BRPI0707047A2

BRPI0707047A2 - anticorpo produzido por hibridoma, anticorpos isolados, composição farmacêutica polinucleotìdeo, vetor, célula hospedeira, método para produção de um anticorpo, método para reduzir ou inibir a angiogênese e método pata aumentar a eficácia de um agente anti-angiogênico

Info

Publication number: BRPI0707047A2
Application number: BRPI0707047-0A
Authority: BR
Inventors: Weilan Ye; Maike Schmidt; Jo-Anne Hongo; Yan Wu
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2006-03-16
Filing date: 2007-03-16
Publication date: 2011-04-12
Also published as: AU2007226522A1; US20130129735A1; US20110200602A1; NO20084320L; IL193514A0; ECSP088743A; IL232011A0; KR101038633B1; US8398976B2; WO2007106915A2; AU2007226522A8; EP1994056A2; MX2008011663A; RU2415870C2; KR20080099328A; EP1994056B1; RU2008140947A; TW201446798A; CA2646513A1; JP2012036205A

Abstract

ANTICORPO PRODUZIDO POR HIBRIDOMA, ANTICORPOS ISOLADOS, COMPOSIçãO FARMACêUTICA, POLINUCLEOTIDEO, VETOR, CéLULA HOSPEDEIRA, MéTODO PARA PRODUçãO DE UM ANTICORPO, MéTODO PARA REDUZIR OU INIBIR A ANGIOGêNESE E MéTODO PARA AUMENTAR A EFICáCIA DE UM AGENTE ANTI-ANGIOGéNICO. RESUMO; A invenção fornece anticorpos anti-EGFL7, composições que compreendem o mesmo e métodos para uso destes anticorpos.

Description

"ANTICORPO PRODUZIDO POR HIBRIDOMA, ANTICORPOS ISOLADOS,COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, POLINUCLEOTÍDEO, VETOR, CÉLULA

HOSPEDEIRA, MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO,MÉTODO PARA REDUZIR OU INIBIR A ANGIOGÊNESE E MÉTODO PARAAUMENTAR A EFICÁCIA DE UM AGENTE ANTI-ANGIOGÊNICO"

Campo Da Invenção

A presente invenção refere-se, de modo geral, às composições emétodos que são úteis para modular o desenvolvimento vascular.Especificamente, a presente invenção refere-se aos anticorpos que se ligam aopolipeptídeo do Domínio 7 Similar ao Fator de Crescimento Epidermal(EGFL7). A presente invenção também se refere ao diagnóstico e tratamentodas condições e doenças associadas à angiogênese.

Antecedentes Da Invenção

O desenvolvimento de um suprimento vascular é umanecessidade fundamental para muitos processos fisiológicos e patológicos. Ocrescimento ativo dos tecidos, como embriões e tumores, exige suprimentoadequado de sangue. Eles satisfazem esta necessidade produzindo fatorespró-angiogênicos, os quais promovem a formação de novos vasos sangüíneosvia um processo chamado angiogênese. A formação de tubo vascular é umevento complexo, porém biologicamente ordenado, envolvendo todas oumuitas das seguintes etapas: a) células endoteliais (ECs) se proliferam a partirde ECs existentes ou diferenciadas a partir de células progenitoras; b) ECsmigram e se juntam para formar estruturas similares a um cordão; c) oscordões vasculares então se submetem à tubulogênese para formar vasos comum lúmen central d) os cordões ou vasos existentes enviam brotos para formarvasos secundários; e) o plexo vascular primitivo se submete também àreconstrução e transformação; e f) células periendoteliais são recrutadas pararevestir os tubos endoteliais, fornecendo manutenção e funções modulatóriaspara os vasos; tais células incluindo, pericitos para capilares pequenos, célulasmusculares lisas para vasos maiores e células do miocárdio no coração.Hanahan, Science 27 7:48-50 (1997); Hogan & Kolodziej, Nat. Rev. Genet.3:513-23 (2002); Lubarsky & Krasnow, Cell 112:19-28 (2003).

É agora bem estabelecido que a angiogênese esteja envolvida napatogênese de diversas disfunções. Isto inclui tumores sólidos e metástases,arterioesclerose, fibroplasia retrolental, hemangiomas, inflamação crônica,doenças neovasculares intra-oculares como retinopatias proliferativas, porexemplo, retinopatia diabética, degeneração macular relacionada à idade(AMD), glaucoma neovascular, rejeição imune de tecido da córneatransplantado e outros tecidos, artrite reumatóide e psoríase. Folkman et ai, J.Biol. Chem., 267:10931-34 (1992); Klagsbrun et ai, Annu. Rev. Physiol.53:217-39 (1991); e Garner A., "Vascular diseases", Em: Pathobiology ofOcular Disease. A Dynamic Approach, Garner A., Klintworth GK1 eds., 2aEdição (Mareei Dekker, NY, 1994), páginas 1625-1710.

No caso de crescimento tumoral, a angiogênese parece sercrucial para a transição de hiperplasia para neoplasia, e para fornecer alimentopara o crescimento e metástase do tumor. Folkman et al., Nature 339:58(1989). A neovascularização permite que as células tumorais adquiram umavantagem no crescimento e autonomia proliferativa, comparado às célulasnormais. Um tumor, usualmente, inicia como uma simples aberração celularque pode proliferar somente a um tamanho de poucos milímetros cúbicos,devido à distância dos leitos capilares disponíveis e pode ficar "dormente" semcrescimento e disseminação adicional por um longo período de tempo.Algumas células tumorais mudam então para o fenótipo angiogênico para ativaras células endoteliais, que se proliferam e amadurecem no interior dos vasoscapilares sangüíneos. Esses novos vasos sangüíneos formados não somentepermitem o crescimento continuado do tumor primário, como também adisseminação e recolonização de células tumorais metastáticas.Consequentemente, foi observada uma correlação entre a densidade dosmicrovasos nas seções de tumor e a sobrevivência dos pacientes com câncerde mama, bem como em diversos outros tumores. Weidner et al., N. Engl. J.

Med. 324:1-6 (1991); Horak et al., Lancet 340:1120-24 (1992); Macchiarini etal., Lancet 340:145-46 (1992). O mecanismo preciso que controla a mudançapara angiogênese não é bem conhecido, mas se acredita que aneovascularização da massa tumoral resulte do equilíbrio da rede de umagrande quantidade de estimuladores e inibidores da angiogênese (Folkman,1995, Nat Med 1 (1):27-31 (1995)).

O processo de desenvolvimento vascular é estreitamenteregulado. Até hoje, um número significante de moléculas, a maioria de fatoressecretados produzidos por células adjacentes, mostraram regular adiferenciação da EC, proliferação, migração e união das estruturas similares acordões. Por exemplo, o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) foiidentificado como o fator chave envolvido no estímulo da angiogênese e naindução da permeabilidade vascular. Ferrara et al., Endocr. Rev. 18:4-25(1997). A descoberta de que a perda de até mesmo um único alelo do VEGFresulta na Ietalidade embrionária, aponta para um papel insubstituível,desempenhado por este fator no desenvolvimento e diferenciação do sistemavascular. Além disso, o VEGF mostrou ser um mediador chave naneovascularização associada com tumores e disfunções intra-oculares.Ferrara et al., Endocr. Rev., acima. O mRNA do VEGF é superexpresso pelamaioria dos tumores humanos examinados. Berkman et al., J. Clin. Invest.91:153-59 (1993); Brown et al., Human Pathol 26:86-91 (1995); Brown et al.,Câncer Res. 53:4727-35 (1993); Mattern et al., Brit. J. Câncer 73:931-34(1996); Dvorak et al., Am. J. PathoL 146:1029-39 (1995).

Além disso, os níveis de concentração do VEGF nos fluidosoculares estão altamente correlacionados com a presença da proliferação ativados vasos sangüíneos em pacientes com diabetes e outras retinopatiasrelacionadas à isquemia. Aiello et al., N. Engl. J. Med. 331:1480-87 (1994).Além disso, estudos demonstraram a localização do VEGF nas membranasneovasculares coroidais em pacientes afetados por AMD. Lopez et al., Invest.Ophthalmol. Vis. Sei. 37:855-68 (1996).

Anticorpos que neutralizam o anti-VEGF suprimem o crescimentode uma variedade de linhagens celulares tumorais humanas em camundongosnus (Kim et al., Nature 362:841-44 (1993); Warren et al., J. Clin. Invest.95:1789-97 (1995); Borgstrõm et al., CancerRes. 56:4032-39 (1996); Melnyk etal., Câncer Res. 56:921-24 (1996)) e também inibem a angiogênese intra-ocular em modelos de disfunções isquêmicas da retina (Adamis et al., Arch.Ophthalmol. 114:66-71 (1996)). Então, anticorpos monoclonais anti-VEGF ououtros inibidores da ação do VEGF são candidatos promissores para otratamento de tumores e várias disfunções neovasculares intra-oculares. Taisanticorpos estão descritos, por exemplo, na patente EP 817.648, publicada em14 de janeiro de 1998; e nos documentos WO 98/45331 e WO 98/45332,ambos publicados em 15 de outubro de 1998. Um dos anticorpos anti-VEGF,bevacizumab, foi aprovado pelo FDA para uso em combinação com um regimede quimioterapia para tratar câncer colorretal metastático (CRC). Ebevacizumab está sendo investigado em muitos testes clínicos em andamentopara tratar vários indícios de câncer.

É reconhecido que a matriz extracelular (ECM) desempenha umpapel importante durante o processo de angiogênese. Madri, TranspiImmunol. 5:179-83 (1997). As ECs são cercadas pela ECM provisória durantesua migração e aderem às novas membranas basais vasculares, sintetizadasapós a formação do lúmen. Além disso, para fornecer uma estrutura durante amorfogênese capilar, a ECM tem mostrado exercer um complexo controle localnas funções das ECs. Por exemplo, a ECM é capaz de regular adisponibilidade de mediadores angiogênicos solúveis para as ECs e especificara natureza e o tipo de interação com a integrina e moléculas de adesão celular.Foi sugerido que a sobrevivência da EC é regulada pela cooperação entre osreceptores do fator de crescimento e integrinas, que são um após o outro,dirigidos pela composição da ECM local. Stupack & Cheresh, Oncogene22:9022-29 (2003).

Apesar dos diversos avanços no campo da angiogênese, algumasdas etapas durante a formação dos tubos vasculares são ainda poucodefinidas. Particularmente, pouco é conhecido sobre como a tubulogênese éregulada, como os cordões vasculares progridem para se tornarem tubos, equais fatores regulam esta transição. Em vista do papel da angiogênese emmuitas doenças e disfunções, é desejável que se tenha uma forma para reduzirou inibir um ou mais efeitos biológicos que causam estes processos. Étambém desejável que se tenha uma forma para avaliar a presença depolipeptídeos patogênicos nas condições normais e da doença, eespecialmente câncer. Há uma necessidade para composições e métodos quepossam aumentar a eficácia das terapias anti-angiogênese existentes.

Descrição Resumida Da Invenção

A invenção está, em parte, baseada na identificação de anticorposcontra o EGFL7 com propriedades que indicam que eles sejam particularmentevantajosos para terapia.

Em um aspecto, a invenção fornece anticorpos produzidos peloshibridomas anti-EGFL7 mumab 4F11.1.8, anti-EGFL7 mumab 10G9.1.6 e anti-EGFL7 mumab 18F7.1.8.

Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-EGFL7 quecompreende uma ou mais regiões determinadas por complementaridade(CDRs) selecionadas a partir do grupo que consiste de: (a) 4F11 CDR-L1seqüência KASQSVDYDGDSYMS (SEQ ID NO: 5); (b) 4F11 CDR-L2seqüência GASNLES (SEQ ID NO: 6); (c) 4F11 CDR-L3 seqüênciaQQNNEDPYT (SEQ ID NO: 7); (d) 4F11 CDR-H1 seqüência TYGMS (SEQ IDNO: 8); (e) 4F11 CDR-H2 seqüência WINTHSGVPTYADDFKG (SEQ ID NO:9); e (f) 4F11 CDR-H3 seqüência LGSSA (SEQ ID NO: 10). Em algumasrealizações, a cadeia leve de dito anticorpo compreende pelo menos uma, pelomenos duas ou todas as três seqüências da CDR selecionadas a partir de:KASQSVDYDGDSYMS (SEQ ID NO: 5), GASNLES (SEQ ID NO: 6), eQQNNEDPYT (SEQ ID NO: 7). Em algumas realizações, a cadeia pesada dedito anticorpo compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as trêsseqüências da CDR selecionadas a partir de: TYGMS (SEQ ID NO: 8),WINTHSGVPTYADDFKG (SEQ ID NO: 9), e LGSSA (SEQ ID NO: 10). Emalgumas realizações, a cadeia leve de dito anticorpo compreende pelo menosuma, pelo menos duas ou todas as três seqüências da CDR selecionadas apartir de: KASQSVDYDGDSYMS (SEQ ID NO: 5), GASNLES (SEQ ID NO: 6),e QQNNEDPYT (SEQ ID NO: 7); e a cadeia pesada de dito anticorpocompreende pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três seqüênciasda CDR selecionadas a partir de: TYGMS (SEQ ID NO: 8),WINTHSGVPTYADDFKG (SEQ ID NO: 9), e LGSSA (SEQ ID NO: 10). Emalgumas realizações, a cadeia leve do anticorpo compreende a seqüência.

DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMSWYQQKPGQPPKLLIYGASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQNNEDPYTFGGG

TKVEIKR (SEQ ID NO: 1). Em algumas realizações, a cadeia pesada doanticorpo compreende a seqüência:

QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGHTFTTYGMSWVKQAPGKGLKWMGWINTHSGVPTYADDFKGRFAFSLETSASTAHLQINNLKNEDTATYFCARLGSSAVDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 2).

Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-EGFL7 quecompreende uma ou mais regiões determinadas por complementaridade(CDRs) selecionadas a partir do grupo que consiste de: (a) 10G9 CDR-L1seqüência RSSQSLVHTNGITYLH (SEQ ID NO: 11); (b) 10G9 CDR-L2seqüência KVSNRFS (SEQ ID NO: 12); (c) 10G9 CDR-L3 seqüênciaSQSTHVPLT (SEQ ID NO: 13); (d) 10G9 CDR-H1 seqüência DYYMNSDYYMN(SEQ ID NO: 14); (e) 10G9 CDR-H2 seqüência DINPKNGGTTYNQKFKG (SEQID NO: 15); e (f) 10G9 CDR-H3 seqüência ALGVFDY (SEQ ID NO: 16). Emalgumas realizações, a cadeia leve de dito anticorpo compreende pelo menosuma, pelo menos duas ou todas as três seqüências da CDR selecionadas apartir de: RSSQSLVHTNGITYLH (SEQ ID NO: 11), KVSNRFS (SEQ ID NO:12), e SQSTHVPLT (SEQ ID NO: 13). Em algumas realizações, a cadeiapesada de dito anticorpo compreende pelo menos uma, pelo menos duas outodas as três seqüências da CDR selecionadas a partir de: DYYMNSDYYMN(SEQ ID NO: 14), DINPKNGGTTYNQKFKG (SEQ ID NO: 15), e ALGVFDY(SEQ ID NO: 16). Em algumas realizações, a cadeia leve de dito anticorpocompreende pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três seqüênciasda CDR selecionadas a partir de: RSSQSLVHTNGITYLH (SEQ ID NO: 11),KVSNRFS (SEQ ID NO: 12), e SQSTHVPLT (SEQ ID NO: 13); e a cadeiapesada de dito anticorpo compreende pelo menos uma, pelo menos duas outodas as três seqüências da CDR selecionadas a partir de: DYYMNSDYYMN(SEQ ID NO: 14), DINPKNGGTTYNQKFKG (SEQ ID NO: 15), e ALGVFDY(SEQ ID NO: 16). Em algumas realizações, a cadeia leve do anticorpocompreende a seqüência.

DIVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHTNGITYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPLTFGAGTKVEIKR (SEQ ID NO: 3). Em algumas realizações, a cadeia pesada doanticorpo compreende a seqüência:EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFSDYYMNSDYYMNWVKQSHGKSLEWIGDINPKNGGTTYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCAREADYDPIYYAMDYWGQGTTLTVSA (SEQ IDNO: 4).

Em algumas realizações, a invenção fornece anticorpos anti-EGFL7 que se ligam especificamente a um polipeptídeo que compreende umasdas seguintes seqüências de aminoácidos: CCP, TIY e ACS. Em algumasrealizações, a invenção fornece anticorpos isolados que se ligam ao mesmoepitopo no EGFL7 humano, como outros anticorpos da invenção. Em algumasrealizações, a invenção fornece anticorpos isolados que competem comooutros anticorpos da invenção, pela ligação ao EGFL7.

Em algumas realizações, o anticorpo da invenção é um anticorpomonoclonal. Em algumas realizações, o anticorpo da invenção é um anticorpoquimérico, um anticorpo humanizado, um anticorpo de afinidade madura, umanticorpo humano ou um anticorpo biespecífico. Em algumas realizações, oanticorpo é um fragmento de anticorpo.

Em algumas realizações, a invenção fornece composiçõesfarmacêuticas que compreendem um anticorpo anti-EGFL7 da invenção. Emalgumas realizações, a composição farmacêutica também compreende umagente anti-angiogênico. Em algumas realizações, o agente anti-angiogênico ébevacizumab ou ranibizumab.

Em algumas realizações, a invenção fornece um polinucleotídeoque codifica um anticorpo da invenção. Em algumas realizações, a invençãofornece vetores que compreendem estes polinucleotídeos. Em algumasrealizações, os vetores são vetores de expressão. Em algumas realizações, ainvenção fornece células hospedeiras, incluindo células procariontes eeucariontes (incluindo células de mamíferos) que compreendem tais vetores.Em algumas realizações, a invenção fornece um método de produção de umanticorpo anti-EGFL7 que compreende (a) expressar um vetor de expressãoem uma célula hospedeira adequada, e (b) recuperar o anticorpo.

Em algumas realizações, a invenção fornece um método parareduzir ou inibir a angiogênese em um sujeito que tem uma condição patológicaassociada à angiogênese, que compreende administrar ao sujeito umaquantidade efetiva de um anticorpo anti-EGFL7 da invenção ou umacomposição farmacêutica que compreende um anticorpo anti-EGFL7 dainvenção. Em algumas realizações, a condição patológica é um neoplasma,por exemplo, um carcinoma. Em algumas realizações, a condição patológicaestá associada com os olhos, por exemplo, uma doença neovascular intra-ocular. Em algumas realizações, um agente anti-angiogênico é administradoao sujeito em adição a um anticorpo anti-EGFL7 da invenção. Em algumasrealizações, o agente anti-angiogênico é um antagonista do fator decrescimento endotelial vascular (VEGF), por exemplo, um anticorpo anti-VEGF(incluindo bevacizumab e ranibizumab). Em algumas realizações, o agenteanti-angiogênico é administrado antes ou subseqüentemente à administraçãodo anticorpo anti-EGFL7 da invenção. Em algumas realizações, um agenteanti-angiogênico é administrado ao mesmo tempo que o anticorpo anti-EGFL7da invenção.

Em algumas realizações, a invenção fornece um método paraaumentar a eficácia de um agente anti-angiogênico em um sujeito que tem umacondição patológica associada à angiogênese, que compreende administrar aosujeito um anticorpo anti-EGFL7 da invenção ou uma composição farmacêuticaque compreende um antiorpo anti-EGFL7 da invenção. Em algumasrealizações, a condição patológica é um neoplasma, por exemplo, umcarcinoma. Em algumas realizações, a condição patológica está associadacom os olhos, por exemplo, uma doença neovascular intra-ocular. Em algumasrealizações, um agente anti-angiogênico é administrado ao sujeito em adição aum anticorpo anti-EGFL7 da invenção. Em algumas realizações, o agente anti-angiogênico é um antagonista do fator de crescimento endotelial vascular(VEGF)1 por exemplo, um anticorpo anti-VEGF (incluindo bevacizumab eranibizumab). Em algumas realizações, o agente anti-angiogênico éadministrado antes ou subseqüentemente à administração do anticorpo anti-EGFL7. Em algumas realizações, um agente anti-angiogênico é administradoao mesmo tempo que o anticorpo anti-EGFL7 da invenção. Em algumasrealizações, outros tratamentos são também administrados, por exemplo, umaterapia com corticoesteróides ou fotodinâmica.

Breve Descrição Das Figuras

FIGURA 1 mostra a seqüência de aminoácido do domínio variávelda cadeia leve do Mab 4F11 (SEQ ID NO: 1) e do HuKI (SEQ ID NO: 17).

FIGURA 2 mostra a seqüência de aminoácido do domínio variávelda cadeia pesada do Mab 4F11 (SEQ ID NO: 2) e do Hulll (SEQ ID NO: 18).

FIGURA 3 mostra a seqüência de aminoácido do domínio variávelda cadeia leve do Mab 10G9 (SEQ ID NO: 3) e do HuKI (SEQ ID NO: 17).

FIGURA 4 mostra a seqüência de aminoácido do domínio variávelda cadeia pesada do Mab 10G9 (SEQ ID NO: 4) e do Hulll (SEQ ID NO: 18).

FIGURA 5 ilustra os domínios do EGFL7 completo e formasincompletas deste, usado para mapear os sítios de ligação do anticorpo.

FIGURA 6 mostra o volume do tumor em um modelo dexenoenxerto em camundongo transfectado com câncer de pulmão humano invivo (NSCLC; H1299) ao longo do tratamento com anticorpos anti-VEGF e anti-EGFL7 da invenção.

FIGURA 7 mostra a sobrevida em um modelo de xenoenxerto emcamundongo transfectado com câncer de pulmão humano in vivo (NSCLC;H1299) ao longo do tratamento com anticorpos anti-VEGF e anti-EGFL7 dainvenção.

FIGURA 8 mostra o volume do tumor em um modelo dexenoenxerto em camundongo transfectado com câncer de mama humano invivo (MDA-MB231) ao longo do tratamento com anticorpos anti-VEGF e anti-EGFL7 da invenção.

FIGURA 9 mostra o volume do tumor em um modelo dexenoenxerto em camundongo transfectado com câncer de mama humano invivo (MDA-MB231) ao longo do tratamento com o anticorpo anti-VEGF e o anti-EGFL7 Mab 18F7 da invenção.

Descricao Detalhada Das Realizações Preferidas

A invenção no presente pedido fornece anticorpos anti-EGFL7,que são úteis, por exemplo, no tratamento ou prevenção de estados da doençaassociados com a expressão e/ou atividade do EGFL7, como aumento daexpressão e/ou atividade, ou expressão e/ou atividade indesejadas. Emalgumas realizações, os anticorpos da invenção são usados para tratar umtumor, um câncer e/ou uma disfunção proliferativa celular.

Em outro aspecto, os anticorpos EGFL7 da invenção são úteiscomo reagentes para detecção e/ou isolamento do EGFL7, tal detecção doEGFL7 em vários tecido e tipos de células.

A invenção também fornece métodos para produção deanticorpos anti-EGFL7, polinucleotídeos que codificam anticorpos anti-EGFL7 ecélulas que compreendem polinucleotídeos que codificam anticorpos anti-EGFL7.

Tecnicas Gerais

As técnicas e procedimentos descritos ou com referência nopresente pedido são geralmente bem conhecidos e comumente empregadosusando-se metodologia convencional pelos técnicos no assunto, como, porexemplo, as metodologias amplamente utilizadas descritas em Sambrook etal.,Molecular Coning: A Laboratory Manual 3a. edição (2001) Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel1 etal. eds., (2003)); a série METHODSIN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH(M. J. MacPherson1 B. D. Hames e G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow e Lane,eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, e ANIMAL CELL

CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)).

Definições

Um anticorpo "isolado" é aquele que foi identificado e separadoe/ou recuperado a partir de um componente de seu ambiente natural.Componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais quepoderiam interferir no uso diagnóstico ou terapêutico do anticorpo, e podemincluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não proteináceos.Em certas realizações, o polipeptídeo será purificado (1) para mais que 95%por peso de anticorpo como determinado pelo método Lowry, ou mais que 99%por peso, (2) para um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de N-terminal ou seqüência de aminoácido interna pelo uso de um sequenciador decopo giratório, ou (3) para homogeneidade por SDS-PAGE sob condições deredução ou não redução usando-se Coomassie blue ou silver stain. Anticorpoisolado inclui o anticorpo in situ dentro de células recombinantes desde quepelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estejapresente. Normalmente, no entanto, o anticorpo isolado será preparado porpelo menos uma etapa de purificação.

Uma molécula "isolada" de ácido nucléico é uma molécula deácido nucléico, identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácidonucléico contaminante com que ela está geralmente associada na fonte naturalde ácido nucléico do anticorpo. Uma molécula de ácido nucléico isolada édiferente da forma ou configuração na qual é encontrada na natureza.Moléculas de ácido nucléico são então distintas das moléculas de ácidonucléico que existem nas células naturais. No entanto, uma molécula de ácidonucléico isolada inclui uma molécula de ácido nucléico contida nas células quenormalmente expressam o anticorpo onde, por exemplo, a molécula de ácidonucléico está em um local do cromossomo diferente daquele das célulasnaturais.

O termo "numeração do resíduo do domínio variável como emkabat" ou "numeração da posição do aminoácido como em Kabat", e variaçõesdestes, refere-se ao sistema de numeração usado para domínios variáveis dacadeia pesada ou domínios variáveis da cadeia leve da coleção de anticorposem kabat et. al„ Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. PublicHealth Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. Usando-se estesistema de numeração, a seqüência de aminoácido linear atual pode contermenos ou mais aminoácidos que correspondem a um encurtamento ouinserção em uma FR ou CDR do domínio variável. Por exemplo, um domíniovariável da cadeia pesada pode incluir uma única inserção de aminoácido(resíduo 52a de acordo com Kabat) após resíduo 52 deH2 e resíduos inseridos(por exemplo, resíduos 82a, 82b e 82c, etc., de acordo com Kabat) apósresíduo 82 da FR da cadeia pesada. A numeração de resíduos de Kabat podeser determinada por um dado anticorpo pelo alinhamento das regiões dehomologia da seqüência do anticorpo com uma seqüência numerada de Kabat"padrão".

A frase "substancialmente similar" ou "substancialmente amesma", como usado no presente pedido, denota um grau suficientemente altode semelhança entre dois valores numéricos (geralmente aquele associadocom um anticorpo da invenção e o outro associado com um anticorporeferência/de comparação), de modo que um técnico no assunto consideraria adiferença pequena entre os dois valores ou sem significância biológica e/ouestatística dentro do contexto da característica biológica medida por ditosvalores (por exemplo, valores KD). A diferença entre ditos dois valores égeralmente menor que cerca de 50%, cerca de 40%, cerca de 30%, cerca de20%, ou cerca de 10%, como uma função do valor para o anticorporeferência/de comparação.

"Afinidade de ligação" geralmente refere-se à força da soma totalde interações não covalentes entre um único sítio de ligação de uma molécula(por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, umantígeno). A menos que indicado de outra forma, como usado no presentepedido, "afinidade de ligação" refere-se à afinidade de ligação intrínseca quereflete uma interação 1:1 entre membros de um par de ligação (por exemplo,anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X para seu parceiro Ypode ser geralmente representada pela constante de dissociação (Kd). Aafinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos na técnica,incluindo esses descritos no presente pedido. Anticorpos de baixa afinidadegeralmente se ligam lentamente aos antígenos e tendem a se dissociarfacilmente, enquanto que anticorpos de alta afinidade geralmente se ligam maisrapidamente aos antígenos e tendem a permanecer ligados por mais tempo.Vários métodos para medir afinidade de ligação são conhecidos na técnica equalquer um destes pode ser usado para os propósitos da presente invenção.Realizações ilustrativas específicas estão descritas a seguir.

Em uma realização, o "Kd" ou "valor Kd" de acordo com estainvenção é medido por um teste de ligação de antígeno radiomarcado (RIA),realizado com a versão Fab de um anticorpo de interesse e seu antígeno comodescrito pelo teste a seguir, que mede afinidade de ligação da solução de Fabspara o antígeno, pelo equilíbrio de Fab com uma concentração mínima deantígeno marcado com I125 na presença de uma série de titulações de antígenonão marcado, capturando então o antígeno ligado com uma placa revestidacom anticorpo anti-Fab (Chen, et al„ (1999) J. Mol Biol 293:865-81 (1999)).Para estabelecer as condições para o teste, placas de microtítulo (Dynex) sãorevestidas durante a noite com 5 pg/ml de um anticorpo anti-Fab de captura(Cappel Labs) em 50 mM de carbonato de sódio (pH 9,6), e subseqüentementebloqueado com 2% (w/v) de albumina de soro bovino em PBS por duas a cincohoras em temperatura ambiente (aproximadamente 23°C). Em uma placa não absorvente (Nunc #269620), 100 pM ou 26 pM de antígeno marcado com I^125 emisturado com uma série de diluições de um Fab de interesse (por exemplo,consistente com a avaliação de um anticorpo anti-VEGF, Fab-12, em Presta etal„ Câncer Res. 57:4593-99 (1997)). O Fab de interesse é então incubadodurante a noite; no entanto, a incubação pode continuar por um período maior(por exemplo, 65 horas) para garantir que o equilíbrio seja alcançado.Posteriormente as misturas são transferidas para a placa de captura paraincubação em temperatura ambiente (por exemplo, por uma hora). A solução éentão removida e a placa lavada oito vezes com 0,1% de Tween-20 em PBS.Quando as placas estiverem secas, 150 μΙ/poço de cintilante (MicroScint-20;Packard) é adicionado, e as placas são contadas em um contador Topcountgamma (Packard) por dez minutos. As concentrações de cada Fab com ligaçãomáxima menor ou igual a 20% são escolhidas para uso em testes de ligaçãocompetitiva. De acordo com outra realização, Kd ou valor Kd é medido pelouso de testes de ressonância plasmônica de superfície usando-se umBIAcore™-2000 ou um BIAcore™-3000 (BlAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25°Ccom chips CM5 de antígeno imobilizado a aproximadamente 10 unidades deresposta (RU). Resumidamente, chips biosensor dextrano carboximetilado(CM5, BIAcore Inc.) são ativados com hidrocloreto de N-etil-N- (3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) e N-hidroxisuccinimida (NHS) deacordo com as instruções do fornecedor. O antígeno é diluído com 10mM deacetato de sódio, PH 4,8, em 5 Mg/ml (aproximadamente 0,2 μΜ) antes dainjeção a uma taxa de fluxo de 5 μΙ/minuto para atingir aproximadamente 10unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Seguindo a injeção deantígeno, 1M de etanolamina foi injetada para bloquear grupos não reagidos.Para medidas cinéticas, duas diluições consecutivas de Fab (0,78 nM a 500nM) são injetadas em PBS com 0,05% de Tween 20 (PBST) a 25°C a uma taxade fluxo de aproximadamente 25 μΙ/min. Taxas de associação (kon) e taxas dedissociação (koff) são calculadas usando-se um modelo de ligação Langmuir umpara um simples (Programa de Avaliação BIAcore versão 3.2) por ajustesimultâneo do sensorgrama de associação e dissociação. A constante deequilíbrio de dissociação (kd) é calculada como a razão Wkon- Ver, porexemplo, Chen, Y., et ai, (1999) J. MoIBioI 293:865-881 (1999). Se a on-rateexceder 106 M"1 S"1 pelo teste de ressonância plasmônica de superfície acima,então a on-rate pode ser determinada pelo uso de uma técnica de extinção defluorescência que mede o aumento ou diminuição na intensidade de emissãofluorescente (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, 16 nm band-pass) a25°C de 20nM de um anticorpo anti-antígeno (forma Fab) em PBS, pH 7,2, napresença de concentrações crescentes de antígeno conforme medido em umespectrômetro, como um espectrômetro equipado com interrupção de fluxo(Aviv Instruments) ou um espectrômetro SLM-Aminco série 8000(ThermoSpectronic) com um cadinho vermelho de mistura.

Uma "on-rate" ou "taxa de associação" ou "Kon" de acordo comesta invenção pode também ser determinada com a mesma ressonânciaplasmônica de superfície descrita acima usando-se um BIAcore™-2000 ou umBIAcoreTM-3000 (BlAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25°C com chips CM5 deantígeno imobilizado a aproximadamente 10 unidades de resposta (RU).Resumidamente, chips biosensor dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.)são ativados com hidrocloreto de N-etil-N - (3-dimetilaminopropil)-carbodiimida(EDC) e N-hidroxisuccinimida (NHS) de acordo com as instruções dofornecedor. O antígeno é diluído com 10mM de acetato de sódio, pH 4,8, em 5pg/ml (aproximadamente 0,2 μΜ) antes da injeção a uma taxa de fluxo de 5μl/minuto para atingir aproximadamente 10 unidades de resposta (RU) deproteína acoplada. Seguindo a injeção de antígeno, 1M de etanolamina foiinjetada para bloquear grupos não reagidos. Para medidas cinéticas, duasdiluições consecutivas de Fab (0,78 nM a 500 nM) são injetadas em PBS com0,05% de Tween 20 (PBST) a 25°C a uma taxa de fluxo de aproximadamente25 μl/min. Taxas de associação (Kon) e taxas de dissociação (Koff) sãocalculadas usando-se um modelo de ligação Langmuir um para um simples(Programa de Avaliação BIAcore versão 3.2) por ajuste simultâneo dosensorgrama de associação e dissociação. A constante de equilíbrio dedissociação (Kd) foi calculada como a razão KoffZKon- Ver, por exemplo, Chen,Y., et a/., (1999) J. Mol Biol 293:865-81 (1999). No entanto, se a on-rateexceder 10® IVM S"1 pelo teste de ressonância de plasmônica de superfícieacima, então a on-rate é geralmente determinada pelo uso de uma técnica deextinção de fluorescência que mede o aumento ou diminuição na intensidadede emissão fluorescente (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, 16 nm band-pass) a 25°C de 20nM de um anticorpo anti-antígeno (forma Fab) em PBS, pH7,2, na presença de concentrações aumentadas de antígeno conforme medidoem um espectrômetro, como um espectrômetro equipado com interrupção defluxo (Aviv Instruments) ou um espectrômetro SLM-Aminco série 8000(ThermoSpectronic) com um cadinho de mistura vermelho.

