TWI428142B - 人類化之抗－ｅｇｆｌ７抗體及其使用方法 - Google Patents

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Description

人類化之抗-EGFL7抗體及其使用方法
本發明大體而言係關於分子生物學領域。更特定言之，本發明係關於抗-EGFL7抗體及該等抗體之用途。
相關申請案
本申請案為根據37 CFR 1.53(b)(1)申請之非臨時申請案，其根據35 USC 119(e)主張2009年5月8日申請之臨時申請案第61/176,817號的優先權，該文獻之內容以引用的方式併入本文中。
血管聯結之發育為許多生理及病理過程之基本需要。諸如胚胎及腫瘤之活躍生長的組織需要適當之血液供應。該等組織藉由產生促血管生成因子來滿足此需要，該等促血管生成因子由現存血管經由稱為血管生成之過程或由祖細胞經由稱為血小管生成之過程來促進新血管形成。管形成(Tubulogenesis)為血管發育中之必要步驟。血管管腔形成為複雜但有序之生物學事件，其涉及所有或許多以下步驟：a)由現存內皮細胞(EC)發生EC增殖或自祖細胞分化；b)EC遷移；c)EC聚結形成索樣結構；d)血管索接著經歷管形成，形成具有中心內腔之血管；e)現存索或血管長出新芽形成次生血管(血管生成)；f)原始血管叢經歷進一步重塑及再成形；及g)募集內皮外細胞以包裹內皮管，從而為血管提供維持及調節功能；該等細胞包括小毛細血管之外被細胞、較大血管之平滑肌細胞及心臟內之心肌細胞。Hanahan,D. Science 277,48-50(1997)；Hogan,B. L. & Kolodziej,P. A. Nature Reviews Genetics. 3,513-23(2002)；Lubarsky,B. & Krasnow,M. A. Cell. 112,19-28(2003)。
目前已充分確定，涉及由先前存在之內皮形成新血管之血管生成與各種病症之發病機理有關。此等病症包括實體腫瘤及轉移瘤；動脈粥樣硬化；晶狀體後纖維組織增生；血管瘤；慢性炎症；眼內新生血管性症候群，諸如增殖性視網膜病(例如糖尿病性視網膜病)、年齡相關之黃斑部變性(AMD)、新生血管性青光眼；移植角膜組織及其他組織之免疫排斥反應；類風濕性關節炎；及牛皮癬。Folkman等人，J. Biol. Chem.,267: 10931-10934(1992)；Klagsbrun等人，Annu. Rev. Physiol.,53: 217-239(1991)；及Garner A.,「Vascular diseases」,Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach,Garner A.,Klintworth GK編，第2版(Marcel Dekker,NY,1994),第1625-1710頁。
在腫瘤生長之情況下，血管生成似乎對於由增生轉變成瘤形成及向腫瘤生長與轉移提供營養至關重要。Folkman等人，Nature,339: 58(1989)。新血管生成允許腫瘤細胞相較於正常細胞獲取生長優勢及增殖自主性。腫瘤通常以單一異常細胞起始，該異常細胞可因與可用毛細血管床之距離而僅增殖至幾立方毫米之尺寸，且腫瘤可在很長一段時間內保持「休眠」而不進一步生長及擴散。一些腫瘤細胞接著轉換成血管生成表型而活化內皮細胞，其增殖並成熟成為新毛細血管。此等新形成之血管不僅允許原發腫瘤持續生長，而且允許轉移性腫瘤細胞擴散及再移生(recolonization)。因此，已觀測到乳癌以及若干種其他腫瘤的腫瘤切片之微血管密度與患者存活率之間有關聯。Weidner等人，N. Engl. J. Med,324: 1-6(1991)；Horak等人，Lancet,340: 1120-1124(1992)；Macchiarini等人，Lancet,340:145-146(1992)。控制血管生成開關(angiogenic switch)之準確機制尚未完全瞭解，但吾人咸信腫瘤塊之新血管生成係因大量血管生成刺激物及抑制物之淨平衡引起(Folkman,1995,Nat Med 1(1):27-31)。
血管發育之過程受到嚴密調控。迄今為止，已顯示大量分子(主要為由周圍細胞產生之分泌因子)調控EC之分化、增殖、遷移及聚結成為索樣結構之過程。舉例而言，血管內皮生長因子(VEGF)已經鑑別為參與刺激血管生成及誘導血管通透性之關鍵因子。Ferrara等人，Endocr. Rev.,18:4-25(1997)。有關甚至單一VEGF對偶基因缺失亦導致胚胎死亡之發現結果指出此因子在血管系統發育及分化中所起到的不可替代之作用。此外，已顯示VEGF為與腫瘤及眼內病症相關之新血管生成之關鍵介體。Ferrara等人，Endocr. Rev.,同上。VEGF mRNA被大部分所研究之人類腫瘤過度表現。Berkman等人，J. Clin. Invest.,91: 153-159(1993)；Brown等人，Human Pathol.,26: 86-91(1995)；Brown等人，Cancer Res.,53: 4727-4735(1993)；Mattern等人，Brit. J. Cancer,73: 931-934(1996)；Dvorak等人，Am. J. Pathol.,146: 1029-1039(1995)。
對血管管腔形成期間之一些步驟仍未有明確定義。特定言之，關於如何調控管形成--血管索如何發展成為血管及何種因子調控此轉變知之甚少。鑒於血小管生成及血管生成在許多疾病及病症中之作用，需要有一種降低或抑制一或多種引起此等過程之生物效應的方法。本文所引用之包括專利申請案及公開案的所有參考文獻均以全文引用的方式併入本文中。
本發明在某種程度上係基於各種針對EGFL7之抗體。EGFL7作為重要及有利之治療性目標而存在，且本發明提供抗體作為用以靶向與EGFL7之表現及/或活性相關之病理性病狀的治療劑及診斷劑。因此，本發明提供與EGFL7相關之方法、組合物、套組及製品。
舉例而言，在一些實施例中，本發明提供抗-EGFL7抗體。在一些實施例中，本發明提供一種抗-EGFL7抗體，其包含包括至少一個、兩個、三個、四個或五個選自由以下組成之群的高變區(HVR)序列之可變域：(i)HVR-L1，其包含KX1 SX2 SX3 DYX4 GDSYX5 S，其中X1 為A或R；X2 為H或Q；X3 為G或V；X4 係選自由D、L、R、S及W組成之群；且X5 為M或V(SEQ ID NO:210)；(ii)HVR-L2，其包含GASX1 X2 EX3 ，其中X1 為N或Y；X2 係選自由L、R及Y組成之群；且X3 為Q或S(SEQ ID NO:211)；(iii)HVR-L3，其包含QQNNEX1 PX2 T，其中X1 為D或E；且X2 為F或Y(SEQ ID NO:212)；(iv)HVR-H1，其包含GX1 X2 X3 X4 TYGX5 S，其中X1 為H或V；X2 為R或T；X3 係選自由F、G、R及S組成之群；X4 係選自由D、G、R及T組成之群；且X5 為M或Y(SEQ ID NO:213)；(v)HVR-H2，其包含GWINX1 X2 SGVPTX3 AX4 X5 X6 X7 X8 ，其中X1 係選自由I、M、T及W組成之群；X2 為H或R；X3 係選自由I、M、T及Y組成之群；X4 為D或H；X5 係選自由D、M及T組成之群；X6 為F或Y；X7 為K或S；且X8 為G或R(SEQ ID NO:214)；及(vi)HVR-H3，其包含AX1 LGSX2 AVDX3 ，其中X1 為N或R；X2 係選自由C、S及Y組成之群；且X3 為A或Y(SEQ ID NO:215)。在一些實施例中，抗-EGFL7抗體包含所有六個前述HVR。在一些實施例中，HVR-L1包含選自SEQ ID NO:31及37-43之胺基酸序列，HVR-L2包含選自由SEQ ID NO:32及44-47組成之群的胺基酸序列，HVR-L3包含選自由SEQ ID NO:33及48組成之群的胺基酸序列，HVR-H1包含選自由SEQ ID NO:34及49-57組成之群的胺基酸序列，HVR-H2包含選自由SEQ ID NO:35及58-73組成之群的胺基酸序列，且HVR-H3包含選自由SEQ ID NO:36及74-77組成之群的胺基酸序列。在一些實施例中，重鏈包含以下構架序列：FR-H1，其包含EX1 QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS，其中X1 為I或V(SEQ ID NO:216)；FR-H2，其包含WVRQAPGKGLEWX1 ，其中X1 為I或V(SEQ ID NO:217)；FR-H3，其包含RFTX1 SX2 DX3 SX4 X5 TX6 YLQMNSLRAEDTAVYX7 CAR，其中X1 為F或I；X2 為L或R；X3 為N或T；X4 係選自由A、E、K及T組成之群；X5 為N或S；X6 係選自由A、L、M、T及V組成之群；且X7 為F或Y(SEQ ID NO:218)；及FR-H4，其包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:219)。在一些實施例中，重鏈包含以下構架序列：FR-H1，其包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO:197)；FR-H2，其包含WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO:198)；FR-H3，其包含RFTISX1 DNSKNTX2 YLQMNSLRAEDTAVYYCAR，其中X1 為L或R；X2 係選自由A、L、M、T及V組成之群(SEQ ID NO:220)；及FR-H4，其包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:200)。在一些實施例中，輕鏈包含以下構架序列：FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:201)；FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:202)；FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:203)；FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:221)或FGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:204)。在一些實施例中，輕鏈包含如圖15所示之4F11.v17或4F11.v22之可變域序列(SEQ ID NO:82及83)。在一些實施例中，重鏈包含如圖16所示之4F11.v17或4F11.v22之可變域序列(SEQ ID NO:84及85)。在一些實施例中，本發明提供一種抗體，其中輕鏈包含如圖15所示之4F11.v17之可變域序列(SEQ ID NO:82)，且重鏈包含如圖16所示之4F11.v17之可變域序列(SEQ ID NO:84)。在一些實施例中，本發明提供一種抗體，其中輕鏈包含如圖15所示之4F11.v22之可變域序列(SEQ ID NO:83)，且重鏈包含如圖16所示之4F11.v22之可變域序列(SEQ ID NO:85)。
在一些實施例中，本發明提供一種抗-EGFL7抗體，其包含包括至少一個、兩個、三個、四個或五個選自由以下組成之群的HVR序列之可變域：(i)HVR-L1，其包含X1 X2 X3 X4 X5 X6 VX7 X8 X9 X10 ITYLX11 ，其中X1 係選自由L、Q、R、S及T組成之群；X2 係選自由P、T及W組成之群；X3 為H或S；X4 為D或Q；X5 為G或S；X6 為L或V；X7 為H或P；X8 係選自由I、L、P、T及Y組成之群；X9 係選自由N、Q或S組成之群；X10 係選自由A、G及S組成之群；且X11 為G或H(SEQ ID NO:222)；(ii)HVR-L2，其包含RVSNX1 X2 S，其中X1 為D或R；且X2 係選自由A、G、F、I及T組成之群(SEQ ID NO:223)；(iii)HVR-L3，其包含X1 QSX2 X3 VPLT，其中X1 係選自由A、G、I、K、L、N、S、T及V組成之群；X2 為C或T；且X3 為F或H(SEQ ID NO:224)；(iv)HVR-H1，其包含GYX1 X2 X3 DX4 YX5 N，其中X1 為N或T；X2 為F或V；X3 係選自由I、M、R及S組成之群；X4 係選自由Y、Q及K組成之群；且X5 為I或M(SEQ ID NO:225)；(v)HVR-H2，其包含GDINX1 X2 X3 X4 X5 X6 HX7 X8 X9 X10 X11 X12 X13 ，其中X1 係選自由A、L、N及P組成之群；X2 係選自由D、L及R組成之群；X3 係選自由G、K、N、R、S及Y組成之群；X4 為G或S；X5 係選自由G、I、K、R、S、T及V組成之群；X6 係選自由G、R及T組成之群；X7 係選自由I、V及Y組成之群；X8 為N或S；X9 係選自由A、N及Q組成之群；X10 為K或V；X11 為F或Q；X12 為K或T；且X13 係選自由G、H、R及S組成之群(SEQ ID NO:226)；及(vi)HVR-H3，其包含X1 REGVYHX2 YDDYAX3 DY，其中X1 係選自由A、N及T組成之群；X2 為D或P；且X3 為M或W(SEQ ID NO:227)。
在一些實施例中，抗-EGFL7抗體包含所有六個前述HVR。在一些實施例中，HVR-L1包含選自SEQ ID NO:100及106-124之胺基酸序列，HVR-L2包含選自由SEQ ID NO:101及125-129組成之群的胺基酸序列，HVR-L3包含選自由SEQ ID NO:102及130-145組成之群的胺基酸序列，HVR-H1包含選自由SEQ ID NO:103及146-153組成之群的胺基酸序列，HVR-H2包含選自由SEQ ID NO:104及154-187組成之群的胺基酸序列，且HVR-H3包含選自由SEQ ID NO:105及188-192組成之群的胺基酸序列。在一些實施例中，重鏈包含以下構架序列：FR-H1，其包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO:197)；FR-H2，其包含WVRQAPGKGLEWX1 ，其中X1 為I或V(SEQ ID NO:228)；FR-H3，其包含RX1 TX2 SX3 DX4 SX5 X6 TX7 YX8 QMNSLRAEDTAVYYC，其中X1 為F或V；X2 為I或L；X3 係選自由L、R及V組成之群；X4 為K或N；X5 係選自由K、N、R及S組成之群；X6 為N或S；X7 係選自由A、L及V組成之群；且X8 為L或M(SEQ ID NO:229)；及FR-H4，其包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:200)。在一些實施例中，重鏈包含以下構架序列：FR-H1，其包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO:197)；FR-H2，其包含WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO:198)；FR-H3，其包含RFTISRDX1 SKNTX2 YLQMNSLRAEDTAVYYCAR，其中X1 為N或K；且X2 係選自由A、L及V組成之群(SEQ ID NO:230)；及FR-H4，其包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:200)。在一些實施例中，輕鏈包含以下構架序列：FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:201)；FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:202)；FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:203)；FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:221)或FGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:204)。在一些實施例中，輕鏈包含如圖27所示之18F7.v6或18F7.v6k之可變域序列(SEQ ID NO:193及194)。在一些實施例中，重鏈包含如圖28所示之18F7.v6或18F7v6k之可變域序列(SEQ ID NO:195及196)。在一些實施例中，本發明提供一種抗體，其中輕鏈包含如圖27所示之18F7.v6之可變域序列(SEQ ID NO:193)，且重鏈包含如圖28所示之18F7.v6之可變域序列(SEQ ID NO:195)。在一些實施例中，本發明提供一種抗體，其中輕鏈包含如圖27所示之18F7.v6k之可變域序列(SEQ ID NO:194)，且重鏈包含如圖28所示之18F7.v6k之可變域序列(SEQ ID NO:196)。
在一些實施例中，本發明提供一種抗體，其中構架序列之至少一部分為人類共同構架序列。在一些實施例中，抗體包含人類κ亞群1共同構架序列。在一些實施例中，抗體包含重鏈人類亞群III共同構架序列。
在一些實施例中，本發明提供一種抗-EGFL7抗體，其為一種雙特異性抗體。在一些實施例中，該雙特異性抗體結合至血管內皮生長因子(VEGF)，例如結合至與貝伐單抗(bevacizumab)或蘭尼單抗(ranibizumab)相同之VEGF抗原決定基。
在一些實施例中，本發明提供一種編碼本發明抗體之核酸。在一些實施例中，本發明提供一種包含該類核酸之載體。在一些實施例中，本發明提供一種包含該核酸或載體之宿主細胞。
在一些實施例中，本發明提供一種包含本發明抗體之組合物。在一些實施例中，該組合物包含載劑。在一些實施例中，該組合物呈醫藥組合物形式。
在一些實施例中，本發明提供一種藉由在適合宿主細胞中表現包含編碼本發明抗體之核酸的載體及回收該抗體來製造抗-EGFL7抗體之方法。在一些實施例中，宿主細胞為原核細胞。在一些實施例中，宿主細胞為真核細胞。
在一些實施例中，本發明提供一種治療腫瘤、癌症或細胞增殖性病症之方法，該方法包含向需要該治療之個體投與有效量之本發明之抗-EGFL7抗體。在一些實施例中，本發明提供一種用於治療腫瘤、癌症或細胞增殖性病症之抗-EGFL7抗體。在一些實施例中，癌症係選自由乳癌、結腸直腸癌、肺癌、食道癌、膀胱癌、卵巢癌、胰臟癌及肝細胞癌組成之群。在一些實施例中，癌症為乳癌、結腸直腸癌或肺癌。在一實施例中，細胞增殖性病症為癌症。
在一些實施例中，治療亦包含有效量之第二藥劑，其中抗-EGFL7抗體為第一藥劑。在一些實施例中，第二藥劑為另一種抗體、化學治療劑、細胞毒性劑、抗血管生成劑、免疫抑制劑、前藥、細胞激素、細胞激素拮抗劑、細胞毒性放射線療法、皮質類固醇、止吐劑、癌症疫苗、鎮痛劑或生長抑制劑。在一些實施例中，第二藥劑為抗-VEGF抗體，例如貝伐單抗。在一些實施例中，第二藥劑係在投與抗-EGFL7抗體之前或之後投與。在一些實施例中，第二藥劑係與抗-EGFL7抗體同時投與。
在一些實施例中，本發明提供一種減少或抑制患有與血管生成相關之病理性病狀之個體的血管生成之方法，該方法包含向該個體投與本發明之抗體，藉此減少或抑制個體之血管生成。在一些實施例中，本發明提供本發明抗體用於治療與血管生成相關之病理性病狀。在一些實施例中，病理性病狀為贅生性病狀。在一些實施例中，病理性病狀為非贅生性病狀。在一些實施例中，非贅生性病狀係選自由糖尿病性及其他增殖性視網膜病、早產兒視網膜病、新生血管性青光眼、年齡相關之黃斑部變性、糖尿病性黃斑部水腫、角膜新血管生成、角膜移植新血管生成、視網膜/脈絡膜新血管生成組成之群。
在一些實施例中，本發明提供一種增強抗血管生成劑在患有與血管生成相關之病理性病狀之個體中之功效的方法，該方法包含向該個體投與有效量之本發明抗體以及抗血管生成劑，藉此增強該抗血管生成劑之抑制活性。在一些實施例中，本發明提供本發明抗體用於增強抗血管生成劑在患有與血管生成相關之病理性病狀之個體中之功效。在一些實施例中，與血管生成相關之病理性病狀為腫瘤、癌症或細胞增殖性病症。在一些實施例中，與血管生成相關之病理性病狀為非贅生性病狀。在一些實施例中，非贅生性病狀係選自由糖尿病性及其他增殖性視網膜病、早產兒視網膜病、新生血管性青光眼、年齡相關之黃斑部變性、糖尿病性黃斑部水腫、角膜新血管生成、角膜移植新血管生成、視網膜/脈絡膜新血管生成組成之群。在一些實施例中，抗血管生成劑係在投與抗-EGFL7抗體之前或之後投與。在一些實施例中，抗血管生成劑係與抗-EGFL7抗體同時投與。在一些實施例中，抗血管生成劑為抗-VEGF劑，即一種抗-VEGF抗體，例如貝伐單抗或蘭尼單抗。
在一些實施例中，本發明提供一種減少或抑制個體腫瘤之灌注及通透性之方法，該方法包含向該個體投與本發明之抗體。在一些實施例中，本發明提供本發明抗體用於減少或抑制個體腫瘤之灌注及通透性。在一些實施例中，該方法或用途進一步包含投與抗血管生成劑，例如抗-VEGF劑(例如抗-VEGF抗體，諸如貝伐單抗)。
本發明提供關於抗-EGFL7抗體之方法、組合物、套組及製品。
本文中提供此等方法、組合物、套組及製品之詳情。
通用技術
本文中所描述或提及之技術及程序一般已為熟習此項技術者所完全瞭解且通常利用習知方法來使用，該習知方法諸如為以下文獻中所述之已被廣泛使用的方法：Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual第3版(2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F. M. Ausubel等人編，(2003))；METHODS IN ENZYMOLOGY系列(Academic Press,Inc.)：PCR 2: A PRACTICAL APPROACH(M. J. MacPherson,B. D. Hames 及G. R. Taylor編(1995))；Harlow及Lane編(1988)ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL；及ANIMAL CELL CULTURE(R. I. Freshney編(1987))。
定義
「分離之」抗體為一種已自自然環境之組分中鑑別且分離及/或回收之抗體。其自然環境之污染物組分為將會干擾抗體之診斷或治療用途之物質，且可包括酶、激素及其他蛋白質性或非蛋白質性溶質。在較佳實施例中，該抗體將被(1)純化至如藉由勞立法(Lowry method)所測定之大於95重量%抗體，且最佳達至大於99重量%；(2)純化至足以經由利用旋杯式定序儀獲得N末端或內部胺基酸序列之至少15個殘基的程度；或(3)純化至藉由SDS-PAGE在還原或非還原條件下使用庫馬斯藍(Coomassie blue)或較佳銀染色得知之均質性。由於抗體之自然環境中之至少一種組分將不會存在，故分離之抗體包括重組細胞內之原位抗體。然而，分離之抗體通常將藉由至少一個純化步驟來製備。
「分離之」核酸分子為一種自至少一種污染物核酸分子鑑別且分離之核酸分子，其在其天然來源中通常與該污染物核酸分子締合。分離之核酸分子在形式或背景方面不同於自然界中所發現者。因此，分離之核酸分子有別於存在於天然細胞中之核酸分子。然而，分離之核酸分子包括通常表現抗體之細胞中所含的核酸分子，其中例如該核酸分子位於不同於天然細胞之染色體位置處。
術語「抗-EGFL7抗體」或「結合至EGFL7之抗體」係指能夠以足夠親和力結合EGFL7以便使抗體適用作靶向EGFL7之診斷及/或治療劑之抗體。在某些實施例中，結合至EGFL7之抗體的解離常數(Kd)1 μM、100 nM、10 nM、1 nM或0.1 nM。
「結合親和力」一般係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間的非共價相互作用之總和的強度。除非另外指示，否則如本文所用之「結合親和力」係指反映結合對成員(例如抗體與抗原)之間的1:1相互作用之固有結合親和力。分子X對其搭配物Y之親和力一般可由解離常數(Kd)表示。親和力可藉由此項技術中已知之常用方法(包括本文所述之方法)來量測。低親和力抗體一般緩慢地結合抗原且傾向於容易解離，而高親和力抗體一般較快地結合抗原且傾向於較久地保持結合。在此項技術中已知各種量測結合親和力之方法，該等方法中之任一者均可用於達成本發明之目的。以下描述特定說明性實施例。
在一實施例中，藉由放射性標記抗原結合檢定(RIA)來量測本發明之「Kd」或「Kd值」，該檢定用相關抗體之Fab形式及其抗原如由以下檢定所述來執行：藉由在一系列用於滴定之未標記抗原存在下以最低濃度之(125 I)標記抗原平衡Fab、接著以塗有抗-Fab抗體之板捕捉結合抗原來量測Fab對抗原之溶解結合親和力(Chen等人，(1999) J. Mol Biol 293:865-881)。為建立檢定條件，用5 μg/ml含捕捉抗Fab抗體(Cappel Lab)之50 mM碳酸鈉(pH 9.6)塗佈微量滴定板(Dynex)隔夜，且隨後在室溫下(約23℃)用含2%(w/v)牛血清白蛋白之PBS阻斷2至5小時。在無吸附劑之板(Nunc #269620)中，將100 pM或26 pM[125 I]-抗原與相關Fab之連續稀釋液混合(例如與對抗-VEGF抗體Fab-12之評估一致，Presta等人，(1997) Cancer Res. 57:4593-4599)。接著培育相關Fab隔夜；然而，培育可持續一段較長之時間(例如65小時)以確保達到平衡。此後，在室溫下將混合物轉移至捕捉板中以用於培育(例如維持1小時)。接著移除溶液且用含有0.1% TweenTM -20之PBS對板洗滌8次。當板已乾燥時，每孔添加150 μl閃爍體(MicroScintTM -20;Packard)，且用TopCount γ計數器(Packard)對板計數十分鐘。選擇提供小於或等於20%最大結合之各Fab濃度用於競爭性結合檢定。根據另一實施例，使用表面電漿子共振檢定，使用BIAcoreTM -2000或BIAcoreTM -3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)，在25℃下，以約10個反應單位(RU)之固定抗原CM5晶片量測Kd或Kd值。簡言之，根據供應商說明書，用N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物感測器晶片(CM5，BIAcore Inc)。將抗原用10 mM乙酸鈉(pH 4.8)稀釋成5 μg/ml(約0.2 μM)，隨後以5 μl/min之流動速率注射，以獲得約10個反應單位(RU)之偶合蛋白。注射抗原後，注射1 M乙醇胺以阻斷未反應之基團。為進行動力學量測，在25℃下，以約25 μl/min之流動速率將兩倍連續稀釋之Fab(0.78 nM至500 nM)注入含0.05% TweenTM 20之PBS(PBST)中。使用簡單的一對一朗繆爾結合模型(one-to-one Langmuir binding model)(BIAcoreTM 評估軟體3.2版)，藉由同時擬合締合及解離感應圖譜來計算締合速率(kon )及解離速率(koff )。根據koff /kon 之比率計算平衡解離常數(Kd)。參見例如Chen,Y.等人，(1999) J. Mol. Biol. 293:865-881。若藉由上述表面電漿子共振檢定得知，締合速率超過106 M-1 S-1 ，則締合速率可藉由使用螢光淬滅技術來測定，該技術係在如用光譜儀(諸如具有攪拌式比色皿之停流裝備型光譜光度計(Aviv Instruments)或8000系列SLM Aminco光譜光度計(ThermoSpectronic))所量測之遞增濃度的抗原存在下，在25℃下量測PBS(pH 7.2)中之20 nM抗-抗原抗體(Fab形式)之螢光發射強度(激發=295 nm；發射=340 nm，16 nm帶通)的增減。
如本文中所用之術語「載體」意欲指一種核酸分子，其能夠輸送已與其連接之另一種核酸。一類載體為「質體」，其係指可接合有其他DNA區段之環狀雙股DNA環。另一類載體為噬菌體載體。另一類載體為病毒載體，其中其他DNA區段可接合至病毒基因組。某些載體能夠在引入該等載體之宿主細胞中自主複製(例如具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如，非游離型哺乳動物載體)可在引入至宿主細胞中之後整合至宿主細胞基因組中，且藉此與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠引導其可操作地連接之基因的表現。該等載體在本文中稱為「重組表現載體」(或簡稱為「重組載體」或「表現載體」)。一般而言，在重組DNA技術中具有效用之表現載體通常呈質體形式。在本說明書中，「質體」及「載體」可互換使用。
如本文中可互換使用之「聚核苷酸」或「核酸」係指任何長度之核苷酸之聚合物，且包括DNA及RNA。核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼基及/或其類似物，或可藉由DNA或RNA聚合酶或合成反應併入聚合物中之任何受質。聚核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其類似物。若存在，則可在組裝聚合物之前或之後對核苷酸結構進行修飾。核苷酸之序列可為非核苷酸組分所穿插。可在合成之後，進一步修飾聚核苷酸，諸如藉由與標記物結合來修飾。其他類型之修飾例如包括：「帽子」；用類似物取代一或多種天然存在之核苷酸；核苷酸間修飾，諸如具有不帶電鍵之修飾(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、磷醯胺酸酯、胺基甲酸酯等)及具有帶電鍵之修飾(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、含有側位部分之修飾(諸如蛋白質，例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚-L-離胺酸等)、具有嵌入劑之修飾(例如，吖啶、補骨脂素(psoralen)等)、含有螯合劑之修飾(例如，金屬、放射性金屬、硼、氧化金屬等)、含有烷化劑之修飾、具有經修飾之鍵的修飾(例如，α-變旋異構核酸等)，以及未經修飾之形式的聚核苷酸。此外，通常存在於糖中之任何羥基均可例如經膦酸酯基、磷酸酯基置換，經標準保護基保護，或經活化以產生與額外核苷酸之額外鍵結，或可與固體或半固體支撐物結合。5'及3'端OH可經磷酸化或經具有1至20個碳原子之胺或有機封端基部分取代。其他羥基亦可衍生成標準保護基。聚核苷酸亦可含有此項技術中一般已知之核糖或去氧核糖之類似形式，包括例如2'-O-甲基-核糖、2'-O-烯丙基核糖、2'-氟-核糖或2'-疊氮基-核糖、碳環糖類似物、α-變旋異構糖、差向異構糖(諸如，阿拉伯糖、木糖或來蘇糖)、哌喃醣、呋喃醣、景天庚酮糖(sedoheptulose)、非環狀類似物及基本核苷類似物(諸如甲基核糖苷)。一或多個磷酸二酯鍵可經替代性鍵聯基團置換。此等替代性鍵聯基團包括(但不限於)磷酸酯基被置換為P(O)S(「硫代酸酯」)、P(S)S(「二硫代酸酯」)、(O)NR2 (「醯胺酸酯」)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2 (「甲縮醛」)之實施例，其中各R或R'獨立地為H或經取代或未經取代之視情況含有醚鍵(-O-)的烷基(1-20個C)、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烷基。並不需要聚核苷酸中之所有鍵均相同。前面描述適用於本文中所提及之所有聚核苷酸，包括RNA及DNA。
如本文中所用之「寡核苷酸」一般係指短的、一般為單股、一般為合成的聚核苷酸，其長度一般(但不一定)小於約200個核苷酸。術語「寡核苷酸」及「聚核苷酸」並不互相排斥。上文關於聚核苷酸之描述同樣且完全適用於寡核苷酸。
除非另外具體說明或於上下文指出，否則如本文中所用之術語「EGFL7」(可互換地稱為「EGF樣多重域7」)係指任何天然的或變異的(無論天然的抑或合成的)EGFL7多肽。術語「天然序列」具體涵蓋天然存在之截短形式或分泌形式(例如胞外域序列)、天然存在之變異體形式(例如替代性剪接形式)及天然存在之對偶基因變異體。術語「野生型EGFL7」一般係指包含天然存在之EGFL7蛋白質之胺基酸序列的多肽。術語「野生型EGFL7序列」一般係指在天然存在之EGFL7中發現之胺基酸序列。
術語「抗體」及「免疫球蛋白」在廣義上可互換使用且包括單株抗體(例如全長或完整單株抗體)、多株抗體、多價抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體，只要其展現所需生物活性即可)且亦可包括某些抗體片段(此在本文中有更詳細的描述)。抗體可為人類抗體、人類化抗體及/或親和力成熟抗體。
術語「可變」係指如下事實：可變域之某些部分的序列在抗體之間廣泛不同且被用於各特定抗體對其特定抗原的結合及特異性。然而，可變性並非均勻分佈於整個抗體可變域中。其集中於輕鏈與重鏈可變域中稱為互補決定區或高變區(CDR或HVR，在本文中可互換使用)之三個區段。可變域之較為高度保守的部分被稱為構架(FR)。天然重鏈及輕鏈之可變域各包含4個主要呈β摺疊構型之FR區，該等FR區由三個HVR連接，該等HVR形成連接β摺疊結構之環，且在一些情況下形成β摺疊結構之一部分。各鏈中之HVR經由FR區緊密地固持在一起，且與另一鏈之HVR一起促使抗體之抗原結合位點形成(參見Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest， 第5版，National Institute of Health,Bethesda,MD(1991))。恆定域並不直接涉及使抗體與抗原結合，但展現出各種效應功能，諸如使抗體參與抗體依賴性細胞毒性。
抗體之木瓜蛋白酶消化產生兩個稱為「Fab」片段之相同抗原結合片段，各具有單個抗原結合位點；及一個殘餘「Fc」片段，該名稱反映其具有容易結晶之能力。胃蛋白酶處理產生具有兩個抗原結合位點且仍能夠使抗原交聯之F(ab')2 片段。
「Fv」為含有完整抗原識別位點及抗原結合位點之最小抗體片段。在雙鏈Fv類型中，此區域由一個重鏈可變域與一個輕鏈可變域緊密、非共價締合之二聚體組成。在單鏈Fv類型中，一個重鏈可變域及一個輕鏈可變域可藉由撓性肽連接子共價連接，以使得輕鏈及重鏈可締合成類似於雙鏈Fv類型之「二聚」結構。正是在此構型中，各可變域之三個HVR相互作用以界定VH-VL二聚體表面上之抗原結合位點。總而言之，六個HVR使抗體具有抗原結合特異性。然而，甚至單個可變域(或僅包含三個對抗原具有特異性之HVR的Fv之一半)亦能夠識別及結合抗原，但親和力低於完整結合位點。
Fab片段亦含有輕鏈恆定域及重鏈第一恆定域(CH1)。Fab'片段因在重鏈CH1域之羧基端添加有少量殘基(包括一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸)而不同於Fab片段。Fab'-SH在本文中指代恆定域之半胱胺酸殘基帶有游離硫醇基之Fab'。F(ab')2 抗體片段最初以彼此之間具有鉸鏈半胱胺酸之Fab'片段對形式產生。亦已知抗體片段之其他化學偶合。
來自任何脊椎動物物種之抗體(免疫球蛋白)之「輕鏈」可基於其恆定域之胺基酸序列而歸類為兩種明顯不同的類型(稱為κ及λ)之一。
視重鏈恆定域之胺基酸序列而定，免疫球蛋白可歸為不同類別。免疫球蛋白有五種主要類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且若干此等類別可進一步分成子類(同型)：例如IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 及IgA2 。對應於不同類別之免疫球蛋白之重鏈恆定域分別被稱為α、δ、ε、γ及μ。熟知不同類別的免疫球蛋白之次單元結構及三維構型。
