TW201446798A - 抗ｅｇｆｌ７抗體、包含其之組合物、編碼其之多核苷酸及其製造及使用方法 - Google Patents

抗ｅｇｆｌ７抗體、包含其之組合物、編碼其之多核苷酸及其製造及使用方法 Download PDF

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Abstract

本發明提供抗EGFL7抗體及包含此等抗體之組合物及使用此等抗體之方法。

Description

抗EGFL7抗體、包含其之組合物、編碼其之多核苷酸及其製造及使用方法
本發明大體係關於用於調節血管發育之組合物及方法。特定言之，本發明係關於與表皮生長因子樣結構域7(EGFL7)多肽結合之抗體。本發明另外係關於與血管生成相關之病況及疾病的診斷及治療。
血管聯結之發育為許多生理及病理過程之基本需要。諸如胚胎及腫瘤之活躍生長組織需要適當之血液供應。它們藉由產生促進新血管經由稱為血管生成之過程形成的促血管生成因子來滿足此需求。血管形成是一個複雜但有序之生物事件，其涉及全部或多個以下步驟：a)內皮細胞(EC)由現存EC增殖或由祖細胞分化；b)EC遷移並聚結形成束狀結構；c)接著血管束經歷管生成(tubulogenesis)形成具有中央腔之血管；d)現存管束或血管伸出新的分枝形成二級血管；e)原始血管叢經歷進一步重塑及再成形；及f)募集外內皮細胞嵌入內皮管中，從而向血管提供維持及調節功能；此等細胞包括小毛細管之周細胞、較大血管之平滑肌細胞及心臟中之心肌細胞。Hanahan,Science 277：48-50(1997)；Hogan及Kolodziej,Nat.Rev.Genet.3：513-23(2002)；Lubarsky及Krasnow,Cell 112：19-28(2003)。
現已充分確定多種病症之發病機理均涉及血管生成。此等病症包括實體腫瘤及轉移瘤；動脈粥樣硬化；晶狀體後纖維組織增生；血管瘤；慢性炎症；眼內新生血管疾病，諸如增生性視網膜病變(例如糖尿病性視網膜病變)、年齡相關之黃斑變性(AMD)、新生血管性青光眼；移植角膜組織及其他組織之免疫排斥反應；類風濕性關節炎；及牛皮癬。Folkman等人，J.Biol.Chem.267：10931-34(1992)；Klagsbrun等人，Annu.Rev.Physiol.53：217-39(1991)及Garner A.,Pathobiology of Ocular Disease中之"Vascular diseases"。A Dynamic Approach,Garner A.,Klintworth GK編輯，第2版(Marcel Dekker,NY,1994)，第1625-1710頁。
在腫瘤生長之情況下，血管生成似乎對於增生轉變成瘤形成及向腫瘤生長及轉移提供營養至關重要。Folkman等人，Nature 339：58(1989)。新血管生成允許腫瘤細胞相比正常細胞獲取生長優勢及增殖自主性。腫瘤通常以單一異常細胞起始，該異常細胞可因與可用毛細血管床之距離而僅增生至幾立方毫米之尺寸，且腫瘤可在一段較長時間段內保持"休眠"而不進一步生長及散佈。接著某些腫瘤細胞轉換成血管生成表型而活化內皮細胞，其增殖並成熟成為新毛細血管。此等新形成之血管不僅允許初生腫瘤持續生長，且亦允許轉移腫瘤細胞散佈及再移生。相應地，在乳癌以及數種其他腫瘤中已觀察到腫瘤切片中之微血管密度與患者存活率之間的相關性。Weidner等人，N.Engl.J.Med.324：1-6(1991)；Horak等人，Lancet 340：1120-24(1992)；Macchiarini等人，Lancet 340：145-46(1992)。控制血管生成轉換之確切機制尚未完全瞭解，但據信腫瘤塊之新血管生成係由大量血管生成刺激劑與抑制劑之淨差引起(Folkman,Nat.Med.1(1)：27-31(1995))。
血管發育之過程受到嚴格調控。截至目前，已顯示大量分子(主要是由周圍細胞產生之分泌因子)調控EC之分化、增殖、遷移及聚結 成為束狀結構。舉例而言，已鑑別血管內皮生長因子(VEGF)為刺激血管生成及誘導血管滲透性所涉及之關鍵因子。Ferrara等人，Endocr.Rev.18：4-25(1997)。有關甚至單一VEGF等位基因缺失亦導致胚胎死亡之發現指出此因子在血管系統發育及分化中所起到的不可替代之作用。此外，已顯示VEGF係與腫瘤及眼內病症相關之新血管生成之關鍵介體。Ferrara等人，Endocr.Rev.同上文。所檢查之大部分人類腫瘤均過度表現VEGF mRNA。Berkman等人，J.Clin.Invest.91：153-59(1993)；Brown等人，Human Pathol.26：86-91(1995)；Brown等人，Cancer Res.53：4727-35(1993)；Mattern等人，Brit.J.Cancer 73：931-34(1996)；Dvorak等人，Am.J.Pathol.146：1029-39(1995)。
另外，眼液中之VEGF濃度值與患有糖尿病及其他局部缺血相關視網膜病變之患者體內存在血管活躍增生高度相關。Aiello等人，N.Engl.J.Med.331：1480-87(1994)。此外，研究已證實VEGF定位於身受AMD之患者之脈絡膜新生血管膜中。Lopez等人，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.37：855-68(1996)。
抗VEGF中和抗體抑制多種人類腫瘤細胞株於裸小鼠體內之生長(Kim等人，Nature 362：841-44(1993)；Warren等人，J.Clin.Invest.95：1789-97(1995)；Borgström等人，Cancer Res.56：4032-39(1996)；Melnyk等人，Cancer Res.56：921-24(1996))，且亦抑制局部缺血視網膜病症模型中之眼內血管生成(Adamis等人，Arch.Ophthalmol.114：66-71(1996))。因此，抗VEGF單株抗體或VEGF作用之其他抑制劑係治療腫瘤及各種眼內新生血管病症之值得期望之候選物。此等抗體描述於(例如)1998年1月14日公開之EP 817,648及1998年10月15日公開之WO 98/45331及WO 98/45332中。一種抗VEGF抗體貝伐單抗(bevacizumab)已由FDA批准與化學治療方案組合用於治療轉移結腸直腸癌(CRC)。在許多正在進行之臨床試驗中亦在研究用於治療各種癌 症指征之貝伐單抗。
已知細胞外基質(ECM)在血管生成過程中起到重要作用。Madri,Transpl.Immunol.5：179-83(1997)。EC在其遷移期間由臨時ECM包圍，且在形成內腔後黏附至新合成之血管基底膜。除在毛細血管形態形成過程中提供支架外，已亦顯示ECM對EC之功能起到複雜之局部控制作用。舉例而言，ECM能夠調控可溶血管生成介體對於EC之可用性且規定與整合素及細胞黏附分子相互作用之性質及類型。亦已表明EC之存活受生長因子受體與整合素間之協作調控，其又受局部ECM之組成控制。Stupack及Cheresh,Oncogene 22：9022-29(2003)。
儘管血管生成領域已取得許多進展，但血管形成過程中之某些步驟仍有待清晰瞭解。特定言之，有關管形成如何調控--血管束如何進展成為管及何種因子調控此轉變知之甚少。鑒於血管生成在許多疾病及病症中之作用，需要一種降低或抑制一或多種引起此等過程之生物作用的方法。亦需要一種檢定正常及疾病條件且尤其是癌症中致病多肽之存在的方法。亦存在對於可增強現存抗血管生成治療之功效之組合物及方法的需求。
本發明部分上係基於鑑別具有指示其特別有益於治療之特性的抗EGFL7抗體。
在一態樣中，本發明提供由融合瘤抗EGFL7 mumab 4F11.1.8、抗EGFL7 mumab 10G9.1.6及抗EGFL7 mumab 18F7.1.8產生之抗體。
在一態樣中，本發明提供一種抗EGFL7抗體，其包含一或多個選自由以下序列組成之群之互補判定區(CDR)：(a)4F11 CDR-L1序列KASQSVDYDGDSYMS(SEQ ID NO：5)；(b)4F11 CDR-L2序列GASNLES(SEQ ID NO：6)；(c)4F11 CDR-L3序列QQNNEDPYT(SEQ ID NO：7)；(d)4F11 CDR-H1序列TYGMS(SEQ ID NO：8)；(e)4F11 CDR-H2序列WINTHSGVPTYADDFKG(SEQ ID NO：9)；及(f)4F11 CDR-H3序列LGSSA(SEQ ID NO：10)。在一些實施例中，該抗體之輕鏈包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下序列之CDR序列：KASQSVDYDGDSYMS(SEQ ID NO：5)、GASNLES(SEQ ID NO：6)及QQNNEDPYT(SEQ ID NO：7)。在一些實施例中，該抗體之重鏈包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下序列之CDR序列：TYGMS(SEQ ID NO：8)、WINTHSGVPTYADDFKG(SEQ ID NO：9)及LGSSA(SEQ ID NO：10)。在一些實施例中，該抗體之輕鏈包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下序列之CDR序列：KASQSVDYDGDSYMS(SEQ ID NO：5)、GASNLES(SEQ ID NO：6)及QQNNEDPYT(SEQ ID NO：7)；且該抗體之重鏈包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下序列之CDR序列：TYGMS(SEQ ID NO：8)、WINTHSGVPTYADDFKG(SEQ ID NO：9)及LGSSA(SEQ ID NO：10)。在一些實施例中，該抗體之輕鏈包含以下序列：DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMSWYQQKPGQPPKLLIYGASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQNNEDPYTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO：1)。在一些實施例中，該抗體之重鏈包含以下序列：QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGHTFTTYGMSWVKQAPGKGLKWMGWINTHSGVPTYADDFKGRFAFSLETSASTAHLQINNLKNEDTATYFCARLGSSAVDYWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO：2)。
在一態樣中，本發明提供一種抗EGFL7抗體，其包含一或多個選自由以下序列組成之群之互補判定區(CDR)：(a)10G9 CDR-L1序列RSSQSLVHTNGITYLH(SEQ ID NO：11)；(b)10G9 CDR-L2序列KVSNRFS(SEQ ID NO：12)；(c)10G9 CDR-L3序列SQSTHVPLT(SEQ ID NO：13)：(d)10G9 CDR-H1序列DYYMNSDYYMN(SEQ ID NO：14)；(e)10G9 CDR-H2序列DINPKNGGTTYNQKFKG(SEQ ID NO：15)；及(f)10G9 CDR-H3序列(SEQ ID NO：16)。在一些實施例中，該抗體之輕鏈包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下序列之CDR序列：RSSQSLVHTNGITYLH(SEQ ID NO：11)、KVSNRFS(SEQ ID NO：12)及SQSTHVPLT(SEQ ID NO：13)。在一些實施例中，該抗體之重鏈包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下序列之CDR序列：DYYMNSDYYMN(SEQ ID NO：14)、DINPKNGGTTYNQKFKG(SEQ ID NO：15)及ALGVFDY(SEQ ID NO：16)。在一些實施例中，該抗體之輕鏈包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下序列之CDR序列：RSSQSLVHTNGITYLH(SEQ ID NO：11)、KVSNRFS(SEQ ID NO：12)及SQSTHVPLT(SEQ ID NO：13)；且該抗體之重鏈包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下序列之CDR序列：DYYMNSDYYMN(SEQ ID NO：14)、DINPKNGGTTYNQKFKG(SEQ ID NO：15)及ALGVFDY(SEQ ID NO：16)。在一些實施例中，該抗體之輕鏈包含以下序列：DIVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHTNGITYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPLTFGAGTKVEIKR(SEQ ID NO：3)。在一些實施例中，該抗體之重鏈包含以下序列：EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASG
YTFSDYYMNSDYYMNWVKQSHGKSLEWIGDINPKNGGTTYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCAREADYDPIYYAMDYWGQGTTLTVSA(SEQ ID NO：4)。
在一些實施例中，本發明提供與包含以下胺基酸序列之一之多肽特異性結合的抗EGFL7抗體：CCP、TIY及ACS。在一些實施例中，本發明提供與本發明之其他抗體結合於人類EGFL7上之相同抗原 決定基的經分離抗體。在一些實施例中，本發明提供與本發明之其他抗體競爭與EGFL7結合之經分離抗體。
在一些實施例中，本發明之抗體為單株抗體。在一些實施例中，本發明之抗體為嵌合抗體、人化抗體、親和力成熟抗體、人類抗體或雙特異性抗體。在一些實施例中，該抗體為抗體片段。
在一些實施例中，本發明提供一種包含本發明之抗EGFL7抗體之醫藥組合物。在一些實施例中，該醫藥組合物另外包含抗血管生成劑。在一些實施例中，該抗血管生成劑為貝伐單抗或雷尼株單抗(ranibizumab)。
在一些實施例中，本發明提供一種編碼本發明之抗體之聚核苷酸。在一些實施例中，本發明提供包含此等聚核苷酸之載體。在一些實施例中，該載體為表現載體。在一些實施例中，本發明提供包含此等載體之宿主細胞，包括原核及真核細胞(包括哺乳動物細胞)。在一些實施例中，本發明提供一種製造抗EGFL7抗體之方法，其包含(a)使表現載體在適當宿主細胞中表現；及(b)回收抗體。
在一些實施例中，本發明提供一種降低或抑制患有與血管生成相關之病理病況之受檢者體內血管生成之方法，其包含向該受檢者投與有效量之本發明之抗EGFL7抗體或包含本發明之抗EGFL7抗體之醫藥組合物。在一些實施例中，該病理病況為贅瘤，例如癌瘤。在一些實施例中，該病理病況與眼有關，例如眼內新生血管疾病。在一些實施例中，除本發明之抗EGFL7抗體外，亦將抗血管生成劑投與受檢者。在一些實施例中，抗血管生成劑為血管內皮生長因子(VEGF)之拮抗劑，例如抗VEGF抗體(包括貝伐單抗及雷尼株單抗)。在一些實施例中，抗血管生成劑係在投與抗EGFL7抗體之前或之後投與。在一些實施例中，抗血管生成劑係與抗EGFL7抗體同時投與。
在一些實施例中，本發明提供一種增強患有與血管生成相關之 病理病況之受檢者體內抗血管生成劑之功效的方法，其包含向該受檢者投與本發明之抗EGFL7抗體或包含本發明之抗EGFL7抗體之醫藥組合物。在一些實施例中，該病理病況為贅瘤，例如癌瘤。在一些實施例中，該病理病況與眼有關，例如眼內新生血管疾病。在一些實施例中，除本發明之抗EGFL7抗體外，亦將抗血管生成劑投與受檢者。在一些實施例中，抗血管生成劑為血管內皮生長因子(VEGF)之拮抗劑，例如抗VEGF抗體(包括貝伐單抗及雷尼株單抗)。在一些實施例中，抗血管生成劑係在投與抗EGFL7抗體之前或之後投與。在一些實施例中，抗血管生成劑係與抗EGFL7抗體同時投與。在一些實施例中，亦投與其他治療，例如皮質類固醇或光動力療法。
圖1展示Mab 4F11輕鏈可變域(SEQ ID NO：1)及HuKI(SEQ ID NO：17)之胺基酸序列。
圖2展示Mab 4F11重鏈可變域(SEQ ID NO：2)及HuIII(SEQ ID NO：18)之胺基酸序列。
圖3展示Mab 10G9輕鏈可變域(SEQ ID NO：3)及HuKI(SEQ ID NO：17)之胺基酸序列。
圖4展示Mab 10G9重鏈可變域(SEQ ID NO：4)及HuIII(SEQ ID NO：18)之胺基酸序列。
圖5描述用於定位抗體結合位點之全長EGFL7及其截斷形式之結構域。藉由西方墨點及免疫沉澱之Mab抗原決定基定位。
圖6展示在用抗VEGF抗體及本發明之抗EGFL7抗體治療之過程中經人類肺癌轉染之基因轉殖小鼠模型(NSCLC；H1299)之活體內腫瘤體積。抗EGFL7 mab純系4F11增強B20.4.1(抗VEGF Mab)之活性。
圖7展示在用抗VEGF抗體及本發明之抗EGFL7抗體治療之過程中經人類肺癌轉染之基因轉殖小鼠活體內模型(NSCLC；H1299)之存活 率。抗VEGF與抗EGFL7之組合產生存活效益。H1299異種移植物卡本-麥爾曲線。
圖8展示在用抗VEGF抗體及本發明之抗EGFL7抗體治療之過程中經人類乳癌轉染之基因轉殖小鼠模型(MDA-MB231)之活體內腫瘤體積。抗EGFL7 Mab 4F11及10G9增強B20.4.1之活性。
圖9展示在用抗VEGF抗體及本發明之抗EGFL7抗體Mab 18F7治療之過程中經人類乳癌轉染之基因轉殖小鼠模型(MDA-MB231)之活體內腫瘤體積。抗EGFL7 Mab 18F7增強B20.4.1之活性。
本發明提供抗EGFL7抗體，其可用於(例如)治療或預防與EGFL7之表現及/或活性(諸如表現及/或活性增強或不合需要之表現及/或活性)相關之疾病狀態。在一些實施例中，本發明之抗體可用於治療腫瘤、癌症及/或細胞增生性病症。
在另一態樣中，本發明之抗EGFL7抗體可用作偵測及/或分離EGFL7(諸如偵測各種組織及細胞類型中之EGFL7)之試劑。
本發明另外提供製造抗EGFL7抗體、編碼抗EGFL7抗體之聚核苷酸及包含編碼抗EGFL7抗體之聚核苷酸之細胞的方法。
通用技術
熟習此項技術者一般已充分瞭解且通常使用常規方法來使用本文描述或提及之技術及程序，諸如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual第3版(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等人編輯，(2003))；METHODS IN ENZYMOLOGY系列(Academic Press,Inc.)：PCR2：A PRACTICAL APPROACH(M.J.MacPherson,B.D.Hames及G.R.Taylor編輯(1995)),Harlow及Lane編輯(1988)ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL及ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshneyb編輯(1987))中所述之廣泛使用之方法。
定義
"經分離"抗體為已經鑑別且與其天然環境之組份分離及/或自天然環境之組份中回收之抗體。其天然環境之污染組份為將干擾抗體之診斷或治療用途之物質，且可包括酵素、激素及其他蛋白或非蛋白溶質。在一些實施例中，抗體將：(1)經純化至如藉由勞立法(Lowry method)所測定大於95重量%抗體且有時大於99重量%；(2)經純化至足以藉由使用旋轉杯式定序儀獲得N末端或內部胺基酸序列之至少15個殘基之程度；或(3)藉由在還原或非還原條件下使用考馬斯亮藍(Coomassie blue)或銀染色藉由SDS-PAGE法經純化至均質。由於抗體天然環境之至少一種組份將不存在，故經分離之抗體包括原位處於重組細胞內之抗體。然而，經分離抗體通常藉由至少一個純化步驟製備。
"經分離"核酸分子為經鑑別且與至少一種通常在抗體核酸之天然來源中與其締合之污染物核酸分子分離的核酸分子。經分離核酸分子之形式或配置不同於其在自然中所見之形式或配置。由此使經分離核酸分子與存在於天然細胞中時之核酸分子相區別。然而，經分離核酸分子包括通常表現抗體之細胞中所含有的核酸分子，其中例如該核酸分子與天然細胞之核酸分子處於不同染色體位置中。
術語"根據Kabat編號之可變域殘基"或"根據Kabat編號之胺基酸位"或其變體係指Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)中用於抗體編碼之重鏈可變域或輕鏈可變域之編號系統。使用此編號系統，實際線性胺基酸序列可含有與可變域之FR或CDR縮短或插入相對應之較少或額外胺基酸。舉例而言，重鏈 可變域可包括H2殘基52後之單一胺基酸插入(根據Kabat之殘基52a)及重鏈FR殘基82後之插入殘基(例如，根據Kabat之殘基82a、82b及82c等)。可藉由將抗體序列之同源區與"標準"Kabat編號序列對準來確定既定抗體中殘基之Kabat編號。
如本文所使用之短語"實質上類似"或"實質上相同"表示兩個數字值(一般一個數字值與本發明之抗體相關且另一個與參考/比較抗體相關)之間具有足夠高之相似度，從而使熟習此項技術者可認為在由該等值(例如Kd值)量測之生物學特徵範圍內該兩個值之間具有極小差異或不具有生物及/或統計學顯著差異。隨參考/比較抗體之值而變化的該兩個值之間的差異一般小於約50%、約40%、約30%、約20%或約10%。
"結合親和力"一般係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原)間之非共價相互作用的總強度。除非另作指示，否則如本文所使用之"結合親和力"係指反映結合對(例如抗體與抗原)成員之間1：1相互作用之固有結合親和力。分子X對其搭配物Y之親和力一般可由解離常數(Kd)表示。可藉由此項技術中已知之常用方法(包括本文所述之方法)量測親和力。低親和力抗體一般與抗原緩慢結合且傾向於容易解離，而高親和力抗體一般與抗原結合較快且傾向於保持較長時間結合。此項技術中已知多種量測結合親和力之方法，該等方法中之任一者均可用於達成本發明之目的。以下描述特定例示性實施例。
在一實施例中，如以下檢定所述藉由以所關注之抗體之Fab型式及其抗原進行之放射性標記抗原結合檢定(RIA)來量測本發明之"Kd"或"Kd值"：在未經標記抗原之連續滴定存在下以最小濃度之(125I)標記抗原平衡Fab，接著捕捉與經抗Fab抗體塗覆之培養盤結合之抗原，藉此來量測Fab對抗原之溶液結合親和力(Chen等人，J.Mol.Biol. 293：865-81(1999))。為確立檢定條件，用50mM碳酸鈉(pH 9.6)中之5μg/ml捕捉抗Fab抗體(Cappel Labs)塗覆微量滴定盤(Dynex)隔夜，且隨後在室溫(約23℃)下以PBS中之2%(w/v)牛血清白蛋白阻斷2至5小時。在無吸附劑培養盤(Nunc #269620)中，將100pM或26pM[125I]抗原與連續稀釋之所關注之Fab混合(例如與抗VEGF抗體Fab-12之評定相一致，Presta等人，Cancer Res.57：4593-99(1997))。接著培育所關注之Fab隔夜；然而，培育可持續一段較長之時間(例如65小時)以確保達到平衡。此後，在室溫下將混合物轉移至捕捉培養盤中以用於培育(例如歷時1小時)。接著移除溶液並用PBS中之0.1% Tween-20洗滌培養盤8次。當培養盤已經乾燥時，每孔添加150μl閃爍體(MicroScint-20；Packard)，且於Topcount γ計數器(Packard)上對培養盤計數10分鐘。選擇提供小於或等於20%最大結合之各Fab濃度用於競爭性結合檢定。根據另一實施例，藉由在25℃下使用表面電漿共振檢定使用BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)以約10個反應單元(RU)之固定抗原CM5晶片量測Kd或Kd值。簡而言之，根據供應商之說明書用N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基)碳化二醯亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物感應器晶片(CM5,BIAcore Inc)。用10mM乙酸鈉(pH 4.8)將抗原稀釋至5μg/ml(約0.2μM)，接著以每分鐘5μl之流動速率進行注射以達成約10個反應單元(RU)之偶聯蛋白。注射抗原後，注射1M乙醇胺以阻斷未反應之基團。對於動力學量測而言，在25℃下以約25μl/min之流動速率注射在具有0.05% Tween 20之PBS(PBST)中兩倍連續稀釋之Fab(0.78nM至500nM)。使用簡單的一對一Langmuir結合模型(BIAcore評估軟體3.2版)藉由同時擬合締合與解離感應譜來計算締合速率(kon)及解離速率(koff)。根據koff/kon之比率來計算平衡解離常數(Kd)。例如參看Chen,Y.等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999)。若由 上述表面電漿共振檢定獲得之締合速率超過106M-1 S-1，則可在如光譜儀(諸如裝備停流裝置之分光光度計(Aviv Instruments)或具有攪拌比色管之8000系列SLM-Aminco光譜光度計(ThermoSpectronic))所量測濃度遞增之抗原存在下，藉由使用於25℃下量測PBS(pH7.2)中之20nM抗抗原抗體(Fab形式)之螢光發射強度之增加或降低(激發=295nm；發射=340nm，16nm帶通)的螢光淬滅技術來測定締合速率。
根據本發明，亦可在25℃下使用BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)以與上述相同之表面電漿共振技術使用約10個反應單元(RU)之固定抗原CM5晶片測定"締合速率"或"kon"。簡而言之，根據供應商之說明書用N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基)碳化二醯亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物感應器晶片(CM5,BIAcore Inc)。用10mM乙酸鈉(pH 4.8)將抗原稀釋至5μg/ml(約0.2μM)，接著以每分鐘5μl之流動速率進行注射以達成約10個反應單元(RU)之偶聯蛋白。注射抗原後，注射1M乙醇胺以阻斷未反應之基團。對於動力學量測而言，在25℃下以約25μl/min之流動速率注射在具有0.05% Tween 20之PBS(PBST)中兩倍連續稀釋之Fab(0.78nM至500nM)。使用簡單的一對一Langmuir結合模型(BIAcore評估軟體3.2版)藉由同時擬合締合與解離感應譜來計算締合速率(kon)及解離速率(koff)。根據koff/kon之比率來計算平衡解離常數(Kd)。例如參看Chen,Y.等人，J.Mol.Biol.293：865-81(1999)。然而，若由上述表面電漿共振檢定獲得之締合速率超過106M-1 S-1，則一般在如光譜儀(諸如裝備停流裝置之分光光度計(Aviv Instruments)或具有攪拌比色管之8000系列SLM-Aminco光譜光度計(ThermoSpectronic))所量測濃度遞增之抗原存在下，藉由使用於25℃下量測PBS(pH 7.2)中之20nM抗抗原抗體(Fab形式)之螢光發射強度之增加或降低(激發=295nm；發射=340nm，16nm帶通)的螢光淬滅 技術來測定締合速率。
