KR100856995B1 - 인간화 항체 및 인간화 항체의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본원에는 혈관 내피 성장인자 (VEGF)에 대한 인간화 항체가 기재되어 있다. 또한 인간화 항체가 자신과 동일한 기원의 항원에 결합하는 것을 향상시키는 골격 돌연변이를 신속하게 발생시키고 동정하는 방법이 기재되어 있다. 개선된 실시태양에서는, 비인간 CDR을 사람 VLκI-VHIII 골격에 그래프트시킨다. 결정적으로 중요한 골격 잔기들의 소군(小群)에 대해 랜덤 돌연변이 유발을 수행한 후, 필라멘트형 파아지의 표면에 생성된 항체 분자의 라이브러리를 모노발런트 표면제시(monovalent display)한다. 최적의 골격 서열을 친화성에 준해서 선별하여 동정한다. 경우에 따라서는 선별된 항체를 추가로 돌연변이시켜서, VL-VH 경계면에 위치한 버니어(vernier) 잔기를 비인간 모항체에 일치하는 잔기로 교체한다. 본원에 기재된 방법은 모든 비인간 항체에 적용할 수 있다. 그 결과 인간화 항체가 얻어진다.
항체, 인간화, 인간화 항체
Description
본 발명은 인간화 항체 및 인간화 항체의 제조 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 단일한 인간 골격 중 결정적으로 중요한 골격 잔기들을 랜덤(random) 돌연변이시켜서 만든 항체 돌연변이체 및 파아지 모노발런트(monovalent) 표면제시 시스템을 써서 인간화 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로는 혈관 내피 성장인자 (VEGF)에 결합하는 쥐과 항체의 인간화에 관한 것이다.
모노클로날 항체 (mAb)는 치료제로서 엄청난 가능성이 있으며, 특히 이들을 한정된 시스템의 조절에 사용할 수 있을 경우에 그러하다. 예를 들면 어떤 상황에서는, 새로운 모세혈관이 기존의 작은 맥관의 벽으로부터 형성되는 맥관형성 (angiogenesis)과 같은 어떤 시스템을 조절하는데 모노클로날 항체가 필요하다. 맥관형성은 일반적으로 창상 및 감염을 당한 후에 중요한데, 손상된 조직의 주변에서 모세혈관의 집중적 성장을 자극할 수 있어야 하기 때문이다. 그러나 맥관형성은 또한 종양의 증식에 있어서도 중요한데, 왜냐하면 종양이 계속해서 성장하기 위해서는 종양 덩어리에 침투하는 모세혈관망의 형성을 유도해야 하기 때문이다.
맥관형성을 조절하는 어떤 성장인자는 이미 밝혀져 있다. 그 중 특별한 관 심의 대상이 되는 것은 혈관 내피 성장인자 (VEGF)로서, 이것은 일부 종양이 풍부한 혈액 공급을 받을 수 있게 하는 작용제인 것처럼 보인다 (Molecular Biology of the Cell, 3rd Ed., Alberts et al., Garland Publishing, 1154쪽 (1994)). 따라서 VEGF에 대한 모노클로날 항체(mAb)는 맥관형성의 조절, 특히 항종양제로서의 용도 등을 비롯한 여러 가지 이유로 유용할 수 있다. VEGF 수용체 결합을 방해하는 쥐과 항-VEGF mAb A4.6.1는 이미 문헌을 통해 알려져 있었다. 이 항체는 유사분열 신호전달을 억제하는 것으로 밝혀진 바 있다 (Kim et al., Growth Factors 7, 53 (1992), Kim et al., Nature 362, 841 (1993)).
위에서 설명한 항-VEGF를 비롯한 대부분의 mAb는 쥐과나 그외의 비인간 공급원으로부터 유래된 것이어서 임상적 효능이 제한되어 있다. 특히 신체는 비인간 항체에 대해서는 대개 면역반응을 일으키기 때문에, 어떤 치료 효과가 생기기 전에 항체는 계로부터 급속하게 제거되어 버린다. 비인간 mAb는 사람에게 투여될 때 면역원성이 야기된다는 것이외에도 이펙터 (effector) 기능의 회복력이 약하다는 한계가 더 있다.
이러한 문제를 피해가기 위한 수단으로서, 항체 "인간화(humanization)"로 알려진 방법을 통해 비인간 mAb의 항원 결합성을 인간 항체에 부여할 수 있다. 인간화 항체는 부모 또는 상응하는 비인간 mAb의 상보적 결정 영역 (CDR) (항체 분자의 항원 결합 부위) 6개의 아미노산을 인간 항체 골격에 그래프트시킨 것이다. 따라서, 비인간 항체의 인간화는 흔히 CDR 그래프팅(grafting)이라 불린다. 이런 인간화 항체 내에 비인간 서열의 낮은 함량 (약 5 %)은 면역원성을 감소시키고 사람에게 투여된 항체의 혈청 반감기를 연장시키는데 효과적인 것으로 입증되었다. 그 중에서도 인간화 모노클로날 항체 ("키메라 면역글로불린")는 미국 특허 제4,816,567호에 개시되어 있다.
불행하게도 CDR 서열의 간단한 그래프트는 부모 비인간 mAb 보다 훨씬 약하게 항원에 결합하는 인간화 항체를 낳는다. 높은 친화도를 보존하기 위해서는 항체를 추가로 조작해서 항원 결합 루프의 구조를 미시적으로 조정해야 한다. 이는 항체 가변 도메인의 골격 영역에서 중요한 잔기들을 부모 쥐과 항체의 대응 서열로 대체함으로써 달성된다. 이런 골격 잔기들 중 어떤 것은 자신들이 직접적으로 항원과 접촉할 수도 있지만 일반적으로는 CDR 루프의 형태를 지탱하는데 관여한다. CDR 형태에서 특정한 골격 잔기들의 중요성에 주목한 연구들이 수행된 바 있으며, 그 결과 항원 결합에 영향을 줄 수 있는 모든 골격 잔기의 포괄적인 리스트가 얻어졌다 (Chothia et al., J. Mol. Biol. 224, 487 (1992), Foote et al., J. Mol. Biol. 224, 489 (1992)). 이 포괄적인 리스트에는 CDR 구조에 잠재적으로 영향을 줄 수 있는 약 30개의 "버니어 (vernier)" 잔기가 포함되어 있다. 인간화 항체 내의 버니어 잔기들의 전체 집합을 수정해서 상응하는 부모 비인간 서열에 일치시킴으로써 보다 높은 항원 친화성을 이끌어낼 수는 있지만, 비인간 서열의 구성요소를 추가로 첨가하면 면역원성이 더 부과될 위험성이 커지기 때문에 일반적으로 이는 바람직하지 못하다. 따라서 치료학적 관점에서 보면 고친화성 인간화 항체를 제공하는 최소한의 집합으로 골격 변화를 한정하는 것이 바람직하다.
따라서 최적의 결합을 제공하기에 충분한 작은 변화 집합을 밝혀내는 것이 필요하다. 그러나 이 필요한 변화는 하나의 인간화 항체와 다른 인간화 항체 사이에 구분될 필요가 있다. 원하는 결과를 얻기 위한 한 가지 방법은 "요주의(suspect)" 골격 서열이 이들의 쥐의 대응부로 대체된 돌연변이 명부를 제작하여 적절한 돌연변이 조합을 밝혀내는 것이었다. 이들 변이체는 개별적으로 제조되며, 항원에 대해 시험한 후 유리한 결합 친화도를 갖는 것으로 밝혀진 다른 변이체와 조합된다. 그러나 이 방법은 개별적인 위치지정 돌연변이 유발 (site-directed mutagenesis), 단리 및 스크리닝을 여러 번 반복 수행해야 하므로 시간이 많이 소요되고 지루하다는 불리한 점이 있다.
항체 인간화를 단순화하기 위한 수단으로서 많은 다른 방법이 개발되었다. 예를 들면 문헌 Queen et al., PNAS USA 86, 10029 (1989), Ketteleborough et al., Protein Eng. 4, 773 (1991), Tempest et al., Biotechnology 9, 266 (1991), Padlan, Mol. Immunol. 28, 489 (1991), Roguska et al., PNAS USA 91, 969 (1994), Studnicka et al., Protein Eng. 7, 805 (1994), Allen et al., J. Immunol. 135, 368 (1985), Carter et al., PNAS USA 89, 4285 (1992), Presta et al., J. Immunol. 151, 2623 (1993), Eigenbrot et al., Proteins 18, 49 (1994), Shalaby et al., J. Exp. Med. 175, 217 (1992), Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th), Public Health Service, NIH, Bestesda, MD (1991), Rosok et al., J. Biol. Chem. 271, 22611 (1996), WO-A-92/22653, GB-A-2 268 744 및 WO 94/04679을 참조한다.
본 발명의 목적은 개별적인 위치지정 돌연변이 유발 및 스크리닝의 주기에 준해서 골격을 최적화하는 현행 방법을 철폐하고, 인간화 항체가 이들의 동족(cognate) 항원으로 결합하는 것을 향상시키는 골격 돌연변이를 신속하게 선별하는 일반적인 수단을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 또한 항체에 낮은 면역원성을 제공하며, 단일한 인간 골격을 일반적인 뼈대로 이용하는 항체의 신속한 인간화 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 골격 변화가 없는 처음의 인간화 항체에 비해 항원에 대한 친화도가 향상되도록 돌연변이된 인간화 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 추가적인 목적은 전신 투여 후에 신체 내에서 제거 속도가 감소되어 체류 시간이 길어진 인간화 항체를 제공하는 것이며, 이 결과 치료 효과를 위해 전신 투여하는데 있어서 보다 낮은 용량을 사용할 수 있다.
본 발명의 목적은 또한 VEGF에 대한 인간화 모노클로날 항체를 제공하는 것이다.
발명의 요약
본 발명은 혈관 내피 성장인자 (VEGF)에 대한 인간화 항체를 제공하는 것이다. 초기 인간화 항-VEGF는 가장 풍부한 인간 서브클래스, 즉 VLκ 하위군 I(VLκI) 및 VH 하위군 III (VHIII)의 컨센서스 서열에서 유래된 골격에 비인간 항-VEGF의 CDR이 그래프트되어 있는 것이다. 이 초기 제작물에서 결정적으로 중요한 골격 잔기를 랜덤 돌연변이시켜서 본원에 기재된 인간화 항-VEGF를 생산하며, 이는 골격 변화가 없는 초기 인간화 항체에 비해 항원에 대한 친화도가 125 배 향상되었다. 하나의 추가 돌연변이로 인해 결합이 6배가 더 향상되었다. 이 인간화 항-VEGF는 본원에 기재된 방법을 통해서 또는 본원에 기재된 서열 정보만 있다면 전통적인 재조합 기술을 통해서 재생산될 수 있다.
본원에는 또한 인간화 항체가 이들의 동족 항원에 결합하는 것을 개선시킨 골격 돌연변이를 신속하게 유발하고 동정하는 방법이 기재되어 있다. 바람직한 실시태양에서는, 비인간 CDR이 인간 VLκI-VHIII 골격으로 그래프트된다. 또한 결정적으로 중요한 골격 잔기의 작은 집합의 랜덤 돌연변이를 유발시킨 후 생성된 항체 분자의 라이브러리를 필라멘트 파아지의 표면에 모노발런트 표면제시(monovalent display)한다. 최적의 골격 서열을 친화성에 준해서 선별하여 동정한다. 경우에 따라서는 선별된 항체를 추가로 돌연변이시켜서, VL-VH 경계면에 위치한 버니어(vernier) 잔기를 비인간 부모 항체에 일치하는 잔기로 교체한다.
본원에 기재된 방법은 모든 비인간 항체에 적용할 수 있다. 그 결과 인간화 항체가 얻어진다.
