KR20190055008A - 항-her2 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 이를 포함하는 키메라 항원 수용체 - Google Patents

항-her2 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 이를 포함하는 키메라 항원 수용체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 암 예방 또는 치료에 이용되는 신규한 항-HER2 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 이를 포함하는 키메라 항원 수용체와 이들의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 암 세포(특히, 유방암 또는 위암 세포)에서 고발현되는 HER2에 특이적으로 결합하는 항체로서, 기존의 트라스투주맙과는 서로 상이한 에피토프에 결합하는 항체이다. 본 발명의 항체는 트라스투주맙 항체에 대하여 비반응성(또는 내성)을 갖고 있거나 또는 민감도가 감소된 HER2-미발현 암 세포에 대해서 트라스투주맙보다 우수한 살상능을 나타낸다. 또한, 본 발명의 항-HER2 항체는 트라스투주맙과 병용투여하는 경우, 트라스투주맙 항체가 작용하는 암세포 주에 대하여 상승적인 살상능을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 조성물은 암의 치료를 위하여 트라스투주맙 항체와의 병용투여 용도 및 트라스투주맙에 의해 치료되지 않는 암의 치료에 매우 유용하게 사용할 수 있다.

Description

항-HER2 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 이를 포함하는 키메라 항원 수용체{Anti-HER2 Antibody or Antigen Binding Fragment Thereof, and Chimeric Antigen Receptor Comprising The Same}
본 발명은 대한민국 산업통상자원부의 지원 하에서 과제번호 1415118385에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리전문기관은 한국산업기술진흥원, 연구사업명은 "국제공동기술개발사업", 연구과제명은 "혁신 에피톱 발굴플랫폼기술 기반 글로벌 항체 신약 개발", 주관기관은 앱클론(주), 연구기간은 2011.11.01-2014.10.31이다.
본 특허출원은 2017년 11월 14일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허 출원 제10-2017-0151841호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 신규한 항-HER2 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 이를 포함하는 키메라 항원 수용체, 및 이들의 용도에 관한 것이다.
Her2/neu(ErbB2) 유전자는 185 kDa 세포막통과 당단백질을 코딩하며 이는 EGFR(epidermal growth factor receptors)의 패밀리 중 하나이다. Her2 단백질은 620개 아미노산 잔기로 이루어진 세포외 도메인, 23개 아미노산 잔기의 세포막통과 도메인 및 타이로신 키나아제 활성을 갖는 490 아미노산 잔기의 세포내 도메인으로 구성되어 있다(Akiyama T, et al., Science, 232(4758):1644-1646(1986)).
한편, 다양한 특성을 갖는 항-HER2 항체가 많은 문헌에 개시되어 있다: Tagliabue et al., Int. J. Cancer 47:933-937 (1991); McKenzie et al., Oncogene 4:543-548 (1989); Maier et al., Cancer Res. 51:5361-5369 (1991); Bacus et al., Molecular Carcinogenesis 3:350-362 (1990); Stancovski et al., PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991); Bacus et al., Cancer Research 52:2580-2589 (1992); Xu et al., Int. J. Cancer 53:401-408 (1993); WO94/00136; Kasprzyk et al., Cancer Research 52:2771-2776 (1992); Hancock et al., Cancer Res. 51:4575-4580 (1991); Shawver et al., Cancer Res. 54:1367-1373 (1994); Arteaga et al., Cancer Res. 54:3758-3765 (1994); Harwerth et al., J. Biol. Chem. 267:15160-15167 (1992); U.S. Pat. No. 5,783,186; Kao et al., U.S. Publ. No. 2009/0285837 (2009); Ross et al., The Oncologist 8:307-325 (2003) and Klapper et al., Oncogene 14:2099-2109 (1997).
항-HER2 항체들 중에서 상업적으로 가장 성공한 항체는 트라스투주맙(trastuzumab) 항체(HerceptinTM)으로 상업화됨, U.S. Pat. No. 5,821,337)로서, 이에 대한 연구가 많이 이루어져 있다: Sapino, A., et al., Annals of Oncology (2007) 18: 1963-1968; Bussolati, G, et al., British Journal of Cancer (2005) 92, 1261-1267; and Glazyrin A, et al., J Histology & Cytochemistry (2007) 55(1):25-33.
트라스투주맙 항체가 상업적으로 성공하기는 하였지만, 이 항체에 대하여 비반응성(또는 내성)을 갖고 있거나 또는 민감도(sensitivity)가 감소된 암 세포 종류들이 상당히 있어, 트라스투주맙 항체에 의한 치료의 한계가 문제되고 있다. 따라서, 이러한 항체 치료학적 문제점을 해결하려는 시도가 당업계에 있다.
예를 들어, 미국 특허 제7,674,460호는 트라스투주맙 항체와 같은 HER2 안타고니스트 및 PCDGF(PC cell-derived growth factor) 안타고니스트를 이용하여 암 세포의 HER2 민감성을 증가시키는 방법을 개시하고 있다. WO 2011/127297는 FoxMl 억제제와 트라스투주맙 항체 조합을 이용하여 트라스투주맙 내성 종양 세포의 증식을 억제하는 방법을 개시하고 있다.
미국 특허출원 공개 제2010-0183604호는 코필린(cofilin) 억제제, PAK1 억제제, LIMK 억제제, RHO 억제제, ROCK1 억제제 또는 ROCK2 억제제를 이용하여 트라스투주맙 내성 암을 치료하는 방법을 개시하고 있다.
본 발명자들은 암(특히, 유방암 및 위암)을 예방 또는 치료할 수 있으며, 트라스투주맙 항체에 대하여 비반응성(또는 내성)을 갖고 있거나 또는 민감도가 감소된 암 세포에 대하여 살상능(또는 증식 억제능)이 우수한 항체, 또는 트라스투주맙 항체와 병용투여를 하는 경우 트라스투주맙 단독투여가 나타내는 항암활성보다 개선된 효능으로 암을 예방 또는 치료할 수 있는 신규한 항체를 개발하고자 노력하였다. 그 결과 트라스투주맙 항체가 거의 작용하지 못하는 HER2-고발현 암 세포에 대해서 트라스투주맙보다 우수한 살상능을 나타내거나, 또는 트라스투주맙 항체와 병용투여시에 항암활성이 개선되는 신규한 항체를 개발함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 HER2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2)에 대한 항체(항-HER2 항체) 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항-HER2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 융합단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항-HER2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor, CAR) 및 이를 발현하는 효과기 세포(effector cell)를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항-HER2 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 또는 상기 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환 된 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항-HER2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항-HER2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항-HER2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 대상체에 투여하여 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 키메라 항원 수용체를 발현하는 효과기 세포를 대상체에 투여하여 HER2의 고발현과 관련된 질환(예컨대, 암)의 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 명세서에서 본 발명의 양태에 따른 항체는 HER2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2)에 특이적으로 결합하는 항체 및 친화도 성숙을 거친 이들의 변형 항체이다.
본 발명의 첫 번째 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 HER2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2)에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다:
(a) 다음의 중쇄 CDR(complementarity determining region) 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역: 서열목록 제1서열의 CDRH1, 서열목록 제2서열의 CDRH2 및 서열목록 제3서열의 CDRH3; 및
(b) 다음의 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역:
서열목록 제4서열의 CDRL1, 서열목록 제5서열의 CDRL2 및 서열목록 제6서열의 CDRL3.
본 발명의 두 번째 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 HER2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2)에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다:
(a) 다음의 중쇄 CDR(complementarity determining region) 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역:
서열목록 제7서열의 CDRH1, 서열목록 제8서열의 CDRH2 및 서열목록 제9서열, 제71서열, 또는 제72서열의 CDRH3; 및
(b) 다음의 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역:
서열목록 제10서열의 CDRL1, 서열목록 제11서열의 CDRL2 및 서열목록 제12서열, 제73서열, 또는 제74서열의 CDRL3.
본 발명의 세 번째 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 HER2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2)에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다:
(a) 다음의 중쇄 CDR(complementarity determining region) 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역:
서열목록 제13서열의 CDRH1, 서열목록 제14서열의 CDRH2 및 서열목록 제15서열의 CDRH3; 및
(b) 다음의 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역:
서열목록 제16서열의 CDRL1, 서열목록 제17서열의 CDRL2 및 서열목록 제18서열의 CDRL3.
본 발명의 네 번째 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 HER2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2)에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다:
(a) 다음의 중쇄 CDR(complementarity determining region) 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역:
서열목록 제19서열의 CDRH1, 서열목록 제20서열의 CDRH2 및 서열목록 제21서열의 CDRH3; 및
(b) 다음의 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역:
서열목록 제22서열의 CDRL1, 서열목록 제23서열의 CDRL2 및 서열목록 제24서열의 CDRL3.
본 발명의 다섯 번째 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 HER2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2)에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다:
(a) 다음의 중쇄 CDR(complementarity determining region) 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역:
서열목록 제25서열의 CDRH1, 서열목록 제26서열의 CDRH2 및 서열목록 제27서열의 CDRH3; 및
(b) 다음의 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역:
서열목록 제28서열의 CDRL1, 서열목록 제29서열의 CDRL2 및 서열목록 제30서열의 CDRL3.
상술한 첫 번째 양태의 항체, 두 번째 양태의 항체, 세 번째 양태의 항체, 네 번째 양태의 항체 및 다섯 번째 양태의 항체를 각각 2G10, 39D2, 24D3, 1G3 및 8G11항체라 하고, 이들은 마우스 항체 또는 키메릭 항체에 해당하며, 이들 중에서 인간화(humanized)된 항체는 앞에 hz를 덧붙여 hz2G10, hz39D2, 및 hz8G11 항체라고 표현한다.
본 발명자들은 암(특히, 유방암 및 위암)을 예방 또는 치료할 수 있으며, 트라스투주맙 항체에 대하여 비반응성(또는 내성)을 갖고 있거나 또는 민감도가 감소된 암 세포에 대하여 살상능(또는 증식 억제능)이 우수한 항체, 또는 트라스투주맙 항체와 병용투여를 하는 경우 트라스투주맙 단독투여가 나타내는 항암활성보다 개선된 효능으로 암을 예방 또는 치료할 수 있는 신규한 항체를 개발하고자 노력하였다. 그 결과 트라스투주맙 항체가 거의 작용하지 못하는 HER2-고발현 암 세포에 대해서 트라스투주맙보다 우수한 살상능을 나타내거나, 또는 트라스투주맙 항체와 병용투여시에 항암활성이 개선되는 신규한 항체를 개발하였다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 HER2에 대하여 특이적 결합능을 갖는다. 특히, 본 발명의 항체 중 hz2G10, hz39D2는 HER2의 도메인 1~4 중 도메인 1에 있는 에피토프에 결합하고, 24D3는 도메인 3에 있는 에피토프에 결합하며, 1G3 및 hz8G11은 트라스투주맙과 마찬가지로 도메인 4에 있는 에피토프에 결합하나, 트라스투주맙이 결합하는 에피토프와 상이한 에피토프에 결합한다.
본 명세서에서, 용어 “트라스투주맙(trastuzumab)”은 미국 특허 제5,821,337호에 개시된 항체를 의미한다.
본 발명의 항체는 트라스투주맙 항체에 대하여 비반응성(또는 내성)을 갖고 있거나 또는 민감도가 감소된 암 세포에 대하여, 단독 또는 트라스투주맙과의 병용에 의해 우수한 살상능 또는 증식 억제능을 갖는다. 본 명세서에서, 암 세포를 언급하면서 사용되는 용어 “살상”, “증식 억제” 또는 “성장 억제”는 동일한 의미로 혼용된다.
본 명세서에서, 용어 “항체(antibody)”는 HER2에 대한 특이 항체로서, 완전한 항체 형태뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편(antigen binding fragment)을 포함한다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
본 명세서에서, 용어 "항원 결합 단편(antigen binding fragment)"은 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab(fragment antigen binding)는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 다이설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 공지되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chin variable fragment, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 또는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
따라서, 본 발명에서 항체는 구체적으로 단일클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fvs(scFv), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab' )단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFv) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 그리고 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 용어 "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3 개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한 본 명세서에서 용어"경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "가변 영역(variable region)" 또는 "가변 도메인(variable domain)"은 항체를 항원에 결합시키는 것과 관련되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 의미한다. Native 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각 도메인은 4 개의 보존된 프레임워크 영역 (framework regions, FR) 및 3 개의 초가변 영역 (hypervariable regions, HVR)을 포함한다. (Kindt et al., Kuby Immunology, 제 6 판, W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)).