如本文所使用之術語"載體"意指能夠轉運所連接之另一核酸分子之核酸分子。一類載體為"質體"，其係指可接合額外DNA區段之環形雙鏈DNA環。另一類載體為噬菌體載體。另一類載體為病毒載體，其中可將額外DNA區段接合至病毒基因組中。某些載體能夠在引入該等載體之宿主細胞中自主複製(例如具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如非游離型哺乳動物載體)可在引入宿主細胞之後整合至宿主細胞之基因組中，且藉此與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠指導與其以可操作方式連接之基因之表現。在本文中將此等載體稱為"重組表現載體"(或簡稱為"重組載體")。一般而言，可用於重組DNA技術中之表現載體通常為質體之形式。在本說明書中，由於質體係最常用之載體形式，故"質體"與"載體"可互換使用。
如本文可互換使用之"聚核苷酸"或"核酸"係指任何長度之核苷酸之聚合物，且包括DNA及RNA。核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼基及/或其類似物，或可藉由DNA或RNA聚合酶或合成反應併入聚合物中之任何基質。聚核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其類似物。若存在對核苷酸結構之修飾，則可在組裝成聚合物之前或之後進行修飾。核苷酸序列可由非核苷酸組份間斷。可在合成後(諸如)藉由與標記共軛對聚核苷酸進行進一步修飾。其他類型之修飾包括(例如)"封端"；一或多個天然存在之核苷酸經類似物取代；核苷酸間修飾，諸如具有不帶電鍵結(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、磷醯胺酸、胺基甲酸酯等)及帶電鍵結(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)之聚核苷酸，含有諸如蛋白質(例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚-L-離胺酸等)之側位部分之聚核苷酸，具有嵌入劑(例如吖啶、補骨脂素(psoralen)等)之聚核苷酸，含有 螯合劑(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)之聚核苷酸，含有烷化劑之聚核苷酸，具有經修飾鍵結之聚核苷酸(例如α變旋異構核酸等)以及未經修飾形式之聚核苷酸。另外，通常存在於糖中之任何羥基均可(例如)經膦酸酯基、磷酸酯基置換，經標準保護基團保護或經活化以製備與額外核苷酸之額外鍵結；或可與固體或半固體支撐物共軛。5'及3'末端OH可經磷酸化或經胺或具有1至20個碳原子之有機封端基團部分取代。其他羥基亦可衍生成為標準保護基團。聚核苷酸亦可含有此項技術中一般已知之核糖或去氧核糖之類似形式，包括(例如)2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟-或2'-疊氮基-核糖；碳環糖類似物；α-變旋異構糖；差向異構糖，諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖；哌喃糖；呋喃糖；景天庚酮糖；非環狀類似物；及基本核苷類似物，諸如甲基核糖苷。一或多個磷酸二酯鍵可經替代性連接基團置換。此等替代性連接基團包括(但不限於)磷酸酯經P(O)S("硫醇酯")、P(S)S("二硫醇酯")、(O)NR2("醯胺化物")、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2("甲縮醛")置換之實施例，其中各R或R'獨立地為H或視情況含有醚(-O-)鍵之經取代或未經取代之烷基(1-20個C)、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烷基。聚核苷酸中之所有鍵結無需相同。上文之描述適用於本文所提及之所有聚核苷酸，包括RNA及DNA。
如本文所使用之"寡核苷酸"一般係指長度一般(但非必需)小於約200個核苷酸之短的、一般為單鏈、一般為合成之聚核苷酸。術語"寡核苷酸"及"聚核苷酸"並不相互排除。上文有關聚核苷酸之描述同樣且完全適用於寡核苷酸。
除非另外明確指示或於上下文中另作指示，否則如本文所使用之術語"EGFL7"(可互換稱為"表皮生長因子樣7")係指如(例如)WO 2005/117968中所述之任何天然或變異體(天然或合成)EGFL7多肽，該專利之揭示內容以全文引用之方式併入本文中用於所有目的。術語 "天然序列"特別涵蓋天然存在之截斷或分泌形式(例如胞外域序列)、天然存在之變異體形式(例如替代性剪接形式)及天然存在之等位基因變異體。術語"野生型EGFL7"一般係指包含天然存在之EGFL7蛋白之胺基酸序列的多肽。術語"野生型EGFL7序列"一般係指於天然存在之EGFL7中發現之胺基酸序列。
術語"抗體"與"免疫球蛋白"在廣義上可互換使用，且包括單株抗體(例如全長或完整單株抗體)、多株抗體、多價抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體，只要其展現出所需之生物活性即可)，且亦可包括某些抗體片段(如本文更詳細地描述)。抗體可為人類抗體、人化抗體及/或親和力成熟抗體。
術語"可變"係指抗體間可變域之某些部分的序列普遍不同且該等部分用於各特定抗體對其特定抗原之結合及特異性的事實。然而，變異性並非均勻分佈於整個抗體可變域中。其集中於輕鏈與重鏈可變域中稱為互補判定區(CDR)或高變區之三個區段。可變域中高度保守之部分稱為構架(FR)。天然重鏈及輕鏈之可變域各自包含主要採用β-折疊構型的由三個CDR連接之四個FR區，其形成環連接，且在一些情況下形成β-折疊結構之部分。各鏈中之CDR由FR區以緊密接近之方式固持在一起，且與其他鏈之CDR一起有助於形成抗體之抗原結合位點(參看Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，National Institute of Health,Bethesda,MD(1991))。抗體與抗原之結合並不直接涉及恆定域，但其展現出各種效應功能，諸如使抗體參與抗體依賴性細胞毒性。
木瓜酵素消化抗體會產生兩個各自具有單一抗原結合位點稱為"Fab"片段的相同抗原結合片段，及剩餘"Fc"片段，其名稱反映其易於結晶之能力。胃蛋白酶處理會得到具有兩個抗原組合位點且仍能夠交聯抗原之F(ab')2片段。
"Fv"為含有完整抗原識別位點及結合位點之最小抗體片段。在雙鏈Fv種類中，此區域係由緊密、非共價締合之一個重鏈可變域與一個輕鏈可變域之二聚體組成。在單鏈Fv種類中，一個重鏈可變域與一個輕鏈可變域可經彈性肽連接子共價連接，從而使輕鏈與重鏈可以與兩鏈Fv種類中之結構類似之"二聚"結構締合。各可變域之三個CDR即係以此構型相互作用而界定VH-VL二聚體表面上之抗原結合位點。總起來說，六個CDR賦予抗體抗原結合特異性。然而，甚至單一可變域(或僅包含三個抗原特異性CDR之一半Fv)亦具有識別並結合抗原之能力，但其親和力低於完整結合位點。
Fab片段亦含有輕鏈恆定域及重鏈第一恆定域(CH1)。Fab'片段因在重鏈CH1結構域之羧基末端添加有少量殘基(包括一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸)而不同於Fab片段。Fab'-SH在本文中係對恆定域之半胱胺酸殘基帶有游離硫醇基之Fab'的命名。最初F(ab')2抗體片段經製造為其間具有鉸鏈半胱胺酸之Fab'片段對。亦已知抗體片段之其他化學偶聯。
可基於恆定域之胺基酸序列將任何脊椎動物物種之抗體(免疫球蛋白)的"輕鏈"分為兩種截然不同之類型(稱為κ及λ)中的一種。
視重鏈恆定域之胺基酸序列而定，可將免疫球蛋白分為不同種類。存在五種主要的免疫球蛋白類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等類別之數種可進一步細分成子類(同型)：例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。與不同類別之免疫球蛋白相對應之重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。不同類別之免疫球蛋白之次單元結構及三維構型係熟知的。
"抗體片段"僅包含完整抗體之一部分，其中該部分較佳保留至少一種，較佳大部分或所有當存在於完整抗體中時通常與該部分相關之功能。抗體片段之實例包括Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段，雙功能抗 體，線性抗體，單鏈抗體分子及由抗體片段形成之多特異性抗體。在一實施例中，抗體片段包含完整抗體之抗原結合位點且因此保留結合抗原之能力。在另一實施例中，抗體片段(例如包含Fc區之片段)保留至少一種當存在於完整抗體中時通常與Fc區相關之生物功能，諸如FcRn結合、抗體半衰期調節、ADCC功能及補體結合。在一實施例中，抗體片段為具有實質上與完整抗體類似之活體內半衰期的單價抗體。舉例而言，此抗體片段可包含連接至Fc序列能夠賦予該片段活體內穩定性之抗原結合臂。
當用於本文中時，術語"高變區"、"HVR"或"HV"係指序列高變且/或形成結構上確定之環之抗體可變域的區域。大體而言，抗體包含六個高變區，三個在VH(H1、H2、H3)中且三個在VL(L1、L2、L3)中。本文中使用且涵蓋多種有關高變區之描繪。Kabat互補判定區(CDR)係基於序列變異性且最常使用(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。而Chothia涉及結構環之位置(Chothia及Lesk J.Mol.Biol.196：901-17(1987))。AbM高變區表示Kabat CDR與Chothia結構環間之折衷，且藉由Oxford Molecular's AbM抗體模型化軟體加以使用。"接觸"高變區係基於對可用複雜晶體結構之分析。
高變區可包含如下"延長高變區"：VL中之24-36(L1)、46-56(L2)及89-97(L3)；及VH中之26-35(H1)、49-65或50至65(H2)及93-102(H3)。關於此等定義中之各者可根據Kabat等人(同上文)對可變域殘基進行編號。
"構架"或"FR"殘基為除如本文所定義之高變區殘基外的彼等可變域殘基。
"人化"形式之非人類(例如鼠科)抗體為含有自非人類免疫球蛋白 獲得之最小序列的嵌合抗體。在極大程度上，人化抗體為人類免疫球蛋白(接受者抗體)，其中接受者高變區之殘基經具有所需特異性、親和力及能力之非人類物種(供體抗體)(諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物)高變區之殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之構架區(FR)殘基經相應之非人類殘基置換。此外，人化抗體可包含未見於接受者抗體或供體抗體中之殘基。進行此等修飾以進一步改進抗體之效能。一般而言，人化抗體將包含實質上所有至少一個且通常兩個可變域，其中所有或實質上所有高變環對應於非人類免疫球蛋白之高變環，且所有或實質上所有FR為人類免疫球蛋白序列之FR。人化抗體視情況亦將包含至少一部分免疫球蛋白恆定區(Fc)，通常為人類免疫球蛋白之恆定區。有關其他細節，參看Jones等人，Nature 321：522-25(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323-29(1988)及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2：593-96(1992)。亦可參看以下評論論文及其中所引用之參考文獻：Vaswani及Hamilton,Ann.Allergy,Asthma & Immunol.1：105-15(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions 23：1035-38(1995)；Hurle及Gross,Curr.Op.Biotech.5：428-33(1994)。
"嵌合"抗體(免疫球蛋白)具有一部分與自特定物種或屬於特定抗體類別或子類獲得之抗體中的相應序列相同或同源的重鏈及/或輕鏈，而鏈之剩餘部分與自另一物種或屬於另一抗體類別或子類獲得之抗體以及此等抗體之片段中的相應序列相同或同源，只要其展現出所需之生物活性即可(美國專利第4,816,567號及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。如本文所使用之人化抗體為嵌合抗體之子集。
"單鏈Fv"或"scFv"抗體片段包含抗體之VH及VL結構域，其中此等結構域係存在於單一多肽鏈中。一般而言，scFv多肽另外包含VH與VL結構域之間使scFv能夠形成抗原結合所需結構之多肽連接子。 有關svFv之評論，參看Plückthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編輯，Springer-Verlag,New York，第269-315頁(1994)。
"抗原"為抗體可選擇性結合之預定抗原。目標抗原可為多肽、醣、核酸、脂質、半抗原或其他天然存在或合成之化合物。一般而言，目標抗原為多肽。
"抗原決定基"為抗體選擇性結合之抗原部分。對於多肽抗原而言，抗原決定基一般為具有約4-10個胺基酸之肽部分。
術語"雙功能抗體"係指具有兩個抗原結合位點之小抗體片段，該等片段包含與相同多肽鏈(VH-VL)中之輕鏈可變域(VL)連接之重鏈可變域(VH)。藉由使用過短而使相同鏈上之兩個結構域之間無法配對之連接子，迫使該等結構域與另一鏈之互補結構域配對並產生兩個抗原結合位點。雙功能抗體更詳細地描述於(例如)EP 404,097、WO 93/11161及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-48(1993)中。
"人類抗體"為具有與人類所產生之抗體之胺基酸序列相對應的胺基酸序列且/或使用本文所揭示之任何製造人類抗體之技術製得的抗體。此有關人類抗體之定義特別排除包含非人類抗原結合殘基之人化抗體。
"親和力成熟"抗體為在一或多個CDR中具有一或多種變化之抗體，與不具有彼等變化之親本抗體相比較，彼等變化使得抗體對抗原之親和力得以改良。較佳之親和力成熟抗體將對目標抗原具有奈莫耳或甚至皮莫耳親和力。親和力成熟抗體可藉由此項技術中已知之程序製得。Marks等人Bio/Technology 10：779-83(1992)描述藉由VH及VL結構域改組達成親和力成熟。CDR及/或構架殘基之隨機突變描述於以下文獻中：Barbas等人，Proc Nat.Acad.Sci.USA 91：3809-13(1994)； Schier等人Gene 169：147-55(1995)；Yelton等人，J.Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson等人，J.Immunol.154(7)：3310-19(1995)及Hawkins等人，J.Mol.Biol.226：889-96(1992)。
抗體"效應功能"係指由抗體之Fc區(天然序列Fc區或胺基酸序列變異體Fc區)引起之彼等生物活性，且其隨抗體同型而變化。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、吞噬作用、細胞表面受體(例如B細胞受體)下調及B細胞活化。
"抗體依賴性細胞介導之細胞毒性"或"ADCC"係指一種細胞毒性形式，其中與存在於某些細胞毒性細胞(例如天然殺傷(NK)細胞、嗜中性白血球及巨噬細胞)上之Fc受體(FcR)結合的分泌Ig使此等細胞毒效應細胞能夠與帶有抗原之目標細胞特異性結合且隨後以細胞毒素殺傷目標細胞。抗體"配備"細胞毒細胞且完全為此殺傷所需。介導ADCC初級細胞(NK細胞)僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血細胞上之FcR表現概述於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)中第464頁之表3中。為評定所關注之分子的ADCC活性，可進行活體外ADCC檢定，諸如美國專利第5,500,362號或第5,821,337號或Presta美國專利第6,737,056號中所述。用於此等檢定中之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及天然殺傷(NK)細胞。另外或其他，可在活體內，例如在動物模型(諸如Clynes等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：652-56(1998)中所揭示之動物模型)中評定所關注之分子的ADCC活性。
"人類效應細胞"係表現一或多個FcR且執行效應功能之白血球。該等細胞較佳至少表現FcγRIII並執行ADCC效應功能。介導ADCC之人類白血球之實例包括周邊血液單核細胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細胞、單核細胞、細胞毒性T細胞及嗜中性白血球，其中PBMC及NK細 胞較佳。效應細胞可自天然來源(例如血液)分離。
"Fc受體"或"FcR"描述與抗體Fc區結合之受體。較佳之FcR為天然序列人類FcR。此外，較佳之FcR為結合IgG抗體之FcR(γ受體)且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII子類之受體，包括此等受體之等位基因變異體及另外剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA("活化受體")及FcγRIIB("抑制受體")，其具有主要在細胞質域中不同之類似胺基酸序列。活化受體FcγRIIA之細胞質域中含有免疫受體酪胺酸基活化基元(ITAM)。抑制受體FcγRIIB之細胞質域中含有免疫受體酪胺酸基抑制基序(ITIM)(參看評論M.Daëron,Annu.Rev.Immunol.15：203-34(1997))。FcR論述於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)；Capel等人，Immunomethods 4：25-34(1994)及de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)中。本文之術語"FcR"中涵蓋其他FcR，包括日後鑑別之FcR。此術語亦包括新生兒受體FcRn，其負責將母體IgG轉移至胎兒體內(Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等人，J.Immunol.24：249(1994))並調控免疫球蛋白之動態穩定。
WO 00/42072(Presta)描述與FcR之結合經改良或經降低之抗體變異體。該專利公開案之內容以引用方式明確併入本文中。亦參看Shields等人J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)。
量測與FcRn結合之方法係已知的(例如參看Ghetie及Ward,Immunol.Today 18：592-8(1997))。可(例如)在表現人類FcRn之轉殖基因小鼠或經轉染人類細胞株中或已投與Fc變異體多肽之靈長類動物體內檢定活體內與人類FcRn之結合及人類FcRn高親和力結合多肽之血清半衰期。
"補體依賴性細胞毒性"或"CDC"係指在補體存在下目標細胞之溶解。經典補體路徑之活化係藉由補體系統之第一組份(C1q)結合至與其同源抗原結合之(適當子類之)抗體而起始。為評定補體活化，可進 行CDC檢定，例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所述。
具有已變化之Fc區胺基酸序列及增強或降低之C1q結合能力的多肽變異體描述於美國專利第6,194,551B1號及WO 99/51642中。彼等專利公開案之內容以引用方式特別併入本文中。亦參看Idusogie等人，J.Immunol.164：4178-84(2000)。
"阻斷"抗體或"拮抗劑"抗體為抑制或降低所結合之抗原之生物活性的抗體。較佳之阻斷抗體或拮抗劑抗體實質或完全抑制抗原之生物活性。
"病症"或"疾病"為將自經本發明之物質/分子或方法進行之治療獲益的任何病況。此包括慢性及急性病症或疾病，包括使哺乳動物易患所述病症之彼等病理病況。本文中待治療之病症的非限制性實例包括惡性及良性腫瘤、癌瘤、母細胞瘤及肉瘤。
術語"細胞增生性病症"及"增生性病症"係指與某種程度之異常細胞增殖相關之病症。在一實施例中，細胞增生性病症為癌症。
如本文所使用之"腫瘤"係指所有贅生性細胞(惡性或良性)之生長及增殖，及所有癌前及癌細胞及組織。如本文所提及之術語"癌症"、"癌性"、"細胞增生性病症"、"增生性病症"及"腫瘤"並不互相排除。
術語"癌症"及"癌性"係指或描述哺乳動物體內通常以不受調控之細胞生長/增殖為特徵之生理病況。癌症之實例包括(但不限於)癌瘤、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤及白血病。此等癌症更特定之實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、垂體癌、食管癌、星形細胞瘤、軟組織肉瘤、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、胰腺癌、神經膠母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝腫瘤、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌、腦癌、子宮內膜 癌、睾丸癌、膽管癌、膽囊癌、胃癌、黑素瘤及各種類型之頭頸部癌。血管生成功能失調可引起許多可由本發明之組合物及方法治療之病症。此等病症包括非贅生性與贅生性病況。贅生性病況包括(但不限於)上文所述之病況。非贅生性病症包括(但不限於)不當或異常肥大、關節炎、類風濕性關節炎(RA)、牛皮癬、牛皮癬斑塊、類肉瘤病、動脈粥樣硬化、動脈粥樣硬化斑、糖尿病性及其他增生性視網膜病變(包括早產兒視網膜病變)、晶狀體後纖維組織增生、新生血管性青光眼、年齡相關之黃斑變性、糖尿病性黃斑水腫、角膜新血管生成、角膜移植物新血管生成、角膜移植物排斥反應、視網膜/脈絡膜新血管生成、隅角新血管生成(虹膜紅變)、眼內新生血管疾病、血管再狹窄、動靜脈畸形(AVM)、腦膜瘤、血管瘤、血管纖維瘤、甲狀腺增生(包括格雷夫氏病(Grave's disease))、角膜及其他組織移植、慢性炎症、肺炎、急性肺損傷/ARDS、敗血症、原發性肺循環血壓過高、惡性肺部積液、腦水腫(例如與急性中風/閉合性頭部損傷/外傷有關)、滑膜炎、RA中之血管翳形成、骨化性肌炎、肥厚性骨形成、骨關節炎(OA)、難治性腹水、多囊卵巢病、子宮內膜異位、流體第三間隔疾病(3rd spacing of fluid diseases)(胰腺炎、間隔症候群、燒傷、腸病)、子宮纖維瘤、早產、諸如IBD之慢性炎症(克隆氏病(Crohn's disease)及潰瘍性結腸炎)、腎同種異體移植排斥反應、炎症性腸病、腎病症候群、不當或異常組織腫塊生長(非癌症)、血友病性關節、肥厚性瘢痕、頭髮生長之抑制、奧韋氏症候群(Osler-Weber syndrome)、化膿性肉芽腫晶狀體後纖維組織增生、硬皮病、沙眼、血管黏附、滑膜炎、皮炎、先兆子癇、腹水、心包積液(諸如與心包炎相關之心包積液)及胸腔積液。
術語"消耗性"病症(例如消耗性症候群、惡病質、肌肉減少症)係指由不當及/或不健康之體重減輕或體細胞質量減輕所引起之病症。 在老年人以及AIDS及癌症患者中，消耗性疾病可導致不當之體重減輕，包括脂肪與無脂肪間隔之體重減輕。消耗性疾病可由不恰當之食物攝入及/或與疾病及/或衰老過程相關之代謝改變引起。癌症患者及AIDS患者以及廣泛手術後或患有慢性感染、免疫疾病、甲狀腺機能亢進、克隆氏病、精神性疾病、慢性心臟衰竭或其他嚴重外傷之患者通常身受消耗性疾病，消耗性疾病有時亦稱為惡病質、代謝病症且有時稱為進食障礙。另外，惡病質以代謝亢進及分解代謝過度為特徵。儘管通常互換使用惡病質與消耗性病症來指代消耗性病況，但存在至少一種體研究根據去脂體重且尤其是體細胞質量之減輕將惡病質與消耗性症候群區別開來(Mayer,J.Nutr.129(1S增補)：256S-59S(1999))。肌肉減少症(另一種可影響衰老個體之病症)通常係以肌肉質量減輕為特徵。如上文所述之末期消耗性疾病可在身受惡病質或肌肉減少症之個體體內發展。
如本文所使用之"治療"係指試圖改變所治療之個體或細胞之自然過程的臨床干預，且可出於預防之目的或臨床病理學過程中進行。所需之治療作用包括預防疾病之發生或復發、緩解症狀、減小疾病之任何直接或間接病理結果、降低疾病進展速率、改善或減輕疾病狀態及病情好轉或改良預後。在一些實施例中，使用本發明之抗體延緩疾病或病症之發展。
"個體"、"受檢者"或"患者"為脊椎動物，例如哺乳動物，尤其包括人類。哺乳動物包括(但不限於)人類、家畜及農畜，及動物園動物、競技類動物或寵物，諸如犬、馬、貓、奶牛等。
"有效量"係指有效達成所需治療或預防結果所必需之劑量及時間量。
本發明之物質/分子、激動劑或拮抗劑之"治療有效量"可根據以下因素而變化：諸如個體之疾病狀態、年齡、性別及體重，及物質/ 分子、激動劑或拮抗劑於個體體內誘發所需反應之能力。治療有效量亦係物質/分子、激動劑或拮抗劑之治療有益作用超過其任何有毒或有害作用的量。
"預防有效量"係指有效達成所需預防結果所必需之劑量及時間量。由於預防劑量係在疾病之前或疾病早期用於受檢者，故預防有效量通常(但非必需)將小於治療有效量。
如本文所使用之"細胞毒性劑"係指抑制或阻礙細胞功能且/或引起細胞破壞之物質。此術語意欲包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32及Lu之放射性同位素)；化學治療劑，例如甲胺喋呤(methotrexate)、阿黴素(adriamicin)、長春鹼類(vinca alkaloids)(長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、依託泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂黴素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔紅黴素(daunorubicin)或其他嵌入劑；酵素及其片段，諸如核分解酶；抗生素；及毒素，諸如細菌、真菌、植物或動物來源之小分子毒素或酶活性毒素(包括其片段及/或變異體)；及下文所揭示之各種抗腫瘤或抗癌劑。其他細胞毒性劑描述於下文中。殺腫瘤劑引起腫瘤細胞之破壞。
