KR20230060531A - Pd-1에 결합하는 항체 및 이의 용도 - Google Patents

Pd-1에 결합하는 항체 및 이의 용도 Download PDF

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밍쥬 천
슈카이 시아
마크 지칭 마
체위 펑
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바이오션, 인코포레이티드
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Abstract

인간 PD-1에 특이적으로 결합하는 단리된 단클론성 항체, 또는 이의 항원-결합 부분이 본원에 제공된다. 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 핵산 분자, 발현 벡터, 숙주 세포 및 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 발현시키기 위한 방법도 제공된다. 본 개시는 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하는 이중특이적 분자 및 약학적 조성물, 뿐만 아니라 본 개시의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 사용한 치료 방법을 추가로 제공한다.

Description

PD-1에 결합하는 항체 및 이의 용도
관련 출원 및 참조에 의한 포함
본 출원은 2020년 8월 31일 월요일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 제 63/072,421에 대한 우선권을 주장한다.
본원에 인용되거나 참조된 모든 문헌(본원에 인용된 모든 문헌 문서, 특허, 공개 특허 출원을 비제한적으로 포함함)("본원에 인용된 문헌"), 및 본원에 인용된 문헌에서 인용되거나 참조된 모든 문헌은 본원에 언급된 임의의 생산물을 위한 또는 본원에 참조로 포함되는 임의의 문헌 내의 임의의 제조업체의 지침, 설명, 생산물 사양 및 생산물 시트와 함께 이에 의해 참조로 본원에 포함되고 본 발명의 실시에 이용될 수 있다. 보다 구체적으로, 모든 참조된 문헌은 각각의 개별 문헌이 구체적으로 그리고 개별적으로 참조로 포함되어 있는 것으로 지시된 것과 동일한 정도로 참조로 포함된다. 본 개시에서 언급된 임의의 젠뱅크(Genbank) 서열은 본 개시의 가장 빠른 유효한 출원일의 젠뱅크 서열을 참조로 포함한다.
발명의 분야
본 개시는 일반적으로 높은 친화성 및 작용성으로 PD-1에 결합하는 단리된 단클론성 항체, 특히 마우스, 키메라 또는 인간화 단클론성 항체, 또는 이의 항원-결합 부분에 관한 것이다. 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 핵산 분자, 발현 벡터, 숙주 세포 및 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 발현시키기 위한 방법도 제공된다. 본 개시는 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함할 수 있는 이중특이적 분자, 면역접합체, 키메라 항원 수용체 및 약학적 조성물, 뿐만 아니라 본 개시의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 사용한 치료 방법을 추가로 제공한다.
면역 체계는 건강한 세포를 보존하고 해로운 침입자에게 피해를 입힌다. 이러한 면역학적 방어와 자가 내성의 균형은 정상적인 생리 기능에 매우 중요하며, 면역 반응에 대한 여러 가지 견제와 균형을 통해 달성된다. 예를 들어, 효과기 면역 세포는 면역 체크포인트를 통과할 때까지 완전한 기능을 발휘할 수 없다. 세포독성 T 림프구 항원 4(CTLA4)와 세포예정사 단백질 1(PD-1)은 처음으로 발견된 두 개의 면역 관문 억제 수용체로, 면역 반응에 대한 브레이크 역할을 하며 면역 억제 신호를 제공한다. CTLA4는 T 세포의 활성화 과정 초기에 유도되며, CD28과 경쟁하며 CD80/CD86과 결합한다. PD-1은 나중에 발현되며 세포예정사 1 리간드 1(PD-L1) 및/또는 PD-L2와 결합하여 TCR/CD28에 의해 유도된 양성 신호를 억제한다(Sharpe AH, Pauken KE. (2018) Nat Rev Immunol. 18(3):153-167).
PD-1은 막 근위 면역수용체 티로신 억제 모티프(ITIM)와 막 원위 티로신 기반 스위치 모티프(ITSM)를 포함하는 막관통 단백질이다(Thomas, M. L. (1995)　J Exp Med　181:1953-6; Vivier, E and Daeron, M (1997)　Immunol Today　18:286-91). PD-L1 결합 시, PD-1 활성화는 ITSM 인산화를 초래하여 포스파타아제 1/2과 SAP(SLAM-Associated Protein)을 포함하는 Src 상동성 영역 2 도메인의 유인, ZAP70과 같은 TCR 및 CD28 근위 신호 분자의 탈인산화, PI3K/AKT 및 Ras-MEK-ERK 경로와 같은 다운스트림 신호 전달 경로의 비활성화로 이어진다(Sharpe AH, Pauken KE. (2018) supra; Yokosuka T et al., (2012) J Exp Med. 209(6):1201-17). 상황에 따라 PD-1-PD-L1 신호 전달은 효과기 T 세포 사멸, 아네르기 및 탈진, 선천성 림프구 세포의 증식 및 작용 및/또는 Treg 세포의 증식을 유도한다(Qin W et al., (2019) Front Immunol. 10:2298).
조혈 세포 및 비조혈 조직에서 발현되는 PD-L1 및 PD-L2는 조직 염증을 예방하고 생체 항상성 유지에 기여할 수 있으며, 암 세포에서 발현되는 PD-L1 및/또는 PD-L2는 암 세포가 면역 감시를 피하도록 돕는다. 구체적으로, 종양 세포의 PD-L1과 세포 독성 T 세포의 PD-1의 결합은 CD8+ T 세포의 아네르기 및 사멸을 초래하고, PD-L1은 종양 세포가 CD8+ T 세포에 의한 용해에 내성을 갖게 한다(Azuma T et al., (2008) Blood 111(7):3635-3643). 항-PD-1 항체 2개, 니볼루맙과 펨브롤리주맙, 항-PD-L1 항체 3개, 아벨루맙, 아테졸리주맙 및 더발루맙 등, 여러 PD-1 또는 PD-L1 억제제가 암 치료용으로 FDA 승인을 받았다. 니볼루맙(OPDIVO®, Bristol Myers Squibb) 은 비소세포 폐암(NSCLC), 신세포암(RCC), 방광암(BC), 현미부수체 불안정성 또는 DNA 오류 복원력 결핍(MSIH/dMMR) 대장암(CRC), 간세포암(HCC), 고전적 호지킨 림프종(cHL), 흑색종 및 두경부 편평 세포암(HNSCC) 치료제로 승인을 받았다. 펨브롤리주맙(KEYTRUDA®, Merck)은 흑색종, HNSCC, 자궁 경부암, cHL, NSCLC, BC, 위암 및 위식도암, 모든 MSI-H/dMMR 진행성 고형 종양의 치료제로 승인을 받았다. 11379명의 환자를 대상으로 실시한 19개의 무작위 임상 시험에 대한 메타분석 결과, 항-PD-1 치료법의 생존 결과가 항-PD-L1 치료법보다 유의하게 우수한 것으로 나타났다(Duan J et al., (2020) JAMA Oncol. 6(3):375-384).
인간 면역결핍 바이러스(HIV), 시미안 면역결핍 바이러스(SIV), B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV) 감염에서도 CD8+ T 세포에서 PD-1이 높게 발현되는 것이 확인되었다. PD-1/PD-L1 차단은 CD8+ T 세포와 CD4+ T 세포의 기능을 회복시키고, 간에 상주하는 NK 세포의 T 세포에 대한 억제 효과를 무효화시키며, 사이토카인 생성을 촉진하고, 바이러스 양을 줄일 수 있다(Barber DL et al., (2006) Nature. 439:682-687; Qin W et al., (2019) supra). 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 치료법은 패혈증에 유익한 효과를 보여주었으며, 니볼루맙과 BMS-936559는 중증 패혈증 치료에 대한 임상 시험이 진행 중이다(Riva A, Chokshi S. (2018) Hepatol Int. 12(3):223-36).
임상적 사용에서 일부 환자는 현재 승인된 항-PD-1 항체에 반응하지 않는다. 따라서, 약학적 특성이 향상된 추가적인 단클론성 항체가 필요하다
본 출원에서 임의의 문헌의 인용 또는 확인은 그러한 문헌이 본 발명에대한 종래 기술로서 이용 가능하다는 것을 인정하는 것이 아니다.
본 개시는, PD-1(예를 들어, 인간 PD-1)에 결합하고 니볼루맙 및 펨브롤리주맙과 같은 종래 기술의 항-PD-1 항체와 비교하여 i) 더 높지는 않더라도 비슷한 인간, 원숭이 및 마우스 PD-1에 대한 결합 친화성/결합능, ii) 더 높지는 않더라도 비슷한 PD-1-PD-L1 상호작용에 대한 차단 활성, 및/또는 iii) 더 우수하지는 않더라도 비슷한 생체내 항-종양 활성을 갖는, 단리된 단클론성 항체(예를 들어, 마우스, 키메라 또는 인간화 단클론성 항체) 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다.
본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 인간, 원숭이 또는 마우스 PD-1 단백질 생체내 검출, 및 PD-1 신호 전달과 관련된 질환, 예컨대, 암, 감염성 질환 및 염증성 질환을 포함하여 다양한 적용을 위해 사용할 수 있다.
따라서, 일 양태에서, 본 개시는 (i) VH CDR1 영역, VH CDR2 영역 및 VH CDR3 영역을 포함할 수 있는 중쇄 가변 영역(여기서, VH CDR1 영역, VH CDR2 영역, 및 VH CDR3 영역은 (1) 각각 SEQ ID NO: 1, 3 및 6(X1=D, X2=Y); (2) 각각 SEQ ID NO: 1, 3 및 6(X1=E, X2=Y); (3) 각각 SEQ ID NO: 1, 4 및 6(X1=D, X2=W); 또는 (4) 각각 SEQ ID NO: 2, 5 및 7 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있음); 및/또는 (ii) VL CDR1 영역, VL CDR2 영역 및 VL CDR3 영역을 포함할 수 있는 경쇄 가변 영역(여기서, VL CDR1 영역, VL CDR2 영역, 및 VL CDR3 영역은 (1) 각각 SEQ ID NO: 8(X1= I, X2=N), 10 및 12; (2) 각각 SEQ ID NO: 8(X1=I, X2=A), 10 및 12; (3) 각각 SEQ ID NO: 8(X1=L, X2=D), 10 및 12; 또는 (4) 각각 SEQ ID NO: 9, 11 및 13과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있음)을 갖는, PD-1에 결합하는 단리된 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 부분에 관한 것이다.
본 개시의 단리된 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 VH CDR1 영역, VH CDR2 영역 및 VH CDR3 영역을 포함할 수 있는 중쇄 가변 영역, 및 VL CDR1 영역, VL CDR2 영역 및 VL CDR3 영역을 포함할 수 있는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 여기서 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은 (1) 각각 SEQ ID NO: 1, 3, 6(X1=D, X2=Y), 8(X1=I, X2=N), 10 및 12; (2) 각각 SEQ ID NO: 1, 3, 6(X1=E, X2=Y), 8(X1=I, X2=A), 10 및 12; (3) 각각 SEQ ID NO: 1, 4, 6(X1=D, X2=W), 8(X1=L, X2=D), 10 및 12; 또는 (4) 각각 SEQ ID NO: 2, 5, 7, 9, 11 및 13과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 14, 15(X1=S, X2=M, X3=K; X1=T, X2=M, X3=K; X1=S, X2=V, X3=K; X1=S, X2=M, X3=T; X1=T, X2=V, X3=T), 16(X1=V, X2=S, X3=I; X1=I, X2=G, X3=I; X1=I, X2=S, X3=M), 17(X1=R, X2=A, X3=V; X1=K, X2=V, X3=V; X1=K, X2=A, X3=R), 18, 19 또는 42와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 30 또는 31의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있다. SEQ ID NO: 16(X1=I, X2=S, X3=M), 18 및 19의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 32, 36 및 38의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있다.
경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 20, 21(X1=N; X1=A), 22 또는 23과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 33 또는 34의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있다. SEQ ID NO: 21 (X1=N), 22 및 23의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 35, 37 및 39의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있다.
본 개시의 단리된 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역은 (1)각각 SEQ ID NO: 14 및 20; (2) 각각 SEQ ID NO: 15(X1=S, X2=M, X3=K) 및 21(X1=N); (3) 각각 SEQ ID NO: 15(X1=T, X2=M, X3=K) 및 21(X1=N); (4) 각각 SEQ ID NO: 15(X1=S, X2=V, X3=K) 및 21(X1=N); (5) 각각 SEQ ID NO: 15(X1=S, X2=M, X3=T) 및 21(X1=N); (6) 각각 SEQ ID NO: 15(X1=T, X2=V, X3=T) 및 21(X1=N); (7) 각각 SEQ ID NO: 16(X1=V, X2=S, X3=I) 및 21(X1=N); (8) 각각 SEQ ID NO: 16(X1=I, X2=G, X3=I) 및 21(X1=N); (9) 각각 SEQ ID NO: 16(X1=I, X2=S, X3=M) 및 21(X1=N); (10) 각각 SEQ ID NO: 17(X1=R, X2=A, X3=V) 및 21(X1=N); (11) 각각 SEQ ID NO: 17(X1=K, X2=V, X3=V) 및 21(X1=N); (12) 각각 SEQ ID NO: 17(X1=K, X2=A, X3=R) 및 21(X1=N); (13) 각각 SEQ ID NO: 42 및 21(X1=A); (14) 각각 SEQ ID NO: 18 및 22; 또는 (15) 각각 SEQ ID NO: 19 및 23과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 개시의 단리된 단클론성 항체, 또는 이의 항원-결합 부분은 이황화 결합에 의해 연결된 중쇄 및 경쇄를 포함할 수 있고, 중쇄는 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있고, 경쇄는 경쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있는데, 여기서 중쇄 가변 영역의 C 말단은 중쇄 불변 영역의 N 말단에 연결되고, 경쇄 가변 영역의 C 말단은 경쇄 불변 영역의 N 말단에 연결되는데, 여기서 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 상술된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
중쇄 불변 영역은 예컨대, 유전자 조작된 인간 IgG1 또는 IgG2 불변 영역 또는 예를 들어, SEQ ID NO: 24에 기재된 아미노산 서열을 갖는 인간 IgG4 불변 영역 또는 이의 기능적 단편과 같이 감소된 FcR 결합 친화성을 가질 수 있다. 중쇄 불변 영역은 정상적이거나 심지어 향상된 FcR 결합 친화성을 갖는 IgG1 불변 영역일 수도 있다. 경쇄 불변 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 25에 기재된 아미노산 서열을 갖는 인간 카파 불변 영역일 수 있다. SEQ ID NO: 24 및 25의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 40 및 41의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있다.
본 개시의 항체는 특정 구현예에서 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하거나 이로 이루어질 수 있고, 여기서 각각의 중쇄는 상기 언급된 중쇄 불변 영역, 중쇄 가변 영역 또는 CDR 서열을 포함할 수 있고, 각각의 경쇄는 상기 언급된 경쇄 불변 영역, 경쇄 가변 영역 또는 CDR 서열을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서 본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 단쇄 가변 단편(scFv) 항체, 또는 항체 단편, 예컨대, Fab 또는 F(ab’)2 단편일 수 있다.　
본 개시는 또한 상기 항체, 또는 이의 항원-결합 부분과는 상이한 결합 특이성을 갖는 제2 기능적 모이어티(예를 들어, 제2 항체)에 연결된 본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함할 수 있는 이중특이적 분자를 제공한다.　 본 개시는 또한 치료제, 예컨대, 세포독소에 연결된, 본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함할 수 있는 면역접합체, 예컨대, 항체-약물 접합체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 키메라 항원 수용체(CAR)의 일부로 구성될 수 있다. 또한 T 세포 및 NK 세포와 같은 항원 키메라 수용체를 포함할 수 있는 면역 세포가 제공된다. 본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 또한 종양용해 바이러스에 의해 인코딩되거나 이와 함께 사용될 수 있다.
본 개시는 본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 핵산 분자, 이러한 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터 및 이러한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 추가로 제공한다. 본 개시의 숙주 세포를 사용하여 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제조하기 위한 방법으로서, (i) 숙주 세포에서 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 발현하는 단계 및 (ii) 숙주 세포 또는 이의 세포 배양물로부터 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 단리하는 단계를 포함하는, 방법도 제공된다.
본 개시는 본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 면역접합체, 이중특이적 분자, 면역 세포, 종양용해 바이러스, 핵산 분자, 발현 벡터 또는 숙주 세포, 및 약?e적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물은 항종양제, 항감염제 또는 항염증제와 같은 특정 질환을 치료하기 위한 치료제를 추가로 함유할 수 있다.
추가의 또 다른 양태에서, 본 개시는 PD-1 신호 전달과 관련된 질환을 치료하는 방법으로서, 본 개시의 치료적 유효량의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
질환은 종양 또는 암일 수 있다. 종양 또는 암은 비소세포 폐암(NSCLC), 신세포암(RCC), 방광암(BC), 현미부수체 불안정성 또는 DNA 오류 복원력 결핍(MSIH/dMMR) 대장암(CRC), 간세포암(HCC), 고전적 호지킨 림프종(cHL), 흑색종 및 두경부 편평 세포암(HNSCC), 자궁 경부암, 위암 및 위식도암, 결장 선암, 및 모든 MSI-H/dMMR 진행성 고형 종양을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 조성물은 본 개시의 항체, 또는 이의 항원-결합 부분, 약한 FcR 결합을 가진 중쇄 불변 영역, 이중특이적 분자, 핵산 분자 또는 발현 벡터를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 추가적인 항암 항체, 예컨대, 항-VISTA 항체, 항-PD-L1 항체, 항-LAG-3 항체 및/또는 항-CTLA-4 항체가 추가로 투여될 수 있다. 추가의 또 다른 구현예에서, 본 개시의 항체, 또는 이의 항원-결합 부분은 사이토카인(예를 들어, IL-2 및/또는 IL-21) 또는 공동자극 항체(예를 들어, 항-CD137 및/또는 항-GITR 항체)와 함께 투여된다. 또 다른 구현예에서, 본 개시의 항체, 또는 이의 항원-결합 부분은 에피루비신, 옥살리플라틴, 및/또는 5-플루오로우라실(5-FU)과 같은 세포독성제일 수 있는 화학치료제와 함께 투여된다. 본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은, 예를 들어, 마우스, 키메라 또는 인간화일 수 있다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간이다.
질환은 감염성 질환일 수 있으며, 바이러스, 박테리아 또는 곰팡이에 의해 유발된 질환을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 감염성 질환은 HIV 감염, 시미안 면역결핍 바이러스 감염, HBV 감염 또는 HCV 감염이다. 조성물은 본 개시의 항체, 또는 이의 항원-결합 부분, 약한 FcR 결합을 가진 중쇄 불변 영역, 이중특이적 분자, 핵산 분자 또는 발현 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 대상체에게 항감염제, 예컨대, 항바이러스제, 항균제, 또는 항진균제가 추가로 투여된다. 본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은, 예를 들어, 마우스, 키메라 또는 인간화일 수 있다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간이다.
