KR20120005021A - 인간화 항-ｅｇｆｌ７ 항체 및 그의 사용 방법 - Google Patents

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웨일란 예
마크 데니스
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Abstract

본 발명은 EGFL7에 대한 항체 및 그의 용도에 관한 것이다.

Description

인간화 항-ＥＧＦＬ７ 항체 및 그의 사용 방법 {HUMANIZED ANTI-EGFL7 ANTIBODIES AND METHODS USING SAME}
관련 출원
본원은 35 USC 119(e) 하에서 2009년 5월 8일자로 출원된 가출원 번호 61/176,817에 대해 우선권을 주장하는, 37 CFR 1.53(b)(1) 하에 출원된 정식 출원으로, 가출원의 내용은 본원에 참고로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 분자 생물학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 항-EGFL7 항체, 및 그의 용도에 관한 것이다.
혈관 분포의 발생은 다수의 생리학적 및 병리학적 프로세스의 기본 요건이다. 활발하게 성장하는 조직 예컨대 배아 및 종양은 충분한 혈액 공급을 필요로 한다. 이들은 혈관신생으로 불리는 프로세스를 통해 기존 혈관으로부터; 또는 혈관형성이라 불리는 프로세스를 통해 전구 세포로부터 새로운 혈관 형성을 촉진하는 전-혈관신생 인자를 생산함으로써 이러한 필요를 만족시킨다. 관생성은 혈관 발생의 필수 단계이다. 혈관 튜브 형성은 하기 단계가 모두 또는 다수 수반되는, 복잡하지만 규칙적인 생물학적 이벤트이다: a) 내피 세포 (EC)가 기존의 EC로부터 증식하거나 전구 세포로부터 분화하는 단계; b) EC가 이동하는 단계; c) EC가 코드-유사 구조를 형성하기 위해 유착하는 단계; d) 이어서 혈관 코드에 관생성이 진행되어, 중앙의 관강이 있는 혈관이 형성되는 단계; e) 기존의 코드 또는 혈관에서 2차 혈관이 자라나 형성되는 단계 (혈관신생); f) 원시 혈관총이 추가로 재보수 및 재성형되는 단계; 및 g) 주변-내피세포를 동원하여 내피 튜브를 싸도록 하여, 유지 및 조절 기능을 혈관에 제공하는 단계; 이러한 세포에는 작은 모세관을 위한 혈관주위세포, 보다 큰 혈관을 위한 평활근 세포 및 심장 내 심근 세포가 포함된다. 문헌 [Hanahan, D. Science 277, 48-50 (1997)]; [Hogan, B. L. & Kolodziej, P. A. Nature Reviews Genetics. 3, 513-23 (2002)]; [Lubarsky, B. & Krasnow, M. A. Cell. 112, 19-28 (2003)].
이미 존재하는 내피로부터의 새로운 혈관 형성을 수반하는 혈관신생이 다양한 장애의 발병기전과 관련이 있다는 것은 현재 널리 확립되어 있다. 그러한 것으로는 고형 종양 및 전이, 아테롬성동맥경화증, 후수정체 섬유증식증, 혈관종, 만성 염증, 안내 신생혈관 증후군, 예컨대 증식성 망막병증, 예를 들어, 당뇨병성 망막병증, 연령-관련 황반 변성 (AMD), 신생혈관 녹내장, 이식된 각막 조직 및 기타 조직의 면역 거부반응, 류마티스 관절염, 및 건선이 포함된다. 문헌 [Folkman et al., J. Biol. Chem., 267: 10931-10934 (1992)]; [Klagsbrun et al., Annu. Rev. Physiol., 53: 217-239 (1991)]; 및 [Garner A., "Vascular diseases", In: Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner A., Klintworth GK, eds., 2nd Edition (Marcel Dekker, NY, 1994), pp 1625-1710].
종양 성장의 경우에, 혈관신생은 증식증에서 신생물로의 이행, 및 종양의 성장 및 전이를 위한 영양분의 제공에 결정적이라 여겨진다. 문헌 [Folkman et al., Nature, 339: 58 (1989)]. 신생혈관형성은 종양 세포가 정상 세포에 비해 성장 이익 및 증식 자율성을 수득할 수 있도록 한다. 종양은 이용가능한 모세관 층으로부터의 거리로 인해 수 ㎣의 크기로만 증식할 수 있는 단일 이상 세포로서 시작되는 것이 일반적이고, 장기간 동안 추가의 성장 및 확산 없이 '휴면 상태'인 채로 있을 수 있다. 이후, 일부 종양 세포가 혈관신생 표현형으로 전환되어 내피 세포를 활성화시키고, 내피 세포가 증식하여 새로운 모세 혈관으로 성숙된다. 이러한 새로 형성된 혈관은 원발성 종양의 지속적인 성장을 허용할 뿐만이 아니라, 전이성 종양 세포의 확산 및 콜로니 재형성까지도 허용한다. 따라서, 유방암 및 또한 여러 다른 종양에서 종양 절편 내의 미세혈관의 밀도와 환자 생존 사이의 상관관계가 관찰되었다. 문헌 [Weidner et al., N. Engl. J. Med., 324: 1-6 (1991)]; [Horak et al., Lancet, 340: 1120-1124 (1992)]; [Macchiarini et al., Lancet, 340: 145-146 (1992)]. 혈관신생 전환을 제어하는 정확한 메카니즘은 널리 이해되어 있지 않지만, 종양 덩어리의 신생혈관형성은 다수의 혈관신생 자극물질 및 억제제의 최종적인 균형으로 인한 것이라 여겨진다 (문헌 [Folkman, 1995, Nat Med 1(1):27-31]).
혈관 발생 프로세스는 엄격하게 조절된다. 현재까지, 대부분 주변 세포에 의해 생산된 분비형 인자인 상당한 수의 분자가 EC 분화, 증식, 이동 및 코드-유사 구조로의 융합을 조절하는 것으로 나타났다. 예를 들어, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)가 혈관신생을 자극하고 혈관 투과성을 유도하는데 수반되는 주요 인자로서 확인되었다. 문헌 [Ferrara et al., Endocr. Rev., 18: 4-25 (1997)]. 단일 VEGF 대립유전자의 손실조차 배아 치사를 초래한다는 발견은 혈관계의 발달 및 분화에서 이러한 인자가 수행하는 대체불가능한 역할을 가리킨다. 또한 VEGF는 종양 및 안내 장애와 관련된 신생혈관형성의 주요 매개물인 것으로 나타났다. 문헌 [Ferrara et al., Endocr. Rev., 상기 문헌]. VEGF mRNA는 검사된 대다수의 인간 종양에서 과다발현된다. 문헌 [Berkman et al., J. Clin. Invest., 91: 153-159 (1993)]; [Brown et al., Human Pathol., 26: 86-91 (1995)]; [Brown et al., Cancer Res., 53: 4727-4735 (1993)]; [Mattern et al., Brit. J. Cancer, 73: 931-934 (1996)]; [Dvorak et al., Am. J. Pathol., 146: 1029-1039 (1995)].
혈관 형성 동안의 단계 중 일부가 여전히 잘 규명되어 있지 않다. 특히, 관생성이 어떻게 조절되는지 -- 혈관 코드가 어떻게 진행되어 튜브가 되는지, 그리고 어떤 인자가 이러한 전이를 조절하는지에 대해서는 거의 알려진 바 없다. 다수의 질환 및 장애에 있어서의 혈관형성 및 혈관신생의 역할을 고려할 때, 이러한 프로세스를 유발하는 하나 이상의 생물학적 효과를 감소시키거나 억제하는 수단을 갖는 것이 바람직하다. 특허 출원 및 공개공보를 포함하여 본원에서 인용된 모든 참고문헌은 그 전문이 참고로 포함된다.
발명의 개요
본 발명은 부분적으로 EGFL7에 대한 다양한 항체를 기초로 한다. EGFL7은 중요하고 유익한 치료제로서 대두되고, 본 발명은 EGFL7의 발현 및/또는 활성과 관련이 있는 병리 상태를 표적화하는데 사용하기 위한 치료 및 진단제로서의 항체를 제공한다. 따라서, 본 발명은 EGFL7과 관련된 방법, 조성물, 키트 및 제조품을 제공한다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명은 항-EGFL7 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 (i)
Figure pct00001
(여기서 X1은 A 또는 R이고; X2는 H 또는 Q이고; X3은 G 또는 V이고; X4는 D, L, R, S 및 W로 이루어진 군으로부터 선택되고; X5는 M 또는 V임) (서열 210)를 포함하는 HVR-L1; (ii)
Figure pct00002
(여기서 X1은 N 또는 Y이고; X2는 L, R 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고; X3은 Q 또는 S임) (서열 211)를 포함하는 HVR-L2; (iii)
Figure pct00003
(여기서 X1은 D 또는 E이고; X2는 F 또는 Y임) (서열 212)를 포함하는 HVR-L3; (iv)
Figure pct00004
(여기서 X1은 H 또는 V이고; X2는 R 또는 T이고; X3은 F, G, R 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고; X4는 D, G, R 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고; X5는 M 또는 Y임) (서열 213)를 포함하는 HVR-H1; (v)
Figure pct00005
(여기서 X1은 I, M, T 및 W로 이루어진 군으로부터 선택되고; X2는 H 또는 R이고; X3은 I, M, T 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고; X4는 D 또는 H이고; X5는 D, M 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고; X6은 F 또는 Y이고; X7은 K 또는 S이고; X8은 G 또는 R임) (서열 214)를 포함하는 HVR-H2, 및 (vi)
Figure pct00006
(여기서 X1은 N 또는 R이고; X2는 C, S 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고; X3은 A 또는 Y임) (서열 215)를 포함하는 HVR-H3으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 초가변 영역 (HVR) 서열을 포함하는 가변 도메인을 포함하는 항-EGFL7 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 항-EGFL7 항체는 상기 언급한 6개의 HVR을 모두 포함한다. 일부 실시양태에서, HVR-L1은 서열 31 및 37-43으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, HVR-L2는 서열 32 및 44-47로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, HVR-L3은 서열 33 및 48로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, HVR-H1은 서열 34 및 49-57로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, HVR-H2는 서열 35 및 58-73으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, HVR-H3은 서열 36 및 74-77로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄는 하기 프레임워크 서열을 포함한다: FR-H1은
Figure pct00007
(여기서 X1은 I 또는 V임) (서열 216)를 포함하고; FR-H2는
Figure pct00008
(여기서 X1은 I 또는 V임) (서열 217)를 포함하고; FR-H3은
Figure pct00009
(여기서 X1은 F 또는 I이고; X2는 L 또는 R이고; X3은 N 또는 T이고, X4는 A, E, K 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고; X5는 N 또는 S이고; X6은 A, L, M, T 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고; X7은 F 또는 Y임) (서열 218)를 포함하고; FR-H4는
Figure pct00010
를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄는 하기 프레임워크 서열을 포함한다: FR-H1은
Figure pct00011
를 포함하고; FR-H2는
Figure pct00012
를 포함하고; FR-H3은
Figure pct00013
(여기서 X1은 L 또는 R이고; X2는 A, L, M, T 및 V로 이루어진 군으로부터 선택됨) (서열 220)를 포함하고; FR-H4는
Figure pct00014
를 포함한다. 일부 실시양태에서, 경쇄는 하기 프레임워크 서열을 포함한다: FR-L1은
Figure pct00015
를 포함하고, FR-L2는
Figure pct00016
를 포함하고, FR-L3은
Figure pct00017
를 포함하고, FR-L4는
Figure pct00018
또는
Figure pct00019
를 포함한다. 일부 실시양태에서, 경쇄는 도 15에 나타낸 바와 같은 4F11.v17 또는 4F11.v22의 가변 도메인 서열 (서열 82 또는 83)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄는 도 16에 나타낸 바와 같은 4F11.v17 또는 4F11.v22의 가변 도메인 서열 (서열 84 및 85)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 경쇄가 도 15에 나타낸 바와 같은 4F11.v17의 가변 도메인 서열 (서열 82)을 포함하고, 중쇄가 도 16에 나타낸 바와 같은 4F11.v17의 가변 도메인 서열 (서열 84)을 포함하는 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 경쇄가 도 15에 나타낸 바와 같은 4F11.v22의 가변 도메인 서열 (서열 83)을 포함하고, 중쇄가 도 16에 나타낸 바와 같은 4F11.v22의 가변 도메인 서열 (서열 85)을 포함하는 항체를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (i)
Figure pct00020
(여기서 X1은 L, Q, R, S 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고; X2는 P, T 및 W로 이루어진 군으로부터 선택되고; X3은 H 또는 S이고; X4는 D 또는 Q이고; X5는 G 또는 S이고; X6은 L 또는 V이고; X7은 H 또는 P이고; X8은 I, L, P, T 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고; X9는 N, Q 또는 S로 이루어진 군으로부터 선택되고; X10은 A, G 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고; X11은 G 또는 H임) (서열 222)를 포함하는 HVR-L1; (ii)
Figure pct00021
(여기서 X1은 D 또는 R이고; X2는 A, G, F, I 및 T로 이루어진 군으로부터 선택됨) (서열 223)를 포함하는 HVR-L2; (iii)
Figure pct00022
(여기서 X1은 A, G, I, K, L, N, S, T 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고; X2는 C 또는 T이고; X3은 F 또는 H임) (서열 224)를 포함하는 HVR-L3; (iv)
Figure pct00023
(여기서 X1은 N 또는 T이고; X2는 F 또는 V이고; X3은 I, M, R 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고; X4는 Y, Q 및 K로 이루어진 군으로부터 선택되고; X5는 I 또는 M임) (서열 225)를 포함하는 HVR-H1; (v)
Figure pct00024
(여기서 X1은 A, L, N 및 P로 이루어진 군으로부터 선택되고; X2는 D, L 및 R로 이루어진 군으로부터 선택되고; X3은 G, K, N, R, S 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고; X4는 G 또는 S이고; X5는 G, I, K, R, S, T 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고; X6은 G, R 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고; X7은 I, V 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고; X8은 N 또는 S이고; X9는 A, N 및 Q로 이루어진 군으로부터 선택되고; X10은 K 또는 V이고; X11은 F 또는 Q이고; X12는 K 또는 T이고; X13은 G, H, R 및 S로 이루어진 군으로부터 선택됨) (서열 226)를 포함하는 HVR-H2; 및 (vi)
Figure pct00025
(여기서 X1은 A, N 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고; X2는 D 또는 P이고; X3은 M 또는 W임) (서열 227)를 포함하는 HVR-H3으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 HVR 서열을 포함하는 가변 도메인을 포함하는 항-EGFL7 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 항-EGFL7 항체는 상기 언급한 6개의 HVR을 모두 포함한다. 일부 실시양태에서, HVR-L1은 서열 100 및 106-124로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, HVR-L2는 서열 101 및 125-129로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, HVR-L3은 서열 102 및 130-145로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, HVR-H1은 서열 103 및 146-153으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, HVR-H2는 서열 104 및 154-187로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, HVR-H3은 서열 105 및 188-192로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄는 하기 프레임워크 서열을 포함한다: FR-H1은
Figure pct00026
를 포함하고; FR-H2는
Figure pct00027
(여기서 X1은 I 또는 V임) (서열 228)를 포함하고; FR-H3은
Figure pct00028
(여기서 X1은 F 또는 V이고; X2는 I 또는 L이고; X3은 L, R 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고; X4는 K 또는 N이고; X5는 K, N, R 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고; X6은 N 또는 S이고; X7은 A, L 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고; X8은 L 또는 M임) (서열 229)를 포함하고; FR-H4는
Figure pct00029
를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄는 하기 프레임워크 서열을 포함한다: FR-H1은
Figure pct00030
를 포함하고; FR-H2는
Figure pct00031
를 포함하고; FR-H3은
Figure pct00032
(여기서 X1은 N 또는 K이고; X2는 A, L 및 V로 이루어진 군으로부터 선택됨) (서열 230)를 포함하고; FR-H4는
Figure pct00033
를 포함한다. 일부 실시양태에서, 경쇄는 하기 프레임워크 서열을 포함한다: FR-L1은
Figure pct00034
를 포함하고, FR-L2는
Figure pct00035
를 포함하고, FR-L3은
Figure pct00036
를 포함하고, FR-L4는
Figure pct00037
또는
Figure pct00038
를 포함한다. 일부 실시양태에서, 경쇄는 도 27에 나타낸 바와 같은 18F7.v6 또는 18F7.v6k의 가변 도메인 서열 (서열 193 및 194)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄는 도 28에 나타낸 바와 같은 18F7.v6 또는 18F7v6k의 가변 도메인 서열 (서열 195 및 196)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 경쇄가 도 27에 나타낸 바와 같은 18F7.v6의 가변 도메인 서열 (서열 193)을 포함하고, 중쇄가 도 28에 나타낸 바와 같은 18F7.v6의 가변 도메인 서열 (서열 195)을 포함하는 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 경쇄가 도 27에 나타낸 바와 같은 18F7.v6k의 가변 도메인 서열 (서열 194)을 포함하고, 중쇄가 도 28에 나타낸 바와 같은 18F7.v6k의 가변 도메인 서열 (서열 196)을 포함하는 항체를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 프레임워크 서열의 적어도 일부가 인간 컨센서스 프레임워크 서열인 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 κ 하위군 1 컨센서스 프레임워크 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 중쇄 인간 하위군 III 컨센서스 프레임워크 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 이중특이적 항체인 항-EGFL7 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 예를 들어 베바시주맙 또는 라니비주맙과 동일한 VEGF 에피토프에 결합한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 그러한 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 담체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 제약 조성물이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 적합한 숙주 세포에서 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 발현시키고, 항체를 회수하는 것에 의한, 항-EGFL7 항체의 제조 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 원핵세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵세포이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 종양, 암 또는 세포 증식성 장애의 치료를 필요로 하는 개체에게 본 발명의 항-EGFL7 항체의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 종양, 암 또는 세포 증식성 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 종양, 암 또는 세포 증식성 장애를 치료하는데 사용하기 위한 항-EGFL7 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 암은 유방암, 결장직장암, 폐암, 식도암, 방광암, 난소암, 췌장암 및 간세포 암종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 암은 유방암, 결장직장암 또는 폐암이다. 일부 실시양태에서, 세포 증식성 장애는 암이다.
일부 실시양태에서, 치료법은 또한 유효량의 제2 의약을 포함하고, 이때 항-EGFL7 항체는 제1 의약이다. 일부 실시양태에서, 제2 의약은 또 다른 항체, 화학요법제, 세포독성제, 항혈관신생제, 면역억제제, 전구약물, 시토카인, 시토카인 길항제, 세포독성 방사선요법제, 코르티코스테로이드, 항구토제, 암 백신, 진통제 또는 성장 억제제이다. 일부 실시양태에서, 제2 의약은 항-VEGF 항체, 예를 들어 베바시주맙이다. 일부 실시양태에서, 제2 의약은 항-EGFL7 항체의 투여 이전 또는 투여 이후에 투여된다. 일부 실시양태에서, 제2 의약은 항-EGFL7 항체와 동시에 투여된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 혈관신생 관련 병리 상태를 갖는 대상체에게 본 발명의 항체를 투여하여 대상체의 혈관신생을 감소시키거나 억제하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 혈관신생을 감소시키거나 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 혈관신생과 관련된 병리 상태를 치료하는데 사용하기 위한 본 발명의 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 병리 상태는 신생물성 상태이다. 일부 실시양태에서, 병리 상태는 비-신생물성 상태이다. 일부 실시양태에서, 비-신생물성 상태는 당뇨병 및 다른 증식성 망막병증, 미숙아 망막병증, 신생혈관 녹내장, 연령-관련 황반 변성, 당뇨병성 황반 부종, 각막 신생혈관형성, 각막 이식 신생혈관형성, 망막/맥락막 신생혈관형성으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 혈관신생과 관련된 병리 상태를 갖는 대상체에게 본 발명의 항체의 유효량을 항혈관신생제와 함께 투여하여 상기 항혈관신생제의 억제 활성을 향상시키는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 항혈관신생제의 효능을 향상시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 혈관신생과 관련된 병리 상태를 갖는 대상체에서 항혈관신생제의 효능을 향상시키는데 사용하기 위한 본 발명의 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 혈관신생과 관련된 병리 상태는 종양, 암 또는 세포 증식성 장애이다. 일부 실시양태에서, 혈관신생과 관련된 병리 상태는 비-신생물성 상태이다. 일부 실시양태에서, 비-신생물성 상태는 당뇨병 및 다른 증식성 망막병증, 미숙아 망막병증, 신생혈관 녹내장, 연령-관련 황반 변성, 당뇨병성 황반 부종, 각막 신생혈관형성, 각막 이식 신생혈관형성, 망막/맥락막 신생혈관형성으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 항혈관신생제는 항-EGFL7 항체의 투여 이전 또는 투여 이후에 투여된다. 일부 실시양태에서, 항혈관신생제는 항-EGFL7 항체와 동시에 투여된다. 일부 실시양태에서, 항혈관신생제는 항-VEGF 작용제, 항-VEGF 항체, 예를 들어 베바시주맙 또는 라니비주맙이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양의 관류 및 투과성을 감소시키거나 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 대상체에서 종양의 관류 및 투과성을 감소시키거나 억제하는데 사용하기 위한 본 발명의 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법 또는 사용은 항혈관신생제, 예를 들어 항-VEGF 작용제 (예를 들어 항-VEGF 항체, 예컨대 베바시주맙)을 투여하는 것을 추가로 포함한다.
도 1은 마우스 (서열 1) 및 인간 (서열 2)로부터의 EGFL7의 아미노산 서열을 도시한다. EMI1, EMI2, EGF 및 코일링된 도메인의 위치를 나타낸다. 말단절단된 EGFL7에는 코일링된 도메인이 결여되어 있다. 펩티드 EMI1 (서열 3), EMI2 (서열 4) 및 p2 (서열 5), P4 (서열 6), p5 (서열 7) 및 p6 (서열 8)의 서열을 밑줄로 표시한다.
도 2는 인간 카파 I 컨센서스 (서열 9) 및 4F11.v1 (서열 10)의 가변 경쇄 도메인의 아미노산 서열을 도시한다. 위치는 카바트(Kabat)에 따라 넘버링하고, 초가변 영역은 박스로 표시한다.
도 3은 인간 하위군 III 컨센서스 (서열 11) 및 4F11.v1 (서열 12)의 가변 중쇄 도메인의 아미노산 서열을 도시한다. 위치는 카바트에 따라 넘버링하고, 초가변 영역은 박스로 표시한다.
도 4는 프레임워크 토글(Toggle) 라이브러리 내의 토글 위치에 사용된 올리고뉴클레오티드를 도시한다. 4F11.v1의 DNA 서열 및 프레임워크 토글을 생성하는데 사용된 올리고뉴클레오티르를 나타낸다. 본래의 아미노산 서열 및 일부 생성된 프레임워크 토글 영역을 또한 나타낸다. 일부 경우에서, 퇴보 코돈을 어떻게 설계하였는지를 기반으로 하여 부가적인 아미노산 잔기를 또한 혼입시켰다. 서열 식별자를 상응하는 서열 (서열 13-28)의 우측에 괄호로 나타내었다.
도 5는 EGFL7에 대한 mu4F11 결합이 펩티드 2 (서열 5)에 의해서는 차단될 수 있지만, 중첩되는 펩티드 1 또는 3 (각각 서열 29 및 30) 또는 무작위 대조군 펩티드에 의해서는 그렇지 않음을 보여주는 결과를 도시한다.
도 6은 마이크로타이터 플레이트 상에 고정된 말단절단된 EGFL7에 대한 4F11.v1 Fab를 디스플레이하는 파지의 결합을 도시한다. 4F11.v1 파지 샘플은 둘 모두 증가된 파지 농도의 함수로서 고정된 EGFL7에 대해 증가된 결합을 나타낸다. 대조군 파지는 낮은 파지 농도에서 4F11.v1 파지의 수준과 유사한 배경 결합을 나타내었는데, 이는 일부 비특이적인 파지-EGFL7 상호작용을 시사한다.
도 7은 유리 아미노 또는 유리 티올을 통해 비오티닐화된 EMI2 도메인 또는 p2 펩티드에 대한 4F11.v1 Fab를 디스플레이하는 파지의 결합을 도시한다.
도 8은 프레임워크 토글 동안 각각의 프레임워크 위치에서 관찰되는 잔기의 존재량을 나타낸다. 프레임워크 토글 동안 각각의 프레임워크 위치에 도입된 아미노산을 열거한다.
도 9는 3개의 프레임워크 각각에 대해 6개의 "단일 위치 라이브러리" (SPL) 각각에서 관찰된 CDR 서열 변화를 도시한다. 라이브러리를 사용된 프레임워크 별로 구분하였다 (4F11.v1, 4F11.v2 및 4F11.v3). 각각의 SPL로부터 수득된 변화 대 특정 CDR 서열을 강조표시한다. 이러한 변화 바깥의 VL 및 VH 서열은 상응하는 프레임워크와 동일하였고, 이를 나타낸다. 서열 식별자를 상응하는 서열 (서열 31-77)의 우측에 괄호로 나타낸다. 1회를 초과하여 나타나는 개개의 서열은 항상 상응하는 서열 식별자를 가지지 않을 수 있다.
도 10은 제한 라이브러리 1 및 2의 가변 경쇄 도메인용 프레임워크 및 라이브러리 설계를 도시한다. 인간 카파 I 컨센서스 (서열 9) 및 4F11.v1 (서열 10)의 아미노산 서열을 라이브러리 1 (서열 78) 및 라이브러리 2 (서열 79)에 사용된 주형과 비교하여 나타낸다. 모든 20개의 아미노산에 대해 무작위화한 위치를 아미노산을 가로지르는 슬래시로 나타낸다.
도 11은 제한 라이브러리 1 및 2의 가변 중쇄 도메인용 프레임워크 및 라이브러리 설계를 도시한다. 인간 하위군 III 컨센서스 (서열 11) 및 4F11.v1 (서열 12)의 아미노산 서열을 라이브러리 1 (서열 80) 및 라이브러리 2 (서열 81)에 사용된 주형과 비교하여 나타낸다. 모든 20개의 아미노산에 대해 무작위화한 위치를 아미노산을 가로지르는 슬래시로 나타낸다.
도 12는 제한 라이브러리 1 및 2 내의 무작위화된 위치에서 관찰된 변화의 빈도를 도시한다. 경쇄 내 위치 53 및 54 및 중쇄 내 위치 29, 52 및 98에서 선택된 아미노산의 선호도를 나타낸다. 임의의 아미노산에 대한 선호도 (시그마(Sigma))는 아미노산의 이항 분포를 가정하여 라이브러리 내에서 해당 잔기의 무작위적 기회 발생도를 초과하는 표준 편차의 수로 보고하였다. 이러한 방법에 의한 스코어링은 예상되는 코돈 바이어스 및 컨센서스를 확립한 경우의 샘플링 통계치를 설명한다.
도 13 및 14는 인간화된 4F11 변이체에 의한 시험관내 고정된 인간 또는 마우스 EGFL7에 대한 HUVEC 부착의 억제를 도시한다. HUVEC (20,000 세포/웰)를 증가되는 농도의 항체의 존재하에서 5 μg/ml 인간 또는 뮤린 EGFL7로 코팅된 96 웰 플레이트에 부착되게 하였다. 세척 이후에도 여전히 플레이트에 부착되어 있는 세포의 개수를 계수하고, 각각의 웰에 플레이팅한 전체 세포의 퍼센트로 계산하였다.
도 15는 인간 카파 I 컨센서스 (서열 9), 4F11.v1 (서열 10), 4F11.v17 (서열 82) 및 4F11.v22 (서열 83)의 가변 경쇄 도메인의 아미노산 서열을 도시한다. 위치는 카바트에 따라 넘버링하고, 초가변 영역은 박스로 표시한다.
도 16은 인간 하위군 III 컨센서스 (서열 11), 4F11.v1 (서열 12), 4F11.v17 (서열 84) 및 4F11.v22 (서열 85)의 가변 중쇄 도메인의 아미노산 서열을 도시한다. 위치는 카바트에 따라 넘버링하고, 초가변 영역은 박스로 표시한다.
도 17은 인간 카파 I 컨센서스 (서열 9) 및 18F7-그라프트 (서열 86)의 가변 경쇄 도메인의 아미노산 서열을 도시한다. 위치는 카바트에 따라 넘버링하고, 초가변 영역은 박스로 표시한다.
도 18은 인간 하위군 III 컨센서스 (서열 11) 및 18F7-그라프트 (서열 87)의 가변 중쇄 도메인의 아미노산 서열을 도시한다. 위치는 카바트에 따라 넘버링하고, 초가변 영역은 박스로 표시한다.
도 19는 프레임워크 토글 라이브러리 내의 토글 위치에 사용된 올리고뉴클레오티드를 도시한다. 18F7-그라프트의 DNA 서열 및 프레임워크 토글을 생성하는데 사용된 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 본래의 아미노산 서열 및 일부 생성된 프레임워크 토글 영역을 또한 나타낸다. 일부 경우에서, 퇴보 코돈을 어떻게 설계하였는지를 기반으로 하여 부가적인 아미노산 잔기를 또한 혼입시켰다. 서열 식별자를 상응하는 서열 (서열 88-99)의 우측에 괄호로 나타낸다.
도 20은 EGFL7에 대한 mu18F7의 결합이 EMI1 (서열 3) 또는 펩티드 P5 (서열 7)에 의해서는 차단될 수 있지만, 펩티드 P4 또는 P6 (각각 서열 6 및 8)에 의해서는 그렇지 않음을 보여주는 결과를 도시한다. 닭 배아 섬유모세포를 HA-태깅된 전장 인간 EGFL7 cDNA를 함유하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포로부터 제조한 세포 용해물을 200배 과량의 경쟁적 펩티드의 존재하에서 mu18F7과 면역침전시켰다. 면역침전은 항-HA 항체를 이용한 웨스턴 블롯으로 분석하였다.
도 21은 마이크로타이터 플레이트 상에 고정된 말단절단된 huEGFL7에 대한 18F7-그라프트 Fab를 디스플레이하는 파지의 결합을 도시한다. 18F7-그라프트 파지 샘플은 둘 모두 증가된 파지 농도의 함수로서 고정된 EGFL7에 대해 증가된 결합을 나타낸다. 대조군 파지는 낮은 파지 농도에서 18F7-그라프트 파지의 수준과 유사한 배경 결합을 나타내는데, 이는 일부 비특이적인 파지-EGFL7 상호작용을 시사한다.
도 22는 유리 아미노 또는 유리 티올을 통해 비오티닐화된 EMI1 도메인 또는 p5 펩티드에 대한 18F7-그라프트 Fab를 디스플레이하는 파지의 결합을 도시한다.
도 23은 프레임워크 토글 동안 각각의 프레임워크 위치에서 관찰되는 잔기의 존재량을 나타낸다. 프레임워크 토글 동안 각각의 프레임워크 위치에 도입된 아미노산을 열거한다.
도 24는 3개의 프레임워크 각각에 대해 6개의 SPL 각각에서 관찰된 CDR 서열 변화를 도시한다. 라이브러리를 사용된 프레임워크 별로 구분하였다 (18F7-그라프트, 18F7-K, 18F7-KV 및 18F7-KA). 각각의 SPL로부터 수득된 변화 대 특정 CDR 서열을 강조표시한다. 이러한 변화 바깥의 VL 및 VH 서열은 상응하는 프레임워크와 동일하였고, 이를 나타낸다. 서열 식별자를 상응하는 서열 (서열 100-192)의 우측에 괄호로 나타낸다. 1회를 초과하여 나타나는 개개의 서열은 항상 상응하는 서열 식별자를 가지지 않을 수 있다.
도 25는 인간화된 18F7 변이체에 의한 시험관내 고정된 인간 또는 마우스 EGFL7에 대한 HUVEC 부착의 억제를 도시한다. HUVEC (20,000 세포/웰)를 증가되는 농도의 항체의 존재하에서 5 μg/ml 인간 또는 뮤린 EGFL7로 코팅된 96 웰 플레이트에 부착되게 하였다. 세척 이후에도 여전히 플레이트에 부착되어 있는 세포의 개수를 계수하고, 각각의 웰에 플레이팅한 전체 세포의 퍼센트로 계산하였다.
도 26은 HUVEC 트랜스웰 이동의 억제를 도시한다. HUVEC (웰당 50,000개 세포)를 16 시간 동안 트랜스웰 플레이트의 상단 챔버 내에서 성장시키고, 상단 챔버 내의 막을 재조합 인간 EGFL7 단백질 5 μg/ml로 코팅하였다. 다양한 농도의 대조군 항체 (항-IgE) 또는 다양한 18F7 변이체를 상단 및 하단 챔버 내의 배양 배지에 첨가하였고, 한편 하단의 웰에는 재조합 인간 VEGF-165를 20 ng/ml 첨가하여 HUVEC 이동을 자극하였다. 상단 챔버의 밑면으로 이동해간 세포를 계수하였고, 처리 (항체 및 농도)에 대해 플롯팅하였다.
도 27은 인간 카파 I 컨센서스 (서열 9), 18F7.v6 (서열 193) 및 18F7.v6k (서열 194)의 가변 경쇄 도메인의 아미노산 서열을 도시한다. 위치는 카바트에 따라 넘버링하고, 초가변 영역은 박스로 표시한다. 18F7.v6k에 대한 서열이 표시되지 않은 경우 (정렬한 제2 및 제3 부분에서), 상응하는 서열은 18F7.v6에 대한 서열과 동일하다.
도 28은 인간 하위군 III 컨센서스 (서열 11), 18F7.v6 (서열 195) 및 18F7.v6k (서열 196)의 가변 중쇄 도메인의 아미노산 서열을 도시한다. 위치는 카바트에 따라 넘버링하고, 초가변 영역은 박스로 표시한다. 18F7.v6k에 대한 서열이 표시되지 않은 경우 (정렬한 제1 및 제3 부분에서), 상응하는 서열은 18F7.v6에 대한 서열과 동일하다.
도 29는 hu18F7.v6k를 단독으로 이용한 경우 및 항-VEGF 항체와 함께 이용한 경우의 H1299 이종이식 종양 성장의 억제를 도시한다.
도 30은 hu18F7.v6k를 단독으로 이용한 경우 및 항-VEGF 항체와 함께 이용한 경우의 LXFL 1674 이종이식 종양 성장의 억제를 도시한다.
도 31은 hu18F7.v6k를 단독으로 이용한 경우 및 항-VEGF 항체와 함께 이용한 경우의 신생아 기관 혈관형성의 억제를 도시한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 항-EGFL7 항체에 관한 방법, 조성물, 키트 및 제조품을 제공한다.
상기 방법, 조성물, 키트 및 제조품에 대한 상세한 설명을 본원에서 제공한다.
일반적 기술
본원에서 기재하거나 언급하는 기술 및 절차는 일반적으로 널리 이해되어 있고, 당업자가 통상적인 방법론, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001)], [Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al., eds., (2003))]; 시리즈 [METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995))], [Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL], 및 [ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)]에 기재되어 있는 광범위하게 활용되는 방법론을 사용하여 통상적으로 사용되는 것이다.
정의
"단리된" 항체는 천연 환경 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 항체이다. 항체의 천연 환경의 오염 성분은 상기 항체의 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법으로 측정시에 항체의 95 중량％를 초과하는 정도, 가장 바람직하게는 99 중량％를 초과하는 정도로, (2) 스피닝 컵 시쿼네이터를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 얻기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 이용하여 환원 또는 비환원 조건하에 SDS-PAGE에 의해 균질한 것으로 나타날 정도로 정제될 것이다. 단리된 항체는 재조합 세포 내의 계내 항체를 포함하는데, 이는 항체 천연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계를 통해 제조될 것이다.
"단리된" 핵산 분자는 항체 핵산의 천연 공급원 내에서 통상적으로 회합되는 적어도 하나의 오염성 핵산 분자로부터 확인되어 이로부터 분리시킨 핵산 분자이다. 단리된 핵산 분자는 자연계에서 발견되는 형태 또는 세팅 이외의 것이다. 따라서, 단리된 핵산 분자는 천연 세포에 존재하는 것과 같은 핵산 분자와 구별된다. 그러나, 단리된 핵산 분자는, 예를 들어 천연 세포의 경우와 상이한 염색체 위치에 존재하며 통상적으로 항체를 발현하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함한다.
용어 "항-EGFL7 항체" 또는 "EGFL7에 결합하는 항체"는 EGFL7을 표적화하는데 있어서 진단제 및/또는 치료제로서 유용할 만큼 충분한 친화도로 EGFL7과 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, EGFL7에 결합하는 항체는 해리 상수 (Kd)가 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM 또는 ≤ 0.1 nM이다.
"결합 친화도"는 일반적으로 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총 합의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에서 사용된 바와 같은 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내재적 결합 친화도를 지칭한다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 표시될 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 방법을 포함하는 당업계에 공지된 통상의 방법으로 측정할 수 있다. 저친화도 항체는 일반적으로 항원과 서서히 결합하고 쉽게 해리되는 경향이 있는 반면, 고친화도 항체는 일반적으로 항원과 보다 신속하게 결합하고 보다 오랫 동안 결합된 상태를 유지하는 경향이 있다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 목적상, 이들 중 임의의 방법이 사용될 수 있다. 구체적인 예시적 실시양태를 아래에 설명한다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 "Kd" 또는 "Kd 값"은 비표지된 항원의 연속 적정물의 존재 하에 (125I)-표지된 항원의 최소 농도로 Fab를 평형화시킨 후에 항-Fab 항체-코팅된 플레이트를 사용하여 결합된 항원을 포획함으로써 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화도를 측정하는 하기 검정에서 기재되는 바와 같이 (문헌 [Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881]), 관심 항체의 Fab 버전 및 그의 항원을 사용하여 수행된 방사성 표지된 항원 결합 검정 (RIA)에 의해 측정된다. 검정 조건을 확립하기 위해, 마이크로타이터 플레이트 (다이넥스 (Dynex))를 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중 5 ㎍/ml의 포획 항-Fab 항체 (카펠 랩스 (Cappel Labs))로 밤새 코팅한 후, PBS 중의 2％ (w/v) 소 혈청 알부민으로 2 내지 5시간 동안 실온 (약 23℃)에서 차단하였다. 비흡착 플레이트 (Nunc #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원을 관심 Fab의 연속 희석액과 혼합한다 (예를 들어, 문헌 [Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599]의 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치함). 이어서, 관심 Fab를 밤새 인큐베이션하되; 그러나, 평형이 도달하는 것을 확실하게 하기 위해 더 오랜 시간 (예를 들어, 65시간) 동안 계속 인큐베이션할 수 있다. 그 후, 혼합물을 실온에서의 인큐베이션 (예를 들어, 1시간 동안)을 위해 포획 플레이트로 보유한다. 이어서, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중의 0.1％ 트윈™-20으로 8회 세척하였다. 플레이트를 건조시킬 때, 150 ㎕/웰의 섬광제 (마이크로신트(MicroScint)™-20; 팩커드 (Packard))를 첨가하고, 플레이트를 탑카운트(TopCount) 감마 계수기 (팩커드) 상에서 10분 동안 계수한다. 최대 결합의 20％ 이하를 제공하는 각 Fab의 농도를 선택하여 경쟁적 결합 검정에 사용한다. 다른 실시양태에 따르면, Kd 또는 Kd 값은 약 10의 반응 단위 (RU)로 고정된 항원 CM5 칩을 사용하여 25℃에서 비아코어(BIAcore)™-2000 또는 비아코어™-3000 (비아코어, 인크. (BIAcore, Inc.), 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)을 사용하는 표면 플라즈몬 공명 검정을 사용함으로써 측정한다. 간략하게 설명하면, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어 인크.)을 공급업체의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)을 사용하여 5 ㎍/ml (약 0.2 μM)로 희석한 후, 커플링된 단백질의 대략 10 반응 단위 (RU)를 달성하도록 5 ㎕/분의 유속으로 주입한다. 항원 주입 후, 미반응 기를 차단하기 위해 1 M 에탄올아민을 주입한다. 역학 측정을 위해, Fab의 2배 연속 희석액 (0.78 nM 내지 500 nM)을 대략 25 ㎕/분의 유속으로 25℃에서 0.05％ 트윈™ 20을 함유하는 PBS (PBST) 중에서 주입한다. 회합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)는 회합 및 해리 센서그램을 동시 대입함으로써 단순 일-대-일 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델 (비아코어™ 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 koff/kon의 비로 계산한다. 예를 들어, 문헌 [Chen, Y., et al., (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881]을 참조한다. 온-레이트 (on-rate)가 상기 표면 플라즈몬 공명 검정에 의해 106M-1S-1을 초과하면, 온-레이트는 분광계, 예컨대 정지 유동 장착 분광분석기 (아비브 인스트루먼츠 (Aviv Instruments)) 또는 교반 큐벳이 구비된 8000-시리즈 SLM Aminco 분광광도계 (써모스펙트로닉(ThermoSpectronic))에서 측정할 때 증가하는 농도의 항원의 존재 하에, PBS (pH 7.2) 중 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 밴드 통과)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 사용하여 결정할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 그에 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 한 가지 유형의 벡터가 "플라스미드"인데, 이는 부가의 DNA 절편을 라이게이션시킬 수 있는 환상 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 또 다른 유형의 벡터는 파지 벡터이다. 또 다른 유형의 벡터는 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터는 그것이 도입된 숙주 세포 내에서 자율 복제가 가능하다 (예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입시에 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 벡터가 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이같은 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 단순히 "재조합 벡터" 또는 "발현 벡터")로서 칭해진다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다. 본 명세서에서, "플라스미드"와 "벡터"은 교환 가능하게 이용될 수 있다.