"化學治療劑"係可用於治療癌症之化合物。化學治療劑之實例包括烷基化劑，諸如噻替哌(thiotepa)及CYTOXAN®環磷醯胺(cyclosphosphamide)；磺酸烷酯，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，諸如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、麥曲多巴(meturedopa)及尤利多巴(uredopa)；伸乙基亞胺及甲基三聚氰胺，包括六甲密胺(altretamine)、曲他胺(triethylenemelamine)、三伸乙基磷醯胺(trietylenephosphoramide)、三伸乙基硫代磷醯胺(triethiylenethiophosphoramide)及三羥甲基三聚氰胺 (trimethylolomelamine)；乙醯精寧(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氫大麻酚(曲大麻酚(dronabinol)，MARINOL®)；β-拉帕酮(beta-lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙鹼(colchicine)；樺木酸(betulinic acid)；喜樹鹼(camptothecin)(包括合成類似物拓撲替康(topotecan)(HYCAMTIN®)、CPT-11(伊立替康(irinotecan)CAMPTOSAR®)、乙醯喜樹鹼、斯可波萊汀(scopolectin)及9-胺基喜樹鹼)；苔蘚蟲素(bryostatin)；卡利他汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)及比折來新(bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；足葉草酸(podophyllinic acid)；替尼泊甙(teniposide)；念珠藻環肽(cryptophycin)(尤其是念珠藻環肽1及念珠藻環肽8)；海兔毒素(dolastatin)；多卡黴素(duocarmycin)(包括合成類似物，KW-2189及CB1-TM1)；艾榴素(eleutherobin)；潘卡替他汀(pancratistatin)；沙科地辛(sarcodictyin)；斯潘他汀(spongistatin)；氮芥末(nitrogen mustard)，諸如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlornaphazine)、膽磷醯胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、氧化氮芥鹽酸鹽、美法侖、新恩比興(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶芥末(uracil mustard)；亞硝基脲(nitrosurea)，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲黴素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，諸如烯二炔類抗生素(enediyne antibiotic)(例如刺孢黴素(calicheamicin)，尤其是刺孢黴素γ1I及刺孢黴素ΩI1(例如參看Agnew,Chem Intl.Ed.Engl.,33：183-186(1994))，地尼黴素(dynemicin)(包括地尼黴素A(dynemicin A))，伊斯帕黴素(esperamicin)以及新製癌菌素發色團(neocarzinostatin chromophore)及相關色蛋白烯二炔類抗生素發色團)、阿克萊諾黴素(aclacinomysin)、放線菌素(actinomycin)、奧瑟黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸(azaserine)、博萊黴素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、卡拉比星(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycinis)、放線菌素D(dactinomycin)、柔紅黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-側氧基-L-正白胺酸、ADRIAMYCIN®多柔比星(包括嗎啉基-多柔比星、氰基嗎啉基-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星及去氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycin)(諸如絲裂黴素C)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾拉黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、博替羅黴素(potfiromycin)、嘌羅黴素(puromycin)、奎拉黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑黴素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他汀(zinostatin)、左柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如甲胺喋呤及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如迪諾特寧(denopterin)、甲胺喋呤、蝶羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉賓(fludarabine)、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙去氧尿苷、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氮尿苷(floxuridine)；雄激素，諸如卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾內酪(testolactone)；抗腎上腺劑，諸如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸 補充劑，諸如葉酸；醋葡醛內酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；胺基乙醯丙酸(aminolevulinic acid)；5-乙炔尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；貝曲布辛(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；伊達曲仙(edatraxate)；德弗法明(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；伊弗尼辛(elfornithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；艾普塞隆(epothilone)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基尿素(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；洛尼達寧(lonidainine)；美登素類(maytansinoids)，諸如美登素(maytansine)及安絲菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫比丹莫(mopidanmol)；尼曲伊寧(nitraerine)；噴司他汀(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；比柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基醯肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK®多醣複合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)；雷佐生(razoxane)；根瘤菌素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；單端孢黴毒素(trichothecene)(尤其是T-2毒素、維拉箭毒A(verracurin A)、漆斑菌素A(roridin A)及安吉毒素(anguidine))；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)(ELDISINE®、FILDESIN®)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露糖醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；瓜西托辛(gacytosine)；阿糖苷(arabinoside)("Ara-C")；噻替派；紫杉醇類(taxoids)，例如TAXOL®紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、ABRAXANETM無十六醇聚氧乙烯醚之紫杉醇之白蛋白工程設計奈米顆粒調配物(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Illinois)及TAXOTERE®多西他賽(doxetaxel)(Rhône-Poulenc Rorer,Antony,France)；氯蘭布辛 (chloranbucil)；吉西他賓(gemcitabine)(GEMZAR®)；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲胺喋呤；鉑類似物，諸如順鉑(cisplatin)及卡鉑(carboplatin)；長春鹼(VELBAN®)；鉑；依託泊苷(VP-16)；異環磷醯胺；米托蒽醌；長春新鹼(ONCOVIN®)；奧賽力鉑(oxaliplatin)；甲醯四氫葉酸(leucovovin)；長春瑞賓(vinorelbine)(NAVELBINE®)；諾凡特龍(novantrone)；依達曲沙(edatrexate)；道諾黴素(daunomycin)；胺基喋呤(aminopterin)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(difluoromethylornithine(DMFO))；類視色素(retinoid)，諸如視黃酸；卡西他賓(capecitabine)(XELODA®)；上述任何物質的醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物；以及兩種或兩種以上上述物質之組合，諸如CHOP(環磷醯胺、多柔比星、長春新鹼及潑尼松龍(prednisolone)之組合療法的縮寫)及FOLFOX(奧賽力鉑(ELOXATINTM)與5-FU及甲醯四氫葉酸組合之治療方案的縮寫)。
此定義中亦包括抗激素劑，其用於調控、降低、阻斷或抑制可促進癌症生長之激素的作用且通常為全身性或整體治療之形式。其可為激素本身。實例包括抗雌激素及選擇性雌激素受體調節劑(SERM)，包括(例如)他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX®他莫昔芬)、EVISTA®雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬鹽酸鹽(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)及FARESTON®托瑞米芬(toremifene)；抗孕酮；雌激素受體下調劑(ERD)；用於抑制或阻止卵巢之藥劑，例如黃體生成激素釋放激素(LHRH)促效劑，諸如LUPRON®及ELIGARD®乙酸亮丙立德(leuprolide acetate)、乙酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、乙酸布舍瑞林(buserelin acetate)及三蝶瑞林(tripterelin)；其他抗雄激素，諸如氟他胺(flutamide)、尼魯胺(nilutamide)及比卡魯胺(bicalutamide)；及抑制調節腎上腺中雌激素產 生之芳香酶的芳香酶抑制劑，諸如4(5)-咪唑、胺魯米特、MEGASE®乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、AROMASIN®依西美坦(exemestane)、福美司坦(formestanie)、法屈唑(fadrozole)、RIVISOR®伏羅唑(vorozole)、FEMARA®來曲唑(letrozole)及ARIMIDEX®安美達錠(anastrozole)。此外，此化學治療劑定義亦包括雙膦酸鹽，諸如氯屈膦酸鹽(clodronate)(例如BONEFOS®或OSTAC®)、DIDROCAL®依替膦酸鹽(etidronate)、NE-58095、ZOMETA®唑來膦酸/唑來膦酸鹽(zoledronic acid/zoledronate)、FOSAMAX®阿侖膦酸鹽(alendronate)、AREDIA®帕米膦酸鹽(pamidronate)、SKELID®替魯膦酸鹽(tiludronate)或ACTONEL®利塞膦酸鹽(risedronate)；以及曲沙他濱(troxacitabine)(1,3-二氧戊環胞嘧啶核苷類似物)；反義寡核苷酸，尤其是抑制與異常細胞增殖相關之信號路徑中之基因表現之反義寡核苷酸，諸如PKC-α、Raf、H-Ras及表皮生長因子受體(EGF-R)；疫苗，諸如THERATOPE®疫苗及基因療法疫苗(例如ALLOVECTIN®疫苗、LEUVECTIN®疫苗及VAXID®疫苗)；LURTOTECAN®拓撲異構酶1抑制劑；ABARELIX® rmRH；拉帕替尼二甲苯磺酸鹽(lapatinib ditosylate)(一種ErbB-2及EGFR雙重酪胺酸激酶小分子抑制劑，亦稱為GW572016)；及上述物質中之任一者的醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。
當用於本文中時，"生長抑制劑"係指抑制細胞(諸如表現EGFL7之細胞)活體外或活體內生長之化合物或組合物。因此，生長抑制劑可為顯著降低S期中細胞(諸如表現EGFL7之細胞)百分比之藥劑。生長抑制劑之實例包括阻斷細胞週期進程(除S期外之其他位置)之藥劑，諸如誘導G1停滯及M期停滯之藥劑。經典M期阻斷劑包括長春鹼類(長春新鹼及長春鹼)、紫杉烷(taxane)及拓撲異構酶II抑制劑(諸如多柔比星、表柔比星、柔紅黴素、依託泊苷及博萊黴素)。彼等使G1 停滯之藥劑亦伴隨產生S期停滯，例如DNA烷基化劑，諸如他莫昔芬、潑尼松(prednisone)、達卡巴嗪、氮芥、順鉑、甲胺喋呤、5-氟尿嘧啶及ara-C。其他資訊可見於Murakami等人之The Molecular Basis of Cancer,Mendelsohn及Israel編輯，第1章，標題為"Cell cycle regulation,oncogenes,and antineoplastic drugs"(WB Saunders：Philadelphia,1995)，尤其第13頁中。紫杉烷(紫杉醇及多西他賽)為源自紫杉樹之抗癌藥物。源自歐洲紫杉之多西他賽(TAXOTERE®,Rhone-Poulenc Rorer)為紫杉醇(TAXOL®,Bristol-Myers Squibb)之半合成類似物。紫杉醇及多西他賽促進自微管蛋白二聚體組裝成微管且藉由防止解聚作用而使微管穩定，此將導致細胞有絲分裂抑制。
"多柔比星"係一種蒽環黴素類抗生素。多柔比星之完整化學名稱為(8S-順)-10-[(3-胺基-2,3,6-三去氧-α-L-來蘇-己吡喃糖基)氧基]-7,8,9,10-四氫-6,8,11-三羥基-8-(羥基乙醯基)-1-甲氧基-5,12-并四苯二酮。
術語"包含Fc區之多肽"係指包含Fc區之多肽，諸如抗體或免疫黏附素(參看本文之定義)。可(例如)在純化多肽期間或藉由重組工程設計編碼多肽之核酸來移除Fc區之C末端離胺酸(根據EU編號系統之殘基447)。因此，根據本發明包含具有Fc區之多肽之組合物可包含具有K447、已移除所有K447之多肽或具有及不具有K447殘基之多肽之混合物。
本發明之組合物及其製造方法
本發明涵蓋包含抗EGFL7抗體及包含編碼抗EGFL7抗體之序列之聚核苷酸的組合物(包括醫藥組合物)。如本文所使用，組合物包含一或多種與EGFL7結合之抗體及/或一或多種包含編碼一或多種與EGFL7結合之抗體之序列的聚核苷酸。此等組合物可另外包含此項技術中熟知之適當載劑，諸如醫藥學上可接受之賦形劑(包括緩衝液)。
本發明亦涵蓋經分離之抗體及聚核苷酸之實施例。本發明亦涵蓋實質上純的抗體及聚核苷酸之實施例。
本發明之抗EGFL7抗體較佳為單株抗體。本發明之範疇內亦涵蓋本文所提供之抗EGFL7抗體之Fab、Fab'、Fab'-SH及F(ab')2片段。此等抗體片段可藉由諸如酶促消化之傳統方式產生，或可藉由重組技術產生。此等抗體片段可為嵌合或人化抗體片段。此等片段可用於達成下文所述之診斷及治療目的。
單株抗體可自實質上均質之抗體群體(亦即包含個別抗體之群體除可能天然存在可以少量存在之突變外其餘均相同)獲得。因此，修飾語"單株"表示並非離散抗體之混合物形式之抗體的特徵。
本發明之抗EGFL7單株抗體可使用最先由Kohler等人，Nature 256：495(1975)描述之融合瘤方法製得，或可藉由重組DNA方法(美國專利第4,816,567號)製得。
在融合瘤方法中，對小鼠或其他適當宿主動物(諸如倉鼠)免疫以誘出產生或能夠產生將與用於免疫之蛋白質特異性結合之抗體的淋巴細胞。一般藉由多次經皮下(sc)或腹膜內(ip)注射EGFL7及佐劑而在動物體內產生抗EGFL7抗體。可使用此項技術中熟知之方法製備EGFL7，某些方法將於本文中進一步描述。舉例而言，下文將描述EGFL7之重組製造。在一實施例中，用含有融合至免疫球蛋白重鏈Fc部分之EGFL7之細胞外域(ECD)的EGFL7衍生物免疫動物。在一實施例中，用EGFL7-IgG1融合蛋白免疫動物。通常使動物對EGFL7與單磷醯脂質A(MPL)/海藻糖二棒狀黴菌酸酯(TDM)(Ribi Immunochem.Research,Inc.,Hamilton,MT)之免疫原性共軛物或衍生物產生免疫且在多個部位皮層內注射溶液。兩週後對動物加強免疫。7至14天對動物取血且檢定血清之抗EGFL7力價。對動物加強免疫直至力價達到平穩階段。
或者，可於活體外免疫淋巴細胞。接著使用適當融合劑(諸如聚乙二醇)使淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合以形成融合瘤細胞(Goding,Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，第59-103頁(Academic Press,1986))。
接種由此製備之融合瘤，並使其在較佳含有一或多種抑制未融合之親代骨髓瘤細胞生長或存活之物質的適當培養基中生長。舉例而言，若親代骨髓瘤細胞缺乏酵素次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT或HPRT)，則用於融合瘤之培養基中通常將包括次黃嘌呤、胺基蝶呤及胸苷(HAT培養基)，該等物質會阻止HGPRT缺陷細胞之生長。
較佳之骨髓瘤細胞為有效融合，使所選抗體產生細胞穩定高量產生抗體且對諸如HAT培養基之培養基敏感之骨髓瘤細胞。其中，較佳之骨髓瘤細胞株為鼠科骨髓瘤株，諸如自購自Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,California USA之MOPC-21及MPC-11小鼠腫瘤及購自American Type Culture Collection,Rockville,Maryland USA之SP-2或X63-Ag8-653細胞獲得之細胞株。亦已描述人類骨髓瘤及小鼠-人類雜交骨髓瘤細胞株用於產生人類單株抗體(Kozbor,J.Immunol.,133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63頁(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。
檢定融合瘤細胞生長於其中之培養基中抗EGFL7之單株抗體的產生。較佳藉由免疫沉澱或藉由活體外結合檢定(諸如放射免疫檢定(RIA)或酶聯結免疫吸附檢定(ELISA))測定由融合瘤細胞產生之單株抗體之結合特異性。
舉例而言，可藉由Munson等人，Anal.Biochem.107：220(1980)之Scatchard分析測定單株抗體之結合親和力。
鑑別產生具有所需特異性、親和力及/或活性之抗體之融合瘤細胞後，可藉由有限稀釋程序次選殖純系並藉由標準方法(Goding,Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，第59-103頁(Academic Press,1986))使其生長。適用於此目的之培養基包括(例如)D-MEM或RPMI-1640培養基。此外，可使融合瘤細胞於活體內以動物體內之腹水腫瘤形式生長。
藉由習知免疫球蛋白純化程序使由次純系分泌之單株抗體與培養基、腹水或血清適當分離，該等純化程序諸如蛋白A-瓊脂糖、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析。
可藉由使用組合文庫篩選具有所需活性之合成抗體純系製得本發明之抗EGFL7抗體。大體上，藉由篩選含有呈現融合噬菌體鞘蛋白之抗體可變區(Fv)之各種片段之噬菌體的噬菌體文庫來選擇合成抗體純系。藉由對抗所欲抗原之親和層析來篩檢此等噬菌體文庫。使表現能夠與所欲抗原結合之Fv片段之純系吸附至該抗原且因此使其與文庫中非結合純系分離。接著將結合純系自該抗原溶離，且可藉由額外之抗原吸附/溶離循環進一步富集。可藉由設計適當之抗原篩選程序選擇所關注之噬菌體純系，隨後使用來自所關注之噬菌體純系之Fv序列及Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991)，第1-3卷中所述之適當恆定區(Fc)序列構築全長抗EGFL7抗體純系來獲得本發明之某些抗EGFL7抗體。
抗體之抗原結合域係由兩個具有約110個胺基酸之可變(V)區形成，兩個可變區分別來自輕鏈(VL)及重鏈(VH)，兩者均存在三個高變環或互補判定區(CDR)。如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.12：433-55(1994)中所述，可使可變域以其中VH與VL經由短的彈性肽共價連接之單鏈Fv(scFv)片段形式或以其中其各自融合至恆定域且非共價相 互作用之Fab片段形式功能性地呈現於噬菌體上。如本文所使用，scFv編碼性噬菌體純系及Fab編碼性噬菌體純共同稱為"Fv噬菌體純系"或"Fv純系"。
可藉由聚合酶鏈反應(PCR)單獨選殖VH及VL基因譜系，且將其隨機重組於噬菌體文庫中，接著可如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.12：433-55(1994)中所述自其中搜索抗原結合純系。來自經免疫來源之文庫提供抗免疫原之高親和力抗體而無需構築融合瘤。或者，可選殖天然譜系以在無任何免疫之情況下提供對抗廣泛範圍之非自體以及自體抗原之人類抗體的單一來源，如Griffiths等人，EMBO J.12：725-34(1993)所述。最後，亦可藉由自幹細胞選殖未經重排之V基因區段且使用含有隨機序列之PCR引子編碼高可變CDR3區並實現活體外重排而合成得到天然文庫，如Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.227：381-88(1992)所述。
使用絲狀噬菌體藉由與少量鞘蛋白pIII融合來呈現抗體片段。抗體片段可以單鏈Fv片段之形式呈現，其中VH與VL結構域經彈性多肽間隔子於相同多肽鏈上連接，(例如)如Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)所述；或以Fab片段形式呈現，其中一條鏈與pIII融合而另一鏈分泌至細菌宿主細胞周質中，在該細胞周質中組裝Fab-鞘蛋白結構，其經由某些野生型鞘蛋白移位而呈現於噬菌體表面上，(例如)如Hoogenboom等人，Nucl.Acids Res.19：4133-37(1991)所述。
大體而言，編碼抗體基因片段之核酸可自由人類或動物採集之免疫細胞獲得。若需要傾向於抗EGFL7純系之文庫，則用EGFL7免疫受檢者來產生抗體反應，且回收脾細胞及/或循環B細胞或其他周邊血液淋巴細胞(PBL)以用於文庫構築。在一較佳實施例中，其藉由在具有功能性人類免疫球蛋白基因陣列(且缺乏功能性內源抗體產生系統)之轉殖基因小鼠體內產生抗人類EGFL7抗體反應，以致於該EGFL7免 疫作用造成產生抗EGFL7人類抗體之B細胞，因而獲得傾向於抗人類EGFL7純系之人類抗體基因片段文庫。下文將描述產生人類抗體之轉殖基因小鼠的產生。
可藉由使用適當篩選程序分離表現EGFL7特異性膜結合抗體之B細胞(例如藉由用EGFL7親和層析分離細胞或使細胞吸附至經螢光染料標記之EGFL7隨後進行流式活化細胞分選(FACS))來獲得抗EGFL7反應性細胞群體之額外富集。
或者，使用未經免疫之供體之脾細胞及/或B細胞或其他PBL提供可能抗體譜系之更佳展示，且亦允許使用EGFL7不具抗原性之任何動物(人類或非人類)物種構築抗體文庫。對於併入活體外抗體基因構築之文庫而言，自受檢者採集幹細胞以提供編碼未經重排之抗體基因區段之核酸。所關注之免疫細胞可自多種動物物種獲得，諸如人類、小鼠、大鼠、兔類、狼、犬科、貓科、豬、牛、馬及鳥類物種等。
自所關注之細胞中回收編碼抗體可變基因區段(包括VH及VL區段)之核酸並使其擴增。在經重排之VH及VL基因文庫之情況下，可藉由自淋巴細胞中分離基因組DNA或mRNA隨後用與經重排VH及VL基因之5'及3'端匹配的引子進行聚合酶鏈反應(PCR)(如Orlandi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：3833-37(1989)所述)，由此製得用於表現之多種V基因譜系，從而獲得所需DNA。可由cDNA及基因組DNA擴增V基因，其中後置引子在編碼成熟V結構域之外顯子的5'端且正向引子在J區段內，如Orlandi等人(1989)及Ward等人，Nature 341：544-46(1989)中所述。然而，對於由cDNA進行擴增，後置引子亦可如Jones等人，Biotechnol.9：88-89(1991)中所述在前導序列之外顯子中，且正向引子如Sastry等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5728-32(1989)中所述在恆定區內。為使互補性最大化，可如Orlandi等人(1989)或Sastry等人(1989)所述將簡並性併入引子中。較佳藉由使用以用以擴 增免疫細胞核酸樣本中所存在之所有可用VH及VL排列之各V基因家族為目標之PCR引子使文庫多樣性最大化，(例如)如Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-97(1991)之方法中所述或如Orum等人，Nucl.Acids Res.21：4491-4498(1993)之方法中所述。對於將經擴增DNA選殖至表現載體中，可如Orlandi等人(1989)中所述在PCR引子內引入稀有限制性位點作為一端之標籤，或如Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)中所述藉由用經標記引子進一步進行PCR擴增引入。
合成性重排之V基因譜系可於活體外自V基因區段獲得。已對大部分人類VH基因區段進行選殖並測序(報導於Tomlinson等人，J.Mol.Biol.227：776-98(1992)中)，且進行定位(報導於Matsuda等人，Nature Genet.3：88-94(1993)中)；可使用此等經選殖區段(包括H1及H2環之所有主要構型)用編碼具有多種序列及長度之H3環的PCR引子產生多種VH基因譜系，如Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.227：381-88(1992)中所述。亦可製得所有序列多樣性集中於單一長度之長H3環中的VH譜系，如Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4457-61(1992)中所述。已對人類Vκ及Vλ區段進行選殖並測序(報導於Williams及Winter,Eur.J.Immunol.23：1456-61(1993)中)且可用其製造合成輕鏈譜系。基於一定範圍之VH與VL折疊及L3與H3長度之合成V基因譜系將編碼具有大量結構多樣性之抗體。擴增V基因編碼DNA後，可根據Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.227：381-88(1992)之方法活體外重排生殖系V基因區段。
