisis posterior en una segunda etapa. En una realizacion, el metodo comprende una primera etapa de deteccion de un cambio en la pluripotencia y un cambio en el recuento de celulas de variantes de celulas madre neoplasicas en respuesta al contacto con el agente y seleccion de un agente como agente de prueba si el agente induce una perdida de pluripotencia y/o una disminucion en el recuento de celulas de las variantes de celulas madre neoplasicas. En una realizacion, el metodo comprende una segunda etapa de poner en contacto una o mas variantes de celulas madre neoplasicas con el agente de prueba y poner en contacto una o mas celulas madre normales con el agente de prueba, detectar un cambio en el recuento de celulas de las variantes de celulas madre neoplasicas en respuesta al agente de prueba, detectar un cambio en el recuento de celulas de las celulas madre normales en respuesta al agente de prueba e identificar el agente de prueba como un agente selectivo contra celulas madre de cancer si el agente de prueba induce una disminucion en el recuento de celulas de las variantes de celulas madre neoplasicas sin inducir una disminucion comparable en las celulas madre normales.
Tambien se ha determinado que los agentes contra celulas madre de cancer presentan curvas complejas de respuesta a la dosis de tal manera que su selectividad y/o actividad no pueden determinarse facilmente extrapolando los resultados de ensayar un agente o agente de prueba usando un numero unico o pequeno de las concentraciones de prueba. Los metodos descritos en el presente documento opcionalmente implican poner en contacto las variantes de celulas madre neoplasicas y/o las celulas madre normales con el agente de prueba en una pluralidad de concentraciones de prueba.
En una realizacion, la pluralidad de concentraciones de prueba vana en al menos aproximadamente 3, 4 o 5 ordenes de magnitud o mas de 5 ordenes de magnitud. En una realizacion, la pluralidad de concentraciones vana al menos desde aproximadamente 0,01 jM a 2 jM, o al menos desde aproximadamente 10 nM hasta aproximadamente 20 |jM. Opcionalmente, la pluralidad de concentraciones de prueba puede ser una serie de dilucion, tal como una serie de dilucion de 8 puntos o de 10 puntos.
En una realizacion, los metodos descritos aqrn implican comparar una curva de respuesta a la dosis para el cambio en el recuento de celulas de las variantes de celulas madre neoplasicas en respuesta al contacto con el agente de prueba en la pluralidad de concentraciones de prueba, con una curva de dosis-respuesta para el cambio en el recuento de celulas de las celulas madre normales en respuesta al contacto con el agente de prueba a la pluralidad de concentraciones de prueba. Una persona experta apreciara que se pueden utilizar una serie de metodos diferentes para comparar curvas de respuesta a la dosis. Por ejemplo, en una realizacion se determina un valor medio de concentracion eficaz maxima (CE50) de un agente de prueba para una disminucion en el recuento de celulas para las variantes de celulas madre neoplasicas, y se determina un valor CE50 para una disminucion en el recuento de celulas en las celulas madre normales.
En una realizacion, se pueden comparar valores de CE50 o mediciones similares para proporcionar una relacion de actividad selectiva para el agente de prueba. Por ejemplo, en una realizacion los metodos incluyen determinar una relacion del valor de CE50 para la disminucion en el recuento de celulas para las celulas madre normales en relacion con el valor CE50 para la disminucion en el recuento de celulas para las variantes de celulas madre neoplasicas. Opcionalmente, los metodos descritos en la presente memoria incluyen ademas identificar un agente de prueba como un agente selectivo contra celulas madres de cancer si la relacion de los valores de CE50 es mayor de 1, 2, 3, 4, 5 o mayor de 5.
En un aspecto de la descripcion, las variantes de celulas madre neoplasicas y/o celulas madre normales se siembran en un receptaculo antes de poner en contacto las celulas con un agente o agente de prueba. En una realizacion, las variantes de celulas madre neoplasicas se siembran en un primer receptaculo de aproximadamente
3.000 a 7.000 celulas por receptaculo y las celulas madre normales se siembran en un segundo receptaculo a razon de aproximadamente 8.000 a 12.000 celulas por receptaculo. En una realizacion, las variantes de celulas madre neoplasicas se siembran a razon de aproximadamente a razon de 4.000 a 6.000 celulas por receptaculo, opcionalmente aproximadamente 5.000 celulas por receptaculo. En una realizacion, las celulas madre normales se siembran a razon de aproximadamente 9.000 a 11.000 celulas por receptaculo, opcionalmente aproximadamente
10.000 celulas por receptaculo.
Opcionalmente, el primer receptaculo y/o el segundo receptaculo son pozos en la misma placa de microtitulacion o pozos en placas de microtitulacion separadas. En una realizacion, la placa de microtitulacion es una placa de microtitulacion de 96 pozos, opcionalmente una placa de microtitulacion recubierta de 96 pozos tal como una placa MatrigelMR.
El cambio en el recuento de celulas para las variantes de celulas madre neoplasicas se detecta entre aproximadamente 48 horas y 96 horas despues de poner en contacto las celulas con el agente de prueba, opcionalmente aproximadamente 72 horas. El cambio en el recuento de celulas para las celulas madre normales se detecta entre aproximadamente 4 dfas y 6 dfas despues de ponerse en contacto las celulas con el agente de prueba, opcionalmente durante aproximadamente 5 dfas.
En una realizacion de los metodos descritos en el presente documento, las variantes de celulas madre neoplasicas se transforman en celulas madre pluripotentes humanas transformadas (CMPht) o en celulas madre pluripotentes
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inducidas transformadas (CMPit). En una realizacion, las variantes de celulas madre neoplasicas son variantes de celulas madre neoplasicas humanas.
Se determina un cambio en el recuento de celulas para las celulas madre neoplasicas y/o las celulas madre normales. En una realizacion, el cambio en el recuento de celulas se determina mediante analisis del contenido de acido desoxirribonucleico (ADN), deteccion de un marcador nuclear tal como histonas o laminina nuclear, condensacion nuclear y/o deteccion nuclear tal como mediante tincion con fluorocromos que se unen al ADN tales como Hoechst, 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), naranja de acridina, DRAQ5 o safarina. Una persona experta apreciara que la deteccion de un cambio en el recuento de celulas puede incluir la identificacion y/o cuantificacion de celulas individuales. Opcionalmente, el cambio en el recuento de celulas se detecta utilizando analisis de alto contenido y/o analisis de imagenes nucleares.
En una realizacion, los metodos descritos en la presente memoria descriptiva incluyen el cribado de un agente de prueba identificado como un agente selectivo contra celulas madre de cancer para la actividad en una lmea celular de cancer, tal como una lmea celular derivada de un sujeto con cancer. En una realizacion, la lmea celular de cancer es una lmea celular leucemica, tal como una lmea celular de leucemia mieloide aguda (LMA). En una realizacion, la actividad es citotoxicidad, induccion de apoptosis, perdida de pluripotencia, induccion de diferenciacion, o combinaciones de los mismos. En una realizacion, la actividad es la presencia/ausencia o nivel o uno o mas biomarcadores.
En una realizacion, los metodos descritos en la presente memoria descriptiva incluyen el cribado de un agente de prueba identificado como un agente selectivo contra celulas madre de cancer para inducir la expresion de uno o mas genes de respuesta al estres. En una realizacion, los genes de respuesta al estres son uno o mas biomarcadores apoptoticos tales como Anexina V, p53 y/o p21.
En otro aspecto de la descripcion, se criban uno o mas agentes para identificar uno o mas agentes de prueba que inducen perdida de pluripotencia y una disminucion en el recuento de celulas de variantes de celulas madre neoplasicas. Estos agentes de prueba pueden entonces ser identificados y validados como agentes selectivos contra celulas madre de cancer usando los metodos descritos en la presente memoria, por ejemplo, comparando cambios en el recuento de celulas en respuesta al agente de prueba en variantes de celulas madre neoplasicas y celulas madre normales.
En una realizacion, el metodo incluye poner en contacto las variantes de celulas madre neoplasicas con el agente, detectar un cambio en la pluripotencia y un cambio en el recuento de celulas de las variantes de celulas madre neoplasicas en respuesta al agente y seleccionar un agente como agente de prueba si el agente induce una perdida de pluripotencia y una disminucion en el recuento de celulas de las variantes de celulas madre neoplasicas. En una realizacion, las variantes de celulas madre neoplasicas se ponen en contacto con el agente a razon de aproximadamente 10 pM. En una realizacion, se criban una pluralidad de agentes en una placa de microtitulacion y se identifican como agentes de prueba con base en una desviacion estandar umbral de la media u otra estadfstica adecuada. Por ejemplo, en una realizacion el umbral es una puntuacion Z de al menos 3 desviaciones estandar de la media, opcionalmente de la media en toda la placa para el cambio en la pluripotencia y cambio en el recuento de celulas. En una realizacion, las variantes de celulas madre neoplasicas se tratan con BMP4 para inducir la perdida de pluripotencia como control positivo, opcionalmente al menos 100 ng/mL de BMP4.
Una persona experta apreciara que pueden utilizarse una serie de metodos diferentes conocidos en la tecnica para detectar un cambio en la pluripotencia de las variantes de celulas madre neoplasicas detectando un cambio en el nivel de expresion de uno o mas marcadores de pluripotencia. Una realizacion incluye detectar la expresion de uno o mas marcadores de pluripotencia usando anticuerpos selectivos para uno o mas marcadores de pluripotencia. En una realizacion, la expresion de uno o mas marcadores de pluripotencia en las variantes de celulas madre neoplasicas o celulas madre normales esta operativamente enlazada a un gen indicador, tal como GFP. En una realizacion, el marcador de pluripotencia se selecciona entre Oct4 y Sox2. En una realizacion, el marcador de pluripotencia se selecciona entre Oct4, Sox2, Nanog, SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81, receptor de IGF1, conexina 43, E-cadherina, fosfatasa alcalina, REX1, CRIPTO, CD24, CD90, CD29, CD9 y CD49f, y mezclas de los mismos.
En un aspecto, la presente descripcion proporciona un metodo para identificar y validar un agente de prueba como un agente selectivo contra celulas madres de cancer que comprende:
poner en contacto una o mas variantes de celulas madre neoplasicas con el agente de prueba y una o mas celulas madre normales con el agente de prueba;
detectar un cambio en una o mas actividades de las variantes de celulas madre neoplasicas en respuesta al agente de prueba,
detectar un cambio en una o mas actividades de las celulas madre normales en respuesta al agente de prueba; e
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identificar el agente de prueba como un agente selectivo contra celulas madre de cancer si el contacto con el agente de prueba induce una o mas actividades en las variantes de celulas madre neoplasicas sin inducir una actividad comparable en las celulas madre normales en las que el cambio en el recuento de celulas para las variantes de celulas madre neoplasicas se detecta entre aproximadamente 48 horas y 96 horas despues de poner en contacto las celulas con el agente de prueba y se detecta el cambio en el recuento de celulas para las celulas madre normales entre aproximadamente 4 dfas y 6 dfas despues de poner en contacto las celulas con el agente de prueba.
En una realizacion, la actividad es apoptosis, necrosis, proliferacion, division celular, diferenciacion, migracion o movimiento, presencia o ausencia de uno o mas biomarcadores, nivel de uno o mas biomarcadores, o induccion de los mismos.
En otro aspecto, se proporciona un metodo de dos etapas para identificar y validar un agente como un agente selectivo contra celulas madre de cancer, que comprende:
detectar un cambio en una o mas actividades de variantes de celulas madre neoplasicas en respuesta al contacto con el agente y seleccionar un agente como agente de prueba si el agente induce una o mas actividades en las variantes de celulas madre neoplasicas; y
poner en contacto una o mas variantes de celulas madre neoplasicas con el agente de prueba y poner en contacto una o mas celulas madre normales con el agente de prueba, detectar un cambio de una o mas actividades de las variantes de celulas madre neoplasicas en respuesta al agente de prueba, detectar un cambio en una o mas actividades de las celulas madre normales en respuesta al agente de prueba e identificacion del agente de prueba como un agente selectivo contra celulas madre de cancer si el agente de prueba induce una o mas actividades en las variantes de celulas madre neoplasicas sin inducir una actividad comparable en el las celulas madre normales.
En una realizacion, la actividad es apoptosis, necrosis, proliferacion, division celular, diferenciacion, migracion o movimiento, presencia o ausencia de uno o mas biomarcadores, nivel de uno o mas biomarcadores o induccion de los mismos.
Se ha determinado sorprendentemente que los compuestos estructuralmente similares a la tioridazina son eficaces para inducir la diferenciacion de celulas madre de cancer o para matar celulas madre de cancer.
En una realizacion, los compuestos tienen un coeficiente de similitud de Tanimoto con la tioridazina de al menos 0,6. En una realizacion, los compuestos tienen un coeficiente de similitud de Tanimoto con la tioridazina de al menos 0,7, 0,8, 0,9 o 0,95. Opcionalmente, los compuestos incluyen, pero no se limitan a, tioridazina, proclorperazina, trifluoperazina, flufenazina, perfenazina y triflupromazina. En una realizacion, los compuestos son derivados de fenotiazina. En una realizacion, el compuesto induce preferentemente la diferenciacion de celulas madre de cancer con respecto a las celulas madre normales. Por ejemplo, en una realizacion los compuestos inducen preferentemente la diferenciacion de variantes de celulas madre neoplasicas con respecto a celulas madre normales.
La invencion solo contempla metodos in vitro. El origen de las celulas madre de cancer usadas en la invencion puede ser in vivo, in vitro o ex vivo. En una realizacion, el origen de las celulas madre de cancer es in vivo, de un sujeto con cancer. En una realizacion, el cancer es leucemia, tal como leucemia mieloide aguda. En una realizacion, el cancer es cancer de mama. En una realizacion, el cancer es cancer de pulmon, cancer de colon, cancer de cerebro o cancer de prostata.
Los metodos descritos aqrn tambien son utiles para controlar o tomar decisiones de tratamiento para un sujeto con cancer o sospechoso de tener cancer sometido a tratamiento con un agente contra celulas madre de cancer.
En algunas realizaciones, el agente contra celulas madre de cancer es tioridazina, un compuesto con similitud estructural con la tioridazina, o un derivado de fenotiazina.
En algunas realizaciones, determinar un nivel de celulas madre de cancer en la muestra comprende determinar el nivel de celulas madre de cancer en la muestra con relacion a otro tipo de celulas en la muestra, tales como celulas diferenciadas. Opcionalmente, los metodos descritos en la presente memoria incluyen la determinacion de un cambio en la fraccion de celulas madre de cancer en relacion con celulas diferenciadas en una muestra a lo largo del tiempo.
En una realizacion, la determinacion del nivel de celulas madre de cancer en la muestra comprende la deteccion de uno o mas biomarcadores asociados con celulas madre de cancer y/o uno o mas biomarcadores asociados con celulas diferenciadas. Opcionalmente, el nivel de celulas madre de cancer en una muestra se puede determinar usando estudios de xenotrasplante como se conoce en la tecnica.
En una realizacion, los metodos descritos en la presente memoria incluyen determinar el nivel de celulas madre de cancer en una muestra probando la muestra para la expresion de biomarcadores asociados con celulas de celulas
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madre de cancer y/o celulas diferenciadas. En una realizacion, los biomarcadores asociados con celulas madre de cancer se seleccionan entre el receptor de dopamina (DR) 1+, DR2+, DR3+, DR4+, DR5+, CD14+, CD34+ y CD44+. En una realizacion, los biomarcadores asociados con celulas diferenciadas se seleccionan entre CD11b+ y CD24+, CD114+ y CD16+.
En una realizacion, la muestra comprende celulas leucemicas o celulas sospechosas de ser celulas leucemicas y la determinacion del nivel de celulas madre de cancer incluye pruebas para uno o mas receptores de dopamina y CD14, en donde las celulas que expresan uno o mas receptores de dopamina y CD14 (DR+, CD14+) se identifican como celulas madre de cancer leucemico. En una realizacion, la muestra comprende celulas leucemicas o celulas sospechosas de ser celulas leucemicas y la determinacion de la presencia o ausencia de celulas madre de cancer incluye pruebas para uno o mas receptores de dopamina y CD14+ y opcionalmente CD34+.
En una realizacion, la muestra comprende celulas de cancer de mama o celulas sospechosas de ser celulas de cancer de mama y determinar el nivel de celulas madre de cancer de mama comprende ensayar la muestra para la expresion de CD44 y la ausencia de expresion de CD24 (CD44+/CD24- o CD44+/CD24bajo). En una realizacion, la determinacion del nivel de celulas madre de cancer de mama comprende ensayar la muestra para la expresion de uno o mas receptores de dopamina seleccionados de DR1, DR2, DR3, DR4 y DR5 y opcionalmente CD44 y CD24 (DR+/ CD44+/CD24- o bajo). En una realizacion, la determinacion del nivel de celulas madre de cancer de mama comprende ensayar la muestra para la expresion de DR5 y opcionalmente CD44 y CD24. Los metodos descritos en el presente documento opcionalmente incluyen ensayar la muestra para detectar otros biomarcadores conocidos en la tecnica que se asocian con celulas madre de cancer o celulas diferenciadas.
En una realizacion, los compuestos tienen un coeficiente de similitud de Tanimoto con la tioridazina de al menos 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o 0,95. Opcionalmente, los compuestos incluyen, pero no se limitan a, tioridazina, proclorperazina, trifluoperazina, flufenazina, perfenazina y triflupromazina. En una realizacion, los compuestos son derivados de fenotiazina. En una realizacion, el compuesto diferencia preferentemente celulas madre de cancer en relacion con celulas madre normales. En una realizacion, el cancer es leucemia mieloide aguda.
Se ha determinado sorprendentemente que los antagonistas del receptor de dopamina tales como la tioridazina o la clorpromazina son citotoxicos para las celulas cancerosas y en particular la leucemia mieloide aguda (LMA). Ademas, se ha descubierto que los antagonistas de los receptores de dopamina a concentraciones toxicas para las celulas cancerosas tienen un efecto relativamente limitado sobre las celulas madre normales, tales como las celulas madre hematopoyeticas. Tambien se ha determinado que los receptores de dopamina se expresan en lmeas celulares de LMA y en celulas de LMA primarias, pero muestran una expresion relativamente menor en lmeas celulares enriquecidas para celulas madre hematopoyeticas normales. Ademas, la expresion de los receptores de dopamina en celulas de LMA se correlaciona con la del marcador monoblastico CD14. Los antagonistas del receptor de la dopamina tales como la tioridazina son citotoxicos para las celulas de LMA que expresan CD14.
En una realizacion, el antagonista del receptor de dopamina es un derivado de fenotiazina tal como tioridazina o clorpromazina. Opcionalmente, el antagonista del receptor de dopamina es un antagonista de multiples receptores que antagoniza mas de un receptor de dopamina. En una realizacion, el antagonista del receptor de dopamina es un antagonista del receptor de dopamina de la familia D2. En una realizacion, el antagonista de DR es un compuesto seleccionado de entre los enumerados en la Tabla 1.
Tambien se divulga un metodo in vitro para reducir la proliferacion de una celula cancerosa que comprende poner en contacto la celula cancerosa con un antagonista del receptor de dopamina. Tambien se da a conocer el uso in vitro de un antagonista del receptor de dopamina para reducir la proliferacion de una celula cancerosa. En un ejemplo, el contacto de la celula con un antagonista del receptor de dopamina in vitro induce la muerte celular o la diferenciacion de una celula cancerosa o celula precancerosa. En un ejemplo, la celula cancerosa es una celula madre de cancer y poner en contacto la celula madre de cancer con un antagonista del receptor de dopamina in vitro induce la diferenciacion de la celula madre de cancer. En un ejemplo, la celula precancerosa es una celula mieloproliferativa. Opcionalmente, la celula cancerosa es una celula leucemica, tal como una celula de leucemia mieloide aguda (LMA) o una celula leucemica monocftica. En un ejemplo, la celula es CD14 positiva. En un ejemplo, el antagonista del receptor de dopamina es un derivado de fenotiazina tal como tioridazina. En un ejemplo, el antagonista de dopamina es un compuesto seleccionado de entre los enumerados en la Tabla 1.
Tambien se divulgan metodos para identificar un sujeto con leucemia. En un ejemplo, los metodos incluyen determinar el nivel de expresion de uno o mas receptores de dopamina en una muestra del sujeto y comparar el nivel de expresion de uno o mas receptores de dopamina con un control. Opcionalmente, la muestra comprende globulos blancos y/o el metodo comprende ademas proporcionar una muestra que comprende globulos blancos del sujeto. En un ejemplo, el aumento de los niveles de expresion de uno o mas receptores de dopamina en comparacion con un control es indicativo de un sujeto con leucemia, tal como leucemia mieloide aguda o leucemia monocftica. En un ejemplo, el metodo comprende ademas ensayar CD14.
Tambien se proporcionan metodos para cribar compuestos por actividad anticancerosa que comprende identificar compuestos que son antagonistas del receptor de dopamina. En una realizacion, la actividad anticancerosa es la
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proliferacion reducida de celulas LMA o celulas monocfticas. Opcionalmente, los metodos incluyen identificar compuestos que inducen preferentemente la diferenciacion de celulas madre de cancer con respecto a celulas madre hematopoyeticas o normales.
En un aspecto, se proporcionan metodos para identificar una celula madre de cancer a partir de una poblacion de celulas. En una realizacion, el metodo comprende determinar si una celula expresa uno o mas biomarcadores seleccionados entre el receptor de dopamina (DR) 1, DR2, DR3, DR4 y DR5. En una realizacion, la expresion del receptor de dopamina (DR) 1, DR2, dR3, DR4 y/o DR5 es indicativa de que la celula es una celula madre de cancer.
En una realizacion, la poblacion de celulas comprende celulas aisladas de un mairnfero o celulas en cultivo tales como un cultivo celular. En una realizacion, la poblacion de celulas comprende celulas madre pluripotentes. En una realizacion, la poblacion de celulas comprende celulas cancerosas tales como celulas cancerosas hematologicas o celulas precancerosas. Opcionalmente, el metodo incluye probar la celula para la expresion de polinucleotidos o polipeptidos que codifican para DR1, DR2, DR3, DR4 o DR5. En una realizacion, una celula que expresa DR1, DR2, DR3, DR4 y DR5 se identifica como una celula madre de cancer. En algunas realizaciones, los metodos descritos en la presente memoria incluyen tambien aislar celulas madre de cancer de una poblacion de celulas. Por ejemplo, las celulas que se identifican como celulas madre de cancer se pueden aislar de una poblacion de celulas u otro material usando metodos conocidos en la tecnica tales como citometna de flujo, clasificacion celular activada por fluorescencia, separacion por columna de afinidad o seleccion magnetica. En una realizacion, las celulas madre de cancer se afslan utilizando anticuerpos para uno o mas de DR1, DR2, DR3, DR4 y DR5.
Otras caractensticas y ventajas de la presente descripcion resultaran evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada.
Breve descripcion de los dibujos
Se describiran ahora una o mas realizaciones de la divulgacion en relacion con los dibujos en los que:
La Figura 1 muestra que la tioridazina a 10 pM es citotoxica para las lmeas celulares leucemicas HL-60, MV4-11 y OCI3.
