KR20230157388A - 백신접종의 방법 및 cd47 차단의 용도 - Google Patents

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KR20230157388A
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에릭 한스 맨팅
새트윈더 카우르 싱
하오샤오 주오
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멘두스 비.브이.
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Abstract

본 개시내용은 하향조절된 CD47 경로를 포함하는 백혈병 기원의 변형된 세포를 제공한다. 암 치료 시 단독으로, 또는 CD47 차단과 조합하여 변형된 세포를 사용하기 위한 방법이 또한 제공된다. 백혈병 기원의 변형된 세포를 포함하는 조성물, 이의 약제학적 조성물 및 제형, 및 변형된 세포를 생산하는 방법이 또한 제공된다.

Description

백신접종의 방법 및 CD47 차단의 용도
관련 출원
본 출원은 2021년 3월 12일에 제출된 미국 가출원 번호 63/160,296의 이익을 주장하며, 이는 모든 목적을 위해 그 전문이 참조로 통합된다.
배경기술
암 세포를 표적으로 하고 사멸시키는 면역계를 활성화하여 임상적으로 관련있는 반응을 생산하는 것이 암 연구의 목표였다. 면역요법은 면역 세포 및 암 상에서 발현되는 분자를 표적으로 함으로써 암에 대한 강력한 면역 반응을 유도하는 것을 목표로 한다. 종양-특이적 항원을 식별함으로써 효과적인 암 백신을 개발함에 있어 막대한 노력이 투자되었다. 암 백신은 이러한 항원을 표적으로 하고 파괴하는 면역계의 능력 및 그들을 내보이는 세포를 증대시키도록 설계된다.
그러나, 종양 탈출 메커니즘의 복잡성으로 인해, 통상적인 암 백신은 모든 환자에서 바람직한 면역 반응을 항상 제공하지는 않으며, 이에 따라 면역요법의 효능을 감소시킨다. 추가로, 면역 관문(immune checkpoint)은 면역계를 제어하는 다양한 억제성 장벽을 제시하며, 이는 종양이 면역 저항성을 발달시키는 메커니즘으로서 조절하는 것으로 나타났다. 예를 들어, 제1 면역 관문은 T 세포가 CTLA-4라고 불리는 음성 면역 관문 단백질에 의해 제어될 것으로 관찰되었을 때 발견되었다. CTLA-4는 T 세포의 활성을 정지시켜 이들이 건강한 세포를 우연히 손상시키는 것을 예방하는 것으로 발견되었다.
이런 이유로, 암을 치료하기 위한 신규한 면역요법 접근법에 대한 필요가 당해 분야에 존재한다. 특히, 암을 치료하기 위한 신규한 암 백신접종 접근법에 대한 필요가 존재한다. 본 발명은 이 필요를 처리하고 만족시킨다.
본 개시내용은, 적어도 부분적으로, 특정한 백혈병-유래 세포(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 백혈병 기원의 변형된 세포)가 항원 제시 세포에 의해 효율적으로 처리된다는 발견에 기반한다. 이것은 이러한 백혈병-유래 세포가 세포-기반 백신으로서 대상체에 투여될 때, 대상체의 수지상 세포가 백혈병-유래 세포에 의해 운반된 항원의 소화 및 처리, 및 그후의 국소 및 전신 면역 반응의 자극에 관여된 메커니즘을 지지한다. 백혈병-유래 세포-기반 백신의 면역 자극 능력에 기반하여, 피부, 종양 내 미세환경, 또는 기타 백신접종 부위에의 백신의 투여 후, 백신은 면역 세포를 모집함으로써 면역원성 환경을 유도할 수 있다. 백신 접종의 부위로의 면역 세포의 모집은 시토카인의 분비 및 상주 및 모집된 항원 제시 세포에 의한 백신 구성성분의 식세포작용의 자극을 유도한다.
본원에서 기재된 바와 같이, 백혈병-유래 세포-기반 백신 식세포작용 과정은 백혈병-유래 세포-기반 백신과 항원-제시 세포 사이의 상호작용을 제한하는 중요한 "나를 먹지 마세요" 신호를 제공하는 SIRPα/CD47 경로에 의해 조절되는 것으로 발견되었다. 항-CD47 차단 항체의 사용은 항원 제시 세포에 의한 백혈병-유래 세포의 흡수를 강화하는 것으로 발견되었다. 이것은 세포-기반 백신 및 CD47 차단제가 종양을 면역계에 노출시킴으로써 및 추가로 백혈병-유래 세포 백신의 생물학적 활성을 증대시킴으로써 상승효과적 방식으로 기능하는 작용의 방식을 입증할 수 있다.
본 발명의 예시적인 백혈병-유래 세포 백신은 DCP-001이다. DCP-001은 DCOne 백혈병 세포주로부터 유래된 백신이며, DCOne 세포는 매우 면역원성인 성숙 수지상 세포(mDC) 표현형을 취할 수 있다. DCOne 세포는 다수의 일반적인 종양-연관 항원을 발현한다. DCOne mDC는 DCOne 종양 관련 항원 레퍼토리와 mDC 공동자극 프로파일을 조합하고 비증식성, 동결된, 방사선 조사된 생산물인 DCP-001의 기초를 형성한다. 본원에서 기재된 바와 같이, DCP-001은, DCP-001이 유래된 백혈병 기원과 상이한 기원임에도 불구하고 고형 종양 암(예를 들어, 비-백혈병 암)의 치료에서 예상치 못하게 효율적이다.
본 개시내용은 암으로부터 유래된 세포 기반 백신(예를 들어, DCP-001)의 용도를 기재한다. CD47 면역요법에서의 현재의 개발은 암 세포의 표면 상의 CD47을 차단하는 것에 관한 것인 반면에, 본 개시내용은 암을 치료하는 데에 사용되는 세포의 표면 상의 CD47을 차단하는 것에 관한 CD47 면역요법에 관한 것이다. 예를 들어, 본 개시내용에서의 CD47의 차단은, 특정한 구현예에서, 세포-기반 백신(예를 들어, DCP-001)의 세포의 표면 상의 CD47을 차단하는 것에 관한 것이다.
일 양태에서, 하향조절된 CD47 경로를 포함하는 단리된 변형된 백혈병 기원의 변형된 세포, 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, 하향조절된 CD47 경로는 CD47 경로의 구성원의 격감 및/또는 억제의 결과이다. 특정한 예시적인 구현예에서, CD47 경로의 구성원은 CD47이다. 특정한 예시적인 구현예에서, 하향조절된 CD47 경로는 CD47 및/또는 CD47 경로의 구성원의 격감 및/또는 억제의 결과이다.
특정한 예시적인 구현예에서, 하향조절된 CD47 경로는 CD47 및/또는 CD47 경로의 구성원을 격감시키고/시키거나 억제하는 제제에 의해 매개된다. 특정한 예시적인 구현예에서, CD47 및/또는 CD47 경로의 구성원을 격감시키는 제제는 항체, 소 분자, 소 RNA, 또는 조작된 뉴클레아제 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정한 예시적인 구현예에서, 항체는 항-CD47 항체이다. 특정한 예시적인 구현예에서, 소 RNA는 소 간섭 RNA(siRNA) 또는 마이크로RNA(miRNA)이다. 특정한 예시적인 구현예에서, 조작된 뉴클레아제 시스템은 메가뉴클레아제 시스템, 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 시스템, 전사 활성화인자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN) 시스템, 및 CRISPR 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정한 예시적인 구현예에서, 조작된 뉴클레아제 시스템은 변형된 세포의 CD47 유전자 자리 및/또는 CD47 경로의 구성원의 유전자 자리 내의 삽입 및/또는 결실을 매개한다. 특정한 예시적인 구현예에서, 조작된 뉴클레아제 시스템은 변형된 세포의 CD47 유전자 자리 내의 삽입 및/또는 결실을 매개한다. 특정한 예시적인 구현예에서, 조작된 뉴클레아제 시스템은 CRISPR 시스템이다.
또 다른 양태에서, CD47 유전자 자리 내의 삽입 및/또는 결실을 포함하는 백혈병 기원의 변형된 세포를 포함하는 약제학적 조성물이 제공되며, 여기서 CD47 유전자 자리 내의 삽입 및/또는 결실은 CD47의 하향조절된 발현을 초래한다.
특정한 예시적인 구현예에서, CD47 유전자 자리 내의 삽입 및/또는 결실은 CD47 유전자 자리 내의 이중 가닥 절단의 수선에 의해 매개된다. 특정한 예시적인 구현예에서, 수선은 비-상동성 말단 봉합(NHEJ) 및 상동 인도 수선(HDR)을 통한 것이다.
특정한 예시적인 구현예에서, CD47 유전자 자리 내의 삽입 및/또는 결실은 조작된 뉴클레아제 시스템에 의해 매개된다. 특정한 예시적인 구현예에서, 조작된 뉴클레아제 시스템은 메가뉴클레아제 시스템, 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 시스템, 전사 활성화인자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN) 시스템, 및 CRISPR 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정한 예시적인 구현예에서, 조작된 뉴클레아제 시스템은 CRISPR 시스템이다.
특정한 예시적인 구현예에서, 약제학적 조성물은 CD47 및/또는 CD47 경로의 구성원을 격감시키고/시키거나 억제하는 제제를 추가로 포함한다. 특정한 예시적인 구현예에서, CD47 및/또는 CD47 경로의 구성원을 격감시키고/시키거나 억제하는 제제는 항-CD47 항체이다.
또 다른 양태에서, 백혈병 기원의 변형된 세포 및 항-CD47 항체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
또 다른 양태에서, 하향조절된 CD47 경로를 포함하는 백혈병 기원의 변형된 세포 및 항-CD47 항체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함한다. 특정한 예시적인 구현예에서, 약제학적 조성물은 동결보존제를 추가로 포함한다.
특정한 예시적인 구현예에서, 변형된 세포는 적어도 하나의 종양 연관 항원 또는, 적어도 하나의 종양 연관 항원을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 여기서 종양 연관 항원은 WT-1, MUC-1, RHAMM, PRAME, p53, 및 서바이빈(Survivin)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정한 예시적인 구현예에서, 변형된 세포는 WT-1, MUC-1, PRAME, 및 서바이빈을 포함한다. 특정한 예시적인 구현예에서, 변형된 세포는 외인성 항원을 포함한다. 특정한 예시적인 구현예에서, 외인성 항원은 종양-연관 항원이다. 특정한 예시적인 구현예에서, 변형된 세포는 수지상 세포 표현형을 포함한다. 특정한 예시적인 구현예에서, 변형된 세포는 성숙 수지상 세포 표현형을 포함한다. 특정한 예시적인 구현예에서, 변형된 세포는 염색체 11p15.5 내지 11p12 사이에 유전적 이상(aberration)을 포함한다. 특정한 예시적인 구현예에서, 유전적 이상은 약 16 Mb의 게놈 영역을 포괄한다. 특정한 예시적인 구현예에서, 변형된 세포는 CD34-양성, CD1a-양성, 및 CD83-양성이다. 특정한 예시적인 구현예에서, 변형된 세포는 DC-SIGN, 랑게린(Langerin), CD80, CD86, CD70, CD40, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 표면 마커를 발현한다. 특정한 예시적인 구현예에서, 변형된 세포는 CD34-양성, CD1a-양성, CD83-양성, CD80-양성, CD86-양성, 및 CD40-양성이다. 특정한 예시적인 구현예에서, 변형된 세포는 CD14-음성이다. 특정한 예시적인 구현예에서, 변형된 세포는 DCOne 세포주로부터 유래된다. 특정한 예시적인 구현예에서, 변형된 세포는 비-증식성이다. 특정한 예시적인 구현예에서, 변형된 세포는 방사선 조사되었다.
또 다른 양태에서, 전구체 세포의 미성숙 세포로의 분화를 허용하는 조건 하에서 전구체 세포를 인큐베이션하는 단계; 및 CD47 및/또는 CD47 경로의 구성원을 격감시키고/시키거나 억제하는 제제의 존재 하에서, 및 미성숙 세포의 성숙을 허용하는 조건 하에서 미성숙 세포를 인큐베이션하여, 그럼으로써 하향조절된 CD47 경로를 포함하는 변형된 세포를 생산하는 단계를 포함하는, 하향조절된 CD47 경로를 포함하는 백혈병 기원의 변형된 세포를 생산하는 방법이 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, CD47 및/또는 CD47 경로의 구성원을 격감시키고/시키거나 억제하는 제제는 항체, 소 분자, 소 RNA, 또는 조작된 뉴클레아제 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정한 예시적인 구현예에서, 항체는 항-CD47 항체이다. 특정한 예시적인 구현예에서, 소 RNA는 소 간섭 RNA(siRNA) 또는 마이크로RNA(miRNA)이다.
특정한 예시적인 구현예에서, 조작된 뉴클레아제 시스템은 변형된 세포의 CD47 유전자 자리 및/또는 CD47 경로의 구성원의 유전자 자리 내의 삽입 및/또는 결실을 매개한다. 특정한 예시적인 구현예에서, 조작된 뉴클레아제 시스템은 변형된 세포의 CD47 유전자 자리 내의 삽입 및/또는 결실을 매개한다. 특정한 예시적인 구현예에서, 조작된 뉴클레아제 시스템은 메가뉴클레아제 시스템, 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 시스템, 전사 활성화인자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN) 시스템, 및 CRISPR 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정한 예시적인 구현예에서, 조작된 뉴클레아제 시스템은 CRISPR 시스템이다.
또 다른 양태에서, 전술한 임의의 방법에 의해 생산된 변형된 세포를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함한다. 특정한 예시적인 구현예에서, 약제학적 조성물은 동결보존제를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 전술한 임의의 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 면역 반응의 강화를 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 강화하는 방법이 제공된다. 또 다른 양태에서, 면역 반응의 강화를 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 강화하는 방법에서 사용하기 위한 전술한 임의의 조성물이 제공된다.
또 다른 양태에서, 전술한 임의의 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 암을 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다. 또 다른 양태에서, 암의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 암을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 전술한 임의의 조성물이 제공된다.
또 다른 양태에서, 하향조절된 CD47 경로를 포함하는 백혈병 기원의 변형된 세포를 포함하는 제1 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 면역 반응의 강화를 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 강화하는 방법이 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, 제1 조성물은 CD47 및/또는 CD47 경로의 구성원을 격감시키고/시키거나 억제하는 제제를 추가로 포함한다.
특정한 예시적인 구현예에서, 방법은 CD47을 격감시키고/시키거나 억제하는 제제를 포함하는 제2 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
특정한 예시적인 구현예에서, 제1 조성물 및 제2 조성물은 동시에 투여된다. 특정한 예시적인 구현예에서, 제1 조성물은 제2 조성물 전에 투여된다. 특정한 예시적인 구현예에서, 제1 조성물은 제2 조성물 후에 투여된다.
또 다른 양태에서, 백혈병 기원의 변형된 세포, 및 CD47 및/또는 CD47 경로의 구성원을 격감시키고/시키거나 억제하는 제제를 포함하는 제1 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 면역 반응의 강화를 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 강화하는 방법이 제공된다.
특정한 예시적인 구현예에서, 변형된 세포는 적어도 하나의 종양 연관 항원 또는, 종양 연관 항원을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 여기서 종양 연관 항원은 대상체에서의 종양과 연관되어 있다. 특정한 예시적인 구현예에서, 변형된 세포는 적어도 하나의 종양 연관 항원 또는 종양 연관 항원을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 여기서 종양 연관 항원은 대상체에서의 종양과 연관되어 있지 않다.
특정한 예시적인 구현예에서, 제1 조성물 및/또는 제2 조성물은 근육내, 피하, 정맥내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 피내, 경피, 피부경유, 조직의 간질 공간으로의 전달, 및 비-종양 조직으로의 전달로 이루어진 군으로부터 선택되는 경로를 통해 투여된다.
특정한 예시적인 구현예에서, 제1 조성물 및/또는 제2 조성물은 정맥내로 투여된다. 특정한 예시적인 구현예에서, 제1 조성물 및/또는 제2 조성물은 정맥내 투여를 위해 제조된다. 특정한 예시적인 구현예에서, 제1 조성물 및/또는 제2 조성물은 정맥내 투여에 허용가능한 희석제 또는 용매를 포함한다.
특정한 예시적인 구현예에서, 제1 조성물 및/또는 제2 조성물은 피내로 투여된다. 특정한 예시적인 구현예에서, 제1 조성물 및/또는 제2 조성물은 피내 투여를 위해 제조된다. 특정한 예시적인 구현예에서, 제1 조성물 및/또는 제2 조성물은 피내 투여에 허용가능한 희석제 또는 용매를 포함한다.
특정한 예시적인 구현예에서, 제1 조성물 및/또는 제2 조성물은 근육내로 투여된다. 특정한 예시적인 구현예에서, 제1 조성물 및/또는 제2 조성물은 근육내 투여를 위해 제조된다. 특정한 예시적인 구현예에서, 제1 조성물 및/또는 제2 조성물은 근육내 투여에 허용가능한 희석제 또는 용매를 포함한다.
특정한 예시적인 구현예에서, 제1 조성물 및/또는 제2 조성물은 종양내로 투여된다. 특정한 예시적인 구현예에서, 제1 조성물 및/또는 제2 조성물은 종양내 투여를 위해 제조된다. 특정한 예시적인 구현예에서, 제1 조성물 및/또는 제2 조성물은 종양내 투여에 허용가능한 희석제 또는 용매를 포함한다.
특정한 예시적인 구현예에서, CD47을 격감시키고/시키거나 억제하는 제제는 항체, 소 분자, 소 RNA, 또는 조작된 뉴클레아제 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정한 예시적인 구현예에서, 항체는 항-CD47 항체이다. 특정한 예시적인 구현예에서, 소 RNA는 소 간섭 RNA(siRNA) 또는 마이크로RNA(miRNA)이다.
특정한 예시적인 구현예에서, 조작된 뉴클레아제 시스템은 변형된 세포의 CD47 유전자 자리 및/또는 CD47 경로의 구성원의 유전자 자리 내의 삽입 및/또는 결실을 매개한다. 특정한 예시적인 구현예에서, 조작된 뉴클레아제 시스템은 변형된 세포의 CD47 유전자 자리 내의 삽입 및/또는 결실을 매개한다. 특정한 예시적인 구현예에서, 조작된 뉴클레아제 시스템은 메가뉴클레아제 시스템, 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 시스템, 전사 활성화인자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN) 시스템, 및 CRISPR 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정한 예시적인 구현예에서, 조작된 뉴클레아제 시스템은 CRISPR 시스템이다.
특정한 예시적인 구현예에서, CD47을 격감시키고/시키거나 억제하는 제제는, 항-CD47 항체, CD47-표적화 소 RNA, 또는 CD47-표적화 조작된 뉴클레아제 시스템을 인코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스 벡터를 포함한다. 특정한 예시적인 구현예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 및 단순 헤르페스 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스로부터 유래된다. 특정한 예시적인 구현예에서, CD47-표적화 소 RNA는 소 간섭 RNA(siRNA) 또는 마이크로RNA(miRNA)이다. 특정한 예시적인 구현예에서, CD47-표적화 조작된 뉴클레아제 시스템은 변형된 세포의 CD47 유전자 자리 내의 삽입 및/또는 결실을 매개한다.
특정한 예시적인 구현예에서, CD47-표적화 조작된 뉴클레아제 시스템은 메가뉴클레아제 시스템, 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 시스템, 전사 활성화인자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN) 시스템, 및 CRISPR 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정한 예시적인 구현예에서, CD47-표적화 조작된 뉴클레아제 시스템은 CRISPR 시스템이다.
특정한 예시적인 구현예에서, 변형된 세포는 적어도 하나의 종양 연관 항원 또는, 적어도 하나의 종양 연관 항원을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 여기서 종양 연관 항원은 WT-1, MUC-1, RHAMM, PRAME, p53, 및 서바이빈으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정한 예시적인 구현예에서, 변형된 세포는 WT-1, MUC-1, PRAME, 및 서바이빈을 포함한다. 특정한 예시적인 구현예에서, 변형된 세포는 외인성 항원을 포함한다. 특정한 예시적인 구현예에서, 외인성 항원은 종양-연관 항원이다. 특정한 예시적인 구현예에서, 변형된 세포는 수지상 세포 표현형을 포함한다. 특정한 예시적인 구현예에서, 변형된 세포는 성숙 수지상 세포 표현형을 포함한다. 특정한 예시적인 구현예에서, 변형된 세포는 염색체 11p15.5 내지 11p12 사이에 유전적 이상을 포함한다. 특정한 예시적인 구현예에서, 유전적 이상은 약 16 Mb의 게놈 영역을 포괄한다. 특정한 예시적인 구현예에서, 변형된 세포는 CD34-양성, CD1a-양성, 및 CD83-양성이다. 특정한 예시적인 구현예에서, 변형된 세포는 DC-SIGN, 랑게린, CD80, CD86, CD70, CD40, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 표면 마커를 발현한다. 특정한 예시적인 구현예에서, 변형된 세포는 CD34-양성, CD1a-양성, CD83-양성, CD80-양성, CD86-양성, 및 CD40-양성이다. 특정한 예시적인 구현예에서, 변형된 세포는 CD14-음성이다. 특정한 예시적인 구현예에서, 변형된 세포는 DCOne 세포주로부터 유래된다. 특정한 예시적인 구현예에서, 변형된 세포는 비-증식성이다. 특정한 예시적인 구현예에서, 변형된 세포는 방사선 조사되었다.
특정한 예시적인 구현예에서, 대상체는 이전에 암을 겪었다. 특정한 예시적인 구현예에서, 대상체는 이전에 암에 대해 치료를 받았다. 특정한 예시적인 구현예에서, 대상체는 암의 재발을 겪고 있다.
특정한 예시적인 구현예에서, 암은 종양이다. 특정한 예시적인 구현예에서, 종양은 고형 종양이다. 특정한 예시적인 구현예에서, 고형 종양은 육종, 암종, 및 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정한 예시적인 구현예에서, 대상체는 인간이다. 특정한 예시적인 구현예에서, 대상체는 가축 및/또는 수의학적 건강관리에 적합한 동물이다.
본 발명의 전술한 및 기타 특징 및 장점은 첨부 도면과 함께 취해진 예시적인 구현예의 다음의 상세한 설명으로부터 더욱 완전하게 이해될 것이다.
도 1은 iMoDC에 의한 DCP-001 또는 DCOne 간세포(progenitor; prog)의 흡수 백분율을 나타내는 그래프이다.
도 2는 표시된 바와 같이, PBMC에서 발견된 세포의 특이적 소집단에 의한 DCP-001 또는 DCOne 간세포의 흡수 백분율을 나타내는 그래프이다.
도 3은 표시된 바와 같이, 제제의 존재 하에서 공동배양되었을 때 iMoDC에 의한 DCP-001 또는 DCOne 간세포(prog)의 흡수 백분율을 나타내는 그래프이다.
도 4a-도 4c는 유세포 분석에 의해 결정된 바와 같은 DCP-001 또는 DCOne 간세포(prog)의 표면 상의 포스파티딜세린(PS: 도 4a, 칼레티쿨린(CRT: 도 4b) 또는 CD47(도 4b)의 발현을 나타내는 그래프이다.
도 5a-도 5c는 아넥신-V(도 5a), CRT-특이적 항체(도 5b), 또는 항-CD47 단클론성 항체(도 5c)의 존재 하에서 공동배양되었을 때 iMoDC에 의한 DCP-001 또는 DCOne 간세포(prog)의 흡수 백분율을 나타내는 그래프이다.
도 6a-도 6h는 표시된 바와 같이, DCP-001에 의한 자극 시 PBMC에서의 다양한 전염증성 시토카인 및 케모카인의 분비를 나타내는 그래프이다.
항-CD47 면역요법은 암 세포를 집어삼키는 면역 세포의 식세포 기능을 유발하기 위해, 암 세포의 표면 상의 CD47의 차단을 목표로 하는 최근의 연구의 표적이 되어왔다. 예를 들어, Lu 등, Onco. Targets Ther. (2020) 13: 9323-9331을 참조하며, 이의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 통합된다. 본원에서 기재된 바와 같이, 백혈병-유래 세포-기반 백신(예를 들어, DCP-001) 식세포작용 과정은 백혈병-유래 세포-기반 백신과 항원-제시 세포 사이의 상호작용을 제한하는 중요한 "나를 먹지 마세요" 신호를 제공하는 SIRPα/CD47 경로에 의해 조절되는 것으로 발견되었다. 항-CD47 차단 항체의 사용은 항원 제시 세포에 의한 DCP-001의 흡수를 강화하는 것으로 발견되었다. 이것은 세포-기반 백신 및 CD47 차단제가 종양을 면역계에 노출시킴으로써 및 추가로 DCP-001 백신의 생물학적 활성을 증대시킴으로써 상승효과적 방식으로 기능하는 작용의 방식을 입증할 수 있다.