可以數種方式藉由將VH與VL基因譜系組合在一起來構築抗體片段譜系。各譜系可在不同載體中產生，且該等載體係於活體外(例如，如Hogrefe等人，Gene 128：119-26(1993)中所述)或於活體內藉由組合感染(例如，如Waterhouse等人，Nucl.Acids Res.21：2265-66(1993)中所述之loxP系統)重組。活體內重組方法利用Fab片段之雙鏈 性質來克服大腸桿菌(E.coli)轉化功率所強加之對於文庫大小之限制。單獨選殖天然VH及VL譜系，將一個選殖至噬菌粒中而另一個選殖至噬菌體載體中。接著藉由含有噬菌粒之細菌的噬菌體感染來組合兩個文庫，從而使各細胞含有不同組合且使文庫大小僅受所存在細胞數量(約1012個純系)限制。兩載體均含有活體內重組信號，從而使VH與VL基因重組於單一複製子上並共包裝於噬菌體病毒粒子中。此等大型文庫提供大量具有良好親和力(Kd-1為約10-8M)之多種抗體。
或者，可相繼將譜系選殖至相同載體中，(例如)如Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：7978-82(1991)中所述；或可藉由PCR將譜系組裝在一起且接著選殖，(例如)如Clackson等人，Nature 352：624-28(1991)中所述。亦可使用PCR組裝將VH及VL DNA與編碼彈性肽間隔子之DNA連接在一起以形成單鏈Fv(scFv)譜系。在另一種技術中，使用"細胞內PCR組裝"藉由PCR將VH與VL基因在淋巴細胞內組合且接著選殖已連接基因之譜系，如Embleton等人，Nucl.Acids Res.20：3831-37(1992)中所述。
由天然文庫產生之抗體(天然或合成)可具有中等親和力(Kd-1為約106至107M-1)，但亦可藉由自次級文庫進行構築並重選而於活體外模擬親和力成熟，如Winter等人(1994)，同上文中所述。舉例而言，可以Hawkins等人，J.Mol.Biol.226：889-96(1992)之方法或Gram等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 89：3576-80(1992)之方法藉由使用易誤聚合酶(報導於Leung等人，Technique 1：11-15(1989)中)於活體外隨機引入突變。此外，可藉由(例如)用具有跨越所關注之CDR之隨機序列的引子使用PCR在所選個別Fv純系中使一或多個CDR隨機突變並篩選較高親和力純系來進行親和力成熟。WO 96/07754(1996年3月14日公開)描述一種誘導免疫球蛋白輕鏈互補判定區突變以建立輕鏈基因文庫的方法。另一有效方法為將由噬菌體呈現所選之VH或VL結構域與自未 經免疫之供體獲得的天然存在之V結構域變異體譜系重組，且以數輪鏈重配置篩選較高親和力者，如Marks等人，Biotechnol.10：779-83(1992)中所述。此技術允許製造親和力在10-9M範圍內之抗體及抗體片段。
可使用EGFL7之所需區域中之胺基酸序列設計編碼EGFL7之核酸序列。或者，可使用cDNA序列(或其片段)。額外EGFL7序列另外揭示於(例如)NM_022963及Xie等人，Cytokine 11：729-35(1999)中。可藉由此項技術中已知之多種方法製備編碼EGFL7之DNA。此等方法包括(但不限於)由Engels等人，Agnew.Chem.Int.Ed.Engl.28：716-34(1989)中所述之任何方法進行之化學合成，諸如三酯、亞磷酸酯、胺基磷酸酯及H-膦酸酯方法。在一實施例中，使用表現宿主細胞優選之密碼子設計EGFL7編碼DNA。或者，可自基因組或cDNA文庫分離編碼EGFL7之DNA。
構築編碼EGFL7之DNA分子後，使DNA分子以可操作方式連接至表現載體(諸如質體)中之表現控制序列，其中控制序列由經載體轉化之宿主細胞識別。一般而言，質體載體含有自可與宿主細胞相容之物種獲得的複製及控制序列。載體通常具有複製位點以及編碼能夠在經轉化細胞中提供表型選擇之蛋白質的序列。此項技術中已知用於在原核及真核宿主細胞中表現之適當載體，且某些載體將在本文中進一步描述。可使用真核生物體(諸如酵母)或自多細胞生物體(諸如哺乳動物)獲得之細胞。
視情況使編碼EGFL7之DNA以可操作方式連接至分泌前導序列而導致宿主細胞將表現產物分泌至培養基中。分泌前導序列之實例包括stII、ecotin、lamB、疱疹GD、lpp、鹼性磷酸酶、轉化酶及α因子。蛋白A之36胺基酸前導序列(Abrahmsen等人，EMBO J.4：3901(1985))亦適用於本文中。
用上文所述之本發明之表現或選殖載體轉染且較佳轉化宿主細胞，並將其培養於經改質以適於誘導啟動子、選擇轉化體或擴增編碼所需序列之基因的習知營養培養基中。
轉染係指實際表現或不表現任何編碼序列之宿主細胞對表現載體之吸收。一般熟習此項技術者已知多種轉染方法，例如CaPO4沉澱及電穿孔。一般當有關此載體操作之任何跡象出現於宿主細胞內時識別轉染成功。此項技術中熟知轉染方法，且某些方法將於本文中進一步描述。
轉化意謂將DNA引入生物體中使得DNA可作為染色體外元件或由染色體成份複製。視所使用之宿主細胞而定，使用適於此等細胞之標準技術進行轉化。此項技術中熟知轉化方法，且某些方法將於本文中進一步描述。
可將用於產生EGFL7之原核宿主細胞如Sambrook等人(同上文)中大體描述進行培養。
可將用於產生EGFL7之哺乳動物宿主細胞培養於此項技術中熟知之多種培養基中，且某些培養基描述於本文中。
本揭示內容中所提及之宿主細胞涵蓋活體外培養物中之細胞以及宿主動物體內之細胞。
可使用技術公認之方法實現對EGFL7之純化。
可使經純化EGFL7附著於用於親和層析分離噬菌體呈現純系之適當基質上，諸如瓊脂糖微珠、丙烯醯胺微珠、玻璃微珠、纖維素、各種丙烯酸系共聚物、甲基丙烯酸羥基酯凝膠、聚丙烯酸及聚甲基丙烯酸系共聚物、耐侖(nylon)、中性及離子性載體及其類似物。可藉由Meth.Enzymol.第44卷(1976)中所述之方法實現EGFL7蛋白附著於基質上。使蛋白配位體附著於多醣基質(例如瓊脂糖、葡聚糖或纖維素)上之常用技術涉及用鹵化氰活化載體且隨後使肽配位體之初級脂族或芳 族胺與經活化基質偶聯。
或者，可將EGFL7用於塗覆吸附培養盤之孔，表現於固定至吸附培養盤上之宿主細胞上或用於細胞分選，或與生物素共軛以用塗覆抗生蛋白鏈菌素之微珠捕捉，或用於篩檢噬菌體呈現文庫之任何其他此項技術中已知之方法中。
使噬菌體文庫樣本與經固定之EGFL7在適於使至少一部分噬菌體顆粒與吸附劑結合之條件下接觸。一般而言，對包括pH值、離子強度、溫度及其類似條件之條件進行選擇以模擬生理條件。洗滌與固相結合之噬菌體，且接著用酸溶離(例如，如Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 88：7978-82(1991)中所述)或用鹼溶離(例如，如Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-97(1991)中所述)或藉由EGFL抗原競爭溶離(例如，以與Clackson等人，Nature 352：624-28(1991)之抗原競爭方法類似之程序)。可在單輪選擇中富集20-1,000倍之噬菌體。此外，可使所富集之噬菌體在細菌培養物中生長並經歷另一輪選擇。
選擇效率視許多因素而定，包括洗滌過程中之解離動力學及單一噬菌體上之多個抗體片段能否同時與抗原接合。具有快速解離動力學(及弱結合親和力)之抗體可藉由使用短時間洗滌、多價噬菌體呈現及抗原於固相中之高塗覆密度予以保留。高密度不僅經由多價相互作用使噬菌體穩定，且亦有利於使已解離之噬菌體再結合。可藉由使用長時間洗滌及單價噬菌體呈現(如Bass等人，Proteins 8：309-14(1990)及WO 92/09690中所述)及低抗原塗覆密度(如Marks等人，Biotechnol.10：779-83(1992)中所述)促進對於具有緩慢解離動力學(及良好結合親和力)之抗體的選擇。
可在對EGFL7具有不同親和力，甚至具有略微不同之親和力之噬菌體抗體之間進行選擇。然而，所選抗體之隨機突變(例如，如上文所述之某些親和成熟技術中進行)可能產生許多突變體，其中大部分 與抗原結合而少數具有較高親和力。使用限制性EGFL7，可競爭淘汰極少之高親和力噬菌體。為保留所有具有較高親和力之突變體，可用過量經結合生物素之EGFL7培育噬菌體，但經結合生物素之EGFL7具有低於EGFL7之恆定目標莫耳親和力之莫耳濃度的濃度。接著可以經抗生蛋白鏈菌素塗覆之順磁微珠捕捉高親和力結合之噬菌體。此"平衡捕捉"使得能夠根據抗體之結合親和力以敏感性選擇抗體，該敏感性允許使具有僅兩倍高親和力之突變體純系與具有較低親和力之大量過量噬菌體分離。亦可操控洗滌與固相結合之噬菌體中所用的條件以基於解離動力學進行區分。抗EGFL7純系亦可根據活性加選擇。
可容易地分離編碼本發明之源自融合瘤之單株抗體或噬菌體呈現Fv純系之DNA，並使用習知程序(例如藉由使用經設計以由融合瘤或噬菌體DNA模板特異性擴增所關注之重鏈及輕鏈編碼區之寡核苷酸引子)進行測序。分離後可將DNA置於表現載體內，接著將表現載體轉染至不會另外產生免疫球蛋白之宿主細胞(諸如大腸桿菌細胞、猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞)中以於重組宿主細胞中獲得所需單株抗體之合成。有關於抗體編碼DNA在細菌中之重組表現之評論論文包括Skerra等人，Curr.Opinion in Immunol.5：256(1993)及Plückthun,Immunol.Rev.130：151(1992)。
可將編碼本發明Fv純系之DNA與已知編碼重鏈及/或輕鏈恆定區之DNA序列(例如適當之DNA序列可由Kabat等人(同上文)獲得)組合以形成編碼全長或部分長度重鏈及/或輕鏈之純系。應瞭解為達成此目的可使用任何同型之恆定區，包括IgG、IgM、IgA、IgD及IgE恆定區，且此等恆定區可由任何人類或動物物種獲得。如本文所使用之定義"嵌合"抗體及"雜交"抗體中包括自一種動物(諸如人類)物種之可變域DNA獲得且接著融合至另一動物物種之恆定區DNA中以形成"雜交"編碼序列(全長重鏈及/或輕鏈)的Fv純系。在一較佳實施例中，自人類 可變DNA獲得之Fv純系係融合至人類恆定區DNA中以形成全人類編碼序列，即全長或部分長度重鏈及/或輕鏈。
舉例而言，亦可藉由以人類重鏈及輕鏈恆定域之編碼序列取代自融合瘤純系獲得之同源鼠科序列(例如，如Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-55(1984)之方法)來修飾編碼本發明之自融合瘤獲得之抗EGFL7抗體的DNA。可藉由使非免疫球蛋白多肽之所有或部分編碼序列與免疫球蛋白編碼序列共價連接來進一步修飾編碼自融合瘤或Fv純系獲得之抗體或片段的DNA。以此方式製備具有本發明之自Fv純系或融合瘤純系獲得之抗體之結合特異性的"嵌合"或"雜交"抗體。
抗體片段
本發明涵蓋抗體片段。在某些情形下，使用抗體片段而非使用整個抗體具有優點。較小尺寸之片段允許迅速清除且可導致對進入實體腫瘤之改良。
已研發出製造抗體片段之多種技術。傳統上，經由蛋白水解消化完整抗體得到此等片段(例如參看Morimoto等人，J.Biochem.Biophys.Meth.24：107-17(1992)及Brennan等人，Science 229：81(1985))。然而，現可藉由重組宿主細胞直接產生此等片段。Fab、Fv及ScFv抗體片段均可表現於大腸桿菌中且由大腸桿菌分泌，由此可容易地產生大量此等片段。可自上文所討論之抗體噬菌體文庫中分離抗體片段。或者，可直接自大腸桿菌回收Fab'-SH片段且使其化學偶聯以形成F(ab')2片段(Carter等人，Bio/Technology 10：163-67(1992))。根據另一方法，可直接自重組宿主細胞培養物中分離F(ab')2片段。具有增加之活體內半衰期的包含補救受體結合抗原決定基殘基之Fab及F(ab')2片段描述於美國專利第5,869,046號中。其他用於產生抗體片段之技術對於熟習此項技術者而言應為顯而易見的。在其他實施例中， 所選擇之抗體為單鏈Fv片段(scFv)。參看WO 93/16185、美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。Fv及sFv為僅有的缺少恆定區但具有完整組合位點之種類；因此，其適於在活體內使用期間達成降低之非特異性結合。可構築sFv融合蛋白來獲得效應蛋白在sFv胺基或羧基末端之融合。參看Antibody Engineering，編輯Borrebaeck,W.H.Freeman and Company(1992)。抗體片段亦可為"線性抗體"，(例如)如美國專利第5,641,870號中所述。此等線性抗體片段可為單特異性或雙特異性。
人化抗體
本發明涵蓋人化抗體。此項技術中已知多種用於人化非人類抗體之方法。舉例而言，人化抗體可具有一或多個由非人類來源引入其中之胺基酸殘基。此等非人類胺基酸殘基通常稱為"輸入"殘基，其通常係自"輸入"可變域取得。可基本上根據Winter及其同事(Jones等人，Nature 321：522-25；Riechmann等人，Nature 332：323-27(1988)；Verhoeyen等人，Science 239：1534-36(1988))之方法藉由以高變區序列取代人類抗體之相應序列進行人化。因此，此等"人化"抗體為嵌合抗體(美國專利第4,816,567號)，其中實質上小於完整人類可變域之序列已經來自非人類物種之相應序列取代。實際上，人化抗體通常為某些高變區殘基及可能某些FR殘基經來自齧齒動物抗體類似位點之殘基取代的人類抗體。
對用於製造人化抗體之人類可變域(輕鏈與重鏈)的選擇對於降低抗原性而言極為重要的。根據所謂之"最佳擬合"方法，對照已知人類可變域序列之完整文庫篩選齧齒動物抗體之可變域序列。接著將與齧齒動物序列最接近之人類序列接受為人化抗體之人類構架(Sims等人，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia等人，J.Mol.Biol.196：901(1987))。另一方法使用自具有特定輕鏈或重鏈子群之所有人類抗體之一致序列獲得的特定構架。相同構架可用於數種不同之人化抗體 (Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：4285(1992)；Presta等人，J.Immunol.,151：2623(1993))。
另外，抗體經人化而保持對抗原之高親和力及其他有利生物學特性極為重要。為達成此目標，根據一種方法，藉由使用親本序列及人化序列之三維模型分析親本序列及各種概念上之人化產物的方法來製備人化抗體。通常可用三維免疫球蛋白模型且其為熟習此項技術者所熟悉。存在描述且呈現所選擇之候選免疫球蛋白序列之大致三維構形結構的電腦程式。此等呈現之檢驗允許分析殘基對候選免疫球蛋白序列之功能可能起到的作用，亦即分析影響候選免疫球蛋白與其抗原結合之能力的殘基。以此方式，可自接受者及輸入序列選擇FR殘基並使其組合，從而達成所需抗體特徵(諸如對目標抗原增加之親和力)。一般而言，對於抗原結合之影響直接且最實質上涉及高變區殘基。
人類抗體
本發明之人類抗EGFL7抗體可藉由將選自源自人類之噬菌體呈現文庫之Fv純系可變域序列與如上所述之已知人類恆定域序列組合來構築。或者，可藉由融合瘤方法製得本發明之人類單株抗EGFL7抗體。用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類雜交骨髓瘤細胞株已由以下文獻描述：例如Kozbor J.Immunol.,133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63頁(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)及Boerner等人，J.Immunol.,147：86(1991)。
現在可產生免疫後能夠在不產生內源免疫球蛋白之情況下產生全人類抗體譜系的轉殖基因動物(例如小鼠)。舉例而言，已描述嵌合及生殖系突變體小鼠中抗體重鏈連接區(JH)基因的純合子缺失導致對於內源抗體產生之完全抑制。將人類生殖系免疫球蛋白基因陣列轉移 至此等生殖系突變體小鼠體內將會於抗原激發後引起人類抗體之產生。例如參看Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA,90：2551(1993)；Jakobovits等人，Nature,362：255(1993)；Bruggermann等人，Year in Immunol.,7：33(1993)。
亦可使用基因改組自非人類(例如齧齒動物)抗體獲得人類抗體，其中人類抗體具有與初始非人類抗體類似之親和力及特異性。根據此方法(亦稱為"抗原決定基印模")，以人類V結構域基因譜系置換藉由如上文所述之噬菌體呈現技術獲得的非人類抗體片段之重鏈或輕鏈可變區，從而產生非人類鏈/人類鏈scFv或Fab嵌合體群體。以抗原進行選擇可導致非人類鏈/人類鏈嵌合scFv或Fab之分離，其中人類鏈恢復移除初級噬菌體呈現純系中之相應非人類鏈時損壞的抗原結合位點，亦即抗原決定基決定(印模)對於人類鏈搭配物之選擇。當重複此過程以置換剩餘非人類鏈時，獲得人類抗體(參看1993年4月1日公開之PCT WO 93/06213)。與傳統藉由CDR移植人化非人類抗體不同，此技術提供不具有非人類來源之FR或CDR殘基的完整人類抗體。
雙特異性抗體
雙特異性抗體為對至少兩種不同抗原具有結合特異性之單株抗體，較佳為人類或人化抗體。在本案中，結合特異性中之一係對於EGFL7而言且另一者係對於任何其他抗原而言。例示性雙特異性抗體可與EGFL7蛋白之兩種不同抗原決定基結合。雙特異性抗體亦可用於將細胞毒性劑定位於表現EGFL7之細胞。此等抗體具有EGFL7結合臂及結合細胞毒性劑(例如沙伯甯(saporin)、抗干擾素-α、長春鹼、蓖麻毒素-A鏈、甲胺喋呤或放射性同位素半抗原)之臂。可製備全長抗體或抗體片段形式之雙特異性抗體(例如F(ab')2雙特異性抗體)。
用於製造雙特異性抗體之方法已為此項技術中所知。傳統上，重組產生雙特異性抗體係基於兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之共同表 現，其中兩條重鏈具有不同特異性(Milstein及Cuello,Nature,305：537(1983))。由於免疫球蛋白重鏈及輕鏈之隨機分配，此等融合瘤(四源雜交瘤)產生10種不同抗體分子之潛在混合物，其中僅一種具有正確雙特異性結構。通常藉由親和層析步驟進行之正確分子之純化相當繁瑣，且產物產率較低。類似程序揭示於1993年5月13日公開之WO 93/08829及Traunecker等人，EMBO J.,10：3655(1991)中。
根據不同且更佳之方法，將具有所需結合特異性(抗體-抗原組合位點)之抗體可變域與免疫球蛋白恆定域序列融合。融合較佳係與包含至少部分鉸鏈區、CH2及CH3區之免疫球蛋白重鏈恆定域之融合。較佳為在至少一種融合中存在含有輕鏈結合所必需之位點之第一重鏈恆定區(CH1)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合體及(若需要)免疫球蛋白輕鏈之DNA插入單獨表現載體中，且將其共轉染至適當之宿主生物體中。在構築時所用三條多肽鏈之不等比率提供最佳產率之實施例中，此使對於三種多肽片段相互比例之調節具有極大靈活性。然而，當至少兩條多肽鏈以相等比率表現產生高產率或當此等比率並非特別重要時，可將兩條或所有三條多肽鏈之編碼序列插入一種表現載體中。
在此方法之一些實施例中，雙特異性抗體係由一臂中具有第一結合特異性之雜交免疫球蛋白重鏈及另一臂中之雜交免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特異性)構成。已發現由於免疫球蛋白輕鏈僅存在於一半雙特異性分子中提供一種簡便之分離方式，故此不對稱結構促進所需雙特異性化合物與非吾人所要之免疫球蛋白鏈組合之分離。此方法揭示於WO 94/04690中。有關產生雙特異性抗體之其他細節，例如參看Suresh等人，Meth.Enzymol,121：210(1986)。
根據另一方法，可工程設計一對抗體分子間之界面以使由重組細胞培養物回收的雜二聚體之百分比最大化。較佳界面包含抗體恆定域之至少一部分CH3結構域。以此方法，使第一抗體分子界面之一或 多條小胺基酸側鏈經較大側鏈(例如，酪胺酸或色胺酸)置換。藉由用較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)置換較大胺基酸側鏈而於第二抗體分子之界面上產生具有與較大側鏈相同或類似尺寸之補償"空穴"。此提供一種使雜二聚體之產率增加超過其他非吾人所要之終產物(諸如均二聚體)的機制。
雙特異性抗體包括交聯或"雜共軛"抗體。舉例而言，雜共軛物中之一抗體可與抗生蛋白偶聯，其他抗體與生物素偶聯。舉例而言，已提出此等抗體以針對非吾人所要細胞之免疫系統細胞為目標(美國專利第4,676,980號)，且用於治療HIV感染(WO 91/00360及WO 92/00373)。可使用任何適宜之交聯方法製造雜共軛抗體。適當之交聯劑已為此項技術中所熟知，且揭示於美國專利第4,676,980號以及大量交聯技術中。
自抗體片段產生雙特異性抗體之技術已描述於文獻中。舉例而言，可使用化學鍵聯製備雙特異性抗體。Brennan等人，Science,229：81(1985)描述一種蛋白水解裂解完整抗體以產生F(ab')2片段之程序。在二硫醇錯合劑亞砷酸鈉存在下還原此等片段以穩定鄰近二硫醇且防止分子間二硫鍵形成。接著將所產生之Fab'片段轉化為硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。接著藉由用巰基乙胺還原將Fab'-TNB衍生物之一再轉化為Fab'-硫醇，且將其與等莫耳量之另一Fab'-TNB衍生物混合以形成雙特異性抗體。所產生之雙特異性抗體可用作用於選擇性固定酵素之試劑。
近期之發展已促進自大腸桿菌直接回收Fab'-SH片段，該等片段可經化學偶聯而形成雙特異性抗體。Shalaby等人，J.Exp.Med.175：217-25(1992)描述完全人化雙特異性抗體F(ab')2分子之產生。大腸桿菌單獨分泌各Fab'片段且使其經歷活體外定向化學偶聯以形成雙特異性抗體。由此形成之雙特異性抗體能夠與過度表現HER2受體之細胞 及正常人類T細胞結合，且亦觸發人類細胞毒性淋巴細胞對人類乳房腫瘤目標之溶解活性。
亦已描述直接由重組細胞培養物製造並分離雙特異性抗體片段之多種技術。舉例而言，已使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體。Kostelny等人，J.Immunol.148(5)：1547-53(1992)。藉由基因融合將來自Fos及Jun蛋白之白胺酸拉鏈肽與兩種不同抗體之Fab'部分連接。在鉸鏈區還原抗體均二聚體以形成單體，且接著使其再氧化以形成抗體雜二聚體。此方法亦可用於產生抗體均二聚體。Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-48(1993)所述之"雙功能抗體"技術已提供一種用於製造雙特異性抗體片段之替代機制。該等片段包含經連接子連接至輕鏈可變域(VL)之重鏈可變域(VH)，該連接子過短而使相同鏈上之兩個結構域之間無法配對。因此，迫使一個片段之VH及VL結構域與另一片段之互補VL及VH結構域配對，藉此形成兩個抗原結合位點。亦已報導另一種藉由使用單鏈Fv(sFv)二聚體來製造雙特異性抗體片段之策略。參看Gruber等人，J.Immunol.152：5368(1994)。
本發明亦涵蓋大於二價之抗體。舉例而言，可製備三特異性抗體。Tutt等人J.Immunol.147：60(1991)。
多價抗體
與二價抗體相比表現與抗體結合之抗原之細胞可更快地內化(及/或異化)多價抗體。本發明之抗體可為具有三個或三個以上抗原結合位點之多價抗體(IgM類別之抗體除外)(例如四價抗體)，多價抗體可容易地藉由重組表現編碼抗體多肽鏈之核酸來製得。多價抗體可包含二聚化結構域及三個或三個以上抗原結合位點。較佳之二聚化結構域包含Fc區或鉸鏈區(或由其組成)。在此情形下，抗體將包含Fc區及三個或三個以上在Fe區胺基末端之抗原結合位點。本文中之較佳多價抗體 包含三至約八個，但較佳四個抗原結合位點(或由其組成)。多價抗體包含至少一條多肽鏈(且較佳兩條多肽鏈)，其中多肽鏈包含兩個或兩個以上可變域。舉例而言，多肽鏈可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1為第一可變域，VD2為第二可變域，Fc為Fc區之一條多肽鏈，X1及X2表示胺基酸或多肽，且n為0或1。舉例而言，多肽鏈可包含VH-CH1-彈性連接子-VH-CH1-Fc區鏈或VH-CH1-VH-CH1-Fc區鏈。本文之多價抗體較佳另外包含至少兩條(且較佳四條)輕鏈可變域多肽。本文之多價抗體可(例如)包含約兩條至約八條輕鏈可變域多肽。本文所涵蓋之輕鏈可變域多肽包含輕鏈可變域且視情形另外包含CL結構域。
抗體變異體
在一些實施例中，本發明涵蓋本文所述之抗體的胺基酸序列修飾。舉例而言，可需要改良抗體之結合親和力及/或其他生物學特性。抗體之胺基酸序列變異體可藉由將適當之核苷酸改變引入抗體核酸中或藉由肽合成來製備。此等修飾包括(例如)抗體胺基酸序列內之殘基缺失及/或插入及/或取代。可進行缺失、插入及取代之任何組合達成最終構築體，只要最終構築體具有所需特徵即可。可在製造序列時將胺基酸變化引入標的抗體胺基酸序列中。
可用於鑑別作為較佳突變位置之抗體之某些殘基或區域的方法稱為"丙胺酸掃描突變"，如Cunningham及Wells,Science,244：1081-85(1989)所述。對此，鑑別殘基或目標殘基之群(例如帶電殘基，諸如arg、asp、his、lys及glu)且將其以中性或負電胺基酸(最佳為丙胺酸或聚丙胺酸)置換以影響胺基酸與抗原的相互作用。接著藉由對取代位點處引入另外或其他變異體來改進彼等對取代展示出功能敏感性之胺基酸位置。因此，儘管已預定引入胺基酸序列變化之位點，但突變本身之性質無需預定。舉例而言，為分析既定位點處突變之效能，在目 標密碼子或區域處進行ala掃描或隨機突變並針對所需活性篩選經表現之免疫球蛋白。
胺基酸序列插入包括長度在一個殘基至含有一百個或更多殘基之多肽之範圍內的胺基末端及/或羧基末端融合以及單一或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N-末端甲硫胺醯基殘基之抗體或融合至細胞毒性多肽之抗體。抗體分子之其他插入變異體包括抗體之N末端或C末端與酵素(例如用於ADEPT)或增加抗體血清半衰期之多肽之融合。
另一類型之抗體胺基酸變異體變化抗體之原始糖基化模式。此變化包括缺失抗體中所存在之一或多個醣部分及/或添加一或多個抗體中不存在之糖基化位點。
多肽之糖基化通常為N連接或O連接。N連接係指醣部分附著於天冬醯胺酸殘基之側鏈。三肽序列天冬醯胺酸-X-絲胺酸及天冬醯胺酸-X-蘇胺酸(其中X為除脯胺酸外之任何胺基酸)為醣部分與天冬醯胺酸側鏈酶促附著之識別序列。因此，多肽中此等三肽序列任一者之存在產生潛在之糖基化位點。O連接糖基化係指糖N-乙醯半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附著至羥基胺基酸，最通常為絲胺酸或蘇胺酸，但亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。
藉由變化胺基酸序列從而使其含有上述三肽序列中之一或多者來便利地實現在抗體中添加糖基化位點(對於N連接糖基化位點而言)。亦可藉由將一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基添加至或取代原始抗體之序列來進行變化(對於O連接糖基化位點而言)。
在抗體包含Fc區之情況下，可變化附著於其上之醣。舉例而言，具有缺乏附著至抗體Fc區之岩藻糖之成熟醣結構的抗體已描述於美國專利申請案第US 2003/0157108號(Presta,L.)中。亦參看US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。附著至抗體Fc區之醣 中具有平分型N-乙醯葡糖胺(GlcNAc)之抗體在WO 2003/011878、Jean-Mairet等人及美國專利第6,602,684號Umaña等人中有所提及。附著至抗體Fc區之寡醣中具有至少一個半乳糖殘基之抗體報導WO 97/30087,Patel等人中。有關具有附著至抗體Fc區之經變化之醣的抗體，亦可參看WO 98/58964(Raju,S.)及WO 99/22764(Raju,S.)。有關具有經修飾糖基化作用之抗原結合分子，亦可參看US 2005/0123546(Umaña等人)。
