CN110585197B - 多巴胺受体拮抗剂泰尔登在治疗急性髓系白血病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了多巴胺受体拮抗剂泰尔登在治疗急性髓系白血病中的应用，开辟了多巴胺受体拮抗剂泰尔登作为药物的新用途，也为治疗急性髓系白血病提供了新的途径，并且通过不同融合蛋白之间的作用机制以及现有的APL理论模型作为支撑，经过相关的体外的细胞实验与体内的动物实验证明，泰尔登可以诱导细胞凋亡和自噬通路来促进AML细胞的死亡，同时泰尔登可以诱导融合蛋白PML‑RARA和AML1‑ETO的表达量的减少，因此是一种潜在的诱导AML细胞死亡的药物，为探索各种AML亚型治疗的替代策略提供了一个新的视角。

Description

多巴胺受体拮抗剂泰尔登在治疗急性髓系白血病中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及多巴胺受体拮抗剂泰尔登在治疗急性髓系白血病中的应用。

背景技术

急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukemia ,AML）是一种极度危害人类健康的恶性克隆性血液系统疾病, AML的主要特点是在骨髓和外周血中的成髓母细胞不受控制的增殖和积累，导致髓系细胞分化受阻，造血功能不全（粒细胞减少、血小板减少或贫血），并伴有或不伴有白细胞增多。此外，在所有类型的白血病中，AML的生存率是最低的。AML在儿童中很少见，但在65岁以上的成年人中比较常见。发达国家的发病率高于发展中国家，西方国家高于东方国家，全世界的发病率是2.25/10万人口，并随年龄的增加发病率逐渐增加。自上世纪90年代以来，AML的发病率增加了30% 以上，死亡率自上世纪70年代初以来增加了79%以上。这些数据提示，人口老龄化以及癌症、辐射、苯和唐氏综合症等疾病治疗的情况都有可能导致AML的发病率增加。尽管目前AML诊断和治疗方面取得了巨大的进步，尤其是近几年关于AML发病机制与预后的研究都取得了突破性的进展，并且AML患者的完全缓解率有了显著的提高，但是AML的早期筛查、复发、化疗抵抗等问题依旧是当前临床面临的难点。因此，在更好地理解AML发生发展的具体分子机制的基础上，寻找敏感的预后靶标及特异性分子治疗靶点将成为治疗AML关键突破口。

AML患者通常伴有造血功能紊乱的并发症，比如出血、疲劳、难治性的感染或白细胞数量极高等症状，后期临床表现主要是呼吸困难、意识混乱或其它器官衰竭等。目前，FAB（法国、美国和英国）协作组依照形态学、细胞化学、细胞遗传学、分子遗传学和免疫表型，同时结合临床的表型将AML分为M0-M7共八种亚型，M0代表急性髓细胞白血病微分化型，M1代表急性粒细胞白血病未分化型，M2代表急性粒细胞白血病部分未分化型，M3代表急性早幼粒细胞白血病，M4代表急性粒-单核细胞白血病，M5代表急性单核细胞白血病，M6代表急性红细胞白血病，M7代表急性巨核细胞白血病。不同的亚型阻滞的细胞分化节点不一样，异质性高，从而导致AML患者的生存周期与生活质量都不乐观，同时针对AML的临床化疗药物和靶向药物而言，对患者的毒副作用大，并且容易产生耐药性，所以患者的临床治疗效果并不理想，亟待开发新的药物来靶向AML的治疗，为患者的生存质量提供尽可能的改善。

M3型即急性早幼粒细胞白血病（Acute Promyelocytic Leukemia ,APL）在临床治疗上取得了巨大的成功，APL产生的原因是15号和17号染色体的异位产生的t(15;17)(q22;q21)，并由此产生PML-RARA融合基因（Promyelocytic Leukemia - Retinoic AcidReceptor Alpha），这个异常的融合蛋白阻滞了粒细胞的正常分化，从而导致早幼粒细胞的异常积累，该亚型的治疗策略是采用全反式维甲酸（All-Trans Retinoid Acid,ATRA）和三氧化二砷（As2O3,ATO）联合用药来诱导APL细胞的分化，ATRA和ATO的联用可以使APL患者的完全缓解率超过90%。

在AML发病的过程中，融合蛋白的产生起了至关重要的作用，并且在AML患者中占40% 。在所有的融合蛋白中最典型的三种是PML-RARA, AML1-ETO(RUNX1- RUNX1T1) 和CBFb-MYH11(Core-Binding Factor Subunit Beta - Myosin Heavy Chain 11)，而且他们占的比例是最高的。不同的融合蛋白可以共同调控下游靶基因的表达，尽管AML的亚型众多，但是不同融合蛋白调控的分子机制可能相同。基于APL被成功治愈的临床意义，既然不同的融合蛋白存在相似的分子调控机制，并且研究报道也证实了融合蛋白可以使造血干细胞的干性维持以及DNA修复相关的基因表达异常，还有就是在AML中PML-RARA和AML1-ETO融合蛋白结合位点的染色质开放程度都有很高的相似性, 由此可以判定在不同的AML亚型中存在共同的融合蛋白作用机制，且这些不同的融合蛋白靶向的下游基因在不同AML亚型中发挥相似的作用。发明人就是基于不同融合蛋白之间的作用机制以及现有的APL理论模型作为支撑来筛选靶向不同亚型AML的潜在药物，通过整合多组学数据，包括致病融合蛋白的ChIP-Seq数据、APL细胞加药前后的表达谱芯片数据以及cMAP数据库中所有药物在不同细胞系中的表达调变数据，采用生物信息学方法筛选得到了一个小分子化合物泰尔登（Chlorprothixene）是治疗AML的潜在药物。

泰尔登常被用于治疗一些精神类疾病，比如精神分裂症、抑郁病和焦虑性神经功能症等，经过相关的体外的细胞实验与体内的动物实验证明，发明人首次发现泰尔登可以诱导细胞凋亡和自噬通路来促进AML细胞的死亡，同时泰尔登可以诱导融合蛋白PML-RARA和AML1-ETO的表达量的减少，借此调控下游与凋亡有关的靶基因的表达来促进AML细胞的死亡，因此发明人发现了泰尔登的新用途，是一种潜在的诱导AML细胞死亡的药物，为探索各种AML亚型治疗的替代策略提供了一个新的视角。

发明内容

本发明的目的在于提供多巴胺受体拮抗剂泰尔登在治疗急性髓系白血病中的应用，开辟了多巴胺受体拮抗剂泰尔登作为药物的新用途，也为治疗急性髓系白血病提供了新的途径。

本发明为实现上述发明目的提供的技术方案如下：

多巴胺受体拮抗剂泰尔登在治疗急性髓系白血病中的应用。

发明人进行了以下实验：

1、通过分析三种融合蛋白PML-RARA, AML1-ETO 和CBFb-MYH11的ChIP-seq数据发现，融合蛋白的异常可以引起基因转录水平的调控异常，三种融合蛋白PML-RARA,AML1-ETO和 CBFb-MYH11共同调控的靶基因在AML疾病发生和治疗中发挥作用。

