ES2236634T3

ES2236634T3 - Anticuerpos anti-vegf.

Info

Publication number: ES2236634T3
Application number: ES03004199T
Authority: ES
Inventors: Manuel The Walter&Eliza Hall Inst. of. Med. Baca; James A. Wells; Leonard G. Presta; Henry B. Lowman; Yvonne Man-Yee Chen
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1997-04-07
Filing date: 1998-04-03
Publication date: 2005-07-16
Anticipated expiration: 2018-04-03
Also published as: FR07C0017I1; EP1650220A3; TR199903123T2; DE122007000021I1; ATE349470T1; AU743758B2; CA2286330A1; DK0973804T3; DE69836729D1; EP0973804B1; BRPI9809387B8; FR05C0020I1; NO324264B1; HK1023577A1; DE69829891T2; NO994869L; EP1787999B1; BR9809387A; DE122005000026I1; PT1325932E

Abstract

Un anticuerpo anti-factor de crecimiento del endotelio vascular que inhibe la angiogénesis inducida por VEGF in vivo y/o se une a VEGF humano con un valor Kd de no más de 1 x 10-8 M y/o tiene un valor ED50 de no más de 5 nM para inhibir la proliferación inducida por VEGF de células endoteliales in vitro, teniendo el anticuerpo un dominio variable de la cadena pesada que comprende las regiones flanqueantes consenso del subgrupo III de cadenas pesadas humanas como se muestra en SEC.ID.Nº 11 y las regiones hipervariables CDRH1, CDRH2 y CDRH3, teniendo las siguientes secuencias de aminoácidos: CDRH1: GYX1X2X3X4YGX5N (SEC.ID.Nº 117), donde X1 es D, T o E, X2 es F, W, o Y, X3 es T, Q, G o S, X4 es H o N; y X5 es M o I; CDRH2: WINTX1TGEPTYAADFKR (SEC.ID.Nº 118), donde X1 es Y o W; y CDRH3: YPX1YX2X3X4X5HWYFDV (SEC.ID.Nº 119), donde X1 es H o Y; X2 es Y, R, K, I, T, E, o W, X3 es G, N, A, D, Q, E, T, K, o S, X4 es S, T, K, Q, N, R, A, E, o G, y X5 es S o G.

Description

Anticuerpos anti-VEGF.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

Esta invención se refiere, en líneas generales, a anticuerpos anti-VEGF y, en particular, a anticuerpos anti-VEGF humanizados y a variantes de anticuerpos anti-VEGF.

Descripción de la técnica relacionada

Ahora está bien establecido que la angiogénesis está implicada en la patogénesis de una diversidad de trastornos. Estos incluyen tumores sólidos, síndromes neovasculares intraoculares tales como retinopatías proliferativas o degeneración macular relacionada con la edad (AMD), artritis reumatoide, y psoriasis (Folkman et al. J. Biol. Chem. 267:10931-10934 (1992); Klagsbrun et al. Annu. Rev. Physiol. 53:217-239 (1991); y Garner A, Vascular diseases. In: Pathobiology of ocular disease. A dynamic approach. Garner A, Klintworth GK, Eds. 2ª Edición Marcel Dekker, NY, pág. 1625-1710 (1994)). En el caso de tumores sólidos, la neovascularización permite a las células tumorales conseguir una ventaja de crecimiento y autonomía proliferativa en comparación con células normales. Por consiguiente, se ha observado una correlación entre la densidad de microvasos en secciones tumorales y en pacientes que sobreviven a cáncer de mama así como a varios tumores distintos (Weidner et al. N Engl J Med 324:1-6 (1991); Horak et al. Lancet 340:1120-1124 (1992); y Macchiarini et al. Lancet 340:145-146 (1992)).

La búsqueda de reguladores positivos de la angiogénesis ha producido muchos candidatos, que incluyen aFGF, bFGF, TGF-\alpha, TGF-\beta, HGF, TNF-\alpha, angiogenina, IL-8, etc. (Folkman et al. y Klagsbrun et al). Los reguladores negativos identificados hasta ahora incluyen trombospondina (Good et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:6624-6628 (1990)), el fragmento N-terminal de 16 kilodalton de prolactina (Clapp et al. Edocrinology, 133:1292-1299 (1993)), angiostatina (O'Reilly et al. Cell, 79:315-328 (1994)) y endostatina (O'Reilly et al. Cell, 88:277-285 (1996)).

El trabajo hecho durante los últimos años ha establecido el papel clave el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) en la regulación de la angiogénesis normal y anormal (Ferrara et al. Endocr. Rev. 18:4-25 (1997)). El descubrimiento de que la pérdida de incluso un único alelo de VEGF da como resultado letalidad embrionaria, apunta a que este factor juega un papel irremplazable en el desarrollo y diferenciación del sistema vascular (Ferrara et al.). Además, se ha mostrado que VEGF es un mediador clave en la neovascularización asociada a tumores y trastornos intraoculares (Ferrara et al.). El ARNm de VEGF se sobre-expresa en la mayoría de los tumores humanos examinados (Berkaman et al. J Clin Invest 91:153-159 (1993); Brown et al. Human Pathol. 26:86-91 (1995); Brown et al. Cancer Res. 53:4727-4735 (1993); Mattern et al. Brit. J. Cancer. 73:931-934 (1996); y Dvorak et al. Am J. Pathol. 146:1029-1039 (1995)). Además, la concentración de VEGF en fluidos oculares está altamente correlacionada con la presencia de proliferación activa de vasos sanguíneos en pacientes con diabetes u otras retinopatías relacionadas con isquemia (Aiello et al. N. Engl. J. Med. 331:1480-1487 (1994)). Además, recientes estudios han demostrado la localización de VEGF en membranas neovasculares coroidales en pacientes afectados por AMD (Lopez et al. Invest. Ophtalmo. Vis. Sci. 37:855-868 (1996)). Los anticuerpos neutralizantes anti-VEGF suprimen el crecimiento de una diversidad de líneas celulares tumorales humanas en ratones desnudos (Kim et al. Nature 362:841-844 (1993); Warren et al. J. Clin. Invest. 95:1789-1797 (1995); Borgström et al. Cancer Res. 56:4032-4039 (1996); y Melnyk et al. Cancer Res. 56:921-924 (1996)) y también inhiben la angiogénesis intraocular en modelos de trastornos retinales isquémicos (Adamis et al. Arch. Ophthalmol. 114:66-71 (1996)). Por lo tanto, los anticuerpos monoclonales anti-VEGF u otros inhibidores de la acción de VEGF son candidatos prometedores para el tratamiento de tumores sólidos y diversos trastornos neovasculares intraoculares.

Sumario de la invención

Como se define en las reivindicaciones, la invención proporciona anticuerpos anti-VEGF y variantes de anticuerpos anti-VEGF con propiedades deseables desde una perspectiva terapéutica, incluyendo fuerte afinidad de unión por VEGF; la capacidad de inhibir la proliferación inducida por VEGF de células endoteliales in vitro; y la capacidad de inhibir la angiogénesis inducida por VEGF in vivo.

El anticuerpo anti-VEGF humanizado o variante de anticuerpo anti-VEGF preferido en este documento se une a VEGF humano con un valor K_{d} de no más de aproximadamente 1 x 10^{-8} M y preferiblemente no más de aproximadamente 5 x 10^{-9} M. Además, el anticuerpo anti-VEGF humanizado o variante puede tener un valor ED50 de no más de aproximadamente 5 nM para inhibir la proliferación inducida por VEGF de células endoteliales in vitro. Los anticuerpos anti-VEGF humanizados o variantes de particular interés en este documento son los que inhiben al menos aproximadamente el 50% del crecimiento del tumor en un modelo tumoral A673 in vivo, a una dosis de anticuerpo de 5 mg/kg.

En una realización, el anticuerpo anti-VEGF tiene un dominio variable de la cadena pesada y la ligera, donde el dominio variable de la cadena pesada comprende regiones hipervariables con las siguientes secuencias de aminoácidos: CDRH1 (GYX_{1}FTX_{2}YGMN, donde X_{1} es T o D y X_{2} es N o H; SEC.ID.Nº 128), CDRH2 (WINTYTGEPTYAADFKR; SEC.ID.Nº 2) y CDRH3 (YPX_{1}YYGX_{2}SHWYFDV, donde X_{1} es Y o H y X_{2} es S o T; SEC.ID.Nº 129). Por ejemplo, el dominio variable de la cadena pesada puede comprender las secuencias de aminoácidos de CDRH1 (GYTFNYGMN; SEC.ID.Nº 1), CDRH2 (WINTYTGEPTYAADFKR; SEC.ID.Nº 2) y CDRH3 (YPHYYGSSHWY
FDV; SEC.ID.Nº 3). Preferiblemente, las tres regiones hipervariables de la cadena pesada se proporcionan en una región flanqueante humana, por ejemplo, en forma de una secuencia contigua representada por la siguiente fórmula: FR1-CDRH1-FR2-CDRH2-FR3-CDRH3-FR4.

La invención también proporciona un dominio variable de la cadena pesada de un anticuerpo anti-VEGF que comprende la secuencia de aminoácidos:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYX_{1}FTX_{2}YGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKR
RFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPX_{3}YYGX_{4}SHWYFDVWGQGTLVTVSS (SEC.ID.Nº 125),
donde X_{1} es T o D; X_{2} es N o H; X_{3} es Y o H y X_{4} es S o T. Una secuencia del dominio variable de la cadena pesada particularmente útil es la del anticuerpo humanizado F(ab)-12 del Ejemplo 1 y comprende la secuencia del dominio variable de la cadena pesada de SEC.ID.Nº 7. Dichas secuencias del dominio variable de la cadena pesada preferidas pueden combinarse con las siguientes secuencias del dominio variable de la cadena ligera o con otras secuencias del dominio variable de la cadena ligera, preferidas, a condición de que el anticuerpo producido de este modo se una a VEGF humano.

El anticuerpo de la invención tiene las secuencias del dominio variable de la cadena ligera que se definen en las reivindicaciones que pueden combinarse con las secuencias del dominio variable de la cadena pesada identificados anteriormente o con otras secuencias del dominio variable de la cadena pesada, a condición de que el anticuerpo producido de este modo mantenga la capacidad de unirse a VEGF humano. Por ejemplo, el dominio variable de la cadena ligera puede comprender regiones hipervariables con las siguientes secuencias de aminoácidos: CDRL1 (SASQDISNYLN; SEC.ID.Nº 4), CDRL2 (FTSSLHS; SEC.ID.Nº 5) y CDRL3 (QQYSTVPWT; SEC.ID.Nº 6). Preferiblemente, las tres regiones hipervariables de la cadena ligera se proporcionan en una región flanqueante humana, por ejemplo, en forma de una secuencia contigua representada por la siguiente fórmula: FR1-CDRL1-FR2-CDRL2-FR3-CDRL3-FR4.

En una realización, la invención proporciona un dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo anti-VEGF humanizado que comprende las secuencias de aminoácidos:

DIGX_{1}TQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDF
TLT ISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR (SEC.ID.Nº 124), donde X_{1} es M o L. Una secuencia del dominio variable de la cadena ligera particularmente útil es la del anticuerpo humanizado F(ab)-12 del Ejemplo 1 y comprende la secuencia del dominio variable de la cadena ligera de SEC.ID.Nº 8.