O termo "vetor", como utilizado no presente pedido, refere-se auma molécula de ácido nucléico capaz de transportar outro ácido nucléico aoqual foi ligado. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere a uma alça deDNA de fita dupla circular na qual segmentos de DNA adicionais podem serligados. Outro tipo de vetor é um vetor fago. Outro tipo de vetor é um vetorviral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados ao genomaviral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célulahospedeira na qual eles são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianosque têm uma origem de replicação bacteriana e vetores episomais demamíferos). Outros vetores (por exemplo, vetores não-episomais demamíferos) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira pelaintrodução em uma célula hospedeira, e através disso serem replicados juntocom o genoma hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes dedirecionar a expressão de genes para o qual eles são ligados operativamente.Tais vetores são referidos no presente como "vetores de expressãorecombinantes" (ou simplesmente, "vetores recombinantes"). Em geral,vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante estãofreqüentemente na forma de plasmídeos. Na presente especificação,"plasmídeo" e "vetor" podem ser usados alternadamente enquanto que oplasmídeo é a forma de vetor mais comumente utilizada.

"Polinucleotídeo" ou "ácido nucléico", como usado alternadamenteno presente pedido, refere-se a polímeros de nucleotídeos de qualquercomprimento, e incluem DNA e RNA. Os nucleotídeos podem serdesoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, nucleotídeos ou bases modificadas,e/ou seus análogos, ou qualquer substrato que possa ser incorporado em umpolímero por DNA ou RNA polimerase, ou por uma reação sintética. Umpolinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, comonucleotídeos metilados e seus análogos. Se presente, modificações naestrutura do nucleotídeo podem ser transmitidas antes ou depois da montagemdo polímero. A seqüência de nucleotídeos pode ser interrompida porcomponentes não nucleotídeos. Um polinucleotídeo pode ser ainda modificadodepois da síntese, como pela conjugação com um marcador. Outros tipos demodificações incluem, por exemplo, "caps", substituições de um ou maisnucleotídeos de ocorrência natural com um análogo, modificações deinternucleotídeos como, por exemplo, aqueles com ligações não carregadas(por exemplo, fosfonato de metila, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos,etc.) e com ligações carregadas (por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos,etc.), aqueles contendo unidades pendentes, tais como, por exemplo, proteínas(por exemplo, nucleases, toxinas, anticorpos, peptídeos sinais, poli-L-lisina,etc.), aqueles contendo intercaladores (por exemplo, acridina, psoralen, etc.),aqueles contendo quelatos (por exemplo, metais, metais radioativos, boro,metais oxidantes, etc.), aqueles contendo alquiladores, aqueles com ligaçõesmodificadas (por exemplo, ácidos nucléicos alfa anoméricos, etc.), assim comoformas não modificadas de polinucleotídeo(s). Além disso, qualquer um dosgrupos hidroxila geralmente presentes nos açúcares pode ser substituído, porexemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos deproteção padrão, ou ativados para preparar ligações adicionais paranucleotídeos adicionais, ou podem ser conjugados a suportes sólidos ou semi-sólidos. As terminações OH 5' e 3' podem ser fosforiladas ou substituídas porgrupos aminas ou componentes do grupo de revestimento orgânico com 1 a 20átomos de carbono. Outras hidroxilas podem também ser derivadas paragrupos de proteção padrão. Polinucleotídeos podem também conter formasanálogas de ribose ou açúcares desoxirribose que são geralmente conhecidosna técnica, incluindo, por exemplo, 2'-0-metil-, Z-O-alil, 2'-flúor- ou 2'-azido-ribose, açúcares carbocíclicos análogos, açúcares alfa-anoméricos, açúcaresepiméricos, como arabinose, xiloses ou lixoses, açúcares piranose, açúcaresfuranose, sedoheptuloses, análogos dos acíclicos e análogos dos nucleosídeosnão básicos, como metil ribosídeo. Uma ou mais ligações fosfodiéster podemser substituídas por grupos de ligações alternativas. Estes grupos de ligaçõesalternativas incluem, mas não se limitam a, realizações em que o fosfato ésubstituído por P(O)SCtioato"), P(S)S ("ditioato"), "(O)NR2 ("amidato"), P(O)R,P(O)OR', CO ou CH2 ("formacetol"), no qual cada R ou R1 é independente de Hou alquil substituído ou não substituído (1-20 C.) opcionalmente contendo umaligação éter (-O-) ligado, aril, alquenil. cicloalquil, cicloalquenil ou araldil. Nemtodas as ligações em um polinucleotídeo precisam ser idênticas. A descriçãoanterior aplica-se para todos os polinucleotídeos referidos no presente pedido,incluindo RNA e DNA.

"Oligonucleotídeo", como utilizado no presente pedido,geralmente refere-se à fita curta simples, geralmente polinucleotídeos sintéticosque são geralmente, mas não necessariamente, menor que aproximadamente200 nucleotídeos em comprimento. Os termos "oligonucleotídeo" e"polinucleotídeo" não são mutuamente exclusivos. A descrição acima parapolinucleotídeos é igualmente e completamente aplicável paraoligonucleotídeos.

O termo "EGFL7" (alternadamente chamado do "Fator deCrescimento Epidermal-Like 7"), como usado no presente pedido, a menos queespecificamente ou contextualmente indicado de outra forma, refere-se aqualquer polipeptídeo EGFL7 nativo ou variante (de ocorrência natural ousintético) como descrito no documento WO 2005/117968, a divulgação deste éintegralmente incorporada ao presente para todos os propósitos. O termo"seqüência nativa" especificamente inclui formas removidas ou secretadas deocorrência natural (por exemplo, uma seqüência do domínio extracelular),formas variantes de ocorrência natural (por exemplo, formas unidasalternativamente) e variantes alélicas de ocorrência natural. O termo "EGFL7tipo selvagem" geralmente refere-se a um polipeptídeo que compreende aseqüência de aminoácido de uma proteína EGFL7 de ocorrência natural. Otermo "seqüência EGFL7 tipo selvagem" geralmente refere-se a uma seqüênciade aminoácido encontrada em um EGFL7 de ocorrência natural.

Os termos "anticorpo" e "imunoglobulina" são usadosalternadamente no mais amplo sentido e incluem anticorpos monoclonais (porexemplo, anticorpos monoclonais de comprimento total ou intactos), anticorpospoliclonais, anticorpos multivalentes, anticorpos multiespecíficos (por exemplo,anticorpos biespecíficos, desde que eles exibam a atividade biológicadesejada) e podem também incluir certos fragmentos de anticorpos (comodescrito em maiores detalhes no presente pedido). Um anticorpo pode serhumano, humanizado e/ou de afinidade madura.

O termo "variável" refere-se ao fato de que certas porções dodomínio variável diferenciam-se extensivamente na seqüência entre anticorpose são usadas na ligação e especificidade de cada anticorpo específico para seuantígeno específico. No entanto, a variabilidade não é distribuídauniformemente por todos os domínios variáveis dos anticorpos. Ela estáconcentrada em três segmentos chamados regiões determinadas porcomplementaridade (CDRs) ou regiões hipervariáveis, ambas nos domíniosvariáveis da cadeia leve e cadeia pesada. As porções mais altamenteconservadas de domínios variáveis são chamadas de regiões de estrutura(FR). Os domínios variáveis das cadeias leves e pesadas nativascompreendem cada um, quatro regiões FR adotando amplamente umaconfiguração folha dobrada β, conectada por três CDRs1 na qual formam alçasque se conectam, e em alguns casos formam parte da estrutura folha dobradaβ. As CDRs em cada cadeia são mantidas bem juntas pelas regiões FR e, comas CDRs da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação doantígeno dos anticorpos, (ver, Kabat et al., Sequences of Proteins ofImmunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, MD. (1991)). Os domínios constantes não estão diretamenteenvolvidos na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem váriasfunções efetoras, como participação do anticorpo na citotoxicidade celulardependente de anticorpo.

A digestão de anticorpos por papaína produz dois fragmentosidênticos de ligação ao antígeno, chamados fragmentos Tab", cada um comum único sitio de ligação ao antígeno, e um fragmento "Fe" residual, cujo nomereflete sua habilidade para cristalizar de imediato. O tratamento com pepsinaproduz um fragmento F(ab')2 que possui dois sítios de combinação de antígenoe é ainda capaz de reticulação com o antígeno.

"Fv" é o fragmento mínimo de anticorpo que contém umreconhecimento de antígeno e sítio de ligação ao antígeno completos. Nostipos de Fv de cadeias duplas, esta região consiste de um dímero de umacadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve em estreita associaçãonão covalente. Nos tipos de Fv de cadeia simples, um domínio variável decadeia leve e um de cadeia pesada podem ser ligados covalentemente por umligante peptídico flexível, como aquele em que as cadeias leve e pesadapodem se associar em uma estrutura "dimérica" análoga àquele tipo de Fv decadeia dupla. É nesta configuração que as três CDRs de cada domíniovariável interage para definir um sítio de ligação ao antígeno na superfície dodímero VH-VL. Coletivemente, as seis CDRs conferem especificidade deligação de antígeno ao anticorpo. No entanto, até um único domínio variável(ou metade de um Fv que compreende somente três CDRs específicas paraum antígeno) possui a habilidade de reconhecer e se ligar a um antígeno,embora com afinidade mais baixa do que o sítio de ligação completo.

O fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeialeve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Fragmentos Fab'diferem de fragmentos Fab pela adição de poucos resíduos na terminaçãocarboxila de um domínio CH1 de cadeia pesada incluindo uma ou maiscisteínas da região de dobradiça do anticorpo. Fab'-SH é a designação nopresente pedido para Fab' na qual o(s) resíduo(s) cisteína dos domíniosconstantes produzem pelo menos um grupo tiol livre. Fragmentos do anticorpoF(Bb1)2 originalmente foram produzidos como pares de fragmentos Fab' quepossuem dobradiça de cisteínas entre eles. Outros acoplamentos químicos defragmentos de anticorpos são também conhecidos.As "cadeias leves" de anticorpos (imunoglobulinas) de qualquerespécie de vertebrado podem ser designadas para um ou dois tipos claramentedistintos, chamados kappa (κ) e Iambda (λ), baseados na seqüência deaminoácidos de seus domínios constantes.

Dependendo da seqüência de aminoácido do domínio constantede suas cadeias pesadas, imunoglobulinas podem ser designadas paradiferentes "classes". Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA1IgD1 IgE1 IgG1 e IgM1 e várias destas podem também ser divididas emsubclasses (isotipos), por exemplo, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4l IgAi e IgA2. Osdomínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentesclasses de imunoglobulinas são chamados de α, δ, ε, γ, e μ, respectivamente.

As subunidades de estruturas e configurações tridimensionais de diferentesclasses de imunoglobulinas são bem conhecidas.

"Fragmentos de anticorpos" compreendem somente uma porçãode um anticorpo intacto, em que a porção mantém preferivelmente pelo menosuma, preferivelmente a maioria ou todas as funções normalmente associadascom a porção quando presente em um anticorpo intacto. Exemplos defragmentos de anticorpos incluem fragmentos Fab1 Fab11 F(Bb1)2, θ fragmentosFv; diacorpos, anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia única eanticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpos. Em umarealização, um fragmento de anticorpo compreende um sítio ligação deantígeno do anticorpo intacto e dessa forma mantém a capacidade de se ligarao antígeno. Em outra realização, um fragmento de anticorpo, por exemplo,aquele que compreende a região Fc, mantém pelo menos uma das funçõesbiológicas normalmente associadas com a região Fc quando presente em umanticorpo intacto, tal como ligação FcRn, modulação de meia vida do anticorpo,função ADCC e ligação complementar. Em uma realização, um fragmento deanticorpo é um anticorpo monovalente que tem uma meia vida in vivosubstancialmente similar a um anticorpo intacto. Por exemplo, tal fragmento deanticorpo pode compreender um braço de ligação de antígeno ligado a umaseqüência Fc capaz de conferir in vivo estabilidade ao fragmento.

Os termos "região hipervariável", ΉVR" ou "HV", quando usadosno presente pedido referem-se às regiões de um domínio variável do anticorpoque são hipervariáveis na seqüência e/ou formas estruturalmente definidascomo alças. Geralmente, anticorpos compreendem seis regiões hipervariáveis,três na VH (H1, H2, H3), e três na VL (L1, L2, L3). Uma série dedelineamentos de regiões hipervariáveis está em uso e são englobadas nopresente. As Regiões Determinadas por Complementaridade de Kabat (CDRs)são baseadas na variabilidade da seqüência e são mais comumente utilizadas(Kabat et ai, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. PublicHealth Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Chothia,ao contrário, refere-se à localização das alças estruturais (Chothia & Lesk J.MoL Biol. 196:901-17 (1987)). As regiões hipervariáveis AbM representam umacordo entre as CDRs de Kabat e alças estruturais de Chothia, e são usadaspelo programa de modelação de anticorpo AbM da Oxford Molecular. Asregiões hipervariáveis de "contato" são baseadas em uma análise dasestruturas cristalinas complexas disponíveis.

Regiões hipervariáveis podem compreender "regiõeshipervariáveis estendidas" como a seguir: 24-36 (L1), 46-56 (L2) e 89-97 (L3)na VL e 26-35 (H1), 49-65 ou 50-65 ou 50 até 65 (H2) e 93-102 (H3) na VH.Os resíduos do domínio variável são numerados de acordo com Kabat et al.,acima, para cada uma destas definições.

"Região de estrutura" ou resíduos "FR" são aqueles resíduos dedomínio variável, exceto os resíduos de região hipervariável como definido nopresente pedido.

Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo,murino) são anticorpos quiméricos que contêm seqüência mínima derivada deimunoglobulina não humana. Na maior parte, anticorpos humanizados sãoimunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) em que resíduos de uma regiãohipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma regiãohipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal comocamundongo, rato, coelho ou primata não humano tendo especificidade,afinidade e capacidade desejadas. Em alguns exemplos, resíduos da regiãode estrutura (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduoscorrespondentes não humanos. Além disto, anticorpos humanizados podemcompreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou noanticorpo doador. Estas modificações são feitas para, além disto, refinar odesempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado irá compreendersubstancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domíniosvariáveis, em que todos ou substancialmente todas as alças hipervariáveiscorrespondem àqueles de uma imunoglobulina não humana e todas ousubstancialmente todas as FRs são aquelas de uma seqüência deimunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente irá tambémcompreender pelo menos uma porção de uma região constante (Fc) daimunoglobulina, tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Paradetalhes adicionais, ver Jones et ai, Nature 321:522-25 (1986); Riechmann efai, Nature 332:323-29 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Bioi 2:593-96 (1992).Ver também os seguintes artigos de revisão e referências citadas nestes:Vaswani e Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunoi 1:105-15 (1998); Harris,Biochem. Soe. Transactions 23:1035-38 (1995); Hurle e Gross, Curr. Op.Biotech. 5:428-33 (1994).

Anticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas) possuem uma porçãoda cadeia pesada e/ou leve idêntica ou homóloga às seqüênciascorrespondentes nos anticorpos derivados de uma espécie específica oupertencente a uma classe ou subclasse específica de anticorpo, enquanto orestante da(s) cadeia(s) é idêntica ou homóloga às seqüênciascorrespondentes nos anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes àoutra classe ou subclasse de anticorpo, assim como fragmentos de taisanticorpos, desde que eles exibam a atividade biológica desejada (Patente US4.816.567; e Morrison et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:6851-6855 (1984)).Anticorpo humanizado, como usado no presente pedido, é um subconjunto deanticorpos quiméricos.

Fragmentos de anticorpos "Fv de cadeia única" ou "scFv"compreendem os domínios VH e VL do anticorpo, em que estes domíniosestão presentes em uma única cadeia polipeptídica. Geralmente, opolipeptídeo scFv também compreende um polipeptídeo Iigante entre osdomínios VH e VL que permite ao scFv formar a estrutura desejada para aligação do antígeno. Para uma revisão de scFv ver Plückthun em ThePharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds.,Springer-Verlag, Nova York, páginas 269-315(1994).

Um "antígeno" é um antígeno pré-determinado ao qual umanticorpo pode se ligar seletivamente. O antígeno alvo pode ser umpolipeptídeo, carboidrato, ácido nucléico, lipídeo, hapteno ou outros compostosde ocorrência natural ou sintéticos. Geralmente, o antígeno alvo é umpolipeptídeo.

Um "epitopo" é a porção do antígeno ao qual o anticorposeletivamente se liga. Para um antígeno polipeptídico, o epitopo é geralmenteuma porção peptídica de aproximadamente 10 aminoácidos.

O termo "diacorpos" refere-se a fragmentos de anticorpospequenos com dois sítios de ligação de antígeno, cujos fragmentoscompreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a umdomínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia polipeptídica (VH - VL).Pelo uso de um Iigante que é muito curto para permitir pareamento entre osdois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a parear com osdomínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação deantígeno. Diacorpos estão descritos mais inteiramente em, por exemplo,patente EP 404.097; documento WO 93/11161; e Hollinger et a/., Proc. NatiAcad. Sei. USA, 90:6444-48 (1993).

Um "anticorpo humano" é aquele que possui uma seqüência deaminoácido que corresponde àquela de um anticorpo produzido por umhumano e/ou foi produzido usando-se qualquer uma das técnicas para se fazeranticorpos humanos como divulgado no presente pedido. Esta definição de umanticorpo humano especificamente exclui um anticorpo humanizado quecompreende resíduos de ligação de antígenos não humanos.

Um anticorpo de "afinidade madura" é aquele com uma ou maisalterações em uma ou mais CDRs deste, o que resulta em um aprimoramentona afinidade do anticorpo para o antígeno, comparado com um anticorpoparental que não possui aquela(s) alteração(ões). Anticorpos de afinidademadura preferidos terão afinidades nanomolar ou até afinidades picomolar parao antígeno alvo. Anticorpos de afinidade madura são produzidos por processosconhecidos na técnica. Marks et al. Bio/Technology 10:779-83 (1992) descrevea maturação da afinidade por mistura dos domínios VH e VL. Mutagêneserandômica de CDR e/ou resíduos de estrutura é descrita por: Barbas et al.,Proe Nat. Acad. Sei, USA 91:3809-13 (1994); Schier et al. Gene 169:147-55(1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J.Immunol. 154(7):3310-19 (1995); e Hawkins et al, J. Moi Biol. 226:889-96(1992).

"Funções efetoras" do anticorpo referem-se àquelas atividadesbiológicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc de seqüência nativa ou umaregião Fc de seqüência de aminoácido variante) de um anticorpo, e variam como isotipo do anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpo incluem:ligação C1q e citoxicidade dependente de complemento; ligação do receptorFc; citoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose, baixocontrole de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de célula B);e ativação de célula B.

"Citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo" ou"ADCC" refere-se a uma forma de citotoxicidade na qual Ig secretado ligadoaos receptores Fc (FcRs) presentes em certas células citotóxicas (por exemplo,células natural killer (NK)1 neutrófilos, e macrófagos) permitem que estascélulas efetoras citotóxicas se liguem especificamente a uma célula alvo queproduz antígeno e subseqüentemente destroem a célula alvo com citotoxinas.Os anticorpos "armam" as células citotóxicas e são absolutamente necessáriospara tal destruição. As células primárias para mediação de ADCC, células NK1expressam apenas FcyRIII, enquanto que monócitos expressam FcyRI, FcyRIIe FcyRIII. A expressão FcR em células hematopoiéticas está resumida naTabela 3 na página 464 de Ravetch & Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92(1991). Para avaliar a atividade ADCC de uma molécula de interesse, um testeADCC in vitro, como descrito nas patentes US 5.500.362 ou 5.821.337 ouPresta patente US 6.737.056, pode ser realizado. Células efetoras úteis paratais ensaios incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) ecélulas Natural Killer (NK). Alternativamente, ou adicionalmente, atividadeADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em ummodelo animal como divulgado em Clynes et ai, Proc. Nati Acad. Sei. USA95:652-56 (1998).

"Células efetoras humanas" são leucócitos que expressam um oumais FcRs e desempenham funções efetoras. Preferivelmente, as célulasexpressam pelo menos FcyRIII e realizam função efetora ADCC. Exemplos deleucócitos humanos que mediam ADCC incluem células mononucleares desangue periférico (PBMC)1 células natural killer (NK)1 monócitos, células Tcitotóxicas e neutrófilos; com PBMCs e células NK sendo preferidas. As célulasefetoras podem ser isoladas de uma fonte nativa, por exemplo, do sangue.

"Receptor Fc" ou "FcR" descreve um receptor que se liga à regiãoFc de um anticorpo. O FcR preferido é um FcR humano de seqüência nativa.Além disso, um FcR preferido é um que se liga a um anticorpo IgG (umreceptor gama) e inclui subclasses dos receptores FcyRIi FcyRII1 e FcyRIII,incluindo variantes alélicas e alternativamente formas unidas destesreceptores. Receptores FcyRII incluem FcyRIIA (um "receptor de ativação") eFcyRIIB (um "receptor de inibição"), que têm seqüências de aminoácidosimilares que diferem primeiramente nos domínios citoplasmáticos destes.Receptor de ativação FcyRIIA contém uma seqüência de ativação deimunoreceptor baseada em tirosina (ITAM) em seu domínio citoplasmático.Receptor de ativação FcyRIIA contém uma seqüência de inibição deimunoreceptor baseado em tirosina (ITIM) em seu domínio citoplasmático. (verrevisão M. em Daéron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-34 (1997)). FcRs sãorevisados em Ravetch e Kinet1 Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capei etai, Immunomethods 4:25-34 (1994); e de Haas et ai, J. Lab. Clin. Med.126:330-41 (1995). Outros FcRs1 incluindo aqueles a serem identificados nofuturo, são englobados pelo termo "FcR" no presente pedido. O termo tambéminclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável por transferir as IgGsmaternas para os fetos (Guyer et ai, J. Immunol. 117:587 (1976) e Kim et ai, J.Immunol. 24:249 (1994)) e regula homeostase de imunoglobulinas.

O Documento WO 00/42072 (Presta) descreve anticorposvariantes com ligação aos FcRs melhoradas ou diminuídas. O conteúdo destapublicação de patente está especificamente incorporado ao presente pedidocomo referência. Ver1 também, Shields et al. J. Bioi Chem. 9(2): 6591-6604(2001).Métodos para medir ligação ao FcRn são conhecidos (ver, porexemplo, Ghetie e Ward1 Immunol. Today 18:592-8 (1997)). Ligação ao FcRnhumano in vivo e meia-vida do soro de polipepídeos de ligação de altaafinidade ao FcRn podem ser testados, por exemplo, em camundongostransgênieos ou linhagens de células humanas transfectadas que expressamFcRn humano, ou em primatas administrados com polipeptídeos Fc variantes.

"Citotoxicidade dependente de complemento" ou "CDC" refere-seà Iise de uma célula alvo na presença de complemento. Ativação da via decomplemento tradicional é iniciada pela ligação do primeiro componente dosistema de complemento (C1q) aos anticorpos (da subclasse apropriada) quesão ligados aos seus antígenos cognatos. Para avaliar ativação decomplemento, um teste CDC pode ser realizado, por exemplo, como descritoem Gazzano-Santoro et ai, J. Immunol. Methods 202:163 (1996).

Polipeptídeos variantes com seqüências de aminoácido da regiãoFc alteradas e capacidade de ligação C1q aumentada ou diminuída estãodescritos na patente US 6.194.551B1 e documento WO 99/511642. Oconteúdo destas publicações de patente está especificamente incorporado aopresente como referência. Ver também, Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-84 (2000).

Um anticorpo "de bloqueio" ou um anticorpo "antagonista" éaquele que inibe ou reduz as atividades biológicas do antígeno ao qual se liga.Anticorpos de bloqueio ou anticorpos antagonistas preferidos inibemsubstancialmente ou completamente a atividade biológica do antígeno.

Uma "disfunção" ou "doença" é qualquer condição que sebeneficiaria do tratamento com uma substância/molécula ou método dainvenção. Isto inclui disfunções ou doenças crônicas e agudas incluindoaquelas condições patológicas que predispõe o mamífero para a disfunção emquestão. Exemplos não Iimitantes de disfunções a serem tratadas no presenteincluem tumores malignos e benignos; carcinoma, blastoma e sarcoma.

Os termos "disfunção proliferativa celular" e "disfunçãoproliferativa" referem-se às disfunções que estão associados com algum graude proliferação celular anormal. Em uma realização, a disfunção celularproliferativa é câncer.

"Tumor", como utilizado no presente, refere-se a todo crescimentoe proliferação celular neoplástico, maligno ou benigno, e todas as células etecidos, cancerosos e pré-cancerosos. Os termos "câncer", "canceroso","disfunção proliferativa celular", "disfunção proliferativa" e "tumor" não sãomutuamente exclusivos como referido no presente pedido.

Os termos "câncer" e "canceroso" referem-se ou descrevem acondição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada porcrescimento/proliferação celular irregular. Exemplos de câncer incluem, masnão se limitam a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia. Exemplosmais específicos de tais cânceres incluem câncer celular escamoso, câncer depulmão de célula pequena, câncer de glândula pituitária, câncer esofágico,astrocitoma, sarcoma de tecido macio, câncer de pulmão de célula não-pequena, adenocarcinoma de pulmão, carcinoma escamoso de pulmão, câncerde peritônio, câncer hepatocelular, câncer gastrointestinal, câncer pancreático,câncer de glioblastoma cervical, câncer ovariano, câncer de fígado, câncer debexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer coloretal,carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma glandular salivar, câncer de rim,câncer de fígado, câncer de próstata, câncer de vulva, câncer de tireóide,carcinoma hepático, câncer de cérebro, câncer de endométrio, câncer detestículo, colangiocarcinoma, carcinoma de vesícula biliar, câncer gástrico,melanoma e vários tipos de câncer de cabeça e pescoço. A desregulação deangiogênese pode levar a muitas disfunções que podem ser tratadas porcomposições e métodos da invenção. Estas disfunções incluem ambas ascondições não neoplásticas e neoplásticas. Condições neoplásticas incluem,mas não se limitam àquelas descritas acima. Distúrbios não neoplásticosincluem, mas não se limitam a hipertrofia indesejada ou anormal, artrite, artritereumatóide (RA)1 psoríase, placas psoriáticas, sarcoidose, arterioesclerose,placas arterioescleróticas, diabética e outras retinopatias proliferativas incluindoretinopatia da prematuridade, fibroplasia retrolental, glaucoma neovascular,degeneração macular relativas à idade, neovascularização da córnea,neovascularização de enxerto de córnea, rejeição de enxerto de córnea,neovascularização da retina/coroidal, neovascularização da íris (rubeose),doenças neovasculares oculares, restenose vascular, deformaçõesarteriovenosas (AVM), meningioma, hemangioma, angiofibroma, hiperplasiasda tireóide (incluindo doenças de Grave), da córnea e outro tecido detransplante, inflamação crônica, inflamação de pulmão, lesão/ARDS aguda depulmão, sepsia, hipertensão pulmonar primária, efusão pulmonar maligna,edema cerebral (por exemplo, associados com derrame agudo / lesãointracraniana /trauma), inflamação sinovial, pano formação em RA, miositeossificante, formação de osso hipertróf.ca, osteoartrite (OA), ascites refratárias,doenças policísticas ovarianas, endometrioses, doenças de fluído do terceiroespaço (pancreatites, síndrome de compartimento, queimaduras, doenças deintestino), fibróide uterina, parto prematuro, inflamações crônicas tal como IBD(doenças de Crohn e colites ulcerativas), rejeição alográfica renal, doençasinflamatórias de intestino, síndrome nefrótica, crescimento indesejado ouanormal de massa de tecido (não-câncer), articulações hemofílicas, cicatrizeshipertróficas, inibição de crescimento de cabelo, síndrome Osler-Weber,fibroplasias retrolental granuloma piogênico, escleroderma, tracoma, adesõesvasculares, sinovites, dermatites, pré-eclampsia, ascites, efusão pericardial(como aquela associada com pericardite), e efusão pleural.

O termo "desnutrição protéico-energética" (por exemplo, síndromeda desnutrição protéico-energética, caquexia, sarcopenia) refere-se a umadisfunção causada pela perda de peso indesejável ou prejudicial, ou perda demassa celular. Em idosos, bem como na AIDS e em pacientes com câncer, adesnutrição protéico-energética pode resultar na perda de peso indesejável,incluindo tanto os compartimentos gordurosos como aqueles sem gordura.Doenças de desnutrição protéico-energética podem ser o resultado da ingestãoinadequada de alimentos, mudanças metabólicas relacionadas à doença e/ouprocessos de envelhecimento. Pacientes com câncer e pacientes com AIDS,bem como pacientes pós-cirurgia extensa ou com infecções crônicas, doençasimunológicas, hipertiroidismo, doença de Crohn, doença psicogênica,isuficiência cardíaca ou outros traumas severos, freqüentemente sofrem dedesnutrição protéico-energética, que algumas vezes também é chamada decaquexia, disfunção metabólica e, algumas vezes, disfunção alimentar. Acaquexia é adicionalmente caracterizada pelo hipermetabolismo ehipercatabolismo. Embora caquexia e a desnutrição protéico-energética sejamusadas alternadamente para se referir às condições de desnutrição protéico-energética, existe pelo menos um corpo de pesquisa que diferencia a caquexiada síndrome da desnutrição protéico-energética como uma perda de massasem gordura, e particularmente, perda de massa celular (Mayer, J. Nutr.129(1S Suppl.):256S-59S (1999)). A sarcopenia, ainda outra tal disfunção quepode afetar o indivíduo em envelhecimento, é tipicamente caracterizada pelaperda de massa muscular. Os estágios finais da desnutrição protéico-energética, como descrito acima, podem se desenvolver nos indivíduos quesofrem tanto de caquexia como de sarcopenia.

Como usado no presente, "tratamento" refere-se à intervençãoclínica em uma tentativa para alterar o curso natural do indivíduo ou célulasendo tratada, e pode ser apresentado também por profilaxia ou durante ocurso da patologia clínica. Efeitos desejáveis de tratamento incluem prevençãode ocorrência ou recidiva da doença, alívio de sintomas, diminuição dequaisquer conseqüências patológicas diretas ou indiretas da doença, reduçãoda taxa de progressão da doença, melhora ou estados de alívio da doença, eremissão ou prognósticos de melhora. Em algumas realizações, anticorpos dainvenção são usados para atrasar o desenvolvimento de uma doença oudisfunção.

Um "indivíduo", "sujeito", ou "paciente" é um vertebrado, porexemplo, um mamífero, incluindo especialmente um humano. Mamíferosincluem, mas não se limitam a humanos, animais domésticos e de criação, dezoológico, para esportes, ou animais de estimação, como cachorros, cavalos,gatos, vacas, etc.

Uma "quantidade efetiva" refere-se a uma quantidade efetiva, nasdosagens e pelo período de tempo necessário para atingir o resultadoterapêutico ou profilático desejado.

Uma "quantidade terapeuticamente efetiva" de umasubstância/molécula da invenção, agonista ou antagonista pode variar deacordo com fatores tais como o estado da doença, idade, sexo, e peso doindivíduo, e a capacidade da substância/molécula, agonista ou antagonistaobter uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamenteefetiva é também aquela na qual qualquer efeito tóxico ou prejudicial dasubstância/molécula, agonista ou antagonista é excedido pelos efeitosterapeuticamente benéficos.

Uma "quantidade profilaticamente efetiva" refere-se a umaquantidade efetiva, na dosagem e pelo período de tempo necessário paraatingir o resultado profilático desejado. Como uma dose prof.lática é usada emsujeitos, antes da doença ou em um estágio inicial, a quantidadeprofilaticamente efetiva tipicamente, mas não necessariamente, será menorque a quantidade terapeuticamente efetiva.O termo "agente citotóxico" como usado no presente pedidorefere-se a uma substância que inibe ou previne a função de células e/oucausa destruição de células. O termo tem a intenção de incluir isótoposradioativos (por exemplo, At211 ,I131 ,l125 , Y90 , Re186 , Sm153,Bi212,P32 eisótopos radioativos de Lu), agentes quimioterapêuticos, por exemplo,metotrexato, adriamicina, alcalóides vinca (vincristina, vinblastina, etoposideo),doxorubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucila, daunorubicina ou outrosagentes intercalantes, enzimas e fragmentos destes, como enzimasnucleolíticas, antibióticos e toxinas, tais como toxinas de molécula pequena outoxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ouanimal, incluindo fragmentos e/ou variantes destes, e os vários agentes anti-tumor ou anti-câncer divulgados abaixo. Outros agentes citotóxicos estãodescritos abaixo. Um agente tumoricida causa destruição de células tumorais.