「抗體片段」僅包含完整抗體之一部分，其中該部分較佳保留當存在於完整抗體中時通常與彼部分相關之功能中之至少一種功能，較佳大部分或全部功能。抗體片段之實例包括Fab、Fab'、F(ab')2 及Fv片段；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成之多特異性抗體。在一實施例中，抗體片段包含完整抗體之抗原結合位點且因此保留結合抗原之能力。在另一實施例中，抗體片段(例如包含Fc區者)保留當存在於完整抗體中時通常與Fc區相關之生物學功能中之至少一者，諸如FcRn結合、抗體半衰期調節、ADCC功能及補體結合。在一實施例中，抗體片段為具有實質上類似於完整抗體的活體內半衰期之單價抗體。舉例而言，該類抗體片段可包含連接至Fc序列之抗原結合臂，Fc序列能夠使該片段具有活體內穩定性。
術語「高變區」、「HVR」或「HV」在本文中使用時係指抗體可變域中在序列上高變及/或形成結構上確定之環的區域。一般而言，抗體包含六個HVR；三個位於VH(H1、H2、H3)中，且三個位於VL(L1、L2、L3)中。在天然抗體中，H3及L3展現六個HVR之最大多樣性，且咸信尤其H3在使抗體具有精細特異性方面起獨特作用。參見例如Xu等人，Immunity 13:37-45(2000)；Johnson及Wu,Methods in M olecular Biology 248:1-25(Lo編輯，Human Press,Totowa,NJ,2003)。實際上，僅由重鏈組成之天然產生之駱駝抗體在不存在輕鏈的情況下亦具功能性及穩定性。參見例如Hamers-Casterman等人，Nature 363:446-448(1993)；Sheriff等人，Nature Struct .Biol . 3:733-736(1996)。
本文中使用且涵蓋許多關於HVR之描繪。Kabat互補決定區(CDR)係基於序列可變性且為最常使用者(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest ,第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。而Chothia係指結構環之位置(Chothia及Lesk,J. Mol. Biol. 196:901-917(1987))。AbM HVR表示Kabat HVR與Chothia結構環之間的折衷，且藉由Oxford Molecular之AbM抗體模型化軟體而加以使用。「接觸」HVR係基於對可獲得之複合晶體結構的分析。以下說明來自此等HVR中之每一者的殘基。
HVR可包含如下「延伸HVR」：VL中之24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)及89-97或89-96(L3)，以及VH中之26-35(H1)、50-65或49-65(H2)及93-102、94-102或95-102(H3)。可變域殘基係根據Kabat等人，同上關於該等定義中之每一者所述而加以編號。
「構架」或「FR」殘基為除本文所定義之高變區殘基以外的彼等可變域殘基。
非人類(例如鼠類)抗體之「人類化」形式為含有源自非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合抗體。在一實施例中，人類化抗體為人類免疫球蛋白(接受者抗體)，其中接受者之HVR的殘基經具有所需特異性、親和力及/或能力之非人類物種(諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物)(供者抗體)之HVR的殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之FR殘基經相應非人類殘基置換。此外，人類化抗體可能包含不存在於接受者抗體或供者抗體中之殘基。可進行此等修飾以進一步改進抗體效能。一般而言，人類化抗體將包含至少一個及通常兩個可變域之實質上全部，其中全部或實質上全部高變環對應於非人類免疫球蛋白之高變環，且全部或實質上全部FR為人類免疫球蛋白序列之FR。人類化抗體視情況亦將包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，通常為人類免疫球蛋白之至少一部分。欲知詳情，參見例如Jones等人，Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332:323-329(1988)；及Presta，Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)。亦參見例如Vaswani及Hamilton,Ann. Allergy,Asthma ＆ Immunol . 1:105-115(1998)；Harris,Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038(1995)；Hurle及Gross,Curr. Op. Biotech. 5:428-433(1994)；以及美國專利第6,982,321號及第7,087,409號。
如本文所用之術語「單株抗體」係指自一群實質上均質之抗體獲得之抗體，亦即構成該群之個別抗體除可以微量存在之可能的突變(例如，天然存在之突變)以外均為相同的。因此，修飾語「單株」指示並非離散抗體之混合物形式之抗體的特徵。在某些實施例中，該類單株抗體通常包括包含結合目標之多肽序列之抗體，其中藉由包括自複數個多肽序列選擇單個目標結合多肽序列之方法來獲得目標結合多肽序列。舉例而言，選擇方法可為自複數個純系(諸如融合瘤純系、噬菌體純系或重組DNA純系之池)選擇獨特純系。應瞭解，所選擇之目標結合序列可被進一步改變，例如以改良對目標之親和力、人類化目標結合序列、改良其在細胞培養物中之產生、降低其活體內免疫原性、產生多特異性抗體等，且包含經改變之目標結合序列之抗體亦為本發明之單株抗體。與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑相反，單株抗體製劑之各單株抗體係針對抗原上之單個決定子。除其特異性外，單株抗體製劑之有利之處在於其通常未受到其他免疫球蛋白污染。
修飾語「單株」指示獲自實質上均質之抗體群體之抗體的特徵，且不應被理解為需要藉由任何特定方法來產生抗體。舉例而言，欲根據本發明使用之單株抗體可藉由各種技術來製備，該等技術例如包括融合瘤方法(例如Kohler及Milstein,Nature, 256:495-97(1975)；Hongo等人，Hybridoma ,14(3): 253-260(1995)；Harlow等人，Antibodies: A Laboratory Manual ,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版；1988)；Hammerling等人，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981))、重組DNA方法(參見例如美國專利第4,816,567號)、噬菌體呈現技術(參見例如Clackson等人，Nature ,352: 624-628(1991)；Marks等人，J. Mol. Biol . 222: 581-597(1992)；Sidhu等人，J. Mol. Biol. 338(2): 299-310(2004)；Lee等人，J. Mol. Biol . 340(5): 1073-1093(2004)；Fellouse,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472(2004)；及Lee等人，J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004))及用於在動物中產生具有部分或所有編碼人類免疫球蛋白序列之人類免疫球蛋白基因座或基因之人類或人類樣抗體的技術(參見例如WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551(1993)；Jakobovits等人，Nature 362: 255-258(1993)；Bruggemann等人，Year in Immunol. 7:33(1993)；美國專利第5,545,807號；第5,545,806號；第5,569,825號；第5,625,126號；第5,633,425號；及第5,661,016號；Marks等人，Bio/Technology 10: 779-783(1992)；Lonberg等人，Nature 368: 856-859(1994)；Morrison,Nature 368: 812-813(1994)；Fishwild等人，Nature Biotechnol. 14: 845-851(1996)；Neuberger,Nature Biotechnol. 14: 826(1996)；及Lonberg及Huszar,Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93(1995))。
本文中之單株抗體明確包括「嵌合」抗體，其中重鏈及/或輕鏈之一部分與源自特定物種或屬於特定抗體類別或子類之抗體的相應序列一致或同源，而該(等)鏈之其餘部分與源自另一物種或屬於另一抗體類別或子類之抗體的相應序列一致或同源；以及該等抗體之片段，只要其展現所需生物活性即可(參見例如美國專利第4,816,567號；及Morrison等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA ,81:6851-6855(1984))。嵌合抗體包括PRIMATIZED抗體，其中抗體之抗原結合區係源自藉由例如以相關抗原使獼猴免疫而產生之抗體。
「單鏈Fv」或「scFv」抗體片段包含抗體之VH及VL域，其中此等域存在於單一多肽鏈中。一般而言，scFv多肽進一步包含介於VH與VL之間使scFv能夠形成抗原結合所需之結構的多肽連接子。關於scFv之綜述，參見Pluckthun,The Pharmacology of Monοclonal Antibodies ,第113卷，Rosenburg及Moore編，Springer-Verlag,New York,第269-315頁(1994)。
「抗原」為抗體可選擇性結合之預定抗原。目標抗原可為多肽、碳水化合物、核酸、脂質、半抗原或其他天然存在或合成之化合物。
術語「雙功能抗體」係指具有兩個抗原結合位點之小抗體片段，該等片段包含在同一多肽鏈中與輕鏈可變域(VL)連接之重鏈可變域(VH)(VH-VL)。藉由使用過短而使得同一鏈上之兩個域間無法配對的連接子，該等域被迫與另一鏈之互補域配對且產生兩個抗原結合位點。雙功能抗體更詳細地例如描述於以下文獻中：EP 404,097；WO 93/11161；及Hollinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA ,90:6444-6448(1993)。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson等人，Nat. Med. 9:129-134(2003)中。
「人類抗體」為具有對應於由人類產生及/或使用如本文所揭示用於製造人類抗體之任何技術製造之抗體的胺基酸序列之胺基酸序列的抗體。此關於人類抗體之定義明確地排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。可使用此項技術中已知之各種技術(包括噬菌體呈現文庫)來產生人類抗體。Hoogenboom及Winter,J. Mol. Biol. ,227:381(1991)；Marks等人，J. Mol. Biol. ,222:581(1991)。Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy ,Alan R. Liss,第77頁(1985)；Boerner等人，J. Immunol. ,147(1):86-95(1991)中所述之方法亦可用於製備人類單株抗體。亦參見van Dijk及van de Winkel,Curr. Opin. Pharmacol., 5:368-74(2001)。人類抗體可藉由將抗原投與已經修飾以回應於抗原攻毒產生該等抗體但內源性基因座已不能使用之轉殖基因動物(例如經免疫之異種小鼠(xenomice))來製備(關於XENOMOUSETM 技術，參見例如美國專利第6,075,181號及第6,150,584號)。關於經由人類B細胞融合瘤技術產生之人類抗體，亦參見例如Li等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA ,103:3557-3562(2006)。
術語「如Kabat中之可變域殘基編號」或「如Kabat中之胺基酸位置編號」及其變化形式係指Kabat等人，同上中用於抗體彙編中之重鏈可變域或輕鏈可變域的編號系統。使用此編號系統，實際的線性胺基酸序列可能含有對應於可變域之FR或HVR之縮短或插入可變域之FR或HVR中的較少或額外胺基酸。舉例而言，重鏈可變域可包括在H2之殘基52後插入的單個胺基酸(根據Kabat為殘基52a)及在重鏈FR殘基82後插入之殘基(例如，根據Kabat為殘基82a、82b及82c等)。可藉由在同源區將既定抗體序列與「標準」Kabat編號序列比對來確定該抗體之殘基的Kabat編號。
Kabat編號系統一般係在提及可變域中之殘基(大致為輕鏈之殘基1-107及重鏈之殘基1-113)時使用(例如Kabat等人，Sequences of Immunological Interest. 第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda，Md.(1991))。「EU編號系統」或「EU指數」一般係在提及免疫球蛋白重鏈恆定區中之殘基時使用(例如，Kabat等人，同上中報導之EU指數)。「如Kabat中之EU指數」係指人類IgG1 EU抗體之殘基編號。除非本文中另有說明，否則對抗體可變域中之殘基編號的提及意謂根據Kabat編號系統編號之殘基。除非本文中另有說明，否則對抗體恆定域中之殘基編號的提及意謂根據EU編號系統編號之殘基(例如參見美國臨時申請案第60/640,323號，關於EU編號之圖)。
「阻斷」抗體或「拮抗劑」抗體為抑制或降低所結合之抗原之生物活性的抗體。某些阻斷抗體或拮抗劑抗體實質上或完全抑制抗原之生物活性。
如本文中所用之術語「實質上類似」或「實質上相同」表示兩個數值(例如一數值與本發明抗體相關而另一數值與參考/比較抗體相關)之間具有足夠高之相似度，以使得熟習此項技術者將認為兩個值之間的差異在由該等值(例如Kd值)所量度之生物學特徵的範圍內幾乎不具有生物學及/或統計學顯著性。該兩個值之間的差異作為參考/比較值的函數，例如小於約50%、小於約40%、小於約30%、小於約20%及/或小於約10%。
如本文中所用之短語「實質上降低」或「實質上不同」表示兩個數值(通常一數值與一種分子相關而另一數值與參考/比較分子相關)之間的差異足夠大，以使得熟習此項技術者將認為兩個值之間的差異在由該等值(例如Kd值)所量度之生物學特徵的範圍內具有統計學顯著性。該兩個值之間的差異作為參考/比較分子之值的函數例如大於約10%、大於約20%、大於約30%、大於約40%及/或大於約50%。
抗體「效應功能」係指可歸因於抗體之Fc區(天然序列Fc區或胺基酸序列變異Fc區)之彼等生物活性，且隨抗體同型而變化。抗體效應功能之實例包括：Clq結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調；及B細胞活化。
本文中術語「Fc區」係用以定義免疫球蛋白重鏈之C端區，包括天然序列Fc區及變異Fc區。儘管免疫球蛋白重鏈之Fc區之邊界可變化，但人類IgG重鏈Fc區通常係定義為自位置Cys226之胺基酸殘基或自Pro230延伸至其羧基端。Fc區之C端離胺酸(根據EU編號系統為殘基447)可以例如在產生或純化抗體期間移除，或藉由重組工程改造編碼抗體重鏈之核酸移除。因此，完整抗體之組合物可包含已移除所有K447殘基之抗體群，未移除K447殘基之抗體群，及具有含K447殘基之抗體與無K447殘基之抗體之混合物的抗體群。
「功能性Fc區」具有天然序列Fc區之「效應功能」。例示性「效應功能」包括C1q結合；CDC；Fc受體結合；ADCC；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體；BCR)之下調等。該等效應功能通常需要Fc區與結合域(例如抗體可變域)組合，且可使用例如本文定義中所揭示之各種檢定評估。
「天然序列Fc區」包含與自然界中發現之Fc區之胺基酸序列一致的胺基酸序列。天然序列人類Fc區包括天然序列人類IgG1 Fc區(非A及A異型)、天然序列人類IgG2 Fc區、天然序列人類IgG3 Fc區及天然序列人類IgG4 Fc區，以及其天然存在之變異體。
「變異Fc區」包含因至少一個胺基酸修飾，較佳一或多個胺基酸取代，而不同於天然序列Fc區之胺基酸序列的胺基酸序列。較佳地，與天然序列Fc區或親本多肽之Fc區相比，變異Fc區具有至少一個胺基酸取代，例如在天然序列Fc區中或在親本多肽之Fc區中有約1個至約10個胺基酸取代，較佳有約1個至約5個胺基酸取代。本文中之變異Fc區較佳與天然序列Fc區及/或與親本多肽之Fc區具有至少約80%同源性，最佳至少約90%同源性，更佳至少約95%同源性。
「Fc受體」或「FcR」描述結合至抗體之Fc區的受體。在一些實施例中，FcR為天然人類FcR。在一些實施例中，FcR為結合IgG抗體之FcR(γ受體)且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII子類之受體，包括彼等受體之對偶基因變異體及替代性剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA(「活化受體」)及FcγRIIB(「抑制受體」)，其具有主要其細胞質域不同之類似胺基酸序列。活化受體FcγRIIA在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之活化基元(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之抑制基元(ITIM)。(參見例如Daron,Annu. Rev. Immunol. 15:203-234(1997))。FcR綜述於例如Ravetch及Kinet,Annu. Rev. Immunol 9:457-92(1991)；Capel等人，Immunomethods 4:25-34(1994)；及de Haas等人，J. Lab. Clin. Med. 126:330-41(1995)中。本文中之術語「FcR」涵蓋其他FcR，包括有待將來鑑別之FcR。
術語「Fc受體」或「FcR」亦包括新生兒受體FcRn，其負責將母體IgG轉移至胎兒(Guyer等人，J .Immunol . 117:587(1976)及Kim等人，J .Immunol . 24:249(1994))且調節免疫球蛋白之內穩定。已知量測與FcRn之結合的方法(參見例如Ghetie及Ward,Immunol .Today 18(12):592-598(1997)；Ghetie等人，Nature Biotechnology ,15(7):637-640(1997)；Hinton等人，J .Biol .Chem . 279(8):6213-6216(2004)；WO 2004/92219(Hinton等人))。
可例如在表現人類FcRn之轉殖基因小鼠或經轉染人類細胞株中，或在投與具有變異Fc區之多肽的靈長類動物中檢定人類FcRn高親和力結合多肽活體內與人類FcRn之結合及血清半衰期。WO 2000/42072(Presta)描述與FcR之結合得到改善或減弱之抗體變異體。亦參見例如Shields等人，J .Biol .Chem . 9(2):6591-6604(2001)。
「人類效應細胞」為表現一或多個FcR且執行效應功能之白血球。在某些實施例中，該等細胞至少表現FcγRIII且執行ADCC效應功能。介導ADCC之人類白血球的實例包括周邊血液單核細胞(PBMC)、自然殺傷(NK)細胞、單核細胞、細胞毒性T細胞及嗜中性白血球。效應細胞可自天然來源分離，例如自血液分離。
「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性」或「ADCC」係指細胞毒性之一種形式，其中結合於某些細胞毒性細胞(例如NK細胞、嗜中性白血球及巨噬細胞)上所存在之Fc受體(FcR)上的分泌性Ig使此等細胞毒性效應細胞能夠特異性結合至帶有抗原之目標細胞且隨後用細胞毒素殺死該目標細胞。介導ADCC之初級細胞NK細胞僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。FcR在造血細胞上之表現概述於Ravetch及Kinet,Annu. Rev. Immunol 9:457-92(1991)之第464頁上的表3中。為評估相關分子之ADCC活性，可執行活體外ADCC檢定，諸如美國專利第5,500,362號或第5,821,337號或美國專利第6,737,056號(Presta)中所述之檢定。適用於該等檢定之效應細胞包括PBMC及NK細胞。或者或另外，可例如在Clynes等人，PNAS USA 95:652-656(1998)中所揭示之動物模型中活體內評估相關分子之ADCC活性。
「補體依賴性細胞毒性」或「CDC」係指在補體存在下目標細胞之溶解。典型補體路徑之活化係由補體系統之第一組分(C1q)與(適當子類之)與同源抗原結合之抗體的結合而引起。為評估補體活化，可執行CDC檢定，例如如Gazzano-Santoro等人，J. Immunol. Methods 202:163(1996)中所述。Fc區胺基酸序列發生改變(具有變異Fc區之多肽)且C1q結合能力得到增強或降低之多肽變異體例如描述於美國專利第6,194,551 B1號及WO 1999/51642中。亦參見例如Idusogie等人，J. Immunol. 164:4178-4184(2000)。
術語「包含Fc區之抗體」係指包含Fc區之抗體。可例如在純化抗體期間，或藉由重組工程改造編碼抗體之核酸來移除Fc區之C端離胺酸(根據EU編號系統為殘基447)。因此，包含本發明之具有Fc區之抗體的組合物可包含具有K447之抗體、已移除所有K447之抗體或具有K447殘基之抗體與無K447殘基之抗體之混合物。
出於本文之目的，「受者人類構架」為包含源自人類免疫球蛋白構架或源自人類共同構架之VL或VH構架之胺基酸序列的構架。「源自」人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之受者人類構架可包含其相同胺基酸序列，或可含有預先存在之胺基酸序列變化。在存在預先存在之胺基酸變化時，存在較佳不超過5處，且較佳為4處或4處以下或3處或3處以下預先存在之胺基酸變化。在VH中存在預先存在之胺基酸變化時，較佳為彼等變化僅位於位置71H、73H及78H中之三處、兩處或一處；例如，彼等位置處之胺基酸殘基可為71A、73T及/或78A。在一實施例中，VL受者人類構架之序列與VL人類免疫球蛋白構架序列或人類共同構架序列一致。
「人類共同構架」為表示人類免疫球蛋白VL或VH構架序列之選擇中最常存在之胺基酸殘基的構架。一般而言，人類免疫球蛋白VL或VH序列係選自可變域序列之亞群。一般而言，序列之亞群為如Kabat等人中之亞群。在一實施例中，對於VL，該亞群為如Kabat等人中之亞群κI。在一實施例中，對於VH，該亞群為如Kabat等人中之亞群III。
「VH亞群III共同構架」包含獲自Kabat等人之可變重鏈亞群III中之胺基酸序列的共同序列。在一實施例中，VH亞群III共同構架胺基酸序列包含以下序列中之每一者之至少一部分或全部：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO:197)-H1-WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO:198)-H2-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC(SEQ ID NO:199)-H3-WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:200)。
「VL亞群I共同構架」包含獲自Kabat等人之可變輕鏈κ亞群I中之胺基酸序列的共同序列。在一實施例中，VH亞群I共同構架胺基酸序列包含以下序列中之每一者之至少一部分或全部:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:201)-L1-WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:202)-L2-GVPSRFSGSG SGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:203)-L3-FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:221)。
「生物樣品」(可互換地稱為「樣品」或「組織或細胞樣品」)涵蓋獲自個體之各種樣品類型且可用於診斷或監測檢定中。該定義涵蓋源於生物之血液及其他液體樣品；固體組織樣品，諸如活檢樣本或組織培養物或由其獲得之細胞，及其子代。該定義亦包括已在取得後以任何方式加以處理之樣品，該等方式諸如為以試劑處理、溶解或增濃某些組分(諸如蛋白質或聚核苷酸)，或嵌埋於半固體或固體基質中用於切片目的。術語「生物樣品」涵蓋臨床樣品且亦包括培養物中之細胞、細胞上清液、細胞溶胞物、血清、血漿、生物流體及組織樣品。生物樣品之來源可為來自新鮮、冷凍及/或保藏器官或組織樣品或活檢或抽出物之固體組織；血液或任何血液組分；體液，諸如腦脊髓液、羊水、腹膜液或間質液；來自個體之妊娠或發育中任何時間之細胞。在一些實施例中，生物樣品係獲自原發性或轉移性腫瘤。生物樣品可含有不與自然界中之組織天然混合之化合物，諸如防腐劑、抗凝劑、緩衝液、固定劑、營養素、抗生素或其類似物。
出於本文之目的，組織樣品之「切片」意謂組織樣品之單一部分或碎片，例如自組織樣品切下之組織或細胞薄片。應瞭解，可獲取組織樣品之多個切片且根據本發明進行分析。在一些實施例中，在形態學與分子層面上分析組織樣品之相同切片，或關於蛋白質與核酸進行分析。
詞語「標記物」在本文中使用時係指直接或間接結合或融合至諸如核酸探針或抗體之試劑且有助於偵測所結合或融合之試劑的化合物或組合物。標記物本身為可偵測的(例如放射性同位素標記物或螢光標記物)，或在酶標記物之狀況下可催化可偵測之受質化合物或組合物發生化學變化。
「藥劑」為用於治療所述病症或其症狀或用於處理副作用之活性藥物。
「病症」或「疾病」為將受益於用本發明之物質/分子或方法治療之任何病狀。此病症或疾病包括慢性及急性病症或疾病，包括使哺乳動物易於罹患所述病症之彼等病理病狀。本文中欲治療之病症的非限制性實例包括惡性及良性腫瘤、癌瘤、母細胞瘤及肉瘤。
術語「細胞增殖性病症」及「增殖性病症」係指與某種程度之異常細胞增殖相關之病症。在一實施例中，細胞增殖性病症為癌症。
如本文所使用之「腫瘤」係指所有的贅生性細胞生長及增殖(無論惡性抑或良性)以及所有的癌變前及癌性細胞與組織。如本文中所提及之術語「癌症」、「癌性」、「細胞增殖性病症」、「增殖性病症」及「腫瘤」並不互相排斥。
術語「癌症」及「癌性」係指或描述哺乳動物之通常特徵為不受調節之細胞生長/增殖的生理性病狀。癌症之實例包括(但不限於)癌瘤、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤及白血病。該等癌症之更特定的實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、垂體癌、食管癌、星形細胞瘤、軟組織肉瘤、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、胰臟癌、神經膠母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝腫瘤、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌、腦癌、子宮內膜癌、睪丸癌、膽管癌、膽囊癌、胃癌、黑素瘤及各種類型之頭頸部癌。血管生成功能失調會引起許多能用本發明之組合物及方法治療之病症。此等病症包括非贅生性病狀與贅生性病狀。贅生性病包括(但不限於)上述彼等病症。非贅生性病症包括(但不限於)不當或異常肥大、關節炎、類風濕性關節炎(RA)、牛皮癬、牛皮癬斑塊、類肉瘤病、動脈粥樣硬化、動脈粥樣硬化斑、糖尿病性及其他增殖性視網膜病(包括早產兒視網膜病)、晶狀體後纖維組織增生、新生血管性青光眼、年齡相關之黃斑部變性、糖尿病性黃斑部水腫、角膜新血管生成、角膜移植物新血管生成、角膜移植物排斥反應、視網膜/脈絡膜新血管生成、隅角新血管生成(虹膜紅變)、眼睛新生血管疾病、血管再狹窄、動靜脈畸形(AVM)、腦膜瘤、血管瘤、血管纖維瘤、甲狀腺增生(包括格雷氏病(Grave's disease))、角膜及其他組織移植、慢性炎症、肺炎、急性肺損傷/ARDS、敗血症、原發性肺循環血壓過高、惡性肺部積液(malignant pulmonary effusion)、腦水腫(例如與急性中風/閉合性頭部損傷/外傷有關)、滑膜炎、RA中之血管翳形成、骨化性肌炎、肥厚性骨形成、骨關節炎(OA)、難治性腹水、多囊卵巢病、子宮內膜異位、第三間隙積液疾病(3rd spacing of fluid diseases)(胰腺炎、腔室症候群(compartment syndrome)、燒傷、腸病)、子宮纖維瘤、早產、諸如IBD之慢性炎症(克羅恩氏病(Crohn's disease)及潰瘍性結腸炎)、腎同種異體移植排斥反應、發炎性腸病、腎病症候群、不當或異常組織腫塊生長(非癌症)、血友病性關節、肥厚性瘢痕、頭髮生長之抑制、奧韋氏症候群(Osler-Weber syndrome)、化膿性肉芽腫晶狀體後纖維組織增生、硬皮病、沙眼、血管黏附、滑膜炎、皮炎、先兆子癇、腹水、心包積液(諸如與心包炎相關之心包積液)及胸腔積液。
術語「消耗性」病症(例如消耗性症候群、惡病質、肌肉減少症)係指由不當及/或不健康之體重減輕或體細胞質量減輕所引起之病症。在老年人以及AIDS及癌症患者中，消耗病會導致不當之體重減輕，包括脂肪區與無脂肪區。消耗病可能為不恰當之食物攝入及/或與疾病及/或衰老過程相關之代謝改變的結果。癌症患者及AIDS患者以及大範圍手術後或患有慢性感染、免疫疾病、甲狀腺機能亢進、克羅恩氏病、精神性疾病、慢性心臟衰竭或其他嚴重外傷之患者通常患有消耗病，消耗病有時亦稱為惡病質、代謝病症且有時稱為進食障礙。另外，惡病質之特徵為代謝亢進及分解代謝過度。儘管通常可互換使用惡病質與消耗病來指代消耗性病況，但存在至少一種研究主體，其根據無脂肪質量且尤其體細胞質量之減輕將惡病質與消耗性症候群區別開來(Mayer,1999,J. Nutr. 129(1S增刊):256S-259S)。肌肉減少症，即會影響老年個體之另一此類病症之特徵通常為肌肉質量減輕。患惡病質或肌肉減少症之個體中可能產生如上所述之末期消耗病。
如本文所使用之「治療」係指試圖改變所治療之個體或細胞之自然過程的臨床干預，且可出於預防之目的或在臨床病理學過程中進行。理想治療效果包括預防疾病發作或復發、緩解症狀、減小疾病之任何直接或間接病理學後果、降低疾病進展速率、改善或緩和疾病狀態，及緩解或改良預後。在一些實施例中，使用本發明之抗體來延遲疾病或病症之發展。
「抗血管生成劑」或「血管生成抑制劑」係指直接地或間接地抑制血管生成、血小管生成或不當之血管通透性的小分子量物質、聚核苷酸、多肽、分離蛋白、重組蛋白、抗體或其結合物或融合蛋白。舉例而言，抗血管生成劑為如上文所定義之血管生成劑之抗體或其他拮抗劑，例如針對VEGF之抗體、針對VEGF受體之抗體、阻斷VEGF受體信號傳導之小分子(例如PTK787/ZK2284、SU6668、SUTENT/SU11248(舒尼替尼蘋果酸鹽(sunitinib malate))、AMG706)。抗血管生成劑亦包括天然血管生成抑制劑，例如血管生長抑素、內皮生長抑素等。參見例如Klagsbrun及D'Amore,Annu. Rev. Physiol.,53:217-39(1991)；Streit及Detmar,Oncogene,22:3172-3179(2003)(例如表3列出惡性黑色素瘤之抗血管生成療法)；Ferrara & Alitalo,Nature Medicine 5(12):1359-1364(1999)；Tonini等人，Oncogene,22:6549-6556(2003)(例如表2列出抗血管生成因子)；及Sato Int. J. Clin. Oncol.,8:200-206(2003)(例如表1列出臨床試驗中所用之抗血管生成劑)。
「個體(individual/subject)」或「患者」為脊椎動物。在某些實施例中，脊椎動物為哺乳動物。哺乳動物包括但不限於農畜(諸如牛)、運動型動物、寵物(諸如貓、狗及馬)、靈長類動物、小鼠及大鼠。在某些實施例中，哺乳動物為人類。
「有效量」係指在必需劑量下及在必需時間內可有效達成所需治療性或預防性結果的量。
本發明之物質/分子、促效劑或拮抗劑之「治療有效量」可視諸如以下之因素而變化：個體之疾病狀態、年齡、性別及體重，以及物質/分子、促效劑或拮抗劑於個體體內誘發所需反應之能力。治療有效量亦為物質/分子、促效劑或拮抗劑之治療有益效果超過其任何有毒或有害效應的量。「預防有效量」係指在必需劑量下及在必需時間內可有效達成所需預防結果之量。由於預防劑量係在患病之前或在患病早期用於個體，因此預防有效量通常(但不一定)小於治療有效量。
如本文中所用之術語「細胞毒性劑」係指能抑制或阻止細胞之功能及/或導致細胞破壞之物質。該術語意欲包括放射性同位素(例如At211 、I131 、I125 、Y90 、Re186 、Re188 、Sm153 、Bi212 、P32 及Lu之放射性同位素)；化學治療劑，例如甲胺蝶呤(methotrexate)、阿黴素(adriamicin)、長春花生物鹼(vinca alkaloid)(長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、依託泊苷(etoposide))、小紅莓(doxorubicin)、美法侖(me1pha1an)、絲裂黴素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、道諾黴素(daunorubicin)或其他嵌入劑；酶及其片段，諸如溶核酶；抗生素；及毒素，諸如細菌、真菌、植物或動物來源之小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段及/或變異體；及以下所揭示之各種抗瘤劑或抗癌劑。其他細胞毒性劑描述於下文中。殺腫瘤劑可破壞腫瘤細胞。
「毒素」為能夠對細胞生長或增殖具有有害效應之任何物質。