질환은 염증성 질환일 수 있다. 염증성 질환은 류머티스 관절염, 대장염, 루푸스 유사 신장염, 전신 홍반성 루푸스, 건선을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 본 개시의 조성물은 본 개시의 항체, 또는 이의 항원-결합 부분, 높은 FcR 결합을 가진 중쇄 불변 영역, 면역접합체, 이중특이적 분자, CAR 면역 세포, 핵산 분자 또는 발현 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 개시의 조성물은 염증 조직에 국소적 전달을 통해 투여된다. 본 개시의 항체는, 예를 들어, 마우스, 키메라 또는 인간화일 수 있다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간이다.
추가의 또 다른 양태에서, 본 개시는 이를 필요로 하는 대상체의 면역 반응을 조절하거나 증진시키는 방법으로서, 대상체의 면역 반응이 조절/증진되도록 본 개시의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다. 조성물은 본 개시의 항체, 또는 이의 항원-결합 부분, 약한 FcR 결합을 가진 중쇄 불변 영역, 이중특이적 분자, 핵산 분자 또는 발현 벡터를 포함한다. 본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은, 예를 들어, 마우스, 키메라 또는 인간화일 수 있다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간이다.
본 개시의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 및 실시예로부터 명백해질 것이고, 이들은 제한적인 것으로 해석되지 않아야 한다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌, 젠뱅크 항목, 특허 및 공개 특허 출원의 내용은 명백히 참조로 본원에 포함된다.
따라서, 본 발명의 목적은 출원인이 권리를 유보하도록 임의의 이전에 공지된 생산물, 생산물을 제조하는 공정, 또는 생산물을 사용하는 방법을 본 발명 내에 포함시키지 않으며, 이에 의해 임의의 이전에 공지된 생산물, 공정, 또는 방법의 포기를 개시한다. 본 발명은 출원인이 권리를 유보하도록 USPTO(35 U.S.C. §112, 첫 단락) 또는 EPO(EPC의 83항)의 서면 기재 요건 및 실시 가능 요건을 충족하지 않는 임의의 생산물, 공정, 또는 생산물의 제조 또는 생산물의 사용 방법을 본 발명의 범주 내에 포함시키고자 하는 것이 아니고, 이에 의해 임의의 이전에 기재된 생산물, 생산물의 제조 공정, 또는 생산물의 사용 방법의 포기를 개시한다는 것이 추가로 주목된다. 본 발명의 실시에 있어서 Art. 53(c) EPC 및 규칙 28(b) 및 (c) EPC를 준수하는 것이 유리할 수 있다. 본 출원의 계보 또는 임의의 다른 계보 또는 임의의 제3자의 종래 출원된 출원에서 출원인의 임의의 등록된 특허(들)의 요지인 임의의 구현예를 명백히 포기하는 모든 권리는 명백히 유보된다. 본 명세서에서 어떤 것도 약속으로 해석되어서는 안된다.
본 개시 내용 및 구체적으로 청구항 및/또는 단락에서, "포함한다(comprises)", "포함된(comprised)", "포함하는(comprising)" 등과 같은 용어는 미국 특허법에서 이에 귀속된 의미를 가질 수 있다는 것이 주목되며; 예를 들어, 이들은 "포함한다(includes)", "포함된(included)", "포함하는(including)" 등을 의미할 수 있고; "필수적으로 이루어지는(consisting essentially of)" 및 "필수적으로 이루어진다(consists essentially of)"와 같은 용어는 미국 특허법에서 이들에게 부여된 의미를 갖고, 예를 들어, 명시적으로 열거되지 않은 요소를 허용하지만, 종래 기술에서 발견되거나 본 발명의 기본적인 또는 신규한 특징에 영향을 미치는 요소는 제외한다.
본 발명을 기술된 특정 구현예로만 제한하고자 하는 것이 아닌, 예로서 주어진 하기 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 가장 잘 이해될 수 있다.
도 1a 및 도 1b는 포획 ELISA에서 인간 PD-1에 대한 마우스 항체 E1A9C8A7 및 E2G4E10B7(a), 및 E1G5D1H1(b)의 결합능을 보여주는 것이다.
도 2는 간접 ELISA에서 마우스 PD-1에 대한 마우스 항체 E1A9C8A7, E2G4E10B7 및 E1G5D1H1의 결합능을 보여주는 것이다.
도 3a 및 도 3b는 간접 ELISA에서 시노몰구스 PD-1에 대한 마우스 항체 E1A9C8A7 및 E2G4E10B7(a), 및 E1G5D1H1(b)의 결합능을 보여주는 것이다.
도 4a 및 도 4b는 세포 기반 결합 FACS 검정에서 인간 PD-1을 발현하는 GS-J2/PD-1 세포에 대한 마우스 항체 E1A9C8A7 및 E2G4E10B7(a), 및 E1G5D1H1(b)의 결합능을 보여주는 것이다.
도 5는 세포 기반 결합 FACS 검정에서 마우스 PD-1을 발현하는 293F-마우스 PD-1 세포에 대한 마우스 항체 E1A9C8A7 및 E2G4E10B7의 결합능을 보여주는 것이다.
도 6a 및 도 6b는 경쟁 ELISA에서 인간 PD-1-인간 PD-L1 결합을 차단하는 마우스 항체 E1A9C8A7 및 E2G4E10B7(a), 및 E1G5D1H1(b)의 능력을 보여주는 것이다.
도 7a 및 도 7b는 세포 기반 차단 FACS 검정에서 세포 표면 인간 PD-L1에 결합하는 인간 PD-1을 차단하는 마우스 항체 E1A9C8A7 및 E2G4E10B7(a), 및 E1G5D1H1(b)의 능력을 보여주는 것이다.
도 8은 세포 기반 차단 FACS 검정에서 세포 표면 마우스 PD-1에 결합하는 마우스 PD-L1을 차단하는 마우스 항체 E1A9C8A7 및 E2G4E10B7의 능력을 보여주는 것이다.
도 9a 및 도 9b는 경쟁 ELISA 시험에서 펨브롤리주맙-PD-1 결합을 차단하는 마우스 항체 E1A9C8A7 및 E2G4E10B7(a), 및 E1G5D1H1(b)의 능력을 보여주는 것이다.
도 10은 세포 기반 기능 검정에서 PD-1-PD-L1 상호작용으로 인한 루시페라제 발현 감소를 역전시키는 마우스 항체 E1A9C8A7, E2G4E10B7 및E1G5D1H1의 능력을 보여주는 것이다.
도 11은 세포 기반 기능 검정에서 PD-1-PD-L1 상호작용으로 인한 루시페라제 감소를 역전시키는 키메라 E1A9C8A7 항체의 능력을 보여주는 것이다.
도 12는 포획 ELISA에서 인간 PD-1에 대한 인간화 항체 huE1A9C8A7-V5 및 huE1A9C8A7-V8의 결합능을 보여주는 것이다.
도 13은 간접 ELISA에서 시노몰구스 PD-1에 대한 인간화 항체 huE1A9C8A7-V5 및 huE1A9C8A7-V8의 결합능을 보여주는 것이다.
도 14는 세포 기반 결합 FACS 검정에서 인간 PD1을 발현하는 GS-J2/PD-1 세포에 대한 인간화 항체 huE1A9C8A7-V5 및 huE1A9C8A7-V8의 결합능을 보여주는 것이다.
도 15는 경쟁 ELISA에서 인간 PD-1-PD-L1 결합을 차단하는 인간화 항체 huE1A9C8A7-V5 및 huE1A9C8A7-V8의 능력을 보여주는 것이다.
도 16은 경쟁 ELISA 시험에서 펨브롤리주맙 PD-1 결합을 차단하는 인간화 항체 huE1A9C8A7-V5 및 huE1A9C8A7-V8의 능력을 보여주는 것이다.
도 17은 세포 기반 차단 FACS 검정에서 세포 표면 PD-L1에 결합하는 PD-1을 차단하는 인간화 항체 huE1A9C8A7-V5 및 huE1A9C8A7-V8의 능력을 보여주는 것이다.
도 18은 세포 기반 기능 검정에서 PD-1-PD-L1 상호작용으로 인한 루시페라제 발현 감소를 역전시키는 인간화 항체 huE1A9C8A7-V5 및 huE1A9C8A7-V8의 능력을 보여주는 것이다.
도 19a 및 도 19b는 인간화 항체 huE1A9C8A7-V5(a) 및 huE1A9C8A7-V8(b)의 단백질 열 이동 검정 결과를 보여주는 것이다.
도 20은 세포 기반 결합 FACS 검정에서 인간 PD1을 발현하는 GS-J2/PD-1 세포에 대한 인간화 항체 huE1A9C8A7-V8 및 huE1A9C8A7-V8-3의 결합능을 보여주는 것이다.
도 21은 세포 기반 기능 검정에서 PD-1-PD-L1 상호작용으로 인한 루시페라제 발현 감소를 역전시키는 인간화 항체 huE1A9C8A7-V8 및 huE1A9C8A7-V8-3의 능력을 보여주는 것이다.
도 22는 마우스 항체 E2G4E10B7 또는 대조군으로 치료된 마우스의 종양 부피 변화를 나타낸다.
본 개시를 보다 용이하게 이해할 수 있도록 보장하기 위해, 소정의 용어가 먼저 정의된다. 추가 정의가 상세한 설명 전반에 걸쳐 기재된다.
용어 "PD-1" 또는 "PD1"은 CD279로도 알려진 세포예정사 단백질 1을 지칭한다. 용어 "PD-1"은 변이체, 동형, 동족체, 동원체 및 이원체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 인간 PD-1 단백질에 특이적인 항체는, 특정 경우에, 원숭이와 같은 인간 이외의 종으로부터의 PD-1 단백질과 교차 반응할 수 있다. 다른 구현예에서, 인간 PD-1 단백질에 특이적인 항체는 인간 PD-1 단백질에 완전 특이적일 수 있고, 다른 종에 대한 또는 다른 유형의 교차 반응성을 나타내지 않거나, 다른 모든 종이 아니라 다른 특정 종으로부터의 PD-1과 교차 반응할 수 있다.
용어 "인간 PD-1" NP_005009.2의 NCBI 참조 번호를 갖는 인간 PD-1의 아미노산 서열과 같은, 인간으로부터의 아미노산 서열을 갖는 PD-1 단백질을 지칭한다(Orth MF et al., (2020), Cancer Immunol. Immunother. 69 (7): 1353-1362). 용어 "원숭이 PD-1" 또는 "시노몰구스 PD-1" XP_001107830.1의 NCBI 참조 번호를 갖는 아미노산 서열과 같은, 원숭이로부터의 아미노산 서열을 갖는 PD-1 단백질을 지칭한다(McGary CS et al., (2017), Immunity 47 (4): 776-788). 용어 "마우스 PD-1" NP_032824.1의 NCBI 참조 번호를 갖는 마우스 PD-1의 아미노산 서열과 같은, 마우스로부터의 아미노산 서열을 갖는 PD-1 단백질을 지칭한다(Lai X et al., (2020) PLoS ONE 15(4): e0231499).
본원에서 사용되는 용어"항체"는 항원-결합 부위가 일반적으로 면역글로불린 분자의 가변 영역 내에 있는 적어도 하나의 항원-결합 부위를 통해 PD-1과 같은 표적을 인식하고 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어는 온전한 다클론성 항체, 온전한 단클론성 항체, 단쇄 Fv(scFv) 항체, 중쇄 항체(HCAb), 경쇄 항체(LCAb), 다중특이적 항체, 이중특이적 항체, 단일특이적 항체, 1가 항체, 항체의 항원-결합 부위를 포함하는 융합 단백질, 및 항체가 요망되는 생물학적 활성을 나타내는 한 항원-결합 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자(예를 들어, 이중 가변 도메인 면역글로불린 분자)를 포괄한다. 항체는 또한 마우스 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 및 인간 항체를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 항체는 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 지칭되는 이의 중쇄 불변 도메인의 동일성에 기초하여 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 또는 이의 하위부류(이소형)(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)인 임의의 5 개 주요 부류의 면역글로불린일 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린은 상이하고 잘 알려진 하위단위 구조 및 3-차원 배열을 갖는다. 항체는 독소 및 방사성 동위원소를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 다른 분자에 네이키드되거나 접합될 수 있다. 달리 명시적으로 지시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 온전한 항체의 "항원-결합 부분"을 포함한다. IgG는 이황화 결합에 의해 상호연결된 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함할 수 있는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성될 수 있다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인(CH1, CH2 및 CH3)으로 구성될 수 있다. 각각의 경쇄는 강쇄 가변 영역(본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성될 수 있다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 구성될 수 있다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)으로 칭해지는 더욱 보존된 영역 사이에 배치된, 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 초가변성 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 V L은 아미노-말단부터 카복시-말단까지 다음 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역글로불린이 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 효과기 세포) 및 전통적인 보체계의 제1 성분(C1q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 결합하는 것을 매개할 수 있다.
본원에서 사용되는 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어(또는 간단히 "항체 부분")는 항원(예를 들어, PD-1 단백질)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어 내에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함할 수 있는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR); 및 (viii) 단일 가변 도메인 및 2개의 불변 도메인을 함유하는 중쇄 가변 영역인 나노바디를 포함한다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH는 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 합성 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 연결될 수 있으며, 이 합성 링커는 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 사슬로 만들어질 수 있게 한다(단쇄 Fv(scFv)로 알려짐; 예를 들어, 문헌[Bird et al., (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al., (1988) Proc. Biol. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조). 이러한 단쇄 항체는 또한 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어 내에 포함되는 것으로 하고자 한다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기법을 사용하여 수득되며, 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.
본원에서 사용되는 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭하는 것으로 하고자 한다(예를 들어, PD-1 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 PD-1 단백질 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음) 그러나, 인간 PD-1 단백질 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 종으로부터의 PD-1 단백질과 같은 다른 항원에 대해 교차 반응성을 가질 수 있다. 더욱이, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "단클론성 항체"는 실질적으로 동종인 항체의 개체군에서 얻은 항체를 지칭한다. 즉, 개체군을 구성하는 개별 항체들은 자연적으로 발생할 수 있는 소량의 돌연변이 및/또는 번역 후 변형(예: 이성질화, 아미드화)을 제외하고 동일하다. 단클론성 항체는 단일 항원 부위에 대해 매우 특이적으로 지시된다. 전형적으로 상이한 결정기(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 다클론성 항체 제제와 달리, 각각의 단클론성 항체는 항원의 단일 결정기에 대해 지시된다. 단클론성 항체는 이러한 특이성 외에도, 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않은 하이브리도마 배양에 의해 합성된다는 점에서 유리하다. 수식어 "단클론성"은 항체의 특성이 실질적으로 동종 항체의 개체군으로부터 얻어지는 것임을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산이 필요한 것으로 해석되어서는 안 된다. 예컨대, 본 발명에 따라 사용되는 단클론성 항체는 이를테면, 하이브리도마법을 포함하는 다양한 기법으로 제조될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "마우스 항체"는 프레임워크와 CDR 영역 둘 모두가 마우스 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 하고자 한다. 추가로, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우, 불변 영역은 또한 마우스 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된다. 본 개시의 마우스 항체는 마우스 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 인코딩되지 않은 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-지정 돌연변이 유발 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에서 사용되는 용어 "마우스 항체"는 또 다른 포유동물 종의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 마우스 프레임워크 서열 상에 접목된 항체를 포함하는 것으로 하고자 하지 않는다.
용어 "키메라 항체"는 비인간 공급원으로부터의 유전 물질을 인간으로부터의 유전 물질과 조합함으로써 제조된 항체를 지칭한다. 또는 보다 일반적으로, 키메라 항체는 특정 종으로부터의 유전 물질과 함께 또 다른 종으로부터의 유전 물질을 갖는 항체이다.
본원에서 사용되는 용어 "인간화 항체"는 인간에서 자연적으로 생성된 항체 변이체와의 유사성을 증가시키도록 변형된 단백질 서열을 갖는 비-인간 종으로부터의 항체를 지칭한다.
용어 "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 인코딩되는 항체 부류(예를 들어, IgM 또는 IgG1)를 지칭한다.
문구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 용어 "항원에특이적으로 결합하는 항체"와 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 "인간 PD-1에 특이적으로 결합하는" 항체는 인간 PD-1 단백질(및 가능하게는 하나 이상의 비-인간 종으로부터의 PD-1 단백질)에 결합하지만 비-PD-1 단백질에는 실질적으로 결합하지 않는 항체를 지칭하는 것으로 하고자 한다. 바람직하게는, 항체는 "고친화성", 즉 5.0 x10-8 M 이하, 더욱 바람직하게는 1.0 x10-8 M 이하, 및 더욱 바람직하게는 5.0 x 10-9 M 이하의 KD로 인간 PD-1 단백질을 결합한다.
본원에서 사용되는 단백질 또는 세포에 "실질적으로 결합하지 않는"이라는 용어는 단백질 또는 세포에 결합하지 않거나 고친화성으로 결합하지 않는,즉, 1.0 x 10-6 M 이상, 더욱 바람직하게는 1.0 x 10-5 M 이상, 더욱 바람직하게는 1.0 x 10-4 M 이상, 더욱 바람직하게는 1.0 x 10-3 M 이상, 더욱더 바람직하게는 1.0 x 10-2 M 이상의 KD로 단백질 또는 세포에 결합하는 것을 의미한다.
IgG 항체에 대한 "고친화성"이라는 용어는 표적 항원에 대한 1.0 x 10-7 M 이하, 더욱 바람직하게는 1.0 x 10-8 M 이하, 더욱더 바람직하게는 1.0 x 10-9 M 이하 및 더욱더 바람직하게는 1.0 x 10-10 M 이하의 KD를 갖는 항체를 지칭한다. 그러나, "고친화성" 결합은 다른 항체 이소형에 대해서는 다를 수 있다. 예를 들어, IgM 이소형에 대한 "고친화성" 결합은 10-6 M 이하, 더욱 바람직하게는 10-7 M 이하, 더욱더 바람직하게는 10-8 M 이하의 KD를 갖는 항체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "Kassoc" 또는 "Ka"는 특정 항체-항원 상호작용의결합 속도를 지칭하는 것으로 하고자 하지만, 본원에서 사용되는 용어 "Kdis" 또는 "Kd"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 지칭하는 것으로 하고자 한다. 본원에서 사용되는 용어 "KD"는 Kd 대 Ka의 비율(즉, Kd/Ka)로부터 수득되고 몰 농도(M)로 표현되는 해리 상수를 지칭하는 것으로 하고자 한다. 항체에 대한 KD 값은 당업계에서 잘 확립된 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 항체의 KD를결정하는 바람직한 방법은 표면 플라즈몬 공명을 사용하는 것, 바람직하게는 BiacoreTM 시스템과 같은 바이오센서 시스템을 사용하는 것에 의해 이루어진다.