도 1은 쥐과 A4.6.1 (VL 및 VH 도메인에 대하여 각각 서열 번호 6 및 9), 인간화 A4.6.1 변이체 hu2.0 (VL 및 VH 도메인에 대하여 각각 서열 번호 7 및 10), 및 인간화 A4.6.1 변이체 hu2.10 (VL 및 VH 도메인에 대하여 각각 서열 번호 8 및 11)의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열 넘버링은 Kabat 등의 문헌 [Sequences of Proteins of Immunological Interest (제5판), Public Health Service, NIH, 미국 메릴랜드주 베데스다 소재 (1991)]에 따른 것이며 미스매치는 * (쥐과 A4.6.1 대 hu2.0) 또는 (hu2.0 대 hu2.10)으로 나타내었다. 변이체 hu2.0은 인간 경쇄 K 하위군 I, 중쇄 하위군 III 골격에 쥐과 항체로부터의 CDR 서열 (굵은선)이 단지 그래프트 되기만 한 것이다. 변이체 hu2.10은 본 명세서에 기술된 파아지 소팅 (sorting) 실험에서 얻어진 컨센서스 인간화 클론이다.
도 2는 랜덤화 표적 골격 잔기를 나타낸다.
도 3은 파아지에서의 Fab-pIII 융합체의 표면 제시를 위한 파지미드 제작물을 나타낸다. 파지미드 제작물은 M13 유전자 III 코트 단백질의 일부에 융합된 항체 A4.6.1의 Fab 단편의 인간화된 이형을 코딩한다. 융합 단백질은 Fab의 중쇄의 카르복실 말단에서 하나의 글루타민 잔기 (supE이. 콜라이의 앰버 코돈의 억제로부터)를 통해 유전자 III 단백질 (잔기 249-406)의 C-말단 영역에 결합되어 이루어진다. F+이. 콜라이를 형질전환시키고, 이어서 M13KO7 헬퍼 파아지로 과다감염시켜 파지미드 입자를 얻게 되는데, 이들 중 일부만이 융합 단백질의 단일 카피를 표면제시한다.
A. 정의
"항체 (Ab)" 및 "면역글로불린 (Ig)"은 구조적 특성이 동일한 당단백질이다. 항체는 특정 항원에 결합 특이성을 나타내는 반면, 면역글로불린은 항체와, 항원 특이성이 결여된 다른 항체 유사 분자 모두를 포괄한다. 후자의 폴리펩티드류는 예를 들어 림프계에 의해 저수준으로, 그리고 골수종에 의해 증가된 수준으로 생산된다.
"천연 항체" 및 "천연 면역글로불린"은 통상 2개의 동일한 경쇄 (L쇄) 및 2개의 동일한 중쇄 (H쇄)로 이루어진 약 150,000 달톤의 헤테로테트라머 당단백질이다. 각각의 경쇄는 하나의 공유 디설파이드 결합으로 중쇄에 결합되어 있으며 디설파이드 결합의 수는 상이한 면역글로불린 이소타입의 중쇄에 따라 달라진다. 각각의 중쇄와 경쇄에서는 또한 쇄내 디설파이드 가교의 간격이 규칙적이다. 각각의 중쇄는 그의 한쪽 말단에 하나의 가변 도메인 (VH)과 다수의 불변 도메인을 차례로 보유한다. 각각의 경쇄는 그의 한쪽 말단에 가변 도메인 (VL)을 반대쪽 말단에 불변 도메인을 보유하는데, 경쇄 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 나란히 위치하며, 경쇄 가변 도메인은 중쇄 가변 도메인과 나란히 정렬되어 있다. 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 사이에는 특별한 아미노산 잔기들이 경계영역을 형성하는 것으로 여겨진다 (Clothia 등의 문헌 [J. Mol. Biol. 186, 651 (1985); Novotny 등의 문헌 [PNAS USA 82, 4592 (1985)] 참조).
"가변"이라는 용어는 가변 도메인의 특정 부분의 서열이 항체들마다 매우 다르고 이 가변 도메인의 특정 부분이 각각의 특정 항체의 특정 항원에 대한 결합성 및 특이성에 이용된다는 사실을 나타낸다. 그러나 가변성은 항체의 가변 도메인에 고르게 분포되어 있지는 않다. 가변성은 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 모두에서 "상보적 결정 영역 (complementarily determing region, CDR)" 또는 "초가변 영역"으로 불리는 세 부분에 집중되어 있다. 가변 도메인의 더 고도로 보존된 부분은 골격 (framework, FR)으로 불리워진다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 각각은 루프 연결을 형성하거나 몇몇 경우 β-시트 구조의 일부를 형성하는 3개의 CDR이 연결된, 주로 p-시트 형태를 채용하는 4개의 FR 영역을 포함한다. 각 쇄의 CDR은 FR 영역에 의해 매우 근접한 위치에서 함께 유지되며, 다른 쇄의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위를 형성하는 데 기여한다 (Kabat 등의 상기 문헌 참조). 불변 도메인은 항체의 항원에 대한 결합에 직접 관련되지는 않지만 여러 이펙터 (effector) 기능, 예를 들어 항체 의존성 세포 독성에서의 항체의 참여 기능을 나타낸다.
항체를 파파인으로 절단하면 Fab 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원 결합 단편 (이들은 각각 단일 항원 결합 부위를 포함함)과, 나머지 "Fc" 단편 (Fc라는 이름은 쉽게 결정화되는 그의 능력을 반영함)이 얻어진다. 펩신으로 처리하면 2개의 항원 결합 부위를 가지며 여전히 항원에 가교결합할 수 있는 F(ab1)2 단편이 얻어진다.
"Fv"는 완전한 항원 인지 부위와 결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 하나의 중쇄 가변 도메인과 하나의 경쇄 가변 영역이 비공유 결합으로 단단하게 결부된 이량체로 구성된다. 이러한 형태에 의해 각 가변 도메인의 세 CDR이 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면에 항원 결합 부위를 규정짓게 된다. 총괄적으로 6개의 CDR이 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나 심지어 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 절반의 Fv)도, 전체 결합 부위보다는 친화성이 적지만, 항원을 인지하고 항원에 결합하는 능력을 가진다.
"Fab" 단편은 경쇄의 불변 도메인과, 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 포함한다. Fab1 단편은 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 항체 힌지 영역의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 몇개의 잔기가 첨가되어 있다는 점에서 Fab 단편과는 다르다. Fab1-SH는 본 명세서에서는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 보유하는 Fab1을 나타내는 것이다. F(ab1)2 항체 단편은 원래 단편 사이에 힌지 시스테인을 가지는 Fab1 단편 쌍으로 만들어졌다. 기타 항체 단편의 화학적 커플링도 알려져 있다.
척추동물종 항체의 경쇄 (면역글로불린)는 경쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리워지는 명확하게 다른 유형 중 어느 하나로 분류될 수 있다.
면역글로불린은 그의 경쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 다른 류로 분류될 수 있다. 면역 글로불린에는 다섯 가지의 주 부류인 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있으며, 이들 중 여러 가지는 서브클래스 (이소타입), 예를 들어 IgG-1, IgG-2, IgG-3과 IgG-4; IgA-1 및 IgA-2로 더 분류될 수 있다. 서로 다른 류의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, 델타, 엡실론, λ, 및 μ로 불리워진다. 서로 다른 류의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 형태는 잘 알려져 있다.
"항체"라는 용어는 가장 넓은 의미로 사용되며 구체적으로는 단일 모노클로날 항체 (작용성 및 길항성 항체 포함), 폴리에피토프 특이성을 갖는 항체 조성물, 및 원하는 생물학적 활성을 나타내기만 한다면 항체 단편 (예를 들어 Fab, F(ab1)2, 및 Fv)을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 "모노클로날 항체"라는 용어는 실질적으로 동종 항체들의 집단으로부터 얻은 항체를 의미하며, 즉, 집단을 이루는 개별적인 항체들은 소량 존재할 수 있는 가능한 자연발생적 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 큰 특이성을 가지며, 단일 항원 부위에 대해 유도된다. 또한, 대개 상이한 항원 결정군 (determinant)(에피토프)에 대해 유도되는 상이한 항체들을 포함하는 통상의 (폴리클로날) 항체 제제와 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 항원 결정군에 대해 유도된다. 모노클로날 항체는 그의 특이성 외에도 그들이 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 하이브리도마 배양에 의해 합성된다는 점에서 잇점을 가진다. 수식어 "모노클로날"은 항체가 실질적으로 동종 집단으로부터 얻어지는 것을 특징으로 한다는 것을 나타내며, 어떠한 특정 방법으로 항체를 생산할 것을 요구하는 것으로 파악되어서는 안된다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 문헌[Kohler 등, Nature 256:495 (1975)]에 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있거나, 재조합 DNA 방법 (예를 들면, 미국 특허 제4,816,567호 참조)에 의해 제조할 수 있다.
"키메라 (chimera)" 항체 (면역글로불린)은 중쇄 및(또는) 경쇄의 일부가 특 정 종으로부터 유래되거나 특정 항체류 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 이 서열과 상동성을 가지지만, 이 쇄(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유래되거나 다른 항체류 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성을 가지는 항체, 및 원하는 생물학적 활성을 나타내기만 한다면 이러한 항체의 단편이다 (미국 특허 제4,816,567호 참조).
비인간 (예를 들어 쥐과) 항체의 "인간화" 형은 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 포함하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 그의 단편 (예를 들어 Fv, Fab, Fab1, F(ab1)2 또는 항체의 다른 항원 결합 서브서열)이다. 대부분의 경우 인간화 항체는 환자의 상보적 결정 영역 (CDR)의 잔기를 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 생쥐, 쥐 또는 토끼 등의 비인간 종의 CDR (공여체 항체)의 잔기로 대체한 인간 면역글로불린 (수용체 항체)이다. 몇몇 경우 인간 면역글로불린의 Fv 골격 잔기는 상응하는 비인간 잔기에 의해 대체된다. 또한 인간화 항체는 환자 항체와, 도입된 CDR 또는 골격 서열 모두에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형으로 항체 능력을 더 개량하고 최적화한다. 일반적으로 인간화 항체는 주로 모든, 또는 실질적으로 모든 CDR 영역이 비인간 면역글로불린의 CDR 영역에 해당하며, 모든, 또는 실질적으로 모든 FR 영역이 인간 면역 글로불린 컨센서스 서열의 FR 영역에 해당하는 하나 이상, 대개는 2개의 가변 도메인 모두를 포함한다. 인간화 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 대개는 인간 면역글로불린의 적어도 일부를 포함하는 것이 최적이다. 더 상세한 것은 Jones 등의 문헌 [Nature 321, 522 (1986)]; Reichmann 등의 문헌 [Nature 332, 323 (1988)]; 및 Presta의 문헌 [Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593 (1992)]을 참조하기 바란다.
"인간에서의 비면역원성"은 치료적 유료량의 인간화 항체와 적당한 인간 조직을 접촉시켰을 때 인간화 항체에 대한 민감성 상태나 저항성이 투여시에 실질적으로 증명되지 않음을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 "혈관 내피 성장 인자" 또는 "VEGF"는 미국 특허 제5,332,671호에 정의되어 있는, 도 1의 인간 아미노산 서열을 포함하는 포유류 성장 인자를 의미한다. 천연 VEGF의 생물학적 활성은 혈관 내피 세포의 선택적인 성장은 촉진할 수 있지만, 소과 각막 내피 세포, 수정체 내피 세포, 부신 피질 세포, BHK-21 섬유아세포, 또는 각질 세포의 성장은 촉진하지 않거나, 상응하는 천연 VEGF의 하나 이상의 에피토프에 대하여 유도된 항체와 면역학적인 교차 반응성을 갖는 면역 에피토프를 보유하는 그의 유사체 또는 변이체에 의해 공유된다.
"위치지정 돌연변이 유발"은 당업계의 표준 기술이며 제한된 미스매칭을 제외하고 돌연변이시킬 단일 가닥 파아지 DNA에 상보적인 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 행하여 원하는 돌연변이를 나타낸다. 간단히 말해서 합성 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 파아지에 상보적인 가닥의 합성을 유도하며, 이렇게 얻은 이중가닥 DNA로 파아지 지지 숙주 박테리아를 형질전환시킨다. 형질전환된 박테리아의 배양물을 상부 아가에 도말하여 파아지를 보유하는 단일 세포로부터 플라크가 형성되게 한다. 이론적으로 새로운 플라크의 50%는 돌연변이된 형태를 단일 가닥으로 보유하는 파아지를 포함하며 50%는 원래 서열을 가진다. 정확하게 매치되는 혼성화는 가능하게 하지만, 원래 가닥과 미스매치되는 것의 혼성화는 충분히 방지되는 온도에서 키나제로 처리된 합성 프라이머와 플라크를 혼성화시킨다. 이어서 프로브와 혼성화하는 플라크를 선별하고 배양하여 이 DNA를 회수한다.