본원에서 상호교환적으로 사용된 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 나타내고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 그의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합효소에 의해, 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 포함될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어 메틸화 뉴클레오티드 및 그의 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 구조에 대한 변형이 존재하는 경우, 이러한 변형은 중합체의 어셈블리 이전 또는 이후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열에 비뉴클레오티드 성분이 개재될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 합성 후에, 예컨대 표지와의 접합에 의해 추가로 변형될 수 있다. 다른 유형의 변형은, 예를 들어 "캡(cap)", 1개 이상의 자연 발생 뉴클레오티드의 유사체로의 치환, 뉴클레오티드간 변형, 예컨대 비하전된 연결을 갖는 것 (예를 들어 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카바메이트 등) 및 하전된 연결을 갖는 것 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 펜던트 모이어티, 예를 들어 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-리신 등)을 함유하는 것, 인터칼레이터(intercalator) (예를 들어, 아크리딘, 프소랄렌 등)가 있는 것, 킬레이터 (예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화성 금속 등)를 함유하는 것, 알킬레이터를 함유하는 것, 변형된 연결이 있는 것 (예를 들어, 알파 아노머 핵산 등), 뿐만 아니라 변형되지 않은 형태의 폴리뉴클레오티드(들)을 포함한다. 추가로, 당 내에 통상적으로 존재하는 임의의 히드록실기가 예를 들어 포스포네이트기, 포스페이트기로 대체되거나, 표준 보호기로 보호되거나, 추가의 뉴클레오티드에 대한 추가의 연결부가 제조되도록 활성화되거나, 또는 고체 또는 반고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH가 포스포릴화되거나 또는 아민 또는 1 내지 20개 탄소 원자의 유기 캡핑 기 모이어티로 치환될 수도 있다. 다른 히드록실이 표준 보호기로 유도체화될 수도 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 예를 들어 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카르보시클릭 당 유사체, 알파-아노머 당, 에피머 당, 예컨대 아라비노스, 자일로스 또는 라이소스, 피라노스 당, 퓨라노스 당, 세도헵툴로스, 비고리형 유사체 및 염기성 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 메틸 리보시드를 비롯한, 당업계에 일반적으로 알려져 있는 리보스 또는 데옥시리보스의 유사한 형태를 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포디에스테르 연결부가 대안적인 연결부로 대체될 수 있다. 이러한 대안적인 연결기에는 포스페이트가 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), (O)NR2 ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2 ("포름아세탈")로 대체된 실시양태가 포함되지만 이것으로 한정되는 것은 아니며, 여기서 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H 또는 에테르(-O-) 연결을 임의로 함유하는 치환되거나 비치환된 알킬 (1-20 C), 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아르알딜이다. 폴리뉴클레오티드 내의 모든 연결부가 동일할 필요는 없다. 전술한 설명은 RNA 및 DNA를 비롯하여 본원에서 언급되는 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.
본원에 사용된 "올리고뉴클레오티드"는 일반적으로, 길이가 약 200개 미만 뉴클레오티드이긴 하지만 반드시 그럴 필요가 없는 짧은, 일반적으로 단일 가닥, 일반적으로 합성 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 서로 배타적이지 않다. 폴리뉴클레오티드에 대한 상기 기재는 올리고뉴클레오티드에 동일하고 완전하게 적용가능하다.
본원에서 사용된 용어 "EGFL7" (상호교환가능하게 "EGF-유사-도메인, 멀티플 7"로 명명됨)은, 달리 구체적으로 또는 문맥적으로 지시되지 않는 한, 임의의 천연 또는 변이체 (천연 또는 합성) EGFL7 폴리펩티드를 지칭한다. 용어 "천연 서열"은 자연 발생 말단절단 또는 분비 형태 (예를 들어, 세포외 도메인 서열), 자연 발생 변이체 형태 (예를 들어, 별법적으로 스플라이싱된 형태) 및 자연 발생 대립유전자 변이체를 명확하게 포함한다. 용어 "야생형 EGFL7"은 일반적으로 자연 발생 EGFL7 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 용어 "야생형 EGFL7 서열"은 일반적으로 자연 발생 EGFL7에서 발견되는 아미노산 서열을 지칭한다.
용어 "항체" 및 "이뮤노글로불린"은 가장 광범위한 의미로 상호교환가능하게 사용되고, 모노클로날 항체 (예를 들어, 전장 또는 무손상 모노클로날 항체), 폴리클로날 항체, 다가 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이중특이적 항체)를 포함하고, 또한 특정 항체 단편 (본원에서 더욱 상세하게 기술됨)을 포함할 수 있다. 항체는 인간, 인간화 및/또는 친화성 성숙된 항체일 수 있다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체마다 서열에서 광범위하게 상이하고 각각의 특정 항체의 그의 특정 항원에 대한 결합 및 특이성과 관련하여 사용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성이 항체 가변 도메인 전반에 걸쳐 고르게 분포되어 있는 것은 아니다. 이는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 모두에서 상보성 결정 영역 또는 초가변 영역 (CDR 또는 HVR, 본원에서 상호교환가능하게 사용됨)이라 불리는 3개의 세그먼트에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 (FR)으로 지칭된다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 4개의 FR 영역을 포함하는데, 이는 β-시트 구조를 연결하고 몇몇 경우에는 이러한 β-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성하는, 3개의 HVR에 의해 연결된 β-시트 배향을 상당 부분 채택하고 있다. 각 쇄에서의 HVR들은 FR 영역에 의해 근접하게 위치되어 있고, 다른 쇄로부터의 HVR과 함께 항체의 항원 결합 부위 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)] 참조). 불변 도메인은 항체가 항원에 결합하는 것에 직접 수반되지는 않지만, 항체-의존적 세포 독성에서의 항체의 참여와 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.
항체를 파파인으로 소화시키면 "Fab" 단편이라고 불리는, 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 2개의 동일한 항원-결합 단편과, 나머지 "Fc" 단편이 생성되는데, Fc라는 명칭은 그의 쉽게 결정화되는 능력을 반영한 것이다. 펩신 처리에 의해, 2개의 항원 결합 부위를 갖고 여전히 항원에 가교결합할 수 있는 F(ab')2 단편이 생성된다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 2-쇄 Fv 종에서, 이러한 영역은 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인이 단단한 비공유적으로 회합된 이량체로 이루어진다. 단일쇄 Fv 종에서, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인은 경쇄 및 중쇄가 2-쇄 Fv종에서와 유사한 "이량체" 구조로 회합할 수 있도록 가요성 펩티드 링커에 의해 공유 연결될 수 있다. 이러한 형태에서, 각 가변 도메인의 3개의 HVR은 상호작용하여 VH-VL 이량체 표면의 항원 결합 부위를 규정한다. 전체적으로, 6개의 HVR이 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 HVR 만을 포함하는 Fv의 절반)일지라도 전체 결합 부위보다 친화도가 낮긴 하지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 수개의 잔기가 부가되었다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 보유하는 Fab'를 나타낸다. F(ab')2 항체 단편은 본래 가운데에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로 생성된다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.
임의의 척추동물 종으로부터의 항체 (이뮤노글로불린)의 "경쇄"는 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 칭해지는 명백하게 상이한 2가지 유형 중의 하나로 지정될 수 있다.
그의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 이뮤노글로불린은 상이한 클래스로 지정될 수 있다. 5가지 주요 클래스의 이뮤노글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이중 몇 가지는 하위클래스 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 나뉠 수 있다. 상이한 클래스의 이뮤노글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다. 상이한 클래스의 이뮤노글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 형상은 잘 공지되어 있다.
"항체 단편"은 무손상 항체의 일부만을 포함하고, 이때 이 부분은 무손상 항체 내에 존재할 때 이 부분과 정상적으로 관련된 기능을 적어도 하나, 바람직하게는 대부분 또는 전부 유지한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자; 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 단편은 무손상 항체의 항원 결합 부위를 포함하기 때문에 항원과 결합하는 능력을 보유한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 단편, 예를 들어 Fc 영역을 포함하는 항체 단편은, 본래 항체 내에 존재하는 경우에 Fc 영역과 통상적으로 연관된 생물학적 기능들, 예를 들어 FcRn 결합성, 항체 반감기 조정, ADCC 기능 및 보체 결합성 중의 적어도 하나의 기능을 보유하고 있다. 한 실시양태에서, 항체 단편은 무손상 항체와 실질적으로 유사한 생체내 반감기를 갖는 1가 항체이다. 예를 들어, 이같은 항체 단편은 단편에 생체내 안정성을 부여할 수 있는 Fc 서열에 연결된 항원 결합 아암을 포함할 수 있다.
용어 "초가변 영역", "HVR" 또는 "HV"가 본원에서 사용되는 경우, 이것은 서열에서 초가변이고/거나 구조적으로 규정된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR; VH 내에 3개 (H1, H2, H3) 및 VL 내에 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. 천연 항체에서, H3 및 L3은 6개의 HVR 중에서 가장 높은 다양성을 나타내고, 특히 H3은 항체에 정밀한 특이성을 부여하는데 특유의 역할을 수행한다고 여겨진다. 예를 들어, 문헌 [Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000)]; [Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)]을 참조한다. 실제로, 중쇄만으로 이루어진 자연 발생 카멜리드(camelid) 항체는 경쇄의 부재 하에 기능적이고 안정하다. 예를 들어, 문헌 [Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993)]; [Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)]을 참조한다.
많은 HVR 설명이 사용되고 있고 본원에 포함된다. 카바트 상보성 결정 영역 (CDR)은 서열 가변성을 기초로 하며, 가장 흔히 사용된다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]). 코티아는 구조적 루프의 위치를 대신 지칭한다 (문헌 [Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]). AbM HVR은 카바트 HVR과 코티아 구조적 루프 사이의 절충안을 나타내고, 옥스포드 몰레큘라(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다. "접촉" HVR은 이용가능한 복합 결정 구조의 분석을 기초로 한다. 이들 각각의 HVR로부터의 잔기를 하기 나타낸다.
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HVR은 다음과 같이 "확장된 HVR"을 포함할 수 있다: VL에서 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 50-56 (L2) 및 89-97 또는 89-96 (L3), 및 VH에서 26-35 (H1), 50-65 또는 49-65 (H2) 및 93-102, 94-102 또는 95-102 (H3). 가변 도메인 잔기는 각각의 상기 정의에 대해 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에 따라 넘버링된다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 이뮤노글로불린에서 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 한 실시양태에서, 인간화 항체는 수용자의 HVR로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및/또는 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 HVR의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 FR 잔기를 상응하는 비-인간 잔기로 대체한다. 추가로, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 이러한 변형은 항체 성능이 추가로 개선되도록 이루어질 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린의 그것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 그것이다. 또한, 인간화 항체는 임의로 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc) 중 적어도 일부, 전형적으로는 인간 이뮤노글로불린의 적어도 일부를 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은, 예를 들어 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다. 또한, 예를 들어 문헌 [Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)]; [Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)]; [Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)]; 및 미국 특허 번호 6,982,321 및 7,087,409를 참조한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉, 이 집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 돌연변이, 예를 들어 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 수식어구 "모노클로날"은 항체의 특징을 별개의 항체의 혼합물이 아니라는 것으로 나타낸다. 특정 실시양태에서, 이러한 모노클로날 항체는 전형적으로 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하고, 표적 결합 폴리펩티드 서열은 복수개의 폴리펩티드 서열로부터 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열의 선별을 포함하는 과정에 의해 수득하였다. 예를 들어, 선별 과정은 복수개의 클론, 예컨대 하이브리도마 클론, 파지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀로부터 독특한 클론을 선별하는 것일 수 있다. 선별된 표적 결합 서열은 예를 들어 표적에 대한 친화도 개선, 표적 결합 서열의 인간화, 세포 배양물 중 그의 생성 개선, 생체내에서의 그의 면역원성 감소, 다중특이적 항체의 생성 등을 위해 추가로 변경될 수 있고, 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체도 본 발명의 모노클로날 항체임을 이해해야 한다. 전형적으로 상이한 결정자 (에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 반대로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원상의 단결정자에 대한 것이다. 모노클로날 항체 제제는 이것의 특이성에 더하여 전형적으로 다른 이뮤노글로불린에 의해 오염되지 않았다는 점에서 유리하다.
수식어구 "모노클로날"은 항체의 특징을 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 것으로 나타내며, 임의의 특정한 방법을 통한 항체 생성이 필요하다는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라서 사용하고자 하는 모노클로날 항체는, 예를 들어 하이브리도마 방법 (예를 들어, 문헌 [Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975)]; [Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995)], [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)]; [Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)] 참조), 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조), 파지 디스플레이 기술 (예를 들어, 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)]; [Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)]; [Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)]; [Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)]; 및 [Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)] 참조)을 비롯한 다양한 기술, 및 인간 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 유전자 또는 인간 이뮤노글로불린 유전자좌의 일부 또는 전부를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 생산하는 기술 (예를 들어, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993)]; [Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993)]; 미국 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016; [Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992)]; [Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994)]; [Morrison, Nature 368: 812-813 (1994)]; [Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996)]; [Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996)]; 및 [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)] 참조)로 제조할 수 있다.
구체적으로, 본원에서의 모노클로날 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이고, 쇄 (들)의 나머지 부분은 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체, 및 또한 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한은 이러한 항체의 단편을 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)] 참조). 키메라 항체는 항체의 항원 결합 영역이 예를 들어 마카쿠 원숭이를 관심 항원으로 면역화하여 생성된 항체로부터 유래된 프리마티즈드(PRIMATIZED)® 항체를 포함한다.
"단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 존재하는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함한다. 일반적으로, scFv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있도록 하는, VH 도메인과 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 검토를 위해, 문헌 [Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.
"항원"은 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 미리 정해진 항원이다. 표적 항원은 폴리펩티드, 탄수화물, 핵산, 지질, 합텐 또는 기타 자연 발생 또는 합성 화합물일 수 있다.
용어 "디아바디"는 동일한 폴리펩티드 사슬 (VH-VL) 내의 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는, 2개의 항원-결합 부위를 갖는 소형 항체 단편을 지칭한다. 동일 쇄 상의 2개의 도메인 사이에서 쌍 형성을 허용하기에는 지나치게 짧은 링커를 사용함으로써, 상기 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 형성하게 되어 2개의 항원-결합 부위를 생성하게 된다. 디아바디는 예를 들어 EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 보다 상세하게 기재되어 있다. 트리아바디(triabody) 및 테트라바디(tetrabody) 역시 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기재되어 있다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖고/거나 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체 제조 기술 중 임의의 것을 이용하여 제조된 것이다. 인간 항체의 이러한 정의에서 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 명확하게 제외된다. 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리를 비롯한 당업계에 공지된 각종 기술을 사용하여 생성할 수 있다. 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. 또한, 문헌 [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)]; [Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)]에 기재된 방법도 인간 모노클로날 항체의 제조에 이용가능하다. 또한 문헌 [van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001)]을 참조한다. 인간 항체는 항원 시험접종에 반응하여 이러한 항체를 생성하도록 변형되었으나 내인성 유전자좌는 무력화시킨 트랜스제닉 동물, 예를 들어 면역화된 제노마우스(xenomice)에게 항원을 투여하여 제조될 수 있다 (예를 들어, 제노마우스(XENOMOUSE)™ 기술에 관한 미국 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584 참조). 또한, 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체에 관해서는 예를 들어 문헌 [Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)]을 참고한다.
용어 "카바트에서와 같은 가변 도메인 잔기 넘버링" 또는 "카바트에서와 같은 아미노산 위치 넘버링" 및 이들의 변형은 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에서 항체 캄필레이션(compilation)의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 사용된 넘버링 시스템을 지칭한다. 이러한 넘버링 시스템을 이용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 단축 또는 이것으로의 삽입에 상응하는 보다 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 후에 단일 아미노산 삽입 (카바트에 따른 잔기 52a), 및 중쇄 FR 잔기 82 후에 삽입된 잔기 (예를 들어, 카바트에 따른 잔기 82a, 82b 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 카바트 넘버링은 항체 서열의 상동성 영역에서 "표준" 카바트 넘버링 서열과 정렬함으로써 주어진 항체에 대하여 결정할 수 있다.
카바트 넘버링 시스템은 일반적으로 가변 도메인 내의 잔기 (대략 경쇄의 잔기 1-107 및 중쇄의 잔기 1-113)을 언급하기 위해 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]). "EU 넘버링 시스템" 또는 "EU 지수"는 일반적으로 이뮤노글로불린 중쇄 불변 영역 내의 잔기를 지칭할 때 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에 보고된 EU 지수). "카바트에서와 같은 EU 지수"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다. 본원에서 달리 언급되지 않는다면, 항체 가변 도메인 내의 잔기 번호에 대한 언급은 카바트 넘버링 시스템에 의한 잔기 넘버링을 의미한다. 본원에서 달리 언급하지 않는다면, 항체의 불변 도메인 내의 잔기 번호에 대한 언급은 EU 넘버링 시스템에 의한 잔기 넘버링을 의미한다 (예를 들어, 미국 가출원 번호 60/640,323에서 EU 넘버링에 대한 도면 참조).
"차단" 항체 또는 "길항제" 항체는 이것이 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 항체이다. 특정 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 억제한다.
본원에서 사용되는 용어 "실질적으로 유사한" 또는 "실질적으로 동일한"은 당업자가 2개의 수치값 (예를 들어, 하나는 본 발명의 항체와 관련이 있고, 다른 하나는 참조/비교 항체와 관련이 있음) (예를 들어, Kd 값)에 의해 측정된 생물학적 특징과 관련하여 이들 2개 값 사이의 차이를 생물학적 및/또는 통계적 유의성이 거의 또는 전혀 없는 것으로 간주할 정도의, 상기 값 사이의 충분히 높은 정도의 유사성을 나타낸다. 상기 2개 값 사이의 차이는 참조/비교 값의 함수로서 예를 들어 약 50％ 미만, 약 40％ 미만, 약 30％ 미만, 약 20％ 미만 및/또는 약 10％ 미만이다.
본원에서 사용되는 어구 "실질적으로 감소된" 또는 "실질적으로 상이한"은 당업자가 2개의 수치값 (일반적으로, 하나는 분자와 관련이 있고, 다른 하나는 참조/비교 분자와 관련이 있음) (예를 들어, Kd 값)에 의해 측정된 생물학적 특징과 관련하여 이들 2개 값 사이의 차이를 통계적 유의성이 있는 것으로 간주할 정도의, 상기 값 사이의 충분히 높은 정도의 차이를 나타낸다. 상기 2개 값 사이의 차이는 참조/비교 분자에 대한 값의 함수로서 예를 들어 약 10％ 초과, 약 20％ 초과, 약 30％ 초과, 약 40％ 초과 및/또는 약 50％ 초과이다.
항체 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 생물학적 활성을 지칭하고, 항체 이소형에 따라 달라진다. 항체 이펙터 기능의 예에는 C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어 B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화가 포함된다.
본원에서의 용어 "Fc 영역"은 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역, 예를 들어 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 정의하는데 사용된다. 이뮤노글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 위치 Cys226에서의 아미노산 잔기로부터, 또는 Pro230으로부터 이것의 카르복실 말단까지의 스트레치인 것으로 정의된다. Fc 영역의 C-말단 리신 (EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 447)은 예를 들어 항체의 생성 또는 정제 동안 또는 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산의 재조합 조작으로 제거될 수 있다. 따라서, 무손상 항체의 조성물은 모든 K447 잔기가 제거된 항체 집단, K447 잔기가 제거되지 않는 항체 집단, 및 K447 잔기가 존재하는 항체와 존재하지 않는 항체들의 혼합물을 갖는 항체 집단을 포함할 수 있다.
"기능적 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 "이펙터 기능"을 보유한다. 예시적인 "이펙터 기능"은 C1q 결합; CDC; Fc 수용체 결합; ADCC; 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등을 포함한다. 상기 이펙터 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 결합할 것을 필요로 하고, 예를 들어 본원의 정의에서 개시된 바와 같은 다양한 검정을 사용하여 평가할 수 있다.
"천연 서열 Fc 영역"은 자연계에서 발견된 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 천연 서열 인간 Fc 영역은 천연 서열 인간 IgG1 Fc 영역 (비-A 및 A 동종이형); 천연 서열 인간 IgG2 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG3 Fc 영역; 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 영역 뿐만 아니라 이들의 자연 발생 변이체를 포함한다.
"변이체 Fc 영역"은 적어도 하나의 아미노산 변형, 바람직하게는 하나 이상의 아미노산 치환(들)을 통하여 천연 서열 Fc 영역과는 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖고, 예를 들어 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역에서 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환, 바람직하게는 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본원에서의 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과의 상동성이 바람직하게 약 80％ 이상, 가장 바람직하게는 그와의 상동성이 약 90％ 이상, 보다 바람직하게는 그와의 상동성이 약 95％ 이상일 것이다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기재한다. 일부 실시양태에서, FcR은 천연 인간 FcR이다. 일부 실시양태에서, FcR은 IgG 항체에 결합하는 수용체 (감마 수용체)이고, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위클래스의 수용체를 포함하고, 이들은 이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 별법적으로 스플라이싱된 형태를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하는데, 이들은 그의 세포질 도메인에서 주로 차이가 나는 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기재의 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신 기재의 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다. (예를 들어, 문헌 [Daeeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)] 참조). FcR은 예를 들어 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]; [Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)]; 및 [de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]에서 검토된다. 추후로 확인될 것을 포함하는 다른 FcR이 본원의 용어 "FcR"에 포함된다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 또한 모체 IgG의 태아로의 전달 (문헌 [Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)]) 및 이뮤노글로불린의 항상성 조절을 담당하는 신생아 수용체 FcRn을 포함한다. FcRn에 대한 결합을 측정하는 방법은 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997)]; [Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997)]; [Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004)]; WO 2004/92219 (Hinton et al.) 참조).
인간 FcRn 고친화도 결합 폴리펩티드의 인간 FcRn에 대한 생체내 결합 및 혈청 반감기는, 예를 들어 인간 FcRn을 발현하는 트랜스제닉 마우스 또는 형질감염된 인간 세포주에서, 또는 변이체 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드를 투여한 영장류에서 검정할 수 있다. WO 2000/42072 (Presta)에는 FcR에 대한 결합이 개선되거나 감소된 항체 변이체가 기재되어 있다. 또한, 예를 들어 문헌 [Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001)]을 참조한다.
"인간 이펙터 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 특정 실시양태에서, 상기 세포는 적어도 FcγRIII을 발현하고 ADCC 이펙터 기능(들)을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 천연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구를 포함한다. 이펙터 세포는 천연 공급원, 예를 들어 혈액으로부터 단리될 수 있다.
"항체-의존성 세포 매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정 세포독성 세포 (예를 들어, NK 세포, 호중구 및 대식세포) 상에 존재하는 Fc 수용체 (FcR)와 결합된 분비형 Ig가 이들 세포독성 이펙터 세포가 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합할 수 있게 하고, 이후에 표적 세포를 세포독소로 사멸시킬 수 있게 하는 세포독성의 형태를 지칭한다. ADCC를 매개하는 주요 세포인 NK 세포는 FcγRIII 만을 발현하는 반면에, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈모세포상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 페이지 464, 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해서, 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337 또는 미국 특허 번호 6,737,056 (Presta)에 기재된 바와 같은 시험관내 ADCC 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 PBMC 및 NK 세포를 포함한다. 별법적으로 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 예를 들어 문헌 [Clynes et al., PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 생체내 평가할 수 있다.
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체 존재 하에 표적 세포의 용해를 나타낸다. 고전적인 보체 경로의 활성화는 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)이 동족 항원에 결합된 항체 (적절한 서브클래스의 항체)에 결합함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기재되어 있는 바와 같은 CDC 검정을 수행할 수 있다. 변경된 Fc 영역 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 변이체 (변이체 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드) 및 증가되거나 감소된 C1q 결합 능력을 갖는 폴리펩티드 변이체는 예를 들어 미국 특허 번호 6,194,551 B1 및 WO 1999/51642에 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]을 또한 참조한다.
용어 "Fc 영역-포함 항체"는 Fc 영역을 포함하는 항체를 지칭한다. Fc 영역의 C-말단 리신 (EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 447)은 예를 들어 항체의 정제 동안, 또는 항체를 코딩하는 핵산의 재조합 조작에 의해 제거될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 Fc 영역을 갖는 항체를 포함하는 조성물은 K447을 갖는 항체, 모든 K447 잔기가 제거된 항체, 또는 K447 잔기가 존재하거나 존재하지 않는 항체들의 혼합물을 포함할 수 있다.
본원의 목적상 "수용자 인간 프레임워크"는 인간 이뮤노글로불린 프레임워크로부터 유래되거나 또는 인간 컨센서스 프레임워크로부터 유래된 VL 또는 VH 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크로부터 "유래된" 수용자 인간 프레임워크는 그의 동일한 아미노산을 포함할 수 있거나, 또는 기존의 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 기존의 아미노산 변화가 존재하는 경우에는, 바람직하게 5개 이하, 바람직하게 4개 이하, 또는 3개 이하의 기존의 아미노산 변화가 존재한다. 기존의 아미노산 변화가 VH에 존재하는 경우, 바람직하게는 이들 변화가 위치 71H, 73H 및 78H 중의 단지 3개, 2개 또는 1개에서만 일어나는 경우, 예를 들어 이들 위치에서의 아미노산 잔기는 71A, 73T 및/또는 78A일 수 있다. 한 실시양태에서, VL 수용자 인간 프레임워크는 VL 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열과 서열 면에서 동일하다.
"인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선별시 가장 흔히 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 서열의 선별은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터 행한다. 일반적으로, 이러한 서열의 하위군은 문헌 [Kabat et al.]에서와 같은 하위군이다. 한 실시양태에서, VL에 대한 하위군은 문헌 [Kabat et al.]에서와 같은 하위군 카파 I이다. 한 실시양태에서, VH의 경우 하위군은 문헌 [Kabat et al.]에서와 같은 하위군 III이다.
"VH 하위군 III 컨센서스 프레임워크"는 카바트 등의 가변 중쇄 하위군 III 내의 아미노산 서열로부터 수득된 컨센서스 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, VH 하위군 III 컨센서스 프레임워크 아미노산 서열은 다음 서열 각각의 적어도 일부 또는 전부를 포함한다:
Figure pct00040
"VL 하위군 I 컨센서스 프레임워크"는 카바트 등의 가변 경쇄 카파 하위군 I 내의 아미노산 서열로부터 수득된 컨센서스 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, VH 하위군 I 컨센서스 프레임워크 아미노산 서열은 각각의 다음 서열의 적어도 일부 또는 전부를 포함한다:
Figure pct00041
"생물학적 샘플" (상호교환가능하게 "샘플" 또는 "조직 또는 세포 샘플"로 칭해짐)은 개체로부터 수득된 다양한 샘플 유형을 포함하고, 진단 또는 모니터링 검정에서 사용될 수 있다. 상기 정의는 생물학적 기원의 혈액 및 기타 액체 샘플, 고체 조직 샘플 예컨대 생검 표본 또는 이로부터 유래된 조직 배양물 또는 세포, 및 그의 자손을 포함한다. 상기 정의는 획득 후 임의의 방식으로, 예컨대 시약으로의 처치, 가용화, 또는 특성 성분, 예컨대 단백질 또는 폴리뉴클레오티드의 강화, 또는 구획화 목적으로 반-고체 또는 고체 매트릭스 내에 매입시키는 것에 의해 조작된 샘플을 또한 포함한다. 용어 "생물학적 샘플"은 임상 샘플을 포함하고, 배양 세포, 세포 상청액, 세포 용해물, 혈청, 혈장, 생체액, 및 조직 샘플을 또한 포함한다. 생물학적 샘플의 공급원은 신선하고/하거나, 동결되고/되거나, 보존된 기관 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고체 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 성분; 체액 예컨대 뇌척수액, 양수, 복막액, 또는 간질액; 대상체의 임신 또는 발달 중 임의 시점으로부터의 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 원발성 또는 전이성 종양으로부터 수득하였다. 생물학적 샘플은 자연계에서는 조직 및 천연적으로 혼합되지 않는 화합물, 예를 들어 보존제, 항응고제, 완충제, 고정제, 영양분, 항생제 등을 함유할 수 있다.
본원의 목적상, 조직 샘플의 "절편"은 조직 샘플의 단일 부분 또는 조각, 예를 들어 조직 샘플로부터 절단된 조직 또는 세포의 박편을 나타낸다. 조직 샘플의 다수의 절편을 취하여 본 발명에 따른 분석에 사용할 수 있음이 이해된다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플의 동일 절편을 형태적 및 분자적 수준 둘다에서 분석하거나, 단백질과 핵산 둘다에 대하여 분석한다.
본원에서 사용될 때 단어 "표지"는 시약, 예를 들어 핵산 프로브 또는 항체에 직접 또는 간접적으로 접합되거나 융합되어, 접합되거나 또는 융합된 시약의 검출을 용이하게 하는 화합물 또는 조성물을 나타낸다. 표지는 그 자체가 검출가능할 수도 있고 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 또는 효소 표지의 경우에는 기질 화합물 또는 조성물의 검출가능한 화학적 변경을 촉매할 수도 있다.
"의약"은 해당 장애 또는 그의 증상, 또는 부작용을 치료하기 위한 활성 약물이다.
"장애" 또는 "질환"은 본 발명의 물질/분자 또는 방법으로의 치료가 이로울 임의의 용태이다. 이것은 포유동물이 해당 장애에 걸리기 쉽게 하는 병리 상태를 포함하는, 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다. 본원에서 치료될 장애의 비-제한적인 예로는 악성 및 양성 종양; 암종, 모세포종, 및 육종이 포함된다.
용어 "세포 증식성 장애" 및 "증식성 장애"는 어느 정도의 비정상적인 세포 증식과 관련이 있는 장애를 지칭한다. 한 실시양태에서, 세포 증식성 장애는 암이다.
본원에서 사용된 "종양"은 모든 신생물성 세포 성장 및 증식 (악성 또는 양성 여부와 상관 없음), 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 나타낸다. 본원에서 지칭되는 바와 같이, 용어 "암", "암성", "세포 증식성 장애", "증식성 장애" 및 "종양"은 상호 배타적인 것이 아니다.
용어 "암" 및 "암성"은 일반적으로 비조절된 세포 성장/증식을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 지칭하거나 설명한다. 암의 예에는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예에는 편평세포 암, 소세포 폐암, 뇌하수체 암, 식도암, 성상세포종, 연조직 육종, 비소세포 폐암, 폐 선암종, 폐의 편평세포 암종, 복막암, 간세포 암, 위장암, 췌장암, 교아세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 음순암, 갑상선암, 간 암종, 뇌암, 자궁내막 암, 고환암, 담관암종, 담낭 암종, 위암, 흑색종, 및 다양한 유형의 두경부암이 포함된다. 혈관신생의 조절 곤란은 본 발명의 조성물 및 방법에 의해 치료될 수 있는 여러 장애를 유발할 수 있다. 이러한 장애에는 비-신생물 및 신생물 상태 둘 모두가 포함된다. 신생물성에는 상기 기술된 것들이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 비-신생물성 장애에는 원치 않는 또는 비정상적인 비대증, 관절염, 류머티스 관절염 (RA), 건선, 건선성 플라크, 사르코이드증, 죽상동맥경화증, 죽상경화판, 당뇨성 및 기타 증식성 망막병증 (미숙아 망막병증 포함), 후수정체 섬유증식, 신생혈관 녹내장, 연령-관련 황반 변성, 당뇨성 황반 부종, 각막 신생혈관형성, 각막 이식 신생혈관형성, 각막 이식 거부, 망막/맥락막 신생혈관형성, 각의 신생혈관형성 (피부 홍조), 안구 신생혈관 질환, 혈관 재협착, 동정맥 기형 (AVM), 수막종, 혈관종, 혈관섬유종, 갑상선 과다형성 (그레이브(Grave) 질환 포함), 각막 및 기타 조직 이식, 만성 염증, 폐 염증, 급성 폐 손상/ARDS, 패혈증, 원발성 폐 고혈압증, 악성 폐 삼출, 뇌 부종 (예를 들어, 급성 뇌졸중/폐쇄성 두부 손상/외상과 관련됨), 활막 염증, RA에서의 판누스(pannus) 형성, 골화 근육염, 비대성 골 형성, 골관절염 (OA), 불응성 복수, 다낭성 난소 질환, 자궁내막증, 체액의 제3공간 질환 (췌장염, 구획 증후군, 화상, 장 질환), 자궁 섬유증, 조산, 만성 염증 예컨대 IBD (크론병 및 궤양성 대장염), 신장 동종이식 거부, 염증성 장 질환, 신 증후군, 원치 않는 또는 비정상적인 조직 덩어리 성장 (비-암), 혈우병성 관절, 비후성 반흔, 모발 성장의 억제, 오슬러-웨버(Osler-Weber) 증후군, 화농성 육아종, 후수정체 섬유증식, 공피증, 트라코마, 혈관 부착, 활막염, 피부염, 자간전증, 복수, 심낭 삼출 (예컨대 심막염과 관련된 것), 및 흉막 삼출이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
용어 "소모성" 장애 (예를 들어, 소모성 증후군, 악액질, 근육감소증)는 바람직하지 않고/거나 건강에 해로운 체중 손실 또는 체 세포 질량 손실에 의해 유발되는 장애를 지칭한다. 노년층 뿐만 아니라 AIDS 및 암 환자에서, 소모성 질환은 지방 및 제지방 저장소 둘 모두를 포함해서 바람직하지 않은 체중 손실을 야기할 수 있다. 소모성 질환은 음식물의 불충분한 섭취 및/또는 질병 및/또는 노화 과정과 관련된 대사 변화의 결과일 수 있다. 암 환자 및 AIDS 환자, 뿐만 아니라 큰 수술 이후의 환자 또는 만성 감염, 면역학적 질환, 갑상선기능항진증, 크론병, 심인성 질환, 만성 심부전 또는 다른 심각한 외상을 가진 환자는 때때로 악액질, 대사 및 때로는 섭식 장애라고도 불리는 소모성 질환으로 빈번하게 고통받는다. 악액질은 부가적으로 대사과다증 및 이화과다증을 특징으로 한다. 악액질 및 소모성 질환은 소모성 상태를 지칭하는데 교환 가능하게 빈번히 사용되지만, 악액질을 제지방 체중 손실, 및 특히 체세포 질량 손실로서 소모성 증후군과 구분짓는 적어도 하나의 연구 실체가 존재한다 (문헌 [Mayer, 1999, J. Nutr. 129(1S Suppl.):256S-259S]). 연로한 개체에게 영향을 미칠 수 있는 또 다른 이같은 장애인 근육감소증은 전형적으로 근육량 손실을 특징으로 한다. 상기한 바와 같은 최종 단계의 소모성 질환은 악액질 또는 근육감소증을 앓는 개체에서 발달할 수 있다.
본원에서 사용된 "치료"는 치료될 개체 또는 세포의 자연적인 과정을 변경하려는 시도에서의 임상적 개입을 나타내고, 예방을 위해 또는 임상 병리학의 과정 도중에 수행될 수 있다. 원하는 치료 효과에는 질환의 발생 또는 재발을 예방하고, 증상을 완화시키며, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병적 결과를 경감시키며, 질환 진행 속도를 감소시키고, 질환 상태를 개선시키거나 일시적으로 완화시키며, 차도시키거나 예후를 개선시키는 것이 포함된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 질병 또는 질환의 발생을 지연시키기 위해 사용된다.
"항혈관신생제" 또는 "혈관신생 억제제"는 혈관신생, 혈관형성 또는 바람직하지 않은 혈관 투과성을 직접 또는 간접적으로 억제하는 소분자량 물질, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 단리된 단백질, 재조합 단백질, 항체 또는 그의 접합체 또는 융합 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 항혈관신생제는 상기 정의된 바와 같은 혈관신생제에 대한 항체 또는 기타 길항제, 예를 들어 VEGF에 대한 항체, VEGF 수용체에 대한 항체, VEGF 수용체 신호전달을 차단하는 소분자 (예를 들어, PTK787/ZK2284, SU6668, 수텐트(SUTENT)®/SU11248 (수니티닙 말레이트), AMG706)이다. 항혈관신생제는 또한 천연 혈관신생 억제제, 예를 들어 안지오스타틴, 엔도스타틴 등을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Klagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991)]; [Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003)] (예를 들어, 악성 흑색종에서의 항혈관신생 요법을 열거한 표 3); [Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12):1359-1364 (1999)]; [Tonini et al., Oncogene, 22:6549-6556 (2003)] (예를 들어, 항혈관신생 인자를 열거한 표 2); 및 [Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)] (예를 들어, 임상 실험에 사용된 항혈관신생제를 열거한 표 1)을 참조한다.
"개체", "대상체" 또는 "환자"는 척추동물이다. 특정 실시양태에서, 척추동물은 포유동물이다. 포유동물은 가축 (예를 들어, 소), 경주용 동물, 애완동물 (예를 들어, 고양이, 개 및 말), 영장류, 마우스 및 래트를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.
"유효량"은 원하는 치료 또는 예방 결과 달성에 필요한 용량에서 그러한 기간 동안 효과적인 양을 나타낸다.
본 발명의 물질/분자, 효능제 또는 길항제의 "치료 유효량"은 개체의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에게서 목적하는 반응을 유도시킬 수 있는 본 발명의 물질/분자, 효능제 또는 길항제의 능력과 같은 요인들에 따라서 다양할 수 있다. 또한 치료 유효량은 물질/분자, 효능제 또는 길항제의 치료적으로 이로운 효과가 임의의 독성 또는 해로운 효과를 능가하는 양이다. "예방 유효량"은 원하는 예방 결과 달성에 필요한 용량 및 그러한 기간 동안 효과적인 양을 나타낸다. 반드시는 아니지만, 일반적으로 예방 용량은 질환 발생 전에 또는 질환의 초기 단계에 대상체에 사용되기 때문에, 예방 유효량은 치료 유효량 미만일 것이다.
본원에서 사용된 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 저해하고/하거나 세포의 파괴를 야기하는 물질을 나타낸다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제, 예를 들어 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포사이드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 기타 인터칼레이팅제, 효소 및 그의 단편 예컨대 뉴클레오용해성(nucleolytic) 효소, 항생제, 및 박테리아, 진균류, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소 (이의 단편 및/또는 변이체 포함) 또는 소분자 독소와 같은 독소, 및 하기에 개시되는 다양한 항종양 또는 항암 작용제를 포함하도록 의도된다. 다른 세포독성제는 하기 기재되어 있다. 종양치사제는 종양 세포의 파괴를 야기한다.
"독소"는 세포의 성장 또는 증식에 해로운 영향을 미칠 수 있는 임의의 물질이다.