2、通过计算生物信息学的方法筛选药物，选取与NB4细胞系加入全反式维甲酸药物处理以后有相似基因表达调控模式的药物，结果表明泰尔登作为一种多巴胺受体拮抗剂，是治疗AML潜在的药物。

3、细胞活力检测、细胞形态学检测和上流式细胞仪检测细胞周期，结果表明泰尔登可以抑制AML细胞系的增殖和诱导NB4细胞系分化。

4、采用高通量转录组测序方法检测由泰尔登介导的AML不同细胞系转录水平的变化，结果表明泰尔登可以诱导AML细胞系在转录水平发生基因调变。

5、选取与线粒体凋亡相关的分子标记caspase-3, caspase-8和PARP，观察NB4和KasuMi-1细胞系在加入泰尔登药物处理以后，在不同的时间梯度与不用的药物浓度作用下，蛋白激酶相关的分子标记的表达情况，结果表明泰尔登可以诱导NB4和KasuMi-1细胞系半胱氨酸蛋白激酶依赖性的细胞凋亡。

6、自噬双标腺病毒免疫荧光实验、单丹磺酰尸胺染色和透射电子显微镜观察自噬小体，结果表明泰尔登可以诱导NB4和KasuMi-1细胞系的细胞自噬反应。

7、蛋白印迹实验加入自噬抑制剂Baf-A1，Baf-A1降低了细胞自噬标志物水平，也降低了细胞凋亡标志物的表达，表明泰尔登可以通过诱导细胞自噬过程来促进AML细胞的凋亡。

8、在融合蛋白PML-RARA和AML1-ETO加入泰尔登，检测不同时间节点融合蛋白的表达水平，实验结果显示泰尔登处理后在12小时，融合蛋白表达水平开始显著降低，表明泰尔登可以诱导融合蛋白PML-RARA 和 AML1-ETO的降解来激活与细胞死亡相关基因的表达。

9、选用Balb/c裸鼠构建NB4细胞株的皮下荷瘤模型，用泰尔登对肿瘤模型进行治疗，结果表明泰尔登可以抑制肿瘤的生长以及诱导原位白血病细胞凋亡和自噬。

上述实验说明，泰尔登通过诱导细胞凋亡和自噬过程，对不同亚型的AML细胞具有抗增殖的作用。

泰尔登诱导的NB4和KasuMi-1细胞自噬与凋亡的关系是协同的，自噬反应能够促进细胞凋亡。

泰尔登能够诱导融合蛋白PML-RARA和AML1-ETO的降解，激活下游靶基因的表达来诱导细胞死亡。

在小鼠成瘤模型中也发现泰尔登能够抑制肿瘤的生长且不影响小鼠的正常生理状态。

本发明的有益效果是：本发明首次发现了泰尔登在AML细胞中的应用，即通过诱导细胞凋亡和自噬过程，对不同亚型的AML细胞具有抗增殖的作用，小鼠成瘤实验验证了泰尔登能够抑制肿瘤的生长且不影响小鼠的正常生理状态，安全性好，泰尔登的新用途为AML的治疗提供了新的潜在方案。

附图说明

图1为PML-RARA、AML1-ETO和CBFb-MYH11共同调控的靶基因。

图2为ML-RARA、AML1-ETO和CBFb-MYH11共同富集到的转录因子。

图3为NB4细胞加入全反式维甲酸以后的差异基因表达；

图4为KasuMi-1细胞中靶基因的基因集富集分析：上边的是敲除AML1-ETO以后被富集得到表达上调的基因，下边是过表达AML1-ETO以后被富集得到表达下调的基因。

图5为在临床病人和正常人之间差异基因的表达聚类热图。

图6为融合蛋白共同调控靶基因的功能富集分析。

图7为药物筛选流程图。Set1为融合蛋白的共同靶基因，Set2为APL细胞ATRA应答基因。

图8为框架筛选的重要药物，行表示药物，列表示基因。

图9为细胞处理对照组(DMSO)或不同浓度的泰尔登(20-100μM) 6、12和24小时,CCK-8试剂盒检测的细胞增情况。

图10为流式细胞仪分析NB4和KasuMi-1细胞的核DNA含量。

图11为不同时间点的细胞周期相关基因在NB4和KasuMi-1细胞中的表达差异。

图12为NB4细胞和对照组细胞分别用40μM泰尔登或二甲基亚砜(DMSO) 培养24 h,流式细胞仪(FACS)检测粒细胞标记物CD11b的表达。

图13为不同时间点氯丙硫醇处理后表达差异基因。

图14为NB4和KasuMi-1被处理后，Set1基因与差异表达基因的重叠。

图15为 NB4和KasuMi-1被处理后，Set2与差异表达基因的重叠。

图16为 NB4和KasuMi-1细胞系差异表达基因的功能富集分析。

图17为以剂量和时间依赖的方式对经泰尔登处理的NB4和KasuMi -1细胞的caspase-3、-8、PARP、Bcl-xL、Bcl-2和Bax的Western blot分析。

图18为NB4和KasuMi -1细胞在不同浓度的泰尔登处理 24 h的结果。

图19为NB4和KasuMi-1细胞凋亡细胞形态。

图20为不同自噬相关基因在不同时间点的泰尔登处理NB4和KasuMi-1细胞的表达。

图21为NB4和KasuMi-1细胞超微结构特征。

图22为KasuMi-1细胞在泰尔登处理24 h后自噬小体个数。

图23为通过荧光显微镜观察MDC染色中代表自噬小体。

图24为免疫印迹分析Atg12,Beclin1和LC3-I / II 的表达水平。

图25为 NB4 和KasuMi-1细胞被处理24 h后, 自噬相关蛋白(Beclin1和LC3-I /II)和凋亡相关蛋白(caspase-3和PARP)免疫印迹检测。

图26为用CCK8试剂盒来检测细胞的活力。

图27为PML-RARA和AML1-ETO的蛋白表达量。

图28为用anti-PML 和 anti-RARA抗体进行ChIP-qPCR验证相关调变基因在NB4细胞系中的富集程度。

图29为用抗AML1-ETOD抗体对KasuMi-1细胞进行ChIP-qPCR分析。

图30为转录组分析融合蛋白PML-RARA和AML1-ETO的靶基因在NB4及KasuMi-1细胞系中的表达量的变化。

图31为泰尔登对NB4瘤裸鼠肿瘤的生长速度的影响。

图32为泰尔登处理以后肿瘤异种移植模型的体重变化。

图33为位细胞死亡检测试剂盒检测肿瘤的凋亡细胞。

图34为免疫组化检测肿瘤的自噬水平的变化。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识。各实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规实验条件或者制造厂商所建议的实验条件。