Un anticuerpo de la invención, que se define en las reivindicaciones, puede ser una variante de un anticuerpo anti-VEGF parental (dicho anticuerpo parental es preferiblemente un anticuerpo anti-VEGF humanizado o humano), donde la variante se une a VEGF humano y comprende una sustitución de aminoácido en una región hipervariable del dominio variable de la cadena pesada y la ligera del anticuerpo anti-VEGF parental. La variante preferiblemente tiene una o más sustituciones en una o más regiones hipervariables del anticuerpo anti-VEGF. Preferiblemente, la sustitución o sustituciones están en el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo parental. Por ejemplo, la sustitución o sustituciones de aminoácido pueden estar en el CDRH1 y/o CDRH3 del dominio variable de la cadena pesada. Preferiblemente, hay sustituciones en estas dos regiones hipervariables. En este documento se demuestra que dichas variantes de "afinidad madurada" se unen a VEGF humano más fuertemente que el anticuerpo anti-VEGF parental del cual se han generado, es decir, tienen un valor K_{d} que es significativamente menor que el del anticuerpo anti-VEGF parental. Preferiblemente, la variante tiene un valor ED50 para inhibir la proliferación inducida por VEGF de células endoteliales in vitro que es al menos aproximadamente 10 veces inferior, preferiblemente al menos aproximadamente 20 veces inferior, y más preferiblemente al menos aproximadamente 50 veces inferior, que el del anticuerpo anti-VEGF parental. Una variante particularmente preferida es la variante Y0317 del Ejemplo 3, que tiene un CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos: GYDFTHYGMN (SEC.ID.Nº 126) y un CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos: YPYYYGTSHWYFDV (SEC.ID.Nº 127). Estas regiones hipervariables y CDRH2 generalmente se proporcionan en una región flanqueante humana, por ejemplo, dando como resultado un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC.ID.Nº 116. Dichas secuencias del dominio variable de la cadena pesada se combinan opcionalmente con un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC.ID.Nº 124, y preferiblemente la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera de SEC.ID.Nº 115.

Se contemplan diversas formas del anticuerpo en este documento. Por ejemplo, el anticuerpo anti-VEGF puede ser un anticuerpo de longitud completa (por ejemplo, teniendo una región Fc humana intacta) o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, un Fab, Fab' o F(ab')_{2}). Además, el anticuerpo puede marcarse con un marcador detectable, inmovilizarse en una fase sólida y/o conjugarse con un compuesto heterólogo (tal como un agente citotóxico).

Se contemplan usos de diagnóstico y terapéuticos para el anticuerpo. Una aplicación de diagnóstico concierne a un método para determinar la presencia de proteína VEGF que comprende exponer una muestra que se cree que contiene la proteína VEGF al anticuerpo anti-VEGF y determinar la unión del anticuerpo a la muestra. Se contempla un kit que comprende el anticuerpo e instrucciones para usar el anticuerpo para detectar la proteína VEGF.

La invención también proporciona: un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo; un vector que comprende ese ácido nucleico, opcionalmente unido de manera operativa a secuencias de control reconocidas por una célula hospedadora transformada con el vector; un célula hospedadora que comprende ese vector; un proceso para producir el anticuerpo, que comprende cultivar la célula hospedadora de modo que se exprese el ácido nucleico y, opcionalmente, recuperar el anticuerpo del cultivo de células hospedadoras (por ejemplo, a partir del medio de cultivo de células hospedadoras). La invención también proporciona una composición que comprende el anticuerpo anti-VEGF y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición para uso terapéutico es estéril y puede liofilizarse. La invención también proporciona un método para tratar un mamífero que padece de un tumor o trastorno retinal, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-VEGF al mamífero.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A y 1B representan las secuencias de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada (SEC.ID.
Nº 9) y de la cadena ligera (SEC.ID.Nº 10) de muMAbVEGF A.4.6.1, el dominio variable de la cadena pesada (SEC.ID.Nº 7) y de la cadena ligera (SEC.ID.Nº 8) de F(ab) humanizado (F(ab)-12) y regiones flanqueantes consenso humanas (hum III para el subgrupo III de cadenas pesadas (SEC.ID.Nº 11); hum\kappaI para el subgrupo I de cadenas ligeras \kappa (SEC.ID.Nº 12)). La Figura 1A alinea las secuencias del dominio variable de la cadena pesada y la Figura 1B alinea las secuencias del dominio variable de la cadena ligera. Los asteriscos indican diferencias entre F(ab)-12 humanizado y el Mab murino o entre F(ab)-12 y la región flanqueante humana. Las Regiones Determinantes de Complementariedad (CDR) están subrayadas.

La Figura 2 es un diagrama en cintas del modelo de los dominios VL y VH del F(ab)-12 humanizado. El dominio VL se muestra en marrón con los CDR en color canela. La cadena lateral del resto L46 se muestra en amarillo. El dominio VH se muestra en morado con los CDR en rosa. Las cadenas laterales de los restos de VH cambiados del humano al murino se muestran en amarillo.

La Figura 3 representa la inhibición de la mitogénesis inducida por VEGF por F(ab)-12 anti-VEGF humanizado del Ejemplo 1. Se sembraron células endoteliales capilares obtenidas de corteza adrenal bovina a una densidad de 6 x 10^{3} células/pocillo en placas de seis pocillos, como se describe en el Ejemplo 1. Se añadieron muMAb VEGF A.4.6.1 o rhuMAb VEGF (IgG1; F(ab)-12) a las concentraciones indicadas. Después de 2-3 horas, se añadió rhVEGF165 a la concentración final de 3 ng/ml. Después de cinco o seis días, las células se trataron con tripsina y se contaron. Los valores mostrados son medias de determinaciones duplicadas. La variación de la media no excede el
10%.

La Figura 4 muestra la inhibición del crecimiento del tumor in vivo por F(ab)-12 anti-VEGF humanizado del Ejemplo 1. Se inyectaron células A673 de rabdomiosarcoma en ratones desnudos BALB/c a una densidad de 2 x 10^{6} por ratón. Comenzando 24 horas después de la inoculación de las células tumorales, se inyectó a los animales con un MAb control, muMAb VEGF A.4.6.1 o rhuVEGF MAb (IgG1; F(ab)-12) dos veces por semana, por vía intraperitoneal. La dosis de MAb control fue 5 mg/kg; los MAb anti-VEGF se dieron a 0,5 o 5 mg/kg, como se indica (n = 10). Cuatro semanas después de la inyección de las células tumorales, los animales se sometieron a eutanasia y se retiraron los tumores y se pesaron. *: diferencia significativa cuando se compara con el grupo control por ANOVA (p < 0,05).

Las Figuras 5A y 5B muestran respectivamente las secuencias de aminoácidos de los dominios variables de la cadena pesada y ligera del anticuerpo A.4.6.1 murino (SEC.ID.Nº 10 para el VL y SEC.ID.Nº 9 para el VH) y las variantes hu2.0 (SEC.ID.Nº 13 para el VL y SEC.ID.Nº 14 para el VH) y hu2.10 (SEC.ID.Nº 15 para el VL y SEC.ID.Nº 16 para el VH) de A.4.6.1 humanizado del Ejemplo 2. La numeración de secuencias está de acuerdo con Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) y los desemparejamientos se indican por asteriscos (A.4.6.1 murino vs hu2.0) o puntos (hu2.0 vs hu2.10). La variante hu2.0 contiene solo las secuencias CDR (marcadas) del anticuerpo murino injertado en una región flanqueante consenso del subgrupo I de cadenas ligeras \kappa humanas (SEC.ID.Nº 12) y la región flanqueante consenso del subgrupo III de cadenas pesadas (SEC.ID.Nº 11). hu2.10 era el clon humanizado consenso obtenido de experimentos de clasificación de fagos descritos en este documento.

La Figura 6 representa los restos flanqueantes fijados como objetivo para aleatorización en el Ejemplo 2.

La Figura 7 representa la construcción de fagémido para la presentación superficial de fusiones Fab-pIII en fagos. El fagémido codifica una versión humanizada del fragmento Fab para el anticuerpo A.4.6.1 fusionado a una porción de la proteína de cubierta del gen III de M13. La proteína de fusión consta del Fab unido al terminal carboxilo de la cadena pesada a un resto de glutamina único (a partir de la supresión de un codón ámbar en E. coli supE), después de la región C-terminal de la proteína del gen III (restos 249-406). La transformación en E. coli F^{+}, seguida de super-infección con el fago auxiliar M13KO7, produce partículas fagémidas en las que una pequeña porción de estas muestra una única copia de la proteína de fusión.

Las Figuras 8A-E representan la secuencia de nucleótidos de doble cadena (SEC.ID.Nº 99) para el vector phMB4-19-1.6 del anticuerpo presentado en fagos en el Ejemplo 3 y las dos secuencias de aminoácidos codificadas de ese modo (SEC.ID.Nº 130 y Nº 100).

Las Figuras 9A y 9B representan respectivamente una alineación de las secuencias de aminoácidos para los dominios variables de la cadena ligera y pesada de variantes anti-VEGF de afinidad madurada en el Ejemplo 3, en comparación con F(ab)-12 del Ejemplo 1 (SEC.ID.Nº 8 y Nº 7 para los dominios variables de la cadena ligera y pesada, respectivamente). Los CDR están subrayados y denominados como L, cadena ligera, o H, cadena pesada, y los números 1-3. Los restos están enumerados secuencialmente en los dominios VL y VH, a diferencia del esquema de numeración Kabat. Se muestra la molécula molde, MB1.6 (SEC.ID.Nº 101 y Nº 102 para los dominios variables de la cadena ligera y pesada, respectivamente) junto con las variantes: H2305.6 (SEC.ID.Nº 103 y Nº 104 para los dominios variables de la cadena ligera y pesada, respectivamente), Y0101 (SEC.ID.Nº 105 y Nº 106 para los dominios variables de la cadena ligera y pesada, respectivamente), e Y0192 (SEC.ID.Nº 107 y Nº 108 para los dominios variables de la cadena ligera y pesada respectivamente). Las diferencias con F(ab)-12 se muestran en recuadros sombrea-
dos.

Las Figuras 10A y 10B representan una alineación de las secuencias de aminoácidos para los dominios variables de la cadena ligera y pesada respectivamente de variantes anti-VEGF de afinidad madurada del Ejemplo 3 en comparación con F(ab)-12 del Ejemplo 1 (SEC.ID.Nº 8 y Nº 7 para los dominios variables de la cadena ligera y pesada, respectivamente). Los CDR están subrayados y denominados por L, cadena ligera, o H, cadena pesada, y los números 1-3. Las variantes se denominan Y0243-1 (SEC.ID.Nº 109 y Nº 110 para los dominios variables de la cadena ligera y pesada, respectivamente), Y0238-3 (SEC.ID.Nº 111 y Nº 112 para los dominios variables de la cadena ligera y pesada, respectivamente), Y0313-1 (SEC.ID.Nº 113 y Nº 114 para los dominios variables de la cadena ligera y pesada, respectivamente), e Y0317 (SEC.ID.Nº 115 y Nº 116 para los dominios variables de la cadena ligera y pesada, respectivamente). Las diferencias con F(ab)-12 se muestran en recuadros sombrea-
dos.

La Figura 11 representa los resultados del ensayo de actividad HuVEC en el Ejemplo 3 para las variantes Y0238-3, Y0192 e Y0313-1 así como F(ab)-12 de longitud completa del Ejemplo 1.

La Figura 12 representa la inhibición de la mitogénesis inducida por VEGF por F(ab)-12 de longitud completa del Ejemplo 1 (rhuMAb VEGF), un fragmento Fab de F(ab)-12 del Ejemplo 1 (rhuFab VEGF), y un fragmento Fab de la variante Y0317 de afinidad madurada del Ejemplo 3 (rhuFab VEGF (afinidad madurada)).

Descripción detallada de las realizaciones preferidas I. Definiciones

El término "VEGF humano" como se usa en este documento se refiere al factor de crecimiento de células del endotelio vascular humano de 165 aminoácidos, y a los factores de crecimiento de células del endotelio vascular de 121, 189 y 206 aminoácidos relacionados, como se describe por Leung et al., Science 246:1306 (1989), y Houck et al., Mol. Endocrin. 5:1806 (1991) junto con las formas alélicas y procesadas de origen natural de esos factores de crecimiento.

La presente invención proporciona anticuerpos antagonistas anti-VEGF que son capaces de inhibir una o más de las actividades de VEGF, por ejemplo, su actividad mitogénica o angiogénica. Los antagonistas de VEGF funcionan interfiriendo con la unión de VEGF a un receptor celular, incapacitando o eliminando células que se han activado por VEGF, o interfiriendo con la activación de células del endotelio vascular después de la unión de VEGF a un receptor celular. Todos estos puntos de intervención por un antagonista de VEGF se considerarán equivalentes para los propósitos de esta invención.