La Figura 2 muestra que la tioridazina a 10 pM tiene efectos limitados en el potencial de formacion de colonias de CMH normales (2A) mientras que reduce significativamente el potencial de formacion de blastocitos de LMA.
La Figura 3 muestra granulos de celulas de colonias de UFC generadas a partir de CMH normal y LMA tratadas con tioridazina.
La Figura 4 muestra que tanto la clorpromazina 10 pM como la tioridazina 10 pM son citotoxicas para las lmeas celulares leucemicas HL-60, MV4-11 y OCI3.
La Figura 5 muestra la expresion de los receptores de dopamina DR1, DR2, DR3, DR4 y DR5. Se observo la expresion de DR en lmeas celulares de LMA, algunas celulas de LMA primaria y las celulas mononucleares (MNC), pero no en celulas enriquecidas con CMH (linaje de CB (-)).
La Figura 6 muestra que los antagonistas de DR multiples son citotoxicos para las lmeas celulares de LMA. SKF = clorhidrato de (R)-(+)-SKF-38393; 7OH = bromhidrato de R(+)-7-hidroxi-DPAT; GR = GR 103691; SCH = clorhidrato de R(+)-SCH-23390; CLOZ = clozapina; CHL = clorhidrato de clorpromazina; THIO = Tioridazina.
La Figura 7 muestra datos de FACS que muestran que los receptores de dopamina se expresan en la poblacion de celulas CD14+ en LMA primaria.
La Figura 8 muestra que la tioridazina se dirige selectivamente y reduce la frecuencia normalizada de las celulas CD14+ en la LMA primaria.
La Figura 9 muestra la identificacion de mefloquina y tioridazina usando el cribado qmmico para compuestos que diferencian CMPh neoplasico. (A) Esquema de la estrategia de cribado. (B) grafico de dispersion XY del porcentaje de actividad residual (% de AR) de las senales de GFP y Hoechst del cribado del compuesto 590. La region esbozada demuestra la perdida de pluripotencia (PDP) como se define por GFP y Hoechst reducidos. Cada punto n = 3, media +/- DE. (C) Resumen de las respuestas observadas con 590 compuestos. (D) Estructura qmmica de los compuestos candidatos; tioridazina, azatioprina y mefloquina. (E) GFP representativo, Hoechst y las imagenes microscopicas fusionadas de celulas v1H9-Oct4-GFP tratadas con compuestos candidatos a 10 pM. (F) Histograma de la intensidad de GFP de estas imagenes. (G) Curvas de respuesta a la dosis de v1H9-Oct4-GFP tratadas con compuestos candidatos y calculo de CE50. Cada punto n = 3; media +/- EEM (error estandar de la media).
La Figura 10 muestra el efecto de la salinomicina, mefloquina y tioridazina en poblaciones normales y neoplasicas. (A-B) Analisis de citometna de flujo de la frecuencia de las celulas Oct4+ en celulas (A) H9 y (B) v1H9-Oct4-GFP
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tratadas con salinomicina (SAL), mefloquina (MQ) y tioridazina (THIO) a 10-7 - 10-6 M. Cada barra n = 3; media +/- DE. Los valores se normalizan a las muestras de control tratadas con DMSO; (-) medio DMSO, (--) media menos una DE, (-) nivel de %Oct4+ en muestras tratadas con BMP4. (C) Relacion de celulas normalizadas %Oct4+ en H9 por v1H9-Oct-GFP con el mismo compuesto a la misma concentracion. Porcentaje de tincion de CMPh neoplasicas positivas para (D) p53 y (E) p21 despues de un tratamiento de 24 h con etoposido 10 pM, tioridazina 10 pM (THIO), y controles (CTRL) tratados con BMP4 y DMSO. Cada barra n = 3; media +/- DE. Se incluyeron imagenes representativas de celulas tratadas con etoposido y tioridazina. Las flechas muestran p53+ y p21+ en celulas tratadas con etoposido frente a celulas tratadas con tioridazina. (F) Genes asociados con la diferenciacion con aumento de > 2 veces despues de tratamiento con tioridazina de CMPh neoplasicas. Genes divididos en linajes respectivos, endodermo (ENDO), mesodermo (MESO), celula germinal (GERM), neural (NEURO) y trofoblasto (TROPH). Cada barra representa la media de dos experimentos separados. (G-K) Multilinaje hematopoyetico y potencial clonogenico en respuesta al tratamiento con el compuesto detectado usando ensayos de metilcelulosa. Pellas representativas de unidades formadoras de colonias (UFC) de (G) celulas madre y progenitoras hematopoyeticas (CMPH) frente a (H) pellas de blastocitos de LMA despues del tratamiento con el compuesto. (I-J) Cuantificacion de las UFC respectivas y UFC de blastocitos generadas a partir de (I) CMPH y (J) celulas blastocitos de LMA despues del tratamiento con el compuesto. Los valores se normalizaron a muestras de control tratadas con DMSO; (-) medio DMSO, (-) media menos un EEM. Cada barra de CMPH n = 7 muestras individuales, media +/- EEM. Cada barra de LMA al menos n = 5 muestras de pacientes individuales, media +/- EEM. (K) Relacion de UFC de CMPH normalizadas por UFC de blastocitos de LMA con el mismo compuesto a la misma concentracion. (L) Frecuencia de celulas granulodticas CD11b normalizadas en celulas cultivadas de LMA del paciente tratadas con tioridazina 10 pM (THIO 10 pM) o veldculo DMSO (CTRL) durante un maximo de 96 horas. Cada barra n = 3, media +/- DE. (*) p <0,05, (**) p <0,01, (***) p <0,001, (****) p <0,0001.
La Figura 11 muestra el efecto de la salinomicina, mefloquina y tioridazina en CMPi y CMPH derivadas de fibroblastos. (A) Analisis de citometna de flujo de la frecuencia de celulas Oct4+ en CMPi derivadas de fibroblastos (CMi-Fib) tratadas con salinomicina (SAL), mefloquina (MQ) y tioridazina (THIO) a 10'7 - 10'6 M. Cada barra n = 3; media +/- DE. Los valores se normalizan a las muestras de control tratadas con DMSO; (-) medio DMSO, (-) media menos una DE, (-) nivel de %Oct4+ en muestras tratadas con BMP4. (B) Respuesta prolongada a la dosis de compuestos sobre CMPh neoplasica. Cada punto media +/- EEM, (C) potencial de linaje hematopoyetico de linaje de CB tratado con tioridazina. Unidades formadoras de colonias (UFC) de eritroblastos (UFC-E), macrofagos (UFC-M) y granulocitos (UFC-G) colonias generadas en ensayos de metilcelulosa. (D) Composicion de UFC generada a partir de linaje de CB tratado con salinomicina, mefloquina y tioridazina. Porcentaje de la composicion de UFC generada con tratamiento con salinomicina (SAL), mefloquina (Mq) y tioridazina (THIO) a 0,1 pM, 1 pM y 10 pM. (*) p <0,05,
(**) p < 0,01.
La Figura 12 muestra el efecto de la tioridazina sobre el injerto de CMH y CML. (A) Frecuencia de celulas CD45+ humanas en la medula osea tras tratamiento de las CMPH con tioridazina 10 pM (THIO 10 pM) o mefloquina 10 pM (MQ 10 pM). Valores normalizados a muestras de control (CTRL) de CMPH tratadas con DMSO. Se evaluaron un total de dos muestras de CMPH. Media +/- EEM. (B) Diagramas de citometna de flujo representativos de dispersion lateral (SSC) frente a marcadores mieloides (CD33) o linfoides (CD19) dentro de la poblacion de hCD45+. 12(C) Frecuencia de blastocitos de LMA CD45+ CD33+ en la medula osea (MO) despues del tratamiento de LMA con tioridazina 10 pM (THIO 10 pM) o mefloquina 10 pM (MQ 10 pM). Valores normalizados a muestras de control (CTRL) de LMA tratadas con DMSO. Se evaluo un total de dos muestras de LMA. (D) Diagramas de flujo representativos de CD33 frente a CD45 en poblaciones de control (CTRL) tratadas con DMSO frente a las tratadas con tioridazina (THIO 10 pM). (E) Relacion del porcentaje normalizado de injerto de CMPH hCD45 por porcentaje normalizado de injerto de blastocitos de LMA CD45 CD33. (*) p < 0,05.
La Figura 13 muestra la respuesta in vivo al tratamiento con farmacos. (A) Frecuencia normalizada de celulas CD45+ humanas en la medula osea tras el tratamiento de CMPH con salinomicina 1 pM (SAL 1 pM) con respecto a muestras tratadas con DMSO (CTRL). Se evaluaron un total de dos muestras de cMpH. Media +/- EEM. (****) p < 0,0001 (B) Efecto de la tioridazina en el trasplante esplenico de CMH y CML. (B, parte superior) Frecuencia de celulas CD45+ humanas en el bazo despues del tratamiento de CMPH con tioridazina 10 pM (THIO 10 pM). Valores normalizados a muestras de control de CMPH tratadas con DMSO (CTRL). Se evaluaron un total de dos muestras de CMPH. Media +/- EEM. (B, parte inferior) Blastocitos CD45+ CD33 + en el bazo despues de tratamiento con tioridazina 10 pM (THIO 10 pM) de LMA. Valores normalizados a muestras de control (CTRL) de LMA tratadas con DMSO. Se evaluaron un total de dos muestras de LMA. (C) Efecto de la tioridazina sobre la regeneracion eritrodtica y megacariodtica. Composicion de celulas sangumeas humanas detectadas en el xenotrasplante de MO inyectado con CMPH tratado con tioridazina 10 pM (THIO 10 pM) o con DMSO (CTRL). Los globulos rojos (GR) se definen por la positividad de la glicoforina A y las plaquetas por CD41a. (D) Confirmacion del injerto leucemico mieloide de xenotrasplantes con LMA. Citometna de flujo de dispersion lateral frente a CD19, un marcador de celulas linfoides. El numero del recuadro representa la media +/- EEM. (E-F) Efecto de la tioridazina sobre la autorrenovacion in vivo de CMH y CML. Los niveles de injerto de (E) celulas hCD45+ o (F) hCD45+CD33+ en MO de xenotrasplantes secundarios que recibieron igual numero de celulas hCD45 explantadas a partir de (E) linaje de CB primario o (F) trasplantes primarios de LMA tratados con tioridazina (THIO 10 pM) o control (CTRL) de DMSO. Cada barra n = 3 ratones, media +/- EEM.
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La Figura 14 muestra los receptores de dopamina expresados en celulas madre neoplasicas. (A-B) Citometna de flujo de (A) celulas H9 normales y (B) H9-Oct4-GFP neoplasicas tenidas con SSEA3 y todos los cinco subtipos de receptores de dopamina (DR). Se muestra la expresion de DR en la fraccion de SSEA3+. (C) Citometna de flujo de sangre del cordon umbilical desprovista de linaje (CMPH) tenida con CD34, CD38 y todos los cinco subtipos de DR. La expresion de DR se presenta en las poblaciones cerradas. (D) Citometna de flujo de 13 muestras de pacientes con LMA tenidas para todos los cinco DR junto con la clasificacion FAB asociada. (E) Colocalizacion de DRD5 en tumor de mama humano primario triplemente negativo (ER-, PR- y HER2-) tenido con CD44 y CD24. (F) La frecuencia de CMC de mama triplemente negativa (CD44+CD24-/bajo) dentro de la poblacion de DRD3 y DRd5. Cada barra compuesta por 3 tumores de mama triplemente negativos primarios, media +/- EEM. (G-H) Frecuencia de blastocitos de LMA (CD33+CD45+) de muestras de pacientes que son tambien positivas para (G) DRD3 y (H) DRD5. Se evaluo un total de 8 muestras de pacientes con LMA para determinar el potencial de iniciacion leucemica en receptores de xenotrasplante. La iniciacion leucemica se definio como injerto humano > 0,1% de CD33+ hCD45+ en medula osea de raton. Se ensayaron cuatro muestras de LMA iniciadoras de leucemia en 22 ratones mientras que se ensayaron 4 muestras de LMA no iniciadoras en 17 ratones. Total, n = 8 muestras de LMA, media +/- EEM.
La Figura 15 (A-B) Citometna de flujo de la fraccion de SSEA3+ en (A) CMPih derivadas de fibroblastos y (B) CMPih derivadas de sangre de cordon umbilical tenidas para todos los cinco receptores de dopamina. (C) Expresion de receptores de dopamina de poblaciones de sangre humana. La citometna de flujo de celulas mononucleares de sangre de cordon tenidas para (C) eritroides (glicoforina A), (C) megacariocitos (CD41a); (D) celulas T (CD3), (D) celulas B (CD19); (E) monocitos (CD14) y (E) granulocitos (CD15). La tincion de los cinco DR en las poblaciones cerradas se muestran como histogramas. (F) Resumen de la localizacion de DR en las poblaciones de sangre. (G) Citometna de flujo del paciente con LMA que muestra DR en poblaciones cerradas. (H) Expresion del receptor de la dopamina en tumores de mama humano triplemente negativos. Las CMC de mama se definen como CD44+CD24- /bajo (Al-Hajj et al., 2003). La colocalizacion de cada DR dentro de la poblacion de CD44 y CD24 se muestra para tres tumores de mama triplemente negativos (ER-, PR- y HER2-).
La Figura 16 muestra que la tioridazina inhibe la senalizacion del receptor de dopamina en la LMA. (A) Expresion de DR de las lmeas celulares LMA-OCI2 y LMA-OCI3. (B) Recuentos celulares de celulas LMA-oCi2 y LMA-OCI3 tratadas con tres farmacos antagonistas de DR. Los valores se normalizan a las muestras de control tratadas con DMSO. Cada barra n = 3; media +/- DE. (C-D) Recuento de celulas viables (7AAD-, Hoechst +) de las mismas lmeas celulares tratadas con (C) 7OH-DPAT, un agonista de la familia DR D2, o (D) SKF38393, un agonista de la familia DR D1, en condiciones libres de suero. Los valores se normalizan a las muestras de control tratadas con DMSO. Cada barra n = 3; media +/- DE.
La Figura 17 muestra un diagrama de dispersion de los recuentos de celulas frente a cambios en la pluripotencia de las celulas v1O4 tratadas con compuestos de bibliotecas qmmicas. En una realizacion ilustrativa, los compuestos en la caja punteada se identificaron con base en su capacidad para causar una perdida de pluripotencia y una reduccion moderada en el recuento de celulas de variantes de celulas madre neoplasicas. Por encima de esta caja estan compuestos que no redujeron significativamente el recuento de celulas ni causaron una ganancia en pluripotencia. Los compuestos situados inmediatamente debajo de la caja punteada se consideraron posiblemente toxicos debido a la magnitud de su efecto sobre el recuento de celulas, sin embargo, algunos de estos compuestos pueden ser utiles como agentes contra celulas madre de cancer puesto que muchos agentes quimioterapeuticos actuales tambien exhiben efectos toxicos similares. La tioridazina esta representada por la estrella negra en el cfrculo punteado mientras que los analogos de la tioridazina son las estrellas negras en la caja punteada. La clorpromazina se identifica como la estrella negra en el cfrculo de color negro. Los analogos de tioridazina (compuestos con estructura similar a tioridazina) estan representados desproporcionadamente al causar una perdida relativa en el recuento de celulas y una perdida de pluripotencia en variantes de celulas madre neoplasicas.
La Figura 18 es un grafico que muestra la induccion de apoptosis (con base en la reduccion en el porcentaje de nucleos normales presentes) despues del tratamiento de las lmeas celulares de cancer LMA, LMA-OCI2 y LMA- OCI3, con los compuestos identificados de la Figura 17 (puntos grises). Los signos de apoptosis aumentan hacia el origen. Los puntos negros se refieren a tioridazina y analogos de tioridazina. La tioridazina induce la muerte celular en lmeas celulares de cancer de LMA, pero los analogos de tioridazina son inactivos. Los analogos de tioridazina con actividad contra variantes de celulas madre neoplasicas (celulas v1O4) no inducen la muerte celular en lmeas celulares de cancer de LMA.
La Figura 19 muestra que las variantes de celulas madre neoplasicas (celulas v1O4) tratadas con tioridazina muestran menos signos de estres/muerte celular que las celulas tratadas con tiostreptona, como un control que se sabe que induce la apoptosis. Imagenes microscopicas de celulas v1O4 tratadas con compuestos a 10 |jM despues del tratamiento de 3 dfas y tenidas con tincion nuclear Hoechst. Se sabe que la tiostreptona induce apoptosis y la citarabina es un agente quimioterapeutico conocido para el tratamiento de la LMA. La hinchazon y la condensacion del nucleo son senales de estres celular o induccion de la muerte celular.
La Figura 20 muestra que el cribado con variantes de celulas madre neoplasicas (celulas v1O4) identifica un pequeno subconjunto de compuestos anticancengenos que son tambien activos contra celulas madre de cancer (CMC). Todos los compuestos terapeuticos anticancerosos conocidos/actuales se identificaron a partir de nuestras
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bibliotecas qmmicas combinadas (NIH, PWK, TOCRIS, CCC: 167 en total) y se graficaron contra el recuento de celulas y PDP. Solo el 5% de los compuestos anticancengenos conocidos se identificaron tambien como compuestos contra celulas madre de cancer que causaron una perdida de pluripotencia y reducciones moderadas en los recuentos celulares de variantes de celulas madre neoplasicas. Por lo tanto, los compuestos anticancengenos que son tambien agentes contra celulas madre de cancer son por lo tanto sorprendentemente poco frecuentes.
La Figura 21 muestra para fines ilustrativos el flujo de trabajo para un proceso de dos etapas para identificar y validar compuestos que selectivamente se dirigen a celulas madre de cancer, pero no a celulas madre normales. Se usan los valores de CE50 de curvas de respuesta a la dosis de variantes de celulas madre neoplasicas (celulas v1O4) y de celulas madre normales (celulas H9) para calcular la relacion de potencia de actividad selectiva para cada compuesto.
La Figura 22 muestra, con fines ilustrativos, la determinacion de la duracion optima y la densidad de siembra inicial para celulas madre normales (celulas H9) y celulas v1O4 para su uso con un analisis de alto contenido para determinar la perdida de pluripotencia y el recuento de celulas. Ai Determinacion de la siembra 6 dfas despues como punto de tiempo optimo en H9. Aii Determinacion de 10K como optima para la densidad de siembra para H9. Determinacion de la siembra 4 dfas despues como punto de tiempo optimo basado en un intervalo de densidades de siembra de celulas v1O4 para la tincion Hoechst (Bi) y la senal GFP (Bii). Determinacion de la densidad de siembra de celulas v1O4 5K como optima para la tincion Hoechst (Ci) y la senal GFP (Cii). Las celulas H9 y v1O4 se sembraron en placas de 96 pozos y se trataron +/- BMP4 (0,1% de DMSO) un dfa despues de la siembra. La respuesta de PDP para v1o4 se cuantifico 4 dfas despues de la siembra utilizando fluorometna de placa y se cuantificaron los recuentos de celulas para H9 mediante analisis de alto contenido.
La Figura 23 muestra un grafico de barras que identifica compuestos con las relaciones de selectividad-actividad mas altas para celulas madre de cancer (celulas v1O4).
La Figura 24A muestra curvas de respuesta a la dosis de compuestos de actividad selectiva que muestran selectividad frente a variantes de celulas madre neoplasicas a 10 pM. La Figura 24B muestra curvas de respuesta a la dosis de compuestos de actividad selectiva que no presentan necesariamente selectividad a 10 pM, pero son sin embargo selectivos a otras concentraciones. Los recuentos de celulas se normalizan a los controles no tratados. La lmea de trazos es de una concentracion de 10 pM. Por lo tanto, los compuestos de cribado a una pluralidad de concentraciones de prueba son utiles para identificar compuestos que son selectivos para agentes anticancengenos.
La Figura 25 muestra, con fines ilustrativos, un grafico del porcentaje de celulas v1O4 o H9 que tinen positivamente para p53 despues del tratamiento con los compuestos de alta actividad selectiva (gris) identificados en la Figura 23. Los niveles altos de p53 indican la activacion de la respuesta al estres dependiente de p53. Los puntos negros representan los niveles de p53 de celulas v1O4 y H9 tratadas con tioridazina y compuestos de tipo estructura tio. Los compuestos de alta selectividad tienen grados variables de actividad de activacion de la respuesta al estres p53. Los analogos de tioridazina mostrados en la Figura 25 por tener poca o ninguna activacion de respuesta al estres p53 incluyen triflupromazina, proclorperazina, trifluoperazina, flufenazina y perfenazina.
La Figura 26 muestra que la tioridazina se dirige selectivamente a celulas madre de cancer que expresan receptores de dopamina. La Figura 26A muestra que la lmea celular de cancer de mama MDA-MB-231 esta altamente enriquecida por celulas madre de cancer (CMC). La citometna de flujo mostro que el 99% de las celulas MDA-MB- 231 exhibfan el fenotipo de antfgeno de CMC de mama CD44+CD24+/bajo. La Figura 26B muestra histogramas que revelan que las celulas MDA-MB-231 tambien expresan diversos receptores de dopamina. La Figura 26C muestra que el tratamiento con tioridazina de celulas MDA-MB-231 reduce la poblacion de celulas que expresan el receptor de dopamina D1, DRD1 (tambien conocido como DR1). Las celulas se trataron durante 3 dfas con tioridazina 10 pM. La Figura 26D muestra que el tratamiento con tioridazina de celulas MDA-MB-231 aumenta la expresion total de CD24. El tratamiento con tioridazina tambien dio como resultado disminuciones en el numero de celulas totales en comparacion con las celulas no tratadas (datos no mostrados).
La Figura 27 muestra un diagrama de dispersion de compuestos identificados y validados como agentes selectivos contra celulas madre de cancer usando un ejemplo de realizacion del metodo de cribado en dos etapas descrito en la presente memoria. En la primera etapa, se trataron variantes de celulas madre neoplasicas (celulas V104) con compuestos de una biblioteca qmmica. Los compuestos que indujeron una perdida de pluripotencia y una reduccion en el recuento de celulas mas alla de un umbral predeterminado (indicado por la lmea discontinua en la Figura 27) se clasificaron como agentes de prueba. En la segunda etapa, se ensayaron una serie de diluciones de agentes de prueba en variantes de celulas madre neoplasicas y celulas madre humanas normales para generar curvas de respuesta a la dosis. Se calcularon los valores CE50 de las curvas de respuesta a la dosis de cada lmea celular y los compuestos que mostraron una diferencia mayor de tres veces en el valor CE50 de las celulas madre normales frente a las variantes de celulas madre neoplasicas se identificaron como agentes selectivos contra celulas madre de cancer (mostrados como estrellas negras en la Figura 27).
Descripcion detallada
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I. Definiciones
Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "cancer" se refiere a uno de un grupo de enfermedades causado por el crecimiento anormal no controlado de celulas que pueden propagarse a tejidos adyacentes u otras partes del cuerpo. Las celulas cancerosas pueden formar un tumor solido, en el que las celulas cancerosas se juntan o existen como celulas dispersas, como en la leucemia.