Um "agente quimioterapêutico" é um componente químico útil notratamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluemagentes alquiladores tais como tiotepa e ciclosfosfamida CYTOXAN®; alquilsulfonados tais como busulfan, improsulfan e piposulfan; aziridinas tais comobenzodopa, carboquona, meturedopa, e uredopa; etileniminas emetilamelaminas incluindo altretamina, trietilenemelamina,trietilenefosforamida, trietilenetiofosforamida e trimetilolomelamina;acetogeninas (especialmente bulatacin e bulatacinona); delta-9-tetraidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapacona; lapacol;colchicinas; ácido betulínico; uma camptotecina (incluindo a sintética análogatopotecan (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®),acetilcamptotecina, scopolectina, e 9-aminocamptotecina); briostatina;calistatina; CC-1065 (incluindo suas análogas adozelesina, carzelesina ebizelesina sintética); podofilotoxina; ácido podofilínico; teniposida; criptof.cinas(particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina(incluindo as sintéticas análogas, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina;pancratistatina; uma sarcodictina; espongistatina; mostardas de nitrogênio taiscomo clorambucila, clornafazina, clolofosfamida, estramustina, ifosfamida,mecloretamina, hidrocloreto óxido de mecloretamina, melfalan, novembiquin,fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracil; nitrosureas taiscomo carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, eranimnustina; antibióticos tais como os antibióticos enedina (por exemplo,caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gammall e caliqueamicinaômega 11 (ver, por exemplo, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994));dinemicina, incluindo dinemicina A; uma esperamicina; assim como cromóforosde neocarzinostatina e cromóforos de antiobióticos enedina cromoproteínasrelacionadas), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina,bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina,cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina ADRIAMYCIN® (incluindo morfolino-doxorubicina,cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina e deoxidoxorubicina),epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas comomitomicina C1 ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina,potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina,estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabólitoscomo metotrexato e 5-fluorouracil (5-FU); análogos de ácido fólico comodenopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina comofludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidinacomo ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina,doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tais como calusterona,propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; ácido fólicorestabelecedor como ácido frolínico; aceglatona; glicosídeo de aldofosfamida;ácido aminolevulínico; eniluracil; ansacrina; bestrabucila; bisantreno;edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato deeliptinio; uma epotilona; etoglucídeo; nitrato de gálio; hidroxiurea; lentinan;lonidainina; maitansinóides como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona;mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina;losoxantrona; 2-etil hidrazida; procarbazina; complexos polissacarídeos PSK®(JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxana; rizoxina; sizofirana;spirogermanio; ácido tenuazonico; triaziquona; 2,2\2"-tricloro trietil amina;tricotecenos (especialmente toxina T2, verracurina A, roridina A e anguidina);uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina; manomustina;mitobronitol; mitolactol; pipobromana; gacitosina; arabinosida ("Ara-C"); tiotepa;taxóides, por exemplo, paclitaxel TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton, N.J.), ABRAXANE™ livre de Cremofor, formulação de paclitaxel denanopartículas de albumina modificada (American Pharmaceutical Partners,Schaumberg, Illinois) e doxetaxel TAXOTERE® (Rhône-Poulenc Rorer, Antony,France); cloranbucila; gencitabina (GEMZAR®); 6-tioguanina; mercaptopurina;metotrexato; análogos da platina como cisplatina e carboplatina; vinblastina(VELBAN®); platina; etoposide (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina(O N COVIN®); oxaliplatina; leucovovina; vinorelbina (NAVELBINE®);novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inibidortopoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinóides como ácidoretinóico; capecitabina (XELODA®); sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidosou derivados de qualquer dos acima; assim como combinações de dois oumais dos acima tais como CHOP, uma abreviação para uma terapia combinadade ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina e prednisolona, e FOLFOX, umaabreviação para um regime de tratamento com oxaliplatina (ELOXATIN)combinado com 5-FU e leucovorina.

Também incluídos nesta definição estão os agentes anti-hormonais que agem para regular, reduzir, bloquear, ou inibir os efeitos dehormônios que podem promover o crescimento de câncer, e estãofreqüentemente na forma de tratamento sistêmico ou do corpo inteiro. Elespodem ser os próprios hormônios. Exemplos incluem anti-estrógenos emoduladores seletivos do receptor de estrógeno (SERMs), incluindo, porexemplo, tamoxifeno (incluindo tamoxifen NOLVADEX®), raloxifeno EVISTA®,droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona etoremifene FARESTON®; anti-progesteronas; infra-reguladores de receptoresde estrógeno (ERDs); agentes de função de supressão ou bloqueio dosovários, por exemplo, agonistas de hormônios que liberam hormônioluteinizante (LHRH) como acetato de Ieuprolida LUPRON® e ELIGARD®,acetato de goserelina, acetato de buserelina e tripterelina; outros anti-androgênicos como flutamida, nilutamida e bicalutamida; e inibidoresaromatase que inibem a enzima aromatase, a qual regula a produção deestrógeno nas glândulas adrenais como, por exemplo, 4(5)-imidazolas,aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano(AROMASIN®), formestano, fadrozola, vorozola RIVISOR®, IetrozolaFEMARA®, e anastrozola ARIMIDEX®. Além disso, tal definição de agentesquimioterapêuticos inclui bisfosfonatos tais como clodronato (por exemplo,BONEFOS® ou OSTAC®), etidronato DIDROCAL®, NE-58095, ácidozoledrônico/zoledronato ZOMETA®, alendronato FOSAMAX®, pamidronatoAREDIA®, tiludronato SKELID®, ou risedronato ACTONEL®; assim comotroxacitabina (uma 1,3-dioxolana nucleosídeo citosina análoga);oligonucleotídeos anti-sentido, em específico aqueles que inibem expressão degenes nas vias de sinalização implicadas na proliferação celular anormal, taiscomo, por exemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras, e receptor do fator de crescimentoepidermal (EGF-R); vacinas tais como vacina THERATOPE® e vacinas deterapia de gene, por exemplo, vacina ALLOVECTIN®, vacina LEUVECTIN®, evacina VAXID®; inibidor topoisomerase 1 LU RTOTECAN®; rmRHABARELIX®; Iapatinib ditosilato (um duplo inibidor de molécula pequena detirosina quinase EGFR e ErbB2 também conhecido como GW572016); e saisfarmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de qualquer um dos acima.

Um "agente inibitório de crescimento" quando usado no presentepedido refere-se a um composto ou composição que inibe o crescimento deuma célula, (como uma célula que expressa EGFL7) tanto in vitro como inDessa forma, o agente inibitório de crescimento pode ser aquele que reduzsignificativamente a porcentagem de células (como células que expressamEGFL7) na fase S. Exemplos de agentes inibitórios de crescimento incluemagentes que bloqueiam a progressão do ciclo celular (em um local, exceto nafase S), como agentes que induzem a interrupção de G1 e interrupção da faseM. Bloqueadores clássicos da fase M incluem as vincas (vincristina evinblastina), taxanos e inibidores topoisomerase Il tais como doxorubicina,epirubicina, daunorubicina, etoposido e bleomicina. Esses agentes quecapturam G1 também se espalham na captura da fase S, por exemplo, agentesalcalinizantes de DNA como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina,mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluor uracila e ara-C. Informaçõesadicionais podem ser encontradas em The Molecular Basis of Câncer,Mendelsohn e Israel, eds., Capítulo 1, entitu.ado "Cell cycle regulation,oncogenes, e antineoplastic drugs" por Murakami et a/. (WB Saunders:Philadelphia, 1995), especialmente pág. 13. Os taxanos (paclitaxel e docetaxel)são drogas anti-câncer, ambas derivadas do teixo. Docetaxel (TAXOTERE®,Rhone-Poulenc Rorer), derivado do teixo europeu, é um análogo semi-sintéticodo paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). Paclitaxel e docetaxelpromovem a montagem de microtúbulos de dímeros de tubulina e estabilizammicrotúbulos pela prevenção da despolimerização, que resulta na inibição demitose nas células."Doxorubicina" é um antibiótico antraciclina. A nomenclaturaquímica completa de doxorubicina é (8S-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-trideoxi-a-L-lixo-hexapiranosil)oxi]-7,8,9J0-tetrahidro-6,8J1-trihidroxi-8-(hidroxiacemetoxi-5,12-naftacenediona.

O termo "polipeptídeo que compreende região Fc" refere-se a umpolipeptídeo, como um anticorpo ou imunoadesina (ver definições no presentepedido), que compreende uma região Fe. A Iisina C-terminal (resíduo 447 deacordo com o sistema de numeração EU) da região Fc pode ser removida, porexemplo, durante a purificação do polipeptídeo ou pela modificaçãorecombinante do ácido nucléico engenheirado que codifica o polipeptídeo.

Consequentemente, a composição que compreende um polipeptídeo que temuma região Fc de acordo com esta invenção pode compreender ospolipeptídeos com K447, com todo K447 removido ou uma mistura dospolipeptídeos com ou sem o resíduo K447.

Composições Da Invencão E Metodos Para Produzir A Mesma

Esta invenção abrange composições, incluindo composiçõesfarmacêuticas, que compreendem um anticorpo anti-EGFL7; e polinucleotídeosque compreendem seqüências que codificam um anticorpo anti-EGFL7. Comousado no presente pedido, composições compreendem um ou mais anticorposque se ligam ao EGFL7, e/ou um ou mais polinucleotídeos que compreendemseqüências que codificam um ou mais anticorpos que se ligam ao EGFL7.Estas composições podem também compreender veículos adequados, comoexcipientes farmaceuticamente aceitáveis incluindo tampões, que são bemconhecidos na técnica.

A invenção também abrange realizações de anticorpo epolinucleotídeo isolados. A invenção também abrange realizações de anticorpoe polinucleotídeo substancialmente puros.

Os anticorpos anti-EGFL7 da invenção são preferivelmentemonoclonais. Também incluídos dentro do escopo da invenção estão osfragmentos Fab1 Fab11 Fab1-SH e F(ab')2. dos anticorpos anti-EGFL7 fornecidosno presente pedido. Estes fragmentos de anticorpos podem ser criados pormeios tradicionais, como digestão enzimática ou podem ser gerados portécnicas recombinantes. Tais fragmentos de anticorpos podem ser quiméricosou humanizados. Estes fragmentos são úteis para o diagnóstico e propósitosterapêuticos apresentados abaixo.

Anticorpos monoclonais são obtidos de uma população deanticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais quecompreendem a população são idênticos, exceto pela possível ocorrêncianatural de mutações que podem estar presentes em menor quantidade. Dessaforma, o modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como nãosendo uma mistura de anticorpos distintos.

Anticorpos monoclonais anti-EGFL7 da invenção podem serfabricados usando-se o método de hibridoma descrito pela primeira vez porKohler et al„ Nature 256:495 (1975) ou podem ser fabricados pelos métodos deDNA recombinante (patente US 4.816.567).

No método de hibridoma, um camundongo ou outro animalhospedeiro apropriado, como hamster, é imunizado para gerar linfócitos queproduzem ou são capazes de produzir anticorpos que irão se ligarespecificamente à proteína usada para imunização. Anticorpos para EGFL7geralmente são cultivados em animais por múltiplas injeções subcutâneas (sc)ou intraperitoniais (ip) do EGFL7 e um adjuvante. EGFL7 pode ser preparadousando-se métodos bem conhecidos na técnica, alguns destes são tambémdescritos no presente pedido. Por exemplo, a produção recombinante deEGFL7 está descrita abaixo. Em uma realização, os animais são imunizadoscom um derivado de EGFL7 que contém o domínio extracelular (ECD) doEGFL7 unido à porção Fc de uma cadeia pesada da imunoglobulina. Em umarealização preferida, os animais são imunizados com uma proteína de fusãoEGFL7-lgG1. Os animais geralmente são imunizados contra conjugadosimunogênicos ou derivados do EGFL7 com lipídeo A monofosforil(MPL)/dimicolato de trealose (DMT) (Ribi Immunochem. Research, Inc.,Hamilton, MT) e a solução é injetada intradermicamente em múltiplos locais.Duas semanas depois os animais são estimulados. Sete a quatorze diasdepois os animais são sangrados e o soro é analisado para titulação do anti-EGFL7. Os animais são estimulados até a titulação platô.

Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Oslinfócitos são então fundidos com uma linhagem de células de mieloma,utilizando-se um agente de fusão apropriado, como polietileno glicol, paraformar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies andPractice, páginas 59-103 (Academic Press, 1986)).

As células de hibridoma preparadas desta forma são semeadas ecultivadas em meio de cultura adequado, que contém preferivelmente uma oumais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das células demieloma parentais não fundidas. Por exemplo, se as células de mielomaparentais não contêm a enzima hipoxantina-guanina fosforibosil transferase(HGPRT ou HPRT), o meio de cultura selecionado para os hibridomastipicamente incluirá hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT),substâncias que evitam o crescimento de células com deficiência de HGPRT.

Células de mieloma preferidas são aquelas que se fundemeficientemente, apoiam a produção de anticorpos estáveis em alto nível pelascélulas produtoras de anticorpos selecionadas e são sensíveis a um meio comomeio HAT. Entre estas, linhagens celulares de mieloma preferidas são aslinhagens de mieloma de murino, como aquelas derivadas de tumores decamundongos MOPC-21 e MPC-11 disponíveis por meio do Salk Institute CellDistribution Center, San Diego, Califórnia, EUA, e SP-2 ou células X63-Ag8-653 disponíveis por meio da Coleção Americana de Tipos de Cultura, Rockville,Maryland1 EUA. Linhagens celulares de mieloma humano e heteromielomahumano de camundongo também foram descritas para a produção deanticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); eBrodeur et ai, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,páginas 51-63 (Mareei Dekker1 Inc., Nova York, 1987)).

O meio de cultura no qual as células de hibridoma estãocrescendo é testado para a produção de anticorpos monoclonais dirigidoscontra EGFL7. Preferivelmente, a especificidade de ligação de anticorposmonoclonais produzidos por células de hibridoma é determinada por meio deimunoprecipitação ou por um teste de ligação in vitro, como radioimunoensaio(RIA) ou ensaio imunoabsorvente ligado a enzimas (ELISA).

A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode, porexemplo, ser determinada por meio da análise Scatchard de Munson et ai,AnaiBiochem., 107:220 (1980).

Após células de hibridoma serem identificadas para produção deanticorpos de especificidade, afinidade e/ou atividade desejadas, os clonespodem ser subclonados por meio da limitação de procedimentos de diluição ecultivados por meio de métodos padrão (Goding, Monoclonal Antibodies:

Principies and Practice, páginas 59-103 (Academic Press, 1986)). O meio decultura adequado para este propósito inclui, por exemplo, meio D-MEM ouRPMI-1640. Além disso, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivocomo tumores de ascite em um animal.

Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones sãoadequadamente separados do meio de cultura, fluido de ascite ou soro, porprocedimentos de purificação de imunoglobulina convencionais, como porexemplo, proteína A Sefarose, cromatografia sobre hidroxilapatita, eletroforeseem gel, diálises ou cromatografia de afinidade.Os anticorpos anti-EGFL7 da invenção podem ser feitos pelo usode bibliotecas combinatórias para seleção de clones de anticorpos sintéticoscom a(s) atividade(s) desejada(s). Em princípio, clones de anticorpos sintéticossão selecionados pela separação de bibliotecas de fago contendo fagos queexpõem vários fragmentos da região variável do anticorpo (Fv) unida à proteínade revestimento do fago. Tais bibliotecas de fago são agrupadas porcromatografia de afinidade contra o antígeno desejado. Clones que expressamfragmentos Fv capazes de se ligar ao antígeno desejado são adsorvidos aoantígeno e então separados dos clones sem ligação na biblioteca. Os clonesde ligação são então eluídos do antígeno e podem ser também aprimoradospor ciclos adicionais de adsorção/elução de antígeno. Alguns dos anticorposanti-EGFL7 da invenção podem ser obtidos pelo projeto de um procedimentode seleção de antígeno adequado para selecionar o clone de fago de interesse,seguido pela construção de um clone do anticorpo anti-EGFL7 completo,usando-se as seqüências Fv do clone de fago de interesse e seqüências deregião constante adequadas (Fc) descritas em Kabat et a/., Sequences ofProteins of Immunological Interest, 5a Edição, NIH Publicação 91-3242,Bethesda MD (1991), volumes.

O domínio de ligação do antígeno de um anticorpo é formado porduas regiões variáveis (V) de cerca de 110 aminoácidos, uma cadeia leve (VL)e uma pesada (VH)1 e ambas apresentam três alças hipervariáveis e regiõesdeterminadas por complementaridade (CDRs). Domínios variáveis podem serexibidos de forma funcional no fago, tanto como fragmentos Fv de cadeia única(scFv), nos quais VH e VL estão ligadas covalentemente através de umpeptídeo curto e flexível, ou como fragmentos Fab, nos quais eles estão unidosa um domínio constante e interagem de forma não covalente, como descrito emWinter et a/., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-55 (1994). Como usado no presentepedido, clones de fago que codificam scFv e clones de fago que codificam Fabsão coletivamente chamados de "clones de fago Fv" ou "clones Fv".

Repertórios de genes VH e VL podem se clonadosseparadamente por reação em cadeia da polimerase (PCR) e recombinadosaleatoriamente em bibliotecas de fago, que podem então ser selecionadas paraclones de ligação de antígeno como descrito em Winter et ai, Ann. Rev.Immunol., 12: 433-55 (1994). Bibliotecas de fontes imunizadas fornecemanticorpos de alta afinidade ao imunógeno, sem a necessidade da construçãode hibridomas. Alternativamente, o repertório virgem pode ser clonado comouma fonte única de anticorpos humanos para uma variedade de antígenospróprios e não-próprios sem qualquer imunização, como descrito por Griffiths etai EMBO J, 12: 725-34 (1993). Finalmente, bibliotecas virgens podemtambém ser feitas sinteticamente pela clonagem dos segmentos do gene V,rearranjados a partir de células-tronco e usando-se primers de PCR quecontêm a seqüência aleatória para codificar as regiões altamente variáveis daCDR3 e para realizar o rearranjo in vitro como descrito Hoogenboom & Winter,J. Moi Bioi, 227:381-88 (1992).

Fago filamentoso é usado para exibir fragmentos de anticorpospela fusão à proteína de revestimento plll menor. Os fragmentos de anticorpopodem ser exibidos como fragmentos Fv de cadeia única, nos quais osdomínios VH e VL estão conectados na mesma cadeia polipeptídica por umespaçador polipeptídico flexível, por exemplo, como descrito por Marks et ai, J.Moi Bioi 222:581-597 (1991), ou como fragmentos Fab1 nos quais uma cadeiaestá unida a plll e a outra é secretada no periplasma da célula hospedeirabacteriana onde ocorre a montagem de uma estrutura de proteína derevestimento de Fab que se torna exibida na superfície do fago pelodeslocamento de algumas proteínas de revestimento tipo selvagem, porexemplo, como descrito em Hoogenboom et ai, Nuci Acids Res. 19:4133-37(1991).Em geral, ácidos nucléicos que codificam fragmentos de gene doanticorpo são obtidos a partir de células imunes colhidas a partir de humanosou animais. Se uma biblioteca induzida em favor de clones anti-EGFL7 édesejada, o sujeito é imunizado com EGFL7 para gerar uma resposta doanticorpo, e as células de baço e/ou células B de circulação e outros linfócitosdo sangue periférico (PBLs) são recuperados a partir da construção dabiblioteca. Em uma realização preferida, uma biblioteca de fragmento de genedo anticorpo humano induzida em favor de clones anti-EGFL7 humanos éobtida pela geração da resposta do anticorpo anti-EGFL7 humano emcamundongos transgênicos que carregam um arranjo do gene daimunoglobulina humana funcional (e sem um sistema de produção do anticorpoendógeno funcional) como aquela imunização EGFL7 que ativa células B paraprodução de anticorpos humanos contra EGFL7. A geração de camundongostrasngênicos que produzem anticorpos humanos está descrita abaixo.

Aprimoramentos adicionais para populações de células reativasanti-EGFL7 podem ser obtidos pelo uso de um procedimento adequado paraisolar células B que expressam anticorpo ligado à membrana específico paraEGFL7, por exemplo, pela separação celular com cromatografia de afinidadeEGFL7 ou adsorção de células para EGFL7 marcadas com fluorcromo seguidopela seleção celular ativada por fluxo (FACS).

Alternativamente, o uso de células de baço e/ou células B ououtras PBLs de um doador imunizado fornece uma melhor representação dopossível repertório do anticorpo, e também permite a construção de umabiblioteca de anticorpo usando-se qualquer espécie animal (humana ou não-humana) em que EGFL7 não é antigênico. Para bibliotecas que incorporam aconstrução do gene do anticorpo in vitro, células-tronco são colhidas do sujeitopara fornecer ácidos nucléicos que codificam segmentos de gene nãorearranjados do anticorpo. As células imunes de interesse podem ser obtidas apartir de uma variedade de espécies animais, como humanos, camundongos,ratos, lagomorfos, caprinos, caninos, felinos, suínos, bovinos, eqüinos,espécies de aves, etc.

Ácidos nucléicos que codificam segmentos de gene variável doanticorpo (incluindo segmentos VH e VL) são recuperados a partir de célulasde interesse e amplificados. No caso de bibliotecas de gene VH e VLrearranjados, o DNA desejado pode ser obtido pelo isolamento do DNA ouRNA genômico a partir dos linfócitos pela reação em cadeia da polimerase(PCR) com primers que são compatíveis com as terminações 5' e 3' dos genesVH e VL rearranjados, como descrito em Orlandi et ai, Proc. Natl. Acad. Sei.USA, 86:3833-37 (1989), com isso produzindo diversos repertórios de gene Vpara expressão. Os genes V podem ser amplificados a partir do cDNA e DNAgenômico, com primers reversos na terminação 5' do exon que codifica odomínio de V maduro e primers forward apoiados no segmento de J, comodescrito em Orlandi et al. (1989) e em Ward et ai, Nature, 341:544-46 (1989).No entanto, para amplificação do cDNA, primers reversos podem também estarapoiados no exon líder, como descrito em Jones et ai, Biotechnol. 9:88-89(1991), e primers forward na região constante, como descrito em Sastry et ai,Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 86:5728-32 (1989). Para maximizar acomplementaridade, a degeneração pode ser incorporada nos primers, comodescrito em Orlandi et ai (1989) ou Sastry et ai (1989). Preferencialmente, adiversidade da biblioteca é maximizada pelo uso de primers de PCRdirecionados à família do gene V, a fim de amplificar todas as disposições VH eVL disponíveis, presentes na amostra de ácido nucléico da célula imune, porexemplo, como descrito no método de Marks et ai, J. Mol. Bioi, 222:581-97(1991) ou como descrito no método de Orum et al., Nuci Acids Res. 21:4491-4498 (1993). Para clonagem do DNA amplificado nos vetores de expressão,sítios de restrição raros podem ser introduzidos no primer de PCR como um tagem uma terminação, como descrito em Orlandi et ai (1989), ou por posterioramplificação por PCR com um primer tag, como descrito em Clackson et ai,Nature, 352:624-628 (1991).

Repertórios de genes V rearranjados sinteticamente podem serderivados in vitro a partir de segmentos de gene V. A maioria dos segmentosdo gene VH humano foi clonado e seqüenciado (relatado em Tomlinson et ai,J. Moi Bioi 227:776 (1992)), e mapeados (relatado em Matsuda et a!., NatureGenet. 3:88-94 (1993); estes segmentos clonados (incluindo todas as principaisconformações da alça H1 e H2) podem ser usados para gerar repertórios degene VH diverso com primers de PCR que codificam alças H3 Ioops daseqüência diversa e comprimento, como descrito em Hoogenboom & Winter, J.Moi Biol., 227:381-88 (1992). Repertórios VH também podem ser feitos comtoda a diversidade de seqüência focada na alça H3 longa de um únicocomprimento, como descrito em Barbas et al., Proc. Nati Acad. Sei. USA,89:4457-61 (1992). Segmentos humanos Vk e VA foram clonados esequenciados (relatado em Williams & Winter, Eur. J. Immunoi 23:1456-61(1993)) e podem ser usados para produzir repertórios de cadeia leve sintéticos.Repertórios do gene V sintético, baseado em uma variação de cópias de VH eVL, e comprimento de L3 e H3, irão codificar anticorpos de diversidadeestrutural considerável. Seguindo amplificação dos DNAs que codificam genesV, segmentos do gene V de linhagem germinativa podem ser rearranjados invitro para os métodos de Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol., 227:381-88(1992).

Repertórios de fragmentos de anticorpo podem ser construídospela combinação de repertórios dos genes VH e VL juntos, de diversasmaneiras. Cada repertório pode ser criado em diferentes vetores, e os vetoresrecombinados in vitro, por exemplo, como descrito em Hogrefe et ai, Gene,128:119-26 (1993), ou in vivo pela infecção combinatória, por exemplo, osistema IoxP, descrito em Waterhouse et ai, Nuei Acids Res. 21:2265-66(1993). A abordagem de recombinação in vivo explora as duas cadeiasnaturais de fragmentos Fab para superar o limite de tamanho da biblioteca,imposto pela eficiência de transformação pela E. coli. Repertórios virgens VHe VL são clonados separadamente, um dentro de um fagomídeo e o outrodentro de um vetor fago. As duas bibliotecas são então combinadas pelainfecção por fago da bactéria contendo o fagomídeo, de forma que cada célulacontenha uma combinação diferente e o tamanho da biblioteca seja limitadoapenas pelo número de células presentes (cerca de 1012 clones). Ambos osvetores contêm sinais de recombinação in vivo, de forma que os genes VH eVL são recombinados em um único replicon e são co-empacotados em fagosvírions. Estas bibliotecas enormes fornecem um grande número de anticorposdiversos com boa afinidade (Kd'1 de aproximadamente 10"8 M).

Alternativamente, os repertórios podem ser clonadosseqüencialmente em um mesmo vetor, por exemplo, como descrito em Barbaset al., Proc. Nati Acad. Sei. USA 88:7978-82 (1991), ou montados juntos porPCR e então clonados, por exemplo, como descrito em Clackson et al., Nature,352:624-28 (1991). A montagem de PCR também pode ser usada para unirDNAs de VH e VL que codificam um peptídeo espaçador flexível para formarrepertórios Fv (scFv) de cadeia única. Ainda outra técnica, "na montagem PCRna célula" é usada para combinar genes VH e VL com linfócitos por PCR eentão clonar repertórios de genes ligados como descrito em Embleton et ai,Nuci Acids Res. 20:3831-37 (1992).

Os anticorpos produzidos pelas bibliotecas virgens (tanto naturalcomo sintético) podem ser de afinidade moderada (Kd'1 de cerca de 106 até 107Μ-1), mas a maturação da afinidade pode ser imitada in vitro pela construção enova seleção de bibliotecas secundárias, como descrito em Winter et ai(1994), acima Por exemplo, a mutação pode ser introduzida aleatoriamente invitro usando-se polimerase com tendência ao erro (relatado em Leung et ai,Technique 1:11-15 (1989)) no método de Hawkins et ai., J. Mol. Biol. 226:889-96 (1992) ou no método de Gram et ai, Proc. Nati Acad. Sci USA 89:3576-80(1992). Adicionalmente, a maturação da afinidade pode ser realizada pelamutação aleatória de uma ou mais CDRs, por exemplo, usando-se PCR comprimers que carregam seqüência aleatória abrangente da CDR de interessenos clones Fv individuais selecionados e assim selecionando clones deafinidade mais alta. O documento WO 96/07754 (publicado em 14 de março de1996) descreveu um método para indução de mutagênese em uma regiãodeterminada por complementaridade da cadeia leve de uma imunoglobulinapara criar uma biblioteca de genes da cadeia leve. Outra abordagem efetiva érecombinar os domínios VH ou VL selecionados pela exibição por fago comrepertórios de domínios V variantes que ocorrem naturalmente, obtidos dedoadores não imunizados e selecionar afinidade mais alta em diversos ciclosde mistura de cadeia como descrito em Marks et ai, Biotechnoi 10:779-83(1992). Esta técnica permite a produção de anticorpos e fragmentos deanticopos com afinidades na faixa de 10"9 M.

A seqüência de ácido nucléico que codifica o EGFL7 pode serdesignada usando-se a seqüência de aminoácido da região desejada doEGFL7. Alternativamente, a seqüência de cDNA (ou fragmentos destes) podeser usada. Seqüências do EGFL7 adicionais são também divulgadas, porexemplo, em NM_022963 e Xie et ai, Cytokine 11:729-35 (1999). DNAs quecodificam o EGFL7 podem ser preparados por uma variedade de métodosconhecidos na técnica. Estes métodos incluem, mas não se limitam à síntesequímica por qualquer um dos métodos descritos em Engels ef ai, Agnew.Chem. Int. Ed. Engi 28:716-34 (1989), como triéster, fosfito, fosforamidito emétodos H-fosfonato. Em uma realização, os códons preferidos pelaexpressão de células hospedeiras são usados na criação do DNA que codificaEGFL7. Alternativamente, o DNA que codifica EGFL7 pode ser isolado a partirde uma biblioteca ou cDNA genômico.

Seguindo a construção da molécula de DNA que codifica EGFL7,a molécula de DNA é ligada operacionalmente a uma seqüência controle deexpressão em um vetor de expressão, como um plasmídeo, em que aseqüência controle é reconhecida por uma célula hospedeira transformada como vetor. Em geral, vetores plasmídeos contêm replicação e seqüênciascontrole que são derivadas de espécies compatíveis com a célula hospedeira.

O vetor geralmente carrega um sítio de replicação, assim como seqüências quecodificam proteínas que são capazes de fornecer seleção fenotípica em célulastransformadas. Vetores adequados para expressão em células hospedeirasprocariontes e eucariontes são conhecidos na técnica e alguns estão tambémdescritos no presente pedido. Organismos eucariontes, como leveduras oucélulas derivadas de organismos multicelulares, como mamíferos, podem serusados.

Opcionalmente, o DNA que codifica EGFL7 estáoperacionalmente ligado a uma seqüência líder secretória, resultando nasecreção da expressão do produto pela célula hospedeira no meio de cultura.Exemplos de seqüências líder secretórias incluem stll, ecotin, IamB1 herpesGD, Ipp, fosfatase alcalina, invertase e fator alfa. A seqüência líder de 36aminoácidos da proteína A também é adequada para uso no presente pedido(Abrahmsen et ai, EMBO J., 4:3901 (1985)).

Células hospedeiras são transfectadas e preferivelmentetransformadas com os vetores de expressão ou de clonagem desta invenção ecultivadas em meio convencional de nutriente modificado como apropriado parainduzir promotores, selecionar transformantes ou amplificar os genes quecodificam as seqüências desejadas.

Transfecção refere-se ao recolhimento de um vetor de expressãopor uma célula hospedeira, se quaisquer seqüências de codificação são ou nãoexpressas. Numerosos métodos de transfecção são conhecidos para ostécnicos no assunto, por exemplo, precipitação e eletroporação por CaPO4. Atransfecção correta é geralmente reconhecida quando qualquer indicação daoperação deste vetor ocorre dentro da célula hospedeira. Métodos paratransfecção são bem conhecidos na técnica, e alguns estão também descritosno presente pedido.

Transformação significa introdução de DNA em um organismo, deforma que o DNA seja replicável, tanto como um elemento extracromossomalcomo por integrante cromossomal. Dependendo da célula hospedeira usada, atransformação é feita usando-se técnicas padrão apropriadas para tais células.

Métodos para transformação são bem conhecidos na técnica, e alguns estãotambém descritos no presente pedido.

Células hospedeiras procariontes usadas para produzir EGFL7podem ser cultivadas como descrito em Sambrook et ai, acima.

As células hospedeiras de mamífero usadas para produzir EGFL7podem ser cultivadas em uma variedade de meios, que são bem conhecidos natécnica e alguns destes estão descritos no presente pedido.

As células hospedeiras referidas nesta divulgação incluem célulasna cultura in vitro, bem como células que estão em um hospedeiro animal.

A purificação do EGFL7 pode ser realizada usando-se métodosreconhecidos na técnica.

O EGFL7 purificado pode ser anexado a uma matriz adequadacomo esferas de agarose, esferas de acrilamida, esferas de vidro, celulose,vários copolímeros acrílicos, géis hidroxil-metacrilato, copolímeros poliacrílicose polimetacrílicos, nylon, veículos neutros e iônicos, e similares, para uso naseparação cromatográfica de afinidade dos clones de exibição por fago. Aligação da proteína EGFL7 à matriz pode ser realizada pelos métodos descritosem Meth. Enzymol., vol. 44 (1976). Uma técnica comumente empregada paraanexar proteínas Iigantes às matrizes de polissacarídeo, por exemplo, agarose,dextrano ou celulose, envolve ativação do veículo com halóides cianogênios esubsequente acoplamento das aminas alifáticas ou aromáticas primárias dopeptídeo Iigante à matriz ativada.

Alternativamente, EGFL7 pode ser usado para revestir os poçosdas placas de adsorção, expressos nas células hospedeiras afixadas às placasde adsorção, ou usado na seleção celular, ou conjugado à biotina para capturacom esferas revestidas de estreptavidina, ou usado em qualquer outro métodoconhecido na técnica para panorama de bibliotecas de exibição porfago.

As amostras de biblioteca de fago são contatadas com EGFL7imobilizado sob condições adequadas para ligação de pelo menos uma porçãodas partículas de fago com o adsorvente. Normalmente, as condições,incluindo pH, força iônica, temperatura e similares são selecionadas para imitaras condições fisiológicas. Os fagos ligados à fase sólida são lavados e entãoeluídos pelo ácido, por exemplo, como descrito em Barbas et ai, Proc. NatiAcad. Sci USA 88:7978-82 (1991), ou por base alcalina, por exemplo, comodescrito em Marks et ai, J. Moi Bioi, 222:581-97 (1991), ou por competição doantígeno EGFL7, por exemplo, em um procedimento similar ao método decompetição de antígeno de Clackson ef ai, Nature, 352:624-28 (1991). Fagospodem ser enriquecidos de 20 a 1000 vezes em um único ciclo de seleção.

Além disso, os fagos enriquecidos podem ser cultivados em cultura de bactériae sujeitos a ciclos posteriores de seleção.

A eficiência de seleção depende de muitos fatores, incluindo acinética de dissociação durante a lavagem e se fragmentos múltiplos deanticorpos em um único fago podem simultaneamente juntar-se ao antígeno.