El término "receptor de VEGF" o "VEGFr" como se usa en este documento se refiere a un receptor celular para VEGF, generalmente un receptor de superficie celular encontrado en células del endotelio vascular, así como variantes del mismo que mantienen la capacidad de unir hVEGF. Un ejemplo de un receptor de VEGF es el receptor fms tipo tirosina quinasa (flt), un receptor transmembrana de la familia tirosina quinasa. DeVries et al., Science 255:989 (1992); Shibuya et al., Oncogene 5:519 (1990). El receptor flt comprende un dominio extracelular, un dominio transmembrana, y un dominio intracelular con actividad tirosina quinasa. El dominio extracelular está implicado en la unión de VEGF, mientras que el dominio intracelular está implicado en la transducción de señales. Otro ejemplo de un receptor VEGF es el receptor flk-1 (también mencionado como KDR). Matthews et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 88:9026 (1991); Terman et al., Oncogene 6:1677 (1991); Terman et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 187:1579 (1992). La unión de VEGF al receptor flt da como resultado la formación de al menos dos complejos de alto peso molecular, que tienen peso molecular aparente de 205.000 y 300.000 Dalton. Se cree que el complejo de 300.000 Dalton es un dímero que comprende dos moléculas de receptor unidas a una única molécula de VEGF.

El término "epítopo A.4.6.1" cuando se usa en este documento, salvo que se indique lo contrario, se refiere a la región de VEGF humano a la que se une el anticuerpo A.4.6.1 descrito en Kim et al., Growth Factors 7:53 (1992) y Kim et al. Nature 362:841 (1993).

"Tratamiento" se refiere tanto a tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas. Los individuos con necesidad de tratamiento incluyen aquellos que ya tienen el trastorno así como aquellos en los que el trastorno es para prevenirlo.

"Mamífero" para propósitos de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, deportivos o de compañía, tales como perros, caballos, gatos, vacas, etc. Preferiblemente, el mamífero es un humano.

"Anticuerpos" (Ab) e "inmunoglobulinas" (Ig) son glicoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos muestran especificidad de unión a un antígeno específico, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas tipo anticuerpo que carecen de especificidad de antígeno. Los polipéptidos del último tipo se producen, por ejemplo, a bajos niveles por el sistema linfoide y a niveles aumentados por mielomas.

"Anticuerpos nativos" e "inmunoglobulinas nativas" son habitualmente glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 Dalton de dos cadenas ligeras idénticas (L) y dos cadenas pesadas idénticas (H). Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada mediante un enlace disulfuro covalente, aunque la cantidad de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulinas. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro intracatenarios espaciados de manera regular. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (V_{H}) seguido de varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (V_{L}) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que restos de aminoácidos particulares forman una superficie de contacto entre los dominios variables de la cadena ligera y pesada.

El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren en gran medida en la secuencia entre anticuerpos y se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida uniformemente por todos los dominios variables de los anticuerpos. Está concentrada en tres segmentos llamados regiones hipervariables tanto en los dominios variables de la cadena ligera como de la cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se llaman regiones flanqueantes (FR). Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera nativas comprenden cada uno cuatro FR (FR1, FR2, FR3 y FR4, respectivamente), que adoptan en gran medida una configuración lámina-\beta, conectadas por tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de la estructura lámina-\beta. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por las FR y, con las regiones hipervariables de otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991), páginas 647-669). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión del anticuerpo a un antígeno, pero muestran diversas funciones efectoras, tales como participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpo.

El término "región hipervariable" cuando se usa en este documento se refiere a los restos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable comprende restos de aminoácidos de una "región determinante de complementariedad" o "CDR" (es decir, los restos 24-24 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o los restos de un "bucle hipervariable" (es decir, los restos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Los restos "flanqueantes" o "FR" son los restos de los dominios variables distintos de los restos de la región hipervariable como se define en este documento.

La digestión de anticuerpos con papaína produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un único sitio de unión a antígeno, y un fragmento "Fc" residual, cuyo nombre refleja su capacidad de cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')_{2} que tiene dos sitios de combinación de antígeno y aún es capaz del entrecruzamiento de antígeno.

"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio completo de reconocimiento o unión al antígeno. Esta región consta de un dímero de un dominio variable de la cadena pesada y uno de la cadena ligera en fuerte asociación no covalente. Está en la configuración en que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interaccionan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero V_{H}-V_{L}. Colectivamente, las seis regiones hipervariables confieren al anticuerpo la especificidad de unión al antígeno. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o medio de un Fv que comprende sólo tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unir antígeno, aunque a una afinidad inferior que el sitio de unión completo.

El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el terminal carboxilo del dominio CH1 de la cadena pesada que incluye una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la denominación en este documento para Fab' en el que el resto o restos de cisteína de los dominios constantes contienen un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} en un principio se produjeron como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.

Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie vertebrada pueden asignarse a dos tipos claramente distintos, llamados kappa (\kappa) y lambda (\lambda), basados en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas se asignan a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varias de estas pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman \alpha, \delta, \varepsilon, \gamma, y \mu, respectivamente. Se conocen bien las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas.

El término "anticuerpo" se usa en este documento en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), y fragmentos de anticuerpos mientras que muestren la actividad biológica deseada.

Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo de longitud completa, generalmente el dominio variable o de unión a antígeno del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')_{2}, y Fv; fragmentos bivalentes; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena simple; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en este documento se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto para posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades minoritarias. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos frente a un sitio antigénico único. Además, en contraste con preparaciones de anticuerpos (policlonales) convencionales que incluyen típicamente diferentes anticuerpos dirigidos frente a diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido frente a un determinante único en el antígeno. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se interpreta que requiere una producción del anticuerpo por ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a usar de acuerdo con la presente invención pueden hacerse por el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature 256:495 (1975), o puede hacerse por métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la Patente de EEUU Nº 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpos en fagos usando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), por ejemplo.

Los anticuerpos monoclonales incluyen específicamente en este documento anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos obtenidos de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la cadena o cadenas es idéntico u homólogo a secuencias correspondiente en anticuerpos obtenidos de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, mientras que muestren la actividad biológica deseada (Patente de EEUU Nº 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima obtenida de una inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los restos de la región hipervariable del receptor se reemplazan por restos de la región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como un ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad, y capacidad deseadas. En algunos casos, los restos de la región flanqueante (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se hacen para perfeccionar adicionalmente la función del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de la menos uno, y típicamente dos dominios variables, en los que todo o sustancialmente todo de las regiones hipervariables corresponde a las de una inmunoglobulina no humana y todo o sustancialmente todo de los FR es de los de una secuencia de una inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región constante (Fc) de una inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena simple" o "sFv" comprenden los dominios V_{H} y V_{L} del anticuerpo, donde estos dominios están presentes en una sola cadena polipeptídica. Generalmente, el polipéptido Fv también comprende un enlazador polipeptídico entre los dominios V_{H} y V_{L} que posibilita que el sFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. Para un análisis de sFv véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, Nueva York, pág. 269-315 (1994).

El término "fragmentos bivalentes" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno, que comprenden dichos fragmentos un dominio variable de la cadena pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (V_{L}) en la misma cadena polipeptídica (V_{H}-V_{L}). Usando un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre dos dominios en la misma cadena, los dominios se fuerzan a emparejar con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno. Los fragmentos bivalentes se describen más a fondo en, por ejemplo, el documento EP 404.097; el documento WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993).

La expresión "anticuerpos lineales" cuando se usa en toda esta solicitud se refiere a los anticuerpos descritos en Zapata et al. Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995). Brevemente, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos Fd en tándem (V_{H}-C_{H}1-V_{H}-C_{H}1) que forman un par de regiones de unión a antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.

Una "variante" de un anticuerpo anti-VEGF, se refiere en este documento a una molécula que difiere en la secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-VEGF parental debido a la adición, deleción y/o sustitución de uno o más restos de aminoácidos en la secuencia del anticuerpo parental. En la realización preferida, la variante comprende una o más sustituciones de aminoácidos en una o más regiones hipervariables del anticuerpo parental. Por ejemplo, la variante puede comprender al menos uno, por ejemplo, de aproximadamente uno a aproximadamente diez, y preferiblemente de aproximadamente dos a aproximadamente cinco, sustituciones en una o más regiones hipervariables del anticuerpo parental. Generalmente, la variante tendrá una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 75% de identidad de la secuencia de aminoácidos con las secuencias del dominio variable de la cadena pesada o ligera del anticuerpo parental (por ejemplo, como en SEC.ID.Nº 7 o Nº 8), más preferiblemente al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 85%, más preferiblemente al menos el 90%, y mucho más preferiblemente al menos el 95%. La identidad u homología con respecto a esta secuencia se define en este documento como el porcentaje de restos de aminoácidos en la secuencia candidata que son idénticos a los restos del anticuerpo parental, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencia. Ninguna extensión, deleción, o inserción N-terminal, C-terminal, o interna en la secuencia del anticuerpo se interpretará que afecta a la identidad u homología de secuencia. La variante mantiene la capacidad de unir VEGF humano y preferiblemente tiene propiedades que son superiores a las del anticuerpo parental. Por ejemplo, la variante puede tener una afinidad de unión más fuerte, capacidad potenciada de inhibir la proliferación inducida por VEGF de células endoteliales y/o capacidad aumentada de inhibir la angiogénesis inducida por VEGF in vivo. Para analizar dichas propiedades, se debe comparar una forma Fab de la variante a una forma Fab del anticuerpo parental o una forma de longitud completa de la variante a una forma de longitud completa del anticuerpo parental, por ejemplo, aunque se ha descubierto que el formato del anticuerpo anti-VEGF afecta a su actividad en los ensayos de actividad biológica descritos en este documento. La variante de un anticuerpo de interés particular en este documento es uno que muestra una potenciación de al menos aproximadamente 10 veces, preferiblemente al menos aproximadamente 20 veces, y más preferiblemente al menos aproximadamente 50 veces, en la actividad biológica cuando se compara con el anticuerpo parental.

El anticuerpo "parental" en este documento es uno que está codificado por una secuencia de aminoácidos usada para la preparación de la variante. Preferiblemente, el anticuerpo parental tiene una región flanqueante humana y, si está presente, tiene una región o regiones constantes de anticuerpo humano. Por ejemplo, el anticuerpo parental puede ser un anticuerpo humanizado o humano.

Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha identificado o separado y/o recuperado de un componente de su medio natural. Los componentes contaminantes de su medio natural son materiales que podrían interferir con los usos de diagnóstico o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteicos o no proteicos. En realizaciones preferidas, el anticuerpo se purificará (1) a más del 95% en peso del anticuerpo determinado por el método de Lowry, y más preferiblemente a más del 99% en peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de la secuencia de aminoácidos N-terminales o internos por el uso de un secuenciador de cubeta giratoria, o (3) hasta homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción con plata. Un anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ en células recombinantes ya que al menos un componente del medio natural del anticuerpo no estará presente. Generalmente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará por al menos un etapa de purificación.

El término "epítopo señalado" cuando se usa en este documento se refiere al anticuerpo anti-VEGF fusionado a un "señalador de epítopo". El polipéptido señalador de epítopo tiene suficientes restos para proporcionar un epítopo frente al que puede hacerse un anticuerpo, pero es suficientemente corto para no interferir con la actividad del anticuerpo anti-VEGF. El señalador de epítopo preferiblemente es suficientemente único para que el anticuerpo frente al mismo no reaccione sustancialmente de manera cruzada con otros epítopos. Los polipéptidos señaladores apropiados generalmente tienen al menos 6 restos de aminoácido y habitualmente entre aproximadamente 8-50 restos de aminoácido (preferiblemente entre aproximadamente 9-30 restos). Los ejemplos incluyen el polipéptido señalador flu HA y su anticuerpo 12CA5 (Field et al. Mol. Cell. Biol. 8:2159-2165 (1988)); el señalador c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 frente al mismo (Evan et al., Mol. Cell. Biol. 5(12):3610-3616 (1985)); y el señalador de la glicoproteína D (gD) del virus de Herpes Simplex y su anticuerpo (Paborsky et al., Protein Engineering 3(6):547-553 (1990)). En ciertas realizaciones, el señalador de epítopo es un "epítopo de unión al receptor de rescate". Como se usa en este documento, el término "epítopo de unión al receptor de rescate" se refiere a un epítopo de la región Fc de una molécula IgG (por ejemplo, IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3}, o IgG_{4}) que es responsable de aumentar la vida media en suero in vivo de la molécula IgG.

El término "agente citotóxico" como se usa en este documento se refiere a una sustancia que inhibe o evita la función de células y/o causa la destrucción de células. Se pretende que el término incluya isótopos radiactivos (por ejemplo, I^{131}, I^{125}, Y^{90} y Re^{186}), agentes quimioterapéuticos, y toxinas tales como toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de las mismas.

Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen Adriamicina, Doxorrubicina, 5-Fluorouracil, Arabinósido de citosina ("Ara-C"), Ciclofosfamida, Tiotepa, Taxotere (docetaxel), Busulfan, Citoxina, Taxol, Metotrexato, Cisplatino, Melfalan, Vinblastina, Bleomicina, Etopósido, Ifosfamida, Mitomicina C, Mitoxantrona, Vincristina, Vinorelbina, Carboplatino, Tenipósido, Daunomicina, Carminomicina, Aminopterina, Dactinomicina, Mitomicinas, Espiramincinas (véase Patente de EEUU Nº 4.675.187), Melfalan y otras mostazas de nitrógeno relacionadas.

El término "profármaco" como se usa en esta solicitud se refiere a una forma precursora o derivada de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica para las células tumorales en comparación con el fármaco parental y es capaz de activarse o convertirse enzimáticamente en la forma parental más activa. Véase, por ejemplo, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pág. 375-382, 615ª Meeting Belfast (1986) y Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pág. 247-267, Humana Press (1985). Los profármacos de esta invención incluyen, aunque sin limitación, profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptidos, profármacos modificados por D-aminoácidos, profármacos glicosilados, profármacos que contienen \beta-lactama, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, 5-fluorocitosina y otros profármacos de 5-fluorouridina que pueden convertirse en el fármaco libre citotóxico más activo. Los ejemplos de fármacos citotóxicos que pueden derivatizarse en una forma de profármaco para usar en esta invención incluyen, aunque sin limitación, los agentes quimioterapéuticos descritos anteriormente.

La palabra "marcador" cuando se usa en este documento se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directa o indirectamente al anticuerpo. El marcador puede ser detectable por sí mismo (por ejemplo, marcadores de radioisótopos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición sustrato que es detectable.

Por "fase sólida" se quiere decir una matriz no acuosa a la que puede adherirse el anticuerpo de la presente invención. Los ejemplos de fases sólidas incluidas en este documento incluyen las formadas parcial o completamente de vidrio (por ejemplo, vidrio de poro controlado), polisacáridos (por ejemplo, agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, alcohol de polivinilo y siliconas. En ciertas realizaciones, según el contexto, la fase sólida puede comprender el pocillo de una placa de ensayo; en otras es una columna de purificación (por ejemplo, una columna de cromatografía de afinidad). Este término también incluye una fase sólida discontinua de partículas discretas, tales como las descritas en la Patente de EEUU Nº 4.275.149.

Un "liposoma" es una pequeña vesícula compuesta de diversos tipos de lípidos, fosfolípidos y/o un tensioactivo que es útil para el suministro de un fármaco (tal como los anticuerpos anti-VEGF descritos en este documento y, opcionalmente, un agente quimioterapéutico) a un mamífero. Los componentes del liposoma se colocan habitualmente en una formación de bicapa, similar a la colocación lipídica de membranas biológicas. Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que está identificada y separada de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante que está generalmente asociada en la fuente natural del ácido nucleico del anticuerpo. Una molécula de ácido nucleico aislada es distinta en la forma o el medio en que se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico aisladas se distinguen de la molécula de ácido nucleico que existe en células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que expresan generalmente el anticuerpo donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una localización cromosómica distinta de la de las células naturales.

La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida de manera operativa en un organismo hospedador particular. Las secuencias de control que son apropiadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión a ribosoma. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación, y potenciado-
res.

Un ácido nucleico está "unido de manera operativa" cuando está colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o líder de secreción está unido de manera operativa a un ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido de manera operativa a una secuencia codificante si influye en la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma está unido de manera operativa a una secuencia codificante si está colocado de modo que facilita la traducción. Generalmente, "unido de manera operativa" significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas en la fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La unión se consigue por ligamiento en sitios de restricción adecuados. Si dichos sitios no existen, se usan adaptadores o enlazadores oligonucleotídicos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

Como se usa en este documento, las expresiones "célula", "línea celular", y "cultivo celular" se usan de manera intercambiable y todas estas denominaciones incluyen progenie. Por tanto, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula sujeto primaria y los cultivos obtenidos de la misma sin considerar la cantidad de transferencias. También se entiende que toda la progenie puede no ser exactamente idéntica en el contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o involuntarias. Se incluye la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la investigada en la célula transformada en un principio. Cuando se pretenden distintas denominaciones, quedará claro del contexto.

II. Modelos para realizar la invención

Los ejemplos posteriores describen la producción de anticuerpos anti-VEGF humanizados y variantes con propiedades deseables desde una perspectiva terapéutica que incluyen: (a) fuerte afinidad de unión por el antígeno VEGF; (b) capacidad para inhibir la proliferación inducida por VEGF de células endoteliales in vitro; y (c) capacidad para inhibir la angiogénesis inducida por VEGF in vivo.

Las afinidades de los anticuerpos pueden determinarse como se describe en los ejemplos posteriores. Los anticuerpos humanizados o variantes preferidos son los que unen VEGF humano con un valor K_{d} de no más de aproximadamente 1 x 10^{-7} M; preferiblemente no más de aproximadamente 1 x 10^{-8} M; y más preferiblemente no más de aproximadamente 5 x 10^{-9} M.

Aparte de anticuerpos con fuerte afinidad de unión por VEGF humano, también es deseable seleccionar anticuerpos humanizados o variantes que tienen otras propiedades beneficiosas desde una perspectiva terapéutica. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser uno que inhibe el crecimiento celular endotelial en respuesta a VEGF. En una realización, el anticuerpo puede ser capaz de inhibir la proliferación celular del endotelio capilar bovino en respuesta a una concentración de eficacia casi máxima de VEGF (3 ng/ml). Preferiblemente, el anticuerpo tiene un valor de dosis 50 (ED50) eficaz de no más de aproximadamente 5 nM, preferiblemente no más de aproximadamente 1 nM, y mucho más preferiblemente no más de aproximadamente 0,5 nM, para inhibir la proliferación inducida por VEGF de células endoteliales en este "ensayo de crecimiento celular endotelial", es decir, a estas concentraciones el anticuerpo es capaz de inhibir el crecimiento celular endotelial inducido por VEGF in vitro al 50%. Un "ensayo de crecimiento celular endotelial" preferido implica cultivar células del endotelio capilar obtenidas de corteza adrenal en presencia de medio de Eagle modificado por Dulbecco bajo en glucosa (DEMEM) (GIBCO) suplementado con suero de ternera al 10%, glutamina 2 mM, y antibióticos (medio de crecimiento), esencialmente como se describe en el Ejemplo 1 posterior. Estas células endoteliales se siembran a una densidad de 6 x 10^{3} células por pocillo, en placas de 6 pocillos en medio de crecimiento. El anticuerpo anti-VEGF parental (control), el anticuerpo anti-VEGF humanizado o la variante se añade después a concentraciones que varían entre 1 y 5000 ng/ml. Después de 2-3 horas, se añade VEGF purificado a una concentración final de 3 ng/ml. Para control de especificidad, cada anticuerpo puede añadirse a las células endoteliales a la concentración de 5000 ng/ml, solos o en presencia de 2 ng/ml de bFGF. Después de cinco o seis días, las células de disocian por exposición a tripsina y se cuentan en un contador Coulter (Coulter Electronics, Hialeah, FL). Los datos pueden analizarse por un programa de ajuste a curva de cuatro parámetros (KaleidaGraph).

El anticuerpo anti-VEGF humanizado o variante preferido también puede ser uno que tiene una actividad de supresión tumoral in vivo. Por ejemplo, el anticuerpo puede suprimir el crecimiento de células A673 de rabdomiosarcoma humanas o células MDA-MB-435 de carcinoma de mama en ratones desnudos. Para estudios de tumores in vivo, se cultivan células A673 de rabdomiosarcoma humano (ATCC; CRL1598) o células MDA-MB-435 (disponibles por la ATCC) en DMEM/F12 suplementado con suero bovino fetal al 10%, glutamina 2 mM y antibióticos como se describe en el Ejemplo 1 posterior. Se inyectan por vía subcutánea ratones desnudos BALB/c hembra de 6-10 semanas de edad con 2 x 10^{6} células tumorales en el área dorsal en un volumen de 200 \mul. Después los animales se tratan con el anticuerpo humanizado o variante y un anticuerpo control sin actividad en este ensayo. El MAb anti-VEGF humanizado o variante se administra a una dosis de 0,5 y/o 5 mg/kg. Cada MAb se administra dos veces por semana por vía intraperitoneal en un volumen de 100 \mul, comenzando 24 horas después de la inoculación de las células tumorales. El tamaño del tumor se determina a intervalos semanales. Cuatro semanas después de la inoculación de células tumorales, los animales se someten a eutanasia y se retiran los tumores y se pesan. El análisis estadístico puede realizarse por ANOVA. Preferiblemente, el anticuerpo en este "ensayo de tumor in vivo" inhibe aproximadamente el 50-100%, preferiblemente aproximadamente el 70-100% y más preferiblemente aproximadamente el 80-100% del crecimiento de las células tumorales A673 humanas a una dosis de 5 mg/kg.

En la realización preferida, el anticuerpo humanizado o variante no logra provocar una respuesta inmunogénica sobre la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo a un paciente humano. Si se provoca una respuesta inmunogénica, la respuesta preferiblemente será de tal modo que el anticuerpo aún proporcione un beneficio terapéutico al paciente tratado con el mismo.

El anticuerpo humanizado o variante también es preferiblemente uno que es capaz de inhibir la angiogénesis inducida por VEGF en un humano, por ejemplo, para inhibir el crecimiento tumoral humano y/o inhibir la angiogénesis intraocular en trastornos retinales.

Los anticuerpos preferidos se unen al "epítopo A.4.6.1" como se define en este documento. Para buscar anticuerpos que se unen al epítopo de un VEGF humano unido por un anticuerpo de interés (por ejemplo, los que bloquean la unión del anticuerpo A.4.6.1 al VEGF humano), se puede realizar un ensayo de bloqueo cruzado de rutina tal como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lane (1988). Como alternativa, se pude realizar un mapeo de epítopos, por ejemplo, como se describe en Champe et al., J. Biol. Chem, 270:1388-1394 (1995), para determinar si el anticuerpo se une a un epítopo de interés.

Los anticuerpos de la realización preferida en este documento tienen un dominio variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos representada por la fórmula: FR1-CDRH1-FR2-CDRH2-FR3-CDRH3-FR4, donde "FR1-4" representan las cuatros regiones flanqueantes y "CDRH1-3" representan las tres regiones hipervariables de un dominio variable de la cadena pesada de un anticuerpo anti-VEGF. FR1-4 derivan de una "secuencia consenso" (es decir, los aminoácidos más habituales de una clase, subclase o subgrupo de cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulinas humanas) como en los ejemplos posteriores. Muchas secuencias de regiones flanqueantes de anticuerpos humanos se recopilan en Kabat et al., supra, por ejemplo. La FR del dominio variable de la cadena pesada se proporciona por una secuencia consenso de un subgrupo de inmunoglobulinas humanas recopilado por Kabat et al., supra. El subgrupo de inmunoglobulinas humanas es el subgrupo III de cadenas pesadas humanas (por ejemplo, como en SEC.ID.Nº 11).

La secuencia FR del dominio variable de la cadena pesada humana tiene sustituciones en ella, por ejemplo, donde el resto de FR humano se reemplaza por un resto no humano correspondiente (por "resto no humano correspondiente" se quiere decir el resto no humano con la misma numeración posicional de Kabat que el resto humano de interés cuando se alinean las secuencias humana y no humana), pero el reemplazamiento con el resto no humano no es necesario. Por ejemplo, un reemplazamiento de un resto de FR distinto del resto no humano correspondiente puede seleccionarse por la presentación en fagos (véase Ejemplo 2 posterior). Los restos de FR del dominio variable de la cadena pesada que pueden contener sustituciones incluyen uno cualquiera o más de los restos de FR con número: 37H, 49H, 67H, 69H, 71H, 73H, 75H, 76H, 78H, 94H (numeración de restos de Kabat empleada aquí). Preferiblemente están sustituidos al menos dos, o al menos tres, o al menos cuatro de estos restos. Una combinación particularmente preferida de sustituciones de FR es: 49H, 69H, 71H, 73H, 76H, 78H, y 94H.