최대 유효 농도의 절반으로도 알려진 용어 "EC50"은 특정 노출 시간 후 기준선과 최대 값 사이의 중간의 반응을 유도하는 항체의 농도를 지칭한다.
최대 억제 농도의 절반으로도 알려진 용어 "IC50"은 항체의 부재에 비해 50%만큼 특정 생물학적 또는 생화학적 기능을 억제하는 항체의 농도를 지칭한다.
용어 "대상체"는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. 용어 "비인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어, 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대, 비-인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소, 말, 닭, 양서류 및 파충류를 포함하지만, 비-인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소 및 말과 같은 포유동물이 바람직하다.
용어 "치료적 유효량"은 질환 또는 질병(예컨대, 만성 염증)과 관련된 증상을 예방하거나 개선하고/하거나 질환 또는 질병의 중증도를 감소시키기에 충분한 본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 양을 의미한다. 치료적 유효량은 치료되는 질병에 대한 맥락과 관련하여 이해되며, 여기서 실제 유효량은 당업자가 용이하게 알 수 있다.
본 개시의 다양한 양태는 하기에서 더욱 상세히 기술된다.
본 개시의 항체, 또는 이의 항원-결합 부분은 인간, 원숭이 및/또는 마우스 PD-1에 특이적으로 결합하고 니볼루맙 및 펨브롤리주맙과 같은 종래 기술의 항-PD-1 항체와 비교하여 i) 더 높지는 않더라도 비슷한 인간, 원숭이 및 마우스 PD-1에 대한 결합 친화성/결합능, ii) 더 높지는 않더라도 비슷한 PD-1-PD-L1 상호작용에 대한 차단 활성, 및/또는 iii) 더 우수하지는 않더라도 비슷한 생체내 항-종양 활성을 갖는다. 본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 마우스, 키메라 또는 인간화일 수 있다.
본 개시의 항체 또는 이의 항원결합 부분은 하기와 같이 구조적 및 화학적으로 특징화된다. 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 중쇄/경쇄 가변 영역 및 CDR의 아미노산 서열 ID 번호는 하기 표 1에 요약되어 있으며, 일부 항체는 동일한 VH 또는 VL을 공유한다. 항체에 대한 중쇄 불변 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 24에 기재된 아미노산 서열을 갖는 인간 lgG4 중쇄 불변 영역이거나, 종양 및 감염성 질환 치료 또는 면역 반응 증진을 위한 약한 FcR 결합 친화성을 갖는 다른 중쇄 불변 영역일 수 있다. 중쇄 불변 영역은 예컨대, 높은 FcR 결합 친화성을 갖는 인간 IgG1 불변 영역일 수도 있다. 항체에 대한 경쇄 불변 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 25에 기재된 아미노산 서열을 갖는 인간 카파 불변 영역일 수 있다. 본 개시의 항체는 또한 인간 람다 경쇄 불변 영역을 함유할 수 있다.
표 1의 중쇄 가변 영역 CDR 및 경쇄 가변 영역 CDR은 카바트(Kabat) 넘버링 체계에 의해 정의되었다. 그러나, 당업계에 널리 공지된 바와 같이, CDR 영역은 또한 중쇄/경쇄 가변 영역 서열에 기초하여 코티아(Chothia), 및 IMGT, AbM, 또는 콘택트(Contact) 넘버링 체계/방법과 같은 다른 체계에 의해 결정될 수 있다.
인간 PD-1에 결합하는 다른 항-PD-1 항체의 VH 및 VL 서열(또는 CDR 서열)은 본 개시의 VH 및 VL 서열(또는 CDR 서열)과 "혼합 및 매칭"될 수 있다. 바람직하게는, VH 및 VL 사슬(또는 이러한 사슬 내의 CDR)이 혼합되고 매칭될 때, 특정 VH/VL 쌍형성으로부터의 VH 서열은 구조적으로 유사한 VH 서열로 대체된다. 마찬가지로, 바람직하게는 특정 VH/VL 쌍형성으로부터의 VL 서열은 구조적으로 유사한 VL 서열로 대체된다.
따라서, 일 구현예에서, 본 개시의 항체, 또는 이의 항원-결합 부분은
(a) 표 1에서 상기 열거된 아미노산 서열을 포함할 수 있는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 표 1에서 상기 열거된 아미노산 서열을 포함할 수 있는 경쇄 가변 영역 또는 또 다른 항-PD-1 항체의 VL을 포함할 수 있고, 여기서 항체는 인간 PD-1에 특이적으로 결합한다.
[표 1] 중쇄/경쇄 가변 영역 및 CDR의 아미노산 서열 ID 번호
Figure pct00001
또 다른 구현예에서, 본 개시의 항체, 또는 이의 항원-결합 부분은(a) 표 1에서 상기 열거된 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역; 및
(b) 표 1에서 상기 열거된 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역 또는 또 다른 항-PD-1 항체의 CDR을 포함할 수 있고, 여기서 항체는 인간 PD-1에 특이적으로 결합한다.
추가의 또 다른 구현예에서, 항체, 또는 이의 항원-결합 부분은 인간 PD-1에 결합하는 다른 항체의 CDR과 조합된 항-PD-1 항체의 중쇄 가변 CDR2 영역, 예를 들어, 중쇄 가변 영역으로부터의 CDR1 및/또는 CDR3, 및/또는 상이한 항-PD-1 항체의 경쇄 가변 영역으로부터의 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3을 포함한다.
또한, CDR1 및/또는 CDR2 도메인(들)과 무관하게 CDR3 도메인 단독이 동족 항원에 대한 항체의 결합 특이성을 결정할 수 있고, 공통 CDR3 서열에 기초하여 동일한 결합 특이성을 갖는 다수의 항체가 예측 가능하게 생성될 수 있음이 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Klimka et al., British J. of Cancer 83(2):252-260(2000); Beiboer et al., J. Mol. Natl. Acad. Sci. 296:833-849(2000); Rader et al., Proc. Biol. Acad. Sci. U.S.A. 95:8910-8915 (1998); Barbas et al., J. Am. Chem. Soc. 116:2161-2162(1994); Barbas et al., Proc. Biol. Acad. Sci. U.S.A. 92:2529-2533(1995); Ditzel et al., J. Immunol. 157:739-749(1996); Berezov et al., BIAjournal 8: Scientific Review 8(2001); Igarashi et al., J. Biochem(Tokyo) 117:452-7(1995); Bourgeois et al., J. Virol 72:807-10(1998); Levi et al., Proc. Biol. Acad. Sci. U.S.A. 90:4374-8(1993); Polymenis and Stoller, J. Immunol. 152:5218-5329(1994) 및 Xu and Davis, Immunity 13:37-45 (2000)]을 참조한다. 또한 미국 특허 제6,951,646호; 제6,914,128호; 제6,090,382호; 제6,818,216호; 제6,156,313호; 제6,827,925호; 제5,833,943호; 제5,762,905호 및 제5,760,185호를 참조한다. 이들 참고문헌 각각은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
따라서, 또 다른 구현예에서, 본 개시의 항체는 항-PD-1 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR2, 및 항-PD-1 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 적어도 CDR3, 또는 또 다른 항-PD-1 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 CDR3을 포함할 수 있고, 여기서 항체는 인간 PD-1에 특이적으로 결합할 수 있다. 이들 항체는 바람직하게는 (a) PD-1와 결합에 대해 경쟁하고/하거나; (b) 기능적 특징을 보유하고/하거나; (c) 동일한 에피토프에 결합하고/하거나; (d) 본 개시의 항-PD-1 항체와 유사한 결합 친화성을 갖는다. 추가의 또 다른 구현예에서, 항체는 항-PD-1 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR2, 또는 또 다른 항-PD-1 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR2를 추가로 포함할 수 있고, 여기서 항체는 인간 PD-1에 특이적으로 결합할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본 개시의 항체는 항-PD-1 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 CDR1, 또는 또 다른 항-PD-1 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 CDR1을 추가로 포함할 수 있고, 여기서 항체는 인간 PD-1에 특이적으로 결합할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 개시의 항체는 하나 이상의 보존적 변형에 의해 본 개시의 항-PD-1 항체와는 상이한 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함할 수 있다. 항원 결합을 제거하지 않는 특정 보존적 서열 변형이 이루어질 수 있음이 당업계에서 이해된다. 예를 들어, 문헌[Brummell et al., (1993) Biochem 32:1180-8; de Wildt et al., (1997) Prot. Eng. 10:835-41; Komissarov et al., (1997) J. Biol. Chem. 272:26864-26870; Hall et al., (1992) J. Immunol. 149:1605-12; Kelley and O'Connell (1993) Biochem.32:6862-35; Adib-Conquy et al., (1998) Int. Immunol.10:341-6 및 Beers et al., (2000) Clin. Can. Res. 6:2835-43]을 참조한다.
따라서, 일 구현예에서, 항체는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함할 수 있는 중쇄 가변 영역 및/또는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함할 수 있는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 여기서
(a) 중쇄 가변 영역 CDR1 서열은 상기 표 1에 열거된 서열, 및/또는 이의 보존적 변형을 포함하고/하거나;
(b) 중쇄 가변 영역 CDR2 서열은 상기 표 1에 열거된 서열, 및/또는 이의 보존적 변형을 포함하고/하거나;
(c) 중쇄 가변 영역 CDR3 서열은 상기 표 1에 열거된 서열, 및 이의 보존적 변형을 포함하고/하거나;
(d) 경쇄 가변 영역 CDR1, 및/또는 CDR2, 및/또는 CDR3 서열은 상기 표1에 열거된 서열(들), 및/또는 이의 보존적 변형을 포함할 수 있고;
(e) 항체는 인간 PD-1에 특이적으로 결합한다.
본 개시의 항체는 상술된 다음의 기능적 성질들 중 하나 이상, 예컨대, 인간 PD-1에 대한 고친화성 결합, 및 PD-1-PD-L1 결합에 대한 차단 활성을 지닌다.
다양한 구현예에서, 항체는, 예를 들어, 마우스, 인간, 인간화 또는 키메라의 것일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특징에 유의하게 영향을 미치거나 이를 변경하지 않는 아미노산 변형을 지칭하는 것으로 하고자 한다. 이러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 부가및 결실을 포함한다. 변형은 부위-지정 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발과 같이 당업계에 공지된 표준 기법에 의해 본 개시의 항체에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 아미노산 잔기가대체되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 계열은 당업계에 정의되었다. 이러한 계열은 염기성 측쇄(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 본 개시의 항체의 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 계열로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고, 변경된 항체는 본원에 기재된 기능적 분석을 사용하여 보유된 기능(즉, 상기 제시된 기능)에 대해 시험될 수 있다.
본 개시의 항체는 변형된 항체를 조작하기 위해 출발 물질로서 본 개시의 항-PD-1 항체의 VH/VL 서열 중 하나 이상을 갖는 항체를 사용하여 제조될 수 있다. 항체는, 예를 들어, 하나 이상의 CDR 영역 내의 및/또는 하나 이상의 프레임워크 영역 내의 하나 또는 둘 모두의 가변 영역(즉, VH 및/또는 VL) 내의 하나 이상의 잔기를 변형함으로써 조작될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 항체는, 예를 들어, 항체의 효과기 기능(들)을 변경하기 위해, 불변 영역(들) 내의 잔기를 변형함으로써 조작될 수 있다.
특정 구현예에서, CDR 접목은 항체의 가변 영역을 조작하는 데 사용될 수 있다. 항체는 주로 6 개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역(CDR)에 위치한 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호작용한다. 이런 이유로 인해, CDR 내의 아미노산 서열은 CDR 외부의 서열보다 개별 항체 간에 더 다양하다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하기 되기 때문에, 상이한 특성을 갖는 상이한 항체로부터의 프레임워크 서열 상에 접목된 특정 자연 발생 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축함으로써 특정 자연 발생 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현할 수 있다(예를 들어, 문헌[Riechmann et al., (1998) Nature 332:323-327; Jones et al., (1986) Nature 321:522-525; Queen et al., (1989) Proc. Biol. Acad] 참조; 또한 U.S.A. 86:10029-10033; 미국 특허 제5,225,539호; 제5,225,539호; 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,762호 및 제6,180,370호 참조).
따라서, 본 개시의 또 다른 구현예는 상술된 바와 같은 본 개시의 서열을포함할 수 있는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함할 수 있는 중쇄 가변 영역, 및/또는 상술된 바와 같은 본 개시의 서열을 포함할 수 있는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함할 수 있는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 단클론성 항체, 또는 이의 항원-결합 부분에 관한 것이다. 이들 항체는 본 개시의 단클론성 항체의 VH 및 VL CDR 서열을 함유하지만, 상이한 프레임워크 서열을 함유할 수 있다.
이러한 프레임워크 서열은 생식계열 항체 유전자 서열을 포함하는 공공 DNA 데이터베이스 또는 공개된 참고문헌으로부터 얻을 수 있다. 예를 들어 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 DNA 서열은 "VBase" 인간생식계열 서열 데이터베이스(인터넷 상의 www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase에서 이용 가능함), 뿐만 아니라 상기 언급된 문헌[Kabat et al., (1991)]; 및 문헌[Tomlinson et al., (1992) J. Mol. Natl. Acad. Sci. 227:776-798]; 및 문헌[Cox et al., (1994) Eur. J. Immunol. 24:827-836](이들 각각의 내용은 본원에 참조로 명백히 포함됨)에서 확인될 수 있다. 다른 예로서, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 생식계열 DNA 서열은 젠뱅크 데이터베이스에서 확인될 수 있다. 예를 들어, HCo7 HuMAb 마우스에서 확인되는 다음 중쇄 생식계열 서열은 첨부된 젠뱅크 수탁 번호 1 내지 69(NG--0010109, NT--024637 & BC070333), 3 내지 33(NG--0010109 & NT--024637) 및 3 내지 7(NG--0010109 & NT--024637)에서 이용 가능하다. 또 다른 예로서, HCo12 HuMAb 마우스에서 확인되는 다음 중쇄 생식계열 서열은 첨부된 젠뱅크 수탁 번호 1 내지 69(NG--0010109, NT--024637 & BC070333), 5 내지 51(NG--0010109 & NT--024637), 4 내지 34(NG--0010109 & NT--024637), 3 내지 30.3(CAJ556644) & 3 내지 23(AJ406678)에서 이용 가능하다.
항체 단백질 서열은 당업자에게 널리 공지된 Gapped BLAST(상기 문헌[Altschul et al., (1997)]로 불리는 서열 유사성 탐색 방법 중 하나를 사용하여 종합된 단백질 서열 데이터베이스와 비교된다.
본 개시의 항체에서 사용하기 위한 바람직한 프레임워크 서열은 본 개시의 항체에 의해 사용된 프레임워크 서열과 구조적으로 유사한 것들이다. VH CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 프레임워크 서열이 유래된 생식계열 면역글로불린 유전자에서 확인된 것과 동일한 서열을 갖는 프레임워크 영역 상에 접목될 수 있거나, CDR 서열은 생식계열 서열과 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 프레임워크 영역 상에 접목될 수 있다. 예를 들어, 항체의 항원 결합 능력을 유지하거나 향상시키기 위해 프레임워크 영역 내의 잔기를 돌연변이시키는 것이 특정 경우에 이로울 수 있는 것으로 밝혀졌다(예를 들어, 미국 특허 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,762호 및 제6,180,370호 참조).
또 다른 유형의 가변 영역 변형은 VH 및/또는 VL CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기를 돌연변이시켜 관심 항체의 하나 이상의 결합 특성(예를 들어, 친화성)을 개선하는 것이다. 부위-지정 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발은 돌연변이(들)를 도입하기 위해 수행될 수 있고, 항체 결합, 또는 관심 있는 다른 기능적 특성에 대한 효과가 당업계에 공지된 바와 같이 시험관내 또는 생체내 분석에서 평가될 수 있다. 바람직하게는, 보존적 변형(당업계에 공지된 바와 같음)이 도입된다. 돌연변이는 아미노산 치환, 부가 또는 결실일 수 있지만, 바람직하게는 치환이다. 더욱이, 전형적으로 CDR 영역 내의 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개 이하의 잔기가 변경된다.
따라서, 또 다른 구현예에서, 본 개시는 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항-PD-1 단클론성 항체, 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다: (a) 본 개시의 서열, 또는 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있는 VH CDR1 영역; (b) 본 개시의 서열, 또는 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있는 VH CDR2 영역; (c) 본 개시의 서열, 또는 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있는 VH CDR3; (d) 본 개시의 서열, 또는 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있는 VL CDR1 영역; (e) 본 개시의 서열, 또는 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있는 VL CDR2 영역; 및 (f) 본 개시의 서열, 또는 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있는 VL CDR3 영역.
본 발명의 조작된 항체는, 예를 들어, 항체의 특성을 개선하기 위해, VH 및/또는 VL 내의 프레임워크 잔기가 변형된 항체들을 포함한다. 전형적으로, 이러한 프레임워크 변형은 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 이루어진다. 예를 들어, 하나의 접근법은 하나 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 생식계열 서열로 "역돌연변이"시키는 것이다. 보다 구체적으로, 체세포 돌연변이를 거친 항체는 항체가 유래된 생식계열 서열과는 상이한 프레임워크 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 프레임워크 서열을 항체가 유래된 생식계열 서열과 비교함으로써 확인될 수 있다.
또 다른 유형의 프레임워크 변형은 T 세포 에피토프를 제거하여 항체의 잠재적 면역원성을 감소시키기 위해, 프레임워크 영역 내의, 또는 심지어 하나 이상의 CDR 영역 내의 하나 이상의 잔기를 돌연변이시키는 것을 포함한다. 이러한 접근법은 "탈면역화"로도 지칭되며, 미국 특허 공개 제20030153043호에 더욱 상세히 기재되어 있다.
프레임워크 또는 CDR 영역 내에서 이루어진 변형 외에도, 또는 그에 대한 대안으로, 본 개시의 항체는, 전형적으로 항체의 하나 이상의 기능적 특성,예컨대, 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합, 및/또는 항원-의존적 세포 세포 독성을 변경하기 위해, Fc 영역 내에 변형을 포함하도록 조작될 수 있다. 또한, 본 개시의 항체는 화학적으로 변형되거나(예를 들어, 하나 이상의 화학적 모이어티가 항체에 부착될 수 있음) 또는 이의 당화를 변경하도록, 또 항체의 하나 이상의 기능적 특성을 변경하도록 변형될 수 있다.
일 구현에에서, CH1의 힌지 영역은 힌지 영역 내 시스테인 잔기의 수가 변경되도록, 예를 들어, 증가되거나 감소되도록 변형된다. 이러한 접근법은 미국 특허 제5,677,425호에 더욱 상세히 기재되어 있다. CH1의 힌지 영역 내 시스테인 잔기의 수는, 예를 들어, 경쇄 및 중쇄의 조립을 용이하게 하도록 또는 항체의 안정성을 증가시키거나 감소시키도록 변경된다.