Anticorpos com cinética de dissociação rápida (e fraca afinidade de ligação)podem ser mantidos pelo uso de lavagens curtas, exibição por fagomultivalente e alta densidade de revestimento de antígeno na fase sólida. Aalta densidade não apenas estabiliza o fago através de interaçõesmultivalentes, mas favorece a religação do fago que foi dissociado. A seleçãode anticorpos com cinética de dissociação lenta (e boa afinidade de ligação)pode ser mantida pelo uso de lavagens longas e exibição por fago monovalentecomo descrito em Bass et ai, Proteins, 8:309-14 (1990) e no documento WO92/09690, e uma densidade de revestimento de antígeno baixa, como descritoem Marks etal., Biotechnol. 10:779-83 (1992).

É possível selecionar entre anticorpos de fago de diferentesafinidades, mesmo com afinidades que diferem levemente, para EGFL7. Noentanto, é provável que a mutação aleatória de um anticorpo selecionado (porexemplo, como realizado em algumas das técnicas de maturação de afinidadedescritas acima) dê origem a muitos mutantes, a maioria para ligação aoantígeno, e poucos com alta afinidade. Com EGFL7 limitante, fago de afinidaealta raro poderia ser concorrente. Para manter todos os mutantes de afinidademais alta, os fagos podem ser incubados com excesso de EGFL7 biotinilado,mas com o EGFL7 biotinilado a uma concentração de menor molaridade doque a afinidade constante molar alvo para EGFL7. Os fagos de alta afinidadede ligação podem então ser capturados pelas esferas paramagnéticasrevestidas com estreptavidina. Tal "captura de equilíbrio" permite que osanticorpos sejam selecionados de acordo com suas afinidades de ligação, comsensibilidade que permita isolamento de clones mutantes com a menorafinidade possível de até duas vezes de um grande excesso de fago comafinidade mais baixa. As condições usadas nas lavagens de fago, ligados auma fase sólida, podem ser manipuladas para discriminar baseado na cinéticade dissociação. Clones anti-EGFL7 podem ter atividade selecionada.

O DNA que codifica anticorpos monoclonais derivados dehibridoma ou clones de exibição por fago da invenção é facilmente isolado esequenciado usando-se procedimentos convencionais (por exemplo, pelo usode sondas de oligonucleotídeos criadas para amplificar especificamente asregiões de codificação das cadeias leve e pesada de interesse, a partir dohibridoma ou molde de DNA de fago). Uma vez isolado, o DNA pode sercolocado em vetores de expressão, que são então transfectados em célulashospedeiras como células E. coli, células COS de símios, células de ovário dehamster Chinês (CHO), ou células de mieloma que, de outra forma, nãoproduzem proteína da imunoglobulina para obter a síntese dos anticorposmonoclonais desejados nas células hospedeiras recombinantes. Os artigos derevisão sobre expressão recombinante em bactérias de DNA que codificaanticorpo incluem Skerra et ai, Curr. Opinion in ImmunoL 5: 256 (1993) ePlückthun, Immunoi Rev. 130:151 (1992).

O DNA que codifica os clones Fv da invenção pode sercombinado com seqüências de DNA conhecidas que codificam regiõesconstantes da cadeia pesada e/ou leve (por exemplo, as seqüências de DNAapropriadas podem ser obtidas a partir de Kabat et a/., acima) para formarclones que codificam cadeias pesadas e/ou leves, completas ou parciais. Seráapreciado que regiões constantes de qualquer isotipo possam ser usadas paraeste propósito, incluindo regiões constantes IgG, IgM, IGA, IgD e IgE, e taisregiões constantes podem ser obtidas a partir de qualquer espécie humana ouanimal. O clone Fv derivado do DNA de domínio variável de uma espécieanimal (como humana) e então fundido ao DNA de região constante de outraespécie animal para formar seqüências de codificação para cadeias pesadase/ou leves "híbridas" completas está incluído na definição de anticorpo"quimérico" e "híbrido", como usado no presente pedido. Em uma realizaçãopreferida, um clone Fv derivado do DNA variável humano é fundido ao DNA deregião constante humana para formar seqüências de codificação para todas ascadeias pesadas e/ou leves humanas completas ou parciais.O DNA que codifica um anticorpo anti-EGFL7 a partir de umhibridoma da invenção pode ser também modificado, por exemplo, pelasubstituição das seqüências de codificação pelos domínios constantes decadeias pesada e leve humanas no lugar das seqüências de murino homólogasderivadas a partir do clone de hibridoma (por exemplo, como no método deMorrison, ef a/., Proa. NatAoad.Soi.USA, 81:6851-55 (1984)). O DNA quecodifica um hibridoma ou anticorpo derivado do clone ou fragmento Fv pode serainda modificado pela junção covalente à seqüência codificadora daimunoglobulina de toda ou parte da seqüência codificadora para umpolipeptídeo não-imunoglobulina. Desta maneira, anticorpos "quiméricos" ou"hídridos" são preparados para ter a especificidade de ligação dos anticorposderivados do clone Fv ou do clone de hibridoma da invenção.

Fragmentos De Anticorpos

A presente invenção inclui fragmentos de anticorpos. Em certascircunstâncias existem vantagens em usar fragmentos de anticorpos ao invésde anticorpos inteiros. O menor tamanho dos fragmentos permite rápidaliberação e pode levar à melhora do acesso à tumores sólidos.

Foram desenvolvidas várias técnicas para a produção defragmentos de anticorpos. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivadosvia digestão proteolítica de anticorpos intactos (ver, por exemplo, Morimoto eta/., J. Biochem. Biophys. Meth. 24:107-17 (1992) e Brennan et ai, Science,229:81 (1985)). Entretanto, esses fragmentos podem ser agora produzidosdiretamente por células hospedeiras recombinantes. Fragmentos de anticorposFab, Fv e ScFv podem ser todos expressos e secretados a partir de E. co//,permitindo assim a fácil produção de grandes quantidades desses fragmentos.Os fragmentos de anticorpos podem ser isolados a partir de bibliotecas de fagode anticorpos discutidas acima. Alternativamente, fragmentos de Fab'-SHpodem ser recuperados diretamente a partir de E. coli e acopladosquimicamente para formar fragmentos de F(Bb1)2 (Carter et al„ BioiTechnoIogy10:163-67 (1992)). De acordo com outra abordagem, fragmentos de F(ab')2podem ser isolados diretamente a partir da cultura de células hospedeirasrecombinantes. Fragmentos Fab e F(Bb1)2 com meia-vida aumentada in vivoque compreendem resíduos do epitopo de ligação do receptor de resgate estãodescritos na patente US 5.869.046. Outras técnicas para a produção defragmentos de anticorpos serão evidentes para os técnicos no assunto. Emoutras realizações, o anticorpo de escolha é um fragmento Fv de cadeia única(scFv). Ver documento WO 93/07378, patentes US 5.571.894 e US 5.587.458.Fv e sFv são os únicos tipos com sítios de combinação intactos desprovidos deregiões constantes, então, eles são adequados ligação não específica reduzidadurante o uso in vivo. Proteínas de fusão sFv podem ser construídas paraproduzir fusão de uma proteína efetora, tanto na terminação amina comocarboxila de um sFv. Ver Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, W.H. Freemane Company (1992). O fragmento de anticorpo pode também ser um "anticorpolinear", por exemplo, como descrito na patente US 5.641.870, por exemplo.Tais fragmentos de anticorpo linear podem ser monoespecíficos oubiespecíficos.

Anticorpos Humanizados

A presente invenção engloba anticorpos humanizados. Váriosmétodos para humanizar anticorpos não humanos são conhecidos na técnica.Por exemplo, um anticorpo humanizado pode ter um ou mais resíduos deaminoácido introduzidos neste, a partir de uma fonte não humana. Estesresíduos de aminoácidos não humanos são freqüentemente chamados deresíduos "importados", os quais são tipicamente retirados de um domíniovariável "importado". A humanização pode ser essencialmente realizadaseguindo-se o método de Winter e colaboradores (Jones et ai, Nature,321:522-25 (1988); Riechmann et ai., Nature, 332:323-27 (1988); Verhoeyen etal., Science, 239:1534-36 (1988)), pela substituição de seqüências de regiõeshipervariáveis pelas seqüências correspondentes de um anticorpo humano.Consequentemente, tais anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos(patente US 4.816.567), em que substancialmente menos de um domíniovariável humano intacto foi substituído pela seqüência correspondente de umaespécie não humana. Na prática, anticorpos humanizados são tipicamenteanticorpos humanos em que alguns resíduos de região hipervariável epossivelmente alguns resíduos FR são substituídos por resíduos de sítiosanálogos em anticorpos de roedores.

A escolha de domínios variáveis humano, tanto leve comopesado, para serem usados na fabricação de anticorpos humanizados é muitoimportante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o método tambémconhecido como "melhor ajuste", a seqüência de domínio variável de umanticorpo de roedor é selecionada em relação à completa biblioteca dasseqüências de domínio variável humana conhecida. A seqüência humana maispróxima daquela de roedor é então aceita como a região de estrutura humanapara o anticorpo humanizado (Sims et ai, J. Immunol., 151:2296 (1993);Chothia et ai, J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Outro método utiliza uma regiãode estrutura específica derivada a partir da seqüência consenso de todos osanticorpos humanos de um subgrupo específico de cadeia leve ou pesada. Amesma estrutura pode ser utilizada para vários anticorpos humanizadosdiferentes (Carter et al„ Proc. Nati Acad. Sci U. S. A., 89: 4285 (1992); Prestaet al., J. Immunoi, 151:2623 (1993)).

É ainda importante que anticorpos sejam humanizados comretenção de alta afinidade para o antígeno e outras propriedades biológicasfavoráveis. Para atingir este objetivo, de acordo com um método, anticorposhumanizados são preparados por um processo de análise de seqüênciasparentais e vários produtos humanizados conceituais, usando-se modelostridimensionais das seqüências parental e humanizada. Modelos deimunoglobulina tridimensional estão comumente disponíveis e são familiarespara aqueles técnicos no assunto. Programas de computador estãodisponíveis, os quais ilustram e exibem possíveis estruturas de conformaçãotridimensional das seqüências de imunoglobulina candidata selecionada. Ainspeção destas exibições permite análise do papel provável no funcionamentoda seqüência de imunoglobulina candidata, isto é, a análise de resíduos queinfluenciam a capacidade da imunoglobulina candidata se ligar ao seuantígeno. Desta maneira, resíduos FR podem ser selecionados e combinadosdas seqüências do receptor e importada de forma que a característica doanticorpo desejada, tal como aumento de afinidade para o antígeno(s) alvo, éatingida. Em geral, resíduos de região hipervariável são diretamente e maissubstancialmente envolvidos na influência da ligação ao antígeno.

Anticorpos Humanos

Anticorpos anti-EGFL7 humanos da invenção podem serconstruídos pela combinação de seqüências de domínio variável do clone Fvselecionadas de bibliotecas de exibição por fago com seqüências de domínioconstante humanas, como descrito acima. Alternativamente, anticorpos anti-EGFL7 monoclonais humanos da invenção podem ser produzidos pelo métodode hibridoma. Linhagens celulares de mieloma humano e heteromielomahumano de camundongo também foram descritas para a produção deanticorpos monoclonais humanos, por exemplo, por Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); e Brodeur et ai, MonocIonaIAntibody Productlon Techniques andApplications, páginas 51-63 (Mareei Dekker, Inc., Nova York, 1987)); e Boerneret ai, J. Immunoi, 147:86(1991).

Agora é possível produzir animais transgênicos (por exemplo,camundongos) que são capazes, mediante imunização, de produzir repertóriocompleto de anticorpos humanos na ausência da produção de imunoglobulinaendógena. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigótica do gene (JH)da região de união da cadeia pesada do anticorpo em camundongos delinhagem germinativa mutante e camundongos quiméricos, resulta na inibiçãocompleta da produção de anticorpo endógeno. A transferência conjunto degene de imunoglobulina da linhagem germinativa humana em tais linhagensgerminativas de camundongo mutante resultará na produção de anticorposhumanos mediante desafio com antígeno. Ver, por exemplo, Jakobovits et ai,Proc. Nati Acad. Sei. USA., 90:2551 (1993); Jakobovits et ai, Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et ai, Yearin Immunoi 7:33 (1993).

A mistura de genes pode também ser usada para derivaranticorpos humanos a partir de anticorpos não humanos de roedores, porexemplo, onde o anticorpo humano possui afinidades similares eespecificidades com o anticorpo não humano. De acordo com este método,que é também chamado de Imprinting do epitopo", a região variável da cadeialeve ou pesada de um fragmento de anticorpo não humano obtido pelastécnicas de exibição por fago, como descrito acima, é substituído por umrepertório de genes do domínio V humano, criando uma população de cadeiasscFv não-humanas/humanas ou FAB quiméricas. A seleção com antígenosresulta no isolamento de uma cadeia não-humana/cadeia quimérica humanascFv ou Fab em que a cadeia humana restaura o sítio de ligação ao antígeno,destruído pela remoção da cadeia não humana correspondente no cloneprimário exibido por fago, isto é, o epitopo dirige (imprime) a escolha da cadeiahumana parceira. Quando o processo é repetido com o objetivo de substituir odomínio V da cadeia não humana remanescente, um anticorpo humano éobtido (ver pedido de patente PCT documento WO 93/06213, publicado em 1de abril de 1993). Diferente da humanização tradicional de anticorpos nãohumanos por enxerto de CDR, esta técnica fornece anticorpos completamentehumanos, que não possuem estrutura ou resíduos Fr ou CDR de origem nãohumana.

ANTICOPOS BIESPECÍFICOS

Os anticorpos biespecíficos são monoclonais, preferencialmentehumanos ou humanizados, anticorpos que possuem especificidades de ligaçãopara pelo menos dois antígenos diferentes. No caso presente, uma dasespecificidades de ligação é para EGFL7 e a outra é para qualquer outroantígeno. Anticorpos biespecíficos exemplares podem se ligar a dois epitoposdiferentes da proteína EGFL7. Anticorpos biespecíficos podem também serusados para localizar agentes citotóxicos para células que expressam EGFL7.Estes anticorpos possuem um braço de ligação de EGFL7 e um braço que seliga ao agente citotóxico (por exemplo, saporina, anti-interferon-α, alcalóide davinca, ricina de cadeia A, metotrexato ou hapteno de isótopo radioativo).Anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos completos oufragmentos de anticorpos (por exemplo, anticorpos biespecíficos F(ab')2).

Métodos de fabricação de anticorpos biespecíficos sãoconhecidos na técnica. Tradicionalmente, a produção recombinante deanticorpos biespecíficos é baseada na coexpressão de dois pares da cadeialeve e cadeia pesada da imunoglobulina, onde as duas cadeias pesadaspossuem especificidades diferentes (Millstein & Cuello., Nature, 305:537(1983)). Devido à escolha aleatória das cadeias leve e pesada daimunoglobulina, esses hibridomas (quadromas) produzem uma misturapotencial de dez moléculas de anticorpos diferentes, das quais apenas umapossui a estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta, queé normalmente realizada por meio de etapas de cromatograf.a de afinidade, éum tanto problemática, e os rendimentos de produto são baixos.Procedimentos similares estão divulgados no documento WO 93/08829publicado em 13 de maio de 1993 e em Traunecker et a/., EMBO J. 10:3655(1991).De acordo com uma abordagem diferente e mais preferida,domínios variáveis de anticorpos com as especificidades de ligação desejadas(sítios de combinação de antígeno-anticorpo) são fundidos à seqüências dodomínio constante da imunoglobulina. A fusão é, preferencialmente, com umdomínio constante da cadeia pesada da imunoglobulina, que compreende pelomenos parte das regiões de dobradiça, CH2 e CH3. É preferível ter a primeiraregião constante da cadeia pesada (CH1), contendo o sítio necessário para aligação da cadeia leve, presente em pelo menos uma das fusões. Os DNAsque codificam as fusões da cadeia pesada da imunoglobulina e, se desejado, acadeia leve da imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressãoseparados e são co-transfectados em um organismo hospedeiro adequado.Isso fornece grande flexibilidade no ajuste das proporções mútuas dos trêsfragmentos do polipeptídeo em realizações onde razões desiguais das trêscadeias do polipeptídeo utilizadas na construção fornecem o máximo derendimento. É possível, no entanto, inserir seqüências de codificação paraduas ou todas as três cadeias de polipeptídeos em um único vetor deexpressão, quando a expressão de pelo menos duas cadeias do polipeptídeoem razões iguais resulta em altos rendimentos ou quando as razões não sãode significância específica.

Em algumas realizações preferidas desta abordagem, osanticorpos biespecíficos são compostos de uma cadeia pesada daimunoglobulina híbrida com a primeira especificidade de ligação em um braço,e um par de cadeias leve e cadeia pesada da imunoglobulina híbrida (quefornece uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Concluiu-seque essa estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecíficodesejado das combinações de cadeia da imunoglobulina indesejadas, pois apresença da cadeia leve da imunoglobulina em apenas metade da moléculabiespecífica fornece uma maneira fácil de separação. Esta abordagem estádescrita no documento WO 94/04690. Para maiores detalhes da geração deanticorpos biespecíficos, ver, por exemplo, Suresh et al., Methods inEnzymology, 121:210(1986).

De acordo com outra abordagem, a interface entre um par demoléculas de anticorpo pode ser modificada geneticamente para maximizar aporcentagem de heterodímeros que são recuperados a partir da cultura decélulas recombinantes. A interface preferida compreende pelo menos umaparte do domínio CH3 de um domínio constante do anticorpo. Neste método,uma ou mais cadeias laterais de aminoácidos pequenos da interface daprimeira molécula de anticorpo são substituídas por cadeias laterais maiores(por exemplo, tirosina ou triptofano). "Cavidades" compensatórias de tamanhoidêntico ou similar à(s) cadeia(s) lateral(is) grande(s) são criadas sobre ainterface da segunda molécula de anticorpo, pela substituição de grandescadeias laterais de aminoácidos por cadeias menores (por exemplo, alanina outreonina). Isso fornece um mecanismo de aumento de produção doheterodímero sobre outros produtos finais indesejados, como homodímeros.

Anticorpos biespecíficos incluem anticorpos reticulados ou«heteroconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado podeser acoplado à avidina e o outro à biotina. Tais anticorpos, por exemplo, forampropostos para atingir células do sistema imunológico para células indesejadas(patente US 4.676.980), e para o tratamento de infecções por HIV (documentoWO 91/00360 e WO 92/00373). Anticorpos heteroconjugados podem serfabricados usando-se qualquer método de reticulação conveniente. Osagentes de reticulação adequados são bem conhecidos na técnica e estãodivulgados na patente US 4.676.980, juntamente com uma série de técnicas dereticulação.

As técnicas de geração de anticorpos biespecíficos a partir defragmentos de anticorpos também foram descritas na literatura. Por exemplo,anticorpos biespecíficos podem ser preparados usando-se ligações químicas.Brennan et al., Science 229:81 (1985) descreve um procedimento em queanticorpos intactos são clivados de forma proteolítica para gerar fragmentosF(ab')2. Estes fragmentos são reduzidos na presença do agente complexanteditiol arsenato de sódio para estabilizar ditióis próximos e prevenir formação debissulfeto intermolecular. Os fragmentos Fab' gerados são então convertidosem derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados do Fab1-TNB éentão reconvertido em Fab1-Kol por redução com mercaptoetilamina e émisturado com uma quantidade equimolar do outro derivado do Fab1-TNB paraformar o anticorpo biespecíf.co. Os anticorpos biespecíficos produzidos podemser usados como agentes para a imobilização seletiva de enzimas.

Recente progresso facilitou a recuperação direta de fragmentosFab1-SH de E. coli, que podem ser acoplados quimicamente para formaranticorpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-25 (1992)descrevem a produção de uma molécula do anticorpo biespecífico humanizadoF(ab')2 de maneira completa. Cada fragmento Fab1 foi secretadoseparadamente a partir de E coli e sujeito ao acoplamento químico direcionadoin vitro para formar o anticorpo biespecífico. O anticorpo biespecífico assimformado foi capaz de se ligar a células que superexpressam o receptor HER2 ecélulas T humanas normais, bem como acionar a atividade lítica dos linfócitoscitotóxicos humanos contra alvos de tumor de mama humano.

Diversas técnicas de fabricação e isolamento de fragmentos deanticorpos biespecíficos, diretamente a partir de cultura celular recombinantetambém foram descritas. Por exemplo, anticorpos biespecíficos foramproduzidos utilizando-se fechos de leucina. Kostelny et al., J. Immunol.,148(5):1547-53 (1992). Os peptídeos do fecho de leucina das proteínas Fos eJun foram ligados às porções Fab1 de dois anticorpos diferentes por fusãogenética. Os homodímeros de anticorpos foram reduzidos na região dedobradiça para formarem monômeros e então reoxidados para formarem osheterodímeros do anticorpo. Este método também pode ser utilizado para aprodução de homodímeros do anticorpo. A tecnologia de "diacorpos" descritapor Hollinger et ai, Proc. Nati Acad. Sci USA 90:6444-48 (1993) forneceu ummecanismo alternativo para fabricação de fragmentos de anticorposbiespecíficos. Os fragmentos compreendem um domínio variável de cadeiapesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) por umligante que é muito curto para permitir o pareamento entre os dois domínios namesma cadeia. Consequentemente, os domínios VH e VL de um fragmentosão forçados a parear com os domínios VL e VH complementares de outrofragmento, através disso, formando dois sítios de ligação ao antígeno. Outraestratégia para fabricação de fragmentos de anticorpos biespecíficos pelo usode dímeros Fv de cadeia única (sFv) também foi relatada. Ver, Gruber et ai, J.Immunoi 152:5368 (1994).

Anticorpos com mais de duas valências são contemplados. Porexemplo, anticorpos triespecíficos podem ser preparados. Tutt et ai, J.Immunoi 147:60(1991).

Anticorpos Multivalentes

Um anticorpo multivalente pode ser internalizado (e/oucatabolizado) mais rápido do que um anticorpo bivalente por uma célula queexpressa um antígeno ao qual os anticorpos se ligam. Os anticorpos dapresente invenção podem ser anticorpos multivalentes (exceto da classe IgM)com três ou mais sítios de ligação de antígeno (por exemplo, anticorpostetravalentes), que podem ser facilmente produzidos por expressãorecombinante de ácido nucléico que codifica as cadeias polipeptídicas doanticorpo. O anticorpo multivalente pode compreender um domínio dedimerização e três ou mais sítios de ligação ao antígeno. O domínio dedimerização preferido compreende (ou consiste de) uma região Fc ou umaregião de dobradiça. Neste cenário, o anticorpo irá compreender uma região Fce três ou mais sítios de ligação ao antígeno amino-terminal para a região Fe. Oanticorpo multivalente preferido no presente pedido compreende de (ouconsiste de) três a cerca de oito, mais preferencialmente, quatro sítios deligação de antígeno. O anticorpo multivalente compreende pelo menos umacadeia polipeptídica (e preferencialmente duas cadeias polipeptídicas), em quea(s) cadeia(s) polipeptídica(s) compreende(m) dois ou mais domínios variáveis.Por exemplo, a cadeia(s) polipeptídica(s) pode(m) compreender VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, sendo que VD1 é um primeiro domínio variável, VD2 é umsegundo domínio variável, Fc é uma cadeia polipeptídica de uma região Fc, X1e X2 representam um aminoácido ou polipeptídeo, e η é 0 ou 1. Por exemplo,a cadeia polipeptídica pode compreender: VH-CHI-Iigante flexível-VH-CH1-cadeia da região Fc ; ou VH-CH1-VH-CH1-cadeia da região Fe. O anticorpomultivalente preferido no presente pedido, além disso, compreende pelo menosdois (e preferencialmente quatro) polipeptídeos do domínio variável da cadeialeve. O anticorpo multivalente no presente pedido pode, por exemplo,compreender aproximadamente dois a oito polipeptídeos do domínio variávelda cadeia leve. Os polipeptídeos do domínio variável da cadeia leve, aquicontemplados, compreendem um domínio variável da cadeia leve e,opcionalmente, também compreendem um domínio CL.

Anticorpos Variantes

Em algumas realizações, modificação(ões) da seqüência deaminoácido dos anticorpos descritos no presente pedido estão contempladas.Por exemplo, pode ser desejável aprimorar a afinidade de ligação e/ou outraspropriedades biológicas do anticorpo. Seqüências de aminoácidos variantes doanticorpo são preparadas por introdução apropriada de trocas de nucleotídeosno ácido nucléico do anticorpo, ou por síntese peptídica. Tais modificaçõesincluem, por exemplo, deleções, inserções e/ou substituições de resíduosdentro das seqüências de aminoácido do anticorpo. Qualquer combinação dedeleção, inserção, e substituição são feitas para se chegar à construção final,contanto que a construção final possua as características desejadas. Asalterações no aminoácido podem ser introduzidas na seqüência de aminoácidodo anticorpo do sujeito no momento que a seqüência é produzida.

Um método útil para identificação de certos resíduos ou regiõesdo anticorpo que estão em locais preferidos para mutagênese é chamado"mutagênese de varredura de alanina" como descrito por Cunningham & Wells,Science, 244:1081-85 (1989). Aqui, um resíduo ou grupo de resíduos alvossão identificados (por exemplo, resíduos carregados tais como arg, asp, his,lys, e glu) e substituídos por um aminoácido carregado negativamente ouneutro (mais preferivelmente alanina ou polialanina) para afetar a interação deaminoácidos com o antígeno. Essas localizações de aminoácidos quedemonstram sensibilidade funcional para as substituições então são refinadaspela introdução, além disto, de ou outras variantes nos sítios de substituição.Consequentemente, enquanto o sítio para a introdução da variação deseqüência de aminoácido é pré-determinado, a natureza da mutação por simesma não precisa ser pré-determinada. Por exemplo, para analisar odesempenho de uma mutação em um dado sítio, varredura de ala oumutagênese randômica é conduzida no códon ou região alvo e asimunoglobulinas expressas são selecionadas para a atividade desejada.

Inserções de seqüência de aminoácidos incluem fusões naterminação amina e/ou carboxila, variando em comprimento de um resíduo atépolipeptídeos que contêm uma centena ou mais de resíduos, bem comoinserções intraseqüência de resíduos de aminoácido únicos ou múltiplos.Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduometionil N-terminal ou o anticorpo fundido a um polipeptídeo citotóxico. Outrasvariantes insercionais da molécula do anticorpo incluem a fusão do N- ou C-terminal do anticorpo a uma enzima (por exemplo, à ADEPT) ou umpolipeptídeo que aumenta a meia-vida de soro do anticorpo.

Outro tipo de aminoácido variante do anticorpo altera o padrão deglicosilação original do anticorpo. Tal alteração inclui deleção de um ou maiscomponentes carboidratos encontrados no anticorpo, e/ou adição de um oumais sítios de glicosilação que não estão presentes no anticorpo.

Glicosilação de polipeptídeos é tipicamente tanto N-Iigado comoO-ligado. N-Iigado refere-se à conexão do componente carboidrato à cadeialateral de um resíduo asparagina. As seqüências de tripeptídio asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina,são seqüências de reconhecimento para conexão enzimática do componentecarboidrato para a cadeia lateral asparagina. Dessa forma, a presença deambas as seqüências de tripeptídios em um polipeptídio cria um sítio deglicosilação potencial. Glicosilação O-Iigado refere-se à conexão de um dosaçúcares N-acetilgalactosamina, galactose, ou xilose a um hidroxi-aminoácido,mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisinapossam também ser usadas.

A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo éconvenientemente realizada por alteração da seqüência de aminoácido, comoaquela que contém uma ou mais das seqüências de tripeptídeos descritasacima (para sítios de glicosilação N-ligado). A alteração pode também ser feitapor adição de, ou substituição de, um ou mais resíduos de serina ou treonina àseqüência do anticorpo original (para sítios de glicosilação O-ligado).

Onde o anticorpo compreende uma região Fc, o carboidratoconectado a este pode ser alterado. Por exemplo, anticorpos com umaestrutura de carboidrato madura que é desprovida de fucose conectada a umaregião Fc do anticorpo estão descritos no pedido de patente US 2003/0157108(Presta, L.). Ver também patente US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd) Anticorpos com uma N-acetilglucosamina bifurcada (GIcNAc) nocarboidrato conectado a uma região Fc do anticorpo estão referidos nodocumento WO 2003/011878, Jean-Mairet et ai e patente US 6.602.684Umana et ai Anticorpos com ao menos um resíduo galactose nooligossacarídeo conectado a uma região Fc do anticorpo estão relatados nodocumento WO 97/30087, Patel et al. Ver, também, documento WO 98/58964(Raju, S.) e documento WO 99/22764 (Raju, S.) que relaciona anticorpos comcarboidrato alterado inserido à região Fc destes. Ver também patente US2005/0123546 (Umana et al.) nas moléculas de ligação ao antígeno comglicosilação modificada.

A variante de glicosilação preferida no presente compreende umaregião Fe, em que uma estrutura de carboidrato é anexada à região Fcdesprovida de fucose. Tais variantes possuem função ADCC melhorada.Opcionalmente, a região Fc também compreende uma ou mais substituiçõesde aminoácidos que também melhoram ADCC, por exemplo, substituições nasposições 298, 333 e/ou 334 da região Fc (numeração de resíduos Eu).Exemplos de tais publicações relacionadas a anticorpos "defucosilados" ou"deficientes em fucose" incluem: patente US 2003/0157108; documento WO2000/61739; documento WO 2001/29246; patente US 2003/0115614; patenteUS 2002/0164328; patente US 2004/0093621; patente US 2004/0132140;patente US 2004/0110704; patente US 2004/0110282; patente US2004/0109865; documento WO 2003/085119; documento WO 2003/084570;documento WO 2005/035586; documento WO 2005/035778; documentoW02005/053742; Okazaki et al. J. Mol. Bioi 336:1239-49 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Exemplos de linhagens celularesque produzem anticorpos defucosilados incluem células Lecl 3 CHO deficientesem proteína de defucosilação (Ripka et ai Arch. Biochem. Biophys. 249:533-45(1986); pedido de patente US 2003/0157108 A1, Presta, L; e documento WO2004/056312 Α1, Adams et ai, especialmente no Exemplo 11), e linhagenscelulares knockout, como gene alfa-1,6-fucosiltransferase, FUT8, células CHOknockout (Yamane-Ohnuki et ai Biotech. Bioeng. 87:614(2004)).

Outro tipo de variante é uma variante de substituição doaminoácido. Estas variantes têm pelo menos um resíduo de aminoácido namolécula do anticorpo substituído por um resíduo diferente. Os sítios de maiorinteresse para mutagênese substitucional incluem as regiões hipervariáveis,mas alterações FR também são contempladas. Substituições conservativassão mostradas na Tabela 1 sob o título de "substituições preferidas". Se taissubstituições resultam em uma alteração na atividade biológica, então maistrocas substanciais, denominadas "substituições exemplares" na Tabela 1, outambém como descritas abaixo na referência para classes de aminoácido,podem ser introduzidas e os produtos selecionados.

Tabela 1

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Modificações substanciais nas propriedades biológicas doanticorpo são realizadas pela seleção de substituições que diferemsignificativamente em seus efeitos na manutenção (a) da estrutura doesqueleto do polipeptídeo na área de substituição, por exemplo, como umaconformação folha ou helicoidal (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula nosítio alvo ou (c) da massa da cadeia lateral. Resíduos que ocorremnaturalmente podem ser divididos em grupos com base nas propriedadescomuns das cadeias laterais:

(1) hidrofóbica: norleucina, met, ala, vai, leu, ile;

(2) hidrofílica neutra: Cys1 Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) ácida: asp, glu;

(4) básica: his, lys, arg;

(5) resíduos que influenciam na orientação da cadeia: gly, pro; e(6) aromática: trp, tyr, phe.

Substituições não conservativas irão conferir troca de um membrode uma destas classes por outra classe.

Um tipo de variante substitucional envolve substituição em um oumais resíduos de região hipervariável de um anticorpo parental (por exemplo,um anticorpo humano ou humanizado). Geralmente, a variante(s) resultante(s)selecionada(s) para posterior desenvolvimento terá propriedades biológicasmelhoradas relativas ao anticorpo parental a partir do qual elas são geradas.Uma maneira conveniente para gerar tais variantes substitucionais envolvematuração de afinidade usando-se exibição por fago. Resumidamente,diversos sítios da região hipervariável (por exemplo, sítios 6-7) são mutadospara gerar todas as possíveis substituições de aminoácido em cada sítio. Osanticorpos dessa forma gerados são exibidos a partir de partículas de fagofilamentoso como fusões para o gene Ill produto de M13 empacotado nointerior de cada partícula. As variantes de fago exibidas são entãoselecionadas para suas atividades biológicas (por exemplo, afinidade deligação), como divulgado no presente pedido. Com o objetivo de identificarcandidatos para sítios de região hipervariável para modificações, pode serrealizada mutagênese de varredura de alanina para identificar resíduos daregião hipervariável que contribuem significativamente para ligação aoantígeno. Alternativamente, ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar umaestrutura cristalina do complexo antígeno-anticorpo para identificar pontos decontato entre o anticorpo e o antígeno. Tais resíduos de contato e resíduosvizinhos são candidatos para substituições de acordo com as técnicaselaboradas no presente pedido. Uma vez que tais variantes são geradas, asvariantes do painel são sujeitas à seleção, como descrito no presente pedido, eanticorpos com propriedades superiores em um ou mais ensaios relevantespodem ser selecionados para posterior desenvolvimento.Moléculas de ácido nucléico que codificam seqüências variantesde aminoácido do anticorpo são preparadas por uma variedade de métodosconhecidos na técnica. Estes métodos incluem, mas não se limitam aoisolamento de uma fonte natural (no caso de ocorrer seqüência variante deaminoácido naturalmente) ou preparação por mutagênese mediada poroligonucleotídeo (ou sítio-dirigida), mutagênese por PCR e mutagênesecassette de uma variante preparada anteriormente ou uma versão não variantedo anticorpo.