"발현 시스템"은 원하는 코딩 서열과, 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함하여 이 서열로 형질전환된 숙주가 코딩된 단백질을 생산할 수 있게 하는 DNA 서열을 의미한다. 발현 시스템은 형질전환을 가능하게 하기 위하여 벡터에 포함될 수 있지만, 관련 DNA를 숙주 염색체 내로 통합시킬 수도 있다.
본 명세서에서 사용되는 "세포", "세포주", 및 "세포 배양물"은 서로 바꾸어 사용할 수 있으며 이러한 용어 모두는 자손을 포함한다. 따라서 "형질전환체" 또는 "형질전환된 세포"는 일차 세포와, 계대배양 횟수와는 상관없이 그로부터 유래된 배양물을 포함한다. 모든 자손은 고의적이거나 우연한 돌연변이로 인해 DNA 서열이 정확하게 동일하지 않을 수 있다는 것은 물론이다. 원래 형질전환된 세포에서 스크리닝된 것과 동일한 기능성을 가지는 돌연변이 자손도 포함된다. 명확한 의미를 알고자 한다면 그 의미는 문맥에서 명료해질 것이다.
"플라스미드"는 대문자 및(또는) 숫자 앞 및(또는) 뒤에 소문자 p로 나타낸다. 본 명세서에서 출발 플라스미드는 구매가능하거나, 제한 효소로 처리되지 않은 것을 공개적으로 입수할 수 있거나, 공개된 방법으로 상기 입수가능한 플라스미드로부터 제작할 수 있다. 또한 다른 플라스미드도 당업계에 알려져 있으며 숙련자에게 명백할 것이다.
"친화성 결합"은 항체에서 하나의 항원 결합 부위와 하나의 에피토프 사이에 일어나는 비공유결합성 상호작용 전체를 합한 강도이다. 저친화성 항체는 항원에 약하게 결합하며 쉽게 해리되는 경향이 있는 반면, 고친화성 항체는 항원에 보다 단단하게 결합하여 결합된 상태를 더 오래 유지한다.
"형질전환"은 DNA를 유기체에 도입하되, 그 DNA가 염색체외 구성요소로서 복제가능하거나 또는 염색체 통합에 의해 복제가능한 것을 의미한다. 사용된 숙주 세포에 따라서, 그러한 세포에 적절한 표준 기술을 써서 형질전환을 수행한다. 염화칼슘을 사용하는 칼슘 처리법 (Cohen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110 (1972) 및 Mandel et al., J. Mol. Biol. 53, 154 (1970))은 원핵생물이나 그외에 실질적인 세포벽 장벽을 포함하는 세포에 통상적으로 이용된다. 그러한 세포벽이 없는 포유동물 세포에 대해서는 인산칼슘 침전법 (Graham and van der Eb, Virology 52, 456 (1978))이 바람직하다. 포유동물 숙주계 형질전환의 일반적인 특징은 1983년 8월 16일 허여된 미국 특허 제4,399,216호 (Axel)에 기재되어 있다. 이스트의 형질전환은 통상 문헌 (Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977) 및 Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 3829 (1979))의 방법에 따라 수행된다. 그러나 DNA를 세포에 도입하는 그밖의 다른 방법, 예를 들면 핵 주입법, 전기천공법 또는 프로토프라스트 융합 등을 사용할 수 있다.
어떤 DNA 단편을 제한 소화물로부터 "회수" 또는 "단리"한다는 것은 그 소화물을 폴리아크릴아미드 또는 아가로오즈 겔 상에서 전기영동법으로 분리하고, 분자 량을 알고 있는 마커 DNA의 이동도에 대해 관심있는 단편의 이동도를 비교하여 관심있는 단편을 동정하고, 원하는 단편을 포함하는 겔 구획을 잘라내어 겔로부터 DNA를 분리한다는 것을 의미한다. 이 과정은 일반적으로 공지된 것이다. 예를 들면 문헌 (Lawn et al., Nucleic Acids Res. 9, 6103 (1981) 및 Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980))을 참조한다.
"라이게이션"은 이중가닥 핵산 단편 사이에 포스포디에스테르 결합을 형성하는 과정을 일컫는다. 특별한 언급이 없다면, 라이게이션은 라이게이션될 DNA 단편의 대략 동몰량의 0.5 mg 당 T4 DNA 라가아제 ("라가아제") 10 유닛과 함께 공지된 완충액 및 조건을 써서 수행할 수 있다.
"조절 서열"이라는 표현은 특정한 숙주 유기체에서 그것에 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위 및 가능하다면 그외에 아직 이해되지 않은 서열 등을 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들면, 전서열 또는 분비 리더(leader)의 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전단백질(preprotain)로서 발현되는 경우 폴리펩티드의 DNA와 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 이들의 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이며, 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결될 DNA 서열들이 인접하며 (contiguous), 분비 리더의 경우 인접하며 리딩 상(相) 내에 존재한다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한효소 부위에서 라이게이션에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 사용한다.
본원에서 사용된 "대표적으로 매긴 번호"란 특정 서열에서 잔기의 위치 번호및 다른 서열에서 이에 상응하는 위치 번호를 의미한다. 상응하는 위치 번호는 서열, 일반적으로는 인간 항체 골격 서열 내의 번호로서, 인간화 항체의 제작에 사용될 때 대표적으로 매겨진 번호에 기능상 동일하다.
통상적으로 "아미노산" 및 "아미노산들"이란 모두 자연상태에서 존재하는 L-α-아미노산을 지칭한다. 그러나 어떤 실시태양에서는 구조적 형태의 제한을 용이하게 하기 위해서 본 발명의 폴리펩티드 또는 펩티드 내에 D-아미노산이 존재할 수 있다. 아미노산은 한 문자 또는 세 문자 명칭으로 나타낸다.
Asp D 아스파르트산 Ile I 이소류신
Thr T 트레오닌 Leu L 류신
Ser S 세린 Tyr Y 티로신
Glu E 글루탐산 Phe F 페닐알라닌
Pro P 프롤린 His H 히스티딘
Gly G 글리신 Lys K 라이신
Ala A 알라닌 Arg R 아르기닌
Cys C 시스테인 Trp W 트립토판
Val V 발린 Gln Q 글루타민
Met M 메티오닌 Asn N 아스파라긴
"아미노산 서열 변이체"란 용어는 천연 아미노산 서열과 비교할 때 이들 아미노산 서열에서 약간의 차이가 있는 분자이다.
치환 변이체는 천연 서열에서 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기가 제거되고, 그와 다른 아미노산이 동일한 위치에 대신해서 삽입된 것을 의미한다. 치환은 분자 내에서 하나의 아미노산만이 치환되었을 경우에는 단일 치환이며, 동일한 분자내에서 둘 이상의 아미노산이 치환되었을 경우에는 다중 치환일 수 있다.
혼성화는 "엄격 조건"에서 수행되는 것이 바람직한데, 여기서 엄격 조건이란 (1) 이온 세기가 낮고 세척 온도가 높은 조건, 예를 들면 0.015 염화나트륨/0.0015 M 시트르산나트륨/0.1 % 나트륨 도데실 술페이트를 50 ℃에서 사용하는 조건, 또는 (2) 42 ℃에서 0.1 % 소혈청 알부민/0.1 % 피콜/0.1 % 폴리비닐피롤리돈/750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨이 함유된 50 nM 인산나트륨 완충액 (pH 6.5)이 함유된 50 % (vol/vol) 포름아미드 등의 포름아미드와 같은 변성제를 혼성화시에 사용하는 조건을 의미한다. 또다른 예는 50 % 포름아미드, 5 x SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6/8), 0.1 % 피로인산 나트륨, 5 x Denhardt's 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA (50 ㎍/ml), 0.1 % SDS, 및 10 % 덱스트란 술페이트를 42 ℃에서 사용하고, 0.2 x SSC 및 0.1 % SDS로 42 ℃에서 세척하는 것이다. 또다른 예는 10 % 덱스트란 술페이트, 2 x SSC (염화나트륨/시트르산 나트륨) 및 50 % 포름아미드의 완충액을 사용하여 55 ℃에서 혼성화한 후, 55 ℃에서 EDTA가 함유된 0.1 x SSC로 이루어진 고엄격 세척을 수행하는 것이다. 핵산 분자의 핵산 서열이 제공될 경우 상기 조건 하에 이 서열에 혼성화하는 다른 핵산 분자는 이 서열의 범위 내에 있는 것으로 여겨진다.
기술되어 있는 아미노산은 이 아미노산 서열을 합성하여 재제작하거나 돌연변이로 재현할 수 있음은 물론이다. 다르게는, 재조합 기술을 사용하여 이 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 회수할 수 있다. DNA는 원하는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA로부터 라이브러리를 형성함으로써 회수한다. 이어서 아미노산 서열을 기초로 하여 프로브를 만든다. 이어서 프로브에 혼성화하는 DNA를 단리하고 DNA에 의해 코딩되는 생성물이 원하는 생성물인지를 결정하기 위하여 분석한다. 일반적으로 세포를 DNA (또는 RNA)로 형질전환시켜 발현 연구를 수행한다.
B. 항체를 인간화하는 일반적인 방법론
본 명세서에 기술된 방법을 사용하여 항체를 인간화할 수 있다. 뿐만 아니라 본 명세서에 구체적으로 기술된 인간화 항체인 인간화 항-VEGF는 본 명세서에 기술된 방법에 의해, 또는 종래의 DNA 재조합 기술에 의해 복제될 수 있음은 물론이다. 구체적으로는 주요 골격 잔기 돌연변이를 본 명세서에 기술하였기 때문에 인간화 항체는 파아지 모노발런트 표면제시 시스템을 사용하여 복제하지 않고도 동일한 돌연변이를 갖도록 복제할 수 있다. 반대로, 기술된 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 종래의 DNA 재조합 기술로 합성하거나 복제할 수 있다. 이어서 DNA 생성물을 발현시키고 동정하고 회수할 수 있다. 별법으로 당업계에 공지된 방법으로 항체에 대하여 위치 지정 돌연변이 유발 시험을 수행하거나, 항체를 본 명세서에 기술된 돌연변이를 갖도록 합성할 수 있다.
본 명세서에 기술된 인간화 항체를 제조하는 특히 바람직한 방법은 인간 VLκI-Cκ1 경쇄 및 인간 VHIII-CH1γ 중쇄 Fd를 코딩하는, 벡터 상에서의 위치 지정 돌연변이 유발에 의해 그래프트된 CDR 서열을 갖는 Fab 단편의 모노발런트 표면제시를 위한 항체 파지미드 벡터를 제조하는 단계, 선별된 주요 골격 잔기의 소집합을 랜덤하게 돌연변이 유발시킴으로써 항체 Fab 파지미드 라이브러리를 제작하는 단계, 인간화 Fab 단편을 발현 및 정제하는 단계, 인간화 Fab 변이체를 선별하는 단계, 및 결합 친화도를 측정하는 단계를 포함한다. 이러한 단계는 특정 순서대로 수행되어야 한다. 이들 단계는 하기 "실시예"에서 구체적으로 기술되지만 일반적으로 하기와 같이 수행된다.
Fab 단편의 모노발런트 표면제시를 위한 항체 파지미드 벡터의 제조
먼저 인간화할 항체를 선별하고 상보적 결정 영역 (CDR)을 동정한다. 항체의 CDR 서열은 Kabat 등의 상기 문헌의 서열 정의에 따라 동정할 수 있다. 인간 VLκI-Cκ1 경쇄 및 인간 VHIII-CH1γ1 중쇄 Fd를 코딩하는 벡터 상에 위치 지정 돌연변이 유발로 CDR 서열을 그래프트시킨다. 이어서 Fab 코딩 서열을 파지미드 벡터로 서브클로닝할 수 있다. 이 제작물은 중쇄의 C-말단이 파아지 코트 단백질의 카르복실 부분에 정확하게 융합된 초기 인간화 항체를 코딩한다. 바람직하게는 파지미드 벡터는 supE 서프레서를 갖는 이. 콜라이 균주 내에서 분비형 중쇄 또는 중쇄-유전자 III 융합체를 발현시키는 파지미드 벡터를 선별한다.