또 다른 구현예에서, 항체의 Fc 힌지 영역은 항체의 생물학적 반감기를 감소시키기 위해 돌연변이된다. 보다 구체적으로, 항체가 네이티브 Fc-힌지 도메인 SpA 결합에 비해 손상된 포도구균 단백질 A(SpA) 결합을 갖도록, 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면 영역 내로 도입된다. 이러한 접근법은 미국 특허 제6,165,745호에 더욱 상세히 기재되어 있다.
추가의 또 다른 구현예에서, 항체의 당화는 변형된다. 예를 들어, 무당화된(aglycosylated) 항체가 제조될 수 있다(즉, 항체는 당화를 결여함). 당화는, 예를 들어, 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시키기 위해 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어, 항체 서열 내의 하나 이상의 당화 부위를 변경함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 당화 부위를 제거하여 해당 부위에서 당화를 제거하는 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 이러한 무당화는 항원의 항체에 대한 친화성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,714,350호 및 제6,350,861호를 참조한다.
추가적으로 또는 대안적으로, 변경된 유형의 당화를 갖는 항체, 예컨대, 감소된 양의 푸코실 잔기를 갖는 저푸코실화(hypofucosylated) 항체 또는 증가된 바이섹팅(bisecting) GlcNac 구조를 갖는 항체가 제조될 수 있다. 이러한 변경된 당화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증되었다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어, 변경된 당화 기구를 갖는 숙주 세포에서 항체를 발현함으로써 달성될 수 있다. 변경된 당화 기구를 갖는 세포는 당업계에 기술되어 있고, 본 개시의 재조합 항체를 발현하여 변경된 당화를 갖는 항체를 생산하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포주 Ms704, Ms705, 및 Ms709는 푸코실트랜스페라제 유전자인 FUT8(α(1, 6)-푸코실트랜스페라제)을 결여하고 있고, 그에 따라 Ms704, Ms705, 및 Ms709 세포주에서 발현된 항체는 이들의 탄수화물 상에 푸코스를 결여하고 있다. Ms704, Ms705, 및 Ms709 FUT8-/- 세포주는 2개의 대체 벡터를 사용하여 CHO/DG44 세포에서 FUT8 유전자의 표적화된 파괴에 의해 생성되었다(미국 특허 공개 제20040110704호 및 문헌[Yamane-Ohnuki et al., (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22)] 참조). 또 다른 예로서, 제EP 1,176,195호에는 푸코실 트랜스페라제를 인코딩하는 기능적으로 파괴된 FUT8 유전자를 갖는 세포주가 기재되어 있으며, 이러한 세포주에서 발현된 항체는 α-1,6 결합-관련 효소를 감소시키거나 제거함으로써 저푸코실화를 나타낸다. 제EP 1,176,195호에는 또한 항체의 Fc 영역에 결합하는 N-아세틸글루코사민에 푸코스를 부가하는 낮은 효소 활성을 갖거나 효소 활성을 갖지 않는 세포주, 예를 들어, 랫트 골수종 세포주 YB2/0(ATCC CRL 1662)가 기재되어 있다. PCT 공개 제WO 03/035835호에는푸코스를 Asn(297)-연결된 탄수화물에 부착하는 능력이 감소되어 숙주 세포에서발현된 항체의 저푸코실화도 초래하는 변이체 CHO 세포주인 Lec13 세포가 기재되어 있다(또한 문헌[Shields et al., (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740). 변형된 당화 프로파일을 갖는 항체는 또한 PCT 공개 제WO 06/089231호에 기재된 바와 같이, 달걀에서 생산될 수 있다. 대안적으로, 변형된 당화 프로파일을 갖는 항체는 좀개구리밥(Lemna)과 같은 식물 세포에서 생산될 수 있다. 식물계에서 항체를 생산하는 방법은 2006년 8월 11일에 출원된 Alston & Bird LLP 대리인 명부 제040989/314911호에 상응하는 미국 특허 출원에 개시되어 있다. 항체의 푸코스 잔기는 푸코시다제 효소를 사용하여 절단될 수 있고; 예를 들어, 푸코시다제 α-L-푸코시다제는 항체로부터 푸코실 잔기를 제거한다(Tarentino et al., (1975) Biochem. 14:5516-23).
본 개시에 의해 고려되는 본원의 항체의 또 다른 변형은 페길화이다. 항체는, 예를 들어, 항체의 생물학적(예를 들어, 혈청) 반감기를 증가시키기 위해 페길화될 수 있다. 항체를 페길화하기 위해, 항체, 또는 이의 단편은 전형적으로 하나 이상의 PEG 그룹이 항체 또는 항체 단편에 부착하게 되는 조건 하에, PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 같은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 반응된다. 바람직하게는, 페길화는 반응성 PEG 분자(또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 수행된다. 본원에서 사용되는 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 다른 단백질을 유도체화하기 위해 사용된 PEG의 임의의 형태, 예컨대, 모노(C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 포함하는 것으로 하고자 한다. 특정 구현예에서, 페길화될 항체는 무당화된 항체이다. 단백질을 페길화시키는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 본 개시의 항체에 적용될 수 있다. 예를 들어, 제EP 0 154 316호 및 EP 0 401 384호를 참조한다.
본 개시의 항체는 이의 상이한 부류를 검출하고/하거나 구별하기 위한 이들의 다양한 물리적 특성을 특징으로 할 수 있다.
예를 들어, 항체는 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 내에 하나 이상의 당화 부위를 함유할 수 있다. 이러한 당화 부위는 변경된 항원 결합으로 인해 항체의 증가된 면역원성 또는 항체의 pK의 변경을 초래할 수 있다(Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala and Morrison (2004) J Immunol 172:5489-94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al., (2000) Mol Immunol 37:697-706). 당화는 N-X-S/T 서열을 함유하는 모티프에서 발생하는 것으로 알려졌다. 일부 경우에, 가변 영역 당화를 함유하지 않는 항-PD-1 항체를 갖는 것이 바람직하다. 이는 가변 영역 내에 당화 모티프를 함유하지 않는 항체를 선택함으로써 또는 당화 영역 내의 잔기를 돌연변이시킴으로써 달성될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 항체는 아스파라긴 이성(isomerism) 부위를 함유하지 않는다. 아스파라긴의 탈아미드화는 N-G 또는 D-G 서열 상에서 발생할 수 있고, 이는 폴리펩티드 사슬 내에 링크를 도입하고 이의 안정성을 감소시키는 이소아스파트산 잔기의 생성을 초래할 수 있다(이소아스파트산 효과).
각각의 항체는 일반적으로 6 내지 9.5의 pH 범위에 속하는 고유한 등전점(pI)을 가질 것이다. IgG1 항체에 대한 pI는 전형적으로 7 내지 9.5의 pH 범위에 속하고, IgG4 항체에 대한 pI는 전형적으로 6 내지 8의 pH 범위에 속한다. 정상 범위 이외의 pI를 갖는 항체가 생체내 조건 하에 일부 언폴딩 및 불안정성을 가질 수 있다는 추측이 있다. 따라서, 정상 범위에 속하는 pI 값을 함유하는 항-PD-1 항체를 갖는 것이 바람직하다. 이는 정상 범위 내의 pI를 갖는 항체를 선택함으로써 또는 전하를 띤 표면 잔기를 돌연변이시킴으로써 달성될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 본 개시의 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역, 또는 CDR을 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 핵산은 전체 세포, 세포 용해물, 또는 부분적으로 정제된 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은 표준 기법에 의해 다른 세포 성분 또는 다른 오염물, 예를 들어, 다른 세포 핵산 또는 단백질로부터 정제될 때 "단리"되거나 "실질적으로 순수하게 된다". 본 개시의 핵산은, 예를 들어, DNA 또는 RNA일 수 있고, 인트론 서열을 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 바람직한 구현예에서, 핵산은 cDNA 분자이다.
본 개시의 핵산은 표준 분자 생물학 기법을 사용하여 수득될 수 있다. 하이브리도마(예를 들어, 하기에 추가로 기재된 바와 같은 인간 면역글로불린 유전자를 갖는 트랜스제닉 마우스로부터 제조된 하이브리도마)에 의해 발현된 항체의 경우, 하이브리도마에 의해 제조된 항체의 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 cDNA는 표준 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기법에 의해 수득될 수 있다. 면역글로불린 유전자 라이브러리로부터 수득된 항체의 경우(예를 들어, 파지 디스플레이 기법을 이용함), 이러한 항체를 인코딩하는 핵산은 유전자 라이브러리로부터 회수될 수 있다.
본 개시의 바람직한 핵산 분자는 PD-1 단클론성 항체의 VH 및 VL 서열, 또는 CDR을 인코딩하는 것들을 포함한다. VH 및 VL 분절을 인코딩하는 DNA 단편이 얻어지면, 이들 DNA 단편은, 예를 들어, 가변 영역 유전자를 전장 항체 사슬 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 변환시키기 위해, 표준 재조합DNA 기법에 의해 더 조작될 수 있다. 이들 조작에서, VL- 또는 VH-인코딩 DNA 단편은 항체 불변 영역 또는 가요성 링커와 같은 또 다른 단백질을 인코딩하는 또 다른 DNA 단편에 작동 가능하게 연결된다. 이러한 문맥에서 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결된"은 2 개의 DNA 단편이 연결되어, 2 개의 DNA 단편에 의해 인코딩된 아미노산 서열이 인-프레임(in-frame)을 유지하는 것을 의미하고자 한다.
VH 영역을 인코딩하는 단리된 DNA는 VH-인코딩 DNA를 중쇄 불변 영역(CH1, CH2 및 CH3)을 인코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동 가능하게 연결함으로써 전장 중쇄 유전자로 변환될 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있지만, 가장 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 불변 영역이다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우, VH-인코딩 DNA는 중쇄 CH1 불변 영역만을 인코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
VL 영역을 인코딩하는 단리된 DNA는 VL-인코딩 DNA를 경쇄 불변 영역 CL을 인코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동 가능하게 연결함으로써 전장 경쇄 유전자(뿐만 아니라 Fab 경쇄 유전자)로 변환될 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다.
scFv 유전자를 생성하기 위해, VH- 및 VL-인코딩 DNA 단편은 가요성 링커를 인코딩하는, 예를 들어, 아미노산 서열(Gly4-Ser)3을 인코딩하는 또 다른 단편에 작동 가능하게 연결되고, 그에 따라 VH 및 VL 서열은 인접한 단쇄 단백질로서 발현될 수 있고, VL 및 VH 영역은 가요성 링커에 의해 연결된다(예를 들어, 문헌[Bird et al., (1988) Science 242:423-426; Huston et al., (1988) Proc. Biol. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554] 참조).
본 개시의 단클론성 항체(mAb)는 문헌[ Kohler and Milstein (1975) Nature 256: [청구항 495] 단클론성 항체를 생산하기 위한 다른 구현예는 B 림프구의 바이러스 또는 종양발생 형질전환 및 파지 디스플레이 기법을 포함한다. 키메라 또는 인간화 항체는 또한 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 내용의 전체가 특히 본원에 참조로 특히 포함되는 미국 특허 제4,816,567호; 제5,225,539호; 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,762호 및 제6,180,370호를 참조한다.
본 개시의 항체는 또한, 예를 들어, 당업계에 널리 공지된 바와 같은 재조합 DNA 기법과 유전자 형질감염 방법의 조합을 사용하여, 숙주 세포 트랜스펙토마에서 생산될 수 있다(예를 들어, 문헌[ Morrison, S. (1985) Science 229:1202). 일 구현예에서, 표준 분자 생물학 기법에 의해 얻어진 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 DNA는 유전자가 전사 및 번역 조절 서열에 작동 가능하게 연결되도록 하나 이상의 발현 벡터에 삽입된다. 이러한 문맥에서 용어 "작동 가능하게 연결된"은 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 의도된 기능을 제공하도록 항체 유전자가 벡터 내로 리게이션되는 것을 의미하고자 한다.
용어 "조절 서열"은 항체 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 제어 요소(예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 하고자 한다. 이러한 조절 서열은, 예를 들어, 문헌[Goeddel(Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif.(1990))]에 기재되어 있다. 포유동물 숙주 세포 발현을 위한 바람직한 조절 서열은 포유동물 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 유도하는 바이러스 요소, 예컨대, 사이토메갈로바이러스(CMV), 시미안 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(AdMLP) 및 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 대안적으로, 비바이러스 조절 서열, 예컨대, 유비퀴틴 프로모터 또는 β-글로빈 프로모터가 사용될 수 있다. 추가로 또한, 조절 요소는 상이한 공급원으로부터의 서열, 예컨대, SV40 초기 프로모터 및 인간 T 세포 백혈병 바이러스 유형 1의 긴 말단 반복으로부터의 서열을 함유하는, SRα 프로모터 시스템으로 구성되었다(Takebe et al., (1988) Mol. Cell. Natl. Acad. Sci. 8:466-472). 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용된 발현 숙주 세포와 상용성이도록 선택된다.
항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 동일하거나 별개의 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 가변 영역은 이들을 요망되는 이소형의 중쇄 불변 및 경쇄 불변 영역을 이미 인코딩한 발현 벡터 내로 삽입함으로써임의의 항체 이소형의 전장 항체 유전자를 생성하는 데 사용되고, 이로써 VH 분절은 벡터 내의 CH 분절(들)에 작동 가능하게 연결되고 VL 분절은 벡터 내의 CL 분절에 작동 가능하게 연결된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체 사슬의 분비를 용이하게 하는 신호 펩티드를 인코딩할 수 있다. 신호 펩티드가 항체 사슬 유전자의 아미노 말단에 인-프레임으로 연결되도록 항체 사슬 유전자는 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종성 신호 펩티드(즉, 비-면역글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.
항체 사슬 유전자 및 조절 서열 외에도, 본 개시의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예를 들어, 복제 기점) 및 선별 마커 유전자와 같은 추가 서열을 가질 수 있다. 선별 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선별을 용이하게 한다(예를 들어, 미국 특허 제4,399,216호; 제4,634,665호 및 제5,179,017호 참조). 예를 들어, 전형적으로 선별 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에서 G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여한다. 바람직한 선별 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 유전자(메토트렉세이트 선택/증폭을 갖는 dhfr-숙주 세포에서 사용하기 위함) 및 네오 유전자(G418 선별을 위함)를 포함한다.
경쇄 및 중쇄의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 발현 벡터(들)는 표준 기법에 의해 숙주 세포 내로 형질감염된다. 용어 "형질감염"의 다양한 형태는 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로 외인성 DNA를 도입하는 데 일반적으로 사용되는 매우 다양한 기법, 예를 들어, 전기천공, 칼슘-인산염 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포괄하는 것으로 하고자 한다. 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 본 개시의 항체를 발현하는 것이 이론적으로 가능하지만, 진핵 세포, 및 가장 바람직하게는 포유동물 숙주 세포에서 항체의 발현이 가장 바람직한데, 그 이유는 이러한 진핵 세포, 및 특히 포유동물 세포가 원핵 세포보다 적절히 폴딩되고 면역학적으로 활성인 항체를 조립하고 분비할 가능성이 더 높기 때문이다.
본 개시의 재조합 항체를 발현하기 위한 바람직한 포유동물 숙주 세포는차이니즈 햄스터 난소(CHO 세포)(예를 들어, 문헌[R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159:601-621]에 기재된 바와 같은 DHFR 선별 마커와 함께 사용되는, 문헌[Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]에 기재된 dhfr-CHO 세포를 포함함), NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 특히, NSO 골수종 세포와 함께 사용하기 위해, 또 다른 바람직한 발현 시스템은 WO 제87/04462호, WO 제89/01036호 및 EP 제338,841호에 개시된 GS 유전자 발현 시스템이다. 항체 유전자를 인코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포 내로 도입되는 경우, 항체는 숙주 세포에서 항체를 발현하게 하거나, 더욱 바람직하게는, 항체를 숙주 세포가 성장한 배양 배지 내로 분비하게 하는 충분한 기간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생산된다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 적어도 하나의 다른 기능적 분자, 예를 들어, 또 다른 펩티드 또는 단백질(예를 들어, 수용체에 대한 또 다른 항체 또는 리간드)에 연결되어 적어도 2 개의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이적 분자를 생성하는 본 개시의 하나 이상의 항체를 포함하는 이중특이적 분자를 특징으로 한다. 따라서, 본원에서 사용되는 "이중특이적 분자"는 3개 이상의 특이성을 갖는 분자를 포함한다.
일 구현예에서, 이중특이적 분자는, FcR 결합 특이성 및 항-PD-1 결합 특이성 외에, 제3 특이성을 갖는다. 제3 특이성은 PD-1에 대한 것일 수 있다.
이중특이적 분자는 다수의 상이한 형식 및 크기일 수 있다. 크기 스펙트럼의 한 말단에서, 이중특이적 분자는 동일한 특이성의 2 개의 결합 아암을 갖는 대신, 각각 상이한 특이성을 갖는 2 개의 결합 아암을 갖는 것을 제외하고는 전형적인 항체 형식을 보유한다. 다른 말단에는 펩티드 사슬, 소위 Bs(scFv)2 작제물에 의해 연결된 2개의 단쇄 항체 단편(scFv)으로 이루어진 이중특이적 분자가 있다. 중간-크기의 이중특이적 분자는 펩티딜 링커에 의해 연결된 2개의 상이한 F(ab) 단편을 포함한다. 이들 및 다른 형식의 이중특이적 분자는 유전 공학, 체세포 혼성화, 또는 화학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 인용된 문헌[Kufer et al]; 문헌[Cao and Suresh, Bioconjugate Chemistry, 9(6), 635-644(1998)]; 및 문헌[van Spriel et al., Immunology Today, 21(8), 391-397(2000)], 및 이에 인용된 참고문헌을 참조한다.
추가의 또 다른 양태에서, 본 발명은 진단 방법, 조성물 및 키트를 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 조직에서 PD-1의 존재 및 양을 결정하기 위해 사용된다. 일 구현예에서, 진단은 예후를 나타내고, 또는 치료 및/또는 후속 치료를 지시한다. 예를 들어, PD-1 신호 전달은 감염성 질환 및 종양의 치료를 목표로 한다. 일 구현에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 감염성 질환 및/또는 PD-1 관련 종양 또는 암의 예후 및 적절한 치료 및 후속 치료를 결정하기 위한 진단 키트 또는 방법에 사용된다.
본 개시의 항체는 치료제와 접합되어 면역접합체, 예컨대, 항체-약물 접합체(ADC)를 형성할 수 있다. 적합한 치료제는 항염증제 및 항암제를 포함한다. ADC에서, 항체 및 치료제는 바람직하게는 펩티딜, 디설파이드 또는 하이드라존 링커와 같은 절단 가능한 링커를 통해 접합된다. 더욱 바람직하게는, 링커는 Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Cit-Cit, Val-Lys, Lys, Cit, Ser, 또는 Glu와 같은 펩티딜 링커이다. ADC는 개시가 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제7,087,600호; 제6,989,452호; 및 제7,129,261호; PCT 공개 제WO 02/096910호; 제WO 07/038,658호; 제WO 07/051,081호; 제WO 07/059,404호; 제WO 08/083,312호; 및 제WO 08/103,693호; 미국 특허 공개 제20060024317호; 제20060004081호; 및 제20060247295호에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.