본 명세서에서, 용어 "CDR(complementarity determining region)"은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)). 중쇄(CDRH1, CDRH2 및 CDRH3) 및 경쇄(CDRL1, CDRL2 및 CDRL3)에는 각각 3개의 CDR이 포함되어 있다. CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공한다.
본 명세서에서, 용어 "프레임 워크(Framework)" 또는 "FR"은 초가변 영역 (hypervariable region, HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 나타낸다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4 개의 FR 도메인 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 구성된다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH 에서 다음의 순서로 나타난다:
FRH1(Framework region 1 of Heavy chain)-CDRH1 (complementarity determining region 1 of Heavy chain)-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4;
또한, HVR 및 FR서열은 일반적으로 VL(또는 Vk)에서 다음의 순서로 나타난다:
FRL1(Framework region 1 of Light chain)-CDRL1(complementarity determining region 1 of Light chain)-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4.
본 명세서에서, 용어 "특이적으로 결합한다" 또는 이와 같은 것은, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 scFv와 같은 다른 구성물이 생리적 조건 하에서 비교적 안정한 항원과 복합체를 형성한다는 것을 의미한다. 특이적 결합은 적어도 약 1 x 10-6 M 이하의 평형 해리 상수 (예를 들어, 이보다 작은 KD는 보다 단단한 결합을 나타냄)로 특성화될 수 있다. 2 개의 분자가 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 방법은 당 업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 평형 투석, 표면 플라스몬 공명 등을 포함한다.
본 명세서에서, 용어 "친화도(Affinity)"는 분자(예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호 작용의 총합의 강도를 의미한다. 달리 명시하지 않는 한, "결합 친화력(binding affinity)"은 결합 쌍 (예를 들어, 항체 및 항원)의 구성원 간의 1:1 상호 작용을 반영하는 내인성(intrinsic) 결합 친화력을 나타낸다. 분자 Y와 그의 파트너 Y의 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기술된 것들을 포함하여 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다.
또한 본 명세서에서 용어, "인간 항체(human antibody)" 또는 "인간화 항체(humanized antibody)"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성된 항체, 또는 인간 항체 레퍼토리(repertoires) 또는 다른 인간 항체 코딩 서열을 이용하는 비인간 근원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유한다.
본 명세서에서 용어, "키메라(chimeric) 항체"는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 근원(source) 또는 종(species)으로부터 유래되고, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 상이한 근원 또는 종에서 유래한 항체를 의미한다.
본 발명의 항-HER2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, HER2를 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서 첨부한 서열목록에 기재된 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다.
이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트(+3.0± 1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ± 1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).
친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, hz2G10 항체와 2G10 항체의 중쇄 가변영역은 각각 서열목록 제31서열, 제32서열의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, hz2G10 항체와 2G10 항체의 경쇄 가변영역은 각각 서열목록 제35서열, 제77서열의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, hz39D2 항체와 39D2 항체의 중쇄 가변영역은 각각 서열목록 제39서열, 제83서열의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, hz39D2 항체와 39D2 항체의 경쇄 가변영역은 각각 서열목록 제43서열, 제85서열의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 24D3 항체의 중쇄 가변영역은 서열목록 제47서열의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 24D3 항체의 경쇄 가변영역은 서열목록 제51서열의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 1G3 항체의 중쇄 가변영역은 서열목록 제55서열의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 1G3 항체의 경쇄 가변영역은 서열목록 제59서열의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, hz8G11 항체와 8G11 항체의 중쇄 가변영역은 각각 서열목록 제63서열, 제79서열의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, hz8G11 항체와 8G11 항체의 경쇄 가변영역은 각각 서열목록 제67서열, 제81서열의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 항체는 단일클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab')단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 그리고 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
한편, 본 발명의 항체 CDR 서열은 종래 항-HER2 항체들의 CDR 서열과 비교하여 상동성(similarity)이 매우 낮아, 그 서열의 독특함이 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 중 hz2G10에 대하여 BLAST 검색을 한 결과, 상동성이 가장 높은 것으로 나온 미국 특허 제8,314,213호 및 제8,404,811호에 개시된 항체는 본 발명의 항체와 CDR 서열 상동성이 50% 미만이며, 더욱이 미국 특허 제8,314,213호 및 제8,404,811호에 기재된 항체는 각각 CD25 및 EGFL7에 결합하는 항체로서, 본 발명의 항체와 그 타겟이 상이하다.
또한, 본 발명의 항-HER2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 상술한 아미노산 서열에 대하여 소폭의 변화, 즉, 3차 구조 및 항체의 기능에 거의 영향을 미치지 않는 변형을 포함하는 항-HER2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 따라서 어떤 구현예의 경우 상술한 서열과 일치하지 않더라도 적어도 90%, 93%, 95% 또는 98% 이상의 유사성을 가질 수 있다.
또한, 본 발명에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 포함되는 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역은 일반식 (GnSm)p 또는 (SmGn)p로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 링커에 의해 연결될 수 있다.
여기에서 상기 n, m 및 p는 독립적으로,
n은 1 내지 7의 정수이고;
m은 0 내지 7의 정수이며;
n과 m의 합은 8이하의 정수이고; 및
p는 1 내지 7의 정수이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 링커는 n = 1 내지 5이고, m = 0 내지 5이다. 보다 구체적인 구현예의 경우, n = 4이고, m = 1이다. 보다 더 구체적인 구현예의 경우, 상기 링커는 (G4S)3 또는 (S4G)3 이다.
다른 구현예의 경우, 상기 링커는 VDGS이고, 또 다른 구현예의 경우, 상기 링커는 ASGS이다.
또한, 본 발명에 따른 항체 또는 항원 결합 단편의 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역은 예를 들어 다음의 배향으로 존재할 수 있다:
경쇄 가변영역-링커-중쇄 가변영역; 또는
중쇄 가변영역-링커-경쇄 가변영역.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 항-HER2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 융합단백질을 제공한다.
본 발명에서 상기 융합단백질은 본 발명의 항-HER2 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 생산성, 정제 효율, 생물학적 활성의 향상, 융합단백질의 안정성 증가, 폴딩(folding)의 향상 및/또는 추가적인 기능성을 가진 기능적 모이어티(moiety)와의 결합을 위하여 제조된다. 상기 융합단백질은 2 이상의 폴리펩타이드 체인이 재조합 융합단백질(recombinant fused protein)로 발현되는 것을 통해 공유결합에 의해 연결되거나, 또는 화학적 컨쥬게이션(conjugation)에 의해 2 이상의 폴리펩타이드 체인이 연결된 컨쥬게이트(conjugate)의 형태로 구현될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 키메라 항원 수용체 폴리펩티드를 제공한다:
(a) HER2 결합 도메인(HER2 binding domain);
(b) 막횡단 도메인(transmembrane domain, TM);
(c) 공동자극 도메인(costimulatory domain); 및
(d) 세포내 신호전달 도메인(intracellular signaling domain, ICD).
본 명세서에서, 용어 “키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)”는 효과기 세포 신호전달 또는 효과기 세포 활성화 도메인(e.g. T-세포 신호전달 또는 T-세포 활성화 도메인)에 연결된 타겟 결합 도메인(e.g. 단일쇄 가변 단편(scFv))을 포함하는 인공적으로 제작된 하이브리드 단백질(융합 단백질) 또는 폴리펩타이드이다. 키메라 항원 수용체는 일반적으로 단일클론항체의 항원-결합 성질을 이용하여 비-MHC-제한 방식으로, 선택된 표적에 대한 T-세포 특이성 및 반응성을 재유도하는 능력을 갖는다. 비-MHC-제한된 항원 인식은 CAR을 발현하는 T-세포에게 항원 처리와 무관하게 항원을 인식하는 능력을 제공하여, 종양 도피의 주요 메카니즘을 회피시킨다. 또한, CAR은 T-세포에서 발현될 때, 유리하게는 내재성 T-세포 수용체(TCR) 알파 및 베타 사슬과 이량체화되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 키메라 항원 수용체는 본 발명에서 상술한 항-HER2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 HER2 결합도메인을 포함하므로 HER2 항원을 인식하며 세포의 표면에서 발현된다.
본 발명의 키메라 항원 수용체는 세포의 표면에서 발현되므로, 막횡단 도메인을 포함한다. 상기 막횡단 도메인은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 막횡단 도메인일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 막횡단 도메인은 CD8, 또는 CD28의 막횡단 도메인이다.
본 발명의 키메라 항원 수용체의 상기 공동자극 도메인은 MHC 클래스 I 분자, TNF 수용체 단백질, 이뮤노글로불린-유사 단백질, 시토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자 (signaling lymphocytic activation molecule, SLAM), 활성화 NK 세포 수용체, BTLA(B an T lymphocyte attenuator), 톨-유사 리간드 수용체(Toll-like ligand receptor), OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질로부터 수득된 기능적 신호전달 도메인일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 공동자극 도메인은 CD28, OX40, 4-1BB (CD137), 및/또는 ICOS (CD278)로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질로부터 수득된 기능적 신호전달 도메인일 수 있고, 보다 구체적으로는 CD28 및/또는 OX40의 기능적 신호전달 도메인일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB, CD28, OX40, CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인, 또는 이들의 조합이다. 상기 세포내 신호전달 도메인은 가장 구체적으로는 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인이다.
본 발명의 키메라 항원 수용체의 상기 HER2 결합 도메인은 힌지 도메인에 의해 상기 막횡단 도메인에 연결된다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 힌지 도메인은 IgG4 힌지, CD8 힌지, 또는 IgD 힌지일 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 항-HER2 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 상술한 키메라 항원 수용체 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "핵산 분자“는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
본 발명의 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 상기 키메라 항원 수용체 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 키메라 항원 수용체 분자를 구성하는 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 것으로 족하며, 어느 특정 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는 다는 것은 당업자에게 자명하다.
이는 뉴클레오티드 서열의 변이가 발생하더라도 변이된 뉴클레오타이드 서열을 단백질로 발현하면 단백질 서열에서 변화를 가져오지 않는 경우도 있기 때문이다. 이를 코돈의 축퇴성이라고 한다. 따라서 상기 뉴클레오타이드 서열은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 본 발명의 HER2에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 중쇄 CDR, 경쇄 CDR, 중쇄 가변영역, 경쇄 가변영역, 중쇄, 또는 경쇄를 이루는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 뉴클레오타이드 서열은 본 명세서의 첨부된 서열목록에 수록되어 있다.
항-HER2 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 상기 키메라 항원 수용체 폴리펩티드를 코딩하는 본 발명의 핵산 분자는 상기한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편; 또는 키메라 항원 수용체 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv . Appl . Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol . Biol . 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc . Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl . BioSci . 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth . Mol . Biol . 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403-10(1990))은 NBCI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 ncbi 웹사이트의 BLAST 페이지를 통하여 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 ncbi 웹사이트의 BLAST help 페이지에서 확인할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "벡터"는 전달 벡터와 발현 벡터를 포함한다.
본 명세서에서 용어 "전달 벡터"는 단리된 핵산을 포함하고 단리된 핵산을 세포 내부로 전달하는데 사용될 수 있는 물질의 조성을 지칭한다. 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 연결된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 바이러스를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 구체적으로 상기 전달 벡터는 자가 복제성 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 상기 용어는 세포 내로의 핵산의 전이를 촉진시키는 비-플라스미드 및 비-바이러스성 화합물, 예컨대 폴리리신 화합물, 리포솜 등을 추가적으로 포함할 수 있는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스성 전달 벡터는 아데노 바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "발현 벡터"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위하여, 발현시킬 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스 작용 인자(cis-acting element)를 포함하고, 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포 또는 시험관 내 발현 시스템에 의해 제공될 수 있다. 상기 발현 벡터는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 그리고 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 상기 스위치 분자를 코딩하는 핵산 분자는 상기 벡터의 프로모터와 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있다. 본 명세서에서, 용어 "작동적으로 결합된"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
본 발명의 재조합 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 벡터는 유전자 클로닝을 위한 벡터, 단백질의 발현을 위한 벡터, 또는 유전자의 전달을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터, 엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 이들은 일반적으로 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 갖는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 벡터가 전달 벡터인 경우 "레트로바이러스 벡터"일 수 있다. 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 유전자 전달을 위해 선택된 유전자는 레트로바이러스 벡터 내에 삽입되고, 레트로바이러스 입자 내에 패키징될 수 있다. 이어서 재조합된 레트로바이러스는 인 비보, 또는 인 비트로에서 목적하는 숙주 세포로 전달될 수 있다. 많은 레트로바이러스 벡터가 관련 기술분야에 알려져 있으며, 본 발명의 구체적인 구현예에서 상기 레트로바이러스 벡터는 MLV-기반의 레트로바이러스벡터인 pMT 레트로바이러스 벡터이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 구현예에 따르면 상기 벡터는 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터이다.
