JP6367038B2 - 受容体の細胞内輸送制御による白血病治療のための新規医薬組成物 - Google Patents

Description

本発明は、受容体の細胞内輸送制御による白血病治療のための新規医薬組成物に関する。

近年、分子標的薬の開発により慢性骨髄性白血病などの造血器悪性腫瘍の治療成績は画期的に改善した。急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などの造血器腫瘍や、固形腫瘍においても数多くの分子異常が明らかにされており、その発症ならびに病態維持に変異型サイトカイン受容体の関与が報告されている。また、変異型サイトカイン受容体を有する腫瘍は既存の抗腫瘍薬に対し抵抗性を示すことから、新たな治療法が求められている。しかしながら、現在までに有効な分子標的薬は開発されておらず、その開発は急務である。また、臨床応用可能な薬剤の開発には選択性、阻害活性、耐性、有害事象など、解決すべき多くの問題があるのが現状である。

造血細胞は、造血因子受容体を介した細胞外からの刺激を細胞内において調節することで恒常性を維持しており、その破綻が白血病をはじめとした造血器腫瘍の発症に深く関わっている。ｃ−ＫＩＴやＦｌｔ３などの受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は、リガンド結合後二量体を形成、自己リン酸化することで活性化し、細胞内にシグナルを伝達する。従来、ＲＴＫからのシグナル伝達は、細胞膜に存在する受容体からのシグナルに依存すると考えられてきた。しかし近年、シグナリングエンドソームという概念、すなわち細胞膜から細胞内小器官であるエンドソームに取り込まれた後のＲＴＫからも種々のシグナルが細胞内に伝達されることが明らかとなってきており、ＲＴＫの細胞内局在の重要性が注目されている。特に急性白血病や、固形腫瘍で認められる恒常的活性型（リガンド非依存性）変異ＲＴＫは、膜表面以外の細胞内小器官に局在し、異所性にシグナルを伝達することで腫瘍活性を維持していることが知られているが、その詳細な機構に関しては不明であった。

一方、本発明の有効成分であるクロルプロマジン（ＣＰＺ）、クロロキン、Ｐｉｔｓｔｏｐなどのクラスリン依存性エンドサイトーシス阻害剤は、一般的に白血病などの造血器腫瘍の治療に用いられることは知られていない。例えば、ＣＰＺは、フェノチアジン誘導体のグループに属し、統合失調症、器質性精神病および躁鬱病の躁病相などの治療にヒト用医薬品として広く使用されている。また、ＣＰＺやフェノチアジン誘導体の抗癌作用を記載した報告は存在するが（特許文献１および２）、ＣＰＺが白血病治療効果を有することは具体的に記載されていない。また、クロロキンやその誘導体は抗マラリア剤などとして使用され得、抗癌作用を記載した報告も存在するが（特許文献３および４）、それらが白血病治療効果を有することは知られていない。

特表平１１−５０７６４７号公報 特表２０１０−５２３７１９号公報 特表２００９−５０２９５４号公報 特表２０１２−５３０６９７号公報

本発明者らは上記のような先行技術における課題を解決すべく、臨床使用が可能な新規白血病治療剤の開発のために鋭意研究を重ねた結果、クラスリン被覆小胞（ＣＣＶ）を介した受容体の細胞内輸送が、活性型変異ＲＴＫにおける腫瘍活性の維持に極めて重要であることを見出した。また、クロルプロマジン、クロロキン、Ｐｉｔｓｔｏｐなどのクラスリン依存性エンドサイトーシス阻害剤を用いて、サイトカイン受容体の細胞内外輸送を変化させることで、腫瘍細胞の増殖をｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいて顕著に抑制しうることを見出した。さらにクロルプロマジンなどのクラスリン依存性エンドサイトーシス阻害剤がＫＩＴ−Ｖ８１４（またはＤ８１６）やＦｌｔ３−ＩＴＤなどの活性型変異ＲＴＫを有するＡＭＬに対して特に強い抗白血病効果を有し、さらに活性型変異ＲＴＫを有する固形腫瘍に対しても強い抗腫瘍効果を示すことを見出し、本発明を完成するに到った。