항체 Fab 파지미드 라이브러리의 제작
다수의 비인간 항체를 인간 VLκI-VHIII 골격에 인간화한 누적된 결과에 기초하여 판단할 때, 항원 결합을 최적화하는데 요구되는 골격 변화는 잔기의 몇몇 부분집합에 한정된다 (Carter 등의 문헌 [PNAS USA 89, 4285 (1992)]; Presta 등의 문헌 [J. Immunol. 151, 2623 (1993)]; Eigenbrot 등의 문헌 [Proteins 18, 49-62 (1994)]; Shalaby 등의 문헌 [J. Exp. Med. 175, 217 (1992)] 참조). 이에 따라 랜덤화를 위해 새로운 잔기군을 선택하였다. 동정된 이들 주요 골격 잔기를 랜덤화하여 필라멘트 파아지의 표면에 제시되는 원하는 Fab 변이체의 라이브러리를 만든다. 구체적으로는, 항원 결합에 중요한 주요 골격 잔기로 VL 잔기 4 및 71과 VH 잔기 24, 37, 67, 69, 71, 73, 75, 76, 78, 93 및 94를 선택하여 랜덤화 표적으로 삼았다.
인간화 Fab 단편의 발현 및 정제
당업계에는 단편을 발현시키고 정제하는 여러 방법이 알려져 있다. 본 명세서에 기술되어 있는 바와 같이 논서프레서 (nonsuppressor) 이. 콜라이 균주 34B8을 파지미드 pMB419 또는 그의 변이체로 형질전환시켰다. 37℃에서 50 μg/mL의 카르베니실린을 함유하는 2YT 5 mL에서 단일 콜로니를 밤새 증식시켰다. 이 배양물을 Chang 등의 문헌 [Gene 55, 189 (1987)]에 기술된 20 μg/mL의 카르베니실린을 함유하는 AP5 배지 200 mL로 희석시키고 30℃에서 26시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 4000 x g에서 펠렛화하고 -20℃에서 2시간 이상 동결시켰다. 이어서 1 mM EDTA를 함유하는 10 mM 트리스-HCl (pH 7.6) 5 mL 세포 펠렛을 재현탁시키고, 4℃에서 90분 동안 진탕시키고, 10,000 x g에서 15분 동안 원심분리하였다. 상층액을 1 mL의 연쇄상구균 단백질 G-세파로스 컬럼 (Pharmacia 제품)에 적용하고 10 mM MES (pH 5.5) 10 mL로 세척하였다. 결합된 Fab 단편을 100 mM 아세트산 2.5 mM로 용출시키고 pH가 8.0인 1 M 트리스-HCl 0.75 mL로 즉시 중화시켰다. Fab 제제의 완충액을 PBS로 교환하고 센트리콘 (Centricon)-30 농축기 (Amicon 제품)를 사용하여 농축시켰다. 대개 Fab의 수율은 단백질 G 정제 후 배양물 1 L 당 약 1 mg이었다. 정제된 Fab 샘플은 전기분무 질량 분광계로 특징을 분석하였으며 농도는 아미노산 분석법으로 측정했다.
인간화 Fab 변이체의 선별
정제된 표지 항원으로 마이크로타이터 플레이트를 코팅한다. 코팅 용액을 버리고, 웰을 블로킹시키고 파지미드 원액을 첨가한다. 일정 시간 후 웰을 세척하고 결합된 파아지를 용출시키고 역가를 측정한다. VEGF-코팅 웰로부터 용출된 나머지 파아지를 다음 선별 사이클에 사용하기 위하여 증식시킨다. 이 공정은 원하는 수의 클론을 얻기 위하여 여러번 되풀이할 수 있다. 예를 들어 수십개의 개별적인 클론을 선별하여 서열결정할 수 있다.
VEGF 결합 친화도의 측정
VEGF에 결합하는 인간화 변이체의 회합 속도 상수 및 해리 속도 상수를 측정한다. 결합 프로파일을 분석하여 가장 큰 친화성을 나타내는 변이체를 선별한다.
인간화 항-VEGF의 투여량
인간화 항-VEGF의 투여량은 Kim 등의 문헌 [Growth Factors 7, 53 (1992)] 및 Kim 등의 문헌 [Nature 362, 841 (1993)]에 기술된 쥐과 항-VEGF에서의 데이터로부터 외삽될 수 있다. 특히 Kim 등은 주 당 2회 10 μg의 적은 양의 VEGF 항체를 투여하여 종양 성장을 현저하게 억제할 수 있음을 증명하였다. 항체 투여량이 50 내지 100 μg일 경우 최대 효과가 얻어졌다.
하기 실시예는 본 발명의 실시를 위한 최량의 형태를 예시하고자 하는 것으로서, 본 발명은 실시예의 구체적인 내용으로 제한되는 것으로 간주되지 않는다.
실시예 I
파지미드 벡터 및 초기 인간화 항-VEGF의 제조
쥐과 항-VEGF mAb A4.6.1은 문헌[Kim et al., Growth Factors, 7, 53 (1992); Kim et al., Nature, 362, 841 (1993)]에 개시되었다. 인간 VLκI-Cκl 경쇄 및 인간 VHIII-CH1γl 중쇄 Fd 단편을 코딩하는 플라스미드 pAK2의 데옥시우리딘 함유 주형을 사용하여 위치지정 돌연변이법에 의해 인간화 A4.6.1의 제1 Fab 변이체인 hu2.0을 제조하였다 (Carter et al., PNAS USA 89, 4285 (1992)). 그래프트되는 A4.6.1 CDR 서열은 본 발명자들이 서열 및 구조 정의, 즉 VH 잔기 26-35 (Chothia et al., J. Mol. Biol. 196, 901 (1987))을 모두 포함시키고자 한 CDR-H1을 제외하고는, 카바트 등의 서열 정의 (Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (5th), Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))에 따라 선택하였다. Fab 코딩 서열을 파지미드 벡터 phGHamg3 내에 서브클로닝하였다 (Bass and Wells, Proteins, 8, 309 (1990); Lowman et al., Biochem. 30, 10832 (1991)). 이 제작물 pMB4-19는 중쇄의 C 말단이 M13 유전자 III 코트 단백질의 카르복실 부분에 정확하게 융합된 초기 인간화 A4.6.1 Fab인 hu2.0을 코딩한다. pMB4-19는 Fab 단편의 모노발런트 표면제시에 대해 상기 설명한 플라스미드인 pDH188과 그 구조가 유사하다 (Garrard et al., Biotechn. 9: 1373-1377 (1991)). pMB4-19와 pDH188 사이의 현격한 차이는 M13 유전자 III 세그먼트가 더 짧고 (코돈 249-406) 항체 중쇄 Fd 단편의 바로 다음에 앰버 정지 코돈이 사용된다는 점 등이다. 이로 인해 이. 콜라이의 supE 서프레서 균주에서 분비형 중쇄 또는 중쇄-유전자 III 융합체의 발현이 가능해 진다.
A4.6.1로부터 유도된 CDR이 인간 VLκI-VHIII 골격 상에 그래프트된 초기 인간화 A4.6.1 Fab 단편 (hu2.0)을 도 1에 도시하였다. hu2.0의 VL 도메인은 서열 7에 나타내었고, hu2.0의 VH 도메인은 서열 10에 나타내었다.
그래프트된 CDR 외의 모든 잔기는 인간 서열로서 유지하였다. 이 초기 인간화 항체의 VEGF에 대한 결합은 검출할 수 없을 정도로 약하였다. 다른 약하게 결합하는 인간화 A4.6.1 변이체 (데이타는 나타내지 않음)의 상대 친화도에 근거할 때, hu2.0의 결합에 대한 KD는 7μM보다 큰 것으로 추정되었다. 이것은 쥐과 A4.6.1로부터 유도된 완전한 VL 및 VH 도메인 및 인간 불변 도메인으로 구성된 키메라 Fab 제작물의 친화도 1.6 nM과 뚜렷한 차이를 보인다. 따라서, hu2.0의 VEGF에 대한 결합은 키메라에 비해 4000배 이상 작았다.
항-VEGF Fab 파지미드 라이브러리의 고안
인간 VLκI-VHIII 골격을 사용할 때 항원 결합을 최적화하기 위해 필요한 골격 변화의 군을 표 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이 선택하였다. 인간화 A4.6.1 파지미드 라이브러리를 문헌[Kunkel et al., Methods Enzymol. 204, 125 (1991)]에 따라 위치지정 돌연변이법에 의해 제조하였다. VH 코돈 24, 37, 67 및 93에서 TAA 정지 트리플렛을 함유하는 pMB4-19의 유도체를 돌연변이 주형(모든 서열 번호는 Kabat 등의 상기 문헌에 따라 지정함)으로서 사용하기 위해 제조하였다. 상기 변형은 야생형 서열에 의한 후속 백그라운드 오염을 억제하기 위한 것이다. 랜덤화 표적 코돈은 4 및 71 (경쇄) 및 24, 37, 67, 69, 71, 73, 75, 76, 78, 93 및 94 (중쇄)이다.
골격 잔기 | 인간 VκLI, VHIII 컨센서스 잔기 | 쥐과 A4.6.1 잔기 | 랜덤화a | |
VL | 4 | Met | Met | Met, Leu |
71 | Phe | Tyr | Phe, Tyr | |
VH | 24 | Ala | Ala | Ala, Val, Thr |
37 | Val | Val | Val, Ile | |
67 | Phe | Phe | Phe, Val, Thr, Leu, Ile, Ala | |
69 | Ile | Phe | Ile, Phe | |
71 | Arg | Leu | Argb, Leub | |
73 | Asp | Thr | Aspb, Thrb | |
75 | Lys | Ala | Lysb, Alab | |
76 | Asn | Ser | Asnb, Serb | |
78 | Leu | Ala | Leu, Ala, Val | |
Phe | 93 | Ala | Ala | Ala, Val, Leu, Thr |
Ser | 94 | Ala | Lys | Arg, Lys |
a: 파지미드 라임브러리에서의 아미노산 다양성 b: 모든 쥐과 (L71/T73/A75/S76) 또는 모든 인간 (R71/D73/K75/N76) VH III 테트라드를 생성시키도록 랜덤화된 VH 71, 73, 75, 76 |
인간화 A4.6.1 파지미드 라이브러리의 고안시의 우려되는 것은 랜덤화에 대한 표적 잔기가 VL 및 VH 서열에 걸쳐 널리 분포한다는 것이다. 합성 올리고뉴클레오티드의 길이가 제한되어 있으므로 이들 각각의 골격 위치의 동시 랜덤화를 이루기 위해서는 다수의 올리고뉴클레오티드의 사용할 수밖에 없다. 그러나, 올리고뉴클레오티드 총수가 증가하면 돌연변이 유발의 효율(즉, 모든 돌연변이성 올리고뉴클레오티드로부터 유래한 서열을 포함하는 돌연변이체의 수득율)이 감소한다. 이 문제를 피하기 위해서, 2개의 특성을 라이브러리 구조에 도입시켰다. 먼저, 가능한 VL 골격 조합체 각각을 코딩하는 상이한 돌연변이 주형 4개를 제조하였다. 이것은 다양성이 제한된 경쇄 골격(단지 4개의 상이한 서열)을 제공하는 간단한 방법이지만, 돌연변이 유발 전략으로부터 2개의 올리고뉴클레오티드에 대한 필요성을 제거한다는 점에서 이점을 갖는다. 다음으로, 126 염기의 2개의 올리고뉴클레오티드를 보다 작은 합성 단편으로부터 미리 회합시켰다. 이것은 2개의 작은 올리고뉴클레오티드보다는 긴 1개의 올리고뉴클레오티드를 사용한 VH 코돈 67, 69, 71, 73, 75, 76, 93 및 94의 랜덤화를 가능하게 하였다. 최종 랜덤 돌연변이 전략은 따라서 4개의 상이한 주형에 대해 2개의 올리고뉴클레오티드만을 동시에 사용하였다.