본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 폴리펩타이드 또는 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다. 한편, 본 발명의 발현 벡터는 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 이를 포함하는 CAR 폴리펩티드의 발현을 평가하기 위한 선택표지로서 선택가능 마커 유전자 및/또는 리포터 유전자를 포함할 수 있다. 선택가능 마커 유전자로는 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 제네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다. 리포터 유전자로는 루시페라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 또는 녹색형광 단백질 유전자를 포함한다.
본 발명의 재조합 벡터를 세포 내로 도입하고 발현시키는 방법은 관련 기술분야에 잘 알려져 있다. 벡터는 당업계에 공지된 방법에 의해 숙주 세포, 예를 들어 포유동물, 박테리아, 효모, 또는 곤충 세포 내로 쉽게 도입될 수 있다. 예를 들면, 벡터는 물리적, 화학적, 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다. 상기 물리적 수단은 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 폭격(particle bombardment), 미세주입, 전기천공 등을 포함한다. 상기 화학적 수단은 콜로이드 분산액 시스템, 예컨대 거대분자 복합체, 나노 캡슐, 마이크로스피어, 비드, 및 수중유 에멀젼, 마이셀 (micelle), 혼합된 마이셀, 및 리포좀을 포함하는 지질-기반 시스템을 포함한다. 또한, 상기 생물학적 수단은 상술한 렌티바이러스, 레트로바이러스 등, DNA 또는 RNA 벡터의 사용을 포함한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환 된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 상기 벡터의 적합한 진핵세포 숙주 세포는 원숭이 신장 세포7(COS7: monkey kidney cells), NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK: baby hamster kidney) 세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK-293 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 키메라 항원 수용체 (CAR) 폴리펩티드를 발현하는 효과기 세포를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 효과기 세포는 수지상 세포, 킬러 수지상 세포, 비만세포, 자연살해 세포, B 림프구, T 림프구, 대식세포 및 이들의 전구세포로 이루어진 군으로부터 선택되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 여기에서, 상기 T 림프구는 염증성 T 림프구, 세포독성 T 림프구, 조절 T 림프구 또는 헬퍼 T 림프구로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명에서 상기 효과기 세포는 자가 세포 또는 동종이형 세포의 집단을 포함한다. 즉, 상기 효과기 세포는 본 HER2 특이적인 CAR 폴리펩티드를 발현하는 자가 세포 또는 동종이형 세포의 집단을 포함한다.
또한, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 효과기 세포는 HER2 특이적 CAR 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질감염 또는 형질 도입된 세포의 집단을 포함한다. 상기 형질 감염 또는 형질 도입은 상술한 바와 같이 당업계에 알려진 다양한 수단에 의해 제한없이 이루어질 수 있다.
따라서, 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면 본 발명의 효과기 세포, 예컨대 T 림프구, 또는 자연살해 세포로 전달되고, HER2 특이적 CAR 코딩 핵산 분자는 mRNA로 전사되며, 상기 mRNA로부터 HER2 특이적 CAR 폴리펩티드가 번역되어 효과기 세포의 표면에 발현된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상술한 본 발명의 항-HER2 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 키메라 항원 수용체 폴리펩티드를 발현하는 효과기 세포를 포함하는, 암 또는 염증성 질환의 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
상기 약제학적 조성물은 상기한 항-HER2 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 또는 키메라 항원 수용체 폴리펩티드를 발현하는 효과기 세포를 포함하는 면역치료용 약제학적 조성물이다.
본 명세서에서 "면역치료(immunotherapy)"란, 면역체계가 암을 제거하도록 돕는 암의 치료방법이다. 면역치료는 능동적 면역치료와 수동적 면역치료로 구분된다. 능동적 면역치료는 i) 암세포 또는 암세포에 의해 생성된 물질을 인체에 주입하여 면역체계를 활성화시키는 암 백신 치료(cancer vaccine therapy), ii) 사이토카인(인터페론, 인터류킨 등), 성장인자 등 면역조절제(immune-modulating agents)를 투여하여 특정 백혈구를 활성화시키는 면역조절 치료를 포함한다. 수동적 면역치료는 특정 암세포에 결합하는 치료적 항체(therapeutic antibody)와 면역세포치료(immune cell therapy)를 포함한다. 면역세포치료는 구체적으로 수지상세포 백신 치료(dendritic cell vaccine therapy)와 CAR-T(chimeric antigen receptor T cell) 치료, NK 세포 치료(natural killer cell therapy), CTL 치료(cytotoxic T lymphocyte therapy), 입양 세포 전이(adoptive cell transfer) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 면역치료는 주로 상술한 HER2 항체를 포함하는 치료적 항체와 HER2 특이적 CAR를 활용한 면역세포치료를 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상술한 본 발명의 항-HER2 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 키메라 항원 수용체 폴리펩티드; 또는 키메라 항원 수용체를 발현하는 효과기 세포를 유효성분으로 이용하기 때문에, 이들 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 의해 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 항-HER2 항체는 트라스투주맙 항체가 거의 작용하지 못하는 MCF-7 세포주에 대해서 트라스투주맙보다 우수한 살상능을 나타낸다. 또한, 본 발명의 항-HER2 항체를 트라스투주맙과 병용투여하는 경우, SKBR-3 유방암 세포주에서 개선된 살상능을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 조성물은 암의 치료를 위하여 트라스투주맙 항체와의 병용투여 용도 및 트라스투주맙에 의해 치료되지 않는 암의 치료에 매우 유효하다.
본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 암은 당업계에 공지된 다양한 암을 포함하며, 예를 들어 유방암, 난소암, 위암, 폐암, 간암, 담도암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 신장암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 두경부암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 요관암을 포함한다.
구체적으로, 본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 암은 HER2-발현 암이고, 보다 구체적으로 HER2-발현 유방암 또는 위암이다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 및 비경구로 투여할 수 있고, 예컨대 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 국소 투여, 비강내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 경막 내 투여, 안구 투여, 피부 투여 및 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다. 본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 암의 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물은 트라스투주맙 항체를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 또한 상술한 유효성분 이외에 다른 약제학적 활성 약제 또는 약물, 예를 들어, 아스파라기나제, 부설판, 카보플라틴, 시스플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 플루오로우라실, 겜시타빈, 하이드록시우레아, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 리툭시맙, 빈블라스틴, 빈크리스틴 등의 화학치료제, 베바시주맙(bevacizumab), 올라파립(olaparib) 등의 표적치료제, 또는 니볼루맙(nivolumab), 펨브롤리주맙(pembrolizumab)와 같은 면역관문억제제를 포함하거나, 이들과 함께 병용투여될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 HER2에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물; 또는 상기의 HER2 특이적 키메라 항원 수용체를 발현하는 효과기 세포를 포함하는 조성물을 치료가 필요한 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료방법을 제공한다.
본 발명의 치료방법의 대상 질병인 암은 상기 약학적 조성물의 치료 대상 질병과 관련하여 정의한 것과 같다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 대상체는 포유동물 또는 인간이다.
본 발명의 암 또는 염증성 질환의 치료방법은 유효성분으로서 상술한 항체 또는 항원 결합 단편; 또는 키메라 항원 수용체를 발현하는 효과기 세포를 공통적으로 사용하는 방법이므로, 중복되는 내용에 대해서는 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 상술한 HER2에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 진단, 예컨대 암을 진단하는 데 이용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 HER2에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 진단 키트는 상술한 본 발명의 항-HER2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하며, 본 발명의 약제학적 조성물과 동일한 질환을 진단하는 바, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 의한 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
상술한 키트는 항체를 포함하기 때문에, 기본적으로 다양한 면역분석(immunoassay) 또는 면역염색(immunostaining)에 적합하게 제작될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C14, I125, P32 및 S35)로 레이블링된 항체가 HER2 단백질을 검출하는 데 이용될 수 있다. 본 발명이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 분석하고자 하는 시료를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ii) 일차항체로서의 본 발명의 항-HER2 항체와 상기 시료를 반응시키는 단계; (iii) 상기 단계 (ii)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (iv) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.
상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 구체적으로는 마이크로타이터 플레이트이다.
상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.
본 발명이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 HER2 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ii) 포획항체와 시료를 반응시키는 단계; (iii) 상기 단계 (ii)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있는 HER2 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (iv) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 항-HER2 항체는 상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질(예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질 (chemiluminescent) 및 FRET (fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.
상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.
본 발명의 키트에 적용될 수 있는 시료는 세포, 조직 또는 조직-유래 추출물, 파쇄물(lysate) 또는 정제물, 혈액, 혈장, 혈청, 림프 또는 복수를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 항체는 인 비보 또는 인 비트로 이미징에 이용될 수 있다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 항체 및 상기 항체에 결합된 검출 가능한 신호를 발생시키는 레이블이 결합된 결합체를 포함하는 이미지용 조성물을 제공한다.
상기 검출 가능한 신호를 발생시키는 레이블은 T1 조영물질(예컨대, Gd 킬레이트 화합물), T2 조영물질(예컨대, 초상자성 물질(예: 마그네타이트, Fe3O4,γ-Fe2O3, 망간 페라이트, 코발트 페라이트 및 니켈 페라이트)), 방사성 동위 원소(예컨대, 11C, 15O, 13N, P32, S35, 44Sc, 45Ti, 118I, 136La, 198Tl, 200Tl, 205Bi 및 206Bi), 형광물질(플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5), 화학발광단, 자기입자, 매스 표지 또는 전자밀집입자를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 암 세포(특히, 유방암 또는 위암 세포)에서 고발현 되는 HER2에 특이적으로 결합하는 항체로서, 트라스투주맙과는 서로 상이한 에피토프에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편이다. 본 발명은 상기 항체 또는 항원 결합 단편, 이를 포함하는 키메라 항원 수용체, 및 이들의 용도를 제공한다.
(b) 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 종래의 HER2 타겟 항체들의 CDR 서열과 비교하여 상동성이 매우 낮아, 그 서열의 독특함이 있다.
(c) 본 발명의 항체는 트라스투주맙 항체에 대하여 비반응성(또는 내성)을 갖고 있거나 또는 민감도가 감소된 HER2-미발현 암 세포에 대해서 트라스투주맙보다 우수한 살상능을 나타낸다. 또한, 본 발명의 항-HER2 항체를 트라스투주맙과 병용투여하는 경우, 트라스투주맙 항체가 작용하는 암세포 주에 대하여 상승적인 살상능을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 조성물은 암의 치료를 위하여 트라스투주맙 항체와의 병용투여 용도 및 트라스투주맙에 의해 치료되지 않는 암의 치료에 매우 유용하게 사용할 수 있다. 특히 본 발명의 항-HER2 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체를 T 림프구 등 효과기 세포에 발현시키는 경우, HER2와 관련된 다양한 암의 면역세포 치료방법으로서 유용하게 사용할 수 있다.
(d) 이론에 얽매이지는 않는 범위에서(Without wishing to be bound by theory), 본 발명의 항체가 상술한 효능을 나타내는 이유는, 트라스투주맙과는 상이한 HER2 상의 에피토프에 결합하여, 트라스투주맙과는 다른 방식으로 HER2를 억제하기 때문인 것으로 판단된다.
도 1은 hz2G10, hz39D2, 24D3, 1G3, 및 hz8G11 클론들의 HER2-ECD-Fc 항원에 대한 친화도를 ELISA로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 hz2G10, hz39D2, 24D3, 1G3, 및 hz8G11 클론들이 결합하는 HER2의 세포 외부 도메인을 확인하기 위하여, HER2의 세포 외부 도메인별 결합여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3a 및 도 3b는 HER2 과발현 유방암 세포주(SKBR-3)와 HER2 미발현 유방암 세포주(MCF-7)에 대한 본 발명의 5종 항체(hz2G10, hz39D2, 24D3, 1G3, 및 hz8G11)의 단독 처리시 세포 성장 억제 효능을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 3c 및 도 3d는 HER2 과발현 유방암 세포주(SKBR-3)와 HER2 미발현 유방암 세포주(MCF-7)에 대한 본 발명의 5종 항체(hz2G10, hz39D2, 24D3, 1G3, 및 hz8G11) 및 트라스투주맙(trastuzumab, TRA) 항체의 병용 처리시 세포 성장 억제 효능을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 개발된 항체의 HER2에 대한 특이성을 확인하기 위하여, ErbB family를 발현하여 개발된 항체의 결합을 검증한 결과를 나타낸 도이다. 세툭시맙(cetuximab, CET), 트라스투주맙(trastuzumab, TRA), 파트리투맙(Patritumab, AMG888, AMG)는 각각 EGFR, HER2, 및 HER3에 결합하는 대조군으로 사용되었다.