「化學治療劑」為適用於治療癌症之化合物。化學治療劑之實例包括：烷基化劑，諸如塞替派(thiotepa)及環磷醯胺(cyclosphosphamide；CYTOXAN)；烷基磺酸酯，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶(aziridine)，諸如苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)及尤利多巴(uredopa)；乙烯亞胺(ethylenimine)及甲基三聚氰胺，包括六甲密胺(altretamine)、三伸乙基蜜胺(triethylenemelamine)、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫代磷醯胺(triethylenethiophosphoramide)及三甲密胺(trimethylomelamine)；多聚乙醯(acetogenin)(尤其布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氫大麻酚(屈大麻酚(dronabinol)，MARINOL)；β-拉帕酮(beta-lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙鹼(colchicine)；樺木酸(betulinic acid)；喜樹鹼(camptothecin)(包括合成類似物拓朴替康(topotecan；HYCAMTIN)、CPT-11(伊立替康(irinotecan；CAMPTOSAR))、乙醯基喜樹鹼、斯考普萊汀(scopolectin)及9-胺基喜樹鹼)；苔蘚抑素(bryostatin)；卡利他汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)及比折來新(bizelesin)合成類似物)；足葉草毒素(podophyllotoxin)；足葉草酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；自念珠藻環肽(cryptophycin)(尤其自念珠藻環肽1及自念珠藻環肽8)；海兔毒素(dolastatin)；多卡米辛(duocarmycin)(包括合成類似物KW-2189及CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉鹼(pancratistatin)；沙考地汀(sarcodictyin)；海綿他汀(spongistatin)；氮芥(nitrogen mustard)，諸如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷醯胺、雌莫司汀(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、鹽酸氧化氮芥、美法侖、新恩比興(novembichin)、膽甾醇對苯乙酸氮芥(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、烏拉莫司汀(uracil mustard)；亞硝基脲，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及拉甯司汀(ranimnustine)；抗生素，諸如烯二炔抗生素(例如卡奇黴素(calicheamicin)，尤其卡奇黴素γ1I及卡奇黴素ωI1(參見例如Nicolaou等人，Angew. Chem Intl. Ed. Engl .,33: 183-186(1994))；CDP323(一種口服α-4整合素抑制劑)；達內黴素(dynemicin)，包括達內黴素A；埃斯培拉黴素(esperamicin)；以及新製癌菌素發色團及相關色蛋白烯二炔抗生素發色團)、阿克拉黴素(aclacinomysin)、放線菌素(actinomycin)、奧斯拉菌素(authramycin)、偶氮絲胺酸(azaserine)、博來黴素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、卡拉比星(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌黴素(carzinophilin)、色黴素(chromomycin)、放線菌素D(dactinomycin)、道諾黴素、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、小紅莓(包括ADRIAMYCIN、N-嗎啉基-小紅莓、氰基-(N-嗎啉基)-小紅莓、2-(N-吡咯啉基)-小紅莓、鹽酸小紅莓脂質體注射液(DOXIL)、脂質體小紅莓TLC D-99(MYOCET)、聚乙二醇化脂質體小紅莓(CAELYX)及去氧小紅莓(deoxydoxorubicin))、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(諸如絲裂黴素C)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾拉黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、潑非黴素(porfiromycin)、嘌呤黴素、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑黴素(streptonigrin)、鏈脲黴素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如甲胺喋呤、吉西他濱(gemcitabine；GEMZAR)、喃氟啶(tegafur；UFTORAL)、卡西他濱(capecitabine；XELODA)、埃博黴素(epothilone)及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如迪諾特寧(denopterin)、甲胺喋呤、喋羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-氮雜尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二去氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素，諸如卡普睪酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內酯(testolactone)；抗腎上腺藥劑，諸如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如夫羅林酸(frolinic acid)；醋葡醛內酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷；胺基乙醯丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；貝司他布(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；艾達曲卡(edatraxate)；得弗伐胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾弗尼辛(elfornithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；埃博黴素；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖(lentinan)；羅尼代寧(lonidainine)；類美登素(maytansinoids)，諸如美登素(maytansine)及美登木素(ansamitocin)；丙脒腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidanmol)；硝爾靈(nitraerine)；噴司他丁(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙醯肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多醣複合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)；雷佐生(razoxane)；根瘤菌素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌；2,2',2'-三氯三乙胺；單端孢黴烯族毒素(trichothecene)(尤其T-2毒素、韋拉庫林A(verracurin A)、桿孢菌素A(roridin A)及安奎定(anguidine))；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)(ELDISINE、FILDESIN)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；雙溴丙基哌嗪(pipobroman)；伽托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside；「Ara-C」)；噻替哌；紫杉醇(taxoid)，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel；TAXOL)、白蛋白工程改造之太平洋紫杉醇之奈米粒子調配物(ABRAXANETM )及多烯紫杉醇(docetaxel)(TAXOTERE)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；6-硫代鳥嘌呤；巰基嘌呤(mercaptopurine)；甲胺喋呤；鉑試劑，諸如順鉑(cisplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)(例如ELOXATIN)及卡鉑(carboplatin)；防止微管蛋白聚合形成微管的長春鹼類(vincas)，包括長春鹼(VELBAN)、長春新鹼(ONCOVIN)、長春地辛(ELDISINE、FILDESIN)及長春瑞賓(vinorelbine；NAVELBINE)；依託泊苷(VP-16)；異環磷醯胺；米托蒽醌；甲醯四氫葉酸(leucovorin)；諾凡特龍(novantrone)；依達曲沙(edatrexate)；道諾黴素；胺基喋呤；伊班膦酸鹽(ibandronate)；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；類視黃素，諸如視黃酸，包括貝瑟羅汀(bexarotene；TARGRETIN)；雙膦酸鹽，諸如氯屈膦酸鹽(clodronate)(例如BONEFOS或OSTAC)、依替膦酸鹽(etidronate；DIDROCAL)、NE-58095、唑來膦酸(zoledronic acid)/唑來膦酸鹽(zoledronate；ZOMETA)、阿侖膦酸鹽(alendronate；FOSAMAX)、帕米膦酸鹽(pamidronate；AREDIA)、替魯膦酸鹽(tiludronate；SKELID)或利塞膦酸鹽(risedronate；ACTONEL)；曲沙他濱(troxacitabine)(1,3-二氧戊環核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，尤其能抑制異常細胞增殖中所涉及之信號傳導路徑中之基因表現的反義寡核苷酸，諸如PKC-α、Raf、H-Ras及表皮生長因子受體(EGF-R)；疫苗，諸如THERATOPE疫苗及基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN疫苗及VAXID疫苗；拓撲異構酶1抑制劑(例如LURTOTECAN)；rmRH(例如ABARELIX)；BAY439006(索拉非尼(sorafenib)；Bayer)；SU-11248(舒尼替尼(sunitinib)，SUTENT，Pfizer)；哌立福新(perifosine)、COX-2抑制劑(例如塞來昔布(celecoxib)或依託昔布(etoricoxib))、蛋白體抑制劑(例如PS341)；硼替佐米(bortezomib；VELCADE)；CCI-779；替吡法尼(tipifarnib；R11577)；歐拉非尼(orafenib)、ABT510；Bcl-2抑制劑，諸如奧利默森鈉(oblimersen sodium；GENASENSE)；匹克生瓊(pixantrone)；EGFR抑制劑(參見以下定義)；酪胺酸激酶抑制劑(參見以下定義)；絲胺酸-蘇胺酸激酶抑制劑，諸如雷帕黴素(rapamycin)(西羅莫司(sirolimus)，RAPAMUNE)；法尼基轉移酶(farnesyltransferase)抑制劑，諸如洛那法尼(lonafarnib；SCH 6636，SARASARTM )；及任何上述化學治療劑之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物；以及兩種或兩種以上上述化學治療劑之組合，諸如CHOP，其為環磷醯胺、小紅莓、長春新鹼及潑尼龍之組合療法之縮寫；及FOLFOX，其為奧沙利鉑(ELOXATINTM )與5-FU及甲醯四氫葉酸之組合之治療方案的縮寫。
如本文中所定義之化學治療劑包括用以調控、降低、阻斷或抑制會促進癌瘤生長之激素作用的「抗激素劑」或「內分泌治療劑」。其本身可為激素，包括(但不限於)：具有混合促效/拮抗概況之抗雌激素，包括他莫昔芬(NOLVADEX)、4-羥基他莫昔芬、托瑞米芬(toremifene；FARESTON)、艾多昔芬(idoxifene)、曲洛昔芬(droloxifene)、雷洛昔芬(raloxifene；EVISTA)、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬鹽酸鹽(keoxifene)及選擇性雌激素受體調節劑(SERM)，諸如SERM3；不具有促效特性之純抗雌激素，諸如氟維司群(fulvestrant；FASLODEX)及EM800(該等藥劑可阻斷雌激素受體(ER)二聚化、抑制DNA結合、增加ER周轉及/或抑制ER含量)；芳香酶抑制劑，包括類固醇芳香酶抑制劑(諸如福美司坦(formestane)及依西美坦(exemestane；AROMASIN))及非類固醇芳香酶抑制劑(諸如阿那曲唑(anastrazole；ARIMIDEX)、來曲唑(letrozole；FEMARA)及胺魯米特)，以及其他芳香酶抑制劑，包括伏氯唑(vorozole；RIVISOR)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate；MEGASE)、法屈唑(fadrozole)及4(5)-咪唑；黃體激素釋放激素促效劑，包括亮丙瑞林(leuprolide；LUPRON及ELIGARD)、戈舍瑞林(goserelin)、布舍瑞林(buserelin)及曲特瑞林(tripterelin)；性類固醇，包括孕激素(諸如乙酸甲地孕酮及乙酸甲羥孕酮)、雌激素(諸如己烯雌酚(diethylstilbestrol)及普雷馬林(premarin))及雄激素/類視黃素(諸如氟羥甲基睪酮(fluoxymesterone)、所有反式視黃酸及芬維A胺(fenretinide))；奧那司酮(onapristone)；抗孕酮劑；雌激素受體下調劑(ERD)；抗雄激素，諸如氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)及比卡魯胺(bicalutamide)；及任何上述激素之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物；以及兩種或兩種以上上述激素之組合。
「生長抑制劑」在本文中使用時，係指能在活體外或活體內抑制細胞(諸如表現EGFL7之細胞)生長之化合物或組合物。因此，生長抑制劑可為能顯著降低S期中之細胞(諸如表現EGFL7之細胞)百分比的藥劑。生長抑制劑之實例包括能阻斷細胞週期進程(在除S期以外之階段)之藥劑，諸如誘導G1停滯及M期停滯之藥劑。經典M期阻斷劑包括長春鹼類(長春新鹼及長春鹼)、紫杉烷(taxane)及拓撲異構酶II抑制劑(諸如小紅莓、表柔比星、道諾黴素、依託泊苷及博萊黴素)。能使G1停滯之彼等藥劑亦擴溢為能使S期停滯，例如DNA烷化劑，諸如他莫西芬、潑尼松(prednisone)、達卡巴嗪、氮芥、順鉑、甲胺喋呤、5-氟尿啶及ara-C。其他資訊可見於Mendelsohn及Israel編，The Molecular Basis of Cancer ,第1章，標題為「Cell cycle regulation,oncogenes,and antineoplastic drugs」Murakami 等人，(WB Saunders: Philadelphia,1995),例如第13頁中。紫杉烷(太平洋紫杉醇與多烯紫杉醇)皆為源自紫杉樹之抗癌藥。源自歐洲紫杉之多烯紫杉醇(TAXOTERE,Rhone-Poulenc Rorer)為太平洋紫杉醇(TAXOL,Bristol-Myers Squibb)之半合成類似物。太平洋紫杉醇及多烯紫杉醇促進由微管蛋白二聚體組裝微管且藉由防止解聚合而使微管穩定，此導致細胞之有絲分裂受到抑制。
「小紅莓」為一種蒽環黴素抗生素。小紅莓之完整化學名稱為(8S-順)-10-[(3-胺基-2,3,6-三去氧-α-L-來蘇-己哌喃糖基)氧基]-7,8,9,10-四氫-6,8,11-三羥基-8-(羥基乙醯基)-1-甲氧基-5,12-幷四苯二酮。
術語「包含Fc區之多肽」係指包含Fc區之多肽，諸如抗體或免疫黏附素(參見下文定義)。可例如在純化多肽期間，或藉由重組工程改造編碼多肽之核酸來移除Fc區之C端離胺酸(根據EU編號系統為殘基447)。因此，包含本發明之具有Fc區之多肽的組合物可包含具有K447之多肽、已移除所有K447之多肽或具有K447殘基之多肽與無K447殘基之多肽之混合物。
貫穿本說明書及申請專利範圍，詞語「包含(comprise)」或其變化形式(諸如comprises或comprising)應理解為意謂包括所述整數或整數組但不排除任何其他整數或整數組。
產生展現較少或無HAMA反應之變異抗體
HAMA反應之減少或消除為臨床開發合適治療劑之顯著態樣。參見例如Khaxzaeli等人，J. Natl. Cancer Inst.(1988),80:937；Jaffers等人，Transplantation(1986),41:572；Shawler等人，J. Immunol.(1985),135:1530；Sears等人，J. Biol. Response Mod.(1984),3:138；Miller等人，Blood(1983),62:988；Hakimi等人，J. Immunol.(1991),147:1352；Reichmann等人，Nature(1988),332:323；Junghans等人，Cahcer Res.(1990).50:1495。如本文所述，本發明提供經人類化以使得HAMA反應減少或消除之抗體。可使用此項技術中已知之常規方法進一步獲得此等抗體之變異體，其中一些方法在下文中作進一步描述。
舉例而言，來自如本文所述之抗體之胺基酸序列可充當使構架及/或高變序列多樣化之起始(親本)序列。連接有起始高變序列之所選構架序列在本文中稱為受者人類構架。雖然受者人類構架可來自或源自人類免疫球蛋白(其VL及/或VH區)，但受者人類構架較佳可來自或源自人類共同構架序列，此係因為已證明該等構架在人類患者中具有最低免疫原性或不具有免疫原性。
在受者源自人類免疫球蛋白時，可視情況選擇基於與供體構架序列之同源性藉由比對供體構架序列與人類構架序列集合中之各種人類構架序列來選擇的人類構架序列，且選擇與受者最同源之構架序列。
在一實施例中，本文之人類共同構架來自或源自VH亞群III及/或VL κ亞群I共同構架序列。
因此，VH受者人類構架可包含以下構架序列中之一者、二者、三者或所有：FR1，其包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO:197)，FR2，其包含WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO:198)，FR3，其包含RFTISX1 DX2 SKNTX3 YLQMNSLRAEDTAVYYC(SEQ ID NO:205)，其中X1 為A或R，X2 為T或N，且X3 為A或L，FR4，其包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:200)。
在一實施例中，VH受者人類構架包含以下構架序列中之一者、二者、三者或所有:FR1，其包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO:197)，FR2，其包含WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO:198)，FR3，其包含RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC(SEQ ID NO:231)，RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCA(SEQ ID NO:206)，RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:207)，RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCS(SEQ ID NO:208)或RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSR(SEQ ID NO:209)，FR4，其包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:200)。
因此，VL受者人類構架可包含以下構架序列中之一者、兩者、三者或所有:FR1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:201)，FR2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:202)，FR3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:203)，FR4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:221)。
雖然受者序列可與無論來自人類免疫球蛋白抑或來自人類共同構架之所選人類構架序列一致，但本發明涵蓋該受者序列可包含相對於人類免疫球蛋白序列或人類共同構架序列預先存在之胺基酸取代。此等預先存在之取代較佳為極少；相對於人類免疫球蛋白序列或共同構架序列通常僅有四個、三個、兩個或一個胺基酸差異。
將非人類抗體之高變區殘基併入VL及/或VH受者人類構架中。舉例而言，可併入對應於Kabat CDR殘基、Chothia高變環殘基、Abm殘基及/或接觸殘基之殘基。視情況併入如下擴展之高變區殘基：24-34(L1)、50-56(L2)及89-97(L3)、26-35(H1)、50-65或49-65(H2)及93-102、94-102或95-102(H3)。
雖然本文中討論高變區殘基之「併入」，但應瞭解，此可以多種方式達成，例如編碼所需胺基酸序列之核酸可藉由使編碼小鼠可變域序列之核酸突變，以便使其構架殘基變成受者人類構架殘基，或藉由使編碼人類可變域序列之核酸突變，以便使高變域殘基變成非人類殘基，或藉由合成編碼所需序列之核酸等而產生。
在本文之實例中，藉由編碼人類受者序列之核酸的Kunkel突變誘發，對各高變區使用獨立寡核苷酸來產生高變區移植變異體。Kunkel等人，Methods Enzymol. 154:367-382(1987)。可使用常規技術在構架及/或HVR內引入適當變化，以校正及重建適當的高變區抗原相互作用。
可使用噬菌體(噬菌粒)呈現(在一些情形下，本文亦稱作噬菌體呈現)作為產生及篩檢由序列隨機突變所產生之文庫中之許多不同的潛在變異抗體之方便且快速的方法。然而，用熟習此項技術者可利用製造及篩檢已改變之抗體之其他方法。
噬菌體(噬菌粒)呈現技術已提供產生及選擇結合至配位體(諸如抗原)之新穎蛋白質的強有力工具。使用噬菌體(噬菌粒)呈現技術允許產生可迅速分選出彼等以高親和力與目標分子結合之序列的大型蛋白質變異體文庫。一般使編碼變異多肽之核酸與編碼病毒鞘蛋白(諸如基因III蛋白或基因VIII蛋白)之核酸序列融合。已開發出使編碼蛋白質或多肽之核酸序列與編碼一部分基因III蛋白之核酸序列融合之單價噬菌粒呈現系統。(Bass,S.,Proteins, 8:309(1990)；Lowman及Wells,Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3:205(1991))。在單價噬菌粒呈現系統中，以低含量表現基因融合體，且亦表現野生型基因III蛋白以使粒子之感染力得以保持。許多專利(例如，美國專利第5,723,286號、美國專利第5,432,018號、美國專利第5,580,717號、美國專利第5,427,908號及美國專利第5,498,530號)已揭示產生肽文庫及篩檢彼等文庫之方法。
已以多種方法製備抗體或抗原結合多肽之文庫，該等方法包括藉經插入隨機DNA序列來變單個基因或藉由選殖相關基因家族。使用噬菌體(噬菌粒)呈現來呈現抗體或抗原結合片段之方法已描述於美國專利第5,750,373號、第5,733,743號、第5,837,242號、第5,969,108號、第6,172,197號、第5,580,717號及第5,658,727號中。接著針對具有所需特徵之抗體或抗原結合蛋白的表現篩檢文庫。
將所選胺基酸取代至模板核酸中之方法在此項技術中為充分確立的，其中一些在本文中有描述。舉例而言，可使用Kunkel方法取代高變區殘基。參見例如Kunkel等人，Methods Enzymol . 154:367-382(1987)。
寡核苷酸之序列包括為欲改變之高變區殘基所設計的一或多個密碼子組。密碼子組為一組用於編碼所需變異胺基酸之不同核苷酸三聯體序列。如下文根據IUB代碼所示，密碼子組可使用指示特定核苷酸或核苷酸之等莫耳混合物的符號來表示。
IUB代碼
G鳥嘌呤
A腺嘌呤
T胸嘧啶
C胞嘧啶
R(A或G)
Y(C或T)
M(A或C)
K(G或T)
S(C或G)
W(A或T)
H(A或C或T)
B(C或G或T)
V(A或C或G)
D(A或G或T)
N(A或C或G或T)
舉例而言，在密碼子組DVK中，D可為核苷酸A或G或T；V可為A或G或C；且K可為G或T。此密碼子組可提供18種不同密碼子且可編碼胺基酸Ala、Trp、Tyr、Lys、Thr、Asn、Lys、Ser、Arg、Asp、Glu、Gly及Cys。
可使用標準方法合成寡核苷酸或引子組。一組寡核苷酸可例如由固相合成來合成，其含有表示由密碼子組提供之核苷酸三聯體之所有可能的組合及將編碼所需胺基酸群組之序列。在此項技術中熟知在某些位置具有所選核苷酸「簡併性」之寡核苷酸的合成。該等具有某些密碼子組之核苷酸組可使用商業核酸合成器(例如可獲自Applied Biosystems,Foster City,CA)來合成，或可購得(例如自Life Technologies,Rockville,MD購得)。因此，所合成之一組具有特定密碼子組之寡核苷酸通常應包括複數個具有不同序列之寡核苷酸，該等差異由整個序列內之密碼子組產生。根據本發明使用之寡核苷酸具有允許與可變域核酸模板雜交且亦可包括用於選殖目的之限制酶位點的序列。
在一種方法中，編碼變異胺基酸之核酸序列可藉由寡核苷酸介導之突變誘發產生。如Zoller等人，Nucleic Acids Res. 10:6487-6504(1987)所述，此技術在此項技術中為熟知的。簡言之，藉由使編碼所需密碼子組之寡核苷酸組與DNA模板雜交來產生編碼變異胺基酸之核酸序列，其中該模板為含有可變區核酸模板序列之質體之單股形式。雜交後，使用DNA聚合酶來合成模板之整個第二互補股，該第二互補股因此將合併有寡核苷酸引子且將含有由寡核苷酸組提供之密碼子組。
一般而言，使用長度為至少25個核苷酸之寡核苷酸。最佳寡核苷酸應具有在編碼突變之核苷酸之任一側與模板完全互補的12至15個核苷酸。此確保寡核苷酸將與單股DNA模板分子適當雜交。寡核苷酸易於使用此項技術中已知且諸如由Crea等人，Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA ,75:5765(1978)所述之技術來合成。
由彼等源自噬菌體M13載體(適合的為市售M13mp18及M13mp19載體)之載體或彼等如由Viera等人，Meth. Enzymol. ,153:3(1987)所述含有單股噬菌體複製起點之載體產生DNA模板。因此，可將欲突變之DNA插入該等載體之一中以產生單股模板。單股模板之產生描述於Sambrook等人，同上之4.21-4.41章節中。
為改變天然DNA序列，在適合雜交條件下，使寡核苷酸與單股模板雜交。接著添加DNA聚合酶(通常為T7DNA聚合酶或DNA聚合酶I之Klenow片段)以使用寡核苷酸作為合成引子來合成該模板之互補股。由此形成異源雙鏈體分子以便使一股DNA編碼突變形式之基因1，且另一股(原始模板)編碼基因1之天然的未改變序列。接著將此異源雙鏈體分子轉型於適合宿主細胞中，該宿主細胞通常為原核生物，諸如大腸桿菌JM101。在使細胞生長後，將其塗覆於瓊脂糖板上且使用經32-磷酸鹽放射性標記之寡核苷酸引子篩檢以鑑別含有突變DNA之菌落。
可對上文剛描述之方法作修改以便產生同源雙鏈體分子，其中質體之兩股均含有突變。修改如下：使單股寡核苷酸與如上所述之單股模板黏接。將三種去氧核糖核苷酸(即去氧核糖腺苷(dATP)、去氧核糖鳥苷(dGTP)及去氧核糖胸苷(dTT))之混合物與稱為dCTP-(aS)之經修飾硫代去氧核糖胞嘧啶(可自Amersham獲得)組合。將此混合物添加至模板-寡核苷酸複合物中。向此混合物中添加DNA聚合酶後，產生除突變鹼基外與模板相同之一股DNA。另外，此股新的DNA將含有dCTP-(aS)而非dCTP，該dCTP-(aS)用以保護該股DNA以免經限制性核酸內切酶消化。在利用適當限制酶於雙股異源雙鏈體之模板股中產生缺口後，可用ExoIII核酸酶或另一適當核酸酶越過含有欲突變誘發之位點的區域來消化模板股。接著終止反應，留下僅部分為單股之分子。接著在所有四種三磷酸去氧核糖核苷酸、ATP及DNA連接酶存在下，使用DNA聚合酶形成完整雙股DNA同源雙鏈體。接著可使此同源雙鏈體分子轉型於適合之宿主細胞中。
如先前所指示，寡核苷酸組之序列具有足以與模板核酸雜交之長度且亦可(但未必)含有限制性位點。可由彼等源自噬菌體M13載體之載體或如由Viera等人，Meth. Enzymol. ,153:3(1987)所述含有單股噬菌體複製起點之載體產生DNA模板。因此，必須將欲突變之DNA插入該等載體之一中以產生單股模板。單股模板之產生描述於Sambrook等人，同上之4.21-4.41章節中。
根據另一方法，可藉由提供上游及下游寡核苷酸組來產生文庫，各組具有複數個具有不同序列之寡核苷酸，該等不同序列係由寡核苷酸之序列內所提供之密碼子組建立。上游及下游寡核苷酸組以及可變域模板核酸序列可用於聚合酶鏈反應中以產生PCR產物之「文庫」。該等PCR產物可稱作「核酸卡匣」，此係由於可使用已建立之分子生物技術使其與其他相關或不相關核酸序列(例如病毒鞘蛋白及二聚化域)融合。
PCR引子之序列包括一或多個針對HVR中之溶劑可接近且高度不同的位置之經設計密碼子組。如上所述，密碼子組為一組用於編碼所要變異胺基酸之不同核苷酸三聯體序列。
可使用標準重組技術分離及選殖如經適當篩檢/選擇步驟選擇之符合所要準則之抗體選擇物。
抗體片段
本發明涵蓋抗體片段。抗體片段可由諸如酶促消化之傳統方法，或藉由重組技術產生。在某些情形下，使用抗體片段而非使用整個抗體具有優點。較小尺寸之片段可使得快速清除且可導致改良實體腫瘤發作。關於某些抗體片段之綜述，參見Hudson等人，(2003)Nat. Med. 9:129-134。已開發出各種技術用於產生抗體片段。傳統上，此等片段可經由完整抗體之蛋白水解消化得到(參見例如Morimoto等人，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117(1992)；及Brennan等人，Science, 229:81(1985))。然而，此等片段目前可由重組宿主細胞直接產生。Fab、Fv及ScFv抗體片段均可在大腸桿菌(E. coli)中表現且自大腸桿菌分泌，因此可使得易於產生大量此等片段。可自上文所討論之抗體噬菌體文庫中分離抗體片段。或者，可直接自大腸桿菌回收Fab'-SH片段且化學偶合以形成F(ab')2 片段(Carter等人，Bio/Technology 10:163-167(1992))。根據另一方法，F(ab')2 片段可自重組宿主細胞培養物直接分離。美國專利第5,869,046號中描述包含救助受體結合抗原決定基殘基的具有增加之活體內半衰期之Fab及F(ab')2 片段。產生抗體片段之其他技術對熟練從業者顯而易見。在某些實施例中，抗體為單鏈Fv片段(scFv)。參見WO 93/16185、美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。Fv及scFv為唯一的具有不含恆定區之完整結合位點的物質；因此，其可適於在活體內使用期間減少非特異性結合。可構築scFv融合蛋白以使效應蛋白融合於scFv之胺基或羧基端。參見Antibody Engineering ,Borrebaeck編，同上。抗體片段亦可為例如如美國專利第5,641,870號中所述之「線性抗體」。該等線性抗體可為單特異性或雙特異性抗體。
人類化抗體
本發明涵蓋人類化抗體。此項技術中已知將非人類抗體人類化之各種方法。舉例而言，人類化抗體中可引入一或多個來自非人類來源之胺基酸殘基。此等非人類胺基酸殘基通常稱為「輸入」殘基，其通常係取自「輸入」可變域。可基本上按照Winter及同事之方法(Jones等人，(1986)Nature 321:522-525；Riechmann等人，(1988)Nature 332：323-327；Verhoeyen等人，(1988)Science 239:1534-1536)藉由用高變區序列取代人類抗體之相應序列來進行人類化。因此，該等「人類化」抗體為嵌合抗體(美國專利第4,816,567號)，其中實質上近似完整之人類可變域已經源自非人類物種之相應序列取代。實際上，人類化抗體通常為一些高變區殘基及可能之一些FR殘基由齧齒動物抗體中類似位點之殘基取代的人類抗體。
欲用於製造人類化抗體之人類可輕鏈與重鏈變域之選擇對於降低抗原性極其重要。根據所謂的「最佳匹配」法，針對整個已知人類可變域序列文庫篩檢齧齒動物抗體之可變域序列。接著將最接近齧齒動物序列之人類序列接受為人類化抗體之人類構架。參見例如Sims等人，(1993)J .Immunol. 151:2296；Chothia等人，(1987)J.Mol. Biol. 196:901。另一方法使用源自具有輕鏈或重鏈之特定亞群之所有人類抗體的共同序列的特定構架。若干不同人類化抗體可使用同一構架。參見例如Carter等人，(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA ,89:4285；Presta等人，(1993)J. Immunοl. ,151:2623。
通常更希望在使抗體保留對抗原之高親合力及其他有利生物特性時進行人類化。為達成此目標，根據一種方法，藉由使用親本序列及人類化序列之三維模型分析親本序列及各種概念上之人類化產物的方法來製備人類化抗體。三維免疫球蛋白模型普遍可得且為熟習此項技術者所熟知。可獲得說明及呈現所選擇之候選免疫球蛋白序列之可能三維構型結構的電腦程式。該等呈現之檢驗允許分析殘基在候選免疫球蛋白序列起作用過程中可能的作用，亦即，分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原之能力的殘基。以此方式，可自接受者序列及輸入序列選擇FR殘基且加以組合，以便獲得所需抗體特徵，諸如對目標抗原之親和力增加。一般而言，高變區殘基直接且大部分實質上涉及對抗原結合之影響。
人類抗體
可藉由將自源自人類之噬菌體呈現文庫所選擇之Fv純系可變域序列與如上所述之已知人類恆定域序列組合來構築本發明之人類抗體。或者，可由融合瘤方法製造本發明之人類單株抗體。亦已描述用以產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類雜骨髓瘤細胞株(Kozbor,J. Immunol. ,133:3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications ,第51-63頁(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；及Boerner等人，J. Immunol. ,147: 86(1991))。