"화학요법제"는 암 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예에는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 시클로스포스파미드 (시톡산(CYTOXAN)®); 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메트우레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민, 예를 들어 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸로멜라민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로칸나비놀 (드로나비놀, 마리놀(MARINOL)®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜히친; 베툴린산; 캄프토테신 (예를 들어, 합성 유사체 토포테칸 (하이캄틴(HYCAMTIN)®), CPT-11 (이리노테칸, 캄프토사르(CAMPTOSAR)®), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴 및 9-아미노캄프토테신); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (예를 들어, 그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토파이신 (특히 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신 (예를 들어, 합성 유사체인 KW-2189 및 CB1-TM1); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로소우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라니무스틴; 항생제, 예컨대 에네디인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 오메가I1 (예를 들어, 문헌 [Nicolaou et al., Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)] 참조); CDP323, 경구 알파-4 인테그린 억제제; 다이네미신, 예를 들어 다이네미신 A; 에스페라미신; 및 또한 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색단백질 에네디인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (예를 들어, 아드리아마이신(ADRIAMYCIN)®, 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 독소루비신 HCl 리포좀 주입물 (독실(DOXIL)®), 리포좀 독소루비신 TLC D-99 (미오세트(MYOCET)®), PEG화 리포좀 독소루비신 (캘릭스(CAELYX)®) 및 데옥시독소루비신), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포르피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물, 예컨대 메토트렉세이트, 겜시타빈 (겜자르(GEMZAR)®), 테가푸르 (우프토랄(UFTORAL)®), 카페시타빈 (크셀로다(XELODA)®), 에포틸론, 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스톨락톤; 항-부신제, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충물, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK® 폴리사카라이드 복합체 (제이에이치에스 내추럴 프로덕츠(JHS Natural Products), 오레곤주 유진 소재); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2'-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안귀딘); 우레탄; 빈데신 (엘디신(ELDISINE)®, 필데신(FILDESIN)®); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 (탁솔(TAXOL)®), 파클리탁셀의 알부민-조작 나노입자 제제 (아브락산(ABRAXANE)™), 및 도세탁셀 (탁소테레(TAXOTERE)®); 클로란부실; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 작용제, 예컨대 시스플라틴, 옥살리플라틴 (예를 들어, 엘록사틴(ELOXATIN)®), 및 카르보플라틴; 튜불린 중합으로 미세소관이 형성되는 것을 저해하는 빈카, 예를 들어 빈블라스틴 (벨반(VELBAN)®), 빈크리스틴 (온코빈(ONCOVIN)®), 빈데신 (엘디신®, 필데신®), 및 비노렐빈 (나벨빈(NAVELBIN)®); 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 류코보린; 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예컨대 레티노산, 예를 들어 벡사로텐 (타르그레틴(TARGRETIN)®); 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트 (예를 들어, 보네포스(BONEFOS)® 또는 오스탁(OSTAC)®), 에티드로네이트 (디드로칼(DIDROCAL)®), NE-58095, 졸레드론산/졸레드로네이트 (조메타(ZOMETA)®), 알렌드로네이트 (포사막스(FOSAMAX)®), 파미드로네이트 (아레디아(AREDIA)®), 틸루드로네이트 (스켈리드(SKELID)®), 또는 리세드로네이트 (악토넬(ACTONEL)®); 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 이상 세포 증식에 연루된 신호전달 경로 중의 유전자의 발현을 억제하는 것, 예를 들어 PKC-알파, Raf, H-Ras, 및 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R); 백신, 예컨대 테라토프(THERATOPE)® 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들어 알로벡틴(ALLOVECTIN)® 백신, 류벡틴(LEUVECTIN)® 백신, 및 박시드(VAXID)® 백신; 토포이소머라제 1 억제제 (예를 들어, 루르토테칸(LURTOTECAN)®); rmRH (예를 들어, 아바렐릭스(ABARELIX)®); BAY439006 (소라페닙; 바이엘(Bayer)); SU-11248 (수니티닙, 수텐트®, 화이자); 페리포신, COX-2 억제제 (예를 들어, 셀레콕시브 또는 에토리콕시브), 프로테오솜 억제제 (예를 들어, PS341); 보르테조밉 (벨케이드(VELCADE)®); CCI-779; 티피파르닙 (R 11577); 오라페닙, ABT510; Bcl-2 억제제, 예컨대 올리메르센 나트륨 (게나센스(GENASENSE)®); 픽산트론; EGFR 억제제 (이하 정의 참조); 티로신 키나제 억제제 (이하 정의 참조); 세린-트레오닌 키나제 억제제, 예컨대 라파마이신 (시롤리무스, 라파뮨(RAPAMUNE)®); 파르네실트랜스퍼라제 억제제, 예컨대 로나파르닙 (SCH 6636, 사라사르(SARASAR)™); 및 상기한 것 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 및 또한 상기한 것 중 2종 이상의 조합물, 예컨대 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 조합 요법에 대한 약어인 CHOP; 및 5-FU 및 류코보린과 조합된 옥살리플라틴 (엘록사틴™)을 사용한 치료법에 대한 약자인 FOLFOX가 포함된다.
본원에 정의된 바와 같은 화학요법제는 암의 성장을 촉진할 수 있는 호르몬의 효과를 조절, 감소, 차단 또는 억제하는 작용을 하는 "항-호르몬제" 또는 "내분비 치료제"를 포함한다. 이들은 혼합된 효능제/길항제 프로파일을 갖는 항에스트로겐, 예를 들어 타목시펜 (놀바덱스(NOLVADEX)®), 4-히드록시타목시펜, 토레미펜 (파레스톤(FARESTON)®), 이독시펜, 드롤록시펜, 랄록시펜 (에비스타(EVISTA)®), 트리옥시펜, 케옥시펜, 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절자 (SERM), 예컨대 SERM3; 효능제 특성을 갖지 않는 순수한 항에스트로겐, 예컨대 풀베스트란트 (파슬로덱스(FASLODEX)®) 및 EM800 (이같은 작용제는 에스트로겐 수용체 (ER) 이량체화를 차단하고/거나, DNA 결합을 억제하고/거나, ER 턴오버를 증가시키고/거나 ER 수준을 억제할 수 있음); 아로마타제 억제제, 예를 들어 스테로이드성 아로마타제 억제제, 예컨대 포르메스탄 및 엑세메스탄 (아로마신(AROMASIN)®), 및 비스테로이드성 아로마타제 억제제, 예컨대 아나스트라졸 (아리미덱스(ARIMIDEX)®), 레트로졸 (페마라(FEMARA)®) 및 아미노글루테티미드, 및 기타 아로마타제 억제제, 예를 들어 보로졸 (리비소르(RIVISOR)®), 메게스트롤 아세테이트 (메가세(MEGASE)®), 파드로졸 및 4(5)-이미다졸; 황체화 호르몬-방출 호르몬 효능제, 예를 들어 류프롤리드 (루프론(LUPRON)® 및 엘리가르드(ELIGARD)®), 고세렐린, 부세렐린 및 트립테렐린; 성 스테로이드, 예를 들어 프로게스틴, 예컨대 메게스트롤 아세테이트 및 메드록시프로게스트론 아세테이트, 에스트로겐, 예컨대 디에틸스틸베스트롤 및 프레마린, 및 안드로겐/레티노이드, 예컨대 플루옥시메스테론, 모든 트랜스레티온산 및 펜레티니드; 오나프리스톤; 항프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향 조절제 (ERD); 항안드로겐, 예컨대 플루타미드, 닐루타미드 및 비칼루타미드; 및 상기한 것 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 및 또한 상기한 것 중 2 종 이상의 조합물을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아닌 호르몬 그 자체일 수 있다.
본원에서 사용되는 "성장 억제제"는 시험관내 또는 생체내에서 세포 (예컨대 EGFL7을 발현하는 세포)의 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 따라서, 성장 억제제는 S기의 세포 (예컨대 EGFL7을 발현하는 세포)의 백분율을 유의하게 감소시키는 것일 수 있다. 성장 억제제의 예는 세포 주기 진행을 (S기 이외의 다른 단계에) 차단하는 작용제, 예컨대 G1 정지 및 M기 정지를 유도하는 작용제를 포함한다. 통상적인 M기 차단제는 빈카 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산 및 토포이소머라제 II 억제제, 예컨대 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신을 포함한다. G1을 정지시키는 작용제, 예를 들어 DNA 알킬화제, 예컨대 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 ara-C는 S기 정지로까지 이어질 수도 있다. 추가의 정보는 문헌 [Mendelsohn and Israel, eds., The Molecular Basis of Cancer, Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al., (W.B. Saunders, Philadelphia, 1995)]의, 예를 들어 p. 13에서 찾아볼 수 있다. 탁산 (파클리탁셀 및 도세탁셀)은 둘 다 주목에서 유래된 항암 약물이다. 유럽형 주목에서 유래된 도세탁셀 (탁소테레®, 론-프랑 로러(Rhone-Poulenc Rorer))은 파클리탁셀 (탁솔®, 브리스톨-마이어스 스퀴브(Bristol-Myers Squibb))의 반합성 유사체이다. 파클리탁셀 및 도세탁셀은 튜불린 이량체로부터의 미세소관 어셈블리를 촉진하고, 탈중합을 방지함으로써 미세소관을 안정화시켜서 세포에서의 유사분열 억제를 야기한다.
"독소루비신"은 안트라시클린 항생제이다. 독소루비신의 완전한 화학명은 (8S-시스)-10-[(3-아미노-2,3,6-트리데옥시-α-L-릭소-헥사피라노실)옥시]-7,8,9,10-테트라히드로-6,8,11-트리히드록시-8-(히드록시아세틸)-1-메톡시-5,12-나프타센디온이다.
용어 "Fc 영역-포함 폴리펩티드"는 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드, 예를 들어 항체 또는 이뮤노어드헤신 (하기 정의 참고)을 나타낸다. Fc 영역의 C-말단 리신 (EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 447)이, 예를 들어, 폴리펩티드의 정제 동안, 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 재조합에 의해 조작함으로써 제거될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 Fc 영역이 있는 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 K447이 있는 폴리펩티드, 모든 K447이 제거된 폴리펩티드, 또는 K447 잔기가 있는 폴리펩티드와 K447 잔기가 없는 폴리펩티드의 혼합물을 포함할 수 있다.
본 명세서 및 청구항을 통해, "포함하다"란 단어, 또는 "포함하는" 또는 "포함된다"와 같은 변형은 제시된 정수 또는 정수들의 군을 포함하고자 하나, 여타 임의의 정수 또는 정수들의 군을 배제하려는 것은 아닌 것으로 이해될 것이다.
HAMA 반응의 감소 또는 부재를 나타내는 변이체 항체의 생성
HAMA 반응의 감소 또는 제거는 적절한 치료제의 임상 개발의 중요한 측면이다. 예를 들어, 문헌 [Khaxzaeli et al., J. Natl. Cancer Inst. (1988), 80:937]; [Jaffers et al., Transplantation (1986), 41:572]; [Shawler et al., J. Immunol. (1985), 135:1530]; [Sears et al., J. Biol. Response Mod. (1984), 3:138]; [Miller et al., Blood (1983), 62:988]; [Hakimi et al., J. Immunol. (1991), 147:1352]; [Reichmann et al., Nature (1988), 332:323]; [Junghans et al., Cancer Res. (1990), 50:1495]을 참조한다. 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명은 HAMA 반응이 저하 또는 제거되도록 인간화되는 항체를 제공한다. 이들 항체의 변이체는 당해 분야에 공지된 통상적인 방법 (이들 중 몇몇이 다음에 추가로 기재된다)을 이용하여 추가로 수득할 수 있다.
예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 항체로부터의 아미노산 서열은 프레임워크 및/또는 초가변 서열(들)의 다양화를 위한 출발 (모) 서열로서 제공될 수 있다. 출발 초가변 서열과 연결되도록 선별된 프레임워크 서열은 본원에서 수용자 인간 프레임워크로서 지칭된다. 수용자 인간 프레임워크가 인간 이뮤노글로불린 (그의 VL 및/또는 VH 영역)으로부터의 것이거나 이로부터 유래되긴 하지만, 바람직하게 수용자 인간 프레임워크는 인간 컨센서스 프레임워크 서열로부터이거나 이로부터 유래되는데, 프레임워크 그 자체는 인간 환자에게서 면역원성을 최소한도로 나타내거나 전혀 나타내지 않은 것으로 입증되었다.
수용자가 인간 이뮤노글로불린으로부터 유래되는 경우에는, 공여자 프레임워크 서열을 인간 프레임워크 서열 컬렉션 내의 각종 인간 프레임워크 서열과 정렬시킴으로서 공여자 프레임워크 서열에 대한 그의 상동성을 기준으로 하여 선별되는 인간 프레임워크 서열을 임의로 선별하고, 수용자로서 가장 상동성인 프레임워크 서열을 선별할 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에서의 인간 컨센서스 프레임워크는 VH 하위군 III 및/또는 VL 카파 하위군 I 컨센서스 프레임워크 서열로부터의 것이거나 이로부터 유래된다.
따라서, VH 수용자 인간 프레임워크는 다음 프레임워크 서열 중 1, 2, 3개 또는 전부를 포함할 수 있다:
Figure pct00042
를 포함하는 FR1
Figure pct00043
를 포함하는 FR2,
Figure pct00044
(여기서 X1은 A 또는 R이고, X2는 T 또는 N이고, X3은 A 또는 L)를 포함하는 FR3,
Figure pct00045
를 포함하는 FR4.
한 실시양태에서, VH 수용자 인간 프레임워크는 다음 프레임워크 서열 중 1, 2, 3개 또는 전부를 포함한다:
Figure pct00046
를 포함하는 FR1,
Figure pct00047
를 포함하는 FR2,
Figure pct00048
Figure pct00049
, 또는
Figure pct00050
를 포함하는 FR3,
Figure pct00051
를 포함하는 FR4.
VL 수용자 인간 프레임워크는 다음 프레임워크 서열 중 1, 2, 3개 또는 전부를 포함할 수 있다:
Figure pct00052
를 포함하는 FR1,
Figure pct00053
를 포함하는 FR2,
Figure pct00054
를 포함하는 FR3,
Figure pct00055
를 포함하는 FR4.
수용자가 인간 이뮤노글로불린으로부터 유래되든지 아니면 인간 컨센서스 프레임워크로부터 유래되든지 간에, 선별된 인간 프레임워크 서열과 서열 면에서 동일할 수 있긴 하지만, 본 발명은 수용자 서열이 인간 이뮤노글로불린 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열과 비교해서 기존에 아미노산 치환을 포함할 수 있다는 것을 고려하고 있다. 이들 기존의 치환은 바람직하게 최소한인데, 통상적으로 인간 이뮤노글로불린 서열 또는 컨센서스 프레임워크 서열과 비교해서 단지 4개, 3개, 2개 또는 1개 아미노산 차이 만을 나타낸다.
비-인간 항체의 초가변 영역 잔기를 VL 및/또는 VH 수용자 인간 프레임워크 내로 혼입한다. 예를 들어, 카바트 CDR 잔기, 코티아 초가변 루프 잔기, Abm 잔기 및/또는 접촉 잔기에 상응하는 잔기를 혼입시킬 수 있다. 임의로, 하기와 같은 확장된 초가변 영역 잔기가 혼입된다: 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3), 26-35 (H1), 50-65 또는 49-65 (H2) 및 93-102, 94-102, 또는 95-102 (H3).
초가변 영역 잔기의 "혼입"이 본원에 논의되어 있긴 하지만, 이는 각종 방식으로 달성할 수 있다는 것을 인지해야 하는데, 예를 들어 목적하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산은 마우스 가변 도메인 서열을 코딩하는 핵산을 돌연변이시켜 그의 프레임워크 잔기가 수용자 인간 프레임워크 잔기로 변화하도록 함으로써 생성시킬 수 있거나, 인간 가변 도메인 서열을 코딩하는 핵산을 돌연변이시켜 초가변 도메인 잔기가 비-인간 잔기로 변화하도록 함으로써 생성시킬 수 있거나, 또는 목적하는 서열을 코딩하는 핵산을 합성하는 등으로 생성시킬 수 있다.
본원의 실시예에서, 초가변 영역-그라프팅된 변이체는 각 초가변 영역에 대한 별개의 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 인간 수용체 서열을 코딩하는 핵산을 쿤켈 (Kunkel) 돌연변이 유발시킴으로써 생성시켰다. 문헌 [Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987)]. 적당한 초가변 영역-항원 상호 작용을 교정하고 재정립하기 위한 통상적인 기술을 사용하여, 적당한 변화를 프레임워크 및/또는 초가변 영역 내에 도입시킬 수 있다.
파지(미드) 디스플레이 (본원에서 일부 정황에서는 파지 디스플레이로 또한 지칭됨)가 서열 무작위화에 의해 생성된 라이브러리에서 다수의 상이한 잠재적인 변이체 항체를 생성시키고 스크리닝하기 위한 편리하고 신속한 방법으로 사용될 수 있다. 그러나, 변경된 항체를 제조하고 스크리닝하기 위한 또 다른 방법들이 당업자에게 이용가능하다.
파지(미드) 디스플레이 기술은 리간드, 예를 들어 항원에 결합하는 신규한 단백질을 생성하고 선택하기 위한 강력한 도구를 제공하였다. 파지(미드) 디스플레이 기술을 사용함으로써, 표적 분자에 높은 친화도로 결합하는 서열에 대해 신속하게 분류될 수 있는 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 생성할 수 있다. 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 바이러스 코트 단백질, 예컨대 유전자 III 단백질 또는 유전자 VIII 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 일반적으로 융합된다. 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열이 유전자 III 단백질의 일부를 코딩하는 핵산 서열에 융합된 1가 파지미드 디스플레이 시스템이 개발되었다. (문헌 [Bass, S., Proteins, 8:309 (1990)]; [Lowman and Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3:205 (1991)]). 1가 파지미드 디스플레이 시스템에서는, 유전자 융합체가 저 수준으로 발현되고, 야생형 유전자 III 단백질이 또한 발현되어 입자의 감염성이 유지된다. 펩티드 라이브러리의 생성 방법 및 이들 라이브러리의 스크리닝 방법이 많은 특허에 개시되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,723,286, 미국 특허 번호 5,432,018, 미국 특허 번호 5,580,717, 미국 특허 번호 5,427,908 및 미국 특허 번호 5,498,530).
항체 또는 항원 결합 폴리펩티드의 라이브러리를 수 많은 방식으로 제조하였는데, 이에는 무작위 DNA 서열을 삽입함으로써 단일 유전자를 변경시키는 방법 또는 관련 유전자 패밀리를 클로닝하는 방법이 포함된다. 파지(미드) 디스플레이를 이용하여 항체 또는 항원 결합 단편을 디스플레이하는 방법이 미국 특허 번호 5,750,373, 5,733,743, 5,837,242, 5,969,108, 6,172,197, 5,580,717, 및 5,658,727에 기재되어 있다. 이어서, 상기 라이브리러리를 대상으로 하여 목적하는 특징을 지닌 항체 또는 항원 결합성 단백질의 발현에 관하여 스크리닝한다.
선택된 아미노산을 주형 핵산으로 치환시키는 방법은 당해 분야에 널리 정립되어 있는데, 이들 중의 몇 가지가 본원에 기재되어 있다. 예를 들어, 쿤켈 방법을 사용하여 초가변 영역 잔기를 치환시킬 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987)]을 참조한다.
올리고뉴클레오티드의 서열에는 변경시키고자 하는 초가변 영역 잔기에 대해 설계된 코돈 세트 중의 하나 이상이 포함된다. 코돈 세트는 원하는 변이체 아미노산을 코딩하는데 사용된 여러 뉴클레오티드 트리플릿(triplet) 서열들의 세트이다. 코돈 세트는 IUB 코드에 따라 아래 나타낸 바와 같이 특정 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드의 등몰 혼합물을 지정하기 위해 기호를 사용하여 나타낼 수 있다.
IUB 코드
G 구아닌
A 아데닌
T 티민
C 시토신
R (A 또는 G)
Y (C 또는 T)
M (A 또는 C)
K (G 또는 T)
S (C 또는 G)
W (A 또는 T)
H (A 또는 C 또는 T)
B (C 또는 G 또는 T)
V (A 또는 C 또는 G)
D (A 또는 G 또는 T)
N (A 또는 C 또는 G 또는 T)
예를 들어, 코돈 세트 DVK에서, D는 뉴클레오티드 A 또는 G 또는 T일 수 있고, V는 A 또는 G 또는 C일 수 있으며, K는 G 또는 T일 수 있다. 이러한 코돈 세트는 18개의 상이한 코돈을 나타낼 수 있고, 아미노산 Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly, 및 Cys를 코딩할 수 있다.
표준 방법을 사용하여 올리고뉴클레오티드 또는 프라이머 세트를 합성할 수 있다. 코돈 세트에 의해 제공되는 뉴클레오티드 트리플릿의 모든 가능한 조합을 나타내고, 목적하는 군의 아미노산을 코딩하는 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드의 세트는 예를 들어 고체상 합성에 의해 합성할 수 있다. 특정 위치에 선택된 뉴클레오티드 "퇴보"가 있는 올리고뉴클레오티드의 합성은 당업계에 주지되어 있다. 특정 코돈 세트를 갖는 뉴클레오티드들의 이같은 세트는 시판되는 핵산 합성기 (예를 들어, 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems), 캘리포니아주 포스터 시티 소재로부터 입수가능)를 사용하여 합성될 수 있거나, 또는 상업적으로 수득될 수 있다 (예를 들어, 라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 메릴랜드주 록빌 소재로부터 수득). 따라서, 특정 코돈 세트를 갖는 합성된 올리고뉴클레오티드 세트는 전형적으로 상이한 서열을 갖는 복수개의 올리고뉴클레오티드를 포함할 것이며, 그 차이는 전체 서열 내 코돈 세트에 의해 확립된다. 본 발명에 따라 사용될 때 올리고뉴클레오티드는 가변 도메인 핵산 주형에 혼성화를 허용하는 서열을 갖고, 또한 클로닝 목적을 위한 제한 효소 부위를 포함할 수 있다.
한 방법에서, 변이체 아미노산을 코딩하는 핵산 서열이 올리고뉴클레오티드-매개 돌연변이유발에 의해 생성될 수 있다. 상기 기술은 문헌 [Zoller et al., Nucleic Acids Res. 10:6487-6504(1987)]에 기재된 바와 같이 당업계에 잘 공지되어 있다. 간략하게, 변이체 아미노산을 코딩하는 핵산 서열은 목적하는 코돈 세트를 코딩하는 올리고뉴클레오티드 세트를 DNA 주형에 혼성화함으로써 생성되고, 여기서 주형은 가변 영역 핵산 주형 서열을 함유하는 단일 가닥 형태의 플라스미드이다. 혼성화 후, DNA 폴리머라제를 사용하여 주형의 전체적인 제2 상보적 가닥이 합성되고, 상기 가닥에는 따라서 올리고뉴크레오티드 프라이머가 혼입될 것이고, 올리고뉴클레오티드 세트에 의해 제공된 코돈 세트를 함유할 것이다.
일반적으로, 길이가 적어도 25개의 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드가 사용된다. 최적의 올리고뉴클레오티드에는 돌연변이(들)를 코딩하는 뉴클레오디드(들)의 어느 한쪽 측면 상의 주형에 대해 완전히 상보적인 12개 내지 15개의 뉴클레오티드가 있을 것이다. 이는 올리고뉴클레오티드가 단일 가닥 DNA 주형 분자에 정확하게 혼성화될 것을 확실하게 한다. 올리고뉴클레오티드는 문헌 [Crea et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 75:5765 (1978)]에 기재된 바와 같이 당업계에 공지된 기술을 사용하여 쉽게 합성된다.
DNA 주형은 박테리오파지 M13 벡터 (시판용 M13mp18 및 M13mp19 벡터가 적합함)로부터 유래된 벡터 또는 문헌 [Viera et al., Meth. Enzymol., 153:3 (1987)]에 의해 기재된 바와 같은 단일 가닥 파지 복제 기점을 함유하는 벡터에 의해 생성된다. 따라서, 돌연변이시킬 DNA를 단일 가닥 주형을 생성하기 위해 상기 벡터 중 하나에 삽입시킬 수 있다. 단일 가닥 주형의 생산은 상기 문헌 [Sambrook et al.]의 섹션 4.21-4.41에 기재되어 있다.
천연 DNA 서열을 변경시키기 위해, 올리고뉴클레오티드를 적절한 혼성화 조건 하에 단일 가닥 주형에 혼성화시킨다. 이어서, DNA 중합 효소, 보통 T7 DNA 폴리머라제 또는 DNA 폴리머라제 I의 클레나우(Klenow) 단편을 첨가하여, 합성을 위한 프라이머로서 올리고뉴클레오티드를 사용하여 주형의 상보성 가닥을 합성한다. 1개의 DNA의 가닥은 유전자 1의 돌연변이된 형태를 코딩하고, 다른 가닥 (원래의 주형)은 유전자 1의 천연의 변경되지 않은 서열을 코딩하도록 헤테로듀플렉스(heteroduplex) 분자를 형성한다. 그후, 이러한 헤테로듀플렉스 분자를 적절한 숙주 세포, 일반적으로는 원핵세포, 예컨대 이. 콜라이 JM101 내로 형질전환시킨다. 세포를 성장시킨 후 아가로스 플레이트 상에 플레이팅하고, 돌연변이된 DNA를 함유하는 박테리아 콜로니를 확인하기 위해 32-포스페이트로 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 스크리닝한다.
플라스미드의 양쪽 가닥 모두가 돌연변이(들)를 함유하는 호모듀플렉스(homoduplex) 분자가 생성되도록 바로 위에서 기술된 방법이 변형될 수 있다. 변형은 하기와 같다: 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 상기 기재된 바와 같이 단일 가닥 주형에 어닐링시킨다. 데옥시리보아데노신 (dATP), 데옥시리보구아노신 (dGTP), 및 데옥시리보티미딘 (dTT)의 3가지 데옥시리보뉴클레오티드의 혼합물을 dCTP-(aS)로 불리는 변형된 티오데옥시리보시토신 (아머샴(Amersham)으로부터 수득될 수 있음)과 조합한다. 이러한 혼합물을 주형-올리고뉴클레오티드 복합체에 첨가한다. 이러한 혼합물에 DNA 폴리머라제를 첨가하면, 돌연변이된 염기를 제외하고 주형과 동일한 DNA의 가닥이 생성된다. 또한, DNA의 이러한 새로운 가닥은 dCTP 대신 dCTP-(aS)를 함유할 것이고, 이는 제한 엔도뉴클레아제 소화로부터 DNA를 보호하는 작용을 한다. 이중 가닥 헤테로듀플렉스의 주형 가닥을 적절한 제한 효소로 닉을 형성한 후, 돌연변이유발될 부위(들)를 함유하는 영역 뒤에서 주형 가닥을 ExoIII 뉴클레아제 또는 또 다른 적합한 뉴클레아제로 소화시킬 수 있다. 그후, 반응을 정지시켜, 부분적으로만 단일 가닥인 분자를 남긴다. 그후, 4가지 모두의 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, ATP, 및 DNA 리가제의 존재 하에 DNA 폴리머라제를 사용하여 완전한 이중 가닥 DNA 호모듀플렉스가 형성된다. 그후, 이러한 호모듀플렉스 분자를 적절한 숙주 세포 내로 형질전환시킨다.
앞서 나타낸 바와 같이, 올리고뉴클레오티드 세트의 서열은 주형 핵산에 혼성화하기에 충분한 길이이고, 또한 반드시는 아니지만 제한 부위를 함유할 수 있다. 문헌 [Viera et al., Meth. Enzymol., 153:3 (1987)]에 기술된 바와 같이 단일 가닥 파지 복제 기원을 함유하는 벡터 또는 박테리오파지 M13 벡터로부터 유래된 벡터에 의해 DNA 주형이 생성될 수 있다. 따라서, 단일 가닥 주형을 생성시키기 위해 돌연변이될 DNA가 이러한 벡터들 중 하나 내로 삽입되어야 한다. 단일 가닥 주형의 생산이 [Sambrook et al., 상기 문헌]의 섹션 4.21-4.41에 기술되어 있다.
다른 방법에 따르면, 각각의 세트가 상이한 서열을 갖는 다수의 올리고뉴클레오티드를 갖는 상류 및 하류 올리고뉴클레오티드 세트를 제공함으로써 라이브러리를 생성시킬 수 있고, 상기 상이한 서열은 올리고뉴클레오티드의 서열 내에 제공된 코돈 세트에 의해 확립된다. 상류 및 하류 올리고뉴클레오티드 세트를 가변 도메인 주형 핵산 서열과 함께 폴리머라제 연쇄 반응에 사용하여 PCR 생성물의 "라이브러리"를 생성시킬 수 있다. 확립된 분자 생물학 기술을 사용하여 다른 관련된 또는 관련되지 않은 핵산 서열, 예를 들어, 바이러스 코트 단백질 및 이량체화 도메인과 융합될 수 있기 때문에, PCR 생성물은 "핵산 카세트"로 지칭될 수 있다.
PCR 프라이머의 서열에는 초가변 영역 내의 용매 접근 가능하고 고도로 다양한 위치에 대해 설계된 코돈 세트 중의 하나 이상이 포함된다. 상기 기술된 바와 같이, 코돈 세트는 원하는 변이체 아미노산을 코딩하는데 사용된 여러 뉴클레오티드 트리플릿 서열들의 세트이다.
적당한 스크리닝/선별 단계를 통하여 선별된 바와 같은, 목적하는 기준을 충족시켜 주는 항체 선별제는 표준 재조합 기술을 사용하여 단리 및 클로닝할 수 있다.
항체 단편
본 발명은 항체 단편을 포함한다. 항체 단편은 통상의 수단, 예컨대 효소 소화에 의해, 또는 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다. 특정 상황에서는, 온전한 항체가 아닌 항체 단편을 사용하는 것이 유리하다. 단편의 크기가 작을수록 제거가 신속하고, 고형 종양에 대한 접근을 개선시킬 수 있다. 특정 항체 단편의 검토를 위해서는 문헌 [Hudson et al., (2003) Nat. Med. 9:129-134]을 참조한다.
항체 단편 생성을 위한 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 무손상 항체의 단백질분해적 소화를 통해 유래되었다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)]; 및 [Brennan et al., Science, 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 현재 이러한 단편들이 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생산될 수 있다. Fab, Fv 및 ScFv 항체 단편은 모두가 이. 콜라이에서 발현되어 분비될 수 있고, 이에 의해 다량의 이들 단편을 쉽게 생성할 수 있다. 항체 단편은 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 별법적으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다 (문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]). 또 다른 접근법에 따라, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리될 수 있다. 샐비지(salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하는, 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')2 단편이 미국 특허 번호 5,869,046에 기재되어 있다. 항체 단편의 생산을 위한 또 다른 기술들이 당업자에게 명백할 것이다. 특정 실시양태에서, 항체는 단일쇄 Fv 단편 (scFv)이다. WO 93/16185; 미국 특허 번호 5,571,894; 및 5,587,458를 참조한다. Fv 및 scFv는 불변 영역이 결여된 무손상 결합 부위를 갖는 유일한 종이고; 따라서 생체내 사용 동안 비특이적 결합의 감소에 적합할 수 있다. scFv 융합 단백질은 scFv의 아미노 또는 카르복시 말단에 이펙터 단백질의 융합체를 생성시키도록 구축될 수 있다. 문헌 [Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, 상기 문헌]을 참조한다. 예를 들어, 항체 단편은 또한 예를 들어 미국 특허 번호 5,641,870에 기재된 바와 같은 "선형 항체"일 수 있다. 이러한 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
인간화 항체
본 발명은 인간화 항체를 포함한다. 비-인간 항체를 인간화하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 인간화 항체에는 비-인간 공급원으로부터 유래된 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입되어 있을 수 있다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "도입" 잔기라 지칭되고, 전형적으로는 "도입" 가변 도메인으로부터의 것이다. 인간화는 인간 항체의 상응하는 서열을 초가변 영역 서열으로 치환하여 본질적으로 윈터(Winter) 및 동료들의 방법 (문헌 [Jones et al., (1986) Nature 321:522-525]; [Riechmann et al., (1988) Nature 332:323-327]; [Verhoeyen et al., (1988) Science 239:1534-1536])을 따라 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 적은 부분이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체 (미국 특허 번호 4,816,567)이다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 초가변 영역 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다.
인간화 항체의 제조에 사용될 경쇄 및 중쇄 모두의 인간 가변 도메인의 선택은 항원성을 감소시키는데 중요할 수 있다. 소위 "최적 맞춤(best-fit)" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인 서열을 공지의 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 이후, 설치류와 가장 근접한 인간 서열을 인간화 항체를 위한 인간 프레임워크로서 수용한다. 예를 들어, 문헌 [Sims et al., (1993) J. Immunol. 151:2296]; [Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol. 196:901]을 참조한다. 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정 프레임워크를 이용한다. 동일한 프레임워크가 여러가지 상이한 인간화 항체를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Carter et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285]; [Presta et al., (1993) J. Immunol., 151:2623]을 참조한다.
추가로, 항원에 대한 높은 친화도 및 기타 유리한 생물학적 특성을 보유하도록 항체를 인간화하는 것이 일반적으로 바람직하다. 이러한 목적을 달성하기 위해서, 한 방법에 따라, 인간화 항체는 모 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하는 모 서열 및 다양한 개념적 인간화 생성물의 분석 공정에 의해 제조된다. 3차원 이뮤노글로불린 모델은 통상적으로 이용가능하고, 당업자에게 익숙하다. 선택된 후보 이뮤노글로불린 서열의 가능한 3차원 형태 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이러한 디스플레이를 조사하면 후보 이뮤노글로불린 서열의 기능에 있어서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 후보 이뮤노글로불린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석이 가능하다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 수용자 서열 및 도입 서열로부터 선택 및 조합되어 원하는 항체 특징, 예를 들어 표적 항원(들)에 대한 친화도 증가를 달성할 수 있다. 일반적으로, 항원 결합에 대한 영향에는 초가변 영역 잔기가 직접적이고 가장 실질적으로 관여한다.
인간 항체
본 발명의 인간 항체는 인간-유래된 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선별된 Fv 클론 가변 도메인 서열(들)을 상기 언급된 바와 같은 공지된 인간 불변 도메인 서열(들)과 합함으로써 구축할 수 있다. 별법적으로, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법에 의해 만들 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가, 예를 들어 문헌 [Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984)]; [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc, New York, 1987)]; 및 [Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)]에 기재되어 있다.
면역화시에 내인성 이뮤노글로불린의 생성 없이 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생성할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)을 생성하는 것이 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 배선 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자를 동형접합 결실시키면 내인성 항체의 생산이 완전히 억제된다는 것이 기재되어 있다. 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자 어레이를 이같은 배선 돌연변이 마우스에게 전달하면, 항원 접종 시 인간 항체가 생산될 것이다. 예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993)]; [Bruggermann et al., Year in Immunol., 7: 33 (1993)])을 참조한다.
유전자 셔플링은 또한 비-인간, 예를 들어 설치류 항체로부터 인간 항체를 유도하는데 사용될 수 있고, 이때 인간 항체는 출발 비-인간 항체와 유사한 친화도 및 특이성을 갖는다. "에피토프 임프린팅(imprinting)"이라고도 지칭되는 이러한 방법에 따라, 본원에 기재된 바와 같은 파지 디스플레이 기술에 의해 수득된 비-인간 항체 단편의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역이 인간 V 도메인 유전자의 레퍼토리로 대체되어 비-인간 쇄/인간 쇄 scFv 또는 Fab 키메라 집단을 생성시킨다. 항원에 의한 선별 결과로서, 인간 쇄가 1차 파지 디스플레이 클론에서 상응하는 비-인간 쇄의 제거시에 파괴된 항원 결합 부위를 복원한 비-인간 쇄/인간 쇄 키메라 scFv 또는 Fab가 단리되고, 즉, 에피토프가 인간 쇄 파트너의 선택을 좌우 (임프린팅)한다. 나머지 비-인간 쇄를 대체하기 위해 상기 과정을 반복하는 경우에 인간 항체가 수득된다 (1993년 4월 1일자로 공개된 PCT WO 93/06213 참조). HVR 그라프팅에 의한 비-인간 항체의 전통적인 인간화와는 달리, 이러한 기술은 비-인간 기원의 FR 또는 HVR 잔기가 없는 완전한 인간 항체를 제공한다.
이중특이적 항체
이중특이적 항체는 적어도 2종의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 인간 또는 인간화 항체이다. 특정 실시양태에서, 하나의 결합 특이성은 EGFL7에 대한 것이며, 나머지는 임의의 기타 다른 항원에 대한 것이다. 특정 실시양태에서, 다른 항원은 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 예를 들어 항체 베바시주맙 및 라니비주맙이 결합하는 에피토프이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 본 발명의 항체의 HVR 서열을 포함하는 제1 아암과 베바시주맙 또는 라니비주맙의 HVR 서열을 포함하는 제2 아암을 갖는다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 베바시주맙 또는 라니비주맙의 VH 및 VL 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 EGFL7의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 EGFL7을 발현하는 세포에 세포독성제를 위치시키는데 사용될 수 있다. 이들 항체는 EGFL7-결합 아암 및 세포독성제, 예컨대 사포린, 항-인터페론-α, 빈카 알칼로이드, 리신 A 쇄, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐에 결합하는 아암을 보유한다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')2 이중특이적 항체)으로 제조될 수 있다.
이중특이적 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생성은 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동 발현을 기초로 하고, 이때 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (문헌 [Milstein and Cuello, Nature, 305: 537 (1983)]). 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마(quadroma))는 10종의 상이한 항체 분자들의 잠재적인 혼합물을 생성하며, 이 중에서 오직 1종만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 통상적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 상기 정확한 분자의 정제는 다소 성가시고 생성 수율이 낮다. 유사한 절차가 1993년 5월 13일자로 공개된 WO 93/08829 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655 (1991)]에 개시되어 있다.
다른 접근법에 따라, 원하는 결합 특이성 (항체 항원 결합 부위)을 갖는 항체 가변 도메인을 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킨다. 융합은 예를 들어 힌지의 적어도 일부, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 도메인을 사용한다. 특정 실시양태에서, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 융합체의 적어도 하나에 존재한다. 이뮤노글로불린 중쇄 융합체 및 원하는 경우에는 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터 내로 삽입하고, 적합한 숙주 유기체 내로 공동형질감염시킨다. 이것은 구축에 사용된 3종의 폴리펩티드 쇄의 동일하지 않은 비율이 최적의 수율을 제공하는 실시양태에서 상기 3종의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조절하는데 있어서 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동일한 비율의 적어도 2종의 폴리펩티드 쇄의 발현으로 높은 수율이 수득되는 경우, 또는 비율이 특별한 유의성을 갖지 않는 경우, 2종 또는 모든 3종의 폴리펩티드 쇄에 대한 코딩 서열을 1개의 발현 벡터에 삽입할 수 있다.
이러한 접근법의 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 한쪽 아암 내에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄, 및 다른쪽 아암 내의 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성을 제공함)으로 구성된다. 이중특이적 분자의 절반에만 이뮤노글로불린 경쇄가 존재하는 것이 용이한 분리 방법을 제공하기 때문에, 이러한 비대칭 구조는 원치않는 이뮤노글로불린 쇄 조합물로부터 원하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 접근법은 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이중특이적 항체의 생성에 대한 추가의 세부사항에 대해서는 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]을 참조한다.
또 다른 접근법에 따라, 한 쌍의 항체 분자 사이의 계면을 조작하여 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 백분율을 최대화할 수 있다. 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이러한 방법에서, 1차 항체 분자의 계면으로부터 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄가 보다 큰 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 아미노산 측쇄 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 큰 측쇄(들)에 대한 동일하거나 유사한 크기의 보상 "공동(cavity)"이 2차 항체 분자의 계면에 생성된다. 이는 동종이량체와 같은 다른 원치않는 최종-생성물에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키는 메카니즘을 제공한다.
이중특이적 항체는 가교된 또는 "이종접합" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종접합체 내의 항체들 중 하나는 아비딘에 커플링되고, 다른 하나는 비오틴에 커플링될 수 있다. 이러한 항체들은, 예를 들어 원치않는 세포에 대한 면역계 세포의 표적화 (미국 특허 번호 4,676,980), 및 HIV 감염의 치료 (WO 91/00360, WO 92/00373, 및 EP 03089)를 위해서 제안되었다. 이종접합 항체는 임의의 편리한 가교 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 적합한 가교제가 당업계에 널리 공지되어 있고, 수많은 가교 기술과 함께 미국 특허 번호 4,676,980에 개시되어 있다.
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성시키는 기술이 또한 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 화학적 연결을 이용하여 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)]은 무손상 항체를 단백질 가수분해적으로 절단하여 F(ab')2 단편을 생성하는 절차를 기재한다. 이러한 단편을 디티올 착화제인 아비산나트륨의 존재 하에 환원시켜, 인접한 디티올들을 안정화시키고 분자간 디술피드 형성을 방지한다. 그 후 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 그 후 Fab'-TNB 유도체 중 하나를 메르캅토에틸아민으로의 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환시키고 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성시킨다. 생산된 이중특이적 항체를 효소의 선택적 고정화를 위한 작용제로서 사용할 수 있다.
최근의 진보는 이중특이적 항체를 형성하도록 화학적으로 커플링될 수 있는, 이. 콜라이로부터의 Fab'-SH 단편의 직접 회수를 용이하게 하였다. 문헌 [Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)]은 완전히 인간화된 이중특이적 항체 F(ab')2 분자의 생산을 기재한다. 각각의 Fab' 단편을 이. 콜라이로부터 따로 분비시키고, 이중특이적 항체를 형성하도록 시험관내 유도 화학 커플링 반응을 실시하였다. 이렇게 형성된 이중특이적 항체는 HER2 수용체를 과다발현하는 세포 및 정상적인 인간 T 세포에 결합할 수 있을 뿐만 아니라, 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 촉발할 수 있었다.
재조합 세포 배양물로부터 직접적으로 이중특이적 항체 단편을 제조 및 단리하기 위한 다양한 기술이 또한 기술되었다. 예를 들어, 류신 지퍼를 사용하여 이중특이적 항체가 생산되었다. 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드가 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 유전자 융합에 의해 연결되었다. 항체 동종이량체가 힌지 영역에서 환원되어 단량체가 형성된 후, 다시 산화되어 항체 이종이량체가 형성되었다. 이러한 방법은 항체 동종이량체의 생산에 또한 이용될 수 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편의 제조를 위한 대안적인 메카니즘을 제공한다. 상기 단편은 동일 쇄 상의 2개의 도메인 사이의 쌍 형성을 허용하기에는 지나치게 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 따라서, 한 단편의 VH 및 VL 도메인이 또 다른 단편의 상보적인 VL 및 VH 도메인과 쌍을 이루게 되어, 2개의 항원 결합 부위가 형성된다. 단일쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또 다른 전략이 또한 보고되었다. 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)]을 참조한다.