除非另有说明，本说明书中使用的全部专业术语和科学用语的含义均与本发明所属技术领域的技术人员一般理解的含义相同。但如有冲突，以包含定义的本说明书为准。

实验材料与实验材料来源如下：

细胞系包括人类急性早幼粒细胞白血病细胞株, 表达PML-RARA融合蛋白的NB4,人类急性早幼粒细胞白血病细胞株，表达AML1-ETO融合蛋白的KasuMi-1，人慢性髓系白血病细胞K562和人类髓系白血病单核细胞U937。细胞系均来自于上海交通大学附属瑞金医院血液学研究所。

实验药物泰尔登购买于Sigma-Aldrich 公司，使用前先用DMSO配制成100nM的储存液，避光保存，然后在按照1：10进行稀释使用。

实验所用ChIP-qPCR引物，如表1所示。

表1 ChIP-qPCR引物

pcDNA3.1-mRFP-GFP-LC3细胞自噬双荧光检测质粒载体购买于吉满生物科技有限公司，该载体带有Rat LC3自噬基因，mRFP红色荧光，GFP绿色荧光，CMV启动子，Kan抗性G418筛选标记。

实验所用抗体，如表2所示。

表2 抗体

抗体名称	购买公司
		Cleaved.caspase3（rabbit monoclonal antibody）	Abcam
Cleaved.caspase8（rabbit monoclonal antibody）	Abcam
		Cleaved. PARP（rabbit monoclonal antibody）	Abcam
Bcl-xL（rabbit monoclonal antibody）	Cell signaling technology
		Bcl-2（rabbit monoclonal antibody）	Cell signaling technology
Bax（rabbit monoclonal antibody）	Cell signaling technology
		ATG12（rabbit monoclonal antibody）	Cell signaling technology
BECLIN1（rabbit monoclonal antibody）	Cell signaling technology
		LC3（rabbit monoclonal antibody）	Cell signaling technology
PML-RARA（rabbit monoclonal antibody）	Abcam
		AML1-ETO（mouse monoclonal antibody）	Diagenode
IgG ( rabbit monoclonal antibody)	Abcam
		GAPDH（rabbit monoclonal antibody）	Sigma

实验中涉及的主要试剂、耗材和试剂盒，如表3所示。

表3 主要试剂、耗材和试剂盒

试剂、耗材和试剂盒名称	购买公司
		胎牛血清（FBS）	Gibco
RPMI-1640培养液	Gibco
		二甲基亚砜(DMSO)	Sigma-Aldrich
培养瓶和移液管等细胞培养耗材	Corning
		十二烷基磺酸钠（SDS）	国药集团化学试剂有限公司
Formaldehyde solution (37%)	Sigma-Aldrich
		0.65 ml Bioruptor® Microtubes	Diagenode
Glycine	国药集团化学试剂有限公司
		Tris-base	国药集团化学试剂有限公司
单丹磺酰尸胺（MDC）	碧云天
		Sigma water	Sigma
RNA Purification Kit	Qiagen
		DNA Marker DL2000	TaKaRa
SYBR Green Realtime PCR Master Mix	TOYOBO
		RNase-Free DNase set	Qiagen
ChIP-IT High Sensitivity	Active Motif
		β-巯基乙醇	国药集团化学试剂有限公司
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen
		细胞裂解液RIPA	碧云天公司
SuperScript™II Reverse Transcriptase	Invitrogen 公司
		QIAquick Gel Extraction kit	Qiagen 公司
AmmoniμM persμlfate（APS）	Sigma-Aldrich
		LiCl	国药集团化学试剂有限公司
DTT	Invitrogen
		Trypsin	国药集团化学试剂有限公司
无水乙醇	国药集团化学试剂有限公司
		氯化钠（Nacl）	国药集团化学试剂有限公司
氯化钾（KCL）	国药集团化学试剂有限公司
		乙酸钠(C2H3NaO2)	国药集团化学试剂有限公司
氯化镁（Mgcl2）	国药集团化学试剂有限公司
		氯仿（CHCl3）	国药集团化学试剂有限公司
甲醇（CH3OH）	国药集团化学试剂有限公司
		异丙醇（C3H8O）	国药集团化学试剂有限公司
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine， （TEMED）	Sigma-Aldrich
		RNase-free water	Sigma-Aldrich
限制性内切酶、T4 连接酶	New England Biolabs
		高保真酶Kod-Plus 酶	TOYOBO 公司
脂质体Lipofectamine 2000	Invitrogen 公司
		Protein Inhibitor Cocktail	Roche 公司
proteinase K	New England biolabs
		Polyvinylidene fluoride (PVDF)	Bio-Rad
pan-caspase inhibitor of caspases (z-VAD-fmk)	Sigma-Aldrich
		BafilomycinA1 (Baf-A1)	Sigma-Aldrich
PropidiμM iodide (PI) and Annexin V	BD Pharmingen™, USA
		CCK8 Kit	东仁化学科技（上海）科技有限公司
凋亡检测试剂盒	东仁化学科技（上海）科技有限公司
		细胞周期检测试剂盒	东仁化学科技（上海）科技有限公司
In Situ Cell Death Detection Kit	Roche, Germany
		BCA蛋白定量试剂盒	碧云天
chemilμMinescence kit	Millipore, Billerica, MA

实验用到的仪器设备，如表4所示。

表4 仪器设备

仪器设备名称	生产公司
		台式高速低温离心机	Eppendorf
湿度CO2细胞培养箱	Forma Scientific
		紫外分光光度计（NanoDropND-1000）	NanoDrop
37℃恒温摇床	ThermoForma
		Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies Inc
化学发光成像分析仪（LAS-4000 Western Blot）	General Electric Company
		凝胶成像系统和PCR 扩增仪	Bio Raid
细菌培养箱	日本三洋电子有限公司
		震荡震荡仪(Vortex)	Scientific Industries
移液枪	Eppendorf
		蛋白电泳仪	美国Bio Raid 公司
相差显微镜荧光显微镜	Nikon
		ABI Prism 7900HT detection system	Thermo Fisher Scientific
超净工作台	苏净集团安森公司
		transmission electron microscopy(TEM)	JEM-1200EXII, JEOL, Tokyo, Japan
fluorescence microscope	Olympus BX43, Tokyo, Japan
		flow cytometry	FACSCalibur, NJ, USA

实验试剂配制，如表5-表16所示。

表5 Lysis buffer配制 (4℃储存)配制

10 mM	Tris-HCl PH 7.5
		10 mM	NaCl
3 mM	MgCl2
		0.5%	IGEPAL

表6 10xPhosphate buffered saline, PBS配制

137 mM	NaCl
		2.7 mM	KCl
1.4 mM	KH2PO4
		4.3 mM	Na2HPO4·12H2O

表7 Pre-IP dilution buffer（ChIP assay）配制

1 mM	PMSF（现用现加）
		0.5%	NP40
3 mM	MgCl2
		1 mM	CaCl2
10 mM	NaCl
		10 mM	Tris-HCl (pH 7.5)