보다 구체적으로는, 하나의 돌연변이유발성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 중쇄 코돈 67, 69, 71, 73, 75, 76, 78, 93 및 94를 랜덤화하기 위해서 60-mer 및 66-mer 단편을 주형-보조 효소 라이게이션에 의해 2개의 126-mer 올리고뉴클레오티드로 사전 조립했다. 구체적으로는, 1.5 nmol의 5' 포스포릴화 올리고뉴클레오티드 GAT TTC AAA CGT CGT NYT ACT WTT TCT AGA GAC AAC TCC AAA AAC ACA BYT TAC CTG CAG ATG AAC (서열 2) 또는 GAT TTC AAA CGT CGT NYT ACT WTT TCT TTA GAC ACC TCC GCA
AGC ACA BYT TAC CTG CAG ATG AAC (서열 1)을 1.5 nmol의 AGC CTG CGC GCT GAG GAC ACT GCC GTC TAT TAC TGT DYA
ARG TAC CCC CAC TAT TAT GGG (서열 2)와 합하였다. 랜덤화된 코돈은 밑줄로 표시하였고 N은 A/G/T/C를 의미하고, W는 A/T를, B는 G/T/C를, D는 G/A/T를, R은 A/G를, Y는 C/T ('/'는 '또는'을 의미함)를 의미한다. 이어서, 1.5 nmol의 주형 올리고뉴클레오티드 CTC AGC GCG CAG GCT GTT CAT CTG CAG GTA (서열 3)을 서열 12 및 1의 5' 말단과 서열 3의 3' 말단에 상보성인 서열과 함께 첨가하여 라이게이션 연결부의 각 말단에서 혼성화시켰다. 이 혼합물에 Taq 리가아제 (New England Biolabs사의 열안정성 리가아제) 및 완충액을 첨가하고, 반응 혼합물을 40회 열순환 (95℃에서 1.25분 및 50℃에서 5분)시켜 라이게이션된 연결부 및 라이게이션되지 않은 연결부 사이에 주형 올리고뉴클레오티드를 순환시켰다. 생성물인 126-mer 올리고뉴클레오티드를 6% 우레아/TBE 폴리아크릴아미드 겔 상에서 정제하고 완충액 중의 폴리아크릴아미드로부터 추출하였다. 2개의 126-mer 생성물을 동일한 비율로 조합하여 에탄올 침전시키고 최종적으로 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA 중에 용해시켰다. 126-mer 올리고뉴클레오티드 혼합 생성물을 504-01로 표지시켰다.
선별한 골격 코돈 (VL 4, 71; VH 24, 37, 67, 69, 71, 73, 75, 76, 93, 94)의 랜덤화는 2 단계로 수행하였다. 먼저, VL 랜덤화는 변형 pMB4-19 주형의 3개의 추가의 유도체를 제조함으로써 달성하였다. 경쇄 내의 골격 코돈 4 및 71은 2개의 돌연변이유발성 올리고뉴클레오티드 GCT GAT ATC CAG TTG ACC CAG TCC CCG (서열 13) 및 TCT GGG ACG GAT TAC ACT CTG ACC ATC (서열 4)를 사용하여 개별적으로 또는 한쌍씩 치환시켰다. 데옥시우리딘 함유 주형을 상기 새로운 유도체 각각으로부터 제조하였다. 원 주형과 함께 상기 4개의 제작물은 4개의 가능한 각각의 경쇄 골격 서열 조합을 코딩하였다 (표 1 참조).
올리고뉴클레오티드 504-01, 2개의 126-mer 올리고뉴클레오티드의 혼합물 및 CGT TTG TCC TGT GCA RYT TCT GGC TAT ACC TTC ACC AAC TAT GGT ATG AAC TGG RTC CGT CAG GCC CCG GGT AAG (서열 5)는 상기한 4개의 주형 각각을 사용하여 중쇄 골격 코돈을 랜덤화하는데 사용하였다. 4개의 라이브러리를 이. 콜라이 XL-1 BLUE CELLS (Stratagene사의 마커 세포)에 전기천공시키고 합하였다. 독립적인 형질전 환체의 총수는 1.2 x 108을 초과하는 것으로 추정되었고, 라이브러리 내의 DNA 최대수보다 약 1,500배 더 큰 것으로 추정되었다.
상기 전략으로부터, 경쇄 내의 잔기 4 및 71, 및 중쇄 내의 잔기 24, 37, 67, 78 및 93은 각각 쥐과 A4.6.1, 인간 VLκI-VHIII 서열 또는 다른 인간 및 쥐과 골격에서 공통적으로 발견되는 서열의 선별이 가능하도록 부분적으로 랜덤화되었다 (표 1). 상기 잔기의 랜덤화는 인간 VLκI-VHIII 컨센서스 또는 A4.6.1 골격 서열 사이에서의 선택에 제한되지 않았다. 오히려, 다른 인간 및 쥐과 골격 서열에서 공통적으로 발견되는 부가의 아미노산을 포함시킴으로써 추가의 다양성에 의해 보다 강한 결합 변이체를 선별할 수 있는 가능성이 존재한다.
중쇄 골격 잔기의 일부는 인간 VHIII 및 쥐과 A4.6.1 골격 서열에 따라 2원 방식으로 랜덤화되었다. 잔기 VH 71, 73, 75 및 76은 항원 결합 부위에 인접한 헤어핀 루프 내에 위치한다. VH 71 및 73의 측쇄는 주로 항체의 정규 구조 내에 파묻혀 있고 CDR-H2 및 CDR-H3의 구조 형성시에 관여한다는 것이 잘 알려져 있다 (Kettleborough et al., Protein Eng. 4, 773 (1991); Carter et al., PNAS USA 89, 4285 (1992); Shalaby et al., J. Exp. Med. 175, 217 (1992)). 다른 한편으로, VH 75 및 76의 측쇄가 용매에 노출된 경우에도 (도 2), 이들 2개의 잔기는 아마도 일부 항체-항원 복합체에서의 직접 항원 접촉에 의해 항원 결합에 영향을 줄 수 있음이 관찰되었다(Eigenbrot, Proteins 18, 49 [1994]). 서열의 근접 및 상호 독립성일 가능성 때문에 VH 71, 73, 75 및 76은 상기 4량체 중에서 단지 2개의 가능한 조합인 모든 인간 VHIII 또는 모든 쥐과 A4.6.1 서열만을 검출할 수 있도록 전체적으로 랜덤화되었다. 최종적으로, VH 잔기 69 및 94가 랜덤화되지만, VHIII 및 A4.6.1 서열을 나타낸다. VH 69 및 94는 이전의 항체 인간화에서 치환되지 않지만, VH III 컨센서스와 A4.6.1 서열 사이에 상이하고(도 1) 적절한 CDR 구조에 잠재적으로 중요하기 때문에 (Foote et al., J. Mol. Biol. 224, 487 (1992)), 이들은 상기 랜덤화 전략에 포함되었다.
파지미드의 표면에 제시된 인간화 A4.6.1 Fab 라이브러리
필라멘트 파아지 표면의 항체 단편의 기능적 제시에 대한 다양한 시스템이 개발되었다 (Winter et al., Ann. Rev. Immunol. 12, 433 (1994)). 이들은 M13 박테리오파아지의 유전자 III 또는 유전자 VIII 코트 단백질에 대한 융합체로서 Fab 또는 단일쇄 Fv (scFv) 단편의 표면제시를 포함한다. 여기서 선택되는 시스템은 Fab 단편이 유전자 III 융합체로서 모노발런트 표면제시된 문헌[Garrard et al., Biotechn. 9, 1373 (1991)]에 기재된 것과 유사하다 (도 3). 이 시스템은 2개의 현저한 특성을 갖는다. 특히, scFv와 달리, Fab 단편은 존재할 경우 아비디티(avidity) 효과에 의해 가장 강한 결합체의 선별을 억제할 수 있는 이량체 종을 형성하는 경향이 없다. 추가적으로, 표면제시되는 단백질의 모노발런트성은 각각의 파지미드 입자에 대한 단백질의 다중 카피의 존재로부터 유래되는 아비디티 효과의 제2의 잠재적인 공급원을 제거한다 (Bass and Wells, Proteins 8, 309 (1990); Lowman et al., Biochemistry 30, 10832 (1991)).
인간화 A4.6.1 Fab 단편을 표면제시하는 파지미드 입자를 이. 콜라이 XL-1 Blue 세포에서 증식시켰다. 랜덤화 pMB4-19 제작물을 보유하는 세포를 50 ㎍/ml 카르베니실린 및 약 1010 M13KO7 헬퍼 파아지 (Viera and Messing, Methods Enzymol. 153, 3 (1987))를 함유하는 25 ml 2YT 배지 중에서 37℃에서 밤새 증식시켰다. 파지미드 원액을 염수 폴리에틸렌 글리콜 용액을 사용한 침전에 의해 배양 상등액으로부터 정제하고, 100 ㎕ PBS (약 1014 파지미드/ml) 중에 재현탁시켰다.
인간화 A4.6.1 Fab 변이체의 선별
정제된 VEGF121 (PBS 중의 10 ㎍/ml 농도의 100 ㎕)를 4℃에서 마이크로타이터 플레이트 웰에 밤새 코팅해 두었다. 코팅 용액을 버리고, 상기 웰 및 비코팅된 웰을 6% 탈지유로 1시간 동안 차단하고 0.05% TWEEN-20(세제)를 함유하는 PBS로 세척하였다. 이어서, 0.1% BSA 및 0.05% TWEEN-20을 함유하는 20 mM Tris (pH 7.5)를 사용하여 파지미드 원액 10 ㎕를 100 ㎕로 희석하여 각 웰에 첨가하였다. 2시간 후에, 웰을 세척하고 결합된 파아지를 0.1 M 글리신 (pH 2.0) 100 ㎕로 용출시키고, 1M Tris pH 8.0 25 ㎕로 중화시켰다. 이의 분취액을 사용하여 용출된 파아지의 수를 적정하였다. VEGF-코팅된 웰로부터 용출된 나머지 파아지를 다음 선별 사이클에 사용하기 위해 증식시켰다. 총 8회의 선별 과정을 수행한 후에, 20개의 클론을 선별하여 서열을 결정하였다 (Sanger et al., PNAS USA 74, 5463 (1977)).
이와 같이, 인간화 A4.6.1 Fab 파지미드 라이브러리로부터의 변이체를 VEGF에 대한 결합을 기초로 하여 선별하였다. VEGF 코팅 대 비코팅 마이크로타이터 플레이트 웰로부터 용출된 파아지에 대한 역가를 비교하여 측정한 기능성 파지미드의 농축도는 7회의 친화도 패닝(panning) 과정까지 증가하였다. 추가의 1회의 선별 과정 후에, 각각의 랜덤화 위치에서 선별된 바람직한 골격 잔기를 확인하기 위해 20개의 클론의 서열을 결정하였다. 표 2에 요약한 바와 같이, 그 결과는 선별된 클론 가운데 강한 컨센서스가 있음을 보여준다. 20개의 클론 중에서 hu2.10으로 명명된 10개는 동일한 DNA 서열을 보유하였다. 랜덤화된 13개의 골격 위치 중에서, 8개의 치환이 hu2.10에서 선별되었다 (VL 71; VH 37, 71, 73, 75, 76, 78 및 94). 흥미로운 사실은, 잔기 VH 37 (Ile) 및 78 (Val)이 인간 VHIII 또는 쥐과 A4.6.1 서열로서 선택되지 않았다는 것이다. 이러한 결과는 일부의 골격 위치가 표적 인간 및 모(母) 쥐과 골격 서열을 넘어서는 다양성 확장에 의해 유리해 질 수 있음을 시사한다.