Pode ser desejável introduzir uma ou mais modificações deaminoácido em uma região Fc dos polipeptídeos de imunoglobulina dainvenção, através disso, gerando uma região Fc variante. A região Fc variantepode compreender uma seqüência de região Fc humana (por exemplo, umaregião Fc IgGI, lgG2, lgG3 ou lgG4 humana) que compreende umamodificação de aminoácido (por exemplo, uma substituição) em uma ou maisposições de aminoácido incluindo nesta, uma dobradiça de cisteína.

Conforme esta descrição e os ensinamentos da técnica, écontemplado que em algumas realizações, um anticorpo usado nos métodosda invenção pode compreender uma ou mais alterações quando comparado aoanticorpo correspondente de tipo selvagem, por exemplo, na região Fc. Estesanticorpos, apesar de tudo, manteriam substancialmente as mesmascaracterísticas necessárias para utilidade terapêutica quando comparados aosseus correspondentes de tipo selvagem. Por exemplo, acredita-se que certasalterações podem ser feitas na região Fc que resultariam em ligação C1qalterada (isto é, ambas melhoradas ou reduzidas) e/ou CitotoxicidadeDependente de Complemento (CDC), por exemplo, como descrito nodocumento WO 99/51642. Ver também Duncan & Winter Nature 322:738-40(1988); patente US 5.648.260; patente US 5.624.821; e documento WO94/29351 com relação a outros exemplos de regiões Fc variantes. Osdocumentos WO 00/42072 (Presta) e WO 2004/056312 descrevem anticorposvariantes com ligação aos FcRs melhoradas ou diminuídas. O conteúdo destaspublicações de patente está especificamente incorporado ao presente comoreferência. Ver, também, Shields et ai J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001).Anticorpos com aumento de meia vida e ligação melhorada para o receptor Fcneonatal (FcRn)1 que é responsável por transferir as IgGs maternas para osfetos (Guyer et ai, J. Immunoi 117:587 (1976) e Kim et ai, J. lmmunol.24:249(1994)), estão descritos na patente US 2005/0014934A1 (Hinton et ai). Estesanticorpos compreendem uma região Fc com uma ou mais substituições nesta,que melhoram ligação da região Fc ao FcRn. Polipeptídeos variantes comseqüências de aminoácido da região Fc alteradas e capacidade de ligação C1qaumentada ou diminuída estão descritos na patente US 6.194.551B1,documento WO 99/511642. O conteúdo destas publicações de patente estáespecificamente incorporado ao presente como referência. Ver também,Idusogie etal. J. Immunoi 164:4178-84 (2000).

Anticorpos Derivados

Os anticorpos da presente invenção podem ser ainda modificadospara conter componentes não proteináceos adicionais que são conhecidos natécnica e facilmente disponíveis. Preferencialmente, os componentesadequados para derivatização do anticorpo são polímeros solúveis em água.Exemplos não Iimitantes de polímeros solúveis em água incluem, mas não selimitam a, polietileno glicol (PEG), copolímeros de etileno glicol/propileno glicol,carboximetilcelulose, dextrana, álcool polivinil, pirrolidona polivinil, poli-1, 3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero anidrido etileno/maleico,poliaminoácidos (tanto homopolímeros como copolímeros aleatórios), edextrana ou poli(n-vinil pirrolidona)polietileno glicol, homopolímeros depropropileno glicol, copolímeros de óxido de prolipropileno/óxido de etileno,polióis polioxietilado (por exemplo, glicerol), álcool polivinil e misturas destes.Propionaldeído de polietileno glicol pode ter vantagens na fabricação devido asua estabilidade em água. O polímero pode ser de qualquer peso molecular, epode ser ramificado ou não ramificado. O número de polímeros anexados aoanticorpo pode variar, e se mais de um polímero for anexado, eles podem ser omesmo ou moléculas diferentes. Em geral, o número e/ou tipos de polímerosusados para derivação podem ser determinados baseado em consideraçõesincluindo, mas não se limitando a, propriedades específicas ou funções doanticorpo a ser melhorado, se o anticorpo derivado será usado em uma terapiasob condições definidas, etc.

Seleção De Anticorpos Com Propriedades DesejadasOs anticorpos da invenção que se ligam ao EGFL7, e em algumasrealizações, podem modular um ou mais aspectos dos efeitos associados aoEGFL7, incluindo, mas não se limitando à interrupção de qualquer via biológicado EGFL7 relevante biologicamente, e/ou tratamento ou prevenção de umadisfunção associada com a expressão e/ou atividade do EGFL7 (comoaumento da expressão e/ou atividade do EGFL7). Por exemplo, os anticorposda invenção podem ser selecionados para suas habilidades de bloqueio daadesão de células HUVEC ao EGFL7, e migração de HUVEC nas placasrevestidas de proteína, como descrito no presente pedido.

Os anticorpos purificados podem ser ainda caracterizados poruma série de testes incluindo, mas não se limitando a, sequenciamento N-terminal, análise de aminoácido, cromatografia líquida de alta eficiência deexclusão por tamanho sem desnaturação (HPLC), espectrometria de massa,cromatografia de troca iônica e digestão por papaína.

Em certas realizações da invenção, os anticorpos produzidos nopresente pedido são analisados para suas atividades biológicas. Em algumasrealizações, os anticorpos da presente invenção são testados para suasatividades de ligação ao antígeno. Os testes de ligação ao antígeno que sãoconhecidos na técnica e podem ser usados no presente pedido incluem semlimitação, qualquer teste de ligação competitiva usando-se técnicas tais comowestern blots, radioimunoensaios, ELISA (ensaio imunoabsorvente ligado àenzima), imunoensaios "sanduíche", testes de imunoprecipitação,imunoensaios fluorescentes e imunoensaios de proteína A. Um teste ilustrativode ligação ao antígeno é fornecido abaixo na seção de Exemplos.

Em algumas realizações, a invenção fornece um anticorpo anti-EGFL7 que compete com um anticorpo que compreende um domínio variávelda cadeia leve que compreende uma seqüência selecionada da SEQ ID NO: 1e SEQ ID NO: 3 e um domínio variável da cadeia pesada que compreende umaseqüência selecionada da SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4 para ligação aoEGFL7. Tais anticorpos concorrentes podem ser obtidos pela separação dossobrenadantes dos hibridoma anti-EGFL7 para ligação ao imobilizado EGFL7em competição com o anticorpo marcado que compreende um domínio variávelda cadeia leve que compreende uma seqüência selecionada da SEQ ID NO: 1e SEQ ID NO: 3 e um domínio variável da cadeia pesada que compreende umaseqüência selecionada da SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4. Tais anticorposconcorrentes incluem anticorpos que reconhecem um epitopo EGFL7, que é omesmo ou se sobrepõe ao epitopo EGFL7 reconhecido pelo anticorpo. Umsobrenadante do hibridoma contendo um anticorpo concorrente reduzirá aquantidade do anticorpo marcado ligado, detectado na mistuta de ligação decompetição do sujeito quando comparado à quantidade de anticorpo marcadoligado, detectado em uma mistura de ligação controle contendo (ou não) oanticorpo irrelevante. Qualquer um dos testes de ligação de competiçãodescritos no presente pedido é adequado para uso nos procedimentosdispostos acima.

Os anticorpos anti-EGFL7 da invenção que possuem aspropriedades descritas no presente pedido podem ser obtidos pela separaçãodos clones de hibridoma do anti-EGFL7 para as propriedades desejadas porqualquer método conveniente. Por exemplo, se um anticorpo monoclonal anti-EGFL7, que compete ou não para ligação ao EGFL7 com um anticorpo quecompreende um domínio variável da cadeia leve que compreende umaseqüência selecionada da SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 3 e um domíniovariável da cadeia pesada que compreende uma seqüência selecionada daSEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4 é desejado, o anticorpo candidato pode sertestado por um teste de competição de ligação. Testes de competição sãobem conhecidos na técnica.

Outros testes funcionais para determinar a capicidade inibitória deanticorpos anti-EGFL7 são conhecidos na técnica, alguns destes estãoexemplificados no presente pedido.

Em algumas realizações, a presente invenção contemplaanticorpos alterados que possuem algumas, mas não todas as funçõesefetoras, que fazem destes candidatos desejáveis para muitas aplicações nasquais a meia vida do anticorpo in vivo é ainda importante para certas funçõesefetoras (como complemento e ADCC) não necessárias ou deletérias. Emcertas realizações, as atividades Fc da imunoglobulina produzida são medidaspara assegurar que somente as propriedades desejadas sejam mantidas.

Testes de citotoxicidade in vitro e/ou in vivo podem ser conduzidos paraconfirmar a redução/depleção das atividades CDC e/ou ADCC. Por exemplo,testes de ligação do receptor Fc (FcR) podem ser conduzidos para assegurarque o anticorpo seja desprovido de ligação ao FcyR (então provavelmentesendo desprovido de atividade ADCC), mas mantenha capacidade de ligaçãoao FcRn. As células primárias para mediação de ADCC, células NK,expressam somente FcyRIII, enquanto que monócitos expressam FcyRI,pcyRII e FcyRIII. A expressão FcR em células hematopoiéticas está resumidana Tabela 3 na página 464 de Ravetch & Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92(1991). Um exemplo de um ensaio in vitro para avaliar atividade ADCC de umamolécula de interesse está descrito na patente US 5.500.362 ou 5.821.337.Células efetoras úteis para tais testes incluem células mononucleares desangue periférico (PBMC) e células Natural Killer (NK). Alternativamente, ouadicionalmente, atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada invivo, por exemplo, em um modelo animal como divulgado em Clynes et al.,Proc. Nati Acad. Sei. USA 95:652-656 (1998). Testes de ligação C1q podemtambém ser realizados para confirmar se o anticorpo é incapaz de se ligar aC1q e então é desprovido de atividade CDC. Para avaliar a ativação decomplemento, um teste CDC, por exemplo, como descrito em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996), pode ser realizado.Ligação FcRn e determinações de liberação/meia vida in vivo também podemser apresentadas usando-se métodos conhecidos na técnica.

Em algumas realizações, a invenção fornece anticorpos alteradosque possuem aumento das funções efetoras e/ou da meia-vida.

Vetores, células Hospedeiras E Métodos Recombinantes

Para produção de um anticorpo recombinante da invenção, oácido nucléico de codificação é isolado e inserido em um vetor replicante paraposterior clonagem (amplificação do DNA) ou para expressão. O DNA quecodifica o anticorpo é facilmente isolado e sequenciado usando-seprocedimentos convencionais (por exemplo, pelo uso de sondas deoligonucleotídeo que são capazes de se ligar especificamente aos genes quecodificam as cadeias leves e pesadas do anticorpo). Muitos vetores estãodisponíveis. A escolha do vetor depende em parte da célula hospedeira a serusada. Geralmente, células hospedeiras preferidas são tanto de origemprocarionte como eucarionte (geralmente de mamíferos). Será apreciado queregiões constantes de qualquer isotipo possam ser usadas para este propósito,incluindo regiões constantes IgG, IgM, IGA, IgD e IgE, e tais regiões constantespodem ser obtidas a partir de qualquer espécie humana ou animal.

a. Geração De Anticorpos Usando-se Células Hospedeiras Procariontes

I. Construção Do Vetor

Seqüências de polinucleotídeo que codificam componentespolipeptídicos do anticorpo da invenção podem ser obtidas usando-se técnicasde recombinação padrão. Seqüências de polinucleotídeos desejadas podemser isoladas e seqüenciadas a partir de células que produzem anticorpo, comocélulas de hibridoma. Alternativamente, polinucleotídeos podem sersintetizados usando-se sintetizador de nucleotídeo ou técnicas de PCR. Umavez obtidas, as seqüências que codificam os polipeptídeos são inseridas emum vetor recombinante capaz de replicar e expressar polinucleotídeosheterólogos em hospedeiros procariontes. Muitos vetores que estãodisponíveis e conhecidos na técnica podem ser usados para o propósito dapresente invenção. A seleção de um vetor apropriado será principalmentedependente do tamanho dos ácidos nucléicos a serem inseridos no vetor e dacélula hospedeira específica a ser transformada com o vetor. Cada vetorcontém vários componentes, dependendo da sua função (amplificação e/ouexpressão de polinucleotídeo heterólogo) e da sua compatibilidade com acélula hospedeira específica na qual reside. Os componentes do vetorgeralmente incluem, mas não se limitam a: uma origem de replicação, um genemarcador de seleção, um promotor, um sítio de ligação de ribossomo (RBS),uma seqüência sinal, um inserto heterólogo de ácido nucléico e uma seqüênciade terminação de transcrição.

Em geral, vetores plasmídeos que contêm replicon e seqüênciasde controle que são derivadas de espécies compatíveis com a célulahospedeira são usados em conexão com estes hospedeiros. O vetorgeralmente carrega um sítio de replicação, assim como seqüênciasmarcadoras que são capazes de fornecer seleção fenotípica em célulastransformadas. Por exemplo, E. colié tipicamente transformada usando-sepBR322, um plasmídeo derivado de uma espécie E. coli. pBR322 contémgenes que codificam resistência à ampicilina (Amp) e tetraciclina (Tet) e, dessaforma, fornece meios fáceis para identificar células transformadas. pBR322,seus derivados, ou outro plasmídeo microbial ou bacteriófago também podemconter, ou ser modificados para conter promotores que podem ser usados peloorganismo microbial para expressão de proteínas endógenas. Exemplos dederivados do pBR322 usados para expressão de anticorpos específicos estãodescritos em detalhes em Carter et aí., patente US 5.648.237.

Além disto, vetores fago que contêm replicon e seqüênciascontrole que são compatíveis com o microorganismo hospedeiro podem serusados como vetores de transformação em conexão com estes hospedeiros.Por exemplo, bacteriófagos como AGEM™-11 pode ser utilizado na fabricaçãode um vetor recombinante que pode ser usado para transformar célulashospedeiras suscetíveis como E. coli LE392.

O vetor de expressão da invenção pode compreender dois oumais pares de promotor-cistron, que codificam cada um dos componentes dopolipeptídeo. Um promotor é uma seqüência reguladora não traduzidalocalizado a montante (5') para um cistron que modula sua expressão.Promotores procariontes tipicamente situam-se em duas classes: induzíveis econstitutivos. Promotor induzível é um promotor que inicia o aumento dosníveis de transcrição do cistron sob seu controle na resposta para mudançasna condição da cultura, por exemplo, a presença ou ausência de um nutrienteou uma mudança na temperatura.

Um amplo número de promotores reconhecidos por umavariedade de células hospedeiras potenciais é bem conhecido. O promotorselecionado pode estar operacionalmente ligado ao cistron do DNA quecodifica a cadeia leve ou pesada pela remoção do promotor da fonte de DNA1via enzima de restrição de digestão e inserção da seqüência do promotorisolada no vetor da invenção. Ambos, seqüência do promotor nativo e muitospromotores heterólogos, podem ser usados para amplificação e/ou expressãodireta dos genes alvo. Em algumas realizações, promotores heterólogos sãoutilizados, já que eles geralmente permitem maior transcrição e alta produçãodo gene alvo expresso, quando comparado ao promotor polipeptídico alvonativo.

Promotores adequados para uso em hospedeiros procariontesincluem o promotor phoA, os sistemas promotores de lactose, um sistemapromotor de triptofano (frp) e promotores híbridos como o promotor tac ou trc.No entanto, outros promotores que são funcionais em bactéria (como outrospromotores bacterianos ou fagos conhecidos) são também adequados. Suasseqüências de nucleotídeo foram publicadas, com isso, permitindo a umtécnico no assunto ligá-los operacionalmente a cistrons que codificam ascadeias alvo leve e pesada (Siebenlist et ai Cell 20:269 (1980)) usando-seligantes ou adaptadores para fornecer qualquer sítio de restrição necessário.

Em um aspecto da invenção, cada cistron no vetor recombinantecompreende um componente de seqüência sinal de secreção que direcionatranslocação dos polipeptídeos expressos através de uma membrana. Emgeral, a seqüência sinal pode ser um componente do vetor, ou esta pode seruma parte do DNA do polipeptídeo alvo que é inserido no vetor. A seqüênciasinal selecionada para o propósito desta invenção deve ser aquela reconhecidae processada (isto é, clivada por uma peptidase sinal) pela célula hospedeira.Para células hospedeiras procariontes que não reconhecem e processam asseqüências sinal nativas para os polipeptídeos heterólogos, a seqüência sinal ésubstituída por uma seqüência sinal procarionte selecionada, por exemplo, dogrupo que consiste de fosfatase alcalina, penicilinase, Ippl ou líderesenterotoxina Il (STII) estáveis ao calor, LamB1 PhoE, PeIB, OmpAe MBP. Emuma realização da invenção, as seqüências sinal usadas em ambos os cistronsdo sistema de expressão são seqüências sinal STII ou variantes destas.

Em outro aspecto, a produção das imunoglobulinas de acordocom a invenção pode ocorrer no citoplasma da célula hospedeira, e então nãonecessita da presença das seqüências sinal de secreção em cada cistron.Nesta consideração, as cadeias leve e pesada da imunoglobulina sãoexpressas, dobradas e montadas para formar imunoglobulinas funcionais nocitoplasma. Certas linhagens hospedeiras (por exemplo, as linhagens E colitrxB') fornecem condições no citoplasma que são favoráveis para formação depontes bissulfeto, através disso, permitindo dobra e montagem apropriadas dassubunidades da proteína expressa. Proba & Pluckthun Gene, 159:203 (1995).

Células hospedeiras procariontes adequadas para expressaranticorpos da invenção incluem Archaebacteria e Eubacteria, como organismosGram-negativos ou Gram-positivos. Exemplos de bactérias úteis incluemEscherichia (por exemplo, E. coli), Bacilli (por exemplo, B. subtilis),Enterobacteria, espécie Pseudomonas (por exemplo, P. aeruginosa),Salmonella typhimurium, Serratia marcescans, Klebsiellal Proteus, Shigella,Rhizobia, Vitreoscilla ou Paracoccus. Em algumas realizações, células Gram-negativas são usadas. Em algumas realizações, células E. coli são usadascomo hospedeiros para a invenção. Exemplos de linhagens de E. coli incluemlinhagem W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2(Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), páginas 1190-1219; depósito ATCC® N0 27.325) e derivadas destas, incluindo linhagem33D3 tendo genótipo W3110 AfhuA (AtonA) ptr3 Iac Iq lacL8 AompTA(nmpc-fepE) degP41 kanR (patente US 5.639.635). Outras linhagens e derivadasdestas, como E coli 294 (ATCC® 31.446), E coli Β, E coUK 1776 (ATCC®31.537) e E coli RV308(ATCC® 31.608) são também adequadas. Estesexemplos são mais ilustrativos do que limitantes. Métodos para construção dederivadas de qualquer uma das bactérias acima mencionadas que têmgenótipos definidos são conhecidos na técnica e descritos em, por exemplo,Bass et ai., Proteins, 8:309-14 (1990). Geralmente é necessário selecionar abactéria apropriada levando-se em consideração a replicabilidade do repliconnas células de uma bactéria. Por exemplo, espécies E. coli, Serratia ouSalmonella podem ser adequadas para serem usadas como hospedeirosquando plasmídeos bem conhecidos, como pBR322, PBR325, pACYC177 oupKN410 são usados para fornecer o replicon. Tipicamente, a célula hospedeiradeve secretar quantidades mínimas de enzimas proteolíticas, e inibidores deprotease adicionais podem, de forma desejável, ser incorporados na culturacelular.

II. Produção De Anticorpo

Células hospedeiras são transformadas com os vetores deexpressão descritos acima e cultivadas em meio convencional de nutrientemodificado como apropriado para induzir promotores, selecionartransformantes ou amplificar os genes que codificam as seqüências desejadas.

Transformação significa introdução de DNA no hospedeiroprocarionte, de forma que o DNA seja replicável, tanto como um elementoextracromossomal ou por integrante cromossomal. Dependendo da célulahospedeira usada, a transformação é feita usando-se técnicas padrãoapropriadas para tais células. O tratamento com cálcio, que emprega cloretode cálcio, é geralmente usado para células bacterianas que contêm barreirassubstanciais na parede celular. Outro método para transformação empregapolietilenoglicol/DMSO. Ainda outra técnica usada é a eletroporação.

Células procariontes usadas para produzir os polipeptídeos dainvenção são cultivadas em meio conhecido na técnica e adequado paracultura de células hospedeiras selecionadas. Exemplos de meios adequadosincluem caldo Luria (LB) mais suplementos de nutrientes necessários. Emalgumas realizações, o meio também contém um agente de seleção, escolhidocom base na construção do vetor de expressão para, seletivamente, permitir ocrescimento de células procariontes que contêm o vetor de expressão. Porexemplo, a ampicilina é adicionada no meio para o crescimento de células comgenes que expressam resistência à ampicilina.

Qualquer suplemento necessário, além das fontes de carbono,nitrogênio e fosfato inorgânico, podem ser também incluídos em concentraçõesapropriadas, introduzido sozinho ou como uma mistura com outro suplementoou meio, como uma fonte de nitrogênio complexa. Opcionalmente, o meio decultura pode conter um ou mais agentes de redução selecionados do grupo queconsiste de glutationa, cisteína, cistamina, tioglicolato, ditioeritritol e ditiotreitol.

As células hospedeiras procariontes são cultivadas emtemperaturas adequadas. Para o crescimento de E. coli, por exemplo,variações de temperatura de aproximadamente 20°C a cerca de 39°C sãogeralmente utilizadas, tipicamente de aproximadamente 25°C a cerca de 37°C,por exemplo, aproximadamente 30°C. O pH do meio pode ser qualquer pHvariando de aproximadamente 5 a cerca de 9, dependendo principalmente doorganismo hospedeiro. Para E. coli, o pH é geralmente de aproximadamente6,8 a cerca de 7,4, e mais tipicamente cerca de 7,0.

Se um promotor induzível é usado no vetor de expressão dainvenção, a expressão de proteína é induzida sob condições adequadas para aativação do promotor. Em um aspecto da invenção, promotores phoA sãousados para controlar a transcrição dos polipeptídeos. Consequentemente, ascélulas hospedeiras transformadas são cultivadas em um meio Iimitante defosfato para indução. O meio Iimitante de fosfato é o meio C.R.A.P (ver, porexemplo, Simmons et a/., J. Immunoi Methods (2002), 263:133-47 (2002)).Uma variedade de outros indutores pode ser usada, de acordo com aconstrução do vetor empregada, como é conhecido na técnica.Em uma realização, os polipeptídeos expressos da presenteinvenção são secretados e recuperados a partir do periplasma das célulashospedeiras. A recuperação de proteína tipicamente envolve o rompimento domicroorganismo, geralmente por tais meios como choque osmótico, sonicaçãoou lise. Uma vez que as células são rompidas, fragmentos de células oucélulas inteiras podem ser removidos por centrifugação ou filtração. Asproteínas podem ser também purificadas, por exemplo, por cromatografia deafinidade em resina. Alternativamente, as proteínas podem ser transportadaspara o meio de cultura e isoladas neste. As células podem ser removidas dacultura e a cultura sobrenadante pode ser filtrada e concentrada para posteriorpurificação das proteínas produzidas. Os polipeptídeos expressos podem serposteriormente isolados e identificados, usando-se métodos comumenteconhecidos, como eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) e testeWestern blot.

Em um aspecto da invenção, a produção de anticorpo éconduzida em grande quantidade por um processo de fermentação. Váriosprocessos de fermentação de batelada em larga escala estão disponíveis paraa produção de proteínas recombinantes. Fermentações em larga escalapossuem pelo menos 1.000 litros de capacidade, preferencialmente de cercade 1.000 a 100.000 litros de capacidade. Esses fermentadores usamagitadores de impulsão para distribuir o oxigênio e os nutrientes, especialmenteglicose (a fonte usual de carbono/energia). Fermentação em pequena escalarefere-se geralmente à fermentação em um fermentador que não tem mais doque aproximadamente 100 litros em capacidade de volume, e pode variar deaproximadamente 1 litro para cerca de 100 litros.

Em um processo de fermentação, a indução da expressão deproteína é tipicamente iniciada depois das células terem crescido sobcondições adequadas para uma densidade desejada, por exemplo, uma OD55Ode aproximadamente 180-220, na qual os estágios das células são de faseestacionária primária. Uma variedade de indutores pode ser usada, de acordocom a construção do vetor empregada, como é conhecido na técnica e descritoacima. As células podem ser cultivadas por períodos mais curtos, antes daindução. As células são usualmente induzidas por aproximadamente 12-50horas, no entanto, tempos de indução mais longos ou mais curtos podem serusados.

Para aprimorar o rendimento da produção e a qualidade dospolipeptídeos da invenção, várias condições de fermentação podem sermodificadas. Por exemplo, para aprimorar a montagem e dobras apropriadasdos polipeptídeos do anticorpo secretado, vetores adicionais quesuperexpressam proteínas chaperonas, como proteínas Dsb (DsbA, DsbB,DsbC, DsbD e ou DsbG) ou FkpA (um peptidilprolil eis, transisomerase comatividade de chaperona) podem ser usados para co-transformar as célulasprocariontes hospedeiras. Foi demonstrado que as proteínas chaperonasfacilitam a dobra e a solubilidade apropriada de proteínas heterólogas,produzidas em células hospedeiras bacterianas. Chen et ai, J Bio Chem274:19601-05 (1999); Georgiou et ai, patente US 6.083.715; Georgiou ef ai,patente US 6.027.888; Bothmann & Pluckthun (2000) J. Bioi Chem.275:17100-05; Ramm & Pluckthun (2000) J. Bioi Chem. 275:17106-13 (2000);Arie et ai, Moiec. Microbioi 39:199-210 (2001).

Para minimizar proteólises de proteínas heterólogas expressas(especialmente aquelas que são proteoliticamente sensíveis), certas linhagensde células hospedeiras, deficientes em enzimas proteolíticas, podem serusadas para a presente invenção. Por exemplo, linhagens de célulashospedeiras podem ser modificadas para efetuar mutação(ões) genética(s) emgenes que codificam proteases bacterianas conhecidas como Protease III,OmpT, DegP, Tsp1 Protease I, Protease Mi, Protease V, Protease Vl ecombinações destas. Algumas linhagens de E. coli deficientes em proteaseestão disponíveis e descritas em, por exemplo, Joly et ai (1998), acima;Georgiou et ai, patente US 5.264.365, Georgiou et ai, patente US 5.508.192;Hara et ai, Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996).

Em uma realização, linhagens de E. coli deficientes em enzimasproteolíticas e transformadas com plasmídeos que superexpressam uma oumais proteínas chaperonas são usadas como células hospedeiras no sistemade expressão da invenção.

III. Purificação De Anticorpo

Métodos de purificação de proteína padrão conhecidos na técnicapodem ser empregados. Os procedimentos a seguir são procedimentos depurificação adequados exemplares: fracionamento em imunoafinidade oucolunas de troca iônica, precipitação em etanol, HPLC de fase reversa,cromatografia em sílica ou em resina de troca catiônica como DEAE1chromatofocusing, SDS-PAGE, precipitação com sulfato de amônio e filtraçãoem gel, usando-se, por exemplo, Sephadex G-75.

Em um aspecto, a Proteína A imobilizada em uma fase sólida éusada para purificação de imunoafinidade dos produtos anticorpo completo dainvenção. A Proteína A é uma proteína com parede celular de 41KD deStaphylococcus aureas que se liga com uma alta afinidade a uma região Fcdos anticorpos. Lindmark et al (1983) J. Immunoi Meth. 62:1-13 (1983). Afase sólida na qual a Proteína A é imobilizada é preferivelmente uma colunaque compreende um vidro ou superfície de sílica, mais preferencialmente, umacoluna de vidro poroso controlada ou uma coluna de ácido silícico. Emalgumas aplicações, a coluna foi revestida com um reagente, como glicerina,na tentativa de prevenir a aderência de contaminantes não específicos.

Como primeiro passo da purificação, a preparação derivada dacultura celular, como descrita acima, é aplicada na fase sólida da Proteína Aimobilizada para permitir ligação específica do anticorpo de interesse àProteína A. A fase sólida é então lavada para remover contaminantes nãoespecificamente ligados à fase sólida. Finalmente, o anticorpo de interesse érecuperado da fase sólida por eluição.

B. Geração De Anticorpos Usando-Se Células Hospedeiras Eucariontes

Os componentes do vetor geralmente incluem, mas não selimitam a um ou mais dos seguintes: uma seqüência sinal, uma origem dereplicação, um ou mais genes marcadores, um elemento enhancer, umpromotor e uma seqüência de terminação de transcrição,

(I) Componente Seqüência Sinal

Um vetor para uso em uma célula hospedeira eucarionte podetambém conter uma seqüência sinal ou outro polipeptídeo que tem um sítio declivagem específico no N-terminal da proteína madura ou polipeptídeo deinteresse. A seqüência sinal heteróloga selecionada, preferencialmente, éaquela reconhecida e processada (isto é, clivada por uma peptidase sinal) pelacélula hospedeira. Na expressão em células de mamíferos, a seqüência sinalde mamíferos, bem como líderes secretórios virais, por exemplo, o sinal gD deherpes simplex, estão disponíveis.

O DNA para tal região precursora é ligado no quadro de leitura aoDNA que codifica o anticorpo.

(II) Origem De Replicação

Geralmente, um componente origem de replicação não énecessário para vetores de expressão em mamíferos. Por exemplo, a origemSV40 pode tipicamente ser usada somente porque esta contém o promotorprimário.

(III) Componente Gene De Seleção

Vetores de expressão e clonagem podem conter um gene deseleção, também chamado de marcador selecionável. Genes de seleçãotípicos codificam proteínas que (a) conferem resistência aos antibióticos ououtras toxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina,(b) complementam deficiências auxotróficas, quando relevante, ou (c) fornecemnutrientes críticos não disponíveis a partir de meios complexos.

Um exemplo de um esquema de seleção utiliza uma droga parainterromper o crescimento de uma célula hospedeira. Essas células, que sãosucessivamente transformadas com um gene heterólogo, produzem umaproteína que confere resistência à droga e, dessa forma, sobrevivem ao regimede seleção. Exemplos de tal seleção dominante usam as drogas neomicina,ácido micofenólico e higromicina.

Outro exemplo de marcadores de seleção adequados para ascélulas de mamíferos são aqueles capazes de identificar células competentespara ocupar o ácido nucléico do anticorpo, como DHFR, timidina quinase,metalotioneína-l e II, preferencialmente genes da metalotioneína de primatas,adenosina deaminase, ornitina decarboxilase, etc.

Por exemplo, células transformadas com o gene de seleçãoDHFR são as primeiras identificadas, pelo cultivo de todos os transformantesem um meio de cultura que contém metotrexato (Mtx), um antagonistacompetitivo do DHFR. Uma célula hospedeira apropriada quando o DHFR tiposelvagem é empregado é a linhagem celular ovariana de hamster Chinês(CHO) deficiente na atividade do DHFR (por exemplo, ATCC® CRL-9096).

Alternativamente, células hospedeiras (particularmentehospedeiros tipo selvagem que contêm DHFR endógeno) transformadas ou co-transformadas com seqüências de DNA que codificam um anticorpo, proteínaDHFR tipo selvagem, e outro marcador selecionável, como aminoglicosídeo 3-fosfotransferase (ΑΡΗ), podem ser selecionados por crescimento celular emum meio que contém um agente de seleção para o marcador selecionável,como um antibiótico aminoglicosídico, por exemplo, canamicina, neomicina ouG418. Verpatente US 4.965.199.

IV Componente Promotor

Vetores de expressão e clonagem usualmente contêm umpromotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e é operacionalmenteligado ao ácido nucléico do polipeptídeo do anticorpo. Seqüências promotorassão conhecidas para eucariontes. Virtualmente, todos os genes eucariontestêm uma região rica em AT1 localizada aproximadamente de 25 a 30 bases amontante do sítio onde a transcrição é iniciada. Outra seqüência encontradade 70 a 80 bases a montante do início da transcrição de muitos genes é umaregião CNCAAT (SEQ ID NO: 19) onde N pode ser qualquer nucleotídeo. Naterminação 3' da maioria dos genes de eucariontes está uma seqüênciaAATAAA (SEQ ID NO: 20) que pode ser o sinal para adição da cauda poli-A àterminação 3' da seqüência codificadora. Todas estas seqüências sãoadequadamente inseridas em vetores de expressão de eucariontes.

A transcrição do polipeptídeo do anticorpo a partir de vetores emcélulas hospedeiras de mamíferos é controlada, por exemplo, por promotoresobtidos a partir de genomas de vírus, como vírus polioma, vírus fowlpox,adenovírus (como Adenovírus 2), vírus de papiloma bovino, vírus de sarcomade aves, citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite-B e Vírus Simian 40(SV40); a partir de promotores heterólogos de mamíferos, por exemplo, opromotor actina ou um promotor imunoglobulina; a partir de promotores dechoque térmico, desde que tais promotores fornecidos sejam compatíveis comos sistemas da célula hospedeira.

Os promotores iniciais e finais do vírus SV40 sãoconvenientemente obtidos como um fragmento de restrição SV40 que tambémcontém a origem de replicação viral SV40. O promotor inicial imediato de umcitomegalovírus humano é convenientemente obtido como um fragmento derestrição Hind\\\ E. Um sistema para expressão de DNA em hospedeirosmamíferos que utiliza o vírus de papiloma bovino como um vetor é divulgado napatente US 4.419.446. Uma modificação deste sistema está descrita na patenteUS 4.601.978. Alternativamente, a repetição terminal longa do Vírus doSarcoma de Rous pode ser usada como promotor.