現有可能產生在免疫後在不產生內源免疫球蛋白之情況下能夠產生全譜系人類抗體之轉殖基因動物(例如小鼠)。舉例而言，已描述嵌合及生殖系突變體小鼠中抗體重鏈連接區(JH)基因的同型純合子缺失導致對於內源抗體產生之完全抑制。將人類生殖系免疫球蛋白基因陣列轉移至此等生殖系突變體小鼠體內將會於抗原激發後引起人類抗體之產生。參見例如Jakobovits等人，Proc. Natl. Acad. Sci USA ,90:2551(1993)；Jakobovits等人，Nature, 362: 255(1993)；Bruggermann等人，Year in Immunol., 7: 33(1993)。
亦可使用基因改組自非人類(例如齧齒動物)抗體獲得人類抗體，其中人類抗體具有與初始非人類抗體類似之親和力及特異性。根據此方法(亦稱為「抗原決定基印記法」)，用人類V域基因譜系置換藉由如本文所述之噬菌體呈現技術獲得的非人類抗體片段之重鏈或輕鏈可變區，產生一群非人類鏈/人類鏈scFv或Fab嵌合體。以抗原進行選擇可導致非人類鏈/人類鏈嵌合scFv或Fab之分離，其中人類鏈恢復移除初級噬菌體呈現純系中之相應非人類鏈時損壞的抗原結合位點，亦即抗原決定基決定(印模)對於人類鏈搭配物之選擇。當重複此過程以置換剩餘非人類鏈時，獲得人類抗體(參見1993年4月1日公開之PCT WO 93/06213)。與傳統藉由HVR移植人類化非人類抗體不同，此技術提供不具有非人類來源之FR或HVR殘基的完整人類抗體。
雙特異性抗體
雙特異性抗體為對至少兩個不同抗原具有結合特異性的單株抗體。在某些實施例中，雙特異性抗體為人類或人類化抗體。在某些實施例中，一種結合特異性係針對EGFL7而另一種針對其他任何抗原。在某些實施例中，其他抗原為血管內皮生長因子(VEGF)，例如由抗體貝伐單抗及蘭尼單抗結合之抗原決定基。在某些實施例中，雙特異性抗體具有包含本發明抗體之HVR序列之第一臂及包含貝伐單抗或蘭尼單抗之HVR序列之第二臂。在某些實施例中，雙特異性抗體包含貝伐單抗或蘭尼單抗之VH及VL序列。在某些實施例中，雙特異性抗體可結合至EGFL7之兩個不同抗原決定基。雙特異性抗體亦可用於將細胞毒性劑定位於表現EGFL7之細胞。此等抗體具有結合EGFL7之臂及結合細胞毒性劑(諸如沙泊寧(saporin)、抗干擾素-α、長春花生物鹼、蓖麻毒素A鏈、甲胺喋呤或放射性同位素半抗原)之臂。可製備全長抗體或抗體片段形式之雙特異性抗體(例如F(ab')2 雙特異性抗體)。
此項技術中已知製造雙特異性抗體之方法。傳統上，雙特異性抗體之重組產生係基於兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之共表現，其中兩個重鏈具有不同特異性(Milstein及Cuello,Nature ,305: 537(1983))。由於免疫球蛋白重鏈及輕鏈之隨機分配，因此此等融合瘤(四源雜交瘤)產生10種不同抗體分子之潛在混合物，其中僅一個具有正確雙特異性結構。通常藉由親和層析步驟進行之正確分子之純化相當繁瑣，且產物產率低。類似程序揭示於1993年5月13日公開之WO 93/08829中及Traunecker等人，EMBO J.,10: 3655(1991)。
根據一種不同方法，使具所需結合特異性之抗體可變域(抗體-抗原結合位點)融合至免疫球蛋白恆定域序列。例如與包含鉸鏈區、CH2及CH3區中之至少部分之免疫球蛋白重鏈恆定域融合。在某些實施例中，含有為輕鏈結合所需之位點的第一重鏈恆定區(CH1)存在於該等融合中之至少一者中。將編碼免疫球蛋白重鏈融合及(必要時)免疫球蛋白輕鏈之DNA插入獨立表現載體中，且共轉染至適合之宿主生物體中。在構築中所使用之三個多肽鏈的不等比率提供最佳產率之實施例實施例中，此舉提供調節三個多肽片段之相互比例的高靈活性。然而，當等比率之至少兩個多肽鏈的表現產生高產率或當比率不具有特殊顯著性時，有可能將兩個或所有三個多肽鏈之編碼序列插入一個表現載體中。
在該方法之一實施例中，雙特異性抗體由一臂中之具有第一結合特異性之雜交免疫球蛋白重鏈及另一臂中之雜交免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特異性)構成。已發現此不對稱結構有利於所需雙特異性化合物與非所需免疫球蛋白鏈組合之分離，因為雙特異性分子之僅一半中存在免疫球蛋白輕鏈提供容易的分離方式。此方法揭示於WO 94/04690中。關於產生雙特異性抗體之其他詳述，參見例如Suresh等人，Methodsin Enzymology ,121:210(1986)。
根據另一方法，可使一對抗體分子之間的界面工程改造以最大化由重組細胞培養物回收之雜二聚體的百分比。該界面包含抗體恆定域之CH 3域之至少一部分。在此方法中，用較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)置換一或多個來自第一抗體分子界面之小胺基酸側鏈。藉由用較小側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)置換大胺基酸側鏈在第二抗體分子界面上產生具有與大側鏈相同或相似大小之補償「空穴」。此舉提供雜二聚體之產率增加超過其他非所需最終產物(諸如同源二聚體)的機制。
雙特異性抗體包括交聯或「異結合」抗體。舉例而言，呈異結合形式之抗體中之一者可與抗生物素蛋白偶合，另一者與生物素偶合。舉例而言，提出該等抗體使免疫系統細胞靶向非所需之細胞(美國專利第4,676,980號)且治療HIV感染(WO 91/00360、WO 92/00373及EP 03089)。可使用任何方便之交聯方法製造異結合抗體。適合之交聯劑以及許多交聯技術在此項技術中為熟知的，且揭示於美國專利第4,676,980號中。
文獻中亦已描述由抗體片段產生雙特異性抗體之技術。舉例而言，可使用化學鍵聯製備雙特異性抗體。Brennan 等人，Science ,229:81(1985)描述使完整抗體經蛋白質裂解以產生F(ab')2 片段的程序。在二硫醇錯合劑亞砷酸鈉存在下，還原此等片段以使鄰二硫醇穩定且阻止形成分子間二硫鍵。接著使所產生之Fab'片段轉化為硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。接著藉由用巰基乙胺還原使Fab'-TNB衍生物中之一者再轉化為Fab'-硫醇，且與等莫耳量之另一Fab'-TNB衍生物混合以形成雙特異性抗體。所產生之雙特異性抗體可用作酶選擇性固定之試劑。
近期之進展已促進自大腸桿菌直接回收Fab'-SH片段，該等片段可經化學偶合而形成雙特異性抗體。Shalaby等人，J. Exp. Med. ,175:217-225(1992)描述了完全人類化雙特異性抗體F(ab')2 分子之製備。各Fab'片段係獨立地自大腸桿菌分泌且活體外經受直接化學偶合以形成雙特異性抗體。由此所形成之雙特異性抗體能夠與過度表現HER2受體之細胞及正常人類T細胞結合，以及觸發人類細胞毒性淋巴細胞對人類乳房腫瘤目標之溶解活性。
亦已描述多種直接自重組細胞培養物製造及分離雙特異性抗體片段之技術。舉例而言，已使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體。Kostelny等人，J. Immunol .,148(5):1547-1553(1992)。藉由基因融合使來自Fos蛋白質及Jun蛋白質之白胺酸拉鏈肽與兩個不同抗體之Fab'部分連接。使抗體均二聚體在鉸鏈區還原以形成單體，且接著再氧化以形成抗體雜二聚體。此方法亦可用於產生抗體均二聚體。Hollinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448(1993)所述之「雙功能抗體」技術提供製備雙特異性抗體片段之替代機制。該等片段包含經過短而無法使同一鏈上之兩個域之間配對之連接子連接至輕鏈可變域(VL)之重鏈可變域(VH)。因此，一個片段之VH及VL域被迫與另一個片段之互補VL及VH域配對，藉此形成兩個抗原結合位點。亦已報導使用單鏈Fv(sFv)二聚體來製造雙特異性抗體片段之另一策略。參見Gruber等人，J. Immunol.,152:5368(1994)。
涵蓋具有兩個以上價數的抗體。舉例而言，可製備三特異性抗體。Tutt等人，J. Immunol. 147: 60(1991)。
多價抗體
與二價抗體相比，表現抗體所結合之抗原的細胞可更快地內化(及/或異化)多價抗體。本發明抗體可為具有三個或三個以上抗原結合位點之多價抗體(IgM類別之抗體除外)(例如四價抗體)，多價抗體可容易地藉由重組表現編碼抗體多肽鏈之核酸來產生。多價抗體可包含一個二聚化域及三個或三個以上抗原結合位點。在某些實施例中，二聚化域包含Fc區或鉸鏈區(或由其組成)。在此情形中，抗體將包含一個Fc區及三個或三個以上位於Fc區之胺基端之抗原結合位點。在某些實施例中，多價抗體包含三個至約八個抗原結合位點(或由其組成)。在一個此類實施例中，多價抗體包含四個抗原結合位點(或由其組成)。多價抗體包含至少一條多肽鏈(例如，兩條多肽鏈)，其中該(該等)多肽鏈包含兩個或兩個以上可變域。舉例而言，多肽鏈可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1為第一可變域，VD2為第二可變域，Fc為Fc區之一條多肽鏈，X1及X2表示胺基酸或多肽，且n為0或1。舉例而言，多肽鏈可包含VH-CH1-可撓性連接子-VH-CH1-Fc區鏈或VH-CH1-VH-CH1-Fc區鏈。本文中之多價抗體可進一步包含至少兩個(例如四個)輕鏈可變域多肽。本文之多價抗體可例如包含約兩條至約八條輕鏈可變域多肽。本文所涵蓋之輕鏈可變域多肽包含輕鏈可變域且視情形進一步包含CL域。
單域抗體
在一些實施例中，本發明抗體為單域抗體。單域抗體為包含抗體之全部或一部分重鏈可變域或者全部或一部分輕鏈可變域之單一多肽鏈。在某些實施例中，單域抗體為人類單域抗體(Domantis,Inc.,Waltham,MA；參見例如美國專利第6,248,516 B1號)。在一實施例中，單域抗體由抗體之全部或一部分重鏈可變域組成。
抗體變異體
在一些實施例中，涵蓋本文所述之抗體的胺基酸序列修飾。舉例而言，可需要改良抗體之結合親和力及/或其他生物學特性。抗體之胺基酸序列變異體可藉由將適當改變引入編碼抗體之核苷酸序列中或藉由肽合成來製備。該等修飾包括例如使抗體胺基酸序列內之殘基缺失及/或在該等殘基中插入及/或取代該等殘基。可進行缺失、插入及取代之任何組合以獲得最終構築體，其限制條件為最終構築體具有所需特徵。可在製造序列時將胺基酸變化引入標的抗體胺基酸序列中。
鑑別抗體之某些為突變誘發之較佳位置的殘基或區之適用方法如Cunningham及Wells(1989)Science ,244:1081-1085所述稱為「丙胺酸掃描突變誘發」。此處，鑑別殘基或目標殘基組(例如帶電殘基，諸如arg、asp、his、lys及glu)且用中性或帶負電之胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)置換以影響胺基酸與抗原之相互作用。接著藉由在取代位點處或為針對取代位點引入其他變異體來改進彼等證明對取代具有功能敏感性之胺基酸位置。因此，雖然預先確定引入胺基酸序列變異之位點，但不必預先確定突變之性質本身。舉例而言，為分析指定位點之突變效能，在目標密碼子或區進行ala掃描或隨機突變誘發，且針對所需活性篩檢所表現之免疫球蛋白。
胺基酸序列插入物包括長度為一個殘基至含有一百個或更多殘基之多肽之胺基及/或羧基端融合體，以及具有單一或多個胺基酸殘基之序列內插入物。末端插入之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他插入變異體包括抗體之N端或C端與酶(例如，對於ADEPT而言)或多肽的融合體，其增加抗體之血清半衰期。
在某些實施例中，改變本發明抗體以增大或減小抗體糖基化之程度。多肽之糖基化通常為N連接型或O連接型。N連接型係指碳水化合物部分連接至天冬醯胺殘基之側鏈。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸及天冬醯胺-X-蘇胺酸(其中X為除脯胺酸以外之任何胺基酸)為碳水化合物部分與天冬醯胺側鏈之酶促連接的識別序列。因此，在多肽中存在此等三肽序列中任一者產生潛在糖基化位點。雖然O連接型糖基化係指糖N-乙醯基半乳胺糖、半乳糖或木糖中之一者連接至羥基胺基酸，最常見為絲胺酸或蘇胺酸，但亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。
宜藉由改變胺基酸序列以使得產生或移除一或多個上述三肽序列來實現抗體糖基化位點之添加或缺失(就N連接型糖基化位點而言)。亦可藉由向原始抗體序列添加一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基、使其缺失或將其取代來產生變化(就O連接型糖基化位點而言)。
在抗體包含Fc區之情況下，可改變附著於其上之醣。由哺乳動物細胞產生之天然抗體通常包含分支鏈、雙觸角(biantennary)寡醣，其一般藉由N鍵聯連接至Fc區之CH2域之Asn297。參見例如Wright等人，(1997)TIBTECH 15:26-32。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及與雙觸角寡醣結構之「莖幹」中之GlcNAc連接之岩藻糖。在一些實施例中，可對本發明抗體中之寡醣進行修飾以產生具有某些改良之特性之抗體變異體。
舉例而言，提供具有碳水化合物結構之抗體變異體，該碳水化合物結構缺乏(直接或間接)連接至Fc區之岩藻糖。該等變異體可具有改良之ADCC功能。參見例如美國專利第US 2003/0157108號(Presta,L.)；第US 2004/0093621號(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。與「去海藻糖基化」或「海藻糖缺乏」抗體變異體有關之公開案的實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人，J. Mol. Biol. 336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人，Biotech. Bioeng. 87:614(2004)。能產生去海藻糖基化抗體之細胞株之實例包括蛋白質海藻糖基化不足之Lec13 CHO細胞(Ripka等人，Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545(1986)；美國專利申請案第US 2003/0157108 A1號,Presta,L；及WO 2004/056312 A1,Adams等人，尤其實例11)，及基因剔除細胞株，諸如α-1,6-海藻糖基轉移酶基因、FUT8 、基因剔除CHO細胞(參見，例如Yamane-Ohnuki等人，Biotech. Bioeng. 87:614(2004)；Kanda,Y.等人，Biotechnol. Bioeng .,94(4):680-688(2006)；及WO2003/085107)。
抗體變異體另外具備經二等分之寡醣，例如其中連接至抗體之Fc區之雙觸角寡醣經GlcNAc二等分。該等抗體變異體可具有減少之岩藻糖基化及/或改良之ADCC功能。該等抗體變異體之實例描述於例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)、美國專利第6,602,684號(Umana等人)及US 2005/0123546(Umana等人)中。亦提供在連接至Fc區之寡醣中具有至少一個半乳糖殘基之抗體變異體。該等抗體變異體可具有改良之CDC功能。該等抗體變異體描述於例如WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；及WO 1999/22764(Raju,S.)中。
在某些實施例中，抗體變異體包含具有一或多個進一步改良ADCC之胺基酸取代的Fc區，該或該等取代例如為在Fc區之位置298、333及/或334(殘基之Eu編號)處之取代。該等取代可以與任何如上所述之變異組合之形式出現。
在某些實施例中，本發明涵蓋具有一些(但非全部)效應功能之抗體變異體，該等效應功能使其成為抗體之活體內半衰期重要的許多應用之合意候選物，但某些效應功能(諸如補體及ADCC)則不必要或有害。在某些實施例中，可量測抗體之Fc活性以確保僅維持所需特性。可進行活體外及/或活體內細胞毒性檢定以確認CDC及/或ADCC活性之降低/衰竭。舉例而言，可進行Fc受體(FcR)結合檢定，以確保抗體缺乏FcγR結合能力(從而可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。介導ADCC之初級細胞、NK細胞僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。FcR表現概述於Ravetch及Kinet,Annu. Rev. Immunol. 9:457-92(1991)之第464頁之表3中。評估相關分子之ADCC活性的活體外檢定之非限制性實例描述於美國專利第5,500,362號(參見例如Hellstrom,I.等人，Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063(1986))及Hellstrom,I等人，Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(參見Bruggemann,M.等人，J. Exp. Med. 166:1351-1361(1987))中。或者，可利用非放射性檢定方法(參見例如流動式細胞測量術之ACTITM 非放射性細胞毒性檢定(CellTechnology,Inc. Mountain View,CA)；及CytoTox非放射性細胞毒性檢定(Promega,Madison,WI))。用於該等檢定之適用效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺傷(NK)細胞。或者或另外，可在活體內，例如在動物模型(諸如在Clynes等人，Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656(1998)中揭示之彼動物模型)中，評估相關分子之ADCC活性。亦可進行Clq結合檢定以確認抗體不能與Clq結合且因此缺乏CDC活性。為了評估補體活化，可執行CDC檢定(參見例如Gazzano-Santoro等人，J. Immunol. Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等人，Blood 101:1045-1052(2003)；及Cragg,M.S.及M.J. Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。亦可使用此項技術中已知之方法執行FcRn結合及活體內清除/半衰期測定(參見例如Petkova,S.B.等人，Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769(2006))。
提供具有一或多個胺基酸取代之其他抗體變異體。雖然相關取代性突變誘發之位點包括高變區，但亦涵蓋FR改變。保守性取代展示於表1中之「較佳取代」之標題下。稱為「例示性取代」之更多實質性變化提供於「胺基酸取代表」中，或如以下關於胺基酸類別所另外描述。可將胺基酸取代引入相關抗體中及例如針對所需活性(諸如改良之抗原結合、降低之免疫原性、改良之ADCC或CDC等)篩選出之產物中。
抗體生物特性之改變可藉由選擇影響以下之取代來實現：(a)取代區中多肽主鏈之結構，例如呈摺疊片或螺旋構型，(b)目標位點處分子之電荷或疏水性，或(c)側鏈大小。胺基酸可根據其側鏈特性之相似性如下分組(A. L. Lehninger,in Biochemistry,第2版，第73-75頁,Worth Publishers,New York(1975))：(1)非極性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)；(2)不帶電極性：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)；(3)酸性：Asp(D)、Glu(E)；(4)鹼性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)。或者，天然存在之殘基可基於共同的側鏈特性來分類：(1)　疏水性：甘白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)　中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)　酸性：Asp、Glu；(4)　鹼性：His、Lys、Arg；(5)　影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；(6)　芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代將必然使此等類別中之一者之成員換成另一類別。亦可將該等經取代之殘基引入保守性取代位點中或引入其餘(非保守性)位點中。
一種類型之取代變異體涉及取代親本抗體(例如人類化抗體或人類抗體)之一或多個高變區殘基。一般而言，選用於進一步開發之所得變異體相對於產生其之親本抗體具有經改良的生物特性。例示性取代變異體為親和力成熟抗體，其可能宜使用基於噬菌體呈現之親和力成熟技術產生。簡言之，使若干高變區位點(例如6-7個位點)突變以在各位點處產生所有可能之胺基酸取代。使由此所產生之抗體以與封裝於各粒子內之噬菌體鞘蛋白(例如M13之基因III產物)之至少部分融合的形式由絲狀噬菌體粒子呈現。接著就生物活性(例如結合親和力)篩檢噬菌體呈現變異體。為鑑別用於修飾之候選高變區位點，可執行掃描突變誘發(例如丙胺酸掃描)以鑑別顯著有助於抗原結合之高變區殘基。或者或另外，分析抗原-抗體複合物之晶體結構可有益於鑑別抗體與抗原之間的接觸點。根據此項技術已知之技術，包括彼等本文詳述之技術，該等接觸殘基及相鄰殘基為取代候選物。一旦產生該等變異體，則使用此項技術中已知之技術(包括本文所述之彼等技術)篩檢該組變異體，且可選擇在一或多個相關檢定中具有優良性質的變異體用於進一步開發。
編碼抗體之胺基酸序列變異體之核酸分子係由此項技術已知之多種方法來製備。此等方法包括(但不限於)自天然來源分離(在天然存在之胺基酸序列變異體之情況下)，或藉由早期製備之變異體或抗體之非變異體形式發生寡核苷酸介導(或定點特異性)之突變誘發、PCR突變誘發及卡匣突變誘發來製備。
可能需要將一或多個胺基酸修飾引入本發明抗體之Fc區，藉此產生Fc區變體。Fc區變異體可包含在一或多個胺基酸位置(包括鉸鏈半胱胺酸位置)處包含胺基酸修飾(例如取代)之人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。
根據此描述及該項技術之教示，預期在一些實施例中，本發明抗體與野生型相應抗體相比可包含例如Fc區中之一或多處修改。然而，此等抗體將保留與其野生型對應物相比實質上相同之治療效用所要的特徵。舉例而言，咸信可在Fc區中產生引起改變(亦即改良或減弱)之C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)的某些變化，例如如WO99/51642中所述。關於Fc區變異體之其他實例，亦參見Duncan及Winter,Nature 322:738-40(1988)；美國專利第5,648,260號；美國專利第5,624,821號；及WO 94/29351。WO 00/42072(Presta)及WO 2004/056312(Lowman)描述具有經改良或經減弱之FcR結合的抗體變異體。亦參見Shields等人，J. Biol. Chem . 9(2): 6591-6604(2001)。在US2005/0014934A1(Hinton等人)中描述半衰期增加且與新生兒Fc受體(FcRn)之結合得到改良的抗體，其負責將母本IgG轉移至胎兒中(Guyer等人，J. Immunol. 117:587(1976)及Kim等人，J. Immunol. 24:249(1994))。此等抗體包含具有一或多個改良Fc區與FcRn之結合的取代之Fc區。具有變化之Fc區胺基酸序列及增加或降低之C1q結合能力之多肽變異體描述於美國專利第6,194,551B1號、WO99/51642中。亦參見Idusogie等人，J.Immunol. 164: 4178-4184(2000)。
在另一態樣中，本發明提供在包含Fc區之Fc多肽之界面中包含修飾的抗體，其中該等修飾有助於及/或促進雜二聚化。此等修飾包含將突起引入第一Fc多肽以及將空穴引入第二Fc多肽，其中該突起可定位於該空穴中以便促進第一Fc多肽與第二Fc多肽之複合。舉例而言，如美國專利第5,731,168號中所述，此項技術中已知產生具有此等修改之抗體之方法。
在另一態樣中，可能需要產生抗體之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代之半胱胺酸工程改造之抗體，例如「thioMAb」。在特定實施例中，經取代之殘基存在於抗體之可達位點。藉由以半胱胺酸取代彼等殘基，從而將反應性硫醇基定位於抗體之可達位點且如本文中另外描述，其可用於將抗體結合至其他部分，諸如藥物部分或連接子-藥物部分。在某些實施例中，任一或多個以下殘基可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205(Kabat編號)；重鏈之A118(EU編號)；及重鏈Fc區之S400(EU編號)。
抗體衍生物
可進一步修飾本發明之抗體以含有此項技術中已知且可易於獲得之額外非蛋白部分。適用於衍生抗體之部分較佳為水可溶性聚合物。水可溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及葡聚糖或聚(N-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛因其在水中之穩定性而可在製造中具有優勢。聚合物可具有任何分子量，且可為分支鏈或為分支鏈聚合物。與抗體連接之聚合物的數目可變化，且若連接一個以上聚合物，則聚合物可為相同或不同分子。一般而言，用於衍生作用之聚合物之數目及/或類型可基於以下考慮因素來確定，該等考慮因素包括(但不限於)待改良抗體之特定特性或功能，抗體衍生物是否將在規定條件下用於療法中等。
在另一實施例中，提供抗體與可藉由暴露於輻射來選擇性加熱之非蛋白部分的結合物。在一實施例中，非蛋白部分為奈米碳管(Kam等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:11600-11605(2005))。此輻射可具有任一波長，且包括但不限於不損傷一般細胞但能將非蛋白部分加熱至可殺死抗體-非蛋白部分近側之細胞之溫度的波長。
活性檢定
本發明抗體之特徵在於可藉由此項技術中已知的各種檢定確定其物理/化學特性及生物功能。
在一態樣中，提供鑑別具有生物活性之其抗-EGFL7抗體之檢定。生物活性可包括例如調節EGFL7相關效應之一或多個態樣，該等效應包括(但不限於)EGFL7結合、低氧脅迫(hypoxic stress)下內皮細胞之EGFL7介導之保護及EGFL7介導內皮細胞黏著之能力。
在本發明之某些實施例中，分析本文所產生之免疫球蛋白之生物活性。在一些實施例中，測試本發明抗體免疫球蛋白之結合活性。此項技術中已知且可用於本文中之抗原結合檢定包括(但不限於)使用諸如西方墨點法之技術進行的任何直接或競爭性結合檢定、放射免疫檢定、ELISA(酶聯免疫吸附檢定)、「夾層」免疫檢定、免疫沈澱檢定、螢光免疫檢定及蛋白質A免疫檢定。下文之實例部分中提供說明性抗原結合檢定。
經純化抗體可進一步藉由一系列檢定來表徵，該等檢定包括(但不限於)N端定序、胺基酸分析、非變性尺寸排除高壓液相層析(HPLC)、質譜分析、離子交換層析及木瓜蛋白酶消化。
在一些實施例中，本發明涵蓋一種經改變之具有一些但非所有效應功能的抗體，該等功能使其成為抗體之活體內半衰期較重要但某些效應功能(諸如補體及ADCC)並非必需或有害處之許多應用的理想候選者。在某些實施例中，量測所產生之免疫球蛋白之Fc活性以確保僅所需特性得以保持。可進行活體外及/或活體內細胞毒性檢定以確認CDC及/或ADCC活性之降低/衰竭。例如，可進行Fc受體(FcR)結合檢定，以確保抗體缺乏FcγR結合能力(從而可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。介導ADCC之初級細胞、NK細胞僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。FcR在造血細胞上之表現概述於Ravetch及Kinet,Annu. Rev. Immunol 9:457-92(1991)之第464頁上的表3中。評估相關分子之ADCC活性之活體外檢定的實例描述於美國專利第5,500,362號或第5,821,337號中。適用於該等檢定之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺傷(NK)細胞。其他或另外，相關分子的ADCC活性可於活體內，例如在動物模型中(諸如Clynes等人，PNAS(USA) 95:652-656(1998)中所揭示之彼動物模型中)評估。亦可進行Clq結合檢定以確認抗體無法結合Clq且因此缺乏CDC活性。為評定補體活化，可執行例如如Gazzano-Santoro等人，J. Immunol. Methods 202:163(1996)中所述之CDC檢定。亦可使用此項技術中已知之方法執行FcRn結合及活體內清除/半衰期測定。
在一些實施例中，本發明提供具有增強之效應功能及/或增加之半衰期之已變化之抗體。
載體、宿主細胞及重組方法
對於重組產生本發明抗體，分離編碼該抗體之核酸且插入可複製之載體中用於進一步選殖(DNA之擴增)或表現。使用習知程序(例如藉由使用能夠特異性結合編碼抗體之重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)容易地分離編碼抗體之DNA並定序。可利用許多載體。載體之選擇部分視待使用之宿主細胞而定。一般而言，較佳宿主細胞起源於原核生物或真核生物(一般哺乳動物)。應瞭解為達成此目的可使用任何同型之恆定區，包括IgG、IgM、IgA、IgD及IgE恆定區，且該等恆定區可由任何人類或動物物種獲得。
a.　使用原核宿主細胞產生抗體
i .　載體構築
可使用標準重組技術獲得編碼本發明抗體之多肽組分的聚核苷酸序列。可自產生抗體之細胞(諸如融合瘤細胞)中分離所需聚核苷酸序列並定序。或者，可使用核苷酸合成器或PCR技術合成聚核苷酸。一旦獲得編碼多肽之序列後，即將其插入能夠在原核宿主中複製且表現異源聚核苷酸之重組載體中。出於本發明之目的，可使用此項技術中可利用且已知之許多載體。適當載體之選擇將主要視欲插入載體中之核酸的大小及欲用載體轉型之特定宿主細胞而定。各載體視其功能(擴增或表現異源聚核苷酸或兩者)及其與其所位於之特定宿主細胞的相容性而定含有各種組分。載體組分一般包括(但不限於)：複製起點、選擇標記基因、啟動子、核糖體結合位點(RBS)、信號序列、異源核酸插入物及轉錄終止序列。
一般而言，含有源自與宿主細胞相容的物種之複製子及控制序列的質體載體與此等宿主聯合使用。載體通常具有複製位點以及能夠在轉型細胞中提供表型選擇之標記序列。舉例而言，通常使用源自大腸桿菌物種之質體pBR322使大腸桿菌轉型。pBR322含有編碼安比西林(ampicillin，Amp)及四環素(tetracycline，Tet)抗性之基因，且因此提供鑑別經轉型細胞之容易方式。pBR322、其衍生物或其他微生物質體或噬菌體亦可含有或經修飾含有可由微生物使用以供表現內源蛋白質之啟動子。用於表現特定抗體之pBR322衍生物之實例詳細描述於Carter等人之美國專利第5,648,237號中。
此外，含有與宿主微生物相容之複製子及控制序列的噬菌體載體可聯合此等宿主用作轉型載體。舉例而言，可利用諸如λGEMTM -11之噬菌體製備可用以使諸如大腸桿菌LE392之易感宿主細胞轉型的重組載體。
本發明之表現載體可包含兩種或兩種以上編碼各多肽組分之啟動子-順反子對。啟動子為位於調節其表現之順反子上游(5')的未經轉譯之調控序列。原核啟動子通常分為兩類：誘導型及組成型。誘導型啟動子為一種啟動子，在該啟動子控制下回應培養條件之改變(例如在有或無營養物或溫度改變下)開始增加程度之順反子轉錄。
熟知由多種潛在宿主細胞所別之大量啟動子。可藉由經限制酶消化自來源DNA移出所選擇之啟動子將所分離之啟動子序列插入本發明載體中而使該啟動子以可操作方式連接至編碼輕鏈或重鏈之順反子DNA。可使用天然啟動子序列與許多異源啟動子來引導目標基因之擴增及/或表現。在一些實施例中，利用異源啟動子，此係因為一般而言，與天然目標多肽啟動子相比，異源啟動子所允許之經表現之目標基因的轉錄較大且產率較高。
適於配合原核宿主使用的啟動子包括PhoA啟動子、β-半乳糖酶及乳糖啟動子系統、色胺酸(trp)啟動子系統及雜交啟動子(諸如tac或trc啟動子)。然而，在細菌中起作用之其他啟動子(諸如其他已知細菌或噬菌體啟動子)亦適合。已公開其核苷酸序列，藉此使得熟練技術者能夠使用連接子或接附子提供任何所需限制性位點使該等序列與編碼目標輕鏈及重鏈之順反子可操作連接。
在本發明之一態樣中，重組載體內之各順反子包含引導經表現之多肽跨膜移位之分泌信號序列組分。一般而言，信號序列可為載體之組分，或其可為插入載體中之目標多肽DNA之一部分。出於本發明之目的所選擇之信號序列應為由宿主細胞識別及加工(亦即由信號肽酶裂解)之信號序列。對於不識別及加工異源多肽之天然信號序列的原核宿主細胞而言，使信號序列經例如選自由以下組成之群的原核信號序列取代：鹼性磷酸酶、青黴素酶、Ipp或熱穩定腸毒素II(STII)前導序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA及MBP。在本發明之一實施例中，用於表現系統之該兩種順反子中之信號序列為STII信號序列或其變異體。
在另一態樣中，本發明之免疫球蛋白的產生可發生在宿主細胞之細胞質中，且因此無需各順反子內均存在分泌信號序列。就此而言，免疫球蛋白輕鏈及重鏈皆在細胞質內表現、摺疊及裝配以形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株(例如大腸桿菌trxB -菌株)提供有利於二硫鍵形成之細胞質條件，藉此允許適當摺疊及裝配經表現之蛋白質次單元。Proba及PluckthunGene ,159:203(1995)。
適於表現本發明抗體之原核宿主細胞包括古細菌(Archaebacteria)及真細菌(Eubacteria)，諸如革蘭氏陰性(Gram-negative)或革蘭氏陽性生物體。適用細菌之實例包括埃希氏桿菌屬(Escherichia)(例如大腸桿菌)、芽孢桿菌屬(Bacilli)(例如枯草芽孢桿菌(B. subtilis))、腸細菌(Enterobacteria)、假單胞菌屬(Pseudomonas)物種(例如銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)、鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)、黏質沙雷菌(Serratia marcescans)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、變形菌屬(Proteus)、志賀氏菌屬(Shigella)、根瘤菌屬(Rhizobia)、透明顫菌(Vitreoscilla)或副球菌屬(Paracoccus)。在一實施例中，使用革蘭氏陰性細胞。在一實施例中，本發明使用大腸桿菌細胞作為宿主。大腸桿菌菌株之實例包括菌株W3110(Bachmann,Cellular and Molecular Biology,第2卷(Washington,D.C.: American Society for Microbiology,1987)，第1190-1219頁；ATCC寄存編號27,325)及其衍生物，包括具有基因型W3110 ΔfhuA(ΔtonA)ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41 kanR之菌株33D3(美國專利第5,639,635號)。其他菌株及其衍生物(諸如大腸桿菌294(ATCC 31,446)、大腸桿菌B、大腸桿菌λ1776(ATCC31,537)及大腸桿菌RV308(ATCC31,608))亦適合。此等實例為說明性的而非限制性的。構築具有確定的基因型之任何以上提及之細菌的衍生物的方法在此項技術中為已知的且描述於例如Bass等人，Proteins,8:309-314(1990)中。一般需要考慮複製子在細菌細胞中之可複製性來選擇適當細菌。舉例而言，當使用熟知質體(諸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410)提供複製子時，適合地可使用大腸桿菌、沙雷氏菌或沙門氏菌菌種作為宿主。宿主細胞通常應分泌最少量之蛋白水解酶，且理想地，可將額外蛋白酶抑制劑併入細胞培養物中。