表8 IP dilution buffer (ChIP assay)配制

20 mM	Tris-HCl PH 8
		1%	Triton-X 100
2 mM	EDTA
		150 mM	NaCl

表9 ChIP wash buffer 1（4℃ 储存）配制

20 mM	Tris-HCl (pH 8.0)
		1 mM	NaCl
1%	Triton-X100
		2 mM	EDTA
1 mM	PMSF（现用现加）

表10 ChIP wash buffer 2 (4℃ 储存) 配制

500 mM	NaCl
		2 mM	EDTA
1 mM	PMSF（现用现加）
		0.1%	SDS
20 mM	Tris-HCl(pH 8.0)
		1%	Triton-X100

表11 ChIP wash buffer 3 (4℃ 储存) 配制

0.5%	SodiμM deoxycholate
		1 mM	EDTA
0.25M	LiCl
		0.5%	NP40
10 mM	Tris-HCl(pH 8.0)

表12 10x电泳蛋白上样缓冲液配制

50%	Glycerol
		0.5%	溴酚蓝
250 mM	Tris-HCl (pH 6.8)
		10%	SDS
12.5%	ß-巯基乙醇

表13 5x SDS-PAGE 转膜液(4℃储存) 配制

29g	Tris-base
		14.5g	Glycine
18.5ml	10%SDS
		200ml	甲醇（现用现加）

表14 5x TBE配制

27.5g	硼酸
		54g	Tris 碱
20ml	EDTA
		H2O	补足1L

表15 5x Tris/Glycine/SDS（1L）配制

50ml	10%SDS
		94g	Glycine
15.1g	Tris-base

表16 TE buffer（4℃ 储存）配制

1 mM	EDTA
		10 mM	Tris-HCl(pH 8.0)

实施例1，三种融合蛋白PML-RARA, AML1-ETO 和 CBFb-MYH11共同调控的靶基因在AML疾病中的作用

在公共数据库GEO上下载三套关于融合蛋白PML-RARA, AML1-ETO 和 CBFb-MYH11的ChIP-seq数据，三套数据分别是GSE18886, GSE23730 和 GSE46044。第一是对Raw reads进行质量分析和控制，去除低质量的reads以及各种污染片段，用到的软件是FastQC；第二是峰值的定位，对于不同的数据质量，选择相对合适的mapping方法，允许不同的mismatch数目以得到数据。基于这些定位到基因组上的序列和其丰度，找到有统计学意义的位点峰值，用到的软件是MACS 2.0版本来获取位点峰值，每个峰最近的RefSeq基因被鉴定为癌融合蛋白的靶基因， 对于获取的每个峰值用IGV软件来展示。

筛选潜在的药分为两步。第一步，首先在cMAP数据库中获取加了小分子药物处理不同细胞系后的差异基因表达图谱，通过公式A=(t-c)/0.5x(t+c)来鉴定差异表达的基因，其中公式中的t代表加药处理组的基因平均表达值，c代表对照组的基因平均表达值；对于每个基因来说可能会有多个探针，根据公式A取最大平均值。把基因差异倍数小于等于0.5的定义为表达下调的基因，把基因差异倍数大于2的定义为表达上调的基因。用累计超几何检测公式来计算富集得到了在cMAP数据库中调变的基因集中富集得到了三种融合蛋白的重叠靶基因。该公式为：

在上面的公式中，x表示cMAP数据库中常见目标基因与每个调控基因集之间重叠的基因数量, M代表cMAP数据库中总的基因数，N代表的是三种癌融合蛋白的共同靶基因数目，k是每种药物处理以后发生变化的的上调基因和下调基因的数量。P值小于等于0.05的被鉴定为候选的药物。

第二步，通过已经被治愈的APL理论模型的相关数据来进一步筛选第一步中所识别的潜在的药物，即选取与NB4细胞系加入全反式维甲酸药物处理以后有相似基因表达调控模式的药物。

一共鉴别出了594个三种融合蛋白PML-RARA, AML1-ETO 和 CBFb-MYH11共同调控的靶基因，如图1所示，结果显示在基因组上一些重要的转录因子被鉴定出来了，例如PU.1,RUNX1和CEBPα，这些转录因子都是在骨髓造血干细胞的分化过程中发挥了重要的作用，而且这三个转录因子都被三个融合蛋白所富集到，如图2所示，在NB4细胞系中加入全反式维甲酸药物处理以后，融合蛋白共同调控的靶基因有70%发生了表达差异，如图3所示，在KasuMi-1的细胞系中，通过基因敲除的手段降低融合蛋白AML1-ETO的表达，被调控的靶基因就会表达上调，再过表达融合蛋白AML1-ETO，被调控的靶基因就会表达下调，如图4所示。由此可以看出这些被调控的靶基因在AML的治疗过程中发挥着重要的作用。

发明人鉴别出的这594个靶基因中有15.5%的基因在临床病人中发生了差异表达，如图5所示，此结果也可以表明这些基因在AML疾病的发展中起了关键作用。对这些靶基因进行功能富集分析表明，白细胞活化、细胞死亡、凋亡和髓细胞分化等生物学调控过程均被显著富集到，如图6所示。这些研究结果表明, PML-RARA、AML1-ETO和CBFb-MYH11共同调控的目标基因在AML疾病发展和治疗过程中发挥了不可替代的作用。

实施例2，通过计算生物信息学的方法识别出泰尔登是治疗AML的潜在药物

首先把三个融合蛋白PML-RARA, AML1-ETO 和 CBFb-MYH11所调控的594个靶基因命名为基因集set1，把NB4细胞加入全反式维甲酸以后所引起的有调变的基因集命名为基因集set2，基因集set1和set2都被看作是潜在的治疗靶标。再统计每一种药物的潜在治疗靶点和差异基因集之间的重叠，以确定AML治疗有意义的药物。利用cMAP数据库挖掘对AML有影响的潜在药物,如图7所示，在cMAP数据库中加了药物处理以后所引起的有调变的基因集分别用T1、T2、T3……Tn表示。采用累积超几何试验富集分析的方法来筛选能够诱导Set1差异表达的重要药物。最后发明人筛选出的候选药物不仅能够靶向三种融合蛋白共同调变的靶基因而且与全反式维甲酸处理有调变反映的基因集也被鉴定出来了。

发明人一共筛选出了四大类药物能够靶向AML，这四大类分别是维甲酸、化疗药物、组蛋白去乙酰化抑制剂药物和靶向多巴胺受体的药物，如图8所示。结果表明，泰尔登作为一种多巴胺受体拮抗剂，同时也是一种典型的精神疾病镇静剂，对不同类型急性髓系白血病具有潜在的治疗作用。