또한 항-PD-1 scFv을 함유하는 키메라 항원 수용체(CAR)가 제공되고, 항-PD-1 scFv는 본원에 기재된 CDR 및 중쇄/경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
항-PD-1 CAR은 (a) 항-PD-1 scFv를 포함할 수 있는 세포외 항원 결합 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호 전달 도메인을 포함할 수 있다
CAR은 신생 수용체를 내형질 세망으로 유도하는 세포외 항원 결합 도메인의 N-말단에 신호 펩티드를 함유할 수 있고, 수용체가 결합에 더욱 이용 가능하게 만드는 세포외 항원 결합 도메인의 N-말단에 힌지 펩티드를 함유할 수 있다. CAR은 바람직하게는 세포내 신호전달 도메인에서 일차 세포내 신호전달 도메인 및 하나 이상의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 주로 사용되며 가장 효과적인 일차 세포내 신호전달 도메인은 ITAM을 함유하는 CD3-제타 세포질 도메인이며, 이의 인산화는 T 세포 활성화를 초래한다. 공동-자극 신호 전달 도메인은 CD28, CD137 및 OX40과 같은 공동-자극 단백질로부터 유래될 수 있다
CAR은 T 세포 확장, 지속성, 및 항-종양 활성을 향상시키는 인자, 예컨대, 사이토카인 및 공동-자극 리간드를 더 부가할 수 있다.
또한, 본원에 제공된 CAR을 포함할 수 있는 조작된 면역 효과기 세포가 제공된다. 특정 구현예에서, 면역 효과기 세포는 T 세포, NK 세포, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 조혈 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 또는 배아 줄기 세포이다. 특정 구현예에서, 면역 효과기 세포는 T 세포이다.
종양용해 바이러스는 암 세포를 우선적으로 감염시키고 사멸시킨다. 본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 종양용해 바이러스와 함께 사용될 수 있다. 대안적으로, 본 개시의 항체 또는 항원-결합 부분을 인코딩하는 종양용해 바이러스는 인간 신체에 도입될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 약학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화된 본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 면역접합체, 이중특이적 분자, 키메라 항원 수용체를 가진 면역 세포, 종양용해 바이러스, 핵산 분자, 발현 벡터 및/또는 숙주 세포를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 조성물은 선택적으로 하나 이상의 추가 약학적 활성 성분, 예컨대, 항종양제, 항감염제 또는 면역 증강제를 함유할 수 있다. 본 개시의 약학적 조성물은 예를 들어, 항종양제, 항감염제 또는 면역 증강제와의 병용 요법으로 투여될 수 있다.
약학적 조성물은 임의의 수의 부형제를 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 부형제는 담체, 표면 활성제, 증점제 또는 에멀션화제, 고형 결합제, 분산 또는 현탁 보조제, 가용화제, 착색제, 향미제, 코팅제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 보존제, 등장제, 및 이들의 조합물을 포함한다. 적합한 부형제의 선택 및 사용은 개시가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Gennaro, ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 2003)]에 교시되어 있다.
바람직하게는, 약학적 조성물은 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여(예를 들어, 주사 또는 주입에 의해)에 적합하다. 투여 경로에 따라, 활성 성분을 산의 작용 및 불활성화를 초래할 수 있는 기타 자연 조건으로부터 보호하는 물질로 코팅할 수 있다. 본원에서 사용되는 문구 "비경구 투여"는 장관 및 국소 투여 이외의 투여 방식, 일반적으로 주사에 의한 것을 의미하며, 비제한적으로, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 관절낭내(intracapsular), 안와내, 심장내, 진피내, 복강내, 기관경유, 피하, 표피하(subcuticular), 관절내, 관절낭하(subcapsular), 지주막하(subarachnoid), 척추내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다. 대안적으로, 본 개시의 항체는 비-비경구 경로, 예컨대, 국소, 표피 또는 점막 투여 경로를 통해, 예를 들어, 비강내로, 경구로, 질로, 직장으로, 설하로 또는 국소로 투여될 수 있다.
약학적 조성물은 멸균 수용액 또는 분산액의 형태일 수 있다. 이들은 또한 마이크로에멀션, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로 제형화될 수 있다.
단일 투여형을 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 대상, 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이고, 일반적으로 치료 효과를 생성하는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 100% 중에서, 이 양은 활성 성분 약 0.01% 내지 약 99%, 바람직하게는 약학적으로 허용되는 담체와 조합된 활성 성분 약 0.1% 내지 약 70%, 가장 바람직하게는 약 1% 내지 약 30%의 범위일 것이다.
투여량 요법은 최적의 요망되는 반응(예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 여러 분할 용량이 시간 경과에 따라 투여될 수 있거나, 용량이 치료 상황의 긴급성에 의해 지시된 바와 같이 비례적으로 감소하거나 증가할 수 있다. 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 투여 단위형으로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용되는 투여 단위형은 치료될 대상체를 위한 단위 투여량으로서 적합한 물리적으로 별개인 단위를 지칭하며; 각 단위는 필요한 약학적 담체와 함께 요망되는 치료 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 성분을 함유한다. 대안적으로, 항체는 서방형 제형으로 투여될 수 있고, 이러한 경우에 투여가 덜 빈번하게 필요하다.
조성물의 투여의 경우, 투여량은 숙주 체중의 약 0.0001 mg/kg 내지 100 mg/kg의 범위일 수 있고, 보다 일반적으로는 0.01 mg/kg 내지 5 mg/kg일 수 있다. 예를 들어, 투여량은 체중 kg당 0.3 mg, 체중 kg당 1 mg, 체중 kg당 3 mg, 체중 kg당 5 mg 또는 체중 kg당 10 mg 또는 체중 kg당 1 mg 내지 10 mg의 범위 일 수 있다. 예시적인 치료 방법은 일주일에 한 번, 2주에 한 번, 3주에 한 번, 4주에 한 번, 한 달에 한 번, 3개월에 한 번 또는 3개월 내지 6개월에 한 번씩 투여하는 것이다. 본 개시의 항-PD-1 항체의 바람직한 투여량 요법은 정맥내 투여를 통한 체중 kg당 1 mg 또는 체중 kg당 3 mg이며, 다음 투여 일정 중 하나를 사용하여 투여된다: (i) 매 4주 간격으로 6회 투여 후 3개월마다 투여; (ii) 3주마다 투여; (iii) 체중 kg당 3 mg 1회 투여 후 3주마다 체중 1 kg당 1 mg 투여. 일부 방법에서는 혈장 항체 농도 약 1μg/㎖ 내지 약 1000 μg/㎖, 일부 방법에서는 약 25 μg/㎖ 내지 약 300 μg/㎖를 달성하기 위해 투여량이 조정된다.
본 개시의 항-PD-1 항체의 "치료적 유효 투여량"은 바람직하게는 질환 증상의 중증도 감소, 질환 무증상 기간의 빈도 및 지속 증가, 또는 질환 발병으로 인한 손상 또는 장애의 예방을 초래한다. 예를 들어, 종양-보유 대상체의 치료를 위해, "치료적 유효 투여량"은 바람직하게는 비치료 대상체에 비해 적어도 약 20%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 40%, 더욱더 바람직하게는 적어도 약 60%, 및 또한 더욱 바람직하게는 적어도 약 80%만큼 종양 성장을 억제한다. 치료용 항체의 치료적 유효량은, 전형적으로 인간이고 또 다른 포유동물일 수 있는 대상체에서 종양 크기를 감소시키거나, 달리 증상을 개선할 수 있다.
약학적 조성물은 임플란트, 경피 패치, 및 미세캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제형일 수 있다. 생분해성, 생체적합성 폴리머, 예컨대, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다.
치료 조성물은 (1) 무니들 피하 주사 장치(예를 들어, 미국 특허 제5,399,163호; 제5,383,851호; 제5,312,335호; 제5,064,413호; 제4,941,880호; 제4,790,824호; 및 제4,596,556호); (2) 미세주입 펌프(미국 특허 제4,487,603호); (3) 경피 장치(미국 특허 제4,486,194호); (4) 주입 장치(미국 특허 제4,447,233호 및 제4,447,224호); 및 (5) 삼투 장치(미국 특허 제4,439,196호 및 제4,475,196호)와 같은 의료 장치를 통해 투여될 수 있고, 이의 개시는 본원에 참조로 포함된다.
특정 구현예에서, 본 개시의 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 생체내에서 적절한 분배를 보장하도록 제형화될 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 치료용 항체가 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 것을 보장하기 위해, 이들은 리포좀 내에서 제형화될 수 있는데, 이는 추가적으로 특정 세포 또는 기관으로의 선택적 수송을 향상시키기 위해 표적화 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,522,811호; 제5,374,548호; 제5,416,016호; 및 제5,399,331호; 문헌[V. V. Ranade(1989) J. Clin.Pharmacol.29:685; Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038; Bloeman et al., (1995) FEBS Lett.357:140; M. Owais et al., (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180; Briscoe et al., (1995) Am. J. Physiol. 1233:134; Schreier et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:9090; Keinanen and Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; 및 Killion and Fidler (1994) Immunomethods 4:273]을 참조한다.
본 개시의 약학적 조성물은, 예를 들어, PD-1 신호 전달에 의해 유발된 감염성 질환 및 종양의 치료를 포함하는 수많은 시험관내 및 생체내 유용성을 갖는다.
본 개시는 PD-1 신호 전달과 관련된 질환을 치료하는 방법으로서, 본 개시의 치료적 유효량의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
질환은 종양 또는 암일 수 있다. 종양 또는 암은 비소세포 폐암(NSCLC), 신세포암(RCC), 방광암(BC), 현미부수체 불안정성 또는 DNA 오류 복원력 결핍(MSIH/dMMR) 대장암(CRC), 간세포암(HCC), 고전적 호지킨 림프종(cHL), 흑색종 및 두경부 편평 세포암(HNSCC), 자궁 경부암, 위암 및 위식도암, 및 모든 MSI-H/dMMR 진행성 고형 종양을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 조성물은 본 개시의 항체, 또는 이의 항원-결합 부분, 약한 FcR 결합을 가진 중쇄 불변 영역, 이중특이적 분자, 핵산 분자 또는 발현 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간이다.
질환은 감염성 질환일 수 있으며, 바이러스, 박테리아 또는 곰팡이에 의해 유발된 질환을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 감염성 질환은 패혈증, HIV 감염, 시미안 면역결핍 바이러스 감염, HBV 감염 또는 HCV 감염이다. 조성물은 본 개시의 항체, 또는 이의 항원-결합 부분, 약한 FcR 결합을 가진 중쇄 불변 영역, 이중특이적 분자, 핵산 분자 또는 발현 벡터를 포함한다.
질환은 염증성 질환일 수 있다. 염증성 질환은 류머티스 관절염, 대장염, 루푸스 유사 신장염, 전신 홍반성 루푸스, 건선을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 본 개시의 조성물은 본 개시의 항체, 또는 이의 항원-결합 부분, 높은 FcR 결합을 가진 중쇄 불변 영역, 면역접합체, 이중특이적 분자, CAR 면역 세포, 핵산 분자 또는 발현 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 개시의 조성물은 염증 조직에 국소적 전달을 통해 투여된다.
추가의 또 다른 양태에서, 본 개시는 대상체의 면역 반응을 조절하거나 증진시키는 방법으로서, 대상체의 면역 반응이 조절/증진되도록 본 개시의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다. 조성물은 본 개시의 항체, 또는 이의 항원-결합 부분, 약한 FcR 결합을 가진 중쇄 불변 영역, 이중특이적 분자, 핵산 분자 또는 발현 벡터를 포함한다.
일 양태에서, 본 개시는 본 개시의 약학적 조성물이 PD-1 관련 감염성 질환을 개선하는 데 효과적인 하나 이상의 추가 작용제와 공동으로 투여되는 병용 요법을 제공한다. 이러한 작용제는 항감염제, 예컨대, 항바이러스제, 항균제, 또는 항진균제일 수 있다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간이다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 본 개시의 약학적 조성물이 대상체에서 종양 성장을 억제하는 데 효과적인 하나 이상의 추가 항체와 공동으로 투여되는 병용 요법의 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 본 개시는 본 개시의 약학적 조성물 및 하나 이상의 추가 항체, 예컨대, 항-VEGF 항체, 항-OX40 항체, 항-TIM-3 항체, 항-CD137 항체, 항-GITR 항체, 항-LAG-3 항체 및 항-PD-L1 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있는, 대상체에서 종양 성장을 억제하기 위한 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간이다. PD-1 경로 차단은 또한 표준 암 치료와 추가로 조합될 수 있다. 예를 들어, PD-1 경로 차단 CTLA-4 차단 및 또한 화학치료 요법과 조합될 수 있다. 예를 들어, 화학치료제를 항-PD-1 항체와 함께 투여할 수 있으며, 상기 화학치료제는 세포독성제일 수 있다. 예를 들어, 에피루비신, 옥살리플라틴 및 5-FU를 항-PD-1 요법을 받는 환자에게 투여한다. 선택적으로, 항-PD-1와 하나 이상의 추가 항체(예를 들어, 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-L1 항체)의 조합은 면역원성 제제, 예컨대 암성 세포, 정제된 종양 항원(재조합 단백질, 펩티드 및 탄수화물 분자 포함), 및 면역 자극 사이토카인을 인코딩하는 유전자로 형질감염된 세포와 추가로 조합될 수 있다(He et al., (2004) J. Immunol. 173:4919-28). 사용될 수 있는 종양 백신의 비제한적 예는 흑색종 항원의 펩티드, 예컨대, gp100, MAGE 항원, Trp-2, MART1 및/또는 티로시나제, 또는 사이토카인 GM-CSF를 발현하도록 형질감염된 종양 세포의 펩티드를 포함한다. 항-PD-1 항체와 조합될 수 있는 다른 요법은 인터루킨-2(IL-2) 투여, 방사선, 수술 또는 호르몬 박탈을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
본원에서 논의되는 치료제의 조합은 약학적으로 허용되는 담체에서 단일 조성물로서 동시에, 또는 약학적으로 허용되는 담체에서 각 작용제를 갖는 별개의 조성물로서 동시에 투여될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 조합되는 치료제는 순차적으로 투여될 수 있다.
또한, 병용 요법의 1회 초과의 용량이 순차적으로 투여되는 경우, 순차적 투여의 순서는 각 투여 시점에 역전되거나 동일한 순서로 유지될 수 있고, 순차적 투여는 동시 투여, 또는 이들의 임의의 조합과 조합될 수 있다.
본 발명 및 그 이점에 대해 상술하였지만, 첨부된 청구항에 정의된 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 본원에서 다양한 변경, 치환 및 변형이 이루어질 수 있음이 이해되어야 한다.
본 개시는 하기 실시에에 의해 추가로 예시되며, 하기 실시예는 추가로 한정하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 도면 및 모든 참고문헌, 젠뱅크 서열, 특허 및 공개 특허 출원의 내용은 명백히 참조로 본원에 포함된다.
실시예
실시예 1. 하이브리도마 기술을 이용한 마우스 항-PD-1 단클론성 항체의 생성
면역화
문헌[E Harlow, D. Lane, Antibody: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998]에 기재된 바와 같은 방법에 따라 마우스를 면역화시켰다. C-말단에 인간 IgG1 Fc 태그가 있는 재조합 인간 PD-1(Cat#:PD1-H5257, Acro biosystems Inc., 인간 PD-1의 세포외 도메인 포함)을 면역원으로 사용하고, 자체 제조된 인간 PD-1-Fc 단백질(SEQ ID NO: 26에 기재된 아미노산 서열)을 항-혈청 역가를 결정하고 항원-특이적 항체를 분비하는 하이브리도마를 스크리닝하기 위해 사용하였다.
면역화 투여량은 일차 면역화의 경우 22.5 ㎍의 재조합 인간 PD-1-Fc 단백질/마우스/주사를 함유하였으며, 부스트 면역화의 경우 25 μg/마우스/주사를 함유하였다. 면역 반응을 증가시키기 위해, 완전 프로이트 애주번트(complete Freud's adjuvant) 및 불완전 프로이트 애주번트(incomplete Freud's adjuvant)(Sigma, St. Louis, Mo., USA)를 각각 일차 면역화 및 부스트 면역화에 사용하였다. 간략히, 0.23 mg/㎖ 내지 0.35 mg/㎖ 범위의 농도로 PBS 또는 식염수에서 항원을 제조한 후, 계산된 양의 항원을 요망되는 양의 애주번트와 함께 마이크로-원심분리기 튜브에 첨가하고, 생성된 혼합물을 2분 동안 약하게 볼텍싱함으로써 혼합하여 유중수 에멀션을 생성하였다. 그 후에, 애주번트-항원 에멀션을 동물 주사에 적절한 주사기 내에 넣었다. 총 22.5 μg 또는 25 μg의 항원을 150 ㎕ 내지 200 ㎕의 부피로 주사하였다. 각 동물을 면역화시킨 후, 항-혈청 역가에 따라 3회 내지 4회 부스트시켰다. ELISA에 의해 측정된 역가가 우수한 동물에게 하이브리도마 융합 전에 복강내 주사에 의해 마지막 부스트 용량을 제공하였다.