ii.抗體產生
用上述表現載體使宿主細胞轉型，並在適當時經修飾之習知營養培養基中培養以誘導啟動子、選擇轉型體或擴增編碼所需序列之基因。
轉型意謂將DNA引入原核宿主中，以便使DNA可作為染色體外要素或由染色體成分複製。視所使用之宿主細胞而定，使用適於該等細胞之標準技術進行轉型。對含有實質細胞壁障壁之細菌細胞而言，一般使用採用氯化鈣之鈣處理。另一轉型方法採用聚乙二醇/DMSO。所使用之另一技術為電穿孔。
用以產生本發明多肽的原核細胞在此項技術中已知且適於培養所選宿主細胞之培養基中生長。適合之培養基之實例包括溶菌肉湯(luria broth，LB)加必需的養補充劑。在一些實施例中，培養基亦含有基於表現載體之構築而選擇之選擇劑，以選擇性允許含有表現載體之原核細胞生長。舉例而言，向培養基中添加安比西林(ampicillin)以使表現安比西林抗性基因之細胞生長。
亦可包括除碳、氮及無機磷酸鹽來源外之任何必需補充物，其單獨或以與另一種補充物或培養基(諸如，複合氮源)之混合物的形式以適當濃度引入。視情況，培養基可含有一或多種選自由以下組成之群的還原劑：麩胱甘肽、半胱胺酸、胱胺、巰基乙酸酯、二硫赤蘚糖醇及二硫蘇糖醇。
在適合之溫度下培養原核宿主細胞。對大腸桿菌生長而言，例如，較佳溫度係在約20℃至約39℃、更佳約25℃至約37℃之範圍內，甚至更佳為約30℃。培養基之pH值主要視宿主生物體而定，可為約5至約9範圍內之任何pH值。對於大腸桿菌而言，pH值較佳為約6.8至約7.4，且更佳為約7.0。
若本發明之表現載體中使用誘導型啟動子，則在適於活化該啟動子之條件下誘導蛋白質表現。在本發明之一態樣中，使用PhoA啟動子控制多肽轉錄。因此，在磷酸鹽限制培養基中培養經轉型之宿主細胞以誘導。較佳地，磷酸鹽限制培養基為C.R.A.P培養基(參見例如Simmons等人，J. Immunol. Methods(2002),263:133-147)。如此項技術中所知，可根據所用載體構築體使用多種其他誘導劑。
在一實施例中，本發明之經表現多肽分泌至宿主細胞之周質中且自其中回收。蛋白質回收通常涉及一般由諸如滲透壓衝擊、音波處理或溶解之方式使微生物碎裂。一旦細胞碎裂，即可藉由離心或過濾來移除細胞碎片或全細胞。蛋白質可例如由親和樹脂層析進一步純化。或者，可將蛋白質轉運至培養基中且在其中進行分離。可自培養物中移除細胞，且過濾培養物上清液且濃縮以進一步純化所產生之蛋白質。可使用諸如聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)及西方墨點檢定之通常已知的方法進一步分離經表現之多肽且加以鑑別。
在本發明之一態樣中，藉由醱酵過程實現抗體大批量產生。可利用多種大規模分批饋料醱酵程序來產生重組蛋白質。大規模醱酵具有至少1000公升之容量，較佳約1,000至100,000公升之容量。此等醱酵器使用攪拌葉輪來分配氧氣及養分，尤其葡萄糖(較佳碳/能量來源)。小規模醱酵一般係指在體積容量不超過約100公升且可在約1公升至約100公升範圍內之醱酵器中進行的醱酵。
在醱酵過程中，通常在已使細胞在適合條件下生長至所需密度(例如OD550為約180-220，在此階段細胞處於穩定期早期)後開始誘導蛋白質表現。如此項技術中已知且如上文所述，可根據所用載體構築體使用多種誘導劑。可在誘導細胞之前使細胞生長較短時間。誘導細胞之時間通常為約12-50小時，但可使用更長或更短之誘導時間。
為改良本發明之多肽的產率及品質，可改變各種醱酵條件。舉例而言，為改良所分泌之抗體多肽之適當裝配及摺疊，可使用過度表現伴侶蛋白(chaperone protein)之其他載體使宿主原核細胞共轉型，該等伴侶蛋白諸如Dsb蛋白(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD及/或DsbG)或FkpA(具有伴侶活性之肽基脯胺醯基順式/反式異構酶)。已說明伴侶蛋白有助於所產生之異源蛋白質在細菌宿主細胞中之適當摺疊及溶解性。Chen等人，(1999) J Bio Chem 274:19601-19605；Georgiou等人，美國專利第6,083,715號；Georgiou等人，美國專利第6,027,888號；Bothmann及Pluckthun(2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105；Ramm及Pluckthun(2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113;Arie等人(2001)Mol. Microbiol. 39:199-210。
為使所表現之異源蛋白質(尤其彼等對易蛋白水解之蛋白質)之蛋白水解降至最低，本發明可使用某些缺乏蛋白水解酶之宿主菌株。舉例而言，宿主細胞菌株可經修飾在編碼已知細菌蛋白酶(諸如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其組合)之基因中實現基因突變。可利用一些缺乏大腸桿菌蛋白酶之菌株且其描述於例如Joly等人，(1998)，同上；Georgiou等人，美國專利第5,264,365號；Georgiou等人，美國專利第5,508,192號；Hara等人，Microbial Drug Resistance ,2 ：63-72(1996)中。
在一實施例中，使用缺乏蛋白水解酶且經過度表現一或多種伴侶蛋白之質體轉型的大腸桿菌菌株作為本發明之表現系統中之宿主細胞。
iii.　抗體純化
可使用此項技術中已知之標準蛋白純化方法。以下程序為適合之純化程序的例示性實例：免疫親和管柱或離子交換管柱分級分離、乙醇沈澱、逆相HPLC、二氧化矽或陽離子交換樹脂(諸如DEAE)層析、層析聚焦、SDS-PAGE、硫酸銨沈澱及使用例如SephadexG-75之凝膠過濾。
在一態樣中，使用固定於固相上之蛋白質A進行本發明全長抗體產物的免疫親和純化。蛋白質A為來自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)之41 kD細胞壁蛋白，其以高親和力結合抗體之Fc區。Lindmark等人，(1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13。蛋白質A所固定之固相較佳為包含玻璃或二氧化矽表面之管柱，更佳為受控微孔玻璃管柱或矽酸管柱。在一些應用中，管柱已塗佈有諸如甘油之試劑以力圖防止污染物之非特異性黏著。
作為純化之第一步驟，將如上所述自細胞培養物衍生之製劑塗覆於固定蛋白質A之固相以使得相關抗體與蛋白質A特異性結合。接著洗滌固相以移除與固相非特異性結合之污染物。最後，藉由溶離自固相回收相關抗體。
b.　使用真核宿主細胞產生抗體
載體組分一般包括(但不限於)以下之一或多者：信號序列、複製起點、一或多個標記基因、強化子元件(enhancer element)、啟動子及轉錄終止序列。
(i)信號序列組份
用於真核宿主細胞中之載體亦可含有信號序列或在相關成熟蛋白或多肽之N端具有特異性裂解位點的其他多肽。所選擇之異源信號序列較佳為由宿主細胞識別及加工(亦即由信號肽酶裂解)之信號序列。在哺乳動物細胞表現中，可利用哺乳動物信號序列以及病毒分泌前導序列，例如單純疱疹gD信號。
此前驅區之DNA在閱讀框架中與編碼抗體之DNA接合。
(ii)複製起點
一般而言，哺乳動物表現載體無需複製起點組分。舉例而言，因SV40起點含有早期啟動子，故通常可僅使用該起點。
(iii)選擇基因組分
表現及選殖載體可含有亦稱為可選擇標記物之選擇基因。典型選擇基因編碼具有下列作用之蛋白質(a)賦予針對於抗生素或其他毒素(例如安比西林、新黴素、甲胺喋呤或四環素)之抗性；(b)補充營養缺陷型不足(必要時)；或(c)提供不可自複合培養基獲得之關鍵養分。
選擇方案之一個實例利用藥物來阻滯宿主細胞生長。彼等經異源基因成功轉型之細胞產生賦予耐藥性之蛋白質，且因此在經歷選擇方案之後存活。該類顯性選擇之實例使用藥物新黴素、黴酚酸及潮黴素(hygromycin)。
適用於哺乳動物細胞之可選標記物的另一實例為彼等能夠鑑別能夠吸收抗體核酸之細胞的可選標記物，諸如DHFR、胸苷激酶、金屬硫蛋白-I及金屬硫蛋白-II(較佳為靈長類動物金屬硫蛋白基因)、腺苷去胺酶、鳥胺酸去羧酶等。
舉例而言，首先藉由在含有甲胺喋呤(Mtx)(DHFR之競爭性拮抗劑)之培養基中培養所有轉型體來鑑別經DHFR選擇基因轉型之細胞。當採用野生型DHFR時，適當之宿主細胞為缺失DHFR活性之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株(例如ATCCCRL-9096)。
或者，可藉由使細胞在含有可選標記物之選擇劑(諸如胺基糖苷抗生素，例如康黴素(kanamycin)、新黴素或G418)的培養基中生長來選擇經編碼抗體之DNA序列、野生型DHFR蛋白及另一可選標記物(諸如胺基糖苷3'-磷酸轉移酶(APH))轉型或共轉型之宿主細胞(尤其是含有內源DHFR之野生型宿主)。參見美國專利第4,965,199號。
(iv)啟動子組分
表現及選殖載體通常含有由宿主生物體識別且以可操作連接至抗體多肽核酸之啟動子。已知用於真核生物之啟動子序列。實際上所有真核基因均具有位於轉錄起始位點上游約25至30個鹼基處之富集AT之區。在許多基因轉錄起始處上游70至80個鹼基處發現的另一序列為CNCAAT(SEQ ID NO:232)區，其中N可為任何核苷酸。大部分真核基因之3'端為AATAAA(SEQ ID NO:233)序列，該序列可為用於將聚腺苷酸尾(poly A tail)添加至編碼序列之3'端的信號。所有此等序列均適於插入真核表現載體中。
抗體多肽自哺乳動物宿主細胞中之載體之轉錄例如受以下啟動子控制：自病毒(諸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒、禽肉瘤病毒、細胞巨大病毒、反轉錄病毒、B型肝炎病毒且猿病毒40(Simian Virus 40，SV40))之基因組獲得的啟動子、異源哺乳動物啟動子(例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子)、熱休克啟動子，其限制條件為該等啟動子與宿主細胞系統相容。
SV40病毒之早期及晚期啟動子宜作為亦含有SV40病毒複製起點之SV40限制片段獲得。人巨細胞病毒之即刻早期啟動子宜作為HindIII E限制片段獲得。美國專利第4,419,446號中揭示在哺乳動物宿主中使用牛乳頭狀瘤病毒作為載體來表現DNA之系統。美國專利第4,601,978號中描述此系統之修改。或者，可使用勞氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)長末端重複單元作為啟動子。
(v)強化子元件成分
由高級真核細胞轉錄編碼本發明抗體多肽之DNA通常藉由將強化子序列插入載體中來增強。目前已知許多強化子序列來自哺乳動物基因(血球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白及胰島素)。然而，通常將使用來自真核細胞病毒之強化子。實例包括位於複製起點晚期側之SV40強化子(bp 100-270)、細胞巨大病毒早期啟動子強化子、複製起點晚期側的多瘤病毒強化子及腺病毒強化子。關於活化真核啟動子之強化元件，亦參見Yaniv,Nature 297:17-18(1982)。雖然可在抗體多肽編碼序列之位置5'或3'處將強化子剪接至載體中，但較佳定位於啟動子之5'位點處。
(νi)　轉錄終止組分
用於真核宿主細胞之表現載體通常亦含有終止轉錄及穩定mRNA所必需之序列。該等序列通常可自真核或病毒DNA或cDNA之5'及偶爾3'之未經轉譯區獲得。此等區含有在編碼抗體之mRNA之未經轉譯部分中轉錄為聚腺苷酸化片段的核苷酸區段。一種適用之轉錄終止組分為牛生長激素聚腺苷酸化區。參見WO94/11026及其中所揭示之表現載體。
(vii)　宿主細胞之選擇及轉型
適用於選殖或表現DNA於本文載體中之宿主細胞包括本文所述之高級真核細胞，包括脊椎動物宿主細胞。使脊椎動物細胞於培養物(組織培養物)中繁殖已成為一種常規程序。適用哺乳動物宿主細胞株之實例為經SV40轉型之猴腎CV1株(COS-7，ATCCCRL 1651)；人類胚腎株(經次選殖而生長於懸浮培養物中之293或293細胞，Graham等人，J.Gen Virol. 36:59(1977))；幼小倉鼠腎細胞(BHK，ATCCCCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216(1980))；小鼠足細胞(sertoli cell)(TM4，Mather,Biol. Reprod. 23:243-251(1980))；猴腎細胞(CV1 ATCCCCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCCCRL-1587)；人宮頸癌細胞(HELA，ATCCCCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCCCCL 34)；布法羅大鼠肝細胞(buffalo rat liver cell)(BRL 3A，ATCCCRL 1442)；人肺細胞(W138，ATCCCCL 75)；人肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562，ATCCCCL51)；TRI細胞(Mather等人，Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68(1982))；MRC5細胞；FS4細胞；及人肝癌細胞株(Hep G2)。
用產生抗體之上述表現載體或選殖載體使宿主細胞轉型，且在適當時經修飾之習知培養基中培養以誘導啟動子、選擇轉型體或擴增編碼所要序列之基因。
(viii)培養宿主細胞
可在多種培養基中培養用以產生本發明抗體之宿主細胞。諸如漢姆氏F10(Ham's F10)(Sigma)、最低必需培養基((MEM)，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)及達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)((DMEM)，Sigma)之市售培養基適於培養宿主細胞。此外，Ham等人，Meth. Enz. 58:44(1979)；Barnes等人，Anal. Biochem.102:255(1980)；美國專利第4,767,704號、第4,657,866號、第4,927,762號、第4,560,655號或第5,122,469號；WO 90/03430；WO 87/00195；或美國專利Re. 30,985中所述之任何培養基均可用作宿主細胞之培養基。任何此等培養基均可視情況補充激素及/或其他生長因子(諸如胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣鹽、鎂鹽及磷酸鹽)、緩衝液(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷及胸苷)、抗生素(諸如GENTAMYCINTM 藥物)、微量元素(定義為通常以在微莫耳濃度範圍內之最終濃度存在的無機化合物)及葡萄糖或等效能源。亦可包括熟習此項技術者已知之適當濃度之任何其他必要補充劑。諸如溫度、pH值及其類似條件之培養條件為彼等先前供選擇用於表現之宿主細胞使用之條件且對一般熟習此項技術者而言將顯而易見。
(ix)　純化抗體
當使用重組技術時，抗體可在細胞內產生或直接分泌至培養基中。若抗體在細胞內產生，則作為第一步，藉由例如離心或超濾移除微粒碎片(宿主細胞或溶解片段)。當抗體分泌至培養基中時，一般首先使用市售蛋白質濃縮過濾器(例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元)濃縮該等表現系統之上清液。在任何先前步驟中均可包括諸如PMSF之蛋白酶抑制劑以抑制蛋白水解，且可包括抗生素以阻止外來污染物生長。
可使用例如羥磷灰石層析法、凝膠電泳法、透析及親和層析法純化自細胞製備之抗體組合物，其中親和層析法為較佳純化技術。蛋白質A作為親和配位體之適宜性視存在於抗體中之任何免疫球蛋白Fc域的種類及同型而定。可使用蛋白質A純化基於γ1、γ2或γ4重鏈之人類免疫球蛋白之抗體(Lindmark等人，J. Immunol. Meth. 62:1-13(1983))。對所有小鼠同型及人類γ3型而言，推薦蛋白質G(Guss等人，EMBO J. 5:15671575(1986))。雖然親和配位體所附著之基質最常為瓊脂糖，但可利用其他基質。機械穩定基質(諸如受控微孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯)所允許之流動速率比瓊脂糖可達成的快，且所允許之處理時間比瓊脂糖可達成的短。當抗體包含CH3域時，Bakerbond ABXTM 樹脂(J. T. Baker,Phillipsburg,NJ)適用於純化。視欲回收之抗體而定，亦可利用其他蛋白質純化技術，諸如離子交換管柱分級分離、乙醇沈澱、逆相HPLC、二氧化矽層析、肝素SEPHAROSETM 層析、陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬胺酸管柱)層析、層析聚焦、SDS-PAGE及硫酸銨沈澱。
在任何初步純化步驟後，可使包含相關抗體及污染物之混合物經受使用pH值介於約2.5-4.5之間的溶離緩衝液之低pH值疏水相互作用層析，較佳在低鹽濃度(例如約0-0.25 M鹽)下進行該層析。
免疫結合物
本發明亦提供包含與一或多種細胞毒性劑結合之抗體的免疫結合物(可互換地稱為「抗體-藥物結合物」或「ADC」)，該或該等細胞毒性劑諸如化學治療劑、藥物、生長抑制劑、毒素(例如蛋白質毒素，細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素(亦即放射性結合物)。
免疫結合物已用於局部傳遞細胞毒性劑，亦即在癌症治療中殺死或抑制細胞生長或增殖之藥物(Lambert,J.(2005)Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549；Wu等人，(2005)Nature Biotechnology 23(9):1137-1146；Payne,G.(2003)i 3:207-212；Syrigos及Epenetos(1999)Anticancer Research 19:605-614；Niculescu-Duvaz及Springer(1997)Adv. Drug Deliv. Rev. 26:151-172；美國專利第4,975,278號)。免疫結合物可使得藥物部分目標傳遞至腫瘤且在其中胞內積聚，其中非結合藥物之全身性投與可對正常細胞以及設法消除之腫瘤細胞產生不可接受程度之毒性(Baldwin等人，Lancet (Mar. 15,1986)第603-05頁；Thorpe(1985)「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」,Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (A. Pinchera等人編)第475-506頁。已報導適用於此等策略中之多株抗體與單株抗體(Rowland等人，(1986)Cancer Immunol. Immunother .21:183-87)。該等方法中使用的藥物包括道諾黴素、阿黴素、甲胺蝶。令及長春地辛(Rowland等人，(1986)同上)。抗體-毒素結合物中所有之毒素包括諸如白喉毒素之細菌毒素、諸如篦麻毒素之植物毒素、小分子毒素(諸如膠達納黴素(geldanamycin)(Mandler等人，(2000)J. Nat. Cancer Inst . 92(19):1573-1581；Mandler等人，(2000)Bioorganic ＆ Med. Chem. Letters 10:1025-1028；Mandler等人，(2002)Bioconjugate Chem. 13:786-791)、類美登素(EP 1391213；Liu等人，(1996)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623)及卡奇黴素(calicheamicin)(Lode等人，(1998)Cancer Res. 58:2928；Hinman等人，(1993)Cancer Res. 53:3336-3342)。毒素可藉由包括微管蛋白結合、DNA結合或拓撲異構酶抑制之機制來發揮其細胞毒性作用。一些細胞毒性藥物當與大抗體或蛋白質受體配位體結合時易變成非活性的或弱活性的。
ZEVALIN(替坦異貝莫單抗(ibritumomab tiuxetan),Biogen/Idec)為抗體-放射性同位素結合物，其由藉由硫脲連接子-螯合劑所結合之抗CD20抗原(發現於正常及惡性B淋巴細胞之表面上)之鼠類IgG1 κ單株抗體與111In或90Y放射性同位素構成(Wiseman等人，(2000)Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77；Wiseman等人，(2002)Blood 99(12):4336-42；Witzig等人，(2002)J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63；Witzig等人，(2002)J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69)。儘管ZEVALIN具有抗B細胞非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)的活性，但在大部分患者中投藥會導致嚴重及延長性血細胞減少症。MYLOTARGTM (吉妥珠單抗奧唑米星(gemtuzumab ozogamicin)，Wyeth Pharmaceuticals)，一種由連接至卡奇黴素的huCD33抗體構成之抗體藥物結合物，於2000年獲准用於注射治療急性骨髓性白血病(Drugs of the Future(2000) 25(7):686；美國專利第4970198號、第5079233號、第5585089號、第5606040號、第5693762號、第5739116號、第5767285號、第5773001號)。康圖單抗美坦辛(Cantuzumab mertansine)(Im munogen,Inc.)，一種由經由二硫鍵連接子SPP與類美登素藥物部分DM1連接之huC242抗體構成之抗體藥物結合物，現正推進至治療表現CanAg之癌症的II期試驗，諸如結腸癌、胰臟癌、胃癌及其他癌症。MLN-2704(Millennium Pharm., BZL Biologics,Immunogen Inc.)，一種由與類美登素藥物部分DM1連接之抗前列腺特異性膜抗原(PSMA)單株抗體構成之抗體藥物結合物，正開發用於可能地治療前列腺腫瘤。阿瑞他汀肽(auristatin peptide)、阿瑞他汀E(AE)及單甲基阿瑞他汀(MMAE)，即海兔毒素之合成類似物，係與嵌合單株抗體cBR96(特異於癌瘤中之Lewis Y)及cAC10(特異於惡性血液腫瘤上之CD30)結合(Doronina等人，(2003) Nature Biotechnol. 21(7):778-784)且正在治療開發中。
在某些實施例中，免疫結合物包含抗體及化學治療劑或其他毒素。本文(例如上文)描述適用於產生免疫結合物之化學治療劑。可使用的酶促活性毒素及其片段包括：白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、篦麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、莫迪素A鏈、α-帚麴菌素(alpha-sarcin)、油桐蛋白質(Aleurites fordii protein)、康乃馨蛋白質、美洲商陸蛋白質(Phytolaca americana protein)(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜抑制劑(momordica charantia inhibitor)、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草抑制劑(sapaonaria officinalis inhibitor)、重組植物毒素(gelonin)、有絲分裂素(mitogellin)、侷限麴菌素(restrictocin)、酚黴素、伊諾黴素(enomycin)及黴菌毒素(tricothecene)。參見例如1993年10月28日公開之WO 93/21232。各種放射性核素可用於產生放射性結合之抗體。實例包括212 Bi、131 I、131 In、90 Y及186 Re。抗體及細胞毒性劑之結合物可使用多種雙功能蛋白偶合劑製得，該等蛋白偶合劑諸如3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-丁二醯亞胺酯(SPDP)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、醯亞胺酯之雙功能衍生物(諸如二亞胺代己二酸二甲酯鹽酸鹽)、活性酯(諸如辛二酸二丁二醯亞胺酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮鹽衍生物(諸如雙(對重氮鹽苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，篦麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人，Science,238:1098(1987)中所述加以製備。碳14標記之1-異硫氰氧基苯甲基-3-甲基二伸乙三胺五乙酸(MX-DTPA)為一種用於使放射性核苷酸與抗體結合之例示性螯合劑。參見WO94/11026。
本文亦涵蓋抗體與一或多種小分子毒素(諸如卡奇黴素、類美登素、海兔毒素、奧瑞他汀(aurostatin)、單端孢黴烯族毒素及CC1065以及此等毒素之具有毒素活性之衍生物)之結合物。
美登素與類美登素
在一些實施例中，免疫結合物包含結合至一或多種類美登素分子之抗體(全長或片段)。
類美登素為藉由抑制微管蛋白聚合發揮作用之有絲分裂抑制劑。美登素最先係自東非灌木齒葉美登木(Maytenus serrata)分離(美國專利第3,896,111號)。隨後，發現某些微生物亦產生類美登素，諸如美登醇及C-3美登醇酯(美國專利第4,151,042號)。例如美國專利第4,137,230號；第4,248,870號；第4,256,746號；第4,260,608號；第4,265,814號；第4,294,757號；第4,307,016號；第4,308,268號；第4,308,269號；第4,309,428號；第4,313,946號；第4,315,929號；第4,317,821號；第4,322,348號；第4,331,598號；第4,361,650號；第4,364,866號；第4,424,219號；第4,450,254號；第4,362,663號及第4,371,533號中揭示合成美登醇及其衍生物及類似物。
類美登素藥物部分為抗體藥物結合物中之引人注目之藥物部分，此歸因於其：(i)相對易於藉由醱酵或化學改質、醱酵產物之衍生化來製備；(ii)易於經適於經由非二硫鍵連接子結合至抗體之官能基衍生化；(iii)在血漿中穩定；及(iv)對多種腫瘤細胞株有效。
含有類美登素之免疫結合物、其製造方法及其治療用途揭示於例如美國專利第5,208,020號、第5,416,064號及歐洲專利EP 0 425 235 B1中。Liu等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623(1996)描述包含連接至針對人類結腸直腸癌之單株抗體C242之類美登素(命名為DM1)的免疫結合物。已發現該結合物對所培養之結腸癌細胞具有高細胞毒性且在活體內腫瘤生長檢定中展示出抗腫瘤活性。Chari 等人，Cancer Research 52:127-131(1992)描述免疫結合物，其中類美登素經由二硫鍵連接子與結合至人類結腸癌細胞株上之抗原的鼠類抗體A7結合，或與結合HER-2/neu致癌基因之另一鼠類單株抗體TA.1結合。在活體外，於每個細胞表現3×105 個HER-2表面抗原之人類乳癌細胞株SK-BR-3上測試TA.1-類美登素結合物之細胞毒性。藥物結合物達成與游離類美登素藥物類似之細胞毒性程度，該細胞毒性程度可藉由增加每個抗體分子類美登素分子之數目而增加。A7-類美登素結合物在小鼠體內展示出低全身細胞毒性。
可藉由在不顯著降低抗體或類美登素分子之生物學活性的情況下將抗體與類美登素分子化學連接來製備抗體-類美登素結合物。參見例如美國專利第5,208,020號。平均每個抗體分子結合3-4個類美登素分子已展示出增強目標細胞之細胞毒性之功效而對抗體功能或溶解性並無不利影響，但預期甚至毒素/抗體之1分子即可增強細胞毒性超過使用裸抗體。類美登素在此項技術中熟知，且可藉由已知技術合成或自天然來源分離。適合之類美登素揭示於例如美國專利第5,208,020號及上文提及之其他專利及非專利公開案中。較佳之類美登素為美登醇及在美登素醇分子之芳環中或其他位置處經改質之美登醇類似物，諸如各種美登醇酯。
存在許多此項技術中已知用於製造抗體-類美登素結合物之鍵聯基團，其包括例如美國專利第5,208,020號或歐洲專利0 425 235 B1；Chari等人，Cancer Research 52:127-131(1992)及2004年10月8日申請之美國專利申請案第10/960,602號中所揭示之彼等鍵聯基團。可如2004年10月8日申請之美國專利申請案第10/960,602號所揭示製備包含連接子組分SMCC之抗體-類美登素結合物。如上文所示之專利所揭示，鍵聯基團包括二硫基、硫醚基、酸不穩定基團、光不穩基團、肽酶不穩定基團或酯酶不穩定基團，較佳為雙硫基及硫醚基。本文中描述及例示說明額外鍵聯基團。
抗體與類美登素之結合物可使用多種雙功能蛋白偶合劑製得，該等蛋白偶合劑諸如3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-丁二醯亞胺酯(SPDP)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸丁二醯亞胺酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、醯亞胺酯之雙功能衍生物(諸如二亞胺代己二酸二甲酯鹽酸鹽)、活性酯(諸如辛二酸二丁二醯亞胺酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮鹽衍生物(諸如雙(對重氮鹽苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。尤其較佳之偶合劑包括提供二硫鍵之3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-丁二醯亞胺酯(SPDP)(Carlsson等人，Biochem. J. 173:723-737(1978))及4-(2-吡啶基硫基)戊酸N-丁二醯亞胺酯(SPP)。
可視連接類型而定將連接子連接於類美登素分子之各種位置處。舉例而言，可藉由使用習知偶合技術與羥基反應形成酯鍵。反應可發生於具有羥基之C-3位置、經羥甲基改質之C-14位置、經羥基改質之C-15位置及具有羥基之C-20位置處。在一較佳實施例中，鍵聯形成於美登醇或美登醇類似物之C-3位置處。
阿瑞他汀及海兔毒素
在一些實施例中，免疫結合物包含結合至海兔毒素或海兔毒素肽類似物及衍生物阿瑞他汀之抗體(美國專利第5635483號、第5780588號)。海兔毒素及阿瑞他汀已顯示會干擾微管動力學、GTP水解及核及細胞分裂(Woyke等人(2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584)且具有抗癌(US 5663149)及抗真菌活性(Pettit等人(1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965)。海兔毒素或阿瑞他汀藥物部分可經由肽藥物部分之N(胺基)端或C(羧基)端與抗體連接(WO 02/088172)。
例示性阿瑞他汀實施例包括2004年11月5日申請之「Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands」，美國申請案第10/983,340號中所示之N端連接之單甲基阿瑞他汀藥物部分DE與DF。
肽基藥物部分通常可藉由在兩個或兩個以上胺基酸及/或肽片段之間形成肽鍵來製備。該等肽鍵可例如根據肽化學領域中熟知之液相合成法(參見E. Schrder及K. Lbke,「The Peptides」，第1卷，第76-136頁,1965,Academic Press)來製備。可根據以下文獻中之方法製備阿瑞他汀/海兔毒素藥物部分：US 5635483；US 5780588；Pettit等人，(1989)J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465；Pettit等人，(1998)Anti-Cancer Drug Design 13:243-277；Pettit,G.R.等人，Synthesis,1996,719-725；及Pettit等人，(1996)J. Chem. Soc. Perkin Trans.1 5:859-863。亦參見Doronina(2003)Nat Biotechnol 21(7):778-784；2004年11月5日申請之「Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands」，美國申請案第10/983,340號(例如，揭示製備與連接子結合之單甲基纈胺酸化合物(諸如MMAE及MMAF)的連接子及方法)。
卡奇黴素
在其他實施例中，免疫結合物包含結合至一或多個卡奇黴素分子之抗體。卡奇黴素家族之抗生素能夠在亞皮莫耳濃度下產生雙股DNA斷裂。關於卡奇黴素家族之結合物的製備，參見美國專利第5,712,374號、第5,714,586號、第5,739,116號、第5,767,285號、第5,770,701號、第5,770,710號、第5,773,001號及第5,877,296號(均屬於American Cyanamid Company)。可使用之卡奇黴素之結構類似物包括(但不限於)γ1I、α2I、α3I、N-乙醯基-γ1I、PSAG及θI1(Hinman等人，Cancer Research 53:3336-3342(1993)；Lode等人，Cancer Research 58:2925-2928(1998)；及上文所提及之屬於American Cyanamid之美國專利)。可與抗體結合之另一抗腫瘤藥物為QFA，其為抗葉酸劑。卡奇黴素與QFA皆具有細胞內作用位點且不易於跨過質膜。因此，細胞經由抗體介導之內化作用攝取此等藥劑可大幅增強其細胞毒性效應。
其他細胞毒性劑