实施例3，细胞活力检测、细胞形态学检测和上流式细胞仪检测细胞周期

选取了四种细胞系，分别是NB4, KasuMi-1, K562 和 U937，NB4、KasuMi-1、K562和U937都是悬浮的人类急性白血病细胞系，培养条件是在含10%的胎牛血清的RPMI-1640培养液中，细胞的生长密度维持在1x105 至 5x105 个/ml。为了防止细胞被污染，培养基中还要加入2 mM L-glutamine，100 U/ml penicillin和100 μg/ml streptomycin，在5％CO2饱和湿度条件下的孵箱内37℃进行常规培养。

采用cck8试剂盒来检测NB4, KasuMi-1, K562 和 U937在不同浓度梯度加药处理下的细胞活性。在96孔板中接种细胞悬液（100μl/孔），接种细胞数大约5x103个，将培养板放在37℃，5% CO2的培养箱中培养24小时。设置不同的药物浓度处理，泰尔登浓度梯度分别的是0，20, 40, 60, 80 和100μM，每个浓密设置三个复孔，并且孵育时间梯度是6h，12h和24h，如图9所示。向每个对照与处理组中都加入10μl的CCK8 溶液，在加入的过程中不能产生气泡，以免影响OD值的读取。将培养板放于培养箱中孵育3h。用酶标仪测定在波长450nm处的吸光度。如果暂时不测定OD值的话，可以向每孔中加入10μl 0.1M的HCL溶液或者1%W/VSDS溶液，在室温条件下避光保存，在24h内吸光度是不会发生变化的。如果待测物质具有氧化性或者还原性的话，可以在加入CCK8之前更换新鲜的培养基，并且用新鲜的培养基清洗细胞两次，尽可能的去掉药物的影响。

活力计算公式：

细胞活力*（%）=[A(加药)-A（空白）]/ [A(0加药)-A（空白）]x100

A(加药)：具有细胞, CCK8溶液和药物溶液的孔的吸光度。

A(空白)：具有培养基和CK8溶液而没有细胞的孔的吸光度。

A(0加药)：具有细胞, CCK8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度。

结果显示，在20μM的时候泰尔登对这四种细胞系的抑制程度几乎没什么影响，或者影响不大，随着用药浓度的逐渐增加，浓度越大对这四种细胞系的影响也就越大，在用药浓度达到40μM的时候，对这四种细胞系的抑制程度是最大的，以后再递增泰尔登浓度，随着药物处理时间的增长，泰尔登对这四种细胞系的抑制程度基本上没有再发生任何变化，同时在40μM的浓度下，随着药物作用时间的延长，细胞活力也在不断下降，由CCK8的实验结果我们可以得到泰尔登对不同的AML细胞系具有明显的抗增殖效果。

检测完细胞活性以后，再在细胞周期方面检测一下泰尔登对AML细胞系的影响。细胞培养：，选取对数生长期NB4和KasuMi-1的细胞，按1×106cells/ mL以2mL接种于6孔板内，进行20和40μM的泰尔登处理，孵育培养24h。细胞固定：800rpm离心5min，收集细胞沉淀，弃上清，用预冷PBS洗涤两次，加入预冷75%乙醇，于4℃固定4h以上。细胞染色：1500rpm离心5min，弃上清，以3mL的PBS洗涤一次，加入400μl溴化乙锭（PI，50ug/mL），100μl RNase A（100ug/mL ），4℃避光孵育30min。流式分析：以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2-3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析，结果如图10所示，随着泰尔登处理浓度的不断增加，细胞分裂主要是集中在G0/G1期，S期的逐渐减少，由此实验结果我们可以看出来AML细胞系在经过泰尔登处理以后，泰尔登可以阻滞细胞周期的进行，使细胞周期停留在G0/G1期而不是继续往下分裂，从而影响细胞的有丝分裂进而抑制AML细胞的增殖。

之后对NB4和KasuMi-1两种细胞系进行RNA提取和转录组测序数据进行挖掘，首先进行RNA提取，取新鲜培养且生长状态良好的NB4和KasuMi-1悬浮细胞，细胞数大约为1x107个，对照组不做任何处理，实验组要加入40μM的泰尔登，处理时间分别是0h，6h，12h和24h，在每个不同的时间点收集细胞于15ml离心管中，然后将留有细胞悬液的离心管放置于冰盒里。实验开始之前先把离心机打开预冷到4度，然后将上述装有悬浮细胞的离心管放于离心机中，2000rpm，离心5min，丢弃上清，留下细胞沉淀。尽快用1ml预冷的PBS，轻轻重悬细胞沉淀并充分吹打，以使细胞沉淀均匀，并将细胞洗净，并将细胞悬液转移至1.5ml的离心管中再次离心，2000rpm, 离心5min，之后在用移液枪洗掉上清。向上述沉淀加入350μl预冷的的buffer RLT，快速的用移液枪吹打混匀，期间会看到粘稠的液体，直至细胞沉淀被充分裂解均匀，继续进行下一步提取步骤。加入一倍体积350μl的75%的乙醇至上述裂解液中，不要离心，还是用移液枪充分吹打均匀，至乙醇与裂解液充分混匀。转移出700μl的混合液于Rneasy收集柱中，小心盖上盖子，大于10000rpm，离心30s，倒掉收集管中的废液。向柱子中加入500μl buffer RW1, 小心盖上盖子，大于10000rpm，离心30s，倒掉收集管中的废液。向柱子中加入500μl buffer RPE, 小心盖上盖子，大于10000rpm，离心30s，倒掉收集管中的废液。重复向柱子中加入500μl buffer RPE, 小心盖上盖子，大于10000rpm，离心30s，倒掉收集管中的废液一次。将柱子放于一个新的2ml离心管中，10000rpm，2min离心，离掉残留的液体。将柱子重新放入一个新的1.5ml的离心管中，加入40μl RNase-free 的水，10000rpm，离心1min，洗脱RNA，之后用Qubit测定RNA浓度，记录好浓度之后， -80℃冰箱保存。其次是RNA文库的构建，采用的试剂盒是IllμMinaTruseq TM RNA sample prep Kit，根据试剂盒中的建库操作步骤完成RNA的文库构建，建完库以后上机测序，采用的测序平台是HiSeq2500，并且是两端同时测序，读长是150bp。进行数据处理，对于转录组数据的处理流程：序列比对-转录组拼接-表达定量-差异基因分析，发明人按照这个流程最终获得了NB4和KasuMi-1细胞系在加药处理以后与对照组相比较在不同时间节点的差异表达基因集。在序列比对的时候用的软件是hisat2，转录组的拼接用的软件是StringTie，转录组基因表达量的值用的是FPKM, 凡是FPKM的值小于2的基因都被删除掉，只有1.5倍调变的基因（q-value<0.05）被认作是表达差异的基因, 然后根据差异基因的表达值来构建热图，如图11所示。以上的实验结果可以表明，泰尔登可以诱导AML细胞系的细胞阻滞来抑制其细胞的生长。