본원에 기재된 방법은 본원에 개시된 특정한 방법 및 실험 조건에 제한되지 않으며, 그러하여 방법 및 조건은 달라질 수 있다는 사실이 이해되어야 한다. 또한, 본원에서 사용된 용어는 특정한 구현예를 기재하기 위한 목적일 뿐 제한하려는 의도가 아님이 이해될 것이다. 본원에 기재된 방법은 당업자의 기술 내에 있는 통상적인 분자 및 세포생물학적 및 면역학적 기술을 사용한다. 이러한 기술은 당업자에게 널리-공지되어 있으며 과학 문헌에서 설명된다.
A. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 과학적 및 기술적 용어는 당업자에게 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 임의의 잠재적인 모호성이 있는 경우, 본원에 제공된 정의가 임의의 사전 또는 외부의 정의보다 우선한다. 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고 복수 용어는 단수를 포함할 수 있다. "또는"의 사용은 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 용어 "포함하는", 뿐만 아니라 기타 형태, 예컨대 "포함하다" 및 "포함된"의 사용은 제한하는 것이 아니다.
일반적으로, 본원에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용되는 명명법은 당해 분야에 잘-공지되어 있고 일반적으로 사용된다. 본원에서 제공되는 방법 및 기술은 달리 표시되지 않는 한 당해 분야에 잘 공지된 통상적인 방법에 따라 및 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의된 다양한 일반적 및 보다 구체적 참조문헌에서 기재된 바와 같이 일반적으로 수행된다. 효소 반응 및 정제 기술은 당해 분야에서 일반적으로 수행되는 바와 같이 또는 본원에 기재된 바와 같이, 제조업자의 설명서에 따라 수행된다. 본원에 기재된 분석화학, 합성 유기화학, 및 의약 및 약제학적 화학과 관련하여 사용된 명명법, 및 이들의 실험실 절차 및 기술은 당해 분야에 잘-공지되어 있고 일반적으로 사용되는 것들이다. 화학 합성, 화학 분석, 약제학적 조제품(preparation), 제형화, 전달, 및 환자의 치료를 위해 표준 기술이 사용된다.
개시내용을 보다 용이하게 이해할 수 있도록, 선택 용어를 하기에서 정의한다.
관사 "a" 및 "an"은 본원에서 관사의 문법적 대상 중 하나 또는 하나 이상(즉, 적어도 하나)을 지칭하는 데 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 수치적 값, 예컨대 양, 시간적 기간 등을 지칭할 때 "약"은 명시된 값으로부터 ±20% 또는 ±10%, ±5%, ±1%, 및 ±0.1%의 변동을 포괄하는 것을 의미하며, 그러하여 변동은 개시된 방법을 수행하는 데에 적절하다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 질환을 "완화하는" 것은 질환의 하나 이상의 증상의 중증도를 감소시키는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "항원"은 면역 반응을 유발하는 분자로서 정의된다. 이 면역 반응은 항체 생산, 또는 특이적인 면역학적으로-적격(competent) 세포의 활성화 중 어느 하나, 또는 둘 다를 수반할 수 있다. 당업자는 사실상 모든 단백질 또는 펩티드를 포함하는 임의의 거대분자가 항원으로서 역할을 할 수 있다는 사실을 이해할 것이다.
본원에서 기재된 바와 같이 폴리펩티드와 관련하여 사용된 바와 같은 용어 "항원" 또는 "항원성"은 T-세포 수용체, 항체, 또는 특이적인 체액성 및/또는 세포성 면역의 기타 요소에 의해 특이적으로 인식되는 적어도 하나의 에피토프를 함유하는 생물학적 분자를 일반적으로 지칭한다. 예를 들어, 폴리펩티드의 MHC 펩티드 항원 복합체 내로의 세포내 처리 및 그 후의 항원 제시 다음에 전체 분자, 또는 분자의 하나 이상의 일부가 인식될 수 있다. 용어 "항원" 또는 "항원성"은 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나, 또는 그 이상의 폴리펩티드의 항원성 에피토프에 대한 언급을 포함한다.
게다가, 항원은 재조합 또는 게놈 DNA로부터 유래될 수 있다. 당업자는 그러므로 그 용어가 사용되는 바와 같이 면역 반응을 유도하는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 부분적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 DNA가 "항원"을 인코딩한다는 사실을 이해할 것이다. 게다가, 당업자는 항원이 단지 유전자의 전장 뉴클레오티드 서열에 의해서만 인코딩될 필요가 없다는 사실을 이해할 것이다. 더욱이, 당업자는 항원이 "유전자"에 의해 인코딩될 필요가 전혀 없다는 사실을 이해할 것이다. 항원이 생성, 합성될 수 있거나 생물학적 시료로부터 유래될 수 있다는 사실을 용이하게 알 수 있다. 이러한 생물학적 시료는, 이에 제한되지는 않으나 조직 시료, 종양 시료, 세포 또는 생물학적 유체를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "동종이계"는 치료를 필요로 하는 대상체와 관련하여, 유전적으로 유사하지 않고 이런 이유로 면역학적으로 부적합한 살아있는 조직 또는 세포의 관여를 지칭한다. 유전적으로 유사하지 않지만, 본원에 기재된 동종이계 세포, 예를 들어 동종이계 백혈병-유래 세포(예를 들어, 백혈병 기원의 변형된 세포)는 같은 종으로부터 유래된다. 예를 들어, 본원에 기재된, 백혈병 기원의 변형된 세포를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법은 비록 여전히 같은 종이지만, 대상체와 유전적으로 유사하지 않은 백혈병 기원의 변형된 세포의 투여를 지칭한다.
"질환"은 동물이 항상성을 유지할 수 없고, 만약 질환이 개선되지 않으면 동물의 건강이 약화되는 동물의 건강 상태이다. 대조적으로, 동물에서의 "장애"는 동물이 항상성을 유지할 수 있지만, 동물의 건강 상태가 장애의 부재 시에 그럴 것보다 덜 유리한 건강 상태이다. 치료되지 않은 채 남겨져도, 장애가 동물의 건강 상태의 추가의 감소를 반드시 야기하는 것은 아니다.
"유효량" 또는 "치료적으로 유효량"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 본원에서 기재된 바와 같이 특정한 생물학적 결과를 달성하거나 치료적 또는 예방적 이익을 제공하기에 효과적인 화합물, 제형, 물질, 또는 조성물의 양을 지칭한다. 이러한 결과는, 이에 제한되지는 않으나, 포유류에 투여될 때, 본 발명의 조성물의 부재 시 검출되는 면역 반응과 비교하여, 검출가능한 수준의 면역 억제 또는 관용을 야기하는 값을 포함할 수 있다. 면역 반응은 당해 분야에-인식된 다양한 방법에 의해 용이하게 평가될 수 있다. 당업자는 본원에서 투여되는 조성물의 양이 다양할 수 있고 많은 요소, 예컨대 치료되는 질환 또는 병태, 치료되는 포유류의 연령 및 건강 및 물리적 조건, 질환의 중증도, 투여되는 특정한 조성물 등에 기반하여 용이하게 결정될 수 있다는 사실을 이해할 것이다.
"인코딩"은 뉴클레오티드의 정의된 서열(즉, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 아미노산의 정의된 서열 및 그들로부터 생성된 생물학적 특성 중 어느 하나를 갖는, 생물학적 처리 시의 기타 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 역할을 하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 유전자, cDNA, 또는 mRNA중의 뉴클레오티드의 특이적 서열의 내재적 특성을 지칭한다. 이에 따라, 유전자는, 세포 또는 기타 생물학적 시스템에서 그 유전자에 대응하는 전사 및 mRNA의 번역이 단백질을 생산하는 경우에 단백질을 인코딩한다. 뉴클레오티드 서열이 mRNA 서열과 동일하고 대개 서열 목록에서 제공되는 코딩 가닥과, 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로서 사용되는 비-코딩 가닥 둘 다는 그 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 기타 생산물을 인코딩하는 것으로 지칭될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "내인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템의 내부로부터의 또는 내부에서 생산되는 임의의 물질을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "외인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템의 외부로부터 도입된 또는 외부에서 생산되는 임의의 물질을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는 본원에 기재된 바와 같은 방법의 수용체, 즉 세포성 면역 반응을 상승시킬 수 있는 수용체를 지칭하며 포유류이다. 특정한 구현예에서, 대상체는 인간이다. 특정한 구현예에서, 대상체는 가축, 예를 들어, 말, 소, 돼지, 양, 개, 고양이 등이다. 용어 "환자" 및 "대상체"는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 특정한 구현예에서, 대상체는 암(예를 들어, 고형 종양)을 겪고 있는 인간이다. 특정한 구현예에서, 대상체는 암(예를 들어, 고형 종양)을 겪고 있는 가축이다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "치료적"은 치료 및/또는 예방을 의미한다. 치료적 효과는 질환 상태의 억제, 차도 또는 근절에 의해 수득된다.
용어가 본원에서 사용되는 바와 같이, 질환을 "치료하는" 것은 대상체가 경험한 질환 또는 장애의 적어도 하나의 징후 또는 증상의 빈도 또는 중증도를 감소시키는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "종양"은 비정상적으로 높은 속도로 증식하는 세포성 물질, 예를 들어, 조직에 대한 언급을 포함한다. 신생물 세포를 포함하는 성장은 "종양"으로도 또한 공지된 신생물이며, 일반적으로 대상체의 신체에서 뚜렷한 조직 덩어리를 형성한다. 종양은 부분적으로 또는 완전히 결여된, 정상 조직과의 구조적 조직화 및 기능적 조화를 나타낸다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 종양은 조혈 종양뿐만 아니라 고체 종양을 포괄하는 것으로 의도된다. 특정한 구현예에서, 종양은 고형 종양이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "종양"은 종양 미세-환경 또는 종양 부위, 즉, 종양 내의 영역 및 종양성 조직의 바로 외부 영역에 대한 언급을 포함한다. 특정한 구현예에서, 종양 미세-환경 또는 종양 부위는 종양 조직의 경계 내의 영역을 포함한다. 특정한 구현예에서, 종양 미세-환경 또는 종양 부위는 종양의 종양 간질 구획을 포함하며, 이는 본원에서 신생 세포의 원형질막과 새롭게 형성된 신생혈관의 혈관 벽 사이에 놓인 모든 것으로서 정의된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "종양 미세-환경" 또는 "종양 부위"는 종양 바로 주변 영역을 포함하여 종양이 상주하는 대상체 내의 위치를 지칭한다.
종양은 양성(예를 들어, 양성 종양) 또는 악성(예를 들어, 악성 종양 또는 암)일 수 있다. 악성 종양은 크게 3가지 주요 유형으로 분류될 수 있다: 상피 구조로부터 발생하는 것을 암종이라고 부르고, 결합 조직, 예컨대 근육, 연골, 지방 또는 뼈로부터 기원하는 것을 육종이라고 부르며, 면역계의 구성성분을 포함한 조혈 구조(혈액 세포의 형성과 관련된 구조)에 영향을 미치는 것을 백혈병 및 림프종이라고 부른다. 다른 종양은, 이에 제한되지는 않으나, 신경 섬유종증을 포함한다.
고형 종양은 양성 또는 악성일 수 있는 조직의 비정상적인 덩어리이다. 특정한 구현예에서, 고형 종양은 그들을 형성하는 세포의 유형에 따라 명명된다(예컨대, 육종, 암종, 및 림프종). 고형 종양의 예, 예컨대 육종 및 암종은, 이에 제한되지는 않으나, 지방육종, 섬유육종, 연골육종, 골육종, 점액육종, 및 기타 육종, 중피종, 육활막종, 평활근육종, 유윙 종양, 결장암종, 횡문근육종, 췌장암, 악성 림프종, 폐암, 유방암, 전립선암, 난소암, 간세포 암종, 선암종, 기저세포 암종, 한선 암종, 편평상피암종, 수질 갑상선 암종, 크롬친화성 세포종 피지샘 암종, 유두상 갑상선 암종, 유두상 선암종, 유두상 암종, 수질 암종, 기관지 암종, 간종양, 신장 세포 암종, 담도 암종, 윌름스 종양, 융모암, 자궁경부암, 정상피종, 고환암, 방광 암종, 흑색종, CNS 종양(예를 들어, 신경교종, 예를 들어, 뇌간 교종 및 혼합 교종, 교모세포종(예를 들어, 교모세포종 다형체), 배아세포종, 성상세포종, 두개인두종, 수모세포종, 상의세포종, 신경초종, CNS 림프종, 속귀신경집종, 송과체종, 혈관아세포종, 뇌수막종, 희소돌기아교세포종, 망막모세포종, 신경모세포종, 및 뇌 전이암) 등을 포함한다.
본원에 개시된 방법에 의한 요법에 순응할 수 있는 암종은, 이에 제한되지는 않으나, 편평 세포 암종(다양한 조직), 기저세포 암종(파부암의 형태), 식도 암종, 이형 세포 암종(방광의 악성 신생물)을 포함하는 방광 암종, 간세포 암종, 결직장 암종, 기관지 암종, 폐의 소세포 암종 및 비-소세포 암종을 포함하는 폐 암종, 결장 암종, 갑상선 암종, 위 암종, 유방 암종, 난소 암종, 부신겉질샘 암종, 췌장 암종, 한선 암종, 전립선 암종, 유두상 암종, 선암종, 피지샘 암종, 수질 암종, 유두상 선암종, 유방 관상피내 암종 또는 담관 암종, 남샘 암종, 신장 세포 암종, 융모막 암종, 윌름스 종양, 정상피종, 태생성 암종, 자궁경부 암종, 고환 암종, 비인두 암종, 골원성 암종, 상피 암종, 자궁 암종 등을 포함한다.
본원에 개시된 방법에 의한 요법에 순응할 수 있는 육종은, 이에 제한되지는 않으나, 점액육종, 연골육종, 척삭종, 골원성 육종, 지방종, 섬유육종, 혈관육종, 림프관육종, 내피육종, 골육종, 중피종, 유잉육종, 평활근육종, 횡문근육종, 림프관내피육종, 윤활막종, 및 기타 연조직 육종을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "면역원성 조성물"은 상기 면역원에 대한 면역 반응을 필요로 하는 대상체에서 면역원에 대한 특정한 면역 반응을 유도하는 물질을 지칭한다. 조성물은 보조제 및 임의로 하나 이상의 약제학적으로-허용가능한 담체, 부형제 및/또는 희석제를 포함할 수 있다. 특정한 구현예에서, 면역원성 조성물은 본원에서 기재된 바와 같이 백혈병 기원의 변형된 세포를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "면역 반응"은 T-세포 매개 및/또는 B-세포 매개 면역 반응을 포함한다. T 세포의 예시적인 면역 기능은, 예를 들어, 시토카인 생산 및 다른 세포에서의 세포독성의 유도를 포함한다. B-세포 기능은 항체 생산을 포함한다. 더욱이, 용어는 T-세포 활성화에 의해 간접적으로 영향을 받는 면역 반응, 예를 들어, 항체 생산 및 시토카인 반응성 세포, 예를 들어, 대식세포의 활성화를 포함한다. 면역 반응에 관여된 면역 세포는 림프구, 예컨대 B 세포 및 T 세포(CD4+ 및 CD8+ 세포); 항원 제시 세포(예를 들어, 전문 항원 제시 세포, 예컨대 수지상 세포, 대식세포, B 림프구, 랑게르한스 세포, 및 비-전문 항원 제시 세포, 예컨대 케라티노사이트, 내피 세포, 성상세포, 섬유아세포, 희소돌기아교세포); 자연 살해 세포; 골수성 세포, 예컨대 대식세포, 호산구, 비만 세포, 호염기구, 및 과립구를 포함한다. 특정한 구현예에서, 용어는 T-세포 매개 면역 반응을 지칭한다. 면역 반응은 일부 구현예에서 T-세포 의존성 면역 반응일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "종양내"는 물질(예를 들어, 백혈병 기원의 변형된 세포)의 종양 내로의 전달 또는 수송을 지칭한다. 본원에 기재된 바와 같이 종양내 전달 수송의 한 가지 예는 당해 분야에 일반적으로 공지된 투여 경로인 종양내 투여에 의한 것이다. 종양내 투여의 대안적인 경로로서, 물질은 유전자 서열을 종양으로 전달하기 위해 널리 개발된 종양-특이적 담체, 예컨대 종양용해 바이러스 또는 유전자 요법 바이러스를 통해 종양으로 전달될 수 있다. 이러한 비히클의 사용은 종양내 투여에 더하여 다수의 투여 경로, 예컨대 정맥내 또는 복강내 투여를 허용하며, 그후에 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 종양 내로의 전달을 초래한다 예를 들어, Lundstrom, Diseases, 6(2):42 (2018); Alemany, Biomedicines, 2, p.36-49 (2014); Twumasi-Boateng 등, Nature Reviews Cancer 18, p.419-432 (2018)를 참조하며, 이의 개시내용은 그들 전문이 본원에 참조로 통합된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "종양외"는, 예를 들어, 대상체의 신체에서, 종양으로부터 떨어진(예를 들어, 먼) 위치를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "백혈병 기원의 변형된 세포"는 항원을 흡수하고, MHC 부류 I 복합체 또는 MHC 부류 II 복합체와 함께 항원, 또는 이의 면역원성 일부를 제시할 수 있는 백혈병 세포주로부터 유래된 세포를 지칭한다. 특정한 구현예에서, 백혈병 기원의 변형된 세포는 수탁 번호 DSMZ ACC3189로 2012년 11월 15일에 DSMZ와 부다페스트 조약의 조건 하에서 수탁된 바와 같은 세포주 DCOne로부터 유래된 세포이다. 수탁된 DCOne 세포주로부터 성숙 세포를 수득하는 절차는 예를 들어, EP2931878B1에 기재되어 있으며, 이의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 통합된다.
범위: 본 개시내용 전반에 걸쳐, 본 발명의 다양한 양태가 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식으로의 상세한 설명은 단지 편의와 간결성을 위한 것이며 본 발명의 범주에 대한 확고한 제한으로 해석되어서는 안 된다는 사실이 이해되어야 한다. 따라서, 범위의 상세한 설명은 모든 가능한 하위범위 뿐만 아니라 범위 내의 개별적인 수치 값을 구체적으로 개시한 것으로 고려되어야 한다. 예를 들어, 범위의 상세한 설명, 예컨대 1 내지 6은 하위범위, 예컨대 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등, 뿐만 아니라 범위 내의 개별적인 수, 예를 들어, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, 및 6을 구체적으로 개시한 것으로 고려되어야 한다. 이것은 범위의 폭과 관계없이 적용된다.
B. 백혈병 기원의 변형된 세포 및 생산 방법
면역 세포를 자극하고 확장시키고, 항원-특이적 면역 세포를 생성하기 위한, 및 치료의 방법을 위한, 백혈병 기원의 변형된 세포의 사용을 포함하는 방법이 본원에서 제공된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "백혈병 기원의 변형된 세포"는 항원, 예컨대 항원성 폴리펩티드를 흡수할 수 있고, MHC 부류 I 복합체 또는 MHC 부류 II 복합체와 함께, 항원, 또는 이의 면역원성 부분을 제시할 수 있는 세포를 지칭한다. 본원에서 제공되는 백혈병 기원의 변형된 세포는 성숙 수지상 세포 표현형을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "수지상 세포"는 항원, 예컨대 항원성 폴리펩티드를 그 세포 내로 흡수하고, MHC 부류 I 복합체 또는 MHC 부류 II 복합체와 함께, 항원, 또는 이의 면역원성 부분을 제시할 수 있는 전문 항원 제시 세포(APC)를 지칭한다. 성숙 수지상 세포 표현형을 갖는다는 것은 백혈병 기원의 변형된 세포가 성숙 수지상 세포의 것과 유사한 기능을 수행할 수 있다는 것을 의미한다. 용어는 성숙도에 따라 미성숙 수지상 세포("imDC") 및 성숙 수지상 세포("mDC") 둘 다를 포함한다.
특정한 구현예에서, 백혈병 기원의 변형된 세포는 백혈병 세포로부터 유래된다. 특정한 구현예에서, 백혈병 기원의 변형된 세포는 백혈병을 갖는 환자로부터 유래된다. 특정한 구현예에서, 백혈병 기원의 변형된 세포는 백혈병을 갖는 환자의 말초 혈액으로부터 유래된다. 특정한 구현예에서, 백혈병 기원의 변형된 세포는 급성 골수성 백혈병을 갖는 환자의 말초 혈액으로부터 유래된다. 당업자는 백혈병 기원의 변형된 세포가 말초 혈액을 수득한 임의의 환자로부터 유래될 수 있다는 사실을 인식할 것이며, 여기서 환자는 이에 따라 유래된 백혈병 기원의 변형된 세포가 본원에 개시된 특징을 포함함을 고려하여, 임의의 유형의 백혈병을 갖는다.
특정한 구현예에서, 백혈병 기원의 변형된 세포는 CD34-양성, CD1a-양성, 및 CD83-양성이다. 특정한 구현예에서, 백혈병 기원의 변형된 세포는 CD14, DC-SIGN, 랑게린, CD40, CD70, CD80, CD83, CD86, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 표면 마커를 포함한다. 특정한 구현예에서, 백혈병 기원의 변형된 세포는 MHC 부류 I 분자를 포함한다. 특정한 구현예에서, 백혈병 기원의 변형된 세포는 MHC 부류 II 분자를 포함한다.
특정한 구현예에서, 백혈병 기원의 변형된 세포는 염색체 11p15.5 내지 11p12 사이에 유전적 이상을 포함한다. 특정한 구현예에서, 유전적 이상은 약 16 Mb의 게놈 영역(예를 들어, 약 20.7 Mb 내지 약 36.6 Mb)을 포괄한다. 특정한 구현예에서, 유전적 이상은 약 60개의 공지 및 비공지된 유전자의 상실을 함유한다.
특정한 구현예에서, 백혈병 기원의 변형된 세포는 공동-자극 분자를 포함한다. 특정한 구현예에서, 공동-자극 분자는, 제한 없이, MHC 부류 I 분자, BTLA 및 톨(Toll) 리간드 수용체를 포함한다. 공동-자극 분자의 예는 CD70, CD80, CD86, 4-1BBL(CD137-리간드), OX40L, CD30L, CD40, PD-L1, ICOSL, ICAM-1, 림프구 기능-연관 항원 3(LFA3(CD58)), K12/SECTM1, LIGHT, HLA-E, B7-H3 및 CD83을 포함한다.
특정한 구현예에서, 백혈병 기원의 변형된 세포는 적어도 하나의 내인성 항원을 포함한다. 변형된 세포의 백혈병 기원에 따라, 백혈병 기원의 변형된 세포는 백혈병 기원에 특이적인 적어도 하나의 공지된 내인성 항원을 포함할 수 있다. 특정한 구현예에서, 내인성 항원은 종양-연관 항원이다. 특정한 구현예에서, 내인성 종양-연관 항원은 WT-1, RHAMM, PRAME, p53, 서바이빈, 및 MUC-1로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
특정한 구현예에서, 백혈병 기원의 변형된 세포는 외인성 항원 또는 이의 펩티드 단편을 포함한다. 이러한 외인성 항원은 다양한 항원 로딩 전략을 통해 백혈병 기원의 변형된 세포에 제공될 수 있다. 예를 들어, 백혈병 기원의 변형된 세포를 로딩하기 위한 전략은, 제한 없이, 합성 긴 펩티드, mRNA 로딩, 펩티드-펄싱(pulsing), 단백질-로딩, 종양 용해물-로딩, 종양 세포와의 공동배양, RNA/DNA 형질감염 또는 바이러스 형질도입의 사용을 포함할 수 있다. 백혈병 기원의 변형된 세포를 로딩하기 위한 다른 전략은 당업자에게 공지되어 있으며 외인성 항원을 백혈병 기원의 변형된 세포에 로딩하는 데에 사용될 수 있다. 일반적으로, 백혈병 기원의 변형된 세포는 특정한 분자를 통해, 예를 들어, MHC I 또는 MHC II를 통해 외인성 항원을 처리할 것이다. 그러하여, 백혈병 기원의 변형된 세포에 의해 포함되는 외인성 항원은 MHC 부류 I 항원 또는 MHC 부류 II 항원일 수 있다. 특정한 구현예에서, 외인성 항원은 종양-연관 항원이다. 예를 들어, 특정한 구현예에서, 백혈병 기원의 변형된 세포는 NY-ESO-1 펩티드 및/또는 WT-1 펩티드, 또는 종양-독립적 항원, 예컨대 CMVpp65로 로딩된다. 특정한 구현예에서, 외인성 항원은 질환 또는 장애, 예를 들어, 비-암-연관 질환 또는 장애와 연관되어 있다. 임의의 종양-연관 항원, 또는 질환 또는 장애와 연관된 항원이 본원에 기재된 백혈병 기원의 변형된 세포에 제공될 수 있다는 사실이 당업자에 의해 인식될 것이다. 그러하여, 특정한 구현예에서, 백혈병 기원의 변형된 세포는 임의의 종양-연관 항원 또는 당업자가 고려하는 질환 또는 장애와 연관된 항원을 포함한다.