可與抗體結合之其他抗瘤劑包括BCNU、鏈脲佐菌素(streptozoicin)、長春新鹼及5-氟尿嘧啶(該家族之藥劑統稱為LL-E33288複合物，如美國專利5,053,394、5,770,710中描述)以及埃斯培拉黴素(esperamicin)(美國專利5,877,296)。
可使用之酶促活性毒素及其片段包括白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(獲自綠膿桿菌)、篦麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、莫迪素A鏈、α-帚麴菌素、油桐蛋白、康乃馨蛋白、美洲商陸蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、重組植物毒素、有絲分裂素、侷限麴菌素、酚黴素、伊諾黴素及黴菌毒素。參見例如1993年10月28日所公開之WO 93/21232。
本發明進一步涵蓋抗體與具有核分解活性之化合物(例如核糖核酸酶或DNA核酸內切酶，諸如去氧核糖核酸酶；DNA酶)之間所形成的免疫結合物。
為選擇性破壞腫瘤，抗體可包含高度放射性原子。可使用多種放射性同位素產生放射性結合抗體。實例包括At211 、I131 、I125 、Y90 、Re186 、Re188 、Sm153 、Bi212 、P32 、Pb212 及Lu之放射性同位素。當使用結合物進行偵測時，其可包含用於閃爍攝影研究之放射性原子，例如tc99m或I123；或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱為磁共振成像，mri)之自旋標記物，諸如碘-123及碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
可以已知方式將放射性標記物或其他標記物併入結合物中。舉例而言，肽可生物合成，或可藉由使用適合胺基酸前驅物進行化學胺基酸合成(例如涉及以氟-19替代氫)來合成。諸如tc99 m或I123 、Re186 、Re188 及In111 之標記物可經由肽中之半胱胺酸殘基連接。可經由離胺酸殘基連接釔-90。可使用IODOGEN方法(Fraker等人(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57)併入有碘-123。「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal,CRC Press 1989)詳細地描述了其他方法。
抗體與細胞毒性劑之結合物可使用多種雙功能蛋白偶合劑製得，該等蛋白偶合劑諸如3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-丁二醯亞胺酯(SPDP)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸丁二醯亞胺酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、醯亞胺酯之雙功能衍生物(諸如二亞胺代己二酸二甲酯鹽酸鹽)、活性酯(諸如辛二酸二丁-二異氰二醯亞胺酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮鹽衍生物(諸如雙(對重氮鹽苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人，Science,238:1098(1987)中所述來製備。碳14標記之1-異硫氰氧基苯甲基-3-甲基二伸乙三胺五乙酸(MX-DTPA)為一種用於使放射性核苷酸與抗體結合之例示性螯合劑。參見WO94/11026。連接子可為利於在細胞中釋放細胞毒性藥物之「可裂解連接子」。舉例而言，可使用酸不穩定連接子、肽酶敏感連接子、光不穩定連接子、二甲基連接子或含二硫鍵之連接子(Chari等人，Cancer Research 52:127-131(1992)；美國專利第5,208,020號)。
該等化合物明確地涵蓋(但不限於)藉由以下交聯劑製備之ADC：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC及磺基-SMPB及SVSB((4-乙烯基碸)苯甲酸丁二醯亞胺酯)，該等交聯試劑為市售的(例如來自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)。參見2003-2004 Applications Handbook and Catalog第467-498頁。
製備抗體藥物結合物
在抗體藥物結合物(ADC)中，抗體(Ab)經由連接子(L)與一或多個藥物部分(D)(例如每個抗體約1至約20個藥物部分)結合。式I之ADC可藉由若干途徑，利用熟習此項技術者已知之有機化學反應、條件及試劑來製備，其包括：(1)使抗體之親核基團與二價連接子試劑反應以經由共價鍵形成Ab-L，之後與藥物部分D反應；及(2)使藥物部分之親核基團與二價連接子試劑反應以經由共價鍵形成D-L，之後與抗體之親核基團反應。本文描述用於製備ADC之額外方法。
Ab-(L-D)p 　I
連接子可由一或多種連接子組分構成。例示性連接子組分包括6-馬來醯亞胺基己醯基(「MC」)、馬來醯亞胺基丙醯基(「MP」)、纈胺酸-瓜胺酸(「val-cit」)、丙胺酸-苯丙胺酸(「ala-phe」)、對胺基苯甲氧基羰基(「PAB」)、4-(2-吡啶基硫基)戊酸N-丁二醯亞胺酯(「SPP」)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸N-丁二醯亞胺酯(「SMCC」)及(4-碘-乙醯基)胺基苯甲酸N-丁二醯亞胺酯(「SIAB」)。額外之連接子組分在此項技術中已知且一些描述於本文中。亦參見「Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands」，美國申請案第10/983,340號,2004年11月5日。
在一些實施例中，連接子可包含胺基酸殘基。例示性胺基酸連接子組分包括二肽、三肽、四肽或五肽。例示性二肽包括：纈胺酸-瓜胺酸(vc或val-cit)、丙胺酸-苯丙胺酸(af或ala-phe)。例示性三肽包括甘胺酸-纈胺酸-瓜胺酸(gly-val-cit)及甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸(gly-gly-gly)。包含胺基酸連接子組分之胺基酸殘基包括天然存在之胺基酸以及次要胺基酸及非天然存在之胺基酸類似物，諸如瓜胺酸。可對胺基酸連接子組分進行設計且優化其對特定酶(例如腫瘤相關蛋白酶、組織蛋白酶B、C及D或纖溶蛋白酶)之酶促裂解之選擇性。
抗體上之親核基團包括(但不限於)：(i)N端胺基；(ii)側鏈胺基，例如離胺酸；(iii)側鏈硫醇基，例如半胱胺酸；及(iv)抗體經糖基化之糖羥基或胺基。胺、硫醇及羥基為親核的且能夠與連接子部分及連接子試劑上之親電子基團反應形成共價鍵，該等親電子基團包括：(i)活性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵甲酸酯及酸鹵化物；(ii)烷基及苄基鹵化物，諸如鹵乙醯胺；(iii)醛、酮、羧基及順丁烯二醯亞胺基。某些抗體具有可還原之鏈間二硫鍵，亦即半胱胺酸橋。可藉由用諸如DTT(二硫蘇糖醇)之還原劑進行處理而使抗體具有與連接子試劑結合之反應性。因此，理論上各半胱胺酸橋將形成兩個反應性硫醇親核體。可經由使離胺酸與2-亞胺基硫雜環戊烷(Traut試劑)反應從而使胺轉化為硫醇而將額外親核基團引入抗體中。可藉由引入一、兩、三、四個或四個以上半胱胺酸殘基(例如製備包含一或多個非天然半胱胺酸胺基酸殘基之突變體抗體)將反應性硫醇基引入抗體(或其片段)中。
亦可藉由修飾抗體以引入可與連接子試劑或藥物上之親核性取代基反應的親電子性部分，來製備抗體藥物結合物。可將糖基化抗體之糖以(例如)過碘酸鹽氧化試劑氧化以形成可與連接子試劑或藥物部分之胺基反應的醛或酮基。所得亞胺希夫鹼(Schiff base)基團可形成穩定鍵，或可例如經硼氫化物試劑還原而形成穩定胺鍵。在一實施例中，糖基化抗體之碳水化合物部分與半乳糖氧化酶或偏過碘酸鈉之反應可於蛋白質中產生可與藥物上之適當基團反應的羰基(醛及酮基團)(Hermanson,Bioconjugate Techniques)。在另一實施例中，含有N端絲胺酸或蘇胺酸殘基之蛋白質可與偏過碘酸鈉反應，從而產生醛而非第一胺基酸(Geoghegan & Stroh,(1992)Bioconjugate Chem. 3:138-146；US 5362852)。該醛可與藥物部分或連接子親核體反應。
同樣，藥物部分上之親核基團包括(但不限於)：能夠與連接子部分及連接子試劑上之親電子基團反應形成共價鍵的胺、硫醇、羥基、醯肼、肟、肼、硫半卡肼、羧酸肼及芳醯肼基團，該等親電子基團包括(i)活性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵甲酸酯及酸鹵化物；(ii)烷基及苄基鹵化物，諸如鹵乙醯胺；(iii)醛、酮、羧基及順丁烯二醯亞胺基。
或者，可例如藉由重組技術或肽合成製造包含抗體及細胞毒性劑之融合蛋白。DNA之長度可包含編碼結合物之兩個部分的各別區，該等區可彼此相鄰或由編碼不破壞結合物所需特性之連接子肽之區分離。
在另一實施例中，抗體可與用於預靶向腫瘤中的「受體」(諸如抗生蛋白鏈菌素)結合，其中將抗體-受體結合物投與患者，之後使用澄清劑將未結合之結合物自循環系統中移除，且接著投與結合至細胞毒性劑(例如放射性核苷酸)的「配位體」(例如抗生物素蛋白)。
醫藥調配物
藉由混合具有所需純度之抗體與生視情況選用之理學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(Remington:The Science and Practice of Pharmacy，第20版(2000))來製備呈水溶液、冷凍乾燥或其他乾燥調配物形式之包含本發明抗體之治療調配物以儲存。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所用劑量及濃度下對接受者而言無毒，且包括：緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽、組胺酸及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八基二甲基苄基氯化銨；氯化六烴季銨(hexamethonium chloride)；氯化苯甲烴銨(benzalkonium chloride)； 苄索氯銨(benzethonium chloride)；苯酚；丁醇或苯甲醇；對羥苯甲酸烷基酯，諸如對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯；兒茶酚(catechol)；間苯二酚(resorcinol)；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；鹽形成抗衡離子，諸如鈉離子；金屬錯合物(例如鋅蛋白質錯合物)；及/或非離子型界面活性劑，諸如TWEENTM 、PLURONICSTM 或聚乙二醇(PEG)。
本文之調配物亦可含有為所治療之特定適應症所必需的一種以上活性化合物，較佳具有彼此並無不利影響之互補活性之活性化合物。該等分子適合地以對預定目的有效之量組合存在。
亦可例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合將活性成截留於所製備之微囊(例如分別為羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊)中、截留於膠狀藥物傳遞系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)中或截留於巨乳液中。該等技術揭示於Remington:The Science and Practice of Pharmacy 第20版(2000)中。欲用於活體內投藥之調配物必須無菌。其易於藉由經由無菌過濾膜過濾來實現。
可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適合實例包括含有本發明免疫球蛋白之固體疏水性聚合物的半通透性基質，該等基質呈成形物品之形式，例如薄膜或微膠囊。持續釋放基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸交酯(美國專利第3,773,919號)、L-麩胺酸與γ乙基-L-麩胺酸酯之共聚物、不可降解性乙烯-乙酸乙烯酯、可降解性乳酸-乙醇酸共聚物(諸如LUPRON DEPOTTM (由乳酸-乙醇酸共聚物與亮丙瑞林乙酸鹽組成之可注射微球體))及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。雖然諸如乙烯-乙酸乙烯酯及乳酸-乙醇酸之聚合物能夠使分子經100天釋放，但某些水凝膠會經短時期釋放蛋白質。當包封免疫球蛋白在軀體中長久保持時，其可能因在37℃下、暴露於潮濕而變性或聚集，導致生物活性降低及可能的免疫原性變化。可視所涉及之機制而設計合理策略以達成穩定。舉例而言，若發現聚集機制為經由硫基-二硫鍵互換形成分子間S-S鍵，則可藉由修飾硫氫基殘基、由酸性溶液冷凍乾燥、控制水分含量、使用適當添加劑及發展特異性聚合物基質組合物來實現穩定化。
用途
本發明之抗體可用於例如活體外、離體及活體內治療方法。
本發明提供適用於調節與EGFL7之表現及/或活性(諸如提高之表現及/或活性或不當表現及/或活性)相關之疾病狀態的方法及組合物，該等方法包含向需要該處理之個體投與有效劑量之抗-EGFL7抗體。
在一態樣中，本發明提供一種治療或預防腫瘤、癌症及/或細胞增殖性病症之方法，該等方法包含向需要該治療之個體投與有效量之本發明之抗-EGFL7抗體。
在一態樣中，本發明提供抑制血管生成之方法，該等方法包含向需要該治療之個體投與效量之抗-EGFL7抗體。
在一態樣中，本發明提供增強另一抗血管生成劑之功效的方法，該等方法包含向需要該治療之個體投與效量之抗-EGFL7抗體。在一些實施例中，個體患有腫瘤、癌症及/或細胞增殖性病症。在一些實施例中，其他抗血管生成劑靶向VEGF，例如抗-VEGF抗體。
應瞭解，任何適合的抗-EGFL7抗體均可用於治療方法，該抗體包括單株及/或多株抗體、人類抗體、嵌合抗體、親和力成熟抗體、人類化抗體及/或抗體片段。在一些實施例中，本文所述之任何抗-EGFL7抗體可用於治療中。
在本文方法中之任一者中，可向個體或患者投與有效量之第二藥劑以及本文之抗體(其中本文之抗體為第一藥劑)，該第二藥劑為可治療需要治療之個體之病狀的另一活性劑。舉例而言，本發明之抗體可與另一抗體、化學治療劑(包括化學治療劑之混合物)、抗血管生成劑、免疫抑制劑、細胞激素、細胞激素拮抗劑及/或生長抑制劑共同投與。該第二藥劑之類型取決於各種因素，包括疾病類型、疾病嚴重性、患者之病狀及年齡、所用第一藥劑之類型及劑量等。
當本發明之抗體抑制腫瘤生長時，例如，可能尤其需要將其與一或多種亦抑制腫瘤生長之其他治療劑組合。舉例而言，在治療方案中，例如在治療任一種本文所述疾病(包括結腸直腸癌、肺癌、肝細胞癌、乳癌及/或胰臟癌)中，本發明抗體可與抗血管生成劑，諸如抗-VEGF抗體(例如AVASTIN)及/或抗-ErbB抗體(例如HERCEPTIN曲妥珠單抗(trastuzumab)抗-HER2抗體，或結合至HER2之II域之抗-HER2抗體，諸如OMNITARGTM 帕妥珠單抗(pertuzumab)抗-HER2抗體)組合。在一些情況下，可使用雙特異性抗體實現先前組合。或者或另外，患者可接受組合輻射治療(例如外光束輻射，或經放射性標記劑(諸如抗體)治療)。
該等以上所說明之組合治療包括組合投與(其中兩種或兩種以上藥劑包括於同一或分開之調配物中)，及分開投與，在此情況下，本發明抗體之投與可在投與佐劑治療之前及/或之後進行。另外，預期將本發明抗體與相對無細胞毒性之藥劑(諸如另一生物分子，例如另一抗體)組合會使細胞毒性相對於將抗體與對細胞具高毒性之化學治療劑或其他藥劑組合的細胞毒性有所降低。
用本文之抗體與一或多種第二藥劑之組合治療較佳會引起癌症之病徵或症狀改良。舉例而言，該療法可使存活率(總存活率及/或無進展存活率)相對於僅以第二藥劑(例如僅化學治療劑)治療之患者有所改良，及/或可產生客觀反應(部分或完全，較佳完全)。此外，以本文之抗體與一或多種第二藥劑組合治療較佳將對患者產生加和且更佳協同(或高於加和)之治療效益。較佳地，在此組合方法中，至少一次投藥第二藥劑與至少一次投藥本文抗體之間的時間為約一個月或一個月以下，更佳為約兩週或兩週以下。
對於癌症治療而言，第二藥劑較佳為另一抗體、化學治療劑(包括化學治療劑之混合物)、抗血管生成劑、免疫抑制劑、前藥、細胞激素、細胞激素拮抗劑、細胞毒性放射療法、皮質類固醇、止吐劑、癌症疫苗、鎮痛劑、抗血管劑及/或生長抑制劑。細胞毒性劑包括與DNA相互作用之藥劑、抗代謝物、拓撲異構酶I抑制劑或拓撲異構酶II抑制劑、或紡錘體抑制劑或穩定劑(例如較佳為長春生物鹼，更佳係選自長春鹼、去氧長春鹼、長春新鹼、長春地辛、長春瑞濱、長春匹定、長春磷汀、長春利定及長春氟寧(vinfunine))，或用於化學療法之任何藥劑，諸如5-氟尿嘧定、紫杉烷、小紅莓或地塞米松(dexamethasone)。
在一些實施例中，第二藥劑為用以治療癌症之另一抗體，諸如針對HER2/neu受體之細胞外域之彼等抗體，例如曲妥珠單抗或其功能片段中之一者、pan-HER抑制劑、Src抑制劑、MEK抑制劑或EGFR抑制劑(例如抗-EGFR抗體，(諸如抑制EGFR之酪胺酸激酶活性的抗體)，其較佳為小鼠單株抗體225，其小鼠雄性嵌合衍生物C225或源自此抗體225之人類化抗體或衍生之天然藥劑、二苯胺基鄰苯二甲醯亞胺、吡唑幷吡啶并嘧啶或吡咯并吡啶幷嘧啶、喹唑啉、吉非替尼(gefitinib)、埃羅替尼(erlotinib)、西妥昔單抗、ABX-EFG、卡拉替尼(canertinib)、EKB-569及PKI-166)、或雙-EGFR/HER-2抑制劑(諸如拉帕替尼(lapatanib))。其他第二藥劑包括阿侖單抗(alemtuzumab，CAMPATHTM )、FavID(IDKLH)、糖基化作用改變之CD20抗體(諸如GA-101/GLYCARTTM )、奧利默森(GENASENSETM )、沙立度胺及其類似物(諸如來那度胺(lenalidomide，REVLIMIDTM ))、伊馬替尼(imatinib)、索拉非尼、奧伐組單抗(ofatumumab，HUMAX-CD20TM )、抗-CD40抗體(例如SGN-40)及抗-CD80抗體(例如伽利昔單抗(galiximab))。
止吐劑較佳為昂丹司瓊鹽酸鹽(ondansetron hydrochloride)、格拉司瓊鹽酸鹽(granisetron hydrochloride)、甲氧氯普胺(metroclopramide)、多潘立酮(domperidone)、氟哌啶醇(haloperidol)、賽克利嗪(cyclizine)、勞拉西泮(lorazepam)、丙氯拉嗪(prochlorperazine)、地塞米松、左美丙嗪(levomepromazine)或托烷司瓊(tropisetron)。疫苗較佳為GM-CSF DNA及基於細胞之疫苗、樹突狀細胞疫苗、重組病毒疫苗、熱休克蛋白(HSP)疫苗、異源或自體腫瘤疫苗。鎮痛劑較佳為布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、三柳酸膽鹼鎂或羥可待酮鹽酸鹽(oxycodone hydrochloride)。抗血管劑較佳為貝伐單抗或rhuMAb-VEGF。其他第二藥劑包括抗增生劑，諸如法呢基蛋白質轉移酶抑制劑、抗VEGF抑制劑、p53抑制劑或PDGFR抑制劑。本文之第二藥劑亦包括生物靶向療法，諸如用抗體之治療以及靶向小分子之療法(例如針對某些受體)。
許多抗血管生成劑已經鑑定且在此項技術中已知，該等抗血管生成劑包括本文中所列舉的抗血管生成劑，例如定義下所列舉的抗血管生成劑，及例如Carmeliet及Jain,Nature 407:249-257(2000)；Ferrara等人，Nature Reviews:Drug Discovery,3:391-400(2004)；及Sato Int. J. Clin. Oncol.,8:200-206(2003)中所列舉的抗血管生成劑。亦參見美國專利申請案US20030055006。在一實施例中，抗-EGFL7抗體與包括(但不限於)以下之抗-VEGF中和抗體(或片段)及/或另一種VEGF拮抗劑或VEGF受體拮抗劑組合使用：例如可溶性VEGF受體(例如VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、神經菌毛蛋白(neuropilin)(例如NRP1、NRP2))片段、能夠阻斷VEGF或VEGFR之適體、中和抗-VEGFR抗體、VEGFR酪胺酸激酶(RTK)之低分子量抑制劑、VEGF之反義策略、針對VEGF或VEGF受體之核糖核酸酶、VEGF之拮抗劑變異體；及其任何組合。或者或另外，兩種或兩種以上血管生成抑制劑，以及VEGF拮抗劑及其他藥劑，可視情況共投與患者。在某些實施例中，一或多種其他治療劑(例如抗癌劑)可與抗-EGFL7抗體、VEGF拮抗劑及抗血管生成劑組合投與。
此處適用之化學治療劑係在上文中例如在「化學治療劑」之定義中說明。
該等第二藥劑可在本文抗體投與後48小時內投與，或在該藥劑投與之後24小時內或12小時內或3-12小時內投與，或可在預先選擇之時間段(其較佳為約1至2天)內投與。此外，該藥劑之劑量可為亞治療劑量。
本文之抗體可與第二藥劑同時、依序或交替投與，或在無反應下與其他療法投與。因此，第二藥劑之組合投與包括使用各別調配物或單一醫藥調配物共投與(同時投與)；及以任一次序連續投與，其中較佳有一段時間兩種(或所有)藥劑同時發揮生物活性。所有此等第二藥劑可彼此組合使用，或其本身與第一藥物組合使用，故本文所用之表達「第二藥劑」並不意謂其分別為除第一藥物外之唯一藥物。因此，第二藥劑無需為一種藥物，但可構成或包含一種以上該藥物。
如本文所述之此等第二藥劑一般以第一藥劑相同之劑量及投藥途徑或以第一藥劑之劑量約1%至99%之量使用。若使用該等第二藥劑，則其較佳以低於不存在第一藥劑時之量使用，尤其在第一藥劑之初始給藥之後續給藥中，以消除或減小由此所引起之副作用。
本發明亦提供抑制或預防復發性腫瘤生長或復發性癌細胞生長的方法及組合物。復發性腫瘤生長或復發性癌細胞生長係用於描述一種病狀，其中患者經歷或經一或多種現行療法(例如癌療法，諸如化學療法、輻射療法、手術療法、激素療法及/或生物學療法/免疫療法、抗-VEGF抗體療法，尤其對於特定癌之標準治療方案)治療在臨床上不足以治療該等患者，或該等患者已不再自療法中獲得任何有益效應，以致該等患者需要其他有效療法。如本文所用，該用語亦可指「無反應/難治癒」患者之病狀，例如其描述對療法有反應但遭受副作用、產生抗性、對療法無反應、對療法無令人滿意之反應等之患者。在各種實施例中，癌症為復發性腫瘤生長或復發性癌細胞生長，其中癌細胞之數目未顯著減低或已提高，或腫瘤大小未顯著減低或已提高，或癌細胞之大小或數目無任何進一步減低。藉由此技術中已知之檢定癌細胞治療有效性的任一方法，使用此技術公認之「復發性」或「難治癒性」或「無反應性」之含義，在活體內或活體外可測定癌細胞是否為復發性腫瘤生長或為復發性癌細胞生長。對抗-VEGF治療有抗性的腫瘤為復發性腫瘤生長之實例。
本發明提供藉由投與抗-EGFL7抗體來阻遏或減緩個體之復發性腫瘤生長或復發性癌細胞生長，以阻遏或減緩個體之復發性腫瘤生長或復發性癌細胞生長的方法。在某些實施例中，可在其他癌治療劑之後投與拮抗劑。在某些實施例中，抗-EGFL7抗體與癌治療劑同時投藥。或者或另外，抗-EGFL7抗體治療與另一種癌症治療交替進行，此可以任一種次序執行。本發明亦涵蓋投與一或多種抑制性抗體以防止經預診患有癌症之患者之癌症的發作或復發的方法。一般而言，個體曾經歷癌治療或當前經歷癌治療。在一實施例中，癌症治療以抗血管生成劑(例如VEGF拮抗劑)治療。抗血管生成劑包括此項技術中已知的彼等藥劑及本文定義中提供的彼等藥劑。在一實施例中，抗血管生成劑為抗-VEGF中和抗體或片段(例如人類化A4.6.1、AVASTIN(Genentech,South San Francisco,CA)、Y0317、M4、G6、B20、2C3等)。參見例如美國專利6,582,959、6,884,879、6,703,020；WO98/45332；WO 96/30046；WO94/10202；EP 0666868B1；美國專利申請案20030206899、20030190317、20030203409及20050112126；Popkov等人,Journal of Immunological Methods 288:149-164(2004)；及WO2005012359。額外藥劑可與VEGF拮抗劑及抗-EGFL7抗體組合投與以阻遏或緩減復發性腫瘤生長或復發性癌細胞生長。
本發明之抗體(及輔助治療劑)可藉由任何適合之方式投與，包括非經腸、皮下、腹膜內、肺內及鼻內方式，且必要時在病灶內投藥用於局部治療。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投藥。另外，適合地藉由脈衝輸注來投與抗體，尤其遞減劑量之抗體。部分上視投藥之短期或長期性而定，可藉由任何適合途徑(例如藉由注射，諸如靜脈內或皮下注射)給藥。
在製備及投與抗體中，可考慮本發明抗體之結合目標之位置。當結合目標為胞內分子時，本發明之某些實施例提供引入結合目標位置所在之細胞中的抗體或其抗原結合片段。在一實施例中，本發明抗體可作為胞內抗體表現於細胞內。如本文中所用之術語「胞內抗體」係指如以下文獻中所述之可細胞內表現且能夠選擇性結合目標分子的抗體或其抗原結合部分：Marasco,Gene Therapy 4:11-15(1997)；Kontermann,Methods 34:163-170(2004)；美國專利第6,004,940號及第6,329,173號；美國專利申請公開案第2003/0104402號及PCT公開案第WO2003/077945號。亦參見例如1996年3月14日公開之WO96/07321，其係關於使用基因療法產生胞內抗體。
可藉由將編碼所需抗體或其抗原結合部分之核酸(不具有通常與編碼抗體或抗原結合片段之基因締合之野生型引導序列及分泌信號)引入目標細胞中來實現胞內抗體之胞內表現。可將一或多種編碼全部或一部分本發明抗體之核酸傳遞至目標細胞，以致表現一或多種能夠結合至胞內目標多肽且調節目標多肽之活性的胞內抗體。可使用任一種將核酸引入細胞內之標準方法，其包括(但不限於)：顯微注射、彈道注射、電穿孔、磷酸鈣沈澱、脂質體及用反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒及帶有相關核酸的牛痘載體轉染。
在某些實施例中，可藉由活體內及離體方法將核酸(視情況含於載體中)引入患者細胞中。在活體內傳遞之一實例中，例如在需要治療干預之部位將核酸直接注入患者中。在活體內傳遞之另一實例中，使用以病毒載體(諸如腺病毒、單純疱疹I病毒或腺相關病毒)及基於脂質之系統(適用於脂質介導之基因轉移的脂質為例如DOTMA、DOPE及DC-Chol)進行之轉染將核酸引入細胞中。關於某些基因標記及基因療法方案的綜述，參見Anderson等人，Science 256:808-813(1992)及WO 93/25673以及其中引用之參考文獻。在離體治療之實例中，移除患者之細胞，將核酸引入彼等分離之細胞中，且直接或例如以包封於植入患者中之多孔膜內之方式將改質之細胞投與患者(參見例如美國專利第4,892,538號及第5,283,187號)。離體傳遞核酸之常用載體為反轉錄病毒載體。
在另一實施例中，提供內在化抗體。抗體可具有增強抗體傳遞入細胞內的某些特徵，或經修飾可具有該等特徵。此項技術中已知達成此目的之技術。舉例而言，已知抗體之陽離子化有助於其吸收至細胞中(參見例如美國專利第6,703,019號)。脂質體轉染或脂質體亦可用於將抗體傳遞至細胞內。當使用抗體片段時，特異性結合目標蛋白之最小抑制片段可為有利的。舉例而言，可基於抗體之可變區序列設計保留結合目標蛋白序列能力的肽分子。該等肽可化學合成及/或藉由重組DNA技術產生。參見例如Marasco等人，Proc. Natl. Acad. Sci USA ,90:7889-7893(1993)。
可藉由此項技術中已知之其他方法增進抗體進入目標細胞中。舉例而言，某些序列，諸如源自HIV Tat或觸角腳突變同源域蛋白之彼等序列能夠跨越細胞膜直接有效地攝取異源蛋白。參見例如Chen等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999),96:4325-4329。
當抗體之結合目標位於腦中時，本發明之某些實施例提供橫越血腦屏障之抗體。存在此項技術中已知用於跨血腦障壁轉運分子之若干方法，其包括(但不限於)物理方法、基於脂質之方法、基於幹細胞之方法以及基於受體及通道之方法。
跨血腦障壁轉運抗體之物理方法包括(但不限於)完全規避血腦障壁，或藉由在血腦障壁中形成開口。規避方法包括(但不限於)直接注入腦內(參見例如Papanastassiou等人，Gene Therapy 9:398-406(2002))、間質輸注/對流增強型傳遞(參見例如Bobo等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2076-2080(1994))及將傳遞裝置植入腦內(參見例如Gill等人，Nature Med. 9:589-595(2003)；及Gliadel WafersTM ,Guildford Pharmaceutical)。在障壁中產生開口之方法包括(但不限於)超音波(參見例如美國專利公開案第2002/0038086號)、滲透壓(例如藉由投與高滲壓甘露糖醇(Neuwelt,E. A.,Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation ,第1卷及第2卷，Plenum Press,N.Y.(1989))、藉由例如緩激肽或滲透劑A-7滲透(參見例如美國專利第5,112,596號、第5,268,164號、第5,506,206號及第5,686,416號))及用含有編碼抗體之基因的載體轉染跨血腦障壁之神經元(參見例如美國專利公開案第2003/0083299號)。
跨血腦障壁轉運抗體之基於脂質之方法包括(但不限於)將抗體包封於偶合至與血腦障壁之血管內皮上之受體結合之抗體結合片段之脂質體中(參見例如美國專利申請公開案第20020025313號)，及將抗體塗佈於低密度脂蛋白粒子中(參見例如美國專利申請公開案第20040204354號)或載脂蛋白E中(參見例如美國專利申請公開案第20040131692號)。
跨血腦障壁轉運抗體之基於幹細胞之方法需要對神經祖細胞(NPC)進行基因工程改造以表現相關抗體且接著將幹細胞植入欲治療之個體之腦中。參見Behrstock等人，(2005) Gene Ther. 2005年12月15日，提前線上出版(報導當植入齧齒動物及靈長類動物模型之腦內時，NPC經基因工程改造以表現帕金森病之神經營養因子GDNF降低症狀)。
跨血腦障壁轉運抗體之基於受體及通道之方法包括(但不限於)：使用糖皮質激素阻斷劑以提高血腦障壁之通透性(參見例如美國專利申請公開案第2002/0065259號、第2003/0162695號及第2005/0124533號)；激活鉀通道(參見例如美國專利申請公開案第2005/0089473號)；抑制ABC藥物轉運體(參見例如美國專利申請公開案第2003/0073713號)；用運鐵蛋白塗佈抗體且調節一或多種運鐵蛋白受體之活性(參見例如美國專利申請公開案第2003/0129186號)；及陽離子化抗體(參見例如美國專利第5,004,697號)。
以與良好醫療實務一致之方式調配、給藥及投與本發明抗體。在此情形下考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病狀、病症之起因、藥劑之傳遞位點、投藥方法、投藥時程及從業醫生已知之其他因素。抗體無需但視情況可與一或多種當前用於預防或治療所述病症之藥劑一起調配。該等其他藥劑之有效量視存在於調配物中之抗體之量、病症或治療之類型及以上討論之其他因素而定。此等藥劑一般以相同劑量且利用本文所述之投藥途徑使用，或以本文所述劑量之約1%至99%使用，或以任意劑量且憑經驗/臨床上確定為適當的任何途徑使用。
為了預防或治療疾病，本發明抗體之適當劑量(當單獨或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)視欲治療之疾病的類型、抗體類型、疾病之嚴重程度及進程、抗體投與是用於預防性抑或治療性目的、先前療法、患者之臨床病史及對抗體之反應以及主治醫師之判斷而定。抗體適於一次性或經一系列治療投與至患者。無論例如藉由一或多次分開投藥，抑或藉由連續輸注，視疾病類型及嚴重程度而定，約1 μg/kg至15 mg/kg(例如，0.1 mg/kg-10 mg/kg)之抗體可為投與患者的初始候選劑量。一種典型日劑量可在約1 μg/kg至100 mg/kg或100 mg/kg以上之範圍內，此視以上所提及之因素而定。對於經數天或更長時間的重複投藥，視病狀而定，治療一般可持續至疾病症狀之所要抑制發生為止。抗體之一種例示性劑量在約0.05 mg/kg至約10 mg/kg之範圍內。因此，可將約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg或10 mg/kg之一或多個劑量(或其任何組合)投與患者。該等劑量可間歇地投與，例如每週或每三週(例如以使得患者接受約2至約20或例如約6個劑量的抗體)。可投與最初較高負荷劑量，接著可投與一或多個較低劑量。例示性給藥方案包含投與約4 mg/kg之初始負荷劑量之抗體，之後投與約2 mg/kg之每週維持劑量之抗體。然而，其他給藥方案均可適用。此療法之進程易於藉由習知技術及檢定監測。
診斷方法及偵測方法
本發明之抗-EGFL7抗體可用於偵測特定細胞或組織中EGFL7之表現的檢定(諸如診斷或預後檢定)中，其中將抗體如下文所述標記及/或固定於不可溶基質上。
在另一態樣中，本發明提供偵測EGFL7之方法，該等方法包含偵測樣品中之EGFL7-抗-EGFL7抗體複合物。如本文所用之術語「偵測」包括在有或無對照物參考下的定性偵測及/或定量偵測(量測水準)。
在另一態樣中，本發明提供本文所述之抗-EGFL7抗體中之任一者，其中抗-EGFL7抗體包含可偵測標記。
在另一態樣中，本發明提供本文所述之抗-EGFL7抗體中之任一者與EGFL7之複合物。在一些實施例中，該複合物為活體內或活體外複合物。在一些實施例中，該複合物包含癌細胞。在一些實施例中，抗-EGFL7抗體經可偵測地標記。
在許多熟知偵測檢定方法之任一種中可使用抗-EGFL7抗體(例如本文所述EGFL7抗體中之任一者)偵測EGFL7。