Con respecto a las regiones hipervariables de la cadena pesada, éstas tienen las siguientes secuencias de aminoácidos:

CDRH1

GYX_{1}X_{2}X_{3}X_{4}YGX_{5}N (SEC.ID.Nº 117), donde X_{1} es D, T o E, pero preferiblemente es D o T; X_{2} es F, W, o Y, pero preferiblemente es F; X_{3} es T, Q, G o S, pero preferiblemente es T; X_{4} es H o N; y X_{5} es M o I, pero preferiblemente es M.

CDRH2

WINTX_{1}TGEPTYAADFKR (SEC.ID.Nº 118), donde X_{1} es Y o W, pero preferiblemente es Y.

CDRH3

YPX_{1}YX_{2}X_{3}X_{4}X_{5}HWYFDV (SEC.ID.Nº 119), donde X_{1} es H o Y; X_{2} es Y, R, K, I, T, E, o W, pero preferiblemente es Y; X_{3} es G, N, A, D, Q, E, T, K, o S, pero preferiblemente es G; X_{4} es S, T, K, Q, N, R, A, E, o G, pero preferiblemente es S o T; y X_{5} es S o G, pero preferiblemente es S.

El dominio variable de la cadena pesada opcionalmente comprende lo que se ha denominado "CDR7" en este documento en FR3 (es decir, forma parte de ella) (véanse Figuras 9B y 10B), donde CDR7 puede tener la siguiente secuencia de aminoácidos:

CDR7

X_{1}SX_{2}DX_{3}X_{4}X_{5}X_{6}TX_{7} (SEC.ID.Nº 120), donde X_{1} es F, I, V, L, o A, pero preferiblemente es F; X_{2} es A, L, V, o I, pero preferiblemente es L; X_{3} es T, V o K, pero preferiblemente es T; X_{4} es S o W, pero preferiblemente es S; X_{5} es S o K, pero preferiblemente es K; X_{6} es N, o S, pero preferiblemente es S; y X_{7} es V, A, L o I, pero preferiblemente es A.

Los anticuerpos de la realización preferida en este documento tienen un dominio variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos representada por la fórmula: FR1-CDRL1-FR2-CDRL2-FR3-CDRL3-FR4, donde "FR1-4" representan las cuatro regiones flanqueantes y "CDRL1-3" representan las tres regiones hipervariables de un dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo anti-VEGF. FR1-4 derivan de una "secuencia consenso" (es decir, los aminoácidos más habituales de una clase, subclase o subgrupo de cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulinas humanas) como en los ejemplos posteriores. La FR del dominio variable de la cadena ligera se proporciona por una secuencia consenso de un subgrupo de inmunoglobulinas humanas recopilado por Kabat et al., supra. El subgrupo de inmunoglobulinas humanas es el subgrupo I de cadenas ligeras kappa (por ejemplo, como en SEC.ID.Nº 12).

La secuencia de FR del dominio variable de la cadena ligera tiene sustituciones en la misma, por ejemplo, donde el resto de FR humano se reemplaza por un resto de ratón correspondiente, pero el reemplazamiento con el resto no humano no es necesario. Por ejemplo, un reemplazamiento de un resto distinto del resto no humano correspondiente puede seleccionarse por la presentación en fagos (véase el Ejemplo 2 posterior). Preferiblemente sólo se sustituye 46L. En otra realización se sustituyen tanto 4L como 46L (enumeración de restos de Kabat empleada
aquí).

Con respecto a los CDR, éstos tienen las siguientes secuencias de aminoácidos:

CDRL1

X_{1}AX_{2}X_{3}X_{4}X_{5}SNYLN (SEC.ID.Nº 121), donde X_{1} es R o S, pero preferiblemente es S; X_{2} es S o N, pero preferiblemente es S; X_{3} es Q o E, pero preferiblemente es Q; X_{4} es Q o D, pero preferiblemente es D; y X_{5} es I o L, pero preferiblemente es I.

CDRL2

FTSSLHS (SEC.ID.Nº 122).

CDRL3

QQYSX_{1}X_{2}PWT (SEC.ID.Nº 123), donde X_{1} es T, A o N, pero preferiblemente es T; y X_{2} es V o T, pero preferiblemente es V.

Los anticuerpos anti-VEGF humanizados preferidos son los que tienen las secuencias de los dominios variables de la cadena pesada y/o ligera de F(ab)-12 en el Ejemplo 1 y variantes del mismo tales como formas de afinidad madurada incluyendo las variantes Y0317, Y0313-1 e Y0238-3 en el Ejemplo 3, siendo Y0317 la variante preferida. Los métodos para generar anticuerpos anti-VEGF humanizados de interés en este documento se elaboran con más detalle a continuación.

A. Preparación de anticuerpo

Los métodos para humanizar anticuerpos anti-VEGF no humanos y generar variantes de anticuerpos anti-VEGF se describen en los ejemplos posteriores. Para humanizar un anticuerpo anti-VEGF, se prepara el material de partida de anticuerpo no humano. Cuando hay que generar una variante, se prepara el anticuerpo parental. Las técnicas ejemplares para generar dicho material de partida de anticuerpos no humanos y anticuerpos parentales se describirán el las siguientes secciones.

(i) Preparación de antígeno

El antígeno VEGF a usar para la producción de anticuerpos puede ser, por ejemplo, VEGF intacto o un fragmento de VEGF (por ejemplo, un fragmento de VEGF que comprende el "epítopo A.4.6.1"). Otras formas de VEGF útiles para la generación de anticuerpos serán evidentes para los especialistas en la técnica. El antígeno VEGF usado para generar el anticuerpo es, preferiblemente, VEGF humano, por ejemplo, como se describe en Leung et al., Science 246:1306 (1989), y Houck et al., Mol. Endocrin. 5:1806 (1991).

(ii) Anticuerpos policlonales

Los anticuerpos policlonales se aumentan preferiblemente en animales por múltiples inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antígeno pertinente y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno pertinente a una proteína que es inmunogénica en la especie a inmunizar, por ejemplo, hemocianina de la lapa californiana, albúmina de suero, tiroglobulina bovina, o inhibidor de tripsina de semilla de soja usando una agente bifuncional o de derivatización, por ejemplo, éster de sulfosuccinimida de maleimidobenzoilo (conjugación a través de restos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de restos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCl_{2}, o R^{1}N=C=NR, donde R y R^{1} son grupos alquilo diferentes.

Los animales se inmunizan frente al antígeno, conjugados inmunogénicos, o derivados combinando, por ejemplo, 100 \mug o 5 \mug de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución por vía intradérmica en múltiples sitios. Un mes después se estimula a los animales con 1/5 a 1/10 de la cantidad original del péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund por inyección subcutánea en múltiples sitios. De siete a 14 días después se extrae sangre de los animales y el suero se ensaya para el título del anticuerpo. Los animales se estimulan hasta el estacionamiento del título. Preferiblemente, el animal se estimula con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado a una proteína diferente y/o a través de un reactivo de entrecruzamiento diferente. Los conjugados también pueden hacerse en cultivo de células recombinantes como proteínas de fusión. Además, se usan apropiadamente agentes de agregación tales como alumbre para potenciar la respuesta inmune.

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(iii) Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales pueden hacerse usando el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o pueden hacerse por métodos de ADN recombinante (Patente de EEUU Nº
4.816.567).

En el método de hibridoma, se inmuniza un ratón u otro animal hospedador apropiado, tal como un hámster o mono macaco, como se ha descrito anteriormente para provocar linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína usada para inmunización. Como alternativa, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Después los linfocitos se fusionan a células de mieloma usando un agente de fusión apropiado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pág. 59-103 (Academia Press, 1986)).

Las células de hibridoma preparadas de este modo se siembran y se hacen crecer en un medio de cultivo apropiado que contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células no fusionadas de mieloma parentales. Por ejemplo, si las células de mieloma parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosiltransferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio HAT), sustancias que evitan el crecimiento de células deficientes en HGPRT.

Las células de mieloma preferidas son la que se fusionan eficazmente, soportan una producción de alto nivel estable de anticuerpo por las células productoras de anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a un medio como el medio HAT. Entre estas, las líneas celulares de mieloma preferidas son líneas de mieloma murinas, tales como las obtenidas de tumores de ratón MOP-21 y M.C.-11 disponibles por el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California EEUU, y células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles por la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland EEUU. También se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pág. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York,
1987)).

El medio de cultivo en el que se hacen crecer las células de hibridoma se ensaya para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos frente al antígeno. Preferiblemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación o por un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente de enzimas unidas (ELISA).

La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse por el análisis de Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Después de identificar que las células de hibridoma producen anticuerpos de la especificidad, afinidad, y/o actividad deseada, los clones pueden subclonarse por procedimientos de dilución limitante y crecimiento por métodos convencionales (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pág. 59-103 (Academia Press, 1986)). Los medios de cultivo apropiados para este propósito incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden crecer in vivo como tumores ascíticos en un animal.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan apropiadamente del medio de cultivo, fluido ascítico, o suero por procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía en hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afini-
dad.

El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aísla y se secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos monoclonales). Las células de hibridoma sirven como fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que después se transfieren en células hospedadoras tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO), o células de mieloma que no producen proteína inmunoglobulina de otro modo, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospedadoras recombinantes. La producción recombinante de anticuerpos se describirá con más detalle posteriormente.

(iv) Humanización y variantes de la secuencia de aminoácidos

Los Ejemplos 1-2 posteriores describen procedimientos para la humanización de un anticuerpo anti-VEGF. En ciertas realizaciones, puede ser deseable generar variantes de la secuencia de aminoácidos de estos anticuerpos humanizados, particularmente cuando éstas mejoran la afinidad de unión u otras propiedades biológicas del anticuerpo humanizado. El Ejemplo 3 describe metodologías para generar variantes de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo anti-VEGF con afinidad potenciada en relación con el anticuerpo parental.

Las variantes de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-VEGF se preparan introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ADN del anticuerpo anti-VEGF, o por síntesis peptídica. Dichas variantes incluyen, por ejemplo, deleciones, y/o inserciones y/o sustituciones en restos en las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos anti-VEGF de los ejemplos en este documento. Cualquier combinación de deleción, inserción, y sustitución se hace para llegar a la construcción final, a condición de que la construcción final tenga las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar procesos post-traduccionales del anticuerpo anti-VEGF humanizado o variante, tal como cambiando el número o posición de los sitios de glicosilación.

Un método útil para la identificación de ciertos restos o regiones del anticuerpo anti-VEGF que son posiciones preferidas para mutagénesis se llama "mutagénesis por exploración de alanina", como se describe por Cunningham y Wells Science, 244:1081-1085 (1989). Aquí, se identifica un resto o grupo de restos diana (por ejemplo, restos cargados tales como arg, asp, his, lys, y glu) y se reemplaza por un aminoácido cargado negativamente o neutro (más preferiblemente alanina o polialanina) para lograr la interacción de los aminoácidos con el antígeno VEGF. Las posiciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones después se perfeccionan introduciendo variantes adicionales o distintas a, o para, los sitios de sustitución. Por tanto, aunque el sitio para introducir una variación de la secuencia de aminoácidos está predeterminado, la naturaleza de la mutación per se no necesita estar predeterminada. Por ejemplo, para analizar el comportamiento de una mutación en un sitio dado, se dirige mutagénesis por exploración de ala o aleatoria al codón o región diana y las variantes de anticuerpos anti-VEGF expresadas se exploran para la actividad deseada. La mutagénesis por exploración de alanina se describe en el Ejemplo 3.

Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxil-terminales que varían en longitud de un resto a polipéptidos que contienen cien o más restos, así como inserciones dentro de la secuencia de un único resto o de múltiples restos de aminoácidos. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo anti-VEGF con un resto metionilo N-terminal o el anticuerpo fusionado a un señalizador de epítopo. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo anti-VEGF incluyen la fusión al N o C-terminal del anticuerpo anti-VEGF de una enzima o un polipéptido que aumenta la vida media en suero del anticuerpo (véase a continuación).

Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácido. Estas variantes tienen al menos un resto de aminoácido retirado en la molécula de anticuerpo anti-VEGF y un resto diferente insertado en su lugar. Los sitios de mayor interés para mutagénesis de sustitución incluyen las regiones hipervariables, aunque también se contemplan alteraciones de FR. Se muestran las sustituciones conservativas en la Tabla 1 con el título de "sustituciones preferidas". Si dichas sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, entonces pueden introducirse cambios más sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares" en la Tabla 1, o como se describe adicionalmente a continuación en referencia a clases de aminoácidos, y se exploran los productos.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

1

Las modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo se consiguen seleccionando sustituciones que difieren significativamente en el efecto en el mantenimiento de (a) la estructura del eje central polipeptídico en el área de sustitución, por ejemplo, como una conformación lámina o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los restos de origen natural se dividen en grupos en base a las propiedades comunes de la cadena lateral:

(1) hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2) hidrófilos neutros: cys, ser, thr;

(3) ácidos: asp, glu;

(4) básicos: asn, gln, his, lys, arg;

(5) restos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y

(6) aromáticos: trp, tyr, phe.

Las sustituciones no conservativas implicarán intercambiar un miembro de estas clases por otra clase.

También puede sustituirse cualquier resto de cisteína no implicado en el mantenimiento de la conformación apropiada del anticuerpo anti-VEGF humanizado o variante, generalmente por serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar entrecruzamientos aberrantes. A la inversa, puede añadirse al anticuerpo un enlace o enlaces de cisteína para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv).

Un tipo particularmente preferido de variante de sustitución implica sustituir uno o más restos de la región hipervariable de un anticuerpo parental (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). Generalmente, la variante o variantes resultantes seleccionadas para desarrollo adicional tendrán propiedades biológicas mejoradas en relación con el anticuerpo parental del que se han generado. Un modo adecuado para generar dichas variantes de sustitución es la maduración de afinidad usando presentación en fagos (véase Ejemplo 3 en este documento). Brevemente, se mutan varios sitios de la región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) para generar todas las posibles sustituciones de aminoácidos en cada sitio. Las variantes de anticuerpo generadas de este modo se muestran de un modo monovalente en partículas fágicas filamentosas como fusiones al producto del gen III de M13 empaquetadas en cada partícula. Las variantes presentadas en fagos se exploran después para su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) como se describe en este documento. Para identificar sitios de la región hipervariable candidatos para modificación, puede realizarse mutagénesis por exploración de alanina (véase Ejemplo 3) a restos de la región hipervariable identificados que contribuyen significativamente a la unión de antígeno. Como alternativa, o además, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el VEGF humano. Dichos restos de contacto y los restos adyacentes son candidatos para sustitución de acuerdo con las técnicas elaboradas en este documento. Una vez que se generan dichas variantes, el panel de variantes se somete a exploración como se describe en este documento y los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes puede seleccionarse para desarrollo adicio-
nal.

Otro tipo de variante de aminoácido del anticuerpo altera el patrón de glicosilación original del anticuerpo. Por alterar se quiere decir delecionar uno o más restos de carbohidratos encontrados en el anticuerpo, y/o añadir uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el anticuerpo.

La glicosilación de los anticuerpos típicamente tiene lugar con enlaces N o enlaces O. Enlace N se refiere a la unión del resto de carbohidrato a la cadena lateral de un resto de asparagina. Las secuencias tripeptídicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del resto de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Por tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un sitio potencial de glicosilación. Glicosilación por enlace O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un hidroxiaminoácido, más habitualmente a serina o treonina, aunque también puede usarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se consigue de manera práctica alterando la secuencia de aminoácidos de modo que contenga una o más de las secuencias tripeptídicas descritas anteriormente (para sitios de glicosilación por enlace N). La alteración también puede hacerse por adición de, o sustitución por, uno o más restos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilación por enlace O).

Las moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-VEGF se preparan por una diversidad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, aunque sin limitación, aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia de aminoácidos de origen natural) o preparación por mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida de sitio), mutagénesis por PCR, o mutagénesis por casete de una variante preparada anteriormente o una versión no variante del anticuerpo anti-VEGF.

(v) Anticuerpos humanos

Como alternativa a la humanización, pueden generarse anticuerpos humanos. Por ejemplo, ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, sobre la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción endógena de inmunoglobulinas. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigótica del gen de la región de unión de la cadena pesada del anticuerpo (J_{H}) en ratones quiméricos o mutantes en la línea germinal da como resultado la inhibición completa de producción endógena de anticuerpos. Transferir la serie de genes de las inmunoglobulinas de la línea germinal humana en dichos ratones mutantes en la línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos sobre la estimulación con antígeno. Véase, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); y las Patentes de EEUU Nº 5.591.669, Nº 5.589.369 y Nº 5.545.807. Los anticuerpos también pueden obtenerse de bibliotecas presentadas en fagos (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); y las Patentes de EEUU Nº 5.565.332 y Nº 5.573.905). Como se ha analizado anteriormente, los anticuerpos humanos también pueden generarse por células B activadas in vitro (véanse las Patentes de EEUU Nº 5.567.610 y Nº 5.229.275).

(vi) Fragmentos de anticuerpo

En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-VEGF humanizado o variante es un fragmento de anticuerpo. Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se obtenían mediante digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan et al., Science 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos ahora pueden producirse directamente por células hospedadoras recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos Fab'-SH pueden recuperarse directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos
F(ab')_{2} (Carter et al. Bio/Technology 10:163-167 (1992)). En otra realización, el F(ab')_{2} se forma usando la cremallera de leucina GCN4 para promover el ensamblaje de la molécula F(ab')_{2}. De acuerdo con otro enfoque, los fragmentos Fv, Fab o F(ab')_{2} pueden aislarse directamente de un cultivo de células hospedadoras recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes para los médicos especialistas.

(vii) Anticuerpos multiespecíficos

En algunas realizaciones, puede ser deseable generar anticuerpos anti-VEGF multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos) humanizados o variantes que tienen especificidades de unión para al menos dos epítopos diferentes. Los anticuerpos biespecíficos ejemplares pueden unir dos epítopos diferentes de la proteína VEGF. Como alternativa, puede combinarse un brazo anti-VEGF con un brazo que se una a una molécula de señalización en un leucocito tal como una molécula receptora de células T (por ejemplo, CD2 o CD3), o receptores Fc para IgG (Fc\gammaR), tal como Fc\gammaRI (CD64), Fc\gammaRII (CD32) y Fc\gammaRIII (CD16) para concentrar los mecanismos de defensa celulares hacia la célula que expresa VEGF. Los anticuerpos biespecíficos también pueden usarse para localizar agentes citotóxicos para células que expresan VEGF. Estos anticuerpos tienen un brazo de unión a VEGF y un brazo que se une al agente citotóxico (por ejemplo, saporina, anti-interferón-\alpha, alcaloide de la vinca, cadena A de ricina, metotrexato o hapteno de isótopo radiactivo). Los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse como anticuerpos de longitud completa o como fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')_{2}).

De acuerdo con otro enfoque para hacer anticuerpos biespecíficos, puede diseñarse la superficie de contacto entre un par de moléculas de anticuerpo para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo de células recombinantes. La superficie de contacto preferida comprende al menos una parte del dominio C_{H}3 de un dominio constante de un anticuerpo. En este método, se reemplazan una o más cadenas laterales pequeñas de aminoácidos de la superficie de contacto de la primera molécula de anticuerpo con cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean "cavidades" de tamaño idéntico o similar a la cadena o cadenas laterales grandes en la superficie de contacto de la segunda molécula de anticuerpo reemplazando cadenas laterales grandes de aminoácidos con otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar la producción del heterodímero sobre otros productos finales no deseados tales como homodímeros. Véase el documento WO96/27011 publicado el 6 de septiembre de 1996.

Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos entrecruzados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede unirse a avidina, el otro a biotina. Los anticuerpos heteroconjugados pueden hacerse usando cualquier método de entrecruzamiento adecuado. Los agentes de entrecruzamiento apropiados son bien conocidos en la técnica, y se describen en la Patente de EEUU Nº 4.676.980, junto con varias técnicas de entrecruzamiento.

Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos también se han descrito en la bibliografía. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse usando enlaces químicos. Brennan et al., Science 229:81 (1985) describe un procedimiento donde se escinden proteolíticamente anticuerpos intactos para generar fragmentos F(ab')_{2}. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente de arsenito sódico complejante de ditiol para estabilizar los ditioles vicinales y evitar la formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados después se convierten en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados Fab'-TNB después se reconvierte en el Fab'-tiol por reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolecular del otro derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden usarse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas. En una realización adicional más, los fragmentos Fab'-SH recuperados directamente de E. coli pueden unirse químicamente in vitro para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992).

También se han descrito diversas técnicas para hacer y aislar fragmentos de anticuerpo biespecíficos directamente de cultivo de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos usando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992). Los péptidos de cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes por fusión génica. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron a la región bisagra para formar monómeros y después se reoxidaron para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este método también puede utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "fragmentos bivalentes" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para hacer fragmentos de anticuerpo biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable de cadena ligera (V_{L}) por un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena. Por consiguiente, los dominios V_{H} y V_{L} de un fragmento se fuerzan a emparejar con los dominios V_{L} y V_{H} complementarios de otro fragmento, formando de ese modo dos sitios de unión a antígeno. También se ha informado de otra estrategia para hacer fragmentos de anticuerpos biespecíficos por el uso de dímeros Fv de cadena simple (sFv). Véase Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994). Como alternativa, el anticuerpo biespecífico puede ser un "anticuerpo lineal" producido como se describe en Zapata et al. Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995).

Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991).

(viii) Otras modificaciones

Se contemplan otras modificaciones del anticuerpo anti-VEGF humanizado o variante. Por ejemplo, puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, de modo que se potencie la eficacia del anticuerpo en el tratamiento del cáncer, por ejemplo. Por ejemplo, puede introducirse un resto o restos de cisteína en la región Fc, permitiendo de ese modo la formación de un enlace disulfuro intercatenario en esta región. El anticuerpo homodimérico generado de este modo puede tener una capacidad de internalización mejorada y/o eliminación celular mediada por el complemento y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). Véase Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). También pueden prepararse anticuerpos homodiméricos con actividad antitumoral potenciada usando entrecruzantes heterofuncionales como se describe en Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565 (1993). Como alternativa, puede diseñarse un anticuerpo que tiene regiones Fc duales y puede tener de ese modo capacidades de lisis por complemento y ADCC potenciadas. Véase Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989).

La invención también concierne a inmunoconjugados que comprenden el anticuerpo descrito en este documento conjugado a un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de las mismas), o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado).

Los agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de dichos inmunoconjugados se han descrito anteriormente. Las toxinas enzimáticamente activas y los fragmentos de las mismas que pueden usarse incluyen la cadena A de la toxina de la difteria, fragmentos no de unión de la toxina difteria, cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de la ricina, cadena A de la abrina, cadena A de la modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolacca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, anomicina y tricotecenos. Está disponible una diversidad de radionúclidos para la producción de anticuerpos anti-VEGF radioconjugados. Los ejemplos incluyen ^{212}Bi, ^{131}I, ^{131}In, ^{90}Y y ^{186}Re.

Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se hacen usando una diversidad de agentes de unión de proteínas bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCL), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis-(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados bis-diazonio (tales como bis(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolueno), y compuestos bis-flúor activo (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, puede prepararse una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un agente quelante ejemplar para la conjugación de radionucleótidos al anticuerpo. Véase documento WO94/11026.

En otra realización, el anticuerpo puede conjugarse a un "receptor" (tal como estreptavidina) para la utilización en el premarcaje tumoral donde el conjugado anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido de la retirada de la circulación del conjugado no unido usando un agente de eliminación y después administrando un "ligando" (por ejemplo, avidina) que se conjuga a un agente citotóxico (por ejemplo, un radionúclido).

Los anticuerpos anti-VEGF descritos en este documento también pueden formularse como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan por métodos conocidos en la técnica, tales como los descritos en Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang et al. Proc Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); y la Patente de EEUU Nº 4.485.045 y Nº 4.544.545. Los liposomas con tiempo de circulación potenciado se describen en la Patente de EEUU Nº 5.013.556.