특정한 구현예에서, 외인성 항원은 비-종양-연관 항원(즉, 종양-독립적 항원)이다. 특정한 구현예에서, 백혈병 기원의 변형된 세포는 종양-독립적 항원, 즉, 종양과 연관되지 않은 항원으로 로딩된다. 예를 들어, 적합한 종양-독립적 항원은, 제한 없이, 바이러스, 박테리아, 진균 기원의 단백질; 알레르겐, 독소 및 독, 또는 다양한 공급원의 모델 항원, 예컨대 닭 달걀 난백 알부민 및 메가투라 크레눌라타(Megathura crenulata)인 자이언트 키홀-림펫(giant keyhole limpet)으로부터의 키홀-림펫 헤모사이아닌을 포함한다. 특정한 구현예에서, 적합한 종양-독립적 항원은 박테리아 기원의 것이다. 특정한 구현예에서, 적합한 종양-독립적 항원은 디프테리아 독소이다. 특정한 구현예에서, 적합한 종양-독립적 항원은 디프테리아 독소의 비-독성 변이체이다. 예를 들어, 특정한 구현예에서, 적합한 종양-독립적 항원은 CRM197 또는 이의 변이체이다. 특정한 구현예에서, 백혈병 기원의 변형된 세포는 CRM197 또는 이의 변이체를 포함한다. 특정한 구현예에서, 적합한 종양-독립적 항원은 바이러스 기원의 것이다. 특정한 구현예에서, 적합한 종양-독립적 항원은 거대세포바이러스(CMV)로부터 유래된 펩티드, 예를 들어, CMV 내부 기질 단백질 pp65로부터 유래된 펩티드이다. 특정한 구현예에서, 백혈병 기원의 변형된 세포는 pp65 펩티드를 포함한다. 임의의 종양-독립적 항원이 본원에 기재된 백혈병 기원의 변형된 세포에 제공될 수 있다는 사실이 당업자에 의해 인식될 것이다. 그러하여, 특정한 구현예에서, 백혈병 기원의 변형된 세포는 당업자가 고려하는 임의의 종양-독립적 항원을 포함한다.
특정한 구현예에서, 백혈병 기원의 변형된 세포를 외인성 항원 또는 이의 펩티드 단편으로 로딩하는 것은 광화학 과정(예를 들어, 광화학 내재화)의 사용을 포함한다. 특정한 구현예에서, 백혈병 기원의 변형된 세포를 외인성 항원 또는 이의 펩티드 단편으로 로딩하는 것은 광화학 내재화의 사용으로 달성된다. 특정한 구현예에서, 광화학 내재화는 항원 또는 이의 펩티드 단편(예를 들어, 항원성 폴리펩티드(예를 들어, 비-종양 항원), 또는 항원성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산)의 백혈병 기원의 변형된 세포 내로의 전달을 강화하는 데에 사용될 수 있다.
광화학 내재화는 다른(otherwise) 막-투과성 분자를 세포기질(cytosol) 또는 표적 세포 내로 도입하기 위해 광 및 감광화 작용제의 사용을 수반하지만 표적 세포의 파괴 또는 사멸을 반드시 초래하지 않는 전달 방법을 지칭한다. 이 방법에서, 내재화되거나 이동될 분자는 감광화 작용제와 함께 세포에 적용된다. 세포의 적합한 파장의 광에의 노출은 감광화 작용제를 활성화하여 결과적으로 세포내 구획 막의 파괴로 이어지고 그후에 분자가 세포기질 내로 방출된다. 광화학 내재화에서, 감광화 작용제와 광 사이의 상호작용은 분자의 세포내 흡수가 개선되도록 세포에 영향을 미치는 데에 사용된다. 광화학 내재화 뿐만 아니라 다양한 감광화 작용제는 PCT 공보 번호 WO 96/07432, WO 00/54708, WO 01/18636, WO 02/44396, WO 02/44395, 및 WO 03/020309, 미국 특허 번호 6,680,301, 미국 특허 번호 5,876,989에 기재되어 있으며, 이들의 개시내용은 그들 전문이 본원에 참조로 통합된다. 특정한 구현예에서, 광화학 내재화는 종양 세포의 세포기질 내로 항원을 전달하는 데에 사용된다. 특정한 구현예에서, 광화학 내재화는 종양 세포의 세포기질 내로의 항원의 전달을 강화하는 데에 사용된다.
백혈병 기원의 변형된 세포를 외인성 항원 또는 이의 펩티드 단편으로 로딩하는 것은 임의의 시간에 수행될 수 있다. 당업자는 그들의 필요에 가장 적합하도록 백혈병 기원의 변형된 세포의 로딩의 구체적인 시기를 결정하고 수행할 수 있을 것이다. 예를 들어, 특정한 구현예에서, 백혈병 기원의 변형된 세포는 이의 성숙 수지상 세포 표현형이 나타나기에 앞서 외인성 항원 또는 이의 펩티드 단편으로 로딩된다. 특정한 구현예에서, 백혈병 기원의 변형된 세포는 성숙 수지상 세포 표현형으로의 백혈병 기원의 변형된 세포의 이행 동안 외인성 항원 또는 이의 펩티드 단편으로 로딩된다. 특정한 구현예에서, 백혈병 기원의 변형된 세포는 백혈병 기원의 변형된 세포가 성숙 수지상 세포 유형을 나타낸 후에 외인성 항원 또는 이의 펩티드 단편으로 로딩된다.
특정한 구현예에서, 백혈병 기원의 변형된 세포는 PCT 공보 번호 WO 2014/006058 및 WO 2014/090795에 기재된 바와 같은 세포주 DCOne의 세포이며, 이들 문헌의 개시내용은 그들 전문이 본원에 참조로 통합된다. 특정한 구현예에서, 백혈병 기원의 변형된 세포는 세포주 DCOne의 세포이며 CD34-양성, CD1a-양성, 및 CD83-양성인 성숙 수지상 세포 표현형을 포함한다. 특정한 구현예에서, 백혈병 기원의 변형된 세포는 세포주 DCOne의 세포이며 CD34-양성, CD1a-양성, 및 CD83-양성이다. 특정한 구현예에서, 백혈병 기원의 변형된 세포는 세포주 DCOne의 세포이며 CD14, DC-SIGN, 랑게린, CD80, CD86, CD40, CD70, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 표면 마커를 포함한다. 특정한 구현예에서, 백혈병 기원의 변형된 세포는 세포주 DCOne의 세포이며 MHC 부류 I을 포함한다. 특정한 구현예에서, 백혈병 기원의 변형된 세포는 세포주 DCOne의 세포이며 MHC 부류 II를 포함한다. 특정한 구현예에서, 백혈병 기원의 변형된 세포는 세포주 DCOne의 세포이며 염색체 11p15.5 내지 11p12 사이에 유전적 이상을 포함한다. 특정한 구현예에서, 백혈병 기원의 변형된 세포는 세포주 DCOne의 세포이며 약 16 Mb의 게놈 영역(예를 들어, 약 20.7 Mb 내지 약 36.6 Mb)을 포괄하는 유전적 이상을 포함한다. 특정한 구현예에서, 백혈병 기원의 변형된 세포는 세포주 DCOne의 세포이며 약 60개의 공지된 및 비공지된 유전자의 상실을 함유하는 유전적 이상을 포함한다.
일 양태에서, 본 개시내용의 백혈병 기원의 변형된 세포는 하향조절된 CD47 경로를 포함한다. CD47은 대식세포 및 수지상 세포(DC)를 포함하는 골수성 세포 상에서 발현되는 신호 조절 단백질(SIRP)α에 대한 리간드로서 편재적으로 발현되고 기능한다. CD47은 대식세포가 CD47-결손 세포의 강력한 거부를 매개하도록, 식세포 작용을 예방하는 SIRPα를 통해 대식세포에 "나를 먹지 마세요" 신호를 제공한다. 예를 들어, Li 등, Nature Comm. (2020) 11: 581을 참조하며, 이의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 통합된다. 그러하여, 본원에서 사용되는 바와 같이, "CD47 경로"는 CD47 및 SIRPα를 통한 세포 사이의 커뮤니케이션을 촉진하는 분자의 네트워크를 지칭한다. 이에 따라, 하향조절된 CD47 경로는 CD47과 SIRPα를 통한 세포 사이의 커뮤니케이션을 촉진하는 분자의 네트워크 중 임의의 하나의 하향조절을 지칭한다.
CD47 면역요법에서의 현재의 개발은 암 세포의 표면 상의 CD47을 차단하는 것에 관한 것인 반면에, 본 개시내용은 암을 치료하는 데에 사용되는 세포의 표면 상의 CD47 경로를 하향조절하는 것에 관한 CD47 면역요법에 관한 것이다. 이러한 하향조절은 암을 치료하는 데에 사용되는 세포(예를 들어, 백혈병 기원의 변형된 세포 기반 백신)를 집어삼키는 면역 세포의 능력을 강화하도록 기능한다. 임의의 이론에 얽매이지 않고, 암을 치료하는 데에 사용되는 세포의 흡수를 강화하는 것은 암을 치료하는 데에 사용된 세포의 증가된 효능 및 생물학적 활성을 초래할 수 있다.
특정한 구현예에서, 하향조절된 CD47 경로는 CD47 경로의 구성원의 격감 및/또는 억제의 결과이다. 특정한 구현예에서, CD47 경로의 구성원은 CD47이다. 그러하여, CD47의 격감 및/또는 억제의 결과로서 하향조절된 CD47 경로를 포함하는 백혈병 기원의 변형된 세포가 본원에서 제공된다. 본원에서 기재된 바와 같이, 하향조절된 CD47 경로를 포함하는 백혈병 기원의 변형된 세포(예를 들어, DCP-001)은 항원 제시 세포에 의한 강화된 흡수를 나타내는 것으로 발견되었다. 실시예 2를 참조한다.
특정한 구현예에서, 하향조절된 CD47 경로는 CD47을 격감시키고/시키거나 억제하는 제제에 의해 매개될 수 있다. 제제는 CD47을 격감시키고/시키거나 억제하도록 작용하는, 당해 분야에 공지된 임의의 제제일 수 있다. 예를 들어, 제제는, 제한 없이, 결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체), 소 분자, 소 RNA, 또는 조작된 뉴클레아제 시스템일 수 있다. 특정한 구현예에서, 소 RNA는 소 간섭 RNA(siRNA) 또는 마이크로RNA(miRNA)일 수 있다.
특정한 구현예에서, 하향 조절된 CD47 경로는 CD47 및/또는 SIRPα를 조절하는 제제(예를 들어, 항-CD47 항체 또는 항-SIRPα 항체)에 의해 매개될 수 있다. CD47 및/또는 SIRPα를 조절하는 다양한 제제가 당해 분야의 당업자에게 공지되어 있고, 다양한 회사에 의해 지속적으로 개발되고 있으며, 예를 들어, Hu5F9-G4(포티 세븐(Forty Seven)), TI-061(아크 온콜로지(Arch Oncology)), TTI-662(트릴리움 테라퓨틱스(Trillium Therapeutics)), TTI-621(트릴리움 테라퓨틱스), SRF231(서페이스 온콜로지(Surface Oncology)), SHR-1603(헝루이(Hengrui)), OSE-172(베링거 잉겔하임(Boehringer Ingelheim)), NI-1701(노브이뮨(Novimmune) SA), IBI188(이노벤트 바이오로직스(Innovent Biologics)), CC-95251(셀젠(Celgene)), CC-90002(셀젠), AO-176(아크 온콜로지), ALX148(ALX 온콜로지), IMM01(이뮨온코 바이오파마(ImmuneOnco Biopharma)), TJC4(I-MAB 바이오파마), TJC4-CK(I-MAB 바이오파마), SY102(사이유안(Saiyuan)), SL-172154(섀턱 랩스(Shattuck Labs)), PSTx-23(패러다임 쉬프트 테라퓨틱스(Paradigm Shift Therapeutics)), PDL1/CD47 BsAb(한미약품), NI-1801(노브이뮨 SA), MBT-001(모피엑스(Morphiex)), LYN00301(링크셀(LynkCell)), IMM2504(이뮨온코 바이오파마), IMM2502(이뮨온코 바이오파마), IMM03(이뮨온코 바이오파마), IMC-002(이뮨온시아 테라퓨틱스(ImmuneOncia Therapeutics)), IBI322(이노벤트 바이로로직스), HMBD-004B(허밍버드 바이로사이언스(Hummingbird Bioscience)), HMBD-004A(허밍버드 바이오사이언스), HLX24(헨리우스(Henlius)), FSI-189(포티 세븐(Forty Seven)), DSP107(KAHR 메디컬(Medical)), CTX-5861(컴패스 테라퓨틱스(Compass Therapeutics)), BAT6004(바이오-테라(Bio-Thera)), AUR-105(오리진(Aurigene)), AUR-104(오리진), 바이오캐드(Biocad)에 의해 개발된 항-CD47 단클론성 항체, ABP-500(에이비프로(Abpro)), ABP-160(에이비프로), BH-29xx(북경 한미)를 포함한다. 특정한 구현예에서, 제제는 가용성 CD47 수용체, 예를 들어, 가용성 SIRPα 단백질이다. 특정한 구현예에서, 가용성 CD47 수용체는 Fc 도메인에 융합된 SIRPα의 CD47 결합 도메인을 포함하는 Fc 융합 단백질이다. 예를 들어, TTI-621(트릴리움 테라퓨틱스)는 IgG1 Fc 도메인에 융합된 SIRPα의 CD47 결합 도메인을 포함하는 Fc 융합 단백질이고, TTI-622(트릴리움 테라퓨틱스)는 IgG4 Fc 도메인에 융합된 SIRPα의 CD47 결합 도메인을 포함하는 Fc 융합 단백질이다.
특정한 구현예에서, CD47 및/또는 SIRPα를 조절하는 제제는 CD47의 약물의 표적이 되는 조절제(druggable modifier)이다. 예를 들어, 약물의 표적이 되는 조절제는 글루타미닐-펩티드 시클로트랜스퍼라아제-유사 단백질(QPCTL)일 수 있으며, 이의 억제 및/또는 결실은 SIRPα-CD47 상호작용을 파괴하고 표적 세포의 증가된 식세포 작용으로 이어지는 것으로 나타났다. 예를 들어, Logtenberg 등, Nat. Med. (2019) 25(4): 612-619를 참조하며, 이의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 통합된다. 특정한 구현예에서, CD47 및/또는 SIRPα를 조절하는 제제는 QPCTL의 억제제이다.
CD47-SIRPα 상호작용을 차단하는 제제는, 제한 없이, 항-CD47 항체, 항-CD47 나노바디, 조작된 SIRPα 변이체 및 기타 융합 단백질, 및 siRNA를 포함한다. 이러한 제제의 사용은 학술 문헌에 보고되었다. 예를 들어, Alvey 등, Curr. Biol. (2017) 27(14): 2065-2077.e6; Weiskopf 등, Science (2013) 341(6141): 88-91; Ma 등, J. Nanobiotechnol. (2020) 18(1): 12; Liu 등, PLoS One (2015) 10(9): e0137345; Sockolosky 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2016) 113(19): E2646-2654; Tseng 등, Proc Natl. Acad. Sci. USA (2013); 110(27): 11103-11108; Weiskopf 등, J. Clin. Invest. (2016) 126(7): 2610-2620; 및 Zhang 등 Front. Immunol. (2020) 11:18에 의한 리뷰 논문을 참조하며, 이들의 개시내용은 그들 전문이 본원에 참조로 통합된다.
CD47-SIRPα 상호작용을 조절하는 적합한 제제는 PCT 공보 번호 WO2020043188, WO2020036977, WO2020019135, WO2020009725, WO2019241732, WO2019238012, WO2019201236, WO2019185717, WO2019184912, WO2019179366, WO2019157843, WO2019144895, WO2019138367, WO2019108733, WO2019086573, WO2019042470, WO2019042285, WO2019042119, WO2019034895, WO2019027903, WO2018233575, WO2018137705, WO2018095428, WO2018089508, WO2018075960, WO2018075857, WO2017215585, WO2017196793, WO2017194634, WO2017121771, WO2017053423, WO2017049251, WO2017027422, WO2016188449, WO2016141328, WO2016109415, WO2016081423, WO2016024021, WO2016023040, WO2016022971, WO2015191861, WO2014087248, WO2013119714, WO2013109752, WO2012170250, WO2011143624, WO2010070047, WO2009046541, WO2005044857, WO2002092784, WO1999040940, 및 WO 1997027873에 기재된 것을 포함하며, 이들의 개시내용은 그들 전문이 본원에 참조로 통합된다.
본 개시내용의 하향조절된 CD47 경로를 포함하는 백혈병 기원의 변형된 세포는 CD47 경로의 구성원을 격감시키고/시키거나 억제하는 제제로 사전-코팅될 수 있다. 특정한 구현예에서, 하향조절된 CD47 경로를 포함하는 백혈병 기원의 변형된 세포는 CD47을 격감시키고/시키거나 억제하는 제제로 사전-코팅된다. 예를 들어, 하향조절된 CD47 경로를 포함하는 백혈병 기원의 변형된 세포는 항-CD47 항체로 사전-코팅될 수 있다. 예를 들어, Li 등, Nature Comm. (2020) 11: 581을 참조하며, 이의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 통합된다.
특정한 구현예에서, CD47 경로의 구성원을 격감시키고/시키거나 억제하는 제제는 조작된 뉴클레아제 시스템이다.
CD47 경로의 구성원을 격감시키고/시키거나 억제함에 있어 사용하기에 적합한 다양한 조작된 뉴클레아제 시스템이 당해 분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어, 메가뉴클레아제 시스템, 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 시스템, 전사 활성화인자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN) 시스템, 및 일정 간격을 두고 분포하는 짧은 회문구조 반복서열(CRISPR) 시스템을 포함한다. 조작된 뉴클레아제 시스템은 CD47 경로의 구성원의 유전자 자리 내에의 삽입 및/또는 결실을 매개할 수 있다. 특정한 구현예에서, 조작된 뉴클레아제 시스템은 CD47 유전자 자리 내의 삽입 및/또는 결실을 매개한다. 그러하여, 본 개시내용은 CD47 유전자 자리 또는 CD47 경로의 구성원의 유전자 자리 내에 삽입 및/또는 결실을 포함하는 백혈병 기원의 변형된 세포를 제공한다. 당업자는, CD47 유전자 자리 또는 CD47 경로의 구성원의 유전자 자리 내의 삽입 및/또는 결실이 CD47 또는 CD47 경로의 구성원의 하향조절된 발현을 초래한다는 사실을 용이하게 인식할 것이다. 삽입 및/또는 결실은, 예를 들어, CD47 유전자 자리 내의 이중 가닥 절단의 수선에 의해 매개될 수 있다. 특정한 구현예에서, 수선은 비-상동성 말단 봉합(NHEJ) 및 상동 인도 수선(HDR)을 통한 것이다.
특정한 구현예에서, CD47 유전자 자리 내의 삽입 및/또는 결실을 포함하는 백혈병 기원의 변형된 세포가 제공되며, 여기서 CD47 유전자 자리 내의 삽입 및/또는 결실은 CD47의 하향조절된 발현을 초래한다.
다양한 CRISPR 시스템 및 유전자 편집을 위한 그들의 사용은 당해 분야의 당업자에게 공지되어 있다. CRISPR RNA 서열 및 CRISPR-연관(Cas) 유전자는, 상보적인 DNA 서열에서 혼입된 RNA를 이용하여 서열-특이적 이중 가닥 절단을 생성하는 효소 단백질-RNA 복합체를 생성한다. 예를 들어, Bhaya 등, Annu. Rev. Genetics (2011) 45: 273-297를 참조하며, 이의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 통합된다. 스트렙토코커스 파이노게네스(Streptococcus pyogenes)로부터의 Cas9 뉴클레아제("Cas9")는 조작된 단일-가이드 RNA(sgRNA)의 20개-뉴클레오티드 가이드 영역과 게놈 표적 서열 사이의 염기-쌍 상보성을 통해 인간 게놈에서 특이적인 부위로 안내될 수 있다. 예를 들어, Cong 등, Science (2013) 339(6121): 819-823; Mali 등, Science (2013) 339(6121): 823-826; Cho 등 Nat. Biotechnol. (2013) 31(3): 230-232; 및 Jinek 등, Elife (2013) 2:e00471을 참조하며, 이들의 개시내용은 그들 전문이 본원에 참조로 통합된다. 촉매적으로-비활성인 프로그래밍 가능한 RNA-의존적 DNA-결합 단백질(dCas9)은 박테리아 또는 진핵생물에서 직접적으로 또는 통합된 이펙터 도메인을 통해 전사를 조절할 수 있는 Cas9의 내에서 엔도뉴클레아제 도메인을 돌연변이시킴으로써 생성될 수 있다. 예를 들어, Qi 등, Cell (2013) 152(5): 1173-1183; Bikard 등, Nucl. Acids Res. (2013) 41(15): 7429-7437; Gilbert 등, Cell (2013) 154(2): 442-451; 및 Mali 등, Nat. Biotechnol. (2013) 31(9): 833-838을 참조하며, 이들의 개시내용은 그들 전문이 본원에 참조로 통합된다.
CRISPR 시스템은 RNA-가이드된 뉴클레아제 매개 편집 시스템이다. RNA-가이드된 뉴클레아제는, 제한 없이, 자연적으로-발생하는 유형 II CRISPR 뉴클레아제, 예컨대 Cas9 뿐만 아니라 그들로부터 유래되거나 수득된 기타 뉴클레아제를 포함한다. 본 개시내용에서 사용될 수 있는 예시적인 Cas9 뉴클레아제는, 이에 제한되지는 않으나, 에스. 파이오게네스(S. Pyogenes) Cas9(SpCas9), 에스. 아우레우스(S. aureus) Cas9(SaCas9), 엔. 메닝기티디스(N. meningitidis) Cas9(NmCas9), 씨. 제주니(C. jejuni) Cas9(CjCas9), 및 지오바실리우스(Geobacillus) Cas9(GeoCas9)을 포함한다. 기능적 측면에서, RNA-가이드된 뉴클레아제는: (a) gRNA와 상호작용하고(예를 들어, 복합체를 이루고); (b) (i) gRNA의 표적화 도메인에 상보적인 서열, 및, 임의로, (ii) "프로토스페이서 인접 모티프", 또는 "PAM"으로 지칭되는 추가적인 서열을 포함하는 DNA의 표적 영역과 연관된, 및 임의로 이를 절단 또는 변형한, gRNA와 함께인 뉴클레아제로서 정의된다. RNA-가이드된 뉴클레아제는, 넓은 측면에서, 그들의 PAM 특이성 및 절단 활성에 의해 정의될 수 있지만, 같은 PAM 특이성 또는 절단 활성을 공유하는 개별적인 RNA-가이드된 뉴클레아제들 사이에 변이체가 존재할 수 있다. 용어 RNA-가이드된 뉴클레아제는 일반적 용어로서 이해되고, 임의의 특정한 유형(예를 들어, Cas9 대 Cpfl), 종(예를 들어, 에스. 파이오게네스 대 에스. 아우레우스) 또는 변이체(예를 들어, 전장 대 결절된 또는 분할된 것; 자연적으로-발생하는 PAM 특이성 대 조작된 PAM 특이성)으로 제한되지 않아야 한다.