(v) Componente Elemento Enhancer

A transcrição do DNA que codifica o polipeptídeo do anticorpodesta invenção por eucariontes mais evoluídos é freqüentemente aumentadapela inserção de uma seqüência enhancer no vetor. Muitas seqüênciasenhancers são agora conhecidas a partir de genes de mamífero (globina,elastase, albumina, α-fetoproteína e insulina). Tipicamente, no entanto, poderáser usado um enhancer de um vírus de célula eucarionte. Exemplos incluem oenhancer SV40 no último lado da origem de replicação (bp 100-270), oenhancer do promotor inicial do citomegalovírus, o enhancer do polioma noúltimo lado da origem de replicação e enhancers de adenovírus. Ver tambémYaniv, Nature 297:17-18 (1982) nos elementos enhancing para ativação depromotores de eucariontes. O enhancer pode ser unido no vetor na posição 5'ou 3' à seqüência codificadora do polipeptídeo do anticorpo, mas estápreferencialmente localizado em um sítio 5' do promotor.

(vi) Componente Terminação De Transcrição

Vetores de expressão usados em célula hospedeiras eucariontestipicamente também irão conter seqüências necessárias para a terminação datranscrição e para estabilização do mRNA. Tais seqüências estão comumentedisponíveis nas regiões não traduzidas de eucariontes 5" e, ocasionalmente 3',ou DNAs ou cDNAs virais. Estas regiões contêm segmentos de nucleotídeostranscritos como fragmentos poliadenilados na porção não traduzida do mRNAque codifica um anticorpo. Um componente da terminação de transcrição útil éa região de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino. Ver documentoWO 94/11026 e o vetor de expressão divulgado neste.(viii Seleção E Transformação De Células Hospedeiras

Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão doDNA nos vetores no presente pedido incluem células eucariontes maisevoluídas descritas no presente pedido, incluindo células hospedeiras devertebrados. A propagação de células de vertebrados na cultura (cultura detecido) tornou-se um procedimento de rotina. Exemplos de linhagens de célulashospedeiras de mamíferos úteis são as linhagens CV1 de rim de macacotransformadas por SV40 (COS-7, ATCC® CRL 1651); linhagem de rimembrionário humano (células 293 ou 293 subclonadas para crescimento emcultura de suspensão, Graham et ai, J. Gen Viroi 36:59 (1977)); células de rimde filhotes de hamster (BHK, ATCC® CCL 10); células ovarianas de hamsterChinês/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Nati Acad. Sci USA 77:4216 (1980));células de Sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-51(1980)); células de rim de macaco (CV1 ATCC® CCL 70); células de rim demacaco verde Africano (VERO-76, ATCC® CRL-1587); células de carcinomacervical humana (HELA, ATCC® CCL 2); células de rim canino (MDCK,ATCC® CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC® CRL 1442);células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano(Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC®CCL51); células TRI (Mather et al, Annals N.Y. Acad. Sei. 383:44-68 (1982));células MRC 5; células FS4; e uma linhagem de hepatoma humano (Hep G2).

Células hospedeiras são transformadas com os vetores deexpressão ou de clonagem descritos acima para produção de anticorpo ecultivadas em meio convencional de nutriente modificado como apropriado parainduzir promotores, selecionar transformantes ou amplificar os genes quecodificam as seqüências desejadas.

(viii) Cultura De Células Hospedeiras As células hospedeiras usadas para produzir um anticorpo destainvenção podem ser cultivadas em uma variedade de meios. Meioscomercialmente disponíveis como F10 de Ham (Sigma), Meio EssencialMínimo ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), e Meio Modificado de Eagle deDulbecco ((DMEM)1 Sigma) são adequados para cultivar as célulashospedeiras. Além disto, qualquer dos meios descritos em Ham et ai, Meth.EnzymoL 58:44 (1979), Barnes et ai, Anal. Biochem. 102:255 (1980), patentesUS 4.767.704, 4.657.866, 4.927.762, 4.560.655; ou 5.122.469; documentosWO 90/03430, WO 87/00195; ou patente US Re. 30.985 podem ser usadoscomo meios de cultura para as células hospedeiras. Qualquer um destesmeios pode ser suplementado, conforme necessário, com hormônios e/ououtros fatores de crescimento (como insulina, transferrina ou fator decrescimento epidermal), sais (como cloreto de sódio, cálcio, magnésio, efosfato), tampões (como HEPES), nucleotídeos (como adenosina e timidina),antibióticos (como droga GENTAMYCIN™), elementos traço (definido comocomponentes inorgânicos usualmente presentes em concentração final na faixamicromolar) e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Qualquer outrosuplemento necessário pode também ser incluído na concentração apropriadaque seria conhecida pelos técnicos no assunto. As condições de cultura, comotemperatura, pH e similares, são aquelas previamente usadas com a célulahospedeira selecionada para expressão, e serão evidentes para um técnico noassunto.

(IX) Purificação De Anticorpo

Quando se utilizam técnicas recombinantes, o anticorpo pode serproduzido intracelularmente, ou diretamente secretado no meio. Se o anticorpoé produzido intracelularmente, como um primeiro passo, o fragmentoparticulado, tanto das células hospedeiras como fragmentos lisados, sãoremovidos, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração. Quando oanticorpo é secretado no meio, sobrenadantes de tais sistemas de expressãoSão, geralmente, primeiro concentrados usando-se um filtro de concentraçãode proteína disponível comercialmente, por exemplo, uma unidade deultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Um inibidor de protease comoPMSF pode ser incluído em qualquer um dos passos antecedentes para inibirproteólises, e antibióticos podem ser incluídos para prevenir o crescimento decontaminantes imprevistos.

A composição de anticorpo preparada a partir das células podeser purificada usando-se, por exemplo, cromatografia em hidroxilapatita,eletroforese em gel, diálise e cromatografia por afinidade, com cromatografiapor afinidade sendo a técnica de purificação preferida. A adequação daproteína A como um Iigante de afinidade depende da espécie e isotipo dequalquer domínio Fc da imunoglobulina que está presente no anticorpo. Aproteína A pode ser usada para purificar anticorpos que são baseados emcadeias pesadas Y1, Y2 ou Y4 humanas (Lindmark et a/., J. Immunoi Meth.62:1-13 (1983)). A proteína G é recomendada para todos os isotipos decamundongo e para Y3 humana (Guss et ai, EMBO J. 5:1567-75 (1986)). Amatriz para a qual o Iigante de afinidade é anexado é mais freqüentementeagarose, mas outras matrizes estão disponíveis. Matrizes mecanicamenteestáveis, como vidro poroso controlado ou poli(estireno-divinil)benzeno,permitem velocidades de fluxo mais rápidas e tempo de processamento maiscurto do que aquele que pode ser atingido com agarose. Quando o anticorpocompreende um domínio CH3, a resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker,Phillipsburg, NJ) é útil para a purificação. Outras técnicas para purificação deproteína, como fracionamento em uma coluna de troca iônica, precipitação emetanol, HPLC Fase Reversa, cromatografia em sílica, cromatografia emheparina SEPHAROSE™, cromatografia em uma resina de troca aniônica oucatiônica (como uma coluna de ácido poliaspártico), chromatofocusing, SDS-PAGE e precipitação em sulfato de amônio estão também disponíveis,dependendo do anticorpo a ser recuperado.

Após qualquer etapa de purificação preliminar, a mistura quecompreende o anticorpo de interesse e os contaminantes pode ser sujeita àcromatografia de interação hidrofóbica em pH baixo, usando-se um tampão deeluição a um pH de aproximadamente 2,5-4,5, preferencialmente realizada embaixas concentrações de sal (por exemplo, de aproximadamente 0-0,25M de sal).

Imunoconjugados

A invenção também fornece imunoconjugados (alternativamentechamados "conjugados anticorpo-droga" ou "ADC"), que compreendemqualquer um dos anticorpos anti-EGFL7 descritos no presente pedido,conjugados a um agente citotóxico, como um agente quimioterapêutico, umadroga, um agente inibitório do crescimento, uma toxina (por exemplo, umatoxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animalou fragmentos destas) ou um isótopo radioativo (isto é, um radioconjugado).

O uso do conjugado anticorpo-droga para a entrega local deagentes citotóxicos ou citostáticos, isto é, drogas para destruir ou inibir célulastumorais no tratamento de câncer (Syrigos & Epenetos (1999) AnticancerResearch 19:605-14 (1999); Niculescu-Duvaz & Springer (1997) Adv. Drug Del.Rev. 26:151-72; patente US 4.975.278) permite entrega direcionada docomponente droga para tumores, e acúmulo intracelular nestes, onde aadministração sitêmica destes agentes droga não conjugados pode resultar emum nível inaceitável de toxicidade para células normais, bem como para célulastumorais a serem eliminadas (Baldwin et ai, Lancet páginas (15 de março de1986):603-05; Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In CâncerTherapy: A Review," em Monoclonal Antibodies '84: Biological And ClinicaiApplications, A. Pinchera et ai (eds), páginas 475-506 (1985). A máximaeficiência com mínima toxicidade é procurada através disso. Tanto osanticorpos policlonais como anticorpos monoclonais foram relatados como úteisnestas estratégias (Rowle et ai, Câncer Immunol. Immunother. 21:183-87(1986)). As drogas usadas nestes métodos incluem daunomicina,doxorubicina, metotrexato e vindesina (Rowle et ai, (1986) acima). Toxinasusadas nos conjugados anticorpo-toxina incluem toxinas bacterianas, comotoxina de difteria, toxinas vegetais como rícino, toxinas de molécula pequenacomo geldanamicina Mandler et ai J. Nat Câncer Inst 92(19): 1573-81;Mandler et ai (2000); Mandler et ai Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-28 (2000); Mandler et ai Bioconjugate Chem. 13:786-91 (2002)),maitansinóides (patente EP 1391213; Liu et ai, (1996) Proc. Nati Acad. SciUSA 93:8618-8623)), e caliqueamicina (Lode et ai Câncer Res. 58:2928(1998); Hinman et ai, Câncer Res. 53:3336-3342 (1993)). As toxinas podemrealizar seus efeitos citotóxicos e citostáticos por mecanismos que incluemligação de tubulina, ligação de DNA ou inibição de topoisomerase. Algumasdrogas citotóxicas tendem a ser inativas ou menos ativas quando conjugadascom grandes anticorpos ou Iigantes do receptor de proteína.

ZEVALIN™ (ibritumomab tiuxetano, Biogen/ldec) é um conjugadoanticorpo-radioisótopo composto de um anticorpo monoclonal kappa IgGI demurino direcionado contra o antígeno CD20 encontrado na superfície delinfócitos B normais e malignos e radioisótopos 111In ou 90Y ligados por umligante quelante tiouréia (Wiseman et al (2000) Eur. Jour. Nuci Med. 27(7):766-77 (2000); Wiseman et al (2002) Blood 99(12):4336-42 (2002); Witzig et al(2002) J. Clin. Oncoi 20(10):2453-63 (2002); Witzig et al J. Clin. Oncoi(15):3262-69 (2002)). Embora ZEVALIN possua atividade contra Linfomanão Hodgkin de célula-B (NHL), a administração resulta em citopenias severase prolongadas na maioria dos pacientes. MYLOTARG™ (gemtuzumabozogamicina, Wyeth Pharmaceuticals), um conjugado anticorpo-drogacomposto de um anticorpo hu CD33 ligado à caliqueamicina, foi aprovadao em2000 para o tratamento por injeção de leucemia mielóide aguda (Drugs of theFuture 25(7):686 (2000); nas patentes US 4970198; 5079233; 5585089;5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001). Cantuzumab mertansina(Immunogen, Inc.), um conjugado anticorpo-droga composto de anticorpohuC242 ligado, via Iigante bissulfeto SPP, ao componente droga maitansinóide,DM1, está avançada nos testes de Fase Il para o tratamento de cânceres queexpressam CanAg1 como de cólon, pancreático, gástrico e outros. MLN-2704(Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.), um conjugado anticorpo-droga composto do anticorpo monoclonal de antígeno de membrana específicoanti-próstata (PSMA) ligado ao componente droga maitansinóide, DM1, estáem desenvolvimento para o tratamento potencial de tumores de próstata. Ospepitídeos auristatina, auristatina E (AE) e monometilauristatina (MMAE),sintéticos análogos de dolastatina, foram conjugados a anticorpos monoclonaisquiméricos cBR96 (específico para Lewis Y em carcinomas) e cAC10(específico para CD30 em malignidades hematológicas) (Doronina et al. NatureBiotech. 21 (7): 778-784 (2003)) e estão em desenvolvimento terapêutico.

Agentes quimioterapêuticos úteis na geração de taisimunoconjugados estão descritos no presente pedido (por exemplo, acima).Toxinas enzimaticamente ativas e fragmentos destas que podem ser usadosincluem cadeia de difiteria A, fragmentos ativos não Iigantes de toxina dedifiteria, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A daricina, cadeia A da abrina, cadeia A da modecina, alfa-sarcina, proteínas deAleurites fordii, proteínas da diantina, proteínas da Phytolaca americana (PAPI,PAPII e PAP-S), inibidor Momordica charantia, curcina, crotina, inibidorsapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicinae os tricotecenos. Ver1 por exemplo, documento WO 93/21232 publicado em28 de outubro de 1993. Uma variedade de radionuclídeos está disponível paraa produção de anticorpos radioconjugados. Exemplos incluem 212Bi, 131I1 131Inl90Y e 186Re. Conjugados de anticorpo e agente citotóxico são fabricadosusando-se uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncionaiscomo propionato de n-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP)1 iminotiolano (IT)1derivados bifuncionais de imidoésteres (como dimetil adipimidato HCI), ésteresativos (como disuccinimidil suberato), aldeídos (como glutaraldeído),compostos bis-azido (como bis (p-azidobenzoil) hexanediamina), derivados debis-diazônio (como bis-(p-diazoniumbenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos(como tolueno 2,6-diisocianato) e compostos bis-ativos de flúor (como 1,5-diflúor-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina ricina pode serpreparada conforme descrito em Vitetta et ai, Science, 238: 1098 (1987). Oácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno triamino penta acético (MX-DTPA)marcado com carbono-14 é um agente quelante exemplar para conjugação deradionucleotídeo ao anticorpo. Ver documento WO 94/11026.

Conjugados de um anticorpo e uma ou mais toxinas de moléculapequena, como caliqueamicinas, maitansinóides, dolastatinas, aurostatinas,tricoteceno e CC1065, e os derivados destas toxinas que possuem toxina ativa,são também contemplados no presente pedido.

i. Maitansina E Maitansinóides

Em algumas realizações, o imunoconjugado compreende umanticorpo da invenção (completo ou fragmentos), conjugado a uma ou maismoléculas de maitansinóides.

Maitansinóides são inibidores mitóticos que agem por inibição dapolimerização da tubulina. A maitansina foi isolada pela primeira vez doarbusto do Leste Africano Maytenus serrata (patente US 3.896.111).

Subseqüentemente, descobriu-se que certos micróbios também produzemmaitansinóides, como maitansinol e ésteres de maitansinol C-3 (patente US4.151.042). Maitansinol sintético e derivados, e análogos destes, estãodivulgados, por exemplo, nas patentes US 4.137.230, 4.248.870, 4.256.746,4.260.608, 4.265.814, 4.294.757, 4.307.016, 4.308.268, 4.308.269, 4.309.428,4.313.946, 4.315.929, 4.317.821, 4.322.348, 4.331.598, 4.361.650, 4.364.866,4.424.219, 4.450.254, 4.362.663 e 4.371.533.

Componentes droga maitansinóides são componentes drogaatrativos em conjugados anticorpo-droga porque eles são: (i) relativamenteacessíveis para serem preparados por fermentação ou modificação química,derivação de produtos de fermentação; (H) receptivos para derivatização comgrupos funcionais adequados para conjugação por meio de Iigantes nãobissulfeto para anticorpos; (iii) estáveis no plasma e; (iv) efetivos contra umavariedade de linhagens celulares tumorais.

Imunoconjugados contendo maitansinóides, métodos paraproduzir os mesmos e seus usos terapêuticos estão divulgados, por exemplo,nas patentes US 5.208.020, 5.416.064 e patente Européia EP 0 425 235 B1,cujas divulgações são expressamente incorporadas ao presente comoreferência. Liu ef a/., Proa. Net,. Aced. Sei. USA 93:8618-23 (1996)descreveram imunoconjugados que compreendem um maitansinóidedesignado DM1, ligado ao anticorpo monoc.onal C242 diretamente contracâncer colorretal humano. Foi descoberto que o conjugado é altamentecitotóxico dirigido à cultura de células cancerosas de có.on, e mostrou teratividade anti-tumor em testes de crescimento de tumor in vivo. Chari et a/..CancerResearch 52:127-31 (1992) descrevem imunoconjugados, no qual ummaitansinóide foi conjugado via um Iigante bissulfeto a um anticorpo murino A7que se liga a um antígeno de linhagem celular de câncer de cólon humano ou aoutro anticorpo monoclonal murino TA.1 que se liga ao oncogene HER-2/neu.A citotoxicidade do conjugado TA.1-maitansinóide foi testada in vitro nalinhagem celular SK-BR-3 de câncer de mama humano, a qual expressaantígenos de superfície 3 χ 105 HER-2 por célula. A droga conjugada atingiuum grau de citotoxicidade similar à droga maitansinóide livre, que poderia seraumentada para elevar o número de moléculas maitansinóide por molécula deanticorpo. O conjugado A7-maitansinóide mostrou baixa citotoxicidadesistêmica em camundongos.

Conjugados anticorpo-maitansinóides são preparados porligações químicas em um anticorpo e uma molécula maitansinóide semdiminuição significante da atividade biológica, tanto do anticorpo como damolécula de maitansinóide. Ver, por exemplo, patente US 5.208.020 (adivulgação desta é expressamente incorporada ao presente como referência).

Uma média de 3-4 moléculas de maitansinóide conjugadas por molécula deanticorpo mostrou eficácia no aumento da citotoxicidade das células alvo, semafetar negativamente a função ou a solubilidade do anticorpo, no entanto, seriaesperado que até uma molécula de toxina/anticorpo aumente a citotoxicidadeacima daquela do anticorpo nu. Maitansinóides são bem conhecidos natécnica e podem ser sintetizados por técnicas conhecidas ou isolados a partirde fontes naturais. Maitansinóides adequados são divulgados, por exemplo, napatente US 5.208.020 e em outras patentes e publicações não patentemencionadas acima. Maitansinóides preferidos são maitansinol e análogos domaitansinol, modificados no anel aromático ou em outras posições da moléculade maitansinol, como vários ésteres de maitansinol.

Existem muitos grupos de ligação conhecidos na técnica para seproduzir conjugados anticorpo-maitansinóide, incluindo, por exemplo, aquelesdivulgados na patente US 5.208.020 ou na patente EP 0 425 235 B1, e Chari efal., CencerResearch 52:127-131 (1992), e patente US 2005/0169933A1, asdivulgações destas são expressamente incorporadas ao presente comoreferência. Conjugados anticorpo-maitansinóide que compreendem ocomponente ligante SMCC podem ser preparados como divulgado no pedidode patente US 10/960.602. Os grupos de ligação incluem grupos bissulfeto,grupos tioéter, grupos de ácido lábil, grupos fotolábil, grupos lábil peptidase ougrupos lábil esterase, como divulgado nas patentes acima identificadas, gruposbissulfeto e tioéter sendo preferidos. Grupos Iigantes adicionais estão descritose exemplificados no presente pedido.

Conjugados do anticorpo e maitansinóide podem ser produzidosusando-se uma variedade de agentes de acoplamento de proteínasbifuncionais como N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP),succinimidiM-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC)1iminotiolano (IT)1 derivados de imidoésteres bifuncionais (como dimetiladipimidato HCI), ésteres ativos (como disuccinimidil suberato), aldeidos (comoglutaraldeído), compostos de bis-azido (como bis (p-azidobenzoil)hexanediamina), derivados de bis-diazônio (como bis-(p-diazoniumbenzoil)-etilenediamina), diisocianatos (como tolueno 2.6-diisocianato), e compostos deflúor bis-ativo (como 1l5-difiúor-2,4-dinitrobenzeno). Agentes de acoplamentoparticularmente preferidos para fornecer uma ligação bissulfeto incluem N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) (Carlsson et a/., Biochem. J.173:723-37 (1978)) e pentanoato de N-succinimidil-4-(2-piridiltio)(SPP).

O ligante pode ser anexado à molécula maitansinóide em váriasposições, dependendo do tipo de ligação. Por exemplo, uma ligação ésterpode ser formado por reação com um grupo hidroxila usando-se técnicasconvencionais de acoplamento. A reação pode ocorrer na posição C-3 que temum grupo hidroxila, na posição C-14 modificada com hidroximetila, na posiçãoC-15 modificada com um grupo hidroxila e na posição C-20 tendo um grupohidroxila. Em uma realização preferida, a ligação é formada na posição C-3 domaitansinol ou em um análogo do maitansinol.

II. AURISTATINAS E DOLASTATINAS

Em algumas realizações, o imunoconjugado compreende umanticorpo da invenção conjugado aos análogos peptidicos das dolastatinas, oudolostatinas e derivados, as auristatinas (patentes US. 5.635.483, 5.780.588).Dolastatinas e auristatinas mostraram não interferir na dinâmica dosmicrotúbulos, hidrólise de GTP e divisão nuclear e celular (Woyke et aiAntimicrob. Agents Chemother. 45(12):3580-3584 (2001) e possuem atividadeanti-câncer (patente US 5.663.149) e antifúngica (Pettit et ai, Antimicrob.Agents Chemother. 42:2961-2965 (1998)). O componente droga dolastatina ouauristatina pode ser anexado ao anticorpo através da terminação N (amina) outerminação C (carboxila) do componente droga peptídica (documento WO02/088172).

Realizações de auristatina exemplares incluem os componentesdroga monometilauristatina DE e DF ligados na terminação N (amina),divulgadas em "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation toLigands", patente US 2005/0238649, a divulgação desta é expressamenteincorporada ao presente como referência.

Tipicamente, componentes droga baseados em peptídeos podemser preparados pela formação de uma ligação peptídica entre dois ou maisaminoácidos e/ou fragmentos peptídicos. Tais ligações peptídicas podem serpreparadas, por exemplo, de acordo com o método de síntese de fase líquida(ver E. Schrõder e K. Lübke, "The Peptides", volume 1, páginas 76-136, 1965,Academic Press) que é bem conhecido no campo da química de peptídeos. Oscomponentes droga auristatina/dolastatina podem ser preparados de acordocom os métodos de: patentes US 5.635.483, US 5.780.588; Pettit et al (1989) J.Am. Chem. Soe. 111:5463-65; Pettit et al (1998) Anti-Cancer Drug Design13:243-77; (1998); Pettit et ai, Synthesis 719-25 (1996); e Pettitef ai, J. Chem.Soe. Perkin Trans. 1 5:859-863 (1996). Ver também Doronina, NatureBiotechnoi 21(7):778-84 (2003); "Monomethylvaline Compounds Capable ofConjugation to Ligands", patente US 2005/0238649, integralmente incorporadaao presente como referência (divulgando, por exemplo, Iigantes e métodos depreparação de compostos monometilvalina, como MMAE e MMAF conjugadosa ligantes).

III Caliqueamicina

Em outras realizações, o imunoconjugado compreende umanticorpo da invenção conjugado a uma ou mais moléculas de caliqueamicina.

A família de antibióticos caliqueamicina é capaz de produzir quebra na fitadupla de DNA em concentrações sub-picomolar. Para a preparação daconjugação da família caliqueamicina, ver patentes US 5.712.374, 5.714.586,5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001, 5.877.296 (todasconcedidas à American Cyanamid Company). Estruturas análogas decaliqueamicina que podem ser usadas incluem, mas não se limitam a, Y1', O2',O31, N-acetil-γι1, PSAG e θ'ι (Hinman et ai, Câncer Research 53:3336-42(1993), Lode et ai, Câncer Research 58:2925-28 (1998) e as patentes USsupracitadas, concedidas à American Cyanamid). Outra droga anti-tumor queo anticorpo pode ser conjugado é QFA, que é um antifolato. Tantocaliqueamicina como QFA têm sítios intracelulares de ação e não atravessamde imediato a membrana plasmática. Então, a percepção celular destesagentes através da internalização mediada pelo anticorpo aumenta muito seusefeitos citotóxicos.

iv. Outros Agentes Citotóxicos

Outros agentes anti-tumor que podem ser conjugados com osanticorpos da invenção incluem BCNU, estreptozoicina, vincristina e 5-flúoruracil, a família de agentes, conhecida coletivamente como complexo LL-E33288 descrita nas patentes US 5.053.394, 5.770.710, bem comoesperamicinas (patente US 5.877.296).

Toxinas enzimaticamente ativas e fragmentos destas que podemser usadas incluem cadeia de difiteria A, fragmentos ativos não ligantes detoxina de difiteria, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia

A da ricina, cadeia A da abrina, cadeia A da modecina, alfa-sarcina, proteínasde Aleurites fordii, proteínas da diantina, proteínas da Phytolaca americana(PAPI, PAPII1 e PAP-S), inibidor Momordica charantia, curcina, crotina, inibidorsapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicinae os tricotecenos. Ver, por exemplo, documento WO 93/21232 publicado em28 de outubro de 1993.

A presente invenção, além disso, contempla um imunoconjugadoformado entre um anticorpo e um componente com atividade nucleolítica (porexemplo, uma ribonuclease ou uma DNA endonuclease, como umadesoxirribonuclease; DNase).

Para destruição seletiva do tumor, o anticorpo pode compreenderum átomo altamente radioativo. Uma variedade de isótopos radioativos estádisponível para a produção de anticorpos radioconjugados. Exemplos incluemAt211, I 131 I 125 γ90, Re186 Re188, Sm 153, Bi212 p32, pb212, e isótopos radioatívosde Lu. Quando o conjugado é usado para detecção, este pode compreenderum átomo radioativo para estudos cintigráficos, por exemplo, tc99m ou I123, ouum marcador giratório para imagem de ressonância magnética nuclear (NMR)(também conhecida como imagem de ressonância magnética, mri), comonovamente iodo-123, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15,oxigênio-17, gadolinio, manganês ou ferro.

O radio ou outros marcadores podem ser incorporarados noconjugado de um modo conhecido. Por exemplo, o pepitídeo pode serbiosintetizado, ou pode ser sintetizado por síntese química de aminoácidousando-se aminoácidos precursores adequados envolvendo, por exemplo flúor-19 no lugar de hidrogênio. Marcadores como tc99m ou I123 ,Ke186 ,Ke188In111 podem ser anexados via um resíduo de cisteína no pepitídeo. ítrio-90pode ser anexado via um resíduo de lisina. O método IODOGEN (Fraker et al..Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57 (1978) pode ser usado paraincorporar iodo-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal,CRC Press 1989) descreve outros métodos em detalhes.

Conjugados do anticorpo e agente citotóxico podem serproduzidos usando-se uma variedade de agentes de acoplamento de proteínabifuncionais, como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato(SPDP)1 succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC),iminotiolano (IT), derivados de imidoésteres bifuncionais (como dimetiladipimidato HCI), ésteres ativos (como disuccinimidil suberato), aldeídos (comoglutaraldeído), compostos de bis-azido (como bis (p-azidobenzoil)hexanediamina), derivados de bis-diazônio (como bis-(p-diazoniumbenzoil)-etilenediamina), diisocianatos (como tolueno 2,6-diisocianato) e compostos deflúor bis-ativo (como 1,5-diflúor-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, umaimunotoxina ricina pode ser preparada como descrito em Vitetta et ai, Science238:1098 (1987). O ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno triamino pentaacético (MX-DTPA) marcado com carbono-14 é um agente quelante exemplarpara conjugação de radionucleotídeo ao anticorpo. Ver documento WO94/11026. O Iigante pode ser um "ligante clivável" que facilita a liberação dadroga citotóxica na célula. Por exemplo, pode ser usado um ligante ácido lábil,ligante sensível a peptidase, ligante fotolábil, ligante dimetil ou ligante quecontém bissulfeto (Chari et ai, CancerResearch 52:127-31 (1992); patente US5.208.020).

Os compostos da invenção expressamente contemplam, mas nãose limitam a ADC preparado com reagentes reticulantes: BMPS1 EMCS1GMBS, HBVS1 LC-SMCC1 MBS1 MPBH1 SBAP1 SIA1 SIAB1 SMCC1 SMPB1SMPH1 sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS. sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, e sulfo-SMPB, e SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona) benzoato) queestão comercialmente disponíveis (por exemplo, pela Pierce Biotecnologia,Inc., Rockford1 IL., E.U.A). Ver páginas 467-498, 2003-2004 ApplicationsHandbook and Catalog.ν. Preparação De Conjugados Anticorpo-Droga

Nos conjugados anticorpo-droga (ADC) da invenção, um anticorpo(Ab) é conjugado com um ou mais componentes droga (D), por exemplo,aproximadamente 1 a cerca de 20 componentes droga por anticorpo, por meiode um Iigante (L). A ADC da Fórmula I pode ser preparada por diversas rotas,empregando reações de química orgânica, condições e reagentes conhecidospara aqueles técnicos no assunto, incluindo: (1) reação de um gruponucleofílico de um anticorpo com um reagente Iigante bivalente, para formarAb-L1 via uma ligação covalente, seguida por reação com um componentedrogaD; e (2) reação de um grupo nucleofílico de um componente droga comum reagente Iigante bivalente, para formar D-L, via uma ligação covalente,seguida por reação com o grupo nucleofílico de um anticorpo. Métodosadicionais para preparar ADC estão descritos no presente pedido.

Ab(LD)p I

O ligante pode ser composto de um ou mais componentesligantes. Componentes Iigantes exemplares incluem 6-maleimidocaproil("MC"), maleimidopropanoil ("MP"), valina-citrullina ("val-cit"), alanina-fenilalanina ("ala-phe"), p-aminobenziloxicarbonil ("PAB"), N-Succinimidil 4-(2-piridiltio) pentanoato ("SPP"), N-Succinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1 carboxilato ("SMCC'), e N-Suceinimidil (4-iodo-acetil) aminobenzoato("SIAB"). Componentes ligantes adicionais são conhecidos na técnica e algunsestão descritos no presente pedido. Ver também "MonomethylvalineCompounds Capable of Conjugation to Ligands", patente US 2005/0238649, oconteúdo desta é expressamente incorporado ao presente como referência.

Em algumas realizações, o Iigante pode compreender resíduos deaminoácidos. Componentes aminoácidos ligantes exemplares incluem umdipeptídeo, um tripeptídeo, um tetrapeptídeo ou um pentapeptídeo.Dipeptídeos exemplares incluem: valina-citrulina (vc ou val-cit), alanina-fenilalanina (af ou ala-phe). Tripeptídeos exemplares incluem: glicina-valina-citrulina (gly-val-cit) e glicina-glicina-glicina (gly-gly-gly)· Resíduos deaminoácidos que compreendem um componente Iigante aminoácido incluemaqueles de ocorrência natural, bem como aminoácidos menores e análogos deaminoácidos que não ocorrem naturalmente, como citrulina. Componentesaminoácidos Iigantes podem ser projetados e otimizados em sua seletividadepara clivagem enzimática por uma enzima específica, por exemplo, umaprotease associada ao tumor, catepsina B, C e D, ou uma protease plasmina.

Grupos nucleofílicos nos anticorpos incluem, mas não se limitama: (i) grupos amina N-terminal, (ii) grupos amina da cadeia lateral, por exemplo,lisina, (iii) grupos tiol da cadeia lateral, por exemplo, cisteína, e (iv) grupos deaçúcares hidroxila ou amina onde o anticorpo é glicosilado. Amina, tiol egrupos hidroxila são nucleofílicos e capazes de reagir para formar ligaçõescovalentes com grupos eletrofílicos nos componentes Iigantes e reagentesIigantes incluindo: (i) ésteres ativos como ésteres NHS, ésteres HOBt,haloformatos e ácidos alóides; (ii) alcila e benzil alóides como haloacetamidas;(iii) aldeídos, cetonas, carboxila e grupos maleimida. Certos anticorpos têmbissulfeto redutível entre cadeias, isto é, pontes de cisteína. Anticorpos podemser produzidos por reação para conjugação com Iigantes reagentes pelotratamento com um agente de redução como DTT (ditiotreitol). Cada ponte decisteína irá formar teoricamente, dessa forma, dois nucleófilos tiol reativos.Grupos nucleofílicos adicionais podem ser introduzidos nos anticorpos atravésda reação de Iisinas com 2-iminotiolano (reagente de Traut) que resulta naconversão de uma amina em um tiol. Grupos tiol reativos podem serintroduzidos no anticorpo (ou fragmento deste) pela introdução de um, dois,três, quatro ou mais resíduos de cisteína (por exemplo, preparando anticorposmutantes que compreendem um ou mais resíduos de aminoácido cisteína nãonativos).Conjugados anticorpo-droga da invenção podem ser tambémproduzidos por modificações do anticorpo para introduzir componenteseletrofílicos, que podem reagir com o substituinte nucleofílico no reagenteIigante ou droga. Os açúcares de anticorpos glicosilados podem ser oxidados,por exemplo, com reagentes oxidantes de periodato, para formar gruposaldeído ou cetona, que podem reagir com o grupo amina de reagentes Iigantesou componentes droga. A resultante imina dos grupos de base de Schiff podeformar uma ligação estável, ou pode ser reduzida, por exemplo, por reagentesboroidrido para formar ligações amino estáveis. Em uma realização, a reaçãoda porção carboidrato de um anticorpo glicosilado, tanto com galactose oxidasecomo com metaperiodato de sódio, pode produzir grupos carbonil (aldeído ecetona) na proteína que pode reagir com grupos apropriados na droga(Hermanson, Bioconjugate Techniques). Em outra realização, proteínascontendo serina ou resíduos de treonina N-terminal podem reagir commetaperiodato de sódio, resultando na produção de um aldeído no lugar doprimeiro aminoácido (Geoghegan & Stroh, Bioconjugate Chem. 3:138-46(1992); patente US 5.362.852). Tal aldeído pode reagir com um componentedroga ou nucleófilo ligante.

