MX2008011663A

MX2008011663A - Anticuerpos de la egfl7 y metodos de uso.

Info

Publication number: MX2008011663A
Application number: MX2008011663A
Authority: MX
Inventors: Maike Schmidt; Weilan Ye; Yan Wu; Jo-Anne Hongo
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2006-03-16
Filing date: 2007-03-16
Publication date: 2008-09-22
Also published as: AU2007226522A1; JP5363972B2; EP1994056A2; NZ570588A; IL193514A0; AR059851A1; IL223416A0; EP2468772A3; CA2646513A1; US20130129735A1; KR20080099328A; US20110200602A1; NO20084320L; RU2008140947A; KR101038633B1; CR10280A; EP2468772A2; JP5364137B2; BRPI0707047A2; WO2007106915A3

Abstract

La invención proporciona anticuerpos anti-EGFL7, composiciones que comprenden estos anticuerpos y métodos de uso de los mismos.

Description

ANTICUERPOS DE LA EGFL7 Y MÉTODOS DE USO ÁMBITO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere generalmente a las composiciones y los métodos que resultan útiles para la modulación del desarrollo vascular. La presente invención se refiere específicamente a los anticuerpos que se unen al polipéptido del dominio 7 similar al factor de crecimiento epidérmico (Epidermal Growth Factor-Like Domain 7) (EGFL7) . La presente invención se refiere además al diagnóstico y el tratamiento de las afecciones y enfermedades asociadas a la angiogénesis .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El desarrollo de un medio de aporte vascular es un requisito fundamental para muchos procesos fisiológicos y patológicos. Los tejidos que experimentan un crecimiento activo, como embriones y tumores, necesitan un adecuado aporte sanguíneo. Dichos tejidos satisfacen esta necesidad mediante la producción de factores proangiogénicos , que fomentan la formación de nuevos vasos sanguíneos mediante un proceso denominado angiogénesis. La formación de los conductos vasculares es un proceso biológico complejo pero perfectamente ordenado que comprende la totalidad o gran parte de los pasos siguientes: a) las células endoteliales (CE) proliferan a partir de las células endoteliales existentes o se diferencian a partir de las células progenitoras ; b) las células endoteliales migran y se fusionan para formar estructuras en forma de cordón; c) los cordones vasculares experimentan entonces el proceso de tubulogénesis para formar vasos con un lumen central; d) de los cordones o vasos existentes empiezan a salir ramificaciones para formar vasos secundarios; e) el primitivo plexo vascular experimenta un nuevo remodelado; y f) las células periendoteliales son atraídas para revestir a los tubos endoteliales, cumpliendo así funciones moduladoras y de sostén de los vasos. Estas células incluyen pericitos para capilares pequeños, células de músculo liso para vasos de mayor tamaño y miocardiocitos en el corazón. Hanahan, Science 277:48-50 (1997) ; Hogan & Kolodzie , Nat. Rev. Genet . 3:513-23 (2002); Lubarsky & Krasnow, Cell 112:19-28 (2003) . Se ha demostrado sobradamente que la angiogénesis interviene en la patogénesis de diversos trastornos. Estos trastornos incluyen tumores sólidos y metástasis, ateroesclerosis, fibroplasia retrolental, hemangiomas, inflamación crónica, enfermedades neovasculares infraoculares como retinopatias proliferativas, por ejemplo, retinopatía diabética, degeneración macular asociada a la edad (DMAE), glaucoma neovascular, rechazo inmunitario de tejido corneal trasplantado y de otros tejidos, artritis reumatoide y psoriasis. Folkman et al., J. Biol . Chem . 267:10931-34 (1992) ; Klagsbrun et al., Annu . Rev. Physiol. 53:217-39 (1991); y Garner A., "Vascular diseases," en: Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner A., lintworth GK, eds., 2nd Edition (Marcel Dekker, NY , 1994), pp 1625-1710. En el caso del crecimiento tumoral, la angiogénesis parece ser crucial para la transición de hiperplasia a neoplasia y para proporcionar alimentación para el crecimiento y la metástasis del tumor. Folkman et al., Nature 339:58 (1989) . La neovasculari zación permite que las células tumorales adquieran una ventaja de crecimiento y autonomía proliferativa frente a las células normales. Un tumor suele comenzar como una única célula anómala que puede proliferar sólo hasta un tamaño de unos pocos milímetros cúbicos debido a la distancia desde los lechos capilares disponibles y puede permanecer "inactiva" sin crecer ni diseminarse durante un largo período de tiempo. Algunas células tumorales cambian entonces a un fenotipo angiogénico para activar células endoteliales , que proliferan y maduran hasta convertirse en nuevos vasos sanguíneos capilares. Estos vasos sanguíneos recién formados no sólo permiten el crecimiento continuo del tumor primario, sino también la diseminación y recolonización de células tumorales metastásicas . Por ello, se ha observado una correlación entre la densidad de los microvasos en cortes histológicos de tumores y la supervivencia de pacientes con cáncer de mama, así como con otros tumores. Weidner et al., N. Engl . J. Med. 324:1-6 (1991) ; Horak et al., Lancet 340:1120-24 (1992) ; Macchiarini et al., Lancet 340:145-46 (1992) . No se conoce bien el mecanismo exacto que controla el cambio angiogénico, pero se cree que la neovascularización de la masa tumoral es consecuencia del equilibrio neto de diversos estimuladores e inhibidores de la angiogénesis (Folkman, Wat. Med. 1(1) :27-31 (1995) ) . El proceso de desarrollo vascular está completamente regulado. Hasta la fecha, se ha demostrado que un número significativo de moléculas, en su mayoría secretadas por factores producidos por células circundantes, regula la diferenciación, proliferación y migración de las células endoteliales y su fusión en estructuras semejantes a cordones. Por ejemplo, se ha determinado que el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) es el factor clave que interviene en la estimulación de la angiogénesis y en la inducción de la permeabilidad vascular. Ferrara et al., Endocr . Rev. 18:4-25 (1997) . El descubrimiento de que la pérdida de un único alelo del VEGF ocasiona letalidad embrionaria indica un papel insustituible desempeñado por este factor en el desarrollo y la diferenciación del sistema vascular. Asimismo, se ha demostrado que el VEGF es un mediador clave en la neovasculari zación asociada a tumores y trastornos infraoculares. Ferrara et al., Endocr. Rev. supra. El ARNm del VEGF está sobreexpresado en la mayoría de los tumores humanos examinados. Berkman et al., J. Clin. Invest. 91:153-59 (1993) ; Brown et al., Human Pathol. 26:86-91 (1995); Brown et al., Cáncer Res. 53:4727-35 (1993) ; Mattern et al., Brit. J. Cáncer 73:931-34 (1996) ; Dvorak et al., Am. J. Pathol. 146:1029-39 (1995) . Asimismo, existe una gran correlación entre los niveles de concentración del VEGF en los líquidos oculares y la presencia de proliferación activa de vasos sanguíneos en pacientes con retinopatía diabética y otras retinopatías asociadas a isquemia. Aiello et al., N. Engl . J. Med. 331:1480-87 (1994) . Además, se ha demostrado en estudios la localización del VEGF en membranas neovasculares coroidales en pacientes con DMAE . López et al., Invest. Ophthalmol.

Vis. Sci. 37:855-68 (1996) . Los anticuerpos neutralizantes anti-VEGF inhiben el crecimiento de diversas lineas de células tumorales humanas en ratones atimicos desnudos (Kim et al., Nature 362:841-44 (1993); Warren et al., J. Clin. Invest. 95:1789-97 (1995) ; Borgstróm et al., Cáncer Res. 56:4032-39 (1996) ; Melnyk et al., Cáncer Res. 56:921-24 (1996) ) y también inhiben la angiogénesis intxaocular en modelos con trastornos retiñíanos isquémicos (Adamis et al., Arch . Ophthalmol . 114:66-71 (1996) ) . Por lo tanto, los anticuerpos monoclonales anti-VEGF u otros inhibidores de la acción del VEGF son prometedores candidatos para el tratamiento de tumores y diversos trastornos neovasculares intraoculares . Estos anticuerpos se describen, por ejemplo, en EP 817.648, publicado el 14 de enero de 1998, y en los documentos WO 98/45331 y WO 98/45332, ambos publicados el 15 de octubre de 1998. Un anticuerpo anti-VEGF, bevacizumab, ha sido aprobado por la FDA para su uso en combinación con un tratamiento a base de quimioterapia para tratar el cáncer colorrectal metastásico (CRC) . Además, el bevacizumab se está investigando en muchos ensayos clínicos en marcha para el tratamiento de diversas indicaciones en neoplasias malignas.

Se sabe que la matriz extracelular (MEC) desempeña un importante papel durante el proceso de angiogénesis . Madri, Transpl. Immunol. 5:179-83 (1997) . Durante su migración las CE están rodeadas por una MEC y después de formar un lumen se adhieren a las membranas básales vasculares recién sintetizadas. Además de servir de andamio durante la morfogénesis capilar, se ha demostrado que la MEC ejerce complejos controles locales sobre las funciones de la CE. Por ejemplo, la MEC puede regular la disponibilidad de mediadores angiogénicos solubles para las CE y determinar la naturaleza y el tipo de interacciones con la integrina y las moléculas de adhesión celular. También se ha sugerido que la supervivencia de las CE es regulada por la cooperación entre los receptores del factor de crecimiento y las integrinas, que a su vez están controladas por la composición de la MEC local. Stupack & Cheresh, Oncogene 22 : 9022-29 (2003) . A pesar de los numerosos avances en el campo de la angiogénesis, algunos de los pasos de la formación de los conductos de los vasos siguen sin estar bien definidos. En particular, poco se sabe sobre la manera en que se regula la tubulogénesis , es decir el modo en que evolucionan los cordones vasculares hasta convertirse en tubos y cuáles son los factores que regulan esa transición. Ante el papel de la angiogénesis en numerosos trastornos y enfermedades, seria útil contar con medios para reducir o inhibir uno o más de los efectos biológicos que provocan esos procesos. También lo seria disponer de medios para realizar ensayos dirigidos a detectar la presencia de polipéptidos patogénicos en estados normales y de enfermedad, especialmente en el cáncer. También existe la necesidad de contar con composiciones y métodos que puedan aumentar la eficacia de las terapias antiangiogénesis existentes.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La invención se basa en parte en la identificación de anticuerpos contra la EGFL7 con propiedades que indican que son particularmente ventajosos para la terapia. En un aspecto, la invención ofrece anticuerpos producidos hibridomas muMAb (anticuerpo monoclonal murino) 4F11.1.8 ant Í-EGFL7 , muMAb 10G9.1.6 anti-EGFL7 y muMAb 18F7.1.8 ant Í-EGFL7. En otro aspecto, la invención ofrece un anticuerpo anti-EGFL7 que comprende una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) seleccionadas a partir del grupo compuesto por: (a) 4F11 CDR-L1 secuencia KASQSVDYDGDSYMS (ID. SEC. N° 5) ; . (b) 4F11 CDR-L2 secuencia GASNLES (ID. SEC. N° 6); (c) 4F11 CDR-L3 secuencia QQNNEDPYT (ID. SEC. N° 7) ; (d) 4F11 CDR-H1 secuencia TYGMS (ID. SEC. N° 8) ; (e) 4F11 CDR-L2 secuencia WINTHSGVPTYADDFKG (ID. SEC. N° 9) ; y (f) 4F11 CDR-H3 secuencia LGSSA (ID. SEC. N° 10) . En algunas formas de realización, la cadena ligera de dichos anticuerpos comprende al menos una, dos o tres de las secuencias de las CDR seleccionadas de: KASQSVDYDGDSYMS (ID. SEC. N° 5), GASNLES (ID. SEC. N° 6) y QQNNEDPYT (ID. SEC. N° 7) . En algunas formas de realización, la cadena pesada de dichos anticuerpos comprende al menos una, dos o tres de las secuencias de las CDR seleccionadas de: TYGMS (ID. SEC. N° 8) , WINTHSGVPTYADDFKG (ID. SEC. N° 9) y LGSSA (ID. SEC. N° 10) . En algunas formas de realización, la cadena ligera de dichos anticuerpos comprende al menos una, dos o tres de las secuencias de las CDR seleccionadas de: KASQSVDYDGDSYMS (ID. SEC. N° 5) , GASNLES (ID. SEC. N° 6) y QQNNEDPYT (ID. SEC. N° 7) ; y la cadena pesada de dichos anticuerpos comprende al menos una, dos o tres de las secuencias de las CDR seleccionadas de: TYGMS (ID. SEC. N° 8), WINTHSGVPTYADDFKG (ID. SEC. N° 9) y LGSSA (ID. SEC. N° 10) . En algunas formas de realización, la cadena ligera del anticuerpo comprende la secuencia : DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMSWYQQKPGQPPKLLIYGASNLESG I PARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQNNEDPYTFGGGTKVEIKR (ID. SEC.

N° 1) . En algunas formas de realización, la cadena pesada del anticuerpo comprende la secuencia: QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGHTFTTYGMS VKQAPGKGLKWMGWINTHSGVPTYA DDFKGRFAFSLETSASTAHLQINNLKNEDTATYFCARLGSSAVDYWGQGTTVTVSS (ID. SEC. N° 2) . En otro aspecto, la invención ofrece un anticuerpo anti-EGFL7 que comprende una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) seleccionadas a partir del grupo compuesto por: (a) 10G9 CDR-L1 secuencia RSSQSLVHTNGITYLH (ID. SEC. N° 11) ; (b) 10G9 CDR-L2 secuencia KVSNRFS (ID. SEC. N° 12) ; (c) 10G9 CDR-L3 secuencia SQSTHVPLT (ID. SEC. N° 13) ; (d) 10G9 CDR-H1 secuencia DYYMNSDYYMN (ID. SEC. N° 14) ; (e) 10G9 CDR-L2 secuencia DINPKNGGTTYNQKFKG (ID. SEC. N° 15); y (f) 10G9 CDR-H3 secuencia ALGVFDY (ID. SEC. N° 16) . En algunas formas de realización, la cadena ligera de dichos anticuerpos comprende al menos una, dos o tres de las secuencias de las CDR seleccionadas de: RSSQSLVHTNGITYLH (ID. SEC. N° 11), KVSNRFS (ID. SEC. N° 12) y SQSTHVPLT (ID. SEC. N° 13) . En algunas formas de realización, la cadena pesada de dichos anticuerpos comprende al menos una, dos o tres de las secuencias de las CDR seleccionadas de: DYYMNSDYYMN (ID. SEC. N° 14), DINPKNGGTTYNQKFKG (ID. SEC. N° 15) y ALGVFDY (ID. SEC. N° 16) . En algunas formas de realización, la cadena ligera de dichos anticuerpos comprende al menos una, dos o tres de las secuencias de las CDR seleccionadas de: RSSQSLVHTNGITYLH (ID. SEC. N° 11) , KVSNRFS (ID. SEC. N° 12) y SQSTHVPLT (ID. SEC. N° 13) ; y la cadena pesada de dichos anticuerpos comprende al menos una, dos o tres de las secuencias de las CDR seleccionadas de: DYYMNSDYYMN (ID. SEC. N° 14), DINPKNGGTTYNQKFKG (ID. SEC. N° 15) y ALGVFDY (ID. SEC. N° 16) . En algunas formas de realización, la cadena ligera del anticuerpo comprende la secuencia: DIVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHTNGITYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPLTFGAGTKVEIKR (ID. SEC. N° 3) . En algunas formas de realización, la cadena pesada del anticuerpo comprende la secuencia: EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFSDY YMNSDYYMNWVKQSHGKSLEWIGDINPKNGGTTYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLT SEDSAVYYCAREADYDPI YYAMDYWGQGTTLTVSA (ID. SEC. N° 4) . En algunas formas de realización, la invención ofrece anticuerpos anti-EGFL7 que se unen específicamente a un polipéptido que comprende una de las siguientes secuencias de aminoácidos: CCP, TIY y ACS . En algunas formas de realización, la invención ofrece anticuerpos aislados que se unen al mismo epítopo en la EGFL7 humana como otros anticuerpos de la invención. En algunas formas de realización, la invención ofrece anticuerpos aislados que compiten por unirse a la EGFL7 con otros anticuerpos de la invención . En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo monoclonal . En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo con maduración de afinidad, un anticuerpo humano o un anticuerpo biespecifico . En algunas formas de realización, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. En algunas formas de realización, la invención ofrece una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-EGFL7 de la invención. En algunas formas de realización, la composición farmacéutica comprende además un agente antiangiogénico . En algunas formas de realización, el agente antiangiogénico es bevacizumab o ranibizumab. En algunas formas de realización, la invención ofrece un polinucleótido que codifica a un anticuerpo de la invención. En algunas formas de realización, la invención ofrece vectores que comprenden a esos polinucleótidos . En algunas formas de realización, los vectores son vectores de expresión. En algunas formas de realización, la invención ofrece células huésped, incluidas las células procarióticas y eucarióticas (incluidas las expresiones celulares de los mamíferos), que comprenden a dichos vectores. En algunas formas de realización, la invención ofrece un método para crear un anticuerpo anti-EGFL7 que comprenda (a) la expresión de un vector de expresión en una célula huésped apropiada y (b) la recuperación del anticuerpo. En algunas formas de realización, la invención ofrece un método para reducir o inhibir la angiogénesis en un sujeto con un estado patológico asociado a la angiogénesis, que comprende la administración al sujeto de una cantidad eficaz del anticuerpo anti-EGFL7 de la invención o una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-EGFL7 de la invención. En algunas formas de realización, el estado patológico es un neoplasma, p.ej. un carcinoma. En algunas formas de realización, el estado patológico está asociado con los ojos, p.ej. una enfermedad neovascular infraocular. En algunas formas de realización, se administra al sujeto un agente antiangiogénico además de un anticuerpo anti-EGFL7 de la invención. En algunas formas de realización, el agente antiangiogénico es un antagonista del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , p.ej. un anticuerpo anti-VEGF (incluidos bevacizumab y ranibizumab) . En algunas formas de realización, el agente antiangiogénico se administra antes o inmediatamente después de la administración del anticuerpo anti-EGFL7. En algunas formas de realización, el agente antiangiogénico se administra simultáneamente con el anticuerpo anti-EGFL7. En algunas formas de realización, la invención ofrece un método para mejorar la eficacia de un agente antiangiogénico en un sujeto con un estado patológico asociado a la angiogénesis , que comprende la administración al sujeto de un anticuerpo anti-EGFL7 de la invención o la composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-EGFL7 de la invención. En algunas formas de realización, el estado patológico es un neoplasma, p.ej. un carcinoma. En algunas formas de realización, el estado patológico está asociado con los ojos, p.ej. una enfermedad neovascular infraocular. En algunas formas de realización, se administra al sujeto un agente antiangiogénico además de un anticuerpo anti-EGFL7 de la invención. En algunas formas de realización, el agente antiangiogénico es un antagonista del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , p.ej. un anticuerpo anti-VEGF (incluidos bevacizumab y ranibizumab) . En algunas formas de realización, el agente antiangiogénico se administra antes o inmediatamente después de la administración del anticuerpo anti-EGFL7. En algunas formas de realización, el agente antiangiogénico se administra simultáneamente con el anticuerpo anti-EGFL7. En algunas formas de realización se administran también otros tratamientos, p.ej. una terapia corticosteroidea o fotodinámica .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS ESQUEMAS La FIGURA 1 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera del Mab (anticuerpo monoclonal) 4F11 (ID. SEC. N° 1 y HuKI (ID. SEC. N° 17) . La FIGURA 2 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada del Mab 4F11 (ID. SEC. N° 2) y HuIII (ID. SEC. N° 18) . La FIGURA 3 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera del Mab 10G9 (ID. SEC. N° 3 y HuKI (ID. SEC. N° 17) . La FIGURA 4 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada del Mab 10G9 (ID. SEC. N° 4) y HuIII (ID. SEC. N° 18) . La FIGURA 5 ilustra los dominios EGFL7 de longitud completa y las formas truncadas de los mismos usados para mapear los sitios de unión de los anticuerpos. La FIGURA 6 muestra el volumen del tumor en vivo en un modelo de xenotransplante murino de cáncer de pulmón humano (NSCLC; H1299) durante el tratamiento con los anticuerpos anti-VEGF y anti-EGFL7 de la invención. La FIGURA 7 muestra la supervivencia en un modelo de xenotransplante murino de cáncer de pulmón humano en vivo (NSCLC; H1299) durante el tratamiento con los anticuerpos anti-VEGF y anti-EGFL7 de la invención. La FIGURA 8 muestra el volumen del tumor en vivo en un modelo de xenotransplante murino de cáncer de mama humano (MDA-MB231 ) durante el tratamiento con los anticuerpos anti-VEGF y anti-EGFL7 de la invención. La FIGURA 9 muestra el volumen del tumor en vivo en un modelo de xenotransplante murino de cáncer de mama humano (MDA-MB231) durante el tratamiento con los anticuerpos anti-VEGF y Mab (anticuerpo monoclonal) 18F7 anti-EGFL7 de la invención .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PREFERENTES La invención contenida en la presente memoria descriptiva proporciona anticuerpos anti-EGFL7, que son útiles, por ejemplo, para el tratamiento o la prevención de estados de enfermedad asociados a la expresión y/o actividad de la EGFL7, como aumento de la expresión y/o actividad o expresión y/o actividad no deseadas. En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención se utilizan para tratar un tumor, un cáncer y/o un trastorno de proliferación celular. En otro aspecto, los anticuerpos anti-EGFL7 de la invención tienen utilidad como reactivos para la detección y/o el aislamiento de la EGFL7, como la detección de la EGFL7 en diversos tejidos y tipos celulares. La invención también proporciona métodos para la fabricación de anticuerpos anti-EGFL7, pol inucleótidos que codifiquen anticuerpos anti-EGFL7 y células que contengan polinucleótidos que codifiquen anticuerpos anti-EFGL7. Técnicas generales Las técnicas y procedimientos descritos o referenciados en la presente memoria descriptiva se conocen bien, por lo general, y se emplean habitualmente con la metodología tradicional usada por los expertos en la materia, como, por ejemplo, las metodologías ampliamente utilizadas descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., CURRENT PROTOCOLS EN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel et al. eds . , (2003)); la serie METHODS EN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D . Hames y G. R. Taylor eds . (1995)), Harlow y Lane, eds . (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, y ANIMAL CELL CULTURE ( R . I. Freshney, ed. (1987)). Definiciones Un anticuerpo "aislado" es aquél que se ha identificado y separado, y/o recuperado, a partir de un componente de su entorno natural. "Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que podrían interferir en el diagnóstico o los usos terapéuticos del anticuerpo, incluyendo enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos y no proteináceos. En algunas formas de realización, el anticuerpo se purificará (1) en más del 95% de su peso tal como se determina por el método de Lowry> y a veces en más del 99% de su peso, (2) en un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia N terminal o interna de aminoácidos mediante un secuenciador de taza giratoria, o (3) hasta alcanzar la homogeneidad mediante SDS-PAGE, en condiciones reductoras o no reductoras, empleando una tinción con azul de Coomassie o plata. Los anticuerpos aislados incluyen el anticuerpo en situ dentro de células recombinantes , ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. En cualquier caso, normalmente, el anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación. Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que se identifica y separa de, al menos, una molécula contaminante de ácido nucleico con la que se asocia habitualmente en la fuente natural del ácido nucleico del anticuerpo. Una molécula de ácido nucleico aislada es distinta de la forma o entorno en los que se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico aisladas se distinguen de la molécula de ácido nucleico que existe en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que habitualmente expresan el anticuerpo donde, por ejemplo, la molécula del ácido nucleico está en una posición cromosómica distinta de la que tiene en las células naturales. El término "numeración de residuos de dominio variable como en Kabat" o "numeración de la posición de los aminoácidos como en Kabat", y las variaciones de los mismos, se refiere al sistema de numeración usado para los dominios variables de cadena pesada o los dominios variables de cadena ligera de la compilación de anticuerpos en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunologícal Interest, 5th Ed.

Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) . Utilizando este sistema de numeración, la secuencia lineal real de aminoácidos puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales que correspondan a un acortamiento de una FR o CDR del domino variable o a una inserción en ellas. Por ejemplo, un dominio variable de la cadena pesada puede incluir una única inserción de aminoácidos (residuo 52a según Kabat) después del residuo 52 de H2 y residuos insertados (por ejemplo, residuos 82a, 82b y 82c, etc., según Kabat) después de un residuo 82 de la FR de la cadena pesada. La numeración de Kabat de los residuos puede estar determinada para un anticuerpo dado por una alineación en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia "estándar" numerada según Kabat. Las frases " sustancialmente similar" o "sustancialmente el/la mismo (a)", tal y como se usan en la presente memoria descriptiva, indican un grado suficientemente elevado de similitud entre dos valores numéricos (por lo general, uno asociado a un anticuerpo de la invención y el otro asociado a un anticuerpo de control /referencia ) , de forma que alguien experto en la materia consideraría la diferencia entre los dos valores de escasa o ninguna significación estadística y/o biológica dentro del contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, valores Kd) . En general, la diferencia entre estos dos valores es aproximadamente inferior al 50%, 40%, 30%, 20% ó 10% en función del valor del anticuerpo de control/referencia. Por "afinidad de unión" generalmente se entiende la fuerza de la suma total de las interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su molécula de enlace (por ejemplo, un antigeno) . Salvo indicación en contrario, tal como se usa en la presente memoria descriptiva, por "afinidad de unión" se entiende la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno) . La afinidad de una molécula X por su molécula de enlace Y se puede representar por lo general mediante la constante de disociación (Kd) . La afinidad se puede medir mediante métodos habituales conocidos en la especialidad, incluidos los descritos en la presente memoria descriptiva. Los anticuerpos de baja afinidad se suelen unir al antígeno lentamente y se suelen disociar de inmediato, mientras que los anticuerpos de alta afinidad se unen al antígeno más rápidamente, por lo general, y suelen permanecer unidos más tiempo. Existen diversos métodos para medir la afinidad de unión conocidos en la especialidad y todos ellos se pueden utilizar para los fines de la presente invención. A continuación, se describen, a modo de ejemplo, formas de realización especificas. En una forma de realización, la "Kd" o el "valor Kd" según esta invención se mide mediante un ensayo de unión a antigenos radiomarcados (RIA) realizado con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antigeno, descrito por el siguiente ensayo que mide la afinidad de unión en solución de Fab a antigenos equilibrando los Fab con una concentración mínima del antígeno marcado con (125I) en presencia de una serie de titulación de antígeno no marcado y, luego, capturando el antígeno unido con una placa con revestimiento de anticuerpos anti-Fab (Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-81). Para establecer las condiciones del ensayo, las placas de microtitulación (Dynex) son recubiertas durante toda la noche con 5 yg/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en 50 mM de carbonato sódico (pH 9,6) y, a continuación, son bloqueadas con 2% (p/v) de albúmina de suero bovino en PBS durante dos a cinco horas a temperatura ambiente (23 °C aproximadamente) . En una placa no adsorbente (Nunc N° 269620), 100 p o 26 p de antígeno marcado con [125I] se mezclan con diluciones seriadas de un Fab de interés (por ejemplo, que concuerde con la evaluación de un anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et al., Cáncer Res. 57:4593-99 (1997)) . A continuación, el Fab de interés se incuba durante toda la noche; no obstante, la incubación puede continuar durante más tiempo (por ejemplo, 65 horas) para garantizar que se alcanza el equilibrio. Después, las mezclas se transfieren a la placa de captura para su incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora) . Luego, se extrae la solución y se lava la placa ocho veces con Tween-20 al 0,1% en PBS . Una vez secas las placas, se añaden 150 µ?/pocillo de centelleador (MicroScint-20 ; Packard) y las placas se cuentan en un contador gamma Topcount (Packard) durante diez minutos. Se eligen concentraciones de cada Fab que proporcionan menos del 20% de unión máxima o un 20% para uso en ensayos de unión competitivos. Según otra forma de realización, el Kd o valor Kd se mide utilizando análisis de resonancia plasmón de superficie que usa BIAcore™-2000 o BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, New Jersey) a 25°C con chips CM5 de antigeno inmovilizado a -10 unidades de respuesta (RU) . Los biosensores de dextrano carboximet ilado (CM5, BIAcore Inc) se activan con clorhidrato de N-etil-N' -( 3-dimetilaminopropil ) -carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS), según las instrucciones del proveedor. El antigeno se diluye con 10 mM de acetato sódico, pH 4,8, a 5 g/ml (-0,2 µ ) antes de la inyección a un caudal de 5 µ?/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de la proteina emparejada. Tras la inyección del antigeno, se inyecta 1 M de etanolamina para bloquear grupos no reaccionados. Para mediciones cinéticas, se inyecta el doble de diluciones seriadas de Fab (0,78 nM a 500 mM) en PBS con 0,05% de Tween 20 (PBST) a 25°C a un caudal de 25 µ?/min aproximadamente. Las tasas de asociación (kon) y las tasas de disociación (koff) se calculan utilizando un sencillo modelo de unión uno a uno de Langmuir (BIAcore Evaluation Software, versión 3.2) al encajar simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación de equilibrio (Kd) se calcula como el cociente koff/kon. Véase, p.ej., Chen, Y., et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999) . Si la tasa de asociación es superior a 106 M'1 S-1 según el ensayo de resonancia plasmón de superficie mencionado anteriormente, la tasa de asociación se puede determinar utilizando una técnica de absorción fluorescente que mide el aumento o la disminución de la intensidad de la emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, 16 nm de frecuencia) a 25°C de 20 nM de un anticuerpo ant i-antigeno (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones cada vez más elevadas de antígeno según medición en un espectrómetro, como un espectrómetro equipado con módulo "stop-flow" (interruptor de flujo) (Aviv Instruments) o un espectrómetro SLM-Aminco serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta con agitador. Según esta invención, también se puede determinar la "tasa de asociación" o "kon" con la misma técnica de resonancia plasmón de superficie descrita anteriormente utilizando BIAcore™-2000 o BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, New Jersey) a 25 °C con chips CM5 de antigeno inmovilizado a -10 unidades de respuesta (RU) . Los biosensores de dextrano carboximet ilado ,(CM5, BIAcore Inc) se activan con clorhidrato de N-etil-N' - ( 3-dimetilaminopropil ) -carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS), según las instrucciones del proveedor. El antigeno se diluye con 10 m de acetato sódico, pH 4,8, a 5 g/ml (-0,2 µ?) antes de la inyección a un caudal de 5 µ?/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de la proteina emparejada. Tras la inyección del antigeno, se inyecta 1 M de etanolamina para bloquear grupos no reaccionados. Para mediciones cinéticas, se inyecta el doble de diluciones seriadas de Fab (0,78 nM a 500 nM) en PBS con 0,05% de Tween 20 (PBST) a 25°C a un caudal de 25 µ?/min aproximadamente. Las tasas de asociación (kon) y las tasas de disociación (koff) se calculan utilizando un sencillo modelo de unión uno a uno de Langmuir (BIAcore Evaluation Software, versión 3.2) al encajar simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación de equilibrio (Kd) se calculó como el cociente koff/kon. Véase, p.ej., Chen, Y., et al., J. Mol. Biol . 293:865-81 (1999) . Sin embargo, si la tasa de asociación es superior a 106 M"1 S"1 según el ensayo de resonancia plasmón de superficie mencionado anteriormente, generalmente la tasa de asociación se puede determinar utilizando una técnica de absorción fluorescente que mide el aumento o la disminución de la intensidad de la emisión de fluorescencia (excitación = 295 nra; emisión = 340 nm, 16 nm de frecuencia) a 25°C de 20 nM de un anticuerpo anti-ant igeno (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones cada vez más elevadas de antigeno según medición en un espectrómetro, como un espect ómetro equipado con módulo "stop-flow" (interruptor de flujo) (Aviv Instruments) o un espectrómetro SLM-Aminco serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta con agitador. En la presente memoria descriptiva, por "vector" se entiende una molécula de un ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que hace referencia a un bucle de ADN circular de doble hebra al que se pueden ligar segmentos adicionales de ADN. Otro tipo de vector es un vector fágico. Otro tipo de vector es un vector vírico, en el que segmentos adicionales de ADN se pueden ligar al genoma vírico. Algunos vectores tienen capacidad de replicación autónoma en un huésped celular en que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores episomales en mamíferos) . Otros vectores (por ejemplo, vectores no episomales en mamíferos) se pueden integrar en el genoma de un huésped celular al introducirse en el huésped y, de este modo, se replican al mismo tiempo que el genoma del huésped. Asimismo, hay vectores capaces de dirigir la expresión de genes a los que están enlazados por su función. Estos vectores se denominan en la presente memoria descriptiva "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente "vectores recombinantes"). En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante tienen con frecuencia la forma de plásmidos . En la presente especificación, los términos "plásmido" y "vector" son intercambiables, dado que el plásmido es la forma de vector más frecuentemente usada. En la presente memoria descriptiva, "polinucleótido" o "ácido nucleico" son términos usados indistintamente y se refieren a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud e incluyen ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos , ribonucleótidos , nucleótidos modificados o bases, y/o sus análogos, o cualquier sustrato que se pueda incorporar a un polímero mediante ADN o ARN polimerasa o mediante una reacción sintética. Un polinucleótido puede incluir nucleótidos modificados, como nucleótidos metilados y sus análogos. De estar presente, la modificación de la estructura del nucleótido se puede producir antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos puede ser interrumpida por componentes no nucleótidos. Un polinucleótido puede ser modificado nuevamente tras la síntesis, por ejemplo mediante conjugación con un marcador. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, "cofias", sustitución de uno o más de los nucleótidos que se producen de forma natural por un análogo; modificaciones de enlaces internucleótidos , como aquellas en las que intervienen enlaces no cargados (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres , fosfoamidatos , carbamatos, etc.) y enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos , fosforoditioatos, etc.); las que contienen porciones colgantes, como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos de señal, poli-L-lisina, etc.) ; las que contienen intercaladores (por ejemplo, acridina, psoralen, etc.) ; las que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radioactivos, boro, metales oxidativos, etc.) ; las que contienen alquilantes; las que contienen enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos anoméricos alfa, etc.) , asi como formas no modificadas de polinucleót ido ( s ) . Asimismo, cualquiera de los grupos hidroxilo presentes habitualmente en los azúcares puede ser sustituido, por ejemplo, por grupos de fosfonatos, grupos fosfatos, protegidos por grupos protectores estándar, o activados para preparar enlaces adicionales a nucleótidos adicionales, o puede ser conjugado a soportes sólidos" o semisólidos. El OH terminal 5' y 3' puede ser fosforilado y sustituido por aminas o porciones de grupos orgánicos en casquete (capping) de 1 a 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos también pueden ser derivatizados a grupos protectores estándar. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de azúcares ribosa o desoxirribosa que son generalmente conocidos en este ámbito; por ejemplo, 2'-0-metil-, 2'-0-allil, 2'-fluoro- o 2 ' -azido-ribosa , análogos de azúcares carbociclicos , azúcares a-anoméricos , azúcares epiméricos como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares piranosas, azúcares furanosas, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos nucleósidos básicos como metil ribosida. Uno o más enlaces de fosfodiéster pueden ser sustituidos por otros grupos de enlace alternativos. Estos grupos alternativos de enlace incluyen formas de realización en las que el fosfato es sustituido por P(0)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato") , "(0)NR2 ("amidato") , P(0)R, P(0)0R', CO o CH2 ( "formacetal" ) , donde cada R o R' es independientemente H o alquilo sustituido o no sustituido (1 °C a 20 °C) que contiene opcionalmente un enlace a éter (-0-), aril, alquenil, cicloalquil, cicloalquenil o aradil. No todos los enlaces en un polinucleót ido tienen que ser idénticos. La descripción anterior se aplica a todos los polinucleótidos mencionados en la presente memoria descriptiva, incluido el ARN y el ADN . En la presente memoria descriptiva, "oligonucleótido" se refiere por lo general a polinucleótidos cortos, habitualmente de hebra única y sintéticos que suelen tener una longitud inferior a 200 nucleótidos, aunque no necesariamente. Los términos "oligonucleótido" y "poligonucleótido" no se excluyen mutuamente. La descripción anteriormente incluida sobre polinucleótidos es aplicable igualmente y en su integridad a los oligonucleót idos . El término "EGFL7" (intercambiable por el término "polipéptido del dominio 7 similar al factor de crecimiento epidérmico) , tal como se usa en la presente memoria se refiere, a menos que especifica o contextualmente se indique otra cosa, a cualquier polipéptido EGFL7 nativo o variante (ya sea nativa o sintética) según se describe, p.ej. en el documento WO 2005/117968, cuyo contenido se incorpora a la presente memoria en su totalidad para cualquier fin. El término "secuencia nativa" engloba específicamente formas segregadas o truncadas que se producen de forma natural (por ejemplo, una secuencia de un dominio extracelular) , las variantes que se producen de forma natural (por ejemplo, formas alternativamente empalmadas) y las variantes alélicas que se producen de forma natural. El término "EGFL7 de tipo natural" se refiere generalmente a un polipéptido que incluye la secuencia de aminoácidos de una proteína de EGFL7 que se produce naturalmente. El término "secuencia de EGFL7 de tipo natural" se refiere generalmente a una secuencia de aminoácidos encontrada en una EGFL7 que se produce naturalmente . Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se usan indistintamente en el sentido más amplio e incluyen anticuerpos monoclonales (por ejemplo, anticuerpos monoclonales intactos o de longitud completa), anticuerpos policlonales , anticuerpos multivalentes , anticuerpos multiespecif icos (por ejemplo, anticuerpos biespecif icos en tanto en cuanto presenten la actividad biológica deseada) y también pueden incluir determinados fragmentos de anticuerpos (como se describe con mayor detalle en la presente memoria descriptiva) . Un anticuerpo puede ser humano, humanizado y/o con maduración de afinidad. El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren ampliamente en sus secuencias de un anticuerpo a otro y se utilizan para la unión y especificidad de cada anticuerpo en particular con relación a su antigeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a través de los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos, denominados regiones de determinación de complementariedad (CDR) o regiones hipervariables , de los dominios variables tanto de la cadena ligera como de la pesada. Las porciones más conservadas de los dominios variables se llaman estructura (FR) . Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera nativas comprenden cuatro FR que, en su mayor parte, adoptan una configuración de hoja-ß, y están conectadas por tres CDR, que crean bucles que conectan a la estructura de la hoja-ß, y en algunos casos forman parte de ella. Las CDR de cada cadena se mantienen unidas y en estrecha proximidad mediante las regiones FR y, junto a las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antigeno de los anticuerpos (véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, D (1991)) . Los dominios constantes no participan directamente en la unión de un anticuerpo a un antigeno, pero desarrollan diversas funciones efectoras, como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad con mediación celular dependiente de anticuerpos. La digestión con papaina de anticuerpos produce dos fragmentos idénticos de unión a antigeno, llamados fragmentos "Fab", cada uno de ellos con un solo sitio de unión a antigeno, y un fragmento "Fe" residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizarse fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación a antigeno y sigue siendo capaz de establecer un enlace cruzado con el antigeno. El "Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio completo de reconocimiento y unión a antígeno. En una especie Fv de dos cadenas, esta región está compuesta por un dímero de un domino variable de cadena pesada y otro de cadena ligera en una estrecha asociación no covalente. En una especie Fv de cadena única, un dominio variable de cadena pesada y otro de cadena ligera se pueden enlazar covalentemente mediante un enlazador peptidico flexible, de forma que las cadenas pesada y ligera se asocien en una estructura "dimérica" análoga a la presente en una especie Fv de dos cadenas. En esta configuración, las tres regiones CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a antigeno en la superficie del dimero VH-VL. Colectivamente, las seis regiones CDR confieren al anticuerpo una especificidad de unión a antigeno. No obstante, incluso un dominio variable simple (o la mitad de un Fv que comprenda únicamente tres regiones CDR especificas para un antigeno) tiene la capacidad de reconocer un antigeno y unirse a él, aunque con una afinidad inferior a la del sitio de unión completo. El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' se diferencian de los Fab por la adición de algunos residuos en el extremo carboxi terminal del dominio CH1 de la cadena pesada, incluyendo una o más cisteinas de la región bisagra de un anticuerpo. Fab ' -SH es la denominación que se da en la presente memoria descriptiva al Fab ' en el que el (los) residuo (s) de cisteina de los dominios constantes presenta (n) un grupo tiol libre. Los fragmentos F(ab')2 de anticuerpos se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' con cisteinas bisagra entre ellos. También se conocen otros emparejamientos químicos de fragmentos de anticuerpos. Las "cadenas ligeras" de anticuerpos ( inmunoglobulinas ) de cualquier vertebrado pueden asignarse a una de dos clases claramente diferenciadas, denominadas kappa (?) y lambda (?) , en función de las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes . Según la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas se pueden asignar a distintas clases. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de éstas pueden seguir dividiéndose en subclases (isotipos), por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las distintas clases de inmunoglobulinas se denominan a, d, e, ? y µ, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las distintas clases de inmunoglobulinas son muy conocidas. Los "fragmentos de anticuerpos" contienen únicamente una porción de un anticuerpo intacto, en la que la porción conserva al menos una de las funciones normalmente asociadas a esa porción cuando está presente en un anticuerpo intacto, aunque es preferible que conserve la totalidad o la mayoría de estas funciones. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos serán los fragmentos Fab, Fab ' , F(ab')2 y Fv, los diacuerpos, los anticuerpos lineales, las moléculas anticuerpos de cadena única y los anticuerpos multiespecí fieos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. En una forma de realización, un fragmento de anticuerpo contiene un sitio de unión a antígeno del anticuerpo intacto y, de este modo, conserva la capacidad para unirse al antígeno. En otra forma de realización, un fragmento de anticuerpo, por ejemplo uno que contiene la región Fe, conserva al menos una de las funciones biológicas habitualmente asociadas a la región Fe cuando está presente en un anticuerpo intacto, como la unión a FcRn, la modulación de la semivida del anticuerpo, la función de la ADCC y la unión a complemento. En una forma de realización, un fragmento de anticuerpo es un anticuerpo monovalente que en vivo tiene una semivida sustancialmente similar a la de un anticuerpo intacto. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo de este tipo puede contener un brazo de unión a antígeno enlazado a una secuencia Fe capaz de dar estabilidad en vivo al fragmento. En la presente memoria descriptiva, por "región hipervariable" , "HVR" o "HV" se entienden las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en su secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos. Por lo general, los anticuerpos contienen seis regiones hipervariables: tres en la VH (Hl, H2, H3) y tres en la VL (Ll, L2, L3) . En la presente memoria descriptiva se usan y engloban diversas delineaciones de regiones hipervariables. Las regiones de determinación de complementariedad (CDR) de Kabat están basadas en la variabilidad de las secuencias y son las más frecuentemente usadas (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed . Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) ) . Chothia, en cambio, se refiere a la ubicación de los bucles estructurales (Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-17 (1987) ) . Las regiones hipervariables de AbM representan una solución intermedia entre las CDR de Kabat y los bucles estructurales de Chothia y son las utilizadas en el software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. Las regiones hipervariables "de contacto" se basan en un análisis de las estructuras de cristales complejos disponibles .

Las regiones hipervariables pueden comprender "regiones hipervariables ampliadas" como se indica a continuación: 24-36 (Ll), 46-56 (L2) y 89-97 (L3) en la VL y 26-35 (Hl), 49-65 ó 50 a 65 (H2) y 93-102 (H3) en la VH . Los residuos de dominio variable están numerados según Kabal et al., como se ha indicado anteriormente, para cada una de estas definiciones . Los residuos de una "región estructural" o "FR" son aquellos residuos de un dominio variable distintos de los de una región hipervariable , tal como se define en la presente memoria descriptiva. Las formas "humanizadas" de los anticuerpos no humanos (por ejemplo, los murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en que los residuos de una región hipervariable del receptor son sustituidos por los residuos de la región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) , como el ratón, la rata, el conejo o los primates no humanos, que tenga la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región de estructura (FR) de la inmunoglobulina humana se sustituyen por sus correspondientes residuos no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentren en el anticuerpo receptor o donante. Estas modificaciones se llevan a cabo para refinar aún más el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos los dominios variables (o al menos uno, y típicamente dos) en que todos, o sustancialmente todos, los bucles hipervariables correspondan a los de una inmunoglobulina no humana y todas, o sustancialmente todas, las FR sean las de una secuencia de inmunoglobulina humana. Opcionalmente , el anticuerpo humanizado también comprenderá al menos una porción de una región constante (Fe) de inmunoglobulina, típicamente humana. Para más detalles, véase Jones et al., Nature, 321:522-25 (1986), Riechmann et al., Nature, 332:323-29 (1988) y Presta, Curr. Op. Struct . Biol., 2:593-96 (1992) . Véanse también los siguientes artículos y referencias citadas en los mismos: Vaswani y Hamilton, Ann . Allergy, Asthma & Immunol . 1:105-15 (1998) ; Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-38 (1995) ; Hurle y Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-33 (1994) . Los anticuerpos ( inmunoglobulinas ) "quiméricos" tienen una porción de la cadena pesada y/o ligera idéntica u homologa a las secuencias correspondientes de anticuerpos obtenidos de una especie en particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpos en particular, mientras que el resto de la(s) cadena (s) es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes de anticuerpos obtenidos de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, asi como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (Patente de EE.UU. n° 4.816.567 y orrison et al., Proc . Nati. Acad. Scí. USA, 81:6851-6855 (1984) ) . Anticuerpo humanizado como se emplea en la presente memoria descriptiva es un subconjunto de anticuerpos quiméricos. Los fragmentos "Fv de cadena simple" o "scFv" de un anticuerpo comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo presentes en una cadena simple de polipépt idos . Por lo general, el polipéptido scFv comprende también un enlazador de polipéptidos entre los dominios VH y VL que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión a antigeno. Para una reseña sobre los scFv, véase Plückthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies , volumen 113, Rosenburg y oore editores, Springer-Verlag, Nueva York, páginas 269-315 (1994) . Un "antigeno" es un antigeno predeterminado al que un anticuerpo se puede unir selectivamente. El antigeno diana puede ser un polipéptido, un carbohidrato, un ácido nucleico, un lipido, un hapteno o un compuesto de ellos, sintético o que se produzca naturalmente. El antigeno diana es, preferiblemente, un polipéptido. Un "epitopo" es la parte del antigeno a la cual el anticuerpo se une selectivamente. Para el antigeno de un polipéptido, el epitopo es generalmente una porción del péptido de aproximadamente 4-10 aminoácidos. El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión a antigeno que comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptidos (VH - VL) . Mediante el uso de un enlazador que sea demasiado corto para permitir el empare amiento entre los dos dominios de la misma cadena, estos dominios se ven obligados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antigeno. Los diacuerpos se describen con más detalle en, por ejemplo, la patente europea 404.097, el documento O 93/11161 y Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-48 (1993) . Un "anticuerpo humano" es aquel que contiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un humano y/o que se ha producido utilizando cualquiera de las técnicas para producción de anticuerpos humanos expuestas en la presente memoria descriptiva. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que contenga residuos de unión a antígeno no humanos. Un anticuerpo con "maduración de afinidad" es aquél con una o más alteraciones en una o más CDR del mismo que dan lugar a una mejora de la afinidad del anticuerpo por el antígeno, en comparación con un anticuerpo padre que no incluye dicha (s) alteración ( es ) . Los anticuerpos con maduración de afinidad preferentes tendrán afinidades nanomolares o incluso picomolares con el antígeno diana. Los anticuerpos con maduración de afinidad se producen mediante procedimientos bien conocidos en el sector. En Marks et al., Bio/Tec nology, 10:779-83 (1992), se describe la maduración de afinidad a través de la eliminación de los dominios VH y VL . La mutagénesis aleatoria de la CDR y/o los residuos estructurales se describen en: Barbas et al., Proc Wat. Acad. Sci, USA, 91:3809-13 (1994) , Schier et al., Gene, 169:147-55 (1995) , Yelton et al., J. Immunol., 155:1994-2004 (1995), Jackson et al., J. Immunol., 154 (7 ) : 3310-19 (1995) y Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226:889-96 (1992) .