다양한 RNA-가이드된 뉴클레아제는 PAM과 프로토스페이서 사이에 상이한 순차적인 관계를 필요로 할 수 있다. 일반적으로, Cas9은 프로토스페이터의 5'인 PAM 서열을 꼭대기 또는 상보 가닥에 대해 시각화된 것으로서 인식한다. PAM 및 프로토스페이서의 특이적인 순차적인 배향을 인식하는 것에 더하여, RNA-가이드된 뉴클레아제는 일반적으로 특이적인 PAM 서열을 인식한다. 에스. 아우레우스 Cas9은, 예를 들어, NNGRRT의 PAM 서열을 인식하며, 여기서 N 서열은 gRNA 표적화 도메인에 의해 인식되는 영역의 바로 3'이다. 에스. 파이오게네스 Cas9은 NGG PAM 서열을 인식한다. 또한 조작된 RNA-가이드된 뉴클레아제는 유사한 뉴클레아제(예컨대, RNA-가이드된 뉴클레아제가 유래된 자연적으로 발생한 변이체, 또는 조작된 RNA-가이드된 뉴클레아제에 대해 가장 큰 아미노산 서열 상동성을 갖는 자연적으로 발생한 변이체)의 PAM 특이성과 상이한 PAM 특이성을 가질 수 있다는 사실에 유의해야 한다. 대체 PAM 서열을 인식하는 변형된 Cas9은 당해 분야에 공지되어 있다. RNA-가이드된 뉴클레아제는 또한 그들의 DNA 절단 특성으로 특징지어진다: 자연적으로-발생하는 RNA-가이드된 뉴클레아제는 표적 핵산에서 이중 가닥 절단(DSB)를 전형적으로 형성하지만, 단일 가닥 절단(SSB)만을 생성하거나, 전혀 자르지 않는 조작된 변이체가 생산되어왔다.
기타 예시적인 Cas9은 변경된 활성이 있는 Cas9의 변이체일 수 있다. 이들은, 예를 들어, Cas9 니카제(nickase)(nCas9), 효소적으로 죽은 Cas9(dCas9), 초정밀 Cas9(HypaCas9), 고충실도 Cas9(Cas9-HF), 강화된 특이성 Cas9(eCas9), 및 확장된 PAM Cas9(xCas9)을 포함한다. 예를 들어, Chen 등 Nature (2017) 550(7676): 407-410; Kleinstiver 등 Nature (2016) 529(7587): 490-495; Slaymaker 등 Science (2016) 351(6268): 84-88; 및 Hu 등 Nature (2018) 556(7699): 57-63을 참조하며, 이들의 개시내용은 그들 전문이 본원에 참조로 통합된다.
전사 활성화인자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)는 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인을 DNA 절단 도메인에 융합함으로써 생성된 인공적인 제한 효소이다. 이들 시약은 효율적이고, 프로그래밍 가능하며, 특이적인 DNA 절단을 가능하게 하고 제자리에서의 게놈 편집을 위한 강력한 도구를 나타낸다. 전사 활성화인자-유사 이펙터(TALE)는 사실상 임의의 DNA 서열에 결합하도록 빠르게 조작될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 TALEN은 광범위하며 또 다른 TALEN의 도움 없이 이중 가닥 DNA를 절단할 수 있는 단량체성 TALEN을 포함한다. 용어 TALEN은 또한 같은 부위에서 DNA를 절단하기 위해 함께 작용하도록 조작된 TALEN의 쌍의 하나 또는 두 구성원을 지칭하는 데에 사용된다. 함께 작용하는 TALEN은 DNA의 좌우상(handedness)을 참조하여 좌-TALEN 및 우-TALEN로서 지칭될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 일련 번호 12/965,590; 미국 일련 번호 13/426,991(미국 특허 번호 8,450,471); 미국 일련 번호 13/427,040(미국 특허 번호 8,440,431); 미국 일련 번호 13/427,137(미국 특허 번호 8,440,432); 및 미국 일련 번호 13/738,381, 및 미국 특허 번호 9,393,257을 참조하며, 이들 모두는 그들 전문이 본원에 참조로 통합된다.
TAL 이펙터는 크산토모나스(Xanthomonas) 박테리아에 의해 분비되는 단백질이다. DNA 결합 도메인은 12번째 및 13번째 아미노산을 제외하곤 매우 보존된 33개-34개 아미노산 서열을 함유한다. 이들 2개의 위치는 매우 가변적이며(반복 가변 이-잔기(Repeat Variable Di-residue(RVD))) 특이적인 뉴클레오티드 인식과 강한 상관관계를 나타낸다. 아미노산 서열과 DNA 인식 사이의 이 간단한 관계는, 적절한 RVD를 함유하는 반복 세그먼트의 조합을 선택함으로써 특이적인 DNA 결합 도메인의 조작을 허용해왔다.
Fok1 엔도뉴클레아제의 말단으로부터의 비-특이적 DNA 절단 도메인은 효모 검정에서 활성인 하이브리드 뉴클레아제를 작제하는 데에 사용될 수 있다. 이들 시약은 또한 식물 세포에서 및 동물 세포에서 활성이다. 초기 TALEN 연구는 야생형 Fok1 절단 도메인을 사용했지만, 일부의 그후의 TALEN 연구는 절단 특이성 및 절단 활성을 개선하도록 설계된 돌연변이가 있는 Fok1 절단 도메인 변이체를 또한 사용하였다. Fok1 도메인은 이량체로서 기능하며, 적절한 배향 및 간격을 갖는 표적 게놈 내의 부위에 대한 고유한 DNA 결합 도메인이 있는 2개의 작제물을 필요로 한다. TALEN DNA 결합 도메인과 Fok1 절단 도메인 사이의 아미노산 잔기의 수 및 2개의 개별적인 TALEN 결합 부위 사이의 염기의 수 둘 다가 높은 수준의 활성을 달성하기 위한 매개변수이다. TALEN DNA 결합 도메인과 Fok1 절단 도메인 사이의 아미노산 잔기의 수는 다수의 TAL 이펙터 반복 서열 및 Fok1 엔도뉴클레아제 도메인 사이에의 스페이서(스페이서 서열과 구별됨)의 도입에 의해 변형될 수 있다. 스페이서 서열은 12개 내지 30개 뉴클레오티드일 수 있다.
TALEN 결합 도메인의 아미노산 서열과 DNA 인식 사이의 관계는 설계가능한 단백질을 허용한다. 이 사례에서, TALE 결합 도메인에서 발견되는 반복적인 서열의 부적절한 어닐링 때문에 인공적인 유전자 합성이 문제가 될 수 있다. 이것에 대한 하나의 해결책은 공개적으로 이용가능한 소프트웨어 프로그램(DNAWorks)를 사용하여 2-단계 PCR에서의 어셈블리(assembly)에 적합한 올리고뉴클레오티드를 계산하는 것이고; 올리고뉴클레오티드 어셈블리에 뒤이어 전체 유전자 증폭이 일어난다. 조작된 TALE 작제물을 생성하기 위한 많은 모듈식 어셈블리 계획이 또한 보고되어왔다. 두 방법 모두 아연 핑거 DNA 인식 도메인을 생성하기 위한 모듈식 어셈블리 방법과 개념적으로 유사한 DNA 결합 도메인을 조작하는 체계적인 접근법을 제공한다.
TALEN 유전자가 조립되면 그들은 플라스미드 내로 삽입된다; 그후에 플라스미드는 유전자 생산물이 발현되는 표적 세포를 감염시키고 게놈에 접근하기 위해 핵에 진입하는 데에 사용된다. TALEN은 세포가 수선 메커니즘으로 반응하는 이중-가닥 절단(DSB)를 도입함으로써 게놈을 편집하는 데에 사용될 수 있다. 이 방식으로, 그들은 예를 들어, 질환을 야기하는 게놈 내의 돌연변이를 교정하는 데에 사용될 수 있다.
메가TAL은 호밍(homing) 엔도뉴클레아제를 TALEN의 모듈식 DNA 결합 도메인과 결합한 융합 단백질이며, 개선된 DNA 서열 표적화 및 증가된 유전자 편집 효율을 초래한다. TAL 앵커(anchor)의 N-말단 융합은, 하나 이상의 호밍 엔도뉴클레아제, 예컨대 하나 이상의 I-HjeMI, I-CpaMI, 및 I-Onul 호밍 엔도뉴클레아제를 포함하는 유전자-표적화된 엔도뉴클레아제의 특이성 및 활성을 증가시키는 데에 이용될 수 있다. 메가TAL은, Cermak 등, Nucl. Acids Res. (2011) 39: e82-e82에 기재된 골든 게이트 어셈블리 전략을 사용하여, 예를 들어, RVD 플라스미드 라이브러리 및 목적지 벡터(destination vector)를 사용하여 작제될 수 있으며, 이의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 통합된다.
메가TAL은 여전히 호밍 엔도뉴클레아제 절단 생화학을 사용하여 DNA를 자르므로, 그들은 모든 다른 유전자 편집 뉴클레아제와는 구별되는 방식으로 DNA 수선 경로를 끌어들인다. 메가TAL은 WO 2013/126794 및 WO 2014/191525에서의 절차에 따라 설계되고 예측될 수 있으며 본 방법에서 사용될 수 있다.
메가뉴클레아제는 14개 내지 40개 염기쌍의 폴리뉴클레오티드 인식 서열을 갖는 이중-가닥 엔도뉴클레아제를 지칭하며, 이는 단량체성 또는 이량체성일 수 있다. 메가뉴클레아제는 US 2014/0121115에서의 절차에 따라 설계되고 예측될 수 있으며, 본 방법에서 사용될 수 있고, 이의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 통합된다. 예시적인 메가뉴클레아제는, 이에 제한되지는 않으나, I-Sce I, I-Chu I, I-Dmo I, I-Cre I, I-Csm I, PI-Sce I, PI-Tli I, PI-Mtu I, I-Ceu I, I-Sce II, I-Sce III, HO, PI-Civ I, PI-Ctr I, PI-Aae I, PI-Bsu I, PI-Dha I, PI-Dra I, PI-May I, PI-Mch I, PI-Mfu I, PI-Mfl I, PI-Mga I, PI-Mgo I, PI Min I, PI-Mka I, PI-Mle I, PI-Mma I, PI-Msh I, PI-Msm I, PI-Mth I, PI-Mtu I, PI-Mxe I, PI-Npu I, PI-Pfu I, PI-Rma I, PI-Spb I, PI-Ssp I, PI-Fac I, PI-Mja I, PI-Pho I, PI-Tag I, PI-Thy I, PI-Tko I, 및 PI-Tsp I을 포함하고; 특히 예시적인 메가뉴클레아제는 I-Sce I, I-Chu I, I-Dmo I, I-Cre I, I-Csm I, PI-Sce I, PI-Pfu I, PI-Tli I, PI-Mtu I, 및 I-Ceu I를 포함하고; 특히 예시적인 메가뉴클레아제는 I-Dmo I, I-Cre I, PI-Sce I, 및 PI-Pfu I를 포함한다.
아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)는 DNA 절단 도메인 및 DNA 결합 아연 핑거 도메인을 갖는 효소이다. ZFN은 엔도뉴클레아제의 비특이적 DNA 절단 도메인을 부위-특이적 DNA 결합 아연 핑거 도메인과 융합함으로써 만들어질 수 있다. 이러한 뉴클레아제는 유전자 편집을 위한 강력한 도구이며 이중 가닥 절단(DSB)를 게놈 DNA 내에 부위-특이적으로 도입하도록 조립될 수 있다. ZFN은 DNA 수선 동안 특이적인 유전자 파괴를 허용하며, 밀접하게 관련된 DNA 주형이 제공되는 경우에 표적화된 유전자는 돌연변이성 비-상동성 말단 봉합(NHEJ)을 통해 파괴되거나 상동 재조합(HR)을 통해 변형될 수 있다.
아연 핑거 단백질은 WO 98/54311, 미국 특허 번호 9,187,758, 9,206,404 및 8,771,985에서의 절차에 따라 설계되고 예측될 수 있으며, 본 방법에서 사용될 수 있고, 이들의 개시내용은 그들 전문이 본원에 참조로 통합된다. 본원에 참조로 통합되는 WO 98/54311은 표적 유전자에 대해 고유한 특이적인 뉴클레오티드 서열에 결합하는 아연 핑거 단백질 도메인의 설계를 허용하는 기술을 개시한다. 18개의 뉴클레오티드를 포함하는 서열이 고등 유기체의 게놈에서의 고유한 위치를 지정하는 데에 충분하다는 것이 계산되었다. 그러므로, 전형적으로, 아연 핑거 단백질 도메인은 헥사닥틸(sexdactyly)이다, 즉, 6개의 아연 핑거를 함유하며, 각각은 특정한 트리플릿(triplet)과의 상호작용을 위한 이의 특이적으로 설계된 알파 헬릭스를 갖는다. 그러나, 일부 예에서, 보다 짧거나 긴 뉴클레오티드 표적 서열이 바람직할 수 있다. 이에 따라, 단백질 내의 아연 핑거 도메인은 적어도 3개 핑거, 또는 2개 내지 12개 핑거, 또는 3개 내지 8개 핑거, 또는 3개 내지 4개 핑거, 또는 5개 내지 7개 핑거, 또는 심지어 6개 핑거를 함유할 수 있다. 일 양태에서, ZFP는 3개 아연 핑거를 함유한다; 또 다른 양태에서, ZFP는 4개의 아연 핑거를 함유한다. ZFN에 대한 추가적인 상세한 설명 및 게놈 편집을 위한 그들의 설계는 US 20120329067에서 발견할 수 있으며, 이는 본원에 참조로 통합된다.
또한 하향조절된 CD47 경로를 포함하는 백혈병 기원의 변형된 세포를 생산하기 위한 방법이 본원에서 제공된다. 특정한 구현예에서, 이러한 방법은 전구체 세포의 미성숙 세포로의 분화를 허용하는 조건 하에서 전구체 세포를 인큐베이션하는 단계; 및 CD47 및/또는 CD47 경로의 구성원을 격감시키고/시키거나 억제하는 제제의 존재 하에서 및 미성숙 세포의 성숙을 허용하는 조건 하에서 미성숙 세포를 인큐베이션하고, 그럼으로써 하향조절된 CD47 경로를 포함하는 백혈병 기원의 변형된 세포를 생산하는 단계를 포함한다.
특정한 구현예에서, 전구체 세포는 DCOne 세포이다. 그러하여, 하향조절된 CD47 경로를 포함하는 백혈병 기원의 변형된 세포를 생산하기 위한 방법이 본원에서 제공되며, 여기서 방법은 DCOne 세포의 미성숙 세포(예를 들어, 미성숙 수지상 세포 표현형을 갖는 세포)로의 분화를 허용하는 조건 하에서 DCOne 세포를 인큐베이션하는 단계, 및 CD47 및/또는 CD47 경로의 구성원을 격감시키고/시키거나 억제하는 제제의 존재 하에서 및 미성숙 세포의 (예를 들어, 성숙 수지상 세포 표현형을 갖는 세포로의) 성숙을 허용하는 조건 하에서 미성숙 세포를 인큐베이션하고, 그럼으로써 하향조절된 CD47 경로를 포함하는 백혈병 기원의 변형된 세포를 생산하는 단계를 포함한다. DCOne 세포의 성숙을 허용하는 조건은, 예를 들어, EP2931878B1에 기재되어 있으며, 이의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 통합된다.
CD47 및/또는 CD47 경로의 구성원을 격감시키고/시키거나 억제하는 제제의 양은 당해 분야의 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 특정한 구현예에서, 제제의 양은 CD47 및/또는 CD47 경로의 구성원의 격감 및/또는 억제를 초래하는 제제의 유효량이다.
제제가 생물학적 제제, 예를 들어, 결합 폴리펩티드(예를 들어, 항체), 소 RNA(예를 들어, siRNA 또는 miRNA), 또는 조작된 뉴클레아제 시스템인 경우, 백혈병 기원의 변형된 세포는 제제 또는 제제의 구성성분을 인코딩하는 하나 이상의 조작된 핵산을 도입함으로써 일반적으로 조작된다.
특정한 구현예에서, CD47 및/또는 CD47 경로의 구성원을 격감시키고/시키거나 억제하는 제제(예를 들어, 항체, 소 RNA, 또는 조작된 뉴클레아제 시스템)는 발현 벡터, 예를 들어, 제제를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현에 의해 세포 내로 도입된다. 적합한 발현 벡터는 당해 분야의 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 제한 없이, 렌티바이러스 벡터, 감마 레트로바이러스 벡터, 포미(foamy) 바이러스 벡터, 아데노 연관 바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 조작된 하이브리드 바이러스, 이에 제한되지는 않으나 트랜스포존 매개 벡터, 예컨대 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty), 피기백(Piggybac), 및 인테그라아제, 예컨대 Phi31을 포함하는 네이키드 DNA를 포함한다. 일부 기타 적합한 발현 벡터는 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 및 레트로바이러스 발현 벡터를 포함한다.
특정한 구현예에서, CD47 및/또는 CD47 경로의 구성원을 격감시키고/시키거나 억제하는 제제(예를 들어, 항체, 소 RNA, 또는 조작된 뉴클레아제 시스템)를 인코딩하는 핵산은 바이러스 형질도입을 통해 세포 내로 도입된다. 특정한 구현예에서, 바이러스 형질도입은 백혈병 기원의 변형된 세포를, 제제를 인코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스 벡터와 접촉시키는 단계를 포함한다.
아데노바이러스 발현 벡터는 게놈 DNA 내로의 통합(integration)에 대해서는 낮은 성능을 갖지만 숙주 세포를 형질감염시키는 것에 대해서는 높은 효율을 갖는 아데노바이러스에 기반한 것이다. 아데노바이러스 발현 벡터는: (a) 발현 벡터의 패키징을 지지하고 (b) 궁극적으로 숙주 세포에서의 면역 수용체를 발현하는 데에 충분한 아데노바이러스 서열을 함유한다. 특정한 구현예에서, 아데노바이러스 게놈은 36 kb의, 선형, 이중 가닥 DNA이며, 여기서 외래 DNA 서열(예를 들어, CD47 및/또는 CD47 경로의 구성원을 격감시키고/시키거나 억제하는 제제를 인코딩하는 핵산)은 본 발명의 발현 벡터를 만들기 위해 아데노바이러스 DNA의 큰 조각을 대체하도록 삽입될 수 있다(예를 들어, Danthinne and Imperiale, Gene Therapy (2000) 7(20): 1707-1714를 참조하며, 이의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 통합된다).
또 다른 발현 벡터는 아데노바이러스 커플링된 시스템을 이용하는 아데노 연관 바이러스(AAV)에 기반한다. 이 AAV 발현 벡터는 숙주 게놈으로의 높은 빈도의 통합을 갖는다. 이는 분열하지 않는 세포를 감염시킬 수 있으며, 이에 따라, 예를 들어, 조직 배양 중 또는 생체내에서 포유류 세포 내로 유전자를 전달하는 데에 이를 유용하게 만든다. AAV 벡터는 감염성에 대한 광범위한 숙주 범위를 갖는다. AAV 벡터의 생성 및 사용에 관한 상세한 내용은 미국 특허 번호 5,139,941 및 4,797,368에 기재되어 있으며, 이들의 개시내용은 그들 전문이 본원에 참조로 통합된다.
레트로바이러스 발현 벡터는 숙주 게놈 내로 통합시키고, 많은 양의 외래 유전적 물질을 전달하고, 광범위한 스펙트럼의 종 및 세포 유형을 감염시키며 특별한 세포주 내에서 패키징될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 핵산(예를 들어, CD47 및/또는 CD47 경로의 구성원을 격감시키고/시키거나 억제하는 제제를 인코딩하는 핵산)을 특정한 위치에서 바이러스 게놈 내로 삽입하여 복제 결함인 바이러스를 생산함으로써 작제된다. 레트로바이러스 벡터가 광범위하게 다양한 세포 유형을 감염시킬 수 있지만, 제제의 통합 및 안정한 발현은 숙주 세포의 분열을 필요로 한다.
렌티바이러스 벡터는 일반적인 레트로바이러스 유전자인 gag, pol, 및 env에 더하여 조절 또는 구조적 기능이 있는 기타 유전자를 함유하는 복합(complex) 레트로바이러스인 렌티바이러스로부터 유래된다(예를 들어, 미국 특허 번호 6,013,516 및 5,994,136을 참조하며, 이들의 개시내용은 그들 전문이 본원에 참조로 통합된다). 렌티바이러스의 일부 예는 인간 면역결핍 바이러스(HIV-1, HIV-2) 및 유인원 면역결핍 바이러스(SIV)를 포함한다. 렌티바이러스 벡터는 HIV 독력 유전자를 다중적으로 약화시킴으로써 생성되어왔다, 예를 들어, 유전자 env, vif, vpr, vpu 및 nef가 결실되어 벡터를 생물학적으로 안전하게 만든다. 렌티바이러스 벡터는 분열하지 않는 세포를 감염시킬 수 있으며 생체내 및 생체외 유전자, 예를 들어, CD47 및/또는 CD47 경로의 구성원을 격감시키고/시키거나 억제하는 제제를 인코딩하는 핵산의 이동 및 발현 둘 다를 위해 사용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 5,994,136를 참조하며, 이의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 통합된다).
발현 벡터는 당해 분야의 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 세포(예를 들어, 백혈병 기원의 변형된 세포) 내로 도입될 수 있다. 발현 벡터는, 바람직한 경우에, 형질감염을 위한 바이러스 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 발현 벡터는 융합, 전기천공, 유전자총, 형질감염, 리포펙션 등에 의해 도입될 수 있다. 세포는 발현 벡터의 도입 전에 배양물 중에서 성장하고 확장될 수 있으며, 벡터의 도입 및 통합을 위한 적절한 처리가 뒤이어질 수 있다. 그후에 세포가 확장되고 벡터 내에 존재하는 마커의 미덕에 의해 스크리닝될 수 있다. 사용될 수 있는 다양한 마커가 당해 분야에 공지되어 있으며, hprt, 네오마이신 내성, 티미딘 키나아제, 하이그로마이신 내성 등을 포함할 수 있다.
하향조절된 CD47 경로를 포함하는 백혈병 기원의 변형된 세포를 생성하기 위한 추가적인 방법은, 제한 없이, 화학적 형질전환 방법(예를 들어, 인산칼슘, 덴드리머, 리포좀 및/또는 양이온성 중합체를 사용함), 비-화학적 형질전환 방법(예를 들어, 전기천공, 광학적 형질전환, 유전자 전기전달 및/또는 유체역학적 전달) 및/또는 입자-기반 방법(예를 들어, 임페일펙션(impalefection), 유전자 총 및/또는 마그네토펙션(magnetofection)을 사용함)을 포함한다.
발현 벡터를 세포 내로 도입하기 위한 물리적 방법은 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 충격법, 미량주사법, 전기천공 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생산하기 위한 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, Sambrook 등 (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York을 참조한다. 발현 벡터를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 화학적 방법은 콜로이드 분산 시스템, 예컨대 거대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로구, 비드, 및 수-중-유 에멀전, 마이셀, 혼합 마이셀을 포함하는 지질-기반 시스템, 및 리포좀을 포함한다.
사용하기에 적합한 지질은 상업적인 공급원으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 디미리스틸 포스파티딜콜린("DMPC")은 미주리주 세인트루이스 소재의 시그마(Sigma)로부터 수득될 수 있고; 디세틸 포스페이트("DCP")는 K&K 라보레이토리스(Laboratories)(플레인뷰, NY)로부터 수득될 수 있고; 콜레스테롤("Choi")은 칼바이오켐-베링(Calbiochem-Behring)으로부터 수득될 수 있으며; 디미리스틸 포스파티딜글리세롤("DMPG") 및 기타 지질은 아반티 폴라 리피즈, 인크.(Avanti Polar Lipids, Inc.)(버밍엄, AL)로부터 수득될 수 있다. 클로로포름 또는 클로포름/메탄올 중의 지질의 스톡 용액은 약 -20℃에서 저장될 수 있다. 클로로포름은 이것이 메탄올보다 더 용이하게 증발되므로 단독 용매로서 사용될 수 있다. "리포좀"은 둘러싸인 지질 이중층 또는 응집체의 생성에 의해 형성된 다양한 단일 및 다중층 지질 비히클을 포괄하는 일반적인 용어이다. 리포좀은 인지질 이중층 막 및 내부 수성 매질과 함께 소포성 구조를 갖는 것으로 특징지어질 수 있다. 다중층 리포좀은 수성 매질에 의해 분리된 다수의 지질 층을 갖는다. 이들은 인지질이 과량의 수용액 중에 현탁될 때 자발적으로 형성된다. 지질 구성성분은 닫힌 구조의 형성 전에 자가-재배열을 겪고 지질 이중층 사이에 물 및 용해된 용질을 가둔다(Ghosh 등, Glycobiology (1991) 5: 505-10). 용액 중 정상적인 소포성 구조와 상이한 구조를 갖는 조성물이 또한 포괄된다. 예를 들어, 지질은 미셀 구조를 취하거나 단지 지질 분자의 불균일한 응집체로서 존재할 수 있다. 또한 리포펙타민-핵산 복합체가 고려된다.