舉例而言，可藉由自所需來源獲得樣品，將樣品與抗-EGFL7抗體混合以使抗體與混合物中存在之任何EGFL7形成抗體/EGFL7複合物，並偵測混合物中存在之任何抗體/EGFL7複合物來檢定生物樣本中之EGFL7。可藉由此項技術中已知之適於特定樣品之方法製備生物樣本用於檢定。根據所使用之檢定類型選擇將樣本與抗體混合之方法及偵測抗體/EGFL7複合物之方法。該等檢定包括免疫組織化學、競爭及夾層檢定及空間抑制檢定。對於樣品製備而言，可使用來自哺乳動物(通常為人類患者)之組織或細胞樣本。樣品之實例包括(但不限於)：癌細胞，諸如結腸、乳房、前列腺、卵巢、肺、胃、胰腺、淋巴瘤及白血病之癌細胞。EGFL7亦可以血清量測。可藉由此項技術中已知之多種程序獲得樣品，該等程序包括(但不限於)外科切除術、抽吸或活組織檢查。組織可為新鮮或冷凍組織。在一實施例中，將樣品固定並嵌埋至石蠟或其類似物中。組織樣品可藉由習知方法固定(亦即保存)(參見例如「Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology」，第3版(1960) Lee G.Luna,HT(ASCP)編，The Blakston Division McGraw-Hill Book Company,New York；The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology (1994) Ulreka V. Mikel編，Armed Forces Institute of Pathology,American Registry of Pathology,Washington,D.C.)。一般技術者應瞭解，固定劑之選擇由欲經組織學染色或另外分析樣品之目的確定。一般技術者亦應瞭解，固定長度視組織樣品之大小及所使用之固定劑而定。舉例而言，可使用中性緩衝福馬林(formalin)、包音氏(Bouin's)或三聚甲醛固定樣品。一般而言，首先將樣品固定，且接著經由上升之一系列醇脫水，用石蠟或其他切片介浸質潤及嵌埋，以可將組織樣品切片。或者，可將組織切片且固定所獲得之切片。舉例而言，可藉由習知方法將組織樣品於石蠟中嵌埋且加工(參見例如「Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology」，同上)。可使用之石蠟之實例包括(但不限於)Paraplast、Broloid及Tissuemay。一旦將組織樣品嵌埋，即可藉由切片機或其類似物將樣品切片(參見例如「Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology」，同上)。舉例而言，對於此程序，切片之厚度可在約3微米至約5微米之範圍內。一旦進行切片，即可藉由若干標準方法將切片附著於載片。載片黏著劑之實例包括(但不限於)矽烷、明膠、聚-L-離胺酸及其類似物。舉例而言，可將石蠟嵌埋切片附著至帶正電之載片及/或塗佈聚-L-離胺酸之載片。若已將石蠟用作嵌埋物質，則一般會將組織切片脫蠟且復水。可藉由若干習知標準方法將組織切片脫蠟。舉例而言，可使用二甲苯及漸升之一系列醇(參見例如「Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology」，同上)。或者，可使用市售之脫蠟非有機藥劑，諸如Hemo-De7(CMS,Houston,Texas)。
EGFL7之分析方法均使用一或多種以下試劑：標記之EGFL7類似物、固定之EGFL7類似物、標記之抗-EGFL7抗體、固定之抗-EGFL7抗體及空間結合物。標記之試劑亦稱為「示蹤物」。
所使用之標記物為不干擾EGFL7及抗-EGFL7抗體之結合的任何可偵測之官能基。已知多種用於免疫檢定之標記物，實例包括可直接偵測之部分，諸如螢光染料、化學發光劑及放射性標記，以及必須經反應或衍生化而得以偵測之部分，諸如酶。
所用之標記物為不干擾EGFL7及抗-EGFL7抗體之結合的任何可偵測之官能基。已知多種用於免疫檢定之標記物，實例包括可直接偵測之部分，諸如螢光染料、化學發光劑及放射性標記，以及必須經反應或衍生化而得以偵測之部分，諸如酶。該等標記物之實例包括：放射性同位素32 P、14 C、125 I、3 H及131 I；螢光團，諸如稀土螯合劑或螢光素及其衍生物；若丹明(rhodamine)及其衍生物；丹醯(dansyl)；傘酮(umbelliferone)；螢光素酶，例如，螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶(美國專利第4,737,456號)；螢光素；2,3-二氫酞嗪二酮；辣根過氧化酶(HRP)；鹼性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖澱粉酶；溶菌酶；醣氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸去氫酶；與使用過氧化氫氧化染料前驅物(諸如HRP)之酶偶合的雜環氧化酶，諸如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶；乳過氧化酶，或微過氧化酶；生物素/抗生物素蛋白；自旋標記物；噬菌體標記物；穩定性自由基，及其類似物。
可使用習知方法使此等標記物與蛋白質或多肽共價結合。舉例而言，可使用諸如二醛、碳化二亞胺、二馬來醯亞胺、雙醯亞胺酯、雙偶氮聯苯胺及其類似物之偶合劑將抗體與上述螢光、化學發光及酶標記連接。參見例如美國專利第3,940,475(螢光測定法)號及第3,645,090號(酶)；Hunter等人，Nature ,144 : 945(1962)；David等人，Biοchemistry ,13 : 1014-1021(1974)；Pain等人，J. Immunol. Methods ,40 : 219-230(1981)；及Nygren,J. Histochem. and Cytochem. ,30 :407-412(1982)。本文中標記較物佳為酶，諸如辣根過氧化酶及鹼性磷酸酶。該標記(包括該等酶)與抗體之結合為一般熟習免疫檢定技術者的標準操作程序。參見例如O'Sullivan等人，「Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay」，Methods in Enzymology ,J.J. Langone及H. Van Vunakis編，第73卷(Academic Press,New York,New York,1981)，第147-166頁。
某些檢定方法中需要固定試劑。固定使抗-EGFL7抗體與在溶液中保持游離之任何EGFL7分離。通常藉由在檢定程序之前如藉由吸附至水不溶性基質或表面(Bennich等人，U.S. 3,720,760)，藉由共價偶合(例如使用戊二醛交聯)使抗-EGFL7抗體或EGFL7類似物不能溶解或藉由在檢定程序之後例如藉由免疫沈澱使抗-EGFL7抗體或EGFL7類似物不能溶解來實現此目的。
可使用免疫組織化學及染色方案研究樣品中蛋白質之表現。已顯示組織切片之免疫組織化學染色為一種評定或偵測樣品中蛋白質之存在的可靠方法。免疫組織化學(「IHC」)技術一般藉由發色或螢光方法利用抗體原位探查及觀測細胞抗原。對於樣品製備而言，可使用來自哺乳動物(通常為人類患者)之組織或細胞樣品。可藉由此項技術中已知之多種程序獲得樣品，該等程序包括(但不限於)外科切除術、抽吸或活組織檢查。組織可為新鮮或冷凍組織。在一實施例中，將樣品固定並嵌埋至石蠟或其類似物中。可藉由習知方法固定(亦即保存)組織樣品。一般熟習此項技術者應瞭解，固定劑之選擇由欲經組織學染色或另外分析樣本之目的確定。一般技術者亦應瞭解，固定長度視組織樣品之大小及所使用之固定劑而定。
IHC可與諸如形態染色及/或原位螢光雜交之額外技術組合進行。存在兩種IHC之通用方法，即直接與間接檢定。根據第一檢定，直接測定抗體與目標抗原(例如EGFL7)之結合。此直接檢定使用可在無進一步抗體相互作用之情況下觀測之經標記試劑，諸如螢光標籤或酶標記之一次抗體。在典型間接檢定中，未結合之一次抗體與抗原結合，且接著經標記之二次抗體與一次抗體結合。在二次抗體與酶標記物結合之情況下，添加發色或螢光受質以便觀測抗原。由於若干二次抗體可與一次抗體上之不同抗原決定基反應，故而出現信號擴增。
用於免疫組織化學之一次及/或二次抗體通常可經可偵測部分標記。可利用多種標記物。
除上述樣品製備程序外，可能需要在IHC之前、期間或之後進一步處理組織切片，例如可進行抗原決定基回收法，諸如在檸檬酸緩衝液中加熱組織樣品(參見例如Leong等人，Appl. Immunohistochem. 4(3):201(1996))。
在視情況選用之阻斷步驟後，在適合條件下使組織切片暴露至一次抗體維持一段足夠之時間段，從而使一次抗體與組織樣品中之目標蛋白抗原結合。用於達成此目的之適當條件可藉由常規實驗確定。藉由使用上文所討論之可偵測標記中之任一者測定抗體與樣品之結合程度。標記物較佳為催化發色受質(諸如3,3'-二胺基聯苯胺色原體)化學變化之酶標記物(例如HRPO)。較佳使酶標記物與特異性結合至一次抗體之抗體結合(例如一次抗體為兔多株抗體且二次抗體為山羊抗兔抗體)。
可安裝由此製備之樣本並以蓋玻片覆蓋。接著例如使用顯微鏡測定載片評估，且可使用此項技術常規使用之染色強度標準。
稱為競爭或夾層檢定之其他檢定方法已良好建立且廣泛用於商業診斷產業中。
競爭檢定依賴於示蹤物EGFL7類似物與測試樣品EGFL7競爭有限量之抗-EGFL7抗體抗原結合位點之能力。一般在競爭之前或之後使抗-EGFL7抗體不溶解，且接著使與抗-EGFL7抗體結合之示蹤物及EGFL7與未結合之示蹤物及EGFL7分離。此分離可藉由傾析(在使結合搭配物預先不溶解之情況下)或藉由離心(在競爭反應後使結合搭配物沈澱之情況下)實現。測試樣品EGFL7之量與如由標記物質之量所量測的結合示蹤物之量成反比。製備已知EGFL7量之劑量反應曲線且與測試結果相比以定量測定測試樣品中所存在之EGFL7的量。當將使用酶作為可偵測標記物時，此等檢定稱為ELISA系統。
稱為「均質」檢定之另一種競爭性檢定不需要相分離。此處，製備並使用酶與EGFL7之結合物，以致當抗-EGFL7抗體與EGFL7結合時，抗-EGFL7抗體之存在將改變酶活性。在此情況下，使EGFL7或其免疫活性片段經雙功能有機橋與酶(諸如過氧化物酶)結合。選擇用於抗-EGFL7抗體之結合物以便使抗-EGFL7抗體之結合抑制或加強標記物之酶活性。此方法本身已以EMIT之名稱經廣泛實踐。
將空間結合物用於均質檢定之位阻方法中。藉由使低分子量半抗原與小EGFL7片段共價連接合成此等結合物，從而使針對半抗原之抗體實質上無法與抗-EGFL7抗體同時與結合物結合。在此檢定程序中，存在於測試樣品中之EGFL7將與抗-EGFL7抗體結合，藉此使抗半抗原與結合物結合，從而導致結合物半抗原之特徵改變，例如當半抗原為螢光團時螢光性改變。
夾層檢定尤其可用於測定EGFL7或抗-EGFL7抗體。在連續夾層檢定中，使用固定之抗-EGFL7抗體吸附測試樣品EGFL7，如藉由洗滌移除測試樣品，使用已結合之EGFL7吸附第二、標記之抗-EGFL7抗體，且接著使結合之物質與殘餘示蹤物分離。結合之示蹤物之量與測試樣品EGFL7成比例。在「同時」夾層檢定中，在添加標記之抗-EGFL7之前不分離測試樣品。使用抗-EGFL7單株抗體作為一種抗體且使用多株抗-EGFL7抗體作為另一種抗體的連續夾層檢定可用於測試樣品中之EGFL7。
上述檢定僅為關於EGFL7之例示性偵測檢定。本發明之範疇內包括目前或以後所開發之使用抗-EGFL7抗體測定EGFL7的其他方法，包括本文所述之生物檢定。
在一態樣中，本發明提供偵測來自諸如人類個體之個體的生物樣品中之聚核苷酸(例如EGFL7聚核苷酸)(例如存在與否或量)的方法。各種偵測聚核苷酸之方法可被採用且包括例如RT-PCR、taqman技術、擴增方法、聚核苷酸微陣列及其類似方法。
用於偵測聚核苷酸(諸如mRNA)之方法為熟知的且包括例如使用互補DNA探針之雜交檢定(諸如使用經標記之EGFL7核糖探針原位雜交)、北方墨點(Northern blot)及相關技術，以及各種核酸擴增檢定(諸如使用對EGFL7具特異性之互補引子的RT-PCR，及其他擴增型偵測方法，諸如分支鏈DNA、SPIA、Ribo-SPIA、SISBA、TMA及其類似物)。
可適宜使用北方點墨法或PCR分析檢定來自哺乳動物之生物樣品中的例如EGFL7 mRNA。舉例而言，諸如定量PCR檢定之RT-PCR檢定在此項技術中為熟知的。在本發明之一個說明性實施例中，偵測生物樣品中之EGFL7 mRNA的方法包含藉由反轉錄使用至少一個引子由樣品產生cDNA；使用EGFL7聚核苷酸作為正義及反義引子擴增由此產生之cDNA，以擴增其中之EGFL7 cDNA；及偵測擴增之EGFL7 cDNA存在與否。另外，該等方法可包括一或多個允許(例如藉由同時檢測管家基因(諸如肌動蛋白家族成員)之比較對照mRNA序列之含量)測定生物樣品中EGFL7 mRNA之量(含量)的步驟。可視情況測定擴增之EGFL7 cDNA之序列。
探針及/或引子可經諸如放射性同位素、螢光化合物、生物發光化合物、化學發光化合物、金屬螯合劑或酶之可偵測標記物標記。該等探針及引子可用於偵測樣品中EGFL7聚核苷酸之存在，且可用作一種偵測表現EGFL7蛋白質之細胞的方式。如由熟練技工所瞭解，大量不同的引子及探針可(例如基於本文提供之序列)加以製備且可有效用於擴增、選殖及/或測定EGFL7 mRNA之存在與否及/或量。
視情況選用之本發明方法包括包含使用微陣列技術偵測組織或細胞樣品中之聚核苷酸(諸如EGFL7聚核苷酸)的方案。舉例而言，使用核酸微陣列，將來自測試及對照組織樣品之測試及對照mRNA樣品反轉錄且標記以產生cDNA探針。接著使探針與固定於固體支撐物上之核酸陣列雜交。該陣列經配置以便使陣列各成員之序列及位置為已知的。舉例而言，可將具有在某些疾病狀態中表現之潛力的一系列基因排列於固體支撐物上。標記之探針與特定陣列成員之雜交指示探針所源自之樣品表現彼基因。疾病組織之差異基因表現分析可提供有價值的資訊。微陣列技術利用核酸雜交技術及計算技術來估算單次實驗內數千基因之mRNA表現圖譜。(參見例如2001年10月11日公開之WO 01/75166；關於陣列製造之論述，參見例如U.S.5,700,637、美國專利5,445,934及美國專利5,807,522；Lockart,Nature Biotechnology,14:1675-1680(1996)；Cheung,V.G.等人，Nature Genetics 21(增刊):15-19(1999))。DNA微陣列為含有於玻璃或其他基質上直接合成或打點於玻璃或其他基質上之基因片段的微型陣列。單個陣列中通常呈現數千基因。一個典型微陣列實驗涉及以下步驟：1.由自樣品分離之RNA製備螢光標記之目標，2.使標記之目標與微陣列雜交，3.洗滌、染色及掃描該陣列，4.分析所掃描之影像，及5.產生基因表現圖譜。目前正使用兩個主要類型之DNA微陣列：寡核苷酸(通常25到70個基體)陣列及含有由cDNA製備之PCR產物的基因表現陣列。在形成陣列時，可預先製造寡核苷酸且將其打點至表面上，或在表面上(原位)直接合成。
Affymetrix GeneChip系統為一種市售微陣列系統，其包含藉由在玻璃表面上直接合成寡核苷酸而製造之陣列。探針/基因陣列：在玻璃晶圓上藉由組合基於半導體之光微影術與固相化學合成技術而直接合成寡核苷酸(通常25個基體)。各陣列含有最多400,000種不同寡聚物且各寡聚物係以數百萬個複本存在。因為寡核苷酸探針係於陣列上之已知位置合成，所以可藉由Affymetrix微陣列套裝軟體(Affymetrix Microarray Suite software)，就基因一致性及相對表現程度來解釋雜交模式及信號強度。各基因係藉由一系列不同的寡核苷酸探針呈現於陣列上。各探針對由完全匹配寡核苷酸及錯配寡核苷酸組成。完全匹配探針具有與特定基因完全互補之序列，且由此量測該基因之表現。錯配探針與完全匹配探針之不同之處在於在中心鹼基位置處存在單一鹼基取代，此會干擾目標基因轉錄物之結合。此有助於測定促成對完全匹配寡聚物所測出之信號的本底及非特異性雜交。微陣列套裝軟體自完全匹配探針之雜交強度減去錯配探針之雜交強度，以確定各探針組之絕對或比強度值。基於來自GenBank及其他核苷酸譜系之當前資訊選擇探針。咸信其序列可識別基因3'端之獨特區域。使用GeneChip雜交烘箱(「回轉式烤肉」烘箱)一次性雜交多達64個陣列。洗滌工作站(fluidics station)執行探針陣列之洗滌及染色。其為完全自動化的且含有四個模組，各模組保持一個探針陣列。經由微陣列套裝軟體，使用預先程式化之洗滌方案獨立地控制各模組。掃描器為共焦雷射螢光掃描器，其量測由結合至探針陣列之標記之cRNA發射的螢光強度。具有微陣列套裝軟體之電腦工作站控制洗滌工作站及掃描器。微陣列套裝軟體可對探針陣列使用預先程式化之雜交、洗滌及染色方案來控制多達8個洗滌工作站。該軟體亦獲得雜交強度資料且使用適當演算法將雜交強度資料轉化成各基因之存在/不存在的信號。最終，該軟體藉由比較分析來偵測實驗之間的基因表現變化，且將輸出格式化為.txt檔案，其可與其他軟體程式一起使用以供進一步資料分析。
在一些實施例中，治療係針對選自由以下組成之群的癌症進行：結腸直腸癌、肺癌、卵巢癌、垂體癌症、胰臟癌、乳腺纖維腺瘤、前列腺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、軟組織肉瘤、乳癌、神經母細胞瘤、黑素瘤、乳房癌、胃癌、結腸直腸癌(CRC)、上皮癌、腦癌、子宮內膜癌、睪丸癌、膽管癌、膽囊癌及肝細胞癌。
生物樣品在本文中有描述，例如在生物樣品之定義中。在一些實施例中，生物樣品為血清或腫瘤之血清。
製品
在本發明之另一態樣中，提供一種含有適用於治療、預防及/或診斷上述病症之物質的製品。該製品包含一容器及一在該容器上或伴隨該容器提供之標籤或包裝插頁。適合之容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可由諸如玻璃或塑膠之各種材料形成。容器容納單獨或與可有效治療、預防及/或診斷病狀之另一種組合物組合之組合物，且可具有無菌進入口(例如容器可為靜脈內溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿之塞子的小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為本發明之抗體。標籤或包裝插頁指示該組合物用於治療諸如癌症之所選病狀。此外，製品可包含(a)內部含有組合物之第一容器，其中該組合物包含本發明抗體；及(b)內部含有組合物之第二容器。本發明之實施例中的製品可進一步包含包裝插頁，該包裝插頁指示第一及第二抗體組合物可用於治療特定病狀，例如癌症。或者或另外，該製品可進一步包含一包含醫藥學上可接受之緩衝液(諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液)的第二(或第三)容器。其可進一步包括自商業及使用者觀點所需之其他物質，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
以下內容為本發明之方法及組合物之實例。應瞭解，在上文提供之一般說明下，可實踐各種其他實施例。
實例
除非另外指出，否則實例中所提及之市售試劑係根據製造商說明書來使用。
實例1：產生人類化mu4F11抗體
此實例展示針對EGFL7之鼠類抗體4F11(mu4F11)之人類化。殘基編號符合Kabat(Kabat等人，Sequences of proteins of immunological interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))。使用單字母胺基酸縮寫。
物質及方法
使全長人類EGFL7及含有EMI及2個EGF域(缺乏2個卷曲螺旋域)之截短形式之人類EGFL7(殘基1-182)在CHO細胞中表現且藉由習知方法純化(圖1 )。以合成方式製得含有EGFL7上之4F11抗原決定基之肽(稱為p2)(RPRYACCPGWKRT；SEQ ID NO:5)及EMI2(PARPRYACCP GWKRTSGLPGACGAAICQPP；SEQ ID NO:4)。
藉由用已在大腸桿菌中表現且再摺疊之重組全長人類EGFL7蛋白質免疫Egfl7 基因剔除小鼠來獲得表現鼠類抗體4F11之融合瘤。藉由ELISA使用經重組人類或鼠類EGFL7塗佈之板篩檢抗體。一組功能阻斷抗體根據其阻斷HUVEC黏附於經EGFL7塗佈之板的能力來鑑別。若干抗體經鑑別為種間功能阻斷抗體，包括命名為4F11之抗體(參見共同擁有之國際專利申請案WO 2007/106915，其申請於2007年3月16日且公開於2007年9月20日)。
選殖鼠類4F11可變域且產生嵌合4F11抗體- 使用標準方法自產生4F11之融合瘤細胞提取總RNA。使用RT-PCR以針對重鏈及輕鏈之簡併引子擴增可變輕鏈(VL)及可變重鏈(VH)域。前置引子對VL區及VH區之N端胺基酸序列具有特異性。分別而言，LC及HC反置引子經設計以黏接至在物種之間高度保守之恆定輕鏈域(CL)及恆定重鏈域1(CH1)中的區域。將擴增之VL及VH選殖至哺乳動物表現載體中，產生嵌合抗體ch4Fl1。使用常規定序方法測定插入物之聚核苷酸序列。
於受者人類共同構架上之直接高變區移植物- 用於此研究之噬菌粒為單價Fab-g3呈現載體且由2個受單個phoA啟動子控制之開放閱讀框架組成。第一開放閱讀框架由融合至受者輕鏈之VL及CH1域之stII信號序列組成，且第二開放閱讀框架由融合至受者重鏈之VH及CH1域、繼之以次要噬菌體鞘蛋白P3之stII信號序列組成。
為了製得CDR移植物，將來自mu4F11之高變區移植於huKI及huIII共同受者構架中，產生直接CDR移植物(4F11.v1)(圖2及圖3 )。在VL域中，將以下區域移植至人類共同受者中：位置24-34(L1；SEQ ID NO:31)、50-56(L2；SEQ ID NO:32)及89-97(L3；SEQ ID NO:33)。在VH域中，移植位置26-35(H1；SEQ NO:34)、49-65(H2；SEQ ID NO:35)及95-102(H3；SEQ ID NO:36)。MacCallum等人(MacCallum等人，J. Mol. Biol. 262: 732-745(1996))當人類化抗體時已分析了抗體及抗原複合晶體結構且發現重鏈之位置49為接觸區之一部分，因此在CDR-H2之定義中包括此位置似乎為合理的。
藉由Kunkel突變誘發，對各高變區使用各別寡核苷酸來產生4F11.v1，其呈呈現於噬菌體上之Fab以及IgG兩種形式。藉由DNA定序鑑別正確純系。
構架套接- 為鑑別對於結合很重要之構架位置，產生構架套接噬菌體文庫以在VL中之位置4處以及VH中之位置2、48、69、71、73、75、76、78及91處提供鼠類或人類胺基酸。如圖4 所示，藉由Kunkel突變誘發使用5個寡核苷酸來使用作模板之4F11.v1突變而使此等位置多樣化。
高變區之隨機化- 在高變區內之位置處使用Kunkel突變誘發引入序列多樣性。為產生單一位置文庫(SPL)，使用編碼NNS之寡核苷酸將各高變區內之各位置個別地隨機化為所有可能的20種胺基酸。此舉產生76個子文庫，各子文庫之多樣性為20，其組合成為涵蓋具有單一突變位於一個高變區內之變異體的混合「單一位置文庫」(SPL)。6個用於突變誘發之模板具有一個在CDRL1、L2、L3、H1、H2或H3中間之終止密碼子(TAA)，以避免重選野生型序列。當產生SPL時，用以引入多樣性之寡核苷酸亦修復相應模板中之終止密碼子。
對於有限文庫，同時併入4個寡核苷酸，其修復終止密碼子(TAA)且在CDR-L2之位置53及54、CDR-H1之位置29、CDR-H2之位置52及CDR-H3之位置98處引入NNS。
產生噬菌體文庫 - 在37℃下將已如上所述經設計而向構架位置或高變區中引入多樣性之寡核苷酸分別於含有660 ng寡核苷酸、50 mM Tris(pH 7.5)、10 mM MgCl2 、1 mM ATP、20 mM DTT及5 U聚核苷酸激酶之20 μl反應物中磷酸化，維持1小時。
為產生構架套接或有限文庫，向突變誘發反應中同時添加經引導而引入多樣性之所有已磷酸化的寡核苷酸。對於SPL，在96孔PCR板中執行76個個別Kunkel突變誘發反應。將2 μl來自磷酸化寡核苷酸反應(上述)之產物添加至於50 mM Tris(pH 7.5)、10 mM MgCl2 中含有相應終止密碼子之300 ng Kunkel模板中，最終體積為10 μl。在90℃下使混合物發生黏接持續2分鐘，並在50℃下持續5分鐘，且接著在冰上冷卻。接著在室溫下藉由添加0.5 μl 10 mM ATP、0.5 μl 10 mM dNTP(dATP、dCTP、dGTP及dTTP各10 mM)、1 μl 100 mM DTT、1 μl 10×TM緩衝液(0.5 M Tris(pH 7.5)、0.1 M MgCl2 )、80 U T4連接酶及4 U T7聚合酶(總體積為20 μl)來填充黏接之模板2小時。接著將此等經填充且連接之產物各轉型至XL1-Blue細胞中，在37℃下在0.5 ml含有5 μg/ml四環素及M13/KO7輔助噬菌體(MOI 10)之2YT中生長2小時，且接著混合並轉移至500 ml含有50 μg/ml卡本西林(carbenicillin)之2YT中且在37℃下生長16小時。
噬菌體選擇 - 將多種形式之抗原用於噬菌體選擇。在4℃下將全長或截短EGFL7(5 μg/ml)於MaxiSorpTM 微量滴定板(Nunc)上之50 mM碳酸氫鈉(pH 9.6)中固定隔夜。亦對EMI2及p2肽經由其游離半胱胺酸(使用順丁烯二醯亞胺PEO2 -生物素；Pierce)或經由其胺基端上之游離胺(使用NHS-LC-生物素，Pierce)作生物素標記。在生物素標記反應時，使用於PBS中2倍莫耳過量之生物素試劑。在4℃下用已於MaxiSorpTM 微量滴定板(Nunc)上之50 mM碳酸氫鈉(pH 9.6)中固定的NeutrAvidin(2 μg/ml)捕捉經生物素標記之EMI2及p2肽隔夜。使用BlockerTM Casein(Pierce)阻斷所有板至少1小時。
自培養上清液中收集噬菌體且懸浮於含有5%乳粉及0.05% TweenTM 20之PBS(PBSBT)中。在添加噬菌體文庫且培育1小時之後，用含有0.05% TweenTM 20之PBS(PBST)充分洗滌微量滴定孔，且藉由用20 mM HCl、500 mM KCl培育各孔30分鐘來溶離結合之噬菌體。用1 M Tris(pH 8)中和溶離之噬菌體且使用XL1-Blue細胞及M13/KO7輔助噬菌體進行擴增，且在37℃下於2YT、50 μg/ml卡本西林中生長隔夜。將自含有目標之孔溶離之噬菌體的效價與自不含目標之孔回收之噬菌體的效價相比以評估增濃程度。
藉由捕捉結合於溶液中遞減濃度的生物素標記之p2肽的噬菌體，隨後用NeutrAvidin捕捉10分鐘(締合速率選擇)且藉由增加洗滌時間及溫度以允許沖走弱結合噬菌體(解離速率選擇)來提高選擇嚴格性。
IgG產生- 出於篩檢之目的，最初於293細胞中產生IgG變異體。使用FuGENE系統將編碼VL及VH之載體(25 μg)轉染至293細胞中。使500 μl FuGENE與4.5 ml不含FBS之DMEM培養基混合，且在室溫下培育5分鐘。將各鏈(25 μg)添加至此混合物中且在室溫下培育20分鐘，且接著在37℃下於5% CO2 中轉移至5個T-150燒瓶中轉染隔夜。第二天，移除含有轉染混合物之培養基且用23 ml含有0.1 ml/L微量元素(A0934)及10 mg/L胰島素(A0940)之PS04培養基置換。將細胞再培育5天，此後在1000 rpm下收集培養基5分鐘，且使用0.22 μm低蛋白結合過濾器無菌過濾。可在添加2.5 ml 0.1% PMSF之後在4℃下儲存每125 ml培養基之樣品。
親和力測定- 藉由表面電漿子共振使用BIAcoreTM -2000執行親和力測定。將截短EGFL7或p2肽固定(約50-200 RU)於CM5感測器晶片上之10 mM乙酸鈉(pH 4.8)中。以30 μL/min之流動速率注射純化之IgG變異體(使用於PBST中0.5 nM至1000 nM之2倍連續稀釋液)。以3分鐘締合及3.5分鐘解離分析各樣品。在每次注射之後，使用10 mM甘胺酸(pH 1.7)再生晶片。
藉由自IgG變異體流槽之反應減去對照流槽之反應來校正結合反應。使用同時擬合kon 與koff 之1:1朗繆爾模型(Languir model)進行動力學分析。
細胞黏著檢定- 在4℃下將小鼠EGFL7(mEGFL7-CB-His)或人類EGFL7(EGFL7-CB-His)以於碳酸鈉緩衝液O/N中5 μg/ml之濃度塗佈於微量滴定板上，接著用含1% BSA之PBS阻斷。添加抗-EGFL7抗體(0.01 μg/ml至100 μg/ml)，隨後添加20,000個/孔處於適當細胞生長培養基(EGM Lonza)中之人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)。將對照細胞接種於無抗體之孔中，以計為100%之接種細胞。以一式三份測試各抗體濃度。在140 g下將板短暫離心5分鐘，使細胞與受質之接觸同步，且接著在CO2 恆溫箱中培育30分鐘且用PBS洗滌3次。使用CyQUANT緩衝液(Molecular Probes)計數黏著於板之細胞且計算為佔所塗細胞總數之百分比。針對各抗體之濃度對與板結合之細胞之百分比作圖。
結果及討論
人類化4F11- 用於人類化mu4F11之人類受者構架係基於共同人類κ I VL域及共同人類亞群III VH域。鑑別mu4F11之各互補決定區(CDR)且移植於人類受者構架中，產生可呈現為噬菌體上之Fab之CDR移植物(4F11.v1)(圖2及圖3 )。
噬菌體選擇之抗原評估- 使用競爭性西方墨點分析使EGFL7上之4F11抗原決定基定位於第二EMI域，且更特定言之定位於肽p2(圖1及圖5 )。呈現4F11.v1之噬菌體結合至固定之全長及截短EGFL7，但亦使用對照噬菌體觀測到明顯的非特異性噬菌體結合(圖6 )。為此，將阻斷4F11結合至截短EGFL7之p2及EMI2肽用於噬菌體選擇。對該等肽經由其游離半胱胺酸作生物素標記產生p2S及EMI2c(使用順丁烯二醯亞胺PEO2 -生物素；Pierce)或經由其胺基端上之游離胺作生物素標記產生p2N及EMI2.n(使用NHS-LC-生物素，Pierce)。為評估結合，在塗佈有NeutrAvidin之微量滴定孔中捕捉生物素標記之肽。使用呈現4F11.v1之噬菌體來評估與所捕捉之經生物素標記之EMI2及p2肽的結合。4F11.v1噬菌體最佳與p2S結合(圖7 )。當使用濃度為50 nM之經生物素標記之肽與塗佈有NeutrAvidin之孔結合時，所捕捉之噬菌體之量最大。
篩檢構架位置- 淘選構架套接文庫，針對固定之經生物素標記的p2S肽作4輪選擇。對來自最後一輪之96個純系作DNA序列分析，在各套接位置處，基於豐度評價胺基酸重要性(圖8 )。在4輪選擇之前及之後的胺基酸豐度表明用Thr(L78T)或Val(L78V)置換L78有可能改良結合。
篩檢CDR位置 -為鑑別進一步的改良，使用以下3個構架產生單一位置文庫：初始CDR移植物(4F11.v1)、具有L78T之4F11.v1(4F11.v2)及具有L78V之4F11.v1(4F11.v3)。對於各SPL，將各CDR內之各位置個別地隨機化為所有可能的胺基酸(對於各構架，總計76個文庫，各含有20個成員，混合成為一個SPL)。使用6個4F11.v1 DNA模板(在適當CDR中含有終止密碼子)來產生3個SPL。在SPL產生期間，藉由使用編碼適當構架變化(L78V或L78V)之誘變寡核苷酸在VH之位置78處引入構架變化。因此，使構架及個別CDR位置同時突變。如表1 所示，針對使用固定之NeutrAvidin捕捉的可溶性p2S肽淘選SPL。
藉由降低p2S肽之濃度、減少結合所需之時間及增加洗滌時間及溫度來逐漸提高選擇嚴格性。對基於4F11.v2及4F11.v3之SPL觀測到最後3輪的選擇期間之噬菌體回收率最高。
獲取來自最後一輪之純系用於DNA序列分析。鑑別各CDR中之個別序列變化(圖9 )。豐度最大之SPL純系在VL內具有變化，即CDR-L2內之位置N53Y。將頻繁出現且在一個以上SPL中出現之變化併入4F11.v3中。使此等變異體(.v4至.v12)、4F11-移植物(.v1)及VH構架之變化(4F11.v2及4F11.v3)表現為IgG，加以純化且藉由Biacore及使用細胞黏著檢定來測試與固定之p2S的結合(表2 )。觀測到與mu4F11相比對4F11.v6及4F11.v10之細胞黏著的抑制較弱，此表明需要進一步改良親和力。
再評估構架位置 -分組併入其他構架變化。使變異體表現為IgG(變異體13至16)且藉由BiacoreTM 測試，結果如表3中所示。
其中，相對於mu4F11，4F11.v14具有最佳親和力。
有限文庫 -基於作為模板之4F11.v13產生兩個有限文庫。文庫1含有與4F11.V13相同之構架變化(LC:M4L及HC:R71L、L78A)，而文庫2含有重鏈中之2個額外變化:N76S及Y91F(圖10及圖11 )。亦將L1及L3之CDR變化(D28S及D94E)併入兩個文庫中。多樣化限於先前已在選擇SPL之後觀測到變化的位置(圖10及圖11)。使此等位置(輕鏈中之53及54以及重鏈中之29、52、98)多樣化為包括所有20種胺基酸且如表4 所示，針對使用固定之NeutrAvidin捕捉的固定之p2S肽進行淘選。
將各文庫在隨機化位置處之不同胺基酸殘基的較佳值繪於圖12 中。在輕鏈中，兩個文庫較佳選擇53Y及54R，而在重鏈中，較佳為29F及52T。在重鏈之CDR-H3中，在兩個文庫之位置98(98Y、98H及98R)處選擇3個胺基酸。為鑑別此等變化之最佳組合，構築變異體17至26(表5)，使其表現為IgG且加以表徵。若干變異體之親和力與ch4F11相比同樣優良或更佳。在細胞遷移檢定中使用人類或小鼠EGFL7進一步表徵變異體(表5及圖13及圖14 )。
相較於mu4F11及4F11.v1來自hu4F11.v17及4F11.v22之VL及VH域分別展示於圖15及圖1 6中。
實例2：產生人類化mu18F7抗體
此實例展示針對EGFL7之鼠類抗體18F7(mu18F7)之人類化。殘基編號符合Kabat(Kabat等人，Sequences of proteinsof immunological interest,第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。使用單字母胺基酸縮寫。
物質及方法
使全長人類EGFL7及含有EMI及2個EGF域(缺乏2個卷曲螺旋域)之截短形式之人類EGFL7(殘基1-182)在CHO細胞中表現且藉由習知方法純化(圖1) 。以合成方式製得含有EGFL7上之18F7抗原決定基之肽(稱為p5)(RACSTYRTIYRTA；SEQ ID NO:7)及EMI1(LTTCDGHR ACSTYRTIYRTAYRRSPG；SEQ ID NO:3)。
藉由用已在大腸桿菌中表現且再摺疊之重組全長人類EGFL7蛋白質免疫Egfl7 基因剔除小鼠來獲得表現鼠類抗體18F7之融合瘤。藉由ELISA使用經重組人類或鼠類EGFL7塗佈之板篩檢抗體。一組功能阻斷抗體根據其阻斷HUVEC黏附於經EGFL7塗佈之板的能力來鑑別。若干抗體經鑑別為種間功能阻斷抗體，包括命名為18F7之抗體(參見共同擁有之國際專利申請案WO 2007/106915，其申請於2007年3月16日且公開於2007年9月20日)。
選殖鼠類18F7可變域且產生嵌合18F7抗體- 使用標準方法自產生18F7之融合瘤細胞提取總RNA。使用RT-PCR以針對重鏈及輕鏈之簡併引子擴增可變輕鏈(VL)及可變重鏈(VH)域。前置引子對VL區及VH區之N端胺基酸序列具有特異性。分別而言，LC及HC反置引子經設計以黏接至在物種之間高度保守之恆定輕鏈域(CL)及恆定重鏈域1(CH1)中的區域。將擴增之VL及VH選殖至哺乳動物表現載體中，產生嵌合抗體ch18F7。使用常規定序方法測定插入物之聚核苷酸序列。
於 受者人類共同構架上之直接高變區移植物 -用於此研究之噬菌粒為單價Fab-g3呈現載體且由2個受單個phoA啟動子控制之開放閱讀框架組成。第一開放閱讀框架由融合至受者輕鏈之VL及CH1域之stII信號序列組成，且第二開放閱讀框架由融合至受者重鏈之VH及CH1域、繼之以次要噬菌體鞘蛋白P3之stII信號序列組成。
為了製得CDR移植物，將來自mu18F7之高變區移植於huKI及huIII共同受者構架中，產生直接CDR移植物(18F7-移植物)(圖17及圖18 )。在VL域中，將以下區域移植至人類共同受者中：位置24-34(L1；SEQ ID NO:100)、50-56(L2；SEQ ID NO:101)及89-97(L3；SEQ ID NO:102)。在VH域中，移植位置26-35(H1；SEQ NO:103)、49-65(H2；SEQ ID NO:104)及95-102(H3；SEQ ID NO:105)。MacCallum等人(MacCallum等人，J .Mol .Biol . 262: 732-745(1996))當人類化抗體時分析了抗體及抗原複合晶體結構且發現重鏈之位置49為接觸區之一部分，因此在CDR-H2之定義中包括此位置似乎為合理的。
藉由Kunkel突變誘發，對各高變區使用各別寡核苷酸來產生18F7移植物，其呈呈現於噬菌體上之Fab以及IgG兩種形式。藉由DNA定序鑑別正確純系。
構架套接 -為鑑別對於結合很重要之構架位置，產生構架套接噬菌體文庫以在VL中之位置87處以及VH中之位置48、67、69、71、73、75、76、78及80處提供鼠類或人類胺基酸。如圖19所示，藉由Kunkel突變誘發，使用3個寡核苷酸來使用作模板之18F7移植物突變而使此等位置多樣化。