Las "funciones efectoras" de un anticuerpo hacen referencia a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fe (una región Fe de una secuencia nativa o una región Fe variable de una secuencia aminoacidica ) de un anticuerpo y puede variar con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de un anticuerpo incluyen: La unión de Clq y la citotoxicidad dependiente de complemento, la unión de receptores de Fe, la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) , la fagocitosis, la regulación a la baja de los receptores en la superficie celular (por ejemplo, el receptor de células B) y la activación de las células B. La "citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en la cual una IgG secretada y unida a los receptores Fe (FcR) presentes en determinadas células citotóxicas (p. ej . , células asesinas naturales (NK) , neutrófilos y macrófagos) posibilita que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula diana que porte un antígeno y, posteriormente, destruyan dicha célula diana con citotoxinas. Los anticuerpos "arman" a las células citotóxicas y son absolutamente necesarios para dicha destrucción. Las principales células que median en la ADCC, las células NK, sólo expresan FCYRIII, mientras que los monocitos expresan FCYRI, FCYRII y FCYRIII. La expresión del FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu . Rev. Immunol, 9:457-92 (1991) . A fin de evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés, se puede realizar un ensayo de ADCC en vitro, como el que se describe en las patentes de EE.UU. nos 5.500.362 ó 5.821.337 o se puede realizar el ensayo de Presta que se describe en la patente de Estados Unidos 6.737.056. Entre las células efectoras útiles para estos ensayos se encontrarán las células sanguíneas mononucleares periféricas (PBMC) y las asesinas naturales (NK) . Como alternativa, o adicionalmente , la actividad de ADCC de la molécula de interés se puede evaluar en vivo, por ejemplo, en un modelo animal como el que se describe en Clynes et al., Proc Nati Acad Sci (USA), 95 : 652-56 (1998) . Las "células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcRs y realizan funciones efectoras. Preferentemente, las células expresan al menos el FcyRIII y realizan la función efectora de ADCC. Ejemplos de leucocitos humanos que median en la ADCC serían las células sanguíneas mononucleares periféricas (PBMC), las células asesinas naturales (NK) , los monocitos, las células T citotóxicas y los neutrófilos, siendo las- PBMC y las NK las células preferentes. Las células efectoras se pueden aislar de una fuente nativa, por ejemplo, de la sangre. Los términos "receptor de Fe" o "FcR" describen un receptor que se une a la región Fe de un anticuerpo. El FcR preferente es un FcR humano con secuencia nativa. Además, un FcR preferente es aquél que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) y pertenece a las subclases de receptores FcyRI, FCYRII y FCYRIII, incluidas las variantes alélicas y las formas enlazadas alternativamente de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen el FcyRIIA (un "receptor activador") y el FcyRIIB (un "receptor inhibidor"), los cuales tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en sus dominios citoplasmát icos . El receptor activador FcyRIIA contiene en su dominio citoplasmát ico un motivo activador inmunorreceptor basado en la tirosina (ITA ) . El receptor inhibidor FcyRIIB contiene en su dominio citoplasmát ico un motivo inhibidor inmunorreceptor basado en la tirosina (ITI ) . (véase reseña M . en Daéron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-34 (1997)) . En Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol, 9:457-92 (1991), Capel et al., Immunomethods , 4:25-34 (1994) y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. , 126:330-41 (1995) también se analizan los FcRs . Otros FcR, incluidos aquéllos que se identifiquen en el futuro, se engloban en el término "FcR" empleado en la presente memoria descriptiva. Este término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es el responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994) ) y regula la homeostasis de las inmunoglobulinas . El documento O 00/42072 (Presta) describe variantes de anticuerpos con capacidad de unión a los FcRs mejorada o disminuida. El contenido de esta publicación de patente se incorpora específicamente a la presente memoria descriptiva a modo de referencia. Véase, además, Shields et al. , J. Biol. Chem., 9 (2) : 6591-6604 (2001) . Se conocen los métodos de medición de la unión al FcRn (véase, por ejemplo, Ghetie y Ward, Immunol. Today 18:592-8 (1997)) . La unión al FcRn humano en vivo y la semivida sérica de los polipéptidos de unión al RcRn humano de alta afinidad pueden analizarse, por ejemplo, en ratones transgénicos o líneas celulares humanas transíectadas que expresan el FcRn humano, o en primates a los que se administran polipéptidos de variante Fe. La "citotoxicidad dependiente de complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una célula diana en presencia del complemento. La vía clásica de activación del complemento se inicia por la unión del primer componente del sistema del complemento (Clq) a los anticuerpos (de la subclase apropiada) que están unidos a su antigeno cognado. A fin de evaluar la activación del complemento, se puede efectuar un ensayo de CDC, por ejemplo, tal como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods , 202:163 (1996) . Las variantes polipeptidicas con secuencias aminoacidicas de la región Fe alteradas y capacidad aumentada o disminuida de unión a Cql se describen en la Patente de EE.UU. n° 6.194.551B1 y el documento WO 99/51642. El contenido de dichas publicaciones de patentes se incorpora específicamente a la presente memoria descriptiva a modo de referencia. Véase, además, Idusogie et al. J. Immunol. 164 : 4178-84 (2000) . Un anticuerpo "de bloqueo" o un anticuerpo "antagonista" es aquel que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno al que se une. Los anticuerpos de bloqueo o anticuerpos antagonistas preferentes inhiben sustancial o completamente la actividad biológica del antígeno. Un "trastorno" o "enfermedad" es un proceso que se beneficiaría del tratamiento con una sustancia/molécula o método de la invención. Incluye trastornos o enfermedades crónicas y agudas, comprendidos los procesos patológicos que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. Ejemplos de trastornos que se tratarán según lo establecido en la presente memoria descriptiva son tumores malignos y benignos, carcinoma, blastoma y sarcoma. Los términos "trastorno de la proliferación celular" y "trastorno de la proliferación" se refieren a trastornos asociados a algún grado de proliferación celular anómala. En una forma de realización, el trastorno de la proliferación celular es un cáncer. En la presente memoria descriptiva, por "tumor" se entiende todo crecimiento y proliferación celular neoplásica, tanto benigna como maligna, así como todas las células y tejidos cancerosos y precancerosos . Tal y como se usan en la presente memoria descriptiva, los términos "cáncer", "canceroso", "trastorno de proliferación celular", "trastorno de proliferación" y "tumor" no se excluyen mutuamente. Los términos "cáncer" y "canceroso" describen o se refieren al estado fisiológico de los mamíferos típicamente caracterizado por un crecimiento/proliferación celular no regulado. Entre los ejemplos de cáncer se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos más concretos de estas clases de cáncer son el cáncer de células escamosas, el cáncer de células pulmonares pequeñas, el cáncer hipofisario, el cáncer esofágico, el astrocitoma, el sarcoma de tejidos blandos, el cáncer de células pulmonares no pequeñas, el adenocarcinoma pulmonar, el carcinoma pulmonar escamoso, el cáncer de peritoneo, el cáncer hepatocelular , el cáncer gastrointestinal, el cáncer pancreático, el glioblastoma , el cáncer de cuello uterino, el cáncer de ovario, el cáncer de hígado, el cáncer de vejiga, el hepatoma, el cáncer de mama, el cáncer de colon, el cáncer colorrectal, el carcinoma endometrial o uterino, el carcinoma de las glándulas salivales, el cáncer de riñon, el cáncer de hígado, el cáncer de próstata, el cáncer vulval, el cáncer de tiroides, el carcinoma hepático, el cáncer cerebral, el cáncer endometrial, el cáncer de testículos, el colangiocarcinoma , el carcinoma de vesícula biliar, el cáncer de estómago, el melanoma y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello. La desregulación de la angiogénesis puede ocasionar muchos trastornos que se pueden tratar mediante las composiciones y métodos de la invención. Estos trastornos incluyen procesos neoplásicos y no neoplásicos. Los procesos neoplásicos incluyen los descritos anteriormente. Entre los procesos no neoplásicos figuran hipertrofia aberrante o no deseada, artritis, artritis reumatoide (AR) , psoriasis, placas psoriáticas, sarcoidosis, ateroesclerosis , placas ateroesclerót icas , retinopatía diabética y otras retinopatias proliferativas , incluida retinopatía de premadurez, fibroplasia retrolental, glaucoma neovascular, degeneración macular asociada a la edad, edema macular diabético, neovasculari zación corneal, neovasculari zación de trasplante de córnea, rechazo de trasplante de córnea, neovascularización retiniana/del coroides, neovascularización del ángulo (rubeosis), enfermedad neovascular ocular, reestenosis vascular, malformaciones arterivenosas (MAV) , meningioma, hemangioma, angiofibroma , hiperplasias de tiroides (incluida enfermedad de Grave) , trasplante de córnea y otros tejidos, inflamación crónica, inflamación pulmonar, lesión pulmonar aguda/síndrome de distrés respiratorio del adulto, sepsis, hipertensión pulmonar primaria, efusiones pulmonares malignas, edema cerebral (por ejemplo, asociado a infarto cerebral/traumatismo craneal cerrado/traumatismo), inflamación sinovial, formación de cataratas en AR, miositis osificante, formación ósea hipertrófica, osteoartrit is (OA) , ascitis refractaria, enfermedad de ovario poliquí st ico , endometriosis , enfermedades en el tercer espacio de fluido (pancreatitis, síndrome compart imental , quemaduras, enfermedad intestinal), fibroides uterinos, parto prematuro, inflamación crónica como enfermedad intestinal inflamatoria (enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa), rechazo de trasplante renal, enfermedad intestinal inflamatoria, síndrome nefrítico, crecimiento de masa tisular anómala o no deseada (no cáncer), articulaciones hemofílicas, cicatrices hipertróficas, inhibición de crecimiento del cabello, síndrome de Osler-Weber, granuloma piogénico, fibroplasias retrolentales , escleroderma , tracoma, adhesiones vasculares, sinovitis, dermatitis, preclampsia, ascitis, efusión pericárdica (como la asociada a pericarditis) y efusión pleural . Por trastornos de "deterioro progresivo" (por ejemplo, síndrome consuntivo, caquexia, sarcopenia) se entiende un trastorno causado por pérdida no deseada y/o no saludable de peso o pérdida de masa celular corporal. En ancianos, así como en pacientes con SIDA y cáncer, la enfermedad consuntiva puede ocasionar una pérdida de peso no deseada, incluyendo los compartimentos grasos y no grasos. Las enfermedades consuntivas pueden ser la consecuencia de una ingesta insuficiente de alimentos y/o cambios metabólicos asociados a enfermedad y/o envejecimiento. Los pacientes con cáncer y SIDA, así como los pacientes que han sido sometidos a cirugía extensiva o que sufren infecciones crónicas, enfermedades inmunitarias , hipertiroidismo, enfermedad de Crohn, enfermedad psicogénica, insuficiencia cardiaca crónica u otro traumatismo grave, sufren frecuentemente enfermedad consuntiva, que también se denomina caquexia, un trastorno metabólico y, en ocasiones, alimentario. La caquexia se caracteriza, además, por hipermetabolismo e hipercatabolismo . Aunque los términos caquexia y enfermedad consuntiva se utilizan con frecuencia indistintamente en referencia a procesos consuntivos, hay al menos un conjunto de estudios que diferencian entre caquexia y síndrome consuntivo como una pérdida de masa magra y, en concreto, de masa celular corporal (Mayer, J. Nutr. 129(1S Suppl . ) : 256S-259S (1999) ) . La sarcopenia, otro trastorno de este tipo que puede afectar a los sujetos durante el envejecimiento, se caracteriza habitualmente por pérdida de masa muscular. La enfermedad consuntiva terminal descrita anteriormente se puede desarrollar en sujetos que padezcan caquexia o sarcopenia. En la presente memoria descriptiva, por "tratamiento" se entiende una intervención clínica en un intento de alterar el proceso natural del individuo o célula tratada y se puede realizar como prevención o durante la evolución de la enfermedad. Son efectos deseables del tratamiento la prevención de la enfermedad o de su recidiva, el alivio de los síntomas, la disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, la disminución del ritmo de progresión de la enfermedad, la mejora o los cuidados paliativos del estado de la enfermedad y la remisión o un pronóstico de mejoría. En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención se usan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o trastorno. Un "individuo", "sujeto" o "paciente" es un vertebrado, p.ej. un mamífero, incluidos especialmente los seres humanos. Los mamíferos incluyen, aunque sin limitarse a ellos, a los seres humanos, los animales domésticos y de granja, y los animales de los zoológicos, los que participan en prácticas deportivas y las mascotas domésticas, como perros, caballos, gatos, vacas, etc. Una "cantidad eficaz" es una cantidad eficaz, a las dosis y durante el tiempo necesarios, para lograr el efecto terapéutico o profiláctico deseado. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de una sustancia/molécula de la invención, agonista o antagonista, puede variar según factores como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo y la capacidad de la sustancia/molécula, agonista o antagonista, para dar lugar a una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz es también aquella a la que los efectos tóxicos o per udiciales de la sustancia/molécula, agonista o antagonista son contrarrestados por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una "cantidad eficaz desde el punto de vista profiláctico" es una cantidad eficaz, a las dosis y durante el tiempo necesarios, para lograr el efecto terapéutico o profiláctico deseado. Habitualmente , aunque no necesariamente, dado que una dosis profiláctica se utiliza en sujetos antes de la enfermedad o en una etapa temprana de la misma, la cantidad profilácticamente eficaz será inferior a la cantidad terapéuticamente eficaz. El término "agente citotóxico", en el contexto de la presente memoria descriptiva, se refiere a una sustancia que inhibe o evita la función de las células y/o causa su destrucción. El término pretende incluir isótopos radioactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radiactivos de Lu) , agentes quimioterapéuticos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etoposido) , doxorrubicina , melfalan, mitomicina C, clorambucil, daunorrubicina u otros agentes intercaladores , enzimas y fragmentos de estas como nucleoliticenzimas , antibióticos y toxinas como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluidos fragmentos y/o variantes de estos y los diversos agentes antineoplásicos o antitumorales que se describen más adelante. Otros agentes citotóxicos se describen más adelante. Un agente tumoricida causa la destrucción de las células tumorales. Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos serían los agentes alquilantes como la tiotepa y la ciclofosfamida (CYTOXAN©) ; los sulfonatos de alquilo como el busulfán, el improsulfán y el piposulfán; las aziridinas como la benzodopa, la carboquona, la meturedopa y la uredopa; las etiloniminas y metilamelaminas incluidas la altretamina, la trietilenomelamina , la trietilenofosforamida, la trietilenotiofosforamida y la trimetilolomelamina ; los acetogeninos (en especial, el bullatacín y la bullatacinona ) ; el delta-9-tetrahidrocannabinol (dronabinol, MARINOL®) ; la beta-lapachona ; el lapachol; las colchicinas el ácido betulínico, una camptotecina (incluido el topotecán análogo sintético (HYCA TIN®) , el CPT-11 (irinotecán, CAMPTOSAR®) , la acetilcamptotecina , la escopolectina y la 9-aminocamptotecina ) ; la briostatina ; la cailistatina ; el CC- 1065 (incluidos sus análogos sintéticos adocelesina, carcelesina y bicelesina) ; la podofilotoxina ; el ácido podofilinico; la teniposida; las criptoficinas (particularmente la criptoficina 1 y la 8); la dolastat ina ; la duocarmicina (incluidos los análogos sintéticos KW-2189 y CB1-TM1) ; la eleuterobina ; la pancratistat ina ; una sarcodictina ; la espongistatina ; los gases nitrógeno como el clorambucil, la clornafacina , la colofosfamida , la estramustina , la ifosfamida, la mecloretamina , el clorhidrato de óxido de mecloretamina, el melfalán, la novembichina , la fenesterina, la prednimustina, la trofosfamida y la uramustina; las nitrosureas como la carmustina, la clorozotocina , la fotemustina, la lomustina, la nimustina y la ranimust ina ; los antibióticos como los de enedina (por ejemplo, la calicheamicina , especialmente la calicheamicina gamma II y la omega II (véase, por ejemplo, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994)); la dinemicina, incluida la dinemicina A; una esperamicina ; el cromóforo de neocarcinostatina y los cromóforos de antibióticos de enedina cromoproteina relacionados (las aclacinomisinas , la actinomicina , la autramicina, la azaserina, las bleomicinas, la cact inomicina , la carabicina, la carminomicina , la carcinofilina , las cromomicinas , la dactinomicina , la daunorrubicina , la detorrubicina , la 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, la doxorrubicina (incluidos ADRIAMYCIN®, la morfolino-doxorrubicina, la cianomorfolino-doxorrubicina , la 2-pirrolino-doxorrubicina y la desoxidoxorrubicina ) , la epirrubicina , la esorrubicina , la idarrubicina , la marcelomicina , las mitomicinas como la mitomicina C, el ácido micofenólico , la nogalamicina , las olivomicinas , la peplomicina, la potfiromicina, la puromicina, la quelamicina, la rodorrubicina , la estreptonigrina , la estreptozocina , la tubercidina, el ubenimex, la cinostatina y la zorrubicina ) ; los ant imetabolitos como el metotrexato y el 5-fluorouracilo (5-FU) ; los análogos del ácido fólico como la denopterina, el metotrexato, la teropterina y el trimetrexato ; los análogos de la purina como la fludarabina, la 6-mercaptopurina , la tiamiprina y la tioguanina; los análogos de la pirimidina como la ancitabina, la azacitidina, la 6-azauridina , el carmofur, la citarabina, la didesoxiuridina , la doxifluridina , la enocitabina y la floxuridina ; los andrógenos como la calusterona, el propionato de dromostanolona , el epit iostanol , el mepitiiostano y la testolactona ; los antiadrenérgicos como la aminoglutet imida , el mitotano y el trilostano; un reabastecedor del ácido fólico como el ácido folinico; la aceglatona; el glucósido aldofosfamida ; el ácido aminolevulinico; el eniluracilo; la amsacrina; el bestrabucil ; el bisantreno; el edatraxato; la defofamina; la demecolcina ; la diaziquona; la elfornitina ; el acetato de eliptinio; una epotilona; el etoglúcido; el nitrato de galio; la hidroxiurea; el lentinan; la lonidainina; los maitansinoides como la maitansina y las ansamitocinas ; la mitoguazona; la mitoxantrona ; el mopidanmol ; la nitraerina; la pentostatina ; el fenamet; la pirarrubicina ; la losoxantrona ; la 2-etilhidracida ; la procarbacina; el complejo polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR) ; el razoxano; la rizoxina; el sizofiran; el espirogermanio ; el ácido tenuazónico; la triaciquona; la 2 , 2 ' , 2 " -triclorotrietilamina ; los tricotecenos (especialmente la toxina T-2, el verracurin A, el roridin A y la anguidina) ; el uretano; la vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®) ; la dacarbacina; la manomustina; el mitobronitol ; el mitolactol; el pipobromán; la gacitosina; la arabinosida ("Ara-C"); la tiotepa; los taxoides, por ejemplo, el paclitaxel (TAXOL®) (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), la formulación de nanoparticulas de paclitaxel mediante ingeniería de albúmina libre de Cremofor (ABRAXANE™) (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) y el doxetaxel (TAXOTERE®) ( Rhóne-Poulenc Rorer, Antony, Francia); el clorambucil ; la gemcitabina (GEMZAR®) ; la 6-tioguanina ; la mercaptopurina ; el metatrexato ; los análogos de platino como el cisplatino y el carboplatino; la vinblastina (VELBAN®) ; el platino; el etopóido (VP-16) ; la ifosfamida; la mitoxantrona ; la vincristina (ONCOVIN®) ; el oxaliplatino; la leucovovina; la vinorrelbina (NAVELBINE®) ; la novantrona; el edatrexato; la daunomicina; la aminopterina ; el ibandronato; el inhibidor RFS 2000 de la topoisomerasa ; la difluorometilornitina (DMFO); los retinoides como el ácido retinoico; capecitabina (XELODA®) ; las sales, los ácidos o los derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de las sustancias anteriores, asi como las combinaciones de una o más de las sustancias anteriores como la CHOP, la abreviatura de una terapia combinada de ciclofosfamida , doxorrubicina , vincristina y prednisolona , y la FOLFOX, la abreviatura de un régimen de tratamiento con oxaliplatino (ELOXATIN™) combinado con 5-FU y leucovovina . También se incluyen en esta definición los agentes antihormonales que regulan, reducen, bloquean o inhiben los efectos de las hormonas que pueden fomentar el crecimiento del cáncer y se presentan a menudo en la forma de un tratamiento sistémico o que afecta a todo el cuerpo. Estos agentes podrán ser hormonas. Los ejemplos comprenden a los antiestrógenos y los moduladores selectivos de receptores de estrógenos (SERM), incluidos, por ejemplo, el tamoxifeno (también el tamoxifeno NOLVADEX®) , el raloxifeno (EVISTA®) , el droloxifeno, el 4-hidroxitamoxifeno, el trioxifeno, el keoxifeno, el LY117018, la onapristona y el toremifeno ( FARESTON®) ; las antiprogesteronas; los reguladores a la baja de los receptores de estrógenos (ERD) ; los agentes que oprimen o cierran los ovarios, por ejemplo, los agonistas de la hormona liberadora de la hormona luteinizante (LHRH) como el acetato de leuprolida (LUPRON® y ELIGARD®) , el acetato de goserelina, el acetato de buserelina y la tripterelina ; otros ant iandrógenos como la flutamida, la nilutamida y la bicalutamida y los inhibidores de la aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, encargada de regular la producción de estrógenos en las glándulas suprarrenales, como, por ejemplo, las 4 ( 5 ) -imidazolas , la aminoglutet imida , el acetato de megestrol (MEGASE®) , el exemestano (AROMAS IN®) , la formestania, la fadrozola, la vorozola (RIVISOR®) , el letrozol (FEMARA®) y la anastrozola (ARIMIDEX®) . Además, esta definición de los agentes quimioterapéut icos incluye los bisfosfonatos como el clodronato (por ejemplo, BONEFOS® u OSTAC®) , el etidronato (DIDROCAL®) , el NE-58095, el ácido zoledrónico/zoledronato (ZOMETA®) , el alendronato (FOSAMAX®) , el pamidronato (AREDIA®) , el tiludronato (SKELID®) o el risedronato (ACTONEL®) , así como la troxacitabina (un análogo de la citosina nucleósida 1 , 3-dioxolano) ; los oligonucleótidos antisentido, en particular los que inhiben la expresión génica en las rutas de señalización implicadas en la proliferación celular aberrante, como, por ejemplo, el PKC-alfa, el Raf, el H-Ras y el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R) ; las vacunas como THERATOPE® y las que se aplican para terapias génicas, por ejemplo, la ALLOVECTIN®, la LEUVECTIN® y la VAXID®; el inhibidor de la topoisomerasa 1 LURTOTECAN®; el rmRH ABARELIX®; el ditosilato de lapatinib (un inhibidor de molécula pequeña doble tirosincinasa del ErbB-2 y el EGFR conocido también como G 572016) y las sales, los ácidos o los derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de las sustancias anteriores . Un "agente inhibidor del crecimiento" se refiere, en el contexto de la presente memoria descriptiva, a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula (como una célula que exprese EGFL7) tanto en vitro como en vivo. Así, el agente inhibidor del crecimiento puede reducir significativamente el porcentaje de células que expresen (como una célula que exprese EGFL7) en la fase S. Ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento serian los agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un punto distinto de la fase S), como los agentes que inducen la detención de la Gl y la fase . Entre los bloqueadores clásicos de la fase M se incluyen las vincas (vincristina y vinblastina ) , los taxanos y los inhibidores de la topoisomerasa II como la doxorrubicina , la epirrubicina , la daunorrubicina , el etopósido y la bleomicina. Esos agentes que detienen la Gl también se desbordan en la detención de la fase S, por ejemplo, los agentes de alquilación del ADN como el tamoxifeno, la prednisona, la dacarbacina, la mecloretamina , el cisplatino, el metotrexato, el 5-fluorouracilo y la ara-C. Puede encontrarse más información al respecto en The Molecular Basis of Cáncer, endelsohn y Israel, eds . , capitulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogenes, y antineoplastic drugs" ("Regulación del anillo celular, oncogenes y fármacos antineoplásicos" por Murakami et al.. (WB Saunders: Philadelphia , 1995), especialmente p. 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son antineoplásicos derivados ambos del tejo del Pacifico. El docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer) se deriva del tejo europeo y es un análogo semisintético del paclitaxel (TAXOL®, Bristol- Myers Squibb) . El paclitaxel y el docetaxel promueven la unión de microtúbulos a partir de dimeros de tubulina y estabilizan los microtúbulos al prevenir la despolimerización, que ocasiona la inhibición de mitosis en células. La "doxorrubicina " es un antibiótico antraciclina . La denominación química completa de la doxorrubicina es (8S-cis) -10- [ (3-amino-2, 3, 6-trideoxi-a-L-lixo-hexapiranosil ) oxi] -7,8,9, 10-tetrahidro-6, 8, 1 l-trihidroxi-8 - (hidroxiacetil ) -1-metoxi-5 , 12-naftacenediona . El término "polipéptido que comprende una región Fe" se refiere a un polipéptido, como un anticuerpo o una inmunoadhesina (véase la definición en esta memoria), que comprende una región Fe. La lisina en el extremo C terminal (residuo 447 según el sistema de numeración de EU) de la región Fe puede ser eliminada, por ejemplo, durante la purificación del polipéptido, o recombinando el ácido nucleico que codifica al polipéptido. Por lo tanto, una composición que contenga un polipéptido con una región Fe según esta invención puede comprender polipéptidos con el K447, con todos los K447 eliminados, o una mezcla de polipéptidos con y sin el residuo K447. Composiciones de la invención y métodos para elaborarlas Esta invención engloba composiciones, incluidas composiciones farmacéuticas, que comprenden un anticuerpo anti-EGFL7 , y polinucleótidos , que incluyen secuencias que codifican un anticuerpo anti-EGFL7. Como se usan en la presente memoria descriptiva, las composiciones comprenden uno o más anticuerpos que se unen a EGFL7 y/o uno o más polinucleótidos que comprenden secuencias que codifican a uno o más anticuerpos que se unen a EGFL7. Estas composiciones pueden contener, además, vehículos aptos, como excipientes farmacéuticamente aceptables que incluyan soluciones tamponadas, que son bien conocidas en el sector. La invención también engloba formas de realización de polinucleótidos y anticuerpos aislados. La invención también engloba formas de realización de polinucleótidos y anticuerpos sustancialmente puros. Los anticuerpos anti-EGFL7 de la invención son preferiblemente monoclonales. También se incluyen dentro del ámbito de la invención fragmentos de anticuerpos como los fragmentos Fab, Fab ' , Fab'-SH y F(ab')2, de los anticuerpos anti-EGFL7 proporcionados en la presente memoria descriptiva. Estos fragmentos de anticuerpos se pueden crear por medios tradicionales, como digestión enzimática, o se pueden generar mediante técnicas recombinantes . Estos fragmentos de anticuerpos pueden ser quiméricos o humanizados. Estos fragmentos son útiles para los fines diagnósticos y terapéuticos que se exponen a continuación. Los anticuerpos monoclonales se obtienen a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos0 individuales que forman la población son idénticos, excepto en posibles mutaciones de formación natural que pueden estar presentes en cantidades insignificantes. Por lo tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo, que consiste en que no es una mezcla de anticuerpos discretos. Pueden conseguirse los anticuerpos monoclonales anti-EGFL7 de la invención por el método del hibridoma, descrito por primera vez en Kohler et al., Nature , 256:495 (1975) , o con el método del ADN recombinante (Patente de Estados Unidos n° 4.816.567) . En el método del hibridoma, un ratón u otro animal huésped apropiado, como un hámster, se inmuniza para obtener linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína utilizada para la inmunización. Los anticuerpos anti-EGFL7 se producen generalmente en animales mediante inyecciones subcutáneas (se) o int raperitoneales (ip) de EGFL7 y un adyuvante. La EGFL7 se puede preparar usando métodos bien conocidos en este ámbito, algunos de los cuales se describen con más detalle en la presente memoria descriptiva. Por ejemplo, más adelante se describe la producción recombinante de EGFL7. En una forma de realización, se inmuniza a los animales con un derivado de EGFL7 que contiene el dominio extracelular (ECD) de EGFL7 fusionado a la porción Fe de una cadena pesada de inmunoglobulina . En una forma de realización, se inmuniza a los animales con una proteina de fusión EGFL7-IgGl. Los animales suelen ser inmunizados contra conjugados inmunogénicos o derivados de EGFL7, con monofosforil lipido A (MPL) /dicrinomicolato de trehalosa (TDM) (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, MT) y la solución se inyecta intradérmicamente en múltiples puntos. Dos semanas más tarde los animales reciben dosis de recuerdo. Entre 7 y 14 días más tarde se extrae sangre a los animales y el suero se analiza para titular los anticuerpos anti-EGFL . Los animales reciben dosis de recuerdo hasta obtener los niveles adecuados de titulación. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar en vitro. Después, los linfocitos se fusionan con las células de mieloma utilizando un agente fusionante adecuado, como por ejemplo poliet ilenglicol , para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies y Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Por lo tanto, las células de hibridoma preparadas se siembran y crecen en un medio de cultivo adecuado que preferentemente contenga una o más sustancias que inhiban el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parental no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma parentales no poseen la enzima hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas generalmente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT) , cuyas sustancias evitan el crecimiento de células con déficit de HGPRT. Las células de mieloma preferentes son aquéllas que se fusionan eficazmente, soportan altos niveles estables de producción de anticuerpos por parte de las células productoras de anticuerpos seleccionadas y son sensibles a un medio como el HAT. Entre éstas, las lineas celulares de mieloma preferentes son lineas de mieloma murino, como aquellas derivadas de los tumores de ratones MOPC-21 y MPC-11, disponibles en el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, EE.UU., y las células SP-2 o X63-Ag8-653, disponibles en el American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, EE.UU. Las lineas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984) ; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques y Applications, pp . 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987) ) . El medio de cultivo en el cual las células de hibridoma crecen se analiza para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos directamente contra EGFL7. Preferentemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma está determinada por la inmunoprecipitación o por un ensayo de unión, como el radioinmunoensayo (RIA) o ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) . La afinidad de unión de un anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse mediante el análisis Scatchard de Munson et al., Ana.. Biochem., 107:220 (1980) . Después de identificar que las células de hibridoma producen anticuerpos con la especificidad, afinidad y/o actividad deseada, los clones se pueden subclonar limitando los procedimientos de dilución y pueden crecer mediante métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies y Practice, pp . 59-103 (Academic Press, 1986)) . Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden crecer en vivo en un animal como tumores con ascitis. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, los fluidos asciticos o el suero mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas , como por ejemplo, la proteina A-sefarosa, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad. Los anticuerpos anti-EGFL7 de la invención se pueden obtener utilizando librerías combinatorias para detectar clones de anticuerpos sintéticos con la actividad o actividades deseadas. En principio, los clones de anticuerpos sintéticos se seleccionan mediante la detección de librerías de fagos que contienen fagos que representan diversos fragmentos de la región variable (Fv) de anticuerpos fusionados a proteína de revestimiento de fagos. Estas librerías de fagos son cribadas mediante cromatografía de afinidad para detectar el antígeno deseado. Los clones que expresan fragmentos Fv capaces de unirse al antígeno deseado son adsorbidos al antígeno y, de este modo, separados de los clones de la biblioteca que no tienen capacidad de unión.

Los clones con capacidad de unión se eluyen entonces del antigeno y pueden ser enriquecidos aún más mediante ciclos adicionales de adsorción/elución de antigenos. Algunos de los anticuerpos anti-EGFL7 de la invención se pueden obtener diseñando un procedimiento apropiado de detección de antigenos para seleccionar el clon del fago de interés, seguido por la construcción de un clon del anticuerpo anti-EGFL7 de longitud completa utilizando las secuencias de Fv del clon del fago de interés y secuencias de la región constante (Fe) adecuadas, descritas en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest , Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. El dominio de unión a antigeno de un anticuerpo está formado a partir de dos regiones variables (V) de unos 110 aminoácidos, una correspondiente a la cadena ligera (VL) y otra correspondiente a la cadena pesada (VH) , que presentan en ambos casos tres bucles hipervariables o regiones de determinación de complementariedad (CDR) . Los dominios variables se pueden representar funcionalmente en el fago, ya sea como fragmentos de Fv de cadena única (scFv), en los que VH y VL están covalentemente enlazadas por medio de un péptido corto y flexible, o como fragmentos Fab, en los que están fusionados a un dominio constante e interactúan no covalentemente , como se describe en Winter et al., Ann. Rev. Immunol . , 12:433-55 (1994) . Como se usa en la presente memoria descriptiva, los clones de fagos que codifican scFv y los clones de fagos que codifican Fab se denominan colectivamente "clones de fagos Fv" o "clones Fv" . Los repertorios de genes de VH y VL se pueden clonar por separado mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y recombinar aleatoriamente en librerías de fagos, en las que se puede buscar por clones de unión a antígeno, como se describe en Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12:433-55 (1994) . Las bibliotecas procedentes de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad al inmunógeno sin la necesidad de construir hibridomas. Alternativamente, el repertorio virgen se puede clonar para proporcionar una única fuente de anticuerpos humanos a una gran variedad de antígenos extraños y también de autoantígenos sin ninguna inmunización como se describe en Griffiths et al., EMBO J, 12:725-34 (1993) . Por último, las librerías nativas también se pueden producir sintéticamente mediante la clonación de segmentos de genes V no reorganizados procedentes de células madre y utilizando cebadores de la PCR que contengan secuencias aleatorias para codificar las regiones CDR3 muy variables y para conseguir la reorganización en vitro como se describe en Hoogenboom y Winter, J. Mol . Biol., 227:381-88 (1992) . El fago filamentoso se utiliza para representar fragmentos de anticuerpos mediante fusión a la proteina de revestimiento menor pIII. Los fragmentos de anticuerpos se pueden representar como fragmentos Fv de cadena única, en los que los dominios de VH y VL están conectados a la misma cadena polipeptídica mediante un separador de polipéptidos flexible, como se describe en Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), o como fragmentos Fab, en los que una cadena se fusiona a pIII y las otras se segregan en el periplasma del huésped celular bacteriano donde el ensamblaje de una estructura proteinica de revestimiento de Fab se representa en la superficie del fago mediante el desplazamiento de las proteínas de revestimiento de tipo natural, por ejemplo, como se describe en Hoogenboom et al., Nucí. Acids Res. 19:4133-37 (1991) . En general, los ácidos nucleicos que codifican fragmentos de genes de anticuerpos se obtienen a partir de inmunocitos recolectados de humanos o animales. Si se desea una librería que presente un sesgo a favor de clones anti-EGFL7, el sujeto es inmunizado con EGFL7 para generar una respuesta a anticuerpos y las células esplénicas y/o los linfocitos B circulantes u otros linfocitos de la circulación periférica se recuperan para la construcción de la librería. En una forma de realización preferente, una librería de fragmentos de genes de anticuerpos humanos sesgada a favor de clones de anti-EGFL7 humano se obtiene generando una respuesta a un anticuerpo anti-EGFL7 humano en ratones transgénicos portadores de una matriz de genes humanos funcionales de la inmunoglobulina (y carentes de un sistema funcional de producción de anticuerpos endógenos), de forma que la inmunización con EGFL7 da lugar a linfocitos B productores de anticuerpos humanos anti-EGFL7. La generación de ratones transgénicos productores de anticuerpos humanos se describe más adelante. El enriquecimiento adicional de poblaciones celulares reactivas a anti-EGFL7 se puede obtener mediante un procedimiento de detección adecuado para aislar linfocitos B que expresen un anticuerpo unido a membrana específico de EGFL7, por ejemplo, mediante separación celular con cromatografía de afinidad a EGFL7 o adsorción de células a EGFL7 marcada con flurocromo seguida de separación de células activadas por fluorescencia (FACS) . Alternativamente, el uso de células esplénicas y/o linfocitos B u otros PBL procedentes de un donante no inmunizado ofrece una mejor representación del posible repertorio de anticuerpos y también permite la construcción de una librería de anticuerpos usando cualquier especie animal (humana o no humana) en la que EGFL7 no es antigénico. En el caso de librerías que incorporen construcción de genes de anticuerpos en vítro, las células madre se recolectan del sujeto para proporcionar ácidos nucleicos que codifiquen segmentos de genes de anticuerpos no organizados. Los inmunocitos de interés se pueden obtener de diversas especies animales, como humanos, ratón, rata, lagomorfa, luprina, canina, felina, porcina, bovina, equina y especies aviares, etc . Los segmentos de regiones variables de genes anticuerpos que codifican ácidos nucleicos (incluidos los segmentos VH y VL) se recuperan a partir de las células de interés y se amplifican. En el caso de librerías de genes de VH y VL reorganizadas, el ADN deseado se puede obtener aislando el ADN o el ARNm genómico de los linfocitos, seguido de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores que se acoplen a los extremos 5' y 3' de los genes de la VH y la VL reorganizados, como se describe en Orlandi et al., Proc. Nati. Acad. Scí. (USA), 86:3833-37 (1989), lo que permite obtener diversos repertorios de genes V para su expresión. Los genes V se pueden amplificar a partir del ADNc y del ADN genómico con cebadores reversos en el extremo 5' del exón que codifica el dominio V maduro y cebadores anversos dentro del segmento J como se describe en Orlandi et al. (1989) y en Ward et al., Nature, 341. Sin embargo, para amplificar desde el ADNc, los cebadores reversos también se pueden situar en el exón líder, como se describe en Jones et al., Biotechnol., 9:88-89 (1991) , y los cebadores anversos dentro de la región constante, como se describe en Sastry et al., Proc . Nati. Acad. Sci. (USA) , 86:5728-32 (1989) . Para maximizar la complementariedad, se puede incorporar la degeneración en los cebadores como se describe en Orlandi et al. (1989) o Sastry et al. (1989) . Preferentemente, la diversidad de las librerías se maximiza utilizando cebadores de la PCR dirigidos a cada familia de genes V para amplificar todas las organizaciones disponibles de VH y VL presentes en la muestra de ácidos nucleicos de inmunocitos, por ejemplo, como se describe en el método de Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-97 (1991) o como se describe en el método de Orum et al., Nucí. Acids Res. 21:4491-4498 (1993) . Para la clonación del ADN amplificado en vectores de expresión, se pueden introducir sitios de restricción poco habituales dentro del cebador de la PCR como una marca en un extremo, según se describe en Orlandi et al. (1989) , o mediante una nueva amplificación de la PCR con un cebador marcado, como se describe en Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) . De segmentos de genes V en vitro se pueden derivar repertorios de genes V sintéticamente reorganizados. La mayoría de los segmentos de genes VH humanos se han clonado y secuenciado (según Tomlinson et al., J. Mol. Biol . , 227:776-98 (1992) , y mapeados (según atsuda et al., Nautre Genet . 3:88-94 (1993) ; estos segmentos clonados (incluidas todas las principales conformaciones del bucle Hl y H2) se pueden utilizar para generar diversos repertorios de genes VH con cebadores de la PCR gue codifican bucles de H3 de secuencia y longitud diversas, como se describe en Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381-88 (1992) . Los repertorios de VH también se pueden hacer con toda la diversidad de secuencias centrada en un bucle de H3 largo de una única longitud, como se describe en Barbas et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 89:4457-61 (1992) . Los segmentos VK y VA humanos se han clonado y secuenciado (según se explica en Williams y Winter, Eur. J. Immunol., 23:1456-61 (1993) ) y se pueden utilizar para hacer repertorios sintéticos de la cadena ligera. Los repertorios de genes V sintéticos, basados en una gran variedad de dominios de VH y VL y longitudes de L3 y H3, codificarán anticuerpos de considerable diversidad estructural. Tras la amplificación de los ADN codificadores de genes V, los segmentos de genes V de linea germinal se pueden reorganizar en vitro según los procedimientos de Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381-88 (1992) . Se pueden construir repertorios de fragmentos de anticuerpos mediante combinación de repertorios de genes de VH y VL juntos de varias formas. Cada repertorio se puede crear en vectores diferentes y los vectores se pueden recombinar en vitro, por ejemplo, como se describe en Hogrefe et al., Gene, 128:119-26 (1993), o en vivo mediante infección combinatoria, por ejemplo, el sistema loxP descrito en aterhouse et al., Nucí. Acids Res. 21:2265-66 (1993) . El procedimiento de la recombinación en vivo se aprovecha de las dos cadenas de los fragmentos Fab para superar el limite en el tamaño de la librería impuesto por la eficacia de transformación de E. coli. Los repertorios de VH y VL vírgenes se clonan por separado, uno en un fagémido y el otro en un vector fágico. Las dos librerías se combinan a continuación mediante infección fágica de bacterias que contienen fagémidos, de forma que cada célula contiene una combinación distinta y el tamaño de la librería sólo está limitado por el número de células presente (unos 10 clones) . Los dos vectores contienen señales de recombinación en vivo, por lo que los genes VH y VL se recombinan en un único replicón y se introducen en viriones fágicos. Estas enormes librerías proporcionan gran número de diversos anticuerpos con buena afinidad (Kd_1 de aproximadamente 10~8 ) . Alternativamente, los repertorios se pueden clonar secuencialmente en el mismo vector, por ejemplo, como se describe en Barbas et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88:7978-82 (1991), o ensamblar juntos mediante PCR y, luego, clonarlos, como se describe en Clackson et al., Nature, 352:624-28 (1991) . El ensamblaje de la PCR también se puede utilizar para unir los ADN de la VH y la VL con ADN que codifica un espaciador peptídico flexible para formar repertorios de Fv de cadena única (scFv) . En otra técnica, "el ensamblaje de la PCR en el interior de la célula" se usa para combinar genes VH y VL dentro de linfocitos mediante PCR y, luego, clonar repertorios de genes enlazados, como se describe en Embleton et al., Nucí. Acids Res. 20:3831-37 (1992) . Los anticuerpos producidos por librerías vírgenes (sean naturales o sintéticas) pueden ser de afinidad moderada (Kd_1 de aproximadamente 106 a 107 M-1), pero la maduración de la afinidad también se puede imitar en vitro mediante construcción y reselección a partir de librerías secundarias, como se describe en Winter et al. (1994), citado anteriormente. Por ejemplo, la mutación se puede introducir aleatoriamente en vitro utilizando polimerasa con tendencia al error (según se explica en Leung et al., Technique, 1:11-15 (1989) ) en el método de Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226:889-96 (1992) o en el método de Gram et al., Proc. Nati, ñcad. Sci USA, 89:3576-80 (1992) . Asimismo, la maduración de la afinidad se puede realizar mediante mutación aleatorizada de una o más CDR, por ejemplo, utilizando PCR con cebadores de secuencia aleatoria que abarquen la CDR de interés, en clones de Fv individuales seleccionados y detecten clones de afinidad más alta. El documento WO 96/07754 (publicado el 14 de marzo de 1996) describía un procedimiento para inducir la mutagénesis en una región de determinación de complementariedad de una cadena ligera de inmunoglobulinas para crear una librería de genes de la cadena ligera. Otro método eficaz consiste en recombinar los dominios de VH o VL seleccionados por representación de fagos con, repertorios de variantes de domino V que se producen naturalmente obtenidos a partir de donantes no inmunizados y detectar los de mayor afinidad en varias series de nueva transposición de cadenas, como se describe en Marks et al., Biotechnol., 10:10:779-83 (1992) . Esta técnica permite la producción de anticuerpos y de fragmentos de anticuerpos con afinidades del orden de 10~9 M. La secuencia de ácidos nucleicos que codifica una EGFL7 se puede diseñar utilizando la secuencia de aminoácidos de la región deseada de EGFL7. Alternativamente, se puede utilizar la secuencia de ADNc (o fragmentos de ésta) . Otras secuencias adicionales de EGFL7 se describen, por ejemplo, en NM_022963 y Xie et al., Cytokíne 11:729-35 (1999) . Los ADN que codifican a EGFL7 se pueden preparar mediante diversos métodos conocidos en el sector. Estos métodos incluyen, aunque sin limitarse a ellos, la síntesis química mediante cualquiera de los métodos descritos en Engels et al., Agnew. Chem. Int. Ed. Engl . , 28:716-34 (1989), como los métodos de triéster, fosfito, fosforamidita y fosfonato H. En una forma de realización, los codones preferidos por la expresión de células huésped se usan en el diseño de la EGFL7 que codifica el ADN. Otra alternativa es aislar el ADN que codifica la EGFL7 a partir de una librería de ADNc o genómica. Tras la construcción de la molécula de ADN que codifica la EGFL7, la molécula de ADN se enlaza funcionalmente a una secuencia de control de la expresión en un vector de expresión, como un plásmido, en la que la secuencia de control es reconocida por una célula huésped transformada con el vector. En general, los vectores plásmidos contienen secuencias de control y replicación que se derivan de especies compatibles con la célula huésped. Por lo general, el vector lleva un sitio de replicación, asi como secuencias que codifican proteínas que son capaces de proporcionar selección fenotípica en células transformadas. Los vectores aptos para la expresión en células huésped procariót icas y eucarióticas son bien conocidos en el sector y algunos se describen con mayor detalle en la presente memoria descriptiva. Se pueden usar organismos eucarióticos , como las levaduras, o células derivadas de organismos pluricelulares, como mamíferos. Opcionalmente , el ADN que codifica la EGFL7 se enlaza funcionalmente a una secuencia líder secretora, lo que origina la secreción del producto de expresión por la célula huésped en el medio de cultivo. Ejemplos de secuencias líder secretoras son stll, ecotina, lamB, herpes GD, lpp, fosfatasa alcalina, invertasa y factor alfa. También es apto para su uso en la presente memoria descriptiva la secuencia líder de 36 aminoácidos de la proteína A (Abrahmsen et al., EMBO J. , : 3901 (1985) ) .