외인성 핵산을 숙주 세포 내로 도입하거나 또는 달리 세포를 제제에 노출시키는 데 사용되는 방법과 관계 없이, 숙주 세포 내의 핵산의 존재를 확인하기 위해, 다양한 검정이 수행될 수 있다. 이러한 검정은, 예를 들어, 당해 분야의 당업자에게 널리 공지된 분자 생물학적 검정, 예컨대 서던 및 노던 블롯팅, RT-PCR 및 PCR; 생화학적 검정, 예컨대, 예를 들어, 면역학적 수단(ELISA 및 웨스턴 블롯)에 의한 특정한 펩티드의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함한다.
일 구현예에서, 세포 내로 도입되는 핵산은 RNA이다. 또 다른 구현예에서, RNA는 시험관내 전사된 RNA 또는 합성 RNA를 포함하는 mRNA이다. RNA는 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)-생성된 주형을 사용하여 시험관내 전사에 의해 생산될 수 있다. 임의의 공급원으로부터의 관심있는 DNA가 적절한 프라이머 및 RNA 폴리머라아제를 사용하여 PCR에 의해 시험관내 mRNA 합성에 대한 주형으로 직접적으로 전환될 수 있다. DNA의 공급원은, 예를 들어, 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 파지 DNA, cDNA, 합성 DNA 서열 또는 DNA의 임의의 기타 적절한 공급원일 수 있다.
PCR은 그후에 세포 내로 도입될 mRNA의 시험관내 전사를 위한 주형을 생성하는 데 사용될 수 있다. PCR을 수행하기 위한 방법이 당해 분야에 공지되어 있다. PCR에서 사용하기 위한 프라이머는 PCR에 대한 주형으로서 사용될 DNA의 영역에 실질적으로 상보적인 영역을 갖도록 설계된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "실질적으로 상보적인"은 프라이머 서열 내의 대다수 또는 모든 염기가 상보적인 뉴클레오티드의 서열을 지칭한다. 실질적으로 상보적인 서열은 PCR을 위해 사용되는 어닐링 조건 하에서 의도된 DNA 표적과 어닐링되거나 하이브리드화될 수 있다. 프라이머는 DNA 주형의 임의의 일부와 실질적으로 상보적이도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 프라이머는 5' 및 3' UTR을 포함하여, 세포에서 정상적으로 전사되는 유전자의 일부(개방 판독 프레임)을 증폭하도록 설계될 수 있다. 프라이머는 관심있는 특정한 도메인을 인코딩하는 유전자의 일부를 증폭하도록 또한 설계될 수 있다. 일 구현예에서, 프라이머는 5' 및 3' UTR의 전부 또는 일부를 포함하여, 인간 cDNA의 코딩 영역을 증폭하도록 설계된다. PCR에 유용한 프라이머는 당해 분야에 널리 공지된 합성 방법에 의해 생성된다. "정방향 프라이머"는 증폭될 DNA 서열의 상류인 DNA 주형 상의 뉴클레오티드에 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드의 영역을 함유하는 프라이머이다. "상류"는 코딩 가닥에 대해 증폭될 DNA 서열에 대한 위치 5을 지칭하도록 본원에서 사용된다. "역방향 프라이머"는 증폭될 DNA 서열의 하류인 이중-가닥 DNA 주형에 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드의 영역을 함유하는 프라이머이다. "하류"는 코딩 가닥에 대해 증폭될 DNA 서열에 대한 위치 3'을 지칭하도록 본원에서 사용된다.
RNA의 안정성 및/또는 번역 효율을 촉진하는 능력을 갖는 화학적 구조가 또한 사용될 수 있다. RNA는 전형적으로 5' 및 3' UTR을 갖는다. 일 구현예에서, 5' UTR은 0개 내지 3000개 뉴클레오티드 길이이다. 코딩 영역에 추가될 5' 및 3' UTR 서열의 길이는, 이에 제한되지는 않으나, UTR의 상이한 영역에 어닐링되는 PCR을 위한 프라이머를 설계하는 것을 포함하는 상이한 방법에 의해 변경될 수 있다. 이 접근법을 사용하여, 당해 분야의 당업자는 전사된 RNA의 형질감염 다음의 최적의 번역 효율을 달성하는 데에 필요한 5' 및 3' UTR 길이를 변형할 수 있다.
5' 및 3' UTR은 관심있는 유전자에 대한 자연적으로 발생하는, 내인성 5' 및 3' UTR일 수 있다. 대안적으로, 관심있는 유전자에 대해 내인성이 아닌 UTR 서열은 UTR 서열을 정방향 및 역방향 프라이머 내에 혼입시킴으로써 또는 주형의 임의의 기타 변형에 의해 추가될 수 있다. 관심있는 유전자에 대해 내인성이 아닌 UTR 서열의 사용은 RNA의 안정성 및/또는 번역 효율을 변형하기에 유용할 수 있다. 예를 들어, 3' UTR 서열 내의 AU-풍부 요소는 mRNA의 안정성을 감소시킬 수 있다는 사실이 공지되어 있다. 그러므로, 3' UTR은 당해 분야에 널리 공지된 UTR의 특성에 기반하여 전사된 RNA의 안정성을 증가시키도록 선택되거나 설계될 수 있다.
일 구현예에서, 5' UTR은 내인성 유전자의 코작(Kozak) 서열을 함유할 수 있다. 대안적으로, 관심있는 유전자에 대해 내인성이 아닌 5' UTR이 상기에 기재된 바와 같이 PCR에 의해 추가될 때, 공통(consensus) 코작 서열은 5' UTR 서열을 추가함으로써 재설계될 수 있다. 코작 서열은 일부 RNA 전사체의 번역의 효율을 증가시킬 수 있지만, 모든 RNA가 효율적인 번역을 가능하게 하는 데에 필요하진 않은 것으로 보인다. 많은 mRNA에 대한 코작 서열의 요건은 당해 분야에 공지되어 있다. 다른 구현예에서, 5' UTR은 RNA 게놈이 세포에서 안정한 RNA 바이러스로부터 유래될 수 있다. 다른 구현예에서 다양한 뉴클레오티드 유사체가 mRNA의 엑소뉴클레아제 분해를 지연시키기 위해 3' 및 5' UTR 내에 사용될 수 있다.
유전자 클로닝에 대한 필요 없이, DNA 주형으로부터 RNA의 합성을 가능하게 하기 위해, 전사체의 프로모터는 전사될 서열의 DNA 주형 상류에 부착되어야 한다. RNA 폴리머라아제에 대한 프로모터로서 기능하는 서열이 정방향 프라이머의 5' 말단에 추가될 때, RNA 폴리머라아제 프로모터는 전사될 개방 판독 프레임의 PCR 생산물 상류 내로 혼입된다. 일 구현예에서, 프로모터는, 본원의 다른 곳에서 기재된 바와 같이, T7 폴리머라아제 프로모터이다. 기타 유용한 프로모터는, 이에 제한되지는 않으나, T3 및 SP6 RNA 폴리머라아제 프로모터를 포함한다. T7, T3 및 SP6 프로모터에 대한 공통 뉴클레오티드 서열은 당해 분야에 공지되어 있다.
일 구현예에서, mRNA는 세포에서 리보좀 결합, 번역의 개시 및 mRNA 안정성을 결정하는 5' 말단 상의 캡(cap) 및 3' 폴리(A) 꼬리 둘 다를 갖는다. 예를 들어, 원형 DNA 주형인 플라스미드 DNA 상에서는, RNA 폴리머라아제가 진핵 세포에서의 발현에 적합하지 않은 긴 연쇄동일서열(concatameric) 생산물을 생산한다. 3' UTR의 말단에서 선형화된 플라스미드 DNA의 전사는 이것이 전사 후 폴리아데닐화 되더라도 진핵 세포 형질감염 시 효과적이지 않은 보통 크기의 mRNA를 초래한다.
선형 DNA 주형 상에서는, 파지 T7 RNA 폴리머라아제가 전사체의 3' 말단을 주형의 마지막 염기를 넘어 연장시킬 수 있다(Schenborn and Mierendorf, Nucl. Acids Res. (1985) 13: 6223-36; Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem. (2003) 270: 1485-65.
전사적 DNA 주형의 폴리A/T 세그먼트는 폴리T 꼬리, 예컨대 100T 꼬리(크기는 50개 내지 5000개 T일 수 있다)를 함유하는 역방향 프라이머를 사용함으로써 PCR 동안, 또는 이에 제한되지는 않으나 DNA 결찰 또는 시험관내 재조합을 포함하는 임의의 기타 방법에 의해 PCR 후에 생산될 수 있다. 폴리(A) 꼬리는 또한 RNA에 안정성을 제공하며 그들의 분해를 감소시킨다. 일반적으로, 폴리(A) 꼬리의 길이는 전사된 RNA의 안정성과 양의 상관관계가 있다. 일 구현예에서, 폴리(A) 꼬리는 100개 내지 5000개 아데노신이다.
RNA의 폴리(A) 꼬리는 폴리(A) 폴리머라아제, 예컨대 이. 콜라이(E. coil) 폴리A 폴리머라아제(E-PAP)를 사용한 시험관내 전사 다음에 추가로 연장될 수 있다. 일 구현예에서, 폴리(A) 꼬리의 길이를 100개 뉴클레오티드에서 300개 내지 400개 뉴클레오티드로 증가시키는 것은 RNA의 번역 효율에 있어 약 2배 증가를 초래한다. 추가적으로, 3' 말단에의 상이한 화학적 기의 부착은 mRNA 안정성을 증가시킬 수 있다. 이러한 부착은 변형된/인공 뉴클레오티드, 압타머 및 기타 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, ATP 유사체가 폴리(A) 폴리머라아제를 사용하여 폴리(A) 꼬리 내로 혼입될 수 있다. ATP 유사체는 RNA의 안정성을 추가로 증가시킬 수 있다.
5' 캡은 또한 RNA 분자에 안정성을 제공한다. 예시적인 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 RNA는 5' 캡을 포함한다. 5' 캡은 당해 분야에 공지되고 본원에 기재된 기술을 사용하여 제공된다(예를 들어, Cougot 등, Trends in Biochem. Sci. (2001) 29: 436-444; Stepinski 등, RNA (2001) 7: 1468-95; Elango 등, Biochim. Biophys. Res. Commun. (2005) 330: 958-966을 참조한다).
특정한 구현예에서, RNA, 예컨대 시험관내 전사된 RNA는 세포 내로 전기천공된다. 세포 투과성 및 생존력을 촉진하는 인자, 예컨대 당, 펩티드, 지질, 단백질, 항산화제, 및 계면활성제를 함유할 수 있는 세포 전기천공에 적합한 임의의 용질이 포함될 수 있다.
방법은 또한, 예를 들어, 투입 RNA의 프로모터 또는 양을 바꿈으로써 넓은 범위에 걸쳐 발현의 수준을 제어하는 능력을 제공하여 발현 수준을 개별적으로 조절하는 것을 가능하게 한다. 더욱이, mRNA 생산물의 PCR-기반 기술은 상이한 구조 및 그들의 도메인의 조합이 있는 mRNA의 설계를 크게 촉진한다.
RNA 형질감염의 하나의 이점은 이것이 본질적으로 일시적이고 벡터가 없다는 점이다. RNA 전이유전자는, 임의의 추가적인 바이러스 서열의 필요 없이 최소의 발현 카세트로서, 세포로 전달되고 그 안에서 발현될 수 있다. 이들 조건 하에서, 전이유전자의 세포 게놈 내로의 통합 가능성은 거의 없다. RNA의 형질감염의 효율 때문에 세포의 클로닝이 필요하지 않다.
시험관내-전사된 RNA(IVT-RNA)를 사용한 세포의 조작은 리포펙션 또는 전기천공의 사용을 포함한다. 전달된 IVT-RNA의 장기적인 발현을 달성하기 위해 다양한 변형을 사용하여 IVT-RNA를 안정화하는 것이 바람직하다.
시험관내 전사를 위한 주형으로서 표준화된 방식으로 이용되고 안정화된 RNA 전사체가 생산되는 방식으로 유전적으로 변형된 일부 IVT 벡터가 문헌에 공지되어 있다. 현재, 당해 분야에서 사용되는 프로토콜은 다음의 구조가 있는 플라스미드 벡터에 기반한다: RNA 전사를 가능하게 하는 5' RNA 폴리머라아제 프로모터, 뒤이어 비번역 영역(UTR)에 의해 3' 및/또는 5' 중 어느 하나에 플랭킹(flanking)된 관심있는 유전자, 및 50개 내지 70개 A 뉴클레오티드를 함유하는 3' 폴리아데닐 카세트. 시험관내 전사에 앞서, 원형 플라스미드는 II 유형 제한 효소(인식 부위가 절단 부위에 해당함)에 의해 폴리아데닐 카세트의 하류에서 선형화된다. 이에 따라 폴리아데닐 카세트는 전사체의 후기의 폴리(A) 서열에 해당한다. 이 절차의 결과로서, 선형화 후 일부 뉴클레오티드가 효소 절단 부위의 부분으로서 남아있고 3' 말단의 폴리(A) 서열을 연장하거나 가린다. 이 비생리학적 돌출부가 이러한 작제물로부터 세포내에서 생산되는 단백질의 양에 영향을 미치는지 여부는 명확하지 않다.
또 다른 양태에서, RNA 작제물은 전기천공에 의해 세포 내로 전달된다. 예를 들어, US 2004/0014645, US 2005/0052630, US 2005/0070841, US 2004/0059285, US 2004/0092907A1에 교시된 바와 같은 포유류 세포 내로의 핵산 작제물의 전기천공의 제형 및 방법론을 참조한다. 임의의 공지된 세포 유형의 전기천공에 필요한 전기장 강도를 포함하여 다양한 매개변수가 관련 연구 문헌뿐만 아니라 해당 분야의 많은 특허 및 출원 중에 일반적으로 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,678,556, 미국 특허 번호 7,171,264, 및 미국 특허 번호 7,173,116을 참조한다. 전기천공의 치료적 적용을 위한 기구, 예를 들어, MEDPULSER™ DNA 전기천공 요법 시스템(이노비오/제네트로닉스(Inovio/Genetronics), 샌디에고, Calif.)가 상업적으로 이용가능하며, 특허, 예컨대 미국 특허 번호 6,567,694; 미국 특허 번호 6,516,223, 미국 특허 번호 5,993,434, 미국 특허 번호 6,181,964, 미국 특허 번호 6,241,701, 및 미국 특허 번호 6,233,482에 기재되어 있다; 전기천공은, 예를 들어, US20070128708A1에 기재된 바와 같이, 시험관내에서 세포의 형질감염을 위해 또한 사용될 수 있다. 전기천공은 시험관내에서 세포 내로 핵산을 전달하기 위해 또한 이용될 수 있다. 따라서, 당해 분야의 당업자에게 공지된 많은 이용가능한 장치 및 전기천공 시스템 중 임의의 것을 이용한, 발현 작제물을 포함하는 핵산의 세포내로의 전기천공-매개 투여는 표적 세포에의 관심있는 RNA의 전달에 대한 흥미로운 새로운 수단을 제시한다.
본원에서 제공되는 바와 같이, 특정한 방법은 백혈병 기원의 변형된 세포의 사용을 이용하며, 여기서 변형된 세포는 비-증식성이다. 특정한 구현예에서, 백혈병 기원의 변형된 세포는 방사선 조사된다. 특정한 구현예에서, 백혈병 기원의 변형된 세포는 본원에 개시된 방법에서의 이의 사용에 앞서 방사선 조사된다. 방사선 조사는, 예를 들어, 표준 조사 장치(감마쎌(Gammacell) 또는 등가물)을 사용하여, 1시간 내지 3시간의 기간 동안, 30 내지 150 Gy, 예를 들어, 100 Gy에서의 감마선 조사에 의해 달성될 수 있다. 방사선 조사는 백혈병 기원의 변형된 세포, 예를 들어 CD34 양성 세포를 포함하는 조성물 중에 임의의 남아있는 간세포가 계속해서 분열할 수 없도록 보장한다. 세포는, 예를 들어, 백신으로서 사용될 때 환자에의 주사에 앞서, 또는 배양이 중지된 직후 방사선 조사될 수 있다. 특정한 구현예에서, 세포는 그들의 면역 자극 능력은 유지하면서 그들의 증식 및/또는 확장하는 능력을 억제하기 위해 방사선 조사된다.
C. 치료 방법
대상체에서 면역 반응을 강화하기 위한 방법이 본원에서 제공된다. 또한 대상체에서 암(예를 들어, 종양)을 치료 또는 예방하기 위한 방법이 본원에서 제공된다. 대상체에서 면역 반응을 강화하는 방법은 대상체가 겪는 암(예를 들어, 종양)의 치료를 초래할 수 있다. 방법은 일반적으로 본원에 기재된 백혈병 기원의 변형된 세포를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체" 또는 "개체" 또는 "환자"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 진단 또는 요법이 바람직한 임의의 대상체, 특히 포유류 대상체를 지칭한다. 포유류 대상체는 예를 들어, 인간, 가축, 농장 동물, 및 동물원, 스포츠, 또는 애완 동물, 예컨대 개, 고양이, 기니피그, 토끼, 랫트, 쥐, 말, 소, 및 젖소를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료하다" 또는 "치료"는 치료적 치료 및 예방적 또는 방지적 수단 둘 다를 지칭하며, 여기서 목표는 바람직하지 않은 생리적 변화 또는 장애, 예컨대 암의 발병 또는 확산을 예방하거나 둔화시키는(줄이는) 것이다. 유익하거나 바람직한 임상 결과는, 검출되거나 검출되지 않든 간에, 이에 제한되지는 않으나, 증상의 완화, 질환의 정도의 감소, 안정화된 질환 상태(즉, 악화되지 않음), 질환 진행의 지연 또는 둔화, 질환 상태의 개선 또는 경감, 및 차도(부분적이든 전체적이든)를 포함한다. "치료"는 치료를 받지 않은 경우 기대된 생존과 비교하여 연장된 생존을 또한 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 이들은 병태 또는 장애가 이미 있는 이들 뿐만 아니라 병태 또는 장애를 갖는 경향이 있거나 이의 위험이 있는 이들 또는 병태 또는 장애가 예방되어야 할 이들을 포함한다. 특정한 구현예에서, 치료는 재발을 예방하거나 질환 또는 장애, 예를 들어 암의 재발을 지연시키는 것을 또한 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "유효량"은 유익하거나 바람직한 결과, 예를 들어 바람직한 치료적 끝지점(예를 들어, 종양의 크기의 부분적인 또는 완전한 감소)의 성취를 가져오기에 충분한 양이다. 유효량은 1회 이상의 투여, 적용 또는 복용량으로 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "치료적으로 유효량"은 비정상적인 생리적 반응 또는 바람직한 반응(예를 들어 향상된 적응 면역 반응)의 측정가능한 개선을 예방, 교정 및/또는 정상화하기에 충분한 양을 의미하는 데 사용된다. 일 양태에서, "치료적으로 유효량"은 적어도 약 30%, 적어도 50%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%만큼 병리학의 임상적으로 유의적인 특성, 예컨대 예를 들어, 종양 질량의 크기를 감소시키기에 충분한 양이다.
본원에서 제공되는 암을 치료하는 방법으로부터 이익을 얻을 대상체는 암을 갖는 이들을 포함한다. 또한 이전에 암에 대한 초기 치료를 받은 대상체가 적합하다. 특정한 구현예에서, 초기 치료는 암에 대한 표준 치료 요법 치료를 포함한다. 암에 대한 표준 치료 요법은 수술, 화학요법, 및/또는 방사선 요법을 포함할 수 있다. 이러한 대상체는 초기 치료에 잘 반응했을 수 있거나, 또는 초기 치료에 불응성이다. 그러하여, 특정한 구현예에서, 본원에서 제공되는 방법은 표준 치료 요법 치료에 불응성인 암을 치료하기에 유용하다. 특정한 구현예에서, 본원에서 제공되는 방법은 암의 재발 또는 반복을 예방하기 위해 대상체를 치료하는 데에 유용하다.
특정한 구현예에서, 본 개시내용에 의해 제공되는 방법은 본원에 기재된 바와 같은 백혈병 기원의 변형된 세포를 포함하는 제1 조성물(예를 들어, 제1 면역원성 조성물)을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 특정한 구현예에서, 백혈병 기원의 변형된 세포는 하향조절된 CD47 경로를 포함한다. 특정한 구현예에서, 본 개시내용에 의해 제공되는 방법은 백혈병 기원의 변형된 세포를 포함하는 제1 조성물, 및 CD47 및/또는 CD47 경로의 구성원을 격감시키고/시키거나 억제하는 제제를 포함하는 제2 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 본원에서 기재된 바와 같이, CD47을 억제하는 것은 세포-기반 백신(DCP-001)의 면역 세포에 의한 흡수를 강화한다. 그러하여, 본원에서 제공되는 방법은 세포-기반 백신의 면역원성을 이용하여, 즉, 상주 면역 세포를 자극하고/하거나 주변 면역 세포를 모집하고, 이러한 면역 세포에 의한 세포-기반 백신의 강화된 흡수와 함께, 세포-기반 백신의 생물학적 활성을 (예를 들어, 세포-기반 백신에 포함된 항원을 제시하고 이에 반응함으로써) 강화한다.
특정한 구현예에서, 대상체에서 면역 반응을 강화하기 위한 방법은 백혈병 기원의 변형된 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 특정한 구현예에서, 대상체에서 면역 반응을 강화하기 위한 방법은 하향조절된 CD47 경로를 포함하는 백혈병 기원의 변형된 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 특정한 구현예에서, 대상체에서 면역 반응을 강화하기 위한 방법은 백혈병 기원의 변형된 세포를 포함하는 제1 조성물의 유효량, 및 CD47 및/또는 CD47 경로의 구성원을 격감시키고/시키거나 억제하는 제제를 포함하는 제2 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 특정한 구현예에서, 대상체에서 면역 반응을 강화하기 위한 방법은 하향조절된 CD47 경로를 포함하는 백혈병 기원의 변형된 세포를 포함하는 제1 조성물의 유효량, 및 CD47 및/또는 CD47 경로의 구성원을 격감시키고/시키거나 억제하는 제제를 포함하는 제2 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
특정한 구현예에서, 대상체에서 암을 치료 또는 예방하기 위한 방법은 백혈병 기원의 변형된 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 특정한 구현예에서, 대상체에서 암을 치료 또는 예방하기 위한 방법은 하향조절된 CD47 경로를 포함하는 백혈병 기원의 변형된 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 특정한 구현예에서, 대상체에서 암을 치료 또는 예방하기 위한 방법은 백혈병 기원의 변형된 세포를 포함하는 제1 조성물의 유효량, 및 CD47 및/또는 CD47 경로의 구성원을 격감시키고/시키거나 억제하는 제제를 포함하는 제2 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 특정한 구현예에서, 대상체에서 암을 치료 또는 예방하기 위한 방법은 하향조절된 CD47 경로를 포함하는 백혈병 기원의 변형된 세포를 포함하는 제1 조성물의 유효량, 및 CD47 및/또는 CD47 경로의 구성원을 격감시키고/시키거나 억제하는 제제를 포함하는 제2 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
특정한 구현예에서, 백혈병 기원의 변형된 세포는 적어도 하나의 종양 연관 항원 또는, 종양 연관 항원을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 여기서 종양 연관 항원은 대상체에서의 종양과 연관되어 있다. 특정한 구현예에서, 백혈병 기원의 변형된 세포는 적어도 하나의 종양 연관 항원 또는, 종양 연관 항원을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 여기서 종양 연관 항원은 대상체에서의 종양과 연관되어 있지 않다. 특정한 구현예에서, 종양 연관 항원 또는, 종양 연관 항원을 인코딩하는 핵산은 백혈병 기원의 변형된 세포에 내인성으로 포함될 수 있다. 특정한 구현예에서, 종양 연관 항원 또는, 종양 연관 항원을 인코딩하는 핵산은 백혈병 기원의 변형된 세포에 외인성으로 제공될 수 있다. 종양 연관 항원 또는, 종양 연관 항원을 인코딩하는 핵산을 세포에 제공하기 위한 다양한 방법이 당해 분야의 당업자에게 공지되어 있다.