2가 초과의 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다. 문헌 [Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991)].
다가 항체
다가 항체는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 2가 항체보다 신속하게 내재화 (및/또는 이화)될 수 있다. 본 발명의 항체는 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 (예를 들어, 4가 항체) 다가 항체 (IgM 클래스 이외의 것)일 수 있고, 이는 항체의 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 핵산의 재조합 발현에 의해 쉽게 생성될 수 있다. 다가 항체는 이량체화 도메인 및 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이량체화 도메인은 Fc 영역 또는 힌지 영역을 포함한다 (또는 이것으로 이루어진다). 이러한 시나리오에서, 항체는 Fc 영역, 및 Fc 영역의 아미노 말단에 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 것이다. 특정 실시양태에서, 다가 항체는 3개 내지 약 8개의 항원 결합 부위를 포함한다 (또는 이것으로 이루어진다). 이러한 한 실시양태에서, 다가 항체는 4개의 항원 결합 부위를 포함한다 (또는 이것으로 이루어진다). 다가 항체는 적어도 하나의 폴리펩티드 쇄 (예를 들어, 2개의 폴리펩티드 쇄)를 포함하고, 여기서의 상기 폴리펩티드 쇄(들)는 2개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어 폴리펩티드 쇄(들)은 VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc (여기서, VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, Fc는 Fc 영역의 1개의 폴리펩티드 쇄이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩티드를 나타내고, n은 0 또는 1임)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 쇄(들)는 VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-Fc 영역 쇄; 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역 쇄를 포함할 수 있다. 본원에서의 다가 항체는 적어도 2개 (예를 들어, 4개)의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 본원에서의 다가 항체는 예를 들어 약 2개 내지 약 8개의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본원에서 고려되는 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 임의로 CL 도메인을 추가로 포함한다.
단일-도메인 항체
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 단일-도메인 항체이다. 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 단일 폴리펩티드 사슬이다. 특정 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (도만티스, 인크.(Domantis, Inc.), 매사추세츠주 왈탐 소재; 예를 들어, 미국 특허 번호 6,248,516 B1 참조). 한 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부로 이루어진다.
항체 변이체
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 항체의 아미노산 서열 변형(들)이 구현된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변경을 도입하거나 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 항체의 아미노산 서열 내 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 목적하는 특징을 갖는 최종 구축물이 생성되도록 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있다. 아미노산 변경은 서열이 제조되는 시점에 대상 항체 아미노산 서열에 도입될 수 있다.
돌연변이유발에 바람직한 위치인 항체의 특정 잔기 또는 영역을 확인하는데 유용한 방법은 문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이라 불린다. 여기서, 잔기 또는 표적 잔기들의 군이 확인되고 (예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대 arg, asp, his, lys 및 glu), 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체되어 아미노산과 항원과의 상호작용에 영향을 미친다. 그 후, 치환에 대해 기능적 감수성을 나타내는 아미노산 위치가 치환 부위에 또는 치환 부위에 대해 추가적인 또는 다른 변이체를 도입함으로써 정련된다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위는 미리 결정되지만, 돌연변이 그 자체의 성질을 미리 결정할 필요는 없다. 예를 들어, 주어진 부위에서의 돌연변이의 성능을 분석하기 위해, 표적 코돈 또는 영역에서 ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이유발을 수행하고, 발현된 이뮤노글로불린을 목적하는 활성에 대해 스크리닝한다.
아미노산 서열 삽입에는 길이 범위가 하나의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합 및 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열내 삽입이 포함된다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소 (예를 들어, ADEPT의 경우) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드가 상기 항체의 N- 또는 C-말단에 융합된 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변경된다. 폴리펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결된다. N-연결은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 대한 탄수화물 모이어티의 부착을 지칭한다. 트리펩티드 서열, 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)이 아스파라긴 측쇄로 탄수화물 모이어티를 효소적으로 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 이러한 트리펩티드 서열 중 어느 하나가 폴리펩티드에 존재함으로써 잠재적인 글리코실화 부위가 생성된다. O-연결된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중의 하나가 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착되는 것을 지칭하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신 또한 사용될 수 있다.
항체에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 하나 이상의 상기한 트리펩티드 서열이 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성된다 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 변경은 또한 본래의 항체 서열에 대한 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가, 결실 또는 치환을 통해 수행될 수도 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우).
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 이에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생성된 천연 항체는 전형적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 대한 N-연결에 의해 일반적으로 부착되는 분지된 2분지의 올리고사카라이드를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Wright et al., (1997) TIBTECH 15:26-32]을 참조한다. 상기 올리고사카라이드는 각종 탄수화물, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스 및 시알산, 및 2분지형 올리고사카라이드 구조의 "줄기" 내의 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 내의 올리고사카라이드의 변형은 특정의 개선된 특성을 지닌 항체 변이체를 제조하기 위해 이루어질 수 있다.
예를 들어, Fc 영역에 (직접 또는 간접적으로) 부착된 푸코스가 결여된 탄수화물 구조를 지닌 항체 변이체가 제공된다. 이러한 변이체는 개선된 ADCC 기능을 지닐 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개공보 번호 US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (교와 하꼬 고교(Kyowa Hakko Kogyo) Co., Ltd)를 참조한다. "탈푸코실화" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변이체에 대한 문헌의 예에는 US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; 문헌 [Okazaki et al., J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)]; [Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]이 포함된다. 탈푸코실화 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예에는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (문헌 [Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)]; 미국 특허 출원 번호 US 2003/0157108 A1, (Presta, L.); 및 WO 2004/056312 A1, (Adams et al., 특히 실시예 11), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (예를 들어, 문헌 [Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]; [Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)]; 및 WO2003/085107 참조)가 포함된다.
이등분된 올리고사카라이드를 수반한 항체 변이체가 추가로 제공되는데, 예를 들어 항체의 Fc 영역에 부착된 이분지의 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분된다. 이같은 항체 변이체는 푸코실화가 감소될 수 있고/거나 ADCC 기능이 개선될 수 있다. 이같은 항체 변이체의 예가, 예를 들어 WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); 미국 특허 번호 6,602,684 (Umana et al.); 및 US 2005/0123546 (Umana et al.)에 기재되어 있다. Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드 내에 적어도 하나의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 상기 항체 변이체는, 예를 들어 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); 및 WO 1999/22764 (Raju, S.)에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 항체 변이체는 ADCC를 추가로 개선시켜 주는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 Fc 영역의 위치 298, 333, 및/또는 334 (잔기의 Eu 넘버링)에서의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 치환은 상기 언급된 모든 변이와 조합해서 일어날 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 모든 이펙터 기능은 아니지만, 몇몇 이펙터 기능을 보유하고 있으므로, 생체 내에서의 항체의 반감기가 중요하긴 하지만 특정의 이펙터 기능 (예컨대 보체 및 ADCC)이 불필요하거나 해로운 많은 적용 분야에 대한 바람직한 후보가 되는 항체 변이체를 고려한다. 특정 실시양태에서, 항체의 Fc 활성을 측정하여 원하는 특성만이 유지되는 것을 확인한다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정을 수행할 수 있다. 예를 들어, 항체에 FcγR 결합은 없지만 (따라서, 아마도 ADCC 활성이 없을 것임), FcRn 결합 능력은 보유하고 있는 것을 확인하기 위해서 Fc 수용체 (FcR) 결합 검정을 수행할 수 있다. ADCC를 매개하는 주요 세포인 NK 세포는 FcγRIII 만을 발현하는 반면에, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈모세포상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)]의 페이지 464, 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비제한적 예는 미국 특허 번호 5,500,362 (예를 들어 문헌 [Hellstrom, I., et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)] 참조) 및 문헌 [Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)]; 5,821,337 (문헌 [Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)] 참조)에 기재되어 있다. 다르게는, 비-방사성 검정 방법을 이용할 수 있다 (예를 들어, 유동 세포계수를 위한 악티(ACTI)™ 비-방사성 세포독성 검정 (셀테크놀로지, 인크.(CellTechnology, Inc.), 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재); 및 사이토톡스(CytoTox) 96® 비-방사성 세포독성 검정 (프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨 소재) 참조). 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 별법적으로 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다. 항체가 C1q에 결합하지 못하여 CDC 활성이 결여되어 있는지를 확인하기 위해 또한 C1q 결합 검정을 수행할 수 있다. 보체 활성화를 평가하기 위해 CDC 검정을 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]; [Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)]; 및 [Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)] 참조). FcRn 결합 및 생체내 청소율/반감기 결정 역시 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)] 참조).
하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 기타 항체 변이체가 제공된다. 치환적 돌연변이유발을 위한 관심 부위는 초가변 영역을 포함하지만 FR 변경도 고려된다. 보존적 치환은 "바람직한 치환"의 표제 하에 표 1에 나타낸다. "예시적인 치환"으로 표시된 보다 실질적인 변화를 "아미노산 치환 표"에서 제공하거나, 또는 아미노산 부류와 관련하여 이하에서 추가로 기재한다. 아미노산 치환을 관심 항체 내로 도입하고, 생성물을 예를 들어 원하는 활성, 예컨대 개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 개선된 ADCC 또는 CDC 등에 대해 스크리닝할 수 있다.
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항체의 생물학적 특성에 있어서의 변형은, (a) 치환 영역에서 예를 들어 시트 또는 나선 형태로서 폴리펩티드 주쇄의 구조에 영향을 미치거나, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성에 영향을 미치거나, 또는 (c) 측쇄의 크기에 영향을 미치는 치환을 선택함으로써 수행될 수 있다. 아미노산은 그의 측쇄 특성의 유사성에 따라 하기 군으로 나뉠 수 있다 (문헌 [A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)]):
(1) 비극성: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(2) 비하전 극성: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)
(3) 산성: Asp (D), Glu (E)
(4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His(H)
별법적으로, 자연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 특성에 따라 하기 군으로 나뉠 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중의 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다. 이러한 치환된 잔기는 또한 보존적 치환 부위 내로 또는 나머지 (비보존된) 부위 내로 도입될 수 있다.
치환 변이체의 한 가지 유형은 모 항체 (예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가 개발을 위해 선택된 생성된 변이체(들)은 이들이 생성되는 모 항체에 비해 변형된 (예를 들어 개선된) 생물학적 특성을 가질 것이다. 예시적 치환 변이체는 친화성 성숙 항체이고, 이는 파지 디스플레이에 기초한 친화성 성숙 기술을 사용하여 편리하게 생성시킬 수 있다. 간략하게 설명하면, 여러 초가변 영역 부위 (예를 들어, 6-7 개 부위)를 각 부위에서 모든 가능한 아미노산 치환이 생성되도록 돌연변이시킨다. 이로써 생성된 항체를 필라멘트형 파지 입자로부터 각 입자 내에 패키지된 파지 외피 단백질 (예를 들어, M13의 유전자 III 생성물)의 적어도 일부에 대한 융합체로서 디스플레이시킨다. 이어서, 파지-디스플레이된 변이체를 그의 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝한다. 변형시킬 후보 초가변 영역 부위를 확인하기 위해서, 스캐닝 돌연변이유발 (예를 들어, 알라닌 스캐닝)을 수행하여 항원 결합에 유의하게 기여하는 초가변 영역 잔기를 확인할 수 있다. 별법적으로 또는 추가로, 항체 및 항원 사이의 접촉 지점을 확인하기 위해서는 항원 항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃 잔기가 당업계에 공지된 기술, 예를 들어 본원에서 상술된 기술에 따라 치환시킬 후보이다. 이러한 변이체가 일단 생성되면, 변이체 패널을 대상으로 하여 본원에 기재된 기술을 포함한, 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 스크리닝하고, 한 가지 이상의 관련 검정에서 탁월한 특성을 지닌 변이체를 추가 개발을 위해 선별할 수 있다.
항체의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 이러한 방법에는 천연 공급원으로부터의 단리 (자연 발생 아미노산 서열 변이체의 경우), 또는 항체의 앞서 제조된 변이체 또는 비-변이체 버전의 올리고뉴클레오티드-매개 (또는 부위-지정) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발 및 카세트 돌연변이유발에 의한 제조가 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 항체의 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 변형을 도입하여 Fc 영역 변이체를 생성시키는 것이 바람직할 수 있다. Fc 영역 변이체는 힌지 시스테인의 위치를 포함한 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 변형 (예를 들어 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
본원 명세서 및 당업계의 교시 내용에 따르면, 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 야생형 대응 항체에 비해, 예를 들어 Fc 영역에 하나 이상의 변경을 포함할 수 있음이 고려된다. 그럼에도 불구하고 이러한 항체는 그의 야생형 대응물과 비교하여 치료학적 유용성에 요구되는 실질적으로 동일한 특성을 유지할 것이다. 예를 들어, WO99/51642에 기술된 바와 같이, 변경된 (즉, 개선된 또는 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 초래할 특정 변경이 Fc 영역에서 이루어질 수 있는 것으로 생각된다. Fc 영역 변이체의 기타 예에 관해서는 또한 문헌 [Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)]; 미국 특허 번호 5,648,260; 미국 특허 번호 5,624,821; 및 WO94/29351을 참조한다. WO00/42072 (Presta) 및 WO 2004/056312 (Lowman)에는 FcR에 대한 결합이 개선 또는 감소된 항체 변이체가 기술되어 있다. 또한 문헌 [Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)]을 참조한다. 모체 IgG를 태아에게 전달하는 것을 담당하는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) (문헌 [Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)])에 대한 결합이 개선되고 반감기가 증가된 항체가 US2005/0014934A1 (Hinton et al.)에 기재되어 있다. 이들 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합성을 개선시키는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. Fc 영역 아미노산 서열이 변경되고 C1q 결합 능력이 증가 또는 감소된 폴리펩티드 변이체가 미국 특허 번호 6,194,551B1, WO99/51642에 기술되어 있다. 또한, 문헌 [Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]을 참조한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 Fc 영역을 포함하는 Fc 폴리펩티드의 계면 내에서의 변형을 포함하는 항체를 제공하며, 이러한 변형은 이종이량체화를 용이하게하고/하거나 촉진시킨다. 이들 변형은 제1 Fc 폴리펩티드 내로의 돌출부 도입 및 제2 Fc 폴리펩티드 내로의 공동의 도입을 포함하고, 여기서 상기 돌출부는 상기 공동 내에 위치하여 제1 및 제2 Fc 폴리펩티드의 복합체화를 촉진시킬 수 있다. 이러한 변형을 갖는 항체를 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 번호 5,731,168에 기재되어 있다.
또 다른 측면에서, 항체의 하나 이상의 잔기를 시스테인 잔기로 치환시킨 시스테인 조작된 항체, 예를 들어 "티오MAb"를 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이와 같이 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 일어난다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써 반응성 티올기가 항체의 접근가능한 부위에 배치되게 되고, 이것을 이용하여 항체를 본원에 추가로 기재한 바와 같이 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 임의의 하나 이상의 하기 잔기가 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (카바트 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링).
항체 유도체
본 발명의 항체는 당업계에 공지되고 용이하게 입수가능한 추가적인 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 바람직하게는, 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체이다. 수용성 중합체의 비제한적 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 무작위 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 이들의 혼합물을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에서의 안정성으로 인해 제조에 유리할 수 있다. 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착되는 중합체의 수는 다양할 수 있으며, 1개 초과의 중합체가 부착될 경우에 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선될 항체의 특정 특성 또는 기능, 항체 유도체가 규정된 조건하에 요법에서 사용될 것인지의 여부 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않은 고려사항을 기초로 결정될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체, 및 방사선 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질성 모이어티의 접합체가 제공된다. 한 실시양태에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (문헌 [Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)]). 방사선은 임의의 파장일 수 있고, 통상적인 세포에는 해를 끼치지 않지만 항체-비단백질성 모이어티에 근접한 세포는 사멸시키는 온도로 비단백질성 모이어티를 가열하는 파장을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
활성 검정
본 발명의 항체는 당업계에 공지된 다양한 검정에 의해 그의 물리적/화학적 성질 및 생물학적 기능에 대해 특성화될 수 있다.
한 측면에서, 생물학적 활성을 갖는 항-EGFL7 항체를 확인하기 위한 검정이 제공된다. 생물학적 활성으로는, 예를 들어 EGFL7 결합을 포함하지만 이것으로 한정되는 것은 아닌 하나 이상의 EGFL7-관련 효과 측면의 조정, 저효소 스트레스 하에서의 내피 세포의 EGFL7-매개 보호, 및 EGFL7가 내피 세포 부착을 매개하는 능력이 포함된다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 본원에서 제조된 항체는 그의 생물학적 활성에 대하여 분석된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이뮤노글로불린은 그의 항원 결합 활성에 대하여 시험된다. 당업계에 공지되고 본원에서 사용될 수 있는 항원 결합 검정은 웨스턴 블롯, 방사성 면역검정, ELISA (효소 결합 면역흡착 검정), "샌드위치" 면역검정, 면역침전 검정, 형광 면역검정 및 단백질 A 면역검정과 같은 기술을 이용한 임의의 직접적 또는 경쟁적 결합 검정을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 항원 결합 검정은 이하의 실시예 섹션에서 제공된다.
정제된 항체를 N-말단 서열분석, 아미노산 분석, 비-변성 크기 배제 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC), 질량 분광법, 이온 교환 크로마토그래피 및 파파인 소화가 포함되지만 이에 제한되지 않는 일련의 검정에 의해 추가로 특성화할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 모든 이펙터 기능은 아니지만, 몇몇 이펙터 기능을 보유하고 있으므로, 생체 내에서의 항체의 반감기가 중요하긴 하지만 특정의 이펙터 기능 (예컨대 보체 및 ADCC)이 불필요하거나 해로운 많은 적용 분야에 대한 바람직한 후보가 되는 변경된 항체를 고려한다. 특정 실시양태에서, 항체의 Fc 활성을 측정하여 원하는 특성만이 유지되는 것을 확인한다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정을 수행할 수 있다. 예를 들어, 항체에 FcγR 결합은 없지만 (따라서, 아마도 ADCC 활성이 없을 것임), FcRn 결합 능력은 보유하고 있는 것을 확인하기 위해서 Fc 수용체 (FcR) 결합 검정을 수행할 수 있다. ADCC를 매개하는 주요 세포인 NK 세포는 FcγRIII 만을 발현하는 반면에, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈모세포상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 페이지 464, 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 예가 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337에 기술되어 있다. 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 별법적으로 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al., PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다. 항체가 C1q에 결합하지 못하여 CDC 활성이 결여되어 있는지를 확인하기 위해 또한 C1q 결합 검정을 수행할 수도 있다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 검정을 수행할 수 있다. 또한, FcRn 결합 및 생체내 청소율/반감기 측정을 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 증가된 이펙터 기능 및/또는 증가된 반감기를 갖는 변경된 항체를 제공한다.
벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법
본 발명의 항체의 재조합 생성을 위해서는, 이를 코딩하는 핵산을 단리시키고, 추가의 클로닝 (DNA 증폭) 또는 발현을 위한 복제가능한 벡터에 삽입한다. 항체를 코딩하는 DNA는 통상의 절차를 사용 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용)하여 쉽게 단리 및 서열분석된다. 다수의 벡터가 이용가능하다. 벡터의 선택은 부분적으로는 사용되는 숙주 세포에 따른다. 일반적으로, 바람직한 숙주 세포는 원핵세포 또는 진핵세포 (일반적으로, 포유동물) 기원 중 하나이다. IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 불변 영역을 포함하여 임의의 이소형 불변 영역이 이러한 목적에 사용될 수 있으며, 이같은 불변 영역이 임의의 인간 또는 동물 종으로부터 수득될 수 있음이 이해될 것이다.
a. 원핵 숙주 세포를 사용한 항체의 생성:
i. 벡터 구축
본 발명의 항체의 폴리펩티드 성분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 표준 재조합 기술을 사용하여 얻을 수 있다. 목적하는 폴리뉴클레오티드 서열은 항체 생성 세포, 예컨대 하이브리도마 세포로부터 단리되어 서열 결정될 수 있다. 별법적으로, 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 합성기 또는 PCR 기술을 사용하여 합성할 수 있다. 일단 얻은 후에, 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 원핵 숙주에서 이종 폴리뉴클레오티드를 복제 및 발현할 수 있는 재조합 벡터 내로 삽입된다. 입수가능하고 당업계에 공지된 많은 벡터를 본 발명의 목적에 사용할 수 있다. 적절한 벡터의 선택은 주로 벡터에 삽입되는 핵산의 크기 및 벡터로 형질전환되는 특정 숙주 세포에 따를 것이다. 각각의 벡터는 그의 기능 (이종 폴리뉴클레오티드의 증폭 또는 발현, 또는 둘 모두) 및 벡터가 존재하게 되는 특정 숙주 세포와의 상용성에 따라 다양한 성분을 포함한다. 벡터 성분은 일반적으로 복제 기점, 선별 마커 유전자, 프로모터, 리보솜 결합 부위 (RBS), 신호 서열, 이종 핵산 삽입물 및 전사 종결 서열을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
일반적으로, 숙주 세포와 상용성인 종으로부터 유래된 레플리콘 및 제어 서열을 함유하는 플라스미드 벡터가 상기 숙주와 함께 사용된다. 벡터는 통상적으로 복제 부위, 및 형질전환된 세포에서 표현형 선별을 제공할 수 있는 마킹(marking) 서열을 포함한다. 예를 들어, 이. 콜라이는 전형적으로 이. 콜라이 종으로부터 유래된 플라스미드인 pBR322를 사용하여 형질전환시킨다. pBR322는 암피실린 (Amp) 및 테트라시클린 (Tet) 내성을 코딩하는 유전자를 함유하고, 따라서 형질전환된 세포를 확인하기 위한 용이한 수단을 제공한다. pBR322, 그의 유도체, 또는 다른 미생물 플라스미드 또는 박테리오파지 또한 내인성 단백질의 발현을 위해 미생물 유기체에 의해 사용될 수 있는 프로모터를 함유하거나 상기 프로모터를 함유하도록 변형될 수 있다. 특정 항체의 발현을 위해 사용되는 pBR322 유도체의 예는 미국 특허 번호 5,648,237 (Carter et al.)에 상세하게 기재되어 있다.
또한, 숙주 미생물과 상용성인 레플리콘 및 제어 서열을 함유하는 파지 벡터를 상기 숙주에 대한 형질전환 벡터로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 박테리오파지, 예컨대 λGEM™-11이 이. 콜라이 LE392와 같은 감수성 숙주 세포의 형질전환에 사용될 수 있는 재조합 벡터의 제조에 이용될 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 각각의 폴리펩티드 성분을 코딩하는 2종 이상의 프로모터-시스트론 쌍을 포함할 수 있다. 프로모터는 시스트론의 발현을 조정하는, 시스트론의 상류 (5')에 위치하는 번역되지 않는 제어 서열이다. 원핵세포 프로모터는 전형적으로 두 유형의 프로모터, 즉 유도성 및 구성적 프로모터로 분류된다. 유도성 프로모터는 배양 조건에서의 변화, 예를 들어 영양소의 존재 또는 부재 또는 온도에서의 변화에 반응하여 그의 제어 하에 있는 시스트론의 전사 수준 증가를 개시시키는 프로모터이다.
다양한 가능한 숙주 세포에 의해 인식되는 수많은 프로모터가 공지되어 있다. 선택된 프로모터는, 제한 효소 소화를 통해 공급원 DNA로부터 프로모터를 제거하고 단리된 프로모터 서열을 본 발명의 벡터 내로 삽입함으로써 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는 시스트론 DNA에 작동가능하게 연결될 수 있다. 천연 프로모터 서열 및 많은 이종 프로모터를 둘 다 사용하여 표적 유전자의 증폭 및/또는 발현을 지시할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이종 프로모터는 일반적으로 천연 표적 폴리펩티드 프로모터에 비해 발현된 표적 유전자의 보다 큰 전사 및 보다 높은 수율을 가능하게 하기 때문에 이것이 이용된다.
원핵 숙주에 사용하기 적합한 프로모터에는 PhoA 프로모터, β-갈락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 및 하이브리드 프로모터, 예컨대 tac 또는 trc 프로모터가 포함된다. 그러나, 박테리아에서 기능적인 다른 프로모터 (예컨대, 다른 공지의 박테리아 또는 파지 프로모터)도 적합하다. 그의 뉴클레오티드 서열은 공개되어 있고, 당업자는 임의의 요구되는 제한 부위를 공급하도록 링커 또는 어댑터를 사용하여 이들 서열을 표적 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 시스트론에 작동가능하게 라이게이션할 수 있다 (문헌 [Siebenlist et al., (1980) Cell 20: 269]).
본 발명의 한 측면에서, 재조합 벡터 내의 각각의 시스트론은 발현된 폴리펩티드의 막을 가로지른 전위를 지시하는 분비 신호 서열 성분을 포함한다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 한 성분일 수 있거나, 또는 벡터 내에 삽입되는 표적 폴리펩티드 DNA의 일부일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 선별된 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단)되는 것이어야 한다. 이종성 폴리펩티드에 천연인 신호 서열을 인식 및 프로세싱하지 않는 원핵생물 숙주 세포에 대해서, 신호 서열이 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, Ipp, 또는 열-안정성 장독소 II (STII) 리더, LamB, PhoE, PelB, OmpA 및 MBP로 이루어진 군으로부터 예를 들어 선택된 원핵생물 신호 서열로 치환된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 발현 시스템의 시스트론 모두에 사용되는 신호 서열은 STII 신호 서열 또는 그의 변이체이다.
또 다른 측면에서, 본 발명에 따른 이뮤노글로불린의 생성은 숙주 세포의 세포질에서 일어날 수 있으며, 따라서 각 시스트론 내의 분비 신호 서열의 존재를 요구하지 않는다. 이와 관련하여, 이뮤노글로불린 경쇄 및 중쇄가 발현되고, 폴딩되고, 어셈블리되어, 세포질 내에서 기능적 이뮤노글로불린을 형성한다. 특정 숙주 균주 (예를 들어, 이. 콜라이 trxB- 균주)는 디술피드 결합 형성에 유리한 세포질 조건을 제공함으로써, 발현된 단백질 서브유닛의 정확한 폴딩 및 어셈블리를 허용한다. 문헌 [Proba and Pluckthun Gene, 159:203 (1995)].
본 발명의 항체의 발현에 적합한 원핵 숙주 세포에는 원시세균 및 유박테리아, 예컨대 그람-음성 또는 그람-양성 유기체가 포함된다. 유용한 박테리아의 예에는 에스케리키아(Escherichia) (예를 들어, 이. 콜라이), 바실러스(Bacilli) (예를 들어, 비. 섭틸리스(B. subtilis)), 엔테로박테리아), 슈도모나스(Pseudomonas) 종 (예를 들어, 피. 아에루기노사(P. aeruginosa)), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 시겔라(Shigella), 리조비아(Rhizobia), 비트레오실라(Vitreoscilla) 또는 파라코쿠스(Paracoccus)가 포함된다. 한 실시양태에서, 그람-음성 세포가 사용된다. 한 실시양태에서, 이. 콜라이 세포가 본 발명에서 숙주로서 사용된다. 이. 콜라이 균주의 예로는 유전자형 W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41 kanR (미국 특허 번호 5,639,635)을 갖는 균주 33D3을 비롯한, 균주 W3110 (문헌 [Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219]; ATCC 기탁 번호 27,325) 및 그의 유도체가 포함된다. 다른 균주 및 그의 유도체, 예컨대 이. 콜라이 294 (ATCC® 31,446), 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 λ1776 (ATCC® 31,537) 및 이. 콜라이 RV308 (ATCC® 31,608)이 또한 적합하다. 이러한 예들은 제한적이기보다는 예시적이다. 특정 유전자형을 갖는 언급된 박테리아의 유도체 중 어느 하나를 제작하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990)]에 기재되어 있다. 박테리아 세포 내의 레플리콘의 복제능을 고려하여 적절한 박테리아를 선택하는 것이 일반적으로 필요하다. 예를 들어, pBR322, pBR325, pACYC177, 또는 pKN410과 같은 널리 공지된 플라스미드를 사용하여 레플리콘을 공급하는 경우에는, 이. 콜라이, 세라티아, 또는 살모넬라 종이 숙주로서 적합하게 사용될 수 있다. 전형적으로, 숙주 세포는 최소량의 단백질 분해 효소를 분비해야 하며, 추가의 프로테아제 억제제는 바람직하게는 세포 배양물에 혼입될 수 있다.
ii. 항체 생산
숙주 세포를 상기 기재된 발현 벡터로 형질전환시키고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 필요에 따라 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양시킨다.
형질전환은 DNA가 염색체외 요소로서 또는 염색체 통합체에 의해 복제가능하도록 DNA를 원핵 숙주 내로 도입하는 것을 의미한다. 사용되는 숙주 세포에 따라, 형질전환은 그 세포에 적절한 표준 기술을 이용하여 수행된다. 염화칼슘을 사용한 칼슘 처리는 실질적인 세포벽 장벽을 함유하는 박테리아 세포에 일반적으로 사용된다. 또 다른 형질전환 방법은 폴리에틸렌 글리콜/DMSO를 사용한다. 사용되는 또 다른 기술은 전기천공이다.
본 발명의 폴리펩티드를 생성하는데 사용되는 원핵세포를 당업계에 공지되고 선택된 숙주 세포의 배양에 적합한 배지에서 성장시킨다. 적합한 배지의 예에는 필수 영양 보충물이 부가된 루리아 브로쓰(luria broth; LB)가 포함된다. 일부 실시양태에서, 배지는 또한 발현 벡터를 함유하는 원핵세포의 성장을 선택적으로 허용하는, 발현 벡터의 구조를 기초로 하여 선택된 선별제를 함유한다. 예를 들어, 암피실린은 암피실린 내성 유전자를 발현하는 세포를 성장시키기 위한 배지에 첨가된다.
또한, 탄소, 질소 및 무기 포스페이트 공급원 이외의 임의의 필요한 보충물이, 단독으로, 또는 복합 질소 공급원과 같은 또 다른 보충물 또는 배지와의 혼합물로서 도입되어 적절한 농도로 포함될 수 있다. 임의로, 배양 배지는 글루타티온, 시스테인, 시스타민, 티오글리콜레이트, 디티오에리트리톨 및 디티오트레이톨로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 환원제를 함유할 수 있다.
원핵 숙주 세포를 적합한 온도에서 배양한다. 이. 콜라이 성장을 위해, 바람직한 온도는 예를 들어 약 20℃ 내지 약 39℃, 보다 바람직하게는 약 25℃ 내지 약 37℃, 보다 더 바람직하게는 약 30℃이다. 배지의 pH는 주로 숙주 유기체에 따라 약 5 내지 약 9 범위의 임의의 pH일 수 있다. 이. 콜라이의 경우, pH는 바람직하게는 약 6.8 내지 약 7.4, 보다 바람직하게는 약 7.0이다.
유도성 프로모터가 본 발명의 발현 벡터에 사용되는 경우에, 단백질 발현은 프로모터의 활성화에 적합한 조건 하에서 유도된다. 본 발명의 한 측면에서, PhoA 프로모터가 폴리펩티드의 전사의 제어에 사용된다. 따라서, 형질전환된 숙주 세포는 유도용의 포스페이트-제한 배지에서 배양된다. 바람직하게는, 포스페이트-제한 배지는 C.R.A.P 배지이다 (예를 들어, 문헌 [Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147] 참조). 당업계에 공지된 바와 같이, 사용되는 벡터 구조물에 따라 다양한 다른 유도제가 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 발현된 폴리펩티드는 숙주 세포의 원형질막 공간 내로 분비되고 그로부터 회수된다. 전형적으로, 단백질 회수는 일반적으로 삼투성 쇼크, 초음파 처리 또는 용해와 같은 수단에 의해 미생물을 분쇄하는 것을 포함한다. 세포가 분쇄되면, 세포 잔해 또는 전체 세포를 원심분리 또는 여과에 의해 제거할 수 있다. 단백질은 예를 들어 친화성 수지 크로마토그래피에 의해 추가로 정제할 수 있다. 별법적으로, 단백질을 배양 배지 내로 옮기고, 그 안에서 단리할 수 있다. 세포를 배양물로부터 제거하고, 배양 상청액을 여과하고 농축하여 생성된 단백질을 추가로 정제할 수 있다. 발현된 폴리펩티드를 추가로 단리하고, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE) 및 웨스턴 블롯 검정과 같은 통상적으로 공지된 방법을 이용하여 확인할 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 항체 생성은 발효 공정에 의해 대량으로 수행된다. 다양한 대규모 유가식(fed-batch) 발효 절차가 재조합 단백질의 생성에 이용가능하다. 대규모 발효는 적어도 1000 리터의 용량, 바람직하게는 약 1,000 내지 100,000 리터의 용량을 갖는다. 상기 발효기는 산소 및 영양소, 특히 글루코스 (바람직한 탄소/에너지 공급원)를 분배시키는 교반기 추진기를 사용한다. 소규모 발효는 일반적으로, 용적이 대략 100 리터 이하인 발효기 내에서의 발효를 지칭하는데, 이는 약 1 리터 내지 약 100 리터 범위일 수 있다.
발효 과정에서, 단백질 발현의 유도는 전형적으로 세포를 적합한 조건 하에서 목적하는 밀도, 예를 들어 약 180 내지 220의 OD550으로 성장시킨 후에 개시되며, 이 단계에서 세포는 초기 정지상이다. 당업계에 공지되고 상기 기재된 바와 같이, 사용되는 벡터 구조물에 따라 다양한 유도제를 사용할 수 있다. 세포를 유도 전에 보다 짧은 기간 동안 성장시킬 수 있다. 세포를 통상적으로 약 12 내지 50시간 동안 유도하지만, 보다 길거나 보다 짧은 유도 시간이 사용될 수도 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 생성 수율 및 품질을 향상시키기 위해, 다양한 발효 조건을 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 분비된 항체 폴리펩티드의 적당한 어셈블리와 폴딩을 개선시키기 위해, 샤페론(chaperone) 단백질, 예를 들어 Dsb 단백질 (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD 및/또는 DsbG) 또는 FkpA (샤페론 활성을 지니고 있는 펩티딜프롤릴 시스,트랜스-이소머라제)를 과다발현하는 부가의 벡터를 사용하여 숙주 원핵 세포를 공동-형질전환시킬 수 있다. 샤페론 단백질은 박테리아 숙주 세포에서 생성된 이종 단백질의 적절한 폴딩 및 가용성을 용이하게 하는 것으로 입증되었다. 문헌 [Chen et al., (1999) J Bio Chem 274:19601-19605]; 미국 특허 번호 6,083,715 (Georgiou et al.); 미국 특허 번호 6,027,888 (Georgiou et al.); [Bothmann and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105]; [Ramm and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113]; [Arie et al., (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210].
발현된 이종 단백질 (특히, 단백질 분해에 감수성인 단백질)의 단백질 분해를 최소화하기 위해, 단백질 분해 효소가 결핍된 특정 숙주 균주를 본 발명에 사용할 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포 균주를 변형시켜, 공지된 세균성 프로테아제, 예를 들어 프로테아제 III, OmpT, DegP, Tsp, 프로테아제 I, 프로테아제 Mi, 프로테아제 V, 프로테아제 VI 및 그의 조합물을 코딩하는 유전자에서 유전적 돌연변이(들)를 수행할 수 있다. 몇몇 이. 콜라이 프로테아제-결핍 균주가 이용가능하며, 예를 들어, 문헌 [Joly et al., (1998), 상기 문헌]; 미국 특허 번호 5,264,365 (Georgiou et al.); 미국 특허 번호 5,508,192 (Georgiou et al.); [Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996)]에 기재되어 있다.
한 실시양태에서, 단백질 분해 효소가 결핍되고 1종 이상의 샤페론 단백질을 과발현하는 플라스미드로 형질전환된 이. 콜라이 균주가 본 발명의 발현 시스템에서 숙주 세포로 사용된다.
iii. 항체 정제
당업계에 공지된 표준 단백질 정제 방법이 이용될 수 있다. 하기 절차는 적합한 정제 절차의 예이다: 면역친화성 또는 이온-교환 칼럼 상의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상 또는 DEAE와 같은 양이온-교환 수지 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱(chromatofocusing), SDS-PAGE, 황산암모늄 침전, 및 예를 들어 세파덱스(Sephadex)® G-75를 이용한 겔 여과.
한 측면에서, 고체상에 고정된 단백질 A가 본 발명의 전장 항체 생성물의 면역친화성 정제에 사용된다. 단백질 A는 항체의 Fc 영역에 고친화도로 결합하는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureas) 유래의 41 kD 세포벽 단백질이다. 문헌 [Lindmark et al., (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13]. 단백질 A가 고정되는 고체상은 바람직하게는 유리 또는 실리카 표면을 포함하는 칼럼, 보다 바람직하게는 제어된 공극 유리 칼럼 또는 규산 칼럼일 수 있다. 일부 용도에서, 칼럼을 글리세롤과 같은 시약으로 코팅하여 가능하게는 오염물의 비특이적 부착을 방지한다.
정제의 제1 단계로서, 상기 기재된 바와 같은 세포 배양액으로부터 유래된 제제를 단백질 A 고정된 고체상에 적용하여 관심 항체가 단백질 A에 특이적으로 결합하게 할 수 있다. 그 후, 고체상을 세척하여 고체상에 비-특이적으로 결합된 오염물을 제거하였다. 최종적으로, 관심 항체를 용출에 의해 고체상으로부터 회수한다.
b. 진핵 숙주 세포를 사용한 항체의 생성:
벡터 성분은 일반적으로 다음 중 하나 이상을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.
(i) 신호 서열 성분
진핵 숙주 세포에 사용하기 위한 벡터는 또한 신호 서열, 또는 관심 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 바람직하게 선택된 이종 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식 및 프로세싱 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단)되는 것이다. 포유동물 세포 발현시에는, 포유동물 신호 서열 및 또한 바이러스성 분비 리더, 예를 들어 단순 포진 gD 신호가 이용가능하다.
이러한 전구체 영역을 위한 DNA는 항체를 코딩하는 DNA에 리딩 프레임으로 라이게이션된다.
(ii) 복제 기점
일반적으로, 복제 기점 성분은 포유동물 발현 벡터에 대해서는 필요하지 않다. 예를 들어, SV40 기점이 전형적으로 사용될 수 있는데, 그 이유는 단지 이것이 초기 프로모터를 함유하기 때문이다.
(iii) 선별 유전자 성분
발현 및 클로닝 벡터는 선별가능한 마커라고도 불리는 선별 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라시클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 관련이 있는 경우에는 영양요구성 결핍을 보충하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 이용가능하지 않은 중요한 영양소를 공급하는 단백질을 코딩한다.
선별 계획의 한 예는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 이용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환된 세포들은 약물 내성을 부여하는 단백질을 생성하고, 따라서 선별 계획에서 생존한다. 이러한 우성 선별의 예는 약물 네오마이신, 미코페놀산 및 히그로마이신을 사용한다.
포유동물 세포에 적합한 선별가능 마커의 또 다른 예는 항체 핵산을 취할 수 있는 세포 성분의 확인을 가능하게 하는 것, 예컨대 DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카르복실라제 등이다.
예를 들어, DHFR 선별 유전자로 형질전환된 세포는 우선 DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트 (Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 모든 형질전환체를 배양함으로써 확인한다. 야생형 DHFR을 사용할 때의 적절한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결여된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주 (예를 들어, ATCC® CRL-9096)이다.
별법적으로, 항체, 야생형 DHFR 단백질, 및 또 다른 선별성 마커 예컨대 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스페라제 (APH)를 코딩하는 DNA 서열로 형질감염되거나 공동-형질감염된 숙주 세포 (특히 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)를 아미노글리코시드성 항생제, 예를 들어, 카나마이신, 네오마이신 또는 G418과 같은 선별성 마커에 대한 선별제를 함유하는 배지에서의 세포 성장에 의해 선별할 수 있다. 미국 특허 번호 4,965,199를 참조한다.
(iv) 프로모터 성분
발현 및 클로닝 벡터는 보통 숙주 유기체에 의해 인식되고 항체 폴리펩티드 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 프로모터 서열은 진핵생물에 대해 공지되어 있다. 실질적으로 모든 진핵세포 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 약 25 내지 30개 염기 상류에 위치하는 AT-풍부 영역을 갖는다. 다수의 유전자의 전사 시작부분으로부터 염기 70개 내지 80개 상류에서 발견된 또 다른 서열은 CNCAAT 영역 (서열 232) (여기서 N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있음)이다. 대부분의 진핵생물 유전자의 3' 말단에는 코딩 서열의 3' 말단에 대한 폴리A 꼬리의 부가를 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열 (서열 233)이 있다. 모든 이러한 서열들이 진핵 발현 벡터 내로 적합하게 삽입된다.