接着进行细胞分化检测，取对数生长期的NB4细胞，按1×106cells/ mL以2mL接种于6孔板内，进行40μM的泰尔登处理，24h孵育培养后，收集细胞于离心管中，1000rpm，离心5min，吸掉培养基，用PBS清洗细胞沉淀三次，再用100μl PBS重悬细胞沉淀，加入10μl PE标记的小鼠抗人的CD11b抗体，4℃下避光孵育30min，之后在用PBS清洗一次，再加入400μlPBS重悬沉淀，上流式细胞仪检测CD11b阳性率，结果如图12所示，NB4细胞在加药处理24h以后，细胞的分化比例明显升高，总分化细胞的百分比显著增加50.1%，治疗组与空白对照组相比增加8.2%, 由此可以表明泰尔登是可以促进AML细胞的分化。

实施例4，高通量转录组测序方法检测由泰尔登介导的AML不同细胞系转录水平的变化

本实施例中的RNA提取、转录组高通量测序和数据分析方法与实施例3中的一致。测序完成以后，与对照组进行比较，实验组的差异基因表达发生了变化，如图13所示,发明人在NB4和KasuMi-1两个细胞系中一共获得的差异基因分别是4651和5938。在NB4细胞系中，有2322个表达上调的基因，2329个表达下调的基因，在KasuMi-1细胞系中，有2883上调的基因，3055个下调的基因。有212个和241个重叠基因被鉴定出来（set1与NB4和KasuMi-1），如图14所示，有1444个和1307个重叠基因被鉴定出来（set2 与NB4和KasuMi-1），如图15所示。这些数据证明了我们筛药方法的可行性和有效性，接着进行功能富集分析，如图16所示，调控基因在凋亡过程(p值:1.66E-10)、细胞周期G1/S相变(p值:5.61E-05)、自噬过程(p值:0.001)、白细胞活化(p值:4.48E-05)和分化(p值:4.78E-04)的调控上显著富集，以上的这些结果表明泰尔登可靶向AML的多个关键生物学过程。

实施例5，泰尔登诱导AML细胞系发生凋亡反应来促进细胞死亡

首先选取与线粒体凋亡相关的分子标记caspase-3, caspase-8和PARP作为研究对象，观察NB4和KasuMi-1细胞系在加入泰尔登处理以后在不同的时间梯度与不用的药物浓度作用下，蛋白激酶相关的分子标记的表达情况。如图17所示，蛋白印记结果显示随着药物浓度的不断增加和时间长度的延伸，caspase-3, caspase-8和PARP的表达量持续增加。这些数据表明，泰尔登通过固有的线粒体途径来诱导AML细胞凋亡，并依赖于caspase的激活。

Bcl-2家族相关基因和caspase基因的表达在调控细胞凋亡过程中发挥着重要作用，包括抗凋亡基因(Bcl-2, Bcl-xL)和促凋亡基因(Bax)，它们是调控细胞存活和死亡的通路的关键基因。为了研究泰尔登是否通过Bcl-2家族成员来破坏线粒体膜的通透性，检测Bcl-2、Bcl-xL以及Bax在NB4和KasuMi-1细胞中的表达。结果表明，抗凋亡基因Bcl-2和Bcl-xL蛋白表达量无论是随着药物剂量的升高还是在单一药物浓度下随着加药时间的不断延长，它们的蛋白表达量水平都是持续降低的，同时促凋亡基因Bax的表达量无论是随着药物剂量的升高还是在单一药物浓度下随着加药时间的不断延长，它们的蛋白表达量水平都是持续显著的表达上调，如图17所示。接着用Annexin-V 和PI双染的方式由流式细胞仪上机检测，96板培养细胞，待细胞生长达到60%-70%，吸出旧培养基，根据实验需求处理，继续培养。根据实验设计，处理组分别用20和40μM的泰尔登处理24h，之后收集到离心管中，离心收集细胞沉淀，接着再用PBS轻轻重悬细胞并计数。取5-10万重悬的细胞，200g离心5 min，弃上清，加入195μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。加入5 μl Annexin V-FITC，轻轻混匀。室温20-25℃，避光孵育10 min，使用铝箔进行避光。200g离心5 min，弃上清，加入190μl Annexin V-FITC结合液重悬细胞。加入10 μl碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置。进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。

NB4和KasuMi-1细胞系在加入泰尔登，泰尔登浓度分别为 0μM，20μM和 40μM， 处理24h后观察结果，正如图18所示，加入泰尔登处理以后，与对照组相比较，位于早期和晚期的细胞亚群的比例显著升高。形态学上用wright’s染色检测凋亡细胞的变化，首先是细胞涂片的制备。收集对照组和加药处理组的细胞离心5min，之后再用PBS洗3遍，去除血清的影响，洗好后离心，吸弃上清，最后离心管内总共剩含细胞液体500μl左右，枪打匀，用枪转移适量至多聚赖氨酸处理好的载玻片上，用枪头平着推开液滴，铺平。自然风干，可以用手来回晃动，加快蒸发，建议时间稍长，15～20min左右。将细胞涂片至于染色架上，滴加适量的Wright stain试剂，覆盖住盖玻片，室温染色10分钟。细胞涂片在滴加适量磷酸盐缓冲液，轻轻的晃动盖玻片使磷酸盐缓冲液与Wright stain试剂充分混合，室温静置10分钟。用自来水或者蒸馏水从盖玻片的一段进行冲洗，也可以用磷酸盐缓冲液进行冲洗，时间大约30s。干燥镜检，先用低倍镜观察，之后再用油镜。如图19所示，经过泰尔登处理后，白血病细胞呈现典型的凋亡特征，包括细胞膜断裂、核碎裂、染色质凝集，有的细胞随着加药时间的延长，整个细胞结构完全破环，成为一个个细胞碎片，这个结果从细胞形态学上可以证明该药能够诱导AML细胞形态发生改变最终导致细胞死亡。

实施例6，泰尔登诱导NB4和KasuMi-1细胞系的细胞自噬反应

对NB4和KasuMi-1的转录组数据进行数据分析，分析结果发现许多与自噬相关的基因在加入泰尔登处理以后发生了明显的调变，例如SQSTM1, ATG14, GABARAPL1, WIPI1,VMP1，如图20所示，这些基因在细胞自噬的调节过程中发挥重要作用。

采用三种不同的实验方法来验证NB4和KasuMi-1细胞系的细胞内自噬小体的形成。

第一种是用透射电子显微镜来观察自噬小体，将 NB4和KasuMi-1的细胞系用40μM的泰尔登处理24h，将悬浮细胞收集到离心管中，短暂的离心尽量除去培养基。在离心获得的细胞沉淀中加入2-5μl的生物胶，室温放置2-3min，或者用针灸银针轻轻地搅拌几下，使其混合均匀。沿着试管壁缓缓的加入固定液。