도 5a 내지 도 5e는 개발된 항체의 트라스투주맙과의 에피토프를 비교한 결과를 나타낸 도이다. 트라스투주맙과의 에피토프 비교를 위하여, 센서칩에 트라스투주맙과 HER2-His를 고정화한 후 본 발명의 5종 항체와의 결합을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 6a 내지 6c는 hz39D2 및 이로부터 친화도를 향상시킨 클론들(hz39D2.14, hz39D2.22, 및 hz39D2.23)의 HER2 과발현 위암 및 유방암 세포에 대한 단독 처리 및 트라스투주맙 항체와의 병용 처리시의 세포 성장 억제 효능을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: HER2에 대한 항체 개발
항체 개발을 위해 HER2 단백질의 세포 외부 도메인(extracellular domain, ECD) 부위를 동물세포를 이용하여 생산하였다. ECD의 C-말단에 인간 IgG1의 힌지 및 Fc 부위(CH2-CH3)가 결합된 형태의 DNA를 pCEP4(Invitrogen, Cat. No. V044-50)에 HindIII와 BamHI 제한효소를 이용하여 클로닝하였다. 이어, FreeStyle 293F(Invitrogen, Cat. No. R790-07) 세포에 폴리에틸렌이민(Polyscience Inc., Cat. No. 23966)을 이용하여 상기 클로닝된 벡터를 일시 형질전환(transient transfection)시키고, 세포 배양액으로부터 Protein-A Ceramic HyperD F 레진(PALL, Cat No. 20078-028)을 이용하여 정제하였다. 정제된 단백질을 Protein assay dye(Bio-Rad, Cat. No. 500-0006)를 이용하여 정량하고 SDS-PAGE 후 쿠마시 블루 염색을 통하여 농도 및 순도를 확인하였다. 정제된 100 μg의 단백질 항원을 Freund's 아쥬번트(Sigma, Cat. No. F5506)와 혼합하고, BALB/c 마우스((주)대한바이오)의 복강에 주사하였다. 2주 후 항원 100 μg을 PBS에 희석하여 추가 주사하고, 3일 뒤 마우스의 비장을 적출하여 림프구를 분리하였다. 분리한 림프구를 마이엘로마 세포주인 SP2/0-Ag14(ATCC, Cat. No. CRL-1581)와 5:1 비율로 혼합하고, PEG-1500(Roche, Cat. No. 783641)을 이용하여 융합(fusion)시켰다. 융합된 세포를 HAT supplement(Sigma, Cat. No. H0262)가 포함된 배지에 배양하여 융합된 세포(하이브리도마, hybridoma)를 선택적으로 선별하여 배양하였다.
얻어진 하이브리도마 세포는 ELISA 방법을 이용하여 항원과 결합하는 항체를 생산하는 세포인지 확인하였다. HER2-ECD-Fc 혹은 ChromPure human IgG(hIgG, Jackson Immunoresearch Lab. Inc., Cat. No. 009-000-003)를 1 μg/mL의 농도로 Costar 96-웰 플레이트(Corning, Cat. No. 3590)에 상온에서 1시간 동안 고착시켰다. TBS-T(0.05% Triton X-100)로 3회 세척 후 300 ㎕의 TBS-T/SM(2% skim milk)로 상온에서 30분 동안 블록킹 하였다. 블록킹 된 플레이트를 3회 세척 후 하이브리도마 배양액을 넣고 37℃에서 1시간 동안 항체를 결합시켰다. 3회 세척 후 2차 항체로 항-mIgG-HRP(Pierce, Cat. No. 31439)을 TBS-T/SM에 1:5,000으로 희석하여 넣고 37℃에서 1시간 동안 항체를 결합시켰다. 3회 세척 후 TMB(SurModics, Cat. No. TMBC-1000-01)를 넣고 상온에서 5분간 발색하였으며, 1 N 황산(sulfuric acid, DukSan, Cat. No. 254)을 추가하여 발색을 정지시켰다. 450 nm에서 흡광도를 Victor X3(PerkinElmer, Cat. No. 2030-0030)를 이용하여 측정하고 HER2-ECD-Fc에 특이적으로 결합하는 항체를 선별하였다.
HER2가 세포 표면에 발현하는 단백질이기 때문에 개발된 항체들이 HER2를 과발현하는 세포에 결합하는지 여부를 세포-기반 ELISA를 통하여 확인하였다. HER2를 과발현하는 난소암 세포주인 SKOV-3(한국세포주은행, Cat. No. 30077)를 Costar 96-웰 세포 배양 플레이트(Corning, Cat. No. 3595)에 10,000 cell/well이 되게 분주한 후 24시간 동안 배양하였다. 다음날 배양액을 제거하고 PBS로 3회 세척 후 하이브리도마 세포 배양액을 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 추가 배양하였다. TBS-T로 3번 세척한 후 2차 항체를 염소 항-mIgG-HRP를 PBS/FBS(3% FBS)에 1:5,000으로 희석하여 첨가하고 상온에서 1시간 동안 처리하였다. TBS-T로 3회 세척한 후 TMB를 이용하여 발색하였다. 음성 대조군인 SP2/0 세포 배양액을 이용한 흡광도보다 높은 흡광도를 보이는 61개 클론이 선별되었다.
본 발명에서는 HER2에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 중 최종 선발된 5종 항체(hz2G10, hz39D2, 24D3, 1G3, hz8G11)를 키메라항체(chimeric antibody) 혹은 인간화항체(humanized antibody, hz)로 변경하여 검증을 진행하였으며, 각 키메라 항체 또는 인간화항체의 아미노산 서열은 서열목록에 수록하였다.
도 1 및 표 1에 본 발명에서 최종 선발된 5종 항체(hz2G10, hz39D2, 24D3, 1G3, hz8G11)의 흡광도를 나타내었다.
선발된 5종 항체의 HER2 단백질의 세포 외부 도메인(ECD)에 대한 결합 확인
항체 농도 (μg/ml)
5x10-7 5x10-6 5x10-5 5x10-4 5x10-3 5x10-2 5x10-1 5 50
PBS 0.13 0.13 0.14 0.14 0.14 0.13 0.16 0.15 0.14
hz2G10 0.12 0.12 0.12 0.12 0.22 1.16 2.69 2.79 2.81
hz39D2 0.12 0.12 0.15 0.47 2.29 2.92 2.78 2.90 2.83
24D4 0.11 0.11 0.12 0.22 1.13 2.76 2.90 2.92 2.75
1G3 0.11 0.11 0.14 0.35 1.77 2.79 2.78 2.81 2.76
hz8G11 0.12 0.12 0.14 0.34 1.67 2.72 2.94 2.90 2.74
실시예 2: 개발된 항체의 HER2 단백질에 대한 결합 부위 확인
본 발명에서 선발된 5종 항체(hz2G10, hz39D2, 24D3, 1G3, hz8G11)의 HER2 단백질의 세포 외부 도메인(extracellular domain, ECD)에 대한 결합 부위를 확인하기 위하여 ELISA 방법을 이용하였다. ELISA를 진행하기 위하여, ERBB family 단백질의 세포 외부 도메인(extracellular domain, ECD) 부위를 동물세포를 이용하여 생산한 후 항원으로 사용하였다. 구체적으로 ECD의 C-말단에 인간 IgG1의 힌지 및 Fc 부위(CH2-CH3)가 결합된 형태의 DNA를 pCEP4 벡터(Invitrogen, Cat. No. V044-50)에 HindIII와 BamHI 제한효소를 이용하여 클로닝하였다. 이어, FreeStyleTM 293F(Invitrogen, Cat. No. R790-07) 세포에 폴리에틸렌이민(Polyscience Inc., Cat. No. 23966)을 이용하여 상기 클로닝된 벡터를 일시 형질전환(transient transfection)시키고, 세포 배양액으로부터 HER2-ECD DI Fc, HER2-ECD DII Fc, HER2-ECD DIII Fc, HER2-ECD DIV Fc, HER2-ECD Fc 융합 단백질을 Protein-A Ceramic HyperD F 레진(PALL, Cat No. 20078-028)을 이용하여 정제하였다. 정제된 단백질을 Protein assay dye(Bio-Rad, Cat. No. 500-0006)를 이용하여 정량하고 SDS-PAGE 후 쿠마시 블루 염색을 통하여 농도 및 순도를 확인하였다.
HER2-ECD DI Fc, HER2-ECD DII Fc, HER2-ECD DIII Fc, HER2-ECD DIV Fc, HER2-ECD Fc 융합 단백질을 1 μg/mL의 농도로 Costar 96-웰 플레이트(Corning, Cat. No. 3690)에 4℃에서 밤새 고착시켰다. TBS-T(0.05% Triton X-100)로 3회 세척 후 100 ㎕의 TBS-T/BSA(5% BSA)로 상온에서 1시간 동안 블록킹하였다. 블록킹된 플레이트를 3회 세척 후 항-HER2 항체를 넣고 상온에서 1시간 동안 항체를 결합시켰다. 3회 세척 후 2차 항체로 항 인간 IgG-HRP를 TBS-T/BSA에 1:3,000으로 희석하여 넣고 상온에서 1시간 동안 항체를 결합시켰다. 3회 세척 후 TMB(SurModics, Cat. No. TMBC-1000-01)를 넣고 상온에서 5분간 발색하였으며, 1 N 황산(sulfuric acid, DukSan, Cat. No. 254)을 추가하여 발색을 정지시켰다. 450 nm에서 흡광도를 Victor X3(PerkinElmer, Cat. No. 2030-0030)를 이용하여 측정하였다.
결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 개발한 항체 중 hz2G10과 hz39D2는 HER2 단백질의 세포 외부 도메인 중 도메인 1에 결합하였고, 24D3는 도메인 3에 결합하였으며, 1G3과 hz8G11은 도메인 4에 결합하는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터 HER2 단백질의 외부 도메인 4에 결합하는 트라스투주맙(TRA)과 비교하여 본 발명의 항체 5종은 트라스투주맙과 상이한 HER 도메인에 결합하여 HER2 과발현 암세포의 성장을 억제할 수 있거나(hz2G10, hz39D2, 24D3), 후술할 실시예의 내용과 같이 트라스투주맙과 병용시, 단독 사용하는 경우에 비하여 현저히 우수한 세포 성장 억제 효과를 나타내므로 HER2 단백질의 발현과 관련된 암의 예방 또는 치료를 위한 단독제제, 또는 트라스투주맙과의 병용제제로서 유용하게 사용할 수 있다.
실시예 3: 개발된 항체들의 유방암 세포 성장 억제 효능 비교
세포 생존능 분석은 HER2가 과발현되는 대표적인 유방암 세포주인 SKBR-3 및 HER2 미발현 유방암 세포주인 MCF-7을 대상으로 단독 또는 트라스투주맙과 병용처리하여 진행되었다. 병용처리의 경우 개발된 항체와 트라스투주맙을 1:1 비율(중량비)로 혼합하여 사용하였다. 96-웰 플레이트에서 SKBR3(한국세포주은행, Cat. No. 30030, 5,000 cells/well), MCF-7(ATCC, Cat. No. HTB22, 5,000 cells/well) 세포를 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 정제된 항체를 최종 20 μg/mL이 되도록 처리하고 4일간 추가 배양하였다. 세포의 생존율을 측정하기 위해서 CCK-8(Dojindo, Cat. No. CK-04-13)를 최종 10%가 되도록 첨가하고 37℃에서 3시간 동안 처리한 후 흡광도를 측정하였다. 항체를 처리하지 않은 웰의 흡광도를 생존율 100%로 하여 상대적 생존율을 계산하였다.
결과는 도 3a 내지 도 3d 및 표 2에 나타내었다.
항체 처리에 의한 HER2-양성 유방암 세포주 SKBR-3 및 HER2-음성 유방암 세포주 MCF-7의 상대적 생존율(단독 처리)
20 μg/ml 농도에서의 상대적 생존율(%)
클론 SKBR-3 MCF-7
hIgG 94.68 92.11
TRA(Trastuzumab) 단독 63.68 98.22
hz2G10 89.06 97.43
hz39D2 96.46 91.42
24D3 93.97 87.33
1G3 74.81 98.66
hz8G11 74.02 98.95
상기 표에서, hIgG는 인간 IgG를 나타낸다.