高變區之隨機化- 在18F7移植物之高變區內之各位置處使用Kunkel突變誘發分別引入全序列多樣性，產生合併於一起之單一位置文庫。在各別位置處使用編碼NNS之寡核苷酸將18F7移植物之各高變區內之各位置完全隨機化為所有可能的20種胺基酸。製得多個文庫，各文庫由20個具有位於一個完全隨機化之高變區內之單一位置的成員組成。為覆蓋高變區內之各位置，產生此類型之76個文庫且組合成為涵蓋位於各高變位置各處之單一突變的混合「單一位置文庫」(SPL)。在各CDR的中間引入終止密碼子(TAA)，以避免重選野生型CDR移植序列。此舉藉由Kunkel突變誘發來實現且產生6個用於18F7移植物之不同模板，各具有已引入不同CDR中之終止密碼子。當產生文庫時，用以引入多樣性之寡核苷酸亦修復相應模板中之終止密碼子。
產生噬菌體文庫- 在37℃下將已如上所述經設計而向構架位置或各高變區中引入多樣性之寡核苷酸分別於含有660 ng寡核苷酸、50 mM Tris(pH 7.5)、10 mM MgCl2 、1 mM ATP、20 mM DTT及5 U聚核苷酸激酶之20 μl反應物中磷酸化，維持1小時。
為產生構架套接文庫，向突變誘發反應中同時添加經引導而引入多樣性之所有3種已磷酸化的寡核苷酸。對於SPL，在96孔PCR板中執行76個個別Kunkel突變誘發反應。將2 μl來自磷酸化寡核苷酸反應(上述)之產物添加至於50 mM Tris(pH 7.5)、10 mM MgCl2 中之含有相應終止密碼子之300 ng Kunkel模板中，最終體積為10 μl。在90℃下使混合物發生黏接持續2分鐘，並在50℃下持續5分鐘，且接著在冰上冷卻。接著在室溫下藉由添加0.5 μl 10 mM ATP、0.5 μl 10 mM dNTP(dATP、dCTP、dGTP及dTTP各10 mM)、1 μl 100 mM DTT、1 μl 10×TM緩衝液(0.5 M Tris(pH 7.5)、0.1 M MgCl2)、80 U T4連接酶及4 U T7聚合酶(總體積為20 μl)來填充黏接之模板2小時。接著將此等經填充且連接之產物各轉型至XL1-Blue細胞中，在37℃下在0.5 ml含有5 μg/ml四環素及M13/KO7輔助噬菌體(MOI 10)之2YT中生長2小時，且接著混合並轉移至500 ml含有50 μg/ml卡本西林之2YT中且在37℃下生長16小時。
噬菌體選擇 -將多種形式之抗原用於噬菌體選擇。在4℃下將全長或截短EGFL7(5 μg/ml)於MaxiSorpTM 微量滴定板(Nunc)上之50 mM碳酸氫鈉(pH 9.6)中固定隔夜。亦對EMI1及p5肽經由其游離半胱胺酸(使用順丁烯二醯亞胺PEO2 -生物素；Pierce)或經由其胺基端上之游離胺(使用NHS-LC-生物素，Pierce)作生物素標記。在生物素標記反應中，使用於PBS中2倍莫耳過量之生物素試劑。在4℃下用已於MaxiSorpTM 微量滴定板(Nunc)上之50 mM碳酸氫鈉(pH 9.6)中固定的NeutrAvidin(2 μg/ml)捕捉經生物素標記之EMI1及p5肽隔夜。使用BlockerTM Casein(Pierce)阻斷所有板至少1小時。
自培養上清液中收集噬菌體且將其懸浮於含有5%乳粉及0.05% TweenTM 20之PBS(PBSBT)中。在添加噬菌體文庫且培育1小時之後，用含有0.05% TweenTM 20之PBS(PBST)充分洗滌微量滴定孔，且藉由在20 mM HCl、500 mM KCl下培育各孔30分鐘來溶離結合之噬菌體。用1 M Tris(pH 8)中和溶離之噬菌體且使用XL1-Blue細胞及M13/KO7輔助噬菌體進行擴增，且在37℃下於2YT、50 μg/ml卡本西林中生長隔夜。將自含有目標之孔溶離之噬菌體的效價與自不含目標之孔回收之噬菌體的效價相比以評估增濃程度。
藉由捕捉結合於溶液中遞減濃度的經生物素標記之p5肽的噬菌體，隨後用NeutrAvidin捕捉10分鐘(締合速率選擇)且藉由增加洗滌時間及溫度以允許沖走弱結合噬菌體(解離速率選擇)來提高選擇嚴格性。
IgG產生- 出於篩檢之目的，最初於293細胞中產生IgG變異體。使用FuGENE系統將編碼VL及VH之載體(25 μg)轉染至293細胞中。使500 μl FuGENE與4.5 ml不含FBS之DMEM培養基混合，且在室溫下培育5分鐘。將各鏈(25 μg)添加至此混合物中且在室溫下培育20分鐘，且接著在37℃下於5% CO2 中轉移至5個T-150燒瓶中轉染隔夜。第二天，移除含有轉染混合物之培養基且用23 ml含有0.1 ml/L微量元素(A0934)及10 mg/L胰島素(A0940)之PS04培養基置換。將細胞再培育5天，此後在1000 rpm下收集培養基5分鐘，且使用0.22 μm低蛋白結合過濾器無菌過濾。可在每125 ml培養基中添加2.5 ml 0.1% PMSF之後在4℃下儲存樣品。
親和力測定 - 藉由表面電漿子共振使用BIAcoreTM -2000執行親和力測定。將截短EGFL7或p5肽固定(約50-200 RU)於CM5感測器晶片上之10 mM乙酸鈉(pH 4.8)中。以30 μL/min之流動速率注射純化之IgG變異體(使用於PBST中0.5 nM至1000 nM之2倍連續稀釋液)。以3分鐘締合及3.5分鐘解離分析各樣品。在每次注射之後，使用10 mM甘胺酸(pH 1.7)再生晶片。
藉由自IgG變異體流槽之反應減去對照流槽之反應來校正結合反應。使用同時擬合kon 與koff 之1:1朗繆爾模型進行動力學分析。
結果及討論
人類化18F7 - 用於人類化mu18F7之人類受者構架係基於共同人類κIVL域及共同人類亞群III VH域。鑑別mu18F7之各CDR且將其移植於人類受者構架中，產生可呈現為噬菌體上之Fab之CDR移植物(圖17及圖18 )。
噬菌體選擇之抗原評估 - 使用競爭性西方墨點分析使EGFL7上之18F7抗原決定基定位於第一EMI域，且更特定言之定位於肽p5(圖1及圖20 )。呈現18F7移植物之噬菌體結合至固定之全長及截短EGFL7，但亦使用對照噬菌體觀測到明顯的非特異性噬菌體結合(圖21 )。為此，將阻斷18F7結合至截短EGFL7之p5及EMI1肽用於噬菌體選擇。對該等肽經由其游離半胱胺酸作生物素標記以產生p5c及EMI1c(使用順丁烯二醯亞胺PEO2 -生物素；Pierce)或經由其胺基端上之游離胺作生物素標記以產生p5n及EMI1n(使用NHS-LC-生物素，Pierce)。為評估結合，在塗佈有NeutrAvidin之微量滴定孔中捕捉生物素標記之肽。在對固定之截短EGFL7作2輪選擇之後，使用構架套接文庫噬菌體池評估與所捕捉之經生物素標記之EMI1及p5肽的結合。噬菌體池結合至p5n及EMI1n，但不結合至p5c或EMI1c(圖22 )。當使用濃度為50 nM之經生物素標記之肽與塗佈有NeutrAvidin之孔結合時，所捕捉之噬菌體之量最大。
在對固定之截短EGFL7作2輪選擇之後，進一步淘選構架套接文庫，針對固定之經生物素標記的p5n肽作2輪選擇。對來自最後一輪之96個純系作DNA序列分析，以便在各套接位置處，基於豐度評價胺基酸重要性(圖23 )。在4輪選擇之前及之後的胺基酸豐度表明N73K及L78A之變化可改良結合。儘管較不顯著，但L78V及V48I亦如此且進一步研究L78V。
使用源自構架套接文庫結果之4個構架探測SPL以圖鑑別進一步的改良。4個構架包括初始CDR移植物(18F7移植物)、具有N73K之18F7移植物(18F7.v2)、具有N73K及L78A之18F7移植物(18F7.v3)以及具有N73K及L78V之18F7移植物(18F7.v4)。對於各構架，產生SPL，其中使各CDR內之各位置個別地隨機化為所有可能的胺基酸(總計76個文庫，各含有20個成員，混合成為一個SPL)。使用6個18F7移植物DNA模板(在適當CDR中含有終止密碼子)來產生所有4個SPL。在SPL產生期間，藉由使用編碼適當構架變化之誘變寡核苷酸在VH之位置73及78處引入構架變化。因此，使構架及個別CDR位置同時突變。如表6所示，對4個SPL針對固定之截短EGFL7作2輪淘選，隨後針對使用固定之NeutrAvidin捕捉之可溶性生物素標記p5n肽作3輪選擇。
藉由降低經生物素標記之p5n肽的濃度、減少結合所需之時間及增加洗滌時間及溫度來逐漸提高選擇嚴格性。對基於18F7.v3及18F7.v4之SPL觀測到最後3輪的選擇期間之噬菌體回收率最高。
獲取來自最後一輪之純系用於DNA序列分析。鑑別各CDR中之個別序列變化(圖24 )。豐度最大之SP文庫純系在VL內之位置S89處具有變化。將頻繁出現且在一個以上SP文庫中出現之變化併入18F7.v3中。使此等變異體(.v5至.v10)、18F7移植物(.v1)及VH構架之變化(.v2、.v3及.v4)表現為IgG以藉由BiacoreTM 進一步分析(表7及表8 )。
對此等10種變異體之BiacoreTM 分析指示其均極佳地結合至固定之mEGFL7或p5肽。18F7.v6之解離速率(kd)最慢，且在HUVEC黏著檢定中為有效的(圖25)。
精製18F7.v6- 18F7.v6中CDR-L1(N28、G29)及CDR-H2(N54、G55)內之可能的異天冬胺酸形成位點(Asn-Gly)藉由測試此等位置處之替代性胺基酸來去除(表9 )。
H2(.v6B及.v6D)中之SG序列表現不佳，而L1(.v6A)中之此序列會增加解離速率。相反，H2(.v6C)中之NS序列對動力學之影響很小(表8及表9 )。在L1連同H2:NS(.v6C)中抽取之其他變化中，NS(.v6J)及NA(.v6K)之變化對解離速率之影響極小(表8及表9、圖25 )。與鼠類18F7相比，可使用此等變化來改良18F7.v6之穩定性，同時仍維持所需生物特性(圖25及圖26 )。來自hu18F7.v6K之VL及VH域分別展示於圖27及圖28中。
實例3：用人類化抗-EGFL7抗體處理帶有腫瘤之小鼠或新生小鼠
研究本發明之人類化抗-EGFL7抗體(單獨及與抗-VEGF療法組合)在各種模型中抑制血管生成及/或腫瘤生長之能力。觀測到抗-EGFL7抗體可增強抗-VEGF療法之功效。
向HRLN雌性nu/nu小鼠皮下注射1×107 個H1299人類非小細胞肺癌腫瘤細胞且允許長成達80 mm3 至120 mm3 之腫瘤。接著將具有腫瘤之小鼠隨機分成4個組(各組12隻小鼠)，以便使各組之平均腫瘤尺寸為122 mm3 。接著如下處理此等小鼠：第1組：以10 mg/kg腹膜內(ip)注射抗-VEGF抗體(B20-4.1；WO 2005/012359及WO 2005/044853)每週一次；第2組：以10 mg/kg腹膜內注射陰性對照抗體抗-豚草IgG每週一次，及以10 mg/kg腹膜內注射抗-EGFL7抗體(hu18F7.v6K)每週兩次；第3組：以10 mg/kg腹膜內注射B20-4.1每週一次，及以10 mg/kg腹膜內注射hu18F7.v6K每週兩次；第4組：未處理。用測徑規量測腫瘤每週兩次，且根據(w 2 ×l )/2(w =腫瘤寬度(mm)，l =腫瘤長度(mm))計算腫瘤體積。當小鼠之腫瘤達到1000 mm3 (定義為「小鼠達到終點」)時使小鼠安樂死。將組平均腫瘤體積+/-SEM對時間作圖，直至50%的小鼠達到終點為止。來自此實驗之資料顯示相較於未處理之對照組，僅用B20.4-1抑或hu18F7.v6K處理均未顯著降低腫瘤生長，但用hu18F7.v6K處理展現生長降低之趨勢(圖29)。相反，用B20.4-1與hu18F7.v6K兩者處理顯著抑制腫瘤生長(圖29)。
向Ba1b-c裸小鼠右側腹皮下注射含有5×106 個HM7癌瘤細胞之0.1 ml MatrigelTM 。當平均腫瘤尺寸達到80-150 mm3 時，將動物分成4組，各組10隻小鼠，以便使所有組之平均腫瘤尺寸大致相等且作如下處理：第1組：以5 mg/kg腹膜內(ip)注射抗-豚草IgG每週兩次；第2組：以5 mg/kg腹膜內注射B20-4.1.1(PCT/US2008/013248)每週兩次；第3組：以10 mg/kg腹膜內注射抗-EGFL7抗體(hu18F7.v6k)每週兩次；第4組：以5 mg/kg腹膜內注射B20-4.1.1每週兩次及以10 mg/kg腹膜內注射hu18F7.v6k每週兩次。用測徑規量測腫瘤每週兩次，且記錄寬度及長度。當腫瘤大於1000 mm3 時或當腫瘤生長或潰爛干擾動物健康狀態時使小鼠安樂死。觀測到第1組及第3組之腫瘤具有類似的生長速率，而第2組之腫瘤與第1組之腫瘤相比生長較緩慢，且第4組之腫瘤展現負生長。
向Balb-c裸小鼠右側腹皮下注射原發性人類大細胞肺癌腫瘤外植體(LXFL 1674)。實驗包含投與人類IgG(hIgG)及鼠類IgG(mIgG)對照抗體之參考組(第1組)、接受hu18F7.v6k及mIgG之第2組、接受B20-4.1.1及hIgG之第3組以及接受hu18F7.v6K及B20-4.1.1之第4組。如下經腹膜內給予所有處理(每週兩次)：在以每劑量5 mg/kg投與B20(或mIgG)之前4小時，給予每劑量10 mg/kg之hu18F7.v6k(或hIgG)。當腫瘤體積超過2000 mm3 時，個別地將小鼠殺死。只要50%以上之第1組對照小鼠活著(第14天)，即評價各組之功效。給藥開始時組規模為10隻小鼠，各小鼠具有一個直徑為5 mm至10 mm之腫瘤。組合療法優於B20-4.1.1單一療法之優勢在統計學上為顯著的(圖30)。
在鼠類新生器官血管生成檢定中亦測試人類化抗-EGFL7抗體hu18F7.v6k及其親本抗體鼠類18F7。在出生之後第1天及第3天給新生小鼠注射抗體，且在第5天獲取器官。用血管內皮細胞標記物CD31染色多個器官中之血管結構，且定量血管密度。各組為：第1組，接受15 mg/ml抗豚草抗體(每次實驗n=3)；第2組，接受5 mg/ml抗-VEGF抗體(G6.31；WO 2005/012359及WO 2005/044853；每次實驗n=3)及10 mg/ml豚草抗體；第3組，接受5 mg/ml G6.31及10 mg/ml鼠類18F7(每次實驗n=4)；及第4組，接受5 mg/ml G6.31及10 mg/ml hu18F7.v6k(每次實驗n=4)。來自3次獨立實驗之混合結果展示於圖31中，其表明抗-VEGF抗體G6.31具有顯著的抗血管生成活性，且G6.31與hu18F7.v6k或鼠類18F7之組合顯著增強G6.31之活性。在腸絨毛血管結構中觀測到類似的抗血管生成活性。此等結果證實在此模型中hu18F7.v6k及鼠類18F7具有類似的抗血管生成活性。
實例4：抗-EGFL7抗體對人類個體中之腫瘤灌注及通透性的抑制
對已投與兩週期之3 mg/kg或15 mg/kg hu18F7.v6k以探測回應於抗體之腫瘤血管結構變化的人類個體進行動態對比-磁共振成像(DCE-MRI)評估。DCE-MRI為允許對腫瘤微循環作功能分析之成像模態。諸如Ve (血管外及細胞外洩漏體積分數)及Ktrans (體積轉移常數)之血管參數的變化反映腫瘤灌注及通透性之變化。在第1個週期中給藥之前相隔約5-7天(但至少相隔24小時)獲得兩個基線預處理掃描(例如相對於抗體投與的第-1天及第-7天)。在第1個週期之第15天及第2個週期之第8天(±2天以考慮安排上的困難)獲得處理後掃描。可評估的轉移性病變必須在肝臟中量測到3 cm，或在其他處有至少一個尺寸2 cm。除DCE-MRI獲取序列之外，在對各個體相同的影像獲取訪問過程中獲取其他MRI獲取序列，諸如擴散加權成像及T1及T2加權成像。如表10所示，觀測到對一些實體腫瘤用抗-EGFL7抗體處理使Ktrans 降低多達約40%。
圖1展示來自小鼠(SEQ ID NO:1)及人類(SEQ ID ON:2)之EGFL7之胺基酸序列。圖上示出EMI1、EM12、EGF及卷曲螺旋域之位置。截短EGFL7缺乏卷曲螺旋域。對肽EML1(SEQ ID NO:3)、EMI2(SEQ ID NO:4)及p2(SEQ ID NO:5)、P4(SEQ ID NO:6)、p5(SEQ ID NO:7)及p6(SEQ ID NO:8)之序列加下劃線；
圖2展示人類κ I共同序列(SEQ ID NO:9)及4F11.v1(SEQ ID NO:10)之可變輕鏈域的胺基酸序列。根據Kabat對位置編號，且對高變區加框；
圖3展示人類亞群III共同序列(SEQ ID NO:11)及4F11.v1(SEQ ID NO:12)之可變重鏈域的胺基酸序列。根據Kabat對位置編號，且對高變區加框；
圖4展示構架套接文庫中用以套接位置之寡核苷酸。圖上顯示4F11.v1之DNA序列及用以產生構架套接之寡核苷酸。亦顯示原始及一些所得構架套接區之胺基酸序列。在一些情況下，基於設計簡併密碼子之方式，亦併入其他胺基酸殘基。相應序列右側之括號中顯示序列識別符(SEQ ID NO:13-28)；
圖5展示表明mu4F11與EGFL7之結合可由肽2(SEQ ID NO:5)，而非由重疊肽1或3(分別為SEQ ID NO:29及30)或隨機對照肽阻斷之結果；
圖6展示呈現4F11.v1 Fab之噬菌體與固定於微量滴定板上之截短EGFL7的結合。4F11.v1噬菌體之兩個樣品顯示與固定EGFL7之結合增加與噬菌體濃度增加呈函數關係。對照噬菌體顯示在低噬菌體濃度下本底結合程度類似於4F11.v1噬菌體，表明一些非特異性的噬菌體-EGFL7相互作用；
圖7展示呈現4F11.v1 Fab之噬菌體與經由游離胺基或游離硫醇生物素標記之EMI2域或p2肽的結合；
圖8展示在構架套接期間各構架位置處發現之殘基之豐度。列出在構架套接期間各構架位置處引入之胺基酸；
圖9展示關於3個構架中之各者在6個「單一位置文庫」(SPL)中之每一者中所觀測到的CDR序列變化。文庫由所用之構架(4F11.v1、4F11.v2及4F11.v3)隔開。突顯出自各SPL相對於特定CDR序列獲得之變化。除此等變化外之VL及VH序列與相應構架一致且現已示出。相應序列右側之括號中顯示序列識別符(SEQ ID NO:31-77)。出現一次以上之個別序列可能不會始終具有相應序列識別符；
圖10展示有限文庫1及2之可變輕鏈域之構架及文庫設計。與用於文庫1(SEQ ID NO:78)及文庫2(SEQ ID NO:79)之模板相比，顯示人類κI共同序列(SEQ ID NO:9)及4F11.v1(SEQ ID NO:10)之胺基酸序列。用穿過胺基酸之斜線顯示已隨機化為所有20種胺基酸之位置；
圖11展示有限文庫1及2之可變重鏈域之構架及文庫設計。與用於文庫1(SEQ ID NO:80)及文庫2(SEQ ID NO:81)之模板相比，顯示人類亞群III共同序列(SEQ ID NO:11)及4F11.v1(SEQ ID NO:12)之胺基酸序列。用穿過胺基酸之斜線顯示已隨機化為所有20種胺基酸之位置；
圖12展示在有限文庫1及2中之隨機化位置處觀測到的變化頻率。圖上顯示在輕鏈之位置53及54以及重鏈之位置29、52及98處所選的胺基酸之較佳值。以指定殘基在呈現胺基酸之二項分佈之文庫中的隨機偶然出現率以上之標準差數目報導任何胺基酸之較佳值(Sigma)。當建立共同序列時，利用此方法之評分可說明預期密碼子偏倚性及抽樣統計概況；
圖13及圖14展示人類化4F11變異體活體外對HUVEC黏著於固定人類或小鼠EGFL7之抑制。在遞增濃度之抗體存在下，使HUVEC(20,000個細胞/孔)黏著至塗佈有5 μg/ml人類或鼠類EGFL7之96孔板。對在洗滌之後仍黏著於板之細胞的數目計數且計算為佔塗覆至各孔之總細胞之百分比；
圖15展示人類κI共同序列(SEQ ID NO:9)、4F11.v1(SEQ ID NO:10)、4F11.v17(SEQ ID NO:82)及4F11.v22(SEQ ID NO:83)之可變輕鏈域之胺基酸序列。根據Kabat對位置編號，且對高變區加框；
圖16展示人類亞群III共同序列(SEQ ID NO:11)、4F11.v1(SEQ ID NO:12)、4F11.v17(SEQ ID NO:84)及4F11.v22(SEQ ID NO:85)之可變重鏈域之胺基酸序列。根據Kabat對位置編號，且對高變區加框；
圖17展示人類κI共同序列(SEQ ID NO:9)及18F7移植物(SEQ ID NO:86)之可變輕鏈域之胺基酸序列。根據Kabat對位置編號，且對高變區加框；
圖18展示人類亞群III共同序列(SEQ ID NO:11)及18F7移植物(SEQ ID NO:87)之可變重鏈域之胺基酸序列。根據Kabat對位置編號，且對高變區加框；
圖19展示構架套接文庫中用以套接位置之寡核苷酸。圖上顯示18F7移植物之DNA序列及用以產生構架套接之寡核苷酸。亦顯示原始及一些所得構架套接區之胺基酸序列。在一些情況下，基於設計簡併密碼子之方式，亦併入其他胺基酸殘基。相應序列右側之括號中顯示序列識別符(SEQ ID NO:88-99)；
圖20展示表明mu18F7與EGFL7之結合可由EMI1(SEQ ID NO:3)或肽P5(SEQ ID NO:7)，而非由肽P4或P6(分別為SEQ ID NO:6及8)阻斷之結果。用含有HA標記之全長人類EGFL7 cDNA之質體轉染雞胚胎纖維母細胞。在200倍過量之競爭性肽存在下，用mu18F7使由經轉染細胞制取之細胞溶胞物免疫沈澱。藉由西方墨點法使用抗HA抗體分析免疫沈澱物；
圖21展示呈現18F7移植物Fab之噬菌體與固定於微量滴定板上之截短huEGFL7的結合。18F7移植物噬菌體之兩個樣品顯示與固定EGFL7之結合增加與噬菌體濃度增加呈函數關係。對照噬菌體顯示在低噬菌體濃度下本底結合程度類似於18F7移植物噬菌體，表明一些非特異性的噬菌體-EGFL7相互作用；
圖22展示呈現18F7移植物Fab之噬菌體與經由游離胺基或游離硫醇生物素標記之EMI1域或p5肽的結合；圖23展示在構架套接期間各構架位置處發現之殘基之豐度。列出在構架套接期間各構架位置處引入之胺基酸；圖24展示關於3個構架中之各者在6個SPL中之每一者中所觀測到的CDR序列變化。文庫由所用之構架(18F7移植物、18F7-K、18F7-KV及18F7-KA)隔開。突顯出自各SPL相對於特定CDR序列獲得之變化。除此等變化外之VL及VH序列與相應構架一致且現已示出。相應序列右側之括號中顯示序列識別符(SEQ ID NO:100-192)。出現一次以上之個別序列可能不會始終具有相應序列識別符；
圖25展示人類化18F7變異體活體外對HUVEC黏著於固定人類或小鼠EGFL7之抑制。在遞增濃度之抗體存在下，使HUVEC(20,000個細胞/孔)黏著於塗佈有5 μg/ml人類或鼠類EGFL7之96孔板。對在洗滌之後仍黏著於板之細胞的數目計數且計算為佔塗覆至各孔之總細胞之百分比；
圖26展示對HUVEC transwell遷移之抑制。使HUVEC(50,000個細胞/孔)在transwell板之頂腔中生長16小時，且用5 μg/ml重組人類EGFL7蛋白質塗佈頂腔中之膜。將各種濃度之對照抗體(抗IgE)或18F7之不同變異體添加至頂腔及底腔中之培養基中，而將20 ng/ml重組人類VEGF-165添加於底部孔中以刺激HUVEC遷移。對遷移至頂腔下側之細胞計數，且針對處理(抗體及濃度)作圖；
圖27展示人類κI共同序列(SEQ ID NO:9)、18F7.v6(SEQ ID NO:193)及18F7.v6k(SEQ ID NO:194)之可變輕鏈域之胺基酸序列。根據Kabat對位置編號，且對高變區加框。在未示出18F7.v6k之序列(在比對之第二及第三部分中)之情況下，相應序列與18F7.v6之序列一致；
圖28展示人類亞群III共同序列(SEQ ID NO:11)、18F7.v6(SEQ ID NO:195)及18F7.v6k(SEQ ID NO:196)之可變重鏈域之胺基酸序列。根據Kabat對位置編號，且對高變區加框。在未示出18F7.v6k之序列(在比對之第一及第三部分中)之情況下，相應序列與18F7.v6之序列一致；圖29展示單獨及與抗-VEGF抗體組合使用的hu18F7.v6k對H1299異種移植腫瘤生長之抑制；
圖30展示單獨及與抗-VEGF抗體組合使用的hu18F7.v6k對LXFL 1674異種移植腫瘤生長之抑制；及
圖31展示單獨及與抗-VEGF抗體組合使用的hu18F7.v6k對新生氣管血管形成之抑制。
<223>　/置換=「Val」或「Tyr」
<220>
<221>　VARIANT
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<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
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<222>　(13)..(13)
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<220>
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<220>
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<211>　6
<212>　DNA
<213>　未知
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<221>　source
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MOD_RES
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<223> Gly或Ser
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<211> 16
<212> PRT
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<220>
<223> 合成構築體
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> Ala或Val
<400> 240
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成構築體
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 243
(無元件符號說明)

Claims (58)

  1. 一種抗-EGFL7抗體，其包含以下六個HVR序列：(i)HVR-L1，其包含RTSQSLVHINX1 ITYLH，其中X1 係選自由A、G及S組成之群(SEQ ID NO：234)；(ii)HVR-L2，其包含RVSNRFS(SEQ ID NO：235)；(iii)HVR-L3，其包含GQSTHVPLT(SEQ ID NO：236)；(iv)HVR-H1，其包含GYTFIDYYMN(SEQ ID NO：237)；(v)HVR-H2，其包含GDINLDNX1 GTHYNQKFKG，其中X1 為G或S(SEQ ID NO：238)；及(vi)HVR-H3，其包含AREGVYHDYDDYAMDY(SEQ ID NO：239)；其中該重鏈包含以下構架序列：FR-H1，其包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO：197)；FR-H2，其包含WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO：198)；FR-H3，其包含RFTISRDKSKNTX1 YLQMNSLRAEDTAVYYCAR，其中X1 為A或V(SEQ ID NO：240)；及FR-H4，其包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：200)。
  2. 如請求項1之抗體，其中HVR-L1包含選自由SEQ ID NO：100、241及242所組成群之胺基酸序列，HVR-L2包含SEQ ID NO：101的胺基酸序列，HVR-L3包含SEQ ID NO：131的胺基酸序列，HVR-H1包含SEQ ID NO：103的胺基酸序列，HVR-H2包含SEQ ID NO：104或243的胺基酸序列，及HVR-H3包含SEQ ID NO：105的胺基酸序列。
  3. 如請求項1或2之抗體，其中： HVR-L1包含胺基酸序列RTSQSLVHINAITYLH(SEQ ID NO：242)，HVR-L2包含胺基酸序列RVSNRFS(SEQ ID NO：101)，HVR-L3包含胺基酸序列GQSTHVPLT(SEQ ID NO：131)，HVR-H1包含胺基酸序列GYTFIDYYMN(SEQ ID NO：103)，HVR-H2包含胺基酸序列GDINLDNSGTHYNQKFKG(SEQ ID NO：243)，及HVR-H3包含胺基酸序列AREGVYHDYDDYAMDY(SEQ ID NO：105)。
  4. 如請求項1或2之抗體，其中輕鏈包含以下構架序列：FR-L1，其包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：201)；FR-L2，其包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：202)；FR-L3，其包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO：203)；FR-L4，其包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：221)或FGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：204)。
  5. 如請求項1之抗體，其中該輕鏈包含如圖27所示之18F7.v6之可變域序列(SEQ ID NO：193)。
  6. 如請求項1之抗體，其中該輕鏈包含如圖27所示之18F7.v6k之可變域序列(SEQ ID NO：194)。
  7. 如請求項1之抗體，其中該重鏈包含如圖28所示之18F7.v6之可變域序列(SEQ ID NO：195)。
  8. 如請求項1之抗體，其中該重鏈包含如圖28所示之18F7.v6k之可變域序列(SEQ ID NO：196)。
  9. 如請求項1之抗體，其中該輕鏈包含如圖27所示之18F7.v6之可變域序列(SEQ ID NO：193)及該重鏈包含如圖28所示之18F7.v6之可變域序列(SEQ ID NO：195)。
  10. 如請求項1之抗體，其中該輕鏈包含如圖27所示之18F7.v6k之可變域序列(SEQ ID NO：194)及該重鏈包含如圖28所示之18F7.v6k之可變域序列(SEQ ID NO：196)。
  11. 如請求項1之抗體，其中該構架序列之至少一部分為人類共同構架序列。
  12. 如請求項11之抗體，其包含人類κ亞群1共同構架序列。
  13. 如請求項11之抗體，其包含重鏈人類亞群III共同構架序列。
  14. 2及5至10中任一項之抗體，其中該抗體為雙特異性抗體。
  15. 如請求項14之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體結合至血管內皮生長因子(VEGF)。
  16. 如請求項15之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體與貝伐單抗(bevacizumab)或蘭尼單抗(ranibizumab)結合相同之VEGF抗原決定基。
  17. 一種核酸，其編碼如請求項1至16中任一項之抗體。
  18. 一種載體，其包含如請求項17之核酸。
  19. 一種宿主細胞，其包含如請求項17之核酸或如請求項18之載體。
  20. 一種組合物，其包含如請求項1至16中任一項之抗體。
  21. 如請求項20之組合物，其中該組合物包含載劑。
  22. 如請求項20或21之組合物，其為醫藥組合物。
  23. 一種製造抗-EGFL7抗體之方法，該方法包含(a)使如請求項18之載體在適合宿主細胞中表現，及(b)回收該抗體。
  24. 如請求項23之方法，其中該宿主細胞為原核細胞。
  25. 如請求項23之方法，其中該宿主細胞為真核細胞。
  26. 一種如請求項1至16中任一項之抗-EGFL7抗體之用途，其係用於製造用以治療腫瘤、癌症或細胞增殖性病症之藥劑。
  27. 如請求項26之用途，其中該癌症係選自由乳癌、結腸直腸癌、肺癌、食道癌、膀胱癌、卵巢癌、胰臟癌及肝細胞癌組成之群。
  28. 如請求項27之用途，其中該癌症為乳癌、結腸直腸癌或肺癌。
  29. 如請求項26之用途，其中該細胞增殖性病症為癌症。
  30. 如請求項26至29中任一項之用途，其中該藥劑進一步包含有效量之第二藥劑。
  31. 如請求項30之用途，其中該第二藥劑為另一種抗體、化學治療劑、細胞毒性劑、抗血管生成劑、免疫抑制劑、前藥、細胞激素(cytokine)、細胞激素拮抗劑、細胞毒性放射線療法、皮質類固醇、止吐劑、癌症疫苗、鎮痛劑或生長抑制劑。
  32. 如請求項31之用途，其中該第二藥劑為抗-VEGF抗體。
  33. 如請求項32之用途，其中該第二藥劑為貝伐單抗。
  34. 如請求項30之用途，其中該第二藥劑係在投與該抗-EGFL7抗體之前或之後投與。
  35. 如請求項30之方法，其中該第二藥劑係與該抗-EGFL7抗體同時投與。
  36. 一種如請求項1至16中任一項之抗體的用途，其係用於製造用以減少或抑制患有血管生成相關病理病狀之個體的血管生成的藥劑。
  37. 如請求項36之用途，其中該病理病狀為贅生病狀。
  38. 如請求項36之用途，其中該病理病狀為非贅生病狀。
  39. 如請求項38之用途，其中該非贅生病狀係選自由糖尿病性及其他增殖性視網膜病、早產兒視網膜病、新生血管性青光眼、年齡相關之黃斑變性、糖尿病性黃斑水腫、角膜新血管生成、角膜移植新血管生成、視網膜/脈絡膜新血管生成組成之群。
  40. 一種如請求項1至16中任一項之抗體的用途，其係用於製造用以增強抗血管生成劑在患有血管生成相關病理病狀之個體之功效的藥劑。
  41. 如請求項40之用途，其中該血管生成相關病理病狀為腫瘤、癌症或細胞增殖性病症。
  42. 如請求項40之用途，其中該血管生成相關病理病狀為非贅生病狀。
  43. 如請求項42之用途，其中該非贅生病狀係選自由糖尿病性及其他增殖性視網膜病、早產兒視網膜病、新生血管性青光眼、年齡相關之黃斑變性、糖尿病性黃斑水腫、 角膜新血管生成、角膜移植新血管生成、視網膜/脈絡膜新血管生成組成之群。
  44. 如請求項40至43中任一項之用途，其中該抗血管生成劑係在投與該抗-EGFL7抗體之前或之後投與。
  45. 如請求項40至43中任一項之用途，其中該抗血管生成劑係與該抗-EGFL7抗體同時投與。
  46. 如請求項40至43中任一項之用途，其中該抗血管生成劑為抗-VEGF劑。
  47. 如請求項46之用途，其中該抗-VEGF劑為抗-VEGF抗體。
  48. 如請求項47之用途，其中該抗-VEGF抗體為貝伐單抗。
  49. 如請求項47之用途，其中該抗-VEGF抗體為蘭尼單抗。
  50. 一種如請求項1至16中任一項之抗體的用途，其係用於製造用以減少或抑制個體腫瘤之灌注及滲透性之藥劑。
  51. 如請求項50之用途，其中該藥劑進一步包含抗血管生成劑。
  52. 如請求項51之用途，其中該抗血管生成劑係在投與該抗-EGFL7抗體之前或之後投與。
  53. 如請求項51之用途，其中該抗血管生成劑係與該抗-EGFL7抗體同時投與。
  54. 如請求項50至53中任一項之用途，其中該抗血管生成劑為抗-VEGF劑。
  55. 如請求項54之用途，其中該抗-VEGF劑為抗-VEGF抗體。
  56. 如請求項55之用途，其中該抗-VEGF抗體為貝伐單抗。
  57. 如請求項26至29、36至43及50至53中任一項之用途，其中該藥物係與化療劑併用。
  58. 如請求項57之用途，其中該化療劑為(a)FOLFOX或(b)卡鉑(carboplatin)及太平洋紫杉醇(paclitaxel)。
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