すなわち、本発明は、
［１］
白血病を治療するための、クラスリン依存性エンドサイトーシス阻害剤を含む医薬組成物；

［２］
クラスリン依存性エンドサイトーシス阻害剤がクロルプロマジン、クロロキン、Ｐｉｔｓｔｏｐ １（登録商標）、およびＰｉｔｓｔｏｐ ２（登録商標）からなる群から選択される、上記［１］に記載の医薬組成物；

［３］
クラスリン依存性エンドサイトーシス阻害剤がクロルプロマジンである、上記［１］に記載の医薬組成物；

［４］
他の白血病治療剤をさらに含む、上記［１］〜［３］のいずれか１つに記載の医薬組成物；

［５］
急性骨髄性白血病を治療するための、上記［１］〜［４］のいずれか１つに記載の医薬組成物；

［６］
活性型変異受容体型チロシンキナーゼを有する急性骨髄性白血病を治療するための、上記［１］〜［５］のいずれか１つに記載の医薬組成物；

［７］
白血病を治療するための、クラスリン依存性エンドサイトーシス阻害剤および他の白血病治療剤を含むキット；

［８］
クラスリン依存性エンドサイトーシス阻害剤がクロルプロマジン、クロロキン、Ｐｉｔｓｔｏｐ １（登録商標）、およびＰｉｔｓｔｏｐ ２（登録商標）からなる群から選択される、上記［７］に記載のキット；

［９］
クラスリン依存性エンドサイトーシス阻害剤がクロルプロマジンである、上記［７］に記載のキット；

［１０］
急性骨髄性白血病を治療するための、上記［７］〜［９］のいずれか１つに記載のキット；ならびに

［１１］
活性型変異受容体型チロシンキナーゼを有する急性骨髄性白血病を治療するための、上記［７］〜［１０］のいずれか１つに記載のキット
に関する。

本発明の新規医薬組成物は、既存の抗腫瘍薬と全く異なる機序で作用するため、これまでに有効な治療方法がなかった難知性の種々腫瘍に対する新たな治療薬として用いることができ、特に白血病、とりわけＡＭＬに対する新たな治療薬として有用である。これまでＡＭＬ治療において有効なＲＴＫ阻害薬が開発されていないことから臨床的意義は高い。

さらに重要なことは、本発明は有効成分として既知の医薬品を通常用量用いた場合の新たな薬理作用に係るものであるため、新規薬剤開発における有害事象に関する問題点がすでに解決できている。特に、ＣＰＺはヒト用医薬品としてすでに承認されており、血液毒性がなく、非血液毒性なども明らかであるため、ＡＭＬの治療薬として特に有用である。

図１は、各種細胞株に対するＣＰＺの選択的増殖抑制効果を示している。各種白血病に代表される細胞株において、ＣＰＺ添加群の細胞数をＤＥＭＳＯ添加群（コントロール）と比較して相対的に示している。 図２は、ＣＰＺによるＢａＦ／ＫＩＴ−Ｖ８１４の皮下における抗腫瘍効果を示している。ＫＩＴ−Ｖ８１４導入Ｂａ／Ｆ３細胞をヌードマウスに移植し、生理食塩水（ＮＳ）、ＣＰＺ ５ｍｇ／ｋｇ、またはＣＰＺ １５ｍｇ／ｋｇで処置した各群につき、２１日目の状態を示している。 図３は、ＣＰＺによるＢａＦ／ＫＩＴ−Ｖ８１４の骨髄および脾臓における抗腫瘍効果を示している。ＫＩＴ−Ｖ８１４導入Ｂａ／Ｆ３細胞をヌードマウスに移植し、生理食塩水（ＮＳ）、またはＣＰＺ １５ｍｇ／ｋｇで処置した各群につき、移植後２１日目の状態を比較している。骨髄においてはＦＡＣＳで解析し、定量化した結果を、脾臓においてはその重量を測定し、定量化した結果をそれぞれ示している。 図４は、ＣＰＺによるＢａＦ／Ｆｌｔ３−ＩＴＤの末梢血および脾臓における抗腫瘍効果を示している。Ｆｌｔ３−ＩＴＤ導入Ｂａ／Ｆ３細胞をヌードマウスに移植し、生理食塩水（ＮＳ）、またはＣＰＺ １５ｍｇ／ｋｇで処置した各群につき、移植後１４日目の状態を比較している。末梢血においてはＦＡＣＳで解析し、定量化した結果を、脾臓においてはその重量を測定し、定量化した結果をそれぞれ示している。 図５は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＣＰＺの抗白血病効果を示している。ＡＭＬ患者の骨髄より単離したＡＭＬ細胞を重度免疫不全マウス（ＮＯＧマウス）に移植し、Ｆｌｔ３−ＩＴＤを有する症例１、およびＫＩＴ−Ｄ８１６を有する症例２のそれぞれに対し、生理食塩水（ＮＳ）投与群、またはＣＰＺ １５ｍｇ／ｋｇ処置群につき、１０週間後における骨髄中のヒトＣＤ４５（白血病細胞）陽性細胞の割合をＦＡＣＳで解析した結果を示している（図５左）。また、ヒト臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞をＮＯＧマウスに移植して同様の処置をした場合の結果も示している（図５右）。