특정한 구현예에서, 본원에서 제공되는 암을 치료하기 위한 방법은 본원에 기재된 백혈병 기원의 변형된 세포(예를 들어, 하향조절된 CD47 경로를 포함하는 백혈병 기원의 변형된 세포)를 포함하는 조성물의 유효량의 1회 이상의 용량을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 조성물은 CD47 및/또는 CD47 경로의 구성원을 격감시키고/시키거나 억제하는 제제를 추가로 포함할 수 있다.
특정한 구현예에서, 백혈병 기원의 변형된 세포를 포함하는 조성물의 1회 이상의 용량은 대상체에 투여된다. 예를 들어, 백혈병 기원의 변형된 세포를 포함하는 조성물의 1회 용량, 2회 용량, 3회 용량, 4회 용량, 5회 용량, 6회 용량, 7회 용량, 8회 용량, 9회 용량, 10회 용량, 11회 용량, 12회 용량 또는 그 이상이 대상체에 투여된다. 1회 이상의 용량의 각각은 실질적으로 같은 수의 백혈병 기원의 변형된 세포를 함유할 수 있거나 상이한 수의 백혈병 기원의 변형된 세포를 함유할 수 있다.
특정한 구현예에서, 조성물(즉, 백혈병 기원의 변형된 세포를 포함함)의 용량은 시간 간격으로, 예를 들어, 1주 간격으로, 2주 간격으로, 3주 간격으로, 4주 간격으로, 5주 간격으로, 6주 간격으로, 7주 간격으로, 8주 간격으로, 9주 간격으로, 10주 간격으로, 11주 간격으로, 12주 간격으로, 또는 그 이상으로 투여될 수 있다. 특정한 구현예에서, 용량 사이의 시간은 약 1일 내지 약 21일, 약 1일 내지 약 22일, 약 1일 내지 약 23일, 약 1일 내지 약 24일, 약 1일 내지 약 3주, 약 1일 내지 약 4주, 약 1일 내지 약 5주, 약 1일 내지 약 10주, 약 1일 내지 약 15주, 약 1일 내지 약 20주, 약 1일 내지 약 25주, 약 1일 내지 약 30주, 약 1일 내지 약 35주, 약 1일 내지 약 40주, 약 1일 내지 약 45주, 약 1일 내지 약 50주, 약 1일 내지 약 1년, 및 이의 임의의 사이에 있는 시간의 양이다. 특정한 구현예에서, 용량 사이의 시간은 약 1일 내지 약 1개월, 14일 내지 약 2개월, 1개월 내지 약 3개월, 2개월 내지 약 5개월, 4개월 내지 약 6개월, 5개월 내지 약 7개월, 6개월 내지 약 8개월, 7개월 내지 약 9개월, 8개월 내지 약 10개월, 9개월 내지 약 11개월, 10개월 내지 약 12개월, 11개월 내지 약 13개월, 12개월 내지 약 14개월, 13개월 내지 약 15개월, 14개월 내지 약 16개월, 15개월 내지 약 17개월, 16개월 내지 약 18개월, 17개월 내지 약 19개월, 18개월 내지 약 20개월, 19개월 내지 약 21개월, 20개월 내지 약 22개월, 21개월 내지 약 23개월, 22개월 내지 약 24개월, 3개월 내지 약 1년, 6개월 내지 약 1년, 및 이의 임의의 사이에 있는 시간의 범위이다.
상기에 기재된 바와 같이, 본원에 기재된 방법은 면역원성 조성물의 1회 이상의 용량의 투여를 포함하는 방법을 포함한다. 특정한 구현예에서, 1회 이상의 용량은 같은 경로의 전달을 통해 투여된다. 특정한 구현예에서, 1회 이상의 용량은 상이한 경로의 전달을 통해 투여된다. 본원에 기재된 방법은 하나 이상의 조성물(예를 들어, 백혈병 기원의 변형된 세포를 포함하는 제1 조성물, 및 CD47 및/또는 CD47 경로의 구성원을 격감시키고/시키거나 억제하는 제제를 포함하는 제2 조성물)의 투여를 또한 포함한다.
특정한 구현예에서, 제1 및/또는 제2 조성물은 종양내로 또는 종양-주위로 투여된다. 이러한 사례에서, 조성물은 종양내 투여를 위해 제형화된다. 조성물의 종양내 투여는 면역원성 조성물의 종양 내로의, 예를 들어, 종양의 중앙으로의, 또는 종양 덩어리 내의 임의의 위치 내로의 직접적인 투여를 포함한다. 종양내 투여는 종양에 가까운 곳, 예를 들어, 종양 주변 공간에의 조성물의 투여를 또한 포함한다. 특정한 구현예에서, 제1 및/또는 제2 조성물은 종양내로 투여된다. 특정한 구현예에서, 제1 및/또는 제2 조성물은 종양내 투여를 위해 제조된다, 예를 들어, 제1 및/또는 제2 조성물은 종양내 투여에 허용가능한 희석제 또는 용매를 포함한다.
특정한 구현예에서, 제1 및/또는 제2 조성물은 종양외로 투여된다. 이러한 사례에서, 조성물은 특이적인 종양외 투여를 위해 제형화된다. 종양외 투여는, 예를 들어, 정맥내, 동맥내, 피하, 피내, 결절내, 림프내 및 근육내 투여를 포함하는 비경구 투여를 포함하며, 이들은 모두 당업자에게 널리 공지되어 있다. 특정한 구현예에서, 본원에 기재된 조성물의 투여는 근육내 주사, 피하 주사, 정맥 주사, 동맥 주사, 복강내 주사, 흉골내 주사, 피내 주사, 경피 주사, 피부 경유 주사, 및 조직의 간질 공간으로의 전달로 이루어진 군으로부터 선택되는 방식에 의해 전달된다.
종양외 투여는 종양 부위로부터 먼 부위에의 투여를 또한 포함한다. 예를 들어, 종양외 투여는 종양(예를 들어, 종양의 가장자리, 또는 종양의 중심)으로부터 적어도 약 0.1 mm, 적어도 약 0.2 mm, 적어도 약 0.3 mm, 적어도 약 0.4 mm, 적어도 약 0.5 mm, 적어도 약 0.6 mm, 적어도 약 0.7 mm, 적어도 약 0.8 mm, 적어도 약 0.9 mm, 적어도 약 1 mm, 적어도 약 2 mm, 적어도 약 3 mm, 적어도 약 4 mm, 적어도 약 5 mm, 적어도 약 6 mm, 적어도 약 7 mm, 적어도 약 8 mm, 적어도 약 9 mm, 적어도 약 10 mm, 적어도 약 15 mm, 적어도 약 20 mm, 적어도 약 25 mm, 적어도 약 30 mm, 적어도 약 35 mm, 적어도 약 40 mm, 적어도 약 45 mm, 적어도 약 50 mm, 적어도 약 60 mm, 적어도 약 70 mm, 적어도 약 80 mm, 적어도 약 90 mm, 적어도 약 10 cm, 적어도 약 20 cm, 적어도 약 30 cm, 적어도 약 40 cm, 적어도 약 50 cm, 50 cm 이상 멀리 있는 부위에서 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
세포외 투여는 종양이 상주하는 기관계와 상이한 기관계 내의 부위에 조성물을 투여하는 것을 또한 포함한다. 예를 들어, 종양이 난소에 또는 난소 내에 상주하는 경우에, 방법은 난소가 아닌 기관계, 예를 들어, 간, 신장 등에서의 부위에서 조성물을 먼 쪽으로 투여하는 단계를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "기관" 또는 "기관계"는 유사한 기능을 갖는 조직의 군을 지칭한다. 기관계의 예는, 제한 없이, 근육계, 소화계(예를 들어, 위, 소장, 대장, 간, 췌장 등), 호흡기계(예를 들어, 폐), 비뇨계(예를 들어, 신장, 방광 등), 생식기(예를 들어, 수컷 및 암컷 생식기, 난소, 태반, 전립선 등), 내분비계, 순환계, 신경계(예를 들어, 중추 및 말초신경계), 피부계(예를 들어, 피부, 피하 조직)를 포함한다.
조성물의 투여는 종양 부위와 대측인 부위에서 또한 수행될 수 있다. 특정한 구현예에서, 방법은 종양 부위(종양이 상주하는 부위)에 대측인 부위에서 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 종양이 난소에 또는 난소 내에 상주하는 경우에, 방법은 난소 대측에 또는 난소 대측 내에 조성물을 먼 쪽으로 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 종양이 왼쪽 난소에 또는 왼쪽 난소 내에 상주하는 경우에, 방법은 오른쪽 난소에 조성물을 먼 쪽으로 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 종양이 오른쪽 난소에 또는 오른쪽 난소 내에 상주하는 경우에, 방법은 왼쪽 난소에 조성물을 먼 쪽으로 투여하는 단계를 각각 포함한다.
특정한 구현예에서, 제1 및/또는 제2 조성물은 정맥내로 투여된다. 특정한 구현예에서, 제1 및/또는 제2 조성물은 정맥내 투여를 위해 제조된다, 예를 들어, 제1 및/또는 제2 조성물은 정맥내 투여에 허용가능한 희석제 또는 용매를 포함한다. 특정한 구현예에서, 제1 및 제2 조성물은 피내로 투여된다. 특정한 구현예에서, 제1 및/또는 제2 조성물은 피내 투여를 위해 제조된다, 예를 들어, 제1 및/또는 제2 조성물은 피내 투여에 허용가능한 희석제 또는 용매를 포함한다. 특정한 구현예에서, 제1 및/또는 제2 조성물은 근육내로 투여된다. 특정한 구현예에서, 제1 및/또는 제2 조성물은 근육내 투여를 위해 제조된다, 예를 들어, 제1 및/또는 제2 조성물은 근육내 투여에 허용가능한 희석제 또는 용매를 포함한다.
D. 조합 요법
본원에서 제공되는 방법은 그들 단독으로, 또한 기타 요법과 조합하여, 암의 치료 시 유용하다. 그러하여, 본원에 기재된 방법과 조합하여 사용하기 위한 조합 요법이 본원에서 또한 제공된다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 방법은 방사선 요법, 또는 세포 증식 억제 또는 항암 활성을 갖는 2차 요법과 조합하여 사용될 수 있다.
특정한 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 암을 치료 또는 에방하는 방법은 제2 요법을 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 특정한 구현예에서, 제2 요법은 조성물 중에 포함된다(예를 들어, 제3 조성물). 특정한 구현예에서, 제2 요법은 방사선 요법을 포함한다. 특정한 구현예에서, 제2 요법은 면역 관문 요법을 포함한다. 특정한 구현예에서, 제2 요법은 항-혈관신생 요법을 포함한다. 특정한 구현예에서, 제2 요법은 폴리(ADP-리보스) 폴리머라아제(PARP) 억제제 요법을 포함한다. 당업자(예를 들어, 의사)는 본원에 기재된 조합 요법에 유용한 구체적인 복용량 및 복용 섭생을 용이하게 결정할 수 있을 것이다.
특정한 양태에서, 본원에서 제공되는 방법은 세포 증식 억제 또는 항암 활성을 갖는 2차 요법과 조합 시 유용하다. 적합한 세포 증식 억제 화학 요법 화합물은, 이에 제한되지는 않으나 DNA-가교제, DNA 단편화제, 끼어들기 약물, 단백질 합성 억제제, 토포아이소머라아제 I 및 II 억제제, 항대사성물질, 미세소관-유도제, 키나아제 억제제, 호르몬 및 호르몬 길항제를 포함한다.
특정한 양태에서, 본원에서 제공되는 방법은 하나 이상의 면역항암(IO) 제제를 포함하는 2차 요법과 조합 시 유용하다. IO 제제는 대상체에서 면역 반응을 강화하고/하거나, 자극하고/하거나, 상향조절하는 데에 효과적인 것으로 공지되어 있다. 특정한 구현예에서, 본원에 기재된 암을 치료하는 방법과 조합한 IO 제제의 사용은 암을 치료하는 데 있어 상승 효과를 초래한다. IO 제제의 예는, 제한 없이, 소 분자 약물, 항체, 및 세포-기반 제제를 포함한다. 특정한 구현예에서, IO 제제는 인간 항체 또는 인간화 항체일 수 있는 단클론성 항체이다.
IO 제제는 자극성 수용체(예를 들어, 공동자극성 수용체)의 작용제, 또는 T 세포에 대한 억제성 신호의 길항제일 수 있다. 둘 다의 결과는 항원-특이적 T 세포 반응의 증폭을 포함한다. 이러한 IO 제제는 당해 분야에서 면역 관문 조절제(예를 들어, 면역 관문 억제제)로 또한 지칭된다. 특정한 구현예에서, IO 제제는 공동자극 및/또는 공동억제 경로를 조절하며, 항원-특이적 T 세포 반응의 기능을 증대시키고/시키거나 회복시킬 수 있다. 공동자극 및/또는 공동억제 경로에 관여된 분자의 예는, 제한 없이, 면역글로불린 상과(superfamily)(IgSF)의 구성원: 예를 들어, B7-1, B7-2, B7-H1(PD-L1), B7-DC(PD-L2), B7-H2(ICOS-L), B7-H3, B7-H4, B7-H5(VISTA), 및 B7-H6을 포함하는 막 단백질의 B7 과의 구성원; 예를 들어, CD40, CD40L, OX-40, OX-40L, CD70, CD27L, CD30, CD30L, 4-1BBL, CD137(4-1BB), TRAIL/아포2(Apo2)-L, TRAILR1/DR4, TRAILR2/DR5, TRAILR3, TRAILR4, OPG, RANK, RANKL, TWEAKR/Fnl4, TWEAK, BAFFR, EDAR, XEDAR, TACI, APRIL, BCMA, LTβR, LIGHT, DcR3, HVEM, VEGI/TL1A, TRAMP/DR3, EDAR, EDA1, XEDAR, EDA2, TNFR1, 림포톡신(Lymphotoxin) α/TNFβ, TNFR2, TNFα, LTβR, 림포톡신 α1β2, FAS, FASL, RELT, DR6, TROY, 및 NGFR을 포함하는 종양 괴사 인자(TNF) 상과의 구성원을 포함한다.
따라서, 특정한 구현예에서, 면역 관문 요법은 (i) 예를 들어, CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG-3, TIM-3, 갈렉틴 9, CEACAM-1, BTLA, CD69, 갈렉틴-1, TIGIT, CD113, GPR56, VISTA, 2B4, CD48, GARP, PD1H, LAIR1, TIM-1, 및 TIM-4를 포함하는 T 세포 활성을 억제하는 단백질의 길항제(예를 들어, 면역 관문 억제제); 및 (ii) 예를 들어, B7-1, B7-2, CD28, 4-1BB(CD137), 4-1BBL, ICOS, ICOS-L, OX40, OX40L, GITR, GITRL, CD70, CD27, CD40, DR3 및 CD28H를 포함하는 T 세포 활성화를 자극하는 단백질의 작용제인 하나 이상의 면역 관문 조절제의 사용을 포함한다.
특정한 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이 제2 요법은 하나 이상의 면역 관문 조절제를 표적으로 할 수 있다. 본 개시내용의 제2 요법에 의해 표적화될 수 있는 면역 관문 조절제(예를 들어, 면역 관문 억제제)는, 제한 없이, 아데노신 A2A 수용체(A2AR), B7-H3(CD276으로도 공지됨), B 및 T 림프구 감쇠제(BTLA), 세포독성 T-림프구-연관 단백질 4(CTLA-4, CD152로도 공지됨), 인돌아민 2,3-디옥시게나제(IDO), 킬러-세포 면역글로불린(KIR), 림프구 활성화 유전자-3(LAG3), 프로그래밍된 사망 1(PD-1), T-세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 3(TIM-3), T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제제(VISTA), 및 NKG2A를 포함할 수 있다.
특정한 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 암을 치료하는 방법은 면역 관문 억제제의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 특정한 예시적인 구현예에서, 면역 관문 억제제는 CTLA-4, PD-1, PD-L1, CD47, NKG2A, B7-H3, 및 B7-H4로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 관문 조절제를 표적으로 한다. 특정한 구현예에서, 면역 관문 억제제는 소 분자, 재조합 리간드, 재조합 수용체, 또는 항체일 수 있다. 면역 관문 억제제 항체는 인간화되거나, 인간이거나, 키메라화될 수 있거나 또는 당해 분야에 공지된 임의의 형태의 항체일 수 있다. 따라서, 특정한 예시적인 구현예에서, 면역 관문 억제제는 항-CTLA-4, 항-PD-1, 항-PD-L1, 항-CD47, 항-NKG2A, 항-B7-H3, 및 항-B7-H4로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체이다. 특정한 구현예에서, 면역 관문 억제제는 이필리무맙, 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 및 세미플리맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체이다.
특정한 구현예에서, 면역 관문 억제제는 PD-1의 이의 리간드 결합 파트너에의 결합을 억제할 수 있는 분자인 PD-1 결합 길항제이다. 특정한 구현예에서, PD-1 리간드 결합 파트너는 PD-L1 및/또는 PD-L2이다. 특정한 구현예에서, PD-L1 결합 길항제는 PDL1의 이의 결합 파트너에의 결합을 억제하는 분자이다. 특정한 구현예에서, PD-L1 결합 파트너는 PD-1 및/또는 B7-1이다. 특정한 구현예에서, PD-L2 결합 길항제는 PD-L2의 이의 결합 파트너에의 결합을 억제하는 분자이다. 특정한 구현예에서, PD-L2의 결합 파트너는 PD-1이다. 예시적인 항체는 미국 특허 번호 8,735,553, 8,354,509, 및 8,008,449에 기재되어 있으며, 이들의 개시내용은 그들 전문이 본원에 참조로 통합된다.
특정한 구현예에서, 면역 관문 억제제는 항-PD-1 항체(예를 들어, 인간 항체, 인간화 항체, 또는 키메라 항체)이다. 특정한 구현예에서, 항-PD-1 항체는 니볼루맙, 펨브로리주맙, 및 CT-011로 이루어진 군으로부터 선택된다. MDX-1106-04, MDX-1106, ONO-4538, BMS-936558, 및 OPDIVO로도 공지된 니볼루맙은 국제 특허 출원 번호 WO2006/121168에 기재된 항-PD-1 항체이며, 이의 개시내용은 그 전문이 본원에 통합된다. MK-3475, 머크(Merck) 3475, 람브롤리주맙, KEYTRUDA, 및 SCH-900475로도 공지된 펨브로리주맙은 국제 특허 출원 번호 WO2009/114335에 기재된 항-PD-1 항체이며, 이의 개시내용은 그 전문이 본원에 통합된다. 피딜리주맙으로도 공지된 CT-011은 국제 특허 출원 번호 WO2009/101611에 기재된 항-PD-1 항체이며, 이의 개시내용은 그 전문이 본원에 통합된다. 추가적인 항-PD-1 항체는 PDR001(노바티스(Novartis); WO2015/112900 참조), MEDI-0680(AMP-514)(아스트라제네카(AstraZeneca); WO2012/145493 참조), REGN-2810(사노피/리제너론(Sanofi/Regeneron); WO2015/112800 참조), JS001(타이저우 준시(Taizhou Junshi)), BGB-A317(베이진(Beigene); WO2015/35606 참조), INCSHR1210(SHR-1210)(인사이트/장쑤 항서 제약(Incyte/Jiangsu Hengrui Medicine); WO2015/085847 참조), TSR-042(ANB001)(테사라/어냅티시스바이오(Tesara/AnaptysBio); WO2014/179664 참조), GLS-010(욱시/하얼빈 글로리아 파마슈티컬스(Wuxi/Harbin Gloria Pharmaceuticals)), AM-0001(아르모/리간드(Armo/Ligand)), 또는 STI-1110(소렌토(Sorrento); WO2014/194302 참조)을 포함하며, 모든 문헌은 그들 전문이 본원에 참조로 통합된다.
특정한 구현예에서, 면역 관문 억제제는 PD-L1 결합 길항제, 예컨대 길항성 PD-L1 항체이다. 예시적인 항-PD-L1 항체는 티센트릭(아테졸리주맙), 더발루맙, 아벨루맙, 세미플리맙, STI-1014(소렌토; WO2013/181634 참조), 또는 CX-072(사이톰X(CytomX); WO2016/149201 참조)로부터 선택될 수 있다. 특정한 구현예에서, 면역 관문 억제제는 PD-L1 길항제, 예컨대 MEDI4736로도 공지된 더발루맙, MPDL3280A로도 공지된 아테졸리주맙, 또는 MSB00010118C로도 공지된 아벨루맙이다.
특정한 구현예에서, 면역 관문 억제제는 CTLA-4의 이의 리간드 결합 파트너에의 결합을 억제할 수 있는 분자인 CTLA-4 결합 길항제이다. CTLA-4는 T 세포의 표면 상에서 발견되며, 항원-제시 세포의 표면 상에서 각각 B7-1 및 B7-2로도 불리는 CD80 또는 CD86에 결합할 때 "오프(off)" 스위치로서 작용한다. CTLA4는 헬퍼 T 세포의 표면 상에서 발현되는 면역글로불린 상과의 구성원이며 T 세포에 억제성 신호를 전달한다. 특정한 구현예에서, 면역 관문 억제제는 항-CTLA-4 항체(예를 들어, 인간 항체, 인간화 항체, 또는 키메라 항체)이다. 항-CTLA-4 항체는 미국 특허 번호 8,119,129, 국제 특허 출원 번호 WO 01/14424, WO 98/42752; WO 00/37504(CP675,206, 트레멜리무맙으로도 공지됨; 예전에는 티실리무맙), 미국 특허 번호 6,207,156; Hurwitz 등, 1998에 개시되어 있으며, 이들의 개시내용은 그들 전문이 본원에 참조로 통합된다. CTLA-4에 결합하기 위한 당해 분야에서 인식된 임의의 이들 항체와 경쟁하는 항체가 사용될 수 있으며, 예를 들어, 인간화 CTLA-4 항체는 국제 특허 출원 번호 WO2001014424, WO2000037504, 및 미국 특허 번호 8,017,114에 기재되어 있고, 이들의 개시내용은 그들 전문이 본원에 참조로 통합된다. 예시적인 항-CTLA-4 항체는 이필리무맙(10D1, MDX-010, MDX-101, 및 여보이(Yervoy)로도 공지됨)을 포함한다.
특정한 구현예에서, 면역 관문 억제제는 B7-H4에 대한 항체(예를 들어, 국제 특허 출원 번호 WO 2013025779 및 WO2013067492에 개시된 것들, 이들의 개시내용은 그들 전문이 본원에 참조로 통합된다)이다. 특정한 구현예에서, 면역 관문 억제제는 제한 없이 인간 B7-H3을 중화하는 항체를 포함하는 B7-H3에 대한 항체이다(예를 들어, 미국 특허 공개 번호 20120294796에서 BRCA84D로서 개시된 MGA271 및 유도체, 이의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 통합된다). 특정한 구현예에서, 면역 관문 억제제는 NKG2A에 대한 항체이며, 예를 들어, Montfoort 등 Cell (2018) 175(7):1744-1755를 참조하고, 이의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 통합된다.
특정한 구현예에서, 면역 관문 억제제는 대식세포 관문 차단이다. 예를 들어, CD47은 우세한 대식세포 관문으로서 식별되었으며, 대식세포에 의한 식세포 작용의 종양 회피로 이어지는 골수성 악성종양에서 과발현되는 것으로 발견되었다. CD47 차단은 백혈병 세포의 집어삼킴을 초래하는 것으로 나타났으며, 전-임상적 데이터는 AML 및 골수이형성 증후군(MDS)을 포함하는 다수의 혈액학적 악성종양에서 항-암 활성을 나타내었다. 예를 들어, Chao 등 Frontiers in Oncology (2019) 9:1380을 참조한다. 따라서, 특정한 구현예에서, 면역 관문 억제제는 CD47에 대한 항체이다.
특정한 양태에서, 본원에서 제공되는 방법은 하나 이상의 항-혈관신생 제제를 포함하는 2차 요법과 조합 시 유용하다. 따라서, 본원에서 제공되는 방법은 항-혈관신생 요법과 조합 시 유용하다. 새로운 혈관의 형성, 또는 혈관신생은 종양에 헌신적인 혈액 공급을 제공하여 이의 성장에 필요한 산소 및 필수 영양소를 공급함으로써 암 성장 및 전이를 촉진한다. 제한 없이, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), 및 섬유아세포 성장 인자(FGF)를 포함하는 혈관신생 및 연관된 성장 인자를 표적으로 하는 요법은 새로운 혈관 성장을 억제하는 것으로 나타났다.