하이브리도마 융합 및 스크리닝
뮤린 골수종 세포주의 세포(SP2/0-Ag14, ATCC#CRL-1581)를 하이브리도마 융합 직전에 대수 성장기에 이를 때까지 배양하였다. 면역화된 마우스로부터의 비장 세포를멸균 제조하고, 문헌[Kohler G, and Milstein C, "Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity," Nature, 256: 495-497(1975)]에 기재된 바와 같은 방법에 따라 뮤린 골수종 세포와 융합하였다. 이어서, 융합된 "하이브리드세포"를 DMEM/20% FCS/HAT 배지의 96-웰 플레이트에 분배하였다. 융합 7일 내지 10일 후, 현미경으로 하이브리도마 콜로니의 생존을 관찰하였다. 2주 후, 자체 제조된 비오틴-표지 인간 PD-1-Fc 단백질을 사용하여 각 웰로부터의 상청액을 포획 ELISA로 처리하였다. 인간 PD-1-Fc 단백질에 결합하는 양성 하이브리도마 분비 항체를 선택하고, 24-웰 플레이트로 옮겼다. 높은 특이적 인간 PD-1 결합 및 PD-1-PD-L1 차단 활성을 나타낸 항체를 생성하는 하이브리도마 클론을 제한된 희석으로 서브클로닝하여 세포주의 클론성을 보장한 후, 단클론성 항체를 정제하였다. 간략히, PBS 완충액을 사용하여 5 내지 10 컬럼 부피로 단백질 A 세파로스 컬럼(Cat#AA0273, bestchrom (Shanghai) Biosciences)을 세척하였다. 본 개시의 하이브리도마의 세포 상청액을 컬럼에 통과시킨 후, 단백질의 흡광도가 기준선에 도달할 때까지 PBS 완충액을 사용하여 컬럼을 세척하였다. 컬럼을 용리 완충액(0.1 M 글리신-HCl, pH 2.7)으로 용출하고, 즉시 중화 완충액(1 M Tris-HCl, pH 9.0)을 사용하여 튜브에 수집하였다. 면역글로불린을 함유하는 분획을 풀링하고, 4℃에서 밤새 PBS 중에 투석하였다. 이어서, 정제된 마우스 단클론성 항체의 시험관내 및 생체내 기능 활성을 하기와 같이 특징화하였다
실시예 2. BIACORE 표면 플라즈몬 공명 기술을 이용한 마우스 항-PD-1 단클론성 항체의 결합 친화성 결정
Biacore T200 시스템(GE healthcare, Pittsburgh, PA, USA)에 의해 실시예 1에서 생성된 정제된 항-PD-1 단클론성 항체(mAb)를 결합 친화성 및 결합 동역학에 대하여 특징화하였다. Opdivo® 니볼루맙(Bristol-Myers Squibb) 및 Keytruda® 펨브롤리주맙(Merck Sharp & Dohme Ltd)이 양성 대조군으로 사용되었다.
간략히, Biacore에 의해 제공되는 표준 아민 커플링 키트(GE healthcare, Pittsburgh, PA, USA)를 사용하여 일차 아민을 통해 CM5 칩(카르복시 메틸 덱스트란 코팅된 칩, Cat#:BR100530, GE healthcare)에염소-항-마우스 IgG(Cat#: BR100838,　GE healthcare, 마우스 항체 포획 키트)를 공유 연결하였다. 바이오센서 표면 상의 미반응 모이어티를 에탄올아민으로 차단하였다. 양성 대조군의 친화성 결정을 위해 단백질 G 칩(Cat#:29-1793-15, GE healthcare)을 사용하였다. 본 개시의 항-PD-1 항체 및 2 μg/㎖ 농도의 양성 대조군 2개를 각각 10 ㎕/min의 유량으로 칩 상에 흘렸다. 이어서, 연속 희석된 재조합 인간 PD-1-his 단백질(Cat#:10377-H08H, Sino biological Inc.), 시노몰구스 PD-1-his 단백질(Cat#:PD1-C5223, Acro biosystems Inc.) 및 재조합 마우스 PD-1-his 단백질(Cat#:50124-M08H, Sino Biological Inc)을 200 nM에서 시작하여 HBS-EP+ 완충액(Biacore 제공)에서 2배 희석하여 각각 30 ㎕/min의 유량으로 칩 상에 흘렸다. 항원-항체 결합 동역학을 2분 동안 추적하고, 해리 동역학을 10분 동안 추적하였다. 결합 및 해리 곡선을 Biacore 평가 소프트웨어를 사용하여 1:1 Langmuir 결합 모델에 피팅시켰다. KD, Ka 및 Kd 값을 결정하고, 하기 표 2-1 및 표 2-2에 요약하였다.　
본 개시의 모든 마우스 항체는 니볼루맙 및 펨브롤리주맙보다 더 높은 결합 친화성으로 인간 PD-1에 특이적으로 결합하였으며, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙과 비교하여 비슷하거나 더 높은 결합 친화성으로 원숭이 PD-1에 결합하였다. 또한, E1A9C8A7 및 E2G4E10B7은 마우스 PD-1에 특이적으로 결합하였으며, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙은 결합하지 않았다.
[표 2-1] 인간 및 시노몰구스 PD-1에 대한 마우스 항-PD-1 단클론성 항체의 결합 친화성
Figure pct00002
[표 2-2] 마우스 PD-1에 대한 마우스 항-PD-1 단클론성 항체의 결합 친화성
Figure pct00003
실시예 3. 마우스 항-PD-1 항체의 결합 활성
PD-1에 대한 본 개시의 마우스 항-PD1 항체의 결합 활성을 포획 ELISA, 간접 ELISA 및 유세포 분석(FACS)을 통해 추가로 결정하였다.
3.1 포획 ELISA
간략히, 96-웰 마이크로플레이트를 4℃에서 밤새 PBS 중 2 ㎍/㎖의 AffiniPure 염소 항-마우스 IgG F(ab’)2 특이적 단편(Cat#:115-005-072, Jackson ImmunoResearch) 또는 염소-항-인간 IgG(Cat#:109-005-097, Jackson ImmunoResearch, 양성 대조군 및 음성 대조군용) 100 ㎕로 코팅하였다. 플레이트를 세척 완충액(PBST, PBS+0.05% Tween-20)으로 1회 세척한 후, 37℃에서 2시간 동안 200 ㎕/웰의 차단 완충액(PBST 중 5% w/v 무지방 우유)으로 차단하였다. 플레이트를 다시 세척하고, 각각 100 ㎕/웰의 연속 희석된 본 개시의 항-PD1 항체, 펨브롤리주맙 및 음성 대조군 hIgG(정맥 주사용 인간 면역글로불린(pH 4), Hualan Biological Engineering Inc.)(66.7 nM에서 시작하여 PBST 중 2.5% 무지방 우유로 5배 연속 희석)와 함께 37℃에서 40분 동안 인큐베이션한 후, 4회 세척하였다. 포획된 항-PD-1 항체를 함유하는 플레이트를 비오틴-표지 인간 PD-1-Fc 단백질(SEQ ID NO: 26으로 자체 제조, PBST 중 2.5% 무지방 우유 110 ng/㎖, 100 ㎕/웰)과 함께 37℃에서 40분 동안 인큐베이션하고, 4회 세척하고, 퍼옥시다제 스트렙타비딘(PBST 중 1:10000 희석, Cat#016-030-084, Jackson ImmunoResearch, 100 ㎕/웰)과 함께 37℃에서 40분 동안 인큐베이션하였다. 최종 세척 후, 플레이트를 100 ㎕/웰의 TMB (Cat#:TMB-S-002, Innoreagents)와 함께 실온에서 인큐베이션하였다. 50 ㎕/웰의 1M H2SO4를 사용하여 3-10분 후에 반응을 중단하고, TMB의 경우 450 nm이고 참조 파장이 630 nm인 이중 파장 모드를 이용하여 마이크로 플레이트 리더에서 흡광도를 판독하였다. OD(450 내지 630) 값을 항체 농도에 대해 플롯팅하였다. GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고, EC50 값을 보고하였다. 결과는 도 1a 및 도 1b에 나타나 있다.
3.2 간접 ELISA
시노몰구스 PD-1 단백질 및 마우스 PD-1 단백질에 대한 본 개시의 항-PD-1 항체의 교차 반응을 시험하였다.
간략히, 96-웰 마이크로플레이트를 37℃에서 2시간 동안 카르보네이트/바이카르보네이트 완충액(pH 9.6) 중 2 ㎍/㎖의 마우스 PD-1-his (Cat#:50124-M08H, Sino Biological Inc) 또는 2 2 ㎍/㎖의의 시노몰구스 PD-1-his(Cat#:PD1-C5223, Acro biosystems Inc.) 100 ㎕로 코팅하였다. 플레이트를 세척 완충액(PBST, PBS+0.05% Tween-20)으로 1회 세척한 후, 37℃에서 2시간 동안 200 ㎕의 차단 완충액(PBST 중 5% w/v 무지방 우유)으로 차단하였다. 플레이트를 다시 세척하고 100 ㎕/웰의 연속 희석된 본 개시의 항-PD-1 항체 또는 대조군(66.7 nM에서 시작, PBST 중 2.5% 무지방 우유로 5배 연속 희석)과 함께 37℃에서 40분 동안 인큐베이션하였다. ELISA 플레이트를 4회 세척하고, 퍼옥시다제 AffiniPure 염소 항-마우스 IgG, Fcγ 특이적 단편(PBST 완충액에서 1:5000 희석, Cat#:115-035-071, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., 100 ㎕/웰) 또는 퍼옥시다제 AffiniPure F(ab')₂ 단편 염소 항-인간 IgG, Fcγ 특이적 단편(Cat#:109-036-098, Jackson ImmunoResearch, 대조군용)과 함께 37℃에서 40분 동안 인큐베이션하였다. 최종 세척 후, 플레이트를 100 ㎕/웰의 TMB (Cat#:TMB-S-002, Innoreagents)와 함께 실온에서 인큐베이션하였다. 50 ㎕/웰의 1M H2SO4를 사용하여 3-10분 후에 반응을 중단하고, TMB의 경우 450 nm이고 참조 파장이 630 nm인 이중 파장 모드를 이용하여 마이크로 플레이트 리더에서 흡광도를 판독하였다. 이어서, OD(450 내지 630) 값을 항체 농도에 대해 플롯팅하였다. GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고, EC50 값을 보고하였다. 결과는 도 2 및 도 3a 및 3b에 나타나 있다.
3.3 세포 기반 결합 FACS
세포 표면에 발현되는 마우스 PD-1에 대한 마우스 항-PD-1 항체의 결합 활성을 세포막 상에서 전장 마우스 PD-1(SEQ ID NO: 27)을 발현하는 Biosion 자체 제조 293F-마우스 PD-1 세포를 사용하여 유세포 분석(FACS)을 통해 시험하였다. 293F-mouse PD-1 세포는 293F 세포를 EcoR I 및 XbaI 부위 사이에 마우스 PD-1 코딩 서열이 삽입된 PCMV-T-P 플라스미드로 리포펙타민 3000 형질감염 시약(Thermo Fisher)의 지침에 따라 형질감염시킴으로써 제조하였다.
또한, 세포 표면에 발현된 인간 PD-1에 대한 본 개시의 마우스 항-PD-1 항체의 결합 활성을 세포 표면 인간 PD-1을 발현하는 GS-J2/PD-1 세포주(Genscript)를 사용하여 유세포 분석(FACS)를 통해 시험하였다.
구체적으로, 293F-마우스 PD-1 세포 및 GS-J2/PD-1 세포를 각각 세포 배양 플라스크로부터 수확하고, 2회 세척하고, 2% v/v 소 태아 혈청(FACS 완충액)을 함유하는 PBS에 재현탁시켰다. 그 후에, 96 웰-플레이트에서 웰 당 2 x 105개 세포를 다양한 농도의 항-PD1 항체 또는 대조군 100 ㎕ 와 함께 얼음 위에서 40분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척한 후, 마우스 단클론성 항체의 경우 100 ㎕/웰의 R-피코에리트린 AffiniPure F(ab')₂ 단편 염소 항-마우스 IgG (H+L)(FACS 완충액 중 1:1000 희석, Cat#:115-116-146, Jackson ImmunoResearch)와 함께 첨가하고, 대조군의 경우 R-피코에리트린 AffiniPure 염소 항-인간 IgG, Fcγ 특이적 단편(Cat#:109-115-098, Jackson ImmunoResearch)과 함께 첨가하였다. 암소에서 4℃에서 40분 동안 인큐베이션한 후, 세포를 3회 세척하고, FACS 완충액에 재현탁시켰다. 형광을 Becton Dickinson FACS Canto II-HTS 장비를 사용하여 측정하고, 항체 농도에 대해 플롯팅하였다. GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고, EC50 값을 보고하였다. 결과는 도 4a 및 도 4b 및 도 5에 나타나 있다.
도 1a 및 도 1b, 도 4a 및 도 4b에 나타난 바와 같이, 본 개시의 마우스 항-PD1 항체는 펨브롤리주맙과 비교하여 비슷하거나 더 높은 Bmax(최대 결합) 및 비슷하거나 더 낮은 EC50으로 인간 PD-1에 특이적으로 결합하였다.
본 개시의 항체는 도 3a 및 도 3b에 나타난 바와 같이, 펨브롤리주맙과 비교하여 더 낮은 Bmax 및 더 높은 EC50로 시노몰구스 PD-1에 결합하였다.
도 2 및 도 5에 따르면, 마우스 항체 E1A9C8A7 및 E2G4E10B7은 마우스 PD-1에 특이적으로 결합하였으며, 펨브롤리주맙은 결합하지 않았다.
실시예 4. PD-1-PD-L1 또는 PD-1-벤치마크 결합에 대한 마우스 항-PD1 항체의 차단 활성
4.1 리간드 차단 ELISA
PD-L1-PD1 결합을 차단하는 본 개시의 항-PD1 항체의 능력을 경쟁 ELISA에서 측정하였다.
간략히, 100 ㎕의 인간 PD-L1-Fc 단백질(SEQ ID NO: 28로 자체 제조)을 4℃에서 밤새 카르보네이트/바이카르보네이트 완충액(pH 9.6) 중 2 ㎍/㎖로 96-웰 마이크로플레이트 상에 코팅하였다. 플레이트를 세척 완충액(PBS+0.05% Tween-20, PBST)으로 세척하고, 37℃에서 2시간 동안 PBST에서 5% w/v 무지방 우유로 차단하였다. 본 개시의 항-PD1 항체 또는 대조군을 비오틴 표지 인간 PD-1-Fc 단백질(SEQ ID NO: 26으로 자체 제조, 2.5% 무지방 우유 PBST에서 137.5 ng/㎖)로 희석하고(80 nM에서 시작하여 4배 연속 희석), 실온에서 40분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트 세척 후, 항체/인간 PD-1-Fc 혼합물을 인간 PD-L1-Fc 코팅 플레이트에 웰 당 100 ㎕씩 첨가하였다. 37℃에서 40분 동안 인큐베이션한 후 세척 완충액을 사용하여 플레이트를 세척하였다. 이어서, 플레이트에 100 ㎕/웰의 퍼옥시다제 스트렙타비딘(PBST 완충액 중 1:10000 희석, Cat#:016-030-084, Jackson Immunoresearch)을 첨가하고 37℃에서 40분 동안 인큐베이션하여 비오틴 표지 인간 PD-1-Fc를 검출하였다. 세척 완충액을 사용하여 플레이트를 다시 세척하였다. 마지막으로, TMB를 첨가하고, 1M H2SO4를 사용하여 반응을 중단하였다. TMB의 경우 450 nm이고 참조 파장이 630 nm인 이중 파장 모드를 이용하여 마이크로플레이트 리더에서 흡광도를 판독한 후, OD(450 내지 630) 값을 항체 농도에 대해 플롯팅하였다. Graphpad Prism 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고, IC50 값을 보고하였다. 결과는 도 6a 및 도 6b에 나타나 있다.
4.2 세포 기반 리간드 차단 FACS
세포 표면 PD-L1에 대한 인간 PD-1-Fc 단백질의 결합을 차단하는 본 개시의 항체의 활성을 세포-표면 인간 PD-L1을 발현하는 세포주 GS-C2/PD-L1(Genscript)를 사용하여 유세포 분석(FACS)을 통해 평가하였다.
본 개시의 항-PD1 항체 및 대조군을 비오틴 표지 인간 PD-1-Fc 용액(SEQ ID NO: 26으로 자체 제조, FACS 완충액에서 137.5 ng/㎖)으로 희석하고(6.67 nM에서 시작하여 3배 연속 희석), 실온에서 40분 동안 인큐베이션하였다. GS-C2/PDL1 세포를 대수 성장기에 세포 배양 플라스크로부터 수확하고, 2회 세척하고, 2% v/v 소 태아 혈청(FACS 완충액)을 함유하는 PBS에 재현탁하였다. GS-C2/PD-L1 세포는 96 웰-플레이트에서 웰 당 0.6 x l05개 세포를 100 ㎕/웰의 항체/PD1-Fc 혼합물과 함께 4℃에서 40분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하고, 100 ㎕/웰의 R-피코에리트린 스트렙타비딘(FACS 완충액에서 1: 500 희석, Cat#:016-110-084, Jackson Immunoresearch)을 첨가하고, 암소에서 4℃에서 40분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 2회 세척하고 FACS 완충액에 재현탁하였다. 형광을 Becton Dickinson FACS Canto II-HTS 장비를 사용하여 측정하였다. Graphpad Prism 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고, IC50 값을 보고하였다. 결과는 도 7a 및 도 7b에 나타나 있다.
세포 표면 마우스 PD-1에 대한 마우스 PD-L1 결합을 차단하는 항-PD1 항체의 활성을 상술된 293F-마우스 PD-1 세포를 사용하여 유세포 분석(FACS)을 통해 평가하였다.
간략히, 293F-마우스 PD-1 세포를 세포 배양 플라스크로부터 수확하고, 2회 세척하고, 2% v/v 소 태아 혈청(FACS 완충액)을 함유하는 PBS에 재현탁하였다. 이어서, 96 웰-플레이트에서 웰 당 1 x 105 세포를 FACS 완충액에서 다양한 농도(80 nM에서 시작하여 3배 연속 희석)의 항-PD-1 항체 또는 대조군 100 ㎕와 함께 4℃에서 40분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 FACS 완충액으로 2회 세척하고 100 ㎕/웰의 재조합 마우스 PD-L1-hFc 단백질(Cat#:50010-M03H, Sino biological Inc., FACS 완충액 중 1 ㎍/㎖)을 첨가하여 4℃에서 40분 동안 인큐베이션하였다. . 플레이트를 FACS 완충액으로 세척한 후, 100 ㎕l/웰의 R-피코에리트린 AffiniPure 염소 항-인간 IgG, Fcγ 특이적 단편(FACS 완충액 중 1:1000 희석, Cat#:109-115-098, Jackson Immunoresearch)을 첨가하여 암소에서 4℃에서 40분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 2회 세척하고 FACS 완충액에 재현탁하였다. 형광을 Becton Dickinson FACS Canto II-HTS 장비를 사용하여 측정하였다. Graphpad Prism 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고, IC50 값을 보고하였다. 결과는 도 [청구항 8]
4.3 벤치마크 차단 ELISA
인간 PD-1-Fc 단백질에 대한 벤치마크(Keytruda® 펨브롤리주맙) 결합을 차단하는 본 개시의 항-PD-1 항체의 능력을 경쟁 ELISA 검정에서 측정하였다. 간략히, 37℃에서 2시간 동안 PBS 중 2 ㎍/㎖ 펨브롤리주맙 100 ㎕로 96-웰 마이크로플레이트를 코팅하였다. ELISA 플레이트를 세척 완충액(PBST, PBS+0.05% Tween-20)으로 1회 세척한 후, 37℃에서 2시간 동안 200 ㎕/웰의 차단 완충액(PBST 중 5% w/v 무지방 우유)으로 차단하였다. 차단하는 동안, 본 개시의 항-PD-1 항체 또는 대조군을 비오틴 표지 인간 PD-1-Fc 단백질(SEQ ID NO: 26으로 자체 제조, 2.5% 무지방 우유 PBST 중 11 ng/㎖)로 희석하고(80 nM에서 시작하여 4배 연속 희석), 실온에서 40분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트 세척 후, 항체/PD-1 단백질 혼합물을 벤치마크 코팅 플레이트에 웰 당 100 ㎕씩 첨가하였다. 37℃에서 40분 동안 인큐베이션한 후, 세척 완충액을 사용하여 플레이트를 세척하고, 100 ㎕/웰의 퍼옥시다제 스트렙타비딘을 첨가하여 37℃에서 40분 동안 인큐베이션하였다. 세척 완충액을 사용하여 플레이트를 다시 세척하였다. 마지막으로, TMB를 첨가하고, 1M H2SO4를 사용하여 반응을 중단하였다. TMB의 경우 450 nm이고 참조 파장이 630 nm인 이중 파장 모드를 이용하여 마이크로플레이트 리더에서 흡광도를 판독하고, OD(450 내지 630) 값을 항체 농도에 대해 플롯팅하였다. Graphpad Prism 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고, IC50 값을 보고하였다. 결과는 도 9a 및 도 9b에 나타나 있다.