변이체 | 잔기 치환 VL VH |
4 71 24 37 67 69 71 73 75 76 78 93 94 | |
쥐과 A4.6.1 | M Y A V F F L T A S A A K |
hu2.0 (CDR-그래프트체) | M F A V FI R N K N L AR |
파아지-선별 클론 | |
hu2.1 (2) | - Y - I - - - - - - V - K |
hu2.2 (2) | L Y - I - - - - - - V - K |
hu2.6 (1) | L - - I T - L T A S V - K |
hu2.7 (1) | L - - I T - - - - - V - K |
hu2.10 (10) | - Y - I - - L T A S V - K |
hu2.0과 쥐과 A4.6.1 항체 사이의 차이는 밑줄로 표시하였다. 각각의 파아지-선별 서열에 대해 확인된 동일한 클론의 수는 괄호 내에 나타내었다. 파아지-선별 클론의 서열 내의 대쉬는 인간 VLκI-VHIII 골격 서열의 선택 (즉, hu2.0과 같음)을 나타낸다. |
분석된 나머지 10개의 클론 중에는 4개의 다른 특유한 아미노산 서열이 존재하였다 (hu2.1, hu2.2, hu2.6 및 hu2.7). hu2.10 외에도, 이들 모든 클론은 위치 VH 37 (Ile), 78 (Val) 및 94 (Lys)에서 동일한 골격 치환을 함유하지만, 위치 24 및 93에 인간 VHIII 컨센서스 서열을 보유하였다. 4개의 클론은 파아지 ELISA 분석 (Cunningham et al., EMBO J. 13, 2508 (1994))에서 시험했을 때 경쇄 코딩 서열을 상실하였고, VEGF에 결합하지 않았다. 본 발명자들은 때때로 다른 Fab 파지미드 라이브러리 (데이타 미공개)에서 중쇄 또는 경쇄 서열의 상실을 알 수 있었고, 이들 클론은 아마도 발현의 강화를 기초로 하여 선별된 것이다. 이러한 제작물은 종종 선별 사이클의 횟수를 저하시키거나 고체 배지 상에서 라이브러리를 증식시킴으로써 최소화할 수 있다.
VEGF 결합 친화도의 측정
인간화 A4.6.1 Fab 변이체의 VEGF121에 대한 결합 (kon) 및 해리 (koff) 속도 상수는 Pharmacia BIAcore 기구 상에서 표면 플라스몬 공명 (Karlsson et al., J. Immun. Methods 145, 229 (1991))에 의해 측정하였다. VEGF121는 1차 아미노기를 통하여 바이오센서 칩 상에 공유결합에 의해 고정되었다. 인간화 A4.6.1 Fab 변이체의 결합은 PBS/0.05% TWEEN-20 (세제) 중의 Fab 용액을 20 ㎕/분의 유속으로 칩 상에 유동시켜 측정하였다. 각각의 결합 측정 후에, 50 mM HCl 수용액 5 ㎕로 3 ㎕/분의 속도로 세척하여 잔류 Fab를 고정된 리간드로부터 제거하였다. 결합 프로필은 간단한 모노발런트 결합 모델을 사용한 비선형 회귀 분석에 의해 분석하였다 (BIAevaluation 소프트웨어 2.0판, Pharmacia).
파아지-선별 변이체 hu2.1, hu2.2, hu2.6, hu2.7 및 hu2.10을 진탕 플라스크를 사용하여 이. 콜라이 중에서 발현시키고, 단백질 G 친화도 크로마토그래피에 의해 Fab 단편을 페리플라즘 추출물로부터 정제하였다. 이들 5개의 클론에 대한 Fab의 회수 수율은 0.2 (hu2.6) 내지 1.7 mg/l (hu2.1)이었다. 각각의 상기 변이체의 항원(VEGF)에 대한 친화도는 표 3에 도시한 바와 같이 BIAcore 기구 상에서 표면 플라스몬 공명에 의해 측정하였다.
변이체 | kon | koff | kD | kD (mut)/ kD (A4.6.1) |
M-1s-1/104 | 104s-1 | nM | ||
A4.6.1 키메라 | 5.4 | 0.85 | 1.6 | |
hu2.0 | ND | ND | >7000** | >4000 |
파아지 선별 클론 | ||||
hu2.1 | 0.70 | 18 | 260 | 170 |
hu2.2 | 0.47 | 16 | 340 | 210 |
hu2.6 | 0.67 | 4.5 | 67 | 40 |
hu2.7 | 0.67 | 24 | 360 | 230 |
hu2.10 | 0.63 | 3.5 | 55 | 35 |
*hu2.10V | 2.0 | 1.8 | 9.3 | 5.8 |
*hu2.10V = 돌연변이 VL Leu46 → Val을 갖는 hu2.10; Biacore 결합 측정에서의 추정된 오차는 ±25%이다. **는 측정하기에 너무 약함, 보다 낮은 결합 추정치. |
상기 결합 데이타의 분석은 컨센서스 클론 hu2.10이 시험된 5개의 변이체 중에서 VEGF에 대한 가장 강한 친화도를 보유함을 보여주었다. 따라서, 본 발명의 Fab 파지미드 라이브러리는 가장 강한 결합 클론에 대해 선택적으로 농축되었다. hu2.10에 대한 KD 계산치는 55 nM로서 골격 변화를 함유하지 않는 hu2.0 (KD > 7 μM)보다 125배 이상 더 강했다. 다른 4개의 선별된 변이체는 모두 VEGF에 대한 보다 약한 결합을 보였고, 가장 약한 것(hu2.7)은 360 nM의 KD를 보였다. 흥미로운 사실은, hu2.6에 대한 KD인 67 nM은 hu2.10의 것보다 단지 경미하게 더 작고, 이 클론의 1 카피만이 서열결정된 20개의 클론 중에서 발견되었다. 이것은 상기 변이체의 가용성 Fab를 발현할 경우에 가장 낮은 발현 및 표면제시 수준에 의한 것일 수 있다. 그러나, 낮은 발현율에도 불구하고, 이 변이체는 인간화 항체로서 유용하다.
인간화 변이체 hu2.10의 추가의 잇점
초기 인간화 변이체보다 항원 친화도에 대한 큰 개선에도 불구하고, hu2.10의 VEGF에 대한 결합은 쥐과 A4.6.1 VL 및 VH 도메인을 함유하는 키메라 Fab 단편보다 여전히 35배 더 약하였다. 이러한 상당한 차이는 추가의 돌연변이를 통하여 인간화 골격에 대해 추가로 최적화시킬 수 있다는 것을 시사하였다. 문헌[Foote et al., J. Mol. Biol. 196, 901 (1992)]에서 확인된 버니어(vernier) 잔기 중에서, 단지 잔기 VL 46, VH 2 및 VH 48만이 A4.6.1 대 인간 VLκI-VHIII 골격에서 상이하였지만 (도 1), 본 파지미드 라이브러리에서 랜덤화되지 않았다. 인간화 A4.6.1 Fv 단편의 분자 모델은 VL 46이 VL-VH 계면에 존재하고, CDRH3의 구조에 영향을 줄 수 있다는 것을 보여주었다. 또한, 상기 아미노산은 대부분의 VLκ 골격에서 거의 항상 류신이었지만(Kabat et al., 상기 문헌), A4.6.1에서는 발린이었다. 따라서, Leu → Val 치환은 hu2.10의 백그라운드에서의 상기 위치에서 이루어졌다. 상기 새로운 변이체에 대한 결합 동력학에 대한 분석은 VEGF 결합에 대한 KD가 추가로 6배 개선되었음을 나타내었다. hu2.10V에 대한 KD(9.3 nM)은 따라서 키메라보다 6배까지 더 컸다. 쥐과 A4.6.1로부터의 대응하는 잔기로 VH 2 또는 VH 48을 치환한 경우에는 VL 46과 대조적으로, hu2.10의 결합 친화도의 개선이 관찰되지 않았다.
흥미로운 것은, 친화도의 마지막 변화 전의 개선의 일부가 회합 속도 상수(kon)의 증가에 의한 것이고, 이것은 VL 46이 항원 결합에 대해 보다 안정한 구조로 항체 구조를 예비구성함에 있어 일정 역할을 수행할 수 있음을 시사한다. 항원 결합에 영향을 미치는 다른 돌연변이는 일차적으로 결합에 대한 해리 속도 상수(koff)의 변화에 의한 것이었다. hu2.1과 hu2.10을 비교한 결과, VH 잔기 71, 73, 75, 76을 A4.6.1 서열로 치환하면 친화도가 5배 개선됨을 알았다. VL 71의 A4.6.1 서열로의 전환 (Phe → Tyr)은 결합에 대한 무시할 수 있는 효과를 갖지만(hu2.2 대 hu2.7), VL 4에 류신을 갖는 변이체는 A4.6.1과 인간 VLκI 골격 모두의 천연 잔기인 메티오닌을 갖는 것보다 약간 더 약하게 (2배 미만) 결합하였다 (hu2.2 대 hu2.1). 여기서 나타내지 않은 다른 인간화 A4.6.1 변이체의 비교 결과는 VH Arg → Lys 변화가 이 잔기의 항원에 대한 직접 접촉 또는 CDR-H3의 적절한 구조 유지에 있어서의 구조적 역할에 의해 KD를 5배 개선시켰음을 보여주었다. 변이체 hu2.6은 컨센서스 클론 hu2.10에 비해 3개의 상이한 서열을 갖지만, 그럼에도 불구하고 유사한 KD를 갖기 때문에, 3개의 치환이 항원 결합에 대해 거의 영향을 주지 않는다는 것을 시사한다. VL 4 및 71에서의 보존적 변화의 무시할 수 있는 효과는 다른 변이체의 결합 데이타와 일치하지만, VH 67의 변화 (Phe → Tyr)는 결합에 대해 거의 영향을 주지 않았다.
결론
상기 설명은 본 발명의 실시에 사용될 수 있는 구체적인 방법을 상세히 나타낸 것이다. 상기 구체적인 방법을 통하여 당업계의 숙련가는 본 발명의 결과를 사용하여 동일한 정보에 귀착되는 또다른 신뢰할 수 있는 방법을 충분히 알 수 있을 것이다. 따라서, 명세서에서 상세하게 설명된 내용이 전체적인 본 발명을 제한하는 것으로 간주되어서는 안되며, 본 발명의 범위는 첨부되는 청구의 범위의 구조에 의해서만 결정되어야 할 것이다. 본원에서 인용된 모든 문헌은 참고를 위해 본원에 포함된 것이다.
(1) GENERAL INFORMATION:
(i) APPLICANT: GENENTECH, INC.
(ii) TITLE OF INVENTION: HUMANIZED ANTIBODIES AND METHODS FOR
FORMING HUMANIZED ANTIBODIES
(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 14
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(ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION:
(A) TELEPHONE: (415) 781-1989
(B) TELEFAX: (415) 398-3249
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:1:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 66 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: unknown
(D) TOPOLOGY: unknown
(ii) MOLECULE TYPE: DNA
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GATTTCAAAC GTCGTNYTAC TWTTTCTTTA GACACCTCCG CAAGCACABY TTACCTGCAG 60
ATGAAC 66
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(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 60 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
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(D) TOPOLOGY: unknown
(ii) MOLECULE TYPE: DNA
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AGCCTGCGCG CTGAGGACAC TGCCGTCTAT TACTGTDYAA RGTACCCCCA CTATTATGGG 60
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(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: unknown
(D) TOPOLOGY: unknown
(ii) MOLECULE TYPE: DNA
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CTCAGCGCGC AGGCTGTTCA TCTGCAGGTA 30
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(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 27 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
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(D) TOPOLOGY: unknown
(ii) MOLECULE TYPE: DNA
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TCTGGGACGG ATTACACTCT GACCATC 27
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(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 75 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
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(D) TOPOLOGY: unknown
(ii) MOLECULE TYPE: DNA
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CGTTTGTCCT GTGCARYTTC TGGCTATACC TTCACCAACT ATGGTATGAA CTGGRTCCGT 60
CAGGCCCCGG GTAAG 75
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(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 107 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) STRANDEDNESS: unknown
(D) TOPOLOGY: unknown
(ii) MOLECULE TYPE: protein
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:6:
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ile Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
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(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 107 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) STRANDEDNESS: unknown
(D) TOPOLOGY: unknown
(ii) MOLECULE TYPE: protein
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:7:
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:8:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 107 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) STRANDEDNESS: unknown
(D) TOPOLOGY: unknown
(ii) MOLECULE TYPE: protein
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:8:
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:9:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 123 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) STRANDEDNESS: unknown
(D) TOPOLOGY: unknown
(ii) MOLECULE TYPE: protein
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:9:
Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Gln Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:10:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 123 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) STRANDEDNESS: unknown
(D) TOPOLOGY: unknown
(ii) MOLECULE TYPE: protein
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:10:
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:11:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 123 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(C) STRANDEDNESS: unknown
(D) TOPOLOGY: unknown
(ii) MOLECULE TYPE: protein
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:11:
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
Asn Tyr Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr
50 55 60
Ala Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser
65 70 75
Ala Ser Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser
95 100 105
Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
110 115 120
Val Ser Ser
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:12:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 66 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: unknown
(D) TOPOLOGY: unknown
(ii) MOLECULE TYPE: DNA
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:12:
GATTTCAAAC GTCGTNYTAC TWTTTCTAGA GACAACTCCA AAAACACABY TTACCTGCAG 60
ATGAAC 66
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:13:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 27 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: unknown
(D) TOPOLOGY: unknown
(ii) MOLECULE TYPE: DNA
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:13:
GCTGATATCC AGTTGACCCA GTCCCCG 27
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:14:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 6072 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: unknown
(D) TOPOLOGY: unknown
(ii) MOLECULE TYPE: DNA
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: misc_feature
(B) LOCATION: 459..460
(D) OTHER INFORMATION: /note= "Light chain begins at base no. 459."