Da mesma maneira, grupos nucleofílicos em um componentedroga incluem, mas não se limitam a: amina, tiol, hidroxila, hidrazido, oximo,hidrazino, tiosemicarbazona, hidrazino carboxilato, e grupos aril hidrazidocapazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos eletrofílicos noscomponentes Iigantes e reagentes ligantes, incluindo: (i) ésteres ativos comoésteres NHS, ésteres HOBt1 haloformatos e ácidos alóides; (ii) alcila e benzilalóides como haloacetamidas; (iii) aldeídos, cetonas, carboxila e gruposmaleimida.

Alternativamente, uma proteína de fusão que compreende oanticorpo e agente citotóxico pode ser produzida, por exemplo, por técnicasrecombinantes ou síntese peptídica. O comprimento do DNA podecompreender regiões respectivas que codificam as duas porções do conjugado,tanto adjacentes uma à outra como separadas por uma região que codifica umpepitídeo ligante que não anula as propriedades desejadas do conjugado.

Ainda em outra realização, o anticorpo pode ser conjugado a um"receptor" (como estreptavidina) para utilização no tumor pré-direcionado, emque o conjugado anticorpo-receptor é administrado ao paciente, seguido pelaremoção do conjugado não ligado da circulação usando-se um agente delimpeza e, então, administração de um "ligante" (por exemplo, avidina) que éconjugado a um agente citotóxico (por exemplo, um radionucleotídeo).

Formulações Farmacêuticas

Formulações terapêuticas que compreendem um anticorpo dainvenção são preparadas para armazenamento por meio da mistura doanticorpo tendo o grau desejado de purificação com veículos opcionaisfarmaceuticamente aceitáveis, excipientes ou estabilizantes (iRemington: TheScience and Practice of Pharmacy 20a edição (2000)), na forma de soluçõesaquosas, formulações Iiofilizadas ou desidratadas. Veículos aceitáveis,excipientes ou estabilizantes são atóxicos para receptores na dosagem econcentrações empregadas, e incluem tampões como fosfato, citrato, histidinae outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina;conservantes (como octadecildimetilbenzil cloreto de amônio; cloreto dehexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, butil ouálcool benzil; alcila parabenos como metil ou propil parabeno; catecol;resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo pesomolecular (menos que aproximadamente 10 resíduos); proteínas, como soro dealbumina, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos comopolivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, histidina,arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratosincluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes como EDTA;açúcares como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; formação de sais decontra-íons como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexo prote.na-Zn); e/ou surfactantes não-iônicos, como TWEEN™, PLURONICS™ oupolietileno glicol (PEG).

A formulação no presente pedido pode também conter mais queum componente ativo, de acordo com o necessário para a indicação especificasendo tratada, preferencialmente aqueles com atividades complementares quenão afetem contrariamente um ao outro. Tais moléculas estão adequadamentepresentes em combinação e nas quantidades efetivas para o propósitopretendido.

Os ingredientes ativos podem também ser capturados namicrocápsula preparada, por exemplo, por técnicas de coacervação ou porpolimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulasde gelatina e microcápsula de poli-(metilmetacilato), respectivamente, emsistemas de distribuição de droga coloidal (por exemplo, lipossomos,microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ounas macroemulsões. Tais técnicas estão divulgadas em Remingtorr. TheScience and Practice of Pharmacy 20a edição (2000).

As formulações a serem usadas para administração in vivo devemser estéreis. Isto é facilmente realizado por filtração através de membranas defiltração estéreis.

Preparações de liberação contínua podem ser preparadas.

Exemplos adequados de preparações de liberação contínua incluem matrizessemipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contêm aimunoglobulina da invenção, no qual matrizes estão na forma de artigosmodelados, por exemplo, filmes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes deliberação contínua incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), ou poli(vinilálcool)), polilactídeos (patente US3 773 919) copolimeros de ácido L-glutãmico e γ etil-L-glutamato, aoetato deetileno-viníl nâo degradável, copolimeros de ácido lático-ácido glicôlicodegradáveis tal como o LUPRON DEPOT™ (microesferas injetáveis compostasde copolimeros de ácido lático-ácido glicôlico e acetato de leuprolido). e ácdopoíi-D-(-)- 3-hidroxibutírico. Enquanto polímeros como acetato de etiíeno-vm,! eácido lático-ácido glicôlico permitem liberação de moléculas por mais de 100dias certos hidrogéis liberam proteínas por períodos de tempo mais curtos.Quando encapsuladas, as imunoglobulinas permanecem no corpo por umlongo periodo, eias podem desnaturar ou agregar como um resultado daexposição à umidade a 37°C, resultando em uma perda da atividade biológicae possíveis alterações na imunogenicidade. Estratégias racionais podem serdesenvolvidas para a estabilização, dependendo do mecanismo envolvido. Porexemplo se o mecanismo de agregação é descoberto como sendo deformação de ligação S-S intermolecular através de intercâmbio tio-bissulfeto, aestabilização pode ser alcançada pela modificação de resíduos suffidnl,liofilização de soluções ácidas, controle da umidade do conteúdo, usoapropriado dos aditivos, e desenvoívimento de composições de matnz depolímero específicas.

Usos

um anticorpo da presente invenção pode ser usado, por exemplo,nos métodos terapêuticos in vitro, ex vivo e in vivo.Em algumas realizações, a invenção fornece métodos parareduzir ou inibir a angiogênese em um sujeito que «em uma condição patológicaassociada á angiogênese, que compreende administrar ao sujeito umaquantidade efe.iva de um anticorpo anti-EGFL7 da invenção. Estas condiçõesincíuem, por exemplo, neoplasmas (incluindo carcinomas, e certas cond.çoesoculares.O câncer passível de melhora para tratamento pela presenteinvenção inclui, mas não se limita a, carcinoma, linfoma, blastoma. sarcoma eleucemia ou malignidades linfóides. Exemplos mais específicos de taiscânceres incluem câncer de mama, câncer de cólon, câncer retal, câncercolorretal, câncer de rim ou renal, câncer de pulmão, incluindo câncer depulmão de célula pequena, câncer de pulmão de célula não pequena,adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão, câncer decélulas escamosas (por exemplo, câncer de células escamosas epiteliais),câncer cervical, câncer ovariano, câncer de próstata, câncer de fígado, câncerde bexiga, câncer do peritônio, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou deestômago, incluindo câncer gastrointestinal, câncer pancreático, câncer decabeça e pescoço, glioblastoma, retinoblastoma, astrocitoma, tecomas,arrenoblastomas, hepatoma, malignidades hematológicas, incluindo linfomanão-Hodgkin, mieloma múltiplo e malignidades hematológicas, carcinoma deendométrio ou uterino, endometriose, flbrosarcomas, coriocarcinoma,carcinoma de glândula salivar, câncer de vulva, câncer de tireóide, carcinomasesofágicos, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma do pênis,carcinoma nasofaringeal, carcinoma laringeal, sarcoma de Kaposi, melanoma,carcinoma de pele, Schwannoma, oligodendroglioma, neuroblastomas,rabdomiosarcoma, sarcoma osteogênico, leiomiosarcomas, carcinomas dotrato urinário, carcinomas da tireóide, tumor de Wilm. bem como proliferaçãovascular anormal associada com faccmatoses, edema (como aquelesassociados com tumores do cérebro) e síndrome de Meigs. Preferencialmente,o câncer é selecionado do grupo que consiste de câncer de mama, câncercolorretal, câncer de pulmão de célula não pequena, linfoma não-Hodgkins(NHL), câncer renal, câncer de próstata, câncer de fígado, câncer de cabeça epescoço, melanoma, câncer ovariano, mesotelioma e mieloma múltiplo. Maispreferencialmente, o câncer é câncer colorretal. As condições cancerosaspassíveis de melhora para tratamento da invenção incluem cânceresmetastáticos. A presente invenção é particularmente adequada para otratamento de tumores vascularizados.

As condições oculares passíveis de melhora pelo tratamento dapresenta invenção incluem doença neovascular ocular, incluindo, mas não selimitando a, degeneração macular relativa à idade, edema macular diabético,retinopatia diabética proliferativa, oclusão venal retinal central com edemamacular cistôide, oclusão venal retinal ramificada com edema macular cistôide,rubeosis irides, miopia patológica/CNV, Sindrome de Von Hippel Lindau,pterígio, POHS (Histoplasmose)/CNV, hemangiomas coroidais, retinopatia deprematuridade (ROP), retinopatia de radiação, tumores intra-oculares (porexemplo, melanoma, retinoblastoma, metàstases e hemangiomas cavernososde órbita), coroidopatia polipcidal. telangiectasia justafoveal idiopática, Doençade Eales1 hemangiomas cavernosos de õrbita, Iinfagiomas orbitais,hemangiomas capilares da pâlpebra, vascularizaçâo de enxerto de côrnea.neovascularização de enxerto de córnea, Doença de Coat e problemas decicatrização associados com cirurgia de glaucoma.

Além disso, pelo menos alguns dos anticorpos da invençãopodem se ligar ao antígeno de outra espécie. Consequentemente, anticorposda invenção podem ser usados para se ligar a uma atividade específica doantígeno, por exemplo, em uma cultura celular contendo o antígeno, emsujeitos humanos ou em outros sujeitos mamíferos que têm o antígeno com oqual um anticorpo da invenção interage (per exemplo, chimpanzé, babuino,sagüi cynomolgus e rhesus, porco ou camundongo). Em algumas realizações,um anticorpo da invenção pode ser usado para inibir atividades do antígenopelo contato do anticorpo com o antígeno de forma que a atividade do antígenoseja inibida. Preferivelmente, o antígeno é uma molécula de proteína humana.

Em algumas realizações, um anticorpo da invenção pode serusado em um método para se ligar a um antígeno em um sujeito que sofre deuma disfunção associada com o aumento da expressão e/ou atividade doantígeno, que compreende administrar ao sujeito um anticorpo da invenção, deforma que o antígeno no sujeito seja ligado. Preferivelmente1 o antígeno é umamolécula de proteína humana e o sujeito é um sujeito humano.Alternativamente, o sujeito pode ser um mamífero que expressa o antígenocom o qual um anticorpo da invenção se liga. Além disso, o sujeito pode serainda um mamífero no qual o antígeno foi introduzido (por exemplo, pelaadministração do antígeno ou pela expressão de um antígeno de transgene).Um anticorpo da invenção pode ser administrado a um sujeito humano parapropósitos terapêuticos. Além disso, um anticorpo da invenção pode seradministrado a um mamífero não humano que expressa um antígeno com oqual a imunoglobulina interage (por exemplo, um primata, porco oucamundongo) para propósitos veterinários ou como um modelo animal dedoença humana. Relativo ao último citado, tais modelos animais podem serúteis para avaliar a eficácia terapêutica de anticorpos da invenção (porexemplo, teste de dosagens e períodos de administração).

Os anticorpos da invenção podem ser usados para tratar, inibir,adiar progressão, prevenir/atrasar recidiva, melhorar ou prevenir doenças,disfunções ou condições associadas com a expressão normal e/ou atividade deuma ou mais moléculas de antígeno.

Em certas realizações, um imunoconjugado que compreende umanticorpo conjugado com um ou mais agentes citotóxicos é administrado aopaciente. Em algumas realizações, o imunoconjugado e/ou antígeno ao qualele é ligado é/são internalizado(s) pela célula, resultando em um aumento daeficácia terapêutica do imunoconjugado na destruição da célula alvo à qual seliga. Em uma realização, o agente citotóxico atinge ou interfere no ácidonucléico na célula alvo. Em uma realização, o agente citotóxico atinge ouinterfere na polimerização dos microtúbulos. Exemplos de tais agentescitotóxicos incluem qualquer um dos agentes quimioterapêuticos apontados nopresente pedido (como um maitansinóide, auristatina, dolastatina ou umacaliqueamicina), um isótopo radioativo, uma ribonuclease ou uma DNAendonuclease.

Anticorpos da invenção podem ser usados tanto sozinhos comoem combinação com outras composições na terapia. Por exemplo, umanticorpo da invenção pode ser co-administrado com outro(s) agente(s)quimioterapêutico(s) (incluindo coquetéis de agentes quimioterapêuticos),outros agente(s) citotóxico(s), agente(s) anti-angiogênico(s), citocinas, e/ouagente(s) inibidor(es) do crescimento. Tais terapias combinadas apontadasacima incluem administração combinada (quando dois ou mais agentes estãoincluídos na mesma formulação ou separados), e administração separada,neste caso, administração do anticorpo da invenção pode ocorrer antes de,e/ou seguindo a administração da terapia ou terapias adjuntas.

O anticorpo da invenção (e agente terapêutico adjunto) é/sãoadministrado(s) por qualquer meio adequado, incluindo parenteral, subcutâneo,intraperitonial, intrapulmonar, e intranasal, e se desejado por tratamento local eadministração intralesional. Infusões parenterais incluem intramuscular,intravenosa, intra-arterial, intraperitonial ou administração subcutânea. Alémdisso, o anticorpo é adequadamente administrado por infusão de pulso,especialmente com declínio de doses do anticorpo. A dosagem pode ser porqualquer rota adequada, por exemplo, por injeções, tais como injeçãointravenosa ou subcutânea, dependendo em parte, se a administração é breveou crônica.

A composição do anticorpo da invenção será formulada, dosada,e administrada em um modo consistente com as boas práticas médicas.Fatores para consideração neste contexto incluem a disfunção específicasendo tratada, o mamífero específico sendo tratado, a condição clínicaindividual do paciente, a causa da disfunção, o local de entrega do agente, ométodo de administração, o período de administração e outros fatoresconhecidos pelo médico. O anticorpo não precisa ser, mas é opcionalmenteformulado com um ou mais agentes atualmente usados para prevenir ou tratara disfunção em questão. A quantidade efetiva de tais outros agentes dependeda quantidade de anticorpos da invenção presente na formulação, o tipo dadisfunção ou tratamento, e outros fatores discutidos acima. Estes geralmentesão usados na mesma dosagem e com rotas de administração comopreviamente mencionado ou cerca de 1 a 99% das dosagens até agoraempregadas.

Para a prevenção ou tratamento da doença, a dosagemapropriada de um anticorpo da invenção (quando usado sozinho ou emcombinação com outros agentes, dependerá do tipo de doença a ser tratada,do tipo de anticorpo, a severidade e curso da doença, se o anticorpo éadministrado para propósitos preventivos ou terapêuticos, terapias prévias, ohistórico clínico do paciente e resposta ao anticorpo, e a discrição do médico.

O anticorpo é adequadamente administrado ao paciente uma vez ou nodecorrer de uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e severidade dadoença, cerca de 1 pg/kg a 15 mg/kg (por exemplo, 0,1mg/kg-10mg/kg) deanticorpo é uma dosagem candidata inicial para administração ao paciente, se,por exemplo, por uma ou mais administrações separadas ou por infusãocontínua. Uma dosagem diária típica pode variar de aproximadamente 1Mg/kga 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores acima mencionados. Paraadministrações repetidas no decorrer de vários dias ou mais tempo,dependendo da condição, o tratamento é prolongado até ocorrer uma desejadasupressão dos sintomas da doença Um dosagem exemplar do anticorpo seriana faixa de aproximadamente 0,05mg/Kg a cerca de 10mg/Kg. Dessa forma,uma ou mais doses de aproximadamente 0,5mg/kg, 2,0mg/kg, 4,0mg/kg ou10mg/kg (ou qualquer combinação destas) pode ser administrada ao paciente.

Tais doses podem ser administradas intermitentemente, por exemplo, a cadasemana ou a cada três semanas (por exemplo, de forma que o paciente recebade duas a cerca de vinte, por exemplo, cerca de seis doses do anticorpo). Umadose de carga inicial mais alta pode ser administrada, seguida de uma ou maisdoses mais baixas. Um regime de dosagem exemplar compreendeadministração de uma dose de carga de aproximadamente 4 mg/kg, seguidopor uma manutenção de dose semanal de aproximadamente 2 mg/kg doanticorpo. No entanto, outros regimes de dosagem podem ser funcionais. Oprogresso desta terapia é facilmente monitorado por testes e técnicasconvencionais.

Os anticorpos anti-EGFLT da invenção são úteis nos testes paradetectar a expressão do EGFL7 (como testes diagnósticos ou prognósticos) emcélulas ou tecidos específicos, em que os anticorpos são marcados comodescrito abaixo e/ou são imobilizados em uma matriz insolúvel.

Em outro aspecto, a invenção fornece métodos para detecção doEGFL7, os métodos que comprendem detectar o complexo anticorpoEGFL7-anti-EGFL7 na amostra. O termo "detecção·, como usado no presente pedido,inclui detecção qualitativa e/ou quantitativa (niveis de medida) com ou semreferência a um controle.

Em outro aspecto, a invenção fornece métodos para diagnósticode uma disfunção associada com a expressão e/ou atividade do EGFL7, osmétodos que comprendem detectar o complexo anticorpo EGFL7-anti-EGFL7na amostra de um paciente que tem ou suspeita-se que tenha a disfunção. Emalgumas realizações, a expressão do EGFL7 é a expressão aumentada ouanormal (indesejada).

Em outro aspecto, a invenção fornece qualquer um dos anticorposanti-EGFL.7 descritos no presente pedido, em que o anticorpo anti-EGFL7compreende um marcador detectável.

Em outro aspecto, a invenção fornece um complexo com qualquerum dos anticorpos anti-EGFL7 descritos no presente pedido e EGFL7. Emalgumas realizações, o complexo está in vivo ou in vitro. Em algumasrealizações, o complexo compreende uma célula cancerosa. Em algumasrealizações, o anticorpo anti-EGFL7 é detectável, marcado.

Anticorpos anti-EGFL7 podem ser usados para a detecção doEGFL7 em qualquer um dos vários métodos de teste de detecção conhecidos.Por exemplo, uma amostra biológica pode ser analisada para EGFL7 pelaobtenção da amostra de uma fonte desejada, misturando-se a amostra com umanticorpo anti-EGFL7 para permitir que o anticorpo forme o complexoanticorpo/EGFL7 com qualquer EGFL7 presente na mistura, e detectarqualquer complexo anticorpo/EGFL7 presente na mistura. A amostra biolôg,capode ser preparada para teste pelos métodos conhecidos na técnica que saoadequados para a amostra especifica. Os métodos de mistura da amostra comanticorpos e os métodos de detecção do complexo anticorPo/EGFL7 saoescolhidos de acordo com o tipo de teste usado. Tais testes incluemimunohistoquimica, testes competitivos ou sanduiche e testes de inib.çãoestérica.

Todos os métodos analíticos para EGFL7 usam um ou mais dosreagentes a seguir: análogo do EGFL7 marcado, análogo do EGFL7imobilizado, anticorpo anti-EGFL7 marcado, anticorpo anti-EGFL7 imobilizado econiugados estéricos. Os reagentes marcados também são conhecidos como"tracers".

O marcador usado é qualquer um de funcionalidade detectávelque não interfira na ligação do EGFL7 com c anticorpo anti-EGFL7. Muitosmarcadores são conhecidos para uso em imunoensaio, exemplos que incluemcomponentes que podem ser detectados diretamente, como fluorcromo.quimiluminescente e marcadores radioativos, bem oomo componentes, comoenzimas, que devem reagir ou derivar para serem detectadas.

O marcador usado é qualquer um de funcionalidade detectávelque não integra na ligação do EGFL7 com o anticorpo an«i-EGFL7. Muitosmarcadores são conhecidos para uso em imunoensaio, exemplos que incluemcomponentes que podem ser detectados diretamente, como fluorcromo,quimiluminescente e marcadores radioativos, bem como componentes, comoenzimas, que devem reagir ou derivar para serem detectadas. Exemplos detais marcadores incluem, os radioisótopos «C. «I. 3H, e —roscomo quelatos de raro-terra (quelatos európio) ou fluorescina e seus denvados,rodamina e seus derivados, dansil, umbeliferona, luceriferases, por exemplo,luciferase de vagalume e Iuciferase bacteriana (patente US 4.737.456),luciferina, 2,3-desidroftalazinedionas, peroxidase de rábano silvestre (HRP),fosfatase alcalina, β-galactosidase, glicoamilase, lisozima, sacarideosoxidases, por exemplo, glicose oxidase, galactose oxidase e glicose-6-fosfatedesidrogenase, oxidases heterociclicas como uricase e xantina ox.dase,acoplamentos com uma enzima que emprega peróxido de hidrogênio paraoxidar um corante precursor como HRP, Iactoperoxidase ou microperox,dase.biotina/avidina, marcadores de spin, radicais livres estáveis e similares.

Métodos convencionais estão disponíveis para ligação covalentedestes marcadores com proteínas ou polipeptídeos. Por exemplo, agentes deacoplamento como dialdeídos, carbodiimidas, dimaleimidas, bis-im.datos,benzidinas bis-diazotizadas e similares podem ser usados para marcar osanticorpos com marcadores fluorescentes, quimiluminescentes e enz.mas. Ver,por exemplo, patente US 3.940.475 (fluorimetria) e 3.645.090 (enzimas);Hunter e, a/., Nature. 144: 945 (1962); David ef ei. Bicohemistry, 13: 1014-21(1974)· Pain et ai, J. Immunoi Methods, 40: 219-30 (1981); e Nygren, J.Histochem. and Cytochem. 30: 407-12 (1982). Marcadores preferidos nopresente pedido são as enzimas como peroxidase de rábano silvestre efosfatase alcalina. A conjugação de tal marcador ao anticorpo, que inclui asenzimas, é um procedimento de manipulação padrão para uma das técnicascomuns nas técnicas de imunoensaio. Ver, por exemplo, O1SuIIivan et ai,"Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use inEnzyme Immunoassay," em Methods in Enzymol., ed. J.J. Langone e H. VanVunakis, Vol. 73 (Academic Press, Nova York, Nova York, 1981), páginas 147-166.

A imobilização de reagentes é necessária para certos métodos deteste. A imobilização confere separação do anticorpo anti-EGFL7 de qualquerEGFL7 que fique livre na solução. Isto é realizado de modo convencional,tanto pela insolubilização do anticorpo anti-EGFL7 como análogo do EGFL7antes do procedimento de teste, como por adsorção a uma matriz ou superfícieinsolúvel em água (Bennich et ai, patente US 3.720.760), por acoplamentocovalente (por exemplo, usando-se glutaraldeído de reticulação), ouinsolubilização do anticorpo anti-EGFL7 ou análogo do EGFL7 subsequente,por exemplo, por imunoprecipitação.

A expressão de proteínas em uma amostra pode ser examinadausando-se protocolos de imunohistoquímica e coloração. Coloraçãoimunohistoquímica de cortes de tecido mostrou ser um método confiável deavaliação ou detecção da presença de proteínas em uma amostra. Técnicasimunohistoquímicas ("IHC") utilizam um anticorpo para sondar e visualizarantígenos in situ, geralmente por métodos cromatogênicos ou fluorescentes.

Para preparação da amostra, uma amostra de célula ou tecido de um mamífero(tipicamente um paciente humano) pode ser usada. A amostra pode ser obtidapor uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica incluindo, mas nãolimitado a excisão cirúrgica, aspiração ou biópsia. O tecido pode ser fresco oucongelado. Em uma realização, a amostra é fixada e embebida em parafina ousimilar. Os cortes de tecido podem ser fixados (isto é, preservados) pordiversas metodologias convencionais. Um técnico no assunto irá apreciar quea escolha de um fixador seja determinada para os propósitos para que aamostra seja histologicamente corada ou analisada de outra forma. Um técnicono assunto irá também apreciar que a extensão da fixação dependa dotamanho da amostra de tecido e do fixador utilizado.

IHC pode ser realizado em combinação com técnicas adicionais,como coloração morfológica e/ou hibridização fluorescente in situ. Doismétodos gerais de IHC estão disponíveis; testes diretos e indiretos. De acordocom o primeiro teste, a ligação do anticorpo ao antígeno alvo (por exemplo,EGFL7) é determinada diretamente. Este teste direto usa um reagentemarcado, tal como uma tag fluorescente ou um anticorpo primário marcadocom enzima, que pode ser visualizado sem interações de anticorpos adicionais.Em um teste indireto típico, o anticorpo primário não conjugado se liga aoantígeno e então um anticorpo secundário marcado se liga ao anticorpoprimário. Onde o anticorpo secundário é conjugado a um marcador enzimático,um substrato cromatogênico ou fluorgênico é adicionado para fornecervisualização do antígeno. A amplificação de sinal ocorre porque diversosanticorpos secundários podem reagir com diferentes epitopos no anticorpoprimário.

O anticorpo primário e/ou secundário usado paraimunohistoquímica tipicamente será marcado com um componente detectável.Diversos marcadores estão disponíveis, as quais podem ser agrupadas nasseguintes categorias:

Com exceção da preparação da amostra dos procedimentosdiscutidos acima, tratamentos adicionais do corte do tecido anterior a, duranteou seguindo IHC pode ser desejado, por exemplo, métodos de recuperação deepitopo, como aquecimento da amostra de tecido em tampão citrato pode serrealizada (ver, por exemplo, Leong ef al. Appi Immunohistochem. 4(3):201(1996)).

Seguindo uma etapa de bloqueio opcional, o corte de tecido éexposto ao anticorpo primário por um período de tempo suficiente e sobcondições adequadas de forma que o anticorpo primário se ligue ao antígenode proteína alvo na amostra de tecido. Condições apropriadas para alcançaristo podem ser determinadas por experimento de rotina. A extensão de ligaçãode anticorpo para a amostra é determinada pelo uso de qualquer um dosmarcadores detectáveis discutidos acima. Preferencialmente, o marcador é ummarcador enzimático (por exemplo, HRPO) que catalisa uma alteração químicado substrato cromatogênico, como cromogênio 3,3"-diaminobenzidina.Preferencialmente a marca enzimática é conjugada ao anticorpo que se ligaespecificamente ao anticorpo primário (por exemplo, o anticorpo primário éanticorpo policlonal de coelho e o anticorpo secundário é anticorpo anti-coelhode cabra).

Amostras preparadas deste modo podem ser montadas ecobertas com cobertura de vidro. A avaliação da lâmina é então determinada,por exemplo, usando-se um microscópio, e o critério de intensidade decoloração, rotineiramente usado na técnica, pode ser empregado.

Outros métodos de teste, conhecidos como testes competitivos ousanduíche, são bem estabelecidos e amplamente usados na indústria dediagnósticos comerciais.

Testes competitivos dependem da capacidade de um análogo dotracer EGFL7 competir com a amostra de teste do EGFL7 por um númerolimitado de sítios de ligação ae antígeno do anticorpo anti-EGFL7. O anticorpoanti-EGFL7 geralmente está insolúvel antes ou depois da competição e então otracer e EGFL7 ligado ao anticorpo anti-EGFL7 são separados de um tracernão ligado e do EGFL7. Esta separação é realizada por decantação (quando oparceiro ligante foi pré-insolubilizado) ou por centrifugação (quando o parceiroligante foi precipitado após a reação competitiva). A quantidade da amostra deteste de EGFL7 é inversamente proporcional à quantidade de tracer ligadocomo medido pela quantidade da substância marcadora. Curvas de respostade dose com quantidades conhecidas de EGFL7 são preparadas ecomparadas com os resultados do teste para determinar quantitativamente aquantidade de EGFL7 presente na amostra de teste. Estes testes sãochamados sistemas ELISA, quando enzimas são usadas como marcadores detectáveis.

Outros tipos de teste competitivo, chamados de teste"homogêneo", não exigem uma fase de separação. Aqui, um conjugado deuma enzima com o EGFL7 é preparado e usado de forma que, quando oanticorpo anti-EGFL7 se liga ao EGFL7, a presença do anticorpo anti-EGFL7modifica a atividade da enzima. Neste caso, o EGFL7 ou seus fragmentosativos imunologicamente são conjugados com uma ponte orgânica bifuncionala uma enzima como uma peroxidase. Conjugados são selecionados para ouso com o anticorpo anti-EGFL7, de forma que a ligação do anticorpo anti-EGFL7 iniba ou potencialize a atividade enzimática do marcador. Este método,por si só, é amplamente praticado com o nome de EMIT.

Conjugados estéricos são usados nos métodos de impedimentoestérico para teste homogêneo. Estes conjugados são sintetizados por ligaçãocovalente com um hapteno de baixo peso molecular a um fragmento pequenodo EGFL7, de forma que o hapteno seja substancialmente incapaz de se ligarao conjugado ao mesmo tempo que o anticorpo anti-EGFL7. Sob esteprocedimento de teste, o EGFL7 presente na amostra de teste irá se ligar aoanticorpo anti-EGFL7, através disso, permitindo a um anti-hapteno se ligar aoconjugado, resultando em uma mudança no caráter do hapteno conjugado, porexemplo, uma mudança na fluorescência, quando o hapteno é um fluoróforo.

Testes sanduíche são especificamente úteis para a determinaçãodo EGFL7 ou anticorpos EGFL7. Em testes sanduíche seqüenciais, umanticorpo anti-EGFL7 imobilizado é usado para adsorver a amostra de teste doEGFL7, a amostra de teste é removida por lavagem, o EGFL7 ligado é usadopara adsorver um segundo anticorpo anti-EGFL7 e o material ligado é entãoseparado do tracer residual. A quantidade de tracer ligado é diretamenteproporcional às amostras de teste do EGFL7. Nos testes sanduíche"simultâneo" a amostra de teste não é separada antes da adição do anti-EGFL7marcado. Um teste sanduíche seqüencial, usando-se um anticorpo monoclonalanti-EGFL7 como um anticorpo e um anticorpo policlonal anti-EGFL7 comooutro, é útil para testar amostras para EGFL7.

Os precedentes são testes de detecção meramente exemplarespara EGFL7. Outros métodos desenvolvidos agora ou no futuro que utilizamanticorpo anti-EGFL7 para determinação do EGFL7 estão incluídos dentro doescopo deste, incluindo os bioensaios descritos no presente pedido.artifins De Fabricação

Em outro aspecto da invenção, é fornecido um artigo defabricação contendo materiais úteis para o tratamento, prevenção e/oudiagnóstico das disfunções descritas acima. O artigo de fabricaçãocompreende um recipiente e uma etiqueta ou uma bula no recipiente ouassociada a este. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas,frascos, seringas, etc. Os recepientes podem ser formados por uma variedadede materiais, como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composiçãoque é, por si mesma ou quando combinada com outra(s) composição(ões),efetiva para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico da condição, e pode terum orifício de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa desolução intravenosa ou um frasco tendo uma rolha perfurável para uma agulhade injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é umanticorpo da invenção. A etiqueta ou bula indica que a composição é usadapara o tratamento da condição da escolha, como asma. Além disso, o artigo defabricação pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composiçãocontida neste, em que a composição compreende um anticorpo da invenção; e(b) um segundo recipiente com uma composição contida neste. O artigo defabricação desta realização da invenção pode, ainda, compreender uma bulaindicando que a primeira e a segunda composição do anticorpo pode ser usadapara tratar uma condição específica, por exemplo, asma. Alternativamente, ouadicionalmente, o artigo de fabricação pode, ainda, compreender um segundo(ou terceiro) recipiente que compreende um tampão farmaceuticamenteaceitável, como água bacteriostática para injeção (BWFI)1 tampão fosfatosalino, solução de Ringer e solução de dextrose. Pode, além disso, incluiroutros materiais comerciais desejáveis do ponto de vista do usuário, incluindooutros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.

A seguir estão os exemplos dos métodos e composições dainvenção. Entende-se que várias outras realizações podem ser praticadas,dada a descrição geral fornecida acima.

Exemplos

Exemplo 1

produção F Caracterização De Anticorpos Monoclonais Para EGFL7Produção De Anticorpos Monoclonais

EGFL7 foi identificada e clonada em uma tentativa de descobrirnovas proteínas humanas transmembrana e secretada, particularmenteaquelas envolvidas na regulação do desenvolvimento vascular. Detalhes daclonagem e expressão da EGFL7 humana estão descritos, por examplo, nopedido de patente US 2003/0224948A1 (em que EGFL7 é identificado comoPRQ1449). O número de acesso no GenBank® para EGFL7 humana éΝΜ_016215.

Camundongos knockout homozigoto Egfl7 (gerados naGenentech) foram imunizados com proteína EGFL7 humana recombinante e decamundongo ligada a His6 produzida por E. coli, diluída em adjuvante Ribi(Corixia, Hamilton, MT) duas vezes por semana, via coxim plantar, em oitodoses. As células B de Iinfonodo foram colhidas de dez camundongos quedemonstraram altas titulações no soro e foram fundidas com células demieloma de camundongo (X63.Ag8.653; American Type Culture Collection®(ATCC®)) Após 10-14 dias, os sobrenadantes foram selecionados paraprodução de anticorpo, dirigido por ELISA usando-se proteína EGFL7recombinante. Os positivos foram subclonados para alcançarmonoclonalidade. Para produção em grande escala de anticorpo purificado,células de hibridoma foram injetadas i.p. em camundongos BALB/c infectadospela primeira vez, ou cultivadas em biorreator completo. Os fluidos de ascitesou sobrenadantes da cultura foram purificados por cromatografia de afinidadecom proteína A (Pharmacia Fast Protein Liquid Chromatography; Pharmacia,Uppsala, Sweden). Três destes anticorpos monoclonais designados 4F11,10G9 e 18F7 foram escolhidos para posterior análise. Estes anticorposmonoclonais foram depositados na ATCC® em janeiro de 2006.amtir.orpqs mqnor·· ™a.s Bloqufiaiui AnraAo e MigracAo Df Célula HUVEC

Foi previamente mostrado que EGFL7 revestida em placas decultura promove adesão de células endoteliais da veia umbilical humana(HUVEC), embora a força de adesão tenha sido significativamente mais fracado que outras moléculas de adesão celular, como fibronectina e colágeno(Parker et ai, Nature 428:754-58 (2004)). Consequentemente, nós realizamosexperimentos para determinar se Mabs 4F11, 10G9 e18F7 poderiam bloqueara adesão celular nas placas revestidas com EGFL7. As placas foram revstidascom 5 pg/ml de fibronectina (Roche) e EGFL7 humana recombinante produzidaem Ε. co//). Após lavagens com PBS1 as HUVECs (Cambrex) foramplaqueadas a uma densidade de 5 χ 10W em meio EGM2 e centrifugadaspor 5 minutos a 140 g para sincronizar a junção celular, e então incubadas.Para analisar a atividade do anticorpo, HUVECs em meio EGM2 foram pré-incubadas com concentrações de 0,5, 5 ou 50 Mg/ml de anticorpo em 50 mM deTris / 125 mM de NaCI1 pH 8,6 antes de serem plaqueadas. Cada um dosMabs 4F11, 10G9 e 18F7 bloqueou a adesão celular nas placas revestidascom EGFL7 humana ou de camundongo de uma maneira dependente daconcentração e nenhum dos Mabs bloqueou adesão celular nas placasrevestidas com fibronectina, confirmando que o bloqueio foi específico paraEGFL7.