El termino "celula cancerosa" tal como se usa en la presente memoria se refiere a una celula caracterizada por crecimiento anormal no controlado y la capacidad de invadir otro tejido o una celula derivada de tal celula. Una celula cancerosa incluye, por ejemplo, una celula cancerosa primaria obtenida de un paciente con cancer o lmea celular derivada de dicha celula. De forma similar, una "celula cancerosa hematologica" se refiere a una celula cancerosa derivada de una celula sangumea o de la medula osea. Ejemplos de celulas cancerosas incluyen, pero no se limitan a, celulas madre de cancer, celulas de cancer de mama, celulas de cancer de recto, celulas de cancer de colon, celulas de cancer de prostata y celulas de cancer hematologicas tales como mielomas, celulas leucemicas o celulas de linfoma.
Tal como se usa en la presente memoria, el termino "celula madre de cancer" se refiere a una celula que es capaz de autorrenovarse y diferenciarse en los linajes de celulas cancerosas que comprenden un tumor solido y/o neoplasia hematologica. Las celulas madre de cancer son unicamente capaces de iniciar y mantener la enfermedad. Las variantes de celulas madre neoplasicas son celulas pluripotentes que presentan las propiedades de las celulas madre de cancer y son utiles en los metodos de cribado descritos en la presente memoria para identificar y/o validar agentes contra celulas madre de cancer.
Tal como se usa en la presente memoria, "biomarcador asociado con celulas madre de cancer" se refiere a un biomarcador tal como un acido nucleico, un polipeptido o un fragmento del mismo, cuya expresion, o falta de el, por una celula es indicativa de que la celula es una celula madre cancerosa. Por ejemplo, en una realizacion la expresion de uno o mas receptores de dopamina (DR+) y CD14 (CD14+) es indicativa de que una celula es una celula madre de cancer leucemico. En una realizacion, una celula que no expresa CD24 (CD24-) o expresa niveles bajos de CD24 (CD24bajo) y expresa CD44 (CD44+) es indicativa de que la celula es una celula madre de cancer de mama.
Tal como se usa en la presente memoria, "biomarcador asociado con celulas diferenciadas" se refiere a un biomarcador tal como un acido nucleico, un polipeptido o un fragmento del mismo, cuya expresion, o falta de la misma, por una celula es indicativa de que la celula esta en un estado diferenciado y no una celula madre tal como una celula madre normal o una celula madre de cancer. Por ejemplo, en una realizacion la expresion de CD11b (CD11b+) es indicativa de que la celula esta en un estado diferenciado y no en una celula madre de cancer.
Tal como se usa en la presente memoria, el termino "variante de celula madre neoplasica" se refiere a una celula que es capaz de diferenciarse en mas de un tipo de celula y no requiere Oct4 para autorrenovacion o supervivencia. Las variantes de celulas madre neoplasicas se distinguen facilmente de las celulas madre normales. Por ejemplo, algunas variantes de celulas madre neoplasicas coexpresan FGFR1 e IGFR1. Por el contrario, las celulas madre embrionarias humanas normales (CMEh) expresan IGF1R, mientras que FGFR1 se expresa exclusivamente en celulas tipo fibroblastos tambien encontradas en los cultivos de celulas madre embrionarias humanas. Algunas variantes de celulas madre neoplasicas no requieren factor basico de crecimiento de fibroblastos (FbCF) en cultivo para el mantenimiento de un estado no diferenciado. Como se usa en la presente memoria, un "estado no diferenciado" se refiere a una celula que es pluripotente o que todavfa es capaz de diferenciarse en mas de un tipo de celula. Algunas variantes de celulas madre neoplasicas mantienen la expresion de SSEA3 en ausencia de FbCF, y/o requieren Nanog para autorrenovacion y supervivencia celular.
En un aspecto de la descripcion, las variantes de celulas madre neoplasicas descritas en la presente memoria pueden ser pasadas como una sola celula. Como se usa en la presente memoria, "pasadas como celulas individuales" se refiere a aislar y transferir individualmente una unica celula a un recipiente de cultivo en el que la celula es entonces capaz de formar una pluralidad de celulas. Opcionalmente, las variantes de celulas madre neoplasicas incluyen uno o mas vectores o constructos informadores tales como un vector en el que la expresion de uno o mas genes de pluripotencia esta unida operativamente a un gen informador. En una realizacion, las variantes de celulas madre neoplasicas tienen caractensticas neoplasicas y presentan un menor potencial de diferenciacion in vitro. En una realizacion, las variantes de celulas madre neoplasicas son nichos independientes y tienen mayor actividad de inicio del tumor. En particular, en una realizacion, las celulas madre neoplasicas presentan una diferenciacion neural significativamente reducida y carecen de potencial hematopoyetico. Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "variantes de celulas madre neoplasicas" incluye celulas madre pluripotentes transformadas (CMPht) o celulas madre pluripotentes inducidas transformadas (CMPit) como se describe en la publicacion PCT No. WO2011026222. Las variantes de celulas madre neoplasicas muestran similitudes en las propiedades funcionales con las celulas madre del cancer somatico y, por lo tanto, son utiles como sustituto de las celulas madre del cancer somatico. Las variantes de celulas madre neoplasicas tambien son susceptibles de alto contenido y alta produccion de cribado in vitro. En una realizacion, las variantes de celulas madre neoplasicas son variantes de celulas madre neoplasicas inducidas. En una realizacion, las variantes de celulas madre neoplasicas
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son variantes de celulas madre neoplasicas humanas. Opcionalmente, las variantes de celulas madre neoplasicas se derivan de una fuente somatica o una fuente embrionaria.
Tal como se utiliza en la presente memoria, una "celula madre normal" es una celula madre que no es una celula madre de cancer o una variante de celula madre neoplasica. Opcionalmente, una "celula madre normal" es una celula madre que no exhibe las caractensticas de una celula cancerosa, como una variante de celula madre neoplasica. Ejemplos de celulas madre "normales" incluyen celulas madre pluripotentes, celulas madre embrionarias y celulas madre hematopoyeticas, celulas madre somaticas. Opcionalmente, las celulas madre normales son celulas madre humanas. Opcionalmente, las celulas madre normales se derivan de una fuente somatica o una fuente embrionaria.
Tal como se usa en la presente memoria, "agente selectivo contra celulas madre de cancer" se refiere a un agente que reduce la proliferacion de celulas madre de cancer en relacion con las celulas madre normales. En algunas realizaciones, un "agente selectivo contra celulas madre de cancer" provoca un aumento en la muerte celular y/o una perdida de pluripotencia de celulas madre de cancer en relacion con las celulas madre normales. En una realizacion, un "agente selectivo contra celulas madre de cancer" es un agente con un valor de concentracion efectiva media (CE50) para una disminucion en el recuento de celulas de variantes de celulas madre neoplasicas que es menor que el valor de CE50 para una disminucion en el recuento de celulas de celulas madre normales. En una realizacion, se selecciona un compuesto como un "agente selectivo contra celulas madre de cancer" si tiene un valor de CE50 para una disminucion en el recuento de celulas de celulas madre normales que es al menos dos (2) veces el valor de CE50 para las variantes de celulas madre neoplasicas. En una realizacion, se selecciona un compuesto como un "agente selectivo contra celulas madre de cancer" si tiene un valor de CE50 para una disminucion en el recuento de celulas de celulas madre normales que es al menos tres (3) veces el valor de CE50 para las variantes de celulas madre neoplasicas.
El termino "trastorno precanceroso" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a uno de un grupo de trastornos hiperproliferativos que pueden desarrollarse en cancer, incluyendo por ejemplo trastornos precancerosos de la sangre, tales como enfermedad mieloproliferativa o smdrome mielodisplasico que es una condicion premaligna que esta relacionada con y/o puede convertirse en leucemia mieloide aguda (LMA).
El termino "celula precancerosa" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una celula caracterizada por un crecimiento anormal no controlado o una celula derivada de dicha celula. El termino "celula precancerosa" incluye, por ejemplo, una celula precancerosa primaria obtenida de un paciente con trastorno precanceroso o lmea celular derivada de tal celula o de una celula madre de cancer. De forma similar, una "celula precancerosa hematologica" se refiere a una celula precancerosa derivada de una celula sangumea o de medula osea. En una realizacion, la celula precancerosa hematologica es una celula mieloproliferativa.
El termino "leucemia" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cualquier enfermedad que implique la proliferacion progresiva de leucocitos anormales encontrados en tejidos hemopoyeticos, otros organos y usualmente en la sangre en un numero aumentado. "Celulas leucemicas" se refiere a leucocitos caracterizados por una proliferacion aumentada anormal de celulas. Las celulas leucemicas pueden obtenerse de un sujeto diagnosticado con leucemia.
El termino "leucemia mieloide aguda" o "leucemia mielogena aguda" ("LMA") se refiere a un cancer de la lmea mieloide de celulas sangumeas, caracterizado por el rapido crecimiento de globulos blancos anormales que se acumulan en la medula osea e interfieren con la produccion de celulas sangumeas normales. Las condiciones preleucemicas tales como los smdromes mielodisplasicos o mieloproliferativos tambien pueden desarrollarse en LMA.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "leucemia monocftica" se refiere a un subtipo de leucemia caracterizado por la expresion de CD14, e incluye la leucemia monocftica aguda, que es un subtipo de leucemia mieloide aguda. En una realizacion, se identifica un sujeto que tiene leucemia monocftica aguda si tienen mas de un 20% de blastocitos en la medula osea, y de estos, mas del 80% pertenecen al linaje monocftico.
El termino "antagonista del receptor de dopamina" se refiere a un compuesto que produce cualquier reduccion detectable o mensurable en la funcion o actividad de uno o mas receptores de dopamina. En una realizacion, los receptores de dopamina (DR) se seleccionan entre DR1, DR2, DR3, dR4 y DR5. Los antagonistas del receptor de la dopamina pueden ser selectivos para uno o multiples receptores de dopamina, es decir, un "antagonista multirreceptor". Ejemplos de antagonistas de dopamina multirreceptores incluyen tioridazina y clorpromazina. Los receptores de dopamina se agrupan comunmente en receptores de dopamina de la familia D1 (DR1 y DR5) y receptores de dopamina de la familia D2 (DR2, DR3 y DR4). En una realizacion, el antagonista del receptor de dopamina es un compuesto seleccionado de entre los enumerados en la Tabla 1.
Tabla 1. Antagonistas de Dopamina adecuados para uso en los metodos de la presente memoria
Antagonista del receptor de dopamina
Mecanismo de accion
Sal de maleato de acetopromazina
Antagonista dopaminergico
Amisulprida
Antagonista de los receptores D2 y D3
Amoxapina
Inhibidor de la recaptacion de dopamina
Azaperona
Antagonista de los receptores dopaminergicos
Benperidol
Antagonista de la dopamina
Benzo[a]fenantridina-10,11-diol, 5,6,6a,7,8,12b- hexahidro-, trans- [CAS]
Ligando D1
Promoprida
Antagonista de la dopamina
Bromperidol
Antagonista de la dopamina
Clorhidrato de clorpromazina
Antagonista de D2, D1, D3, D4 y D5 selectivos
Clorhidrato de clorprotixeno
Antagonista de D2 del receptor de la dopamina
Clorhidrato de clomipramina
derivado de clorpromazina
Disulfiram
Inhibidor de la beta-hidroxilasa de la dopamina
DO 897/99
Antagonista de D3
Domperidona
Antagonistas de la dopamina
DROPERIDOL
Antagonista de D2 (receptor de dopamina)
Clorhidrato de etopropazina
Derivado de tioridazina
Fluperlapina
Antagonista de D2 (receptor de dopamina)
Diclorhidrato de flufenazina
Antagonista de dopamina, antagonista de D1 & D2
Diclorhidrato de GBR 12909
Inhibidor de la recaptacion de dopamina
Haloperidol
Antagonista de la dopamina D2, antagonista no selectivo
Clorhidrato de hidrastinina
Bloqueador del receptor de la dopamina
Indatralina
antagonista potente D
Itoprida
Receptores D2 de dopamina e inhibicion de la ECA
LEVOSULPIRIDA
Antagonista de D2, D3 & D4
Succinato de loxapina
Antagonista de la dopamina/D2, D4
Mesoridazina
Antagonista de D2
Besvalato de mesoridazina
Antagonista de D
Sal de maleato de metotrimeprazina
Derivado de tioridazina
Clorhidrato de metixeno
Derivado de tioridazina
Clorhidrato de molindona
Antagonista del receptor de la dopamina
Nafadotrida
Antagonista de D3
Maleato de nomifensina
Inhibidor de la captacion de dopamina
OLANZAPINA
Antagonista de D1 & D2
PEROSPIRONE HCl
Antagonista D2 & D4
Perfenazina
Antagonista D1 & D2
FENOTIAZINA
Derivado de tioridazina
Pimozida
Antagonista de la dopamina
Piperacetazina
Derivado de tioridazina
Proclorperazina
Derivado de tioridazina
Dimaleato de proclorperazina
Antagonista de la dopamina
Clorhidrato de promazina
Antagonista del receptor de la dopamina
Clorhidrato de prometazina
Derivado de tioridazina
Quetiapina
antagonista de los receptores de serotonina y dopamina
HEMIFUMARATO DE QUETIAPINA
Antagonista de D2
Clorhidrato de R(+)-SCH-23390
Antagonista de D1
Racloprida
Antagonista de D2
Clorhidrato de Remoxiprida
Antagonista dopaminergico
RISPERIDONA
Antagonista de D1 & D2
Clorhidrato de S(-)eticloprida
Antagonista del receptor de la dopamina
Sertindol
Antagonista del receptor de dopamina D2/ serotonina 5- HT2
SKF 83566
Antagonista de D1
Spiperona
Antagonista de D2
Sulpirida
Antagonista de D2
Sulpirida
Antagonista de D2 & D3
Malato de tietilperazina
Derivado de tioridazina
Dimesilato de tioproperazina
Antagonista de D1 & D2
Clorhidrato de tioridazina
Derivado de tioridazina
Diclorhidrato de triflupromazina
Antagonista de D2
Clorhidrato de Triflupromazina
Antagonista de D1 & D2
Tartrato de trimeprazina
Derivado de tioridazina
Clorhidrato de trimetobenzamida
Antagonista de D2
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Clorhidrato de ziprasidona
Antagonista de dopamina D2/ serotonina 5-HT2
Zotepina
Antagonista de dopamina D2/serotonina 5-HT2
Como se usa en la presente memoria, el termino "fenotiazina" o "derivado de fenotiazina" se refiere a un compuesto que se deriva o contiene una fraccion o estructura principal de fenotiazina. La fenotiazina tiene la formula S(CaH4)2NH y los derivados de fenotiazina comprenden una o mas sustituciones o adiciones a la fenotiazina. Por ejemplo, algunos derivados de fenotiazina tienen una estructura de tres anillos en la que dos anillos de benceno estan unidos por un nitrogeno y un azufre. Ejemplos de derivados de fenotiazina incluyen tioridazina, clorpromazina, levomepromazina, mesoridazina, flufenazina, perfenazina, proclorperazina y trifluoperazina. Ejemplos adicionales de derivados de fenotiazina para uso en los metodos de la presente descripcion se exponen en la Tabla 1. En una realizacion, la tioridazina tiene el nombre IUPAC 10-{2-[(RS)-1-Metilpiperidin-2-il]etil}-2-metilsulfanilfenotiazina. Opcionalmente, se usan una o mas formas racemicas de un derivado de fenotiazina tal como tioridazina en los metodos descritos en la presente memoria.
Tal como se usa en la presente memoria, "reducir la proliferacion de una celula cancerosa" se refiere a una reduccion en el numero de celulas que surgen de una celula cancerosa como resultado del crecimiento celular o division celular e incluye la muerte celular o la diferenciacion de una celula madre de cancer. El termino "muerte celular" tal como se utiliza en la presente memoria incluye todas las formas de muerte celular incluyendo necrosis y apoptosis. Tal como se usa en el presente documento, la "diferenciacion de una celula madre de cancer" se refiere al proceso mediante el cual una celula madre de cancer pierde la capacidad de autorrenovarse y provocar los linajes de celulas cancerosas que comprenden un tumor o una neoplasia maligna hematologica. Como se usa aqm, "matar una celula madre de cancer" incluye todas las formas de muerte celular incluyendo necrosis y apoptosis.
El termino "determinar un pronostico" se refiere a una prediccion del progreso y/o resultado probable de una enfermedad, que opcionalmente incluye resultados definidos (tales como recuperacion, smtomas, caractensticas, duracion, recurrencia, complicaciones, muertes y/o tasas de supervivencia).
Tal como se usa en la presente memoria, el termino "control" se refiere a una muestra comparativa o a un valor predeterminado. En una realizacion, "control" se refiere a un nivel de expresion de un biomarcador como se describe en la presente memoria. En una realizacion, el control es representativo de celulas, tejidos o sangre normales, libres de enfermedad. En una realizacion, el control es representativo de sujetos con cancer para los cuales se conoce el resultado clmico o la gravedad de la enfermedad. Por ejemplo, en una realizacion el "control" es representativo de sujetos que han sobrevivido durante al menos 5 anos despues de un diagnostico con LMA. En una realizacion, el "control" es representativo de sujetos con cancer que tienen una etapa particular del grado de la enfermedad. En una realizacion, el "control" es representativo de celulas madre que no son celulas madre de cancer. En algunas realizaciones, el termino "control" se refiere a una muestra de un sujeto tomada en un momento de tiempo anterior.
El termino "sujeto" tal como se utiliza en la presente memoria incluye todos los miembros del reino animal incluyendo mairnferos, y se refiere adecuadamente a seres humanos. Opcionalmente, el termino "sujeto" incluye mairnferos que han sido diagnosticados con cancer o estan en remision.
II. Metodos y usos
Se ha encontrado sorprendentemente que los antagonistas del receptor de dopamina (DR) son citotoxicos para las lmeas LMA y las LMA primarias, siendo al mismo tiempo mucho menos toxicos para las celulas madre hematopoyeticas normales. Como se muestra en los Ejemplos 2 y 10, el antagonista de DR tioridazina redujo significativamente la funcion de celulas madre leucemicas (CML) mientras se preservaba la capacidad de celulas madre hematopoyeticas normales.
En una realizacion, los antagonistas del receptor de dopamina son antagonistas para uno o mas de los receptores de dopamina (DR) tales como DR1, DR2, DR3, DR4 y DR5. Opcionalmente, el antagonista de DR es un antagonista de multiples receptores, o es espedfico para un solo subtipo de receptor de dopamina. En una realizacion, el antagonista de DR es un derivado de fenotiazina tal como tioridazina, o clorpromazina. En una realizacion, el antagonista de DR se selecciona entre los compuestos enumerados en la Tabla 1.
En una realizacion, los metodos o usos descritos en la presente invencion implican un derivado de fenotiazina tal como tioridazina o clorpromazina. Un experto en la tecnica facilmente podna identificar derivados adicionales de fenotiazina que son antagonistas del receptor de dopamina. En una realizacion, los derivados de fenotiazina tienen una toxicidad diferencial para celulas cancerosas, tales como celulas leucemicas, en comparacion con celulas madre normales o celulas madre hematopoyeticas.
Un metodo in vitro para reducir la proliferacion de una celula o celulas cancerosas que comprende poner en contacto la celula con un antagonista del receptor de dopamina. Tambien se describe el uso in vitro de un antagonista del receptor de dopamina para reducir la proliferacion de una celula o celulas cancerosas. En un ejemplo, la celula cancerosa es una celula madre de cancer. En un ejemplo, el antagonista de DR induce la diferenciacion o muerte
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celular de una celula madre de cancer. En un ejemplo, el antagonista de DR induce la muerte celular de una celula cancerosa. La celula cancerosa puede ser una celula precancerosa tal como una celula mielodiplasica o mieloproliferativa. En un ejemplo, la celula cancerosa es una celula cancerosa hematologica. En un ejemplo, la celula cancerosa es una celula leucemica, tal como una celula de un sujeto con LMA. En un ejemplo, el antagonista del receptor de DR es un derivado de fenotiazina tal como tioridazina o clorpromazina. En un ejemplo, el antagonista de DR se selecciona entre los compuestos enumerados en la Tabla 1.
Como se muestra en el Ejemplo 4 y la Figura 5, los solicitantes han mostrado sorprendentemente que algunas lmeas celulares de LMA y celulas de LMA primarias presentan un aumento relativo en la expresion de receptores de dopamina en comparacion con las celulas madre hematopoyeticas normales. Por lo tanto, la seleccion de sujetos con cancer para la expresion de receptores de dopamina en celulas cancerosas puede servir para identificar sujetos que se beneficianan del tratamiento con antagonistas del receptor de dopamina.
Se ha observado la expresion de receptores de dopamina en muestras de cancer de mama y LMA y puede servir como un biomarcador para la gravedad de la enfermedad. Como se muestra en el Ejemplo 11 y en las Figuras 14g- h, los altos niveles de expresion de DR se correlacionan con un mal pronostico mientras que los niveles bajos muestran un mejor pronostico.
Como se muestra en el Ejemplo 11, la expresion del receptor de dopamina demarca celulas madre de cancer humano de otras celulas tales como CMPh normales que expresan el marcador pluripotente SSEA3. Por consiguiente, en una realizacion, se proporciona un metodo para identificar una celula madre de cancer a partir de una poblacion de celulas que comprende determinar si una celula expresa uno o mas biomarcadores seleccionados entre el receptor de dopamina (dR) 1, DR2, DR3, DR4 y DR5. En una realizacion, la expresion de DR1, DR2, DR3, DR4 o DR5 es indicativa de que la celula es una celula madre de cancer. Opcionalmente, la expresion de 2 o mas, 3 o mas, 4 o mas o todos los 5 DR es indicativa de que la celula es una celula madre de cancer. En una realizacion, una celula que expresa DR1, DR2, DR3, DR4 y DR5 se identifica como una celula madre de cancer.
En una realizacion, la celula madre de cancer se identifica a partir de una poblacion de celulas. En una realizacion, la poblacion de celulas contiene mas de un tipo de celulas, tales como celulas somaticas, celulas madre pluripotentes, celulas cancerosas y/o celulas madre de cancer. En una realizacion, la poblacion de celulas es una pluralidad de celulas en cultivo celular, tal como cultivo de tejido. En una realizacion, la poblacion de celulas es de un mairnfero, tal como una muestra de tejido primario o una muestra de sangre. En una realizacion, la poblacion de celulas es de un marnffero con cancer o que se sospecha que tiene cancer. En una realizacion, la poblacion de celulas incluye celulas madre, celulas madre somaticas y/o celulas madre pluripotentes, asf como una o mas celulas madre de cancer. En una realizacion, la poblacion de celulas incluye celulas cancerosas o celulas precancerosas tales como celulas cancerosas hematologicas. En una realizacion, la poblacion de celulas incluye celulas monocfticas. En una realizacion, la poblacion de celulas incluye celulas de cancer de mama. Opcionalmente, la poblacion de celulas es de una muestra de tejido, tal como una muestra de tumor, que se ha disociado en celulas individuales.