Las células huésped son transíectadas y preferiblemente transformadas con los vectores de expresión o clonación de esta invención y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados como es adecuado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Por transfección se entiende la captación de un vector de expresión por una célula huésped, con independencia de que estén expresadas realmente secuencias de codificación. Normalmente, los expertos conocen numerosos métodos de transfección, como por ejemplo, precipitación y electroporacion de CaP04. Por lo general, se reconoce que se ha logrado la transfección cuando se produce una indicación del funcionamiento de este vector dentro de la célula huésped. Los métodos de transfección son bien conocidos en el sector y algunos se describen con mayor detalle en la presente memoria descriptiva. Transformación significa introducir ADN en un organismo de forma que el ADN sea replicable, ya sea como elemento extracromosómico o como integrante cromosómico. Dependiendo de la célula huésped usada, la transformación se realiza utilizando técnicas estándar apropiadas para dichas células. Los métodos de transformación son bien conocidos en el sector y algunos se describen con mayor detalle en la presente memoria descriptiva. Las células huésped procarióticas usadas para producir la EGFL7 se pueden cultivar como se describe en términos generales en Sambrook et al., según lo indicado anteriormente . Las células huésped en mamíferos usadas para producir la EGFL7 se pueden cultivar en diversos medios, que son bien conocidos en el sector y algunos de los cuales se describen en la presente memoria descriptiva. Las células huésped mencionadas en esta memoria engloban células en cultivo en vitro, así como células que están dentro de un animal huésped. La purificación de la EGFL7 se puede lograr utilizando métodos reconocidos en este ámbito. La EGFL7 purificada se puede unir a una matriz adecuada como partículas de agarosa, partículas de acrilamida, partículas de vidrio, celulosa, diversos copolímeros acrílicos, geles de metacrilato de hidróxilo, copolímeros poliacrílieos y polimetacrílieos , nailon, moléculas vehículo neutras e iónicas y similares, para uso en la separación mediante cromatografía de afinidad de clones de representación de fagos. La unión de la proteína EGFL7 a la matriz se puede conseguir mediante los métodos descritos en Meth . Enzymology, vol. 44 (1976). Una técnica comúnmente empleada para unir ligandos de proteínas a matrices de polisacáridos , por ejemplo, agarosa, dextrano o celulosa, supone la activación de la molécula vehículo con halidos cianógenos y el acoplamiento subsiguiente de las aminas primarias alifáticas o aromáticas del ligando peptídico a la matriz activada. Alternativamente, la EGFL7 se puede utilizar para revestir los pocilios de placas de adsorción, expresada en huéspedes celulares en placas de adsorción o utilizada en separación celular, o conjugada con biotonina para captura con partículas revestidas de estreptavidina , o utilizadas en cualquier otro procedimiento conocido en el sector para detectar librerías de representación de imágenes de fagos. Las muestras de librerías de fagos están en contacto con la EGFL7 inmovilizada en condiciones aptas para la unión de al menos una porción de partículas de fago con el adsorbente. Normalmente, las condiciones, incluido el pH, la concentración iónica, la temperatura y similares, se seleccionan de forma que imiten condiciones fisiológicas. Los fagos unidos a la fase sólida se lavan y, luego, se eluyen mediante ácido, por ejemplo, como se describe en Barbas et al., Proc . Nati. ñcad. Sci USA, 88:7978-82 (1991), o mediante álcali, por ejemplo como se describe en Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-97 (1991) , o mediante competición antigénica con la EGFL7, por ejemplo, en un procedimiento similar al procedimiento de competición antigénica de Clackson et al., Nature, 352:624-28 (1991) . Los fagos se pueden enriquecer de 20 a 1.000 veces en una única serie de selección. Además, los fagos enriquecidos se pueden cultivar en cultivos bacterianos y estar sometidos a nuevas series de selección. La eficacia de la selección depende de muchos factores, incluida la cinética de la disociación durante el lavado y si múltiples fragmentos de anticuerpos de un único fago se pueden unir simultáneamente a antigeno. Los anticuerpos con rápida cinética de disociación (y afinidades de unión débiles) se pueden conservar mediante el uso de lavados cortos, representación de imágenes de fagos multivalente y densidad de revestimiento alta del antigeno en fase sólida. La densidad elevada no sólo estabiliza al fago durante las interacciones multivalentes , sino que, además, favorece la unión del fago disociado otra vez. La selección de anticuerpos con lenta cinética de disociación (y buenas afinidades de unión) se puede promover mediante el uso de largos lavados y representación de imágenes de fagos monovalente, como se describe en Bass et al., Proteins, 8:309-14 (1990) y en el documento WO 92/09690, y una baja densidad de revestimiento del antigeno como se describe en Marks et al., Biotechnol . , 10:779-83 (1992) . Es posible seleccionar entre anticuerpos de fagos de distintas afinidades, incluso con afinidades que difieren ligeramente, para EGFL7. Sin embargo, la mutación aleatoria de un anticuerpo seleccionado (por ejemplo, como la realizada en algunas de las técnicas de maduración de la afinidad descritas anteriormente) es probable que ocasione muchos mutantes, la mayoría de unión a antígeno, y unos cuantos con afinidad más alta. Con una EGFL7 limitada, es raro que se puedan completar fagos de alta afinidad. Para conservar todos los mutantes de afinidad más alta, los fagos se pueden incubar con una cantidad mayor de EGFL7 biotinilada, pero con EGFL7 biotinilada a una concentración de molaridad inferior a la constante de afinidad molar diana para EGFL7. Los fagos con afinidad de unión más alta pueden, entonces, ser capturados por partículas paramagnéticas revestidas de estreptavidina . Esta "captura en equilibrio" permite seleccionar los anticuerpos según sus afinidades de unión, con una sensibilidad que permite aislar clones mutantes con una afinidad tan solo dos veces superior de la enorme cantidad de fagos con afinidad menor. Las condiciones usadas en el lavado de fagos unidos a una fase sólida también se pueden manipular para distinguirlos en función de la cinética de disociación. También se pueden seleccionar clones anti-EGFL7 por su actividad. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales derivados de hibridoma o los clones de Fv de la invención es rápidamente aislado y secuenciado utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando cebadores oligonucleóticos diseñados para amplificar específicamente las regiones que codifican las cadenas ligera y pesada de interés de plantillas de ADN de fagos o hibridoma) . Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, que después se transfectan en células huésped, como por ejemplo las células E. coli, las células COS de monos, las células de ovario de hámster chino (CHO) o las células de mieloma que, de otro modo, no producen la proteína de la inmunoglobulina , para obtener la síntesis de los anticuerpos monoclonales deseados en las células huésped recombinantes . Los artículos de revisión sobre expresión recombinante en bacterias del ADN que codifican el anticuerpo incluyen Skerra et al., Curr. Opinión en Immunol. 5:256 (1993) y Plückthun, Immunol. Rev . 130:151 (1992) . El ADN que codifica los clones de Fv de la invención se pueden combinar con secuencias de ADN conocidas que codifican las regiones constantes de la cadena ligera y/o la cadena pesada (por ejemplo, las secuencias de ADN apropiadas se pueden obtener según Kabat et al., como se ha descrito anteriormente) para formar clones que codifiquen cadenas ligeras y/o pesadas de longitud total o parcial. Se tendrá en cuenta que las regiones constantes de cualquier isótopo se pueden utilizar para este fin, incluidas las regiones constantes IgG, Ig , IgA, IgD e IgE y que dichas regiones constantes se pueden obtener de cualquier especie animal o humana. Un clon de Fv se deriva del ADN del dominio variable de una especie animal (por ejemplo, un humano) y, luego, se fusiona al ADN de la región constante de otra especie animal para formar una o más secuencias de codificación, puesto que una cadena ligera y/o pesada de longitud completa e "híbrida" está incluida en la definición de anticuerpo "híbrido" y "quimérico" como se usa en la presente memoria descriptiva. En una forma de realización preferente, un clon de Fv derivado de ADN variable humano se fusiona con ADN de región constante humano para formar una o más secuencias de codificación para todas las cadenas ligeras y/o pesadas de longitud parcial o completa y humanas. El ADN que codifica un anticuerpo anti-EGFL7 derivado de un hibridoma de la invención también se puede modificar, por ejemplo, mediante sustitución de las secuencias murinas homologas derivadas del clon de hibridoma por la secuencia de codificación para los dominios constantes de la cadena ligera y pesada humanas (por ejemplo, como en el método de Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81:6851-55 (1984) ) . El ADN que codifica un anticuerpo o fragmento derivado del clon de Fv o un hibridoma se puede modificar a su vez mediante la unión covalente a la secuencia de codificación de la inmunoglobulina de la totalidad o parte de la secuencia de codificación de un polipéptido que no sea inmunoglobulina. De este modo, se preparan anticuerpos "quiméricos" o "híbridos" que tienen la especificidad de unión de los anticuerpos de la invención derivados del clon de hibridoma o del clon de Fv. Fragmentos de anticuerpos La presente invención engloba fragmentos de anticuerpos. En determinadas circunstancias, existen ventajas en el uso de fragmentos de anticuerpos, en vez de anticuerpos completos. El menor tamaño de los fragmentos permite una rápida eliminación y puede llevar a un mejor acceso a tumores sólidos . Se han desarrollado varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se obtenían mediante digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical y Biophysical Methods 24:107-17 (1992) ; y Brennan et al., Science, 229:81 (1985)) . Sin embargo, estos fragmentos ahora se pueden producir directamente mediante células huésped recombinantes . Los fragmentos de anticuerpos Fab, Fv y ScFv pueden expresarse todos en E. coli y secretarse a partir de E. coli, lo que permite la fácil producción de grandes cantidades de estos fragmentos. Los fragmentos de anticuerpos se pueden aislar de las librerías de fagos descritas anteriormente. Alternativamente, los fragmentos Fab'-SH se puede recuperar directamente de E. coli y unir químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al., Bio/'Technology 10:163-67 (1992)) . De acuerdo con otro enfoque, los fragmentos F(ab')2 se pueden aislar directamente desde cultivos de células huésped recombinantes. El fragmento Fab y F(ab')2 con mayor semivida en vivo que comprende residuos de un epítopo de unión a un receptor de rescate se describe en la Patente de Estados Unidos n° 5.869.046. Los expertos en este campo conocerán otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. En otras formas de realización, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv de cadena simple (scFv) . Véase el documento WO 93/16185; la patente de Estados Unidos n° 5.571.894 y la patente de Estados Unidos n° 5.587.458. Fv y scFv son las únicas especies con puntos de combinación intactos que están privados de regiones constantes; por ello, son aptos para una unión no especifica reducida durante el uso en vivo. Las proteínas de fusión scFv se pueden construir para obtener la fusión de una proteína efectora en el extremo carboxi terminal o amino terminal de un scFv. Véase Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, W.H. Freeman y Company (1992). El fragmento de anticuerpo puede ser también un "anticuerpo lineal", por ejemplo, tal y como se describe en la patente de Estados Unidos n° 5.641.870. Estos fragmentos de anticuerpos lineales pueden ser monoespecí fieos o biespecí fieos . Anticuerpos humanizados La presente invención engloba anticuerpos humanizados. En el sector se conocen diversos procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado puede tener uno o más residuos de aminoácidos introducidos en el mismo desde una fuente que es no humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos se conocen, por lo general, como residuos "importados" que con frecuencia se toman de un dominio variable de "importación". La humanización se puede realizar esencialmente a través del método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-25 (1986) ; Riechmann et al., Nature, 332:323-27 (1988) ; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-36 (1988) ), al sustituir las secuencias de la región hipervariable por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente de EE.UU. n° 4.816.567) , en los que se ha sustituido básicamente menos de un dominio variable humano intacto por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son generalmente anticuerpos humanos en los que los residuos de la región hipervariable y posiblemente algunos residuos FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores. La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, que se utilizarán para realizar los anticuerpos humanizados es muy importante para disminuir la ant igenicidad . De acuerdo con el denominado método "del más apto", la secuencia del dominio variable del anticuerpo de un roedor se compara con · toda la biblioteca de secuencias conocidas de los dominios variables humanos. Entonces, se acepta la secuencia humana más parecida a la de los roedores como estructura humana (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993) ; Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)) . Otro método utiliza una estructura especifica derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo en particular de las cadenas ligeras o pesadas. La misma estructura se puede utilizar para diferentes anticuerpos humanizados (Cárter et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992) ; Presta et al. , J. Immunol., 151:2623 (1993) ) . Además, es importante que los anticuerpos se humanicen con retención de la afinidad alta para el antigeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, siguiendo uno de los procedimientos, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y varios productos humanizados conceptuales que utilizan modelos tridimensionales de las secuencias parentales y las humanizadas. Generalmente se dispone de modelos de inmunoglobina tridimensional conocidos por las personas familiarizadas con el sector. Existen programas informáticos que ilustran y muestran estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidata. La inspección de estas visualizaciones permite analizar el papel que los residuos probablemente desempeñan en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antigeno. De esta manera, los residuos FR se pueden seleccionar y combinar a partir de las secuencias receptoras y de importación para lograr la característica deseada del anticuerpo, como por ejemplo una mayor afinidad por el/los antígeno(s) . En general, los residuos de la región hipervariable están directamente y más sustancialmente implicados en la influencia sobre la unión del antígeno. Anticuerpos humanos Los anticuerpos humanos anti-EGFL7 de la invención se pueden construir combinando una o más secuencias de dominio variable Fv de clones seleccionadas de librerías de representación en imágenes de fagos derivados de humanos con una o más secuencias de domino constante humanas, como se ha descrito anteriormente. Alternativamente, los anticuerpos humanos monoclonales anti-EGFL7 de la invención se pueden producir por el método del hibridoma. Las líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984) ; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques y Applications, pp . 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987) ; y Boerner et al., J. Immunol., 147:86 (1991) . Actualmente es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que sean capaces, una vez inmunizados, de generar un repertorio completo de anticuerpos humanos cuando no se produzca inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la eliminación homocigótica del gen de la cadena pesada del anticuerpo que se une a la región del gen (JH) en ratones quiméricos y en lineas germinales de ratones mutantes ocasiona la inhibición total de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia de la matriz de genes humanos de la inmunoglobulina de linea germinal a uno de estos ratones mutantes de linea germinal ocasionará la producción de anticuerpos humanos al actuar sobre el antigeno. Véase, por ej . , Jakobovits et al. , Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993) ; Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993) ; Bruggemann et al. , Year en Immunol. 7:33 (1993) . También se puede utilizar la transposición de genes para derivar anticuerpos humanos de no humanos, por ejemplo, anticuerpos de roedores, en los que el anticuerpo humano tiene afinidades y especificidades similares al anticuerpo no humano de inicio. Según este método, que también se denomina "impronta de epitopos", la región variable de cadena pesada o ligera de un fragmento de anticuerpo no humano obtenido mediante técnicas de representación en imágenes de fagos como las descritas anteriormente se sustituye por un repertorio de genes de dominio V humanos, lo que crea una población de quimeras Fab o scFv de cadena humana/cadena no humana. La selección con el antigeno da lugar al aislamiento de un Fab o scFV quimérico de cadena humana/cadena no humana, en el que la cadena humana restaura el sitio de unión a antigeno destruido al eliminar la cadena no humana correspondiente del clon de la representación del fago primario; es decir, el epitopo rige (sella) la elección de la molécula de la cadena humana. Cuando se repite el proceso para sustituir la cadena no humana restante, se obtiene un anticuerpo humano (véase PCT O 93/06213 publicado el 1 de abril de 1993) . A diferencia de la tradicional humanización de anticuerpos no humanos mediante transplante de CDR, esta técnica proporciona anticuerpos completamente humanos que no tienen residuos FR o CDR de origen no humano. Anticuerpos biespecificos Los anticuerpos biespecí fieos son anticuerpos monoclonales , preferiblemente humanos o humanizados, que tienen especificidades de unión con al menos dos antigenos diferentes. En el caso que nos ocupa, una de las especificidades de unión corresponde a EGFL7 y la otra, a cualquier otro antigeno. Los anticuerpos biespecificos ejemplares se pueden unir a dos epitopos diferentes de la proteina EGFL7. Los anticuerpos biespecificos también se pueden utilizar para localizar agentes citotóxicos de las células que expresan la EGFL7. Estos anticuerpos tienen un brazo de unión a EGFL7 y un brazo que se une al agente citotóxico (por ej . , saporin, anti-interferón-a, alcaloide de la vinca, cadena de ricina A, metotrexato o hapteno con un isótopo radiactivo) . Los anticuerpos biespecificos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (por ej . anticuerpos biespecificos F(ab')2). Los procedimientos para realizar anticuerpos biespecificos son conocidos en la materia. La producción recombinante tradicional de anticuerpos biespecificos se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina , en que las dos cadenas tienen distintas especificidades (Milstein y Cuello, Nature, 305:537 (1983)). Debido a la variedad aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina , estos hibridomas (cuadromas) producen una posible mezcla de 10 moléculas diferentes de anticuerpos, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecifica correcta. La purificación de la molécula correcta, que generalmente se realiza mediante etapas de cromatografía de afinidad, es bastante complicada, y la cantidad de producto que se obtiene es baja. En el documento WO 93/08829 publicado el 13 de mayo de 1993 y en Traunecker et al., EMBO J. , 10:3655-3659 (1991) se describen procedimientos similares. Según una técnica distinta y que se suele preferir, los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (puntos de combinación anticuerpo-antígeno) se fusionan a las secuencias de domino constante de la inmunoglobulina. La fusión es preferentemente con un dominio constante de cadena pesada de la inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Es preferible tener la primera región constante de cadena pesada (CH1), que contiene el punto necesario para la unión de la cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de la inmunoglobulina y, si se desea, de cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se co-transfectan a un organismo huésped adecuado. Esto mantiene la gran flexibilidad al ajustar las proporciones mutuas de tres fragmentos polipéptidos en realizaciones en donde las proporciones desiguales de las tres cadenas de polipéptidos utilizados en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias de codificación de dos o de las tres cadenas de polipéptidos en un vector de expresión cuando la expresión es de al menos de dos cadenas de polipéptidos en resultados con proporciones iguales en rendimientos altos o cuando las proporciones no tienen particular importancia. En algunas formas de realización de este método, los anticuerpos biespecificos se componen de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se descubrió que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en sólo una de las mitades de la molécula biespecífica proporciona una forma sencilla de separación. Este método se describió en el documento WO 94/04690. Para obtener mayores detalles sobre la generación de anticuerpos biespeci fieos , véase, por ejemplo, Suresh et al., Meth . Enzymol. 121:210 (1986) . Según otro enfoque, la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpos se puede modificar para maximizar el porcentaje de heterodimeros que se recuperan de un cultivo celular recombinante . La interfaz preferente comprende al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante del anticuerpo. En este procedimiento, una o más cadenas laterales cortas de aminoácidos de la interfaz de la primera molécula del anticuerpo se reemplazan con cadenas laterales más largas (por ej . tirosina o triptófano) . Las "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la cadena o cadenas laterales largas se crean en la interfaz de la segunda molécula del anticuerpo al reemplazar las cadenas laterales largas de aminoácidos por cadenas más cortas (por ej . , alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para incrementar la producción del heterodimero con relación a otros productos finales no deseados como los homodimeros . Los anticuerpos biespecificos incluyen anticuerpos reticulantes o "heteroconj ugados" . Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconj ugado se puede unir a la avidina o a la biotina. Estos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para conseguir que las células del sistema inmunitario actúen sobre células no deseadas (patente de EE.UU. n° 4.676.980) y para el tratamiento de la infección de VIH (documentos WO 91/00360 y WO 92/00373) . Los anticuerpos heteroconjugados se pueden obtener utilizando cualquier procedimiento de reticulación adecuado. Los agentes reticulantes adecuados se conocen bien en la materia y se desvelan en la patente de EE.UU. n° 4.676.980, junto con una serie de técnicas de reticulación. Las técnicas para generar anticuerpos biespecificos a partir de fragmentos de anticuerpos también se han descrito en la bibliografía. Por ejemplo, los anticuerpos biespecificos se pueden preparar mediante un enlace químico. Brennan et al. , Science, 229:81 (1985) describe un procedimiento en el que los anticuerpos intactos se separan proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia de arsenito de sodio del agente que forma complejos con el ditiol para estabilizar los ditioles vecinales y evitar la formación de disulfuros intermoleculares. Los fragmentos Fab ' generados se convierten entonces en derivados del t ionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados del Fab ' -TNB se reconvierte entonces en Fab'-tiol por reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar de otro derivado del Fab ' -TNB para formar el anticuerpo biespecifico . Los anticuerpos biespecificos producidos se pueden utilizar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas. Descubrimientos recientes han facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab'-SH de E. coli, que se pueden unir químicamente para formar anticuerpos biespecificos . En Shalaby et al. , J. Exp. Med. , 175:217-25 (1992) se describe la producción de una molécula F(ab')2 de anticuerpo biespecifico completamente humanizado. Cada fragmento Fab' se secretó de manera separada a partir de E. coli y se sometió a unión química dirigida en vítro para formar el anticuerpo biespecif ico . Por lo tanto, el anticuerpo biespecífico formado era capaz de unirse a células que sobreexpresaban el receptor HER2 y las células T humanas normales, así como de desencadenar la actividad lítica de los linfocitos citotóxicos humanos contra dianas de tumor de mama humano . También se han descrito varias técnicas para realizar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecificos directamente de cultivos celulares recombinantes . Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecificos utilizando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol . , 148 ( 5 ) : 1547 -53 (1992) . Los péptidos con cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se enlazaron a las porciones Fab ' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los homodímeros del anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y después se reoxidaron para formar los heterodímeros del anticuerpo. Este procedimiento también se puede utilizar para producir los homodímeros del anticuerpo. La tecnología "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-48 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para realizar fragmentos de anticuerpos biespecí fieos . Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) mediante un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios de la misma cadena. Por consiguiente, los dominios VH y VL de un fragmento se fuerzan a aparearse con los dominios complementarios VL y VH de otro fragmento, formando, por lo tanto, dos lugares de unión del antígeno. También se ha informado de otra estrategia para realizar fragmentos de anticuerpos biespecí fieos mediante el uso de dímeros Fv de cadena única (scFv) . Véase Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994) .

También se contemplan los anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecificos . Tutt et al., J. Immunol . 147:60 (1991). Anticuerpos muí ivalen es Un anticuerpo multivalente puede internalizarse (y/o catabolizarse) más de prisa que un anticuerpo bivalente por una célula que exprese un antigeno al que se unen los anticuerpos. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos multivalentes (que son los que no pertenecen a la clase IgM) con tres o más sitios de unión al antigeno (por ejemplo, anticuerpos tetravalentes), que pueden producirse fácilmente mediante expresión recombinante del ácido nucleico que codifica las cadenas de polipéptidos del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerización y tres o más sitios de unión al antigeno. El dominio preferente de dimerización comprende una región Fe o una región bisagra o está formado por ellas. En esta situación, el anticuerpo comprenderá una región Fe y tres o más sitios de unión al antigeno amino-terminal a la región Fe. El anticuerpo multivalente preferente en la presente memoria descriptiva comprende entre tres y ocho sitios de unión al antigeno aproximadamente, aunque preferentemente cuatro, o está formado por esos sitios. El anticuerpo multivalente comprende al menos una cadena de polipéptidos (y preferentemente dos cadenas de polipéptidos ) , en el cual la cadena o cadenas de polipéptidos comprenden dos o más dominios variables. Por ejemplo, la cadena o cadenas de polipéptidos pueden comprender VD1- (XI ) n-VD2- (X2 ) n-Fc, donde VD1 es un primer dominio de variable, VD2 es un segundo dominio de variable, Fe es una cadena de polipéptidos de una región Fe, XI y X2 representan una aminoácido o polipéptido y n es 0 ó 1. Por ejemplo, la cadena o cadenas de polipéptidos pueden comprender: VH-CHl-enlazador flexible-VH-CHl- cadena de la región FC o VH-CHl-VH-CHl-cadena de la región Fe. El anticuerpo multivalente de la presente memoria descriptiva comprende, además, preferentemente, al menos dos (y preferiblemente cuatro) polipéptidos de dominio variable de la cadena ligera. El anticuerpo multivalente de la presente memoria descriptiva, por ejemplo, puede comprender entre dos y cuatro polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. Los polipéptidos de dominio variable de cadena ligera considerados en esta memoria descriptiva comprenden un dominio variable de cadena ligera y, opcionalmente , un dominio CL. Variantes de anticuerpos En algunas formas de realización se contemplan la(s) modificación (es) de la secuencia de aminoácidos descritas en la presente memoria. Por ejemplo, puede desearse mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo se pueden preparar al introducir cambios nucleótidos adecuados en el ácido nucleico del anticuerpo, o mediante síntesis del péptido. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, eliminaciones de y/o inserciones dentro y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias del aminoácido del anticuerpo. Cualquier combinación de eliminación, inserción y sustitución se realiza para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas. Las alteraciones aminoacídicas pueden ser introducidas en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo del sujeto en el momento en que se realiza la secuencia. Un procedimiento útil para identificar ciertos residuos o regiones del anticuerpo que son localizaciones preferentes para la mutagénesis se llaman "mutagénesis de barrido de alanina" tal como lo describen Cunningham y Wells, Science, 244:1081-85 (1989) . Aquí, se identifica un residuo o un grupo de residuos dianas (por ej . residuos cargados como por ejemplo arg, asp, his, lis y glu) y se reemplazan por aminoácidos cargados neutra o negativamente (preferentemente alanina o polialanina) para incidir en la interacción de los aminoácidos con el antigeno. Estas localizaciones de los aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan al introducir más u otras variantes en, o por, los sitios de sustitución. Por tanto, a pesar de que el sitio donde introducir una variación de una secuencia de aminoácidos está predeterminado, no es necesario que la naturaleza de la mutación per se tenga un carácter predeterminado. Por ejemplo, para analizar el rendimiento de una mutación en un lugar dado, se realiza el barrido de alanina o mutagénesis aleatoria en el codón o región diana y las inmunoglobulinas expresadas se monitorizan para detectar la actividad deseada. Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones en los extremos amino y/o carboxi terminal que abarcan desde un residuo hasta polipéptidos que contienen, cien o más residuos, asi como inserciones dentro de la secuencia de uno o múltiples residuos de aminoácidos. Ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo metionil en el extremo N terminal o el anticuerpo fusionado a un polipéptido citotóxico. Otras variantes de inserción de la molécula del anticuerpo incluyen la fusión del extremo N o C terminal del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que aumente la semivida sérica del anticuerpo. Otro tipo de variante de aminoácido del anticuerpo altera el patrón de glicosilación original del anticuerpo. Esta alteración incluye borrar uno o más residuos glucidicos encontrados en el anticuerpo, y/o agregar uno o más lugares de glicosilación que no están presentes en el anticuerpo. La glicosilación de los polipéptidos se realiza generalmente por enlace N u O. Por enlace tipo N se entiende el anclaje del residuo glucidico en la cadena lateral de un residuo de asparragina. Las secuencias de tripéptidos asparragina-X-serina y asparragina-X-treonina , en donde X es cualquier aminoácido excepto la prolina, son las secuencias de reconocimiento para los anclajes enzimáticos del residuo glucidico a la cadena lateral de asparragina. Por lo tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptidos en un polipéptido crea un lugar de glicosilación potencial. La glicosilación por enlace tipo O se refiere al anclaje de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina , galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, a pesar de que también se puede utilizar 5-hidroxiprolina y 5-hidroxilisina .

La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se logra convenientemente al alterar la secuencia del aminoácido para que contenga una o más de las secuencias de tripéptidos descrita (s) anteriormente (para lugares de glicosilación unidos por enlace tipo N) . La alteración también se puede realizar mediante la adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para lugares de glicosilación unidos por enlace tipo O) . Donde el anticuerpo comprende una región Fe, se puede alterar el carbohidrato unido al mismo. Por ejemplo, los anticuerpos con una estructura de carbohidratos madura que carece de fucosa unida a una región Fe del anticuerpo se describen en la Solicitud de Patente de EE.UU. n° 2003/0157108 (Presta, L.) . Véase también US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co . , Ltd) . Los anticuerpos con una N-acetilglucosamina (GlcNAc) bisectriz en el carbohidrato unido a una región Fe del anticuerpo se describen en el documento WO 2003/011878, Jean- airet et al. y en la Patente de Estados Unidos n° 6.602.684, Umaña et al. Los anticuerpos con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido unido a una región Fe del anticuerpo se describen en el documento WO 97/30087, Patel et al. Véanse también los documentos WO 98/58964 (Raju, S.) y WO 99/22764 (Raju, S.) con respecto a los anticuerpos con carbohidratos alterados unidos a la región Fe de los mismos. Véase también US 2005/0123546 (Umaña et al.) sobre moléculas de unión a antigeno con glicosilación modificada. En la presente memoria descriptiva, la variante de glicosilación preferente comprende una región Fe, en la que una estructura de carbohidratos anexa a la región Fe carece de fucosa. Estas variantes han mejorado la función de la ADCC. Opcionalmente , la región Fe también comprende una o más sustituciones de aminoácidos en la zona que mejora aún más la ADCC; por ejemplo, sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fe (numeración Eu de residuos) . Entre las publicaciones relacionadas con los anticuerpos "defucosilados" o "con déficit de fucosa" podríamos citar: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; Okazaki et al. J. Mol. Biol . 336:1239-49 (2004) ; Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004) . Entre los ejemplos de líneas celulares que producen anticuerpos defucosilados encontraríamos las células Lecl3 CHO con déficit de fucosilación de proteínas (Ripka et al., ñrch. Biochem. Biophys. 249:533-45 (1986) ; la Solicitud de Patente de EE.UU. n° US 2003/0157108 Al, Presta, L: y el documento O 2004/056312 Al, Adams et al., especialmente el ejemplo 11) y las líneas celulares bloqueadas, como el gen alfa-1, 6-fucosiltransferasa, el FUT8 y células CHO bloqueadas (Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87:614 (2004) ) . Otro tipo de variante es una variante de sustitución aminoacídica . Estas variantes reemplazan al menos un residuo de aminoácidos en la molécula del anticuerpo por un residuo diferente. Los lugares de mayor interés para la mutagénesis por sustitución incluyen las regiones hipervariables , pero las alteraciones FR también se contemplan. Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1 debajo del encabezado "sustituciones preferentes". Si dichas sustituciones ocasionan un cambio en la actividad biológica, entonces se pueden introducir cambios más sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares" en la Tabla 1, o como se describe a continuación con referencia a las clases de aminoácidos, y los productos se pueden monitorizar.

Tabla 1 Las modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo se logran seleccionando sustituciones que difieran significativamente en su efecto de mantener (a) la estructura de la base del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación plana o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el lugar diana, o (c) el residuo de la cadena lateral. Los residuos que aparecen de forma natural se dividen en grupos sobre la base de las propiedades comunes de sus cadenas laterales: (1) hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, i le; (2) hidrófilos neutrales: Cis, Ser, Tr, Asn, Gln; (3) ácidos: asp, glu; (4) básicos: his, lis, arg; (5) residuos que tiene influencia en la orientación de la cadena: gli, pro; y (6) aromáticos: trp, tir, fe.

Las sustituciones no conservadoras supondrán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase . Un tipo de variante de sustitución implica sustituir uno o más residuos de región hipervariable de un anticuerpo parental (por ej . , un anticuerpo humanizado o humano) . Generalmente, la variante o variantes resultantes seleccionadas para mayor desarrollo tendrán propiedades biológicas mejoradas con respecto al anticuerpo parental desde el cual se generaron. Una manera conveniente de generar dichas variantes de sustitución implica la maduración de afinidad utilizando una presentación en fagos. De manera resumida, varios sitios de regiones hipervariables (por ejemplo, 6-7 sitios) se mutan para generar todas las sustituciones posibles de aminoácidos en cada sitio. Los anticuerpos generados de esta manera se representan a partir de partículas de fagos filamentosas como fusiones al producto del gen III de M13 dentro de cada partícula. Las variantes presentadas en fagos se monitorizan para detectar su actividad biológica (por ej . afinidad de unión) como se describe en esta memoria descriptiva. Para identificar los lugares de la región hipervariable candidatos para la modificación, se pueden realizar barridos de alanina para identificar residuos de la región hipervariable que contribuyan significativamente a la unión del antigeno. Como alternativa, o adicionalmente , puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo antigeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antigeno. Dichos residuos de contacto y los residuos adyacentes son candidatos a la sustitución de acuerdo con las técnicas elaboradas en la presente memoria descriptiva. Una vez que se generan dichas variantes, el panel de variantes está sujeto a monitorización, tal como se describe en la presente memoria descriptiva y los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes se pueden seleccionar para mayor desarrollo. Las moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de secuencia de aminoácidos del anticuerpo se preparan mediante varios métodos conocidos en el sector. Estos métodos incluyen, entre otros, aislamiento desde una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia de aminoácidos presentes en la naturaleza) o preparación mediante mutagénesis con mediación oligonucleótida (o controlada en situ) , mutagénesis PCR, y mutagénesis de módulo de una variante preparada anteriormente o una versión no variante del anticuerpo.