포유동물 숙주 세포에서의 벡터로부터의 항체 폴리펩티드 전사는, 예를 들어, 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스 (예컨대 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 원숭이 바이러스 40 (SV40)와 같은 바이러스의 게놈으로부터, 이종성 포유동물 프로모터, 예를 들어, 액틴 프로모터 또는 이뮤노글로불린 프로모터로부터, 또는 열-쇼크 프로모터로부터 수득된 프로모터에 의해 제어될 수 있고, 단, 이같은 프로모터들은 숙주 세포 시스템과 혼화성이다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스성 복제 기점을 또한 함유하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 수득하였다. 인간 시토메갈로바이러스의 극초기 프로모터가 HindIII E 제한 단편으로 편리하게 수득하였다. 소 유두종 바이러스를 벡터로 사용하여 포유동물 숙주에서 DNA를 발현시키기 위한 시스템이 미국 특허 번호 4,419,446에 개시되어 있다. 이러한 시스템의 변형은 미국 특허 번호 4,601,978에 기재되어 있다. 별법적으로, 라우스 육종 바이러스의 긴 말단 반복체를 프로모터로 사용할 수 있다.
(v) 인핸서 요소 성분
고등 진핵세포에 의한 본 발명의 항체 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 전사는 종종 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가된다. 많은 인핸서 서열이 현재 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백질 및 인슐린)로부터 공지되어 있다. 그러나, 전형적으로는 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 이것의 예는 복제 기점의 하류 쪽 (bp 100-270)의 SV40 인핸서, 시토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점 하류 쪽의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 또한, 진핵 프로모터의 활성화를 위한 인핸서 요소에 대한 문헌 [Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)]을 참조한다. 인핸서는 항체 폴리펩티드-코딩 서열에 대해 5' 또는 3'인 위치에서 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 5'인 부위에 위치한다.
(vi) 전사 종결 성분
진핵 숙주 세포에 사용되는 발현 벡터는 보통 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열 또한 함유할 것이다. 이러한 서열은 진핵생물 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때때로 3' 비번역 영역으로부터 통상적으로 이용가능하다. 이들 영역은 항체를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 절편을 포함한다. 유용한 전사 종결 성분 중 하나는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. WO 94/11026 및 이에 개시된 발현 벡터를 참조한다.
(vii) 숙주 세포의 선택 및 형질전환
본원의 벡터에서 DNA의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포에는 척추동물 숙주 세포를 비롯하여 본원에 기재된 보다 고등한 진핵세포가 포함된다. 배양 (조직 배양)시 척추동물 세포의 증식은 일상적인 방법이 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40으로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC® CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (293 세포 또는 현탁 배양으로 성장시키기 위해 서브클로닝된 293 세포, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC® CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, 문헌 [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, 문헌 [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC® CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC® CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC® CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC® CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC® CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC® CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC® CCL51); TRI 세포 (문헌 [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간종양 세포주 (Hep G2)이다.
숙주 세포를 상기 기재된 항체 생산을 위한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환시킨 다음, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나, 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형시킨 통상의 영양 배지에서 배양시킨다.
(viii) 숙주 세포의 배양
본 발명의 항체를 생산하는데 사용된 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 시판 배지, 예컨대 햄 F10 (시그마(Sigma)), 최소 필수 배지 (MEM) (시그마), RPMI-1640 (시그마) 및 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) (DMEM) (시그마)가 숙주 세포의 배양에 적합하다. 또한, 문헌 [Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979)], [Barnes et al., Anal. Biochem.102:255 (1980)], 미국 특허 번호 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 등록 30,985에 기재되어 있는 임의의 배지를 숙주 세포를 위한 배양 배지로서 사용할 수 있다. 임의의 이들 배지에는 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예컨대 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제 (예컨대 HEPES), 뉴클레오티드 (예컨대 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예컨대 겐타마이신(GENTAMYCIN)™ 약물), 미량 원소 (통상적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨) 및 글루코스 또는 등가의 에너지원이 보충될 수 있다. 또한, 임의의 다른 필요한 보충물을 당업자에게 공지된 적절한 농도로 포함시킬 수도 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 이용된 것이고, 당업자에게 명백할 것이다.
(ix) 항체의 정제
재조합 기술을 사용할 때, 항체는 세포 내에서 생성되거나, 또는 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포 내에서 생성되는 경우, 제1 단계로서 입자형 잔해인 숙주 세포 또는 용해된 단편을 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거하였다. 항체가 배지로 분비되는 경우, 일반적으로는 우선 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액을 시판되는 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 장치를 사용하여 농축시킨다. 단백질분해를 억제하기 위해 프로테아제 억제제, 예를 들어 PMSF를 임의의 이전 단계에 포함시킬 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 저해하기 위해 항생제를 포함시킬 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은, 예를 들어 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수 있는데, 친화성 크로마토그래피가 전형적으로 바람직한 정제 단계 중의 하나이다. 친화성 리간드로서의 단백질 A의 적합성은 항체 내에 존재하는 임의의 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 따라 달라진다. 단백질 A가 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄를 기초로 하는 항체를 정제하는데 사용될 수 있다 (문헌 [Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)]). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 γ3에 대해 권고된다 (문헌 [Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)]). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 흔하게는 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예컨대 공극이 제어된 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스로 달성할 수 있는 것보다 더 빠른 유속 및 더 짧은 프로세싱 시간을 가능하게 한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, 베이커본드(Bakerbond) ABX™ 수지 (제이. 티. 베이커(J. T. Baker), 뉴저지주 필립스버그 소재)가 정제에 유용하다. 회수할 항체에 따라, 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예컨대 이온-교환 칼럼에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카에서의 크로마토그래피, 헤파린 세파로스™에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예를 들어, 폴리아스파르트산 칼럼)에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 황산암모늄 침전이 이용될 수도 있다.
임의의 예비 정제 단계(들) 후에, 관심 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물로 pH 약 2.5 내지 4.5의 용출 완충제를 사용하는, 바람직하게는 낮은 염 농도 (예를 들어 약 0 내지 0.25 M 염)에서 수행되는 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피를 실시할 수 있다.
면역접합체
본 발명은 또한 하나 이상의 세포독성제, 예를 들어 화학요법제, 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성접합체)에 접합된 항체를 포함하는 면역접합체 (구별없이 "항체-약물 접합체", 또는 "ADC"로 지칭됨)를 제공한다.
면역접합체는 암의 치료에서 세포독성제, 즉 세포를 사멸시키거나 성장 또는 증식을 억제하는 약물의 국소 전달을 위해 사용되었다 (문헌 [Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549]; [Wu et al., (2005) Nature Biotechnology 23(9):1137-1146]; [Payne, G. (2003) i 3:207-212]; [Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614]; [Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drug Deliv. Rev. 26:151-172]; 미국 특허 번호 4,975,278). 면역접합체는 종양으로의 약물 모이어티의 표적화된 전달 및 그 내부의 세포내 축적을 가능하게 하고, 이때 비접합된 약물의 전신 투여는 제거하고자 하는 종양 세포 뿐만 아니라 정상 세포에도 허용되지 않는 수준의 독성을 일으킬 수 있다 (문헌 [Baldwin et al., Lancet (Mar. 15, 1986) pp. 603-05]; [Thorpe (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (A. Pinchera et al., eds) pp. 475-506]). 이들 전략에 유용한 것으로서 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체가 둘 모두 보고되어 있다 (문헌 [Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother. 21:183-87]). 상기 방법에 사용되는 약물은 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 및 빈데신을 포함한다 (문헌 [Rowland et al., (1986) 상기 문헌]). 항체-독소 접합체에 사용되는 독소는 박테리아 독소, 예컨대 디프테리아 독소, 식물 독소, 예컨대 리신, 소분자 독소, 예컨대 겔다나마이신 (문헌 [Mandler et al., (2000) J. Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581]; [Mandler et al., (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028]; [Mandler et al., (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791]), 메이탄시노이드 (EP 1391213; [Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623]), 및 칼리케아미신 ([Lode et al., (1998) Cancer Res. 58:2928]; [Hinman et al., (1993) Cancer Res. 53:3336-3342])을 포함한다. 독소는 튜불린 결합, DNA 결합, 또는 토포이소머라제 억제를 포함한 메카니즘에 의해 세포독성 효과를 발휘할 수 있다. 일부 세포독성 약물은 큰 항체 또는 단백질 수용체 리간드에 접합되는 경우에 불활성이 되거나 활성이 감소되는 경향이 있다.
제발린(ZEVALIN®) (이브리투모맙 티욱세탄, 비오겐(Biogen)/이덱(Idec))은 티오우레아 링커-킬레이터에 의해 결합된, 정상 및 악성 B 림프구의 표면 상에서 발견되는 CD20 항원에 대해 지시된 뮤린 IgG1 카파 모노클로날 항체 및 111In 또는 90Y 방사성 동위원소로 구성된 항체-방사성 동위원소 접합체이다 (문헌 [Wiseman et al., (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77]; [Wiseman et al., (2002) Blood 99(12):4336-42]; [Witzig et al., (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63]; [Witzig et al., (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69]). 제발린은 B-세포 비-호지킨 림프종 (NHL)에 대해 활성을 갖지만, 투여는 대부분의 환자에서 중증 및 장기 혈구감소증을 일으킨다. 칼리케아미신에 연결된 huCD33 항체로 구성된 항체-약물 접합체인 밀로타르그(MYLOTARG)™ (겜투주맙 오조가미신, 와이어쓰 파마슈티칼스(Wyeth Pharmaceuticals))는 주사에 의한 급성 골수성 백혈병 치료용으로 2000년에 승인되었다 (문헌 [Drugs of the Future (2000) 25(7):686]; 미국 특허 번호 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001). 디술피드 링커 SPP를 통해 메이탄시노이드 약물 모이어티 DM1에 연결된 huC242 항체로 구성된 항체-약물 접합체인 칸투주맙 메르탄신 (이뮤노겐, 인크.(Immunogen, Inc.))은 CanAg을 발현하는 암, 예컨대 결장암, 췌장암, 위암 및 기타 암의 치료를 위해 II상 시험 중이다. 메이탄시노이드 약물 모이어티 DM1에 연결된 항-전립선 특이적 막 항원 (PSMA) 모노클로날 항체로 구성된 항체-약물 접합체인 MLN-2704 (밀레니엄 팜.(Millennium Pharm.), BZL 바이올로직스(BZL Biologics), 이뮤노겐, 인크.)는 전립선 종양의 잠재적인 치료를 위해 개발되고 있다. 아우리스타틴 펩티드인 아우리스타틴 E (AE) 및 모노메틸아우리스타틴 (MMAE) (돌라스타틴의 합성 유사체)이 키메라 모노클로날 항체 cBR96 (암종 상의 루이스(Lewis) Y에 특이적) 및 cAC10 (혈액 악성종양 상의 CD30에 특이적)에 접합되었고 (문헌 [Doronina et al., (2003) Nature Biotechnol. 21(7):778-784]), 치료용으로 개발 중이다.
특정 실시양태에서, 면역접합체는 항체 및 화학치료제 또는 다른 독소를 포함한다. 면역접합체의 생성에 유용한 화학치료제는 본원에서 설명된다 (예를 들어, 상기와 같음). 사용될 수 있는 효소 활성 독소 및 그의 단편은 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래됨), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 예를 들어, 1993년 10월 28일자로 공개된 WO 93/21232를 참조한다. 방사성접합된 항체의 생성을 위한 다양한 방사선핵종이 이용가능하다. 이것의 예는 212Bi, 131I, 131In, 90Y 및 186Re를 포함한다. 항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 2관능성 단백질-커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 2관능성 유도체 (예컨대 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조한다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사선뉴클레오티드를 항체에 접합시키기 위한 예시적인 킬레이트화제이다. WO 94/11026을 참조한다.
항체 및 하나 이상의 소분자 독소, 예를 들어 칼리케아미신, 메이탄시노이드, 돌라스타틴, 아우로스타틴, 트리코테센 및 CC1065, 및 독소 활성을 갖는 이들 독소의 유도체의 접합체가 또한 본원에서 고려된다.
메이탄신 및 메이탄시노이드
일부 실시양태에서, 면역접합체는 하나 이상의 메이탄시노이드 분자에 접합된 항체 (전장 또는 단편)를 포함한다.
메이탄시노이드는 튜불린 중합을 억제함으로써 작용하는 유사분열 억제제이다. 메이탄신은 동아프리카 관목 메이테누스 세라타(Maytenus serrata)로부터 처음 단리되었다 (미국 특허 번호 3,896,111). 이후, 특정 미생물이 또한 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄시놀 및 C-3 메이탄시놀 에스테르를 생성하는 것으로 발견되었다 (미국 특허 번호 4,151,042). 합성 메이탄시놀 및 그의 유도체 및 유사체는 예를 들어 미국 특허 번호 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; 및 4,371,533에 개시되어 있다.
메이탄시노이드 약물 모이어티는, 이들이 (i) 발효 또는 화학적 변형, 발효 생성물의 유도체화에 의한 제조에 비교적 이용가능하고, (ii) 비-디술피드 링커를 통해 항체에 접합되기에 적합한 관능기로 유도체화될 수 있고, (iii) 혈장에서 안정하며, (iv) 다양한 종양 세포주에 대해 효과적이기 때문에, 항체 약물 접합체에서 매력적인 약물 모이어티이다.
메이탄시노이드를 함유하는 면역접합체, 그의 제조 방법, 및 그의 치료 용도는 예를 들어 미국 특허 번호 5,208,020, 5,416,064 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1에 개시되어 있다. 문헌 [Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)]에는 인간 결장직장암에 대해 작용하는 모노클로날 항체 C242에 연결된 DM1로 명명된 메이탄시노이드를 포함하는 면역접합체가 기재되어 있다. 상기 접합체는 배양된 결장암 세포에 대해 고도로 세포독성인 것으로 밝혀졌고, 생체내 종양 성장 검정에서 항종양 활성을 나타냈다. 문헌 [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)]에서는 메이탄시노이드가 인간 결장암 세포주 상의 항원에 결합하는 뮤린 항체 A7에 또는 HER-2/neu 종양유전자에 결합하는 다른 뮤린 모노클로날 항체 TA.1에 디술피드 링커를 통해 접합된 면역접합체를 설명하고 있다. TA.1-메이탄시노이드 접합체의 세포독성은 세포당 3x105 HER-2 표면 항원을 발현하는 인간 유방암 세포주 SK-BR-3에 대해 시험관 내에서 시험하였다. 약물 접합체는 유리 메이탄시노이드 약물에 유사한 수준의 세포독성을 달성하였고, 이것은 항체 분자당 메이탄시노이드 분자의 수를 증가시켜 증가시킬 수 있다. A7-메이탄시노이드 접합체는 마우스에서 낮은 전신 세포독성을 나타냈다.
항체-메이탄시노이드 접합체는 항체 또는 메이탄시노이드 분자의 생물학적 활성을 유의하게 감소시키지 않으면서 항체를 메이탄시노이드 분자에 화학적으로 연결시킴으로써 제조된다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,208,020을 참조한다. 항체 분자 당 평균 3-4개로 접합된 메이탄시노이드 분자는 항체의 기능 또는 용해도에 부정적인 영향 없이 표적 세포의 세포독성을 증진시키는 효능을 나타냈지만, 1개의 독소/항체 분자일지라도 네이키드 항체의 사용에 비해 세포독성을 증진시킬 것이라 예상된다. 메이탄시노이드는 당업계에 공지되어 있으며, 공지의 기술에 의해 합성될 수도 있고 천연 공급원으로부터 단리될 수도 있다. 적합한 메이탄시노이드는 예를 들어 미국 특허 번호 5,208,020 및 본원에서 상기 언급된 다른 특허 및 비-특허 간행물에 개시되어 있다. 바람직한 메이탄시노이드는 메이탄시놀, 및 메이탄시놀 분자의 방향족 고리 또는 다른 위치에서 변형된 메이탄시놀 유사체, 예컨대 다양한 메이탄시놀 에스테르이다.
항체-메이탄시노이드 접합체를 제조하기 위한 많은 연결기가 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 번호 5,208,020 또는 EP 특허 0 425 235 B1, 문헌 [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)], 및 2004년 10월 8일자로 출원된 미국 특허 출원 번호 10/960,602에 개시된 것이 포함된다. 링커 성분 SMCC를 포함하는 항체-메이탄시노이드 접합체는 2004년 10월 8일자로 출원된 미국 특허 출원 번호 10/960,602에 개시된 바와 같이 제조될 수 있다. 연결기는 상기 언급된 특허에 개시된 바와 같이 디술피드 기, 티오에테르 기, 산 불안정성 기, 광분해성 기, 펩티다제 불안정성 기 또는 에스테라제 불안정성 기를 포함하고, 디술피드 및 티오에테르 기가 바람직하다. 추가의 연결기는 본원에 기재되고 예시되어 있다.
항체 및 메이탄시노이드의 접합체는 다양한 2관능성 단백질 커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 2관능성 유도체 (예컨대 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 디술피드 연결을 제공하기 위해 특히 바람직한 커플링제는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP) (문헌 [Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 (1978)]), 및 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 (SPP)를 포함한다.
링커는 연결 유형에 따라 다양한 위치에서 메이탄시노이드 분자에 부착될 수 있다. 예를 들어, 에스테르 연결부는 통상적인 커플링 기술을 이용하여 히드록실기와의 반응으로 형성될 수 있다. 반응은 히드록실기를 갖는 C-3 위치, 히드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 히드록실기로 변형된 C-15 위치, 및 히드록실기를 갖는 C-20 위치에서 일어날 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 연결은 메이탄시놀 또는 메이탄시놀 유사체의 C-3 위치에서 형성된다.
아우리스타틴 및 돌라스타틴
일부 실시양태에서, 면역접합체는 돌라스타틴 또는 돌라스타틴 펩티드 유사체 및 유도체, 예를 들어 아우리스타틴 (미국 특허 번호 5635483; 5780588)에 접합된 항체를 포함한다. 돌라스타틴 및 아우리스타틴은 미세관 역학, GTP 가수분해, 및 핵 및 세포 분열을 방해하며 (문헌 [Woyke et al., (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584]), 항암 (US 5663149) 및 항진균 활성 ([Pettit et al., (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965])을 갖는 것으로 나타났다. 돌라스타틴 또는 아우리스타틴 약물 모이어티는 펩티드성 약물 모이어티의 N (아미노) 말단 또는 C (카르복실) 말단을 통해 항체에 부착될 수 있다 (WO 02/088172).
예시적인 아우리스타틴 실시양태에는 2004년 11월 5일자로 출원된 미국 연속 출원 번호 10/983,340의 "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"에 개시되어 있는, N-말단 연결된 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF가 포함된다.
전형적으로, 펩티드-기재의 약물 모이어티는 2개 이상의 아미노산 및/또는 펩티드 단편 사이의 펩티드 결합 형성으로 제조될 수 있다. 이러한 펩티드 결합은 예를 들어 펩티드 화학 분야에 널리 공지된 액상 합성 방법 (문헌 [E. Schroeder and K. Luebke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press] 참조)에 따라 제조할 수 있다. 아우리스타틴/돌라스타틴 약물 모이어티는 US 5635483; US 5780588; 문헌 [Pettit et al., (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465]; [Pettit et al., (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277]; [Pettit, G.R., et al., Synthesis, 1996, 719-725]; 및 [Pettit et al., (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863]의 방법에 따라 제조할 수 있다. 또한, 문헌 [Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7):778-784]; 2004년 11월 5일자로 출원된 미국 연속 출원 번호 10/983,340의 "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands" (예를 들어, 링커 및 링커에 접합된 모노메틸발린 화합물, 예컨대 MMAE 및 MMAF의 제조 방법을 개시함)을 참고한다.
칼리케아미신
다른 실시양태에서, 면역접합체는 하나 이상의 칼리케아미신 분자에 접합된 항체를 포함한다. 칼리케아미신 부류의 항생제는 피코몰 미만의 농도에서 이중 가닥 DNA 절단부를 생성할 수 있다. 칼리케아미신 부류의 접합체의 제조에 대해서는, 미국 특허 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 5,877,296 (모두 아메리칸 시아나미드 캄파니(American Cyanamid Company))을 참조한다. 사용할 수 있는 칼리케아미신의 구조적 유사체는 γ1I, α2I, α3I, N-아세틸-γ1I, PSAG 및 θI1을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다 (문헌 [Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993)], [Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998)] 및 상기 언급된 아메리칸 시아나미드의 미국 특허). 항체가 접합될 수 있는 또 다른 항-종양 약물은 항폴레이트인 QFA이다. 칼리케아미신 및 QFA는 둘 다 세포내 작용 부위를 갖고, 원형질막을 쉽게 통과하지 않는다. 따라서, 항체-매개 내재화를 통한 이들 작용제의 세포 흡수는 이들의 세포독성 효과를 크게 증진시킨다.
다른 세포독성제
항체에 접합될 수 있는 다른 항종양제는 BCNU, 스트렙토조신, 빈크리스틴 및 5-플루오로우라실, 미국 특허 5,053,394, 5,770,710에 기재된, 집합적으로 LL-E33288 복합체로 공지된 작용제 부류, 및 에스페라미신 (미국 특허 5,877,296)을 포함한다.
사용할 수 있는 효소 활성 독소 및 그의 단편은 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 아에루기노사로부터 유래됨), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 예를 들어, 1993년 10월 28일 공개된 WO 93/21232를 참조한다.
본 발명은 항체와 핵산분해 활성을 갖는 화합물 (예를 들어 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제, 예컨대 데옥시리보뉴클레아제; DNase) 사이에 형성된 면역접합체를 추가로 고려한다.
종양의 선택적 파괴를 위해서, 항체는 높은 방사성의 원자를 포함할 수 있다. 다양한 방사성동위원소가 방사성 접합된 항체의 생산을 위해 이용가능하다. 그 예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 접합체는 검출용으로 사용되는 경우에 섬광조영 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어 tc99m 또는 I123을 포함하거나, 핵자기 공명 (NMR) 영상화 (자기 공명 영상화, mri로도 공지됨)용 스핀 (spin) 표지, 예를 들어 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
방사성- 또는 다른 표지를 공지의 방식으로 접합체에 혼입시킬 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 생합성될 수도 있고, 또는 예를 들어 수소 대신에 불소-19를 포함하는 적합한 아미노산 전구체를 사용한 화학적 아미노산 합성에 의해 합성될 수도 있다. tc99m 또는 I123, Re186, Re188 및 In111과 같은 표지가 펩티드 내의 시스테인 잔기를 통해 부착될 수 있다. 이트륨-90은 리신 잔기를 통해 부착될 수 있다. 요오도겐(IODOGEN) 방법 (문헌 [Fraker et al., (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57])을 사용하여 요오드-123을 혼입시킬 수 있다. 문헌 [Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy (Chatal, CRC Press 1989)]에는 다른 방법이 상세히 기재되어 있다.
항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 2관능성 단백질 커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 2관능성 유도체 (예컨대 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사선뉴클레오티드를 항체에 접합시키기 위한 예시적인 킬레이트화제이다. WO 94/11026을 참조한다. 링커는 세포 내에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산 불안정성 링커, 펩티다제-감수성 링커, 광분해성 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드-함유 링커 (문헌 [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)]; 미국 특허 번호 5,208,020)가 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물은 시판하는 (예를 들어 피어스 바이오테크놀로지, 인크. (미국 일리노이주 록포드 소재)로부터의) 가교결합 시약: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC, 및 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트)을 사용하여 제조된 ADC를 명백하게 고려하지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 문헌 [2003-2004 Applications Handbook and Catalog]의 467-498 페이지를 참조한다.
항체 약물 접합체의 제조
항체 약물 접합체 (ADC)에서, 항체 (Ab)는 링커 (L)를 통해 항체당 하나 이상의 약물 모이어티 (D), 예를 들어 약 1 내지 약 20개의 약물 모이어티에 접합된다. 하기 화학식 I의 ADC는 이하를 비롯하여, 당업자에게 공지되어 있는 유기 화학 반응, 조건, 및 시약을 이용하여 여려 경로로 제조할 수 있다: (1) 항체의 친핵성 기를 2가 링커 시약과 반응시켜, 공유결합을 통해 Ab-L을 형성시킨 후, 이를 약물 모이어티 D와 반응시키는 방법; 및 (2) 약물 모이어티의 친핵성 기를 2가 링커 시약과 반응시켜, 공유결합을 통해 D-L을 형성시킨 후, 이를 항체의 친핵성 기와 반응시키는 방법. ADC를 제조하는 추가의 방법은 본원에 기재되어 있다.
<화학식 I>
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링커는 하나 이상의 링커 성분으로 구성될 수 있다. 예시적인 링커 성분에는 6-말레이미도카프로일 ("MC"), 말레이미도프로파노일 ("MP"), 발린-시트룰린 ("val-cit"), 알라닌-페닐알라닌 ("ala-phe"), p-아미노벤질옥시카르보닐 ("PAB"), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트 ("SPP"), N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1 카르복실레이트 ("SMCC"), 및 N-숙신이미딜 (4-요오도-아세틸) 아미노벤조에이트 ("SIAB")가 포함된다. 부가적인 링커 성분이 당업계에 공지되어 있고, 일부는 본원에서 기재된다. 또한, 2004년 11월 5일자로 출원된 미국 연속 출원 번호 10/983,340의 "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"를 참조한다.
일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 예시적인 아미노산 링커 성분은 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드 또는 펜타펩티드를 포함한다. 예시적인 디펩티드에는 발린-시트룰린 (vc 또는 val-cit), 알라닌-페닐알라닌 (af 또는 ala-phe)이 포함된다. 예시적인 트리펩티드에는 글리신-발린-시트룰린 (gly-val-cit) 및 글리신-글리신-글리신 (gly-gly-gly)이 포함된다. 아미노산 링커 성분을 포함하는 아미노산 잔기는 자연적으로 발생하는 것들 및 또한 소수의 아미노산 및 비-자연 발생 아미노산 유사체, 예컨대 시트룰린을 포함한다. 아미노산 링커 성분은 특정 효소, 예를 들어 종양-관련 프로테아제, 카텝신 B, C 및 D, 또는 플라스민 프로테아제에 의한 효소적 절단에 대한 이들의 선택도 측면에서 디자인되고 최적화될 수 있다.
항체상의 친핵성 기는 (i) N-말단 아민기, (ii) 측쇄 아민기, 예를 들어 리신, (iii) 측쇄 티올기, 예를 들어 시스테인, 및 (iv) 항체가 글리코실화되는 당 히드록실기 또는 아미노기를 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 아민, 티올 및 히드록실기는 친핵성이고, 반응하여 링커 모이어티 및 링커 시약 상의 친전자성 기, 예를 들어 (i) 활성 에스테르, 예컨대 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예컨대 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카르복실 및 말레이미드기와 공유 결합을 형성할 수 있다. 특정 항체는 환원가능한 쇄간 디술피드, 즉 시스테인 브릿지를 갖는다. 환원제, 예컨대 DTT (디티오트레이톨) 처리를 통해 항체를 링커 시약과의 접합에 반응성이 되도록 할 수 있다. 따라서, 각각의 시스테인 브릿지는 이론상 2개의 반응성 티올 친핵성 기를 형성할 것이다. 리신을 2-이미노티올란 (트라우트 시약)과 반응시켜서 아민을 티올로 전환시킴으로써 추가의 친핵성 기를 항체에 도입할 수 있다. 반응성 티올기는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그보다 많은 수의 시스테인 잔기를 도입함으로써 (예를 들어, 하나 이상의 비-천연 시스테인 아미노산 잔기를 포함하는 돌연변이체 항체를 제조함으로써) 항체 (또는 그의 단편)에 도입될 수 있다.
항체 약물 접합체는 또한 링커 시약 또는 약물 상의 친핵 치환기와 반응할 수 있는 친전자성 모이어티를 도입하기 위한 항체의 변형에 의해 생산될 수 있다. 글리코실화된 항체의 당을, 예를 들어 퍼요오데이트 산화 시약으로 산화시켜서 링커 시약 또는 약물 모이어티의 아민기와 반응할 수 있는 알데히드 또는 케톤 기를 형성할 수 있다. 생성되는 이민 쉬프 염기성 기는 안정적인 연결부를 형성할 수도 있거나, 또는 예를 들어 보로히드라이드 시약에 의해 환원되어 안정적인 아민 연결부를 형성할 수도 있다. 한 실시양태에서, 글리코실화된 항체의 탄수화물 부분을 갈락토스 옥시다제 또는 나트륨 메타-퍼요오데이트와 반응시키면, 약물상의 적절한 기와 반응할 수 있는 카르보닐 (알데히드 및 케톤)기가 단백질 내에 생성될 수 있다 (헤르만슨, 바이오컨쥬케이트 테크닉스(Hermanson, Bioconjugate Techniques)). 또 다른 실시양태에서, N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기를 함유하는 단백질을 나트륨 메타-퍼요오데이트와 반응시키면, 첫번째 아미노산 대신에 알데히드가 생성될 수 있다 (문헌 [Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146]; US 5362852). 그러한 알데히드는 약물 모이어티 또는 링커 친핵체와 반응할 수 있다.
유사하게, 약물 모이어티 상의 친핵성 기는 (i) 활성 에스테르, 예컨대 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예컨대 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카르복실 및 말레이미드기를 포함하는, 링커 모이어티 및 링커 시약 상의 친전자성 기와 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있는, 아민, 티올, 히드록실, 히드라지드, 옥심, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트, 및 아릴히드라지드기를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
별법적으로, 항체 및 세포독성제를 포함하는 융합 단백질은 예를 들어 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. DNA의 길이는 서로 인접하거나 접합체의 목적하는 특성을 파괴하지 않는 링커 펩티드를 코딩하는 영역에 의해 분리된, 접합체의 2개 부분을 코딩하는 각각의 영역을 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체를 종양 예비표적화에 활용하기 위해 "수용체" (상기, 스트렙타비딘)에 접합시킬 수 있고, 항체-수용체 접합체를 환자에게 투여한 다음, 소실제를 사용하여 결합되지 않은 접합체를 순환계로부터 제거하고, 이어서 세포독성제 (예를 들어, 방사성 뉴클레오티드)에 접합된 "리간드" (예를 들어, 아비딘)를 투여한다.
제약 제제
본 발명의 항체를 포함하는 치료학적 제제는 저장을 위해, 목적하는 순도를 갖는 항체를 임의의 생리학상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000)])와 수용액, 동결건조되거나 다른 건조된 제제의 형태로 혼합함으로써 제조된다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 히스티딘 및 기타 유기산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 기타 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 금속 착체 (예를 들어, Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함할 수 있다.
본원에서의 제제는 치료될 특정 적응증에 필요하다면 1가지를 초과하는 활성 화합물, 바람직하게는 서로에게 역효과를 일으키지 않는 보완적인 활성이 있는 것들을 또한 함유할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 유효한 양으로 조합되어 적합하게 존재한다.
활성 성분은 예를 들어 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 내에, 또는 마크로에멀젼 내에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000)]에 개시되어 있다.
생체내 투여에 사용될 제제는 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.
서방성 제제를 제조할 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 본 발명의 이뮤노글로불린을 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이러한 매트릭스는 성형 용품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 서방성 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산 및 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 이루어진 주사가능한 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 예컨대 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일을 초과하여 분자를 방출할 수 있는 반면, 특정 히드로겔은 단백질을 더 짧은 기간 동안 방출한다. 캡슐화된 이뮤노글로불린이 오랜 시간 동안 신체 내에 유지되는 경우, 이들은 37℃에서 습기에 노출될 때 변성 또는 응집되어 생물학적 활성의 손실 및 면역원성의 가능한 변화가 야기될 수 있다. 수반된 메카니즘에 따라 안정화를 위한 합리적인 전략이 고안된다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 상호교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 발견되면, 안정화는 술프히드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 수분 함량의 제어, 적절한 첨가제의 사용 및 특정 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 달성될 수 있다.
용도
본 발명의 항체는, 예를 들어 시험관내, 생체외 및 생체내 치료 방법에서 사용될 수 있다.
본 발명은 EGFL7 발현 및/또는 활성, 예컨대 증가된 발현 및/또는 활성 또는 바람직하지 않은 발현 및/또는 활성과 관련된 질환 상태를 조정하는데 유용한 방법 및 조성물을 제공하며, 상기 방법은 유효량의 항-EGFL7 항체를 그러한 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 종양, 암, 및/또는 세포 증식성 장애를 치료하거나 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 유효량의 항-EGFL7 항체를 그러한 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 혈관신생을 억제하는 방법을 제공하며, 그러한 방법은 유효량의 항-EGFL7 항체를 그러한 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 또 다른 항혈관신생제의 효능을 향상시키는 방법을 제공하며, 그러한 방법은 유효량의 항-EGFL7 항체를 그러한 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 개체는 종양, 암, 및/또는 세포 증식성 장애를 갖는다. 일부 실시양태에서, 다른 항혈관신생제는 VEGF, 예를 들어 항-VEGF 항체를 표적으로 한다.
모노클로날 및/또는 폴리클로날 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 친화성 성숙 항체, 인간화 항체, 및/또는 항체 단편을 비롯하여 임의의 적합한 항-EGFL7 항체는 치료 방법에 사용될 수 있음을 이해한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 기재하는 임의의 항-EGFL7 항체가 치료에 사용된다.
본원의 임의의 방법 중, 한 방법은 대상체 또는 환자에게 본원의 항체와 함께 유효량의 제2 의약을 투여할 수 있고 (이때 본원의 항체는 제1 의약임), 제2 의약은 치료를 필요로 하는 대상체에서 상태를 치료할 수 있는 또 다른 활성제이다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 또 다른 항체, 화학요법제(들) (화학요법제 칵테일 포함), 항혈관신생제(들), 면역억제제(들), 시토카인(들), 시토카인 길항제(들), 및/또는 성장 억제제(들)과 함께 공동 투여될 수 있다. 이같은 제2 의약의 유형은 장애의 유형, 질환의 중증도, 환자의 상태 및 연령, 사용하는 제1 의약의 유형 및 용량 등을 비롯한 다양한 인자에 의해 좌우된다.
예를 들어 본 발명의 항체가 종양 성장을 억제하는 경우, 이를 역시 종양 성장을 억제하는 하나 이상의 다른 치료제와 조합하는 것이 특히 바람직할 수 있다. 예를 들어, 치료 섭생, 예를 들어 결장직장암, 폐암, 간세포 암종, 유방암 및/또는 췌장암을 비롯하여 본원에서 기재하는 임의의 질환을 치료하는데 있어서 본 발명의 항체를 항혈관신생제, 예컨대 항-VEGF 항체 (예를 들어, 아바스틴®) 및/또는 항-ErbB 항체 (예를 들어 헤르셉틴® 트라스트주맙 항-HER2 항체 또는 HER2의 도메인 II에 결합하는 항-HER2 항체, 예컨대 옴니타르그(OMNITARG)™ 페르투주맙 항-HER2 항체)와 조합할 수 있다. 일부 경우에, 이중특이적 항체를 이용하여 이전 조합을 달성할 수 있다. 별법적으로 또는 추가로, 환자는 조합된 방사선 요법 (예를 들어, 외부 빔 조사 또는 방사성 표지된 작용제, 예컨대 항체에 의한 요법)을 받을 수도 있다. 상기 언급된 이러한 조합 요법에는 조합 투여 (이 경우에는 2종 이상의 작용제가 동일 또는 별도 제제에 포함됨) 및 별도 투여가 포함되고, 이 경우 본 발명 항체는 보조 요법 또는 요법들의 투여 전 및/또는 후에 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체를 또 다른 생물학적 분자, 예를 들어 또 다른 항체와 같은 비교적 비-세포독성인 작용제와 조합하는 것은 항체를 세포에 매우 독성인 기타 작용제인 화학요법제와 조합하는 것에 비해 세포독성을 감소시킬 것으로 기대된다.
본원의 항체와 하나 이상의 제2 의약 조합물에 의한 치료는 바람직하게는 암의 징후나 증상을 개선시킨다. 예를 들어, 이같은 요법은 제2 의약 (예를 들어, 화학요법제 단독) 만으로 치료받은 환자에 비해 생존기간 (전체 생존기간 및/또는 무진행 생존기간)을 개선시킬 수 있고/거나, 객관적인 반응 (부분적 또는 완전한 반응, 바람직하게는 완전한 반응)을 야기할 수 있다. 또한, 본원의 항체 및 하나 이상의 제2 의약(들)의 조합물에 의한 치료는 바람직하게는 환자에 대해 추가적이고, 보다 바람직하게는 상승작용적 (또는 추가적인 것 보다 훨씬 더 큰) 치료학적 이점을 야기한다. 바람직하게는, 이러한 조합물 방법에서 제2 의약의 적어도 한번의 투여 및 본원의 항체의 적어도 한번의 투여 사이의 시간은 약 1 개월 이하, 보다 바람직하게는 약 2 주 이하이다.
암의 치료를 위해, 제2 의약은 바람직하게는 또 다른 항체, 화학요법제 (화학요법제 칵테일 포함), 항혈관신생제, 면역억제제, 전구약물, 시토카인, 시토카인 길항제, 세포독성 방사선요법제, 코르티코스테로이드, 항구토제, 암 백신, 진통제, 항-혈관 작용제 및/또는 성장 억제제이다. 세포독성제에는 DNA와 상호작용하는 작용제, 항대사물, 토포이소머라제 I 또는 II 억제제 또는 스핀들 억제제 또는 안정화 작용제 (예를 들어, 바람직하게는 빈카 알칼로이드, 보다 바람직하게는 빈블라스틴, 데옥시빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈, 비네피딘, 빈포실틴, 빈졸리딘 및 빈푸닌으로부터 선택됨), 또는 화학요법에 사용되는 임의의 작용제, 예컨대 5-FU, 탁산, 독소루비신 또는 덱사메타손이 포함된다.
일부 실시양태에서, 제2 의약은 암을 치료하는데 사용되는 또 다른 항체, 예컨대 HER2/neu 수용체의 세포외 도메인에 대해 지시된 항체, 예를 들어 트라스투주맙, 또는 그의 기능적 단편 중 하나, 판-HER 억제제, Src 억제제, MEK 억제제 또는 EGFR 억제제 (예를 들어, 항-EGFR 항체 (예컨대 EGFR의 티로신 키나제 활성을 억제하는 것), 바람직하게는 마우스 모노클로날 항체 225, 그의 마우스-인간 키메라 유도체 C225, 또는 이러한 항체 225로부터 유래되거나 천연 작용제로부터 유래된 인간화 항체, 디아닐리노프탈이미드, 피라졸로- 또는 피롤로피리도피리미딘, 퀴나질린, 게피티닙, 에를로티닙, 세툭시맙, ABX-EFG, 카네르티닙, EKB-569 및 PKI-166) 또는 이중-EGFR/HER-2 억제제, 예컨대 라파타닙이다. 부가적인 제2 의약으로는 알렘투주맙 (캄패스(CAMPATH)™), FavID (IDKLH), 글리코실화가 변경된 CD20 항체, 예컨대 GA-101/글리카르트(GLYCART)™, 오블리메르센 (게나센스(GENASENSE)™), 탈리도미드 및 그의 유사체, 예컨대 레날리도미드 (레브리미드(REVLIMID)™), 이마티닙, 소라페닙, 오파투무맙 (휴맥스(HUMAX)-CD20™), 항-CD40 항체, 예를 들어 SGN-40 및 항-CD-80 항체, 예를 들어 갈릭시맙이 포함된다.
항구토제는 바람직하게는 온단세트론 히드로클로라이드, 그라니세트론 히드로클로라이드, 메트로클로프라미드, 돔페리돈, 할로페리돌, 시클리진, 로라제팜, 프로클로르페라진, 덱사메타손, 레보메프로마진 또는 트로피세트론이다. 백신은 바람직하게는 GM-CSF DNA 및 세포 기반 백신, 수지상 세포 백신, 재조합 바이러스 백신, 열 충격 단백질 (HSP) 백신, 동종이계 또는 자가 종양 백신이다. 진통제는 바람직하게는 이부프로펜, 나프록센, 콜린 마그네슘 트리살리실레이트 또는 옥시코돈 히드로클로라이드이다. 항-혈관 작용제는 바람직하게는 베바시주맙 또는 rhuMAb-VEGF이다. 추가의 제2 의약으로는 항-증식성 작용제, 예컨대 파르네실 단백질 트랜스퍼라제 억제제, 항-VEGF 억제제, p53 억제제 또는 PDGFR 억제제가 포함된다. 본원의 제2 의약은 또한 생물학적으로 표적화된 요법, 예컨대 예를 들어 특정 수용체에 대한 항체에 의한 치료 뿐만 아니라 소분자 표적화된 요법을 포함한다.