En un aspecto del metodo, la etapa de determinar si la celula expresa uno o biomarcadores comprende probar la celula para la expresion de polinucleotidos o polipeptidos que codifican para DR1, DR2, DR3, DR4 o DR5. Por ejemplo, se pueden usar metodos conocidos en la tecnica tales como RT-PCR o genes informadores que detectan la expresion de polinucleotidos, o metodos inmunohistoqmmicos que detectan la expresion de polipeptidos, para determinar la expresion de un biomarcador tal como DR1, DR2, DR3, DR4 o DR5. En una realizacion, los biomarcadores son biomarcadores de la superficie celular y el metodo implica detectar DR1, DR2, DR3, DR4 o DR5 expresados en la superficie de la celula.
En una realizacion, los metodos para identificar una celula madre de cancer o determinar un nivel de celulas madre de cancer como se describe en la presente memoria incluyen determinar el nivel de expresion de uno o mas biomarcadores seleccionados entre el receptor de dopamina (DR) 1, DR2, DR3, DR4 y DR5 y luego comparar el nivel de expresion con un nivel de control. Por ejemplo, en una realizacion el control representa celulas que no son celulas madre de cancer, tales como celulas madre somaticas, celulas madre hematopoyeticas o celulas que expresan el marcador de pluripotencia SSEA3, y celulas que tienen un mayor nivel de expresion de los biomarcadores DR1, DR2, DR3, DR4 y/o DR5 en comparacion con el control se identifican como celulas madre de cancer. Opcionalmente, las celulas que tienen una mayor cantidad de expresion en comparacion con el control se identifican como celulas madre de cancer (por ejemplo, al menos 2X, 5X o 10X, etc.).
En una realizacion, el metodo tambien puede comprender: (a) proporcionar una poblacion de celulas (b) poner en contacto a la poblacion con un agente que se une espedficamente a uno o mas biomarcadores seleccionados de DR1, DR2, dR3, DR4 y DR5; y (c) seleccionar celulas que se unen espedficamente al agente de (b), identificando asf y/o aislando celulas madre de cancer de una poblacion de celulas. En una realizacion, el agente es un anticuerpo que se une selectivamente a un biomarcador. En una realizacion, los metodos descritos aqrn pueden incluir opcionalmente dos o mas etapas de seleccion o de aislamiento. Los metodos descritos aqrn tambien pueden incluir una seleccion de etapa negativa, por ejemplo, excluyendo celulas que expresan uno o mas marcadores expresados
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en celulas que no son celulas madre de cancer, o excluyendo celulas que muestran niveles reducidos de expresion de un marcador particular.
En una realizacion, la presente descripcion incluye aislar celulas madre de cancer de una poblacion de celulas. Por ejemplo, en una realizacion, las celulas que se identifican como celulas madre de cancer se afslan de celulas que no son celulas madre de cancer o de otros materiales en una muestra seleccionando o aislando celulas que expresan uno o mas biomarcadores seleccionados de DR1, DR2, DR3, DR4 y DR5. Opcionalmente, las celulas madre de cancer se afslan o seleccionan usando metodos conocidos en la tecnica para clasificar celulas basandose en la expresion de uno o mas biomarcadores. Por ejemplo, en una realizacion, la etapa de aislar las celulas madre de cancer de la poblacion de celulas comprende citometria de flujo, clasificacion de celulas activadas por fluorescencia, panoramizacion, separacion por columna de afinidad o seleccion magnetica. En una realizacion, las celulas que expresan uno o mas receptores de dopamina se afslan utilizando un agente de union que se une selectivamente a receptores de dopamina que esta conjugado con un soporte tal como el matric en una columna de separacion o perlas magneticas. En una realizacion, los metodos incluyen determinar el nivel de celulas madre de cancer en una muestra mediante la deteccion de uno o mas biomarcadores asociados con celulas madre de cancer y/o uno o mas biomarcadores asociados con celulas diferenciadas como se describe en la presente memoria.
En un aspecto de la descripcion, los metodos descritos aqrn incluyen determinar el nivel de uno o mas biomarcadores en una muestra de un sujeto, tal como el nivel de uno o mas receptores de dopamina. En una realizacion, la muestra comprende celulas cancerosas o se sospecha que comprende celulas cancerosas o celulas precancerosas. Por ejemplo, la muestra puede comprender una muestra de sangre, por ejemplo, una muestra de sangre periferica, una muestra de sangre fraccionada, una muestra de medula osea, una biopsia, una muestra de tejido congelada, una muestra de tejido fresco, una muestra celular y/o una seccion incrustada en parafina. En una realizacion, el sujeto tiene o se sospecha que tiene LMA y la muestra comprende celulas mononucleares. En ciertas realizaciones, la muestra se procesa antes de detectar el nivel de biomarcador. Por ejemplo, una muestra puede fraccionarse (por ejemplo, por centrifugacion o usar una columna para exclusion por tamano o por FACS usando un biomarcador para monocitos), concentrarse o procesarse, dependiendo del metodo de determinacion del nivel de biomarcador empleado.
El nivel de expresion de los biomarcadores descritos en la presente memoria se puede determinar por metodos conocidos comunmente por un experto en la tecnica. Por ejemplo, en una realizacion, el nivel de uno o mas biomarcadores se determina midiendo o detectando el nivel de un acido nucleico tal como ARNm, o el nivel de una protema o polipeptido. En una realizacion, la expresion de uno o mas biomarcadores se determina detectando la expresion en la superficie celular de DR1, DR2, DR3, DR4 y/o DR5. En una realizacion, los metodos descritos en la presente memoria incluyen la deteccion de un biomarcador usando inmunohistoqmmica, tal como utilizando anticuerpos espedficos para el biomarcador u otro agente de deteccion espedfico de biomarcador. Ejemplos de anticuerpos del receptor de dopamina adecuados para su uso en los metodos descritos aqrn se enumeran tambien en el Ejemplo 7 de la presente descripcion.
En una realizacion, el nivel de un ARNm que codifica para un biomarcador se determina mediante PCR cuantitativa tal como RT-PCR, analisis en serie de la expresion genica (SAGE), uso de un microarreglo, tecnologfa digital de codigos de barras o transferencia de Northern. Un experto en la tecnica apreciara que se pueden usar varios metodos para determinar el nivel de un biomarcador, incluyendo enfoques de espectrometna de masas, tales como control de reaccion multiple (CRM) y control de iones del producto (ClP), e incluyendo tambien metodos basados en anticuerpos tales como inmunoensayos tales como transferencias de Western y ensayos de inmunoabsorcion ligados a enzimas (ELISA). En ciertas realizaciones, la etapa de determinar la expresion de un biomarcador tal como uno o mas receptores de dopamina como se describe en la presente memoria, comprende el uso de inmunohistoqmmica y/o un inmunoensayo. En ciertas realizaciones, el inmunoensayo es un ELISA. En aun otra realizacion, el ELISA es un ELISA tipo sandwich.
El termino "nivel" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una cantidad (por ejemplo, cantidad relativa o concentracion) de un biomarcador o tipo celular que es detectable o medible en una muestra. Por ejemplo, el nivel puede ser una concentracion tal como pg/L o una cantidad relativa tal como 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3,0, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4,0, 4,2, 4,4, 4,6, 4,8, 5,0, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 60, 80 y/o 100 veces o mas a un nivel de control, estandar o nivel de referencia. Opcionalmente, un control es un nivel tal como el nivel medio o mediano en una muestra de control. El nivel de biomarcador puede ser, por ejemplo, el nivel de protema, o de un ARNm que codifica para el biomarcador tal como un receptor de dopamina.
En una realizacion, cuando se determina el nivel de dos o mas biomarcadores, se pueden usar los niveles de los dos o mas biomarcadores para generar un perfil de expresion para el sujeto. Por ejemplo, en una realizacion, los metodos descritos aqrn incluyen determinar un nivel para dos o mas biomarcadores en la muestra, generar un perfil de expresion basado en el nivel de los dos o mas biomarcadores y comparar el perfil de expresion con un perfil de expresion de control. A continuacion, se utiliza una diferencia o similitud en el perfil de expresion de la muestra de prueba y el perfil de expresion de control para determinar un nivel de celulas madre de cancer en una muestra, proporcionar un pronostico para el sujeto de prueba, identificar el sujeto que tiene cancer o indicar si el sujeto es adecuado para el tratamiento con un antagonista del receptor de dopamina.
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Un aspecto adicional de la descripcion incluye metodos de cribado de compuestos para actividad anticancerosa que comprende identificar compuestos que antagonizan uno o mas receptores de dopamina. En una realizacion, los compuestos que antagonizan los receptores de dopamina se identifican por tener actividad anticancengena. En una realizacion, los metodos incluyen cribado de compuestos para identificar aquellos que reducen la proliferacion de celulas madre de cancer en relacion con celulas madre normales, tales como celulas madre hematopoyeticas como se expone en los Ejemplos 7 y 8 de la presente descripcion.
La presente descripcion tambien proporciona metodos para identificar y validar un agente de prueba como un agente selectivo de celulas madre anticancer. En una realizacion, el metodo comprende:
i) poner en contacto una o mas variantes de celulas madre neoplasicas con el agente de prueba y una o mas celulas madre normales con el agente de prueba;
ii) detectar un cambio en el recuento de celulas de las variantes de celulas madre neoplasicas en respuesta al agente de prueba, y detectar un cambio en el recuento de celulas de las celulas madre normales en respuesta al agente de prueba; y
iii) identificar el agente de prueba como un agente selectivo contra celulas madre de cancer si el contacto con el agente de prueba induce una disminucion en el recuento de celulas de las variantes de celulas madre neoplasicas sin inducir una disminucion comparable en las celulas madre normales,
en donde el cambio en el recuento de celulas para las variantes de celulas madre neoplasicas se detecta entre aproximadamente 48 horas y 96 horas despues de ponerse en contacto las celulas con el agente de prueba y se detecta el cambio en el recuento de celulas para las celulas madre normales entre aproximadamente 4 dfas y 6 dfas despues de contactar las celulas con la prueba agente.
Opcionalmente, los metodos descritos aqu incluyen agentes de cribado para seleccionar agentes de prueba que inducen perdida de pluripotencia y/o una disminucion en el recuento de celulas de variantes de celulas madre neoplasicas antes de cribar los agentes de prueba para la actividad diferencial sobre el recuento de celulas de celulas madre normales y variantes de celulas madre neoplasicas. En una realizacion, el metodo incluye cribar uno o mas agentes para identificar uno o mas agentes de prueba que inducen perdida de pluripotencia y una disminucion en el recuento de celulas de variantes de celulas madre neoplasicas. Las realizaciones descritas en este documento tambien incluyen tambien un metodo de dos etapas para identificar y validar un agente de prueba como un agente selectivo de celulas madre anticancer. En una realizacion, el metodo comprende:
i) detectar un cambio en la pluripotencia y un cambio en el recuento de celulas de variantes de celulas madre neoplasicas en respuesta al contacto con el agente y seleccionar un agente como agente de prueba si el agente induce una perdida de pluripotencia y/o una disminucion en el recuento de celulas de las variantes de las celulas madre neoplasicas; y
ii) poner en contacto una o mas variantes de celulas madre neoplasicas con el agente de prueba y poner en contacto una o mas celulas madre normales con el agente de prueba, detectar un cambio en el recuento de celulas de las variantes de celulas madre neoplasicas en respuesta al agente de prueba, detectar un cambio en el recuento de celulas madre normales en respuesta al agente de prueba e identificacion del agente de prueba como un agente selectivo contra celulas madre de cancer si el agente de prueba induce una disminucion en el recuento de celulas de las variantes de celulas madre neoplasicas sin inducir una disminucion comparable en las celulas madre normales.
Los agentes de cribado para seleccionar agentes de prueba que inducen perdida de pluripotencia y una disminucion en el recuento de celulas de variantes de celulas madre neoplasicas antes del cribado para actividad diferencial con respecto al efecto de los agentes de prueba sobre celulas madre normales y variantes de celulas madre neoplasicas proporciona una serie de ventajas. El cribado de los agentes de prueba para la actividad diferencial utilizando celulas madre normales es tanto un recurso intensivo como consumidor de tiempo. El uso de un metodo de cribado en dos etapas permite un enfoque mas espedfico para validar agentes como agentes selectivos contra celulas madre de cancer. En particular, el cultivo de celulas madre normales es relativamente diffcil comparado con el cultivo de celulas madre neoplasicas. El ensayo de aquellos agentes que inducen una perdida de pluripotencia y/o una disminucion en el recuento de celulas de variantes de celulas madre neoplasicas para la actividad diferencial usando celulas madre normales minimiza los recursos y el tiempo que de otro modo senan necesarios para validar agentes contra celulas madre de cancer.
Ademas, se ha determinado que los agentes de identificacion que 1) inducen una perdida de pluripotencia y reducen el recuento de celulas de variantes de celulas madre neoplasicas e 2) inducen una disminucion en el recuento de celulas de las variantes de celulas madre neoplasicas sin inducir una disminucion comparable en las celulas madre normales, es particularmente eficaz para identificar y validar agentes contra celulas madre de cancer que dirigen selectivamente la capacidad de autorrenovacion de las celulas madre de cancer.
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En un aspecto de la descripcion, se ha determinado que los agentes de prueba de cribado sobre variantes de celulas madre neoplasicas y celulas madre humanas normales en una pluralidad de concentraciones de prueba para cambios diferenciales en el recuento de celulas son utiles para la identificacion y validacion de agentes de prueba como agentes selectivos contra celulas madre de cancer. Aunque muchos metodos de cribado de alto rendimiento solo ensayan agentes para la actividad en una sola o en un pequeno numero de concentraciones de prueba, algunos agentes selectivos contra celulas madre de cancer no se identificaran facilmente probando un agente para la actividad diferencial sobre el recuento de celulas a una sola o un pequeno numero de concentraciones de prueba. Como se muestra en la Figura 24 y el Ejemplo 18, la 8-azaguanina y el parbendazol muestran niveles comparables con respecto a una reduccion en el recuento de celulas normalizadas a concentraciones de prueba de aproximadamente 10 nM o aproximadamente 10 jM, pero muestran actividad diferencial a una concentracion de prueba de aproximadamente 1 jM. La floxuridina muestra una actividad diferencial mucho mas pronunciada a 10 nM que a concentraciones mas altas tales como 1 jM o 10 jM.
En consecuencia, en algunas realizaciones, los metodos descritos en la presente memoria incluyen poner en contacto las variantes de celulas madre neoplasicas y las celulas madre normales con un agente de prueba en una pluralidad de concentraciones de prueba y detectar un cambio en el recuento de celulas para una o mas variantes de celulas madre neoplasicas y para las celulas madre normales en la pluralidad de concentraciones de prueba. En una realizacion, la pluralidad de concentraciones de prueba vana en al menos 3 ordenes de magnitud, y opcionalmente al menos 4 o 5 ordenes o magnitudes. En una realizacion, la pluralidad de concentraciones de prueba vana al menos desde aproximadamente 0,01 jM a 2 jM, o al menos desde aproximadamente 10 nM hasta aproximadamente 20 jM. En una realizacion, la pluralidad de concentraciones de prueba vana al menos desde aproximadamente 1 nM hasta aproximadamente 10 jM. En una realizacion, la pluralidad de concentraciones de prueba vana en al menos 3, 4 o 5 ordenes de magnitud e incluye al menos una concentracion de prueba entre 10 nM y 10 jM, entre 10 nM y 1 jM o entre 0,01 jM y 2 jM. En una realizacion, la pluralidad de concentraciones de prueba comprende una serie de diluciones, tal como una serie de diluciones de 5 puntos, 8 puntos o 10 puntos, opcionalmente en donde la pluralidad de las concentraciones de prueba vana en al menos 3, 4 o 5 ordenes de magnitud e incluye al menos una concentracion de prueba entre 10 nM y 10 jM, entre 10 nM y 1 jM o entre 0,01 jM y 2 jM.
En un aspecto de la descripcion, un agente de prueba se pone en contacto con celulas madre normales en una o una pluralidad de concentraciones de prueba y el agente de prueba se pone en contacto con variantes de celulas madre neoplasicas en una o una pluralidad de concentraciones de prueba y se identifica un agente de prueba como un agente selectivo contra celulas madres de cancer si el contacto con el agente de prueba induce una disminucion en el recuento de celulas de las variantes de celulas madre neoplasicas sin inducir una disminucion comparable en las celulas madre normales. La identificacion de agentes de prueba que muestran actividad diferencial con respecto a la disminucion del recuento de celulas de variantes de celulas madre neoplasicas en relacion con celulas madre normales ayuda a identificar agentes que son selectivos para celulas madre de cancer y exhiben menos toxicidad hacia celulas madre normales.
Una persona experta puede usar una variedad de metodos para determinar si un agente de prueba induce una disminucion en el recuento de celulas de las variantes de celulas madre neoplasicas sin inducir una disminucion comparable en las celulas madre normales. Por ejemplo, en una realizacion se compara una curva de respuesta a la dosis para el cambio en el recuento de celulas de variantes de celulas madre neoplasicas con una curva de respuesta a la dosis para el cambio en el recuento de celulas de las celulas madre normales en respuesta al contacto con el agente de prueba a una pluralidad de concentraciones de prueba. En una realizacion, se considera que un agente de prueba induce una disminucion en el recuento de celulas de las variantes de celulas madre neoplasicas sin inducir una disminucion comparable en las celulas madre normales si a una concentracion de prueba unica el recuento de celulas normalizado de las variantes de celulas madre neoplasicas es al menos 10%, 20%, 30%, 40% o 50% menor que el recuento de celulas normalizadas de las celulas madre normales. En una realizacion, se considera que un agente de prueba induce una disminucion en el recuento de celulas de las variantes de celulas madre neoplasicas sin inducir una disminucion comparable en las celulas madre normales si hay una diferencia estadfsticamente significativa entre el recuento de celulas normalizadas de las variantes de celulas madre neoplasicas y las celulas madre normales en respuesta a un agente de prueba. En una realizacion, la diferencia entre el recuento de celulas normalizadas de las variantes de celulas madre neoplasicas y las celulas madre normales en respuesta a un agente de prueba se calcula y/o se compara a una concentracion unica o sobre una pluralidad de concentraciones de prueba tales como calculando y/o comparando el area bajo una curva de respuesta a la dosis.
En una realizacion, los metodos descritos en la presente memoria incluyen la determinacion de una medida cuantificable del cambio en el recuento de celulas en respuesta a un agente de prueba para las variantes de celulas madre neoplasicas y para las celulas madre normales. Por ejemplo, en una realizacion, se determina un valor de concentracion efectiva maxima media (CE50) para la disminucion en el recuento de celulas para las variantes de celulas madre neoplasicas y un valor de CE50 para la disminucion en el recuento de celulas para las celulas madre normales. En una realizacion, se determina la relacion de los valores de CE50 para un agente de prueba dado en celulas madre normales con respecto a variantes de celulas madre neoplasicas y se identifica un agente de prueba como un agente selectivo de celulas madre anticancer si la relacion de los valores de CE50 es mayor que un valor
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predeterminado. Por ejemplo, en una realizacion, se identifica un agente de prueba como un agente selectivo de celulas madre anticancer si la relacion de los valores de CE50 para una disminucion en el recuento de celulas normales con respecto a las variantes de celulas madre neoplasicas es mayor que 2, 3 o 4. En una realizacion preferida, se identifica un agente de prueba como un agente selectivo de celulas madre anticancer si la racion de los valores de CE50 es mayor que 3.
En otro aspecto de la presente descripcion, se investigo el efecto de la densidad de siembra de las variantes de celulas madre neoplasicas y celulas madre normales sobre los metodos para identificar y validar un agente o un agente de prueba como un agente selectivo de celulas madre anticancer. Como se muestra en la Figura 22 y en el Ejemplo 16, la siembra de las variantes de celulas madre neoplasicas y celulas madre normales a densidades de siembra espedficas permite la deteccion rapida y efectiva de agentes selectivos contra celulas madre de cancer como se describe en la presente memoria. El uso de densidades espedficas de celulas para sembrar las variantes de celulas madre neoplasicas y las celulas madre normales como se describe en la presente memoria ayuda a evitar problemas con la reproducibilidad, el crecimiento erratico de celulas y la debilidad de la senal en los metodos de cribado que utilizan estas celulas.
En una realizacion, las variantes de celulas madre neoplasicas se siembran en un primer receptaculo a razon de aproximadamente 3.000 a 7.000 celulas por receptaculo y las celulas madre normales se siembran en un segundo receptaculo a razon de aproximadamente 8.000 a 12.000 celulas por receptaculo. En una realizacion, las variantes de celulas madre neoplasicas se siembran a razon de aproximadamente 4.000 a 6.000 celulas por receptaculo y preferiblemente a razon de aproximadamente 5.000 celulas por receptaculo. En una realizacion, las celulas madre normales se siembran a razon de aproximadamente 9.000 a 11.000 celulas por receptaculo y preferiblemente a razon de aproximadamente 10.000 celulas por receptaculo.
Los metodos aqrn descritos para identificar y validar un agente o un agente de prueba como un agente selectivo de celulas madre anticancer pueden opcionalmente realizarse usando placas de microtitulacion o receptaculos similares que permitan la separacion ffsica de muestras. Por ejemplo, en una realizacion, las variantes de celulas madre neoplasicas se siembran en el primer receptaculo y las celulas madre normales se siembran en el segundo receptaculo y el primer y segundo receptaculos son pozos en la misma placa de microtitulacion o pozos en placas de microtitulacion separadas. La placa de microtitulacion puede ser una placa de microtitulacion de 96 pozos, opcionalmente una placa de microtitulacion recubierta de 96 pozos u otro recipiente similar con una pluralidad de receptaculos utiles en la automatizacion de ensayos de cribado.
Los metodos descritos en la presente memoria comprenden detectar un cambio en el recuento de celulas de variantes de celulas madre neoplasicas o celulas madre normales en respuesta a un agente de prueba. El cambio en el recuento de celulas para las variantes de celulas madre neoplasicas se detecta entre aproximadamente 48 horas y 96 horas despues de ponerse en contacto las celulas con el agente de prueba, opcionalmente aproximadamente 72 horas. El cambio en el recuento de celulas para las celulas madre normales se detecta entre aproximadamente 4 dfas y 6 dfas despues de ponerse en contacto las celulas con el agente de prueba, opcionalmente aproximadamente 5 dfas. En una realizacion, las variantes de celulas madre neoplasicas y las celulas madre normales se ponen en contacto con un agente o un agente de prueba aproximadamente 12 a 36 horas y preferiblemente aproximadamente 24 horas despues de sembrar las variantes de celulas madre neoplasicas, opcionalmente a razon de aproximadamente 3.000 a 7.000 celulas por receptaculo y las celulas madre normales a razon de aproximadamente 8.000 a 12.000 celulas por receptaculo.
Pueden utilizarse una diversidad de metodos conocidos en la tecnica para detectar un cambio en el recuento de celulas de las variantes de celulas madre neoplasicas o celulas madre normales en respuesta a un agente o un agente de prueba. Por ejemplo, en algunas realizaciones se determina un cambio en el recuento de celulas mediante analisis del contenido de acido desoxirribonucleico (ADN), deteccion de un marcador nuclear tal como histonas o laminina nuclear, condensacion nuclear y/o deteccion nuclear tal como por tincion con fluorocromos de union a ADN tales como Hoescht, 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), naranja de acridina, DRAQ5 o safarina. El cambio en el recuento de celulas puede detectarse usando un analisis de alto contenido, opcionalmente analisis de imagenes nucleares u otras tecnicas adecuadas para su uso en ensayos de cribado de alto rendimiento para detectar un cambio en el recuento de celulas en respuesta a un agente o un agente de prueba.