많은 항-혈관신생 제제가 당해 분야에 공지되어 있으며 본원에서 제공되는 방법과 조합하여 사용하기에 적합할 것이다. 예시적인 항-혈관신생 제제는, 제한 없이, 생리적 제제, 예컨대 성장 인자(예를 들어, ANG-2, NK1, 2, 4(HGF), 형질전환 성장 인자 베타(TGF-β)), 시토카인(예를 들어, 인터페론, 예컨대 IFN-α, -β, -γ, 혈소판 인자 4(PF-4), PR-39), 프로테아제(예를 들어, 절단된 AT-III, 콜라겐 XVIII 단편(엔도스타틴)), HmwKallikrein-d5 플라스민 단편(안지오스타틴), 프로트롬빈-F1-2, TSP-1), 프로테아제 억제제(예를 들어, 메탈로프로테아제의 조직 억제제, 예컨대 TIMP-1, -2, 또는 -3; 마스핀; 플라스미노겐 활성화제-억제제, 예컨대 PAI-1; 색소 상피성 유도 인자(PEDF)), 툼스타틴(Tumstatin), 항체 제품(예를 들어, 콜라겐-결합 항체 HUIV26, HU177, XL313: 항-VEGF; 항-인테그린(예를 들어, 비탁신(Vitaxin), (Lxsys)), 및 글리코시다아제(예를 들어, 헤파리나아제-I 또는 -II)를 포함한다. 또한, 제한 없이, VEGF, VEGF 수용체, EGFR, bFGF, PDGF-B, PD-ECGF, TGF-α를 포함하는 TGF, 엔도글린, Id 단백질, 다양한 프로테아제, 산화질소 신타아제, 아미노펩티다아제, 트롬보스폰딘, k-ras, Wnt, 사이클린-의존성 키나아제, 미세소관, 열 충격 단백질, 헤파린-결합 인자, 신타아제, 콜라겐 수용체, 인테그린, 및 표면 프로테오글라이칸 NG2에 직접 대항하는 분자를 포함하는, 혈관신생-연관 항원(단백질 및 폴리펩티드를 포함함)에 대한 길항제인 분자가 적합하다. 항-혈관신생 잠재력을 갖고 있다고 공지되거나 여겨지는 "화합물" 또는 변형된 생리적 제제는, 예를 들어, 빈블라스틴, 탁솔, 케토코나졸, 탈리도마이드, 돌레스타틴, 콤브레스타틴 A, 라파마이신(Guba, 등 Nature Medicine (2002) 8:128-135, 이의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 통합된다), CEP-7055(세팔론, 인크.(Cephalon, Inc.)로부터 이용가능함), 플라본 아세트산, 베이(Bay) 12-9566(바이어 코프.(Bayer Corp.)), AG3340(아고론 인크.(Agouron, Inc.)). CGS. 27023A(노바티스), 테트라사일신 유도체(예를 들어, COL-3(콜라게닉스 인크.(Collagenix, Inc.))), 네오바스타트(애터나(Aeterna)), BMS 275291(브리스톨-마이어 스퀴브(Bristol-Myers Squibb)), 낮은 용량의 5-FU, 낮은 용량의 메토트렉세이트(MTX), 이르소플라딘, 라디시콜, 사이클로스포린, 카프토릴, 셀레콕시브, D45152-황산화 다당류, 양이온 단백질(프로타민), 양이온 펩티드-VEGF, 수라민(폴리설포네이티드 나프틸 우레아), VEGF의 기능 또는 생산을 방해하는 화합물(예를 들어, SU5416 또는 SU6668(수젠(Sugen)), PTK787/ZK22584(노바티스)), 디스타마이신 A, 안지오자임(리보자임), 이소플라비노이드, 스타우로스포린 유도체, 제니스테인, EMD121974(머크 KcgaA), 티르포스틴, 이소퀴놀론, 레티노산, 카복시아미도트리아졸, TNP-470, 옥트레오티드, 2-메톡시에스트라디올, 아미노스테롤(즉, 스쿠알라민), 글루타티온 유사체(예를 들어, N-아세틸-L-시스테인), 콤브레타스타틴 A-4(옥시젠), Eph 수용체 차단제(Himanen 등 Nature (2001) 414(6866):933-938, 이의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 통합된다), Rh-안지오스타틴, Rh-엔도스타틴(국제 특허 출원 번호 WO 01/93897을 참조하며, 이의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 통합된다), 사이클릭-RGD 펩티드, 아큐틴-디스인테그린, 벤조디아제핀, 인간화 항-avb3 Ab, Rh-PAI-2, 아밀로리드, p-아미도벤즈아미딘, 항-uPA ab, 항-uPAR Ab, L-페닐알라닌-N-메틸아미드(예를 들어, 바티미스타트, 마리마스타트), AG3340, 및 미노사이클린을 포함한다.
특정한 구현예에서, 항-혈관신생 제제는 항-VEGF 항체이다. 예시적인 항-VEGF 항체는 VEGF에 대한 충분한 친화도 및 특이성으로 결합하여 VEGF의 생물학적 활성을 감소시키거나 억제할 수 있는 임의의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 특정한 구현예에서, 항-VEGF 항체는, 제한 없이, 하이브리도마 ATCC HB 10709에 의해 생산되는 단클론성 항-VEGF 항체 A4.6.1과 같은 에피토프에 결합하는 단클론성 항체; Presta 등 Cancer Research (1997) 57:4593-4599에 따라 생성된 재조합 인간화 항-VEGF 단클론성 항체를 포함하며, 이의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 통합된다. 특정한 구현예에서, rhuMAb VEGF 또는 AVASTIN으로도 공지되어 있는 항-VEGF 항체는 베바시주맙(BV)이다. 베바시주맙 및 기타 인간화 항-VEGF 항체는 미국 특허 번호 6,884,879에 추가로 기재되어 있으며, 이의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 통합된다. 추가적인 항체는, 예를 들어, 국제 특허 출원 번호 WO2005/012359 및 WO2005/044853에 기재된 바와 같이, G6-31 및 B20-4.1을 포함하며, 이들의 개시내용은 그들 전문이 본원에 참조로 통합된다. 추가적인 항-VEGF 항체는 다음의 미국 특허 번호 7,060,269, 6,582,959, 6,703,020, 및 6,054,297; 국제 특허 공개 번호 WO98/45332, WO 96/30046, 및 WO94/10202; 유럽 특허 번호 EP 0666868B1; 미국 특허 공개 번호 2006009360, 20050186208, 20030206899, 20030190317, 20030203409, 및 20050112126; 및 Popkov 등, Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004)에 기재되어 있으며, 이들의 개시내용은 그들 전문이 본원에 참조로 통합된다. 추가적인 VEGF 억제제는 VEGFR 및 PDGFR 둘 다에 대한 활성이 있는 VEGF-수용체 티로신-키나아제 억제제(RTKI)의 군에 속하는 수니티닙(SUTENT®, 화이자(Pfizer)) 및 소라페닙(NEXAVAR®, 오닉스 및 바이엘 헬스케어 파마슈티컬스(Onyx and Bayer Healthcare Pharmaceuticals))을 포함한다. 특정한 구현예에서, 항-혈관신생 제제는 수니티닙이다. 여전히 다른 VEGF 억제제는 혈관 내피 성장인자 수용체(VEGFR)에 리간드가 결합하는 것을 예방하는 융합 단백질을 포함한다. 이들 융합 단백질은 때때로 VEGF 트랩(trap)으로 지칭되며, 애플리버셉트를 포함한다. 따라서, 특정한 구현예에서, 항-혈관신생 요법은 베바시주맙, 애플리버셉트, 수니티닙, 및 소라페닙으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항-혈관신생 제제를 포함한다.
특정한 구현예에서, 본원에서 제공되는 방법은 하나 이상의 폴리(ADP-리보스) 폴리머라아제(PARP) 억제제를 포함하는 제2 요법과 조합 시 유용하다. 따라서, 본원에서 제공되는 방법은 PARP 억제제 요법과 조합 시 유용하다. PARP는 DNA 수선, 유전자 발현, 세포 주기 제어, 세포내 트래픽킹(trafficking) 및 에너지 대사를 포함하여, 세포에서의 많은 기능에 관여된 단백질의 과이다. PARP 단백질은 염기 절제 수선 경로를 통해 단일 가닥 절단 수선에서 중요한 역할을 한다. PARP 억제제는 존재하는 DNA 수선 결함, 예컨대 BRCA1 및 BRCA2가 있는 종양에 대한 단일요법으로서, 및 DNA 손상을 유도하는 항암제와 함께 투여될 때 조합 요법으로서의 활성을 나타내었다. PARP 억제제는 소 분자, 핵산, 핵산 유사체 또는 유도체, 펩티드, 펩티드모방체(peptidomimetic), 단백질, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 단당류, 이당류, 삼당류, 올리고당류, 다당규, 지질, 글리코사미노글리칸, 생물학적 재료로부터 만들어진 추출물, 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 예시적인 PARP 억제제는, 제한 없이, 올라파립, 벨리파립 또는 이의 전구약물, 루카파립, 탈라조파립, 니라파립, INO-1001, AZD2461, SC10914, BGB-290, 및 플루조파립을 포함한다. 따라서, 특정한 구현예에서, PARP 억제제 요법은 올라파립, 니라파립, 루카파립, 및 벨리파립으로 이루어진 군으로부터 선택되는 PARP 억제제를 포함한다.
암의 치료 시 유용한 방법(예를 들어, 암 요법) 및 제2 요법(예를 들어, 면역 관문 요법, 항-혈관신생 요법, PARP 억제제 요법)을 포함하는 본원에 기재된 조합 요법은, 암 요법 및 제2 요법이 동시에(예를 들어, 실질적으로 동시에) 또는 순차적으로 대상체에 투여되는 치료 섭생을 포괄한다. 예를 들어, 본원에 기재된 암 요법은 제2 요법과 함께 대상체에 실질적으로 동시에 투여될 수 있다. 실질적으로 동시의 투여는, 예를 들어, 고정된 비율의 각각의 요법을 갖는 단일 복용량 형태 또는, 각각의 요법에 대한 여러 가지 단일 복용량 형태를 대상체에 투여함으로써 달성될 수 있다. 각각의 요법은, 제한 없이, 경구 경로, 정맥내 경로, 종양내 경로, 근육내 경로, 및 점막 조직을 통한 직접적인 흡수를 포함하는 임의의 적절한 경로에 의해 순차적으로 또는 실질적으로 동시에 투여될 수 있다.
특정한 구현예에서, 암 요법 및 제2 요법은 같은 경로에 의해 또는 상이한 경로에 의해 투여된다. 예를 들어, 선택된 조합의 암 요법은 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있는 동시에 조합의 제2 요법은 종양내로 투여될 수 있다. 대안적으로, 예를 들어, 모든 요법은 정맥내로 투여될 수 있거나 또는 모든 치료제는 종양내로 투여될 수 있다.
특정한 구현예에서, 조합 요법은 기타 생물학적으로 활성인 성분 및 비-약물 요법(예를 들어, 수술 또는 방사선 치료)와 조합한 암 요법 및 제2 요법의 투여를 포함할 수 있다. 조합 요법이 비-약물 치료를 추가로 포함하는 경우에, 비-약물 치료는 요법 및 비-약물 치료의 조합의 공동-작용으로부터의 유익한 효과가 성취되는 한 임의의 적합한 시간에 수행될 수 있다.
E. 약제학적 조성물 및 제형
약제학적 조성물 및 제형, 예컨대 단위 용량 형태 조성물을 포함하는, 본 개시내용의 백혈병 기원의 변형된 세포(예를 들어, 하향조절된 CD47 경로를 포함하는 백혈병 기원의 변형된 세포)를 포함하는 면역원성 조성물이 또한 제공된다. 약제학적 조성물 및 제형은 일반적으로 하나 이상의 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 본 개시내용의 요법은 조성물, 예를 들어, 백혈병 기원의 변형된 세포(예를 들어, 하향조절된 CD47 경로를 포함하는 백혈병 기원의 변형된 세포) 및 임의로 약제학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 약제학적 조성물(예를 들어, 면역원성 약제학적 조성물) 중에 구성될 수 있다.
특정한 구현예에서, 조성물은 본 개시내용의 백혈병 기원의 변형된 세포(예를 들어, 하향조절된 CD47 경로를 포함하는 백혈병 기원의 변형된 세포)를 포함한다. 특정한 구현예에서, 조성물은 본원에 기재된 바와 같이, CD47 및/또는 CD47 경로의 구성원을 격감시키고/시키거나 억제하는 제제(예를 들어, 결합 폴리펩티드, 소 분자, 소 RNA, 또는 조작된 뉴클레아제 시스템)을 추가로 포함한다. CD47 및/또는 CD47 경로의 구성원을 격감시키고/시키거나 억제하는 제제는 유효량으로 조성물 중에 공동-제형화되어 백혈병-기원의 변형된 세포에 포함된 CD47 및/또는 CD47 경로의 구성원의 격감 및/또는 억제를 초래할 수 있다.
본 개시내용의 하향조절된 CD47 경로를 포함하는 백혈병 기원의 변형된 세포는 CD47 경로의 구성원을 격감시키고/시키거나 억제하는 제제로 사전-코팅될 수 있다. 특정한 구현예에서, 하향조절된 CD47 경로를 포함하는 백혈병 기원의 변형된 세포는 CD47을 격감시키고/시키거나 억제하는 제제로 사전-코팅된다. 예를 들어, 하향조절된 CD47 경로를 포함하는 백혈병 기원의 변형된 세포는 항-CD47 항체로 사전-코팅될 수 있다. 예를 들어, Li 등, Nature Comm. (2020) 11: 581을 참조한다. 특정한 구현예에서, 조성물은, 예를 들어, 백혈병 기원의 변형된 세포를 코팅하는 항-CD47 항체를 추가로 포함한다. 그러하여, 본 개시내용은 백혈병 기원의 변형된 세포 및 항-CD47 항체를 포함하는 조성물(예를 들어, 면역원성 조성물)을 제공한다. 본 개시내용은 하향조절된 CD47 경로를 포함하는 백혈병 기원의 변형된 세포 및 항-CD47 항체를 포함하는 조성물(예를 들어, 면역원성 조성물)을 또한 제공한다.
특정한 구현예에서, 조성물은 적어도 하나의 추가적인 치료제(예를 들어, 세포증식억제성 또는 항암 활성을 갖는 제2 요법)을 포함한다.
용어 "약제학적 제형"은, 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 허용하는 그러한 형태로 있으며, 제형이 투여될 대상체에 용납할 수 없을 정도로 독성이 있는 추가적인 구성성분을 함유하지 않은 조제물을 지칭한다. "약제학적으로 허용가능한 담체"는 활성 성분 이외의, 대상체에 비독성인, 약제학적 제형 중의 성분을 지칭한다. 따라서, 다양한 적합한 제형이 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체는, 이에 제한되지는 않으나, 완충제, 부형제, 안정화제, 또는 보존제를 포함한다. 특정한 구현예에서, 담체의 선택은 특정한 세포에 의해 및/또는 투여의 방법에 의해 부분적으로 결정된다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 생리적으로 상용성인 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수지연제 등을 포함한다. 특정한 구현예에서, 백혈병 기원의 변형된 세포(예를 들어, 하향조절된 CD47 경로를 포함하는 백혈병 기원의 변형된 세포)를 함유하는 조성물에 대한 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여(예를 들어, 주사 또는 주입에 의해)에 적합하다. 특정한 구현예에서, 적합한, 예를 들어, 소 분자 기반 제2 요법의 경우에, 제2 요법을 함유하는 조성물에 대한 담체는 비-비경구, 예를 들어, 경구 투여에 적합하다. 본 개시내용의 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 염, 항산화제, 수성 및 비-수성 담체, 및/또는 보조제, 예컨대 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 포함할 수 있다. 특정한 구현예에서, 약제학적 조성물은 보존제를 함유할 수 있다. 적합한 보존제는, 예를 들어, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 벤조산나트륨, 및 염화벤잘코늄을 포함할 수 있다. 특정한 구현예에서, 2가지 이상의 보존제의 혼합물이 사용된다. 보존제 또는 이의 혼합물은 총 조성물의 약 0.0001 중량% 내지 약 2 중량%의 양으로 전형적으로 존재한다. 담체는, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에 의해 기재된다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 이용되는 복용량 및 농도에서 수용체에 일반적으로 비독성이며, 이에 제한되지는 않으나: 완충제, 예컨대 인산염, 구연산염, 및 기타 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 겔라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; 킬레이팅제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 설탕, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 카운터-이온, 예컨대 나트륨; 금속 복합체(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.
특정한 구현예에서 완충제가 조성물 중에 포함된다. 적합한 완충제는, 예를 들어, 시트르산, 시트르산나트륨, 인산, 인산칼륨, 및 다양한 기타 산 및 염을 포함한다. 특정한 구현예에서, 2가지 이상의 완충제의 혼합물이 사용된다. 완충제 또는 이의 혼합물은 총 조성물의 약 0.001 중량% 내지 약 4 중량%의 양으로 전형적으로 존재한다. 투여가능한 약제학적 조성물을 제조하기 위한 방법은 공지되어 있다. 예시적인 방법은, 예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21판 (2005년 5월 1일)에 보다 상세히 기재되어 있다.
제형은 수용액을 포함할 수 있다. 제형 또는 조성물은, 각각의 활성이 서로 악영향을 미치지 않는 경우에, 세포로 치료되는 특정한 적응증, 질환, 또는 병태에 유용한 하나 이상의 활성 성분, 예컨대 세포에 상호보완적인 활성이 있는 것들을 또한 함유할 수 있다. 이러한 활성 성분은 의도된 목적에 유효한 양으로 조합되어 적합하게 존재한다. 이에 따라, 특정한 구현예에서, 약제학적 조성물은 기타 약제학적으로 활성인 제제 또는 약물, 예컨대 화학요법제, 예를 들어, 아스파라기나제, 부설판, 카보플라틴, 시스플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 플루오로우라실, 젬시타빈, 하이드록시우레아, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 리툭시맙, 빈블라스틴, 및/또는 빈크리스틴을 추가로 포함한다. 특정한 구현예에서 약제학적 조성물은 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하기에 유효한 양으로, 예컨대 치료적으로 유효한 또는 예방적으로 유효한 양으로 세포를 함유한다. 특정한 구현예에서 치료적 또는 예방적 효능은 치료된 대상체의 주기적인 평가에 의해 모니터링된다. 바람직한 복용량은 세포의 단일 볼루스(bolus) 투여에 의해, 세포의 다중 볼루스 투여에 의해, 또는 세포의 연속적인 주입 투여에 의해 전달될 수 있다.
제형은, 경구, 정맥내, 복강내, 피하, 폐, 경피, 근육내, 비강내, 협측, 설하, 또는 좌약 투여를 위한 것을 포함한다. 특정한 구현예에서, 세포 집단은 비경구적으로 투여된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "비경구"는 정맥내, 근육내, 피하, 직장, 질, 복강내 투여를 포함한다. 특정한 구현예에서, 세포는 정맥내, 복강내, 또는 피하 주사에 의한 말초 전신 전달을 사용하여 대상체에 투여된다.
특정한 구현예에서, 암을 치료하기 위한 방법은 백혈병 기원의 변형된 세포(예를 들어, 하향조절된 CD47 경로를 포함하는 백혈병 기원의 변형된 세포)를 포함하는 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 면역원성 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함한다. 특정한 구현예에서, 면역원성 조성물은 피내 투여를 위해 제형화된다. 특정한 구현예에서, 면역원성 조성물의 투여는 피내이다. 특정한 구현예에서, 면역원성 조성물은 복강내 투여를 위해 제형화된다. 특정한 구현예에서, 면역원성 조성물의 투여는 복강내이다. 특정한 구현예에서, 면역원성 조성물은 종양내 투여를 위해 제형화된다. 특정한 구현예에서, 면역원성 조성물의 투여는 종양내이다.
특정한 구현예에서, 면역원성 조성물은 국소 제어 림프절 투여를 위해 제형화된다. 특정한 구현예에서, 면역원성 조성물의 투여는 국소 제어 림프절 내로의 것이다. 특정한 구현예에서, 국소 제어 림프절 투여는 난소암의 초기 치료 동안 또는 그 다음에 수행된다. 특정한 구현예에서, 국소 제어 림프절 투여는 난소암의 초기 치료 동안 또는 그 다음에 수행되며, 여기서 초기 치료는 수술을 포함한다.
특정한 구현예에서 조성물은 멸균 액체 조제품, 예를 들어, 등장성 수용액, 현탁액, 에멀전, 분산액, 또는 점성 조성물로서 제공되며, 이들은 일부 양태에서 선택된 pH로 완충될 수 있다. 액체 조제품은 보통 겔, 기타 점성 조성물, 및 고체 조성물보다 제조하기가 더 쉽다. 추가적으로, 액체 조성물은 특히 주사를 통해 투여하기가 다소 더 편리하다. 반면에, 점성 조성물이 특이적인 조직과의 보다 긴 접촉 기간을 제공하기에 적절한 점도 범위 내에서 제형화될 수 있다. 액체 또는 점성 조성물은, 예를 들어, 물, 식염수, 인산 완충 식염수, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있는 담체를 포함할 수 있다.
멸균 주사가능한 용액은 세포를 용매에, 예컨대 적합한 담체, 희석제, 또는 부형제, 예컨대 멸균수, 생리 식염수, 글루코스, 덱스트로스 등과의 혼합물에 혼입함으로써 제조될 수 있다. 조성물은 투여의 경로 및 바람직한 조제품에 따라, 보조 물질, 예컨대 습윤제, 분산제, 또는 유화제(예를 들어, 메틸셀룰로오스), pH 완충제, 겔화 또는 점도 강화 첨가제, 보존제, 향미제, 및/또는 색소를 함유할 수 있다. 일부 양태에서, 적합한 조제품을 제조하기 위해 표준 연구서가 참고될 수 있다. 생체내 투여를 위해 사용될 수 있는 제형은 일반적으로 멸균되어 있다. 멸균성은, 예를 들어, 멸균 여과 멤브레인을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
항균 보존제, 항산화제, 킬레이팅제, 및 완충액을 포함하는, 조성물의 안정성 및 멸균성을 강화하는 다양한 첨가제가 첨가될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항균 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 및 소르브산에 의해 보장될 수 있다. 주사가능한 약제학적 형태의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 겔라틴의 사용에 의해 유발될 수 있다.
본 개시내용의 약제학적 조성물 중 활성 성분의 실제 복용량 수준은, 환자에의 지나친 독성 없이, 특정한 환자, 조성물, 및 투여의 방식에 대해 바람직한 치료적 반응을 달성하기에 유효한 활성 성분의 양을 수득하도록 다양할 수 있다. 선택된 복용량 수준은 이용되는 본 개시내용의 특정한 조성물의 활성, 투여의 경로, 투여의 시간, 이용되는 특정한 화합물의 배설률, 치료의 지속기간, 기타 약물, 이용되는 특정한 조성물과 조합하여 사용된 화합물 및/또는 재료, 연령, 성별, 체중, 조건, 치료되는 환자의 일반적인 건강 및 이전의 병력, 및 의술에서 널리 공지된 유사 인자를 포함하여 다양한 약동학적 인자에 의존할 것이다. 본 개시내용의 조성물은 당해 분야에 널리 공지된 하나 이상의 다양한 방법을 사용하여 하나 이상의 투여의 경로를 통해 투여될 수 있다. 당업자에 의해 인식될 바와 같이, 투여의 경로 및/또는 방식은 바람직한 결과에 따라 다양할 것이다.
특정한 구현예에서, 조성물은 동결보존제(CPA)를 포함한다. 세포의 동결보존을 위한 방법이 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, C. B. Morris, "Cryopreservaton of Animal and Human Cell Lines" (2007), in Methods in Molecular Biology, vol 368: Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols, 2nd Ed. (J. G. Day and G. N. Stacey eds.), Humana Press Inc. Totowa, N.J., pp. 227-236을 참조하며, 이의 전문은 본원에 참조로 통합된다. 특정한 구현예에서, CPA를 포함하는 조성물은 매우 낮은 온도의 사용을 허용하여 조성물 중에 함유된 재료(예를 들어, 본원에 기재된 백혈병 기원의 변형된 세포)의 구조적 측면을 보존한다. 일반적으로, 동결보존 및 CPA의 사용은 비정질 상 중의 조성물의 고형화를 허용한다. 대개 액체인 CPA는 동결보존 과정으로부터의 동해를 감소시킨다. CPA는 2개의 카테고리로 나눠질 수 있다: (1) 세포막-투과 동결보존제, 예컨대 디메틸 설폭사이드(DMSO), 글리세롤, 및 1,2-프로판디올; 및 (2) 비막-투과 동결보존제, 예컨대 2-메틸-2,4-펜탄디올 및 중합체, 예컨대 폴리비닐 피롤리돈, 히드록시에틸 전분, 및 다양한 당. 적합한 CPA는, 제한 없이, CELLBANKER® 시리즈의 CPA, CRYOSTOR® 시리즈의 CPA, 디메틸설폭사이드(DMSO), 에틸렌 글리콜, 글리세롤, 트레할로스, 프로필렌 글리콜 등을 포함한다. 추가로, 바이오소재, 예컨대 알기네이트, 폴리비닐 알코올, 및 키토산이 통상적인 소 분자와 함께 얼음 결정 성장을 방해하는 데 사용될 수 있다.