본원에 기재된 것들, 예를 들어 정의 섹션에 기재된 것들, 및 예를 들어 문헌 [Carmeliet and Jain, Nature 407:249-257 (2000)]; [Ferrara et al., Nature Reviews:Drug Discovery, 3:391-400 (2004)]; 및 [Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)]에 기재된 것들을 비롯한 많은 항혈관신생제가 확인되어 있고 당업계에 공지되어 있다. 또한, 미국 특허 출원 US20030055006을 참조한다. 한 실시양태에서, 항-EGFL7 항체는 예를 들어 가용성 VEGF 수용체 (예를 들어, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, 뉴로필린 (예를 들어, NRP1, NRP2)) 단편, VEGF 또는 VEGFR을 차단할 수 있는 압타머, 중화 항-VEGFR 항체, VEGFR 티로신 키나제 (RTK)의 저분자량 억제제, VEGF에 대한 안티센스 전략, VEGF 또는 VEGF 수용체에 대한 리보자임, VEGF의 길항제 변이체, 및 이들의 임의의 조합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 항-VEGF 중화 항체 (또는 단편) 및/또는 또 다른 VEGF 길항제 또는 VEGF 수용체 길항제와 조합되어 사용된다. 별법적으로 또는 추가로, VEGF 길항제 및 기타 작용제에 더하여 2 이상의 혈관생성 억제제가 임의로 환자에게 공동-투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 추가적인 치료제, 예를 들어, 항암제가 항-EGFL7 항체, VEGF 길항제, 및 항혈관신생제와 조합되어 투여될 수 있다.
본원에 유용한 화학요법제가 상기에서, 예를 들어 "화학요법제"의 정의에 지개되어 있다.
이같은 제2 의약은 본원의 항체 투여 이후 48 시간 이내, 또는 상기 작용제 이후 24 시간 이내, 또는 12 시간 이내, 또는 3-12 시간 이내에 투여될 수 있거나, 또는 미리 정해둔 시간에 걸쳐, 바람직하게는 약 1 내지 2 일에 걸쳐 투여될 수 있다. 또한, 이같은 작용제의 용량은 필요량 이하일 수 있다.
본원에서의 항체는 제2 의약과 동시에, 순차적으로 또는 교대로, 또는 다른 치료법과 비-반응성일 때 투여될 수 있다. 따라서, 제2 의약의 조합 투여는 별도의 제제 또는 단일 제약 제제를 사용하는 공동 투여 (동시 투여), 및 임의 순서의 연속 투여 (바람직하게는, 양쪽 (또는 모든) 의약들이 이들의 생물학적 활성을 동시에 발휘하는 기간이 있음)를 포함한다. 모든 이들 제2 의약은 서로 조합하여 사용할 수도 있고, 또는 그 자체를 제1 의약과 함께 사용할 수도 있기 때문에, 본원에서 사용된 바와 같은 "제2 의약"이라는 표현은 이것이 각각 제1 약물에 추가되는 유일한 의약라는 것을 의미하지 않는다. 따라서, 제2 의약이 1종의 의약일 필요는 없고, 1종 초과의 이러한 약물로 이루어지거나 이것을 포함할 수 있다.
본원에서 제시되는 상기 제2 의약은 일반적으로 제1 의약과 동일한 투여량으로 동일한 투여 경로로, 또는 제1 의약의 약 1 내지 99％의 투여량으로 사용된다. 이러한 제2 의약이 조금이라도 사용되는 경우, 바람직하게는 이들은 특히 제1 의약의 초기 투여 이후의 투여시에 제1 의약이 존재하지 않는 경우보다 더 적은 양으로 사용되어, 이에 의해 야기되는 부작용을 제거하거나 감소시킨다.
본 발명은 또한 재발성 종양 성장 또는 재발성 암 세포 성장을 억제 또는 예방하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 재발성 종양 성장 또는 재발성 암 세포 성장은 1종 이상의 현재 이용가능한 요법 (예를 들어, 암 요법, 예컨대 화학요법, 방사선 요법, 수술, 호르몬 요법 및/또는 생물학적 요법/면역요법, 항-VEGF 항체 요법, 특히 특정 암에 대한 표준 치료법)을 받고 있거나 이러한 요법으로 치료받은 환자에서 상기 요법이 상기 환자의 치료에 임상적으로 적절하지 못하거나 또는 환자가 상기 요법의 임의의 이로운 효과를 더이상 받지 못하여 이들 환자에게 추가의 효과적인 요법이 필요한 상태를 기재하는데 사용된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 상기 어구는 예를 들어 요법에 반응하지만 부작용으로 고통받는 환자, 내성이 발달된 환자, 요법에 반응하지 않는 환자, 요법에 만족스럽게 반응하지 않는 환자 등을 기재하는 "비-반응성/불응성" 환자의 상태를 지칭할 수도 있다. 다양한 실시양태에서, 암은 암 세포의 수가 유의하게 감소되지 않았거나 증가되었거나, 또는 종양 크기가 유의하게 감소되지 않았거나 증가되었거나, 또는 암 세포의 수 또는 크기에서 임의의 추가의 감소가 일어나지 못한 경우에 재발성 종양 성장 또는 재발성 암 세포 성장이다. 암 세포가 재발성 종양 성장 또는 재발성 암 세포 성장인지를 결정하는 것은, 이러한 정황에서의 "재발성" 또는 "불응성" 또는 "비-반응성"의 당업계에서 허용되는 의미를 사용하여, 암 세포에 대한 치료의 유효성을 검정하기 위한 당업계 공지의 임의의 방법으로 생체내 또는 시험관내 이루어질 수 있다. 항-VEGF 치료에 내성인 종양은 재발성 종양 성장의 예이다.
본 발명은 대상체에서 재발성 종양 성장 또는 재발성 암 세포 성장을 차단 또는 감소시키기 위해 항-EGFL7 항체를 투여함으로써, 이러한 대상체에서 재발성 종양 성장 또는 재발성 암 세포 성장을 차단 또는 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 길항제는 다른 암 치료 이후에 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항-EGFL7 항체는 암 요법과 동시에 투여된다. 별법적으로 또는 추가로, 항-EGFL7 항체 요법은 또 다른 암 요법과 교대로 하며, 이는 임의 순서로 수행될 수 있다. 본 발명은 또한 암에 걸리기 쉬운 환자에서 암의 발병 또는 재발을 예방하기 위해 1종 이상의 억제성 항체를 투여하는 방법을 포함한다. 일반적으로, 대상체는 암 요법을 받았거나 현재 암 요법을 받고 있는 중이다. 한 실시양태에서, 암 요법은 항혈관신생제, 예를 들어 VEGF 길항제 처치이다. 항혈관신생제는 당업계에 공지된 것, 및 본원에서 정의 표제하의 섹션에 기재된 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 항혈관신생제는 항-VEGF 중화 항체 또는 단편 (예를 들어, 인간화 A4.6.1, 아바스틴® (제넨테크, 캘리포니아주 사우쓰 샌 프란시스코 소재), Y0317, M4, G6, B20, 2C3 등)이다. 예를 들어 미국 특허 6,582,959, 6,884,879, 6,703,020; WO98/45332; WO 96/30046; WO94/10202; EP 0666868B1; 미국 특허 출원 20030206899, 20030190317, 20030203409, 및 20050112126; 문헌 [Popkov et al., Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004)]; 및 WO2005012359를 참조한다. 재발성 종양 성장 또는 재발성 암 세포 성장을 차단 또는 감소시키기 위해 추가의 작용제를 VEGF 길항제 및 항-EGFL7 항체와 조합하여 투여할 수 있다.
본 발명의 항체 (및 보조 치료제)은 비경구, 피하, 복강내, 폐내 및 비내, 및 원한다면 국소 치료용의 병변내 투여를 비롯한 임의의 적절한 수단으로 투여된다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 추가로, 항체는 특히 항체의 용량을 감소시킨 펄스 주입에 의해 적합하게 투여된다. 투여는 임의의 적합한 경로, 예를 들어 부분적으로는 투여가 단기인지 장기인지에 따라 정맥내 또는 피하 주사와 같은 주사에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 항체의 결합 표적의 위치는 항체의 제조 및 투여에 있어서 고려될 수 있다. 결합 표적이 세포내 분자일 경우, 본 발명의 특정 실시양태는 결합 표적이 위치하는 세포에 도입되도록 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 내부체로서 세포내에서 발현될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "내부체"는, 예를 들어 문헌 [Marasco, Gene Therapy 4: 11-15 (1997)]; [Kontermann, Methods 34: 163-170 (2004)]; 미국 특허 번호 6,004,940 및 6,329,173; 미국 특허 출원 공개공보 번호 2003/0104402, 및 PCT 공보 번호 WO2003/077945에 기재된 바와 같이, 세포내에서 발현되고 표적 분자에 선택적으로 결합할 수 있는 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 지칭한다. 또한, 예를 들어 세포내 항체를 생성하기 위한 유전자 요법의 사용에 관한, 1996년 3월 14일에 공개된 WO96/07321을 참조한다.
내부체의 세포내 발현은 표적 세포로의 목적하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 코딩하는 핵산 (항체 또는 항원 결합 단편을 코딩하는 유전자에 정상적으로 회합되어 있는 야생형 리더 서열 및 분비 신호가 결여된 것)을 도입하는 것에 의해 영향을 받을 수 있다. 모든 또는 일부의 본 발명의 항체를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 표적 세포에 전달하여 하나 이상의 내부체를 발현시킬 수 있고, 이는 세포내 표적 폴리펩티드에 결합하여 표적 폴레펩티드의 활성을 조정할 수 있다. 핵산을 세포에 도입하는 임의의 표준 방법을 사용할 수 있고, 예를 들어 미세주사, 탄도 주사, 전기천공, 인산칼슘 침전, 리포좀, 및 관심 핵산을 운반하는 레트로바이러스성, 아데노바이러스성, 아데노-관련 바이러스성 및 우두 벡터에 의한 형질감염이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
특정 실시양태에서, 핵산 (임의로 벡터에 함유된 것)을 환자의 세포에 생체내적 방법 및 생체외적 방법으로 도입할 수 있다. 생체내 전달의 일례에서, 핵산을 환자에, 예를 들어 치료적 개입이 요구되는 부위에 직접 주사한다. 생체내 전달의 추가의 예에서, 바이러스성 벡터 (예컨대 아데노바이러스, 제I형 단순 포진 바이러스, 또는 아데노-관련 바이러스)에 의한 형질감염 및 지질-기반 시스템 (유전자의 지질-매개 전달에 유용한 지질은 예를 들어 DOTMA, DOPE 및 DC-Chol임)을 이용하여 핵산을 세포에 도입한다. 특정 유전자 마킹 및 유전자 요법 프로토콜의 검토를 위해, 문헌 [Anderson et al., Science 256:808-813 (1992)], 및 WO 93/25673 및 여기서 언급된 참고문헌을 참조한다. 생체외 치료의 예에서는, 환자의 세포를 제거하고, 단리된 세포에 핵산을 도입하고, 변형된 세포를 환자에게 직접적으로, 또는 예를 들어 환자에게 이식되는 다공성 막 내에 캡슐화하여 투여한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,892,538 및 5,283,187 참조). 핵산의 생체외 전달을 위해 흔히 사용되는 벡터는 레트로바이러스성 벡터이다.
또 다른 실시양태에서, 항체를 내재화하는 방법이 제공된다. 항체는 세포 내로의 항체의 전달을 강화하는 특정 특성을 지닐 수 있거나, 또는 이같은 특성을 지니도록 변형될 수 있다. 이를 달성하기 위한 기술이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 항체의 양이온화는 세포내로의 그의 흡수를 용이하게 하는 것으로 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,703,019 참조). 리포펙션 또는 리포솜을 또한 사용하여 항체를 세포 내로 전달할 수 있다. 항체 단편이 사용되는 경우에는, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 최소형 억제성 단편이 유리하다. 예를 들어 항체의 가변-영역 서열을 기초로 하여, 표적 단백질 서열에 결합하는 능력을 보유하는 펩티드 분자를 디자인할 수 있다. 이러한 펩티드는 화학적으로 합성하고/하거나 재조합 DNA 기술에 의해 생산할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)]을 참조한다.
표적 세포 내로의 항체의 진입이 당업계에 공지된 방법에 의해 향상될 수 있다. 예를 들어, 특정 서열, 예컨대 HIV Tat 또는 안테나페디아(Antennapedia) 호메오도메인(homeodomain) 단백질이 세포막을 가로지르는 이종성 단백질의 효율적인 흡수를 지시할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), 96:4325-4329]을 참조한다.
항체의 결합 표적이 뇌에 위치한 경우, 본 발명의 특정 실시양태는 혈액-뇌 장벽을 통과하는 항체를 제공한다. 물리적 방법, 지질 기재의 방법, 줄기 세포 기재의 방법, 및 수용체 및 채널 기재의 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 혈액-뇌 장벽을 가로질러 분자를 수송하는 당업계 공지의 접근법이 여러가지 존재한다.
혈액-뇌 장벽을 가로지르는 항체를 수송하는 물리적 방법에는, 혈액-뇌 장벽을 완전히 포위하는 것, 또는 혈액-뇌 장벽에 구멍을 생성시키는 것이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 우회적 방법은 뇌로의 직접 주사 (예를 들어, 문헌 [Papanastassiou et al., Gene Therapy 9: 398-406 (2002)] 참조), 세포간 주입/대류-증진 전달 (예를 들어, 문헌 [Bobo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2076-2080 (1994)] 참조), 및 뇌 내 전달 장치의 이식 (예를 들어, 문헌 [Gill et al., Nature Med. 9: 589-595 (2003)]; 및 길포드 파마슈티칼(Guildford Pharmaceutical)의 글리아델 웨이퍼즈(Gliadel Wafers)™ 참조)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 장벽 내 개구의 생성 방법에는 초음파 (예를 들어, 미국 특허 공개공보 번호 2002/0038086 참조), 삼투압 (예를 들어, 고장성 만니톨의 투여에 의함 (문헌 [Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 & 2, Plenum Press, N.Y. (1989)]), 예를 들어 브래디키닌 또는 투과화제 A-7에 의한 투과화 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,112,596, 5,268,164, 5,506,206, 및 5,686,416 참조), 및 항체를 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터에 의한, 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 뉴런의 형질감염 (예를 들어, 미국 특허 공개공보 번호 2003/0083299 참조)이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
혈액-뇌 장벽을 가로지르는 항체를 수송하는 지질-기반 방법에는, 혈액-뇌 장벽의 혈관 내피세포 상의 수용체에 결합하는 항체 결합 단편에 커플링되는 리포좀에 항체를 봉입시키는 것 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개공보 번호 20020025313 참조), 및 저-밀도 리포단백질 입자 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개공보 번호 20040204354 참조) 또는 아포리포단백질 E (예를 들어, 미국 특허 출원 공개공보 번호 20040131692 참조)로 항체를 코팅하는 것이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
혈액-뇌 장벽을 가로지르는 항체를 수송하는 줄기 세포-기반 방법은 신경 전구 세포 (NPC)가 관심 항체를 발현하도록 유전자 조작한 다음, 치료할 개체의 뇌에 줄기 세포를 이식하는 것을 수반하였다. 문헌 [Behrstock et al., (2005) Gene Ther. 15 Dec. 2005 advanced online publication] (신경영양 인자 GDNF를 발현하도록 유전자 조작된 NPC를 설치류 및 영장류 모델의 뇌에 이식한 경우에 파킨슨병의 증상이 감소됨을 보고함)을 참조한다.
혈액-뇌 장벽을 가로지르는 항체를 수송하는 수용체 및 채널-기반 방법에는 혈액-뇌 장벽의 투과성을 증가시키기 위한 글루코코르티코이드 차단제의 사용 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개공보 번호 2002/0065259, 2003/0162695, 및 2005/0124533 참조); 칼륨 채널의 활성화 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개공보 번호 2005/0089473 참조); ABC 약물 수송체의 억제 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개공보 번호 2003/0073713 참조); 트랜스페린에 의한 항체 코팅 및 하나 이상의 트랜스페린 수용체의 활성 조절 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개공보 번호 2003/0129186 참조); 및 항체의 양이온화 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,004,697 참조)가 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항체는 우수 의료 실무와 일치하는 방식으로 제제화되고 투약되고 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려할 인자에는 치료할 특정 장애, 치료받을 특정 포유동물, 개별 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의료 전문인에게 공지된 다른 인자가 포함된다. 반드시 그럴 필요는 없지만, 임의로, 항체는 문제의 장애를 예방 또는 치료하는데 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와 함께 제제화된다. 이러한 다른 작용제의 유효량은 제제 내에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 다른 요인들에 의해 좌우된다. 이는 일반적으로 상기 기재된 바와 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 본원에 기재된 투여량의 약 1 내지 99％로, 또는 실험적으로/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 투여량 및 경로에 의해 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체의 적절한 투여량 (단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가의 치료제와 조합으로 사용될 때)은 치료될 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 담당 의사의 결정에 따라 결정될 것이다. 항체는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라서, 예를 들어 1회 이상의 별개 투여에 의해서든 아니면 연속식 주입에 의해서든지 상관없이, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg)의 항체가 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량이다. 한 가지 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 치료는 일반적으로 상태에 따라 질환 증상이 원하는 수준으로 저해될 때까지 지속된다. 항체의 한 가지 예시적인 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 이들의 임의의 조합) 중 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 매 3 주마다 투여될 수 있다 (예를 들어, 약 2회 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회 용량의 항체가 환자에게 제공되도록). 보다 높은 초기 부하 용량을 투여한 후, 1회 이상의 보다 낮은 용량을 투여할 수 있다. 예시적인 투약법은 항체를 약 4 mg/kg의 초기 부하 용량으로 투여한 후에 약 2 mg/kg씩의 매주 유지 용량으로 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 다른 투여 방식이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상적인 기술 및 검정에 의해 쉽게 모니터링된다.
진단 방법 및 검출 방법
본 발명의 항-EGFL7 항체는 또한 항체를 이하에 기재된 바와 같이 표지하고/거나 불용성 매트릭스 상에 고정시킨 특정 세포 또는 조직에서 EGFL7 발현을 검출하는 검정 (예컨대, 진단 또는 예측 검정)에 유용하다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 샘플에서 EGFL7-항-EGFL7 항체 복합체를 검출하는 것을 포함하는 EGFL7의 검출 방법을 제공한다. 본원에서 사용된 용어 "검출"은 대조군과 관련된 또는 대조군과 상관없는 정성적 및/또는 정량적 검출 (수준 측정)을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에서 기재하는 임의의 항-EGFL7 항체를 제공하며, 이때 항-EGFL7 항체가 검출가능한 표지를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에서 기재하는 임의의 항-EGFL7 항체 및 EGFL7 복합체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 복합체는 생체내 또는 시험관내에 존재한다. 일부 실시양태에서, 복합체는 암 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-EGFL7 항체는 검출가능하게 표지된다.
항-EGFL7 항체 (예를 들어, 본원에서 기재하는 임의의 EGFL7 항체)는 널리 공지되어 있는 수많은 검출 검정 방법 중 어느 하나에서 EGFL7을 검출하는데 사용될 수 있다.
예를 들어, 목적하는 공급원으로부터 샘플을 수득하고, 샘플과 항-EGFL7 항체를 혼합하여 항체가 혼합물에 존재하는 임의의 EGFL7과 함께 항체/EGFL7 복합체를 형성하도록 하고, 혼합물에 존재하는 임의의 항체/EGFL7 복합체를 검출하는 것에 의해 생물학적 샘플에서 EGFL7을 검정할 수 있다. 생물학적 샘플은 특정 샘플에 적합한 당업계에 공지된 방법에 의해서 검정용으로 제조될 수 있다. 샘플을 항체와 혼합하는 방법 및 항체/EGFL7 복합체를 검출하는 방법은 사용된 검정의 유형에 따라 선택된다. 이러한 검정에는 면역조직화학, 경쟁 및 샌드위치 검정, 및 입체 억제 검정이 포함된다. 샘플 제조를 위해, 포유동물 (전형적으로 인간 환자)로부터의 조직 또는 세포 샘플을 사용할 수 있다. 샘플의 예는 암세포, 예를 들어 결장, 유방, 전립선, 난소, 폐, 위, 췌장, 림프종 및 백혈병 암세포를 포함하고 이로 제한되지 않는다. EGFL7은 또한 혈청에서 측정할 수 있다. 샘플은 수술에 의한 절제, 흡인 또는 생검을 포함하나 이로 제한되지 않는 당업계에 공지된 다양한 절차에 의해 얻을 수 있다. 조직은 신선하거나 냉동될 수 있다. 한 실시양태에서, 샘플은 고정되고 파라핀 등에 포매된다. 조직 샘플은 통상의 방법으로 고정 (즉, 보존)될 수 있다 (예를 들어, 문헌 ["Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology," 3rd edition (1960) Lee G. Luna, HT (ASCP) Editor, The Blakston Division McGraw-Hill Book Company, New York]; [The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology (1994) Ulreka V. Mikel, Editor, Armed Forces Institute of Pathology, American Registry of Pathology, Washington, D.C.] 참조). 당업자라면, 샘플이 조직학적으로 염색되거나 또는 다른 방법에 의해 분석되는 목적에 따라 고정액의 선택이 결정됨을 인지하고 있을 것이다. 당업자라면 또한 고정 기간이 조직 샘플의 크기 및 사용된 고정액에 의존함을 인지하고 있을 것이다. 예를 들어, 중성 완충된 포르말린, 보우인(Bouin) 또는 파라포름알데히드를 사용하여 샘플을 고정시킬 수 있다. 일반적으로, 샘플을 먼저 고정시킨 후에 농도가 상승하는 일련의 알콜을 통해 탈수시켜서 조직 샘플이 절편화될 수 있도록 파라핀 또는 다른 절편화 매질로 침윤 및 포매시킨다. 다르게는, 조직을 절편화하여 수득된 절편을 고정시킬 수 있다. 예를 들어, 조직 샘플을 통상의 방법으로 파라핀에 포매시키고 처리할 수 있다 (예를 들어, 문헌 ["Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", 상기 문헌] 참조). 사용될 수 있는 파라핀의 예는 파라플라스트(Paraplast), 브롤로이드(Broloid) 및 티슈메이(Tissuemay)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 조직 샘플이 포매되면, 샘플을 마이크로톰 등으로 절편화시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 ["Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", 상기 문헌] 참조). 이러한 절차의 예를 들어, 절편의 두께는 약 3 ㎛ 내지 약 5 ㎛의 범위일 수 있다. 절편화되면, 절편을 여러가지 표준 방법을 통해 슬라이드에 부착시킬 수 있다. 슬라이드 접착제의 예는 실란, 젤라틴, 폴리-L-리신 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 파라핀 포매된 절편은 양으로 하전된 슬라이드 및/또는 폴리-L-리신으로 코팅된 슬라이드에 부착될 수 있다. 파라핀이 포매재로서 사용된 경우, 조직 절편을 일반적으로 탈파라핀화하고 물에 재수화시킨다. 조직 절편은 통상적인 여러가지 표준 방법을 통해 탈파라핀화될 수 있다. 예를 들어, 크실렌 및 점차적으로 농도가 감소하는 일련의 알콜을 사용할 수 있다 (예를 들어, 문헌 ["Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", 상기 문헌] 참조). 다르게는, 시판되는 탈파라핀화 비-유기 작용제, 예컨대 Hemo-De7 (CMS, 텍사스주 휴스톤 소재)을 사용할 수 있다.
EGFL7에 대한 분석 방법은 모두 하나 이상의 다음과 같은 시약을 사용한다: 표지된 EGFL7 유사체, 고정된 EGFL7 유사체, 표지된 항-EGFL7 항체, 고정된 항-EGFL7 항체 및 입체 접합체. 표지된 시약은 또한 "추적자"로 공지되어 있다.
사용되는 표지는 EGFL7 및 항-EGFL7 항체의 결합을 방해하지 않는 임의의 검출가능한 관능기이다. 다수의 표지가 면역검정에서의 사용에 대해 공지되어 있고, 그 예에는 직접 검출될 수 있는 모이어티, 예컨대 형광색소, 화학발광체 및 방사성 표지, 뿐만 아니라 검출하기 위해서 반응시키거나 유도시켜야 하는 모이어티, 예컨대 효소가 포함된다.
사용되는 표지는 EGFL7 및 항-EGFL7 항체의 결합을 방해하지 않는 임의의 검출가능한 관능기이다. 다수의 표지가 면역검정에서의 사용에 대해 공지되어 있고, 그 예에는 직접 검출될 수 있는 모이어티, 예컨대 형광색소, 화학발광체 및 방사성 표지, 뿐만 아니라 검출하기 위해서 반응시키거나 유도시켜야 하는 모이어티, 예컨대 효소가 포함된다. 이러한 표지의 예는 방사성 동위원소 32P, 14C, 125I, 3H 및 131I, 형광단, 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움베릴페론, 루시페라제, 예컨대 반딧불이 루시페라제 및 박테리아 루시페라제 (미국 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제, 예컨대 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, HRP와 같은 염료 전구체를 산화시키기 위해 과산화수소를 사용하는 효소와 커플링된 헤테로시클릭 옥시다제, 예컨대 유리카제 및 크산틴 옥시다제, 락토퍼옥시다제 또는 마이크로퍼옥시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 자유 라디칼 등을 포함한다.
이러한 표지들을 단백질 또는 폴리펩티드에 공유 결합시키기 위해 통상적인 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체를 상기-기재된 형광체, 화학발광체 및 효소 표지로 태깅하기 위하여 커플링제, 예로서, 디알데히드, 카르보디이미드, 디말레이미드, 비스-이미데이트, 비스-디아조화 벤지딘 등이 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 3,940,475 (형광측정법) 및 3,645,090 (효소); 문헌 [Hunter et al., Nature, 144: 945 (1962)]; [David et al., Biochemistry, 13: 1014-1021 (1974)]; [Pain et al., J. Immunol. Methods, 40: 219-230 (1981)]; 및 [Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30: 407-412 (1982)]을 참조한다. 본원에서 바람직한 표지는 양고추냉이 퍼옥시다제 및 알칼리성 포스파타제와 같은 효소이다. 효소를 비롯한, 상기와 같은 표지를 항체에 접합시키는 것은 면역검정 기법에 있어 당업자에게 표준의 조작 절차이다. 예를 들어, 문헌 [O'Sullivan et al., "Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay," in Methods in Enzymology, ed. J.J. Langone and H. Van Vunakis, Vol. 73 (Academic Press, New York, New York, 1981), pp. 147-166]을 참조한다.
특정 검정 방법에 대해서는 시약의 고정이 요구된다. 고정은 용액 내에 유리 상태로 남아있는 임의의 EGFL7로부터 항-EGFL7 항체를 분리하는 것을 수반한다. 이는 통상적으로 수-불용성 매트릭스 또는 표면에 흡착시키거나 (U.S. 3,720,760 (Bennich et al.)), 공유 커플링시키거나 (예를 들어, 글루타르알데히드 가교를 이용), 또는 항-EGFL7 항체 또는 EGFL7 유사체를 예를 들어 면역침전 이후 고정시키는 것에 의하는 것과 같이, 검정 절차 이전에 항-EGFL7 항체 또는 EGFL7 유사체를 불용성화하는 것에 의해 달성된다.
샘플 내 단백질의 발현은 면역조직화학 및 염색 프로토콜을 사용하여 검사할 수 있다. 조직 절편의 면역조직화학 염색은 샘플 내 단백질의 존재를 평가 또는 검출하는 신뢰할 수 있는 방법으로 나타난 바 있다. 면역조직화학 ("IHC") 기술은 프로브에 대한 항체를 이용하고, 일반적으로 발색 또는 형광 방법에 의해 계내에서 세포 항원을 가시화시킨다. 샘플 제조를 위해, 포유동물 (전형적으로 인간 환자)로부터의 조직 또는 세포 샘플을 사용할 수 있다. 샘플은 수술에 의한 절제, 흡인 또는 생검을 포함하나 이로 제한되지 않는 당업계에 공지된 다양한 절차에 의해 얻을 수 있다. 조직은 신선하거나 냉동될 수 있다. 한 실시양태에서, 샘플은 고정되고 파라핀 등에 포매된다. 조직 샘플은 통상의 방법에 의해 고정 (즉, 보존)될 수 있다. 당업자라면, 샘플이 조직학적으로 염색되거나 또는 다른 방법에 의해 분석되는 목적에 따라 고정액의 선택이 결정됨을 인지하고 있을 것이다. 당업자라면 또한 고정 기간이 조직 샘플의 크기 및 사용된 고정액에 의존함을 인지하고 있을 것이다.
IHC는 형태 염색 및/또는 형광 계내 혼성화와 같은 부가적인 기술과 함께 수행할 수 있다. 2가지 일반적인 IHC 방법; 즉 직접 및 간접 검정을 이용할 수 있다. 첫번째 검정에 따르면, 항체의 표적 항원 (예를 들어, EGFL7)에 대한 결합을 직접 측정한다. 이러한 직접 검정은 추가의 항체 상호작용 없이도 가시화될 수 있는 표지된 시약, 예를 들어 형광 태그 또는 효소-표지된 1차 항체를 사용한다. 전형적인 간접 검정에서는, 미접합 1차 항체가 항원에 결합한 후, 표지된 2차 항체가 상기 1차 항체에 결합한다. 2차 항체가 효소 표지에 접합된 경우, 항원이 가시화되도록 발색 또는 형광 기질을 첨가한다. 여러 2차 항체가 1차 항체 상의 상이한 에피토프와 반응할 수 있기 때문에 신호 증폭이 발생한다.
면역조직화학에 사용되는 1차 및/또는 2차 항체는 전형적으로 검출가능한 모이어티로 표지될 것이다. 수 많은 표지가 이용 가능하다.
앞서 논의한 샘플 제조 절차 외에, IHC 이전, 동안 또는 이후에 조직 절편을 추가로 처리하는 것이 바람직할 수 있는데, 예를 들어 시트레이트 완충제 중에서 조직 샘플을 가열하는 것과 같은 에피토프 회복 방법을 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Leong et al., Appl. Immunohistochem. 4(3):201 (1996)] 참조).
임의의 차단 단계 후에, 조직 절편을 1차 항체가 조직 샘플 중의 표적 단백질 항원에 결합하기에 적합한 조건하에 충분한 기간 동안 1차 항체에 노출시킨다. 이를 달성하기에 적절한 조건은 통상적인 실험으로 결정할 수 있다. 항체가 샘플에 결합하는 정도는 상기 논의된 검출가능한 표지 중 어느 하나를 사용하여 결정한다. 바람직하게는, 표지는 발색 기질, 예컨대 3,3'-디아미노벤지딘 발색원의 화학적 변경을 촉매하는 효소 표지 (예를 들어, HRPO)이다. 바람직하게는, 효소 표지는 1차 항체에 특이적으로 결합하는 항체에 접합된다 (예를 들어, 1차 항체는 토끼 폴리클로날 항체이고, 2차 항체는 염소 항-토끼 항체이다).
이와 같이 제조한 시료를 장착하여 커버 글라스를 덮을 수 있다. 이어서, 예를 들어 현미경을 사용하여 슬라이드 평가를 수행하고, 당업계에서 통상 사용되는 염색 강도 기준을 사용할 수 있다.
경쟁 또는 샌드위치 검정으로 공지된 다른 검정 방법도 잘 수립되어 있으며 상업적 진단 산업에서 널리 사용되고 있다.
경쟁 검정은 제한된 수의 항-EGFL7 항체 항원-결합 부위에 대해 시험 샘플 EGFL7과 경쟁하는 추적자 EGFL7 유사체의 능력에 의존한다. 항-EGFL7 항체를 일반적으로는 경쟁 전 또는 후에 불용성화시킨 다음, 항-EGFL7 항체에 결합된 추적자 및 EGFL7를 결합되지 않은 추적자 및 EGFL7로부터 분리한다. 이러한 분리는 경사분리 (결합 파트너가 사전에 불용화된 경우) 또는 원심분리 (결합 파트너가 경쟁 반응 후에 불용화된 경우)에 의해 달성된다. 시험 샘플 EGFL7의 양은 마커 물질의 양으로 결정되는 바와 같은 결합된 추적자의 양에 반비례한다. 기지의 양의 EGFL7에 대한 용량-반응 곡선을 제작하여 시험 결과와 비교함으로써 시험 샘플에 존재하는 EGFL7의 양을 양적으로 측정한다. 이러한 검정은, 측정가능한 마커로서 효소가 사용되는 경우에 ELISA 시스템이라 지칭된다.
"동종" 검정이라 불리는 또 다른 종류의 경쟁적 검정은 상 분리를 필요로 하지 않는다. 여기서는, 항-EGFL7 항체가 EGFL7에 결합하는 경우에 항-EGFL7 항체의 존재가 효소 활성을 변형시키도록, EGFL7과 효소의 접합체를 제조하여 사용한다. 이러한 경우, EGFL7 또는 그의 면역학적으로 활성인 단편을 2관능성 유기 가교에 의해 퍼옥시다제와 같은 효소에 접합시킨다. 항-EGFL7 항체의 결합이 표지의 효소 활성을 억제하거나 강화시키도록 항-EGFL7 항체와 함께 사용하기 위한 접합체가 선택된다. 상기 방법 그 자체는 EMIT이라는 명칭하에 널리 실시된다.
동종 검정을 위한 입체 장애 방법에서는 입체 접합체를 사용한다. 상기 접합체는, 합텐에 대한 항체가 실질적으로 항-EGFL7 항체와 동시에 접합체에 결합할 수 없도록, 작은 EGFL7 단편에 저분자량 합텐을 공유 결합시킴으로써 합성한다. 이 검정 절차하에서, 시험 샘플에 존재하는 EGFL7는 항-EGFL7 항체와 결합함으로써 항-합텐이 접합체에 결합하게 하여, 접합체 합텐의 특징 변화, 예를 들어 합텐이 형광단인 경우에는 형광의 변화를 일으킬 것이다.
샌드위치 검정은 EGFL7 또는 항-EGFL7 항체의 측정에 유용하다. 순차적 샌드위치 검정에서는, 고정된 항-EGFL7 항체를 사용하여 시험 샘플 EGFL7를 흡착하고, 세척에 의해 시험 샘플을 제거하고, 결합된 EGFL7를 사용하여 제2의 표지된 항-EGFL7 항체를 흡착한 다음, 결합된 물질을 잔류 추적자로부터 분리한다. 결합된 추적자의 양은 시험 샘플 EGFL7에 직접적으로 비례한다. "동시" 샌드위치 검정에서는, 표지된 항-EGFL7를 첨가하기 전에 시험 샘플을 분리하지 않는다. 항-EGFL7 모노클로날 항체를 하나의 항체로 사용하고, 폴리클로날 항-EGFL7 항체를 다른 항체로 사용하는 순차적 샌드위치 검정이, EGFL7에 대해 샘플을 시험하는 데 유용하다.
상기 내용은 단지 EGFL7에 대한 예시적인 검출 검정이다. 본원에 기재된 생물검정을 비롯하여, EGFL7을 측정하기 위한 항-EGFL7 항체를 사용하는 현재나 이후에 개발되는 다른 방법은 본 발명의 범주 내에 포함된다.
한 측면에서, 본 발명은 개체, 예컨대 인간 개체로부터 얻은 생물학적 샘플 중의 폴리뉴클레오티드(들) (예를 들어, EGFL7 폴리뉴클레오티드) (예를 들어, 그의 존재 또는 부재, 또는 양)를 검출하기 위한 방법을 제공한다. 폴리뉴클레오티드를 검출하는 다양한 방법이 사용될 수 있으며, 여기에는, 예를 들어 RT-PCR, 택맨, 증폭 방법, 폴리뉴클레오티드 마이크로어레이 등이 포함된다.
폴리뉴클레오티드 (예컨대 mRNA)의 검출 방법은 널리 공지되어 있고, 예를 들어 상보적 DNA 프로브를 사용하는 혼성화 검정 (예컨대, 표지된 EGFL7 리보프로브를 이용한 계내 혼성화), 노던 블롯 및 관련 기술, 및 다양한 핵산 증폭 검정 (예컨대 EGFL7에 특이적인 상보성 프라이머를 사용하는 RT-PCR, 및 다른 증폭 유형의 검출 방법, 예컨대 분지형 DNA, SPIA, 리보-SPIA, SISBA, TMA 등)이 포함된다.
포유동물 유래의 생물학적 샘플을, 예를 들어 노던 블롯, 도트 블롯 또는 PCR 분석을 이용하여 EGFL7 mRNA에 대해 편리하게 검정할 수 있다. 예를 들어, RT-PCR 검정, 예컨대 정량적 PCR 검정은 당업계에 공지되어 있다. 본 발명의 예시적인 실시양태에서, 생물학적 샘플 중의 EGFL7 mRNA를 검출하는 방법에는 적어도 하나의 프라이머를 이용하는 역전사에 의해 샘플로부터 cDNA를 생성하고; EGFL7 폴리뉴클레오티드를 센스 및 안티센스 프라이머로 사용하여 여기서 EGFL7 cDNA를 증폭시킴으로써 상기 생성된 cDNA를 증폭시키고; 증폭된 EGFL7 cDNA의 존재 또는 부재를 검출하는 것이 포함된다. 또한, 상기 방법에는, 생물학적 샘플 중의 EGFL7 mRNA의 양 (수준)을 측정하는 (예를 들어, 하우스키핑 유전자, 예컨대 액틴 패밀리 구성원의 비교 대조군 mRNA 서열 수준을 동시에 조사함으로써) 하나 이상의 단계가 포함될 수 있다. 임의로, 증폭된 EGFL7 cDNA의 서열을 결정할 수 있다.
프로브 및/또는 프라이머를 검출가능한 마커, 예컨대 방사성동위원소, 형광 화합물, 생물발광 화합물, 화학발광 화합물, 금속 킬레이터 또는 효소로 표지할 수 있다. 상기 프로브 및 프라이머를 샘플 중의 EGFL7 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하는데 사용할 수 있고, EGFL7 단백질 발현 세포를 검출하는 수단으로서 사용할 수 있다. 당업자가, 매우 많은 서로 다른 프라이머 및 프로브를 제조할 수 있고 (예를 들어, 본원에서 제공되는 서열에 기초하여), 이를 효율적으로 사용하여 EGFL7 mRNA를 증폭하고/거나, 클로닝하고/거나, 그의 존재 또는 부재 및/또는 양을 측정할 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명의 임의의 방법에는, 마이크로어레이 기술을 이용하여 조직 또는 세포 샘플 중의 폴리뉴클레오티드, 예컨대 EGFL7 폴리뉴클레오티드를 검출하는 것을 포함하는 프로토콜이 포함된다. 예를 들어, 핵산 마이크로어레이를 이용하여, 시험군 및 대조군 조직 샘플로부터 얻은 시험군 및 대조군 mRNA 샘플을 역전사시키고, 표지하여 cDNA 프로브를 제조한다. 이후, 프로브를 고체 지지체에 고정된 핵산의 어레이에 혼성화시킨다. 상기 어레이를 이 어레이의 각 구성원의 서열 및 위치를 알 수 있게 배열한다. 예를 들어, 특정 질환 상태에서 발현될 잠재력을 갖는 유전자의 선택물을 고체 지지체상에 배열할 수 있다. 특정 어레이 구성원을 갖는 표지된 프로브의 혼성화는, 프로브가 유래된 샘플이 상기 유전자를 발현함을 나타낸다. 질환 조직의 차등적 유전자 발현 분석은 가치있는 정보를 제공할 수 있다. 마이크로어레이 기술에서는 단일 실험 내에서 수천 개 유전자의 mRNA 발현 프로파일을 평가하기 위해 핵산 혼성화 기술 및 전산화 기술을 이용한다. (예를 들어, 2001년 10월 11일자로 공개된 WO 01/75166 참조; (예를 들어, 어레이 제작의 논의에 대해서는 U.S. 5,700,637, 미국 특허 5,445,934, 및 미국 특허 5,807,522, 문헌 [Lockart, Nature Biotechnology, 14:1675-1680 (1996)]; [Cheung, V.G. et al., Nature Genetics 21(Suppl):15-19 (1999)] 참조)). DNA 마이크로어레이는, 유리 또는 다른 기판에서 직접 합성되거나 이것으로 스팟팅되는 유전자 단편을 함유하는 미니어처 어레이이다. 수천개의 유전자는 통상적으로 단일 어레이로 나타낸다. 전형적인 마이크로어레이 실험은 다음 단계를 수반한다: 1. 샘플로부터 단리된 RNA로부터 형광 표지된 표적의 제조, 2. 표지된 표적의 마이크로어레이에 대한 혼성화, 3. 어레이의 세척, 염색 및 스캐닝, 4. 스캐닝된 영상의 분석 및 5. 유전자 발현 프로필의 생성. 현재, 2가지 주요 유형의 DNA 마이크로어레이가 사용된다: 올리고뉴클레오티드 (통상적으로, 25 내지 70 mer) 어레이 및 cDNA로부터 제조된 PCR 생성물을 함유하는 유전자 발현 어레이. 어레이를 형성하는 경우, 올리고뉴클레오티드는 미리 제작되어 표면에 스팟팅되거나, 또는 표면에서 직접 합성될 수 있다 (계내).