Los metodos descritos aqrn implican el uso de variantes de celulas madre neoplasicas y/o celulas madre normales. Por ejemplo, en una realizacion, las variantes de celulas madre neoplasicas se transforman en celulas madre pluripotentes humanas transformadas (CMPht) o en celulas madre pluripotentes inducidas transformadas (CMPit) tales como las descritas en la publicacion PCT No. WO2011026222. En una realizacion, las celulas madre normales son celulas madre pluripotentes, o celulas madre pluripotentes inducidas, o celulas madre pluripotentes inducidas derivadas de fibroblastos.
Algunas realizaciones de los metodos descritos en la presente memoria comprenden detectar un cambio en la pluripotencia y un cambio en el recuento de celulas de variantes de celulas madre neoplasicas en respuesta al contacto con un agente y seleccionar un agente como agente de prueba si el agente induce una perdida de pluripotencia y/o una disminucion en el recuento de celulas de las variantes de celulas madre neoplasicas. En una
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realizacion preferida, se selecciona un agente como agente de prueba si el agente induce una perdida de pluripotencia y una disminucion en el recuento de celulas de las variantes de celulas madre neoplasicas. En una realizacion preferida, las variantes de celulas madre neoplasicas se ponen en contacto con un agente a una concentracion de prueba unica con el fin de seleccionar agentes de prueba. El uso de una unica concentracion de prueba para seleccionar agentes de prueba en una primera etapa minimiza los recursos y el tiempo requeridos para seleccionar e identificar agentes contra celulas madre de cancer en los metodos descritos en la presente memoria. Por ejemplo, en una realizacion las variantes de celulas madre neoplasicas se ponen en contacto con un agente a 10 jM. Opcionalmente, se pone en contacto un agente de prueba con variantes de celulas madre neoplasicas y celulas madre normales a una pluralidad de concentraciones de prueba para identificar el agente de prueba como un agente selectivo contra celulas madre de cancer si el agente de prueba induce una disminucion en el recuento de celulas de las variantes de celulas madre neoplasicas sin inducir una disminucion comparable en las celulas madre normales.
En una realizacion, se selecciona un agente como agente de prueba si el agente induce una perdida o pluripotencia y/o una disminucion en el recuento de celulas de las variantes de celulas madre neoplasicas. En algunas realizaciones, se selecciona un agente como agente de prueba si el agente induce una perdida o pluripotencia y/o una disminucion en el recuento de celulas que es estadfsticamente significativa. Por ejemplo, en una realizacion, se criban una pluralidad de agentes en una placa de microtitulacion y se seleccionan como agentes de prueba con base en una desviacion estandar de umbral respecto a la media. En una realizacion, se selecciona un agente como un agente de prueba con base en un umbral de una puntuacion Z de al menos 3 desviaciones estandar de la media, opcionalmente de la media de toda la placa para el cambio en pluripotencia y cambio en el recuento de celulas.
En algunas realizaciones, los metodos descritos en la presente memoria incluyen el uso de controles positivos y/o negativos. Por ejemplo, en una realizacion se usan variantes de celulas madre neoplasicas tratadas con una sustancia tal como BMP4 que induce una perdida de pluripotencia en variantes de celulas madre neoplasicas como control positivo. En una realizacion, las celulas tratadas con al menos 100 ng/mL de BMP4 se usan como control positivo. Otras realizaciones pueden emplear el uso de agentes de diferenciacion tales como activina A, acido retinoico, acido ascorbico, nicotinamida, insulina o transferrina.
Pueden utilizarse una diversidad de metodos conocidos en la tecnica para detectar una perdida de pluripotencia de las variantes de celulas madre neoplasicas en respuesta a un agente. Por ejemplo, en una realizacion, se detecta un cambio en la pluripotencia de las variantes de celulas madre neoplasicas detectando un cambio en el nivel de expresion de uno o mas marcadores de pluripotencia. Se puede detectar un cambio en el nivel de expresion de un marcador de pluripotencia mediante el uso de deteccion inmunohistoqmmica tal como anticuerpos selectivos para el marcador de pluripotencia o mediante el uso de otros metodos para analizar la expresion de genes tales como RT- PCR cuantitativa. La expresion de uno o mas marcadores de pluripotencia tambien puede estar operativamente unida a un gen indicador en las variantes de celulas madre neoplasicas y se detecta un producto del gen indicador. En una realizacion preferida, el gen informador codifica la protema fluorescente verde (PFV), o un gen que genera un producto de expresion que se detecta facilmente usando metodos de cribado de alto rendimiento tales como analisis de imagenes. En una realizacion, el marcador de pluripotencia se selecciona entre Oct4 y Sox2. En una realizacion, el marcador de pluripotencia se selecciona entre Oct4, Sox2, Nanog, SSEA3, SSEA4, tRA-1-60, TRA-1- 81, receptor de IGF1, conexina 43, E-cadherina, fosfatasa alcalina, REX1, CRIPTO, CD24, CD90, CD29, CD9 y CD49f, y mezclas de los mismos.
En algunas realizaciones, los metodos para identificar y validar un agente o un agente de prueba como un agente selectivo de celulas madre anticancer, comprenden ademas el cribado de un agente de prueba identificado como un agente selectivo contra celulas madre de cancer para la actividad en una lmea celular de cancer derivada de un sujeto con cancer. Por ejemplo, en una realizacion, la lmea celular cancerosa puede ser una lmea celular leucemica, opcionalmente una lmea celular de leucemia mieloide aguda (LMA). En una realizacion, la actividad es citotoxicidad, induccion de apoptosis, perdida de pluripotencia, induccion de diferenciacion o combinaciones de los mismos, de la lmea celular de cancer.
En algunas realizaciones, los metodos descritos en la presente memoria para identificar y validar un agente o agente de prueba como un agente selectivo contra celulas madre de cancer comprenden ademas el cribado de un agente de prueba identificado como un agente selectivo contra celulas madre de cancer para inducir la expresion de uno o mas genes de respuesta al estres, opcionalmente uno o mas biomarcadores apoptoticos tales como Anexina V, p53 y/o p21.
Se ha determinado sorprendentemente que los compuestos estructuralmente similares a la tioridazina son eficaces para inducir la diferenciacion de celulas madre de cancer o para matar celulas madre de cancer. En particular, los compuestos que son estructuralmente similares a la tioridazina son utiles para inducir selectivamente la diferenciacion de celulas madre de cancer o reducir la proliferacion de celulas madre de cancer. Como se muestra en la Figura 26 y Ejemplo 20, el tratamiento de una lmea celular enriquecida por celulas madre de cancer (CMC) con tioridazina se dirige selectivamente a la poblacion de CMC que expresan receptores de dopamina y da como resultado un aumento en celulas que expresan CD24.
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Tambien se describe un metodo in vitro para inducir selectivamente la diferenciacion de una celula madre de cancer o reducir la proliferacion de una celula madre de cancer que comprende poner en contacto la celula madre de cancer con un compuesto que tiene un coeficiente de similitud de Tanimoto con tioridazina de al menos 0,6. En un ejemplo, el compuesto se selecciona del grupo que consiste en tioridazina, proclorperazina, trifluoperazina, flufenazina, perfenazina y triflupromazina. En algunos ejemplos, el compuesto que tiene un coeficiente de similitud de Tanimoto con la tioridazina de al menos 0,6 es un derivado de fenotiazina. En algunos ejemplos, el compuesto induce preferentemente la diferenciacion de celulas madre de cancer con respecto a las celulas madre normales.
En algunas realizaciones, el agente contra celulas madre de cancer es un antagonista del receptor de dopamina o un agente que selectivamente se dirige a celulas madre de cancer como se describe en el presente documento, incluyendo, pero sin limitarse a los agentes enumerados en la Figura 23. En una realizacion, el antagonista del receptor de dopamina tiene un coeficiente de similitud de Tanimoto con la tioridazina de al menos 0,6. Opcionalmente, el antagonista del receptor de dopamina es un derivado de fenotiazina o un compuesto seleccionado entre tioridazina, proclorperazina, trifluoperazina, flufenazina, perfenazina y triflupromazina.
En un aspecto, los metodos descritos en la presente memoria son utiles para determinar un curso de tratamiento o controlar a un sujeto sometido a tratamiento con un agente contra celulas madre de cancer mediante la deteccion de una reduccion en celulas madre de cancer y/o la diferenciacion o perdida de pluripotencia de celulas madre de cancer en respuesta al agente contra celulas madre de cancer. En consecuencia, en una realizacion la determinacion de un nivel de celulas madre de cancer en la muestra comprende determinar una fraccion de celulas madre de cancer en relacion con celulas diferenciadas en la muestra. En una realizacion, la deteccion de un cambio en la fraccion de celulas madre de cancer en relacion con celulas diferenciadas en una muestra de un sujeto en el tiempo o en comparacion con una muestra de control es util para determinar un curso de tratamiento o control de un sujeto con cancer o sospechoso de tener cancer como se describe en la presente memoria.
En una realizacion, puede determinarse un nivel de celulas madre de cancer en una muestra detectando la expresion de uno o mas biomarcadores o una firma de biomarcadores asociados con celulas madre de cancer y/o uno o mas biomarcadores o una firma de biomarcadores asociados con celulas diferenciadas. Por ejemplo, las celulas madre de cancer se pueden detectar en una muestra probando la muestra para la expresion de uno o mas receptores de dopamina (DR) seleccionados de DR1, DR2, DR3, DR4, DR5 y uno o mas de CD14, CD34 y CD44. Como se muestra en la Figura 14, la expresion de DR es indicativa de la presencia de celulas madre de cancer. En una realizacion, la muestra comprende celulas leucemicas o celulas sospechosas de ser celulas leucemicas y los biomarcadores asociados con celulas diferenciadas se seleccionan entre CD11B+ CD114+ y CD16+. En una realizacion, la muestra comprende celulas de cancer de mama o celulas sospechosas de ser celulas de cancer de mama y el biomarcador asociado con celulas diferenciadas es CD24-.
En una realizacion, se puede determinar un nivel de celulas madre de cancer en una muestra o un cambio en el nivel de celulas madre de cancer en una muestra detectando la expresion de biomarcadores asociados con celulas madre de cancer en relacion con la expresion de biomarcadores asociados con celulas diferenciadas. Por ejemplo, en una realizacion, un aumento en la fraccion de celulas que expresan CD11b en relacion con celulas que expresan biomarcadores asociados con celulas madre de cancer leucemico (tales como DR+, CD14+) es indicativo del efecto del agente contra celulas madre de cancer en la diferenciacion de celulas madre de cancer y no simplemente matando las celulas cancerosas. En una realizacion, un aumento en la fraccion de celulas que expresan CD24 es indicativo del efecto del agente contra celulas madre de cancer en diferenciar celulas madre de cancer de mama y no simplemente matar celulas cancerosas. En una realizacion, un aumento en la fraccion de celulas que expresan CD24 con respecto a celulas que expresan CD44, y opcionalmente uno o mas receptores de dopamina, es indicativo del efecto del agente contra celulas madre de cancer en la diferenciacion de celulas madre de cancer de mama y no simplemente matando las celulas del cancer de mama.
En una realizacion, el nivel de celulas madre de cancer en una muestra se puede determinar detectando la expresion de biomarcadores conocidos en la tecnica que se asocian con celulas madre de cancer. Por ejemplo, Eppert et al. (2011) y Al-Hajj et al. (2003) (se incorporan por referencia en su totalidad) describen biomarcadores y firmas de expresion genica que estan asociados con celulas madre espedficas de cancer tales como celulas madre de cancer leucemico.
Se pueden ensayar muestras para la expresion de biomarcadores asociados con celulas madre de cancer o celulas diferenciadas usando metodos inmunohistoqmmicos para detectar niveles de protema, metodos basados en fluorescencia tales como FACS o RT-PCR o metodos basados en RT-PCR cuantitativa para detectar niveles de transcritos de biomarcadores o utilizando otros metodos como se describen en la presente memoria o conocidos en la tecnica.
En una realizacion, determinar un nivel de celulas madre de cancer en una muestra comprende detectar la presencia o ausencia de celulas madre de cancer en la muestra. Otros metodos para determinar la presencia o ausencia de celulas madre de cancer incluyen el uso de estudios de xenotrasplante en modelos animales tales como ratones.
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En una realizacion, la muestra comprende celulas cancerosas o celulas sospechosas de ser celulas cancerosas. En una realizacion, la muestra es de un sujeto con cancer o que se sospecha que tiene cancer. Opcionalmente, la muestra puede ser una muestra de sangre periferica, o una muestra de medula osea. En algunas realizaciones, la muestra puede ser una muestra de tejido tal como una biopsia de tejido u otra toma de muestra biologica de un sujeto con cancer o que se sospecha que tiene cancer. Por ejemplo, en algunas realizaciones la muestra es de un sujeto con leucemia e incluye celulas leucemicas o celulas sospechosas de ser celulas leucemicas o es de un sujeto con cancer de mama e incluye celulas de cancer de mama o celulas sospechosas de ser celulas de cancer de mama. Opcionalmente, la muestra se procesa antes de determinar el nivel de celulas madre de cancer, para eliminar otros tipos de celulas o restos celulares o para seleccionar celulas que son celulas cancerosas, incluyendo celulas madre de cancer. Por ejemplo, en una realizacion la muestra es una muestra de sangre periferica que contiene celulas leucemicas y la muestra se enriquece en una poblacion de celulas que son CD34+ o CD34+ CD38- antes de determinar un nivel de celulas madre de cancer. En una realizacion, la muestra es una muestra de cancer de mama y la muestra se enriquece en una poblacion de celulas que son CD44+ CD24- antes de determinar un nivel de celulas madre de cancer.
En una realizacion, la muestra comprende celulas leucemicas o celulas sospechosas de ser celulas leucemicas y determinar la presencia de ausencia de celulas madre de cancer comprende ensayar la muestra para CD14 y uno o mas biomarcadores asociados con celulas madre de cancer tales como DR1, DR2, DR3, DR4 y DR5. En una realizacion, la expresion de CD14 y uno o mas receptores de dopamina es indicativa de la presencia de celulas madre de cancer en la muestra. En una realizacion, la expresion de CD14, CD34 y uno o mas receptores de dopamina es indicativa de la presencia de celulas madre de cancer leucemico en la muestra.
En una realizacion, la muestra comprende celulas de cancer de mama o celulas sospechosas de ser celulas de cancer de mama y determinar la presencia de ausencia de celulas madre de cancer comprende ensayar la muestra por la expresion de CD44 y CD24. En una realizacion, detectar celulas que expresan CD44 y no expresan CD24 es indicativa de la presencia de celulas madre de cancer.
Los siguientes ejemplos no limitativos son ilustrativos de la presente divulgacion:
Ejemplos
Ejemplo 1: La tioridazina es citotoxica para las lmeas celulares leucemicas
El efecto de la tioridazina sobre el numero de celulas normalizadas se evaluo en 3 lmeas de celulas leucemicas: HL- 60, MV4-11 y OCI-AML3. Todas las tres lmeas son lmeas celulares leucemicas. HL-60 se derivo de LMA promielocftica, mientras que MV 4-11 y OCI-AML3 son representativos de la LMA. Cada compuesto se incubo con las celulas durante 72 h. El control fue DMSO (es decir, el vehmulo utilizado para el compuesto) durante 72 h. Cada condicion tema tres repeticiones.
Tal como se muestra en la Figura 1, las dosis de 0,1 pM y 1 pM de tioridazina tuvieron poco efecto sobre el numero de celulas normalizadas, mientras que a 10 pM el numero de celulas normalizadas se redujo a casi cero.
Ejemplo 2: Actividad diferencial de la tioridazina sobre el potencial de formacion de blastocitos de LMA y el potencial de formacion de colonias de celulas madre normales
Los efectos de la tioridazina sobre la formacion de blastocitos en una lmea celular de LMA se compararon con el efecto de la tioridazina sobre la formacion de colonias en celulas madre humanas normales.
Las CMH y progenitores normales procedfan ya sea de sangre periferica movilizada o sangre de cordon umbilical de pacientes sanos. Las celulas de LMA primaria fueron tomadas de pacientes diagnosticados con LMA. Tanto CMH normales como celulas de LMA primaria se cultivaron bajo condiciones de prueba de metocelulosa in vitro estandar (vease
http://www.stemcell.com/en/Products/All-Products/MethoCult-H4434-Classic.aspx, asf como Clinton Campbell et al. The human stem cell hierarchy is defined by a functional dependence on Mcl-1 for self-renewal capacity. Blood 116 (9) 1433-1442 (4 de junio de 2010), incorporada aqrn por referencia) durante al menos 14 dfas antes del registro del numero de colonias. Como se muestra en la Figura 2, tioridazina 10 pM tiene un efecto diferencial sobre las CMH normales frente a las celulas de LMA. La tioridazina 10 pM redujo el potencial de formacion de colonias de CMH normales de aproximadamente 100 (CTRL tratado con DMSO) hasta aproximadamente 66 colonias totales (Figura. 2A), pero tuvo un efecto mucho mas significativo en celulas de LMA reduciendo el numero de colonias de UFC hasta aproximadamente 22 colonias de blastocitos (Figura. 2B) hasta 1,6 colonias de blastocitos.
La Figura 3 muestra pellas de celulas de colonias de UFC generadas a partir de CMH normales y LMA tratadas con tioridazina. A una dosis de 10 pM, las celulas sedimentadas son todavfa visibles para las CMH, pero no para celulas de LMA. Por tanto, la tioridazina se dirige selectivamente al potencial de UFC de blastocitos de celulas de LMA.
Ejemplo 3: La clorpromazina es toxica para las lmeas celulares de LMA
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Tambien se investigo el antagonista del receptor de dopamina y el compuesto clorpromazina relacionado con fenotiazina para efectos sobre las lmeas celulares de LMA HL-60, MV4-11 y OCI-AML3. La prueba se llevo a cabo como se muestra en el Ejemplo 1. Como se muestra en la Figura 4, 10 pM de clorpromazina es toxico para las lmeas celulares de LMA.
Ejemplo 4: Expresion de receptores de dopamina en sangre normal frente a leucemia
La expresion de los receptores de dopamina DR1, DR2, DR3, DR4 y DR5 se analizo en lmeas celulares de LMA (HL-60, MV4-11, LMA-OCl2 y LMA-OCl3), celulas de LMA primaria (AML22101, AML29428, AML22174 , AML29560) aisladas de pacientes con LMA, celulas mononucleares sangumeas normales (MNC) (MPB21471 y MPB28137; sangre de paciente sano), asf como celulas primarias de sangre de cordon umbilical enriquecidas con celulas madre humanas o progenitoras normales (CB107, CB108 y CB109) utilizando el kit de enriquecimiento de celulas progenitoras hematopoyeticas humanas StemSep® (
http://www.stemcell.com/en/Products/All-Products/StemSep- Human-Hematopoietic-Progenitor-Cell-Enrichment-Kit.aspx) y los niveles de enriquecimiento de CMH/progenitoras humanas confirmados por citometna de flujo. La expresion de isotipo se midio como fondo. Los picos a la derecha del pico del isotipo representan la expresion positiva de los marcadores de DR.
Como se muestra en la Figura 5, los receptores de dopamina se expresan en lmeas celulares de LMA primaria, LMA y celulas de sangre mononucleares normales (CMN) pero no en sangre enriquecida por CMH normales (CB(sin linaje). Los datos muestran que cuando la muestra es positiva para la expresion de DR que todos los cinco subtipos de DR estan normalmente presentes.
No todas las LMA primarias se observaron para expresar receptores de dopamina. En consecuencia, los sujetos pueden ser cribados previamente para la expresion de receptores de dopamina con el fin de identificar sujetos adecuados para el tratamiento de LMA con antagonistas de DR. Opcionalmente, el cribado previo de sujetos puede abarcar todos los cinco subtipos de DR, o subtipos espedficos o combinacion de subtipos.
Ejemplo 5: Los antagonistas de DR multiples son citotoxicos para las lmeas celulares de LMA
Se ensayaron una serie de agonistas de receptores de dopamina, antagonistas de D3-, antagonistas de OR1 y 5 y antagonistas de multiples receptores para determinar la citotoxicidad contra tres lmeas celulares de LMA HL-60, OCI-AML2 y OCI-AML3. El ensayo se realizo como se expone en el Ejemplo 1.
Como se muestra en la Figura 6, CLOZ a concentraciones mas altas, asf como CHL y THIO tienen un efecto significativo sobre la citotoxicidad de las lmeas celulares de LMA. Sin estar limitado por la teona, el efecto citotoxico puede requerir la inhibicion de multiples receptores de dopamina. THIO, CHL y CLOZ que son antagonistas de multiples receptores trabajan para erradicar las lmeas celulares de LMA mientras que los antagonistas espedficos de D3 y DR1 y 5 reducen solamente el conteo de celulas al 60%.
Ejemplo 6: Los receptores de dopamina se expresan en la poblacion de celulas CD14+ de LMA primaria
La expresion de los subtipos de receptores de dopamina se analizo en celulas de LMA primarias. Las celulas de LMA primaria obtenidas de pacientes con LMA fueron tenidas conjuntamente con anticuerpos espedficos para el subtipo de DR y CD14 antes de ser analizadas usando citometna de flujo. Se encontro que la mayona de las celulas de DR+ eran positivas para CD14.
Como se muestra en la Figura 7, la expresion del marcador monodtico CD14 esta correlacionada con la expresion de cada subtipo de DR.
Los efectos de la tioridazina tambien se examinaron en una subpoblacion de celulas CD14+ en LMA primaria. Las celulas de LMA primaria se cultivaron bajo control (veldculo DMSO) o tioridazina 10 pM durante 72 horas y luego se tineron con anticuerpos espedficos para CD14. Se determino el numero de celulas CD14+ tanto en muestras tratadas con control como con tioridazina usando citometna de flujo y se encontro que la frecuencia de celulas CD14+ era menor en la muestra tratada con tioridazina, lo que sugiere que este compuesto se dirige selectivamente a la subpoblacion de CD14+ en celulas de LMA.
Tal como se muestra en la Figura 8, la tioridazina 10 pM tambien redujo la frecuencia normalizada de las celulas CD14+ en celulas de LMA primaria, mostrando que la tioridazina se dirige selectivamente a las celulas CD14+. El grupo de control de LMA contema una fraccion de celulas CD14+. Esta fraccion se reduce con el tratamiento con tioridazina y se representa como una reduccion en la frecuencia normalizada del control (100%) frente a las tratadas (20%).