도 3a, 도 3b 및 상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 5종의 항체는 단독처리에서 모두 SKBR-3 유방암 세포주의 증식을 억제하는 효능을 나타내었고, 항체 농도 범위에 따라 양성대조군인 트라스투주맙보다 우수하거나 대등한 세포 성장 억제 효능을 나타내었다(도 3a). 하지만, 본 발명의 5종의 항체는 모두 HER2-음성 세포인 MCF-7 세포주에 대해서 양성 대조군인 트라스투주맙과 마찬가지로 상당한 정도의 세포 증식 억제 효능은 나타내지 않았다(도 3b).
항체 처리에 의한 HER2-양성 유방암 세포주 SKBR-3 및 HER2-음성 유방암 세포주 MCF-7의 상대적 생존율(병용 처리)
20 μg/ml 농도에서의 상대적 생존율(%)
클론 SKBR-3 MCF-7
hIgG 94.68 92.11
TRA(Trastuzumab) 단독 63.68 98.22
TRA+hz2G10 68.98 90.56
TRA+hz39D2 77.29 90.62
TRA+24D3 63.75 97.21
TRA+1G3 62.16 102.33
TRA+hz8G11 52.62 98.41
상기 표에서, hIgG는 인간 IgG를 처리한 실험군을 나타내고, TRA+는 트라스트주맙(Trastuzumab)과 본 발명의 항체를 병용 처리한 실험군을 나타낸다.
도 3c, 도 3d 및 상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 5종의 항체(hz2G10, hz39D2, 24D3, 1G3, hz8G11)는 모두 트라스투주맙과 병용처리 시에 SKBR-3 유방암 세포주에서 트라스투주맙 단독처리보다 우수하거나 동등한 세포 성장 억제 효능을 나타내었다(도 3c).
이론에 얽매이지 않는 범위에서(Without wishing to be bound by theory), 본 발명의 항체가 상술한 효능을 나타내는 이유는, 트라스투주맙과는 상이한 HER2 상의 에피토프에 결합하여, 트라스투주맙과는 다른 방식으로 HER2를 억제하기 때문인 것으로 판단된다.
실시예 4: 항체 서열 분석
항체 서열을 분석하기 위해서 각 하이브리도마의 RNA를 이용하여 phage Fab 항체 라이브러리를 제작하고 이로부터 HER2-ECD-Fc와 결합하는 파아지를 얻기 위하여 3차에 걸친 선별 과정(panning)을 진행하였다(Phage display: a laboratory manual, Carlos Barbas III, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press). 하이브리도마 배양 후 RNA를 SV Total RNA Isolation System(Promega, Cat. No. Z3100)를 이용하여 분리하고 cDNA를 합성하였다. 공지 프라이머 세트(참조: Phage display: a laboratory manual, Carlos Barbas III, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press)를 이용하여 항체의 가변영역을 증폭하고 인간 Ck(Kappa chain)와 CH1과 연결하여 pComb3X 벡터(Barbas laboratory, The Scripps Research Institute)에 Sfi-I 제한효소를 이용하여 클론닝하고, ER2537 박테리아(New England Biolabs, Cat. No. 801-N)에 형질전환 하였다. 형질전환 된 박테리아에 VCSM13 헬퍼 파아지(Stratagene, Cat. No. 200251)를 감염시켜 파아지를 얻고 HER2-ECD-Fc가 고착된 이뮤노튜브를 이용하여 HER2-ECD-Fc와 결합하는 클론을 확보하였다.
각 항체의 콜로니 중에서 HER2-ECD-Fc와 결합하는 항체를 ELISA 방법으로 확인하였다. 형질전환 된 박테리아 콜로니들을 600 nm에서 흡광도가 0.5가 되도록 37℃에서 배양한 후 IPTG를 최종 1 mM이 되게 처리하고 30℃에서 밤새 배양하면서 Fab 형태의 항체를 발현하였다. 5 mL 배양 후 원심분리를 통하여 세포를 수집하고 0.4 mL의 1X TES(50 mM Tris, 1 mM EDTA, 20%(v/v) sucrose, pH 8.0)에 세포를 현탁한 후 4℃에서 10분간 처리하였다. 여기에 0.6 mL의 0.2X TES를 첨가하고 추가로 4℃에서 30분간 처리한 후 원심분리하여 상등액을 취하였다. HER2-ECD-Fc가 1 μg/mL 농도로 코팅된 Costar 96-well half area plate(Corning Inc., Cat. No. 3690)를 TBS-T로 3회 세척 후 TBS-T/SM(3% non-fat skim milk, 0.05% Triton X-100)으로 상온에서 1시간 동안 블록킹 하였다. 각 콜로니의 배양액(Broth) 혹은 periplasmic extract(Periplasm)를 TBS-T/SM을 이용하여 1:3 비율로 희석하여 처리 후 상온에서 1시간 동안 결합시켰다. 3회 세척 후 2차 항체로 항-HA-HRP(Roche, Cat. No. 120-138-190-01)를 1:5000 희석하여 상온에서 1시간 결합하고 3회 세척 후 TMB를 이용하여 발색하였다.
대부분의 콜로니들이 세포 배양액 혹은 periplasmic extract에서 흡광도가 0.2 이상으로 나왔으며, 이들 클론들을 대상으로 항체의 염기서열을 분석하였다. 염기서열 분석 결과 단일 하이브리도마에서 유래한 콜로니들은 동일한 서열임을 확인하였다.
각 클론에서 생산된 항체들의 CDR 서열은 다음 표 4 및 표 5에 정리되어 있다.
클론 CDRH1 CDRH2 CDRH3
hz2G10 DYYMY
(서열번호 1)		 YINSGGGSTYYPDTVKG
(서열번호 2)		 EALYDYDYAMDY
(서열번호 3)
hz39D2 NYGVN
(서열번호 7)		 WINTHTGEPTYAEEFKG
(서열번호 8)		 DDYYVRVDY
(서열번호 9)
24D3 SCAMS
(서열번호 13)		 TISGGGSYTYYPDSVKG
(서열번호 14)		 HGGYESWFPY
(서열번호 15)
1G3 DTYMH
(서열번호 19)		 RIDPANGYTRYDPNFQG
(서열번호 20)		 YYYGFYAMDY
(서열번호 21)
hz8G11 GYYMH
(서열번호25)		 HINPNNGGTSYNQKFKG
(서열번호 26)		 EEAFAY
(서열번호 27)
클론 CDRL1 CDRL2 CDRL3
hz2G10 KSSQSLLYSNGKTYLN
(서열번호 4)		 LVSKLDS
(서열번호 5)		 VQGTHFPLT
(서열번호 6)
hz39D2 KASQDINSYLS
(서열번호 10)		 RANRLVD
(서열번호 11)		 LQYDEFPWT
(서열번호 12)
24D3 RSSQSLVHSNGNTYLH
(서열번호 16)		 KVSNRFS
(서열번호 17)		 SQSTHVPPWT
(서열번호 18)
1G3 KASQDVSTAVA
(서열번호 22)		 SASYRYT
(서열번호 23)		 QQHYSTPPT
(서열번호 24)
hz8G11 RASQDISNYLN
(서열번호 28)		 YTSRLHS
(서열번호 29)		 QQGITPPWT
(서열번호 30)
상기 표 4 및 5는 각각 개발된 항체들의 중쇄 CDR (CDRH) 및 경쇄 CDR (CDRL)의 아미노산 서열이다.
실시예 5: 개발된 항체의 HER2에 대한 특이성
개발된 본 발명의 5종 항체가 HER2가 속한 ErbB 패밀리 단백질 중 HER2에 특이적으로 결합하는지를 ELISA 방법으로 확인하였다. 개발된 항체가 ErbB 패밀리 단백질 중 HER2에 특이적으로 결합하는지를 확인하기 위해서 ErbB 패밀리에 속하는 EGFR, HER2, HER3 및 HER4의 세포 외부 도메인을 대상으로 ELISA 방법으로 확인하였다. EGFR의 세포 외부 도메인(EGFR-ECD-Fc)은 실시예 2에 상술한 HER2-ECD-Fc와 동일한 방법으로 생산되었으며, HER3 (R&D Systems, #348-RB-050)와 HER4 (R&D Systems, #1131-ER-050) 단백질은 구매하여 사용하였다. 세툭시맙(cetuximab, CET), 트라스투주맙(trastuzumab, TRA), 파트리투맙(Patritumab, AMG888, AMG)을 각각 EGFR, HER2, 및 HER3에 결합하는 대조군 항체로 사용하였다
결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 5종 항체는 인간 ErbB 패밀리 단백질 중 HER2 특이적으로 결합하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 개발된 항체의 트라스투주맙과의 에피토프 비교
HER2에 대한 항체 트라스투주맙은 HER2 ECD의 4개 도메인 중에서 도메인-4에 결합하는 것으로 알려져 있다. 개발된 항체들이 트라스투주맙의 HER2에 대한 에피토프와 중복되는지 확인하기 위해서 Octet(Pall ForteBio) 기기를 이용하여 에피토프 비닝(epitope binning)을 진행하였다. AR2G 센서칩 (Fortebio, Cat. No. 18-5092(tray), 18-5093(pack), 18-5094(case))에 트라스투주맙을 10 μg/mL의 농도로 ECD/NHS를 이용한 아민 커플링 방법으로 고정시켰다. 트라스투주맙이 고정된 센서칩에 HER2-ECD-His 단백질을 10 μg/mL의 농도로 10 분 동안 결합시키고 이후 5 분 동안 트라스투주맙과 HER2-ECD 사이의 결합을 안정화시켰다. 이후 본 발명의 항체 5종을 10 μg/mL의 농도로 10분 동안 결합시키고, 10분간 항원과 항체 사이의 결합을 안정화 시켰다. 트라스투주맙을 고정한 이후에 모든 항체 항원은 kinetics buffer (Fortebio, cat No. 18-1092 )를 이용하여 희석하였고, 안정화시키는 단계에서도 역시 같은 buffer를 사용하였다. 만약 2차로 결합시킨 항체가 트라스투주맙과 결합된 HER2-ECD 단백질에 추가 결합한다면, 이는 트라스투주맙과 에피토프를 공유하지 않는 항체로 해석할 수 있다.
결과는 도 5a 내지 도 5e에 나타내었다.
도 5a 내지 도 5e에 나타낸 바와 같이, 개발된 항체인 hz2G10, hz39D2, 24D3, 및 hz8G11은 트라스투주맙에 결합된 HER2-ECD에 추가 결합하였기 때문에 트라스투주맙과 상이한 에피토프를 갖고 있음을 확인하였다. 반면 1G3는 트라스투주맙에 결합된 HER2-ECD에 대한 추가 결합이 보이지 않기 때문에 에피토프를 공유하는 항체로 판단된다.
실시예 7: 친화도가 증진된 hz39D2 항체 개발
본 발명자들은 인간화 39D2 항체(hz39D2)를 기반으로 친화도가 증진된 항체를 개발하기 위하여, 경쇄 또는 중쇄 사슬의 CDR3를 무작위화(randomization)한 파지 항체 라이브러리를 개발하였다 (Phage display: a laboratory manual, Carlos Barbas III, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press). 중쇄사슬의 CDR3 중 Kabat 넘버링에 따른 아미노산 번호인 D101, Y102에 해당하는 D와 Y 및 경쇄사슬의 CDR 중 P95, W96, T97에 해당하는 P, W, T는 인간 항체의 각 위치에서 자주 발견되는 아미노산이기 때문에 무작위화에서 제외하였다. 이 때 사용된 프라이머는 중쇄 및 경쇄 사슬의 CDR3에 해당하는 부위에 대한 것으로 무작위화 하고자 하는 아미노산에 해당하는 코돈의 첫 번째와 두 번째 위치에는 adenine(A), cytosine(C), guanine(G) 및 thymine(T)를 동일 비율로 혼합하여 무작위로 들어가도록 하였으며, 세 번째 위치는 guanine(G)이나 cytosine(C)이 동일 비율로 들어가도록 합성하여 사용하였다. 개발된 라이브러리로부터 친화도가 향상된 클론을 HER2-ECD-His 단백질을 이용한 바이오패닝(biopanning)을 통하여 선별하였다. 최종적으로 선별된 3개 항체 hz39D2.14, hz39D2.22, 및 hz39D2.23의 CDR 서열 정보는 표 6 및 표 7에 정리되어 있으며 친화도를 증진시키기 위하여 변경된 아미노산 잔기는 볼드체 및 밑줄로 표시하였다.