아피메트릭스 진칩(Affymetrix GeneChip)® 시스템은, 유리 표면상에서 올리고뉴클레오티드를 직접 합성하여 제작되는 어레이를 포함하는 시판되는 마이크로어레이 시스템이다. 프로브/유전자 어레이: 올리고뉴클레오티드 (일반적으로 25 mer)는 반도체-기재 포토리소그래피 및 고체상 화학적 합성 기술의 조합에 의해 유리 웨이퍼 상에서 직접 합성된다. 각각의 어레이는 최대 400,000개의 상이한 올리고를 함유하고, 각각의 올리고는 수백만개의 카피로 존재한다. 올리고뉴클레오티드 프로브는 어레이상의 공지된 위치에서 합성되기 때문에, 혼성화 패턴 및 신호 강도는 아피메트릭스 마이크로어레이 스위트(Affymetrix Microarray Suite) 소프트웨어에 의해 유전자 정체성 및 상대적인 발현 수준의 면으로 해석될 수 있다. 각각의 유전자는 어레이에서 일련의 상이한 올리고뉴클레오티드 프로브에 의해 나타난다. 각각의 프로브 쌍은 완전 매치 올리고뉴클레오티드 및 미스매치 올리고뉴클레오티드로 이루어진다. 완전 매치 프로브는 특정 유전자에 대해 정확하게 상보적인 서열을 갖기 때문에 유전자 발현을 결정한다. 미스매치 프로브는 중심 염기 위치에서의 단일 염기 치환에 의해 완전 매치 프로브과 상이하여 표적 유전자 전사체의 결합을 방해한다. 이것은 완전 매치 올리고에 대해 측정된 신호에 기여하는 백그라운드 및 비-특이적 혼성화를 결정하는 것을 돕는다. 마이크로어레이 스위트 소프트웨어는 완전 매치 프로브의 혼성화 강도로부터 미스매치 프로브의 혼성화 강도를 감하여 각 프로브 세트에 대한 절대 강도 값 또는 특이적 강도 값을 결정한다. 프로브는 진뱅크(GenBank)® 및 다른 뉴클레오티드 정보보관소의 최근 정보를 기초로 선택한다. 상기 서열은 유전자의 3' 말단의 독특한 영역을 인식한다고 여겨진다. 진칩(GeneChip)® 혼성화 오븐 ("회전식(rotisserie)" 오븐)을 사용하여 한번에 최대 64개 어레이의 혼성화를 수행한다. 플루이딕스 스테이션(fluidics station)은 프로브 어레이의 세척 및 염색을 수행한다. 이는 완벽하게 자동화되어 있고, 4가지 모듈을 함유하며, 각 모듈에는 하나의 프로브 어레이가 들어간다. 각 모듈은 미리 프로그래밍된 플루이딕스 프로토콜을 이용하여 마이크로어레이 스위트 소프트웨어를 통해 독립적으로 제어된다. 스캐너는 공초점 레이저 형광 스캐너이며, 이는 프로브 어레이에 결합된 표지된 cRNA에 의해 방출되는 형광 강도를 측정한다. 마이크로어레이 스위트 소프트웨어에 의한 컴퓨터 워크스테이션은 플루이딕스 스테이션 및 스캐너를 제어한다. 마이크로어레이 스위트 소프트웨어는 프로브 어레이에 대해 미리 프로그래밍된 혼성화, 세척 및 염색 프로토콜을 이용하여 최대 8개의 플루이딕스 스테이션을 제어할 수 있다. 또한, 상기 소프트웨어는 혼성화 강도 데이터를 수득하고 이것을 적절한 알고리즘을 이용하여 각 유전자에 대한 존재/부재 신호로 전환한다. 마지막으로, 상기 소프트웨어는 실험들 사이의 비교 분석에 의해 유전자 발현의 변화를 검출하고, 결과를 .txt 파일 형식으로 구성하며, 이를 사용하여 다른 소프트웨어 프로그램으로 추가의 데이터 분석을 수행할 수 있다.
일부 실시양태에서, 치료는 결장직장암, 폐암, 난소암, 뇌하수체 암, 췌장암, 유방 섬유선종, 전립선암, 두경부 편평 세포 암종, 연조직 육종, 유방암, 신경모세포종, 흑색종, 유방 암종, 위암, 결장직장암 (CRC), 상피 암종, 뇌암, 자궁내막암, 고환 암, 담관암종, 담낭 암종 및 간세포 암종으로 이루어진 군으로부터 선택된 암을 위한 것이다.
생물학적 샘플은 본원에서 예를 들어 생물학적 샘플의 정의에서 기술된다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈청 또는 종양의 생물학적 샘플이다.
제조품
본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 언급된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조품이 제공된다. 제조품은 용기, 및 용기상에 있거나 용기와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 시린지 등을 포함한다. 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 용기가 형성될 수 있다. 용기는, 단독으로 또는 다른 조성물(들)과 조합하여 질병을 치료, 예방 및/또는 진단하는데 유효한 조성물을 보유하며, 멸균성 유입 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 상기 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 봉지 또는 바이알일 수 있음). 조성물 내의 적어도 한 가지 활성제는 본 발명의 항체이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 해당 조성물이 선택된 상태, 예컨대 암의 치료에 사용된다는 것을 표시한다. 더우기, 제조품은 (a) 그 내부에 조성물을 함유하고 있는 제1 용기 (이 조성물은 본 발명의 항체를 포함함); 및 (b) 그 내부에 조성물을 함유하고 있는 제2 용기를 포함할 수 있다. 이러한 본 발명의 양태에서의 제조품은 상기 제1 및 제2 항체 조성물을 사용하여 특별한 질환, 예를 들어 암을 치료할 수 있다는 것을 표시한 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 별법적으로 또는 추가로, 제조품은 제약상 허용되는 완충제, 예컨대 주사용 정균수 (BWFI), 인산염 완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이것은 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질, 예를 들어 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 더 포함할 수 있다.
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 예이다. 상기 제시된 일반적인 설명을 기초로 하여 다양한 다른 실시양태를 실시할 수 있음이 이해된다.
실시예
달리 나타내지 않는 한, 본 실시예에서 언급되는 시판 시약은 제조업체의 지침에 따라 사용하였다.
실시예 1: 인간화 mu4F11 항체의 생성
본 실시예는 EGFL7에 대해 지시된 뮤린 항체 4F11 (mu4F11)의 인간화를 보여준다. 잔기 번호는 카바트 (문헌 [Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)])에 따른다. 단일 문자의 아미노산 약어를 사용했다.
물질 및 방법
EMI 및 2 EGF 도메인 (2개의 코일링된 도메인이 결여된 것)을 함유하는 전장 인간 EGFL7 및 인간 EGFL7의 말단절단된 형태 (잔기 1-182)를 CHO 세포에서 발현시키고, 통상적인 방법으로 정제하였다 (도 1). p2
Figure pct00058
및 EMI2
Figure pct00059
로 불리는 EGFL7 상의 4F11 에피토프를 함유하는 펩티드를 합성적으로 제조하였다.
Egfl7 녹아웃 마우스를 이. 콜라이에서 발현시키고 재폴딩시킨 재조합 전장 인간 EGFL7 단백질로 면역화하여 뮤린 항체 4F11을 발현하는 하이브리도마를 수득하였다. 재조합 인간 또는 뮤린 EGFL7 코팅된 플레이트를 이용하여 ELISA로 항체를 스크리닝하였다. HUVEC가 EGFL7 코팅된 플레이트에 부착하는 것을 차단하는 항체의 능력으로 기능 차단 항체 패널을 확인하였다. 4F11로 지정된 것을 비롯하여 몇몇 항체는 교차-종 기능 차단 항체인 것으로 확인되었다 (2007년 3월 16일자로 출원되어 2007년 9월 20일자로 공개된 공동소유의 국제 특허 출원 WO 2007/106915 참조).
뮤린 4F11 가변 도메인의 클로닝 및 키메라 4F11 항체의 생성 - 표준 방법을 이용하여 4F11을 생산하는 하이브리도마 세포로부터 전체 RNA를 추출하였다. 중쇄 및 경쇄에 대한 퇴보 프라이머를 이용한 RT-PCR로 가변 경쇄 (VL) 및 가변 중쇄 (VH) 도메인을 증폭시켰다. 정방향 프라이머는 VL 및 VH 영역의 N-말단 아미노산 서열에 특이적이었다. 종들 사이에서 고도로 보존된 불변 경쇄 (CL) 및 불변 중쇄 도메인 1 (CH1) 내의 영역으로 어닐링하기 위해 LC 및 HC 역방향 프라이머를 각각 설계하였다. 증폭된 VL 및 VH를 포유동물 발현 벡터에 클로닝하여 키메라 항체 ch4F11을 생성하였다. 삽입체의 폴리뉴클레오티드 서열은 통상적인 서열분석 방법을 이용하여 결정하였다.
수용자 인간 컨센서스 프레임워크 상으로 직접 초가변 영역 그라프트 - 본 작업을 위해 사용된 파지미드는 1가 Fab-g3 디스플레이 벡터이고, 이는 단일 phoA 프로모터의 제어 하에 2개의 오픈 리딩 프레임으로 이루어진다. 제1 오픈 리딩 프레임은 수용자 경쇄의 VL 및 CH1 도메인에 융합된 stII 신호 서열로 이루어지고, 제2 오픈 리딩 프레임은 수용자 중쇄의 VH 및 CH1 도메인에 융합된 stII 신호 서열, 및 이어서 존재하는 마이너 파지 코트 단백질 P3으로 이루어진다.
CDR 그라프트를 제조하기 위해, mu4F11로부터의 초가변 영역을 huKI 및 huIII 컨센서스 수용자 프레임워크로 그라프팅시켜 직접 CDR-그라프트 (4F11.v1)를 생성하였다 (도 2 및 3). VL 도메인에서는, 다음 영역이 인간 컨센서스 수용자에 그라프팅되었다: 위치 24-34 (L1; 서열 31), 50-56 (L2; 서열 32) 및 89-97 (L3; 서열 33). VH 도메인에서는, 위치 26-35 (H1; 서열 34), 49-65 (H2; 서열 35) 및 95-102 (H3; 서열 36)이 그라프팅되었다. 맥칼럼(MacCallum) 등은 (문헌 [MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)]) 항체 및 항원 복합체 결정 구조를 분석하였고, 중쇄의 위치 49가 접촉 영역의 일부임을 발견하였고, 따라서 항체를 인간화할 때 CDR-H2 정의 내에 이 위치를 포함시키는 것이 합당한 것으로 보인다.
각각의 초가변 영역에 대해 별도의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 쿤켈 돌연변이유발에 의해 파지 상에 디스플레이된 Fab 및 IgG 둘 모두로서 4F11.v1을 생성시켰다. 올바른 클론을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.
프레임워크 토글 - 결합에 중요한 프레임워크 위치를 확인하기 위해, 프레임워크 토글 파지 라이브러리를 생성하여 VL의 위치 4, 및 VH의 위치 2, 48, 69, 71, 73, 75, 76, 78 및 91에 뮤린 또는 인간 아미노산을 제공하였다. 주형으로서 사용된 4F11.v1을 돌연변이화하기 위해, 이들 위치를 도 4에서 개략한 바와 같이 5개의 올리고뉴클레오티드를 이용한 쿤켈 돌연변이유발에 의해 다양화하였다.
초가변 영역의 무작위화 - 쿤켈 돌연변이유발을 이용하여 초가변 영역 내 위치에 서열 다양성을 도입하였다. 단일 위치 라이브러리 (SPL)를 생성하기 위해, 각 초가변 영역 내의 각각의 위치를 NNS를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 모든 가능한 20개의 아미노산으로 개별적으로 무작위화하였다. 그 결과 76개의 하위-라이브러리가 생성되었고, 이들 각각은 초가변 영역 중 하나 안에 위치하는 단일 돌연변이를 갖는 변이체를 포함하는 풀링된 "단일 위치 라이브러리" (SPL)로 합해진 20개의 다양성을 갖는다. 돌연변이유발에 사용된 6개의 주형은 야생형 서열이 다시 선택되는 것을 피하기 위해 CDR L1, L2, L3 H1, H2 또는 H3의 중심에 하나의 정지 코돈 (TAA)을 가졌다. SPL이 생성된 경우, 다양성 도입을 위해 사용된 올리고뉴클레오티드는 또한 상응하는 주형에서 정지 코돈을 수선하였다.
제한 라이브러리의 경우에는, 4개의 올리고뉴클레오티드를 동시에 혼입시켰고, 이는 정지 코돈 (TAA)을 수선하고 CDR-L2의 위치 53 및 54, CDR-H1의 29, CDR-H2의 52 및 CDR-H3의 98에 NNS를 도입시켰다.
파지 라이브러리의 생성 - 상기에서 개략한 바와 같은 프레임워크 위치 또는 초가변 영역에 다양성을 도입하기 위해 설계된 올리고뉴클레오티드를 올리고뉴클레오티드 660 ng, 50 mM 트리스 pH 7.5, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 20 mM DTT, 및 5 U 폴리뉴클레오티드 키나제를 함유하는 20 ㎕ 반응물 중에서 1 시간 동안 37℃에서 개별적으로 인산화시켰다.
프레임워크 토글 또는 제한 라이브러리를 생성하기 위해, 다양성이 도입되도록 모든 인산화시킨 올리고뉴클레오티드를 동시에 돌연변이유발 반응에 첨가하였다. SPL의 경우에는, 96 웰 PCR 플레이트에서 76개의 개별 쿤켈 돌연변이유발 반응을 수행하였다. 인산화된 올리고뉴클레오티드 반응물 (상기)로부터, 2 ㎕를 50 mM 트리스 pH 7.5, 10 mM MgCl2 중의 상응하는 정지 코돈을 함유하는 쿤켈 주형 300 ng에 최종 부피 10 ㎕로 첨가하였다. 혼합물을 90℃에서 2 분, 50℃에서 5 분 동안 어닐링시킨 다음, 빙상에서 냉각시켰다. 이어서, 0.5 ㎕ 10 mM ATP, 0.5 ㎕ 10 mM dNTP (dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 각각 10 mM), 1 ㎕ 100 mM DTT, 1 ㎕ 10X TM 완충제 (0.5 M 트리스 pH 7.5, 0.1 M MgCl2), 80 U T4 리가제, 및 4 U T7 폴리머라제를 전체 부피 20 ㎕로 첨가하여 어닐링된 주형을 2 시간 동안 실온에서 충전시켰다. 이어서 이렇게 충전되고 라이게이션된 생성물 각각으로 테트라시클린 5 μg/ml을 함유하는 2YT 0.5 ml 중에서 성장시킨 XL1-블루 세포 및 M13/KO7 헬퍼 파지 (MOI 10)를 2 시간 동안 37℃에서 형질전환시킨 다음, 풀링하고, 50 μg/ml 카르베니실린을 함유하는 500 ml 2YT로 옮기고, 16 시간 동안 37℃에서 성장시켰다.
파지 선별 - 파지 선별에 다중 항원 형태를 사용하였다. 전장 또는 말단절단된 EGFL7 (5 μg/ml)을 50 mM 중탄산나트륨 (pH 9.6) 중에서 맥시소르프(MaxiSorp)™ 마이크로타이터 플레이트 (Nunc) 상에 4℃에서 밤새 고정시켰다. 또한 EMI2 및 p2 펩티드를 이들의 유리 시스테인을 통해 (말레이미드 PEO2-비오틴; 피어스 이용) 또는 이들의 아미노 말단 상의 유리 아민을 통해 (NHS-LC-비오틴, 피어스 이용) 비오티닐화하였다. 비오티닐화 반응 동안, PBS 중에서 2배 몰 과량의 비오틴 시약을 사용하였다. 비오티닐화된 EMI2 및 p2 펩티드를 50 mM 중탄산나트륨 (pH 9.6) 중에서 맥시소르프™ 마이크로타이터 플레이트 (Nunc) 상에 고정된 뉴트라비딘® (2 μg/ml) 상에 4℃에서 밤새 포획시켰다. 모든 플레이트를 블록커(Blocker)™ 카세인 (피어스)을 이용하여 적어도 1 시간 동안 차단시켰다.
배양 상청액으로부터 파지를 수거하고, 5％ 분유 및 0.05％ 트윈™ 20을 함유하는 PBS (PBSBT) 중에 현탁시켰다. 파지 라이브러리를 첨가하고 1 시간 인큐베이션한 후, 마이크로타이터 웰을 0.05％ 트윈™ 20을 함유하는 PBS (PBST)로 광범위하게 세척하고, 웰을 20 mM HCl, 500 mM KCl와 30 분 동안 인큐베이션하여 결합된 파지를 용출시켰다. 용출된 파지를 1 M 트리스 (pH 8)로 중화시키고, XL1-블루 세포 및 M13/KO7 헬퍼 파지를 이용하여 증폭시키고, 2YT, 50 μg/ml 카르베니실린 중에서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 표적 함유 웰로부터 용출된 파지의 역가를 비표적 함유 웰로부터 회수한 파지의 역가와 비교하여 강화를 평가하였다.
용액 중에 감소되는 농도의 비오티닐화된 p2 펩티드에 결합된 파지를 포획한 후 뉴트라비딘® 상에서 10 분 동안 포획시키고 (온 레이트 선별), 세척 시간 및 온도를 증가시켜 약하게 결합된 파지가 유실되게 하여 (오프 레이트 선별) 선별 엄격도를 증가시켰다.
IgG 생산 - 스크리닝을 위해, 293 세포에서 IgG 변이체를 먼저 생산하였다. FuGENE® 시스템을 이용하여 VL 및 VH를 코딩하는 벡터 (25 μg)로 293 세포를 형질감염시켰다. FuGENE® 500 ㎕를 FBS를 함유하지 않는 DMEM 배지 4.5 ml와 혼합하고, 실온에서 5 분 동안 인큐베이션하였다. 각각의 쇄 (25 μg)를 이 혼합물에 첨가하고, 실온에서 20 분 동안 인큐베이션한 다음, 5％ CO2 중에서 37℃에서 밤새 형질감염을 위해 5개의 T-150 플라스크로 옮겼다. 다음날 형질감염 혼합물을 함유하는 배지를 제거하고, 0.1 ml/L 미량 원소 (A0934) 및 10 mg/L 인슐린 (A0940)을 함유하는 23 ml PS04 배지로 교체하였다. 세포를 추가로 5 일 동안 인큐베이션한 후, 배지를 1000 rpm에서 5 분 동안 수거하고, 0.22 μm 저 단백질 결합 필터를 이용하여 멸균 여과하였다. 샘플을 125 ml의 배지마다 2.5 ml 0.1％ PMSF를 첨가한 후 4℃에서 저장할 수 있다.
친화도 결정 - 친화도 결정은 비아코어™-2000을 이용한 표면 플라즈몬 공명으로 수행하였다. 말단절단된 EGFL7 또는 p2 펩티드를 10 mM 아세트산 나트륨 (pH 4.8) 중에서 CM5 센서 칩 상에 고정시켰다 (대략 50 - 200 RU). 정제된 IgG 변이체를 30 μL/분의 유속으로 주입하였다 (PBST 중의 0.5 내지 1000 nM의 2배 연속 희석액 이용). 각각의 샘플을 3-분 회합 및 3.5-분 해리로 분석하였다. 각각의 주입 이후, 10 mM 글리신 (pH 1.7)을 이용하여 칩을 재생시켰다.
결합 반응은 IgG 변이체 유동 세포로부터 대조군 유동 세포를 차감하여 교정하였다. kon 및 koff 동시 대입의 1:1 랭귀어(Languir) 모델을 역학 분석에 사용하였다.
세포 부착 검정 - 마우스 EGFL7 (mEGFL7-CB-His) 또는 인간 EGFL7 (EGFL7-CB-His)을 탄산나트륨 완충제 O/N 중에서 4℃에서 마이크로타이터 플레이트 상에 5 μg/ml로 코팅한 다음, PBS 중의 1％ BSA로 차단시켰다. 적절한 세포 성장 배지 (EGM 론자) 내에 항-EGFL7 항체를 첨가한 후 (0.01 μg/ml 내지 100 μg/ml), 20,000개의 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)/웰을 첨가하였다. 100％의 시딩된 세포를 계산하기 위해 대조군 세포를 항체가 부재하는 웰에 시딩하였다. 각 항체 농도를 3중으로 시험하였다. 플레이트를 140 g에서 5 분 동안 스핀 다운시켜 기판과 세포가 접촉되게 한 다음, CO2 인큐베이터 내에서 30 분 동안 인큐베이션하고, PBS로 3 회 세척하였다. CyQUANT® 완충제 (몰레큘라 프로브스(Molecular Probes))를 이용하여 플레이트에 부착된 세포를 계수하고, 플레이팅된 총 세포의 퍼센트로 계산하였다. 플레이트에 결합된 세포의 백분율을 각 항체 농도에 대해 플롯팅하였다.
결과 및 논의
4F11의 인간화 - mu4F11의 인간화에 사용된 인간 수용자 프레임워크는 컨센서스 인간 카파 I VL 도메인 및 컨센서스 인간 하위군 III VH 도메인을 기반으로 한다. mu4F11에 대한 각 상보성 결정 영역 (CDR)을 확인하고, 인간 수용자 프레임워크에 그라프팅시켜 CDR 그라프트 (4F11.v1)를 생성하였고, 이는 파지 상에서 Fab로서 디스플레이될 수 있다 (도 2 및 3).
파지 선별을 위한 항원 평가 - 경쟁적 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 EGFL7 상의 4F11 에피토프를 제2 EMI 도메인에 대해, 보다 구체적으로는 펩티드 p2에 대해 맵핑하였다 (도 1 및 5). 4F11.v1을 디스플레이하는 파지는 고정된 전장 및 말단절단된 EGFL7에 결합하였지만, 대조군 파지를 이용하였을때 또한 유의한 비특이적 파지 결합이 관찰되었다 (도 6). 이러한 이유로, 4F11이 말단절단된 EGFL7에 결합하는 것을 차단하는 p2 및 EMI2 펩티드를 파지 선별에 사용하였다. 펩티드를 그의 유리 시스테인을 통해 비오티닐화하여 p2S 및 EMI2c를 생성하거나 (말레이미드 PEO2-비오틴; 피어스 이용) 또는 그의 아미노 말단의 유리 아민을 통해 비오티닐화하여 p2N 및 EMI2.n을 생성하였다 (NHS-LC-비오틴, 피어스 이용). 결합을 평가하기 위해, 비오티닐화된 펩티드를 뉴트라비딘®으로 코팅된 마이크로타이터 웰 내에 포획시켰다. 4F11.v1을 디스플레이하는 파지를 사용하여 포획된 비오티닐화된 EMI2 및 p2 펩티드에의 결합을 평가하였다. 4F11.v1 파지는 p2S에 가장 잘 결합하였다 (도 7). 포획된 파지의 양은 뉴트라비딘® 코팅된 웰에의 결합에 비오티닐화된 펩티드를 50 nM 농도로 사용한 경우에 가장 많았다.
프레임워크 위치 스크리닝 - 프레임워크 토글 라이브러리를 고정된 비오티닐화된 p2S 펩티드에 대한 4 라운드의 선별 동안 패닝시켰다. 마지막 라운드로부터의 96 클론의 DNA 서열 분석을 이용하여, 존재량을 기반으로 각 토글링된 위치에서의 아미노산 중요도를 평가하였다 (도 8). 4 라운드 선별 전후 아미노산 존재량은 L78의 Thr (L78T) 또는 Val (L78V)로의 교체가 결합을 개선시킬 수 있음을 시사하였다.
CDR 위치 스크리닝 - 추가의 개선점을 확인하기 위해, 3개의 프레임워크를 이용하여 단일 위치 라이브러리를 생성하였다: 최초 CDR 그라프트 (4F11.v1), L78T 함유 4F11.v1 (4F11.v2), 및 L78V 함유 4F11.v1 (4F11.v3). 각 SPL의 경우, 각 CDR 내의 각 위치를 모든 가능한 아미노산으로 개별적으로 무작위화하였다 (총 76 개의 라이브러리, 각각은 20 구성원을 함유하고, 각각의 프레임워크에 대해 하나의 SPL로 풀링됨). 6개의 4F11.v1 DNA 주형 (적절한 CDR 내에 정지 코돈을 함유함)을 이용하여 3개의 SPL을 생성하였다. SPL 생성 동안 적절한 프레임워크 변화 (L78V 또는 L78V)를 코딩하는 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드를 이용하여 VH 내의 위치 78에 프레임워크 변화를 도입하였다. 이에 따라, 프레임워크 및 개개의 CDR 위치가 동시에 돌연변이되었다. SPL을 표 1에서 개략한 바와 같이 고정된 뉴트라비딘®을 사용하여 포획한 가용성 p2S 펩티드에 대해 패닝시켰다:
Figure pct00060
선별 엄격도는 p2S 펩티드의 농도를 감소시키고, 결합 허용 시간을 줄이고, 세척 시간 및 온도를 증가시켜 점차적으로 증가시켰다. 선별 마지막 3 라운드 동안 4F11.v2 및 4F11.v3에 기초한 SPL에서 가장 높은 파지 회수가 관찰되었다.
마지막 라운드로부터의 클론을 골라내어 DNA 서열 분석하였다. 각각의 CDR 내의 개개의 서열 변화를 확인하였다 (도 9). 가장 풍부한 SPL 클론은 CDR-L2 내의 VL 내 위치 N53Y에서 변화를 가졌다. 빈번하게 나타나고 하나를 초과하는 SPL에서 나타난 변화를 4F11.v3에 혼입시켰다. 이들 변이체 (.v4 내지 .v12), 4F11-그라프트 (.v1) 및 VH 프레임워크에 대한 변화 (4F11.v2 및 4F11.v3)를 IgG로 발현시키고, 정제하고, 비아코아 및 세포 부착 검정을 이용하여 고정된 p2S에 대한 결합을 시험하였다 (표 2). mu4F11에 비해 4F11.v6 및 4F11.v10에서 보다 약한 세포 부착 억제가 관찰되었고, 이는 추가의 친화도 개선이 요망됨을 나타낸다.
Figure pct00061
프레임워크 위치의 재평가 - 세트에 추가의 프레임워크 변화를 혼입시켰다. 변이체를 IgG로 발현시키고 (변이체 13 내지 16), 표 3에서 개략한 바와 같이 비아코아™로 시험하였다:
Figure pct00062
이들 중, 4F11.v14가 mu4F11와 관련하여 가장 높은 친화도를 가졌다.
제한 라이브러리 - 주형으로서 4F11.v13을 기반으로 하여 2개의 제한 라이브러리를 생성하였다. 라이브러리 1은 4F11.V13과 동일한 프레임워크 변화를 함유한 반면 (LC:M4L 및 HC:R71L, L78A), 라이브러리 2는 중쇄에서 2개의 추가의 변화: N76S 및 Y91F를 함유하였다 (도 10 및 11). 또한 L1 및 L3 내의 CDR 변화 (D28S 및 D94E)를 라이브러리 둘 모두에 혼입시켰다. 다양화는 SPL 선별 후 변화가 종전에 관찰되었던 위치로 제한시켰다 (도 10 및 11). 이들 위치 (경쇄 내 53 및 54 및 중쇄 내 29, 52, 98)가 모든 20 개의 아미노산을 포함하도록 다양화시키고, 표 4에서 개략한 바와 같이 고정된 뉴트라비딘을 이용하여 포획한 고정된 p2S 펩티드에 대해 패닝시켰다:
Figure pct00063
각 라이브러리에 대해 무작위화된 위치에서의 상이한 아미노산 잔기 선호도를 도 12에 플롯팅하였다. 경쇄에서 라이브러리는 둘 모두 53Y 및 54R를 우세하게 선택한 반면, 중쇄에서는 29F 및 52T에 대한 선호도가 존재하였다. 중쇄의 CDR-H3에서, 3개의 아미노산이 라이브러리 둘 모두에서 위치 98에서 선택되었다 (98Y, 98H, 및 98R). 이들 변화의 최고의 조합을 확인하기 위해, 변이체 17 내지 26 (표 5)을 구축하고, IgG로 발현 및 특성화시켰다. 몇몇 변이체는 ch4F11 보다 양호하거나 더 나은 친화도를 가졌다. 인간 또는 마우스 EGFL7을 이용하여 세포 이동 검정에서 변이체를 추가로 특성화하였다 (표 5 및 도 13 및 14).
Figure pct00064
mu4F11 및 4F11.v1과 비교하여 hu4F11.v17 및 4F11.v22로부터의 VL 및 VH 도메인을 각각 도 15 및 16에 나타낸다.
실시예 2: 인간화 mu18F7 항체의 생성
본 실시예는 EGFL7에 대해 지시된 뮤린 항체 18F7 (mu18F7)의 인간화를 보여준다. 잔기 번호는 카바트 (문헌 [Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)])에 따른다. 단일 문자의 아미노산 약어를 사용했다.
물질 및 방법
EMI 및 2 EGF 도메인 (2개의 코일링된 도메인이 결여된 것)을 함유하는 전장 인간 EGFL7 및 인간 EGFL7의 말단절단된 형태 (잔기 1-182)를 CHO 세포에서 발현시키고, 통상적인 방법으로 정제하였다 (도 1). p5 (RACSTYRTIYRTA; 서열 7) 및 EMI1 (LTTCDGHRACSTYRTIYRTAYRRSPG; 서열 3)로 불리는 EGFL7 상의 18F7 에피토프를 함유하는 펩티드를 합성적으로 제조하였다.
Egfl7 녹아웃 마우스를 이. 콜라이에서 발현시키고 재폴딩시킨 재조합 전장 인간 EGFL7 단백질로 면역화하여 뮤린 항체 18F7을 발현하는 하이브리도마를 수득하였다. 재조합 인간 또는 뮤린 EGFL7 코팅된 플레이트를 이용하여 ELISA로 항체를 스크리닝하였다. HUVEC가 EGFL7 코팅된 플레이트에 부착하는 것을 차단하는 항체의 능력으로 기능 차단 항체 패널을 확인하였다. 18F7로 지정된 것을 비롯하여 몇몇 항체는 교차-종 기능 차단 항체인 것으로 확인되었다 (2007년 3월 16일자로 출원되어 2007년 9월 20일자로 공개된 공동소유의 국제 특허 출원 WO 2007/106915 참조).
뮤린 18F7 가변 도메인의 클로닝 및 키메라 18F7 항체의 생성 - 표준 방법을 이용하여 18F7을 생산하는 하이브리도마 세포로부터 전체 RNA를 추출하였다. 중쇄 및 경쇄에 대한 퇴보 프라이머를 이용한 RT-PCR로 가변 경쇄 (VL) 및 가변 중쇄 (VH) 도메인을 증폭시켰다. 정방향 프라이머는 VL 및 VH 영역의 N-말단 아미노산 서열에 특이적이었다. 종들 사이에서 고도로 보존된 불변 경쇄 (CL) 및 불변 중쇄 도메인 1 (CH1) 내의 영역으로 어닐링하기 위해 LC 및 HC 역방향 프라이머를 각각 설계하였다. 증폭된 VL 및 VH를 포유동물 발현 벡터에 클로닝하여 키메라 항체 ch18F7을 생성하였다. 삽입체의 폴리뉴클레오티드 서열은 통상적인 서열분석 방법을 이용하여 결정하였다.
수용자 인간 컨센서스 프레임워크 상으로 직접 초가변 영역 그라프트 - 본 작업을 위해 사용된 파지미드는 1가 Fab-g3 디스플레이 벡터이고, 이는 단일 phoA 프로모터의 제어 하에 2개의 오픈 리딩 프레임으로 이루어진다. 제1 오픈 리딩 프레임은 수용자 경쇄의 VL 및 CH1 도메인에 융합된 stII 신호 서열로 이루어지고, 제2 오픈 리딩 프레임은 수용자 중쇄의 VH 및 CH1 도메인에 융합된 stII 신호 서열, 및 이어서 존재하는 마이너 파지 코트 단백질 P3으로 이루어진다.
CDR 그라프트를 제조하기 위해, mu18F7로부터의 초가변 영역을 huKI 및 huIII 컨센서스 수용자 프레임워크로 그라프팅시켜 직접 CDR-그라프트 (18F7-그라프트)를 생성하였다 (도 17 및 18). VL 도메인에서는, 다음 영역이 인간 컨센서스 수용자에 그라프팅되었다: 위치 24-34 (L1; 서열 100), 50-56 (L2; 서열 101) 및 89-97 (L3; 서열 102). VH 도메인에서는, 위치 26-35 (H1; 서열 103), 49-65 (H2; 서열 104) 및 95-102 (H3; 서열 105)가 그라프팅되었다. 맥칼럼(MacCallum) 등은 (문헌 [MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)]) 항체 및 항원 복합체 결정 구조를 분석하였고, 중쇄의 위치 49가 접촉 영역의 일부임을 발견하였고, 따라서 항체를 인간화할 때 CDR-H2 정의 내에 이 위치를 포함시키는 것이 합당한 것으로 보인다.
각각의 초가변 영역에 대해 별도의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 쿤켈 돌연변이유발에 의해 파지 상에 디스플레이된 Fab 및 IgG 둘 모두로서 18F7-그라프트를 생성시켰다. 올바른 클론을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.
프레임워크 토글 - 결합에 중요한 프레임워크 위치를 확인하기 위해, 프레임워크 토글 파지 라이브러리를 생성하여 VL의 위치 87, 및 VH의 위치 48, 67, 69, 71, 73, 75, 76, 78 및 80에 뮤린 또는 인간 아미노산을 제공하였다. 주형으로서 사용된 18F7-그라프트를 돌연변이화하기 위해, 이들 위치를 도 19에서 개략한 바와 같이 3개의 올리고뉴클레오티드를 이용한 쿤켈 돌연변이유발에 의해 다양화하였다.
초가변 영역의 무작위화 - 쿤켈 돌연변이유발을 이용하여 18F7-그라프트의 초가변 영역 내 각 위치에 개별적으로 전체 서열 다양성을 도입하여 함께 풀링된 단일 위치 라이브러리를 생성하였다. 각각의 위치에서 NNS를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 18F7-그라프트의 각각의 초가변 영역 내의 각 위치를 모든 가능한 20 개의 아미노산에 대해 완전히 무작위화하였다. 각각이 완전히 무작위화된 초가변 영역 중 하나 내에 위치하는 단일 위치를 갖는 20 개의 구성원으로 이루어진 다중 라이브러리를 제작하였다. 초가변 영역 내의 각 위치를 커버하기 위해, 이러한 유형의 라이브러리를 76개 생성하고, 각 초가변 위치에 걸쳐 위치하는 단일 돌연변이를 아우르는 풀링된 "단일 위치 라이브러리" (SPL)로 합하였다. 야생형 CDR 그라프팅된 서열이 다시 선택되는 것을 피하기 위해, 각 CDR의 중앙에 정지 코돈 (TAA)을 도입하였다. 이는 쿤켈 돌연변이유발로 달성하였고, 18F7-그라프트에 대해 6 개의 상이한 주형 - 각각 상이한 CDR에 정지 코돈이 도입된 것 - 이 생성되었다. 라이브러리가 생성되면, 다양성 도입을 위해 사용된 올리고뉴클레오티드는 또한 상응하는 주형에서 정지 코돈을 수선하였다.
파지 라이브러리의 생성 - 상기에서 개략한 바와 같은 프레임워크 위치 또는 각각의 초가변 영역에 다양성을 도입하기 위해 설계된 올리고뉴클레오티드를 올리고뉴클레오티드 660 ng, 50 mM 트리스 pH 7.5, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 20 mM DTT, 및 5 U 폴리뉴클레오티드 키나제를 함유하는 20 ㎕ 반응물 중에서 1 시간 동안 37℃에서 개별적으로 인산화시켰다.
프레임워크 토글 라이브러리를 생성하기 위해, 다양성이 도입되도록 인산화시킨 모든 3 개의 올리고뉴클레오티드를 동시에 돌연변이유발 반응에 첨가하였다. SPL의 경우에는, 96 웰 PCR 플레이트에서 76개의 개별 쿤켈 돌연변이유발 반응을 수행하였다. 인산화된 올리고뉴클레오티드 반응물 (상기)로부터, 2 ㎕를 50 mM 트리스 pH 7.5, 10 mM MgCl2 중의 상응하는 정지 코돈을 함유하는 쿤켈 주형 300 ng에 최종 부피 10 ㎕로 첨가하였다. 혼합물을 90℃에서 2 분, 50℃에서 5 분 동안 어닐링시킨 다음, 빙상에서 냉각시켰다. 이어서, 0.5 ㎕ 10 mM ATP, 0.5 ㎕ 10 mM dNTP (dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 각각 10 mM), 1 ㎕ 100 mM DTT, 1 ㎕ 10X TM 완충제 (0.5 M 트리스 pH 7.5, 0.1 M MgCl2), 80 U T4 리가제, 및 4 U T7 폴리머라제를 전체 부피 20 ㎕로 첨가하여 어닐링된 주형을 2 시간 동안 실온에서 충전시켰다. 이어서 이렇게 충전되고 라이게이션된 생성물 각각으로 테트라시클린 5 μg/ml을 함유하는 2YT 0.5 ml 중에서 성장시킨 XL1-블루 세포 및 M13/KO7 헬퍼 파지 (MOI 10)를 2 시간 동안 37℃에서 형질전환시킨 다음, 풀링하고, 50 μg/ml 카르베니실린을 함유하는 500 ml 2YT로 옮기고, 16 시간 동안 37℃에서 성장시켰다.
파지 선별 - 파지 선별에 다중 항원 형태를 사용하였다. 전장 또는 말단절단된 EGFL7 (5 μg/ml)을 50 mM 중탄산나트륨 (pH 9.6) 중에서 맥시소르프™ 마이크로타이터 플레이트 (Nunc) 상에 4℃에서 밤새 고정시켰다. 또한 EMI1 및 p5 펩티드를 이들의 유리 시스테인을 통해 (말레이미드 PEO2-비오틴; 피어스 이용) 또는 이들의 아미노 말단 상의 유리 아민을 통해 (NHS-LC-비오틴, 피어스 이용) 비오티닐화하였다. 비오티닐화 반응 동안, PBS 중에서 2배 몰 과량의 비오틴 시약을 사용하였다. 비오티닐화된 EMI1 및 p5 펩티드를 50 mM 중탄산나트륨 (pH 9.6) 중에서 맥시소르프™ 마이크로타이터 플레이트 (Nunc) 상에 고정된 뉴트라비딘® (2 μg/ml) 상에 4℃에서 밤새 포획시켰다. 모든 플레이트를 블록커™ 카세인 (피어스)을 이용하여 적어도 1 시간 동안 차단시켰다.
배양 상청액으로부터 파지를 수거하고, 5％ 분유 및 0.05％ 트윈™ 20을 함유하는 PBS (PBSBT) 중에 현탁시켰다. 파지 라이브러리를 첨가하고 1 시간 인큐베이션한 후, 마이크로타이터 웰을 0.05％ 트윈™ 20을 함유하는 PBS (PBST)로 광범위하게 세척하고, 웰을 20 mM HCl, 500 mM KCl와 30 분 동안 인큐베이션하여 결합된 파지를 용출시켰다. 용출된 파지를 1 M 트리스 (pH 8)로 중화시키고, XL1-블루 세포 및 M13/KO7 헬퍼 파지를 이용하여 증폭시키고, 2YT, 50 μg/ml 카르베니실린 중에서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 표적 함유 웰로부터 용출된 파지의 역가를 비표적 함유 웰로부터 회수한 파지의 역가와 비교하여 강화를 평가하였다.
용액 중에 감소되는 농도의 비오티닐화된 p5 펩티드에 결합된 파지를 포획한 후 뉴트라비딘® 상에서 10 분 동안 포획시키고 (온 레이트 선별), 세척 시간 및 온도를 증가시켜 약하게 결합된 파지가 유실되게 하여 (오프 레이트 선별) 선별 엄격도를 증가시켰다.
IgG 생산 - 스크리닝을 위해, 293 세포에서 IgG 변이체를 먼저 생산하였다. FuGENE® 시스템을 이용하여 VL 및 VH를 코딩하는 벡터 (25 μg)로 293 세포를 형질감염시켰다. FuGENE® 500 ㎕를 FBS를 함유하지 않는 DMEM 배지 4.5 ml와 혼합하고, 실온에서 5 분 동안 인큐베이션하였다. 각각의 쇄 (25 μg)를 이 혼합물에 첨가하고, 실온에서 20 분 동안 인큐베이션한 다음, 5％ CO2 중에서 37℃에서 밤새 형질감염을 위해 5개의 T-150 플라스크로 옮겼다. 다음날 형질감염 혼합물을 함유하는 배지를 제거하고, 0.1 ml/L 미량 원소 (A0934) 및 10 mg/L 인슐린 (A0940)을 함유하는 23 ml PS04 배지로 교체하였다. 세포를 추가로 5 일 동안 인큐베이션한 후, 배지를 1000 rpm에서 5 분 동안 수거하고, 0.22 μm 저 단백질 결합 필터를 이용하여 멸균 여과하였다. 샘플을 125 ml의 배지마다 2.5 ml 0.1％ PMSF를 첨가한 후 4℃에서 저장할 수 있다.