Ejemplo ilustrativo 7: Identificacion y caracterizacion de farmacos que inducen la diferenciacion de CMPh
La identificacion de farmacos que se dirigen a celulas madre de cancer (CMC) sin afectar a las celulas madre normales (CM) sena ideal para futuras terapias contra el cancer, pero esta limitada por la falta de pruebas para CMC
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y CM normales en humanos que son susceptibles cribados biologicos robustos. Como se establece en los siguientes ejemplos, utilizando una plataforma de diferenciacion de celulas madre pluripotentes humanas normales (CMPh) frente a neoplasicas, se identificaron compuestos que no son toxicos, pero inducen diferenciacion para vencer la autorrenovacion neoplasica de las CMC. De los diversos agentes candidates identificados contra CMC, la tioridazina, un farmaco antipsicotico aprobado, fue capaz de dirigir de forma selectiva CMC somaticas humanas capaces de iniciar la enfermedad leucemica in vivo sin tener ningun efecto sobre la capacidad de CM de sangre normal. El antagonismo de la senalizacion del receptor de dopamina (DR) por la tioridazina forma la base del direccionamiento selectivo de CMC, y revelo DR como un biomarcador para CMC originadas en tumores hematopoyeticos y de mama.
Procedimientos experimentales
Generacion de lmeas EOS-GFP de CMPh neoplasicas. Se transdujeron celulas CMPh v1H9 o v2H9 neoplasicas (Werbowetski-Ogilvie et al., 2009) con lentivirus que portaba los vectores EOS-C3+ o EOS-S4+ proporcionados por el Dr. James Ellis (Hotta et al., 2009). Despues de la transduccion lentiviral se seleccionaron las celulas utilizando Puromicina, y posteriormente se clasificaron como celulas individuales en una placa de 96 pozos con base en la expresion de GFP utilizando un FASCAria II (Becton-Dickinson). Las colonias generadas a partir de clones de celulas individuales se usaron para establecer las lmeas v1H9-Oct4-GFP (EOS-C3+), v2H9-Oct4-GFP (EOS-C3+) y v1H9-Sox2-GFP (EOS-S4+).
Cultivo celular. Se cultivaron las CMPi derivadas de CMEh H9, v1H9, v1H9-Oct4-GFP, v2H9-Oct4-GFP, v1 H9-Sox2- GFP y derivadas de fibroblastos como se describio anteriormente (Chadwick et al., 2003; Werbowetski-Ogilvie et al. 2009).
Muestras humanas primarias. Para los espedmenes de LMA, se recogio sangre periferica y/o de medula osea en el momento de la presentacion clmica. Se obtuvieron celulas hematopoyeticas sanas a partir de muestras de sangre de cordon umbilical. Todas las muestras se obtuvieron despues del consentimiento informado de acuerdo con los protocolos aprobados por la Junta de Etica de Investigacion en la Universidad McMaster y el Centro de Ciencias de la Salud de Londres. Las muestras de tumor de mama humano se obtuvieron de cirugfas de mamoplastia de reduccion despues del consentimiento informado de acuerdo con los protocolos aprobados por la Junta de Etica de Investigacion en la Universidad de McMaster.
Plataforma de cultivo in vitro para CMPh normales y neoplasicas. Los cribados qmmicos implicaron celulas v1H9- Oct4-GFP sembradas a razon de 5.000 celulas por pozo en medio acondicionado con fibroblasto embrionario de raton (MAFER) complementado con 8 ng/mL de FbCF. 24 horas mas tarde se intercambio el medio por MAFER con compuestos a 10 pM y DMSO al 0,1%, DMSO al 0,1% (-BMP4) o 100 ng/mL de BMP4 y DMSO al 0,1% (+BMP4) durante 48 horas antes de ser intercambiados con medios frescos con el compuesto durante 24 h adicionales (tiempo total de tratamiento con el compuesto de 72 horas) antes de fijarse y prepararse para la formacion automatizada de imagenes y el analisis del lector de placas. Se sembraron CMPi derivadas de H9 y fibroblastos confluentes a razon de 10.000 celulas por pozo en MAFER complementado con 8 ng/mL de FbCF. 24 horas mas tarde se trataron las celulas con compuestos a 10 pM y DMSO al 0,1%, DMSO al 0,1% (-BMP4) o 100 ng/mL de BMP4 y DMSO al 0,1% (+BMP4). Se intercambio el MAFER fresco complementado con compuestos diariamente durante 5 dfas. El dfa 5, se fijaron las CMPh y prepararon para la formacion automatizada de imagenes y analisis del lector de placas. Veanse los procedimientos experimentales suplementarios para mas detalles.
Ensayo de Teratoma. Se inyectaron intratesticularmente 400.000 CMEh H9 o v1H9-Oct4-GFP en ratones NOD/SCID machos y se analizaron los teratomas para Oct4 como se ha descrito previamente. (Werbowetski-Ogilvie et al., 2009).
Ensayos de xenotrasplantes. Se irradiaron en forma casi letal ratones adultos NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) con 315 rads 24 horas antes del trasplante. Se inyectaron 0,8-1,0 x 107 CMN de LMA o 1,5-1,8 x 105 celulas hematopoyeticas de CB sin linaje tratadas con compuesto o vehteulo DMSO durante 24 horas a traves de la vena de la cola (IV). Despues de 6-10 semanas, los animales fueron sacrificados, y se analizaron la MO y el bazo para detectar la presencia de celulas humanas mediante citometna de flujo (LSRII, BD) y los datos se analizaron utilizando el software FlowJo (Tree Star Inc). Para los trasplantes de CMPH secundarias, se inyectaron en forma IV igual numero de celulas humanas injertadas de trasplantes de CB sin linaje en ratones NSG irradiados adultos como se describe para trasplantes primarios.
Analisis estadfstico. Los datos se representan como la media ± EEM o la media ± DE. Las diferencias significativas entre los grupos se determinaron utilizando la prueba t de Student bidireccional o unidireccional no apareada.
Cultivo de celulas madre pluripotentes. Se cultivaron las celulas CMEh H9, v1H9, v1H9-Oct4-GFP, v2H9-Oct4-GFP, v1H9-Sox2-GFP y CMPi derivadas de fibroblastos en placas recubiertas con MatrigelMR (BD Biosciences 353234) con medio acondicionado con fibroblastos embrionarios de raton (MAFER) complementado con 8 ng/mL de FbCF (GIBCO 13256-029). MAFER esta compuesto por KO-DMEM (GIBCO 10829-018), 20% de reemplazo de suero KO (GIBCO 10828-028), 1% de aminoacidos no esenciales (GIBCO 11140-050), L-Glutamina 1 mM, p-mercaptoetanol (Sigma Aldrich M7522). Las lmeas celulares se pasaron cada 7 dfas usando 100 Unidades/mL de colagenasa IV
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(GIBCO 17104-019) durante 2-3 minutes. La densidad de siembra de celulas, la duracion del ensayo y la concentracion del vehteulo DMSO en 96 pozos se optimizaron para las celulas v1H9-Oct4-GFP y CMPh H9 normales. Para v1H9-Oct4-GFP, se selecciono una densidad inicial de siembra optima de 5.000 celulas por pozo durante 72 h de tratamiento con base en los niveles maximos de GFP y discriminacion de z' entre los controles ± BMP4. Para CMPh normales, se selecciono una densidad de siembra optima de 10.000 celulas por pozo con base en la discriminacion maxima de z' entre los controles ± BMP4.
Muestras humanas primarias. Se prepararon celulas mononucleares usando Ficoll-Paque Premium (GE Healthcare). Para las celulas hematopoyeticas, el agotamiento del linaje se realizo utilizando EasySep (StemCell Technologies) siguiendo las recomendaciones del fabricante.
Cultivo de celulas LMA/CMPH. Se cultivaron lmeas de celulas de LMA, a saber, OCI-AML2 (M4), OCI-AML3 (M4), HL-60 (M2) y MV-4-11 (M5) en RPMI (Gibco) complementado con FBS inactivado con calor al 5% (HyClone). Para los estudios de agonistas de DR con bromhidrato de R(+)-7-hidroxi-DPAT (Sigma), se emplearon condiciones libres de suero debido a la prevalencia de dopamina en FBS (Little et al., 2002). Los blastocitos de pacientes con LMA se cultivaron en IMDM complementado con 5% de FBS inactivado por calor (HyClone), 5 ng/mL de IL3 (sistemas R&D), 5 x 10'5 de p-mercaptoetanol (Sigma) y BIT (StemCell Technologies). El medio de CMH contema IMDM complementado con bSa al 1% (Sigma), 100 ng/mL de SCF (sistemas R&D), 100 ng/mL de Flt-3L (sistemas R&D) y 20 ng/mL de TPO (sistemas R&D). Se trataron las muestras de CMPH y LMA del paciente con compuesto o vehteulo DMSO (0,1%) durante 24 horas antes de los estudios de siembra en placa de UFC o de xenotrasplantes.
Anticuerpos. Los anticuerpos utilizados para la inmunocitoqmmica fueron los siguientes: Oct3/4 (BD Trunsduction Laboratories, cat. # 611203), Sox2 (R&D, cat. # AF2018). Para detectar celulas hematopoyeticas humanas, se uso CD45 anti-humana marcada con Pacific Blue, PE, APC o FITC (BD Biosciences). Se adquirieron los anticuerpos FITC anti-CD33, PE anti-CD13, FITC anti-CD41a, FITC anti-HLA DR y PE anti-CD19 de BD Pharmingen. Se adquirieron PE anti-CD14, PE anti-CD15 y PE anti-GlyA de Immunotech Beckman Coulter. Para determinar la pluripotencia, PE anti-SSEA3 (BD Biosciences) y PE o AlexaFluor488 anti-Oct4 (BD Biosciences). Anticuerpos del receptor de dopamina anti- humana de conejo; se obtuvieron DRD1 (Cat. # 324390), DRD2 (Cat. # 324393), DRD3 (Cat. # 324402), DRD4 (Cat. # 324405) y DRD5 (Cat. # 324408) de EMD Chemical. Como anticuerpo secundario se utilizo Alexa-Fluor-488 anticonejo (Molecular Probes). Se utilizaron IgG de conejo anti-p53 primario (Cat. # 2527) y anti-p21 (Cat. # 2947) originarias de Cell Signaling Technology para tenir celulas fijas y permeabilizadas. Se utilizo alexa-Fluor-546 anticonejo (Molecular Probes) como anticuerpo secundario. Para la tincion del tumor de mama, se obtuvieron APC anti-CD44 y PE-CD24 de BD Pharmingen.
Formacion de imagenes automatizadas y analisis
Formacion de imagenes de CMPh neoplasicas. Las celulas se fijaron en paraformaldehtelo al 2% y se tineron con 10 |jg/mL de Hoechst 33342 (Invitrogen) con un dispensador de multiples gotas Combi (Thermo). Para los experimentos que involucraron la inmunocitoqmmica Oct4, se uso un anticuerpo monoclonal para Oct4 (BD) junto con un Alexa- Fluor-647 secundario (Invitrogen). La tincion inmunocitoqmmica se realizo mediante un manipulador de lfquidos automatizado Janus (Perkin Elmer). Las imagenes fueron adquiridas a 10x N.A con un lector Arrayscan HCS VTI (Cellomics) por medio de iluminacion de epifluorescencia y conjuntos de filtros estandar.
Formacion de imagenes de CMPh normales. Las celulas se fijaron en paraformaldehtelo al 2% y se tineron con 10 jg/mL de Hoechst 33342 (Invitrogen). Se usaron tecnicas estandar de inmunocitoqmmica de fluorescencia para tenir las celulas con un anticuerpo monoclonal para Oct4 (BD), y un anticuerpo Alexa-Fluor-647 secundario (Invitrogen). Todas las etapas se realizaron mediante un manipulador de lfquidos automatizado Janus (Perkin Elmer). Las imagenes se adquirieron a 5x con un lector HCS Arrayscan (Cellomics) por medio de iluminacion de epi- fluorescencia y conjuntos de filtros estandar.
Analisis de imagen. El analisis de la imagen se realizo utilizando conjuntos de instrucciones personalizados en el software Acapella (Perkin Elmer). Los objetos nucleares se segmentaron de la senal de Hoechst. Para las lmeas celulares neoplasicas, el analisis de la intensidad de los objetos se realizo unicamente en las celulas GFP positivas. Para las lmeas celulares normales, se cuantifico la fraccion de celulas Alexa-Fluor-647-positivas. Las imagenes y los datos del nivel de pozo se almacenaron y analizaron en una base de datos Columbus (Perkin Elmer) y analisis de datos adicionales, registro de compuestos e identificacion de los aciertos en ActivityBase (IDBS).
Analisis de la expresion genica. Se recolectaron celulas en condiciones espedficas y se extrajo el ARN usando un kit de RNeasy (Qiagen), generacion de ADN complementario (ADNc) utilizando el kit de smtesis de ADNc SuperScript III® (Invitrogen), amplificacion previa y reaccion de matriz TaqMan® (Applied Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El perfil de expresion genica para cada poblacion de celulas tratadas se analizo utilizando una tarjeta matriz de pluripotencia de celulas madre TaqMan® en un sistema de PCR en tiempo real ViiA 7 (Applied Biosystems). Cada muestra de reaccion se dispenso en pozos de carga en la tarjeta matriz y se centrifugo dos veces a 336 x g durante 1 min cada vez, se sello y se coloco en el termociclador. Se usaron las siguientes condiciones de los ciclos para todas las aplicaciones de tarjetas matriz: 45°C durante 10 min, 94°C durante 10 min y 40 ciclos de 94°C durante 30 segundos seguido por 60°C durante 1 min. Los datos de la matriz se normalizaron a
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ARN 18S y GAPDH y las comparaciones se realizaron utilizando el software de analisis de datos 2.0 (Applied Biosystems).
Ensayo de formacion de colonias de metilcelulosa. Se cultivaron las celulas linfocfticas de pacientes con LMA o celulas de CB sin linaje durante 24 horas en presencia del compuesto o control de DMSO como vehmulo (0,1%). Se sembraron celulas de LMA a razon de 50.000 celulas/mL en Methocult GF H4434 (Stem Cell Technologies). Las celulas de CB sin linaje se sembraron a razon de 1.000 celulas/mL en Methocult GF H4434 (Stem Cell Technologies). Se hizo recuento de colonias despues de 14 dfas de cultivo usando criterios morfologicos estandar.
Recuento volumetrico de celulas. El numero de celulas LMA-OCI2 y LMA-OCI3 presentes despues de 72 horas de tratamiento con antagonistas de DR (Figura 16b) y agonista (Figura 16c-d) se contaron midiendo el numero de eventos dentro de un volumen fijo siguiendo la estrategia de rejilla definida por dispersion directa y agrupacion de dispersion lateral, 7AAD- y Hoechst+.
Procesamiento de muestras de cancer de mama humano. Las muestras de tumor de mama humano se obtuvieron de cirugfas de mamoplastia de reduccion despues del consentimiento informado de acuerdo con los protocolos aprobados por la Junta de Etica de Investigacion en la Universidad de McMaster. Los trozos de tumor de mama se cortaron en pequenos fragmentos (trozos de menos de 1 mm) con tijeras y bistun. Posteriormente, se anadieron 3 mL de Versene (1 mL de EDTA 0,5 M en 1 L de PBS 1X) y 7 mL de solucion de tripsina-colagenasa para cada gramo de tejido tumoral y se incubaron durante 30 min a 37°C. La solucion de tripsina-colagenasa consistio en RPMI 1640 (Gibco # 11875093), 2% de penicilina/estreptomicina (Invitrogen # 15140163), 1% de antimicotico Fungizone (Invitrogen # 15290018), 2% de fBs, 3 mg/mL de Colagenasa A (Roche Diagnostics # 11088793001), y 0,1% de tripsina al 2,5% (Gibco # 15090). Se anadio entonces un volumen igual de RPMI 1640 con 2% de FBS a la suspension de tejido. La suspension de tejido se filtro a traves de un filtro de nylon de 40 pm (Falcon # 352340). El sobrenadante se descarto y el sedimento celular se resuspendio en 10 mL de mezcla nutriente F-12 + GlutaMAX Ham 1X (Gibco # 31765) complementado con 2% de penicilina/estreptomicina y 1% de antimicotico Fungizone. Se contaron las celulas viables utilizando un hemocitometro y una solucion de azul de tripano y se prepararon para citometna de flujo. La tincion de anticuerpos inclrna anticuerpos de conejo anti-receptor de dopamina humana; DRD1 (Cat. #324390), DRD2 (Cat. #324393), DRD3 (Cat. #324402), DRD4 (Cat. #324405) and DRD5 (Cat#324408), se obtuvieron de EMD Chemical y se uso Alexa-Fluor-488 anti-conejo (Molecular Probes) como anticuerpo secundario junto con APC anti-CD44 y PE-CD24, ambos procedentes de BD Pharmingen.
Ejemplo ilustrativo 8: Identificacion mediante cribado de alto rendimiento de compuestos que inducen diferenciacion de CMPh neoplasicas
Los inventores han descrito previamente una variante de lmea de celulas madre pluripotentes humanas (CMPh) que muestra caractensticas neoplasicas que incluyen autorrenovacion y supervivencia mejoradas, junto con bloqueo aberrante en la capacidad de diferenciacion terminal in vitro e in vivo (Werbowetski-Ogilvie et al., 2009). Con base en estas similitudes en las propiedades funcionales con las CMC somaticas, se examinaron las CMPh neoplasicas como un sustituto para las CMC somaticas que senan susceptibles de alto contenido y cribado de alto rendimiento in vitro. Se desarrollo una plataforma de cribado para identificar moleculas pequenas que selectivamente se dirigen a CMPh neoplasicas mientras que tienen poco efecto en CMPh normales. Esta plataforma de cribado diferencial es capaz de identificar potentes farmacos candidatos que se dirigen selectivamente a CMC somaticas mientras se ahorra capacidad de CM sanas.
Oct4 y Sox2 proporcionan un indicador confiable de perdida autorrenovacion del estado pluripotente e induccion de diferenciacion de CMPh normales y neoplasicas. Para proporcionar un metodo mas directo para detectar la perdida de Oct4 o Sox2 durante la diferenciacion inducida de CMPh neoplasicas, se generaron lmeas informadoras de GFP mediante transduccion de CMPh neoplasicas con el informador EOS-GFP (v1H9-Oct4-GFP y v1H9-Sox2-GFP, respectivamente) (Hotta et al., 2009). Se observo correlacion entre la intensidad de GFP y la expresion de Oct4 y Sox2 en tratamientos que favorecieron la estabilidad de autorrenovacion y condiciones que inducen diferenciacion con la adicion de BMP4. Esta respuesta se encontro consistentemente utilizando una lmea de CMPh neoplasica adicional, v2H9 (Werbowetski-Ogilvie et al., 2009) transducida con el mismo informador de GFP del lentivirus EOS (v2H9-Oct4-GFP), asf como una lmea informadora Sox2 (v1H9-Sox2-GFP).
La respuesta uniforme a la diferenciacion y el mantenimiento de la pluripotencia en todas las lmeas celulares de CMPh generadas tambien revelo que la integracion viral o la seleccion clonal mediante insercion del constructo informador EOS es irrelevante para la sensibilidad. Estos resultados sugieren que los compuestos que inducen la diferenciacion pueden identificarse basandose en la reduccion de la intensidad de GFP en las lmeas informadoras de CMPh neoplasicas y podnan ser explotados para el cribado qmmico. Para tal fin, se utilizaron condiciones para la microscopfa automatizada de alto contenido y el cribado fluorometrico de alto rendimiento para detectar reducciones en la expresion del marcador de pluripotencia de CMPh. El analisis microscopico de CMPh normales mostro que se pierden celulas distintas Oct4+ despues del tratamiento con BMP4. Del mismo modo, la reduccion de la GFP y Oct4 debido al tratamiento con BMP4 de las CMPh Oct4-GFP neoplasicas se cuantifico mediante microscopfa de alto contenido y fluorometna con base en el lector de placas. Para identificar candidatos ideales, se evaluo en paralelo el
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direccionamiento para la diferenciacion de CMC tanto de CMPh normales como neoplasicas en respuesta al tratamiento con compuesto.
Dada la validacion de la plataforma de cribado, se seleccionaron bibliotecas qmmicas compuestas de 590 compuestos anotados bien establecidos de la coleccion clmica de NIH y se cribo la coleccion de compuestos canadienses. Estas colecciones se han examinado previamente en numerosas otras lmeas celulares de mairnferos (Diallo et al., 2010; Shoemaker, 2006). Despues de la demostracion de que las plataformas de cribado fluorometrico de alto rendimiento (HTS) y el cribado de alto contenido (HCS) producen mediciones equivalentes para la perdida de pluripotencia (RFU de GFP e intensidad media de GFP por celda, respectivamente) y el recuento de celulas (RFU de Hoechst y recuento de celulas) de los 51 compuestos definidos, se selecciono hTs como la plataforma preferida para cribar mas rapidamente las bibliotecas de compuestos (Figura 9a). De los 590 compuestos cribados (a 10 pM con base en estudios previos (Inglese et al., 2007)), se identificaron 11 compuestos para inducir diferenciacion como se indica por una reduccion tanto en el porcentaje de actividad residual de GFP (% RA) como % RA de Hoechst (Figuras 9b-c). Un total de 4 de estos compuestos; indatralina, tioridazina, azatioprina y mefloquina, se identificaron como compuestos candidatos con base en agrupaciones y niveles % RA de Hoechst superiores a 30% (Figura 9b). El analisis de alto contenido secundario revelo que la indatralina es un candidato cuestionable y, por lo tanto, se excluyo, mientras que el analisis de contenido y los analisis HTS confirmaron doblemente la tioridazina, azatioprina y mefloquina como compuestos candidatos (Figura 9d) y se seleccionaron para pruebas adicionales (Figuras 9e-g). Cuando se comparo con las CMPh tratadas de control, cada compuesto pareda inducir cambios morfologicos distintos en CMPh neoplasicas (Figura 9e). La reduccion en la intensidad de GFP se confirmo mediante analisis de imagen (Figura 9f) y se evaluo adicionalmente en una amplia gama de dosis para calcular la mitad de la concentracion maxima eficaz (CE50) para cada compuesto (Figura 9g). Se encontro que solamente la tioridazina y la mefloquina poseen valores de CE50 inferiores al umbral objetivo de 10 pM (Figura 9g) y, por lo tanto, se definieron como candidatos para una evaluacion mas profunda usando CMPh neoplasicas y CMC somaticas de pacientes.