Puede ser deseable introducir una o más modificaciones en los aminoácidos en la región Fe de polipéptidos de inmunoglobulina de la invención, lo que genera una variante de la región Fe. La variante de la región Fe puede comprender una secuencia de la región Fe humana (por ejemplo, una región Fe de IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4 humanas) que contenga una modificación de aminoácidos (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones de aminoácidos, incluida la de la cisteina bisagra. Según esta descripción y los conocimientos del sector, se contempla que en algunas realizaciones un anticuerpo usado en los métodos de la invención pueda comprender una o más alteraciones, frente a su anticuerpo homólogo de tipo natural, por ejemplo, en la región Fe. No obstante, estos anticuerpos conservarán las mismas características necesarias para uso terapéutico, frente a su homólogo de tipo natural. Por ejemplo, se cree que se pueden realizar algunas alteraciones en la región Fe que daría como resultado la unión Clq alterada y/o en Citotoxicidad Dependiente de Complementos (CDC) , por ejemplo, como se describe en WO 99/51642. Véase también Duncan & Winter Nature 322:738-40 (1988) ; Patente de EE.UU. n° 5.648.260; Patente de EE.UU. n° 5.624.821; y 094/29351 que se refieren a otros ejemplos de variantes de regiones Fe. Los documentos WO 00/42072 (Presta) y WO 2004/056312 (Lowman) describen variantes de anticuerpos con capacidad de unión a los FcRs mejoradas o disminuidas. El contenido de estas publicaciones de patentes se incorpora específicamente a la presente memoria descriptiva a modo de referencia. Véase además Shields et al., J. Biol. Chem., 9 ( 2 ) : 6591-6604 (2001) . Los anticuerpos con un aumento de su semivida y una unión mejorada al receptor neonatal Fe (FcRn), que es responsable de la transmisión de las IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), se describen en US2005/0014934A1 (Hinton et al.) . Estos anticuerpos comprenden una región Fe con una o más sustituciones que mejoran la unión de la región Fe al FcRn. Las variantes polipept ídicas con secuencias aminoacídicas de la región Fe alteradas y capacidad aumentada o disminuida de unión a Cql se describen en la Patente de EE.UU. n° 6.194.551B1 y el documento W099/51642. El contenido de dichas publicaciones de patentes se incorpora específicamente a la presente memoria descriptiva a modo de referencia. Véase además Idusogie et al. J. Immunol. 164:4178-84 (2000) . Derivados del anticuerpo Los anticuerpos de la presente invención pueden modificarse aún más a fin de que contengan fracciones no proteicas adicionales que son conocidas en el sector y se encuentran disponibles. Preferiblemente, las fracciones adecuadas para la derivati zación del anticuerpo son polímeros solubles en agua. Ejemplos no limitantes de los polímeros solubles en agua incluyen los siguientes componentes: poliet ilenglicol (PEG), copolímero de etilenglicol / propilenglicol , carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinilo, polivinilpirrolidona, poli-1, 3-dioxolano, poli-1 , 3 , 6-trioxano, copolímero anhídrido etileno/maleico, poliaminoácidos (ya sean homopolímeros o copolímeros aleatorios), y dextrano o poli (n-vinilpirrolidona ) polietilenglicol , homopolímeros de propropilenglicol , oxido de prolipropileno / copolímeros de oxido de etileno, polialcoholes polioxiet ilados (por ej . glicerol), alcohol polivinilo, y mezclas de los mismos. Es posible que el polietilenglicol propionaldehído ofrezca ventajas en la elaboración, dada su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede ser ramificado o no. La cantidad de polímetros adheridos al anticuerpo puede variar y, si se une más de un polímero, los polímeros pueden ser las mismas o diferentes moléculas. Generalmente, la cantidad y/o tipo de polímeros utilizados para la derivatización pueden determinarse en función de ciertas consideraciones, como las propiedades o funciones particulares del anticuerpo a mejorar, si el anticuerpo derivatizado será utilizado en un tratamiento en condiciones definidas, etc. Detección de anticuerpos con las propiedades deseadas Los anticuerpos de la invención que se unen a EGFL7, y en algunas formas de realización, pueden modular uno o más aspectos de los efectos asociados a EGFL7, incluidos, aunque sin limitarse a ellos, la interrupción de cualquier vía biológica de EGFL7 biológicamente significativa, y/o tratamiento y/o prevención de un tumor, trastorno de proliferación celular o un cáncer; y/o tratamiento o prevención de un trastorno asociado a la expresión y/o actividad de EGFL7 (como por ejemplo una mayor expresión y/o actividad de EGFL7). Por ejemplo, los anticuerpos de la invención pueden detectarse por su capacidad para bloquear la adhesión de las células HUVEC a EGFL7 y la migración de HUVEC hacia las placas revestidas con la proteina EGFL7, como se describe en la presente memoria. Asimismo, los anticuerpos purificados se pueden caracterizar mediante una serie de ensayos que incluyen la secuenciación del extremo N-terminal, el análisis de aminoácidos, la cromatografía líquida de alta resolución no desnaturalizante de exclusión por tamaño (HPLC) , espectrometría de masas, cromatografía de intercambio iónico y digestión con papaína. En ciertas formas de realización de la invención se analiza la actividad biológica de los anticuerpos producidos en la misma. En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención se prueban por su actividad de unión al antígeno. Los ensayos de unión al antígeno que se conocen en la especialidad y pueden ser usados en la presente memoria descriptiva incluyen ensayos de unión competitiva o directa que usan técnicas como western blots, radioinmunoensayos , ELISA (ensayo de inmunoadsorción enzimática) , inmunoanálisis de doble anticuerpo (tipo "sandwich"), ensayos de inmunoprecipitación , inmunoensayos fluorescentes e inmunoensayos de proteína A. Los ensayos de unión a antígeno ilustrativos se incluyen más adelante en la sección Ejemplos. En algunas formas de realización, la invención ofrece un anticuerpo anti-EGFL7 que compite con un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera que incluye una secuencia seleccionada del ID. SEC. N° 1 y del ID. SEC. N° 3 y un dominio variable de cadena pesada que incluye una secuencia seleccionada del ID. SEC. N° 2 y del ID. SEC. N° 4 para unión a EGFL . Estos anticuerpos competidores se pueden obtener mediante detección de sobrenadantes de hibridoma anti-EGFL7 para unión a EGFL7 inmovilizada en competencia con un anticuerpo marcado que contiene un dominio variable de la cadena ligera que incluye una secuencia seleccionada del ID. SEC. N° 1 y del ID. SEC N° 3 y un dominio variable de cadena pesada que incluye una secuencia seleccionada del ID. SEC. N° 2 y del ID. SEC N° 4. Estos anticuerpos competidores incluyen anticuerpos que reconocen un epítopo de EGFL7 que es el mismo o se superpone al epitopo de EGFL7 reconocido por el anticuerpo. Un sobrenadante de hibridoma que contenga un anticuerpo competidor reducirá la cantidad de anticuerpo marcado unido detectado en la mezcla de unión de competición en el sujeto, frente a la cantidad de anticuerpo marcado unido detectada en una mezcla de unión a control que contenga un anticuerpo no pertinente (o ningún anticuerpo) . Cualquiera de los ensayos de unión por competición descritos en la presente memoria descriptiva son aptos para uso en el procedimiento siguiente.. Los anticuerpos anti-EGFL7 de la invención que tengan las propiedades descritas en esta memoria descriptiva se pueden obtener mediante detección de clones de hibridoma anti-EGFL7 para las propiedades deseadas mediante un método práctico. Por ejemplo, si se desea un anticuerpo monoclonal anti-EGFL7 que compita o no compita para la unión de EGFL7 a un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera que incluye una secuencia seleccionada del ID. SEC. N° 1 y del ID. SEC. N° 3 y un dominio variable de cadena pesada que incluye una secuencia seleccionada del ID. SEC. N° 2 y del ID. SEC. N° 4, puede probarse el anticuerpo candidato en un ensayo de competición de unión. Los ensayos de competición son bien conocidos en la especialidad. Se conocen en el sector otros ensayos útiles para determinar la capacidad inhibidora de los anticuerpos anti-EGFL7, algunos de los cuales se incluyen en la presente memoria descriptiva a modo de ejemplo. En algunas formas de realización, la presente invención contempla anticuerpos alterados que tienen algunas, pero no la totalidad, de las funciones efectoras, lo que los convierte en un candidato deseable para muchas aplicaciones en las que la semivida del anticuerpo en vivo es importante, pero determinadas funciones efectoras (como complemento y ADCC) son innecesarias o nocivas. En algunas formas de realización, se miden las actividades Fe de la inmunoglobulina producida para garantizar que sólo se mantienen las propiedades deseadas. Se pueden llevar a cabo ensayos de citotoxicidad en vitro o en vivo para confirmar la reducción/depleción de actividades de CDC y/o ADCC . Por ejemplo, pueden realizarse los ensayos de unión del receptor Fe (FcR) para asegurar que el anticuerpo carece de unión a FcyR (por eso es probable que carezca de actividad ADCC) , pero conserva la capacidad de unión a FcRn. Las células primarias para la mediación, ADCC, células NK, expresan sólo FcRIII, mientras que los monocitos expresan FcRI, FcRII y FcRIII. La expresión del FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol, 9:457-92 (1991) . En las Patentes de EE.UU. N°s. 5.500.362 ó 5.821.337 se describe un ejemplo de un ensayo en vitro para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés. Entre las células efectoras útiles para estos ensayos se encuentran las células mononucleares de la sangre periférica (PB C) y las células asesinas (NK) . Como alternativa, o adicionalmente , la actividad de ADCC de la molécula de interés se puede evaluar en vivo, por ejemplo, en un modelo animal como el que se describe en Clynes et al., Proc. Nati. Acad. Sel. (USA) , 95:652-656 (1998) . También se pueden llevar a cabo los ensayos de unión Clq para confirmar que el anticuerpo no puede unirse al Clq y por ello carece de actividad CDC. A fin de evaluar la activación del complemento, se puede efectuar un ensayo de CDC, por ejemplo, tal como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Meth . , 202:163 (1996). También se pueden realizar la unión de FcRn y eliminación en vivo/determinaciones de semivida con el uso de métodos conocidos en la especialidad. En algunas formas de realización, la invención proporciona anticuerpos alterados que tienen más funciones efectoras y/o mayor semivida. Vectores , células huésped y métodos recombinantes Para la producción recombinante de un anticuerpo de la invención, el ácido nucleico que lo codifica se aisla e inserta en un vector replicable para la clonación subsiguiente (amplificación del ADN) o para expresión. El ADN que codifica el anticuerpo se aisla fácilmente y se secuencia utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleótidas capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo). Hay muchos vectores disponibles. La elección del vector depende en parte del huésped celular que se utilice. Por lo general, las células huésped preferidas son de origen procariótico o eucariótico (en general, de mamíferos) . Se tendrá en cuenta que las regiones constantes de cualquier isótopo se pueden utilizar para este fin, incluidas las regiones constantes IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, y que dichas regiones constantes se pueden obtener de cualquier especie animal o humana. a. Generación de anticuerpos usando células huésped eucarióticas i. Construcción de vectores Las secuencias de polinucleótidos que codifiquen componentes de polipéptidos del anticuerpo de la invención se pueden obtener utilizando técnicas recombinantes estándar. Las secuencias deseadas de polinucleótidos se pueden aislar y secuenciar a partir de anticuerpos que producen células, como por ejemplo células de hibridoma. Alternativamente, los polinucleótidos se pueden sintetizar usando técnicas de PCR o sintetizador de nucleótidos. Una vez obtenidas, las secuencias que codifican los polipéptidos se insertan en un vector recombinante capaz de replicar y expresar polinucleótidos heterólogos en los huéspedes procarióticos . Muchos vectores que están disponibles y son conocidos en la especialidad se pueden utilizar para el fin de la presente invención. La selección de un vector apropiado dependerá principalmente del tamaño de los ácidos nucleicos que se van a insertar en el vector y de la célula huésped concreta que se transformará con el vector. Cada vector contiene diversos componentes, dependiendo de su función (amplificación o expresión de polinucleótido heterólogo o ambas) y su compatibilidad con la célula huésped concreta en la que resida. Los componentes del vector incluyen, por lo general: un origen de replicación, un gen marcador de la selección, un promotor, un sitio de unión a ribosoma (RBS), una secuencia de señal, la inserción del ácido nucleico heterólogo y una secuencia de terminación de la transcripción. En general, los vectores plásmidos que contienen secuencias de control y replicón que se derivan de especies compatibles con la célula huésped se usan en conexión con estos huéspedes. Por lo general, el vector lleva un sitio de replicación, asi como secuencias de marcado, que son capaces de proporcionar selección fenotipica en células transformadas. Por ejemplo, E. coli se transforma habitualmente usando pBR322, un plásmido derivado de una especie E. coli . El pBR322 contiene genes que codifican la resistencia a ampicilina (Amp) y tetraciclina (Tet) y, de este modo, proporcionan una forma fácil de identificar células transformadas. El pBR322, sus derivados, u otros plásmidos microbianos o bacteriófagos pueden contener también, o ser modificados para que contengan, promotores que pueden ser utilizados por el organismo microbiano para la expresión de proteínas endógenas. Ejemplos de derivados del pBR322 usados para la expresión de anticuerpos concretos se describen en detalle en Cárter et al., Patente de EE.UU. n° 5.648.237. Además, los vectores fágicos que contienen secuencias de control y replicón que son compatibles con los microorganismos huésped se pueden usar como vectores de transformación en relación con estos huéspedes. Por ejemplo, un bacteriófago como AGEM™-11 se puede utilizar para marcar un vector recombinante que se pueda utilizar para transformar células huésped susceptibles como E. coli LE392. El vector de expresión de la invención puede comprender dos o más pares de promotores de cistrón, que codifiquen cada uno de los componentes polipeptídicos . Un promotor es una secuencia reguladora no traducida situada antes del extremo 5' del promotor en un cistrón que modula su expresión. Los promotores procariót icos suelen pertenecer a dos clases: inducibles y constitutivos. El promotor inducible es aquel que inicia un aumento de los niveles de transcripción del cistrón bajo su control en respuesta a cambios en las condiciones del cultivo, por ejemplo, la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio de temperatura.

Se conoce un gran número de promotores reconocidos por diversas células huésped posibles. El promotor seleccionado puede ser funcionalmente enlazado al ADN del cistrón que codifica la cadena pesada o ligera mediante eliminación del promotor del ADN fuente a través de digestión enzimática mediante restricción e inserción de la secuencia aislada del promotor en el vector de la invención. Tanto la secuencia nativa del promotor como muchos promotores heterólogos se pueden utilizar para dirigir la amplificación y/o expresión de los genes diana. En algunas realizaciones, se utilizan promotores heterólogos, puesto que por lo general permiten una mayor transcripción y una mayor producción del gen diana expresado, frente al promotor polipeptidico diana nativo. Los promotores aptos para su uso con huéspedes procarióticos incluyen el promotor phoA, los sistemas promotores de lactosa y beta galactamasa, un sistema promotor a base de triptofano ( trp) y promotores híbridos como el promotor tac o el trc. Sin embargo, también son aptos otros promotores que son funcionales en bacterias (como otros promotores de fagos o bacterianos conocidos) . Sus secuencias nucleótidas han sido publicadas, lo cual permite que un experto pueda ligarlas a los cistrones que codifican a las cadenas diana liviana y pesada (Siebenlist et al., Cell 20:269 (1980) usando enlazadores o adaptadores a fin de suministrar todos los sitios de restricción necesarios. En un aspecto de la invención, cada cistrón dentro del vector recombinante comprende un componente de la secuencia de señal de la secreción que dirige la translocación de los polipéptidos expresados en una membrana. En general, la secuencia de señal puede ser un componente del vector, o puede ser parte del ADN del polipéptido diana que se inserta en el vector. La secuencia de señal seleccionada a efectos de esta invención es aquella que la célula huésped reconoce y procesa (es decir, escindida por una peptidasa de señal) . Para las células huésped procarióticas que no reconocen ni procesan las secuencias de señal nativas a los polipéptidos heterólogos, la secuencia de señal es sustituida por una secuencia de señal procariótica seleccionada, por ejemplo, entre un grupo formado por fosfatasa alcalina, penicilasa, lpp o líderes de enterotoxina II termoestable (STII) , LamB, PhoE, PelB, OmpA y BP. En una realización de la invención, las secuencias de señal usadas en los dos cistrones del sistema de expresión son secuencias de señal STII o variantes de ellas. En otro aspecto, la producción de las inmunoglobulinas según la invención puede tener lugar en el citoplasma de la célula huésped y, por lo tanto, no requiere la presencia de secuencias de señal de secreción dentro de cada cistrón. A este respecto, las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina se expresan, multiplican y ensamblan para formar inmunoglobulinas funcionales dentro del citoplasma. Determinadas cepas de huéspedes (por ejemplo, las cepas de E. coli trxB~) ofrecen condiciones citoplasmáticas que son favorables a la formación de uniones de disulfuros, lo que permite la multiplicación y el ensamblaje correctos de las subunidades de las proteínas expresadas. Proba y Plückthun, Gene, 159 : 203 (1995) . Las células huésped procariót icas aptas para la expresión de anticuerpos de la invención incluyen Archaebacteria y Eubacteria, como microorganismos grampositivos o gramnegativos . Entre los ejemplos de bacterias útiles se incluyen Escherichia (por ejemplo, E. coli), Bacilli (por ejemplo, B. subtilis) , Enterobacteria , las especies Pseudomonas (por ejemplo, P. aeruginosa) , Salmonella typhimurium , Serratia marcescans , Klebsiella , Proteus , Shigella, Rhizobia , Vitreoscilla o Paracoccus. En algunas formas de realización se utilizan células gramnegat ivas . En algunas formas de realización se utilizan células E. coli como huéspedes para la invención. Entre los ejemplos de cepas E. coli se incluyen la W3110 (Bachmann, Cellular y Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C. : American Society for icrobiology , 1987) , pp . 1190-1219; ATCC® Depósito No. 27,325) y derivados de las mismas, que comprenden la cepa 33D3 con el genotipo W3110 AfhuA (AtonA) ptr3 lac Iq lacL8 AompTA (nmpc-fepE) degP41 kanR (Patente de EE.UU. n° . 5.639.635) . Otras cepas y derivados de las mismas, como E . coli 294 (ATCC® 31,446) , E. coli B, E. coliX 1776 (ATCC® 31,537) y E. coli RV308 (ATCC® 31,608) también están indicados. Estos ejemplos tienen un carácter ilustrativo y no limitador. Los métodos para construcción de derivados de cualquiera de las bacterias antes mencionadas con genotipos definidos son conocidos en el sector y se describen, por ejemplo, en Bass et al., Proteins, 8:309-14 (1990) . Por lo general, es necesario seleccionar las bacterias apropiadas teniendo en cuenta la replicabilidad del replicón en las células de una bacteria. Por ejemplo, las especies E. coli, Serratia o Salmonella se pueden usar como huésped cuando se utilizan plásmidos bien conocidos como pBR322, pBR325, pACYC177 o pKN410 para suministrar al replicón. Normalmente, en caso de que la célula huésped deba secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticas puede resultar conveniente incorporar al cultivo celular inhibidores adicionales de la proteasa. ii. Producción de anticuerpos Las células huésped se transforman con los vectores de expresión descritos anteriormente y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados como es adecuado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Transformación significa introducir ADN en el huésped procariótico de forma que el ADN sea replicable, ya sea como elemento extracromosómico o como integrante cromosómico. Según la célula huésped que se utilice, la transformación se realiza empleando técnicas estándar apropiadas para dichas células. El tratamiento con calcio que emplea cloruro de calcio se usa por lo general para células bacterianas que contienen barreras sustanciales en la pared celular. Otro método de transformación emplea polietilenglicol/DMSO. Otra técnica utilizada es la electroporacion . Las células procarióticas usadas para producir los polipéptidos de la invención se cultivan en medios conocidos en el sector y aptos para el cultivo de células huésped seleccionadas. Ejemplos de medios apropiados son caldo de luria (LB) más nutrientes suplementarios necesarios. En algunas realizaciones, los medios también contienen un agente de selección, elegido en función de la construcción del vector de expresión, para permitir el crecimiento selectivo de células procarióticas que contengan el vector de expresión. Por ejemplo, se añade ampicilina a los medios de cultivo para el crecimiento de células que expresan un gen resistente a ampicilina. Los anticuerpos necesarios aparte de carbono, nitrógeno y fuentes inorgánicas de fosfato también se pueden incluir a concentraciones apropiadas introducidas solas en una mezcla con otro suplemento o medio de cultivo como una fuente de nitrógeno compleja. Opcionalmente , el medio de cultivo puede contener uno o más agentes reductores seleccionados a partir del grupo formado por glutationa, cisterna, cistamina, tioglicolato , dit ioeritriol y ditiotreitol . Las células huésped procarióticas se cultivan a temperaturas apropiadas. Para el desarrollo de E. coli, por ejemplo, en general se utiliza un intervalo de temperatura entre aprox. 20°C y aprox. 39°C; normalmente las temperaturas oscilan entre aprox. 25°C y aprox. 37°C, p.ej. aprox. 30°C. El pH del medio de cultivo puede ser cualquiera comprendido entre 5 y 9 aproximadamente, dependiendo sobre todo del microorganismo huésped. El pH para E. coli oscila en general entre 6,8 y 7,4 aproximadamente, y normalmente es de aprox. 7,0. Si un promotor inducible se utiliza en el vector de expresión de la invención, la expresión de la proteina se induce en condiciones aptas para la activación del promotor. En un aspecto de la invención, se utilizan promotores PhoA para controlar la transcripción de los polipéptidos . Según esto, las células huésped transformadas se cultivan en un medio limitador de fosfato para la inducción. En general, el medio de cultivo limitador de fosfato es el C.R.A.P (véase, por ejemplo, Simmons et al., J. Immunol. Methods 263:133-47 (2002)) . Se pueden utilizar otros inductores diversos, según el constructo de vector empleado, como se sabe en el sector.

En una realización, los polipéptidos expresados de la presente invención se secretan en el periplasma de las células huésped y se recuperan allí. La recuperación de las proteínas supone la ruptura de los microorganismos, por lo general mediante choque osmótico, sonicación o lisis. Una vez producida la ruptura de las células, los desechos celulares o células enteras se pueden eliminar mediante centrifugación o filtración. Las proteínas pueden ser purificadas más, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad con resina. De manera alternativa, pueden transportarse proteínas dentro del medio de cultivo y aislarse en él. Las células pueden retirarse del cultivo, y el sobrenadante del cultivo puede filtrarse y concentrarse para proceder a la posterior purificación de las proteínas producidas. Los polipéptidos expresados pueden volver a aislarse e identificarse mediante métodos comunes conocidos, como la electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) y ensayos Western blot. En uno de los aspectos de la invención, la ..producción de anticuerpos se realiza en gran cantidad mediante proceso de fermentación. Existen varios procesos disponibles de fermentación de lotes alimentados a gran escala para la producción de proteínas recombinantes . Las fermentaciones a gran escala se realizan en dispositivos de al menos 1.000 litros de capacidad, preferiblemente entre aprox. 1.000 y 100.000 litros de capacidad. Estos termentadores utilizan agitadores de hélice para distribuir oxígeno y nutrientes, especialmente glucosa (la fuente habitual de carbono/energía). La fermentación a pequeña escala hace referencia generalmente a la fermentación en termentadores de aproximadamente no más de 100 litros de capacidad volumétrica, y pueden variar de 1 a 100 litros aproximadamente . En un proceso de fermentación, la inducción de expresión proteica se inicia típicamente después de que las células hayan crecido en condiciones adecuadas hasta alcanzar la densidad deseada, p. ej . una OD550 de entre 180-220, momento en el cual las células se encuentran en la fase estacionaria temprana. Pueden usarse distintos inductores, de acuerdo con el constructo del vector utilizado, tal y como se conoce en el sector y como se ha descrito anteriormente. Las células pueden hacerse crecer durante períodos más cortos antes de la inducción. Las células se inducen normalmente durante unas 12-50 horas, aunque es posible utilizar tiempos de inducción más cortos o más prolongados. Pueden modificarse distintas condiciones de fermentación para mejorar el rendimiento de producción y la calidad de los polipéptidos de la invención. Por ejemplo, para mejorar el ensamblaje adecuado y el plegamiento de los polipéptidos de anticuerpos secretados, pueden utilizarse vectores adicionales que sobreexpresan la proteína chaperona, tales como proteínas Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD y/o DsbG) o FkpA (una peptidil-propil cis, trans-isomerasa con actividad chaperona) para co-transformar las células huésped procariót icas . Se ha demostrado que las proteínas chaperonas facilitan la solubilidad y el plegamiento adecuado de las proteínas heterólogas producidas en células bacteriales huésped. Chen et al., J. Biol . Chem. 274:19601-05 (1999) ; Georgiou et al., Patente de EE.UU. No. 6.083.715; Georgiou et al., Patente de EE.UU. No. 6.027.888; Bothmann y Plückthun, J. Biol. Chem. 275:17100-05 (2000); Ramm y Plückthun, J. Biol. Chem. 275:17106-13 (2000) ; Arle et al., Molec. Microbiol. 39:199-210 (2001) . Pueden utilizarse ciertas cepas huésped con deficiencia de enzimas proteoliticas para minimizar la proteolisis de proteínas heterólogas (especialmente las que son sensibles desde el punto de vista proteolítico ) . Por ejemplo, las cepas de células huésped pueden modificarse para efectuar mutaciones genéticas relativas a los genes que codifican proteasas bacteriales conocidas, como la Proteasa III, OmpT, DegP, Tsp, Proteasa I, Proteasa Mi, Proteasa V, Proteasa VI y combinaciones de éstas. Algunas cepas de E. coli con deficiencia de proteasas están disponibles, y descritas, por ejemplo en Joly et al. (1998), citado anteriormente; Georgiou et al., Patente de EE.UU. n° 5.264.365; Georgiou et al., Patente de EE.UU. n° 5.508.192; Hará et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996) . En una forma de realización, en el sistema de expresión de la invención se utilizan como células huésped cepas de E. coli con deficiencia de enzimas proteoliticas transformadas con plásmidos que sobreexpresan una o más proteínas chaperonas . iii. Purificación de anticuerpos Pueden emplearse métodos estándar del sector para la purificación de proteínas. Los siguientes procedimientos tienen carácter ejemplar en lo que se refiere a procedimientos de purificación adecuados: fraccionamiento en columnas de intercambio iónico o de inmunoafinidad, precipitación en etanol, HPLC de fase reversa, cromatografía en anhídrido silícico o en una resina de intercambio catiónico tal como DEAE, cromatoisoenfoque , SDS-PAGE, precipitación en sulfato de amonio y filtrado en gel mediante, por ejemplo, Sephadex G-75. En un aspecto, se utiliza Proteína A inmovilizada en una fase sólida para purificación por inmunoafinidad de los productos de anticuerpos de longitud completa de la invención. La proteína A es una proteína de pared celular de 41kD del Staphylococcus áureas que se une con gran afinidad por la región Fe de los anticuerpos. Lindmark et al., J. Immunol. Meth .. , 62:1-13 (1983) . La fase sólida en la cual se inmoviliza la proteína A es preferiblemente una columna que comprende una superficie de vidrio o sílice, y mejor aún si es una columna de vidrio de poro controlado o una columna de ácido silícico. En algunas aplicaciones, la columna ha sido recubierta con un reactivo, como el glicerol, para evitar una posible adherencia inespecífica de contaminantes.