本発明の医薬組成物に用いられるクラスリン依存性エンドサイトーシス阻害剤としては、限定されるものではないが、クロルプロマジン、クロロキン、Ｐｉｔｓｔｏｐ １（登録商標）、およびＰｉｔｓｔｏｐ ２（登録商標）を挙げることができる。好ましい実施態様では、本発明の医薬組成物に用いられるクラスリン依存性エンドサイトーシス阻害剤はクロルプロマジンである。

本発明の医薬組成物は、造血器腫瘍や固形腫瘍などの様々な腫瘍の治療に用いることができるが、特に白血病の治療に有用である。本発明の医薬組成物で治療しうる白血病としては、限定されるものではないが、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、および慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を挙げることができる。好ましい実施態様では、本発明の医薬組成物は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療に用いられる。

別の実施態様では、本発明の医薬組成物は、活性型変異受容体型チロシンキナーゼを有する腫瘍、特に活性型変異受容体型チロシンキナーゼを有する急性骨髄性白血病を治療するために用いられる。活性型変異受容体型チロシンキナーゼとしては、限定されるものではないが、ＫＩＴ−Ｖ８１４、ＫＩＴ−Ｄ８１６、およびＦｌｔ３−ＩＴＤなどを挙げることができる。

本発明の医薬組成物は、有効成分であるクラスリン依存性エンドサイトーシス阻害剤に加えて、必要に応じて、賦形剤（例えば、マンニトール、ソルビトールの如き糖誘導体；トウモロコシデンプン、バレイショデンプンの如きデンプン誘導体；または、結晶セルロースの如きセルロース誘導体など）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムの如きステアリン酸金属塩；またはタルクなど）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはポリビニルピロリドンなど）、崩壊剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウムの如きセルロース誘導体など）、防腐剤（メチルパラベン、プロピルパラベンの如きパラオキシ安息香酸エステル類；またはクロロブタノール、ベンジルアルコールの如きアルコール類など）、ｐＨ調整剤（例えば、塩酸、硫酸またはリン酸などの無機酸、酢酸、コハク酸、フマル酸またはリンゴ酸等の有機酸、あるいはこれらの塩など）、ならびに希釈剤等の通常使用される医薬製剤用添加剤を、単独または２種以上を混合して配合することができる。

本発明の医薬組成物は、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、溶液製剤、懸濁液製剤、もしくは乳化液製剤などの剤形で経口投与することができ、または坐剤、注射剤、静脈内点滴剤、もしくは吸入製剤などの剤形で非経口投与することができる。

本発明におけるクラスリン依存性エンドサイトーシス阻害剤の投与量は、処置される状態の重篤度、処置される患者の年齢、体重、用いられる剤形等の条件によって適宜変化しうる。ヒトに投与する場合、有効成分が０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜１０００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜１００ｍｇ／ｋｇ／日、より好ましくは０．５ｍｇ／ｋｇ／日〜５０ｍｇ／ｋｇ／日の用量となるように投与される。