本文之較佳糖基化變異體包含Fc區，其中附著至Fc區之醣結構缺乏岩藻糖。此等變異體具有經改良之ADCC功能。視情況，Fc區中另外包含一或多處進一步改良ADCC之胺基酸取代，例如Fc區298、333及/或334位(殘基之EU編號)之取代。有關"去岩藻糖化"或"岩藻糖缺陷"抗體之公開案之實例包括：US 2003/0157108、WO 2000/61739、WO 2001/29246、US 2003/0115614、US 2002/0164328、US 2004/0093621、US 2004/0132140、US 2004/0110704、US 2004/0110282、US 2004/0109865、WO 2003/085119、WO 2003/084570、WO 2005/035586、WO 2005/035778、WO2005/053742，Okazaki等人，J.Mol.Biol.336：1239-49(2004)；Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87：614(2004)。產生去海藻糖化抗體之細胞株之實例包括在蛋白質岩藻糖化方面有缺陷之Lec13 CHO細胞(Ripka等人，Arch.Biochem.Biophys.249：533-45(1986)；美國專利申請案第US 2003/0157108 A1號，Presta,L及WO 2004/056312 A1,Adams等人，尤其是實例11)及基因剔除細胞株，諸如α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因(FUT8)基因剔除CHO細胞(Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87：614(2004))。
另一類型之變異體為胺基酸取代變異體。此等變異體在抗體分子中具有至少一種經不同殘基置換之胺基酸殘基。最引人關注之取代 突變位點包括高變區，但亦涵蓋FR變化。表1中標題"較佳取代"下展示保守型取代。若此等取代導致生物活性改變，則可引入表1中命名為"例示性取代"或如下文參考胺基酸類別進一步描述之更具實質性之改變且篩選產物。
對抗體生物學特性之實質修飾可藉由選擇取代來實現，該等取代在其維持以下各物之作用方面顯著不同：(a)取代區域中多肽骨架之結構，例如折疊或螺旋構形；(b)分子目標位點處之電荷或疏水性；或(c)側鏈體積。可基於共同側鏈特性將天然存在之殘基分組：(1)疏水性：正白胺酸、met、ala、val、len、ile； (2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：asp、glu；(4)鹼性：his、lys、arg；(5)影響鏈定向之殘基：gly、pro；及(6)芳族：trp、tyr、phe。
非保守型取代將需要此等類別之一之成員與另一類別交換。
一種類型之取代變異體涉及取代親本抗體(例如人化抗體或人類抗體)之一或多個高變區殘基。一般而言，選擇用於進一步研究之所得變異體應相對於產生其之親本抗體具有經改良之生物學特性。一種用於產生此等取代變異體之適宜方式涉及使用噬菌體呈現進行之親和力成熟。簡而言之，使數個高變區位點(例如6-7個位點)突變，於各位點處產生所有可能之胺基酸取代。當融合至包裝於各絲狀噬菌體顆粒內之M13之基因III產物時，由絲狀噬菌體顆粒呈現由此產生之抗體。接著針對如本文所揭示之抗體之生物學活性(例如結合親和力)篩選噬菌體呈現之變異體。為鑑別用於修飾之候選高變區位點，可進行丙胺酸掃描突變以鑑別顯著有助於抗原結合之高變區殘基。另外或其他，其可有益於分析抗原-抗體複合物之晶體結構以鑑別抗體與抗原之間的接觸點。此等接觸殘基及相鄰殘基為根據本文詳述之技術進行取代之候選物。在產生此等變異體後，如本文所述使變異體組合經歷篩選，且可在一或多個相關檢定中選擇具有優良特性之抗體用於進一步研究。
編碼抗體胺基酸序列變異體之核酸分子可藉由此項技術中已知之多種方法製備。此等方法包括(但不限於)自天然來源分離(在天然存在之胺基酸序列變異體之情況下)或藉由先前製備之抗體之變異體或非變異體型式的寡核苷酸介導(或定點)突變、PCR突變及盒式突變來製備。
可需要將一或多處胺基酸修飾引入本發明之免疫球蛋白多肽之Fc區中，藉此產生Fc區變異體。Fc區變異體可包含在一或多個胺基酸位置(包括鉸鏈半胱胺酸位置)處包含胺基酸修飾(例如取代)之人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。
根據本說明及此項技術之教示，預期在一些實施例中與野生型對應物抗體相比本發明之方法中所使用之抗體可包含一或多處(例如)Fc區中之變化。然而，此等抗體將保留與其野生型對應物相比實質上相同之治療效用所需特徵。舉例而言，據認為可於Fc區中進行將引起C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)變化(亦即改良或降低)之某些變化，(例如)如WO 99/51642中所述。有關Fc區變異體之其他實例，亦可參看Duncan及Winter Nature 322：738-40(1988)；美國專利第5,648,260號、美國專利第5,624,821號及WO 94/29351。WO 00/42072(Presta)及WO 2004/056312(Lowman)描述與FcR之結合經改良或經降低之抗體變異體。此等專利公開案之內容以引用之方式明確地併入本文中。亦參看Shields等人J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)。US2005/0014934A1(Hinton等人)中描述具有增加之半衰期及經改良之與新生兒Fc受體(FcRn)之結合的抗體，其中FcRn負責將母體IgG轉移至胎兒體內(Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等人，J.Immunol.24：249(1994))。此等抗體包含具有一或多處改良Fc區與FcRn之結合之取代的Fc區。具有變化之Fc區胺基酸序列及增加或降低之C1q結合能力之多肽變異體描述於美國專利第6,194,551B1號、WO 99/51642中。彼等專利公開案之內容以引用之方式明確地併入本文中。亦參看Idusogie等人J.Immunol.164：4178-84(2000)。
抗體衍生物
可進一步修飾本發明之抗體使其含有此項技術中已知且可易於獲得之額外非蛋白部分。適於衍生抗體之部分較佳為水溶性聚合物。 水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及葡聚糖或聚(N-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛因其於水中之穩定性而可於製造時具有優點。聚合物可具有任何分子量，且可具支鏈或不具支鏈。附著於抗體之聚合物的數目可變化，且若附著一種以上聚合物，則它們可為相同或不同分子。一般而言，用於衍生作用之聚合物之數目及/或類型可基於包括(但不限於)待改良抗體之特殊特性或功能，抗體衍生物是否將用於指定條件下之療法等考慮來確定。
篩選具有所需特性之抗體
本發明之抗體與EGFL7結合，且在一些實施例中可調節一或多個與EGFL7相關作用之態樣，包括(但不限於)破壞任何生物學相關之EGFL7生物路徑，及/或治療及/或預防腫瘤、細胞增生性病症或癌症，及/或治療或預防與EGFL7表現及/或活性(諸如增加之EGFL7表現及/或活性)相關之病症。舉例而言，如本文所述可針對抗體阻斷HUVEC細胞與EGFL7黏附及HUVEC於經EGFL7蛋白塗覆之培養盤上遷移之能力篩選本發明之抗體。
可將經純化之抗體另外藉由一系列檢定表徵，該等檢定包括(但不限於)N末端測序、胺基酸分析、非變性尺寸排除高壓液相層析(HPLC)、質譜法、離子交換層析及木瓜酵素消化。
在本發明之某些實施例中，分析本文所製造之抗體之生物活性。在一些實施例中，測試本發明抗體之抗原結合活性。此項技術中已知且可用於本文中之抗原結合檢定包括(但不限於)使用諸如西方墨點法之技術進行的任何直接或競爭性結合檢定、放射免疫檢定、 ELISA(酶聯結免疫吸附劑檢定)、"夾層"免疫檢定、免疫沉澱檢定、螢光免疫檢定及蛋白A免疫檢定。下文之實例部分中提供說明性抗原結合檢定。
在一些實施例中，本發明提供一種與包含如下輕鏈可變域及如下重鏈可變域之抗體競爭與EGFL7結合的抗EGFL7抗體，該輕鏈可變域包含選自SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：3之序列且該重鏈可變域包含選自SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：4之序列。可藉由針對與包含如下輕鏈可變域及如下重鏈可變域之經標記抗體競爭與固定EGFL7之結合篩選抗EGFL7融合瘤上清液來獲得此等競爭抗體，該輕鏈可變域包含選自SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：3之序列且該重鏈可變域包含選自SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：4之序列。此等競爭抗體包括識別與該抗體所識別之EGFL7抗原決定基相同或與其重疊之EGFL7抗原決定基的抗體。與含有不相關(或無)抗體之對照結合混合物中所偵測之已結合、經標記抗體的量相比較，含有競爭劑抗體之融合瘤上清液將降低標的競爭結合混合物中所偵測之已結合、經標記抗體的量。本文所述之任何競爭性結合檢定均適用於前述程序。
可以任何適宜之方法藉由針對所需特性篩選抗EGFL7融合瘤純系來獲得具有本文所述之特性的本發明之抗EGFL7抗體。舉例而言，若需要與包含如下輕鏈可變域及如下重鏈可變域之抗體競爭或不與其競爭與EGFL7結合之抗EGFL7單株抗體，其中該輕鏈可變域包含選自SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：3之序列且該重鏈可變域包含選自SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：4之序列，則可於結合競爭性檢定中測試候選抗體。此項技術中熟知競爭性檢定。
此項技術中已知測定抗EGFL7抗體之抑制能力的其他功能性檢定，某些檢定將在本文中例示說明。
在一些實施例中，本發明涵蓋已變化之抗體，其具有某些但並 非所有效應功能，此使其成為抗體在活體內之半衰期極為重要而某些效應功能(諸如補體及ADCC)卻並非必需或有害之多種應用中的合乎需要之候選物。在某些實施例中，量測所產生之免疫球蛋白之Fc活性以確保僅所需特性得以保持。可進行活體外及/或活體內細胞毒性檢定以確認CDC及/或ADCC活性之降低/衰竭。舉例而言，可進行Fc受體(FcR)結合檢定以確保抗體缺乏FcγR結合(由此可能缺乏ADCC活性)但仍保留FcRn結合能力。介導ADCC之初級細胞(NK細胞)僅表現FcRIII，而單核細胞表現FcRI、FcRII及FcRIII。造血細胞上之FcR表現概述於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)第464頁之表3中。評定所關注分子之ADCC活性之活體外檢定之實例描述於美國專利第5,500,362號或第5,821,337號中。可用於此等檢定之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及天然殺傷(NK)細胞。另外或其他，可(例如)在動物模型(諸如Clynes等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)中所揭示之動物模型)中於活體內評定所關注分子之ADCC活性。亦可進行C1q結合檢定以確認抗體無法與C1q結合且因此缺乏CDC活性。對於評定補體活化，可進行CDC檢定，(例如)如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Meth.202：163(1996)中所述。亦可使用此項技術中已知之方法進行FcRn結合及活體內清除/半衰期測定。
在一些實施例中，本發明提供具有增強之效應功能及/或增加之半衰期之經變化抗體。
載體、宿主細胞及重組方法
為重組產生本發明之抗體，分離編碼該抗體之核酸且將其插入可複製之載體中用於進一步選殖(DNA之擴增)或表現。容易地分離編碼抗體之DNA且使用習知程序(例如藉由使用能夠與編碼抗體重鏈及輕鏈之基因特異性結合的寡核苷酸探針)進行測序。多種載體均可 用。載體之選擇部分上視所使用之宿主細胞而定。一般而言，較佳之宿主細胞為原核或真核(一般為哺乳動物)來源。應瞭解為達成此目的可使用任何同型之恆定區，包括IgG、IgM、IgA、IgD及IgE恆定區，且此等恆定區可由任何人類或動物物種獲得。
a.使用原核宿主細胞產生抗體
i.載體構築
可使用標準重組技術獲得編碼本發明抗體之多肽組份的聚核苷酸序列。可自產生抗體之細胞(諸如融合瘤細胞)中分離所需聚核苷酸序列並進行測序。或者，可使用核苷酸合成器或PCR技術合成聚核苷酸。在獲得編碼多肽之序列後，將其插入能夠在原核宿主中複製並表現異源聚核苷酸之重組載體中。對於本發明而言可使用可用且為此項技術中所知之多種載體。對於適當載體之選擇將主要視插入載體中之核酸的大小及經載體轉化之特定宿主細胞而定。各載體視其功能(異源聚核苷酸擴增或表現或兩者)及其與其所滯留之特定宿主細胞的相容性而定含有多種組份。載體組份一般包括(但不限於)複製起點、選擇標記基因、啟動子、核糖體結合位點(RBS)、信號序列、異源核酸插入物及轉錄終止序列。
一般而言，與此等宿主一起使用含有自與宿主細胞相容的物種獲得之複製子及控制序列的質體載體。載體通常具有複製位點以及能夠於經轉化細胞中提供表型選擇之標記序列。舉例而言，通常使用pBR322(一種自大腸桿菌物種獲得之質體)轉化大腸桿菌。pBR322含有編碼安比西林(ampicillin)(Amp)及四環素(tetracycline)(Tet)抗性之基因，且因此提供簡便的鑑別經轉化細胞之方式。pBR322、其衍生物或其他微生物質體或噬菌體亦可含有或經修飾而含有可由微生物生物體用於表現內源蛋白之啟動子。用於表現特定抗體之pBR322衍生物之實例詳細描述於Carter等人之美國專利第5,648,237號中。
此外，可與此等宿主一起使用含有與宿主微生物相容之複製子及控制序列的噬菌體載體作為轉化載體。舉例而言，諸如λGEMTM-11之噬菌體可用於製造可用以轉化易感宿主細胞(諸如大腸桿菌LE392)之重組載體。
本發明之表現載體可包含兩種或兩種以上編碼各多肽組份之啟動子-順反子對。啟動子為位於調節其表現之順反子上游(5')之未經轉譯之調控序列。原核啟動子通常分為兩類，亦即誘導型及組成型。誘導型啟動子為在其對培養條件之改變(例如養分存在與否或溫度改變)作出回應之控制下起始順反子以增加量轉錄之啟動子。
大量可由多種潛在宿主細胞所別之啟動子已為吾人所熟知。可藉由經限制酶消化將所選擇之啟動子自源DNA移除且將所分離之啟動子序列插入本發明之載體中而使該啟動子以可操作方式連接至編碼輕鏈或重鏈之順反子DNA。可使用天然啟動子序列與多種異源啟動子指導目標基因之擴增及/或表現。在一些實施例中，因與天然目標多肽啟動子相比，異源啟動子一般允許經表現之目標基因達成較快轉錄及較高產率，故而使用異源啟動子。
適用於原核宿主之啟動子包括phoA啟動子、β-半乳聚糖酶及乳糖啟動子系統、色胺酸(trp)啟動子系統及雜合啟動子(諸如tac或trc啟動子)。然而，在細菌中具有功能性之其他啟動子(諸如其他已知之細菌或噬菌體啟動子)亦適用。其核苷酸序列已經公佈，藉此熟習此項技術者能夠使用提供任何所需限制位點之連接子或轉接子以可操作方式將其與編碼目標輕鏈及重鏈之順反子接合(Siebenlist等人，Cell 20：269(1980))。
在本發明之一態樣中，重組載體內之各順反子均包含引導經表現之多肽跨膜移位之分泌信號序列組份。一般而言，信號序列可為載體之組份，或其可為插入載體中之目標多肽DNA之部分。出於本發明 之目的所選擇之信號序列應為可由宿主細胞識別及處理(亦即由信號肽酶裂解)之信號序列。對於不識別及處理異源多肽之天然信號序列的原核宿主細胞而言，信號序列經(例如)選自由以下各物組成之群之原核信號序列取代：鹼性磷酸酶、青黴素酶、Ipp或熱穩定性腸毒素II(STII)前導序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA及MBP。在本發明之一實施例中，用於表現系統之兩種順反子中之信號序列為STII信號序列或其變異體。
在另一態樣中，本發明之免疫球蛋白的產生可於宿主細胞之細胞質中發生，且因此無需各順反子內均存在分泌信號序列。就此而言，免疫球蛋白之輕鏈及重鏈皆係在細胞質內表現、折疊並組裝形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株(例如大腸桿菌trxB -菌株)提供有利於二硫鍵形成之細胞質條件，藉此允許適當折疊及組裝經表現之蛋白次單元。Proba及Plückthun,Gene 159：203(1995)。
適於表現本發明抗體之原核宿主細胞包括古細菌(Archaebacteria)及真細菌(Eubacteria)，諸如革蘭氏陰性(Gram-negative)或革蘭氏陽性生物體。適用細菌之實例包括埃希氏菌(Escherichia)(例如大腸桿菌)、桿菌(Bacilli)(諸如枯草桿菌(B.subtilis))、腸內菌(Enterobacteria)、假單胞菌(Pseudomonas)物種(例如綠膿桿菌(P.aeruginosa))、鼠傷寒沙門桿菌(Salmonella typhimurium)、黏質沙雷氏菌(Serratia marcescens)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、變形桿菌(Proteus)、志賀桿菌(Shigella)、根瘤菌(Rhizobia)、透明顫菌(Vitreosculla)或副球菌(Paracoccus)。在一些實施例中，使用革蘭氏陰性細胞。在一些實施例中，將大腸桿菌細胞用作本發明之宿主。大腸桿菌菌株之實例包括W3110菌株(Bachmann,Cellular and Molecular Biology，第2卷(Washington,D.C.：American Society for Microbiology,1987)，第1190-1219頁；ATCC®寄存號27,325)及其衍生物，包括具有 基因型W3110 △fhuA(△tonA)ptr3 lac Iq lacL8 △ompT△(nmpc-fepE)degP41 kanR之33D3菌株(美國專利第5,639,635號)。其他菌株及其衍生物，諸如大腸桿菌294(ATCC® 31,446)、大腸桿菌B、大腸桿菌λ 1776(ATCC® 31,537)及大腸桿菌RV308(ATCC® 31,608)亦適用。此等實例係出於說明而非限制之目的。用於構築任何具有指定基因型之上文所述細菌之衍生物的方法已為此項技術中所知且描述於(例如)Bass等人，Proteins,8：309-14(1990)中。一般需要考慮複製子在細菌細胞中之可複製性來選擇適當之細菌。舉例而言，當使用熟知之質體(諸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410)提供複製子時，大腸桿菌、沙雷氏菌(Serratia)或沙門氏菌(Salmonella)物種可適於用作宿主。一般而言，宿主細胞應分泌最低量蛋白水解酶，且可適宜地將額外之蛋白酶抑制劑併入細胞培養物中。
ii.抗體產生
用上述表現載體轉化宿主細胞，並將其培養於經改質以適於誘導啟動子、選擇轉化體或擴增編碼所需序列之基因的習知營養培養基中。
轉化意謂將DNA引入原核宿主中使得DNA可作為染色體外元件或由染色體成份複製。視所使用之宿主細胞而定，使用適於此等細胞之標準技術進行轉化。使用氯化鈣進行鈣處理一般用於含有實質細胞壁障壁之細菌細胞。另一轉化方法採用聚乙二醇/DMSO。所使用之另一技術為電穿孔。
使用於產生本發明多肽之原核細胞在此項技術中已知且適於培養所選擇之宿主細胞的培養基中生長。適當培養基之實例包括加有必需養分補充物之Luria肉湯(LB)。在一些實施例中，培養基亦含有基於表現載體之構造而選擇之選擇劑，其用以選擇性允許含有表現載體之原核細胞生長。舉例而言，將安比西林添加至培養基中以使表現安 比西林抗性基因之細胞生長。
亦可包括單獨或以與另一種補充物或培養基之混合物(諸如複合氮源)之形式以適當濃度引入的除碳、氮及無機磷酸鹽來源外之任何必需補充物。視情況，培養基可含有一或多種選自由以下各物組成之群的還原劑：麩胱甘肽、半胱胺酸、胱胺、巰基乙酸酯、二硫赤藻糖醇及二硫蘇糖醇。
將原核宿主細胞在適當溫度下培養。對於大腸桿菌之生長而言，例如一般使用在約20℃至約39℃範圍內之溫度，通常為約25℃至約37℃，例如約30℃。培養基之pH值可主要視宿主生物體而定為約5至約9範圍內之任何pH值。對於大腸桿菌而言，pH值一般為約6.8至約7.4，且通常為約7.0。
若在本發明之表現載體中使用誘導型啟動子，則在適於該啟動子活化之條件下誘導蛋白表現。在本發明之一態樣中，使用phpA啟動子控制多肽之轉錄。因此，將經轉化之宿主細胞培養於磷酸鹽限制性培養基中以用於誘導。磷酸鹽限制性培養基一般為C.R.A.P培養基(例如參看Simmons等人，J.Immunol.Meth.263：133-47(2002))。如此項技術中已知，可根據所使用之載體構築體使用多種其他誘導物。
在一實施例中，本發明之經表現多肽經分泌至宿主細胞周質中且自周質將其回收。蛋白回收通常涉及一般藉由諸如滲壓震擾、超音波處理或溶解之方式分裂微生物。分裂細胞後，可藉由離心或過濾移除細胞碎片或整個細胞。可進一步(例如)藉由親和樹脂層析純化蛋白質。或者，可將蛋白質轉移至培養基中並於其中進行分離。可將細胞自培養物中移除，並過濾培養物上清液且濃縮以進一步純化所產生之蛋白質。可進一步分離經表現之多肽且使用諸如聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)及西方墨點檢定之通常已知的方法加以鑑別。
在本發明之一態樣中，藉由醱酵方法來進行大量抗體之製造。 可使用多種大規模饋料分批醱酵程序製造重組蛋白。大規模醱酵具有至少1,000公升之容量，較佳約1,000至100,000公升之容量。此等醱酵罐使用攪拌器葉輪分配氧氣及養分，尤其是葡萄糖(常用碳/能量源)。小規模醱酵一般係指在不大於約100公升之容量且可在約1公升至約100公升範圍內之醱酵罐中進行的醱酵。
在醱酵過程中，通常在細胞已於適當條件下生長至所需密度(例如OD550為約180至220)後起始對於蛋白表現之誘導，在該階段細胞係處於穩定期早期。如此項技術中已知且如上文所述，可根據所使用之載體構築體使用多種誘導物。可於誘導前使細胞生長一段較短之時間。儘管可使用較長或較短之誘導時間，但通常誘導細胞歷經約12至50個小時。
為改良本發明多肽之產率及品質，可改變多種醱酵條件。舉例而言，為改良經分泌抗體多肽之適當組裝及折疊，可使用過度表現伴隨蛋白之額外載體共轉化宿主原核細胞，該等伴隨蛋白諸如Dsb蛋白(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD及/或DsbG)或FkpA(具有伴隨活性之肽基脯胺醯基順反異構酶)。已證實伴隨蛋白促進細菌宿主細胞中所產生之異源蛋白之適當折疊及溶解性。Chen等人，J Bio Chem 274：19601-05(1999)；Georgiou等人，美國專利第6,083,715號；Georgiou等人，美國專利第6,027,888號；Bothmann及Plückthun J.Biol.Chem.275：17100-05(2000)；Ramm及Plückthun J.Biol.Chem.275：17106-13(2000)；Arie等人，Mol.Microbiol.39：199-210(2001)。
為使經表現異源蛋白(尤其對於蛋白水解敏感之蛋白)之蛋白水解降至最低，可將某些蛋白水解酶缺陷性宿主菌株用於本發明中。舉例而言，可修飾宿主細胞菌株以實現編碼已知細菌蛋白酶(諸如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其組合)之基因的基因突變。可使用某些大腸桿菌蛋白酶缺陷菌株 且其描述於(例如)Joly等人，(1998)，同上文；Georgiou等人，美國專利第5,264,365號；Georgiou等人，美國專利第5,508,192號；Hara等人，Microbial Drug Resistance,2：63-72(1996)中。
在一實施例中，使用經過度表現一或多種伴隨蛋白之質體轉化的蛋白水解酶缺陷性大腸桿菌菌株作為本發明之表現系統中的宿主細胞。
iii.抗體純化
可使用此項技術中已知之標準蛋白純化方法。下述程序為例示性適當純化程序：免疫親和管柱或離子交換管柱分級分離、乙醇沉澱、逆相HPLC、矽石或陽離子交換樹脂(諸如DEAE)層析、層析聚焦、SDS-PAGE、硫酸銨沉澱及使用(例如)Sephadex G-75之凝膠過濾。
在一態樣中，將固定於固相上之蛋白A用於本發明之全長抗體產物的免疫親和純化。蛋白A為來自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)之41kD細胞壁蛋白，其以高親和力與抗體之Fc區結合。Lindmark等人，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983)。固定蛋白A之固相較佳為包含玻璃或矽石表面之管柱，更佳為受控微孔玻璃管柱或矽酸管柱。在一些應用中，管柱經諸如甘油之試劑塗覆以力圖防止污染物之非特異性黏附。
作為純化之第一步驟，可將如上文所述自細胞培養物獲得之製備物塗覆於固定蛋白A之固相上以使所關注抗體與蛋白A特異性結合。接著洗滌固相以移除與固相非特異性結合之污染物。最後，藉由溶離自固相回收所關注之抗體。
b.使用真核宿主細胞產生抗體
載體組份一般包括(但不限於)一或多種以下組份：信號序列、複製起點、一或多個標記基因、增強子元件、啟動子及轉錄終止序列。
(i)信號序列組份
用於真核宿主細胞中之載體亦可含有信號序列或在所關注之成熟蛋白或多肽之N末端具有特異性裂解位點的其他多肽。所選擇之異源信號序列較佳為可由宿主細胞識別及處理(亦即由信號肽酶裂解)之信號序列。在哺乳動物細胞表現中，可用哺乳動物信號序列以及病毒分泌前導序列，例如單純疱疹gD信號。
此前驅區之DNA在閱讀框架中與編碼抗體之DNA接合。
(ii)複製起點
一般而言，哺乳動物表現載體無需複製起點組份。舉例而言，通常可使用SV40起點僅係因為其含有早期啟動子。
(iii)選擇基因組份
表現及選殖載體可含有選擇基因，亦稱為可選標記物。典型之選擇基因編碼具有以下功能之蛋白質(a)賦予對於抗生素或其他毒素(例如安比西林、新黴素(neomycin)、甲胺喋呤或四環素)之抗性；(b)補充營養缺陷(在相關時)；或(c)提供不能自複合培養基獲得之關鍵養分。
選擇流程之一實例係利用藥物使宿主細胞之生長停滯。經異源基因成功轉化之彼等細胞可產生呈現藥物抗性之蛋白質且因此在該選擇方案中存活。此顯性選擇之實例使用藥物新黴素、黴酚酸及濕黴素(hygromycin)。
適用於哺乳動物細胞之可選標記物的另一實例為使得能夠鑑別能夠吸收抗體核酸之細胞的可選標記物，諸如DHFR、胸苷激酶、金屬硫蛋白-I及II(較佳為靈長類動物金屬硫蛋白基因)、腺苷脫胺酶、鳥胺酸脫羧酶等。
舉例而言，首先藉由在含有甲胺喋呤(Mtx)(DHFR之競爭性拮抗劑)之培養基中培養所有轉化體來鑑別經DHFR選擇基因轉化的細胞。 當使用野生型DHFR時，其中一種適當之宿主細胞為缺失DHFR活性之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株(例如ATCC® CRL-9096)。
或者，可藉由在含有針對可選標記物之選擇劑(諸如胺基糖苷抗生素，例如康黴素(kanamycin)、新黴素或G418)的培養基中進行細胞生長來選擇經編碼抗體、野生型DHFR蛋白及另一可選標記物(諸如胺基糖苷3'-磷酸轉移酶(APH))之DNA序列轉化或共轉化之宿主細胞(尤其是含有內源DHFR之野生型宿主)。參看美國專利第4,965,199號。