Como primer paso de purificación, la preparación derivada del cultivo celular, según lo descrito anteriormente, se aplica a la fase sólida de Proteína A inmovilizada para permitir la unión específica del anticuerpo de interés a la Proteína A. A continuación se procede a lavar la fase sólida para eliminar los contaminantes unidos inespecí ficamente a ella. Finalmente, el anticuerpo de interés se recupera de la fase sólida mediante elución. b . Generación de anticuerpos usando células huésped eucarióticas Los componentes del vector suelen incluir, entre otros, uno o más de los elementos siguientes: una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un potenciador, un promotor y una secuencia de finalización de la transcripción. (i) Componente de secuencia de la señal Un vector para uso en una célula huésped eucariótica puede contener también una secuencia de señal u otro polipéptido con una escisión específica en el término N de la proteína madura o polipéptido. La secuencia de señal heteróloga seleccionada preferiblemente es aquella que la célula huésped reconoce y procesa (es decir, escindida por una peptidasa de señal) . En la expresión celular de los mamíferos, están disponibles las secuencias de señal de los mamíferos así como los líderes secretores víricos, por ejemplo, la señal del herpes simplex gD. El ADN para la región de dicho precursor está ligado en la estructura de lectura al ADN que codifica el anticuerpo. (ii) Origen de la replicación Por lo general, no es necesario un componente origen de la replicación para los vectores de expresión en mamíferos. Por ejemplo, el origen SV40 se puede utilizar habitualmente solo porque contiene el promotor precoz. (iii) Componente gen de selección Los vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, también denominado marcador seleccionable . Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) otorgan resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina , (b) complementan las deficiencias auxotróficas , si procede, o (c) suministran nutrientes básicos no disponibles a partir de medios complejos. Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Estas células que se transforman con éxito con un gen heterólogo producen una proteina que otorga resistencia al fármaco y, asi, sobrevive a la estrategia de selección. Ejemplos de esta selección dominante utilizan los fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina. Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamíferos son los que permiten la identificación de las células encargadas de absorber el ácido nucleico del anticuerpo, como DHFR, timidina cinasa, metalotioneína I y II, preferiblemente, genes de metalotioneína en primates, adenosina deaminasa, ornitina decarboxilasa , etc. Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección DHFR se identifican primero a través del cultivo de todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx) , un antagonista competitivo del DHFR. Una célula huésped adecuada cuando se utiliza el DHFR de tipo natural es la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad del DHFR (por ejemplo, ATCC® CRL-9096) . Alternativamente, las células huésped (en especial los huéspedes naturales que contienen DHFR endógeno) transformadas o co-transformadas con secuencias de ADN que codifican un anticuerpo, la proteina DHFR natural y otro marcador seleccionante como la aminoglicosida 3'-fosfotransferasa (APH) pueden seleccionarse mediante crecimiento celular en un medio que contenga un agente de selección para el marcador seleccionable , como un antibiótico aminoglicosidico, por ejemplo, canamicina, neomicina o G418. Véase la patente de Estados Unidos n° 4.965.199. (iv) Componente promotor Los vectores de expresión y clonación suelen contener un promotor que es reconocido por el organismo huésped y está funcionalmente enlazado al ácido nucleico del polipéptido del anticuerpo. Se conocen las secuencias de promotores para eucariotas. Prácticamente todos los genes eucarióticos tienen una región rica en ?? situada aproximadamente entre las bases 25 y 30 antes del extremo del promotor desde el sitio donde se inicia la transcripción. Otra secuencia encontrada entre las bases 70 y 80 antes del inicio de la transcripción de muchos genes es la región CNCAAT (ID. SEC. N° 19), donde N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucarióticos es una secuencia AATAAA (ID. SEC. ¡NT 20) que puede ser la señal para la adición de la cola de poli (A) al extremo 3' de la secuencia de codificación. Todas estas secuencias se insertan bien en los vectores de expresión eucariótica. La transcripción del polipéptido de anticuerpos a partir de los vectores en células huésped de mamíferos está controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos a partir de los genomas de virus como el poliomavirus , el virus de la viruela de las aves de corral, el adenovirus (como el Adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma aviario, el citomegalovirus , un retrovirus, el virus de la hepatitis B y el Simian Virus 40 (SV40), a partir de promotores heterologos de mamíferos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina , o a partir de promotores de choque térmico, siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de las células huésped. Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40 se obtienen fácilmente como un fragmento de restricción del SV40, que también contiene el origen viral de replicación del SV40. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene fácilmente como un fragmento de restricción HindIII E. Un sistema para la expresión del ADN en huéspedes de mamíferos utilizando el virus del papiloma bovino como vector se da a conocer en la Patente de Estados Unidos n° 4.419.446. Una modificación de este sistema se describe en la Patente de Estados Unidos n° 4.601.978. Alternativamente, la repetición del terminal largo del virus del sarcoma de Rous se puede utilizar como promotor. (v) Componente elemento potenciador La trascripción de ADN que codifique el polipéptido del anticuerpo de esta invención a través de eucariotas más altas se aumenta con frecuencia al insertar la secuencia de un potenciador en el vector. Actualmente, se conocen diversas secuencias de potenciadores de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, fetoproteína alfa e insulina) . No obstante, lo habitual es que se utilice un potenciador procedente de un virus de células eucariót icas . Entre los ejemplos destacan el potenciador SV40 en el lado tardío del origen de la replicación (bp 100-270), el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus , el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de la replicación y los potenciadores de adenovirus. Véase también Yaniv, Nature 297:17-18 (1282) para elementos de potenciación para la activación de los promotores eucariót icos . El potenciador puede empalmarse en el vector en una posición 5' a 3' a la secuencia de codificación del polipéptido del anticuerpo, pero está situado preferiblemente en un sitio 5' desde el promotor . (vi) Componente de finalización de la transcripción Los vectores de expresión utilizados en células huésped eucarióticas contendrán también, por lo general, secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para la estabilización del ARNm. Estas secuencias están habitualmente disponibles desde las regiones no traducidas del extremo 5' , y ocasionalmente el 3', de los ADN o ADNc virales o eucarióticos . Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica un anticuerpo. Un componente de finalización de la transcripción útil es la ¦ región de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina. Véase el documento WO 94/11026 y el vector de expresión que se da a conocer en el mismo. (vii) Selección y transformación de células huésped Entre las células huésped apropiadas para clonación o expresión del ADN en los vectores de la presente memoria descriptiva figuran las células eucariotas más altas, incluidas las células huésped de vertebrados. La propagación de células de vertebrados en cultivos (cultivo tisular) se ha convertido en un procedimiento habitual. Ejemplos de líneas celulares útiles de mamíferos son la línea CV1 de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC® CRL 1651) ; la línea « de riñon embrionario humano (293 ó 293 células subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977) ); células de riñon de crias de hámster (BHK, ATCC® CCL 10) ; células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)) ; células sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-51 (1980) ) ; células de riñon de mono (CV1 ATCC® CCL 70) ; células de riñon de mono verde africano (VERO-76, ATCC® CRL-1587) ; células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC® CCL 2) ; células caninas de riñon (MDCK, ATCC® CCL 34); células de riñon de ratas búfalo (BRL 3A, ATCC® CRL 1442) ; células de pulmón humano (W138, ATCC® CCL 75) ; células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065) ; tumor de mama de ratón (MMT 060562, ATCC® CCL51 ) ; células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982) ) ; células MRC 5; células FS4; y una linea de hepatoma humano (Hep G2) . Las células huésped se transforman con los vectores de expresión o clonación descritos anteriormente para la producción del anticuerpo y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados como es adecuado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. (viii) Cultivo de las células huésped Las células huésped utilizadas para producir un anticuerpo de esta invención se pueden cultivar en diversos medios. Medios coraercialmente disponibles como Ham's FIO (Sigraa) , Minimal Essential Médium ( (MEM) , (Sigma) , RPMI-1640 (Sigma) y Dulbecco's Modified Eagle 's Médium ( ( DMEM) , Sigma) son aptos para el cultivo de células huésped. Además, como medio de cultivo de las células huésped puede usarse cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth . Enzymol. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), Pat. de EE.UU. Nos. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655 ó 5.122.469; en los documentos O 90/03430, WO 87/00195 o en la Patente de EE.UU. Ref. 30.985. Cualquiera de estos medios puede complementarse según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro sódico, calcio, magnesio y fosfato), soluciones (como HEPES) , nucleótidos (tales como adenosina y timidina) , antibióticos (como el fármaco GENTAMYCIN™) , oligoelementos (definidos como los compuestos inorgánicos generalmente presentes en las concentraciones finales del intervalo micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. Se pueden incluir también otros suplementos necesarios a concentraciones adecuadas que serán conocidas por aquellos con conocimientos en la materia. Las condiciones del cultivo, como temperatura o pH entre otras, son las utilizadas anteriormente con la célula huésped seleccionada para expresión y serán conocidas por los expertos en la materia. (ix) Purificación del anticuerpo Al utilizar técnicas recombinantes , se puede producir el anticuerpo intracelularmente o directamente secretado en el medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como primer paso, los residuos de partículas, ya sean células huésped o fragmentos Usados, se eliminan, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración . Cuando el anticuerpo es secretado en el medio, los sobrenadantes de dichos- sistemas de expresión se concentran primero, por lo general, utilizando un filtro para concentración de proteínas disponible comercialmente , por ejemplo una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Se puede incluir un inhibidor de la proteasa como PMSF en cualquiera de las fases anteriores para inhibir la proteolisis y se pueden incluir antibióticos para impedir el crecimiento de contaminantes accidentales. La composición del anticuerpo preparado a partir de las células se puede purificar utilizando, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita , electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad. Esta última es la técnica de purificación preferida. La idoneidad de la proteína A como ligando de afinidad depende de las especies y del isotipo del domino Fe de la inmunoglobulina que está presente en el anticuerpo. La proteína A puede utilizarse para purificar anticuerpos que se basan en cadenas pesadas humanas ??, ?2 o ?4 (Lindmark et al., J. Immunol . Meth. 62:1-13 (1983)) . La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para la ?3 humana (Guss et al., EMBO J. 5:1567-75 (1986) ) . La matriz a la que el ligando de afinidad se une es con frecuencia la más agarosa, pero también están disponibles otras matrices. Las matrices mecánicamente estables, como vidrio poroso controlado o poli (estirenodivinil ) benceno, permiten tasas de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que los que se pueden lograr con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg , New Jersey) es útil para la purificación. También están disponibles, dependiendo del anticuerpo que quiera recuperarse, otras técnicas para la purificación de las proteínas, como fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación en etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en anhídrido silícico, cromatografía en heparina SEPHAROSE™, cromatografía en una resina de intercambio iónico o catiónico (como una columna de ácido poliaspártico) , cromatoisoenfoque , SDS-PAGE y precipitación en sulfato de amonio. Siguiendo cualquiera de las fases preliminares de purificación, la mezcla que contiene el anticuerpo de interés y los contaminantes puede estar sujeta a cromatografía de interacción hidrófoba con pH bajo utilizando una solución de elución a un pH entre 2,5 y 4,5, preferiblemente a concentraciones bajas en sal (por ejemplo, entre 0-0,25 M aproximadamente) . Inmunoconjugados La invención proporciona además inmunoconj ugados (también denominados "conjugados de anticuerpos con fármacos" o "ADC"), que comprenden cualquiera de los anticuerpos anti-EGFL7 descritos en la presente memoria descriptiva conjugado a un agente citotóxico, como por ejemplo un agente quimioterapéutico, un fármaco, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, animal o vegetal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radioactivo (es decir, un radioconj ugado ) . El uso de anticuerpos conjugados con fármaco para la administración local de agentes citostáticos o citotóxicos, es decir los fármacos para matar o inhibir a las células tumorales en el tratamiento del cáncer (Syrigos y Epenetos, Antícancer Research 19:605-14 (1999) ; Niculescu-Duvaz y Springer, ñdv . Drug Del. Rev. 26:15-72; Patente de EE.UU. 4.975.278) permite la administración delimitada del fármaco a tumores, y la acumulación intracelular del mismo, donde la administración sistemática de estos agentes no conjugados con fármacos puede resultar en inaceptables niveles de toxicidad tanto para las células normales, como para las células tumorales que se intenta eliminar (Baldwin et al., (1986) Lancet pp . (Mar. 15, 1986) :603-05 (1986) ; Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents En Cáncer Therapy: A Review, " en Monoclonal Antibodies '84: Biological Y Clinical Applications, A. Pinchera et al. (eds.), pp . 475-506 (1985) . Se busca la máxima eficacia con la mínima toxicidad. Ambos anticuerpos, monoclonales y policlonales , han sido descritos como útiles en estas estrategias (Rowland et al., Cáncer Immunol . Immunother . 21:183-87 (1986) ) . Los medicamentos empleados en estos métodos incluyen a la daunomicina, la doxorrubicina , el metotrexato y la vindesina (Rowland et al., (1986) mencionado anteriormente) . Entre las toxinas empleadas en anticuerpos conjugados con toxinas se encuentran las toxinas bacterianas como la toxina de la difteria, toxinas vegetales ¡como la ricina, toxinas de pequeñas moléculas como la geldanamicina (Mandler et al (2000) J. of the Nat. Cáncer Inst. 92 ( 19 ) : 1573-81 (2000) ; Mandler et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-28 (2000) ; Mandler et al., Bioconjugate Chem. 13:786-91 (2002) ), maitansinoides (EP 1391213; Liu et al., Proc. Nati. ñcad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996) ), y calicheamicina (Lode et al., Cáncer Res. 58:2928 (1998) ; Millauer e al., Cáncer Res. 53:3336-3342 (1993)) . Las toxinas pueden producir sus efectos citotóxicos y citostáticos mediante mecanismos que incluyen la unión de tubulina, la unión de ADN o la inhibición de la topoisomerasa . Algunos medicamentos citotóxicos tienden a ser inactivos o menos activos cuando se conjugan con grandes anticuerpos o ligandos receptores de proteínas. ZEVALIN™ (ibritumomab tiuxetan, Biogen/Idec) es un anticuerpo conjugado con radioisótopos compuesto por un anticuerpo monoclonal kappa IgGl murino dirigido contra el antígeno CD20 encontrado en la superficie de los linfocitos B cancerosos y normales y contra el radioisótopo 111 In o 90Y unido por un quelante enlazador de tiourea (Wiseman et al., Eur. Jour. Nucí. Med. 27(7) :766-77 (2000) ; Wiseman et al., Blood 99 (12) : 4336-42 (2002) ; Witzig et al., J. Clin. Oncol. 20 (10) :2453-63 (2002) ; Witzig et al., J. Clin. Oncol . 20 (15) : 3262-69 2002)) . A pesar de que el ZEVALIN presenta actividad contra las células B del linfoma no Hodgkin (NHL) , su administración provoca citopenias graves y prolongadas en la mayoría de los pacientes. MYTOLARG™ (Gentuzumab ozogamicina, Wyeth Pharmaceuticals ) , un anticuerpo conjugado con fármaco compuesto por un anticuerpo hu CD33 enlazado a ca licheamicina , se aprobó en 2000 para el tratamiento de leucemia mieloide aguda por inyección {Drugs of the Future 25(7) :686 (2000) ; Patentes de EE.UU. N°s. 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001) . Cantuzumab mertansina (Inmugen, Inc.) , un anticuerpo conjugado con fármaco compuesto por el anticuerpo huC242 enlazado al grupo de fármacos de los maitansinoides por medio de un enlazador de disulfuro SPP, DM1, está bien avanzado en ensayos clínicos de Fase II para el tratamiento de cánceres que expresan CanAg, como los de colon, páncreas, gástricos y otros. MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.), un anticuerpo conjugado con fármaco compuesto por el anticuerpo monoclonal del antígeno de membrana ant iprostático (PSMA) enlazado al grupo de los maitansinoides, DM1, está en fase de desarrollo para el · tratamiento potencial de los tumores de próstata. Los péptidos auristatina, auristatina E (??) y monometilauristatina (MMAE) , análogos sintéticos de dolastatina, fueron conjugados a anticuerpos monoclonales quiméricos cBR96 (específicos para Lewis Y en carcinomas) y cAClO (específicos para CD30 en tumores hematológicos (Doronina et al., Nature Biotech. 21 ( 7 ) : 78-784 (2003) ) y están bajo desarrollo terapéutico. Los agentes quimioterapéut icos útiles en la generación de inmunoconj ugados se describen en la presente memoria (por ejemplo, los descritos anteriormente) . Las toxinas enzimát icamente activas y los fragmentos de las mismas que se pueden utilizar incluyen cadena de difteria A, fragmentos activos sin unión de la toxina de la difteria, cadena de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena de ricina A, cadena de abrina A, cadena de modecina A, al fa-sarcina , proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor de la Momordica charantia , curcina, crotina, inhibidor de la Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina , fenomicina, enomicina y los tricotecenos . Véase, por ejemplo, el documento WO 93/21232, publicado el 28 de octubre de 1993. Se dispone de diversos radionúclidos para la producción de anticuerpos radioconj ugados . Entre los ejemplos se incluyen 212Bi, 131I, 131In, 90Y y 185Re. Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se pueden realizar utilizando una variedad de agentes de unión a proteina bifuncionales , como por ejemplo N-succinimidil-3- ( 2-piridilditio) propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (como el dimet iladipimidato HC1), ésteres activos (por ejemplo, disuccinimidil suberato) , aldehidos (por ejemplo, glutaraldehidos ) , compuestos bis-azido (como bis (p-azidobenzoil ) hexanodiamina ) , derivados de bis-diazonio (como bis- (p-diazoniobenzoil ) -etilenodiamina ) , diisocianatos (por ejemplo, 2 , 6-diisocianato de tolueno), y compuestos bis-activos de fluoruro (como 1 , 5-dif luoruro-2 , 4 -dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina se puede preparar tal y como se describe en Vitetta et al., Science 238:1098 (1987) . El ácido triaminopentaacético 1-isotiocianatobencil-3-metildietileno marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un ejemplo de agente quelante para la conjugación de un radionucleótido a un anticuerpo. Véase el documento WO 94/11026. También se contemplan en la presente memoria descriptiva los conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de molécula pequeña, como una calicheamicina , maitansinoides , dolastatinas , aurostat inas , un tricoteceno y un CC1065, y los derivados de estas toxinas que tengan una actividad tóxica. i. Maitansina y maitansinoides En algunas realizaciones, el inmunocon ugado comprende un anticuerpo de la invención (longitud completa o fragmentos) conjugado con una o más moléculas de maitansinoides. Los maitansinoides son inhibidores mitóticos que actúan inhibiendo la polimerización de la tubulina. La maitansina se aisló por primera vez a partir del arbusto de África oriental Maytenus serrata (Patente de Estados Unidos 3.896.111) . Posteriormente, se descubrió que determinados microbios también producían maitansinoides, como el maitansinol y los ésteres de C-3 amitansinol (Patente de Estados Unidos N° 4.151.042) . El maitansinol sintético y sus derivados y análogos se describen, por ejemplo, en las Patentes Estados Unidos N10s 4.137.230; 4.248.870; 4.256.746; 4.260.608; 4.265.814; 4.294.757; 4.307.016; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.313.946; 4.315.929; 4.317.821; 4.322.348; 4.331.598; 4.361.650; 4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663 y 4.371.533. Las porciones de fármacos maitansinoides son porciones de fármacos que resultan atractivas para la elaboración de conjugados de anticuerpos con fármacos por sus siguientes características: (i) son relativamente accesibles en lo que se refiere a su preparación mediante fermentación, modificación química o derivación de productos de fermentación, (ii) son fáciles de someter a derivación, con grupos funcionales adecuados para conjugación a través de los enlazadores no disulfuro con anticuerpos, (iii) estabilidad en plasma, y (iv) resultan efectivos frente a distintas líneas celulares tumorales. Los inmunoconj ugados que contienen maitansinoides , los métodos para elaborarlos y su uso terapéutico se describen, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU N°s. 5.208.020 y 5.416.064, y en la Patente Europea 0 425 235 Bl, y los descubrimientos de las mismas se incorporan expresamente a la presente memoria descriptiva a modo de referencia. Liu et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:8618-23 (1996) describe los inmunoconj ugados que comprenden un maitansinoide denominado DM1 enlazado al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra el cáncer colorrectal humano. Se descubrió que el conjugado era altamente citotóxico para las células del cáncer de colon en cultivo y demostró actividad antineoplásica en ensayos de crecimiento tumoral en vivo. Chari et al., Cáncer Research 52:127-31 (1992) describen inmunoconj ugados en los que un maitansinoide se conjugaba por medio de un enlazado de disulfuro al anticuerpo murino A7 que se une a un antígeno en las lineas celulares del cáncer de colon humano, o a otro anticuerpo monoclonal murino TA.l que se une al oncogén HER-2/neu. La citotoxicidad del conjugado TA .1-maitansinoide se probó en vitro en la linea celular del cáncer de mama SK-BR-3, que expresa 3 x 105 antigenos de superficie HER-2 por célula. El conjugado de fármaco consiguió un alto grado de citotoxicidad similar al fármaco maitansinoide libre, que podría ser mayor si se aumentase el número de moléculas maitansinoides por cada molécula de anticuerpo. El conjugado A7-maitansinoide mostró una citotoxicidad sistémica baja en ratones. Los conjugados de anticuerpo-maitansinoide se preparan mediante enlace químico de un anticuerpo a una molécula de maitansinoide sin hacer que disminuya significativamente la actividad biológica de ambos elementos del conjugado. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N° 5.208.020 (cuyos descubrimientos se incorporan expresamente a la presente memoria descriptiva a modo de referencia) . Una media de 3-4 moléculas maitansinoides conjugadas por anticuerpo ha mostrado eficacia en la mejora de la citotoxicidad de las células diana sin afectar negativamente a la función o la solubilidad del anticuerpo, aunque cabría esperar incluso que una molécula toxina/anticuerpo mejore la citotoxicidad en relación con el uso del anticuerpo desnudo. Los maitansinoides son muy conocidos en el sector y pueden sintetizarse mediante técnicas conocidas o aislarse de fuentes naturales. En la Patente de EE.UU. N° 5.208.020 y en otras patentes y publicaciones no patentadas a las que anteriormente se ha hecho referencia, por ejemplo, se describen maitansinoides adecuados. Los maitansinoides preferidos son el maitansinol y análogos modificados del maitansinol, en el anillo aromático o en otras posiciones de la molécula de maitansinol, como distintos ésteres del maitans inol . En la especialidad se conocen muchos grupos de enlace para producir conjugados anticuerpo-maitansinoide , incluidos, por ejemplo, los descritos en la Patente de Estados Unidos N° 5.208.020 o en la Patente Europea 0 425 235 Bl, en Chari et al., Cáncer Research 52:127-131 (1992) y en la Solicitud de patente de EE.UU. N° 2005/0169933A1, cuyos descubrimientos se incorporan expresamente a la presente memoria descriptiva a modo de referencia. Los conjugados anticuerpo-maitansinoide que comprenden al componente enlazador SMCC pueden prepararse como se describe en la Patente de EE.UU. N° 2005/0169933A1. Los grupos de enlace incluyen grupos de disulfuro, grupo de tioéter, grupos acidolábiles , grupos fotolábiles, grupos peptidasa lábiles o grupos esterasa lábiles, como los descritos en las patentes mencionadas anteriormente, y los preferidos son grupos de diosulfuro y tioéter. En la presente memoria descriptiva se dan ejemplos y se describen grupos enlazantes adicionales. Los conjugados del anticuerpo y el maitansinoide se pueden realizar utilizando una variedad de agentes de unión a proteina bifuncionales , como por ejemplo N-succinimidil-3- ( 2-piridilditio) propionato (SPDP) , succinimidil-4- (N-maleimidometil ) ciclohexano-1-carboxilato (S CC) , iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (como el dimet iladipimidato HCI) , ésteres activos (por ejemplo, disuccinimidil suberato) , aldehidos (por ejemplo, glutaraldehidos ) , compuestos bis-azido (como bis (p-azidobenzoil ) hexanodiamina ) , derivados de bis-diazonio (como bis- (p-diazoniobenzoil) -et ilenodiamina ) , diisocianatos (por ejemplo, 2 , 6-diisocianato de tolueno) , y compuestos bis-activos de fluoruro (como 1 , 5-difluoruro-2 , -dinitrobenceno ) . Los agentes de unión particularmente preferidos son N-sucinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-37 (1978) ) y N-sucinimidil- - (2-piridilditio ) pentanoato (SPP) para proporcionar un enlace de disulfuro .

El enlazador se puede unir a la molécula de maitansinoide en varias posiciones, dependiendo del tipo de enlace. Por ejemplo, un enlace con éster se puede formar mediante reacción con un grupo hidroxilo que utilice técnicas de unión convencionales. La reacción puede producirse en la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo, la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxilo. En una realización preferente, el enlace se forma en la posición 3 del maitansinol o de un análogo del maitansinol . ii. Auristatinas y dolastatinas En algunas formas de realización, el inmunocon ugado comprende un anticuerpo de la invención conjugado con dolastatinas o análogos peptidicos a la dolastatina y derivados, las auristatinas (Patentes de EE.UU. N°s. 5,635,483; 5,780,588) . Se ha determinado que las dolastatinas y las auristatinas interfieren con la dinámica de microtúbulos , la hidrólisis GTP, y la división nuclear y celular (Woyke et al., Antimicrob. Agents Chemother. 45 (12) : 3580-3584 (2001)) y tienen actividad anticancerigena (EE.UU. 5.663.149) y antifúngica (Pettit et al., Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965 (1998) ) . La porción del fármaco auristatina o dolastatina puede estar unida al anticuerpo a través de los extremos terminales N (amino) o C (carboxil) de la porción peptidica del fármaco ( O 02/088172) . Entre los ejemplos de realizaciones de auristatina se incluyen las porciones DE y DF enlazadas a monometilauristatina por el extremo terminal N, como se revela en "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", EE.UU 2005/0238649, cuyo contenido se incorpora expresamente en su totalidad a modo de referencia. Por lo general, las porciones de fármacos basadas en péptidos pueden prepararse formando un enlace peptidico entre uno o más aminoácidos y/o fragmentos de péptidos. Estos enlaces peptidicos pueden prepararse, por ejemplo, de acuerdo con el método de síntesis de fase líquida (véase E. Schróder y K. Lübke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press) que es bien conocido en el campo de la química de péptidos. Las porciones de fármacos auristatina/dolastatina pueden prepararse de acuerdo con los métodos siguientes: EE.UU. 5.635.483; EE.UU. 5.780.588; Pettit et al., J. Am. Chem. Soc. 111:5463-65 (1989) ; Pettit et al., Anti-Cancer Drug Design 13:243-77 (1998); Pettit et al., Synthesis 719-25 (1996) ; y Pettit et al., J. Chem. Soc.

Perkin Trans. 1 5:859-863 (1996) . Véase también Doronina, Nature Biotechnol. 21(7) :778-84 (2003) ; "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", EE.UU. 2005/0238649, incorporados a la presente memoria descriptiva a modo de referencia en su totalidad (describen, p.ej., enlazadores y métodos de preparación de compuestos de monometilvalina , como conjugados MMAE y MMAF a enlazadores) . iii. Calicheamicina En otras realizaciones, el inmunocon ugado comprende un anticuerpo de la invención conjugado con una o más moléculas de calicheamicina. La familia de antibióticos de la calicheamicina es capaz de producir la ruptura del ADN de hebra doble en concentraciones por debajo de picomolar. Para la preparación de conjugados de la familia de la calicheamicina, véanse las Patentes de Estados Unidos N°s. 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001 y 5.877.296 (todas para American Cyanamid Company) . Entre los análogos estructurales de la calicheamicina que se pueden utilizar se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, ???, a2?, a3?, N-acet il-??? , PSAG y T?? (Hinman et al., Cáncer Research 53:3336-42 (1993), Lode et al., Cáncer Research 58:2925-28 (1998) y las Patentes de EE.UU. anteriormente mencionadas para American Cyanamid) .