도 6a 및 도 6b, 도 7a 및 도 7b에서 나타난 바와 같이, 본 개시의 항-PD-1 항체는 펨브롤리주맙과 비슷하거나 약간 더 낮은 활성으로 인간 PD-L1에 대한 인간 PD-1의 결합을 차단할 수 있었다는 것을 알 수 있다. 도 8에 따르면, 항체 E1A9C8A7 및 E2G4E10B7은 높은 차단 활성으로 세포 표면 마우스 PD-1에 대한 마우스 PD-L1 결합을 차단하였다. 이것은 마우스 PD-1을 결합할 수 없었던 펨브롤리주맙과 구별된다.
도 9a 및 도 9b는 본 개시의 항-PD-1 항체가 펨브롤리주맙에 대한 PD-1의 결합을 차단할 수 있었다는 것을 보여주며, 항체가 동일하거나 유사한 에피토프에 결합할 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 5. 마우스 항-PD-1 항체의 세포 기반 기능 검정
세포막 PD-1과 세포막 PD-L1의 상호작용을 차단하는 본 개시의 항체의 활성을 유전자 조작된 세포주 2개, 즉, 상술된 NFAT 반응 요소(NFAT-RE)에 의해 인간 PD-1 및 루시페라제 리포터를 안정적으로 발현하는 GS-J2/PD-1(Genscript, 효과기 세포주) 및 인간 PD-L1 및 조작된 세포 표면 항원 펩티드/주요 조직 적합 유전자 복합체(MHC)를 안정적으로 발현하는 GS-C2/PD-L1(Genscript, 항원 전달 세포)을 사용하여 세포 기반 기능 검정에서 평가하였다. 이 두 세포주를 공동 배양할 때 GS-J2/PD-1 세포에서 T-세포 수용체(TCR)-NFAT-매개 루시페라제 발현은 PD-1-PD-L1 상호작용에 의해 억제되거나 감소될 것이다.
세포 기반 기능 검정은 하기와 같이 수행되었다. 간략히, 10% FBS(Cat#:10099-141, Gibco,)가 보충된 20 ㎕ RPMI1640 배지(Cat#:12430-054, Gibco)에서 대수 성장기의 1.0 x l04 GS-C2/PD-L1세포를 384-웰 세포 배양 플레이트(Cat#:3765, Corning)에 분주하였다. 다음날, 연속 희석된 본 개시의 항-PD-1 항체 또는 대조군(음성 대조군으로 자체 제조한 항-CD22 항체 포함)을 검정 완충액(RPMI1640+1%FBS)에서 300 nM에서 시작하여 5배 연속 희석하여 제조하였다. 배양 배지를 폐기한 후, 384-웰 플레이트에 20 ㎕의 희석된 항-PD1 항체 및 20 ㎕의 GS-J2/PD-1 효과기 세포(7.5*105/ml)를 첨가하였다. 인큐베이터에서 37℃에서 6시간 동안 공동 배양한 후, 플레이트에 루시페라제 검출 시약(30 ㎕/웰, Cat#:E6120, Promega)을 첨가하였다. 10분 후, 플레이트를 Tecan infinite 200Pro 플레이트 리더에서 분석하였다. GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 발광 신호를 분석하고, EC50 값을 보고하였다.
결과는 도 10에 나타나 있다.
본 개시의 모든 항-PD1 항체는 GS-J2/PD-1 세포에서 PD-1-PD-L1 상호작용으로 인한 루시페라제 발현 감소를 니볼루맙보다 더욱 효과적으로 역전시킬 수 있었지만 펨브롤리주맙과는 비슷한 활성을 보였다는 것을 알 수 있다.
실시예 6. 키메라 항체의 생성 및 특징화
본 개시의 항-PD-1 mAb의 중쇄/경쇄 가변 영역을 시퀀싱하고, 그 서열 ID 번호를 표 1에 요약하였다.
항-PD1 마우스 mAb E1A9C8A7의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 각각 인간 IgG4 중쇄 불변 영역(SEQ ID NO: 24) 및 인간 카파 경쇄 불변 영역(SEQ ID NO.: 25)에 프레임내에서 클로닝하였고, 여기서 가변 영역의 C-말단은 상응하는 불변 영역의 N-말단에 연결되었다.
인간 IgG4 중쇄 불변 영역에 연결된 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드를 각각 함유하는 벡터, 및 인간 카파 경쇄 불변 영역에 연결된 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드를 각각 함유하는 벡터를 1 mg/㎖의 PEI와 함께 1.1:1 비율의 경쇄 대 중쇄 작제물에서 50 ㎖의 293F 현탁 세포 배양물에 일시적으로 형질감염시켰다.
키메라 항체를 함유하는 세포 상청액을 진탕 플라스크에서 6 일 후에 수확하고, 세포 상청액으로부터 키메라 항체를 정제하였다. 정제된 키메라 항체를 상기 실시예의 프로토콜에 따라 BIAcore 친화성 시험 및 세포-기반 기능 검정에서 시험하였다.
결과는 표 3 및 도 11에 나타나 있다.
표 3의 결합 친화성 데이터는 키메라 항체 E1A9C8A7이 인간 PD-1에 높은 결합 친화성을 가진다는 것을 시사한다.
도 11에 따르면, 키메라 항체 E1A9C8A7은 GS-J2/PD-1 세포에서 PD-1-PD-L1 상호작용으로 인한 루시페라제 발현 감소를 니볼루맙보다 더욱 효과적으로 역전시킬 수 있었지만 펨브롤리주맙과는 비슷한 활성을 보였다.
[표 3] 키메라 항-PD1 항체의 결합 친화성
Figure pct00004
실시예 7. 항-PD1 단클론성 항체 E1A9C8A7의 인간화
마우스 항-PD-1 항체 E1A9C8A7을 인간화시키고 추가로 특징화하였다. 하기에서 상세히 기술되는 바와 같이 잘 확립된 CDR-접목 방법을 사용하여 인간화를 수행하였다.
마우스 항체 E1A9C8A7의 인간화를 위한 수용체 프레임워크를 선택하기 위해, 마우스 E1A9C8A7 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열을 인간 면역글로불린 유전자 데이터베이스에 대해 블라스팅하였다. 가장 높은 상동성을 갖는 인간 생식계열을 인간화를 위한 수용체 프레임워크로 선택하였다. 마우스 항체 중쇄/경쇄 가변 영역 CDR을 선택된 프레임워크에 삽입하고, 프레임워크 내의 잔기(들)를 추가로 역돌연변이시켜 더 많은 후보 중쇄/경쇄 가변 영역을 수득하였다. 총 11개의 예시적인 인간화 E1A9C8A7 항체, 즉, huE1A9C8A7-V1에서 huE1A9C8A7-V11까지의 항체를 수득하였고, 이의 중쇄/경쇄 가변 영역 서열 ID 번호를 표 1에 기재하였다.
인간 IgG4 중쇄 불변 영역(SEQ ID NO: 24)에 연결된 인간화 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드를 각각 함유하는 벡터, 인간화 카파 경쇄 불변 영역(SEQ ID NO: 25)에 연결된 인간화 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드를 각각 함유하는 벡터를 1 mg/㎖의 PEI와 함께 1.1:1 비율의 경쇄 대 중쇄 작제물에서 50 ㎖의 293F 현탁 세포 배양물에 일시적으로 형질감염시켰다.
실시예 8. 인간화 E1A9C8A7 항체의 특징화
인간화 E1A9C8A7 항체를 함유하는 세포 상청액을 진탕 플라스크에서 6일 후에 수확하고, Octet 시스템(Fortebio, Octet RED 96)을 통해 인간 PD-1에 대한 결합 친화성을 시험하였다.
간략히, AHC 바이오센서(항-인간 IgG Fc 포획, ForteBio)를 10 mM 글리신(pH 1.5)에 3초 동안 미리 담근 후, 러닝 완충액(PBST 중 0.5% w/v BSA)이 있는 웰에 3초 동안 침지시키고, 담금 및 침지 단계를 3회 반복하였다. 그런 후, 센서를 각각 인간화 항-PD-1 항체를 함유하는 세포 상청액, HBS-EP+ 중 2 μg/㎖의 키메라 E1A9C8A7 항체 및 HBS-EP+ 중 2 μg/㎖의 니볼루맙이 있는 웰에 200초 동안 침지시킨 후, 러닝 완충액이 있는 웰에 1분 동안 담갔다. 러닝 완충액이 있는 다른 웰에서 새로운 기준선을 100초 동안 실행하였다. 이어서, 센서를 러닝 완충액 중 인간 PD-1-his 단백질(Cat#:PD1-H5221, Acro biosystems Inc., 100 nM에서 시작하여 2배 연속 희석)이 있는 웰에 120초 동안 침지시킨 후, 기준선 웰에 4분 동안 담갔다. 마지막으로, 센서를 10 mM 글리신(pH 1.5)에 30초 동안 미리 담근 후, 러닝 완충액이 있는 웰에 30초 동안 침지시켰다. 결합 및 해리 곡선을 ForteBio 데이터 분석 8.1 평가 소프트웨어를 사용하여 1:1 Langmuir 결합 모델에 피팅시켰다. Ka, Kd 및 KD 값을 결정하고 하기 표 4에 요약하였다.
[표 4] 인간화 E1A9C8A7 mAb의 결합 친화성
Figure pct00005
데이터는, huE1A9C8A7-V3을 제외한, 인간화 PD1 항체를 함유하는 모든 세포 상청액이 키메라 항체와 유사하지만 니볼루맙보다는 높은 인간 PD-1 결합 친화성을 갖는다는 것을 보여준다.
인간화 항체 huE1A9C8A7-V5 및 huE1A9C8A7-V8을 상술된 바와 같이 정제하고, 하기의 약간 수정된 상기 실시예의 프로토콜에 따라 BIAcore, 포획 ELISA, 간접 ELISA, 경쟁 ELISA, 세포-기반 결합 FACS, 세포-기반 리간드-차단 FACS 및 세포-기반 기능 검정에서 시험하였다.
포획 ELISA의 경우, 96-웰 플레이트를 AffiniPure 염소-항-마우스 IgG F(ab’)2 특이적 단편 대신 2 ㎍/㎖ AffiniPure 염소 항-인간 IgG, Fcγ 특이적 단편(Cat#:109-005-098, Jackson Immunoresearch) 100 ㎕ 으로 코팅하였다. 비오틴 표지 인간 PD-1-Fc, 100 ㎕/웰 대신, 2.5% 무지방 우유 PBST 중 39.2 ng/㎖의 비오틴 표지 인간 PD-1-his 단백질(SEQ ID NO: 29로 자체 제조)을 사용하였다.
간접 ELISA의 경우, 퍼옥시다제 AffiniPure F(ab')₂ 단편 염소 항-인간 IgG, Fcγ 특이적 단편(Cat#:109-036-098, Jackson Immunoresearch) 을 인간화 항체로 100 ㎕/웰 사용하였다.
BIAcore 시험의 경우, 염소 항-인간 IgG(Cat#:BR100839, GE healthcare, 인간 항체 포획 키트)를 CM5 칩에 공유 연결하였다.
벤치마크 차단 ELISA의 경우, 비오틴 표지 인간 PD-1-Fc 용액, 100 ㎕/웰 대신, 2.5% 무지방 우유 PBST 중 15.7 ng/㎖의 비오틴 표지 인간 PD-1-his 단백질(SEQ ID NO: 29로 자체 제조)을 사용하였다.
세포-기반 결합 FACS의 경우, R-피코에리트린 AffiniPure 염소 항-인간 IgG Fcγ 특이적 단편(Cat#:109-115-098, Jackson ImmunoResearch)이 인간화 항체로 사용되었다(FACS 완충액 중 1:1000 희석, 100 ㎕/웰).
또한, 인간화 항체 huE1A9C8A7-V5 및 huE1A9C8A7-V8을 열 안정성에 대하여 시험하였다. 간략히, 단백질 열 이동 검정을 이용하여 GloMelt™ 열 이동 단백질 안정성 키트(Cat#:33022-T, Biotium)를 사용함으로써 Tm(용융 온도)을 결정하였다. 간략히, GloMelt™ 염료가 해동되고 실온에 도달하도록 하였다. 염료가 들어 있는 바이알을 볼텍싱하고 원심분리하였다. 이어서, 5 ㎕의 200x 염료를 95 ㎕의 PBS에 첨가함으로써 10x 염료를 제조하였다. 2 ㎕의 10x 염료 및 10 ㎍의 인간화 항체를 첨가하고, 총 반응 부피가 20 ㎕가 되도록 PBS를 첨가하였다. 염료 및 항체가 들어 있는 튜브를 잠시회전시키고, 표 5에서의 매개변수를 갖는 용융 곡선 프로그램으로 설정된 실시간 PCR 열 순환기(Roche, LightCycler 480 II)에 배치하였다.
[표 5] 용융 곡선 프로그램에 대한 매개변수
Figure pct00006
결과는 표 6-1 및 6-2, 도 12 내지 도 18 및 도 19a 및 도 19b에 나타나 있다.
[표 6-1] 인간화 mAb huE1A9C8A7-V5 및 huE1A9C8A7-V8의 결합 친화성/결합능
Figure pct00007
*시험하지 않음.
[표 6-2] 인간화 mAb huE1A9C8A7-V5 및 huE1A9C8A7-V8의 기능 활성
Figure pct00008
*시험하지 않음.
데이터에 따르면, 인간화 항체 huE1A9C8A7-V5 및 huE1A9C8A7-V8은 인간 PD-1(예를 들어, 도 12, 표 6-1) 및 시노몰구스 PD-1(예를 들어, 도 13, 표 6-1)에 대해 니볼루맙 및 펨브롤리주맙보다 더 높은 결합 친화성/활성을 보여주었다. 인간화 항체 huE1A9C8A7-V5 및 huE1A9C8A7-V8은 마우스 PD1에도 특이적으로 결합하였으며, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙은 결합하지 않았다(표 6-1).
또한, 항체 huE1A9C8A7-V5 및 huE1A9C8A7-V8은 경쟁 ELISA(도 15) 및 세포-기반 차단 FACS 시험(도 17)에서 니볼루맙 및 펨브롤리주맙과 비교했을 때 PD-1-PD-L1 결합 또는 상호작용에서 비슷한 차단 능력을 보여주었다. 항체 huE1A9C8A7-V8 및 huE1A9C8A7-V5는 세포 기반 기능 검정에서 니볼루맙과 비슷한 활성으로 PD-1-PD-L1 상호작용으로 인한 루시페라제 발현 감소를 역전시킬 수 있었다(도 18).
실시예 9. huE1A9C8A7-V8-3 항체의 생성 및 특성화
탈아미노화는 아스파라긴 잔기, 특히 CDR의 아스파라긴 잔기에서 발생하여 항체의 저하를 초래한다. 아스파르트산 잔기, 특히 글리신 잔기가 뒤따르는 잔기는 항체의 저하를 초래하는 또 다른 일반적인 원인인 이성질화를 일으키기 쉽다. 본 개시의 항체의 생산, 저장 및 생체내 대사 과정에서 아미노산 탈아미노화 및/또는 이성질화를 피하기 위해 CDR 서열을 더 나은 화학적 안정성을 위해 최적화할 수 있다.
인간화 항체 huE1A9C8A7-V8은 중쇄 가변 영역 CDR3 및 경쇄 가변 영역 CDR1에서 변형되었다. CDR이 변형된 항체를 huE1A9C8A7-V8-3으로 지정하고, 상술한 바와 같이 정제하여 상기 실시예의 프로토콜에 따라 BIAcore, 세포-기반 결합 FACS 및 세포-기반 기능 검정에서 시험하였다.
결과는 표 7-1 및 7-2, 도 20 및 도 21에 나타나 있다.
[표 7-1] 인간 및 시노몰구스 PD-1에 대한 huE1A9C8A7-V8-3의 결합 친화성
Figure pct00009
[표 7-2] 마우스 PD-1에 대한 huE1A9C8A7-V8-3의 결합 친화성
Figure pct00010
표 7-1 및 7-2에 따르면, huE1A9C8A7-V8-3은 huE1A9C8A7-V8보다 약간 더 높은 마우스, 인간 및 시노몰구스 PD-1에 대한 결합 친화성을 보여주었다. 그리고, 이 두 항체는 도 20에서 보는 바와 같이, 인간 PD-1에 대해 비슷한 결합 활성을 보여주었다.
또한, 도 21에서 보는 바와 같이, huE1A9C8A7-V8 및 huE1A9C8A7-V8-3은 GS-J2/PD-1 세포에서 PD-1-PD-L1 상호작용으로 인한 루시페라제 발현 감소를 니볼루맙보다 더욱 효과적으로 역전시킬 수 있었지만, 펨브롤리주맙과는 비슷한 활성을 보였다는 것을 알 수 있다.
실시예 10. 마우스 E2G4E10B7 항체의 생체내 항종양 유효성
마우스 E2G4E10B7 항체의 생체내 항종양 유효성을 C57BL/6 마우스에서 시험하였다. 간략히, C57BL/6 마우스에게 2 x 106 마우스 대장암 MC38 세포(Cat#:HYC3401, Obio Technology (Shanghai) Corp., Ltd.)를 오른쪽 겨드랑이에 피하 주사하였다. 종양부피를 전자캘리퍼를 사용하여 3주간 주 2회 측정하였고 (길이×폭2)/2로 계산하였다. 종양이 약 30~150 mm3의 평균 부피에 도달하면 종양을 가진 마우스 24마리를 선택하여 3개의 그룹으로 무작위 배정하였으며, 동물 그룹을 배정한 날을 1일 차로 지정하였다. 각 그룹에는 각각 매개체(Dulbecco의 인산염 완충액, DPBS라고도 함), 마우스 E2G4E10B7 항체 및 InVivoMAb 항-마우스 PD-1(Cat#:BE0146, Bio X Cell, CD279라고도 함)을 10 mg/kg의 용량으로 1, 4, 8, 11, 15, 18일 차에 꼬리 정맥에 정맥 주사하였다.