친화도 결정 - 친화도 결정은 비아코어™-2000을 이용한 표면 플라즈몬 공명으로 수행하였다. 말단절단된 EGFL7 또는 p5 펩티드를 10 mM 아세트산 나트륨 (pH 4.8) 중에서 CM5 센서 칩 상에 고정시켰다 (대략 50 - 200 RU). 정제된 IgG 변이체를 30 μL/분의 유속으로 주입하였다 (PBST 중의 0.5 내지 1000 nM의 2배 연속 희석액 이용). 각각의 샘플을 3-분 회합 및 3.5-분 해리로 분석하였다. 각각의 주입 이후, 10 mM 글리신 (pH 1.7)을 이용하여 칩을 재생시켰다.
결합 반응은 IgG 변이체 유동 세포로부터 대조군 유동 세포를 차감하여 교정하였다. kon 및 koff 동시 대입의 1:1 랭귀어 모델을 역학 분석에 사용하였다.
결과 및 논의
18F7의 인간화 - mu18F7의 인간화에 사용된 인간 수용자 프레임워크는 컨센서스 인간 카파 I VL 도메인 및 컨센서스 인간 하위군 III VH 도메인을 기반으로 한다. mu18F7에 대한 각 CDR을 확인하고, 인간 수용자 프레임워크에 그라프팅시켜 CDR 그라프트를 생성하였고, 이는 파지 상에서 Fab로서 디스플레이될 수 있다 (도 17 및 18).
파지 선별을 위한 항원 평가 - 경쟁적 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 EGFL7 상의 18F7 에피토프를 제1 EMI 도메인에 대해, 보다 구체적으로는 펩티드 p5에 대해 맵핑하였다 (도 1 및 20). 18F7-그라프트를 디스플레이하는 파지는 고정된 전장 및 말단절단된 EGFL7에 결합하였지만, 대조군 파지를 이용하였을때 또한 유의한 비특이적 파지 결합이 관찰되었다 (도 21). 이러한 이유로, 18F7이 말단절단된 EGFL7에 결합하는 것을 차단하는 p5 및 EMI1 펩티드를 파지 선별에 사용하였다. 펩티드를 그의 유리 시스테인을 통해 비오티닐화하여 p5c 및 EMI1c를 생성하거나 (말레이미드 PEO2-비오틴; 피어스 이용) 또는 그의 아미노 말단의 유리 아민을 통해 비오티닐화하여 p5n 및 EMI1n을 생성하였다 (NHS-LC-비오틴, 피어스 이용). 결합을 평가하기 위해, 비오티닐화된 펩티드를 뉴트라비딘®으로 코팅된 마이크로타이터 웰 내에 포획시켰다. 고정된 말단절단된 EGFL7에 대한 2 라운드의 선별 이후, 프레임워크 토글 라이브러리 파지 풀을 이용하여 포획된 비오티닐화된 EMI1 및 p5 펩티드에 대한 결합을 평가하였다. 파지 풀은 p5n 및 EMI1n에 결합하였지만, p5c 또는 EMI1c에는 결합하지 않았다 (도 22). 포획된 파지의 양은 뉴트라비딘® 코팅된 웰에의 결합에 비오티닐화된 펩티드를 50 nM 농도로 사용한 경우에 가장 많았다.
고정된 말단절단된 EGFL7에 대한 2 라운드의 선별 이후, 프레임워크 토글 라이브러리를 고정된 비오티닐화된 p5n 펩티드에 대한 2 라운드의 선별을 위해 추가로 패닝시켰다. 마지막 라운드로부터의 96 개의 클론의 DNA 서열 분석을 이용하여, 존재량을 기반으로 각 토글링된 위치에서의 아미노산 중요도를 평가하였다 (도 23). 4 라운드 선별 전후 아미노산 존재량은 N73K 및 L78A 변화가 결합을 개선시킴을 시사하였다. 덜 두드러졌지만, L78V 및 V48I도 역시 그러하였고, L78V를 추가로 연구하였다.
프레임워크 토글 라이브러리 결과물로부터 유래된 4 개의 프레임워크를 이용하여 추가의 개선점을 확인하기 위해 SPL을 조사하였다. 4개의 프레임워크는 최초 CDR 그라프트 (18F7-그라프트), N73K 함유 18F7-그라프트 (18F7.v2), N73K 및 L78A 함유 18F7-그라프트 (18F7.v3), 및 N73K 및 L78V 함유 18F7-그라프트 (18F7.v4)를 포함하였다. 각 프레임워크에 대해, 각 CDR 내의 각 위치를 모든 가능한 아미노산으로 개별적으로 무작위화한 SPL을 생성하였다 (총 76 개의 라이브러리, 각각은 20 구성원을 함유하고 하나의 SPL로 풀링됨). 6개의 18F7-그라프트 DNA 주형 (적절한 CDR 내에 정지 코돈을 함유함)을 이용하여 모든 4개의 SPL을 생성하였다. SPL 생성 동안 적절한 프레임워크 변화를 코딩하는 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드를 이용하여 VH 내의 위치 73 및 78에 프레임워크 변화를 도입하였다. 이에 따라, 프레임워크 및 개개의 CDR 위치가 동시에 돌연변이되었다. 4개의 SPL을 표 6에서 개략한 바와 같이 고정된 말단절단된 EGFL7에 대해 2 라운드 동안 패닝시킨 후, 고정된 뉴트라비딘®을 이용하여 포획한 가용성 비오티닐화된 p5n 펩티드에 대해 3 라운드의 선별동안 패닝시켰다:
Figure pct00065
선별 엄격도는 비오티닐화된 p5n 펩티드의 농도를 감소시키고, 결합 허용 시간을 줄이고, 세척 시간 및 온도를 증가시켜 점차적으로 증가시켰다. 선별 마지막 3 라운드 동안 18F7.v3 및 18F7.v4에 기초한 SPL에서 가장 높은 파지 회수가 관찰되었다.
마지막 라운드로부터의 클론을 골라내어 DNA 서열 분석하였다. 각각의 CDR 내의 개개의 서열 변화를 확인하였다 (도 24). 가장 풍부한 SP 라이브러리 클론은 VL 내의 위치 S89에서 변화를 가졌다. 빈번하게 나타나고 하나를 초과하는 SP 라이브러리에서 나타난 변화를 18F7.v3에 혼입시켰다. 이들 변이체 (.v5 내지 .v10), 18F7-그라프트 (.v1) 및 VH 프레임워크에 대한 변화 (.v2, .v3 및 .v4)를 비아코아™에 의한 추가의 분석을 위해 IgG로 발현시켰다 (표 7 및 8).
Figure pct00066
Figure pct00067
이들 10 개의 변이체에 대한 비아코어™ 분석은 고정된 mEGFL7 또는 p5 펩티드에 대한 모든 결합이 상당히 좋음을 나타내었다. 18F7.v6이 가장 느린 해리율 (kd)을 가졌고, HUVEC 부착 검정에서 효과적이었다 (도 25).
18F7.v6의 폴리싱 - 18F7.v6의 CDR-L1 (N28,G29) 및 CDR-H2 (N54, G55) 내의 잠재적 이소-아스파르트산 형성 부위 (Asn-Gly)를 이 위치에서 대안적 아미노산을 시험하는 것에 의해 제거하였다 (표 9).
Figure pct00068
H2 내의 SG 서열 (.v6B 및 .v6D)이 불량하게 발현된 반면, L1 내의 이 서열 (.v6A)은 해리율을 증가시켰다. 대조적으로, H2 내의 NS 서열 (.v6C)은 역학에 거의 영향을 미치지 않았다 (표 8 및 9). H2:NS (.v6C)와 함께 L1로 샘플링된 기타 변화 중에서, NS (.v6J) 및 NA (.v6K) 변화는 해리율에 최소한의 영향을 가졌다 (표 8 및 9, 도 25). 이러한 변화는 뮤린 18F7과 비교하여 목적하는 생물학적 특성은 여전히 유지하면서 18F7.v6의 안정성을 개선시키는데 사용될 수 있다 (도 25 및 26). hu18F7.v6K로부터의 VL 및 VH 도메인을 각각 도 27 및 28에 나타낸다.
실시예 3: 종양 보유 마우스 또는 새끼 마우스의 인간화 항-EGFL7 항체에 의한 처리
본 발명자들은 다양한 모델에서 본 발명의 인간화 항-EGFL7 항체가 (단독으로, 그리고 항-VEGF 요법과 조합되어) 혈관신생 및/또는 종양 성장을 억제시키는 능력을 조사하였다. 본 발명자들은 항-EGFL7 항체가 항-VEGF 요법의 효능을 향상시킴을 관찰하였다.
HRLN 암컷 nu/nu 마우스에 1x107 H1299 인간 비소세포 폐암 종양 세포를 피하 주사하고, 종양이 80-120 mm3로 발달되게 하였다. 이어서 종양 보유 마우스를 각 그룹 내 평균 종양 크기가 122 mm3이 되도록 무작위로 4 그룹 (각각 12 마리의 마우스)으로 분류하였다. 이어서 이들 마우스를 다음과 같이 처리하였다: 그룹 1: 항-VEGF 항체 (B20-4.1; WO2005/012359 및 WO2005/044853)를 주 1회 10 mg/kg으로 복강내 (ip) 주사; 그룹 2: 음성 대조군 항체 항-돼지풀 IgG를 주 1회 10 mg/kg 및 항-EGFL7 항체 (hu18F7.v6K)를 주 2회 10 mg/kg으로 ip 주사; 그룹 3: B20-4.1을 주 1회 10 mg/kg으로 및 hu18F7.v6K를 주 2회 10 mg/kg으로 ip 주사; 그룹 4: 비처리. 캘리퍼로 종양을 주 2회 측정하고, 종양 부피를 (w2 x l)/2 (w = 종양 폭 (mm), l = 종양 길이 (mm))와 같이 계산하였다. 이어서 종양이 1000 mm3에 이르면 ("마우스가 종점에 이르렀다"고 규정함) 마우스를 안락사시켰다. 마우스의 50％ 이상이 종점에 도달할 때까지 그룹 평균 종양 부피 +/- SEM를 시간에 대해 플롯팅하였다. 이 실험으로부터의 데이터는, hu18F7.v6K에 의한 처리가 성장을 감소시키는 경향을 나타내기는 하지만, B20.4-1 뿐만 아니라 hu18F7.v6K 단독에 의한 처리는 비처리 대조군에 비해 종양 성장을 현저하게 감소시키지 못함을 보여주었다 (도 29). 대조적으로, B20.4-1 및 hu18F7.v6K 둘 모두에 의한 처리는 종양 성장을 현저하게 억제하였다 (도 29).
Balb-c 누드 마우스의 우측 옆구리에 0.1 ml 매트리겔(Matrigel)™ 중의 5 x 106 HM7 암종 세포를 피하 주사하였다. 평균 종양 크기가 80-150 mm3에 이르면, 동물을 모든 그룹 내의 평균 종양 크기가 대략 동일하도록 각각 10 마리의 마우스로 4 그룹으로 분리하고 다음과 같이 처리하였다: 그룹 1: 항-돼지풀 IgG를 주 2회 5 mg/kg으로 ip 주사; 그룹 2: B20-4.1.1 (PCT/US2008/013248)를 주 2회 5 mg/kg으로 ip 주사; 그룹 3: 항-EGFL7 항체 (hu18F7.v6k)를 주 2회 10 mg/kg으로 ip 주사; 그룹 4: B20-4.1.1를 주 2회 5 mg/kg 및 hu18F7.v6k를 주 2회 10 mg/kg으로 ip 주사. 캘리퍼로 주 2회 종양을 측정하고, 폭 및 길이를 기록하였다. 종양이 1000 mm3을 초과하거나 또는 종양 성장 또는 궤양이 동물 건강을 위협할 때 마우스를 안락사시켰다. 본 발명자들은 그룹 1 및 3의 종양 성장 속도가 유사한 반면, 그룹 2의 종양은 그룹 1의 종양에 비해 보다 느리게 성장하였고, 그룹 4의 종양은 마이너스 성장을 나타냄을 관찰하였다.
Balb-c 누드 마우스의 우측 옆구리에 원발성 인간 대세포 폐암 종양 체외이식편 (LXFL 1674)을 피하 주사하였다. 본 실험은 인간 IgG (hIgG) 및 뮤린 IgG (mIgG) 대조군 항체를 투여받는 참조 그룹 (그룹 1), hu18F7.v6k 및 mIgG를 수여받는 그룹 2, B20-4.1.1 및 hIgG를 수여받는 그룹 3, 및 hu18F7.v6K 및 B20-4.1.1을 수여받는 그룹 4를 포함하였다. 모든 처리는 B20 (또는 mIgG)를 5 mg/kg/용량으로 투여하기 4 시간 전에 hu18F7.v6k (또는 hIgG)를 10 mg/kg/용량으로 매주 2 회 ip로 행하였다. 종양 부피가 2000 mm3을 초과하면 마우스를 개별적으로 희생시켰다. 그룹 1 대조군 마우스가 50％를 초과하여 살아있는 한 (제14일), 그룹에 대해 효능을 평가하였다. 투약 시작시의 그룹 크기는 마우스 당 각각 직경이 5-10 mm인 하나의 종양을 보유하는 10 마리의 마우스였다. B20-4.1.1 단일요법에 비해 조합 요법의 이점이 통계적으로 현저하였다 (도 30).
본 발명자들은 또한 뮤린 새끼 장기 혈관신생 검정에서 인간화 항-EGFL7 항체 hu18F7.v6k 및 그의 모 항체 뮤린 18F7을 시험하였다. 신생 마우스에게 생후 제1일 및 제3일에 항체를 주사하고, 제5일에 장기를 수거하였다. 다중 장기내 혈관계를 혈관 내피 세포 마커 CD31로 염색하고, 혈관 밀도를 측량하였다. 그룹은 다음과 같다: 15 mg/ml 항-돼지풀 항체 (n=3/실험)를 수여받은 그룹 1, 5 mg/ml 항-VEGF 항체 (G6.31; WO2005/012359 및 WO2005/044853; n=3/실험) 및 10 mg/ml 돼지풀 항체를 수여받은 그룹 2, 5 mg/ml G6.31 및 10 mg/ml 뮤린 18F7 (n=4/실험)을 수여받은 그룹 3, 및 5 mg/ml G6.31 및 10 mg/ml hu18F7.v6k (n=4/실험)를 수여받은 그룹 4. 3개의 독립적인 실험으로부터 모은 결과를 도 31에 나타내었고, 이는 항-VEGF 항체 G6.31이 현저한 항-혈관신생 활성을 가지며, G6.31과 hu18F7.v6k 또는 뮤린 18F7을 조합한 것이 G6.31의 활성을 현저하게 향상시킴을 보여주었다. 장 융모 혈관계에서 유사한 항-혈관신생 활성이 관찰되었다. 이들 결과는 hu18F7.v6k 및 뮤린 18F7이 본 모델에서 유사한 항-혈관신생 활성을 가짐을 확인시켜주었다.
실시예 4: 인간 대상체에서 항-EGFL7 항체에 의한 종양 관류 및 투과성의 억제
본 발명자들은 항체에 반응한 종양 혈관계에서의 변화를 조사하기 위해 hu18F7.v6k 3 mg/kg 또는 15 mg/kg을 2 사이클로 투여받은 인간 대상체에 대해 역동적 대조 자기 공명 영상 (DCE-MRI) 평가를 수행하였다. DCE-MRI는 종양 미세순환의 기능적 분석을 가능하게 하는 영상 검사법이다. 혈관 파라미터, 예컨대 Ve, 단편적인 혈관외 및 세포외 누설량, 및 Ktrans, 부피 이동 상수의 변화는 종양 관류 및 투과성에서의 변화를 반영한다. 사이클 1에서 투약하기 대략 5-7 일 이전 (적어도 24 시간 이전) (예를 들어, 항체 투여와 관련하여 제-1일 및 제-7일)에 2 개의 전처리 기준선 스캔을 수득하였다. 처리후 스캔은 사이클 1의 제15일 및 사이클 2의 제8일 (일정관리의 어려움을 고려하여 ± 2일)에 수득하였다. 평가가능한 전이성 병변은 간에서는 3 cm 이상인 것으로 측정되어야 하거나, 또는 다른 곳에서는 적어도 하나의 크기가 2 cm 이상인 것으로 측정되어야 한다. DCE-MRI 획득 장면에 더하여, 각 대상체에 대한 동일한 영상 획득 과정 동안 다른 MRI 획득 장면, 예컨대 확산 강조 영상 및 T1- 및 T2-강조 영상을 획득하였다. 표 10에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 항-EGFL7 항체에 의한 처리가 일부 고형 종양에서 Ktrans를 최대 대략 40％ 만큼 감소시킴을 관찰하였다.
Figure pct00069
SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC. et al. <120> HUMANIZED ANTI-EGFL7 ANTIBODIES AND METHODS USING SAME <130> P4328R1 WO <140> <141> <150> 61/176,817 <151> 2009-05-08 <160> 233 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 278 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 1 Met Gln Thr Met Trp Gly Ser Gly Glu Leu Leu Val Ala Trp Phe Leu 1 5 10 15 Val Leu Ala Ala Asp Gly Thr Thr Glu His Val Tyr Arg Pro Ser Arg 20 25 30 Arg Val Cys Thr Val Gly Ile Ser Gly Gly Ser Ile Ser Glu Thr Phe 35 40 45 Val Gln Arg Val Tyr Gln Pro Tyr Leu Thr Thr Cys Asp Gly His Arg 50 55 60 Ala Cys Ser Thr Tyr Arg Thr Ile Tyr Arg Thr Ala Tyr Arg Arg Ser 65 70 75 80 Pro Gly Val Thr Pro Ala Arg Pro Arg Tyr Ala Cys Cys Pro Gly Trp 85 90 95 Lys Arg Thr Ser Gly Leu Pro Gly Ala Cys Gly Ala Ala Ile Cys Gln 100 105 110 Pro Pro Cys Gly Asn Gly Gly Ser Cys Ile Arg Pro Gly His Cys Arg 115 120 125 Cys Pro Val Gly Trp Gln Gly Asp Thr Cys Gln Thr Asp Val Asp Glu 130 135 140 Cys Ser Thr Gly Glu Ala Ser Cys Pro Gln Arg Cys Val Asn Thr Val 145 150 155 160 Gly Ser Tyr Trp Cys Gln Gly Trp Glu Gly Gln Ser Pro Ser Ala Asp 165 170 175 Gly Thr Arg Cys Leu Ser Lys Glu Gly Pro Ser Pro Val Ala Pro Asn 180 185 190 Pro Thr Ala Gly Val Asp Ser Met Ala Arg Glu Glu Val Tyr Arg Leu 195 200 205 Gln Ala Arg Val Asp Val Leu Glu Gln Lys Leu Gln Leu Val Leu Ala 210 215 220 Pro Leu His Ser Leu Ala Ser Arg Ser Thr Glu His Gly Leu Gln Asp 225 230 235 240 Pro Gly Ser Leu Leu Ala His Ser Phe Gln Gln Leu Asp Arg Ile Asp 245 250 255 Ser Leu Ser Glu Gln Val Ser Phe Leu Glu Glu His Leu Gly Ser Cys 260 265 270 Ser Cys Lys Lys Asp Leu 275 <210> 2 <211> 274 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Arg Gly Ser Gln Glu Val Leu Leu Met Trp Leu Leu Val Leu Ala 1 5 10 15 Val Gly Gly Thr Glu His Ala Tyr Arg Pro Gly Arg Arg Val Cys Ala 20 25 30 Val Arg Ala His Gly Asp Pro Val Ser Glu Ser Phe Val Gln Arg Val 35 40 45 Tyr Gln Pro Phe Leu Thr Thr Cys Asp Gly His Arg Ala Cys Ser Thr 50 55 60 Tyr Arg Thr Ile Tyr Arg Thr Ala Tyr Arg Arg Ser Pro Gly Leu Ala 65 70 75 80 Pro 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 3 Leu Thr Thr Cys Asp Gly His Arg Ala Cys Ser Thr Tyr Arg Thr Ile 1 5 10 15 Tyr Arg Thr Ala Tyr Arg Arg Ser Pro Gly 20 25 <210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 4 Pro Ala Arg Pro Arg Tyr Ala Cys Cys Pro Gly Trp Lys Arg Thr Ser 1 5 10 15 Gly Leu Pro Gly Ala Cys Gly Ala Ala Ile Cys Gln Pro Pro 20 25 30 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 5 Arg Pro Arg Tyr Ala Cys Cys Pro Gly Trp Lys Arg Thr 1 5 10 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 6 Leu Thr Thr Cys Asp Gly His Arg Ala Cys Ser Thr Tyr 1 5 10 <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 7 Arg Ala Cys Ser Thr Tyr Arg Thr Ile Tyr Arg Thr Ala 1 5 10 <210> 8 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 8 Arg Thr Ala Tyr Arg Arg Ser Pro Gly Val Thr Pro Ala 1 5 10 <210> 9 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 9 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 10 <211> 112 <212> PRT <213> 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said position" <220> <221> VARIANT <222> (15)..(15) <223> /replace="Met" <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> /note="Residue given in the sequence has no preference with respect to those in the annotation for said position" <400> 229 Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 230 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> /replace="Lys" <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> /note="Residue given in the sequence has no preference with respect to those in the annotation for said position" <220> <221> VARIANT <222> (13)..(13) <223> /replace="Leu" or "Val" <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> /note="Residue given in the sequence has no preference with respect to those in the annotations for said position" <400> 230 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 231 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 231 Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 232 <211> 6 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Eukaryotic sequence" <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 232 cncaat 6 <210> 233 <211> 6 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Eukaryotic sequence" <400> 233 aataaa 6

Claims (73)

  1. (i)
    Figure pct00070
    (여기서 X1은 A 또는 R이고; X2는 H 또는 Q이고; X3은 G 또는 V이고; X4는 D, L, R, S 및 W로 이루어진 군으로부터 선택되고; X5는 M 또는 V임) (서열 210)를 포함하는 HVR-L1;
    (ii)
    Figure pct00071
    (여기서 X1은 N 또는 Y이고; X2는 L, R 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고; X3은 Q 또는 S임) (서열 211)를 포함하는 HVR-L2;
    (iii)
    Figure pct00072
    (여기서 X1은 D 또는 E이고; X2는 F 또는 Y임) (서열 212)를 포함하는 HVR-L3;
    (iv)
    Figure pct00073
    (여기서 X1은 H 또는 V이고; X2는 R 또는 T이고; X3은 F, G, R 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고; X4는 D, G, R 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고; X5는 M 또는 Y임) (서열 213)를 포함하는 HVR-H1;
    (v)
    Figure pct00074
    (여기서 X1은 I, M, T 및 W로 이루어진 군으로부터 선택되고; X2는 H 또는 R이고; X3은 I, M, T 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고; X4는 D 또는 H이고; X5는 D, M 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고; X6은 F 또는 Y이고; X7은 K 또는 S이고; X8은 G 또는 R임) (서열 214)를 포함하는 HVR-H2, 및
    (vi)
    Figure pct00075
    (여기서 X1은 N 또는 R이고; X2는 C, S 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고; X3은 A 또는 Y임) (서열 215)를 포함하는 HVR-H3
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개 이상의 초가변 영역 (HVR) 서열을 포함하는 가변 도메인을 포함하는 항-EGFL7 항체.
  2. 제1항에 있어서, 하기 HVR 서열을 포함하는 가변 도메인을 포함하는 항-EGFL7 항체:
    (i)
    Figure pct00076
    (여기서 X1은 A 또는 R이고; X2는 H 또는 Q이고; X3은 G 또는 V이고; X4는 D, L, R, S 및 W로 이루어진 군으로부터 선택되고; X5는 M 또는 V임) (서열 210)를 포함하는 HVR-L1;
    (ii)
    Figure pct00077
    (여기서 X1은 N 또는 Y이고; X2는 L, R 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고; X3은 Q 또는 S임) (서열 211)를 포함하는 HVR-L2;
    (iii)
    Figure pct00078
    (여기서 X1은 D 또는 E이고; X2는 F 또는 Y임) (서열 212)를 포함하는 HVR-L3;
    (iv)
    Figure pct00079
    (여기서 X1은 H 또는 V이고; X2는 R 또는 T이고; X3은 F, G, R 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고; X4는 D, G, R 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고; X5는 M 또는 Y임) (서열 213)를 포함하는 HVR-H1;
    (v)
    Figure pct00080
    (여기서 X1은 I, M, T 및 W로 이루어진 군으로부터 선택되고; X2는 H 또는 R이고; X3은 I, M, T 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고; X4는 D 또는 H이고; X5는 D, M 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고; X6은 F 또는 Y이고; X7은 K 또는 S이고; X8은 G 또는 R임) (서열 214)를 포함하는 HVR-H2, 및
    (vi)
    Figure pct00081
    (여기서 X1은 N 또는 R이고; X2는 C, S 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고; X3은 A 또는 Y임) (서열 215)를 포함하는 HVR-H3.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, HVR-L1이 서열 31 및 37-43으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, HVR-L2이 서열 32 및 44-47로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, HVR-L3이 서열 33 및 48로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, HVR-H1이 서열 34 및 49-57로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, HVR-H2가 서열 35 및 58-73으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, HVR-H3이 서열 36 및 74-77로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄가 하기 프레임워크 서열을 포함하는 것인 항체:
    Figure pct00082
    (여기서 X1은 I 또는 V임) (서열 216)를 포함하는 FR-H1;
    Figure pct00083
    (여기서 X1은 I 또는 V임) (서열 217)를 포함하는 FR-H2;
    Figure pct00084
    (여기서 X1은 F 또는 I이고; X2는 L 또는 R이고; X3은 N 또는 T이고, X4는 A, E, K 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고; X5는 N 또는 S이고; X6은 A, L, M, T 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고; X7은 F 또는 Y임) (서열 218)를 포함하는 FR-H3; 및
    Figure pct00085
    를 포함하는 FR-H4.
  5. 제4항에 있어서, 중쇄가 하기 프레임워크 서열을 포함하는 것인 항체:
    Figure pct00086
    를 포함하는 FR-H1;
    Figure pct00087
    를 포함하는 FR-H2;
    Figure pct00088
    (여기서 X1은 L 또는 R이고; X2는 A, L, M, T 및 V로 이루어진 군으로부터 선택됨) (서열 220)를 포함하는 FR-H3; 및
    Figure pct00089
    를 포함하는 FR-H4.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 경쇄가 하기 프레임워크 서열을 포함하는 것인 항체:
    Figure pct00090
    를 포함하는 FR-L1,
    Figure pct00091
    를 포함하는 FR-L2,
    Figure pct00092
    를 포함하는 FR-L3,
    Figure pct00093
    또는
    Figure pct00094
    를 포함하는 FR-L4.
  7. 제1항에 있어서, 경쇄가 도 15에 나타낸 바와 같은 4F11.v17의 가변 도메인 서열 (서열 82)을 포함하는 것인 항체.
  8. 제1항에 있어서, 경쇄가 도 15에 나타낸 바와 같은 4F11.v22의 가변 도메인 서열 (서열 83)을 포함하는 것인 항체.
  9. 제1항에 있어서, 중쇄가 도 16에 나타낸 바와 같은 4F11.v17의 가변 도메인 서열 (서열 84)을 포함하는 것인 항체.
  10. 제1항에 있어서, 중쇄가 도 16에 나타낸 바와 같은 4F11.v22의 가변 도메인 서열 (서열 85)을 포함하는 것인 항체.
  11. 제1항에 있어서, 경쇄가 도 15에 나타낸 바와 같은 4F11.v17의 가변 도메인 서열 (서열 82)을 포함하고, 중쇄가 도 16에 나타낸 바와 같은 4F11.v17의 가변 도메인 서열 (서열 84)을 포함하는 것인 항체.
  12. 제1항에 있어서, 경쇄가 도 15에 나타낸 바와 같은 4F11.v22의 가변 도메인 서열 (서열 83)을 포함하고, 중쇄가 도 16에 나타낸 바와 같은 4F11.v22의 가변 도메인 서열 (서열 85)을 포함하는 것인 항체.
  13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 프레임워크 서열의 적어도 일부가 인간 컨센서스 프레임워크 서열인 항체.
  14. 제13항에 있어서, 인간 κ 하위군 1 컨센서스 프레임워크 서열을 포함하는 항체.
  15. 제13항에 있어서, 중쇄 인간 하위군 III 컨센서스 프레임워크 서열을 포함하는 항체.
  16. (i)
    Figure pct00095
    (여기서 X1은 L, Q, R, S 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고; X2는 P, T 및 W로 이루어진 군으로부터 선택되고; X3은 H 또는 S이고; X4는 D 또는 Q이고; X5는 G 또는 S이고; X6은 L 또는 V이고; X7은 H 또는 P이고; X8은 I, L, P, T 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고; X9는 N, Q 또는 S로 이루어진 군으로부터 선택되고; X10은 A, G 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고; X11은 G 또는 H임) (서열 222)를 포함하는 HVR-L1;
    (ii)
    Figure pct00096
    (여기서 X1은 D 또는 R이고; X2는 A, G, F, I 및 T로 이루어진 군으로부터 선택됨) (서열 223)를 포함하는 HVR-L2;
    (iii)
    Figure pct00097
    (여기서 X1은 A, G, I, K, L, N, S, T 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고; X2는 C 또는 T이고; X3은 F 또는 H임) (서열 224)를 포함하는 HVR-L3;
    (iv)
    Figure pct00098
    (여기서 X1은 N 또는 T이고; X2는 F 또는 V이고; X3은 I, M, R 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고; X4는 Y, Q 및 K로 이루어진 군으로부터 선택되고; X5는 I 또는 M임) (서열 225)를 포함하는 HVR-H1;
    (v)
    Figure pct00099
    (여기서 X1은 A, L, N 및 P로 이루어진 군으로부터 선택되고; X2는 D, L 및 R로 이루어진 군으로부터 선택되고; X3은 G, K, N, R, S 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고; X4는 G 또는 S이고; X5는 G, I, K, R, S, T 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고; X6은 G, R 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고; X7은 I, V 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고; X8은 N 또는 S이고; X9는 A, N 및 Q로 이루어진 군으로부터 선택되고; X10은 K 또는 V이고; X11은 F 또는 Q이고; X12는 K 또는 T이고; X13은 G, H, R 및 S로 이루어진 군으로부터 선택됨) (서열 226)를 포함하는 HVR-H2; 및
    (vi)
    Figure pct00100
    (여기서 X1은 A, N 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고; X2는 D 또는 P이고; X3은 M 또는 W임) (서열 227)를 포함하는 HVR-H3
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개 이상의 HVR 서열을 포함하는 가변 도메인을 포함하는 항-EGFL7 항체.
  17. 제16항에 있어서, 하기 HVR 서열을 포함하는 가변 도메인을 포함하는 항-EGFL7 항체:
    (i)
    Figure pct00101
    (여기서 X1은 L, Q, R, S 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고; X2는 P, T 및 W로 이루어진 군으로부터 선택되고; X3은 H 또는 S이고; X4는 D 또는 Q이고; X5는 G 또는 S이고; X6은 L 또는 V이고; X7은 H 또는 P이고; X8은 I, L, P, T 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고; X9는 N, Q 또는 S로 이루어진 군으로부터 선택되고; X10은 A, G 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고; X11은 G 또는 H임) (서열 222)를 포함하는 HVR-L1;
    (ii)
    Figure pct00102
    (여기서 X1은 D 또는 R이고; X2는 A, G, F, I 및 T로 이루어진 군으로부터 선택됨) (서열 223)를 포함하는 HVR-L2;
    (iii)
    Figure pct00103
    (여기서 X1은 A, G, I, K, L, N, S, T 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고; X2는 C 또는 T이고; X3은 F 또는 H임) (서열 224)를 포함하는 HVR-L3;
    (iv)
    Figure pct00104
    (여기서 X1은 N 또는 T이고; X2는 F 또는 V이고; X3은 I, M, R 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고; X4는 Y, Q 및 K로 이루어진 군으로부터 선택되고; X5는 I 또는 M임) (서열 225)를 포함하는 HVR-H1;
    (v)
    Figure pct00105
    (여기서 X1은 A, L, N 및 P로 이루어진 군으로부터 선택되고; X2는 D, L 및 R로 이루어진 군으로부터 선택되고; X3은 G, K, N, R, S 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고; X4는 G 또는 S이고; X5는 G, I, K, R, S, T 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고; X6은 G, R 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고; X7은 I, V 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고; X8은 N 또는 S이고; X9는 A, N 및 Q로 이루어진 군으로부터 선택되고; X10은 K 또는 V이고; X11은 F 또는 Q이고; X12는 K 또는 T이고; X13은 G, H, R 및 S로 이루어진 군으로부터 선택됨) (서열 226)를 포함하는 HVR-H2; 및
    (vi)
    Figure pct00106
    (여기서 X1은 A, N 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고; X2는 D 또는 P이고; X3은 M 또는 W임) (서열 227)를 포함하는 HVR-H3.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, HVR-L1이 서열 100 및 106-124로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, HVR-L2가 서열 101 및 125-129로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, HVR-L3이 서열 102 및 130-145로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, HVR-H1이 서열 103 및 146-153으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, HVR-H2가 서열 104 및 154-187로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, HVR-H3이 서열 105 및 188-192로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄가 하기 프레임워크 서열을 포함하는 것인 항체:
    Figure pct00107
    를 포함하는 FR-H1;
    Figure pct00108
    (여기서 X1은 I 또는 V임) (서열 228)를 포함하는 FR-H2;
    Figure pct00109
    (여기서 X1은 F 또는 V이고; X2는 I 또는 L이고; X3은 L, R 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고; X4는 K 또는 N이고; X5는 K, N, R 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고; X6은 N 또는 S이고; X7은 A, L 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고; X8은 L 또는 M임) (서열 229)를 포함하는 FR-H3; 및
    Figure pct00110
    를 포함하는 FR-H4.
  20. 제19항에 있어서, 중쇄가 하기 프레임워크 서열을 포함하는 것인 항체:
    Figure pct00111
    를 포함하는 FR-H1;
    Figure pct00112
    를 포함하는 FR-H2;
    Figure pct00113
    (여기서 X1은 N 또는 K이고; X2는 A, L 및 V로 이루어진 군으로부터 선택됨) (서열 230)를 포함하는 FR-H3; 및
    Figure pct00114
    를 포함하는 FR-H4.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 경쇄가 하기 프레임워크 서열을 포함하는 것인 항체:
    Figure pct00115
    를 포함하는 FR-L1,
    Figure pct00116
    를 포함하는 FR-L2,
    Figure pct00117
    를 포함하는 FR-L3,
    Figure pct00118
    또는
    Figure pct00119
    를 포함하는 FR-L4.
  22. 제16항에 있어서, 경쇄가 도 27에 나타낸 바와 같은 18F7.v6의 가변 도메인 서열 (서열 193)을 포함하는 것인 항체.
  23. 제16항에 있어서, 경쇄가 도 27에 나타낸 바와 같은 18F7.v6k의 가변 도메인 서열 (서열 194)을 포함하는 것인 항체.
  24. 제16항에 있어서, 중쇄가 도 28에 나타낸 바와 같은 18F7.v6의 가변 도메인 서열 (서열 195)을 포함하는 것인 항체.
  25. 제16항에 있어서, 중쇄가 도 28에 나타낸 바와 같은 18F7.v6k의 가변 도메인 서열 (서열 196)을 포함하는 것인 항체.
  26. 제16항에 있어서, 경쇄가 도 27에 나타낸 바와 같은 18F7.v6의 가변 도메인 서열 (서열 193)을 포함하고, 중쇄가 도 28에 나타낸 바와 같은 18F7.v6의 가변 도메인 서열 (서열 195)을 포함하는 것인 항체.
  27. 제16항에 있어서, 경쇄가 도 27에 나타낸 바와 같은 18F7.v6k의 가변 도메인 서열 (서열 194)을 포함하고, 중쇄가 도 28에 나타낸 바와 같은 18F7.v6k의 가변 도메인 서열 (서열 196)을 포함하는 것인 항체.
  28. 제16항에 있어서, 프레임워크 서열의 적어도 일부가 인간 컨센서스 프레임워크 서열인 항체.
  29. 제28항에 있어서, 인간 κ 하위군 1 컨센서스 프레임워크 서열을 포함하는 항체.
  30. 제28항에 있어서, 중쇄 인간 하위군 III 컨센서스 프레임워크 서열을 포함하는 항체.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체인 항체.
  32. 제31항에 있어서, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)에 결합하는 이중특이적 항체.
  33. 제32항에 있어서, 베바시주맙 또는 라니비주맙과 동일한 VEGF 에피토프에 결합하는 이중특이적 항체.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 항체를 코딩하는 핵산.
  35. 제34항의 핵산을 포함하는 벡터.
  36. 제34항의 핵산 또는 제35항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  37. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 담체를 포함하는 조성물.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 제약 조성물인 조성물.
  40. (a) 적합한 숙주 세포에서 제35항의 벡터를 발현시키는 단계, 및 (b) 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 항-EGFL7 항체의 제조 방법.
  41. 제40항에 있어서, 숙주 세포가 원핵세포인 방법.
  42. 제40항에 있어서, 숙주 세포가 진핵세포인 방법.
  43. 종양, 암 또는 세포 증식성 장애의 치료를 필요로 하는 개체에게 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 항-EGFL7 항체의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 종양, 암 또는 세포 증식성 장애를 치료하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 암이 유방암, 결장직장암, 폐암, 식도암, 방광암, 난소암, 췌장암 및 간세포 암종으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 암이 유방암, 결장직장암 또는 폐암인 방법.
  46. 제43항에 있어서, 세포 증식성 장애가 암인 방법.
  47. 제43항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 항-EGFL7 항체가 제1 의약이고, 개체에게 제2 의약의 유효량을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 제2 의약이 또 다른 항체, 화학요법제, 세포독성제, 항혈관신생제, 면역억제제, 전구약물, 시토카인, 시토카인 길항제, 세포독성 방사선요법제, 코르티코스테로이드, 항구토제, 암 백신, 진통제 또는 성장 억제제인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 제2 의약이 항-VEGF 항체인 방법.
  50. 제49항에 있어서, 제2 의약이 베바시주맙인 방법.
  51. 제47항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 의약을 항-EGFL7 항체의 투여 이전 또는 투여 이후에 투여하는 방법.
  52. 제47항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 의약을 항-EGFL7 항체와 동시에 투여하는 방법.
  53. 혈관신생 관련 병리 상태를 갖는 대상체에게 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 항체를 투여하여 대상체의 혈관신생을 감소시키거나 억제하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 혈관신생을 감소시키거나 억제하는 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 병리 상태가 신생물성 상태인 방법.
  55. 제53항에 있어서, 상기 병리 상태가 비-신생물성 상태인 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 비-신생물성 상태가 당뇨병 및 다른 증식성 망막병증, 미숙아 망막병증, 신생혈관 녹내장, 연령-관련 황반 변성, 당뇨병성 황반 부종, 각막 신생혈관형성, 각막 이식 신생혈관형성, 망막/맥락막 신생혈관형성으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  57. 혈관신생과 관련된 병리 상태를 갖는 대상체에게 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 항체의 유효량을 항혈관신생제와 함께 투여하여 상기 항혈관신생제의 억제 활성을 향상시키는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 항혈관신생제의 효능을 향상시키는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 혈관신생과 관련된 병리 상태가 종양, 암 또는 세포 증식성 장애인 방법.
  59. 제57항에 있어서, 혈관신생과 관련된 병리 상태가 비-신생물성 상태인 방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 비-신생물성 상태가 당뇨병 및 다른 증식성 망막병증, 미숙아 망막병증, 신생혈관 녹내장, 연령-관련 황반 변성, 당뇨병성 황반 부종, 각막 신생혈관형성, 각막 이식 신생혈관형성, 망막/맥락막 신생혈관형성으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  61. 제57항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항혈관신생제를 항-EGFL7 항체의 투여 이전 또는 투여 이후에 투여하는 방법.
  62. 제57항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항혈관신생제를 항-EGFL7 항체와 동시에 투여하는 방법.
  63. 제57항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항혈관신생제가 항-VEGF 작용제인 방법.
  64. 제63항에 있어서, 상기 항-VEGF 작용제가 항-VEGF 항체인 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 항-VEGF 항체가 베바시주맙인 방법.
  66. 제64항에 있어서, 상기 항-VEGF 항체가 라니비주맙인 방법.
  67. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 항체를 대상체에게 투여하여 대상체에서 종양의 관류 및 투과성을 감소시키거나 억제하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양의 관류 및 투과성을 감소시키거나 억제하는 방법.
  68. 제67항에 있어서, 항혈관신생제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 항혈관신생제를 항-EGFL7 항체의 투여 이전 또는 투여 이후에 투여하는 방법.
  70. 제68항에 있어서, 상기 항혈관신생제를 항-EGFL7 항체와 동시에 투여하는 방법.
  71. 제67항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항혈관신생제가 항-VEGF 작용제인 방법.
  72. 제71항에 있어서, 상기 항-VEGF 작용제가 항-VEGF 항체인 방법.
  73. 제72항에 있어서, 상기 항-VEGF 항체가 베바시주맙인 방법.

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