본원에서 언급되거나 인용된 기사, 특허, 및 특허 출원의 내용, 및 모든 기타 문서 및 전자적으로 이용가능한 정보는 이로써, 각각의 개별적인 간행물이 구체적이고 개별적으로 참조로 통합된 것으로 표시된 것과 같은 정도로 그들 전문이 참조로 통합된다. 출원인은 임의의 이러한 기사, 특허, 특허 출원, 또는 기타 물리적 및 전자적 문서로부터의 임의의 및 모든 자료 및 정보를 본 출원에 물리적으로 통합할 권리를 보유한다.
본 발명은 이의 구체적인 구현예를 참조하여 기재되었지만, 본 발명의 진정한 사상 및 범주를 벗어나지 않으면서 다양한 변경이 이루어질 수 있고 등가물이 대체될 수 있다는 사실이 당업자에 의해 이해되어야 한다. 본원에 개시된 구현예의 범주를 벗어나지 않고 적합한 등가물을 사용하여 본원에 기재된 방법의 기타 적합한 변형 및 적용이 이루어질 수 있다는 사실이 당업자에게 용이하게 명백할 것이다. 더욱이, 특정한 상황, 재료, 물질의 조성, 과정, 과정 단계 또는 단계들을 본 발명의 목적, 사상 및 범주에 적용하도록 많은 변형이 이루어질 수 있다. 모든 이러한 변형은 여기에 첨부된 청구범위의 범주 내에 있는 것으로 의도된다. 이제 특정한 구현예를 상세히 기재하였으나, 이는 단지 예시의 목적을 위해 포함되고 제한하려는 것으로 의도가 아닌 다음의 실시예를 참조하여 더욱 명확하게 이해될 것이다.
F. 실험 실시예
실시예 1: 항원 제시 세포에 의한 DCP-001의 처리
DCP-001은 세포주 DCOne의 분화 및 성숙을 통해 생성된 성숙 수지상 세포(DC) 표현형을 갖는 백혈병 기원의 변형된 세포를 포함하는 동종이계 세포-기반 백신이다. DCOne는 수탁 번호 DSMZ ACC3189로 2012년 11월 15일에 DSMZ와 부다페스트 조약의 조건 하에서 수탁되었다. 수탁된 DCOne 세포주로부터 성숙 세포를 수득하는 과정은 예를 들어, EP2931878B1에 기재되어 있으며, 이의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 통합된다.
DCP-001은 미성숙 단핵구 유래 수지상 세포(iMoDC)에 의해 세포내이입되는 것으로 발견되었다. VPD450 염료를 사용하여 iMoDC를 표지하고 CFSE 염료를 사용하여 DCP-001 또는 DCOne 간세포를 표지하였다. VPD450-표지된 iMoDC를 CFSE-표지된 DCP-001 또는 DCOne 간세포와 (1:1 비율) 4시간 동안 37℃에서 공동배양하였다. 그후에 세포를 항원 제시 세포(APC)-접합된 항-CD274에 대해 30분 동안 4℃에서 염색하였다. 도 1은 iMoDC에 의한 DCP-001 또는 DCOne 간세포의 흡수 백분율을 나타내며, 이는 총 APC-양성 iMoDC 개체수 중에서 VPD450/CFSE 양성 개체수로서 결정하였다. 도 1에서, 데이터는 16회 내지 25회의 독립적인 실험을 나타낸다; ****는 p < 0.0001인 독립표본 t-검정에 의해 계산된 바와 같은 통계적으로 유의적인 차이를 표시한다.
DCP-001은 말초 혈액에서 항원 제시 세포에 의해 흡수된 것으로 또한 발견되었다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 CFSE-표지된 DCP-001 또는 DCOne 간세포와 1:1 비율로 4시간 동안 공동배양하였다. 공동배양 4시간 후, 세포를 단핵구(CD14+), 골수성 DC(CD11chi, HLA-DR+, CD14-), 형질세포성 DC(CD304+, HLA-DR+), T 세포(CD3+), B 세포(CD19+)로 식별하였다. 흡수를 정량화하기 위해, PBMC의 특이적 소집단에서의 VPD450/CFSE-양성 집단의 백분율을 결정하였다. 도 2는 표시된 바와 같이, PBMC의 각각의 특이적 소집단에 의한 DCP-001 또는 DCOne 간세포의 흡수 백분율을 나타낸다. 도 2에서, 데이터는 3회의 독립적인 실험을 나타내고, 평균 ± SEM로서 표현된다; *는 홀름-시닥(Holm-Sidak) 방법을 사용하여 p < 0.05; 및 ** p < 0.01인 독립표본 t-검정에 의해 계산된 바와 같은 통계적으로 유의적인 차이를 표시한다.
실시예 2: DCP-001의 처리 시 포스파티딜세린(PS) 및 CD47의 역할
항원 제시 세포에 의한 DCP-001의 처리에 관여된 경로를 설명하기 위해, 호스트(host) iMoDC에 의한 DCP-001 또는 DCOne 간세포(prog)의 흡수에서의 청소체(scavenger) 수용체의 역할을 조사하였다. 청소체 수용체는 iMoDC에 의한 DCP-001의 흡수에서 불필요한 것으로 발견되었다. 폴리이노신산(폴리I; 50μg/mL), 항-CD36 항체(50μg/mL), 항-CD204 항체(50μg/mL), 또는 항-LOX-1 항체(50μg/mL)로부터 선택된 제제를 실시예 1에 기재된 바와 같은 iMoDC 흡수 검정 동안 첨가하였다. 도 3은 각각의 제제의 존재 하에서의 iMoDC에 의한 DCP-001 또는 DCOne 간세포의 흡수 백분율을 나타낸다. 도 3에서, 데이터는 3회의 독립적인 실험을 나타내며 평균 ± SEM로서 표현된다.
DCP-001 및 DCOne 간세포의 표면 상의 포스파티딜세린(PS: 도 4a), 칼레티쿨린(CRT: 도 4b), 및 CD47(도 4c)의 발현을 유세포분석에 의해 결정하였다. DCP-001은 PS, CRT, 및 CD47을 발현하는 것으로 발견되었다. 도 4a 내지 도 4c에서, 데이터는 DCP-001 및 DCOne 간세포의 4개 내지 6개 뱃치(batch)로부터 수득된 값을 나타내며, 평균 ± SEM로서 표현된다. 도 4a에서, *** 는 p < 0.001인 독립표본 t-검정에 의해 계산된 바와 같은 통계적으로 유의적인 차이를 표시한다.
항원 제시 세포에 의한 DCP-001의 흡수에 대한 PS 및 CRT("나를 먹으세요" 신호)의 역할을 평가하기 위해, 정제된 재조합 아넥신 V 또는 CRT-특이적 항체를 DCP-001 또는 DCOne 간세포와 공동배양된 iMoDC(각각 도 5a 및 5b)에 첨가하였다. 도 5a에 도시된 바와 같이, 공동배양물에의 아넥신 V의 첨가는 DCP-001의 흡수의 백분율의 유의적인 감소를 초래하였다. 도 5a에서, 데이터는 3회 내지 4회의 독립적인 실험을 나타내고 평균 ± SEM로서 표현된다; *는 p < 0.05인 대응표본 t-검정에 의해 계산된 바와 같은 통계적으로 유의적인 차이를 표시한다. 도 5b에 도시된 바와 같이, 공동배양물에의 CRT-특이적 항체의 첨가는 DCP-001의 흡수의 정규화된 백분율의 유의적인 감소를 초래하였다. 흡수의 정규화된 백분율은 CRT-특이적 항체의 존재 하에서의 흡수를 대조군(항체의 부재 하, 100%로 설정됨)에 대해 정규화함으로써 계산하였다. 도 5b에서, 데이터는 3회 내지 4회의 독립적인 실험을 나타내고 평균 ± SEM로서 표현된다; **는 p < 0.01인 대응표본 t-검정에 의해 계산된 바와 같은 통계적으로 유의적인 차이를 표시한다.
항원 제시 세포에 의한 DCP-001의 흡수에서의 "나를 먹지 마세요" 신호 CD47의 역할을 평가하기 위해, CD47을 표적으로 하는 단클론성 항체를 DCP-001 또는 DCOne 간세포와 공동배양된 iMoDC(도 5b)에 첨가하였다. 도 5b에 도시된 바와 같이, CD47의 차단은 DCP-001 및 DCOne 간세포 둘 다의 강화된 흡수를 초래하였다. 도 5b에서, 데이터는 3회 내지 4회의 독립적인 실험을 나타내고 평균 ± SEM로서 표현된다; *는 p < 0.05; 및 **p < 0.005인 대응표본 t 검정에 의해 계산된 바와 같은 통계적으로 유의적인 차이를 표시한다.
실시예 3: DCP-001의 면역원성
DCP-001 및 DCOne 간세포(prog)를 6일 동안의 공동배양에 의해 PBMC 자극 검정에서 시험한 이후에 상층액을 다중 분석을 위해 루미넥스(Luminex) 플랫폼 상에서 수집하였다. 도 6a-도 6h에 도시된 바와 같이, DCP-001은 PBMC에서 다양한 전염증성 시토카인(IL-1β, GM-CSF, IFN-γ, IL-2, TNF-α, 및 IL-6) 및 케모카인(IL-8 및 RANTES)의 분비를 자극하는 것으로 발견되었다. 데이터는 12회의 독립적인 실험을 나타내며 평균 ± SEM로서 표현된다.

Claims (110)

  1. 하향조절된 CD47 경로를 포함하는 단리된 백혈병 기원의 변형된 세포, 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 하향조절된 CD47 경로는 CD47 경로의 구성원의 격감 및/또는 억제의 결과인 약제학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서, CD47 경로의 구성원은 CD47인 약제학적 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하향조절된 CD47 경로는 CD47 및/또는 CD47 경로의 구성원의 격감 및/또는 억제의 결과인 약제학적 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하향조절된 CD47 경로는 CD47 및/또는 CD47 경로의 구성원을 격감시키고/시키거나 억제하는 제제에 의해 매개되는 약제학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 CD47 및/또는 CD47 경로의 구성원을 격감시키는 제제는 항체, 소 분자, 소 RNA, 또는 조작된 뉴클레아제 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 항체는 항-CD47 항체인 약제학적 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 소 RNA는 소 간섭 RNA(siRNA) 또는 마이크로RNA(miRNA)인 약제학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 조작된 뉴클레아제 시스템은 메가뉴클레아제 시스템, 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 시스템, 전사 활성화인자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN) 시스템, 및 CRISPR 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  10. 제6항에 있어서, 상기 조작된 뉴클레아제 시스템은 변형된 세포의 CD47 유전자 자리 및/또는 CD47 경로의 구성원의 유전자 자리 내의 삽입 및/또는 결실을 매개하는 약제학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 조작된 뉴클레아제 시스템은 변형된 세포의 CD47 유전자 자리 내의 삽입 및/또는 결실을 매개하는 약제학적 조성물.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 조작된 뉴클레아제 시스템은 CRISPR 시스템인 약제학적 조성물.
  13. CD47 유전자 자리 내의 삽입 및/또는 결실을 포함하는 백혈병 기원의 변형된 세포를 포함하는 약제학적 조성물로서, 상기 CD47 유전자 자리 내의 삽입 및/또는 결실은 CD47의 하향조절된 발현을 초래하는 약제학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 CD47 유전자 자리 내의 삽입 및/또는 결실은 CD47 유전자 자리 내의 이중 가닥 절단의 수선에 의해 매개되는 약제학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 수선은 비-상동성 말단 봉합(NHEJ) 및 상동 인도 수선(HDR)을 통한 것인 약제학적 조성물.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, CD47 유전자 자리 내의 삽입 및/또는 결실은 조작된 뉴클레아제 시스템에 의해 매개되는 약제학적 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 조작된 뉴클레아제 시스템은 메가뉴클레아제 시스템, 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 시스템, 전사 활성화인자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN) 시스템, 및 CRISPR 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 조작된 뉴클레아제 시스템은 CRISPR 시스템인 약제학적 조성물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, CD47 및/또는 CD47 경로의 구성원을 격감시키고/시키거나 억제하는 제제를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 CD47 및/또는 CD47 경로의 구성원을 격감시키고/시키거나 억제하는 제제는 항-CD47 항체인 약제학적 조성물.
  21. 백혈병 기원의 변형된 세포 및 항-CD47 항체를 포함하는 약제학적 조성물.
  22. 하향조절된 CD47 경로를 포함하는 백혈병 기원의 변형된 세포 및 항-CD47 항체를 포함하는 약제학적 조성물.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 동결보존제를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 세포는 적어도 하나의 종양 연관 항원 또는, 적어도 하나의 종양 연관 항원을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 상기 종양 연관 항원은 WT-1, MUC-1, RHAMM, PRAME, p53, 및 서바이빈(Survivin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 세포는 WT-1, MUC-1, PRAME, 및 서바이빈을 포함하는 약제학적 조성물.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 세포는 외인성 항원을 포함하는 약제학적 조성물.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 항원은 종양-연관 항원인 약제학적 조성물.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 세포는 수지상 세포 표현형을 포함하는 약제학적 조성물.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 세포는 성숙 수지상 세포 표현형을 포함하는 약제학적 조성물.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 세포는 염색체 11p15.5 내지 11p12 사이에 유전적 이상(aberration)을 포함하는 약제학적 조성물.
  32. 제76항에 있어서, 상기 유전적 이상은 약 16 Mb의 게놈 영역을 포괄하는 약제학적 조성물.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 세포는 CD34-양성, CD1a-양성, 및 CD83-양성인 약제학적 조성물.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 세포는 DC-SIGN, 랑게린(Langerin), CD80, CD86, CD70, CD40, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 표면 마커를 발현하는 약제학적 조성물.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 세포는 CD34-양성, CD1a-양성, CD83-양성, CD80-양성, CD86-양성, 및 CD40-양성인 약제학적 조성물.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 세포는 CD14-음성인 약제학적 조성물.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 세포는 DCOne 세포주로부터 유래된 것인 약제학적 조성물.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 세포는 비-증식성인 약제학적 조성물.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 세포는 방사선 조사된 것인 약제학적 조성물.
  40. 하향조절된 CD47 경로를 포함하는 백혈병 기원의 변형된 세포를 생산하는 방법으로서,
    전구체 세포의 미성숙 세포로의 분화를 허용하는 조건 하에서 전구체 세포를 인큐베이션하는 단계; 및
    CD47 및/또는 CD47 경로의 구성원을 격감시키고/시키거나 억제하는 제제의 존재 하에서, 및 미성숙 세포의 성숙을 허용하는 조건 하에서 미성숙 세포를 인큐베이션하고, 그럼으로써 하향조절된 CD47 경로를 포함하는 변형된 세포를 생산하는 단계를 포함하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 CD47 및/또는 CD47 경로의 구성원을 격감시키고/시키거나 억제하는 제제는 항체, 소 분자, 소 RNA, 또는 조작된 뉴클레아제 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 항체는 항-CD47 항체인 방법.
  43. 제41항에 있어서, 상기 소 RNA는 소 간섭 RNA(siRNA) 또는 마이크로RNA(miRNA)인 방법.
  44. 제41항에 있어서, 상기 조작된 뉴클레아제 시스템은 변형된 세포의 CD47 유전자 자리 및/또는 CD47 경로의 구성원의 유전자 자리 내의 삽입 및/또는 결실을 매개하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 조작된 뉴클레아제 시스템은 변형된 세포의 CD47 유전자 자리 내의 삽입 및/또는 결실을 매개하는 방법.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 상기 조작된 뉴클레아제 시스템은 메가뉴클레아제 시스템, 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 시스템, 전사 활성화인자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN) 시스템, 및 CRISPR 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  47. 제44항 내지 제46항에 있어서, 상기 조작된 뉴클레아제 시스템은 CRISPR 시스템인 방법.
  48. 제40항 내지 제47항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 변형된 세포를 포함하는 약제학적 조성물.
  49. 제48항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  50. 제48항 또는 제49항에 있어서, 동결보존제를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  51. 면역 반응의 강화를 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 강화하는 방법으로서, 제1항 내지 제39항 및 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항의 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  52. 암의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 암을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 제1항 내지 제39항 및 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항의 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  53. 면역 반응의 강화를 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 강화하는 방법으로서, 하향조절된 CD47 경로를 포함하는 백혈병 기원의 변형된 세포를 포함하는 제1 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 제1 조성물은 CD47 및/또는 CD47 경로의 구성원을 격감시키고/시키거나 억제하는 제제를 추가로 포함하는 방법.
  55. 제53항 또는 제54항에 있어서, CD47을 격감시키고/시키거나 억제하는 제제를 포함하는 제2 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  56. 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 조성물 및 제2 조성물은 동시에 투여되는 방법.
  57. 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 조성물은 제2 조성물 전에 투여되는 방법.
  58. 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 조성물은 제2 조성물 후에 투여되는 방법.
  59. 면역 반응의 강화를 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 강화하는 방법으로서, 백혈병 기원의 변형된 세포, 및 CD47 및/또는 CD47 경로의 구성원을 격감시키고/시키거나 억제하는 제제를 포함하는 제1 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  60. 제53항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 세포는 적어도 하나의 종양 연관 항원 또는, 종양 연관 항원을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 상기 종양 연관 항원은 대상체에서의 종양과 연관되어 있는 방법.
  61. 제53항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 세포는 적어도 하나의 종양 연관 항원 또는, 종양 연관 항원을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 상기 종양 연관 항원은 대상체에서의 종양과 연관되어 있지 않은 방법.
  62. 제53항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 조성물 및/또는 제2 조성물은 근육내, 피하, 정맥내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 피내, 경피, 피부경유, 조직의 간질 공간으로의 전달, 및 비-종양 조직으로의 전달로 이루어진 군으로부터 선택되는 경로를 통해 투여되는 방법.
  63. 제53항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 조성물 및/또는 제2 조성물은 정맥내로 투여되는 방법.
  64. 제63항에 있어서, 상기 제1 조성물 및/또는 제2 조성물은 정맥내 투여를 위해 제조되는 방법.
  65. 제63항 또는 제64항에 있어서, 상기 제1 조성물 및/또는 제2 조성물은 정맥내 투여를 위해 허용가능한 희석제 또는 용매를 포함하는 방법.
  66. 제53항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 조성물 및/또는 제2 조성물은 피내로 투여되는 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상기 제1 조성물 및/또는 제2 조성물은 피내 투여를 위해 제조되는 방법.
  68. 제66항 또는 제67항에 있어서, 상기 제1 조성물 및/또는 제2 조성물은 피내 투여를 위해 허용가능한 희석제 또는 용매를 포함하는 방법.
  69. 제53항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 조성물 및/또는 제2 조성물은 근육내로 투여되는 방법.
  70. 제69항에 있어서, 상기 제1 조성물 및/또는 제2 조성물은 근육내 투여를 위해 제조되는 방법.
  71. 제69항 또는 제70항에 있어서, 상기 제1 조성물 및/또는 제2 조성물은 근육내 투여를 위해 허용가능한 희석제 또는 용매를 포함하는 방법.
  72. 제53항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 조성물 및/또는 제2 조성물은 종양내로 투여되는 방법.
  73. 제72항에 있어서, 상기 제1 조성물 및/또는 제2 조성물은 종양내 투여를 위해 제조되는 방법.
  74. 제72항 또는 제73항에 있어서, 상기 제1 조성물 및/또는 제2 조성물은 종양내 투여를 위해 허용가능한 희석제 또는 용매를 포함하는 방법.
  75. 제53항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD47을 격감시키고/시키거나 억제하는 제제는 항체, 소 분자, 소 RNA, 또는 조작된 뉴클레아제 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  76. 제75항에 있어서, 상기 항체는 항-CD47 항체인 방법.
  77. 제75항에 있어서, 상기 소 RNA는 소 간섭 RNA(siRNA) 또는 마이크로RNA(miRNA)인 방법.
  78. 제75항에 있어서, 상기 조작된 뉴클레아제 시스템은 변형된 세포의 CD47 유전자 자리 및/또는 CD47 경로의 구성원의 유전자 자리 내의 삽입 및/또는 결실을 매개하는 방법.
  79. 제78항에 있어서, 상기 조작된 뉴클레아제 시스템은 변형된 세포의 CD47 유전자 자리 내의 삽입 및/또는 결실을 매개하는 방법.
  80. 제78항 또는 제79항에 있어서, 상기 조작된 뉴클레아제 시스템은 메가뉴클레아제 시스템, 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 시스템, 전사 활성화인자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN) 시스템, 및 CRISPR 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  81. 제78항 내지 제80항에 있어서, 상기 조작된 뉴클레아제 시스템은 CRISPR 시스템인 방법.
  82. 제53항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD47을 격감시키고/시키거나 억제하는 제제는, 항-CD47 항체, CD47-표적화 소 RNA, 또는 CD47-표적화 조작된 뉴클레아제 시스템을 인코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스 벡터를 포함하는 방법.
  83. 제82항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 및 단순 헤르페스 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스로부터 유래되는 방법.
  84. 제82항에 있어서, 상기 CD47-표적화 소 RNA는 소 간섭 RNA(siRNA) 또는 마이크로RNA(miRNA)인 방법.
  85. 제82항에 있어서, 상기 CD47-표적화 조작된 뉴클레아제 시스템은 변형된 세포의 CD47 유전자 자리 내의 삽입 및/또는 결실을 매개하는 방법.
  86. 제85항에 있어서, 상기 CD47-표적화 조작된 뉴클레아제 시스템은 메가뉴클레아제 시스템, ZFN 시스템, TALEN 시스템, 및 CRISPR 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  87. 제85항 또는 제86항에 있어서, 상기 CD47-표적화 조작된 뉴클레아제 시스템은 CRISPR 시스템인 방법.
  88. 제53항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 세포는 적어도 하나의 종양 연관 항원 또는, 적어도 하나의 종양 연관 항원을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 상기 종양 연관 항원은 WT-1, MUC-1, RHAMM, PRAME, p53, 및 서바이빈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  89. 제53항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 세포는 WT-1, MUC-1, PRAME, 및 서바이빈을 포함하는 방법.
  90. 제53항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 세포는 외인성 항원을 포함하는 방법.
  91. 제53항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 항원은 종양-연관 항원인 방법.
  92. 제53항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 세포는 수지상 세포 표현형을 포함하는 방법.
  93. 제53항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 세포는 성숙 수지상 세포 표현형을 포함하는 방법.
  94. 제53항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 세포는 염색체 11p15.5 내지 11p12 사이에 유전적 이상을 포함하는 방법.
  95. 제94항에 있어서, 상기 유전적 이상은 약 16 Mb의 게놈 영역을 포괄하는 방법.
  96. 제53항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 세포는 CD34-양성, CD1a-양성, 및 CD83-양성인 방법.
  97. 제53항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 세포는 DC-SIGN, 랑게린, CD80, CD86, CD70, CD40, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 표면 마커를 발현하는 방법.
  98. 제53항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 세포는 CD34-양성, CD1a-양성, CD83-양성, CD80-양성, CD86-양성, 및 CD40-양성인 방법.
  99. 제53항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 세포는 CD14-음성인 방법.
  100. 제53항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 세포는 DCOne 세포주로부터 유래된 것인 방법.
  101. 제53항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 세포는 비-증식성인 방법.
  102. 제53항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 세포는 방사선 조사된 것인 방법.
  103. 제53항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 이전에 암을 앓았던 방법.
  104. 제53항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 이전에 종양에 대한 치료를 받았던 방법.
  105. 제53항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 암의 재발을 겪고 있는 방법.
  106. 제53항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 종양인 방법.
  107. 제106항에 있어서, 상기 종양은 고형 종양인 방법.
  108. 제107항에 있어서, 상기 고형 종양은 육종, 암종, 및 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  109. 제53항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간인 방법.
  110. 제53항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 가축 및/또는 수의학적 건강관리에 적합한 동물인 방법.
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