细胞固定完以后，在经过脱水、包埋、固化和切片最后用透射电镜观察拍照。与未加入泰尔登处理的对照组相比较，有大量的自噬小体存在于细胞的细胞质部位，如图21所示。

第二种是自噬双标腺病毒免疫荧光实验，将病毒从负八十冰箱取出，在冰上融化，使用PBS或者培养基来稀释病毒达到自己需要的浓度，然后分装保存，避免多次冻融影响转染效果，将生长状态良好的目的细胞接种到24孔板上，使细胞的浓度在1x105/ml左右，总之接种的原则就是第二天病毒感染之前细胞的融合度能够达到80%左右，对于悬浮细胞KasuMi-1细胞的感染主要是通过平角离心的方法进行转染，将病毒加入到培养皿中，用封口膜封好，放到水平离心机中低速离心1h，然后取出放到培养箱中正常培养，感染24h以后，可以观察GFP以及RFP的荧光表达情况，36-48h可以进行细胞固定、封片和拍照观察转染的效果，mRFP-GFP-LC3是串联荧光蛋白腺病毒表达GFP和mRFP, 根据GFP和mRFP来追踪标记LC3，绿色荧光GFP的减弱表明溶酶体和自噬小体的融合从而形成自噬溶酶体。在显微镜下绿色荧光GFP和红色荧光mRFP通过merge以后，可以显示黄光，黄色的斑点就是自噬体，红色的斑点是自噬溶酶体，通过观察计数不同的斑点数可以清析的了解自噬流的强弱情况，如图22所示，此结果表明泰尔登可以诱导AML细胞发生自噬反应。

第三种是单丹磺酰尸胺（monodansylcadaverine，MDC）染色，用去离子水稀释10x的wash buffer 到1x，800g离心5min，收集细胞，用500μl 1x wash buffer 清洗细胞一次，丢弃上清。在重心加入500μl 1x wash buffer 重悬细胞沉淀，并调节细胞浓度至1x105/ml。吸取90μl的细胞悬液于新的EP管中，加入10μl的 MDC Stain，轻轻混匀。室温避光染色15-45min。800g离心5min，收集细胞，用500μl 1x wash buffer 清洗细胞2次，丢弃上清。加入100μl的 collection buffer 重悬细胞，逐滴加入到在玻片上，在盖上盖玻片，荧光显微镜下面观察拍照，如图23所示。

此外还进行了免疫印迹实验，以剂量和时间依赖的方式检测ATG12、Beclin1和LC3的水平。结果表明，泰尔登可以上调ATG12、Beclin1和LC3的水平，如图24所示，这些发现表明泰尔登是急性髓系白血病细胞自噬的一个强诱导剂，在时间梯度和浓度梯度上都能反映出自噬反应的存在。

实施例7，泰尔登通过诱导细胞自噬过程来促进AML细胞的凋亡

在用40μM泰尔登处理24h的NB4和KasuMi-1的细胞系中加入自噬抑制剂Baf-A1。蛋白印迹实验结果表明，Baf-A1可显著降低细胞自噬标志物beclin1和LC3水平，相应的，Baf-A1处理也降低了细胞凋亡标志物caspase3和PARP的表达，如图25所示。用CCK-8法检测细胞活力，使用自噬抑制剂Baf-A1对NB4和KasuMi-1细胞进行处理以后，用泰尔登预处理后细胞存活率显著提高如图26所示。这些结果表明，抑制自噬明显降低了泰尔登对AML细胞的生长抑制，提高了AML的细胞活性，由此可以得出泰尔登诱导的自噬可促进AML细胞凋亡，自噬与凋亡在AML细胞死亡的过程中起到一个相互协同的作用，共同促进AML细胞的死亡。

实施例8，泰尔登诱导融合蛋白PML-RARA 和 AML1-ETO的降解来激活与细胞死亡相关基因的表达

检测融合蛋白PML-RARA 和AML1-ETO在加入40μM浓度泰尔登处理后不同的时间节点融合蛋白的表达水平。实验结果显示在泰尔登处理12小时以后，它们的蛋白表达水平就开始显著降低，此后随时间的延长，在24和48h的时候实验结果展示表明泰尔登能够明显诱导PML-RARA 和AML1-ETO 蛋白表达量的减少，如图27所示。

选取9个PML-RARA 和AML1-ETO共同调变的靶基因进行染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP），9个靶基因分别为CCDC88B、FTH1、HCST、KLF6、SH3BGRL3、LMNA、LGALS1、MALAT1、MAFG，引物序列如表1所示。根据免疫沉淀（immμMoprecipitation，IP）反应的效率和组数收集大约1×107个NB4和KasuMi-1细胞。向新鲜收集的细胞加入终浓度 1%的甲醛，室温摇床上摇匀固定8-10min。加入 1/20 体积的甘氨酸终止固定反应，室温摇床孵育 5min，终止固定。将细胞用细胞刮刀刮下，转移到置于冰上的50ml离心管中，5000rpm，10min离心，弃上清。用预冷的 1*PBS 重悬细胞，4000rpm，5分钟，4℃离心，洗两次。弃上清，沉淀加入预先配置好的含蛋白酶抑制剂 PMSF 和 Cocktail的细胞裂解液，充分混匀细胞，置于冰上裂解10min， 500g，5min，4℃离心。重复上述步骤两次。细胞裂解3 次后用含 PMSF的 pre-IP dilution buffer 重悬沉淀，使每组样本的终体积为1.5ml。加入以下试剂：40μl的100mM PMSF，100μl的20%SDS，460μl的Pre-IP Dilutionbuffer ，100μl的25*Protease inhibitor stock ，80μl的5M NaCL，220μl的 Nuclease-free Water，总共得到 2.5ml 的沉淀混合物，用于超声反应。使用 Bioruptor 非接触式超声仪进行超声，每次7个循环，每个循环30s开，30s关，总共超声20个循环，使最终得到的DNA片段在 200-800bp之间。12000rpm，10min，4℃离心，取上清。将上清转移至新的1.5ml的EP管，取10μl上清用于解交链，纯化解交联产物用于检测超声效率，其余上清用于免疫沉淀反应，也可保存在-80℃。若 DNA 储存于-80℃，则置于冰上缓慢解冻用于后续免疫沉淀反应。将上清转移到一个15ml 的离心管，加入 5 倍体积的含蛋白酶抑制剂PMSF 和 Cocktail的IP dilution buffer。取大约10μl体积的 beads 用 IP dilution buffer 洗一次，清洗条件为2000rpm，5min，4℃。将预洗过的 beads 加入到 IP 样本中。4℃冰箱，摇床转30min。2000rpm，5min，4℃离心后，将上清转移到新的 1.5ml EP管。取10μl上清用做input，于4℃保存，剩余染色质用于免疫沉淀反应，加入适量的抗体（一般为5μl），阴性对照组加入IgG抗体。加入目的抗体 4℃孵育过夜。第二天，同样用 IP dilution buffer 预洗beads，2000rpm ，5min， 4℃。将预洗过的 beads 加入到每个IP 体系中， 4℃，摇床旋转孵育3h。离心 2000rpm 5min 4℃，轻轻弃上清。用 wash buffer 1 轻轻重悬沉淀的 beads，随后转移至spin-X colμMn 中。4℃摇床孵育5min，2000rpm 2min 4℃离心，弃上清。重复用wash buffer 1 轻轻重悬沉淀的 beads，随后转移至 spin-X colμMn 中。4℃摇床孵育5min，2000rpm，2min 4℃离心，弃上清这两个步骤两次。用 wash buffer 2 轻轻重悬beads，按照上述方法洗两次。用 wash buffer 3 轻轻重悬 beads，按照上述方法洗两次。用TE buffer洗beads三次。把spin-X colμMn 转移至新的管内，加入适量体积的 Elutionbuffer。65℃孵育 30min。3000rpm，室温离心2min。再次加入 Elution buffer 重复65℃孵育 30min。3000rpm，室温离心2min，得到 IP 样本。向上述得到的 IP 样本和input中分别加入蛋白酶K。65℃解交联，过夜。使用PCR纯化试剂盒进行 DNA 纯化，得到的样本用于全基因组测序或 Q-PCR 实验。对被抗体富集以后的DNA进行q-PCR验证，通过ChIP-qPCR检测实验结果显示，泰尔登处理后，在相关基因的转录起始位点TSS区域，CCDC88B、FTH1、HCST、KLF6、SH3BGRL3、LMNA、LGALS1、MALAT1、MAFG基因的富集显著降低，如图28和图29所示。