클론 CDRH1 CDRH2 CDRH3
hz39D2 NYGVN
(서열번호 7)		 WINTHTGEPTYAEEFKG
(서열번호 8)		 DDYYVRVDY
(서열번호 9)
hz39D2.14 NYGVN
(서열번호 7)		 WINTHTGEPTYAEEFKG
(서열번호 8)		 D E YYVR T DY
(서열번호 71)
hz39D2.22 NYGVN
(서열번호 7)		 WINTHTGEPTYAEEFKG
(서열번호 8)		 D E YYVRVDY
(서열번호 72)
hz39D2.23 NYGVN
(서열번호 7)		 WINTHTGEPTYAEEFKG
(서열번호 8)		 D E YYVRVDY
(서열번호 73)
클론 CDRL1 CDRL2 CDRL3
hz39D2 KASQDINSYLS
(서열번호 10)		 RANRLVD
(서열번호 11)		 LQYDEFPWT
(서열번호 12)
hz39D2.14 KASQDINSYLS(서열번호 10) RANRLVD
(서열번호 11)		 LQYDEFPWT
(서열번호 12)
hz39D2.22 KASQDINSYLS(서열번호 10) RANRLVD
(서열번호 11)		 L EL DEFPWT
(서열번호 73)
hz39D2.23 KASQDINSYLS(서열번호 10) RANRLVD
(서열번호 11)		 LQ L DEFPWT
(서열번호 74)
선별된 상기 3종 항체(hz39D2.14, hz39D2.22, 및 hz39D2.23)의 친화도 증가를 검증하기 위해서 IgG 형태로 항체를 생산하였다. CM5 센서칩에 goat anti-human IgG(Invitrogen, #H10500)을 2000 RU로 ECD/NHS 방법으로 고정시켰다. 이후 항체를 50 μl/min의 속도로 5분동안 결합시키고 5분동안 버퍼를 흘려주어 안정화 시켰다. 항체를 안정화 시킨 후 HER2-ECD-His 단백질을 50 μl/min의 속도로 4분동안 결합시키고 15분동안 버퍼를 흘려주어 분리시켰다. 각 농도의 분석 뒤에는 10 mM Glycine (pH 1.5)를 이용하여 재생시키고 다음 분석을 진행하였다. 항체의 친화도는 BIAevaluation 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 분석 결과는 표 8에 정리되어 있다. 하기 표 8에 나타낸 바와 같이, 선별된 3종 항체(hz39D2.14, hz39D2.22, 및 hz39D2.23)는 모두 hz39D2에 비하여 친화도가 향상되었음을 확인할 수 있었다.
클론 Ka (1/Ms) Kd (1/s) KD (M)
hz39D2 6.8E+04 2.5E-03 3.7E-08
hz39D2.14 3.7E+04 3.0E-04 8.0E-09
hz39D2.22 8.1E+04 1.6E-04 2.0E-09
hz39D2.23 7.1E+04 2.0E-04 2.8E-09
친화도가 향상된 상기 3종 항체(hz39D2.14, hz39D2.22, 및 hz39D2.23)의 항암 효능을 HER2 과발현 위암 세포인 NCI-N87과 OE-19, 그리고 유방암 세포인 BT-474 세포를 이용하여 분석하였다. 세포에 각 항체를 5 μg/ml의 농도로 단독 혹은 트라스투주맙과 병용처리시의 암 세포 생존율을 분석하여 도 6a 내지 도 6c에 나타내었다.
도 6a 내지 도 6c에서 확인할 수 있듯이, 친화도가 향상된 hz39D2.14, hz39D2.22, 및 hz39D2.23 항체들은 hz39D2에 비하여 단독 처리시 향상된 암세포 증식 억제 효능을 나타냄을 확인할 수 있다.
<110> AbClon Inc. <120> Anti-HER2 Antibody or Antigen Binding Fragment Thereof, and Chimeric Antigen Receptor Comprising The Same <130> PN170159P <150> KR 10-2017-0151841 <151> 2017-11-14 <160> 110 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of hz2G10 antibody <400> 1 Asp Tyr Tyr Met Tyr 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of hz2G10 antibody <400> 2 Tyr Ile Asn Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of hz2G10 antibody <400> 3 Glu Ala Leu Tyr Asp Tyr Asp Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 of hz2G10 antibody <400> 4 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL2 of hz2G10 antibody <400> 5 Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT 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Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ala Leu Tyr Asp Tyr Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 32 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of hz2G10 heavy chain variable region <400> 32 gaggtgcagt tggtcgagtc tggaggaggt ctggtacagc cagggggaag tctgagactg 60 agctgcgccg cttctggttt tacctttagc gattactata tgtattgggt aagacaggca 120 cctggtaaag gtttggaatg ggtggcctac ataaactcgg gcgggggcag cacctactac 180 ccggataccg tgaagggccg cttcaccatc tcccgagaca acgcgaaaaa ttcattgtat 240 ctgcaaatga actcacttag agctgaagat actgccgttt actactgcgc cagagaagca 300 ctctatgact atgattacgc tatggattac tgggggcagg gcacaaccgt cactgtttct 360 agt 363 <210> 33 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of hz2G10 heavy chain <400> 33 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 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His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 34 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of hz2G10 heavy chain <400> 34 gaggtgcagt tggtcgagtc tggaggaggt ctggtacagc cagggggaag tctgagactg 60 agctgcgccg cttctggttt tacctttagc gattactata tgtattgggt aagacaggca 120 cctggtaaag gtttggaatg ggtggcctac ataaactcgg gcgggggcag cacctactac 180 ccggataccg tgaagggccg cttcaccatc tcccgagaca acgcgaaaaa ttcattgtat 240 ctgcaaatga actcacttag agctgaagat actgccgttt actactgcgc cagagaagca 300 ctctatgact atgattacgc tatggattac tgggggcagg gcacaaccgt cactgtttct 360 agtgcctcca ccaagggccc ctccgtgttc cctctggccc cctccagcaa gtccacctct 420 ggcggcacag ccgccctggg ctgcctggtg aaagactact tccccgagcc cgtgaccgtg 480 tcctggaact ctggcgccct gacctccggc gtgcacacct tccctgccgt gctgcagtcc 540 tccggcctgt actccctgtc ctccgtggtg accgtgccct ccagctctct gggcacccag 600 acctacatct gtaacgtgaa ccacaagccc tccaacacca aggtggacaa gaaggtggaa 660 cccaagtcct gcgacaagac ccacacctgt cccccctgcc ctgcccctga actgctgggc 720 ggaccttccg tgttcctgtt ccccccaaag cccaaggaca ccctgatgat ctcccggacc 780 cccgaagtga cctgcgtggt ggtggacgtg tcccacgagg accctgaagt gaagttcaat 840 tggtacgtgg acggcgtgga agtgcacaat gccaagacca agcccagaga ggaacagtac 900 aactccacct accgggtggt gtctgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 960 aaagaataca agtgcaaagt ctccaacaag gccctgcctg cccccatcga aaagaccatc 1020 tccaaggcca agggccagcc ccgcgagccc caggtgtaca ccctgccccc tagccgggac 1080 gagctgacca agaaccaggt gtccctgacc tgtctggtga aaggcttcta cccctccgac 1140 attgccgtgg aatgggagtc caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccct 1200 gtgctggact ccgacggctc attcttcctg tactccaagc tgaccgtgga caagtcccgg 1260 tggcagcagg gcaacgtgtt ctcctgctcc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1320 acccagaagt ccctgtccct gagccccggc aag 1353 <210> 35 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of hz2G10 light chain variable region <400> 35 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 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atcaatactc acacagggga accaacatat 180 gctgaggagt tcaaaggacg gtttgttttt agtctggaca cctccgtgtc taccgcctac 240 ctgcagattt ccagccttaa agcagaggac actgctgtat actactgtgc cagagacgat 300 tactatgtga gggtggatta ctgggggcag gggaccaccg tgacagtctc aagt 354 <210> 41 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of hz39D2 heavy chain <400> 41 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr His Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Asp Tyr Tyr Val Arg Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 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Sequence <220> <223> Amino acid sequence of 1G3 light chain variable region <400> 59 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 60 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of 1G3 light chain variable region <400> 60 gatattgtga tgacgcagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60 atcacctgca aggccagtca ggatgtgagt actgctgtag cctggtatca acagaaacca 120 ggacaatctc ctaaactact gatttactcg gcatcctacc ggtacactgg agtccctgat 180 cgcttcactg gcagtggatc tgggacggat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 240 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ggctattaca tgcactgggt ccggcaggca 120 cccggacaag ggctggaatg gataggtcac attaatccaa acaatggcgg taccagttat 180 aaccagaaat ttaaggggag gacaaccctg acagttgata aatccatcag tacagcatat 240 atggagctca gcagactgag aagcgacgat actgctgtgt actactgcgc gcgggaggag 300 gctttcgcct actggggcca agggacctta gtgactgtct catca 345 <210> 65 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of hz8G11 heavy chain <400> 65 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gln Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly His Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Thr Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Glu Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 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gcgggaggag 300 gctttcgcct actggggcca agggacctta gtgactgtct catcagcctc caccaagggc 360 ccctccgtgt tccctctggc cccctccagc aagtccacct ctggcggcac agccgccctg 420 ggctgcctgg tgaaagacta cttccccgag cccgtgaccg tgtcctggaa ctctggcgcc 480 ctgacctccg gcgtgcacac cttccctgcc gtgctgcagt cctccggcct gtactccctg 540 tcctccgtgg tgaccgtgcc ctccagctct ctgggcaccc agacctacat ctgtaacgtg 600 aaccacaagc cctccaacac caaggtggac aagaaggtgg aacccaagtc ctgcgacaag 660 acccacacct gtcccccctg ccctgcccct gaactgctgg gcggaccttc cgtgttcctg 720 ttccccccaa agcccaagga caccctgatg atctcccgga cccccgaagt gacctgcgtg 780 gtggtggacg tgtcccacga ggaccctgaa gtgaagttca attggtacgt ggacggcgtg 840 gaagtgcaca atgccaagac caagcccaga gaggaacagt acaactccac ctaccgggtg 900 gtgtctgtgc tgaccgtgct gcaccaggac tggctgaacg gcaaagaata caagtgcaaa 960 gtctccaaca aggccctgcc tgcccccatc gaaaagacca tctccaaggc caagggccag 1020 ccccgcgagc cccaggtgta caccctgccc cctagccggg acgagctgac caagaaccag 1080 gtgtccctga cctgtctggt gaaaggcttc tacccctccg acattgccgt ggaatgggag 1140 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gacatacaga tgacgcagag ccctagttca ctgtctgcct ccgtcggcga cagagtgacg 60 atcagctgcc gagccagcca agatattagt aactacctca attggtacca gcagaaacct 120 ggaaaagcac ccaagctttt gatctattac accagcaggc tgcatagcgg agtgccgagc 180 agattttcgg gttctggcag cggcaccgat ttctctctga ctatcagtag cctgcaaccc 240 gaagacattg ctacatatta ttgtcagcag ggaatcaccc ctccatggac atttggaggg 300 ggaacaaagg tggagattaa a 321 <210> 69 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of hz8G11 light chain <400> 69 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Thr Pro Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 70 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of hz8G11 light chain <400> 70 gacatacaga tgacgcagag ccctagttca ctgtctgcct ccgtcggcga cagagtgacg 60 atcagctgcc gagccagcca agatattagt aactacctca attggtacca gcagaaacct 120 ggaaaagcac ccaagctttt gatctattac accagcaggc tgcatagcgg agtgccgagc 180 agattttcgg gttctggcag cggcaccgat ttctctctga ctatcagtag cctgcaaccc 240 gaagacattg ctacatatta ttgtcagcag ggaatcaccc ctccatggac atttggaggg 300 ggaacaaagg tggagattaa acggaccgtg gccgctccct ccgtgttcat cttcccaccc 360 tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc agcgtggtct gcctgctgaa caacttctac 420 ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg caactcccag 480 gaatccgtca ccgagcagga ctccaaggac agcacctact ccctgtcctc caccctgacc 540 ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 600 ctgtccagcc ccgtgaccaa gtccttcaac cggggcgagt gc 642 <210> 71 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of hz39D2.14 antibody <400> 71 Asp Glu Tyr Tyr Val Arg Thr Asp Tyr 1 5 <210> 72 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of hz39D2.22 and hz39D2.23 antibody <400> 72 Asp Glu Tyr Tyr Val Arg Val Asp Tyr 1 5 <210> 73 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 of hz39D2.22 antibody <400> 73 Leu Glu Leu Asp Glu Phe Pro Trp Thr 1 5 <210> 74 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 of hz39D2.23 antibody <400> 74 Leu Gln Leu Asp Glu Phe Pro Trp Thr 1 5 <210> 75 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of 2G10 heavy chain variable region <400> 75 Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Met Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Asn Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Arg Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ala Leu Tyr Asp Tyr Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 76 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of 2G10 heavy chain variable region <400> 76 gaggtgaagc ttctcgagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcaa cctctggatt cactttcagt gactattaca tgtattgggt tcgccagact 120 ccagagatga ggctggagtg ggtcgcatat attaatagtg gtggtggtag cacctattat 180 ccagacactg taaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240 ctgcaaatga gccgtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtgc aagagaggcc 300 ctctatgatt acgactatgc tatggactac tggggtcaag gaaccacggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 77 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of 2G10 light chain variable region <400> 77 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 78 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of 