別の実施態様では、本発明の有効成分であるクラスリン依存性エンドサイトーシス阻害剤は、他の抗癌剤と併用して用いられる。そのような抗癌剤としては、限定されるものではないが、アルキル化剤、白金製剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質、抗腫瘍性植物成分、ホルモン、および分子標的薬などを用いることができ、白血病治療剤として用いられるものが特に好ましい。そのような他の白血病治療剤としては、限定されるものではないが、ダウノルビシン、イダルビシン、シタラビン、エトポシド、ビンカアルカロイド、トレチノイン、三酸化ヒ素、プレドニゾロン、ビンクリスチン、シクロホスファミド、Ｌ−アスパラギナーゼ、メトトレキサート、イマチニブ、フルダラビン、リツキシマブ、６−メルカプトプリン、タミバロテン、ダサチニブ、ミトキサントロン、ビンデシン、エノシタビン、ニロチニブ、ダサチニブ、ベタメタゾン、デキサメタゾン、ドキソルビシン、ボスチニブ、ペントスタチン、ネララビン、アザシチジン、アクラルビシン、ブサルファン、ナイムスチン、ラニムスチン、ミトザントロン、ヒドロキシウレア、インターフェロン、およびレナリドマイドなどを挙げることができ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて、本発明の有効成分であるクラスリン依存性エンドサイトーシス阻害剤と併用することができる。

本発明の有効成分であるクラスリン依存性エンドサイトーシス阻害剤と他の抗癌剤が併用される場合、それらは同時に投与されてもよく、または別々に投与されてもよい。また、そのような併用の場合、本発明の有効成分であるクラスリン依存性エンドサイトーシス阻害剤と他の抗癌剤は合剤の形態であってもよく、またはキットの形態であってもよい。

以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１
ＣＰＺのＡＭＬ細胞株に対するｉｎ ｖｉｔｒｏでの選択的抗腫瘍効果
ＢＡＬＬ１（ヒトＢ細胞性白血病細胞株）、ＨＬ６０（ヒト前骨髄球性白血病細胞株）、ＴＡＬＬ−１（ヒトＴ細胞性白血病細胞株）、ＫＧ１（ヒト急性骨髄性白血病細胞株）、ＴＨＰ１（ヒト単球性白血病細胞株）、Ｋａｓｕｍｉ（８；２１転座型急性骨髄性白血病細胞株）、Ｋ５６２（ヒト慢性骨髄性白血病細胞株）、ＨＭＣ１（ヒト肥満細胞性白血病細胞株、ＫＩＴ−Ｄ８１６変異を有する）、およびＭＯＬＭ１３（ヒト急性骨髄性白血病細胞株、Ｆｌｔ３−ＩＴＤ変異を有する）の各種白血病細胞株１０００個／１００μＬに対し、ＤＥＭＳＯ（コントロール）またはＣＰＺ（７．５ｍＭ）をそれぞれ０．１μＬ添加し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで７２時間培養した。ＤＥＭＳＯ添加群（コントロール）の細胞数とＣＰＺ添加群の細胞数をそれぞれＡＴＰアッセイにより計測し、ＤＥＭＳＯ添加群に対するＣＰＺ添加群の細胞数の増殖倍数（Ｆｏｌｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）を計算した。結果を図１に示す。

図１から明らかなように、ＣＰＺは様々な白血病細胞株に対して増殖抑制作用を示した。特に、活性型変異ＲＴＫであるＫＩＴ−Ｄ８１６およびＦｌｔ３−ＩＴＤ変異をそれぞれ有するＨＭＣ１およびＭＯＬＭ１３に対して細胞増殖を強く抑制した。

実施例２
活性型変異ＲＴＫを導入した細胞株に対するＣＰＺのｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍効果
ＫＩＴ−Ｖ８１４をＩＬ３依存性細胞株Ｂａ／Ｆ３に導入し、ヌードマウスに移植した後、生理食塩水（ＮＳ）、またはＣＰＺ ５ｍｇ／ｋｇもしくはＣＰＺ １５ｍｇ／ｋｇで１日１回処置した各群につき、２１日目の状態を観察した。結果を図２に示す。

図２から明らかなように、生理食塩水投与群では顕著な皮下の腫瘤形成が認められた（矢印）。ＣＰＺ ５ｍｇ／ｋｇ投与群においても腫瘤形成が認められたが、その大きさは生理食塩水投与群と比べ、顕著に抑制されていた。またＣＰＺ １５ｍｇ／ｋｇ投与群では腫瘤形成が認められなかった。