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: misc_feature
(B) LOCATION: 1101..1102
(D) OTHER INFORMATION: /note= "Light chain terminates at base no. 1101."
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: misc_feature
(B) LOCATION: 1254..1255
(D) OTHER INFORMATION: /note= "Heavy chain begins at base
no. 1254."
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: misc_feature
(B) LOCATION: 2424..2425
(D) OTHER INFORMATION: /note= "Heavy chain terminates at
base no. 2424."
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:14:
GAATTCAACT TCTCCATACT TTGGATAAGG AAATACAGAC ATGAAAAATC TCATTGCTGA 60
GTTGTTATTT AAGCTTTGGA GATTATCGTC ACTGCAATGC TTCGCAATAT GGCGCAAAAT 120
GACCAACAGC GGTTGATTGA TCAGGTAGAG GGGGCGCTGT ACGAGGTAAA GCCCGATGCC 180
AGCATTCCTG ACGACGATAC GGAGCTGCTG CGCGATTACG TAAAGAAGTT ATTGAAGCAT 240
CCTCGTCAGT AAAAAGTTAA TCTTTTCAAC AGCTGTCATA AAGTTGTCAC GGCCGAGACT 300
TATAGTCGCT TTGTTTTTAT TTTTTAATGT ATTTGTAACT AGAATTCGAG CTCGGTACCC 360
GGGGATCCTC TAGAGGTTGA GGTGATTTTA TGAAAAAGAA TATCGCATTT CTTCTTGCAT 420
CTATGTTCGT TTTTTCTATT GCTACAAACG CGTACGCTGA TATCCAGATG ACCCAGTCCC 480
CGAGCTCCCT GTCCGCCTCT GTGGGCGATA GGGTCACCAT CACCTGCAGC GCAAGTCAGG 540
ATATTAGCAA CTATTTAAAC TGGTATCAAC AGAAACCAGG AAAAGCTCCG AAAGTACTGA 600
TTTACTTCAC CTCCTCTCTC CACTCTGGAG TCCCTTCTCG CTTCTCTGGA TCCGGTTCTG 660
GGACGGATTA CACTCTGACC ATCAGCAGTC TGCAGCCAGA AGACTTCGCA ACTTATTACT 720
GTCAACAGTA TAGCACCGTG CCGTGGACGT TTGGACAGGG TACCAAGGTG GAGATCAAAC 780
GAACTGTGGC TGCACCATCT GTCTTCATCT TCCCGCCATC TGATGAGCAG TTGAAATCTG 840
GAACTGCTTC TGTTGTGTGC CTGCTGAATA ACTTCTATCC CAGAGAGGCC AAAGTACAGT 900
GGAAGGTGGA TAACGCCCTC CAATCGGGTA ACTCCCAGGA GAGTGTCACA GAGCAGGACA 960
GCAAGGACAG CACCTACAGC CTCAGCAGCA CCCTGACGCT GAGCAAAGCA GACTACGAGA 1020
AACACAAAGT CTACGCCTGC GAAGTCACCC ATCAGGGCCT GAGCTCGCCC GTCACAAAGA 1080
GCTTCAACAG GGGAGAGTGT TAAGCTGATC CTCTACGCCG GACGCATCGT GGCCCTAGTA 1140
CGCAACTAGT CGTAAAAAGG GTATCTAGAG GTTGAGGTGA TTTTATGAAA AAGAATATCG 1200
CATTTCTTCT TGCATCTATG TTCGTTTTTT CTATTGCTAC AAACGCGTAC GCTGAGGTTC 1260
AGCTGGTGGA GTCTGGCGGT GGCCTGGTGC AGCCAGGGGG CTCACTCCGT TTGTCCTGTG 1320
CAGCTTCTGG CTATACCTTC ACCAACTATG GTATGAACTG GATCCGTCAG GCCCCGGGTA 1380
AGGGCCTGGA ATGGGTTGGA TGGATTAACA CCTATACCGG TGAACCGACC TATGCTGCGG 1440
ATTTCAAACG TCGTTTTACT ATTTCTTTAG ACACCTCCGC AAGCACAGTT TACCTGCAGA 1500
TGAACAGCCT GCGCGCTGAG GACACTGCCG TCTATTACTG TGCAAAGTAC CCCCACTATT 1560
ATGGGAGCAG CCACTGGTAT TTCGACGTCT GGGGTCAAGG AACCCTGGTC ACCGTCTCCT 1620
CGGCCTCCAC CAAGGGCCCA TCGGTCTTCC CCCTGGCACC CTCCTCCAAG AGCACCTCTG 1680
GGGGCACAGC GGCCCTGGGC TGCCTGGTCA AGGACTACTT CCCCGAACCG GTGACGGTGT 1740
CGTGGAACTC AGGCGCCCTG ACCAGCGGCG TGCACACCTT CCCGGCTGTC CTACAGTCCT 1800
CAGGACTCTA CTCCCTCAGC AGCGTGGTGA CCGTGCCCTC CAGCAGCTTG GGCACCCAGA 1860
CCTACATCTG CAACGTGAAT CACAAGCCCA GCAACACCAA GGTCGACAAG AAAGTTGAGC 1920
CCAAATCTTG TGACAAAACT CACCTCTAGA GTGGCGGTGG CTCTGGTTCC GGTGATTTTG 1980
ATTATGAAAA GATGGCAAAC GCTAATAAGG GGGCTATGAC CGAAAATGCC GATGAAAACG 2040
CGCTACAGTC TGACGCTAAA GGCAAACTTG ATTCTGTCGC TACTGATTAC GGTGCTGCTA 2100
TCGATGGTTT CATTGGTGAC GTTTCCGGCC TTGCTAATGG TAATGGTGCT ACTGGTGATT 2160
TTGCTGGCTC TAATTCCCAA ATGGCTCAAG TCGGTGACGG TGATAATTCA CCTTTAATGA 2220
ATAATTTCCG TCAATATTTA CCTTCCCTCC CTCAATCGGT TGAATGTCGC CCTTTTGTCT 2280
TTAGCGCTGG TAAACCATAT GAATTTTCTA TTGATTGTGA CAAAATAAAC TTATTCCGTG 2340
GTGTCTTTGC GTTTCTTTTA TATGTTGCCA CCTTTATGTA TGTATTTTCT ACGTTTGCTA 2400
ACATACTGCG TAATAAGGAG TCTTAATCAT GCCAGTTCTT TTGGCTAGCG CCGCCCTATA 2460
CCTTGTCTGC CTCCCCGCGT TGCGTCGCGG TGCATGGAGC CGGGCCACCT CGACCTGAAT 2520
GGAAGCCGGC GGCACCTCGC TAACGGATTC ACCACTCCAA GAATTGGAGC CAATCAATTC 2580
TTGCGGAGAA CTGTGAATGC GCAAACCAAC CCTTGGCAGA ACATATCCAT CGCGTCCGCC 2640
ATCTCCAGCA GCCGCACGCG GCGCATCTCG GGCAGCGTTG GGTCCTGGCC ACGGGTGCGC 2700
ATGATCGTGC TCCTGTCGTT GAGGACCCGG CTAGGCTGGC GGGGTTGCCT TACTGGTTAG 2760
CAGAATGAAT CACCGATACG CGAGCGAACG TGAAGCGACT GCTGCTGCAA AACGTCTGCG 2820
ACCTGAGCAA CAACATGAAT GGTCTTCGGT TTCCGTGTTT CGTAAAGTCT GGAAACGCGG 2880
AAGTCAGCGC CCTGCACCAT TATGTTCCGG ATCTGCATCG CAGGATGCTG CTGGCTACCC 2940
TGTGGAACAC CTACATCTGT ATTAACGAAG CGCTGGCATT GACCCTGAGT GATTTTTCTC 3000
TGGTCCCGCC GCATCCATAC CGCCAGTTGT TTACCCTCAC AACGTTCCAG TAACCGGGCA 3060
TGTTCATCAT CAGTAACCCG TATCGTGAGC ATCCTCTCTC GTTTCATCGG TATCATTACC 3120
CCCATGAACA GAAATTCCCC CTTACACGGA GGCATCAAGT GACCAAACAG GAAAAAACCG 3180
CCCTTAACAT GGCCCGCTTT ATCAGAAGCC AGACATTAAC GCTTCTGGAG AAACTCAACG 3240
AGCTGGACGC GGATGAACAG GCAGACATCT GTGAATCGCT TCACGACCAC GCTGATGAGC 3300
TTTACCGCAG GATCCGGAAA TTGTAAACGT TAATATTTTG TTAAAATTCG CGTTAAATTT 3360
TTGTTAAATC AGCTCATTTT TTAACCAATA GGCCGAAATC GGCAAAATCC CTTATAAATC 3420
AAAAGAATAG ACCGAGATAG GGTTGAGTGT TGTTCCAGTT TGGAACAAGA GTCCACTATT 3480
AAAGAACGTG GACTCCAACG TCAAAGGGCG AAAAACCGTC TATCAGGGCT ATGGCCCACT 3540
ACGTGAACCA TCACCCTAAT CAAGTTTTTT GGGGTCGAGG TGCCGTAAAG CACTAAATCG 3600
GAACCCTAAA GGGAGCCCCC GATTTAGAGC TTGACGGGGA AAGCCGGCGA ACGTGGCGAG 3660
AAAGGAAGGG AAGAAAGCGA AAGGAGCGGG CGCTAGGGCG CTGGCAAGTG TAGCGGTCAC 3720
GCTGCGCGTA ACCACCACAC CCGCCGCGCT TAATGCGCCG CTACAGGGCG CGTCCGGATC 3780
CTGCCTCGCG CGTTTCGGTG ATGACGGTGA AAACCTCTGA CACATGCAGC TCCCGGAGAC 3840
GGTCACAGCT TGTCTGTAAG CGGATGCCGG GAGCAGACAA GCCCGTCAGG GCGCGTCAGC 3900
GGGTGTTGGC GGGTGTCGGG GCGCAGCCAT GACCCAGTCA CGTAGCGATA GCGGAGTGTA 3960
TACTGGCTTA ACTATGCGGC ATCAGAGCAG ATTGTACTGA GAGTGCACCA TATGCGGTGT 4020
GAAATACCGC ACAGATGCGT AAGGAGAAAA TACCGCATCA GGCGCTCTTC CGCTTCCTCG 4080
CTCACTGACT CGCTGCGCTC GGTCGTTCGG CTGCGGCGAG CGGTATCAGC TCACTCAAAG 4140
GCGGTAATAC GGTTATCCAC AGAATCAGGG GATAACGCAG GAAAGAACAT GTGAGCAAAA 4200
GGCCAGCAAA AGGCCAGGAA CCGTAAAAAG GCCGCGTTGC TGGCGTTTTT CCATAGGCTC 4260
CGCCCCCCTG ACGAGCATCA CAAAAATCGA CGCTCAAGTC AGAGGTGGCG AAACCCGACA 4320
GGACTATAAA GATACCAGGC GTTTCCCCCT GGAAGCTCCC TCGTGCGCTC TCCTGTTCCG 4380
ACCCTGCCGC TTACCGGATA CCTGTCCGCC TTTCTCCCTT CGGGAAGCGT GGCGCTTTCT 4440
CATAGCTCAC GCTGTAGGTA TCTCAGTTCG GTGTAGGTCG TTCGCTCCAA GCTGGGCTGT 4500
GTGCACGAAC CCCCCGTTCA GCCCGACCGC TGCGCCTTAT CCGGTAACTA TCGTCTTGAG 4560
TCCAACCCGG TAAGACACGA CTTATCGCCA CTGGCAGCAG CCACTGGTAA CAGGATTAGC 4620