2G10 light chain variable region <400> 78 gatattgtga tgacccagtc tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctct 60 atctcttgca agtcaagtca gagcctctta tatagtaatg gaaaaaccta tttgaattgg 120 ttattacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180 tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt gggtcaggaa cagattttac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattactgcg tgcaaggtac acattttccg 300 ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaa 336 <210> 79 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of 8G11 heavy chain variable region <400> 79 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly His Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Thr Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Glu Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ala 115 <210> 80 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of 8G11 heavy chain variable region <400> 80 gaggtgcaac ttcagcagtc tggacctgac ctggtgaagc ctgggacttc agtgaagata 60 tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact ggctactaca tgcactgggt gaagcagagc 120 catggaaaga gccttgagtg gattggacat attaatccta acaatggtgg tactagctac 180 aaccagaagt tcaagggcaa gaccatatta actgtggaca agtcttccag cacagccttc 240 atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagagaagaa 300 gcctttgctt actggggcca agggactctg gtcactgtct ctgca 345 <210> 81 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of 8G11 light chain variable region <400> 81 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Asn Val Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ile Thr Pro Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 82 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of 8G11 light chain variable region <400> 82 gatattgtga tgacccagtc tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60 atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120 gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180 aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat ttttctctca ccattagcaa cgtggagcaa 240 gaagacattg ccacttactt ttgccaacag ggtattacgc ctccgtggac gttcggtgga 300 gggaccaagc tggagctgaa a 321 <210> 83 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of 39D2 heavy chain variable region <400> 83 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr His Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Asp Tyr Tyr Val Arg Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 84 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of 39D2 heavy chain variable region <400> 84 gaggttcagc tgcagcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60 tcctgcaagg cttctgggta taccttcaca aactatggag tgaattgggt gaagcaggct 120 ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacaccc acactggaga gccaacatat 180 gctgaagagt tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctat 240 ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac acggctacat atttctgtgc aagagatgat 300 tactacgtaa gggtagacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 354 <210> 85 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of 39D2 light chain variable region <400> 85 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr 65 70 75 80 Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 86 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of 39D2 light chain variable region <400> 86 gatattgtaa tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ccctaggaga gagagtcact 60 atcacttgca aggcgagtca ggacattaat agctatttaa gctggttcca gcagaaacca 120 gggaaatctc ctaagaccct gatctatcgt gcaaacagat tggtagatgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctca ccatcagcag cctggagtat 240 gaagatatgg gaatttatta ttgtctacag tatgatgagt ttccgtggac gttcggtgga 300 gggaccaagc tggagctgaa a 321 <210> 87 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of hz39D2.14 heavy chain variable region <400> 87 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr His Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Glu Tyr Tyr Val Arg Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 88 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of hz39D2.14 heavy chain variable region <400> 88 caagtccaac tcgtgcagtc aggatctgaa ctgaagaaac ctggagcgag cgttaaggtt 60 tcctgcaagg ccagcggcta tacgttcact aactatggtg tcaactgggt gagacaggca 120 cccggccagg gcctggagtg gatgggttgg atcaatactc acacagggga accaacatat 180 gctgaggagt tcaaaggacg gtttgttttt agtctggaca cctccgtgtc taccgcctac 240 ctgcagattt ccagccttaa agcagaggac actgctgtat actactgtgc cagagacgag 300 tactatgtga ggaccgatta ctgggggcag gggaccaccg tgacagtctc aagt 354 <210> 89 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of hz39D2.14 heavy chain <400> 89 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr His Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Glu Tyr Tyr Val Arg Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 90 <211> 1344 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of hz39D2.14 heavy chain <400> 90 caagtccaac tcgtgcagtc aggatctgaa ctgaagaaac ctggagcgag cgttaaggtt 60 tcctgcaagg ccagcggcta tacgttcact aactatggtg tcaactgggt gagacaggca 120 cccggccagg gcctggagtg gatgggttgg atcaatactc acacagggga accaacatat 180 gctgaggagt tcaaaggacg gtttgttttt agtctggaca cctccgtgtc taccgcctac 240 ctgcagattt ccagccttaa agcagaggac actgctgtat actactgtgc cagagacgag 300 tactatgtga ggaccgatta ctgggggcag gggaccaccg tgacagtctc aagtgcctcc 360 accaagggcc cctccgtgtt ccctctggcc ccctccagca agtccacctc tggcggcaca 420 gccgccctgg gctgcctggt gaaagactac ttccccgagc ccgtgaccgt gtcctggaac 480 tctggcgccc tgacctccgg cgtgcacacc ttccctgccg tgctgcagtc ctccggcctg 540 tactccctgt cctccgtggt gaccgtgccc tccagctctc tgggcaccca gacctacatc 600 tgtaacgtga accacaagcc ctccaacacc aaggtggaca agaaggtgga acccaagtcc 660 tgcgacaaga cccacacctg tcccccctgc cctgcccctg aactgctggg cggaccttcc 720 gtgttcctgt tccccccaaa gcccaaggac accctgatga tctcccggac ccccgaagtg 780 acctgcgtgg tggtggacgt gtcccacgag gaccctgaag tgaagttcaa ttggtacgtg 840 gacggcgtgg aagtgcacaa tgccaagacc aagcccagag aggaacagta caactccacc 900 taccgggtgg tgtctgtgct gaccgtgctg caccaggact ggctgaacgg caaagaatac 960 aagtgcaaag tctccaacaa ggccctgcct gcccccatcg aaaagaccat ctccaaggcc 1020 aagggccagc cccgcgagcc ccaggtgtac accctgcccc ctagccggga cgagctgacc 1080 aagaaccagg tgtccctgac ctgtctggtg aaaggcttct acccctccga cattgccgtg 1140 gaatgggagt ccaacggcca gcccgagaac aactacaaga ccaccccccc tgtgctggac 1200 tccgacggct cattcttcct gtactccaag ctgaccgtgg acaagtcccg gtggcagcag 1260 ggcaacgtgt tctcctgctc cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaag 1320 tccctgtccc tgagccccgg caag 1344 <210> 91 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of hz39D2.14 light chain variable region <400> 91 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 92 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of hz39D2.14 light chain variable region <400> 92 cggaccgtgg ccgctccctc cgtgttcatc ttcccaccct ccgacgagca gctgaagtcc 60 ggcaccgcca gcgtggtctg cctgctgaac aacttctacc cccgcgaggc caaggtgcag 120 tggaaggtgg acaacgccct gcagtccggc aactcccagg aatccgtcac cgagcaggac 180 tccaaggaca gcacctactc cctgtcctcc accctgaccc tgtccaaggc cgactacgag 240 aagcacaagg tgtacgcctg cgaagtgacc caccagggcc tgtccagccc cgtgaccaag 300 tccttcaacc ggggcgagtg c 321 <210> 93 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of hz39D2.14 light chain <400> 93 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 94 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of hz39D2.14 light chain <400> 94 gacattcaaa tgacacagtc tcccagctcc cttagtgctt cggtgggcga tcgggtgacc 60 ataacatgca aggcctcaca ggacatcaac agctatctct catggtttca gcagaagcca 120 ggaaaagcac ctaaaacgtt gatctacagg gccaatcgcc tcgttgacgg agtcccctcc 180 agattcagcg ggagtgggtc tggtcaggat tatactctga ccatctcctc tctgcagcct 240 gaagactttg ccacttacta ctgtctgcaa tacgatgagt tcccatggac cttcggccag 300 ggcaccaagg tggagattaa acggaccgtg gccgctccct ccgtgttcat cttcccaccc 360 tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc agcgtggtct gcctgctgaa caacttctac 420 ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg caactcccag 480 gaatccgtca ccgagcagga ctccaaggac agcacctact ccctgtcctc caccctgacc 540 ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 600 ctgtccagcc ccgtgaccaa gtccttcaac cggggcgagt gc 642 <210> 95 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of hz39D2.22 heavy chain variable region <400> 95 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr His Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Glu Tyr Tyr Val Arg Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 96 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of hz39D2.22 heavy chain variable region <400> 96 caagtccaac tcgtgcagtc aggatctgaa ctgaagaaac ctggagcgag cgttaaggtt 60 tcctgcaagg ccagcggcta tacgttcact aactatggtg tcaactgggt gagacaggca 120 cccggccagg gcctggagtg gatgggttgg atcaatactc acacagggga accaacatat 180 gctgaggagt tcaaaggacg gtttgttttt agtctggaca cctccgtgtc taccgcctac 240 ctgcagattt ccagccttaa agcagaggac actgctgtat actactgtgc cagagacgag 300 tactatgtga gggtggatta ctgggggcag gggaccaccg tgacagtctc aagt 354 <210> 97 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of hz39D2.22 heavy chain <400> 97 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr His Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Glu Tyr Tyr Val Arg Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 98 <211> 1344 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of hz39D2.22 heavy chain <400> 98 caagtccaac tcgtgcagtc aggatctgaa ctgaagaaac ctggagcgag cgttaaggtt 60 tcctgcaagg ccagcggcta tacgttcact aactatggtg tcaactgggt gagacaggca 120 cccggccagg gcctggagtg gatgggttgg atcaatactc acacagggga accaacatat 180 gctgaggagt tcaaaggacg gtttgttttt agtctggaca cctccgtgtc taccgcctac 240 ctgcagattt ccagccttaa agcagaggac actgctgtat actactgtgc cagagacgag 300 tactatgtga gggtggatta ctgggggcag gggaccaccg tgacagtctc aagtgcctcc 360 accaagggcc cctccgtgtt ccctctggcc ccctccagca agtccacctc tggcggcaca 420 gccgccctgg gctgcctggt gaaagactac ttccccgagc ccgtgaccgt gtcctggaac 480 tctggcgccc tgacctccgg cgtgcacacc ttccctgccg tgctgcagtc ctccggcctg 540 tactccctgt cctccgtggt gaccgtgccc tccagctctc tgggcaccca gacctacatc 600 tgtaacgtga accacaagcc ctccaacacc aaggtggaca agaaggtgga acccaagtcc 660 tgcgacaaga cccacacctg tcccccctgc cctgcccctg aactgctggg cggaccttcc 720 gtgttcctgt tccccccaaa gcccaaggac accctgatga tctcccggac ccccgaagtg 780 acctgcgtgg tggtggacgt gtcccacgag gaccctgaag tgaagttcaa ttggtacgtg 840 gacggcgtgg aagtgcacaa tgccaagacc aagcccagag aggaacagta caactccacc 900 taccgggtgg tgtctgtgct gaccgtgctg caccaggact ggctgaacgg caaagaatac 960 aagtgcaaag tctccaacaa ggccctgcct gcccccatcg aaaagaccat ctccaaggcc 1020 aagggccagc cccgcgagcc ccaggtgtac accctgcccc ctagccggga cgagctgacc 1080 aagaaccagg tgtccctgac ctgtctggtg aaaggcttct acccctccga cattgccgtg 1140 gaatgggagt ccaacggcca gcccgagaac aactacaaga ccaccccccc tgtgctggac 1200 tccgacggct cattcttcct gtactccaag ctgaccgtgg acaagtcccg gtggcagcag 1260 ggcaacgtgt tctcctgctc cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaag 1320 tccctgtccc tgagccccgg caag 1344 <210> 99 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of hz39D2.22 light chain variable region <400> 99 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Glu Leu Asp Glu Phe Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 100 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of hz39D2.22 light chain variable region <400> 100 gacattcaaa tgacacagtc tcccagctcc cttagtgctt cggtgggcga tcgggtgacc 60 ataacatgca aggcctcaca ggacatcaac agctatctct catggtttca gcagaagcca 