次に、ＧＦＰでモニタリング可能なＫＩＴ−Ｖ８１４導入Ｂａ／Ｆ３細胞をヌードマウスに移植した。生理食塩水（ＮＳ）またはＣＰＺ １５ｍｇ／ｋｇで１日１回処置し、それぞれ移植後２１日目の骨髄および脾臓を分析した。骨髄についてはＦＡＣＳで解析し、定量化した。また、脾臓についてはその重量を測定し、定量化した。結果を図３に示す。

また、ＧＦＰでモニタリング可能なＦｌｔ３−ＩＴＤ導入Ｂａ／Ｆ３細胞をヌードマウスに移植した。生理食塩水（ＮＳ）またはＣＰＺ １５ｍｇ／ｋｇで１日１回処置し、それぞれ移植後１４日目の末梢血および脾臓を分析した。末梢血についてはＦＡＣＳで解析し、定量化した。また、脾臓についてはその重量を測定し、定量化した。結果を図４に示す。なお、図４の脾臓の写真については、未処置群（ＣＴＬ）の脾臓の写真も示している
。

図３および図４から明らかなように、生理食塩水（ＮＳ）投与群と比較して、ＣＰＺ投与群において、ＧＦＰ陽性細胞の骨髄、脾臓、および末梢血への浸潤が強く抑制されていた。

実施例３
ＡＭＬ細胞に対するクラスリン依存性エンドサイトーシス阻害剤のｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍効果
ＡＭＬ患者の骨髄より単離したＡＭＬ細胞を重度免疫不全マウス（ＮＯＧマウス）に移植し、ＡＭＬを発症させた。次いで、Ｆｌｔ３−ＩＴＤ変異を有する症例１、およびＫＩＴ−Ｄ８１６変異を有する症例２のそれぞれに対し、１日１回生理食塩水（ＮＳ）を投与した群、またはＣＰＺ １５ｍｇ／ｋｇで処置した各群につき、１０週間後における骨髄中のヒトＣＤ４５（白血病細胞）陽性細胞の割合をＦＡＣＳで解析し、抗白血病効果を検討した。結果を図５左に示す。

その結果から明らかなように、Ｆｌｔ３−ＩＴＤおよびＫＩＴ−Ｄ８１６のいずれの症例においても、ＣＰＺ投与群は生理食塩水投与群と比べ、ヒトＣＤ４５陽性細胞が減少した。すなわち、ＣＰＺがｉｎ ｖｉｖｏにおいてもＡＭＬに対して強い抗白血病効果を示すことが確認できた。

次に、ヒト臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞をＮＯＧマウスに移植し、上記ＡＭＬ細胞を移植した場合と同様の処置をした。その結果、ＣＰＺ投与群と生理食塩水投与群に有意な差はなく、ＣＰＺ投与はＣＤ３４陽性細胞の生着および生存には影響しなかった（図５右）。したがって、ＣＰＺはＦｌｔ３−ＩＴＤおよびＫＩＴ−Ｄ８１６などの活性型変異受容体型チロシンキナーゼを有する急性骨髄性白血病の治療に特に有用であることが分かった。

クラスリン依存性エンドサイトーシス阻害剤を有効成分とする本発明の医薬組成物は、既存の抗腫瘍薬と全く異なる機序で種々腫瘍に作用するため、これまでに有効な治療方法がなかった難知性の腫瘍、例えば白血病、特に急性骨髄性白血病、とりわけ活性型変異受容体型チロシンキナーゼを有する急性骨髄性白血病に対する新たな治療薬として用いることができる。

Claims (3)

1. ＫＩＴ−Ｄ８１６またはＦｌｔ３−ＩＴＤを有する急性骨髄性白血病を治療するための、クロルプロマジンを含む医薬組成物。
2. 他の白血病治療剤をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
3. ＫＩＴ−Ｄ８１６またはＦｌｔ３−ＩＴＤを有する急性骨髄性白血病を治療するための、クロルプロマジンおよび他の白血病治療剤を含むキット。

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