Nós também examinamos se estes anticorpos podem bloquear amigração de HUVEC nas placas revestidas com EGFL7. As placas foramrevestidas com 5 Mg/ml de uma das seguintes proteínas: BSA (Sgima),colágeno (Upstate), fibronectina (Roche) e EGFL7 humana recombinante(produzida em E. coli na Genentech). Após lavagens com PBS, as HUVECs(Cambrex) foram plaqueadas a uma densidade de 5x10W em EGM2(Cambrex). Permitiu-se que as células se juntassem por duas horas e amonocamada foi raspada com pontas de pipeta. Os poços foram lavados duasvezes com EGM2 e o meio fresco contendo 50 Mg/ml de um mab controle, ou4F11, 10G9, 18F7 foram adicionados, respectivamente. Os poços foramfotografados em vários intervalos de tempo ao longo de 24 horas paramonitorar o fechamento das áreas raspadas. Cada um dos Mabs 4F11, 10G9 e18F7 bloqueou a migração celular nas placas revestidas com proteína EGFL7,mas não nas placas revestidas com outras proteínas. O mab controle nãobloqueou a atividade com qualquer uma das proteínas. Estes resultadosindicam que todos os três anti-EGFL7 especificamente bloquearam a migraçãode HUVEC com EGFL7.De modo interessante, nós observamos que o bloqueio pelo Mab4F11 foi dependente da formulação. Especificamente, o anticorpo foialtamente efetivo no bloqueio da adesão celular de HUVEC quando o estoquede anticorpo foi preparado em 50 mM de Tris / 125 mM de NaCl, mas exibiueficácia mínima quando preparado em PBS. Esta diferença não foi observadapara os outros dois Mabs.

Determinação Da Seqüência De Mabs 4F11 E10G9

O RNA total foi extraído das células de hibridoma que produzemos anticorpos monoclonais EGFL7 anti-humano 4F11 e 10G9, usando-se o MiniKit RNeasy® (Qiagen, Germany). Os domínios variáveis da cadeia leve (VL) eda cadeia pesada (VH) do 4F11 e do 10g9 foram amplificados usando-se RT-PCR com os seguintes primers degenerados:Para 4F11:

Cadeia leve (LC) forward: 5'- GTCAGATATCGTKCTSACMCARTCTCCWGC-3'(SEQ ID NO: 21)

Cadeia pesada (HC) forward: 5'-GATCGACGTACGCTCAGATHCARYTGGTGCARTCT

GGGATCGACGTACGCTCAGATHCARYTGGTGCARTCTGG -3' (SEQ ID NO: 22)

Para 10G9:

Cadeia leve (LC) forward: 5'- GATCGATATCGTGATGACBCARACTCCACT-3'(SEQ ID NO: 23)

Cadeia pesada (HC) forward: 5'-GATCGACGTACGCTGAGGTYCAGCTSCAGCAGTCTGG -3' (SEQ ID NO: 24)

Para ambos, 4F11 e 10G9:

Cadeia leve reverso: 5'-TTTDAKYTCCAGCTTGGTACC-3' (SEQ ID NO: 25)Cadeia pesada reverso: 5'-

ACAGTGGGCCCTTGGTGGAGGCTGMRGAGACDGTGASHRDRGT-3' (SEQID NO: 26)

Os primers forward foram específicos para as seqüências deaminoácidos das regiões VL e VH dos dois anticorpos. Respectivamente, osprimers reversos LC e HC foram designados para anelar com uma região nodomínio 1 constante da cadeia leve (CL) e da cadeia pesada (CH1), que sãoidênticos para os dois anticorpos e altamente conservados entre as espécies.VL amplificada foi clonada em um vetor de expressão de célula pRK demamífero (Shields et a/., J- Biol- Chem. 276:659-04 (2000)). VH amplificada foiinserida em um vetor de expressão de célula pRK de mamífero. A seqüênciade polinucleotídeos dos insertos foi determinada usando-se métodos desequenciamento de rotina. As seqüências das cadeias leve e pesada do 4F11(SEQ ID NOs: 1 e 2, respectivamente) e as cadeias leve e pesada do 10G9(SEQ ID NOs: 3 e 4, respectivamente) estão mostradas nas FIGs. 1 a 4.Tfrtf= Do ISOTIPO E De AFINIDAng DE LIGAÇÃO

Mab 4F11, 10G9 e 18F7 foram determinados como sendo isotiposlgG2b usando-se métodos padrão.

A afinidade dos Mabs tanto para EGFL7 humana como decamundongo foi determinada por ressonância plasmônica de superfícieusando-se Pharmacia BlAcore® 3000 (BIAcore AB1 Uppsala1 Sweden) emtemperatura ambiente (ver, por exemplo, Morton et a/., Meth. Enzymol.295:268-94 (1998)). Os anticorpos anti-EGFL7 foram imobilizados ao chipsensor (CM5) por emio de grupos amina primária. A matriz da superfície dochip sensor carboximetilado foi ativada pela injeção de 20 μΙ de uma mistura de0,025 M de N-hidróxi-succinimida e 0,1 M de N-etil-N'(dimetilaminopropil)carbodiimida a 5 μΙ/min. 5-10 μΙ de10 Mg/ml de solução de proteína EGFL7recombinante humana ou de camundongo em 10 mM de acetato de sódio, PH4,5, foi injetada a 5 μΙ/min. Após acoplamento, locais não osupados no chipforam bloqueados pela injeção de 20 μΙ de etanolamina 1M, pH 8,5. O tampãode corrida foi PBS contendo 0,05% de polissorbato 20. Para mediçõescinéticas, duas diluições em série da EGFL7 unida à poli-His em tampão decorrida foram injetadas sobre o fluxo de células por 3 minutos a uma taxa defluxo de 30 μΙ/min e a EGFL7 unida à polihis ligado, foi dissociada por 20minutos. A superfície de ligação foi regenerada pela injeção de 20 μΙ de 10 mMde glicina HCI (pH 1,5). O fluxo celular um, que foi ativado, mas não teveanticorpo imobilizado, foi usado como uma referência celular. Não houveligação específica significante da EGFL7 unida à poli-His para o fluxo celularum. Para o cálculo de ligação aparente, os dados foram analisados usando-seum modelo de ligação 1:1 com ajuste global. As constantes das taxas deassociação e de dissociação foram ajustadas simultaneamente (programaBIAevaIuation). Os resultados destes experimentos usando-se estoques deMab em 50 mM de Tris /125 mM de NaCI são mostrados na Tabela 2.

Tabela 2

<table>table see original document page 131</column></row><table>

Determinação Do Epitopo Da EGFL7 Reconhecido Por Mabs

Nós determinamos o epitopo reconhecido pelos anticorposmonoclonais, nós primeiro mapearmos a região da EGFL7 ligada por cada umdos Mabs. Células 293 foram transfectadas com vetores de expressão quecompreendem tanto formas da proteína EGFL7 completa como incompleta,como mostrado na FIG. 5. Western blots de Iisados celulares de célulastransfectadas foram sondados com Mabs 4F11, 10G9 e 18F7. Nósobservamos que cada um dos Mabs se ligou à porção EMI da EGFL7.

Para limitar o epitopo específico reconhecido por cada Mab, nóssintetizamos polipeptídeos sobrepostos que ampliam uma porção do domínioEMI e testamos suas habilidades de competição com EGFL7 completa paraligação com Mab. Por exemplo, as seqüências dos polipeptídeos usados paraMab 4F11 foram as seguintes:

p1 RSPGLAPARPRYA (SEQ ID NO: 27)

p2 RPRYACCPGWKRT (SEQ ID NO: 28)

p3 GWKRTSGLPGACG (SEQ ID NO: 29)

Nós misturamos Mab 4F11 com a proteína EGFL7 e um excessomolar de 10 vezes de cada um dos polipeptídeos p1, p2 e p3,imunoprecipitamos os complexos resultantes e visualizamos os mesmos porSDS-PAGE. Para Mab 4F11, nós observamos que somente p2 competiu coma EGFL7 completa para ligação com Mab 4F11. Os resultados indicam queMab 4F11 reconhece um epitopo da EGFL7 que compreende a seqüênciaCCP.

Nós realizamos experimentos similares com os outros dois Mabsusando-se polipeptídeos tendo as seguintes seqüências:

p4 LTTCDGHRACSTY (SEQ ID NO: 30)

p5 RACSTYRTIYRTA (SEQ ID NO: 31)

P6 RTAYRRSPGVTPA (SEQ ID NO: 32)

Nós determinamos que tanto Mab 10G9 como 18F7 reconhecemum epitopo que compreende a seqüência RTIY (SEQ ID NO 33).

Exemplo 2

Mabs Anti-Egfl7 Inibem O Crescimento De Tumor In Vivo

Neste exemplo, Mabs anti-EGFL7 foram testados para suashabilidades de inibir o crescimento de tumor in vivo em diversos modelos. Nósinicialmente testamos oo Mabs em PBS no modelo Colo205 (câncer colorretalhumano) e no modelo A673 (modelo rabdomiosarcoma humano). Nós nãoobservamos um efeito nestes modelos com os Mabs em PBS como únicosagentes.

Nós então testamos os Mabs sozinhos e/ou em combinação comum anticorpo anti-VEGF, B20.4.1 (descrito no documento WO 2005/012359).

Nós testamos os anticorpos em três modelos: um modelo de câncer de mamahumano Her2 ("modelo Fo5"), um modelo (Ή1299") de câncer de pulmãohumano (NSCLC) e outro modelo de câncer de mama humano ("MDA-MB231"). Estes modelos de tumor são bem estabelecidos e estão descritos,por exemplo, em Lee et al., Clin CancerRes. 11(16):6065-74 (2005); Cameronet al., Câncer Cell Int.5:23 (2005); Finkle et al., Clinicai CancerRes. 10:2499-251(2004). Cada animal foi tratado com Mab anti-erva-de-santiago (controle);B20.4 sozinho; 18F7 sozinho, ou B20.4 mais 4F11, 10G9, ou 18F7.Resumidamente, para o modelo H1299, injetou-se em fêmeas decamundongos nu/nu HRLN, 1 χ 107 células tumorais H1299, subcutaneamenteno flanco; e para o modelo MDA-MB231, injetou-se em fêmeas decamundongos nu/nu HRLN, 5 χ 106 células tumorais MDA-MB231subcutaneamente no flanco. Para cada modelo, os tratamentos com anticorpoforam iniciados quando a média de tamanho do tumor atingiu 100 mm(correspondente ao dia 0 nas FIGS. 6-9). O controle anti-erva-de santiago Mabe B20.4 foram administrados a 10 mg/kg, uma vez por semana e 4F11, 10G9e18F7 foram administrados a 10 mg/kg, duas vezes por semana (identificadoscom flechas abaixo do eixo χ nas FIGS 6, 8 e 9).

Nós não observamos um efeito no modelo Fo5. Nós observamosefeitos inibitórios de tumor significantes nos outros dois modelos. Comomostrado nas FIGs. 6-7, no modelo H1299, Mab 4F11 em combinação comB20.4.1 foi significativamente mais efetivo que o controle ou o B20.4.1 sozinho.Conforme mostrado na FIG. 8, no modelo MDA-MB231, tanto Mab 4F11 comoMab 10G9 em combinação com B20.4.1 foi significativamente mais efetivo queo controle ou o B20.4.1 sozinho. Conforme mostrado na FIG. 9, no modeloMDA-MB231, Mab 18F7 sozinho foi mais efetivo que o controle, e emcombinação com B20.4.1 foi significativamente mais efetivo que o Mab18F7 ou0 B20.4.1 sozinho.

De maneira interessante, nós também observamos que otratamento com Mab 4F11 no modelo H1299 previne a recuperação vasculartotal após a suspensão da terapia com anti-VEGF (B20.4.1). Quando ospadrões vasculares de tumor foram comparados entre tumores tratados comB20.4.1 sozinho e aqueles tratados com B20.4.1 e 4F11 após o tratamento serinterrompido, nós observamos um atraso significante na revascularização dotumor. Estes resultados sugerem fortemente que a terapia com anti-EGFL7pode fornecer eficácia adicional ou até sinérgica, quando combinada com aterapia com anti-VEGF.

Nós também usamos outros modelos de tumor disponíveis nocampo de testes de atividades anti-tumor de anticorpos anti-EGFL7. Estesincluem, mas não se limitam a: LS174T (Cólon), BXPC3 (Próstata), HCT116(Cólon), MV-522 (NSCLC), SKMES (NSCLC), Colon26 (Cólon), MDA-MB231(Mama), MCF7 (Mama), H1299 (NSCLC), SW620 (Cólon), LL (Pulmão), Fo5(Mama), 4T1 (Mama), HT29 (Cólon), SW480 (Cólon), 786-0 (Renal).

A linhagem celular de hibridoma a seguir foi depositada naAmerican Type Culture Collection®, PO Box 1549, Manassas, VA, 20108, EUA(ATCC®):

<table>table see original document page 134</column></row><table>

Estes depósitos foram feitos com base no fornecimento doTratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito deMicroorganismos para Efeitos de Procedimentos de Patentes e osRegulamentos destes (Tratado de Budapeste). Isto assegura a manutenção deum depósito viável por 30 anos a partir da data do depósito. Estas linhagenscelulares estarão disponíveis pela ATCC com base nos termos do Tratado deBudapeste, e sujeitas a um acordo entre a Genentech, Inc. e ATCC, o queassegura disponibilidade permanente e irrestrita das linhagens celulares aopúblico, sob emissão da patente US pertinente ou sob apresentação pública dequalquer pedido de patente US ou estrangeiro, qualquer um que venhaprimeiro, e assegura disponibilidade das linhagens celulares para aqueledeterminado pelo Representante de Marcas e Patentes no direito deste, deacordo com 35 USC §122 e as regras do Representante conforme anexo(incluindo 37 CFR §1.14 com referência específica a 886 OG 638).

O titular do presente pedido teve acordado que se a linhagemcelular depositada for perdida ou destruída quando cultivada sob condiçõesadequadas, será imediatamente reposta em notificação por um espécime damesma linhagem celular. A disponibilidade das linhagens celularesdepositadas não deve ser interpretada como uma licença para praticar ainvenção na violação dos direitos concedidos com base na autoridade dequalquer governo de acordo com suas leis de patente.

Embora a invenção precedente tenha sido descrita em detalhes, atítulo de ilustração e exemplo para os propósitos de esclarecer o entendimento,as descrições e exemplos não devem ser interpretados como Iimitantes doescopo da invenção.Listagem de Seqüências

<110> Weilan Ye, et al.

<120> ANTICORPOS DO EGFL7 E MÉTODOS PARA SEU USO<130> P2327R1

<150> US 60/783,686<151> 16-03-2006

<150> US 60/812,569<151> 09-06-2006

<160> 33

<210> 1<211> 112<212> PRT

<213> Mus musculus<400> 1

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu1 5 10 15

Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp20 25 30

Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly35 40 45

Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser50 55 60

Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe65 70 75

Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr80 85 90

Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly95 100 105

Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg110

<210> 2<211> 117<212> PRT

<213> Mus musculus<400> 2

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly1 5 10 15

Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly His Thr Phe Thr20 25 30Thr Tyr Gly Met Ser Trp Val Lys Cln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

35 40 45

Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr His Ser Gly Val Pro Thr Tyr

50 55 60

Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser

65 70 75

Ala Ser Thr Ala His Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp

80 85 90

Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Leu Gly Ser Ser Ala Val Asp

95 100 105

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

110 115

<210> 3<211> 113<212> PRT<213> Mus musculus

<400> 3

Asd Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu1 5 10 15

Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val20 25 30

His Thr Asn Gly Ile Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro35 40 45

Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe50 55 60

Ser Gly Val Pro Asp Arg PheSer Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp65 70 75

Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val80 85 90

Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala95 100 105

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg110

<210> 4<211> 128<212> PRT<213> Mus musculus

<400> 4Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly15 10 15

Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser20 25 30Asd Tvr Tvr Met Asn Ser Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Lys Cln35 40 45

Ser His Glv Lys Ser Leu Clu Trp Ile Gly Asp Ile Asn Pro Lys50 55 60

Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr65 70 75

Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg80 85 90

Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu95 100 105

Ala Asp Tyr Asp Pro Ile Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln110 115 I20

Cly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ala125

<210> 5<211> 15<212> PRT

<213> Mus musculus

<Lys>Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Ser1 5 10 15

<210> 6<211> 7<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 6Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser5

<210> 7<211> 9<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 7

Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Tyr Thr5

<210> 8<211> 5<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 8Thr Tyr Gly Met Ser

5

<210> 9<211> 17<212> PRT<213> Mus musculus<400> 9

Trp Ile Asn Thr His Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe1 5 10 15

Lys Cly

<210> 10<211> 5<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 10Leu Gly Ser Ser Ala5

<210> 11<211> 16<212> PRT

<21B> Mus musculus<400> 11

Arq Ser Ser Gln Ser Leu Val His Thr Asn Gly Ile Thr Tyr Leu1 5 10 15

His

<210> 12<211> 7<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 12Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser5

<210> 13<211> 9<212> PRT

<213> Mus musculus<400> 13

Ser Gln Ser Thr His Val Pro Leu Thr

5

<210> 14<211> 11<212> PRT

<213> Mus musculus<400> 14

Asp Tyr Tyr Met Asn Ser Asp Tyr Tyr Met Asn5 10

<210> 15<211> 17<212> PRT<213> Mus musculus

<400> 15

Asp Ile Asn Pro Lys Asn Gly Cly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe1 5 10 15

Lys Gly

<210> 16

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 16Ala Leu Gly Val Phe Asp Tyr5

<210> 17<211> 108<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 17

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

1 5 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser

20 25 30

Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys

35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75

Ser Ser Leu Gln Pro Clu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

80 85 90

Tyr Asn Ser Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu

95 100 105

Ile Lys Arg

<210> 18

<211> 112

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 18

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

20 25 30Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Cln Ala Pro Cly Lys Gly Leu35 40 45

Clu Trp Val Ser Val Ile Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser65 70 75

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly95 100 105

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala110

<210> 19<211> 6<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> seqüência é sintetizada<220>

<221> base_modificada<222> 2

<223> base é g, a, t ou c<220>

<221> sinal_CAAT base_modificada<222> completa<223> caixa CAAT

<400> 19cncaat 6

<210> 20<211> 6<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> seqüência é sintetizada<220>

<221> sinal_polyA<222> completo

<223> sinal de poliadenilação

<400> 20aataaa 6

<210> 21<211> 30<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<22Β> seqüência é sintetizada<220>

<221> Base_modificada<222> completo

<223> Primer para amplificação da seqüência de anticorpo<220>

<221> base_modificada<222> 13

<223> base é g ou t<220>

<221> base_modificada<222> 16

<223> base é g ou c<220>

<221> base_modificada<222> 19

<223> base é a ou c<220>

<221> base_modificada<222> 22

<223> base é g ou a<220>

<221> base_modificada<222> 28

<223> base é a ou t<400> 21

gtcagatatc gtkctsacmc artctccwgc 30

<210> 22<211> 74<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> seqüência é sintetizada<220>

<221> Base_modificada<222> completo

<223> Primer para amplificação da seqüência de anticorpo<220>

<221> base_modificada<222> 20, 57

<223> base é a or c ou t<220>

<221> base_modificada<222> 23,32,60,69<223> base é g ou a

<220><221> base_modificada

<222> 24, 61

<223> base é t ou c

gatcgacgta cgctcagath carytggtgc artctgggat cgacgtacgc 50

tcagathcar ytggtgcart ctgg 74

<210> 23<211> 30<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> seqüência é sintetizada<220>

<221> Base_modificada<222> completo

<223> Primer para amplificação da sequencia de anticorpo<220>

<221> base_modificada<222> 19

<223> base é g ou c ou t<220>

<221> base_modificada<222> 22

<223> base é g ou a<400> 23

gatcgatatc gtgatgacbc aractccact 30

<210> 24

<211> 37

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> seqüência é sintetizada<220>

<221> Base_modificada

<222> completo

<223> Primer para amplificação da sequencia de anticorpo

<220>

<221> base_modificada<222> 20

<223> base é t ou c<220>

<221> base_modificada<222> 26

<223> base é g ou c

<400> 24

gatcgacgta cgctgaggty cagctscagc agtctgg 57<210> 25<211> 21<212> DNA

<21Β> Seqüência aritificial<220>

<223> seqüência é sintetizada<220>

<221> base_modificada<222> 4

<223> base é a ou g ou t<220>

<221> base_modificada<222> 6

<223> base é g ou t<220>

<221> base_modificada<222> 7

<223> base é t ou c<220>

<221> Base_modificada<222> completo

<223> Primer para amplificação da seqüência de anticorpo

<400> 25tttdakytcc agcttggtac c 21

<210> 26<211> 43<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> seqüência é sintetizada<220>

<221> Base_modificada

<222> completo

<223> Primer para amplificação da sequencia de anticorpo

<220>

<221> base_modificada<222> 25

<223> base é a ou c<220>

<221> base_modificada

<222> 26,39

<223> base é g ou a

<220>

<221> base_modificada<222> 32, 40

<223> base é a ou g ou t<220>

<221> base_modificada<222> 37

<223> base é g ou c<220>

<221> base_modificada<222> 38

<223> base é a ou c ou t400> 26

acagtgggcc cttggtggag gctgmrgaga cdgtgashrd rgt 43

<210> 27<211> 13<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 27

Arg Ser Pro Gly Leu Ala Pro Ala Arg Pro Arg Tyr Ala5 10

<210> 28<211> 13<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 28

Arg Pro Arg Tyr Ala Cys Cys Pro Gly Trp Lys Arg Thr5 10

<210> 29<211> 13<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 29

Gly Trp Lys Arg Thr Ser Gly Leu Pro Gly Ala Cys Gly5 10

<210> 30<211> 13<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 30

Leu Thr Thr Cys Asp Gly His Arg Ala Cys Ser Thr Tyr5 10

<210> 31<211> 13<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 31

Arg Ala Cys Ser Thr Tyr Arg Thr Ile Tyr Arg Thr Ala5 10

<210> 32<211> 13<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 32

Arg Thr Ala Tyr Arg Arg Ser Pro Cly Val Thr Pro Ala5 10

<210> 33<211> 4<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 33Arg Thr Ile Tyr

Claims

1. ANTICORPO PRODUZIDO POR HIBRIDOMA, selecionadodo grupo que consiste de: anti-EGFL7 mumab 4F11.1.8, anti-EGFL7 mumab- 10G9.1.6 e anti-EGFL7 mumab 18F7.1.8.

2. ANTICORPO, anti-EGFL7 que compreende uma ou maisregiões determinadas por complementaridade (CDRs) selecionadas do grupoque consiste de:(a) 4F11 CDR-L1 seqüência KASQSVDYDGDSYMS (SEQ ID NO: 5);(b) 4F11 CDR-L2 seqüência GASNLES (SEQ ID NO: 6);(c) 4F11 CDR-L3 seqüência QQNNEDPYT (SEQ ID NO: 7);(d) 4F11 CDR-H1 seqüência TYGMS (SEQ ID NO: 8);(e) 4F11 CDR-H2 seqüência WlNTHSGVPTYADDFKG (SEQ ID NO: 9);e(f) 4F11 CDR-H3 seqüência LGSSA (SEQ ID NO: 10).

3. ANTICORPO, anti-EGFL7 de acordo com a reivindicação 2,caracterizado pelo fato de que a cadeia leve de dito anticorpo compreende pelomenos uma, pelo menos duas ou todas as três seqüências da CDRselecionadas de: KASQSVDYDGDSYMS (SEQ ID NO: 5), GASNLES (SEQ IDNO: 6), e QQNNEDPYT (SEQ ID NO: 7).

4. ANTICORPO, anti-EGFL7 de acordo com a reivindicação 2,caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada de dito anticorpo compreendepelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três seqüências da CDRselecionadas de: TYGMS (SEQ ID NO: 8), WlNTHSGVPTYADDFKG (SEQ IDNO: 9), e LGSSA (SEQ ID NO: 10).

5. ANTICORPO, anti-EGFL7 de acordo com a reivindicação 2,caracterizado pelo fato de que a cadeia leve de dito anticorpo compreende pelomenos uma, pelo menos duas ou todas as três seqüências da CDRselecionadas de: KASQSVDYDGDSYMS (SEQ ID NO: 5), GASNLES (SEQ IDNO: 6), e QQNNEDPYT (SEQ ID NO: 7); e em que a cadeia pesada de ditoanticorpo compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as trêsseqüências da CDR selecionadas de: TYGMS (SEQ ID NO: 8),WINTHSGVPTYADDFKG (SEQ ID NO: 9), e LGSSA (SEQ ID NO: 10).

6. ANTICORPO, anti-EGFL7 de acordo com a reivindicação 2,caracterizado pelo fato de que a cadeia leve de dito anticorpo compreende aseqüência:DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMSWYQQKPGQPPKLLIYGASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQNNEDPYTFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO: 1).

7. ANTICORPO, anti-EGFL7 de acordo com a reivindicação 2,caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada de dito anticorpo compreende aseqüência:QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGHTFTTYGMSWVKQAPGKGLKWMGWINTHSGVPTYADDFKGRFAFSLETSASTAHLQINNLKNEDTATYFCARLGSSAVDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 2).

8. ANTICORPO, anti-EGFL7 que compreende uma ou maisregiões determinadas por complementaridade (CDRs) selecionadas do grupoque consiste de:(a) 10G9 CDR-L1 seqüência RSSQSLVHTNGITYLH (SEQ ID NO: 11);(b) 10G9 CDR-L2 seqüência KVSNRFS (SEQ ID NO: 12);(c) 10G9 CDR-L3 seqüência SQSTHVPLT (SEQ ID NO: 13);(d) 10G9 CDR-H1 seqüência DYYMNSDYYMN (SEQ ID NO: 14);(e) 10G9 CDR-H2 seqüência DINPKNGGTTYNQKFKG (SEQ ID NO:-15); e(f) 10G9 CDR-H3 seqüência ALGVFDY (SEQ ID NO: 16).

9. ANTICORPO, anti-EGFL7 de acordo com a reivindicação 8,caracterizado pelo fato de que a cadeia leve de dito anticorpo compreende pelomenos uma, pelo menos duas ou todas as três seqüências da CDRselecionadas de: RSSQSLVHTNGITYLH (SEQ ID NO: 11), KVSNRFS (SEQ IDNO: 12), e SQSTHVPLT (SEQ ID NO: 13).

10. ANTICORPO, anti-EGFL7 de acordo com a reivindicação 8,caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada de dito anticorpo compreendepelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três seqüências da CDRselecionadas de: D YYM N S DYYM N (SEQ ID NO: 14),DINPKNGGTTYNQKFKG (SEQ ID NO: 15) e ALGVFDY (SEQ ID NO: 16).

11. ANTICORPO, anti-EGFL7 de acordo com a reivindicação 8,caracterizado pelo fato de que a cadeia leve de dito anticorpo compreende pelomenos uma, pelo menos duas ou todas as três seqüências da CDRselecionadas de: RSSQSLVHTNGITYLH (SEQ ID NO: 11), KVSNRFS (SEQ IDNO: 12), e SQSTHVPLT (SEQ ID NO: 13); e em que a cadeia pesada de ditoanticorpo compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as trêsseqüências da CDR selecionadas de: DYYMNSDYYMN (SEQ ID NO: 14),DINPKNGGTTYNQKFKG (SEQ ID NO: 15), e ALGVFDY (SEQ ID NO: 16).

12. ANTICORPO, anti-EGFL7 de acordo com a reivindicação 8,caracterizado pelo fato de que a cadeia leve de dito anticorpo compreende aseqüência:DIVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHTNGITYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPLTFGAGTKVEIKR (SEQ ID NO: 3).

13. ANTICORPO, anti-EGFL7 de acordo com a reivindicação 8·,caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada de dito anticorpo compreende aseqüência:EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFSDYYMNSDYYMNWVKQSHGKSLEWIGDINPKNGGTTYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCAREADYDPIYYAMDYWGQGTTLTVSA (SEQ ID NO: 4).

14. ANTICORPO, anti-EGFL7 que se liga especificamente aum polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácido selecionadado grupo que consiste de: CCP, RTIY (SEQ ID NO 33).

15. ANTICORPO ISOLADO, que se liga ao mesmo epitopo noEGFL7 humano que o anticorpo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 14.

16. ANTICORPO ISOLADO, que compete com o anticorpopara ligação ao EGFL7, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a14.

17. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é umanticorpo monoclonal.

18. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é selecionadodo grupo que consiste de um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado,um anticorpo de afinidade madura, um anticorpo humano e um anticorpobiespecífico.

19. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é umfragmento de anticorpo.

20. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, que compreende umanticorpo anti-EGFL7 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19.

21. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com areivindicação 20, que também compreende um agente anti-angiogênico.

22. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com areivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o agente anti-angiogênico éselecionado do grupo que consiste de bevacizumab e ranibizumab.

23. POLINUCLEOTÍDEO, que codifica um anticorpo de acordocom qualquer uma das reivindicações 1 a 19.

24. VETOR, que compreende o polinucleotídeo, de acordo coma reivindicação 23.

25. VETOR, de acordo com a reivindicação 24, caracterizadopelo fato de que o vetor é um vetor de expressão.

26. CÉLULA HOSPEDEIRA, que compreende um vetor, deacordo com as reivindicações 24 ou 25.

27. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é procarionte.

28. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é eucarionte.

29. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é de mamífero.

30. MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO, anti-EGFL7 dito método que compreende (a) expressar um vetor, de acordo com areivindicação 25 em uma célula hospedeira adequada, e (b) recuperar oanticorpo.

31. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 30, caracterizadopelo fato de que a célula hospedeira é procarionte.

32. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 30, caracterizadopelo fato de que a célula hospedeira é eucarionte.

33. MÉTODO PARA REDUZIR OU INIBIR A ANGIOGÊNESE,em um sujeito que tem uma condição patológica associada à angiogênese quecompreende administrar ao sujeito uma quantidade efetiva de um anticorpoanti-EGFL7, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19 ou acomposição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 20.

34. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 33, caracterizadopelo fato de que a condição patológica é um neoplasma.

35. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 34, caracterizadopelo fato de que o neoplasma é um carcinoma.

36. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 33, caracterizadopelo fato de que a condição patológica está associada aos olhos.

37. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 36, caracterizadopelo fato de que a condição patológica é uma doença neovascular intra-ocular.

38. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações-33 a 35, que também compreende administrar ao sujeito um agente anti-angiogênico.

39. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 38, caracterizadopelo fato de que o agente anti-angiogênico é um antagonista do fator decrescimento endotelial vascular (VEGF).

40. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 39, caracterizadopelo fato de que o antagonista é um anticorpo anti-VEGF.

41. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizadopelo fato de que o anticorpo anti-VEGF é bevacizumab.

42. MÉTODO, de acordo com as reivindicações 36 ou 37, quetambém compreende administrar ao sujeito um agente anti-angiogênico.

43. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 42, caracterizadopelo fato de que o agente anti-angiogênico é um antagonista do fator decrescimento endotelial vascular (VEGF).

44. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 43, caracterizadopelo fato de que o antagonista é um anticorpo anti-VEGF.

45. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 44, caracterizadopelo fato de que o anticorpo anti-VEGF é ranibizumab.

46. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações-38 a 45, caracterizado pelo fato de que o agente anti-angiogênico éadministrado antes ou subseqüentemente à administração do anticorpo anti-EGFL7.

47. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações-38 a 45, caracterizado pelo fato de que o agente anti-angiogênico éadministrado ao mesmo tempo que o anticorpo anti-EGFL7.

48. MÉTODO PARA AUMENTAR A EFICÁCIA DE UMAGENTE ANTI-ANGIOGÊNICO, em um sujeito que tem uma condiçãopatológica associada à angiogênese que compreende administrar ao sujeito oanticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19 ou acomposição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 20 ou 21.

49. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 38, caracterizadopelo fato de que a condição patológica é um neoplasma.

50. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 39, caracterizadopelo fato de que o neoplasma é um carcinoma.

51. MÉTODO, de acordo com as reivindicações 48 a 50,caracterizado pelo fato de que o agente anti-antigênico (anti-angiogênico) ébevacizumab.

52. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 51, que também compreende administrar um agente quimioterapêutico.

53. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 48, caracterizadopelo fato de que a condição patológica está associada aos olhos.

54. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 53, caracterizadopelo fato de que a condição patológica é uma doença neovascular intra-ocular.

55. Método, de acordo com as reivindicações 53 ou 54,caracterizado pelo fato de que o agente anti-angiogênico é ranibizumab.

56. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 55, que também compreende administrar um corticoesteróide.

57. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 55,que também compreende administrar uma terapia fotodinâmica.