120 ggaaaagcac ctaaaacgtt gatctacagg gccaatcgcc tcgttgacgg agtcccctcc 180 agattcagcg ggagtgggtc tggtcaggat tatactctga ccatctcctc tctgcagcct 240 gaagactttg ccacttacta ctgtctggag ctcgatgagt tcccatggac cttcggccag 300 ggcaccaagg tggagattaa a 321 <210> 101 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of hz39D2.22 light chain <400> 101 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Glu Leu Asp Glu Phe Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 102 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of hz39D2.22 light chain <400> 102 gacattcaaa tgacacagtc tcccagctcc cttagtgctt cggtgggcga tcgggtgacc 60 ataacatgca aggcctcaca ggacatcaac agctatctct catggtttca gcagaagcca 120 ggaaaagcac ctaaaacgtt gatctacagg gccaatcgcc tcgttgacgg agtcccctcc 180 agattcagcg ggagtgggtc tggtcaggat tatactctga ccatctcctc tctgcagcct 240 gaagactttg ccacttacta ctgtctggag ctcgatgagt tcccatggac cttcggccag 300 ggcaccaagg tggagattaa acggaccgtg gccgctccct ccgtgttcat cttcccaccc 360 tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc agcgtggtct gcctgctgaa caacttctac 420 ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg caactcccag 480 gaatccgtca ccgagcagga ctccaaggac agcacctact ccctgtcctc caccctgacc 540 ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 600 ctgtccagcc ccgtgaccaa gtccttcaac cggggcgagt gc 642 <210> 103 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of hz39D2.23 heavy chain variable region <400> 103 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr His Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Glu Tyr Tyr Val Arg Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 104 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of hz39D2.23 heavy chain variable region <400> 104 caagtccaac tcgtgcagtc aggatctgaa ctgaagaaac ctggagcgag cgttaaggtt 60 tcctgcaagg ccagcggcta tacgttcact aactatggtg tcaactgggt gagacaggca 120 cccggccagg gcctggagtg gatgggttgg atcaatactc acacagggga accaacatat 180 gctgaggagt tcaaaggacg gtttgttttt agtctggaca cctccgtgtc taccgcctac 240 ctgcagattt ccagccttaa agcagaggac actgctgtat actactgtgc cagagacgag 300 tactatgtga gggtggatta ctgggggcag gggaccaccg tgacagtctc aagt 354 <210> 105 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of hz39D2.23 heavy chain <400> 105 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr His Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Glu Tyr Tyr Val Arg Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 106 <211> 1344 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of hz39D2.23 heavy chain <400> 106 caagtccaac tcgtgcagtc aggatctgaa ctgaagaaac ctggagcgag cgttaaggtt 60 tcctgcaagg ccagcggcta tacgttcact aactatggtg tcaactgggt gagacaggca 120 cccggccagg gcctggagtg gatgggttgg atcaatactc acacagggga accaacatat 180 gctgaggagt tcaaaggacg gtttgttttt agtctggaca cctccgtgtc taccgcctac 240 ctgcagattt ccagccttaa agcagaggac actgctgtat actactgtgc cagagacgag 300 tactatgtga gggtggatta ctgggggcag gggaccaccg tgacagtctc aagtgcctcc 360 accaagggcc cctccgtgtt ccctctggcc ccctccagca agtccacctc tggcggcaca 420 gccgccctgg gctgcctggt gaaagactac ttccccgagc ccgtgaccgt gtcctggaac 480 tctggcgccc tgacctccgg cgtgcacacc ttccctgccg tgctgcagtc ctccggcctg 540 tactccctgt cctccgtggt gaccgtgccc tccagctctc tgggcaccca gacctacatc 600 tgtaacgtga accacaagcc ctccaacacc aaggtggaca agaaggtgga acccaagtcc 660 tgcgacaaga cccacacctg tcccccctgc cctgcccctg aactgctggg cggaccttcc 720 gtgttcctgt tccccccaaa gcccaaggac accctgatga tctcccggac ccccgaagtg 780 acctgcgtgg tggtggacgt gtcccacgag gaccctgaag tgaagttcaa ttggtacgtg 840 gacggcgtgg aagtgcacaa tgccaagacc aagcccagag aggaacagta caactccacc 900 taccgggtgg tgtctgtgct gaccgtgctg caccaggact ggctgaacgg caaagaatac 960 aagtgcaaag tctccaacaa ggccctgcct gcccccatcg aaaagaccat ctccaaggcc 1020 aagggccagc cccgcgagcc ccaggtgtac accctgcccc ctagccggga cgagctgacc 1080 aagaaccagg tgtccctgac ctgtctggtg aaaggcttct acccctccga cattgccgtg 1140 gaatgggagt ccaacggcca gcccgagaac aactacaaga ccaccccccc tgtgctggac 1200 tccgacggct cattcttcct gtactccaag ctgaccgtgg acaagtcccg gtggcagcag 1260 ggcaacgtgt tctcctgctc cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaag 1320 tccctgtccc tgagccccgg caag 1344 <210> 107 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of hz39D2.23 light chain variable region <400> 107 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu Asp Glu Phe Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 108 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of hz39D2.23 light chain variable region <400> 108 gacattcaaa tgacacagtc tcccagctcc cttagtgctt cggtgggcga tcgggtgacc 60 ataacatgca aggcctcaca ggacatcaac agctatctct catggtttca gcagaagcca 120 ggaaaagcac ctaaaacgtt gatctacagg gccaatcgcc tcgttgacgg agtcccctcc 180 agattcagcg ggagtgggtc tggtcaggat tatactctga ccatctcctc tctgcagcct 240 gaagactttg ccacttacta ctgtctgcaa ctcgatgagt tcccatggac cttcggccag 300 ggcaccaagg tggagattaa a 321 <210> 109 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of hz39D2.23 light chain <400> 109 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu Asp Glu Phe Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 110 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of hz39D2.23 light chain <400> 110 gacattcaaa tgacacagtc tcccagctcc cttagtgctt cggtgggcga tcgggtgacc 60 ataacatgca aggcctcaca ggacatcaac agctatctct catggtttca gcagaagcca 120 ggaaaagcac ctaaaacgtt gatctacagg gccaatcgcc tcgttgacgg agtcccctcc 180 agattcagcg ggagtgggtc tggtcaggat tatactctga ccatctcctc tctgcagcct 240 gaagactttg ccacttacta ctgtctgcaa ctcgatgagt tcccatggac cttcggccag 300 ggcaccaagg tggagattaa acggaccgtg gccgctccct ccgtgttcat cttcccaccc 360 tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc agcgtggtct gcctgctgaa caacttctac 420 ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg caactcccag 480 gaatccgtca ccgagcagga ctccaaggac agcacctact ccctgtcctc caccctgacc 540 ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 600 ctgtccagcc ccgtgaccaa gtccttcaac cggggcgagt gc 642

Claims (23)

  1. 하기 (a) 내지 (e) 중 어느 하나를 포함하는 HER2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2)에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편:
    (a) 서열목록 제1서열의 CDRH1, 서열목록 제2서열의 CDRH2 및 서열목록 제3서열의 CDRH3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열목록 제4서열의 CDRL1, 서열목록 제5서열의 CDRL2 및 서열목록 제6서열의 CDRL3를 포함하는 경쇄 가변영역;
    (b) 서열목록 제7서열의 CDRH1, 서열목록 제8서열의 CDRH2 및 서열목록 제9서열, 제71서열, 또는 제72서열의 CDRH3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열목록 제10서열의 CDRL1, 서열목록 제11서열의 CDRL2 및 서열목록 제12서열, 제73서열, 또는 제74서열의 CDRL3를 포함하는 경쇄 가변영역;
    (c) 서열목록 제13서열의 CDRH1, 서열목록 제14서열의 CDRH2 및 서열목록 제15서열의 CDRH3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열목록 제16서열의 CDRL1, 서열목록 제17서열의 CDRL2 및 서열목록 제18서열의 CDRL3를 포함하는 경쇄 가변영역;
    (d) 서열목록 제19서열의 CDRH1, 서열목록 제20서열의 CDRH2 및 서열목록 제21서열의 CDRH3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열목록 제22서열의 CDRL1, 서열목록 제23서열의 CDRL2 및 서열목록 제24서열의 CDRL3를 포함하는 경쇄 가변영역; 및
    (e) 서열목록 제25서열의 CDRH1, 서열목록 제26서열의 CDRH2 및 서열목록 제27서열의 CDRH3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열목록 제28서열의 CDRL1, 서열목록 제29서열의 CDRL2 및 서열목록 제30서열의 CDRL3를 포함하는 경쇄 가변영역.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 (a)의 중쇄 가변영역은 서열목록 제31서열, 또는 제75서열의 아미노산 서열을 포함하는 것이고;
    상기 (b)의 중쇄 가변영역은 서열목록 제39서열, 제83서열, 제87서열, 제95서열, 또는 제103서열의 아미노산 서열을 포함하는 것이고;
    상기 (c)의 중쇄 가변영역은 서열목록 제47서열의 아미노산 서열을 포함하는 것이고;
    상기 (d)의 중쇄 가변영역은 서열목록 제55서열의 아미노산 서열을 포함하는 것이고; 및
    상기 (e)의 중쇄 가변영역은 서열목록 제63서열 또는 제79서열의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 (a)의 경쇄 가변 영역은 서열목록 제35서열, 또는 제77서열의 아미노산 서열을 포함하는 것이고;
    상기 (b)의 경쇄 가변영역은 서열목록 제43서열, 제85서열, 제91서열, 제99서열, 또는 제107서열의 아미노산 서열을 포함하는 것이고;
    상기 (c)의 경쇄 가변영역은 서열목록 제51서열의 아미노산 서열을 포함하는 것이고;
    상기 (d)의 경쇄 가변영역은 서열목록 제59서열의 아미노산 서열을 포함하는 것이고; 및
    상기 (e)의 경쇄 가변영역은 서열목록 제67서열 또는 제81서열의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (a)를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열목록 제33서열의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것이고;
    상기 (b)를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열목록 제41서열, 제89서열, 제97서열, 제105서열의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것이고;
    상기 (c)를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열목록 제49서열의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것이고;
    상기 (d)를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열목록 제57서열의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것이고; 및
    상기 (e)를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열목록 제65서열의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  5. 제1항에 있어서, 상기 (a)를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열목록 제37서열의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것이고;
    상기 (b)를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열목록 제45서열, 제93서열, 제101서열, 제109서열의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것이고;
    상기 (c)를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열목록 제53서열의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것이고;
    상기 (d)를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열목록 제61서열의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것이고; 및
    상기 (e)를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열목록 제69서열의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 융합단백질.
  7. 다음을 포함하는 키메라 항원 수용체 폴리펩티드:
    (a) HER2 결합 도메인(HER2 binding domain);
    (b) 막횡단 도메인(transmembrane domain, TM);
    (c) 공동자극 도메인(costimulatory domain); 및
    (d) 세포내 신호전달 도메인(intracellular signaling domain, ICD).
  8. 제7항에 있어서, 상기 HER2 결합도메인은 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 HER2에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 것인, 키메라 항원 수용체 폴리펩티드.
  9. 제7항에 있어서, 상기 막횡단 도메인은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 막횡단 도메인을 포함하는 것인, 키메라 항원 수용체 폴리펩티드.
  10. 제7항에 있어서, 상기 공동자극 도메인은 MHC 클래스 I 분자, TNF 수용체 단백질, 이뮤노글로불린-유사 단백질, 시토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자 (signaling lymphocytic activation molecule, SLAM), 활성화 NK 세포 수용체, BTLA(B an T lymphocyte attenuator), 톨-유사 리간드 수용체(Toll-like ligand receptor), OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질로부터 수득된 기능적 신호전달 도메인인, 키메라 항원 수용체 폴리펩티드.
  11. 제7항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB, CD28, OX40, CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인, 키메라 항원 수용체 폴리펩티드.
  12. 제1항의 HER2에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자.
  13. 제7항의 키메라 항원 수용체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자.
  14. 제12항 또는 제13항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  15. 제14항의 재조합 벡터로 형질전환 된 숙주세포.
  16. 제7항의 키메라 항원 수용체 폴리펩티드를 발현하는 효과기 세포.
  17. 제16항에 있어서, 상기 효과기 세포는 수지상 세포, 킬러 수지상 세포, 비만세포, 자연살해 세포, B 림프구, T 림프구, 대식세포 및 이들의 전구세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 효과기 세포.
  18. 제17항에 있어서, 상기 T 림프구는 염증성 T 림프구, 세포독성 T 림프구, 조절 T 림프구 또는 헬퍼 T 림프구로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 효과기 세포.
  19. (a) 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 HER2에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  20. 제16항의 키메라 항원 수용체 폴리펩티드를 발현하는 효과기 세포를 포함하는, 암의 치료용 약제학적 조성물.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 암은 유방암, 난소암, 위암, 폐암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 두경부암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 요관암인 것을 특징으로 하는 조성물.
  22. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 트라스투주맙 항체를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  23. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 HER2에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암 진단용 키트.
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