AGAGCGAGGT ATGTAGGCGG TGCTACAGAG TTCTTGAAGT GGTGGCCTAA CTACGGCTAC 4680
ACTAGAAGGA CAGTATTTGG TATCTGCGCT CTGCTGAAGC CAGTTACCTT CGGAAAAAGA 4740
GTTGGTAGCT CTTGATCCGG CAAACAAACC ACCGCTGGTA GCGGTGGTTT TTTTGTTTGC 4800
AAGCAGCAGA TTACGCGCAG AAAAAAAGGA TCTCAAGAAG ATCCTTTGAT CTTTTCTACG 4860
GGGTCTGACG CTCAGTGGAA CGAAAACTCA CGTTAAGGGA TTTTGGTCAT GAGATTATCA 4920
AAAAGGATCT TCACCTAGAT CCTTTTAAAT TAAAAATGAA GTTTTAAATC AATCTAAAGT 4980
ATATATGAGT AAACTTGGTC TGACAGTTAC CAATGCTTAA TCAGTGAGGC ACCTATCTCA 5040
GCGATCTGTC TATTTCGTTC ATCCATAGTT GCCTGACTCC CCGTCGTGTA GATAACTACG 5100
ATACGGGAGG GCTTACCATC TGGCCCCAGT GCTGCAATGA TACCGCGAGA CCCACGCTCA 5160
CCGGCTCCAG ATTTATCAGC AATAAACCAG CCAGCCGGAA GGGCCGAGCG CAGAAGTGGT 5220
CCTGCAACTT TATCCGCCTC CATCCAGTCT ATTAATTGTT GCCGGGAAGC TAGAGTAAGT 5280
AGTTCGCCAG TTAATAGTTT GCGCAACGTT GTTGCCATTG CTGCAGGCAT CGTGGTGTCA 5340
CGCTCGTCGT TTGGTATGGC TTCATTCAGC TCCGGTTCCC AACGATCAAG GCGAGTTACA 5400
TGATCCCCCA TGTTGTGCAA AAAAGCGGTT AGCTCCTTCG GTCCTCCGAT CGTTGTCAGA 5460
AGTAAGTTGG CCGCAGTGTT ATCACTCATG GTTATGGCAG CACTGCATAA TTCTCTTACT 5520
GTCATGCCAT CCGTAAGATG CTTTTCTGTG ACTGGTGAGT ACTCAACCAA GTCATTCTGA 5580
GAATAGTGTA TGCGGCGACC GAGTTGCTCT TGCCCGGCGT CAACACGGGA TAATACCGCG 5640
CCACATAGCA GAACTTTAAA AGTGCTCATC ATTGGAAAAC GTTCTTCGGG GCGAAAACTC 5700
TCAAGGATCT TACCGCTGTT GAGATCCAGT TCGATGTAAC CCACTCGTGC ACCCAACTGA 5760
TCTTCAGCAT CTTTTACTTT CACCAGCGTT TCTGGGTGAG CAAAAACAGG AAGGCAAAAT 5820
GCCGCAAAAA AGGGAATAAG GGCGACACGG AAATGTTGAA TACTCATACT CTTCCTTTTT 5880
CAATATTATT GAAGCATTTA TCAGGGTTAT TGTCTCATGA GCGGATACAT ATTTGAATGT 5940
ATTTAGAAAA ATAAACAAAT AGGGGTTCCG CGCACATTTC CCCGAAAAGT GCCACCTGAC 6000
GTCTAAGAAA CCATTATTAT CATGACATTA ACCTATAAAA ATAGGCGTAT CACGAGGCCC 6060
TTTCGTCTTC AA 6072
Claims (29)
- 비인간 항체의 상보적 결정 영역 (CDR)이 VLκ 하위군 I (VLκI) 골격 및 VH 하위군 III (VHIII) 골격을 포함하는 인간 항체 골격에 그래프트되어 서열 7을 포함하는 경쇄 가변영역 서열 및 서열 10을 포함하는 중쇄 가변영역 서열을 이루며,VL 도메인 중 대표적으로 매겨진 번호인 4 및 71번 잔기 중 적어도 하나가 각각 류신 및 티로신으로 치환되고,VH 도메인 중 대표적으로 매겨진 번호인 37, 67, 69, 71, 73, 75, 76, 78 및 94번 잔기 중 3개 이상이 각각 이소류신, 트레오닌, 페닐알라닌, 류신, 트레오닌, 알라닌, 세린, 발린 및 라이신으로 치환되고,상기 잔기 번호 매김은 하기 카바트 (Kabat) 번호 매김에 따른 것인, 인간화 (humanized) 항-혈관 내피 성장인자 항체.
- 제1항에 있어서, 상기 VL 도메인이 서열 8에 기재된 서열을 갖고, VH 도메인이 서열 11에 기재된 서열을 갖는 것인 인간화 항체.
- 제1항에 있어서, 상기 VL 도메인이 서열 8에 기재된 서열을 갖되, 서열 8의 46번 잔기인 류신이 발린으로 치환된 것이고, 상기 VH 도메인이 서열 11에 기재된 서열을 갖는 것인 인간화 항체.
- 제1항에 있어서, 상기 VL 도메인이 서열 8에 기재된 서열을 갖고, VH 도메인이 서열 11에 기재된 서열을 갖되, 서열 8에서 4번 잔기인 메티오닌이 류신으로 치환되고, 71번 잔기인 티로신이 페닐알라닌으로 치환되고, 서열 11에서 67번 잔기인 페닐알라닌이 트레오닌으로 치환된 것인 인간화 항체.
- 제1항에 있어서, 상기 VL 도메인이 서열 7에 기재된 서열을 갖고, VH 도메인이 서열 10에 기재된 서열을 갖되, 서열 7에서 71번 잔기인 페닐알라닌이 티로신으로 치환되고, 서열 10에서 37번 잔기인 발린이 이소류신으로 치환되고, 78번 잔기인 류신이 발린으로 치환되고, 94번 잔기인 아르기닌이 라이신으로 치환된 것인 인간화 항체.
- 제1항에 있어서, 상기 VL 도메인이 서열 7에 기재된 서열을 갖고, VH 도메인이 서열 10에 기재된 서열을 갖되, 서열 7에서 4번 잔기인 메티오닌이 류신으로 치환되고, 71번 잔기인 페닐알라닌이 티로신으로 치환되고, 서열 10에서 37번 잔기인 발린이 이소류신으로 치환되고, 78번 잔기인 류신이 발린으로 치환되고, 94번 잔기인 아르기닌이 라이신으로 치환된 것인 인간화 항체.
- 제1항에 있어서, 상기 VL 도메인이 서열 7에 기재된 서열을 갖고, VH 도메인이 서열 10에 기재된 서열을 갖되, 서열 7에서 4번 잔기인 메티오닌이 류신으로 치환되고, 서열 10에서 37번 잔기인 발린이 이소류신으로, 67번 잔기인 페닐알라닌이 트레오닌으로, 78번 잔기인 류신이 발린으로, 94번 잔기인 아르기닌이 라이신으로 치환된 것인 인간화 항체.
- 비인간 항체의 상보적 결정 영역 (CDR)을 VLκ 하위군 I (VLκI) 골격 및 VH 하위군 III (VHIII) 골격을 포함하는 인간 항체 골격에 그래프트시켜 서열 7을 포함하는 경쇄 가변영역 서열 및 서열 10을 포함하는 중쇄 가변영역 서열을 이루는 단계,VL 도메인에서 잔기 4 및 71 중 적어도 하나를 각각 류신 및 티로신으로 치환하는 단계, 및VH 도메인에서 잔기 37, 67, 69, 71, 73, 75, 76, 78 및 94 중 3 개 이상을 각각 이소류신, 트레오닌, 페닐알라닌, 류신, 트레오닌, 알라닌, 세린, 발린 및 라이신으로 치환하는 단계를 포함하고, 상기 잔기 번호 매김이 하기 카바트 (Kabat) 번호 매김에 따른 것인, 비인간 항-혈관 내피 성장인자 항체의 인간화 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 VL 도메인이 서열 8에 기재된 서열을 갖고, VH 도메인이 서열 11에 기재된 서열을 갖는 것인 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 VL 도메인이 서열 8에 기재된 서열을 갖되, 서열 8의 46번 잔기인 류신이 발린으로 치환된 것이고, 상기 VH 도메인이 서열 11에 기재된 서열을 갖는 것인 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 VL 도메인이 서열 8에 기재된 서열을 갖고, VH 도메인이 서열 11에 기재된 서열을 갖되, 서열 8에서 4번 잔기인 메티오닌이 류신으로 치환되고, 71번 잔기인 티로신이 페닐알라닌으로 치환되고, 서열 11에서 67번 잔기인 페닐알라닌이 트레오닌으로 치환된 것인 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 VL 도메인이 서열 7에 기재된 서열을 갖고, VH 도메인이 서열 10에 기재된 서열을 갖되, 서열 7에서 71번 잔기인 페닐알라닌이 티로신으로 치환되고, 서열 10에서 37번 잔기인 발린이 이소류신으로 치환되고, 78번 잔기인 류신이 발린으로 치환되고, 94번 잔기인 아르기닌이 라이신으로 치환된 것인 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 VL 도메인이 서열 7에 기재된 서열을 갖고, VH 도메인이 서열 10에 기재된 서열을 갖되, 서열 7에서 4번 잔기인 메티오닌이 류신으로 치환되고, 71번 잔기인 페닐알라닌이 티로신으로 치환되고, 서열 10에서 37번 잔기인 발린이 이소류신으로 치환되고, 78번 잔기인 류신이 발린으로 치환되고, 94번 잔기인 아르기닌이 라이신으로 치환된 것인 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 VL 도메인이 서열 7에 기재된 서열을 갖고, VH 도메인이 서열 10에 기재된 서열을 갖되, 서열 7에서 4번 잔기인 메티오닌이 류신으로 치환되고, 서열 10에서 37번 잔기인 발린이 이소류신으로, 67번 잔기인 페닐알라닌이 트레오닌으로, 78번 잔기인 류신이 발린으로, 94번 잔기인 아르기닌이 라이신으로 치환된 것인 방법.
- 제8항에 있어서, 치환된 VL 및 VH 도메인을 파지미드의 표면으로 드러내는 단계,VEGF가 치환된 VL 및 VH 도메인에 결합하는가 여부를 결정하는 단계, 및VEGF에 결합하는 인간화 항체를 선별하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 서열 14에 기재된 서열을 갖는 핵산 분자에 의해 코딩되는 인간화 항체.
- 제1항에 있어서, 상기 VH 도메인의 37번, 78번 및 94번 잔기가 각각 아미노산 이소류신, 발린 및 라이신으로 치환된 것인 인간화 항체.
- 제1항에 있어서, 상기 VH 도메인의 71번, 73번, 75번 및 76번 잔기가 각각 아미노산 류신, 트레오닌, 알라닌 및 세린으로 치환된 것인 인간화 항체.
- 제1항에 있어서, 상기 VL 도메인의 46번 잔기가 아미노산 발린으로 치환된 것인 인간화 항체.
- 제8항에 있어서, 상기 VH 도메인의 37번, 78번 및 94번 잔기가 각각 아미노산 이소류신, 발린 및 라이신으로 치환된 것인 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 VH 도메인의 71번, 73번, 75번 및 76번 잔기가 각각 아미노산 류신, 트레오닌, 알라닌 및 세린으로 치환된 것인 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 VL 도메인의 46번 잔기가 아미노산 발린으로 치환된 것인 방법.
- 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항 또는 제18항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, Fab, Fab1, F(ab1)2 및 Fv로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 단편인 인간화 항체.
- 삭제
- 제8항 내지 제15항 중의 어느 한 항 또는 제22항 내지 제24항 중의 어느 한 항에 있어서, 인간화 항체가 Fab, Fab1, F(ab1)2 및 Fv로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 단편인 방법.
- 삭제
- 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항 또는 제18항 내지 제21항 중의 어느 한 항의 인간화 항체를 포함하는, 유사분열 신호전달(mitogenic signaling)을 억제함으로써 종양 성장을 억제하는 제약 조성물.
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