(iv)啟動子組份
表現及選殖載體通常含有由宿主生物體識別且以可操作方式連接至抗體多肽核酸之啟動子。已知用於真核生物之啟動子序列。實際上所有真核基因均具有位於轉錄起始位點上游大約25至30個鹼基處之富AT區。另一可見於多種基因之轉錄起始點上游70至80個鹼基處之序列為CNCAAT區(SEQ ID NO：19)，其中N可為任何核苷酸。在大部分真核基因之3'端為AATAAA序列(SEQ ID NO：20)，其可為將聚A尾添加至編碼序列3'端之信號。所有此等序列均適於插入至真核表現載體中。
哺乳動物宿主細胞中自載體之抗體多肽轉錄(例如)受自病毒(諸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、反轉錄病毒、B型肝炎病毒及猿病毒40(SV40))基因組，自異源哺乳動物啟動子(例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子)，自熱休克啟動子獲得的啟動子控制，其限制條件為此等啟動子與宿主細胞系統相容。
SV40病毒之早期及晚期啟動子係以亦含有SV40病毒複製起點之SV40限制片段形式便利獲得。人類巨細胞病毒之立即早期啟動子係以HindIII E限制片段形式便利獲得。使用牛乳頭狀瘤病毒作為載體於哺乳動物宿主中表現DNA之系統揭示於美國專利第4,419,446號中。 對於此系統之修飾描述於美國專利第4,601,978號中。或者，可使用勞斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)之長末端重複序列作為啟動子。
(v)增強子元件組份
由較高等真核生物對編碼本發明抗體多肽之DNA的轉錄通常可藉由將增強子序列插入載體中來增加。現已知多種來自哺乳動物基因(血球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白及胰島素)之增強子序列。然而，吾人通常將使用來自真核細胞病毒之增強子。實例包括複製起點(bp 100-270)後側之SV40增強子、巨細胞病毒早期啟動子增強子、複製起點後側之多瘤病毒增強子及腺病毒增強子。關於用於活化真核啟動子之增強元件，亦可參看Yaniv,Nature 297：17-18(1982)。可將增強子在抗體多肽編碼序列之5'或3'位置處剪接至載體中，但其較佳位於啟動子之5'位置處。
(vi)轉錄終止組份
用於真核宿主細胞中之表現載體通常亦含有終止轉錄及穩定mRNA所必需之序列。此等序列通常可自真核或病毒DNA或cDNA之5'且有時3'非轉譯區獲得。此等區含有轉錄為編碼抗體之mRNA之非轉譯部分中之多聚腺嘌呤化片段的核苷酸區段。一種適用之轉錄終止組份為牛生長激素多聚腺嘌呤化區。參看WO 94/11026及其中所揭示之表現載體。
(vii)宿主細胞之選擇及轉化
適用於選殖或表現本文載體中之DNA之宿主細胞包括本文所述之較高等真核生物細胞，包括脊椎動物宿主細胞。使脊椎動物細胞在培養物(組織培養物)中繁殖已成為一種常規程序。適用之哺乳動物宿主細胞株之實例為經SV40轉化之猴腎CV1細胞株(COS-7,ATCC® CRL 1651)、人類胚腎細胞株(293細胞或經次選殖在懸浮液培養物中生長之293細胞，Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977))、幼倉鼠腎細胞 (BHK,ATCC® CCL 10)、中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))、小鼠塞利特氏細胞(mouse sertoli cell)(TM4,Mather,Biol.Reprod.23：243-251(1980))、猴腎細胞(CV1 ATCC® CCL 70)、非洲綠猴腎細胞(VERO-76,ATCC® CRL-1587)、人類宮頸癌細胞(HELA,ATCC® CCL 2)、犬科腎細胞(MDCK,ATCC® CCL 34)、水牛鼠肝細胞(buffalo rat liver cell)(BRL 3A,ATCC® CRL 1442)、人類肺細胞(W138,ATCC® CCL 75)、人類肝細胞(Hep G2,HB 8065)、小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562,ATCC® CCL51)、TRI細胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))、MRC5細胞、FS4細胞及人類肝腫瘤細胞株(Hep G2)。
用上述用於產生抗體之表現或選殖載體轉化宿主細胞，並將其培養於經改質以適於誘導啟動子、選擇轉化體或擴增編碼所需序列之基因的習知營養培養基中。
(viii)培養宿主細胞
可將用於產生本發明抗體之宿主細胞培養於多種培養基中。諸如Ham's F10(Sigma)、最低必需培養基(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)及杜貝卡氏經改質伊格氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)，Sigma)之市售培養基均適於培養宿主細胞。此外，可使用以下文獻中所述之任何培養基作為宿主細胞之培養基：Ham等人，Meth.Enzymol.58：44(1979)；Barnes等人，Anal.Biochem.102：255(1980)；美國專利第4,767,704號、第4,657,866號、第4,927,762號、第4,560,655號或第5,122,469號，WO 90/03430、WO 87/00195或美國專利參考30,985。任何此等培養基均可視需要補充激素及/或其他生長因子(諸如胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣、鎂及磷酸鹽)、緩衝液(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷及胸苷)、抗生素(諸如GENTAMYCINTM藥物)、示蹤元素(定義為 無機化合物，通常以在微莫耳範圍內之最終濃度存在)及葡萄糖或等效能源。亦可包括將為熟習此項技術者所知之適當濃度的任何其他必需補充物。培養條件(諸如溫度、pH值及其類似條件)為選擇用於表現之宿主細胞先前所使用之條件且對於一般技術者為顯而易見的。
(ix)抗體純化
當使用重組技術時，抗體可於細胞內產生或經直接分泌至培養基中。若抗體於細胞內產生，則作為第一步驟，例如藉由離心或超濾移除宿主細胞或已溶解片段之顆粒碎片。在抗體經分泌至培養基中之情形下，通常首先使用市售蛋白濃縮過濾器(例如Amicon或Millipore Pellicon超濾裝置)濃縮來自此等表現系統之上清液。任何前述步驟中均可包括蛋白酶抑制劑(諸如PMSF)以抑制蛋白水解且可包括抗生素以阻止外來污染物之生長。
可使用(例如)羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析及親和層析純化由細胞製備之抗體組合物，其中親和層析為較佳純化技術。蛋白A作為親和配位體之適用性視物種及存在於抗體中之任何免疫球蛋白Fc結構域的同型而定。蛋白A可用於純化基於人類γ1、γ2或γ4重鏈之抗體(Lindmark等人，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。蛋白G推薦用於所有小鼠同型及人類γ3(Guss等人，EMBO J.5：1567-75(1986))。親和配位體所附著之基質最常見為瓊脂糖，但亦可使用其他基質。與使用瓊脂糖可達成之流動速率及處理時間相比，諸如受控微孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯之機械穩定性基質允許較快的流動速率及較短的處理時間。當抗體包含CH3結構域時，可使用Bakerbond ABXTM樹脂(J.T.Baker,Phillipsburg,NJ)用於純化。視待回收之抗體而定，亦可使用其他用於蛋白純化之技術，諸如離子交換管柱分級分離、乙醇沉澱、逆相HPLC、矽石層析、肝素SEPHAROSETM層析、陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬胺酸管柱)層析、層析聚焦、SDS-PAGE及硫 酸銨沉澱。
在任何初步純化步驟後，可使包含所關注抗體及污染物之混合物經歷使用pH值在約2.5-4.5之間的溶離緩衝液較佳在低鹽濃度(例如約0-0.25M鹽)下進行的低pH值疏水性相互作用層析。
免疫共軛物
本發明亦提供免疫共軛物(亦互換稱為"抗體-藥物共軛物"或ADC)，其包含與細胞毒性劑，諸如化學治療劑、藥物、生長抑制劑、毒素(例如細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(亦即放射性共軛物)共軛之本文所述之任何抗EGFL7抗體。
使用抗體-藥物共軛物局部傳遞細胞毒性劑或細胞生長抑制劑(亦即在癌症治療中用於殺傷或抑制腫瘤細胞之藥物)(Syrigos及Epenetos,Anticancer Research 19：605-14(1999)；Niculescu-Duvaz及Springer,Adv.Drg Del.Rev.26：151-72(1997)；美國專利第4,975,278號)允許將藥物部分目標傳遞至腫瘤且於其中實現細胞內積累，其中此等非共軛藥劑之全身投藥可產生對正常細胞以及意欲消除之腫瘤細胞不可接受之毒性含量(Baldwin等人，Lancet，第(1986年3月15日)：603-05頁(1986)；Thorpe,"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review",Monoclonal Antibodies '84：Biological And Clinical Applications,A.Pinchera等人(編輯)，第475-506頁(1985))。藉此同時尋求最大功效與最小毒性。已報導多株抗體與單株抗體均適用於此等策略(Rowland等人，Cancer Immunol.Immunother.21：183-87(1986))。此等方法中所使用之藥物包括道諾黴素、多柔比星、甲胺喋呤及長春地辛(Rowland等人，(1986)同上文)。抗體-毒素共軛物中所使用之毒素包括細菌毒素，諸如白喉毒素；植物毒素，諸如蓖麻毒素；小分子毒素，諸如格爾德黴素(geldanamycin)(Mandler等人，J. Nat.Cancer Inst.92(19)：1573-81(2000)；Mandler等人，Bioorganic & Med.Chem.Letters 10：1025-28(2000)；Mandler等人，Bioconjugate Chem.13：786-91(2002))、美登素類(EP 1391213；Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623(1996))及刺孢黴素(Lode等人，Cancer Res.58：2928(1998)；Hinman等人，Cancer Res.53：3336-3342(1993))。毒素可藉由包括微管蛋白結合、DNA結合或拓撲異構酶抑制之機制實現其細胞毒性及細胞生長抑制作用。某些細胞毒性藥物在與大抗體或蛋白受體配位體共軛時傾向於不具活性或具有較低活性。
ZEVALINTM(替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)，Biogen/Idec)係一種抗體-放射性同位素共軛物，其係由經硫脲連接子-螯合劑結合之針對可見於正常及惡性B淋巴細胞表面上之CD20抗原之鼠科IgG1κ單株抗體與111In或90Y放射性同位素構成(Wiseman等人，Eur.Jour.Nucl.Med.27(7)：766-77(2000)；Wiseman等人，Blood 99(12)：4336-42(2002)；Witzig等人，J.Clin.Oncol.20(10)：2453-63(2002)；Witzig等人，J.Clin.Oncol.20(15)：3262-69(2002))。儘管ZEVALIN具有對抗B細胞非霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's Lymphoma,NHL)之活性，但投藥在大多數患者體內引起嚴重且長期之血球減少。MYLOTARGTM(吉妥單抗(gemtuzumab ozogamicin)，Wyeth Pharmaceuticals)係一種由連接至刺胞黴素之hu CD33抗體構成的抗體藥物共軛物，已於2000年經批准用於注射治療急性骨髓白血病(Drugs of the Future 25(7)：686(2000)；美國專利第4970198號、第5079233號、第5585089號、第5606040號、第5693762號、第5739116號、第5767285號、第5773001號)。康妥單抗(Cantuzumab mertansine，Immunogen,Inc.)係一種由經由二硫化物連接子SPP連接至美登素類藥物部分DM1之huC242抗體構成的抗體藥物共軛物，已進入用於治療表現CanAg之癌症(諸如結腸癌、胰腺癌、胃癌及其他癌症)之II期試驗。MLN-2704(Millennium Pharm.,BZL Biologics,Immunogen Inc.)係一種由連接至美登素類藥物部分DM1之抗前列腺特異性膜抗原(PSMA)單株抗體構成的抗體藥物共軛物，其對前列腺腫瘤之潛在治療正在研究中。使奧瑞他汀肽(auristatin peptide)，奧瑞他汀E(AE)及單甲基奧瑞他汀(MMAE)(海兔毒素之合成類似物)與嵌合單株抗體cBR96(對癌瘤之Lewis Y具特異性)及cAC10(對血液科惡性疾病之CD30具特異性)共軛(Doronina等人，Nature Biotech.21(7)：778-784(2003))且正在對其進行治療研究。
可用於產生免疫共軛物之化學治療劑已描述於本文(例如上文)中。可使用之酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌)、蓖麻毒素A鏈、相思子毒素A鏈、蒴蓮根毒蛋白(modeccin)A鏈、帚麴菌素(α-sarcin)、桐油(Aleurites fordii)蛋白、康乃馨(dianthin)蛋白、洋商陸(Phytolacca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻楓樹蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、天堂果蛋白(gelonin)、有絲分裂素(mitogellin)、侷限麴菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)及黴菌毒素(tricothecene)。例如參看1993年10月28日公開之WO 93/21232。多種放射性核種可用於製造放射性共軛抗體。實例包括212Bi、131I、131In、90Y及186Re。抗體與細胞毒性劑之共軛物可使用多種雙功能蛋白偶聯劑製得，該等蛋白偶聯劑諸如3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(SPDP)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、醯亞胺酯之雙功能衍生物(諸如己二亞胺酸二甲酯鹽酸鹽)、活性酯(諸如辛二酸二琥珀醯亞胺酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙-疊氮基化合物(諸如雙-(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙-重氮鹽衍生物(諸如雙-(對重氮鹽苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta 等人，Science,238：1098(1987)中所述來製備。碳14標記之1-異硫氰氧基苯甲基-3-甲基二伸乙三胺五乙酸(MX-DTPA)為一種用於使放射性核苷酸與抗體共軛之例示性螯合劑。參看WO 94/11026。
本文亦涵蓋抗體與一或多種小分子毒素(諸如刺胞黴素、美登素類、海兔毒素、奧瑞他汀、單端孢黴毒素及CC1065以及此等毒素之具有毒素活性之衍生物)之共軛物。
i.美登素及美登素類化合物
在一些實施例中，免疫共軛物包含與一或多個美登素類分子共之本發明之抗體(全長或片段)。
美登素類化合物為藉由抑制微管蛋白聚合發揮作用之有絲分裂抑制劑。美登素最先係自東非灌木齒葉美登木(Maytenus serrata)分離(美國專利第3,896,111號)。隨後，發現某些微生物類亦產生美登素類化合物，諸如美登醇及C-3美登醇酯(美國專利第4,151,042號)。合成美登醇及其衍生物及類似物揭示於(例如)美國專利第4,137,230號、第4,248,870號、第4,256,746號、第4,260,608號、第4,265,814號、第4,294,757號、第4,307,016號、第4,308,268號、第4,308,269號、第4,309,428號、第4,313,946號、第4,315,929號、第4,317,821號、第4,322,348號、第4,331,598號、第4,361,650號、第4,364,866號、第4,424,219號、第4,450,254號、第4,362,663號及第4,371,533號中。
美登素類藥物部分為抗體藥物共軛物中最引人關注之藥物部分，此係因為其：(i)相對易於藉由醯酵或化學改質、醯酵產物之衍生作用來製備；(ii)易於經適於經由非二硫化物連接子與抗體共軛之官能基衍生；(iii)在血漿中穩定；及(iv)有效對抗多種腫瘤細胞株。
含有美登素類化合物之免疫共軛物、其製造方法及其治療用途揭示於(例如)美國專利第5,208,020號、第5,416,064號及歐洲專利EP 0 425 235 B1中，該等專利之揭示內容以引用之方式明確地併入本文 中。Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-23(1996)描述包含連接至針對人類結腸直腸癌之單株抗體C242之美登素類化合物(命名為DM1)的免疫共軛物。已發現該共軛物對所培養之結腸癌細胞具有高細胞毒性且在活體內腫瘤生長檢定中展示出抗腫瘤活性。Chari等人，Cancer Research 52：127-31(1992)描述免疫共軛物，其中美登素類化合物經由二硫化物連接子與結合至人類結腸癌細胞株上之抗原的鼠科抗體A7共軛，或與結合HER-2/neu致癌基因之另一鼠科單株抗體TA.1共軛。在活體外，於每個細胞表現3×105個HER-2表面抗原之人類乳癌細胞株SK-BR-3上測試TA.1-美登素類化合物共軛物之細胞毒性。藥物共軛物達成與游離美登素類藥物類似之細胞毒性程度，該細胞毒性程度可藉由增加每個抗體分子美登素類化合物分子之數目而增加。A7-美登素類化合物共軛物在小鼠體內展示出低全身細胞毒性。
可藉由在不顯著降低抗體或美登素類化合物分子之生物學活性的情況下將抗體與美登素類化合物分子化學連接來製備抗體-美登素類化合物共軛物。例如參看美國專利第5,208,020號(其揭示內容係以引用之方式明確地併入本文中)。平均每個抗體分子共軛3-4個美登素類化合物分子已展示出增強目標細胞之細胞毒性之功效而對抗體功能或溶解性並無不利影響，但預期甚至1分子毒素/抗體即可增強細胞毒性超過使用裸抗體。美登素類化合物已為此項技術中所熟知，且可藉由已知技術合成或自天然來源分離。適當之美登素類化合物揭示於(例如)美國專利第5,208,020號及上文提及之其他專利及非專利公開案中。較佳之美登素類化合物為美登醇及在美登素醇分子之芳環中或其他位置處經改質之美登醇類似物(諸如各種美登醇酯)。
此項技術中已知多種用於製造抗體-美登素類化合物共軛物之連接基，包括(例如)以下文獻中所揭示之連接基：美國專利第5,208,020號或EP專利0 425 235 B1；Chari等人，Cancer Research 52：127-131 (1992)及US2005/0169933A1，該等文獻之揭示內容係以引用之方式明確地併入本文中。可如US2005/0169933A1中所揭示來製備包含連接子組份SMCC之抗體-美登素類化合物共軛物。連接基包括二硫基團、硫醚基團、酸不穩定性基團、光不穩定性基團、肽酶不穩定性基團或酯酶不穩定性基團，如上文識別之專利中所揭示二硫基團及硫醚基團較佳。本文中描述及例示說明額外連接基。
抗體與美登素類化合物之共軛物可使用多種雙功能蛋白偶聯劑製得，該等蛋白偶聯劑諸如3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(SPDP)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸琥珀醯亞胺酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、醯亞胺酯之雙功能衍生物(諸如己二亞胺酸二甲酯鹽酸鹽)、活性酯(諸如辛二酸二琥珀醯亞胺酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙-疊氮基化合物(諸如雙-(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙-重氮鹽衍生物(諸如雙-(對重氮鹽苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。特別較佳之偶聯劑包括提供二硫鍵之3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(SPDP)(Carlsson等人，Biochem.J.173：723-37(1978))及4-(2-吡啶基硫基)戊酸N-琥珀醯亞胺酯(SPP)。
可視連接類型而定將連接子附著於美登素類化合物分子之各種位置處。舉例而言，可藉由使用習知偶聯技術與羥基反應形成酯鍵。反應可發生於具有羥基之C-3位置、經羥甲基改質之C-14位置、經羥基改質之C-15位置及具有羥基之C-20位置處。在一較佳實施例中，鍵結形成於美登醇或美登醇類似物之C-3位置處。
ii.奧瑞他汀及海兔毒素
在一些實施例中，免疫共軛物包含與海兔毒素或海兔毒素之肽類似物及衍生物奧瑞他汀共軛之本發明抗體(美國專利第5,635,483號、第5,780,588號)。海兔毒素及奧瑞他汀已展示干擾微管動力學、 GTP水解及核及細胞分裂(Woyke等人，Antimicrob.Agents Chemother.45(12)：3580-3584(2001))且具有抗癌(US 5,663,149)及抗真菌活性(Pettit等人，Antimicrob.Agents Chemother.42：2961-2965(1998))。可經由肽藥物部分之N(胺基)末端或C(羧基)末端使海兔毒素或奧瑞他汀藥物部分附著於抗體(WO 02/88172)。
例示性奧瑞他汀實施例包括N末端連接之單甲基奧瑞他汀藥物部分DE及DF，其揭示於"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands",US2005/0238649中，該文獻之揭示內容以全文引用之方式明確地併入本文中。
一般而言，肽基藥物部分可藉由在兩個或兩個以上胺基酸及/或肽片段之間形成肽鍵而製備。此等肽鍵可(例如)根據肽化學領域中熟知之液相合成方法(參看E.Schröder及K.Lübke,"The Peptides"，第1卷，第76-136頁，1965,Academic Press)製備。奧瑞他汀/海兔毒素藥物部分可根據以下文獻之方法製備：US 5,635,483、US 5,780,588，Pettit等人，J.Am.Chem.Soc.111：5463-65(1989)；Pettit等人，Anti-Cancer Drug Design 13：243-77(1998)；Pettit等人，Synthesis 719-25(1996)及Pettit等人，J.Chem.Soc.Perkin Trans.1 5：859-863(1996)。亦參看Doronina,Nature Biotechnol.21(7)：778-84(2003)；"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands",US2005/0238649，其以其全文引用之方式併入本文中(揭示(例如)連接子及製備與連接子共軛之諸如MMAE及MMAF之單甲基纈胺酸化合物的方法)。
iii.刺胞黴素
在其他實施例中，免疫共軛物包含與一或多個刺胞黴素分子共軛之本發明抗體。刺胞黴素家族之抗生素能夠在亞皮莫耳濃度下產生雙鏈DNA斷裂。有關刺胞黴素家族共軛物之製備，參看美國專利第 5,712,374號、第5,714,586號、第5,739,116號、第5,767,285號、第5,770,701號、第5,770,710號、第5,773,001號及第5,877,296號(均頒予American Cyanamid Company)。可使用之刺胞黴素之結構類似物包括(但不限於)γ1I、α2I、α3I、N-乙醯基-γ1I、PSAG及θI1(Hinman等人，Cancer Research 53：3336-42(1993)；Lode等人，Cancer Research 58：2925-28(1998)及上文所提及之頒予American Cyanamid之美國專利)。可與抗體共軛之另一抗腫瘤藥物為QFA，其為抗葉酸劑。刺胞黴素與QFA皆具有細胞內作用位點且不易於跨過質膜。因此，細胞經由抗體介導之內化作用攝取此等藥劑顯著增強其細胞毒性作用。
iv.其他細胞毒性劑
可與本發明抗體共軛之其他抗腫瘤劑包括BCNU、鏈脲佐菌素(streptozoticin)、長春新鹼及5-氟尿嘧啶，美國專利第5,053,394號、第5,770,710號中所述之共同稱為LL-E33288複合物的藥劑家族以及伊斯帕黴素(美國專利第5,877,296號)。
可使用之酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌)、蓖麻毒素A鏈、相思子毒素A鏈、蒴蓮根毒蛋白A鏈、帚麴菌素、桐油蛋白、康乃馨蛋白、洋商陸蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻楓樹蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制劑、天堂果蛋白、有絲分裂素、侷限麴菌素、酚黴素、伊諾黴素及黴菌毒素。例如參看1993年10月28日公開之WO 93/21232。
本發明另外涵蓋抗體與具有核分解活性之化合物(例如核糖核酸酶或DNA內切酶，諸如去氧核糖核酸酶；DNA酶)之間所形成的免疫共軛物。
為選擇性破壞腫瘤，抗體可包含高度放射性原子。可使用多種放射性同位素產生放射性共軛抗體。實例包括At211、I131、I125、 Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素。當使用共軛物進行偵測時，其可包含用於閃爍攝影研究之放射性原子，例如tc99m或I123；或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱為磁共振成像，mri)之自旋標記，諸如碘-123及碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
可以已知方式將放射性標記或其他標記併入共軛物中。舉例而言，肽可生物合成，或可藉由使用適當胺基酸前驅物進行化學胺基酸合成(例如涉及以氟-19胺基酸替代氫)來合成。可經由肽中之半胱胺酸殘基附著諸如tc99m或I123、Re186、Re188及In111之標記。可經由離胺酸殘基附著釔-90。可使用IODOGEN方法(Fraker等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.80：49-57(1978))併入碘-123。"Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy"(Chatal,CRC Press 1989)詳細描述其他方法。