Ejemplo 9: La tioridazina induce selectivamente la diferenciacion de CMPh neoplasica y reduce los blastocitos de LMA humana sin afectar las celulas madre/progenitoras hematopoyeticas normales
Las respuestas a la tioridazina y la mefloquina se evaluaron tanto en CMPh normales (Figura 10a) como neoplasicas (Figura 10b) a tres concentraciones usando citometna de flujo cuantitativa para detectar la perdida de Oct4 y revelar el grado de diferenciacion. La salinomicina, un inhibidor selectivo reportado de CMC de mama (Gupta et al., 2009), se incluyo para comparacion. A 10 pM, todos los compuestos redujeron el numero de celulas, pero los niveles de Oct4 en las CMPh normales restantes no fueron inferiores a los niveles observados con tratamiento con BMP4 (Figura 10a). Esta misma respuesta se replico en celulas MPi humanas derivadas de fibroblastos, (Figura 11a), que representan una lmea adicional de CMPh normal de un origen distinto (adulto), indicando que los efectos no son espedficos para las fuentes embrionarias. Cuando se usaron los mismos compuestos para tratar CMPh neoplasicas, los tratamientos con mefloquina y tioridazina provocaron reducciones en el numero de celulas y los niveles de Oct4 en CMPh neoplasicas. Solo la tioridazina fue capaz de reducir los niveles de Oct4 por debajo de los controles de diferenciacion con BMP4 (Figura 10b), lo que indica la capacidad de la tioridazina para superar el bloque de diferenciacion de CMPh neoplasicas. Se llevo a cabo una respuesta de dosis mas completa de todos los compuestos sobre las CMPh neoplasicas para confirmar esta respuesta (Figura 11b). Para identificar los compuestos que diferencian selectivamente las CMPh neoplasicas cuantitativamente, se determino la proporcion de porcentaje normalizado de celulas Oct4+ entre CMPh normales y neoplasicas en respuesta a estos compuestos. Por ejemplo, una proporcion de 1 sugiere una diferenciacion equivalente mientras que una relacion >1 define relativamente mas diferenciacion en CMPh neoplasicas frente a CMPh normales. Solo la tioridazina, tanto a 1 pM como a 10 pM, tuvo un impacto significativo sobre la induccion de la diferenciacion de CMPh neoplasicas sobre CMPh normales (Figura 10c). La acumulacion rapida del marcador de tension celular p53 (Figura 10d) y su objetivo transcripcional p21 (Figura 10e) se utilizaron para distinguir adicionalmente la induccion de diferenciacion de la toxicidad celular. El tratamiento de CMPh neoplasicas con el agente quimioterapeutico toxico etoposido dio como resultado altos niveles de p53 y p21 despues de 24 h. Sin embargo, el tratamiento con tioridazina 10 pM o BMP4, a diferencia de los agentes que inducen solamente toxicidad, no dio lugar a acumulacion de p53 o p21, consistente con la diferenciacion inducida en lugar de programas de respuesta al estres. Ademas, el tratamiento con tioridazina condujo a la expresion de genes de diferenciacion cuantificados mediante TaqMan, un PCR cuantitativo de un arreglo de baja densidad en CMPh neoplasicas. Se observo una sobrerregulacion en 21 de los 50 genes asociados a la diferenciacion (Figura 10f) en CMPh neoplasicas tratadas en consonancia con los efectos inductores de diferenciacion de la tioridazina.
Para examinar las similitudes potenciales en la respuesta qmmica de CMPh neoplasicas con respecto a CMC somaticas, se evaluaron poblaciones normales y neoplasicas del sistema hematopoyetico humano. Experimentalmente, la autorrenovacion y la diferenciacion tanto de las celulas madre-progenitoras hematopoyeticas humanas (CMPH) como de las celulas madre leucemicas (CML) pueden ser interrogadas por poderosos y bien establecidos ensayos in vitro e in vivo unicamente disponibles para el sistema hematopoyetico, convirtiendolo en un tejido ideal para evaluar la subrogacion potencial del uso de CMPh normales y neoplasicas como una herramienta de cribado primario para compuestos anti-CMC. La sangre del cordon umbilical (CB sin linaje), esta altamente enriquecida por CMPh y es una fuente confiable de CM somaticas normales capaces de autorrenovacion y diferenciacion multilinaje para todos los linajes sangumeos. La leucemia mieloide aguda (LMA) es una neoplasia
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hematologica caracterizada por un bloqueo en la diferenciacion mieloide madura que es sostenida por una CML autorrenovable (Bonnet y Dick, 1997; Lapidot et al., 1994).
Como tal, se llevaron a cabo ensayos de progenitor en metilcelulosa con CMPH y muestras de 5 pacientes con LMA; cada uno tratado con tioridazina, mefloquina o salinomicina con el fin de evaluar el impacto de cada compuesto sobre la diferenciacion hematopoyetica clonogenica y multilinaje in vitro. Se muestran pellas de celulas representativas de las unidades formadoras de colonias totales (UFC) generadas a partir de CMPH (Figura 10g) y LMA (Figura 10h) tratadas con cada compuesto. El tratamiento con tioridazina dio lugar a una reduccion en la capacidad de proliferacion /clonogenica de LMA, al mismo tiempo que retiene la diferenciacion multilinaje de CMPH (Figura 11c). Los cambios en la diferenciacion multilinaje se cuantificaron basandose en la enumeracion de UFC generadas despues del tratamiento de CMPH (Figura 10i) y muestras del paciente con LMA (Figura 10j) con estos compuestos. La salinomicina tanto a 1 pM como a 10 pM redujo el potencial de UFC de blastocitos de LMA (Figura 10j), pero tambien redujo el potencial de UFC de CMPH sobre todas las dosis ensayadas (Figura 10i) indicativas de toxicidad no espedfica en el sistema hematopoyetico. Por el contrario, la mefloquina y la tioridazina redujeron la formacion de UFC de blastocitos de LMA (Figura 10j) aunque tienen poco efecto sobre el potencial de UFC de CMPH (Figura 10i) y la composicion de multilinaje (Figura 11d) indicando que la mefloquina y la tioridazina no alteran la hematopoyesis normal.
El resultado mas deseado de los compuestos identificados hacia el uso clmico implicana la eliminacion preferencial de la generacion de UFC de blastocitos de LMA mientras se preserva la capacidad progenitora CMPH normales. Se calculo la relacion entre las UFC totales generadas a partir de CMPH frente a blastocitos de LMA para revelar la mayor selectividad para direccionamiento a LMA (Figura 10k). Una proporcion de 1 sugiere un potencial progenitor normal a neoplasico equivalente mientras que una proporcion >1 define un compuesto que reduce selectivamente el potencial de UFC de blastocitos de LMA. Las dosis de salinomicina (1 pM), mefloquina (10 pM) y tioridazina (10 pM) produjeron los valores de relacion mas altos para cada compuesto (Figura 10k) y, por lo tanto, se seleccionaron para la evaluacion in vivo. La tioridazina 10 pM, en particular, demostro la proporcion mas alta de todos los compuestos, pero lo mas importante fue que el unico compuesto que mostro un potencial UFC de blastocitos de LMA significativamente menor con respecto al potencial de UFC de CMPH normales (Figura 10k). Para determinar si la especificidad de la tioridazina para reducir el potencial clonogenico de las UFC de blastocitos de LMA se debio a la induccion de diferenciacion, se analizo la frecuencia de CD11b, un marcador de maduracion granulodtica en las celulas de LMA del paciente en respuesta al tratamiento con tioridazina (Figura 10l). Se observo un aumento marcado en la frecuencia de las celulas de blastocitos de LMA granulocftica con una duracion en el tratamiento (Figura 10l), que indica que la tioridazina exhibe su orientacion espedfica de celulas LMA a traves de la induccion de diferenciacion. Este hallazgo es analogo a la induccion de diferenciacion demostrada en CMPh neoplasicas (Figura 10a-f) y confirma la lectura robusta de esta plataforma de cribado hacia la identificacion de agentes capaces de diferenciar las celulas neoplasicas. Este resultado tambien sugiere que la tioridazina puede representar el mejor candidato para el direccionamiento espedfico de CMC de LMA que requiere pruebas usando ensayos in vivo de xenoinjerto de raton en humano.
Ejemplo 10: La tioridazina reduce la funcion de CML mientras se evitan las CMPH normales
Para delinear si la inhibicion de los blastocitos de LMA detectadas in vitro se debieron a los compuestos que afectan al compartimento de celulas madre neoplasicas, se llevaron a cabo estudios de xenotrasplante (Dick, 2008) que definen funcionalmente CML y celulas madre hematopoyeticas (CMH) (Figura 12). El tratamiento de CMPH con salinomicina (1 pM) redujo significativamente el injerto hematopoyetico a niveles casi no detectables (Figura 13a) revelando que este compuesto interfiere con la hematopoyesis normal de CMPH y, por lo tanto, se excluyo de una evaluacion adicional, ya que es poco probable que proporcione el anti-CMC terapeutico selectivo de direccionamiento deseado. Por el contrario, el tratamiento con mefloquina (10 pM) mostro una reduccion ligera, incluso insignificante, en la capacidad CMH con respecto a los controles (Figura 12a]. Sin embargo, la mefloquina demostro ser ineficiente en la reduccion de la capacidad de CML de LMA y por lo tanto se descarto una evaluacion adicional debido a la ausencia de efectos selectivos (Figura 12c).
En contraste con salinomicina y mefloquina, el tratamiento de CMPH con tioridazina 10 jM mostro el mismo nivel de injerto de medula osea (MO) (Figura 12a) y de injerto esplenico (Figura 13b) como celulas tratadas con vehfculo de control. La capacidad de reconstitucion del multilinaje fue identica a la de las CMH humanas tratadas con control y tioridazina con desarrollo mieloide (Figura 12b), linfoide (Figura 12b), eritroide (Figura 13d) y megacariodtico (Figura 13d) completamente no afectado. Como se midio mediante trasplante serial secundario, el tratamiento con tioridazina no afecto la autorrenovacion de CMH en comparacion con las muestras tratadas con control (Figura 13f). Sin embargo, en marcado contraste con la salinomicina y la mefloquina, el tratamiento con tioridazina fue capaz de reducir significativamente las CML de LMA iniciadores de la enfermedad leucemica (Figuras 12c-d; Figura 13c; Figura 13e). El calculo de la relacion de la regeneracion hematopoyetica normal de CMPH (%hCD45+) con respecto a la leucemogenesis de LMA (blastocitos% CD33+ hCD45+) revelo que la tioridazina redujo significativamente la funcion de CML mientras preserva la capacidad de CMH normal (Figura 12e). En ausencia de tioridazina, no se observo diferencia en el nivel de injerto leucemico de los receptores de trasplante secundario. Esto sugiere que la exposicion continuada a este farmaco es necesaria para inhibir la leucemogenesis en receptores secundarios. Estos datos demuestran que la tioridazina se centra selectivamente en CMC somaticas, mientras que no tiene ningun
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efecto sobre las propiedades de CM normales in vivo. Como se identifico a la tioridazina a traves del uso de una nueva plataforma de cribado diferencial utilizando CMPh normales y neoplasicas in vitro, los efectos funcionales de la tioridazina proporcionan un ejemplo del valor predictivo del uso de las CMP humanas para comprender las CMC somaticas.
Ejemplo 11: Los receptores de dopamina demarcan CMC humanas
Se sabe que la tioridazina actua a traves de los receptores de dopamina (DR 1-5) (Beaulieu y Gainetdinov, 2011; Seeman y Lee, 1975). Para evaluar si el mecanismo de accion de la tioridazina interfiere selectivamente con CMC humanas frente a CM normales es a traves del antagonismo de DR, se analizo la expresion de la superficie de celulas DR. Hasta la fecha, se han identificado cinco DR y se han dividido en receptores de la familia D1 (D1 y D5) y de la familia D2 (D2, D3 y D4) (Sibley y Monsma, 1992). Las CMPh normales que expresan el marcador pluripotente SSEA3 caredan de la expresion de DR (Figura 14a y Figuras 15a-b). Por el contrario, CMPh neoplasicas expresaron los cinco DR (Figura 14b]. La expresion diferencial observada de los DR y la inhibicion selectiva de tioridazina para CMPh neoplasicas sugieren que la inhibicion de la senalizacion del DR puede jugar un papel en el direccionamiento selectivo de CMC humanas frente CM normales.
Para ampliar el papel potencial de DR en CMC con base en el papel funcional del tratamiento con tioridazina, se examino si el antagonismo de DR podna explicar la perdida de la funcion de CML despues del tratamiento con tioridazina. La expresion de DR1-5 se analizo en CMPH (Figura 14c) y en celulas mononucleares hematopoyeticas humanas de CB normal (Figuras 15c-f) y muestras de pacientes con LMA (Figura 14d y Figura 15g). No se observaron DR en las CMH primitivas o poblaciones progenitoras de CB (identificadas como las fracciones CD34+38- o CD34+38+, respectivamente (Bhatia et al., 1997)) (Figura 14c) indicando que las CMH y progenitores no expresan Los objetivos para tioridazina. De manera similar, los DR no pudieron ser detectados en la superficie de celulas eritroides (Figura 15c), megacariocfticas (Figura 15c) y linfoides (Figura 15d). Solo monocitos definidos como CD14+ y aproximadamente la mitad de la poblacion de granulocitos definida como CD15+ expresaron los DR (Figuras 15e-f). Todas las 13 muestras de pacientes con LMA analizadas conteman una poblacion de blastocitos DR+ con diferentes niveles de los cinco receptores (Figura 14d) y se detectaron predominantemente en celulas CD34+/CD14+ (Figura 15g). Sin embargo, a diferencia de las CMH normales, las celulas CD34+ no se correlacionan con la capacidad de CML en LMA humana (Taussig et al., 2008) y recientemente se han identificado en numerosas subfracciones desprovistas de CD34 o CD38 (Eppert et al., 2011). Las observaciones de la expresion diferencial de DR en muestras hematopoyeticas humanas normales y de LMA sugieren fuertemente que las CML de LMA humanas son heterogeneas y el direccionamiento del farmaco debe basarse en vfas moleculares en lugar de predicciones de fenotipos sustitutivos.
Aparte del tejido hematopoyetico, se han identificado recientemente CMC somaticas y se han validado en tumores de mama humanos y tienen un fenotipo CD44+ CD24-/bajo (Al-Hajj et al., 2003). Usando tumores primarios de mama humano que son negativos para el receptor de estrogeno (ER-), receptor de progesterona (PR-) y receptor epidermico humano 2 (HER2-) que estan asociados con los resultados de pronostico mas pobre (Dent et al., 2007) se revelo la colocalizacion de dR en las CMC de mama CD44+ CD24-/bajo (n=3 pacientes) (Figuras 14e-f y Figura 15h). Este hallazgo es consistente con los bajos niveles de DR encontrados en el tejido mamario normal, mientras que los tumores benignos de mama muestran niveles intermedios y los canceres de mama muestran altos niveles de estos receptores (Carlo, 1986). Se investigo si la expresion de dR en blastocitos de LMA se correlacionaba con la incidencia de CML en pacientes con LMA. Las muestras de LMA con una gran fraccion de blastocitos de DRD3+ (Figura 14g) y blastocitos de DRD5+ (Figura 14h) contienen CML, ya que son capaces de iniciar la leucemia en receptores de xenotransplantes, a diferencia de muestras de pacientes con LMA con niveles significativamente menores de DR que no contienen CML. Las muestras de pacientes con LAM que contienen CML han sido correlacionadas con resultados pronosticos deficientes, mientras que las muestras sin CML demuestran un buen pronostico (Eppert et al., 2011). Los altos niveles de expresion de Dr se correlacionan con mal pronostico mientras que los niveles bajos muestran un buen pronostico (Figuras 14g-h), lo que sugiere que la evaluacion de DR tiene aplicaciones de biomarcadores pronosticos y es menos compleja que las firmas moleculares o lecturas de CML para cada paciente con LMA. Basados en la identificacion inicial en CMPh neoplasicas, estos resultados colectivos sugieren un papel potencialmente mas generalizable para la expresion de dR en CMC somaticas humanas de lo previsto y validan DR como biomarcador candidato para otras CMC en humanos.
Ejemplo 12: El antagonismo de la tioridazina de la DR inhibe la LMA humana
Para comprender mejor el papel funcional de la DR en la LMA humana, se utilizaron dos lmeas celulares de LMA derivadas de pacientes, LMA-OCI2 y LMA-OCI3 (Koistinen et al., 2001).
Al igual que las muestras primarias, estas dos lmeas celulares revelaron expresion para cada DR1-5 (Figura 16a) con niveles claramente superiores a los observados en muestras de pacientes. Debido a la biodisponibilidad de dopamina en suero bovino fetal (FBS) (Little et al., 2002), se emplearon condiciones libres de suero para evaluar el papel de los DR en LMA. Ambas lmeas de LMA se trataron con tioridazina y se compararon con otros antagonistas conocidos de DR, clozapina y clorpromazina (Seeman y Lee, 1975). Todos los tres antagonistas de DR redujeron el numero de celulas de LMA despues del tratamiento (Figura. 16b). Para evaluar adicionalmente la especificidad de la
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DR dirigida a las celulas LMA humanas, las muestras de LMA del paciente se dividieron en subfracciones DR+ y DR- usando clasificacion de celulas activadas por fluorescencia antes de ser tratadas con vehmulo DMSO o tioridazina durante 24 horas y luego evaluadas para determinar el contenido de UFC de blastocitos. Solo se observo una reduccion en la generacion de UFC de blastocitos en la subfraccion de DR+ tratada con tioridazina (Figura 17a), mientras que no se observo reduccion en la subfraccion de DR- tratada con tioridazina (Figura 17b). Por el contrario, la adicion de un agonista de la familia D2 de DR, 7OH-DPAT, aumento el numero de celulas de LMA (Figura 16c). La familia D2 y la familia D1 de DR ejercen acciones opuestas sobre la senalizacion intracelular que conduce a efectos biologicos diferenciales (Self et al., 1996). El tratamiento con un agonista de la familia D1 de DR, (SKF38393), dio como resultado una reduccion significativa en el numero de celulas de LMA que confirma que la senalizacion de la familia D2 es necesaria para la supervivencia de las celulas de LMA (Figura 16d). Estos resultados combinados sugieren que el mecanismo de la accion de la tioridazina es a traves del antagonismo de las DR de la familia D2 y no debido a los efectos fuera del objetivo, e identifica una nueva via de direccionamiento de CMC a traves de la senalizacion de DR.
Ejemplo ilustrativo 13: Analogos de tioridazina como agentes contra celulas madre de cancer
La Figura 17 muestra un diagrama de dispersion de variantes de celulas madre neoplasicas (celulas v1O4, celulas v1H9-Oct4-GFP) tratadas con diferentes bibliotecas qmmicas para identificar compuestos activos, es decir, aquellos que indujeron una perdida de pluripotencia (PDP, una medida basada en la deteccion de un informador de los niveles de Oct 4, que en este caso es una salida de senal de GFP) y una reduccion en el recuento de celulas (por debajo de 750 celulas por imagen adquirida). Los compuestos que redujeron los recuentos de celulas por debajo de 100 se clasificaron como posiblemente toxicos, pero dado que muchos agentes de quimioterapia actuales presentan efectos toxicos similares, estos pueden ser utiles como agentes contra celulas madre de cancer.
En resumen, las celulas v1O4 se sembraron en placas de 96 pozos recubiertas con Matrigel (5000 celulas/pozo) que conteman medio acondicionado con fibroblastos embrionarios de raton (MAFER) complementado con 8 ng/mL de FbCF y se trataron durante 72 horas con compuestos disueltos en DMSO. La concentracion final de cada compuesto utilizado en el tratamiento fue 10 pM o 1 pM (n=3). Los pozos de control se trataron con DMSO al 0,1% (control bajo) o 100 ng/mL de BMP4 (control alto para inducir PDP). Al cabo de 72 horas, las celulas se fijaron, se tineron con Hoechst y se formaron imagenes mediante microscopfa automatica. La intensidad de GFP y la senal de Hoechst fueron cuantificados como medidas de PDP y el recuento de celulas, respectivamente, y los compuestos con un puntaje Z de mas de 3 desviaciones estandar de la media para el recuento de celulas reducido y se escogieron PDP para un estudio mas detallado.
La tioridazina se selecciono para estudio adicional (Figura 17, estrella en un drculo punteado) asf como otros seis compuestos con estructuras qmmicas similares (analogos de tioridazina) (Figura 17, estrellas en caja punteada). Los analogos de tioridazina identificados para estudio adicional incluyeron proclorperazina, trifluoperazina, flufenazina, perfenazina y triflupromazina. La similitud estructural de los analogos se determino sobre la base de estos compuestos con un coeficiente de similitud de Tanimoto > 0,6 cuando se compara con tioridazina (calculado mediante el software IDBS SARView). Sorprendentemente, los analogos de tioridazina se representaron desproporcionadamente al causar una perdida relativa en el recuento de celulas y una perdida de pluripotencia en variantes de celulas madre neoplasicas (6/64 = 9%) en comparacion con una frecuencia total de analogos de tioridazina presentes en todas las bibliotecas qmmicas (22/1594 = 1,4%), una diferencia mayor a seis veces. Esto sugiere que una caractenstica estructural presente en la tioridazina y compuestos relacionados provoca una reduccion en el numero de celulas y PDP en celulas madre de cancer neoplasico.
El compuesto relacionado con la fenotiazina, clorpromazina es citotoxico para varias lmeas celulares de leucemia, asf como para otros tipos de lmeas celulares de cancer, con una potencia comparable a la tioridazina. Sin embargo, la clorpromazina no tuvo un efecto comparable sobre las celulas v1O4 (Figura 17, estrella circular). Por consiguiente, el efecto de la clorpromazina depende de la celula que se expone y que tiene algunas propiedades anticancengenas que no necesariamente implica que tiene amplia actividad contra todas las celulas cancerosas o celulas madre de cancer.
Ejemplo 14: Analogos de tioridazina con actividad en variantes de celulas madre neoplasicas no inducen muerte celular en lmeas celulares de cancer de LMA
Se han utilizado lmeas celulares de cancer en ensayos de cribado de alto rendimiento para identificar compuestos terapeuticas potenciales contra el cancer. La viabilidad celular es una salida comunmente utilizada para evaluar la actividad potencial contra el cancer de un compuesto. Sin embargo, las terapias contra el cancer que dependen unicamente de la induccion de la muerte celular pueden no representar el metodo mas eficaz para erradicar las celulas madre del cancer. La identificacion de compuestos que se dirigen espedficamente a celulas madre de cancer e inducir su diferenciacion podna representar otro tipo de terapia dirigida. La dificultad para identificar estos tipos de compuestos se debe en parte a la falta de sustitutos apropiados para las celulas madre del cancer. Basandose en las caractensticas y propiedades caracterizadas de las variantes de celulas madre neoplasicas, son utiles para identificar compuestos contra el cancer que no necesariamente inducen la muerte celular.
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Dos observaciones demuestran la utilidad de las variantes de celulas madre neoplasicas en la identificacion de compuestos que fueron o no fueron identificados como compuestos anticancengenos por otros sistemas. Ambas observaciones estan relacionadas con la respuesta de lmeas celulares de cancer de LMA, LMA-OCI2 y LMA-OCI3 a la tioridazina y analogos de tioridazina.
Anteriormente se demostro que la tioridazina reduce el numero de celulas tanto en el LMA-OCI2 como en el LMA- OCI3 (vease, por ejemplo, la PCT/CA2010/000175). Las celulas LMA-OCI2 y LMA-OCI3 se trataron con tioridazina y las celulas se analizaron para detectar signos de muerte celular inducida por apoptosis. Como se muestra en la Figura 18, la tioridazina ejerce sus efectos sobre estas lmeas celulares a traves de la muerte celular, con igual eficacia frente a LMA-OCI2 y LMA-OCI3. Esto contrasta con los efectos inducidos por la diferenciacion de la tioridazina en las variantes de celulas madre neoplasicas. Una demostracion adicional de la utilidad de los procedimientos descritos en la presente invencion se ilustra mediante la respuesta de las lmeas celulares de cancer a analogos de tioridazina. Las Figuras 17 y 18 mostraron que estos compuestos presentaban actividad similar a la tioridazina, incluyendo la capacidad para reducir el numero de celulas y la pluripotencia en celulas v1, y producir respuestas de diferenciacion similares. Sin embargo, los analogos de tioridazina no indujeron significativamente la apoptosis en las lmeas celulares de cancer de LMA; estos analogos de tioridazina no habnan sido probablemente identificados en un cribado de viabilidad utilizando estas celulas.