Pueden generarse liposomas particularmente útiles por el método de evaporación de fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención pueden conjugarse a los liposomas como se describe en Martin et al., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982) mediante una reacción de intercambio de disulfuro. Opcionalmente el liposoma contiene un agente quimioterapéutico (tal como Doxorrubicina). Véase Gabizon et al., J. Nacional Cancer Inst. 81(19):1484(1989).

El anticuerpo de la presente invención también puede usarse en ADEPT conjugando el anticuerpo a una enzima de activación de profármaco que convierte un profármaco (por ejemplo, un agente quimioterapéutico peptídico, véase el documento WO81/01145) a un fármaco anti-cáncer activo. Véase, por ejemplo, el documento WO 88/07378 y la Patente de EEUU Nº 4.975.278.

El componente enzimático del inmunoconjugado útil para ADEPT incluye cualquier enzima capaz de funcionar en un profármaco de modo que lo convierta en su forma citotóxica más activa.

Las enzimas que son útiles en el método de esta invención incluyen, aunque sin limitación, fosfatasa alcalina, útil para convertir profármacos que contienen fosfato en fármacos libres; arilsulfatasa, útil para convertir profármacos que contienen sulfato en fármacos libres; citosina desaminasa, útil para convertir 5-fluorocitosina no tóxica en el fármaco anti-cáncer, 5-fluoroacilo; proteasas, tales como la proteasa de serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como las catepsinas B y L), que son útiles para convertir profármacos que contienen péptidos en fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir profármacos que contienen sustituyentes D-aminoácidos; enzimas de escisión de carbohidratos tales como \beta-galactosidasa y neuraminidasa, útiles para convertir profármacos glicosilados en fármacos libres; \beta-lactamasa, útil para convertir fármacos derivados con \beta-lactamas en fármacos libres; y penicilina amidasas, tales como la penicilina V amidasa o penicilina G amidasa, útiles para convertir fármacos derivatizados en sus nitrógenos de amina con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. Como alternativa, pueden usarse anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la técnica como "abzimas", para convertir los profármacos de la invención en fármacos activos libres (véase, por ejemplo, Massey, Nature 328:457-458 (1987)). Los conjugados anticuerpo-abzima pueden prepararse como se describe en este documento para suministrar la abzima a la población de células tumorales.

Las enzimas de esta invención pueden unirse covalentemente a los anticuerpos anti-VEGF por técnicas bien conocidas en la técnica tales como el uso de los reactivos entrecruzantes heterobifuncionales analizados anteriormente. Como alternativa, pueden construirse proteínas de fusión que comprenden al menos la región de unión al antígeno de una anticuerpo de la invención unida a al menos una porción funcionalmente activa de una enzima de la invención usando técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984)).

En ciertas realizaciones de la invención, puede ser deseable usar un fragmento de anticuerpo, en lugar de un anticuerpo intacto, para aumentar la penetración tumoral, por ejemplo. En este caso, puede ser deseable modificar el fragmente de anticuerpo para aumentar su vida media en suero. Esto puede conseguirse, por ejemplo, por incorporación de un epítopo de unión a receptor de rescate en el fragmento de anticuerpo (por ejemplo, por mutación de la región apropiada en el fragmento de anticuerpo o incorporando el epítopo en un señalizador peptídico que después se fusiona al fragmento de anticuerpo al final o en el medio, por ejemplo, por síntesis de ADN o péptidos). Véase el documento WO96/32478 publicado el 17 de octubre de 1996.

El epítopo de unión a receptor de rescate generalmente constituye una región donde uno cualquiera o más restos de aminoácidos de uno o dos bucles de un dominio Fc se transfieren a una posición análoga del fragmento del anticuerpo. Aún más preferiblemente, se transfieren tres o más restos de uno o dos bucles del dominio Fc. Más preferido todavía, el epítopo se toma del dominio CH2 de la región Fc (por ejemplo, de una IgG) y se transfiere a la región CH1, CH3, o V_{H}, o a más de una de dichas regiones del anticuerpo. Como alternativa, el epítopo se toma del dominio CH2 de la región Fc y se transfiere a la región C_{L} o región V_{L}, o ambas, del fragmento de anticuerpo.

En realizaciones preferidas, el epítopo de unión a receptor de rescate comprende la secuencia: PKNSSMISNTP (SEC.ID.Nº 17), y opcionalmente también comprende una secuencia seleccionada entre el grupo compuesto por HQSLGTQ (SEC.ID.Nº 18), HQNLSDGK (SEC.ID.Nº 19), HQNISDGK (SEC.ID.Nº 20), o VISSHLGQ (SEC.ID.Nº 21), particularmente cuando el fragmento de anticuerpo es un Fab o F(ab')_{2} o el epítopo de unión a receptor de rescate es un polipéptido que contiene la secuencia o secuencias: HQNLSDGK (SEC.ID.Nº 19), HQNISDGK (SEC.ID.Nº 20), o VISSHLGQ (SEC.ID.Nº 21) y las secuencia: PKNSSMISNTP (SEC.ID.Nº 17).

Las modificaciones covalentes del anticuerpo anti-VEGF humanizado o variante también se incluyen en el alcance de esta invención como se define en las reivindicaciones. Pueden hacerse por síntesis química o por escisión enzimática o química del anticuerpo, si es aplicable. Se introducen otros tipos de modificaciones covalentes del anticuerpo en la molécula haciendo reaccionar restos de aminoácidos marcados del anticuerpo con un agente de derivatización orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los restos N o C-terminales. Las modificaciones covalentes ejemplares de polipéptidos se describen en la Patente de EEUU Nº 5.534.615. Un tipo preferido de modificación covalente del anticuerpo comprende la unión del anticuerpo a uno de una diversidad de polímeros no proteicos, por ejemplo, polietilenglicol, propilenglicol, o polioxialquilenos, del modo descrito en las Patentes de EEUU Nº 4.640.835; Nº 4.496.689; Nº 4.301.144; Nº 4.670.417; Nº 4.791.192 ó Nº 4.179.337.

B. Vectores, células hospedadoras y métodos recombinantes

La invención también proporciona un ácido nucleico asilado que codifica el anticuerpo anti-VEGF humanizado o variante, vectores y células hospedadoras que comprenden el ácido nucleico, y técnicas recombinantes para la producción del anticuerpo.

Para la producción recombinante del anticuerpo, puede asilarse el ácido nucleico que lo codifica e insertarse en un vector de replicación para clonación adicional (amplificación del ADN) o para expresión. En otra realización, el anticuerpo puede producirse por recombinación homóloga, por ejemplo, como se describe en la Patente de EEUU Nº 5.204.244. El ADN que codifica el anticuerpo monoclonal se aísla y se secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo). Están disponibles muchos vectores. Los componentes del vector generalmente incluyen, aunque sin limitación, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de terminación de la transcripción, por ejemplo, como se describe en la Patente de EE UU Nº 5.534.615 expedida el 9 de julio de 1996.

Las células hospedadoras apropiadas para clonación y expresión del ADN en los vectores en este documento, son las células procariotas, levaduras, o eucariotas superiores descritas anteriormente. Las procariotas apropiadas para este propósito incluyen eubacterias, tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo Serratia marcescans, y Shigella, así como Bacilli tales como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P descrito en el documento DD 266.710 publicado el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa, y Streptomyces. Un hospedador de clonación de E. coli preferido es E. coli 294 (ATCC 31.446), aunque son apropiadas otras cepas tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537), y E. coli W3110 (ATCC 27.325). Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de limitantes.

Además de los procariotas, los microbios eucariotas tales como hongos o levaduras filamentosos son hospedadores de clonación o expresión apropiados para vectores que codifican anticuerpo anti-VEGF. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura común del pan, es la más habitualmente usada entre los microorganismos hospedadores eucariotas inferiores. Sin embargo, están habitualmente disponibles varios otros géneros, especies, y cepas, y son útiles en este documento, tales como Schizosaccharomyces pombe; hospedadores Kluyveromyces tales como, por ejemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans, y K. marxiamis; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, y hospedadores Aspergillus tales como A. nidulans y A. niger.

Las células hospedadoras apropiadas para la expresión de anticuerpos anti-VEGF glicosilados se obtienen de organismos multicelulares. Los ejemplos de células de invertebrados incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas y variantes de baculovirus y células hospedadoras de insecto permisivas correspondientes de hospedadores tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), y Bombyx mori. Están disponibles al público una diversidad de cepas virales para la transfección, por ejemplo, la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y dichos virus pueden usarse en este documento como los virus de acuerdo con la presente invención, particularmente para transfección de células de Spodoptera frugiperda. También pueden utilizarse como hospedadores cultivos de células vegetales del algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate, y tabaco.

Sin embargo, el interés ha sido mayor en células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivos tisulares) ha llegado a ser un procedimiento de rutina. Los ejemplos de líneas celulares hospedadoras de mamífero son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de riñón embrionario humano (293 o células 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4. Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76. ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor de mama de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TR1 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2).

Las células hospedadoras se transforman con los vectores de expresión o clonación descritos anteriormente para la producción de anticuerpos anti-VEGF y se cultivan en medio nutriente convencional modificado del modo apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes, o ampliar los genes que codifican las secuencias deseadas.

Las células hospedadoras usadas para producir el anticuerpo anti-VEGF de esta invención pueden cultivarse en una diversidad de medios. Los medios disponibles en el mercado tales como Ham's F10 (Sigma), Medio Esencial Mínimo ((MEM), Sigma)), RPM1I-1640 (Sigma), y Medio de Eagle Modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) son apropiados para cultivar las células hospedadoras. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), las Patentes de EE UU Nº 4.767.704; Nº 4.657.866; Nº 4.927.762; Nº 4.560.655; o Nº 5.122.469; documentos WO 90/03430; WO 87/00195; o la Patente de EEUU Re. Nº 30.985 pueden usarse como medios de cultivo para las células hospedadoras. Cualquiera de estos medios puede suplementarse si es necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro sódico, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como el fármaco GENTAMYCIN™), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos habitualmente presentes a concentraciones finales en el intervalo micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente. También pueden incluirse otros suplementos cualesquiera necesarios a las concentraciones apropiadas que serían conocidas para los especialistas en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH, y similares, son las previamente usadas con las células hospedadoras seleccionadas para expresión, y serán evidentes para el especialista en la técnica.

Cuando se usan técnicas recombinantes, el anticuerpo puede producirse de manera intracelular, en el espacio periplásmico, o secretarse directamente en el medio. Si el anticuerpo se produce de manera intracelular, como primera etapa, los restos particulados, células hospedadoras o fragmentos lisados, se retiran, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) describe un procedimiento para asilar anticuerpos que se secretan al espacio periplásmico de E. coli. Brevemente, se descongela la pasta celular en presencia de acetato sódico (pH 3.5), EDTA, y fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) durante aproximadamente 30 minutos. Los restos celulares pueden retirarse por centrifugación. Cuando se secreta el anticuerpo en el medio, los sobrenadantes de dichos sistemas de expresión generalmente primero se concentran usando un filtro de concentración de proteínas disponible en el mercado, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Puede incluirse un inhibidor de proteasa tal como PMSF en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteolisis y pueden incluirse antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes adventicios.

La composición de anticuerpo preparada a partir de estas células puede purificarse usando, por ejemplo, cromatografía en hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, y cromatografía de afinidad, siendo con cromatografía de afinidad la técnica de purificación preferida. Lo apropiada que sea la proteína A como ligando de afinidad depende de la especie e isotipo de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina que esté presente en el anticuerpo. Puede usarse la proteína A para purificar anticuerpos que están basados en las cadenas pesadas \gamma1, \gamma2, o \gamma4 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-12 (1983)). Se recomienda la proteína G para todos los isotipos de ratón y para \gamma3 humana (Guss et al., EMBO J. 5:1567-1575 (1986)). La matriz a la que se une el ligando de afinidad es, de la manera más frecuente, agarosa, pero están disponibles otras matrices. Las matrices mecánicamente estables tales como vidrio de poro controlado o poli(estirenodivinil)benceno permiten velocidades de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que los que pueden conseguirse con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio C_{H}3, la resina Bakerbond ABX™ (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para la purificación. También son apropiadas otras técnicas para la purificación de proteínas tales como fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de Fase Inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparin SEPHAROSE™, cromatografía en una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna de ácido poliaspártico), cromatoenfoque, SDS-PAGE, y precipitación en sulfato de amonio, dependiendo del anticuerpo a recuperar.