Otro fármaco antineoplásico con el que es posible conjugar el anticuerpo es QFA, que es un atifolato. Tanto la calicheamicina como el QFA tienen puntos intracelulares de acción y no atraviesan fácilmente la membrana plasmática. Por ello, la absorción celular de estos agentes a través de la internalización mediada por el anticuerpo potencia enormemente sus efectos citotóxicos. iv. Otros agentes citotóxicos Otros agentes antitumorales que se pueden conjugar con los anticuerpos de la invención incluyen BCNU, estreptozoicina , vincristina y 5-fluorouracilo, la familia de agentes conocidos colectivamente como complejo LL-E33288 descrito en las Patentes de EE.UU. 5.053.394, 5.770.710, asi como las esperamicinas (Patente de EE.UU. n° 5.877.296). Las toxinas enzimáticamente activas y los fragmentos de las mismas que se pueden utilizar incluyen cadena de difteria A, fragmentos activos sin unión de la toxina de la difteria, cadena de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena de ricina A, cadena de abrina A, cadena de modecina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S) , inhibidor de la Momordica charantía , curcina, crotina, inhibidor de la Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina , fenomicina, enomicina y los tricotecenos . Véase, por ejemplo, el documento WO 93/21232 publicado el 28 de octubre de 1993. Esta invención también contempla un inmunoconj ugado formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolitica (por ejemplo, una ribonucleasa o una endonucleasa de ADN como por ejemplo la desoxirribonucleasa ; ADNasa) . ' Para la destrucción selectiva del tumor, el anticuerpo puede comprender un átomo altamente radioactivo. Se dispone de una variedad de isótopos radiactivos para la producción de anticuerpos radioconj ugados . Entre los ejemplos se incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radiactivos de Lu . Cuando el conjugado se utiliza para la detección, puede comprender un átomo radioactivo para gammagrafia, por ejemplo tc99m o I123, una etiqueta rotatoria para resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como diagnóstico por imágenes obtenidas mediante resonancia magnética), como yodo-123 nuevamente, yodo-131, indio-111, fluorina-19, carbono-13, nitrógeno-15 , oxigeno-17, gadolinio, manganeso o hierro. El radio u otros marcadores se pueden incorporar en el conjugado en formas conocidas. Por ejemplo, el péptido se puede biosintetizar o sintetizar mediante síntesis química de aminoácidos utilizando precursores adecuados de aminoácidos que contengan, por ejemplo, fluorina-19 en vez de hidrógeno. Etiquetas como tc99m o I123, Re186, Re188 y In111 se pueden unir a través de un residuo de cisteína en el péptido. El itrio-90 se puede unir a través de un residuo de lisina. El método IODOGEN (Fraker et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57 (1978) puede utilizarse para incorporar yodo-123. Véase, por ejemplo, "Monoclonal Antibodies en Immunoscint igraphy" (Chatal, CRC Press 1989) , que describe otros métodos detalladamente . Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se pueden realizar utilizando una variedad de agentes de unión a proteína bifuncionales como por ejemplo N-succinimidil- 3- (2-piridildit io ) propionato (SPDP) , succinimidil-4 - (N-maleimidometil ) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (como el dimetiladipimidato HCI), ésteres activos (por ejemplo, disuccinimidil suberato) , aldehidos (por ejemplo, glutaraldehídos ) , compuestos bis-azido (como bis (p-azidobenzoil ) hexanodiamina) , derivados de bis-diazonio (como bis- (p-diazoniobenzoil ) -etilenodiamina ) , diisocianatos (por ejemplo, 2 , 6-diisocianato de tolueno) , y compuestos bis- activos de fluoruro (como 1 , 5-difluoruro-2 , -dinitrobenceno ) . Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina se puede preparar tal y como se describe en Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987) . El ácido triaminopentaacét ico 1-isotiocianatobencil-3-metildietileno marcado con carbono 14 (I¾<-DTPA) es un ejemplo de agente quelante para la conjugación de un radionucleótido a un anticuerpo. Véase el documento WO94/11026. El enlazador puede ser un "enlazador escindible" que facilita la liberación del fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, puede utilizarse un enlazador acidolábil, un enlazador sensible a la peptidasa, un enlazador fotolábil, un enlazador de dimetilo o un enlazador que contenga disulfuro (Chari et al., Cáncer Research 52:127-31 (1992) ; patente de EE.UU. N° 5.208.020) . Los compuestos de la invención contemplan expresamente el ADC preparado con reactivos reticulares: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-S CC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB y SVSB ( sucinimidil- ( 4 -vinilsulfona) benzoata) que se comercializan (por ejemplo, por Pierce Biotechnology , Inc., Rockford, IL., EE.UU) . Véanse las páginas 467-498, 2003-2004 Applications Handbook y Catalog. v. Preparación de conjugados de anticuerpos con fármacos En los conjugados de anticuerpos con fármacos (ADC) de la invención, un anticuerpo (Ab) se conjuga a una o más porciones de un fármaco (D), por ejemplo, porciones de fármaco de 1 a 20 aproximadamente por anticuerpo, a través de un enlazador (L) . Los ADC de la formula I se pueden preparar por varios medios, empleando reacciones químicas orgánicas, condiciones y reactivos conocidos por los expertos, como: (1) una reacción de un grupo nucleofílico de un anticuerpo con un agente enlazador bivalente, para formar un Ab-L, mediante una unión bivalente, seguida de la reacción con una fracción del fármaco D; y (2) una reacción de un grupo nucleofílico de una fracción del fármaco con un reactivo enlazador bivalente, para formar D-L, mediante un enlace covalente, seguido de la reacción con el grupo nucleofílico del anticuerpo. En la presente memoria descriptiva, se describen los métodos adicionales para la preparación del ADC. A (LD) p I El enlazador puede estar formado por uno o más componentes enlazadores. Los componentes de enlace ejemplares incluyen: 6-maleimidocaproilo ("MC"), maleimidopropanoilo (" P"), valina-citrulina ("val-cit"), alanina-fenilalanina ("ala-fe"), p-aminobensiloxicarbonil ( " PAB" ) , N-Succinimidil 4- (2-piridiltio) pentanoato ("SPP"), N-Succinimidil 4- (N-maleimidometil) ciclohexano- 1 carboxilato ("SMCC ), y N-Succinimidil ( 4 -yodo-acet il ) aminobenzoato ("SIAB") . Los componentes enlazadores adicionales son conocidos en el sector y algunos se describen en la presente memoria descriptiva. Véase también "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", EE.UU. 2005/0238649, cuyo contenido se incorpora en su totalidad a la presente memoria a modo de referencia . En ciertas formas de realización, el enlazador puede comprender residuos de aminoácidos. Los componentes enlazadores ejemplares de aminoácidos incluyen un dipéptido, un tripéptido, un tetrapéptido o un pentapéptido . Los dipéptidos ejemplares incluyen: valina-citrulina (ve o val-cit) , alanina-fenilalanina (af o ala-fe) . Los tripéptidos ejemplares incluyen: glicina-valina-citrul ina (gli-val-cit ) y glicina-glicina-glicina ( gli-gli-gli ) . Los residuos de aminoácidos que comprenden un componente enlazador de aminoácidos incluyen aquellos que se producen de forma natural, tales como los aminoácidos menores y los análogos de aminoácidos que no se producen de forma natural, como la citrulina. Los componentes enlazadores pueden designarse y optimizarse en su selectividad para la escisión mediante una enzima especifica, por ejemplo, una proteasa asociada a un tumor, catepsina B, C y D, o una proteasa plasmina. Los grupos nucleofilicos en los anticuerpos incluyen, aunque sin limitarse a ellos, : (i) grupos amino N-terminal, (ii) grupos amino de la cadena lateral, por e . lisina, (iii) grupos tiol de la cadena lateral, por ej . cisteina, y (iv) grupos amino o hidroxilo de azúcares donde el anticuerpo es glicosilado. Los grupos amino, tiol e hidroxilo son nucleofilicos y son capaces de reaccionar para formar uniones covalentes con grupos electrofilicos en las porciones del enlazador y los reactivos enlazadores, que incluyen: (i) ásteres activos como los ésteres NHS, los ésteres HOBt, haloformos, y haluro de ácido; (ii) haluros de alquilo y bencilo como las haloacetamidas ; (iii) aldehidos, cetonas, carboxilo y grupos maleimidos. Ciertos anticuerpos contienen bisulfuros de intercadena reducible, es decir, puentes de cisteina. Los anticuerpos pueden convertirse en reactivos mediante conjugación con reactivos enlazadores mediante el tratamiento con un agente reductor como el DTT (ditiotreitol ) . Por lo tanto, cada puente de cisteina formará, en teoría, dos nucleófilos tiol reactivos. Los grupos nucleofilicos adicionales pueden introducirse en los anticuerpos a través de la reacción de las lisinas con 2- iminotiolano (reactivo de Traut), lo que da lugar a la conversión de una amina en un tiol. Los grupos tiol reactivos pueden ser introducidos en un anticuerpo (o un fragmento del mismo) mediante la introducción de uno, dos, tres, cuatro o más residuos de cisteina (por ej . preparando anticuerpos mutantes que comprendan uno o más residuos de aminoácidos de cisteinas no nativas). Los conjugados de anticuerpos de la invención con fármacos también pueden producirse mediante la modificación del anticuerpo para introducir porciones electrofilicas , las cuales pueden reaccionar con sustituyentes nucleofilicos en el reactivo enlazador o el fármaco. Las azúcares de los anticuerpos glicosilados pueden oxidarse, por ej . con reactivos oxidantes de periodato, a fin de formar grupos cetonas o aldehidos, los cuales pueden reaccionar con el grupo amina de los reactivos enlazadores o las fracciones del fármaco. Los grupos resultantes de amina base de Schiff pueden formar un enlace estable, o pueden reducirse, por ej . mediante los reactivos de hidruro de boro para formar enlaces amina estables. En una forma de realización, la reacción de la porción carbohidratada de un anticuerpo glicosilado, ya sea con galactosa oxidasa o con metaperiodato de sodio, puede producir grupos de carbonilo (aldehidos y cetonas) en la proteína que pueden reaccionar con los grupos apropiados en el fármaco (técnicas de bioconjugado de Hermanson) . En otra forma de realización, las proteínas que contienen residuos de serina o treonina N-terminal pueden reaccionar con metaperiodato de sodio, lo que da lugar a la producción de un aldehido en lugar del primer aminoácido (Geoghegan & Stroh, Bioconjugate Chem. 3:138-46 (1992) : EE.UU. 5.362.852) . Puede hacerse que este aldehido reaccione con un fragmento de fármaco o un nucleófilo enlazador. Del mismo modo, los grupos nucleofí lieos en una fracción del fármaco incluyen los siguientes compuestos: los grupos amino, tiol, hidroxilo, hidracida, oxima, hidracina, tiosemicarbazona , carboxilato de hidracina y aril-hidracida , capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrofí lieos en las fracciones enlazadoras y reactivos enlazadores, que incluyen: (i) ásteres activos como los ésteres NHS, los ésteres HOBt, haloformos, y haluro de ácido; (ii) haluros de alquilo y bencilo como las haloacetamidas ; (iii) aldehidos, cetonas, carboxilo y grupos maleimidos. Alternativamente, es posible realizar una fusión de proteínas que contengan el anticuerpo y el agente citotóxico, por ej . mediante técnicas recombinantes o síntesis de péptidos. La longitud del ADN puede incluir regiones respectivas que codifiquen las dos porciones del conjugado, ya sea adyacente entre si o en forma separada por una región que codifica un péptido de enlace, el cual no destruye las propiedades deseadas del conjugado. En otra forma de realización, el anticuerpo puede conjugarse con un "receptor" (como la estreptavidina ) para utilización en el premarcado del tumor donde se administra al paciente el conjugado receptor del anticuerpo, luego se elimina de la circulación el conjugado no unido usando un agente de eliminación y seguidamente se administra un "ligando" (por ej . avidina), que se conjuga con un agente citotóxico (por ej . un radionucleótido) . Formulaciones farmacéuticas Las formulaciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo de la invención se preparan para su conservación mediante la mezcla de anticuerpos con el grado deseado de pureza con moléculas vehículo, excipientes o estabilizantes opcionales fisiológicamente aceptables (Remington: The Science y Practice of Pharmacy 20th edition (2000)), en forma de soluciones acuosas, liofilizadas u otras formulaciones liofili zadas . Los vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en todas las dosis y concentraciones empleadas e incluyen soluciones tamponadas, como fosfato, citrato, histidina y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (como por ejemplo, cloruro amonio de octadecildimetilbencilo; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio; alcohol bencilo, fenol o butilo benzil alcohol; alquil parabeno como el metal o propel parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol ; 3-pentanol; y m-cresol) ; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de 10 residuos) ; proteínas, como cera albúmina, gelatina, o inmunoglobulinas ; polímeros hidrofílicos como la polivinilpirrolidona ; aminoácidos como glicerina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos , disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes como la EDTA; azúcares como sucrosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contra-iones de formación salina como el sodio; complejos metálicos (por ej . complejos Zn-proteína ) ; surfactantes y/o no iónicos como TWEEN™, PLURONICS™ o poliet ilenglicol (PEG) . La formulación de la presente memoria descriptiva también contiene más de un compuesto activo tal y como sea necesario para la indicación particular que se está tratando, preferentemente aquellas con actividades complementarias que no se afectan de manera adversa entre si. Dichas moléculas están presentes en combinación en cantidades que sean eficaces para el fin que se pretende. Los principios activos también se pueden atrapar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y poli-(met ilmetacrilato ) , respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nanoparticulas y nanocápsulas ) , o en macroemulsiones . Estas técnicas se divulgan en Remington: The Science y Practice of Pharmacy 20th edition (2000) . Las formulaciones para administrar en vivo deben ser estériles. Esto se logra mediante la filtración a través de membranas de filtración estériles. Se pueden elaborar preparaciones de liberación controlada. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación controlada incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen la inmunoglobulina de la invención, cuyas matrices están en forma de elementos moldeados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación controlada incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli- (2-hidroxietil-metacrilato) , o poli- ( vinilalcohol ) ) , poliláctidos (patente de Estados Unidos N° 3.773.919) , copolimeros del ácido L-glutámico y ?-etil-L-glutamato, acetato de etilenvinilo no degradable, copolimeros del ácido glicólico-ácido láctico degradables como por ejemplo LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas por copolimeros del ácido glicólico-ácido láctico y acetato de leuprolida) , y ácido poli-D- ( - ) -3-hidroxibutí rico . Mientras que los polímeros como el acetato de etilenvinilo y el ácido glicólico-ácido láctico permiten la liberación de moléculas por un período de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo menores. Cuando las inmunoglobulinas encapsuladas permanecen en el organismo por un largo período de tiempo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a la humedad a 37 °C, lo cual se traduce en una perdida de la actividad biológica y en posibles cambios en la inmunogenicidad . Es posible concebir estrategias racionales para su estabilización dependiendo del mecanismo que intervenga. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es de formación de uniones intermoleculares S-S mediante el intercambio t io-disulfuro , se puede lograr la estabilización mediante la modificación de los residuos sulfhidrilos, liof ilizando soluciones ácidas, controlando la humedad, utilizando aditivos adecuados y desarrollando composiciones de matrices de polímeros especificas. Usos Puede usarse un anticuerpo de la presente invención, por ejemplo, en métodos terapéuticos en vitro, ex vivo e en vivo.

En algunas formas de realización, la invención ofrece métodos para reducir o inhibir la angiogénesis en un sujeto que presente un estado patológico asociado a la angiogénesis; estos métodos comprenden la administración al sujeto de una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-EGFL7 de la invención. Entre los estados patológicos se incluyen, p.ej., neoplasmas (comprendidos los carcinomas) y ciertas afecciones oculares.

Entre los tipos de cáncer que pueden tratarse con la presente invención se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia o neoplasias linfoides. Entre los ejemplos más específicos de estos tipos de cáncer figuran cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, cáncer de riñon o renal, cáncer de pulmón incluidos cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer de células escamosas (p.ej., cáncer de células escamosas epiteliales) , cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular , cáncer de estómago o gástrico incluidos cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, cáncer de cabeza y cuello, glioblastoma, retinoblastoma , astrocitoma, tecomas, arrenoblastomas , hepatoma, tumores hematológicos incluidos linfoma no-Hodgkin (NHL) , mieloma múltiple y tumores hematológicos agudos, carcinoma endometrial o uterino, endometriosis , fibrosarcomas , coriocarcinoma , carcinoma de las glándulas salivares, cáncer vulval, cáncer tiroideo, carcinomas esofágicos, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma del pene, carcinoma nasofaríngeo, carcinomas laríngeos, sarcoma de Kaposi, melanoma, carcinomas de la piel, Schwannoma, oligodendroglioma , neuroblastomas , rabdomiosarcoma , sarcoma osteogénico, leiomiosarcomas , carcinomas del tracto urinario, carcinomas tiroideos y tumor de Wilm, así como proliferación vascular anormal asociada a facomatosis, edema (como el asociado a los tumores cerebrales) y síndrome de Meigs. Preferiblemente, el cáncer se selecciona del grupo compuesto por cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón de células no pequeñas, linfoma no-Hodgkin (NHL), cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer de cabeza y cuello, melanoma, cáncer de ovario, mesotelioma y mieloma múltiple. Más específicamente, el cáncer es cáncer colorrectal . Los estados cancerosos que pueden tratarse con la presente invención incluyen a los cánceres metastásicos . La presente invención es particularmente apta para el tratamiento de tumores vascularizados. Las afecciones oculares que pueden tratarse con la presente invención incluyen las enfermedades neovasculares , comprendiendo, aunque sin limitarse a ellos, degeneración macular relacionada con la edad, edema macular diabético, retinopatía diabética proliferativa , oclusión de la vena central de la retina con edema macular cistoide, oclusión de rama de la vena retinal con edema macular cistoide, rubeosis iridis, miopía patológica/CNV, Síndrome de Von Hippel Lindau, pterigio, POHS ( histoplasmosis ) /CNV, hemangiomas coroidales, retinopatía de la premadurez (ROP) , retinopatía por radiación, tumores infraoculares (p.ej., melanoma, retinoblastoma , metástasis y hemangiomas cavernosos de la órbita), coroidopatía polipoidal, telangiectasia yuxtafoveal idiopática, enfermedad de Eales, hemangiomas cavernosos de la órbita, linfangiomas orbitales, hemangiomas capilares del párpado, vascularización del trasplante de córnea, neovasculari zación del trasplante de córnea, enfermedad de Coats y problemas para la curación de las heridas asociados a la cirugía de glaucoma. Además, al menos algunos de los anticuerpos de la invención se pueden unir al antígeno de otras especies. Por consiguiente, los anticuerpos de la invención pueden usarse para unirse a la actividad de un antígeno específico, por ejemplo, en un cultivo celular que contenga el antígeno, en humanos o en otros mamíferos que tengan el antígeno con el que un anticuerpo de la invención reaccione (ej . chimpancé, babuino, tití, macaco de Java y macaco de la India, cerdo o ratón) . En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención se puede usar para inhibir las actividades del antígeno mediante el contacto del anticuerpo con el antígeno de tal manera que la actividad del antígeno quede inhibida. Preferiblemente, el antígeno es una molécula proteínica humana . En algunas formas de realización, un anticuerpo de la invención se puede usar en un método para unir a un antígeno en un sujeto que sufre un trastorno asociado a un aumento de la expresión y/o actividad del antígeno, que comprende administrar al sujeto un anticuerpo de la invención de tal manera que se una el antígeno en el sujeto. Preferiblemente, el antígeno es una molécula proteínica humana. De manera alternativa, el sujeto puede ser un mamífero que expresa el antigeno con el que se une un anticuerpo de la invención. Además, el sujeto puede ser un mamífero al que se le ha introducido el antígeno (ej . mediante la administración del antígeno o mediante la expresión de un trasgén del antígeno) . Un anticuerpo de la invención puede administrarse a un sujeto humano para fines terapéuticos. Además, un anticuerpo de la invención se puede administrar a mamíferos no humanos que expresan un antígeno con el que la inmunoglobulina reaccione (ej . , primate, cerdo o ratón) para fines veterinarios o como modelo animal de una enfermedad humana. Sobre esto último, dichos modelos animales pueden ser útiles para evaluar la eficacia terapéutica de los anticuerpos de la invención (ej . pruebas de dosis y períodos de administración) . Los anticuerpos de la invención se pueden usar para tratar, inhibir, retrasar la progresión, prevenir/retrasar la recidiva, mejorar o prevenir enfermedades, trastornos o procesos asociados a la expresión y/o actividad de una o más moléculas antigénicas. En algunas formas de realización, se administra al paciente el inmunoconj ugado que comprende un anticuerpo conjugado con uno o más agentes citotóxicos. En algunas formas de realización, el inmunocon ugado y/o el antígeno al que va unido es internalizado por la célula, lo que ocasiona una mayor eficacia terapéutica del inmunocon ugado para inactivar la célula diana a la que se une. En una forma de realización, el agente citotóxico actúa o interfiere con el ácido nucleico en la célula diana. En una forma de realización, el agente citotóxico actúa o interfiere con la polimerización de microtúbulos . Como ejemplos de los citados agentes citotóxicos se incluyen cualquiera de los agentes quimioterapéuticos citados en la presente memoria descriptiva (por ejemplo, un maitansinoide , una auristatina, una dolastatina o una caliqueamicina ) , un isótopo radioactivo, una ribonucleasa o una ADN endonucleasa . Los anticuerpos de la invención se pueden usar solos o junto con otras composiciones en un tratamiento. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención se puede administrar con untamente con uno o más agentes quimioterapéuticos (incluidos cócteles de agentes quimioterapéuticos ) , otro (s) agente (s) citotóxico ( s ) , agente (s) angiogénico ( s ) , citocinas y/o agente (s) inhibidor ( es ) del crecimiento. Las terapias combinadas descritas anteriormente incluyen administración combinada (en la que los dos o más agentes se incluyen en la misma formulación o en formulaciones separadas), y administración separada, en cuyo caso la administración del anticuerpo de la invención puede producirse antes, y/o después, de la administración de la terapia o terapias asociadas . El anticuerpo de la invención (y el agente terapéutico asociado) se administra (n) por cualquier medio apto, incluyendo las vías parenteral, subcutánea, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal, y, si se desea para tratamiento local, la vía intralesional . Las infusiones parentales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial , intraperitoneal y subcutánea. Además, el anticuerpo se administra correctamente mediante infusión de efecto rápido con dosis del anticuerpo cada vez menores. La dosificación puede realizarse mediante cualquier vía adecuada, por ej . mediante inyecciones vía intravenosa o subcutánea, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. La composición del anticuerpo de la invención debe formularse, dosificarse y administrarse de una manera consistente empleando una práctica médica adecuada. Los factores a considerar en este contexto incluyen el trastorno especifico sometido a tratamiento, el mamífero específico sometido a tratamiento, el estado clínico del paciente, la causa del trastorno, la localización de la administración del agente, el método de administración, la regulación de la administración y otros factores conocidos por los facultativos. El anticuerpo puede formularse opcionalmente con uno o más agentes utilizados actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de dichos agentes depende de la cantidad de anticuerpos de la invención, el tipo de enfermedad o trastorno o tratamiento, y otros factores ya abordados con anterioridad. Estos son generalmente usados en las mismas dosis y con las mismas vías de administración descritas en la presente memoria descriptiva o aproximadamente entre 1% y 99% de las dosis empleadas hasta este momento. Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosis adecuada de un anticuerpo de la invención (cuando se utiliza aislado o en combinación con otros agentes) dependerá de: el tipo de enfermedad que vaya a tratarse; el tipo de anticuerpo; la gravedad y el curso de la enfermedad; si el anticuerpo se administra con fines preventivos o terapéuticos; la terapia anterior; la historia clínica del paciente y la respuesta al anticuerpo; y el criterio del médico tratante. El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente una vez o en una serie de tratamientos. Según el tipo y la gravedad de la enfermedad, una dosis inicial candidata para la administración a un paciente es de aproximadamente 1 pg/kg a 15 mg/kg (por e . , 0,lmg/kg-10 mg/kg) de anticuerpo, ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas o mediante una infusión continua. Una dosis diaria normal puede oscilar entre aproximadamente 1 pg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores anteriormente mencionados. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la enfermedad, el tratamiento se mantiene hasta que se produzca la supresión deseada de los síntomas de la misma. Un ejemplo de dosis del anticuerpo se situaría en el intervalo de aproximadamente 0,05 mg/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg. Por lo tanto, se puede administrar al paciente una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas) . Dichas dosis se pueden administrar de manera intermitente, por ej . , una vez por semana o cada tres semanas (por ej . , de modo que el paciente reciba desde aproximadamente dos a aproximadamente veinte, por ej . , aproximadamente seis dosis del anticuerpo) . Se puede administrar una mayor carga de dosis inicial seguida de una o más dosis menores. Un ejemplo de pauta posológica comprende la administración de una dosis inicial aproximada de 4 mg/kg, seguida de una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 2 mg/kg del anticuerpo. No obstante, también pueden ser útiles otras pautas posológicas. El progreso de este tratamiento se controla fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales. Los anticuerpos anti-EGFL7 de la invención son útiles en ensayos para detectar la expresión de EGFL7 (como ensayos diagnósticos o pronósticos) en células o tejidos específicos en los que los anticuerpos están marcados como se describe más adelante y/o están inmovilizados en una matriz insoluble.

La invención proporciona métodos para la detección de EGFL7, los cuales comprenden la detección del complejo formado por EGFL7 y anticuerpos anti-EGFL7 en la muestra. Por "detección" se entiende en la presente memoria la detección cualitativa y/o cuantitativa (niveles de medición) con o sin referencia a un control. La invención proporciona métodos para diagnosticar un trastorno asociado a la expresión y/o actividad de EGFL7, los cuales incluyen la detección del complejo formado por EGFL7 y anticuerpos anti-EGFL7 en una muestra biológica procedente de un paciente que tiene o de quien se sospecha que tiene el trastorno. En algunas formas de realización, - la expresión de EGFL7 es una expresión aumentada o anómala (no deseada) . La invención proporciona cualquiera de los anticuerpos anti-EGFL7 descritos en la presente memoria descriptiva, donde el anticuerpo anti-EGFL7 comprende un marcador detectable . La invención ofrece un complejo de cualquiera de los anticuerpos anti-EGFL7 descritos en la presente memoria y de EGFL7. En algunas formas de realización, el complejo está en vivo o en vitro. En algunas formas de realización, el complejo comprende una célula cancerosa. En algunas formas de realización, el anticuerpo anti-EGFL7 está marcado de forma detectable. Los anticuerpos anti-EGFL7 se pueden usar para la detección de EGFL7 en cualquiera de los diversos métodos de detección bien conocidos. Por ejemplo, se puede realizar un análisis de una muestra biológica para EGFL7 mediante la obtención de la muestra de una fuente deseada, añadiendo y mezclando la muestra con anticuerpo anti-EGFL7 para permitir al anticuerpo formar el complejo anticuerpo/EGFL7 con cualquier EGFL7 presente en la mezcla, y la detección de cualquier complejo ant icuerpo/EGFL7 presente en la mezcla. La muestra biológica puede ser preparada para su análisis mediante métodos conocidos en el sector que son aptos para la muestra concreta. Los métodos para añadir y mezclar la muestra con anticuerpos y los métodos de detección del complejo anticuerpo/EGFL7 se eligen según el tipo de ensayo utilizado. Estos ensayos incluyen ensayos inmuhistoquimicos , ensayos competitivos, inmunoanálisis de doble anticuerpo (tipo "sandwich") y ensayos de inhibición de ésteres. Los métodos analíticos para la detección de EGFL7 usan uno o más de los reactivos siguientes: análogo EGFL7 marcado, análogo EGFL7 inmovilizado, anticuerpo anti-EGFL7 marcado, anticuerpo anti-EGFL7 inmovilizado y conjugados de ésteres. Los reactivos marcados también se conocen como "trazadores" . El marcador usado es cualquier funcionalidad detectable que no interfiera con la unión de EGFL7 y el anticuerpo anti-EGFL7. Se conocen numerosos marcadores para uso en inmunoensayos y entre los ejemplos figuran las porciones que se pueden detectar directamente, como marcadores radioactivos, quimioluminescentes o fluorocromo, así como porciones, como enzimas, que se deben hacer reaccionar o derivar para que sea posible detectarlas. El marcador usado es cualquier funcionalidad detectable que no interfiera con la unión de EGFL7 y el anticuerpo anti-EGFL7. Se conocen numerosos marcadores para uso en inmunoensayos y entre los ejemplos figuran las porciones que se pueden detectar directamente, como marcadores radioactivos, quimioluminescentes o fluorocromo, asi como porciones, como enzimas, que se deben hacer reaccionar o derivar para que sea posible detectarlas. Ejemplos de estos marcadores son los radioisótopos 32P, 1 C, 125I, 3H y 131I, fluoroforos como algunos quelantes térreos raros o fluoresceina y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansil, umbeliferon, luceriferasas (por ejemplo, luciferasa de la luciérnaga y luciferasa bacteriana (Patente de EE.UU. n.° 4.737.456), luciferina, 2 , 3-dihidroftalazinadionas , peroxidasa de rábano picante (HPR) , fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, glucoamilasa , lisozima, oxidasas sacáridas, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa , oxidasas heterociclicas como uricasa y xantina oxidasa, acopladas con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de tinte como HRP, lactoperoxidasa , o microperoxidasa , biotina/avidina , marcadores rotatorios, marcadores bacteriófagos, radicales libres estables y similares. Se dispone de métodos convencionales para unir estos marcadores covalentemente a proteínas o polipépt idos . Por ejemplo, se pueden usar agentes de unión como dialdehídos, carbodiimidas , dimaleimidas , bis-imidatos , benzidina bis-diazotidazada y similares para marcar los anticuerpos con los marcadores enzimáticos, fluorescentes y quimioluminiscentes antes descritos. Véanse, por ejemplo, Patentes de EE.UU. N°s. 3.940.475 ( fluorimetría) y 3.645.090 (enzimas) ; Hunter et al., Nature, 144:945 (1962) ; David et al., Biochemistry, 13:1014-21 (1974) ; Pain et al., J. Immunol . Meth. 40:219-30 (1981) ; y Nygren, J. Histochem. y Cytochem. 30:407-12 (1982) . Los marcadores preferentes en la presente memoria descriptiva son enzimas como peroxidasa de rábano picante y fosfatasa alcalina. La conjugación de este marcador, incluidas las enzimas, con el anticuerpo es un procedimiento de manipulación estándar para cualquier experto en técnicas de inmunoensayo . Véase, por ejemplo, O'Sullivan et al., "Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use en Enzyme Immunoassay, " en Methods en Enzymology, ed. J.J. Langone y H. Van Vunakis, Vol . 73 (Academic Press, New York, New York, 1981), pp . 147-166. Para ciertos métodos de ensayo es necesaria la inmovilización de reactivos. La inmovilización supone separar el anticuerpo anti-EGFL7 de cualquier EGFL7 que permanezca libre en solución. Tradicionalmente , esto se consigue tanto insolubili zando el anticuerpo anti-EGFL7 o el análogo de EGFL7 antes del procedimiento de ensayo, como por adsorción en una superficie o matriz insoluble a agua (Bennich et al., EE.UU. 3.720.760), mediante acoplamiento covalente (por ejemplo, usando reticulación con glutaraldehido ) , o insolubilización del anticuerpo anti-EGLF7 o del análogo de EGFL7 y después,' por ejemplo, por inmunoprecipitación . La expresión de proteínas en una muestra se puede examinar usando protocolos de tinción e inmunihistoquímica . La tinción inmunohistoquímica de cortes tisulares ha demostrado ser un método fiable de evaluar o detectar la presencia de proteínas en una muestra. Las técnicas de inmunohistoquímica ("IHC") utilizan un anticuerpo para detectar y visualizar antígenos celulares en situ, por lo general mediante métodos cromogénicos o fluorescentes. Para la preparación de la muestra, se puede utilizar una muestra celular o de tejido procedente de un mamífero (normalmente, un paciente humano) . Las muestras se pueden obtener mediante diversos procedimientos conocidos en el sector, incluidas, aunque sin limitarse a ellas, extirpación quirúrgica, aspiración o biopsia. El tejido puede ser fresco o congelado. En una forma de realización, la muestra se fija y embebe en parafina o similares. La muestra de tejido se puede fijar (es decir, preservar) mediante métodos convencionales. Cualquier experto en la materia sabrá que la elección de un fijador depende del fin para el cual se procederá a marcar histológicamente a la muestra o del método de análisis que se utilice. Cualquier experto en la materia también sabrá que la duración de la fijación depende del tamaño de la muestra de tejido y del fijador utilizado. La IHC se puede realizar en combinación con otras técnicas, como tinción morfológica y/o hibridi zación en situ fluorescente. Se dispone de dos métodos generales de IHC: ensayos directos e indirectos. Según el primer ensayo, la unión del anticuerpo al antigeno diana (por ejemplo, EGFL7) se determina directamente. Este ensayo directo usa un reactivo marcado, como un marcador fluorescente o un anticuerpo primario marcado con una enzima, el cual se puede visualizar sin mayor interacción con el anticuerpo. En un ensayo indirecto típico, el anticuerpo primario no conjugado se une al antígeno y, luego, un anticuerpo secundario marcado se une al anticuerpo primario. Si el anticuerpo secundario se conjuga a un marcador enzimático, se añade un sustrato cromogénico o fluorogénico para permitir la visualización del antígeno. La amplificación de la señal se produce porque varios anticuerpos secundarios pueden reaccionar con distintos epítopos en el anticuerpo primario. El anticuerpo primario y/o secundario utilizado para inmunohistoquímica estará marcado habitualmente con una porción detectable. Se dispone de numerosos marcadores que se pueden agrupar, por lo general, en las categorías siguientes : Aparte de los procedimientos de preparación de la muestra tratados anteriormente, tal vez se requiera un nuevo tratamiento del corte histológico antes o después de aplicar la IHC, o durante su aplicación. Por ejemplo, se pueden realizar métodos de recuperación de epítopos, como calentamiento de la muestra tisular en solución tamponada con citrato (véase, por ejemplo, Leong et al., Appl . Immunohistochem. 4(3) :201 (1996)) . Después de un paso opcional de bloqueo, el corte histológico queda expuesto al anticuerpo primario durante un tiempo suficiente y en condiciones idóneas para que el anticuerpo primario se una al antígeno de la proteína diana en la muestra de tejido. Las condiciones idóneas para lograr esto se pueden determinar mediante experimentos habituales. El alcance de la unión del anticuerpo a la muestra se determina mediante el uso de uno de los marcadores detectables mencionados anteriormente. Preferiblemente, el marcador es un marcador enzimático (por ejemplo, HRPO) que cataliza una alteración química del sustrato cromogénico como cromogén de 3 , 3 ' -diaminobenzidina . Preferiblemente, el marcador enzimático se conjuga al anticuerpo que se une específicamente al anticuerpo primario (por ejemplo, el anticuerpo primario es anticuerpo policlonal de ratón y el anticuerpo secundario es anticuerpo anticonejo de cabra). Las muestras así preparadas se pueden montar y cubrir en la placa. A continuación, se determina la evaluación de la muestra, por ejemplo, usando un microscopio, y se pueden emplear criterios de intensidad de la tinción usados habitualmente en el sector. Otros métodos de ensayo, conocidos como ensayos competitivos o de inmunoanálisis de doble anticuerpo, son bien conocidos y ampliamente usados en el sector diagnóstico comercial . Los ensayos competitivos dependen de la capacidad de un análogo de EGFL7 del trazador para competir con la muestra de prueba EGFL7 en un número limitado de sitios de unión a antígeno del anticuerpo anti-EGFL7. Por lo general, el anticuerpo anti-EGFL7 se insolubiliza antes o después de la competición y, luego, el trazador y EGFL7 unidos al anticuerpo anti-EGFL7 se separan del trazador y de EGFL7 no unidos. Esta separación se logra decantando (donde la molécula de enlace estaba preinsolubilizada ) o centrifugando (donde la molécula de enlace se había precipitado tras la reacción competitiva) . La cantidad de EGFL7 de la muestra de prueba es inversamente proporcional a la cantidad de trazador unida según la medición de la cantidad de sustancia marcadora. Las curvas dosis-respuesta con cantidades conocidas de EGFL7 se preparan y comparan con el resultado de la prueba para determinar cuantitativamente la cantidad de EGFL7 presente en la muestra de prueba. Estos ensayos se denominan sistemas ELISA cuando las enzimas se usan como marcadores detectables. Otra especie de ensayo competitivo, denominado ensayo "homogéneo", no exige fase de separación. En este caso, se prepara y utiliza un conjugado de una enzima con EGFL7, de forma que, cuando el anticuerpo anti-EGFL7 se une a EGFL7, la presencia del anticuerpo anti-EGFL7 modifica la actividad enzimática. En este caso, la EGFL7 o sus fragmentos inmunológicamente activos se conjugan con un puente orgánico bifuncional a una enzima como peroxidasa. Los conjugados se seleccionan para uso con anticuerpos anti-EGFL7, de forma que la unión al anticuerpo anti-EGFL7 inhibe o potencia la actividad enzimática del marcador. Este método se aplica ampliamente con el nombre de EMIT. Se usan conjugados de ésteres en métodos de obstaculización de ésteres para ensayos homogéneos. Estos conjugados se sintetizan mediante enlace covalente de un hapteno de bajo peso molecular a un pequeño fragmento de EGFL7, de forma que el anticuerpo anti-hapteno no pueda unirse al conjugado al mismo tiempo que el anticuerpo anti-EGFL7. Con este procedimiento, la EGFL7 presente en la muestra de prueba se unirá al anticuerpo anti-EGFL7, lo que permitirá al antihapteno unirse al conjugado y esto, a su vez, ocasionará un cambio en el carácter del hapteno conjugado, por ejemplo, un cambio en fluorescencia cuando el hapteno es un fluoroforo. Los ensayos tipo "sandwich" son especialmente útiles para la determinación de EGFL7 y de los anticuerpos anti-EGFL7. En ensayos "sandwich" secuenciales se usa un anticuerpo anti-EGFL7 inmovilizado para adsorber la EGFL7 de la muestra de prueba, se retira la muestra de prueba mediante lavado., la EGFL7 unida se utiliza para adsorber un segundo anticuerpo anti-EGFL7 marcado y el material unido se separa luego del trazador residual. La cantidad de trazador unido es directamente proporcional a la EGFL7 de la muestra de prueba. En ensayos "sandwich simultáneos" la muestra de prueba no se separa antes de añadir el anticuerpo anti-EGFL7 marcado. En muestras de prueba para la detección de EGFL7 es útil un ensayo secuencial tipo "sandwich" que utilice como anticuerpo un anticuerpo monoclonal anti-EGFL7 y un anticuerpo policlonal anti-EGFL7. Los anteriores no son más que ejemplos de ensayos para la detección de EGFL7. En el ámbito de la presente memoria descriptiva están incluidos otros métodos desarrollados actualmente o en lo sucesivo que utilicen un anticuerpo anti-EGFL7 para la determinación de EGFL7, incluidos los bioensayos descritos en la misma. Artículos de fabricación En otro aspecto de la invención, se propone un articulo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los desórdenes descritos anteriormente. El elemento de fabricación comprende un envase y una etiqueta o prospecto en el envase o asociado a él. Entre los envases adecuados se encuentran, por ejemplo, botes, viales, jeringas, etc. Los envases pueden estar hechos de diversos materiales, como vidrio o plástico. El envase tiene una composición que, por si sola o combinada con otra u otras composiciones, es eficaz en el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de la enfermedad y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el envase puede ser una bolsa para solución intravenosa o un vial con un tapón perforable por una aguja hipodérmica ) . Al menos un agente activo de la composición es un anticuerpo de la invención. La etiqueta o prospecto indica que la composición se ha utilizado para el tratamiento de una afección especifica, como asma. Además, el articulo de fabricación puede comprender (a) un primer envase con una composición contenida en él, donde la composición comprenda un anticuerpo de la invención; y (b) un segundo envase con una composición contenida en él. El articulo de fabricación de esta forma de realización de la invención puede comprender también un prospecto que indique que la composición del primer y del segundo anticuerpo se puede usar para tratar un proceso concreto, por ejemplo, asma. De modo alternativo, o adicional, el elemento de fabricación puede comprender un segundo (o tercer) envase que contiene una solución farmacéuticamente aceptable, como agua bacteriostática para inyección (BWFI), una solución salina fosfatada, una solución de Ringer y una solución de dextrosa. También puede incluir otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluidas otras soluciones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas. A continuación se incluyen ejemplos de los métodos y composiciones de la invención. A partir de la descripción general proporcionada anteriormente, se entiende que se pueden dar varias formas de realización.