Por consiguiente, el uso de los ensayos de cribado divulgados en la presente memoria que usan variantes de celulas madre neoplasicas son significativamente diferentes de otros procesos de cribado que usan lmeas celulares de cancer.
Ejemplo 15: Los compuestos identificados como compuestos anticancengenos son raramente compuestos contra celulas madre de cancer
Las bibliotecas qmmicas usadas para cribar celulas madre pluripotentes neoplasicas (celulas v1O4) contienen compuestos que se describen como agentes terapeuticos anticancengenos conocidos o actuales. Muchos de estos productos terapeuticos contra el cancer presumiblemente han mostrado toxicidad contra las lmeas celulares de cancer.
Se realizo una busqueda con MetaDrug para farmacos de moleculas pequenas con estructuras disponibles que se usan en el tratamiento de canceres humanos ("neoplasias"). Esta busqueda encontro 167 de dichos compuestos anticancengenos a partir de las bibliotecas NIH, PWK, TOCRIS y CCC combinadas. Estos compuestos anticancengenos se representaron como se muestra en la Figura 20 y solo se identifico un pequeno subconjunto de ellos (5%) que teman actividad contra variantes de celulas madre neoplasicas (celulas v1O4). Esto sugiere que la plataforma de cribado descrita en este documento, tal como se describe en el Ejemplo 16, es altamente estricta o esta identificando compuestos anticancengenos de una manera unica. Ademas, es poco probable que los compuestos identificados como compuestos anticancengenos sean agentes contra celulas madre de cancer.
Ejemplo ilustrativo 16: Flujo de trabajo mejorado para la identificacion de alto rendimiento de compuestos que selectivamente se dirigen a celulas madre de cancer, pero no a celulas madre normales
Anteriormente, los presentes inventores describieron los efectos de la tioridazina sobre variantes de celulas madre neoplasicas y celulas madre H9 normales usando citometna de flujo cuantitativa para medir los niveles de Oct4 en ambos tipos de celulas despues del tratamiento con tres concentraciones diferentes de tioridazina (vease el documento PCT/CA2010/000175). Solo en la concentracion mas alta probada (10 |jM) hubo una diferencia significativa en la perdida de pluripotencia (basada en la expresion de Oct4) entre las celulas v1 neoplasicas y H9 normales (PCT/CA2010/000175). Sin embargo, la citometna de flujo cuantitativa no es facilmente susceptible al analisis de alto rendimiento.
Aqrn, los inventores describen metodos mejorados de cribado para identificar y validar compuestos que selectivamente se dirigen a celulas madre de cancer en comparacion con celulas madre normales como se muestra en la Figura 21. Los inventores tambien han determinado que la siembra de celulas madre normales y variantes de celulas madre neoplasicas como densidades de siembra espedficas como se muestra en la Figura 22 mejora el ensayo de cribado y permite la deteccion rapida y efectiva de agentes selectivos contra celulas madre de cancer. Los ejemplos de compuestos candidatos identificados usando este procedimiento de cribado secundario se describen como que tienen actividad selectiva o alternativamente, se denominan como activos selectivos, como se muestra en la Figura 23.
La primera etapa en el proceso de cribado, el cribado primario, se muestra en la Figura 21, etapa 1 y tambien se describe en la Figura 17 y Ejemplo 13. En esta etapa inicial de cribado, los compuestos que reducen los conteos de variantes de celulas madre neoplasicas y causan una PDP se identifican como compuestos activos. Estos compuestos se someten a continuacion a otro conjunto de analisis descritos en la Figura 21, etapa 2. Esta etapa representa una mejora respecto a los metodos de citometna de flujo cuantitativos previos para determinar la potencia del compuesto y detectar diferencias en la respuesta entre variantes de celulas madre neoplasicas y celulas madre normales. Se ensayan diluciones de 8 o 10 puntos para cada compuesto en variantes de celulas
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madre neoplasicas (V1O4) y celulas madre normales (celulas H9) para generar curvas de respuesta a la dosis. Para cada compuesto, se extrapolan los valores de concentracion efectivos para la reduccion del 50% en los recuentos celulares (CE50) de las curvas de respuesta a la dosis de las celulas tratadas v1O4 y H9. Los datos de respuesta a la dosis se ajustaron con una ecuacion de Hill de 4 parametros para derivar CE50, pendientes, valores mmimos y maximos usando el software IDBS ActivityBase. Los valores de CE50 se utilizan entonces para calcular una relacion de potencia de actividad selectiva (CE50 de H9/CE50 de v1O4). Un valor de relacion por encima de 1 indica que el compuesto es mas potente contra las celulas v1O4 que contra las celulas H9. Los valores de relacion se utilizan entonces como base para identificar compuestos de alta actividad selectiva que podnan inducir potencialmente la diferenciacion de celulas madre de cancer, pero no celulas madre normales. El ensayo de un compuesto sobre las variantes de celulas madre neoplasicas y las celulas madre normales a una cantidad de diferentes concentraciones permite la generacion de curvas de respuesta a la dosis y la identificacion de compuestos que exhiben actividad selectiva que no puede ser identificada mediante cribado a una sola concentracion o en un rango limitado de concentraciones. La eficacia de cada compuesto tambien se puede cuantificar mediante analisis si se deriva el valor min del ajuste de Hill de 4 parametros. Una metrica alternativa para la actividad selectiva es una comparacion de eficacia. EFICACIA selectiva = Minajustado de H9-Minajustado de v1O4.
Ejemplo ilustrativo 17: Compuestos contra celulas madre de cancer identificados usando relaciones de alta selectividad
Se calcularon las relaciones de actividad de selectividad [CE50 (v1O4)/CE50 (H9)] como se discutio en el Ejemplo 15 para una serie de compuestos cribados utilizando los metodos descritos en la presente memoria. Se selecciono un valor de relacion de 3 como umbral para identificar compuestos de alta actividad selectiva. Se espera que estos compuestos induzcan selectivamente la diferenciacion/toxicidad en las celulas madre del cancer, pero tienen efectos mmimos sobre las celulas madre normales. Los compuestos identificados usando el ensayo de cribado con las relaciones de actividad selectiva mas elevadas se muestran en la Figura 23. Sorprendentemente, las relaciones de potencia de actividad selectiva para tioridazina y analogos de tioridazina eran demasiado bajas para ser incluidas en la Figura 23, lo que sugiere que los otros compuestos descritos en la presente memoria pueden tener una ventana terapeutica mas grande.
Ejemplo ilustrativo 18: El analisis de curvas de respuesta a la dosis permite la identificacion de agentes contra celulas madre de cancer
La mayona de los metodos primarios de cribado de alto rendimiento utilizan un unico punto de concentracion para interrogar la respuesta de un ensayo debido al tratamiento con un compuesto. La presente divulgacion describe ensayos y condiciones para manipular variantes de celulas madre neoplasicas y celulas madre normales con el fin de desarrollar ensayos basados en celulas madre para identificar y validar compuestos como selectivos para celulas madre de cancer. En particular, los metodos permiten la generacion de curvas de respuesta a la dosis como se muestra en las Figuras 21 y 24. Los datos de estas curvas se utilizaron para distinguir las diferencias en la respuesta de variantes de celulas madre neoplasicas y celulas madre normales a compuestos con potencias variables.
La Figura 24A muestra 7 compuestos selectivos activos que podnan haberse identificado ensayando las celulas en un solo punto de concentracion de 10 pM. La Figura 24B muestra las curvas de respuesta a la dosis para los otros 12 compuestos selectivos activos. Basandose en un solo punto de concentracion de 10 pM, muchos de estos compuestos no se habnan considerado selectivos para las celulas madre de cancer, tales como la 8-azaguanina, el parbendazol o el 31-8220. Como se muestra en el Ejemplo 17, estos 19 compuestos selectivos activos parecen tener aun mayor selectividad para las celulas madre de cancer que la tioridazina.
Ejemplo ilustrativo 19: Algunos compuestos de alta actividad selectiva tienen una baja actividad de activacion de respuesta al estres p53.
La LMA se caracteriza por celulas hematopoyeticas neoplasicas que estan bloqueadas en su capacidad para diferenciarse en celulas maduras. De forma similar, las variantes de celulas madre neoplasicas tambien son refractarias a las senales de diferenciacion normales (vease Werbowetski-Ogilvie et al., 2009). Los agentes que pueden inducir la diferenciacion de celulas progenitoras/madre neoplasica representan una estrategia prometedora para el tratamiento de ciertos canceres. El tratamiento de la leucemia promielocftica aguda (LPA) usado acido todo- trans-retinoico (ATRA) y trioxido de arsenico son ejemplos de aplicaciones de esta estrategia. Se cree que estos compuestos erradican las celulas madre del cancer que mantienen el cancer induciendo la diferenciacion.
Para identificar compuestos que demostraron tener alta selectividad (Figura 23) que son tambien eficientes en la induccion de la diferenciacion, se analizaron variantes de celulas madre neoplasicas tratadas para detectar cambios en la respuesta al estres citotoxico que depende de p53. Variantes de celulas madre neoplasicas (celulas v1O4) y celulas madre H9 normales fueron fijadas y tenidas para la expresion de p53 despues del tratamiento con compuestos de actividad selectiva. El porcentaje de tincion de celulas v1O4 y celulas H9 positivas para p53 se grafico luego para cada compuesto como se muestra en la Figura 25. Los altos niveles de activacion de p53 indicaron alta toxicidad celular. Aunque los compuestos de actividad selectiva causaron niveles variables de
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activacion de p53 tanto en celulas v1O4 como H9, las celulas v1O4 generalmente parecen ser mas sensibles con respecto a las celulas H9 normales.
Los compuestos de alta actividad selectiva agrupados cerca de la esquina inferior izquierda no aumentaron significativamente la respuesta de estres dependiente de p53 en celulas v1O4 y H9. Este grupo puede contener candidatos potenciales para compuestos que diferencian selectivamente las celulas v1O4. Se determinaron los niveles de p53 de variantes de celulas madre neoplasicas tratadas con tioridazina y analogos de tioridazina y tambien se muestran en la Figura 25 como puntos negros. Como se muestra en la Figura 25, los analogos de tioridazina aparecieron en esta misma esquina inferior izquierda, en consonancia con observaciones previas de que actuaban sobre variantes de celulas madre neoplasicas induciendo diferenciacion.
Ejemplo 20 La tioridazina se dirige selectivamente a celulas madre de cancer de mama que expresan receptores de dopamina.
Como se muestra en el Ejemplo 12, los receptores de dopamina (DR) se colocalizan en la fraccion de celulas madre de cancer (CMC) del tejido de cancer de mama triplemente negativo primario. MDA-MB-231 es una lmea celular derivada de un carcinoma de mama triplemente negativo que esta altamente enriquecido por celulas que poseen el fenotipo CMC de mama identificado y aceptado, CD44+CD24-/bajo (Figura 26A) (Al-Hajj et al., 2003, Mani et al., 2008). La Figura 26B muestra que las CMC de mama coexpresan diferentes subtipos de DR. El tratamiento de las celulas con tioridazina dio lugar a una menor frecuencia de celulas que expresan DR de tipo D1 (DRD1) (Figura 26C). Esto fue acompanado por un aumento en la expresion de CD24 como se muestra en la Figura 26D, que es un determinante negativo para CMC de mama y asociado con la reduccion de la capacidad de repoblacion (Sleeman et al., 2006). Estos resultados demuestran que la tioridazina se dirige selectivamente a la poblacion de CMC de mama que expresa DR, a traves de diferenciacion inducida y muerte celular y tambien es consistente con los datos de la Figura 10 y el Ejemplo 9 que muestran la diferenciacion inducida por tioridazina de variantes de celulas madre neoplasicas humanas y blastocitos de LMA.
Ejemplo 21 Identificacion de agentes selectivos contra celulas madre de cancer usando un metodo de cribado de dos etapas.
La Figura 27 es un diagrama de dispersion que muestra los resultados del cribado de una biblioteca qmmica usando un metodo de cribado en dos etapas para la deteccion de agentes selectivos contra celulas madre de cancer. La etapa de cribado primario identifico compuestos con actividad contra celulas madre de cancer (agentes de prueba) basados en su capacidad para inducir una perdida de pluripotencia (PDP) y disminucion en el recuento de celulas de las variantes de celulas madre neoplasicas (todos los compuestos por debajo de la lmea discontinua en la Figura 27). Esta primera etapa ayuda a identificar compuestos que pueden estar dirigidos a las propiedades de rigurosidad (o autorrenovacion) de las celulas madre del cancer. El diagrama de dispersion muestra las diversas propiedades de la biblioteca de compuestos probada, ya que algunos compuestos indujeron PDP con una reduccion moderada en el numero de celulas, mientras que otros compuestos indujeron PDP con un alto nivel de citotoxicidad. En general, los compuestos mas citotoxicos paredan tener una mayor induccion de PDP. El direccionamiento de agentes que inducen tanto la perdida de pluripotencia como una reduccion en el recuento de celulas da como resultado una mayor proporcion de agentes que se identifican como agentes selectivos contra celulas madre de cancer en la segunda etapa del metodo de cribado. La siguiente etapa del metodo en dos etapas implico la identificacion de agentes contra celulas madre de cancer que se dirigen selectivamente y reducen los recuentos celulares de variantes de celulas madre neoplasicas y no de celulas madre normales, ensayando los agentes de prueba a una pluralidad de concentraciones de prueba y opcionalmente determinar los valores de CE50. Los compuestos que superan un valor de relacion de selectividad predeterminado se enumeran en la Figura 23 como compuestos selectivos activos y se muestran como estrellas negras en la Figura 27.
Aunque se ha descrito la presente divulgacion con referencia a lo que actualmente se considera que son los ejemplos preferidos, debe entenderse que la divulgacion no esta limitada a los ejemplos descritos.
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Claims (15)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para identificar y validar un agente de prueba como un agente selectivo de celulas madre anticancer, comprendiendo el metodo:
    i) poner en contacto una o mas variantes de celulas madre neoplasicas con el agente de prueba y una o mas celulas madre normales con el agente de prueba;
    ii) detectar un cambio en el recuento de celulas de las variantes de celulas madre neoplasicas en respuesta al agente de prueba, y detectar un cambio en el recuento de celulas de las celulas madre normales en respuesta al agente de prueba;
    iii) identificar el agente de prueba como un agente selectivo contra celulas madre de cancer si el contacto con el agente de prueba induce una disminucion en el recuento de celulas de las variantes de celulas madre neoplasicas sin inducir una disminucion comparable en las celulas madre normales; y opcionalmente
    iv) poner en contacto las variantes de celulas madre neoplasicas y las celulas madre normales con el agente de prueba en una pluralidad de concentraciones de prueba y detectar un cambio en el recuento de celulas para una o mas variantes de celulas madre neoplasicas y para las celulas madre normales en la pluralidad de las concentraciones de prueba;
    en donde el cambio en el recuento de celulas para las variantes de celulas madre neoplasicas se detecta entre aproximadamente 48 horas y 96 horas despues de poner en contacto las celulas con el agente de prueba y se detecta el cambio en el recuento de celulas para las celulas madre normales entre aproximadamente 4 dfas y 6 dfas despues de poner en contacto las celulas con el agente de prueba.
  2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende ademas antes de la etapa i) detectar un cambio en la pluripotencia y un cambio en el recuento de celulas de variantes de celulas madre neoplasicas en respuesta al contacto con el agente y seleccionar un agente como agente de prueba si el agente induce una perdida de pluripotencia y/o una disminucion en el recuento de celulas de las variantes de celulas madre neoplasicas.
  3. 3. El metodo de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que la pluralidad de concentraciones de prueba vana en al menos aproximadamente 3, 4 o 5 ordenes de magnitud, o donde la pluralidad de concentraciones vana al menos desde aproximadamente 0,01 pM hasta 2 pM o al menos desde aproximadamente 10 nM hasta aproximadamente 20 pM, o donde la pluralidad de concentraciones de prueba comprende al menos una serie de diluciones de 8 puntos.
  4. 4. El metodo de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que la etapa de identificar el agente de prueba como un agente selectivo contra celulas madres de cancer comprende comparar una curva de respuesta a la dosis para el cambio en el recuento de celulas de las variantes de celulas madre neoplasicas en respuesta al contacto con el agente de prueba a la pluralidad de concentraciones de prueba a una curva de respuesta a la dosis para el cambio en el recuento de celulas de las celulas madre normales en respuesta al contacto con el agente de prueba a la pluralidad de concentraciones de prueba, opcionalmente puede comprender ademas determinar para el agente de prueba un valor concentracion efectiva maxima para el 50% (CE50) para la disminucion en el recuento de celulas para las variantes de celulas madre neoplasicas y un valor de CE50 para la disminucion en el recuento de celulas en las celulas madre normales, opcionalmente puede comprender ademas la determinacion de una relacion del valor de CE50 para la disminucion en el recuento de celulas para las celulas madre normales en relacion con el valor de CE50 para la disminucion en el recuento de celulas para las variantes de celulas madre neoplasicas, opcionalmente en donde el agente de prueba puede identificarse como un agente selectivo contra celulas madre de cancer si la relacion de los valores de CE50 es mayor que 3.
  5. 5. El metodo de la reivindicacion 1 o 2, en el que las variantes de celulas madre neoplasicas se siembran en un primer receptaculo hasta aproximadamente 3.000 a 7.000 celulas por receptaculo y las celulas madre normales se siembran en un segundo receptaculo hasta aproximadamente 8.000 a 12.000 celulas por receptaculo, opcionalmente en donde las variantes de celulas madre neoplasicas se siembran a razon de aproximadamente 4.000 a 6.000 celulas por receptaculo, opcionalmente alrededor de 5.000 celulas por receptaculo, opcionalmente en donde las celulas madre normales se siembran a razon de aproximadamente 9.000 a 11.000 celulas por receptaculo, opcionalmente alrededor de 10.000 celulas por receptaculo.
  6. 6. El metodo de la reivindicacion 5, en el que el primer receptaculo y el segundo receptaculo son pozos en la misma placa de microtitulacion o pozos en placas de microtitulacion separadas, opcionalmente en donde la placa de microtitulacion es una placa de microtitulacion de 96 pozos, opcionalmente una placa de microtitulacion recubierta de 96 pozos.
  7. 7. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el cambio en el recuento de celulas para las variantes de celulas madre neoplasicas se detecta entre aproximadamente 72 horas despues de ponerse en contacto las celulas con el agente
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    de prueba y se detecta el cambio en el recuento de celulas para las celulas madre normales entre aproximadamente 5 d^as despues de poner en contacto las celulas con el agente de prueba; o el metodo de la reivindicacion 2, en el que el cambio en el recuento de celulas para las variantes de celulas madre neoplasicas se detecta entre aproximadamente 48 horas y 96 horas despues de ponerse en contacto las celulas con el agente de prueba, opcionalmente aproximadamente 72 horas, y el cambio en el recuento de celulas para celulas madre normales se detecta entre aproximadamente 4 dfas y 6 dfas despues de poner en contacto las celulas con el agente de prueba, opcionalmente aproximadamente 5 dfas, y el cambio en pluripotencia para las variantes de celulas madre neoplasicas se detecta entre 48 y 96 horas despues de poner en contacto las variantes de celulas madre neoplasicas con el agente de prueba, opcionalmente aproximadamente 72 horas despues de poner en contacto las variantes de celulas madre neoplasicas con el agente de prueba.
  8. 8. El metodo de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que las variantes de celulas madre neoplasicas son celulas madre pluripotentes humanas transformadas (CMPht) o celulas madre pluripotentes inducidas transformadas (CMPit).
  9. 9. El metodo de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que las celulas madre normales son celulas madre pluripotentes, o celulas madre pluripotentes inducidas, o celulas madre pluripotentes inducidas derivadas de fibroblastos.
  10. 10. El metodo de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, que comprende ademas el cribado del agente de prueba identificado como un agente selectivo contra celulas madre de cancer por la actividad en una lmea celular de cancer derivada de un sujeto con cancer, opcionalmente en donde la lmea celular de cancer es una lmea celular leucemica, opcionalmente una lmea celular de leucemia mieloide aguda (LMA).
  11. 11. El metodo de la reivindicacion 10, en el que la actividad es citotoxicidad, induccion de apoptosis, perdida de pluripotencia, induccion de diferenciacion, o combinaciones de los mismos.
  12. 12. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende ademas antes de la etapa i) cribar uno o mas agentes para identificar uno o mas agentes de prueba que inducen perdida de pluripotencia y una disminucion en el recuento de celulas de variantes de celulas madre neoplasicas, que comprende opcionalmente antes de la etapa i) poner en contacto las variantes de celulas madre neoplasicas con el agente, detectar un cambio en la pluripotencia y un cambio en el recuento de celulas de las variantes de celulas madre neoplasicas en respuesta al agente y seleccionar un agente como agente de prueba si el agente induce una perdida de pluripotencia y una disminucion en el recuento de celulas de las variantes de celulas madre neoplasicas, opcionalmente en donde las variantes de celulas madre neoplasicas se ponen en contacto con el agente a aproximadamente 10 pM.
  13. 13. El metodo de la reivindicacion 12, en el que se criban una pluralidad de agentes en una placa de microtitulacion y se identifican como agentes de prueba con base en una desviacion estandar umbral de la media, opcionalmente un umbral de una puntuacion Z de al menos 3 desviaciones estandar respecto a la media, opcionalmente a partir de la media en toda la placa para el cambio en la pluripotencia y el cambio en el recuento de celulas.
  14. 14. El metodo de la reivindicacion 12, en el que se usan variantes de celulas madre neoplasicas tratadas con protema morfogenica osea 4 (BMP4) para inducir perdida de pluripotencia como control positivo, opcionalmente en donde las celulas se tratan con al menos 100 ng/mL de BMP4.
  15. 15. El metodo de la reivindicacion 12, en el que se detecta el cambio en pluripotencia de las variantes de celulas madre neoplasicas detectando un cambio en el nivel de expresion de uno o mas marcadores de pluripotencia, opcionalmente en donde la deteccion de la expresion de uno o mas marcadores de pluripotencia comprende el uso de anticuerpos selectivos para uno o mas marcadores de pluripotencia, opcionalmente en donde la expresion de uno o mas marcadores de pluripotencia en una o mas variantes de celulas madre neoplasicas esta operativamente unida a un gen informador, opcionalmente en donde el marcador de pluripotencia se selecciona entre Oct4 y Sox2, opcionalmente donde el marcador de pluripotencia se selecciona entre Oct4, Sox2, Nanog, SSEA3, SSEA4, TRA-1- 60, TRA-1-81, receptor de IGF1, conexina 43, E-caderina, fosfatasa alcalina, REX1, CRIPTO, CD24, CD90, CD29, CD9 y CD49f, y mezclas de los mismos.
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