抗體與細胞毒性劑之共軛物可使用多種雙功能蛋白偶聯劑製得，該等蛋白偶聯劑諸如3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(SPDP)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸琥珀醯亞胺酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、醯亞胺酯之雙功能衍生物(諸如己二亞胺酸二甲酯鹽酸鹽)、活性酯(諸如辛二酸二琥珀醯亞胺酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙-疊氮基化合物(諸如雙-(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙-重氮鹽衍生物(諸如雙-(對重氮鹽苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人，Science,238：1098(1987)中所述來製備。碳14標記之1-異硫氰氧基苯甲基-3-甲基二伸乙三胺五乙酸(MX-DTPA)為一種用於使放射性核苷酸與抗體共軛之例示性螯合劑。參看WO 94/11026。連接子可為促進細胞毒性藥物在細胞中釋放之"可裂解連接子"。舉例而言，可使用酸不穩定性連 接子、肽酶敏感性連接子、光不穩定性連接子、二甲基連接子或含二硫鍵連接子(Chari等人，Cancer Research 52：127-31(1992)；美國專利第5,208,020號)。
本發明之化合物特別涵蓋(但不限於)用如下交聯劑試劑製備之ADC：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺酸基-EMCS、磺酸基-GMBS、磺酸基-KMUS、磺酸基-MBS、磺酸基-SIAB、磺酸基-SMCC及磺酸基-SMPB及SVSB((4-乙烯基碸)苯甲酸琥珀醯亞胺酯)，該等交聯劑試劑為可購得的(例如購自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)。參看2003-2004 Applications Handbook and Catalog，第467-498頁。
v.抗體藥物共軛物之製備
在本發明之抗體藥物共軛物(ADC)中，抗體(Ab)經由連接子(L)與一或多個藥物部分(D)共軛，例如每個抗體約1至約20個藥物部分。可使用熟習此項技術者已知之有機化學反應、條件及試劑，藉由數種途徑來製備式I之ADC，該等途徑包括：(1)使抗體之親核基團與二價連接子試劑反應以經由共價鍵形成Ab-L，隨後與藥物部分D反應；及(2)使藥物部分之親核基團與二價連接子試劑反應以經由共價鍵形成D-L，隨後與抗體之親核基團反應。本文描述用於製備ADC之額外方法。
Ab(LD)p I
連接子可由一或多種連接子組份構成。例示性連接子組份包括6-馬來醯亞胺基己醯基("MC")、馬來醯亞胺基丙醯基("MP")、纈胺酸-瓜胺酸("val-cit")、丙胺酸-苯丙胺酸("ala-phe")、對胺基苯甲氧基羰基("PAB")、4-(2-吡啶基硫基)戊酸N-琥珀醯亞胺酯("SPP")、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸N-琥珀醯亞胺酯("SMCC")及(4-碘-乙 醯基)胺基苯甲酸N-琥珀醯亞胺酯("SIAB")。額外之連接子組份已為此項技術中所知且某些描述於本文中。亦參看"Monomcthylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands",US2005/0238649，其內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，連接子可包含胺基酸殘基。例示性胺基酸連接子組份包括二肽、三肽、四肽或五肽。例示性二肽包括纈胺酸-瓜胺酸(vc或val-cit)、丙胺酸-苯丙胺酸(af或ala-phe)。例示性三肽包括甘胺酸-纈胺酸-瓜胺酸(gly-val-cit)及甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸(gly-gly-gly)。包含胺基酸連接子組份之胺基酸殘基包括天然存在之胺基酸以及次要胺基酸及非天然存在之胺基酸類似物，諸如瓜胺酸。可對胺基酸連接子組份進行設計且優化其對特定酵素(例如腫瘤相關蛋白酶、組織蛋白酶B、C及D或纖溶蛋白酶)之酶促裂解之選擇性。
抗體上之親核基團包括(但不限於)：(i)N-末端胺基；(ii)側鏈胺基，例如離胺酸；(iii)側鏈硫醇基，例如半胱胺酸；及(iv)糖羥基或胺基，其中抗體經糖基化。胺基、硫醇基及羥基為親核基團且能夠與連接子部分及連接子試劑上之親電子基團反應形成共價鍵，該等親電子體包括：(i)活性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵代甲酸酯及酸鹵化物；(ii)烷基及苯甲基鹵化物，諸如鹵代乙醯胺；(iii)醛、酮、羧基及馬來醯亞胺基。某些抗體具有可還原之鏈間二硫鍵，亦即半胱胺酸橋。可藉由用諸如DTT(二硫蘇糖醇)之還原劑進行處理而使抗體具有與連接子試劑共軛之反應性。由此，理論上各半胱胺酸橋將形成兩個反應性硫醇親核體。可經由離胺酸與2-亞胺基硫維環戊烷(Traut試劑)之反應使胺轉化為硫醇而將額外親核基團引入抗體中。可藉由引入一個、兩個、三個、四個或四個以上半胱胺酸殘基(例如製備包含一或多個非天然半胱胺酸胺基酸殘基之突變體抗體)而將反應性硫醇基引入抗體(或其片段)中。
本發明之抗體藥物共軛物亦可藉由修飾抗體以引入可與連接子試劑或藥物上之親核取代基反應之親電子部分而製得。可將糖基化抗體之糖以(例如)過碘酸鹽氧化試劑氧化以形成可與連接子試劑或藥物部分之胺基反應的醛或酮基。所得亞胺希夫鹼(Schiff base)基團可形成穩定鍵，或可經(例如)硼氫化物試劑還原而形成穩定胺鍵。在一實施例中，糖基化抗體之醣部分與半乳糖氧化酶或偏過碘酸鈉之反應可於蛋白質中產生可與藥物上之適當基團反應的羰基(醛及酮基團)(Hermanson,Bioconjugate Techniques)。在另一實施例中，可使含有N-末端絲胺酸或蘇胺酸殘基之蛋白質與偏過碘酸鈉反應而導致產生替代第一胺基酸之醛(Geoghegan及Stroh,Bioconjugate Chem.3：138-46,(1992)U.S.5,362,852)。此醛可與藥物部分或連接子親核體反應。
同樣，藥物部分上之親核基團包括(但不限於)：胺、硫醇、羥基、醯肼、肟、肼、硫半卡(thiosemicarbazone)、羧酸肼及芳基醯肼基團，其能夠與連接子部分及連接子試劑上之親電子基團反應形成共價鍵，該等親電子體包括：(i)活性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵代甲酸酯及酸鹵化物；(ii)烷基及苯甲基鹵化物，諸如鹵代乙醯胺；(iii)醛、酮、羧基及馬來醯亞胺基。
或者，可(例如)藉由重組技術或肽合成製造包含抗體及細胞毒性劑之融合蛋白。DNA之長度可包含編碼共軛物之兩個部分的各別區域，該等區域可彼此相鄰或由編碼不破壞共軛物所需特性之連接子肽之區域分離。
在另一實施例中，可使抗體與"受體"(諸如抗生蛋白鏈菌素)共軛以用於預靶向腫瘤，其中將抗體-受體共軛物投與患者，隨後使用清除劑自循環中移除未結合之共軛物，且接著投用與細胞毒性劑(例如放射性核苷酸)共軛之"配位體"(例如抗生物素蛋白)。
醫藥調配物
藉由將具有所需純度之抗體與生理學上可接受之可選載劑、賦形劑或穩定劑混合(Remington：The Science and Practice of Pharmacy第20版(2000))來製備呈水溶液、凍乾或其他乾燥調配物形式之包含本發明抗體之治療調配物以供儲存。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所使用之劑量及濃度下對接受者無毒性，且包括緩衝液，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽、組胺酸及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基苯甲基氯化銨、氯化六羥季銨、氯化苯甲烴銨、苄索氯銨、苯酚、丁醇或苯甲醇、對羥基苯甲酸烷酯(諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯)、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他醣，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白錯合物)；及/或非離子界面活性劑，諸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
本文之調配物亦可視需要含有一種以上用於所治療之特定指征的活性化合物，較佳為具有彼此無不利影響之互補活性之活性化合物。此等分子適於以有效用於預定目的之量存在於組合中。
亦可將活性成份截留於膠狀藥物傳遞系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)或巨乳液中(例如)藉由凝聚技術或界面聚合而製備之微膠囊(例如，分別為羥甲基纖維素或明膠-微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中。此等技術揭示於Remington：The Science and Practice of Pharmacy第20版(2000)中。
待用於活體內投藥之調配物必須無菌。此易於藉由經無菌濾膜 過濾來實現。
可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適當實例包括含有本發明免疫球蛋白之固體疏水性聚合物的半滲透性基質，該等基質為成形物品之形式，例如薄膜或微膠囊。持續釋放基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥基乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸交酯(美國專利第3,773,919號)、L-麩胺酸與γ乙基-L-麩胺酸酯之共聚物、不降解乙烯-乙酸乙烯酯、可降解乳酸-乙醇酸共聚物(諸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林構成的可注射微球體))及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。諸如乙烯-乙酸乙烯酯及乳酸-乙醇酸之聚合物使得分子能夠釋放超過100天，而某些水凝膠釋放蛋白質持續較短時間。當經封裝免疫球蛋白在體內保持一段較長時間時，其可因在37℃下暴露至濕氣而變性或凝集，從而導致生物學活性之喪失及免疫原性之可能改變。可視所涉及之機制而定設計合理的穩定策略。舉例而言，若發現凝集機制為經由硫基-二硫化物互換形成分子間S-S鍵，則可藉由修飾氫硫基殘基、由酸性溶液凍乾、控制濕氣含量、使用適當添加劑及形成特定聚合物基質組合物來達成穩定。
用途
本發明之抗體可用於(例如)活體外、離體及活體內治療方法。
在一些實施例中，本發明提供降低或抑制患有與血管生成相關之病理病況之受檢者體內血管生成的方法，其包含向該受檢者投與有效量之本發明之抗EGFL7抗體。此等病況包括(例如)贅瘤(包括癌瘤)及某些眼病。
可由本發明之治療改善之癌症包括(但不限於)癌瘤、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤及白血病或淋巴惡性疾病。更特定言之，此等癌症之實例包括乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、腎癌、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及肺鱗狀癌)、鱗狀細胞癌(例如上皮 鱗狀細胞癌)、子宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌、膀胱癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(包括胃腸癌)、胰腺癌、頭頸部癌、神經膠母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、星形細胞瘤、泡膜細胞瘤、卵巢男性細胞瘤、肝腫瘤、血液科惡性疾病(包括非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、多發性骨髓瘤及急性血液科惡性疾病)、子宮內膜癌或子宮癌、子宮內膜異位、纖維肉瘤、絨膜癌、唾液腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、食管癌、肝癌、肛門癌、陰莖癌、鼻咽癌、喉癌、卡波希氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、黑素瘤、皮膚癌、神經鞘瘤、少突神經膠質瘤、神經母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、骨源性肉瘤、平滑肌肉瘤、尿道癌、甲狀腺癌、威爾姆氏瘤(Wilm's tumor)以及與母斑病相關之異常血管增生、水腫(諸如與腦腫瘤相關之水腫)及米格氏症候群(Meigs' syndrome)。癌症較佳係選自由乳癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、腎癌、前列腺癌、肝癌、頭頸部癌、黑素瘤、卵巢瘤、間皮瘤及多發性骨髓瘤組成之群。癌症更佳為結腸直腸癌。可由本發明之治療改善之癌病況包括轉移性癌症。本發明尤其適於治療血管形成腫瘤。
可由本發明之治療改善之眼病包括眼內新生血管疾病，包括(但不限於)年齡相關之黃斑變性、糖尿病性黃斑水腫、增生性糖尿病性視網膜病變、視網膜中央靜脈阻塞併發黃斑囊樣水腫、視網膜分枝靜脈阻塞併發黃斑囊樣水腫、虹膜紅變、病理性近視/CNV、逢希伯-林道症候群(Von Hippel Lindau Syndrome)、翼狀胬肉、POHS(組織漿菌病)/CNV、脈絡膜血管瘤、早產兒視網膜病(ROP)、放射性視網膜病變、眼內腫瘤(例如黑素瘤、視網膜母細胞瘤、轉移瘤及眼眶海綿狀血管瘤)、息肉狀脈絡膜病變、特發性近中心凹型毛細管擴張、伊爾斯氏病(Eales' Disease)、眼眶海綿狀血管瘤、眼眶淋巴管瘤、眼瞼毛細血管瘤、角膜移植物血管形成、角膜移植物新血管生成、滲出性視 網膜病(Coats Disease)及與青光眼手術相關之創傷癒合問題。
此外，至少某些本發明之抗體可結合來自其他物種之抗原。因此，本發明之抗體可用於(例如)在含有抗原之細胞培養物中、人類受檢者體內或具有與本發明之抗體交叉反應之抗原的其他哺乳動物受檢者(例如黑猩猩、狒狒、絨猴、獼猴及恆河猴、豬或小鼠)體內結合特異性抗原活性。在一些實施例中，可藉由使本發明之抗體與抗原接觸從而抑制抗原活性而將抗體用於抑制抗原活性。抗原較佳為人類蛋白分子。
在一些實施例中，本發明之抗體可用於結合身受與抗原表現及/或活性增加相關之病症之受檢者體內之抗原的方法中，該方法包含向受檢者投與本發明之抗體從而與受檢者體內之抗原結合。抗原較佳為人類蛋白分子且受檢者為人類受檢者。或者，受檢者可為表現與本發明抗體結合之抗原的哺乳動物。另外，受檢者可為已引入抗原(例如藉由投與抗原或藉由表現抗原轉殖基因)之哺乳動物。可將本發明之抗體投與人類受檢者用於治療目的。此外，可將本發明之抗體投與表現與該免疫球蛋白交叉反應之抗原的非人類哺乳動物(例如靈長類動物、豬或小鼠)用於獸醫目的或將其作為人類疾病之動物模型。就後種情況而言，此等動物模型可用於評估本發明抗體之治療功效(例如測試投藥劑量及時程)。
本發明之抗體可用於治療、抑制、延緩與一或多種抗原分子之表現及/或活性相關之疾病、病症或病況之進程、防止/延緩其復發、改善或預防該等疾病、病症或病況。
在某些實施例中，將包含與一或多種細胞毒性劑共軛之抗體的免疫共軛物投與患者。在一些實施例中，免疫共軛物及/或與其結合之抗原經細胞內化，從而引起免疫共軛物殺傷其所結合之目標細胞之治療功效增加。在一實施例中，細胞毒性劑靶向或干擾目標細胞中之 核酸。在一實施例中，細胞毒性劑靶向或干擾微管聚合。此等細胞毒性劑之實例包括本文所述之任何化學治療劑(諸如美登素類化合物、奧瑞他汀、海兔毒素或刺胞黴素)、放射性同位素或核糖核酸酶或DNA核酸內切酶。
本發明之抗體可單獨或與其他組合物組合用於治療。舉例而言，本發明之抗體可與化學治療劑(包括化學治療劑之混合液)、其他細胞毒性劑、抗抗原劑、細胞因子及/或生長抑制劑共投藥。上文所述之此等組合療法包括組合投藥(其中兩種或兩種以上藥劑包括於相同或單獨調配物中)及單獨投藥，在後種情況下投與本發明之抗體可在投與輔助療法之前及/或之後進行。
本發明之抗體(及輔助治療劑)可藉由任何適當之方式投與，包括非經腸、皮下、腹膜內、肺內及鼻內，且視需要在病灶內投藥用於局部治療。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投藥。此外，抗體亦適於藉由脈衝輸注投與，尤其以遞減劑量投與抗體。部分上視投藥之短期或長期性而定，可藉由任何適當途徑(例如藉由注射，諸如靜脈內或皮下注射)給藥。
本發明之抗體組合物可以與良好醫療實踐相符之方式調配、給藥及投藥。在此方面需考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個體患者之臨床情況、病症之起因、傳遞藥劑之部位、投藥方法、投藥時程及專業醫師已知之其他因素。抗體無需但視情況可與一或多種當前用於預防或治療所述病症之藥劑一起調配。此等其他藥劑之有效量視存在於調配物中之本發明之抗體的量、病症或治療之類型及上文所討論之其他因素而定。此等藥劑一般係以與上文所用相同之劑量及投藥途徑使用，或以上文所用劑量之約1%至99%之劑量使用。
對於預防或治療疾病，本發明抗體之適當劑量(當單獨使用或與 其他藥劑組合使用時)將視待治療之疾病類型、抗體類型、疾病之嚴重程度及病程、出於預防抑或治療目的投與抗體、先前療法、患者臨床病史及對抗體之反應以及主治醫師之判斷而定。抗體適於一次性或經一系列治療投與至患者。視疾病類型及嚴重程度而定，約1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)之抗體可為(例如)藉由一或多次單獨投藥或藉由連續輸注投與至患者之初始候選劑量。一種典型日劑量可在約1μg/kg至100mg/kg或更高劑量之範圍內，此視上文所提及之因素而定。對於經數天或更長時間重複投藥而言，視病況而定，將持續進行治療直至出現所需疾病症狀抑制。抗體之一例示性劑量將在約0.05mg/kg至約10mg/kg之範圍內。因此，可以約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何組合)中之一或多種劑量向患者投藥。此等劑量可間歇投與，例如每週或每三週(例如使患者接收約兩次劑量至約二十次劑量，例如約六次劑量之抗體)。可以較高之初始負荷劑量，隨後以一或多次較低劑量投藥。例示性給藥方案包含投與約4mg/kg之初始負荷劑量之抗體，隨後投與約2mg/kg之每週維持劑量之抗體。然而，其他劑量方案亦可用。此療法之進展易於藉由習知技術及檢定監測。
本發明之抗EGFL7抗體可用於偵測特定細胞或組織中EGFL7之表現的檢定(諸如診斷或預後檢定)中，其中抗體如下文所述經標記且/或經固定於不可溶基質上。
本發明提供偵測EGFL7之方法，該等方法包含偵測樣本中之EGFL7-抗-EGFL7抗體複合物。如本文所使用之術語"偵測"包括參考或不參考對照情況下之定性及/或定量偵測(量測含量)。
本發明提供診斷與EGFL7表現及/或活性相關之病症的方法，該等方法包含偵測來自患有或懷疑患有該病症之患者的生物樣本中之EGFL7-抗-EGFL7抗體複合物。在一些實施例中，EGFL7表現為增加 之表現或異常(不合需要)表現。
本發明提供本文所述之任何抗EGFL7抗體，其中該抗EGFL7抗體包含可偵測之標記。
本發明提供一種本文所述之任何抗EGFL7抗體與EGFL7之複合物。在一些實施例中，該複合物為活體內或活體外複合物。在一些實施例中，該複合物包含癌細胞。在一些實施例中，抗EGFL7抗體經可偵測地標記。
可以多種熟知之偵測檢定方法中之任一種使用抗EGFL7抗體偵測EGFL7。舉例而言，可藉由自所需來源獲得樣本，將樣本與抗EGFL7抗體混合以使抗體與混合物中存在之任何EGFL7形成抗體/EGFL7複合物，並偵測混合物中存在之任何抗體/EGFL7複合物來檢定生物樣本中之EGFL7。可藉由此項技術中已知之適於特定樣本之方法製備生物樣本用於檢定。根據所使用之檢定類型選擇將樣本與抗體混合之方法及偵測抗體/EGFL7複合物之方法。此等檢定包括免疫組織化學、競爭及夾層檢定及空間抑制檢定。
用於EGFL7之分析方法均使用一或多種以下試劑：經標記之EGFL7類似物、經固定之EGFL7類似物、經標記之抗EGFL7抗體、經固定之抗EGFL7抗體及空間共軛物。經標記之試劑亦稱為"示蹤劑"。
所使用之標記為不干擾EGFL7與抗EGFL7抗體之結合的任何可偵測之官能基。已知多種用於免疫檢定之標記，實例包括可直接偵測之部分，諸如螢光染料、化學發光劑及放射性標記；以及必須經反應或衍生化而得以偵測之部分，諸如酵素。
所使用之標記為不干擾EGFL7與抗EGFL7抗體之結合的任何可偵測之官能基。已知多種用於免疫檢定之標記，實例包括可直接偵測之部分，諸如螢光染料、化學發光劑及放射性標記；以及必須經反應或衍生化而得以偵測之部分，諸如酵素。此等標記之實例包括放射性同 位素32P、14C、125I、3H及131I；螢光團，諸如稀土螯合劑或螢光素及其衍生物、若丹明(rhodamine)及其衍生物、丹醯基、繖酮；螢光素酶，例如螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶(美國專利第4,737,456號)；蟲螢光素；2,3-二氫酞嗪二酮；辣根過氧化物酶(HRP)；鹼性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡萄糖澱粉酶；溶菌酶；醣氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；雜環氧化酶，諸如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶，其與使用過氧化氫氧化染料前驅物之酵素(諸如HRP、乳過氧化物酶或微過氧化物酶)偶聯；生物素/抗生物素蛋白；自旋標記；噬菌體標記；穩定自由基及其類似物。
可使用習知方法使此等標記與蛋白質或多肽共價結合。舉例而言，可使用偶聯劑將抗體與上述螢光、化學發光及酵素標記連接，該等偶聯劑諸如二醛、碳化二醯亞胺、二馬來醯亞胺、雙醯亞胺酯、雙重氮化聯苯胺及其類似物。例如參看美國專利第3,940,475號(螢光測定法)及第3,645,090號(酵素法)；Hunter等人，Nature 144：945(1962)；David等人，Biochemistry 13：1014-21(1974)；Pain等人，J.Immunol.Meth.40：219-30(1981)及Nygren,J.Histochem.and Cytochem.30：407-12(1982)。本文中之較佳標記為諸如辣根過氧化物酶及鹼性磷酸酶之酵素。此標記(包括酵素)與抗體之共軛對於一般熟習免疫檢定技術者而言為標準操作程序。例如參看O'Sullivan等人，"Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay,"Methods Enzymol.，編輯J.J.Langone及H.Van Vunakis，第73卷(Academic Press,New York,New York,1981)，第147-166頁。
某些檢定方法中需要固定試劑。固定使抗EGFL7抗體與在溶液中保持游離之任何EGFL7分離。通常藉由在檢定程序之前如藉由吸附至水不溶性基質或表面(Bennich等人，U.S.3,720,760)，藉由共價偶聯 (例如使用戊二醛交聯)使抗EGFL7抗體或EGFL7類似物不溶解化或藉由在檢定程序之後(例如)藉由免疫沉澱使抗EGFL7抗體或EGFL7類似物不溶解化來實現此目的。
可使用免疫組織化學及染色實驗程序檢測樣本中蛋白質之表現。已顯示組織切片之免疫組織化學染色係一種評定或偵測樣本中蛋白質之存在的可靠方法。免疫組織化學("IHC")技術一般藉由發色或螢光方法利用抗體原位探查並觀測細胞抗原。對於樣本之製備而言，可使用來自哺乳動物(通常為人類患者)之組織或細胞樣本。可藉由此項技術中已知之多種程序獲得樣本，該等程序包括(但不限於)手術切除、抽吸或活組織檢查。組織可為新鮮或冷凍組織。在一實施例中，將樣本固定並嵌埋至石蠟或其類似物中。可藉由習知方法固定(亦即保存)組織樣本。一般熟習此項技術者應瞭解固定劑之選擇由待經組織學染色或另外分析樣本之目的確定。一般熟習此項技術者亦將瞭解固定長度視組織樣本之大小及所使用之固定劑而定。
IHC可與諸如形態染色及/或原位螢光雜交之額外技術組合進行。存在兩種IHC之通用方法，即直接與間接檢定。根據第一檢定，直接測定抗體與目標抗原(例如EGFL7)之結合。此直接檢定使用可在無進一步抗體相互作用之情況下觀測之經標記試劑，諸如螢光標籤或酵素標記之一級抗體。在典型間接檢定中，未共軛之一級抗體與抗原結合，且接著經標記之二級抗體與一級抗體結合。在二級抗體與酵素標記共軛之情況下，添加發色或螢光底物以便觀測抗原。由於數種二級抗體可與一級抗體上之不同抗原決定基反應，故而出現信號擴增。
用於免疫組織化學之一級及/或二級抗體通常可經可偵測部分標記。可使用多種標記，其在文中的其他部份描述。
除上文所討論之樣本製備程序外，可需要在IHC之前、期間或之後進一步處理組織切片。舉例而言，可進行抗原決定基修復方法，諸 如檸檬酸鹽緩衝液中加熱組織樣本(例如參看Leong等人Appl.Immunohistochem.4(3)：201(1996))。
在可選阻斷步驟後，在適當條件下使組織切片暴露至一級抗體歷時一段足夠之時間段，從而使一級抗體與組織樣本中之目標蛋白抗原結合。用於達成此目的之適當條件可藉由常規實驗確定。藉由使用上文所討論之可偵測標記中之任一種測定抗體與樣本之結合程度。標記較佳為催化發色底物(諸如3,3'-二胺基聯苯胺色原體)化學變化之酶標記(例如HPRO)。較佳使酶標記與特異性結合至一級抗體之抗體共軛(例如一級抗體為兔多株抗體且二級抗體為山羊抗兔抗體)。
可安裝由此製備之試樣並以蓋玻片覆蓋。接著(例如)使用顯微鏡測定載片評估，且可使用此項技術常規使用之染色強度標準。
稱為競爭或夾層檢定之其他檢定方法已良好建立且廣泛用於商業診斷產業中。
競爭檢定係基於示蹤劑EGFL7類似物與測試樣本EGFL7競爭有限量之抗EGFL7抗體抗原結合位點之能力。一般在競爭之前或之後使抗EGFL7抗體不溶解，且接著使與抗EGFL7抗體結合之示蹤劑及EGFL7與未結合之示蹤劑及EGFL7分離。此分離可藉由傾析(在使結合搭配物預先不溶解之情況下)或藉由離心(在競爭反應後使結合搭配物沉澱之情況下)實現。測試樣本EGFL7之量與如由標記物質之量所量測的結合示蹤劑之量成反比。製備已知EGFL7量之劑量反應曲線並將其與測試結果相比較以定量測定測試樣本中所存在之EGFL7量。當將使用酵素作為可偵測標記物時，此等檢定稱為ELISA系統。
稱為"均相"檢定之另一種競爭檢定不需要相分離。對此，製備並使用酵素與EGFL7之共軛物，從而當抗EGFL7抗體與EGFL7結合時，抗EGFL7抗體之存在將改變酵素活性。在此情況下，使EGFL7或其免疫活性片段經雙功能有機橋與酵素(諸如過氧化物酶)共軛。選擇用於 抗EGFL7抗體之共軛物使得抗EGFL7抗體之結合將抑制或加強標記之酵素活性。此方法本身已以EMIT之名稱經廣泛實踐。
將空間共軛物用於均相檢定之位阻方法中。藉由使低分子量半抗原與小EGFL7片段共價連接合成此等共軛物，從而使針對半抗原之抗體實質上無法與抗EGFL7抗體同時與共軛物結合。在此檢定程序中，存在於測試樣本中之EGFL7將與抗EGFL7抗體結合，藉此使抗半抗原與共軛物結合，從而導致共軛物半抗原之特徵改變，例如當半抗原為螢光團時螢光性改變。