对KasuMi-1的转录组测序数据进行分析, 融合蛋白调变的这些靶基因的表达量显著升高, 实验结果证明了当致癌融合蛋白的作用被药物抑制掉或者被直接降解掉以后，能解除这些融合蛋白对下游靶基因的调控作用，从而使靶基因的表达量改变。对于AML细胞系来说，加入了泰尔登药物处理白血病细胞系可以明显抑制融合蛋白PML-RARA 和AML1-ETO 对下游靶基因的调控作用，如图30所示。以上这些结果表明，泰尔登可诱导降低融合蛋白水平，从而提高凋亡相关基因的表达，最终导致AML细胞死亡。

实施例9，小鼠皮下成瘤实验

订购4周龄SPF级BALB/c裸鼠12只，雌雄各半，适应喂养1周后，开始实验。将状态良好的NB4细胞，用PBS重悬，制成单细胞悬液，调整密度为5x107/ml，将肿瘤细胞接种至小鼠右侧腋下，接种量为5x107/只。接种完成后将小鼠返回IVC系统继续饲养观察。在接种后约10-15天肿瘤体积长至100mm3左右，将模型小鼠随机分为2组，对照组和实验组，每组6只，雌雄各半。实验组：腹腔注射泰尔登，给药剂量为15mg/kg。对照组：腹腔注射生理盐水，给药体积与实验组同。各组给药频率为2次/周，共5周。在药物干预过程中，每5天测量一次小鼠肿瘤体积，小鼠体重及小鼠状态。给药结束后一周，颈椎脱臼处死小鼠，剥离肿瘤并拍照称重，将肿瘤组织一分为二，一部分福尔马林固定，一部分液氮冷冻保存。如图31所示，与未治疗组相比，泰尔登处理过的肿瘤大小明显减小。未治疗组和治疗组的体重无明显差异，由此也可以说明该剂量的药物对动物的正常生长和体内的新陈代谢是没有影响的，如图32所示，这些数据表明，泰尔登在体内具有抗肿瘤作用，且无明显毒性。将剥离下来肿瘤制成石蜡切片，通过TUNEL检测试剂盒分析评估了肿瘤细胞的凋亡情况，步骤如下：室温平衡150ml 4%的多聚甲醛和1xPBS, 把做好的切片放置其中20min。用1xPBS冲洗切片两次。1x PBS，30分钟，室温。开始在冰上冷却。0.1％Triton / 0.1％柠檬酸钠，2分钟，4℃。所有载玻片：PBS冲洗2次。对照载玻片：在100μl，200μg/ ml 的DNase I溶液中，10分钟，室温. 1x PBS冲洗，在单独的容器中漂洗2次，然后与其他载玻片组合。擦拭组织，从管2中取出100μl，用于2个阴性对照，每个50μl。加入管1的总体积50μl，加管2的剩余物450μl。将100μl TUNEL反应混合物或100μl对照标记溶液用于阴性对照应用于每个载玻片。在室中孵育60分钟，37°C。PBS洗涤3次。擦拭组织。使用100μl抗FITC-AP conj。在室中孵育30min，37°C。PBS洗涤3次。100mMTris缓冲液，pH 8.2, 5分钟，室温。加入50-100μl底物溶液，每滴载5-6滴Vector Blue或Vector Red底物。混合：5ml 100mM Tris，pH 8.2 和1滴左旋咪唑2滴每种溶液1,2和3中的任一种载体底物在没有光的情况下孵育，室温。矢量蓝色 - 10分钟，矢量红 - 20分钟。dH2O，1次，停止颜色反应。结果表明，与对照组相比较，在泰尔登处理的小鼠体内能够观察到明显增加的凋亡细胞，如图33所示，LC3的免疫组化结果也表明实验处理组与对照组相比较，自噬水平显著上调，如图34所示。通过裸鼠成瘤的体内试验证明，泰尔登不仅在体外影响AML不同亚型的细胞系的生长，同时在体内实验证实了该药物都是通过诱导白血病细胞凋亡和自噬途径来导致细胞的最终死亡。

Claims (4)

1.多巴胺受体拮抗剂泰尔登在制备治疗M3亚型急性髓系白血病药物中的应用，其特征在于，泰尔登通过诱导细胞凋亡和自噬过程，对M3亚型的AML细胞具有抗增殖的作用。

2.根据权利要求1所述的多巴胺受体拮抗剂泰尔登在制备治疗M3亚型急性髓系白血病药物中的应用，其特征在于：所述药物为与NB4细胞系加入全反式维甲酸药物处理以后有相似基因表达调控模式的药物。

3.根据权利要求1所述的多巴胺受体拮抗剂泰尔登在制备治疗M3亚型急性髓系白血病药物中的应用，其特征在于：泰尔登诱导的NB4和KasuMi-1细胞自噬与凋亡的关系是协同的，自噬反应能够促进细胞凋亡。

4.根据权利要求1所述的多巴胺受体拮抗剂泰尔登在制备治疗M3亚型急性髓系白血病药物中的应用，其特征在于：泰尔登能够诱导融合蛋白PML-RARA和AML1-ETO的降解，激活下游靶基因的表达来诱导M3亚型AML细胞死亡。

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