EJEMPLOS EJEMPLO 1. Producción y caracterización de los anticuerpos monoclonales para EGFL7 Producción de anticuerpos monoclonales EGFL7 fue identificada y clonada en un esfuerzo por descubrir nuevas proteínas humanas secretadas y de membrana, en particular aquellas que intervienen en la regulación del desarrollo vascular. Los detalles de clonación y la expresión de la EGFL7 humana se describen, por ejemplo, en la solicitud de patente de EE.UU. 2003/0224948A1 (en la cual EGFL7 se identifica como PR01449) . El número de acceso al GenBank® para la EGFL7 humana es NM_016215. El ratón "bloqueado" homogocito EGFL7 (generado en Genentech) fue inmunizado con E. coli producido por proteínas humanas recombinantes marcadas His6 y EGFL7 de ratón, diluido en adyuvante Ribi (Corixia, Hamilton, MT) e inyectado en las patas en ocho dosis, dos veces por semana. Los linfocitos B de los nodulos linfáticos se recogieron de diez ratones que mostraron elevadas titulaciones de suero y se fusionaron con células de mieloma de ratón (X63. Ag8.653 ; American Type Culture Collection® (ATCC®) ) . Al cabo de 10-14 días se procedió a tamizar a los sobrenadantes para la producción de anticuerpos mediante ELISA directo utilizando la proteina EGFL7 recombinante . Los positivos fueron subclonados dos veces para lograr la monoclonalidad . Para la producción a gran escala del anticuerpo purificado se inyectaron i.p. células de hibridoma en ratones BALB/c cebados o se cultivaron en un biorreactor Integra. Los fluidos asciticos o los sobrenadantes del cultivo fueron purificados mediante cromatografía de afinidad con proteína A (Pharmacia Fast Protein Liquid Chromatography ; .Pharmacia, Uppsala, Suecia) . Tres de esos anticuerpos monoclonales designados 4F11, 10G9 y 18F7 fueron elegidos para ser sometidos a más análisis. Esos anticuerpos monoclonales fueron depositados con el ATCC® en Enero de 2006. Los anticuerpos monoclonales bloquean la adhesión y la migración de las células HUVEC Previamente se había demostrado que la EGFL7 que cubría las placas de cultivo favorecía la adhesión de las células (HUVEC) endoteliales de la vena umbilical, aunque la resistencia de la adhesión era significativamente menor a la de otras moléculas de adhesión celular como fibronectina y colágeno (Parker et al., Natura 428:754-58 (2004)) . Por consiguiente, realizamos experimentos para determinar si los anticuerpos monoclonales 4F11, 10G9 y 18F7 podían bloquear la adhesión celular a las placas cubiertas con EGFL7. Se procedió a cubrir las placas con 5pg/ml de fibronectina (Roche) y EGFL7 humana recombinante producida en E. coli. Después del lavado con solución PBS, las HUVEC (Cambrex) fueron colocadas sobre una placa a una densidad de 5 x 105/cm2 en medio EGM2 (Cambrex) , se procedió a centrifugar durante 5 minutos a 140 g para sincronizar la unión celular y después se incubó. Para analizar la actividad del anticuerpo, se procedió a incubar las HUVEC en medio EGM2 con las concentraciones de anticuerpo de 0,5, 5 ó 50 pg/ml en NaCl 50 mM Tris / 125 mM, pH 8,6, antes de colocar sobre la placa. Todos los anticuerpos monoclonales 4F11, 10G9 y 18F7 bloquearon la adhesión celular en las placas cubiertas con proteína EGFL7 humana o de ratón en una concentración dependiente del método y ninguno de los anticuerpos monoclonales bloqueó la adhesión celular en las placas cubiertas con fibronectina, confirmando que el bloqueo era específico de la EGFL7. También analizamos si esos anticuerpos pueden bloquear la migración de las células HUVEC en placas cubiertas con EGFL7. Se procedió a cubrir las placas con 5 µg/ml de una de las siguientes proteínas: BSA (Sigma) , colágeno (Upstate) , fibronectina (Roche) y EGFL7 recombinante humana (producida en E. Coli en Genentech) . Después del lavado con solución PBS, las HUVEC (Cambrex) fueron .colocadas sobre placas a una densidad de 5xl05/cm2 en EGM2 (Cambrex) . Se dejó que las células se unieran durante dos horas y se procedió a "marcar" la monocapa con la punta de una pipeta. Los pocilios fueron lavados dos veces con EGM2 y un medio nuevo conteniendo 50 yg/ml de un anticuerpo monoclonal de control, o se añadieron 4F11, 10G9 ó 18F7, respectivamente. Los pocilios fueron fotografiados en varios intervalos de tiempo a lo largo de 24 horas para controlar el cierre de las "marcas". Los anticuerpos monoclonales 4F11, 10G9 y 18F7 bloquearon la migración celular en placas cubiertas con la proteína EGFL7, pero no lo hicieron con las placas cubiertas con otras proteínas. El anticuerpo monoclonal de control no tiene actividad de bloqueo sobre ninguna de las proteínas. Estos resultados indican que los tres anticuerpos monoclonales anti-EGFL7 bloquearon específicamente la migración de las células HUVEC en las placas cubiertas con EGFL7. Curiosamente, observamos que el bloqueo por parte del anticuerpo monoclonal 4F11 dependía de la formulación. Específicamente, el anticuerpo era sumamente eficaz en el bloqueo de la adhesión de las células HUVEC cuando el stock del anticuerpo se preparaba en NaCl 50 mM Tris / 125 mM, pero mostraba una eficacia mínima cuando se preparaba en PBS . Esta diferencia no se observó en los otros dos anticuerpos monoclonales . Determinación de la secuencia de los anticuerpos monoclonales 4F11 y 10G9 Se extrajo el ARN total de las células de hibridoma que producen los anticuerpos monoclonales de ratón anti-EGFL7 humano 4F11 y 10G9, usando el Mini Kit RNeasy® (Qiagen, Alemania) . Los dominios de variable ligera (VL) y de variable pesada (VH) de 4F11 y 10G9 fueron amplificados usando RT-PCR con los siguientes cebadores degenerados: Para 4F11: Cadena ligera (LC) anversa: 5' GTCAGATATCGTKCTSACMCARTCTCCWGC-3 ' (ID. SEC. N° 21) Cadena pesada (HC) anversa: 5'- GATCGACGTACGCTCAGATHCARYTGGTGCARTCT GGGATCGACGTACGCTCAGATHCARYTGGTGCARTCTGG -3' (ID. SEC. N° 22) Para 10G9: Cadena ligera (LC) anversa: 5' GATCGATATCGTGATGACBCARACTCCACT- 3' (ID. SEC. N° 23) Cadena pesada (HC) anversa: 5' GATCGACGTACGCTGAGGTYCAGCTSCAGCAGTCTGG -3' (ID. SEC. N° 24) Para 4F11 y 10G9: Cadena ligera reversa: 5' - T TDAKYTCCAGCTTGGTACC-3 ' (ID. SEC. N° 25) Cadena pesada reversa: 5' ACAGTGGGCCCTTGGTGGAGGCTGMRGAGACDGTGASHRDRGT- 3 ' (ID. SEC. N° 26) Los cebadores anversos eran específicos para la secuencia de aminoácidos N-terminal de las regiones VL y VH . Los cebadores reversos LC y los HC, respectivamente, se diseñaron para hibridar en una región del dominio constante ligero (CL) y del dominio constante pesado 1(CH1), que es idéntico para los dos anticuerpos y se mantiene en gran medida entre las especies. La VL amplificada fue clonada en un vector de expresión celular de mamífero pRK (Shields et al., J. Biol. Chem. 276:659-04 (2000)). La VH amplificada se introdujo en un vector de expresión celular de mamífero pRK. La secuencia de polinucleótidos en las inserciones se determinó mediante los métodos de secuenciación habituales. Las secuencias de las cadenas ligera y pesada de 4F11 (ID. SEC. N°s.: 1 y 2, respectivamente) y las cadenas ligeras y pesadas de 10G9 (ID. SEC. N°s.: 3 y 4, respectivamente) se muestran en las FIGURAS 1 A 4. Prueba de isotipo y afinidad de unión Se determinaron los anticuerpos monoclonales 4F11, 10G9 y 18F7 para ser isotipos IgG2b usando métodos estándar. La afinidad de -unión de los anticuerpos monoclonales para la EGFL7 humana y de ratón se determinó mediante resonancia plasmón de superficie usando Pharmacia BIAcore® 3000 (BIAcore AB, Uppsala, Suecia) a temperatura ambiente (véase, p.ej., Morton et al., Meth. Enzymol. 295:268-94 (1998) ) . Los anticuerpos anti-EGFL7 fueron inmovilizados ante el chip sensor (CM5) a través de grupos amino primarios. La matriz superficial del chip sensor carboximetilado fue activada mediante una inyección de 20 µ? de una mezcla de N-hidroxisuccinimida 0,025 M y N-etil-N' (dimetilaminopropil ) carbodiimida 0,1 M a 5 µ?/min. Se inyectaron 5-10 µ? de solución 10 µ?/?t?? de proteínas EGFL7 de recombinante humano o de ratón en 10 mM de acetato de sodio, pH 4,5, a 5 µ?/min. Después del emparejamiento, los sitios del chip que estaban desocupados fueron bloqueados mediante una inyección de 20 µ? de etanolamina 1 , pH 8.5. El tampón fue PBS conteniendo polisorbato 20 al 0,05%. Para las mediciones cinéticas, se inyectó en el tampón el doble de diluciones seriadas de EGFL7 marcada poli-His en el flujo celular durante 3 minutos a un caudal de 30 µ?/min y se permitió a la EGFL7 marcada poli-His unida que se disociase durante 20 minutos. La superficie de unión se regeneró inyectando 20 µ? de 10 mM glicina*HCl (pH 1,5) . El flujo celular uno, que se activó pero no tuvo inmovilizado el anticuerpo, se usó como célula de referencia. No hubo ninguna unión no especifica significativa de la EGFL7 marcada poli-His al flujo celular uno. Para calcular la afinidad de unión aparente se analizaron los datos empleando un modelo de unión 1:1 con utilización de encaje global. Las constantes de las tasas de asociación y disociación se ajustaron simultáneamente (programa BIAevaluation) . Los resultados de estos experimentos usando stocks de anticuerpos monoclonales NaCl 50 mM Tris / 125 mM se muestran en la Tabla 2. Tabla 2. KD de anticuerpos monoclonales para la EGFL7 humana y de ratón Determinación del epitopo de la EGFL7 reconocido por los anticuerpos monoclonales Determinamos el epítopo reconocido por los anticuerpos monoclonales y primero mapeamos la región de EGFL7 que se unió a cada uno de los anticuerpos monoclonales. Fueron transfectadas 293 células con vectores de expresión comprendiendo formas de longitud completa o truncada de la proteina EGFL7 como se muestra en la FIG. 5. Después fueron ensayados Western blots de Usados celulares de las células transfectadas con anticuerpos monoclonales 4F11, 10G9 y 18F7. Observamos que cada uno de los anticuerpos monoclonales se unía a la porción EMI de la EGLF . Para estrechar el epitopo especifico reconocido por cada anticuerpo monoclonal, sintetizamos los polipéptidos superpuestos que abarcan una porción del dominio EMI y los sometimos a ensayo a fin de determinar su capacidad para competir con la EGFL7 de longitud completa para unirse a los anticuerpos monoclonales. Por ejemplo, las secuencias de los polipéptidos usados por el anticuerpo monoclonal 4F11 fueron las siguientes: pl RSPGLAPARPRYA (ID. SEC. N° 27) p2 RPRYACCPGWKRT (ID.

SEC. N° 28) p3 GWKRTSGLPGACG (ID. SEC. N° 29) Mezclamos el anticuerpo monoclonal 4F11 con la proteina EGFL7 y un exceso molar de 10 veces de cada uno de los polipéptidos pl, p2 y p3, inmunoprecipitando los complejos resultantes y visual i zándolos mediante SDS-PAGE. Para el anticuerpo monoclonal 4F11, observamos que sólo p2 competía con la EGFL7 de longitud completa para unirse al anticuerpo monoclonal 4F11. Los resultados indican que el anticuerpo monoclonal 4F11 reconoce un epítopo de la EGFL7 que comprende la secuencia CCP. Realizamos experimentos similares con los otros dos anticuerpos monoclonales usando polipéptidos con las siguientes secuencias: p4 LTTCDGHRACSTY (ID. SEC. N° 30) P5 RACSTYRTIYRTA (ID.

SEC. N° 31) ?ß RTAYRRSPGVTPA (ID. SEC. N° 32) Determinamos que los anticuerpos monoclonales 10G9 y 18F7 reconocen a un epítopo que comprende la secuencia RTIY (ID. SEC. N° 33) .

EJEMPLO 2. Los anticuerpos monoclonales anti-EGFL7 inhiben el crecimiento tumoral en vivo En este ejemplo, se sometió a prueba a los anticuerpos monoclonales anti-EGFL7 a fin de comprobar su capacidad para inhibir el crecimiento tumoral en vivo en varios modelos. Primero probamos los anticuerpos monoclonales en PBS en el modelo Colo205 (cáncer colorrectal humano) y el modelo A673 (modelo de rabdomiosarcoma humano) . No observamos ningún efecto en estos modelos con los anticuerpos monoclonales en PBS como agentes únicos. Después probamos los anticuerpos monoclonales solos y/o en combinación con un anticuerpo anti-VEGF, B20.4.1 (descrito en el documento WO 2005/012359) . Probamos los anticuerpos en tres modelos: un modelo de cáncer de mama humano Her2 ("modelo Fo5"), un modelo de cáncer de pulmón humano (NSCLC) ("H1299") y otro modelo de cáncer de mama humano ("MDA-MB231") . Estos modelos de tumores están bien determinados y descritos en, p.ej. Lee et al., Clin Cáncer Res. 11(16) :6065-74 (2005); Cameron et al., Cáncer Cell Int.5:23 (2005) ; Finkle et al., Clinical Cáncer Res. 10:2499-251(2004) . Cada animal fue tratado con el anticuerpo monoclonal anti-Artemisa (control) ; B20.4 solo; 18F7 solo; o B20.4 más 4F11, 10G9 ó 18F7. En síntesis, para el modelo H1299 a ratones nu/nu hembra HRLN se les inyectó 1 x 107 H1299 de células tumorales subcutáneamente en el costado; y para el modelo MDA-MB231 a ratones nu/nu hembra HRLN se les inyectó 5 x 106 MDA-MB231 de células tumorales subcutáneamente en el costado. En cada modelo, los tratamientos con anticuerpos comenzaron cuando el tamaño medio del tumor alcanzó los 100 mm3 (correspondiente al día 0 en las FIGS. 6-9) . El anticuerpo monoclonal anti-Artemisa y B20.4 se administraron en 10 mg/kg, una vez por semana, y 4F11, 10G9 y 18F7 se administraron en 10 mg/kg, dos veces por semana (identificado con flechas debajo del eje "x" en las FIGS . 6, 8 y 9) . No observamos ningún efecto en el modelo Fo5. Observamos efectos significativos de inhibición del tumor en los otros dos modelos. Como se muestra en las FIGS. 6-7, en el modelo H1299 el anticuerpo monoclonal 4F11 en combinación con B20.4.1 fue significativamente más eficaz que el control o B20.4.1 solo. Como se muestra en la FIG. 8, en el modelo DA-MB231 tanto el anticuerpo monoclonal 4F11 como el 10G9 en combinación con B20.4.1 fueron más eficaces que el control o B20.4.1 solo. Como se muestra en la FIG. 9, en el modelo MDA-MB231 el anticuerpo monoclonal 18F7 solo fue más eficaz que el control y en combinación con B20.4.1 fue significativamente más eficaz que el anticuerpo monoclonal 18F7 o B20.4.1 solo. Curiosamente, observamos que el tratamiento con el anticuerpo monoclonal 4F11 en el modelo H1299 impide la recuperación vascular total después de interrumpir la terapia anti-VEGF (B20.4.1) . Cuando se compararon las pautas vasculares tumorales entre los tumores tratados con B20.4.1 solo y los tratados con B20.4.1 y 4F11, después de interrumpir el tratamiento observamos un retraso significativo en la revascularización del tumor. Estos resultados constituyen un sólido indicio de que la terapia con anti-EGFL7 puede ofrecer eficacia añadida, o incluso sinérgica, cuando se combina con un tratamiento anti-VEGF. También usamos otros modelos tumorales disponibles en la especialidad para someter a prueba las actividades antitumorales de los anticuerpos anti-EGFL7. Entre ellos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos: LS174T (colon), BXPC3 (próstata), HCT116 (Colon) , MV-522 (NSCLC) , SKMES (NSCLC) , Colon26 (Colon), MDA-MB231 (mama) , MCF7 (mama), H1299 (NSCLC), SW620 (Colon), LL (pulmón), Fo5 (mama), 4T1 (mama), HT29 (Colon), SW480 (Colon), 786-0 (Renal) .

En la American Type Culture Collection®, PO Box 1549, Manassas, VA, 20108, USA (ATCC®) se ha depositado el a siguiente hibridoma: Lineas celulares Registro ATCC® Nc Fecha depósito muMAb ant Í-EGFL7 4F11.1.8 PTA-7343 de febrero de 2006 muMAb ant Í-EGFL 10G9.1.6 PTA-7344 de febrero de 2006 muMAb ant i -EGFL7 18F7.1.8 PTA-7345 de febrero de 2006 Estos depósitos se realizaron de conformidad con los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento internacional del depósito de microorganismos a los fines del procedimiento en materia de patentes y el Reglamento del mismo (Tratado de Budapest) . Esto asegura el mantenimiento de un depósito viable durante 30 años a partir de la fecha de depósito. La ATCC pondrá a disposición estas lineas celulares según los términos del Tratado de Budapest y sujeto al acuerdo entre Genentech, Inc. y ATCC, que garantiza la disponibilidad permanente e ilimitada al público de las lineas celulares del depósito una vez concedida la patente de EE.UU. pertinente o una vez que se haga pública cualquier solicitud de patente de EE.UU. o extranjera, lo que ocurra primero, y asegura la disponibilidad de las lineas celulares a la persona que determine el Comisionado de Patentes y Marcas Registradas de EE.UU. para que tenga derecho a las mismas, en función del articulo 122 del Titulo 35 del Código de EE.UU. (35 USC § 122) y las normas del Comisionado de conformidad con lo anterior (incluyendo el articulo 1.14 del Titulo 37 del Código de Normas Federales (37 CFR § 1.14) , con especial referencia a 886 OG 638) . El beneficiario de la presente solicitud ha aceptado que en caso de que las lineas celulares depositadas se pierdan o resulten destruidas cuando se cultiven en las condiciones adecuadas, serán inmediatamente sustituidas previa notificación con especímenes de la misma línea celular. La disponibilidad de las líneas celulares depositadas no debe interpretarse como una licencia para practicar la invención en contravención de los derechos otorgados por la autoridad de cualquier gobierno, de acuerdo con sus leyes de patentes.

Aunque la anterior invención se ha descrito en detalle a modo de ejemplo a efectos de claridad y comprensión, las descripciones y ejemplos no se deben interpretar de forma que limiten el ámbito de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un anticuerpo producido por un hibridoma seleccionado del grupo compuesto por: muMAb anti-EGFL7 4F11.1.8, muMAb antÍ-EGFL7 10G9.1.6 y muMAb anti-EGFL7 18F7.1.8.
2. Un anticuerpo anti-EGFL7 que comprende una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) seleccionadas a partir del grupo compuesto por: (a) 4F11 CDR-L1 secuencia KASQSVDYDGDSYMS (ID. SEC. N° 5); (b) 4F11 CDR-L2 secuencia GASNLES (ID. SEC. N° 6); (c) 4F11 CDR-L3 secuencia QQNNEDPYT (ID. SEC. N° 7); (d) 4F11 CDR-H1 secuencia TYG S (ID. SEC. N° 8); (e) 4F11 CDR-H2 secuencia WINTHSGVPTYADDFKG (ID. SEC. N° 9); y (f) 4F11 CDR-H3 secuencia LGSSA (ID. SEC. N° 10).
3. El anticuerpo anti-EGFL7 de la reivindicación 2, donde la cadena ligera de dichos anticuerpos comprende al menos una, dos o tres de las secuencias de las CDR seleccionadas de: KASQSVDYDGDSYMS (ID. SEC. N° 5), GASNLES (ID. SEC. N° 6) y QQNNEDPYT (ID. SEC. N° 7) .
4. El anticuerpo anti-EGFL7 de la reivindicación 2, donde la cadena pesada de dichos anticuerpos comprende al menos una, dos o tres de las secuencias de las CDR seleccionadas de: TYGMS (ID. SEC. N° 8), WINTHSGVPTYADDFKG (ID. SEC. N° 9) y LGSSA (ID. SEC. N° 10) .
5. El anticuerpo anti-EGFL7 de la reivindicación 2, donde la cadena ligera de dichos anticuerpos comprende al menos una, dos o tres de las secuencias de las CDR seleccionadas de: KASQSVDYDGDSYMS (ID. SEC. N° 5), GASNLES (ID. SEC. N° 6) y QQNNEDPYT (ID. SEC. N° 7); y donde la cadena pesada de dichos anticuerpos comprende al menos una, dos o tres de las secuencias de las CDR seleccionadas de: TYGMS (ID. SEC. N° 8) , WINTHSGVPTYADDFKG (ID. SEC. N° 9) y LGSSA (ID. SEC. N° 10) .
6. El anticuerpo anti-EGFL7 de la reivindicación 2, donde la cadena ligera de dicho anticuerpo comprende la secuencia: DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMSWYQQKPGQPPKLLIYGASNLESG IPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQNNEDPYTFGGGTKVEIKR (ID. SEC. N° 1) .
7. El anticuerpo anti-EGFL7 de la reivindicación 2, donde la cadena pesada de dicho anticuerpo comprende la secuencia: QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGHTFTTYGMS VKQAPGKGLKWMGWINTHSGVPTYA DDFKGRFAFSLETSASTAHLQINNLKNEDTATYFCARLGSSAVDYWGQGTTVTVSS (ID. SEC. N° 2) .
8. Un anticuerpo anti-EGFL7 que comprende una o más regiones determinantes de la complementa riedad (CDR) seleccionadas a partir del grupo compuesto por: (a) 10G9 CDR-L1 secuencia RSSQSLVHTNGITYLH (ID. SEC. N° 11) ; (b) 10G9 CDR-L2 secuencia KVSNRFS (ID. SEC. N° 12); (c) 10G9 CDR-L3 secuencia SQSTHVPLT (ID. SEC. N° 13) ; (d) 10G9 CDR-H1 secuencia DYYMNSDYYMN (ID. SEC. N° 14) ; (e) 10G9 CDR-H2 secuencia DINPK GGTTYNQKFKG (ID. SEC. N° 15); y (f) 10G9 CDR-H3 secuencia ALGVFDY (ID. SEC. N° 16) .
9. El anticuerpo anti-EGFL7 de la reivindicación 8, donde la cadena ligera de dichos anticuerpos comprende al menos una, dos o tres de las secuencias de las CDR seleccionadas de: RSSQSLVHTNGITYLH (ID. SEC. N° 11), KVSNRFS (ID. SEC. N° 12) y SQSTHVPLT (ID. SEC. N° 13) .
10. El anticuerpo anti-EGFL7 de la reivindicación 8, donde la cadena pesada de dichos anticuerpos comprende al menos una, dos o tres de las secuencias de las CDR seleccionadas de: DYY NSDYYMN (ID. SEC. N° 14) , DINPKNGGTTYNQKFKG (ID. SEC. N° 15) y ALGVFDY (ID. SEC. N° 16) .
11. El anticuerpo anti-EGFL7 de la reivindicación 8, donde la cadena ligera de dichos anticuerpos comprende al menos una, dos o tres de las secuencias de las CDR seleccionadas de: RSSQSLVHTNGITYLH (ID. SEC. N° 11) , KVSNRFS (ID. SEC. N° 12) y SQSTHVPLT (ID. SEC. N° 13) ; y donde la cadena pesada de dichos anticuerpos comprende al menos una, dos o tres de las secuencias de las CDR seleccionadas de: DYYMNSDYYMN (ID. SEC. N° 14), DINPKNGGTTYNQKFKG (ID. SEC. N° 15) y ALGVFDY (ID. SEC. N° 16) .
12. El anticuerpo anti-EGFL7 de la reivindicación 8, donde la cadena ligera de dicho anticuerpo comprende la secuencia: DIVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHTNGITYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPLTFGAGTKVEIKR (ID. SEC. N° 3) .
13. El anticuerpo anti-EGFL7 de la reivindicación 8, donde la cadena pesada de dicho anticuerpo comprende la secuencia: EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFSDYYMNSDYYMNWVKQSHGKSLE IGDINPKN GGTTYNQKFKGKATLTVDKSSSTAY ELRSLTSEDSAVYYCAREADYDPIYYAMDYWGQGT TLTVSA (ID. SEC. N° 4) .
14. Un anticuerpo anti-EGFL7 que se une específicamente a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo compuesto por. CCP, RTIY (ID. SEC. N° 33) .
15. Un anticuerpo aislado que se une al mismo epítopo en la EGFL7 humana que el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.
16. Un anticuerpo aislado que compite para unirse a EGFL7 con cualquiera de los anticuerpos mencionados en las reivindicaciones i a 14.
17. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
18. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, donde el anticuerpo se selecciona a partir del grupo compuesto por un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo con maduración de afinidad, un anticuerpo humano y un anticuerpo biespecifico .
19. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo.
20. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-EGFL7 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.
21. La composición farmacéutica de la reivindicación 20, comprendiendo además un agente antiangiogénico .
22. La composición farmacéutica de la reivindicación 21, donde el agente antiangiogénico se selecciona a partir del grupo que comprende a bevacizumab y ranibizumab.
23. Un polinucleótido que codifique un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.
24. Un vector que comprenda el polinucleótido de la reivindicación 23.
25. El vector de la reivindicación 24, donde el vector es un vector de expresión.
26. Una célula huésped que comprende un vector de la reivindicación 24 ó 25.
27. La célula huésped de la reivindicación 26, donde la célula huésped es procariótica .
28. La célula huésped de la reivindicación 26, donde la célula huésped es eucariótica.
29. La célula huésped de la reivindicación 26, donde la célula huésped es de mamífero.
30. Un método para elaborar un anticuerpo anti-EGFL7, que comprenda (a) la expresión de un vector de la reivindicación 25 en una célula huésped apta y (b) la recuperación del anticuerpo.
31. El método de la reivindicación 30, donde la célula huésped es procariótica.
32. El método de la reivindicación 30, donde la célula huésped es eucariótica.
33. Un método para reducir o inhibir la angiogénesis en un sujeto que tenga un estado patológico asociado a la angiogénesis, que comprende la administración al sujeto de una cantidad eficaz del anticuerpo anti-EGFL7 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 o la composición farmacéutica de la reivindicación 20.
34. El método de la reivindicación 33, en el que el estado patológico es un neoplasma.
35. El método de la reivindicación 34, donde el neoplasma es un carcinoma.
36. El método de la reivindicación 33, en el que el estado patológico está asociado con los ojos.
37. El método de la reivindicación 36, donde el estado patológico es una enfermedad neovascular infraocular.
38. El método de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 35, que comprende la administración al sujeto de un agente antiangiogénico.
39. El método de la reivindicación 38, donde el agente antiangiogénico es un antagonista del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) .
40. El método de la reivindicación 39, donde el antagonista es un anticuerpo anti-VEGF.
41. El método de la reivindicación 40, donde el anticuerpo anti-VEGF es bevacizumab.
42. El método de cualquiera de las reivindicaciones 36 ó 37 que comprende además la administración al sujeto de un agente antiangiogénico .
43. El método de la reivindicación 42, donde el agente antiangiogénico es un antagonista del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) .
44. El método de la reivindicación 43, donde el antagonista es un anticuerpo anti-VEGF.
45. El método de la reivindicación 44, donde el anticuerpo anti-VEGF es ranibizumab.
46. El método de cualquiera de las reivindicaciones 38 a 45, donde el agente ant iangiogénico se administra antes o inmediatamente después de la administración del anticuerpo anti-EGFL7.
47. El método de cualquiera de las reivindicaciones 38 a 45, donde el agente ant iangiogénico se administra simultáneamente con el anticuerpo anti-EGFL7.
48. Un método para aumentar la eficacia de un agente antiangiogénico en un sujeto que tenga un estado patológico asociado a la angiogénesis , que comprende la administración al sujeto del anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 o la composición farmacéutica de las reivindicaciones 20 ó 21.
49. El método de la reivindicación 38, en el que el estado patológico es un neoplasma.
50. El método de la reivindicación 39, donde el neoplasma es un carcinoma.
51. El método de cualquiera de las reivindicaciones 48 a 50, donde el agente antiantiogénico es bevacizumab.
52. El método de cualquiera de las reivindicaciones 48 a 51, que comprende además la administración de un agente quimioterapéutico .
53. El método de la reivindicación 48, en el que el estado patológico está asociado con los ojos.
54. El método de la reivindicación 53, donde el estado patológico es una enfermedad neovascular intraocular.
55. El método de las reivindicaciones 53 ó 54, donde el agente antiangiogénico es ranibizumab.
56. El método de cualquiera de las reivindicaciones 53 a 55, que comprende además la administración de un corticosteroide .
57. El método de cualquiera de las reivindicaciones 53 a 55, que comprende además la administración de una terapia fotodinámica .