매개체 그룹의 마우스와 다른 두 그룹의 마우스는 각각 15일 차와 22일 차에 안락사시키고 종양을 채취해 무게를 측정하였다. 종양 성장률(T/C%= (Vt(각 치료군에서 t일 차에 측정한 종양 부피)/V0(1일 차에 측정한 종양 부피))/ (대조군의 Vt /V0) × 100%) 및 종양 성장 억제율(IRTV%= 100%- T/C%) 을 결정하였다.
종양을 가진 동물들은 모든 치료에서 우수한 내약성을 보였다. 표 8 및 도 22에서 보는 바와 같이, 10 mg/kg에서 마우스 E2G4E10B7 항체는 10 mg/kg에서 InVivoMAb 항-마우스 PD-1보다 유의하게 우수한 유효성을 보였다.
[표 8] 마우스 E2G4E10B7 항체의 항종양 유효성
Figure pct00011
a 15일 차의 종양 부피, 학생의 시험을 통해 매개체 대조군과 비교, *P≤0.05 및 **P<0.01.b 15일 차의 T/C% 및 IRTV%종양 부피, 학생의 시험을 통해 InVivoMAb 항-마우스 PD-1 그룹과 비교, *P≤0.05 및 **P<0.01.
본 개시는 하나 이상의 구현예와 연관되어 상술되었지만, 본 개시는 이들 구현예로 제한되지 않고, 본 설명은 첨부된 청구항의 사상 및 범위 내에 포함될 수 있는 모든 대안, 변형, 및 등가물을 포괄하는 것으로 하고자 함이 이해되어야 한다. 본원에 인용된 모든 참고문헌은 추가로 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
본 출원의 서열은 하기에서 요약된다.
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
***
본 발명의 바람직한 구현예가 이와 같이 상세히 기술되었지만, 상기 단락에 의해 정의된 발명은, 이의 다수의 분명한 변동이 본 발명의 사상 또는 범위로부터 벗어남 없이 가능함에 따라 상기 설명에 기재된 특정 세부 사항으로 제한되지 않아야 함이 이해되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Biosion Inc. <120> PD-1 BINDING ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> 55532 00039 <150> US 63/072,421 <151> 2020-08-31 <160> 42 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR1 of mouse, chimeric and humanized E1A9C8A7 antibodies, and mouse E2G4E10B7 <400> 1 Asp Tyr Val Met His 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR1 of mouse E1G5D1H1 <400> 2 Asp Phe Tyr Met Tyr 1 5 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR2 of mouse, chimeric and humanized E1A9C8A7 antibodies <400> 3 Val Ile Ser Thr Tyr His Ile Pro Ala Val Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR2 of mouse E2G4E10B7 <400> 4 Val Ile Ser Thr His Phe Gly Asp Gly Val Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR2 of mouse E1G5D1H1 <400> 5 Thr Ile Ser Asn Ser Gly Thr Gln Thr 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Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 26 <211> 382 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human PD1-Fc protein <400> 26 Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala 1 5 10 15 Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe 20 25 30 Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro 35 40 45 Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln 50 55 60 Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg 65 70 75 80 Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr 85 90 95 Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu 100 105 110 Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro 115 120 125 Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Glu 130 135 140 Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 145 150 155 160 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 165 170 175 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 180 185 190 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 195 200 205 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 210 215 220 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 225 230 235 240 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 245 250 255 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 260 265 270 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 275 280 285 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 290 295 300 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 305 310 315 320 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 325 330 335 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 340 345 350 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 355 360 365 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 370 375 380 <210> 27 <211> 294 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse PD-1-his <400> 27 Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln 1 5 10 15 Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp 20 25 30 Arg Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala 35 40 45 Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met 50 55 60 Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala 65 70 75 80 Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln 85 90 95 Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp 100 105 110 Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu 115 120 125 His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val 130 135 140 Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro 145 150 155 160 Lys Pro Glu Gly Arg Phe Gln Gly Met Val Ile Gly Ile Met Ser Ala 165 170 175 Leu Val Gly Ile Pro Val Leu Leu Leu Leu Ala Trp Ala Leu Ala Val 180 185 190 Phe Cys Ser Thr Ser Met Ser Glu Ala Arg Gly Ala Gly Ser Lys Asp 195 200 205 Asp Thr Leu Lys Glu Glu Pro Ser Ala Ala Pro Val Pro Ser Val Ala 210 215 220 Tyr Glu Glu Leu Asp Phe Gln Gly Arg Glu Lys Thr Pro Glu Leu Pro 225 230 235 240 Thr Ala Cys Val His Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Thr Glu Gly 245 250 255 Leu Gly Ala Ser Ala Met Gly Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Leu Gln 260 265 270 Gly Pro Arg Pro Pro Arg His Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu 275 280 285 His His His His His His 290 <210> 28 <211> 453 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human PDL1-Fc protein <400> 28 Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser 1 5 10 15 Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu 20 25 30 Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln 35 40 45 Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg 50 55 60 Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala 65 70 75 80 Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys 85 90 95 Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val 100 105 110 Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro 115 120 125 Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys 130 135 140 Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys 145 150 155 160 Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr 165 170 175 Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr 180 185 190 Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile 195 200 205 Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr Glu Pro Lys 210 215 220 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 225 230 235 240 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 260 265 270 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 275 280 285 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 290 295 300 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 305 310 315 320 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 325 330 335 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 340 345 350 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 355 360 365 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 370 375 380 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 385 390 395 400 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 405 410 415 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 420 425 430 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 435 440 445 Leu Ser Pro Gly Lys 450 <210> 29 <211> 151 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human PD1-his <400> 29 Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala 1 5 10 15 Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe 20 25 30 Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro 35 40 45 Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln 50 55 60 Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg 65 70 75 80 Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr 85 90 95 Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu 100 105 110 Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro 115 120 125 Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln His 130 135 140 His His His His His His His 145 150 <210> 30 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of mouse E1A9C8A7 <400> 30 caggtccagc tgcagcagtc tggggctgag gtggtgaggc ctggggtctc agtgaggatt 60 tcctgcaagg gttctggcta cacattctct gattatgtta tgcactggat gaagcagagt 120 catggagaga gcctagagtg gattggggtt atcagtactt accatattcc tgctgtctac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggccacaatg actgtagaca aatcctccag tacagtctat 240 ctggaacttg ccagactgac atctgaggat tctgccatct attactgtgc aagagaggtc 300 tatggtgact cttactactt cgatgtctgg ggcgcgggga ccacggtcac cgtctcctca 360 <210> 31 <211> 361 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of chimeric E1A9C8A7 <400> 31 caagtgcagc tgcagcagag cggcgccgaa gtggtgagac ccggcgtgag cgtgaggatc 60 agctgcaagg gcagcggcta taccttcagc gactacgtga tgcactggat gaagcagagc 120 cacggcgagt ctctggagtg gatcggagtg atcagcacct accacatccc cgccgtgtac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggccaccatg accgtggaca agagcagcag caccgtgtat 240 ctggagctgg ctagactgac ctccgaggat agcgccatct actactgcgc cagagaggtg 300 tacggcgata gctactactt cgacgtgtgg ggcgccggaa ccacagtgac cgtgagcagc 360 g 361 <210> 32 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of huE1A9C8A7-V8 <400> 32 caagtgcagc tggtgcagag cggagccgaa gtggtgaaac ccggcgccag cgtgaagatc 60 agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gactacgtga tgcactgggt gagacaagcc 120 cccggccagt ctctggagtg gatgggcgtg atcagcacct accacatccc cgccgtgtac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggccaccatg accgtggaca ccagcaccag caccgtgtat 240 ctggagctgt cctctctgag gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagaggtg 300 tacggcgaca gctactactt cgacgtgtgg ggccaaggca ccacagtgac cgtgagcagc 360 <210> 33 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL of mouse E1A9C8A7 <400> 33 gatgttttga tgacccaaat tccactctcc ctgcctgtta gtcttggaga tcaagtctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagcattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120 tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttccg 300 tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336 <210> 34 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL of chimeric E1A9C8A7 <400> 34 gacgtgctga tgacccagat ccctctgtct ctgcccgtgt ctctgggaga tcaagtgagc 60 atcagctgca gatccagcca gagcatcgtg cacagcaacg gcaacaccta tctggagtgg 120 tatctgcaga agcccggcca gagccccaag ctgctgatct acaaggtctc caatagattc 180 tccggcgtgc ccgatagatt cagcggaagc ggcagcggca ccgacttcac actgaagatc 240 tccagagtgg aggccgagga tctgggcgtg tactactgct ttcaaggcag ccacgtgccc 300 tacacctttg gcggcggcac caaactggag atcaag 336 <210> 35 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL of huE1A9C8A7-V1 - huE1A9C8A7-V11 <400> 35 gacatcgtga tgacccagac acctctgtct ctgcccgtga cacccggcga gcccgccagc 60 atcagctgca gaagcagcca gagcatcgtg cacagcaacg gcaacaccta tctggagtgg 120 tatctgcaga agcccggcca gagccctcag ctgctgatct acaaggtgtc caatagattc 180 agcggcgtgc ccgacagatt cagcggcagc ggaagcggca cagacttcac actgaagatc 240 tccagagtgg aggccgagga cgtgggcgtg tactactgct tccaaggcag ccacgtgcct 300 tacaccttcg gcggcggcac caaggtggag atcaag 336 <210> 36 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of mouse E2G4E10B7 <400> 36 caggtccagc tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctggggtctc agtgaagatt 60 tcctgcaagg gttctggcta cacattcact gattatgtta tgcactgggt gaggcagagc 120 catgcaaaga gtctagagtg gattggagtt atcagtactc actttggtga tggtgtttac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggccacaatg actgtagaca aatcctccag cacagcctat 240 atggaacttg ccagactgac atctgaggat tctgccatct attactgtgc aagagaggtc 300 tatggtgact cttggtactt cgatgtctgg ggcgcaggga ccacggtcac cgtctcctca 360 <210> 37 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL of mouse E2G4E10B7 <400> 37 gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagccttgta catagtgatg gaaacaccta tttagaatgg 120 tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagactgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttccg 300 tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336 <210> 38 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of mouse E1G5D1H1 <400> 38 gaagtgcagt tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc tctgaagctc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt gacttttaca tgtattgggt tcgccagact 120 ccggaaaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtaata gtggtactca aacctactat 180 ctagacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa taacctgtac 240 ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt actattgtgc tagagactac 300 tataggtacg acagctggta cttcgatgtc tggggcgcag ggaccacggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 39 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL of mouse E1G5D1H1 <400> 39 gacattgtat taacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctcaagggca gagagccacc 60 atctcctgca gagccagtga aagtgttgat ttttatggca caagtttaat gcagtggttc 120 caactgaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa cgtcgaatct 180 ggagtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacaa acttcagcct caacatccat 240 cctgtggagg aggatgatat tgccatgtat ttctgtcagc aaagtaggaa ggttccgtgg 300 acattcggtg gaggcaccaa ccttgaaatc aaa 333 <210> 40 <211> 984 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain constant region for chimeric and humanized antibodies <400> 40 gccagcacaa agggcccttc cgtgtttccc ctggccccct gcagcaggag cacctctgag 60 tccaccgccg ccctgggctg tctggtgaag gactactttc ccgagcccgt gaccgtgagc 120 tggaattccg gcgccctgac atccggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct gcagtcctcc 180 ggcctgtaca gcctgagctc cgtggtgaca gtgccttcct cctccctggg caccaagacc 240 tacacatgta atgtggatca caagcccagc aacacaaagg tggataagag agtggagtcc 300 aagtacggcc ctccttgccc tccctgtcct gccccagagt tcctgggcgg cccctctgtg 360 ttcctgttcc cccctaagcc caaggacaca ctgatgatct ccaggacccc tgaggtgacc 420 tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaggac cctgaggtgc agttcaattg gtacgtggat 480 ggcgtggagg tgcacaatgc caagacaaag cccagagagg agcagtttaa ttccacatac 540 agggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggattggc tgaacggcaa ggagtacaag 600 tgtaaggtga gcaacaaggg cctgccttcc tccatcgaga agacaatcag caaggccaag 660 ggccagccta gggagcccca ggtgtacaca ctgcctccca gccaggagga gatgaccaag 720 aaccaggtga gcctgacctg cctggtgaag ggcttctacc ctagcgacat cgccgtggag 780 tgggagtcca acggccagcc cgagaataac tacaagacaa caccccccgt gctggattcc 840 gatggcagct tctttctgta ctccaggctg accgtggata agagcaggtg gcaggagggc 900 aatgtgttca gctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca atcactacac ccagaagagc 960 ctgtccctga gcctgggcaa gtga 984 <210> 41 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain constant region for chimeric and humanized antibodies <400> 41 cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60 ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120 tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180 agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240 aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300 agcttcaaca ggggagagtg ttag 324 <210> 42 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of huE1A9C8A7-V8-3 <400> 42 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Ser Thr Tyr His Ile Pro Ala Val Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Val Tyr Gly Glu Ser Tyr Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120

Claims (21)

  1. (i) VH CDR1 영역, VH CDR2 영역 및 VH CDR3 영역을 포함할 수 있는 중쇄 가변 영역(여기서, VH CDR1 영역, VH CDR2 영역, 및 VH CDR3 영역은 (1) 각각 SEQ ID NO: 1, 3 및 6(X1=D, X2=Y); (2) 각각 SEQ ID NO: 1, 3 및 6(X1=E, X2=Y); (3) 각각 SEQ ID NO: 1, 4 및 6(X1=D, X2=W); 또는 (4) 각각 SEQ ID NO: 2, 5 및 7 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함함); 및/또는 (ii) VL CDR1 영역, VL CDR2 영역 및 VL CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역(여기서, VL CDR1 영역, VL CDR2 영역, 및 VL CDR3 영역은 (1) 각각 SEQ ID NO: 8(X1= I, X2=N), 10 및 12; (2) 각각 SEQ ID NO: 8(X1=I, X2=A), 10 및 12; (3) 각각 SEQ ID NO: 8(X1=L, X2=D), 10 및 12; 또는 (4) 각각 SEQ ID NO: 9, 11 및 13과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있음)을 갖는, PD-1에 결합하는 단리된 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  2. 제1항에 있어서, VH CDR1 영역, VH CDR2 영역 및 VH CDR3 영역, VL CDR1 영역, VL CDR2 영역, 및 VL CDR3 영역은 (1) 각각 SEQ ID NO: 1, 3, 6(X1=D, X2=Y), 8(X1=I, X2=N), 10 및 12; (2) 각각 SEQ ID NO: 1, 3, 6(X1=E, X2=Y), 8(X1=I, X2=A), 10 및 12; (3) 각각 SEQ ID NO: 1, 4, 6(X1=D, X2=W), 8(X1=L, X2=D), 10 및 12; 또는 (4) 각각 SEQ ID NO: 2, 5, 7, 9, 11 및 13과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  3. 제1항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 14, 15(X1=S, X2=M, X3=K; X1=T, X2=M, X3=K; X1=S, X2=V, X3=K; X1=S, X2=M, X3=T; X1=T, X2=V, X3=T), 16(X1=V, X2=S, X3=I; X1=I, X2=G, X3=I; X1=I, X2=S, X3=M), 17(X1=R, X2=A, X3=V; X1=K, X2=V, X3=V; X1=K, X2=A, X3=R), 18, 19 또는 42와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  4. 제1항에 있어서, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 20, 21(X1=N; X1=A), 22 또는 23과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  5. 제2항에 있어서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 (1) SEQ ID NO: 14 및 20; (2) 각각 SEQ ID NO: 15(X1=S, X2=M, X3=K) 및 21(X1=N); (3) 각각 SEQ ID NO: 15(X1=T, X2=M, X3=K) 및 21(X1=N); (4) 각각 SEQ ID NO: 15(X1=S, X2=V, X3=K) 및 21(X1=N); (5) 각각 SEQ ID NO: 15(X1=S, X2=M, X3=T) 및 21(X1=N); (6) 각각 SEQ ID NO: 15(X1=T, X2=V, X3=T) 및 21(X1=N); (7) 각각 SEQ ID NO: 16(X1=V, X2=S, X3=I) 및 21(X1=N); (8) 각각 SEQ ID NO: 16(X1=I, X2=G, X3=I) 및 21(X1=N); (9) 각각 SEQ ID NO: 16(X1=I, X2=S, X3=M) 및 21(X1=N); (10) 각각 SEQ ID NO: 17(X1=R, X2=A, X3=V) 및 21(X1=N); (11) 각각 SEQ ID NO: 17(X1=K, X2=V, X3=V) 및 21(X1=N); (12) 각각 SEQ ID NO: 17(X1=K, X2=A, X3=R) 및 21(X1=N); (13) 각각 SEQ ID NO: 42 및 21(X1=A); (14) 각각 SEQ ID NO: 18 및 22; 또는 (15) 각각 SEQ ID NO: 19 및 23과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  6. 제1항에 있어서, IgG1, IgG2 또는 IgG4 이소형인, 단리된 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  7. 제1항에 있어서, 중쇄 가변 영역에 연결된 SEQ ID NO: 24의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 가변 영역에 연결된 SEQ ID NO: 25을 아미노산 서열을 갖는 경쇄 불변 영역을 포함하는, 단리된 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  8. 제1항에서, (a) 인간 PD-1에 결합하고; (b) 원숭이 PD-1에 결합하고; (c) 마우스 PD-1에 결합하고; (d) PD-1-PD-L1을 차단하고/하거나; (e) 생체내 항종양 활성을 가지는, 단리된 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  9. 제1항에 있어서, 마우스, 키메라 또는 인간 항체인, 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  10. 제1항에 있어서, 단리된 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 뉴클레오티드.
  11. 제10항의 뉴클레오티드를 포함하는, 발현 벡터.
  12. 제11항의 발현 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
  13. 제1항의 단리된 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약학적 조성물.
  14. PD-1 신호 전달과 관련된 질환을 치료하는 방법으로서, 치료적 유효량의 제13항의 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 질환은 암인, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 암은 고형 암인, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 암은 비소세포 폐암(NSCLC), 신세포암(RCC), 방광암(BC), (NSCLC), 대장암(CRC), 간세포암(HCC), 고전적 호지킨 림프종(cHL), 흑색종, 두경부 편평 세포암(HNSCC), 결장암, 자궁 경부암, 또는 위암 및 위식도암인, 방법.
  18. 제14항에 있어서, 질환은 감염성 질환인, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 감염성 질환은 패혈증, HIV 감염, 시미안 면역결핍 바이러스 감염, HBV 감염 또는 HCV 감염인, 방법.
  20. 제14항에 있어서, 질환은 염증성 질환인, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 염증성 질환은 류머티스 관절염, 대장염, 루푸스 유사 신장염, 전신 홍반성 루푸스 및 건선인, 방법
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