夾層檢定尤其可用於測定EGFL7或抗EGFL7抗體。在連續夾層檢定中，使用經固定抗EGFL7抗體吸附測試樣本EGFL7，如藉由洗滌移除測試樣本，使用已結合之EGFL7吸附第二、經標記抗EGFL7抗體，且接著使已結合之物質與殘餘示蹤劑分離。已結合示蹤劑之量與測試樣本EGFL7成比例。在"同時"夾層檢定中，在添加經標記抗EGFL7之前不分離測試樣本。使用抗EGFL7單株抗體作為一種抗體且使用多株抗EGFL7抗體作為另一種抗體的連續夾層檢定可用於測試樣本中之EGFL7。
上述檢定僅為有關EGFL7之例示性偵測檢定。本發明之範疇內包括現在或以後所研發之使用抗EGFL7抗體測定EGFL7的其他方法，包括本文所述之生物檢定。
製造物品
在本發明之另一態樣中，提供一種含有可用於治療、預防及/或診斷上文所述病症之物質的製造物品。該製造物品包含容器及容器上或與容器相聯之標籤或包裝插頁。適當之容器包括(例如)瓶子、小瓶、注射器等。容器可由多種材料(諸如玻璃或塑料)形成。容器容納單獨或與有效治療、預防及/或診斷病況之另一種組合物組合之組合物，且可具有無菌接取口(例如容器可為靜脈內溶液袋或具有可由皮 下注射針刺穿之塞子的小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為本發明之抗體。標籤或包裝插頁指示組合物係用於治療所選擇之病況，諸如哮喘。此外，製造物品亦可包含(a)其中含有組合物之第一容器，其中該組合物包含本發明之抗體；及(b)其中含有組合物之第二容器。在本發明之此實施例中，製造物品可另外包含應指示第一及第二抗體組合物可用於治療特定病況(諸如哮喘)之包裝插頁。另外或其他，製造物品亦可另外包含第二(或第三)容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝液，諸如抑菌注射用水(BWFI)、經磷酸鹽緩衝之生理食鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。其可另外包括自商業及使用者之角度而言合乎需要之其他物質，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
以下為本發明之方法及組合物之實例。應瞭解可基於上文所提供之基本描述實施各種其他實施例。
實例 實例1抗EGFL7單株抗體之製造及表徵
單株抗體之製造
鑑別並選殖EGFL7力圖發現新穎的人類分泌及跨膜蛋白，尤其是血管發育調控所涉及之蛋白。有關選殖及表現人類EGFL7之詳細內容描述於(例如)專利申請案US2003/0224948A1(其中將EGFL7稱為PRO1449)中。人類EGFL7之GenBank®寄存編號為NM_016215。
一週兩次(八次劑量)使用經Ribi佐劑(Corixia,Hamilton,MT)稀釋的大腸桿菌產生之經His6標記之重組人類及小鼠EGFL7蛋白經由足墊免疫Egfl7純合子基因剔除小鼠(在Genentech產生)。自10隻展現高血清力價之小鼠之淋巴結採集B細胞，並使其與小鼠骨髓瘤細胞(X63.Ag8.653；American Type Culture Collection®(ATCC®))融合。10-14天後，藉由使用重組EGFL7蛋白進行直接ELISA來針對抗體產生篩 選上清液。次選殖陽性組兩次以達成單株性質。對於大規模製造經純化抗體而言，將融合瘤細胞腹膜內注射至經姥鮫烷預致敏之BALB/c小鼠體內，或將其培養於Integra生物反應器中。藉由蛋白A親和層析(Pharmacia Fast Protein Liquid Chromatography；Pharmacia,Uppsala,Sweden)純化腹水液或培養物上清液。選擇此等單株抗體中命名為4F11、10G9及18F7之三種抗體用於進一步分析。2006年1月將此等單株抗體寄存於ATCC®。
單株抗體阻斷HUVEC細胞黏附及遷移
先前已顯示塗覆於培養盤上之EGFL7促進人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)黏附，但黏附之強度顯著弱於其他細胞黏附分子，諸如纖維結合蛋白及膠原蛋白(Parker等人，Nature 428：754-58(2004))。因此，進行實驗確定Mab 4F11、10G9及18F7能否阻斷細胞黏附至經EGFL7塗覆之培養盤。用5μg/ml纖維結合蛋白(Roche)及大腸桿菌中產生之重組人類EGFL7塗覆培養盤。PBS沖洗後，以EGM2培養基(Cambrex)中5×105/cm2之密度塗覆HUVEC(Cambrex)，並以140g離心5分鐘以使細胞附著同步，且接著進行培育。為分析抗體活性，在塗覆前用50mM Tris/125mM NaCl(pH 8.6)中0.5、5或50μg/ml濃度之抗體預先培育EGM2培養基中之HUVEG。Mab 4F11、10G9及18F7各自均以濃度依賴性方式阻斷細胞黏附至經人類或小鼠EGFL7蛋白塗覆之培養盤且Mab均未阻斷細胞黏附至經纖維結合蛋白塗覆之培養盤，從而證實阻斷對EGFL7具特異性。
亦檢測此等抗體能否阻斷HUVEC於經EGFL7塗覆之培養盤上遷移。用5μg/ml以下蛋白質之一塗覆培養盤：BSA(Sgima)、膠原蛋白(Upstate)、纖維結合蛋白(Roche)及重組人類EGFL7(在Genentech於大腸桿菌中產生)。PBS沖洗後，以EGM2培養基(Cambrex)中5×105/cm2之密度塗覆HUVEC(Cambrex)。允許細胞附著2小時且使用移液管尖 單層劃痕。用EGM2將孔洗滌兩次，並分別添加含有50μg/ml對照Mab或4F11、10G9、18F7之新鮮培養基。24小時內於數個時間間隔拍取孔之相片以監測劃痕閉合。Mab 4F11、10G9及18F7各自均阻斷經EGFL7蛋白塗覆之培養盤上之細胞遷移，但經其他蛋白質塗覆之培養盤上無阻斷。對照Mab對任何蛋白質均無阻斷活性。此等結果表明所有三種抗EGFL7 mab均特異性阻斷MUVEC於EGFL7上之遷移。
有趣的是觀察到Mab 4F11之阻斷視調配物而定。特定言之，當在50mM Tris/125mM NaCl中製備抗體儲備液時，抗體對於阻斷HUVEC細胞黏附非常有效，但當在PBS製備時顯示出極小之功效。對於其他兩種Mab未觀察到此差異。
Mab 4F11及10G9之序列測定
使用RNeasy®小型套組(Qiagen,Germany)自產生小鼠抗人類EGFL7單株抗體4F11及10G9之融合瘤細胞中提取全RNA。以如下簡並引子使用RT-PCR擴增4F11及10g9之可變輕鏈(VL)及可變重鏈(VH)結構域：
對於4F11而言：
輕鏈(LC)正向：5'-GTCAGATATCGTKCTSACMCARTCTCCWGC-3'(SEQ ID NO：21)
重鏈(HC)正向：5'-GATCGACGTACGCTCAGATHCARYTGGTGCARTCTGGGATCGACGTACGCTCAGATHCARYTGGTGCARTCTGG-3'(SEQ ID NO：22)
對於10G9而言：
輕鏈(LC)正向：5'-GATCGATATCGTGATGACBCARACTCCACT-3'(SEQ ID NO：23)
重鏈(HC)正向：5'-GATCGACGTACGCTGAGGTYCAGCTSCAGCAGTCTGG-3'(SEQ ID NO：24)
對於4F11與10G9而言：
輕鏈反向：5'-TTTDAKYTCCAGCTTGGTACC-3'(SEQ ID NO：25)
重鏈反向：5'-ACAGTGGGCCCTTGGTGGAGGCTGMRGAGACDGTGASHRDRGT-3'(SEQ ID NO：26)。
正向引子對兩種抗體之VL及VH區N末端胺基酸序列具有特異性。分別設計LC及HC反向引子以使其與恆定輕鏈域(CL)及恆定重鏈域(CH1)中之區域黏接，該區域對於兩種抗體係相同的且跨物種高度保守。將經擴增之VL選殖至pRK哺乳動物細胞表現載體(Shields等人，J.Biol.Chem.276：659-04(2000))中。將經擴增之VH插入pRK哺乳動物細胞表現載體中。使用常規測序方法測定插入物之聚核苷酸序列。4F11輕鏈與重鏈(分別為SEQ ID NO：1及2)及10G9輕鏈與重鏈(分別為SEQ ID NO：3及4)之序列展示於圖1至4中。
同型測試及結合親和力
使用標準方法測定Mab 4F11、10G9及18F7為同型IgG2b。
在室溫下，藉由使用Pharmacia BIAcore® 3000(BIAcore AB,Uppsala,Sweden)進行表面電漿共振來測定Mab對人類及小鼠EGFL7之結合親和力(例如參看Morton等人，Meth.Enzymol.295：268-94(1998))。將抗EGFL7抗體經由一級胺基固定於感應器晶片(CM5)上。藉由以5μl/min注射20μl 0.025M N-羥基琥珀醯亞胺與0.1M N-乙基-N'(二甲基胺基丙基)碳化二醯亞胺之混合物來活化經羧甲基化之感應器晶片表面基質。以5μl/min注射5-10μl 10μg/ml之重組人類或小鼠EGFL7蛋白於10mM乙酸鈉(pH 4.5)中之溶液。偶聯後，藉由注射20μl 1M乙醇胺(pH 8.5)阻斷晶片上未經佔據之位點。電泳緩衝液為含有0.05%聚山梨醇酯20之PBS。對於動力學量測而言，將於電泳緩衝液中經兩倍連續稀釋之經聚-His標記之EGFL7以30μl/min之流動速率注射經過流槽歷時3分鐘，且使已結合之經polyhis標記之EGFL7解離 20分鐘。藉由注射20μl 10mM甘胺酸鹽酸鹽(pH 1.5)使結合表面再生。使用經活化但不具有固定抗體之一號流槽作為參考槽。經聚His標記之EGFL7與一號流槽不存在顯著之非特異性結合。為計算表觀結合親和力，使用1：1結合模型使用整體擬合分析資料。同時擬合締合及解離速率常數(BIAevaluation軟體)。此等使用Mab於50mM Tris/125mM NaCl中之儲備液進行之實驗的結果展示於表2中。
由Mab識別之EGFL7抗原於定基之測定
測定由單株抗體識別之抗原決定基，首先定位各Mab所結合之EGFL7區域。用包含如圖5中所示之全長EGFL7或截斷形式蛋白質之表現載體轉染293細胞。接著用Mab 4F11、10G9及18F7探查經轉染細胞之細胞溶解物的西方墨點。觀察到各Mab均與EGFL7之EMI部分結合。
為縮小由各Mab識別之特異性抗原決定基之範圍，合成跨越一部分EMI結構域之重疊多肽並測試其與全長EGFL7競爭與Mab結合之能力。舉例而言，用於Mab 4F11之多肽的序列如下：
p1 RSPGLAPARPRYA (SEQ IDNO：27)
p2 RPRYACCPGWKRT (SEQ ID NO：28)
p3 GWKRTSGLPGACG (SEQ ID NO：29)
將Mab 4F11與EGFL7蛋白及10倍莫耳過量之多肽p1、p2及p3之各者混合，免疫沉澱所得複合物並藉由SDS-PAGE對其進行觀測。對於Mab 4F11而言，觀察到僅p2與全長EGFL7競爭與Mab 4F11之結合。結果表明Mab 4F11識別包含序列CCP之EGFL7抗原決定基。
使用具有以下序列之多肽對其他兩種Mab進行類似實驗：
p4 LTTCDGHRACSTY (SEQ ID NO：30)
p5 RACSTYRTIYRTA (SEQ ID NO：31)
p6 RTAYRRSPGVTPA (SEQ ID NO：32)
測定Mab 10G9與18F7均識別包含序列RTIY(SEQ ID NO 33)之抗原決定基。
實例2抗EGFL7 Mab活體內抑制腫瘤生長
在此實例中，測試抗EGFL7 Mab活體內抑制數種模型中腫瘤生長之能力。首先在Colo205模型(人類結腸直腸癌)及A673模型(人類橫紋肌肉瘤模型)中測試PBS中之Mab。並未觀察到作為單一藥劑之PBS中之Mab在此等模型中之作用。
接著測試單獨Mab及/或Mab與抗EGFL7抗體B20.4.1(描述於WO 2005/012359中)之組合。在以下三種模型中測試抗體：Her2人類乳癌模型("Fo5模型")、人類肺癌(NSCLC)模型("H1299")及另一人類乳癌模型("MDA-MB231")。此等腫瘤模型已經良好建立且描述於(例如)Lee等人，Clin Cancer Res.11(16)：6065-74(2005)；Cameron等人，Cancer Cell Int.5：23(2005)；Finkle等人，Clinical Cancer Res.10：2499-251(2004)中。以抗豚草Mab(對照)、單獨B20.4、單獨18F7，或B20.4與4F11、10G9或18F7處理各動物。簡而言之，對於H1299模型而言，將1×107 H1299腫瘤細胞皮下注射於HRLN雌性nu/nu小鼠側腹；且對於MDA-MB231模型而言，將5×106 MDA-MB231腫瘤細胞皮下注射於HRLN雌性nu/nu小鼠側腹。對於各模型而言，當平均腫瘤尺寸達到100mm3(對應於圖6-9中之第0天)時開始抗體治療。每週一次以10mg/kg投與抗豚草對照Mab及B20.4，且每週兩次以10mg/kg投與4F11、10G9及18F7(在圖6、8及9中以x軸下之箭頭表示)。
在Fo5模型中未觀察到作用。在其他兩個模型中觀察到顯著腫瘤抑制作用。如圖6-7中所示，在H1299模型中，與B20.4.1組合之Mab 4F11比對照或單獨B20.4.1顯著有效。如圖8中所示，在MDA-MB231模型中，與B20.4.1組合之Mab 4F11或Mab 10G9比對照或單獨B20.4.1有效。如圖9中所示，在MDA-MB231模型中，單獨M18F7比對照有效，且與B20.4.1組合之Mab 18F7比單獨Mab 18F7或單獨B20.184.1顯著有效。
有趣的是亦觀察到在H1299模型中Mab 4F11治療阻礙停止抗VEGF治療(B20.4.1)後之完全血管恢復。當停止治療後，將經單獨B20.4.1治療之腫瘤與經B20.4.1及4F11治療之腫瘤的腫瘤血管模式相比較，觀察到腫瘤血管再生成顯著延遲。此等結果明確表明抗EGFL7療法在與抗VEGF療法組合時可提供附加或甚至協同之功效。
亦使用此項領域中可用之其他腫瘤模型測試抗EGFL7抗體之抗腫瘤活性。此等模型包括(但不限於)：LS174T(結腸)、BXPC3(前列腺)、HCT116(結腸)、MV-522(NSCLC)、SKMES(NSCLC)、Colon26(結腸)、MDA-MB231(乳房)、MCF7(乳房)、H1299(NSCLC)、SW620(結腸)、LL(肺)、Fo5(乳房)、4T1(乳房)、HT29(結腸)、SW480(結腸)、786-0(直腸)。
以下融合瘤已寄存於American Type Culture Collection®,PO Box 1549,Manassas,VA,20108,USA(ATCC®)：
此等寄存係遵國際認可用於專利程序之循微生物寄存布達佩斯 條約及相關細則(Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure and the Regulations thereunder)(布達佩斯條約)的規定進行。此確保自寄存之日起維持能活寄存物30年。此等細胞株可由ATCC遵循布達佩斯條約之條款使用，且服從Genentech,Inc與ATCC達成之協定，其確保當有關美國專利頒佈時或任何美國或國外專利申請案向公眾公開(無論何種情況首先出現)時公眾對此等細胞株永久及不受限制之使用，且確保由經授權之美國專利及商標委員會委員(U.S.Commissioner of Patents and Trademarks)根據35 USC §122及依照其之委員會規則(包括37 CFR §1.14及對886 OG 638之特別參考)所確定的人員對此等細胞株之使用。
本申請案之受讓人已同意若所寄存之細胞株在適當條件下培養時毀損或破壞，則應迅速發出通告以相同細胞株之試樣將其置換。不應將所寄存之細胞株之可用性解釋為違反任何政府當局根據其專利法律授予之權利實踐本發明之許可。
儘管上文已出於清楚理解之目的藉助說明及實例略為詳細地描述本發明，但不應將說明及實例解釋為限制本發明之範疇的限制。
【生物材料寄存】
國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】
1.食品工業發展研究所；96年06月08日；BCRC 960306
2.食品工業發展研究所；96年06月08日；BCRC 960307
3.食品工業發展研究所；96年06月08日；BCRC 960308
國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】
1.美國；American Type Culture Collection(ATCC)；2006年02月01日；PTA-7343； 2.美國；American Type Culture Collection(ATCC)；2006年02月01日；PTA-7344； 3.美國；American Type Culture Collection(ATCC)；2006年02月01日；PTA-7345
<110> 美商建南德克公司
<120> 抗EGFL7之抗體及其使用方法
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<160> 33
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Claims (57)

  1. 一種抗體，其係由一選自由以下各物組成之群之融合瘤產生：抗EGFL7 mumab 4F11.1.8、抗EGFL7 mumab 10G9.1.6及抗EGFL7 mumab 18F7.1.8。
  2. 一種抗EGFL7抗體，其包含一或多個選自由以下序列組成之群之互補判定區(CDR)：(a)4F11 CDR-L1序列KASQSVDYDGDSYMS(SEQ ID NO：5)；(b)4F11 CDR-L2序列GASNLES(SEQ ID NO：6)；(c)4F11 CDR-L3序列QQNNEDPYT(SEQ ID NO：7)；(d)4F11 CDR-H1序列TYGMS(SEQ ID NO：8)；(e)4F11 CDR-H2序列WINTHSGVPTYADDFKG(SEQ ID NO：9)；及(f)4F11 CDR-H3序列LGSSA(SEQ ID NO：10)。
  3. 如請求項2之抗EGFL7抗體，其中該抗體之輕鏈包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下序列之CDR序列：KASQSVDYDGDSYMS(SEQ ID NO：5)、GASNLES(SEQ ID NO：6)及QQNNEDPYT(SEQ ID NO：7)。
  4. 如請求項2之抗EGFL7抗體，其中該抗體之重鏈包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下序列之CDR序列：TYGMS(SEQ ID NO：8)、WINTHSGVPTYADDFKG(SEQ ID NO：9)及LGSSA(SEQ ID NO：10)。
  5. 如請求項2之抗EGFL7抗體，其中該抗體之輕鏈包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下序列之CDR序列：KASQSVDYDGDSYMS(SEQ ID NO：5)、GASNLES(SEQ ID NO：6)及QQNNEDPYT(SEQ ID NO：7)；且 其中該抗體之重鏈包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下序列之CDR序列：TYGMS(SEQ ID NO：8)、WINTHSGVPTYADDFKG(SEQ ID NO：9)及LGSSA(SEQ ID NO：10)。
  6. 如請求項2之抗EGFL7抗體，其中該抗體之輕鏈包含以下序列：DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMSWYQQKPGQPPKLLIYGASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQNNEDPYTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO：1)。
  7. 如請求項2之抗EGFL7抗體，其中該抗體之重鏈包含以下序列：QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGHTFTTYGMSWVKQAPGKGLKWMGWINTHSGVPTYADDFKGRFAFSLETSASTAHLQINNLKNEDTATYFCARLGSSAVDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：2)。
  8. 一種抗EGFL7抗體，其包含一或多個選自由以下序列組成之群之互補判定區(CDR)：(a)10G9 CDR-L1序列RSSQSLVHTNGITYLH(SEQ ID NO：11)；(b)10G9 CDR-L2序列KVSNRFS(SEQ ID NO：12)；(c)10G9 CDR-L3序列SQSTHVPLT(SEQ ID NO：13)；(d)10G9 CDR-H1序列DYYMNSDYYMN(SEQ ID NO：14)；(e)10G9 CDR-H2序列DINPKNGGTTYNQKFKG(SEQ ID NO：15)；及(f)10G9 CDR-H3序列ALGVFDY(SEQ ID NO：16)。
  9. 如請求項8之抗EGFL7抗體，其中該抗體之輕鏈包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下序列之CDR序列： RSSQSLVHTNGITYLH(SEQ ID NO：11)、KVSNRFS(SEQ ID NO：12)及SQSTHVPLT(SEQ ID NO：13)。
  10. 如請求項8之抗EGFL7抗體，其中該抗體之重鏈包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下序列之CDR序列：DYYMNSDYYMN(SEQ ID NO：14)、DINPKNGGTTYNQKFKG(SEQ ID NO：15)及ALGVFDY(SEQ ID NO：16)。
  11. 如請求項8之抗EGFL7抗體，其中該抗體之輕鏈包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下序列之CDR序列：RSSQSLVHTNGITYLH(SEQ ID NO：11)、KVSNRFS(SEQ ID NO：12)及SQSTHVPLT(SEQ ID NO：13)；且其中該抗體之重鏈包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下序列之CDR序列：DYYMNSDYYMN(SEQ ID NO：14)、DINPKNGGTTYNQKFKG(SEQ ID NO：15)及ALGVFDY(SEQ ID NO：16)。
  12. 如請求項8之抗EGFL7抗體，其中該抗體之輕鏈包含以下序列：DIVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHTNGI TYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLK ISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPLTFGAGTKVEIKR (SEQ ID NO： 3)。
  13. 如請求項8之抗EGFL7抗體，其中該抗體之重鏈包含以下序列：EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFSDYYMNSDYYMNWVKQSHGKSLEWIGDINPKNGGTTYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCAREADYDPIYYAMDYWGQGTTLTVSA(SEQ ID NO：4)。
  14. 一種抗EGFL7抗體，其與一包含一選自由以下序列組成之群之胺基酸序列之多肽特異性結合：CCP、RTIY(SEQ ID NO 33)。
  15. 一種經分離抗體，其與如請求項1至14中任一項之抗體結合於人類EGFL7上之相同抗原決定基。
  16. 一種經分離抗體，其與如請求項1至14中任一項之抗體競爭與EGFL7結合。
  17. 如請求項1至16中任一項之抗體，其中該抗體為單株抗體。
  18. 如請求項1至16中任一項之抗體，其中該抗體係選自由嵌合抗體、人化抗體、親和力成熟抗體、人類抗體及雙特異性抗體組成之群。
  19. 如請求項1至16中任一項之抗體，其中該抗體為一抗體片段。
  20. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至19中任一項之抗EGFL7抗體。
  21. 如請求項20之醫藥組合物，其另外包含抗血管生成劑。
  22. 如請求項21之醫藥組合物，其中該抗血管生成劑係選自由貝伐單抗(bevacizumab)及雷尼株單抗(ranibizumab)組成之群。
  23. 一種聚核苷酸，其編碼如請求項1至19中任一項之抗體。
  24. 一種載體，其包含如請求項23之聚核苷酸。
  25. 如請求項24之載體，其中該載體為一表現載體。
  26. 一種宿主細胞，包含如請求項24或25之載體。
  27. 如請求項26之宿主細胞，其中該宿主細胞為原核細胞。
  28. 如請求項26之宿主細胞，其中該宿主細胞為真核細胞。
  29. 如請求項26之宿主細胞，其中該宿主細胞為哺乳動物細胞。
  30. 一種製造抗EGFL7抗體之方法，該方法包含(a)使如請求項25之載體在一適當宿主細胞中表現；及(b)回收該抗體。
  31. 如請求項30之方法，其中該宿主細胞為原核細胞。
  32. 如請求項30之方法，其中該宿主細胞為真核細胞。
  33. 一種如請求項1至19中任一項之抗EGFL7抗體或如請求項20之醫 藥組合物之用途，其係用於製造降低或抑制一患有與血管生成相關之病理病況之受檢者體內血管生成之藥物。
  34. 如請求項33之用途，其中該病理病況為贅瘤。
  35. 如請求項34之用途，其中該贅瘤為癌瘤。
  36. 如請求項33之用途，其中該病理病況係與眼有關。
  37. 如請求項36之用途，其中該病理病況為眼內新生血管疾病。
  38. 如請求項33至35中任一項之用途，其另外包含向該受檢者投與抗血管生成劑。
  39. 如請求項38之用途，其中該抗血管生成劑為血管內皮生長因子(VEGF)之拮抗劑。
  40. 如請求項39之用途，其中該拮抗劑為抗VEGF抗體。
  41. 如請求項40之用途，其中該抗VEGF抗體為貝伐單抗。
  42. 如請求項36或37之用途，其另外包含向該受檢者投與抗血管生成劑。
  43. 如請求項42之用途，其中該抗血管生成劑為血管內皮生長因子(VEGF)之拮抗劑。
  44. 如請求項43之用途，其中該拮抗劑為抗VEGF抗體。
  45. 如請求項44之用途，其中該抗VEGF抗體為雷尼株單抗。
  46. 如請求項38之用途，其中該抗血管生成劑係在投與該抗EGFL7抗體之前或之後投與。
  47. 如請求項38之用途，其中該抗血管生成劑係與該抗EGFL7抗體同時投與。
  48. 一種如請求項1至19中任一項之抗體或如請求項20或21之醫藥組合物之用途，其係用於製造增強一患有與血管生成相關之病理病況之受檢者體內抗血管生成劑之功效之藥物。
  49. 如請求項48之用途，其中該病理病況為贅瘤。
  50. 如請求項49之用途，其中該贅瘤為癌瘤。
  51. 如請求項48至50中任一項之用途，其中該抗血管生成劑為貝伐單抗。
  52. 如請求項48至50中任一項之用途，其另外包含投與化學治療劑。
  53. 如請求項48之用途，其中該病理病況係與眼有關。
  54. 如請求項53之用途，其中該病理病況為眼內新生血管疾病。
  55. 如請求項53或54之用途，其中該抗血管生成劑為雷尼株單抗。
  56. 如請求項53或54之用途，其另外包含投與皮質類固醇。
  57. 如請求項53或54之用途，其另外包含投與光動力療法。
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