Después de cualquier etapa o etapas de purificación preliminar, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y los contaminantes puede someterse a cromatografía de interacción hidrófoba de bajo pH usando un tampón de elución a un pH entre aproximadamente 2,5-4,5, preferiblemente realizada a concentraciones salinas bajas (por ejemplo, solución salina de aproximadamente 0-0,25 M).

C. Formulaciones farmacéuticas

Las formulaciones terapéuticas del anticuerpo se preparan para almacenarlas mezclando el anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con vehículos, excipientes o estabilizadores óptimos fisiológicamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences 16ª edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos, excipientes, o estabilizadores aceptables son no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleados, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; alcohol fenólico, butílico o bencílico; parabenos de alquilo tales como parabeno de metilo o propilo; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos que incluyendo glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trealosa o sorbitol; sales que forman contraiones tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol
(PEG).

La formulación en este documento también puede contener más de un compuesto activo, si es necesario, para la afección particular que se está tratando, preferiblemente los de actividades complementarias que no influyen de manera adversa entre sí (véase sección F a continuación). Dichas moléculas están presentes de manera apropiada en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido.

Los ingredientes activos también pueden atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización entre superficies, por ejemplo, microcápsula de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsula de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de liberación de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 16ª edición, Osol, A. Ed. (1980).

Las formulaciones a usar para administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente por filtración a través de membranas estériles de filtración.

Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos apropiados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos que contienen el anticuerpo, que están dichas matrices en forma de artículos con forma, por ejemplo, películas, o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), o poli(vinilalcohol)), polilactidas (Patente de EE UU Nº 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y \gamma etil-L-glutamato, acetato de etilen-vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico- ácido glicólico degradables tales como el Lupron Depot™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Mientras que los polímeros tales como acetato de etilenvinilo y ácido láctico-ácido glicólico posibilitan una liberación de moléculas durante más de cien días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando permanecen anticuerpos encapsulados en el cuerpo durante un tiempo largo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a humedad a 37ºC, dando como resultado una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Pueden elaborarse estrategias razonables para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces S-S intermoleculares a través de intercambio de tio-disulfuro, la estabilización puede conseguirse modificando los restos sulfhidrilo, liofilizando a partir de soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos apropiados, y desarrollando composiciones de matriz polimérica específicas.

D. Usos no terapéuticos del anticuerpo

Los anticuerpos de la invención pueden usarse como agentes de purificación por afinidad. En este proceso, los anticuerpos se inmovilizan en una fase sólida tal como una resina Sephadex o papel de filtro, usando métodos bien conocidos en la técnica. El anticuerpo inmovilizado se hace contactar con una muestra que contiene la proteína VEGF (o fragmento de la misma) a purificar, y después se lava el soporte con un disolvente apropiado que retirará sustancialmente todo el material en la muestra excepto la proteína VEGF, que se une al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, se lava el soporte con otro disolvente apropiado, tal como tampón glicina, pH 5,0, que liberará la proteína VEGF del anticuerpo.

Los anticuerpos anti-VEGF también pueden ser útiles en ensayos de diagnóstico para la proteína VEGF, por ejemplo, detectando su expresión en células, tejidos, o suero específicos. Dichos métodos de diagnóstico pueden ser útiles en diagnosis del cáncer.

Para aplicaciones de diagnóstico, el anticuerpo típicamente se marca con un resto detectable. Son apropiados numerosos marcadores que pueden agruparse generalmente en las siguientes categorías:

(a) Radioisótopos, tales como ^{35}S, ^{14}C, ^{125}I, ^{3}H, e ^{135}I. El anticuerpo puede marcarse con el radioisótopo usando las técnicas descritas en Current Protocols in Immunology, Volúmenes 1 y 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, Nueva York, New York, Pubs. (1991), por ejemplo, y la radiactividad puede medirse usando un cuenta de centelleo.

(b) Marcadores fluorescentes tales como quelatos térreos raros (quelatos de curopio) o fluoresceína o sus derivados, rodamina y sus derivados, dansil, Lisamina, ficoeritrina y rojo Texas son apropiados. Los marcadores fluorescentes pueden conjugarse al anticuerpo usando las técnicas descritas en Current Protocols in Immunology, supra, por ejemplo. La fluorescencia puede cuantificarse usando un fluorímetro.

(c) Están disponibles diversos marcadores enzima-sustrato y la Patente de EE UU Nº 4.275.149 proporciona un análisis de algunos de ellos. La enzima generalmente cataliza una alteración química del sustrato cromogénico que puede medirse usando diversas técnicas. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de color en un sustrato, que puede medirse de un modo espectrofotométrico. Como alternativa, la enzima puede alterar la fluorescencia o quimioluminiscencia del sustrato. Las técnicas para cuantificar un cambio en la fluorescencia se han descrito anteriormente. El sustrato quimioluminiscente llega a excitarse electrónicamente por una reacción química y entonces puede emitir luz que puede medirse (usando un quimioluminómetro, por ejemplo) o donar energía a un aceptor fluorescente. Los ejemplos de marcadores enzimáticos incluyen luciferasas (por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana; Patente de EE UU Nº 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalacinedionas, malato deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa tal como peroxidasa de rábano rusticano (HRPO), fosfatasa alcalina, \beta-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas de sacáridos (por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa, y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), oxidasas heterocíclicas (tales como uricasa y xantina oxidasa), lactoperoxidasa, microperoxidasa, y similares. Las técnicas para conjugar enzimas a anticuerpos se describen en O' Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, Nueva York, 73:147-166 (1981).

Los ejemplos de combinaciones enzimas-sustrato incluyen, por ejemplo:

(i) peroxidasa de rábano rusticano (HRPO) con hidrógeno peroxidasa como sustrato, donde la hidrógeno peroxidasa oxida un precursor con color (por ejemplo, ortofenilendiamina (OPD) o clorhidrato de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB));

(ii) fosfatasa alcalina (AP) con de para-nitrofenilo como sustrato cromogénico; y

(iii) \beta-D-galactosidasa (\beta-D-Gal) con un sustrato cromogénico (por ejemplo, p-nitrofenil-\beta-D-galactosidasa) o el sustrato fluorogénico 4-metilumbeliferil-\beta-D-galactosidasa.

Otras numerosas combinaciones enzima-sustrato son apropiadas para los especialistas en la técnica. Para un análisis general de estas, véanse las Patentes de EEUU Nº 4.275.149 y Nº 4.318.980.

A veces, el marcador está conjugado indirectamente con el anticuerpo. El especialista en la técnica será consciente de diversas técnicas para conseguir esto. Por ejemplo, el anticuerpo puede conjugarse con biotina y cualquiera de las tres categorías principales de marcadores mencionados anteriormente puede conjugarse con avidina, o viceversa. La biotina se une de manera selectiva a avidina y, de este modo, el marcador puede conjugarse con el anticuerpo en este modo indirecto. Como alternativa, para conseguir la conjugación indirecta del marcador con el anticuerpo, el anticuerpo se conjuga con un pequeño hapteno (por ejemplo, digoxina) y uno de los diferentes tipos de marcadores mencionados anteriormente se conjuga con un anticuerpo anti-hapteno (por ejemplo, anticuerpo anti-digoxina). De este modo, puede conseguirse la conjugación indirecta del marcador con el anticuerpo.

En otra realización de la invención, el anticuerpo anti-VEGF no necesita estar marcado, y la presencia del mismo puede detectarse usando un anticuerpo marcado que se une al anticuerpo anti-VEGF.

Los anticuerpos de la presente invención pueden emplearse en cualquier método de ensayo conocido, tal como ensayos de unión competitiva, ensayos tipo sándwich directos o indirectos, y ensayos de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pág. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987).

Los ensayos de unión competitiva se basan en la capacidad de un patrón marcado para competir con el analito de la muestra de ensayo para unirse con una cantidad limitada de anticuerpo. La cantidad de proteína VEGF en la muestra de ensayo es inversamente proporcional a la cantidad de patrón que llega a unirse a los anticuerpos. Para facilitar la determinación de la cantidad de patrón que llega a unirse, generalmente se insolubilizan los anticuerpos antes o después de la competición, de modo que el patrón y el analito que se unen a los anticuerpos pueden separarse de manera adecuada del patrón y del analito que permanecen sin unirse.

Los ensayos tipo sándwich implican el uso de dos anticuerpos, capaces cada uno de unirse a una porción inmunogénica diferente, o epítopo, de la proteína a detectar. En un ensayo tipo sándwich, el analito de la muestra de ensayo se une por un primer anticuerpo que está inmovilizado en un soporte sólido, y posteriormente un anticuerpo secundario se une al analito, formando de este modo un complejo tripartito insoluble. Véase, por ejemplo, la Patente de EE UU Nº 4.376.110. El anticuerpo secundario puede por sí mismo estar marcado con un resto detectable (ensayos tipo sándwich directos) o pueden medirse usando un anticuerpo anti-inmunoglobulina que está marcado con un resto detectable (ensayo tipo sándwich indirecto). Por ejemplo, un tipo de ensayo tipo sándwich es un ensayo ELISA, en cuyo caso el resto detectable es una enzima.

Para inmunohistoquímica, la muestra tumoral puede ser fresca o congelada o puede estar embebida en parafina y fijada con un conservante tal como formalina, por ejemplo.

Los anticuerpos también pueden usarse para ensayos de diagnóstico in vivo. Generalmente, el anticuerpo está marcado con un radionúclido (tales como ^{111}In, ^{99}Tc, ^{14}C, ^{131}I, ^{125}I, ^{3}H, ^{32}P o ^{35}S) de modo que el tumor puede localizarse usando inmunocentelleografía.

E. Kits de diagnóstico

Por motivos de comodidad, el anticuerpo de la presente invención puede proporcionarse en un kit, es decir, una combinación empaquetada de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones para realizar en ensayo de diagnóstico. Cuando el anticuerpo está marcado con una enzima, el kit incluirá sustratos y cofactores requeridos por la enzima (por ejemplo, un sustrato precursor que proporciona el cromóforo o fluoróforo detectable). Además, pueden incluirse otros aditivos tales como estabilizadores, tampones (por ejemplo, un tampón de bloqueo o un tampón de lisis) y similares. Las cantidades relativas de los diversos reactivos pueden variar ampliamente para proporcionar concentraciones en solución de los reactivos que optimizan sustancialmente la sensibilidad del ensayo. Particularmente, los reactivos pueden proporcionarse como polvos secos, habitualmente liofilizados, incluyendo excipientes que, en disolución, proporcionarán una solución de reactivo que tiene la concentración apropiada.

F. Usos terapéuticos para el anticuerpo

Para aplicaciones terapéuticas, los anticuerpos anti-VEGF de la invención se administran a un mamífero, preferiblemente a un humano, en una forma de dosificación farmacéuticamente aceptable, tal como las analizadas anteriormente, incluyendo las que pueden administrarse a un humano por vía intravenosa como un bolo o por infusión continua durante un periodo de tiempo, por vía intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, o por inhalación. Los anticuerpos también se administran apropiadamente por vía intratumoral, peritumoral, intralesional, o perilesional, para ejercer efectos terapéuticos locales así como sistémicos. Se espera que la vía intraperitoneal sea particularmente útil, por ejemplo, en el tratamiento de tumores de ovario.

Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosificación apropiada de anticuerpo dependerá del tipo de enfermedad a tratar, como se ha definido anteriormente, la gravedad y el curso de la enfermedad, si el anticuerpo se administra para propósitos preventivos o terapéuticos, la terapia previa, la historia clínica del paciente y la respuesta al anticuerpo, y el juicio del médico que está atendiendo. El anticuerpo se administra apropiadamente al paciente en una vez o durante una serie de tratamientos.

Los anticuerpos anti-VEGF son útiles en el tratamiento de diversas enfermedades y trastornos neoplásicos y no neoplásicos. Los neoplasmas y afecciones relacionadas que son susceptibles al tratamiento incluyen carcinomas de mama, carcinomas de pulmón, carcinomas gástricos, carcinomas esofágicos, carcinomas colorectales, carcinomas de hígado, carcinomas de ovario, tecomas, arrenoblastomas, carcinomas cervicales, carcinoma endometrial, hiperplasia endometrial, endometriosis, fibrosarcomas, coriocarcinoma, cáncer de cabeza y cuello, carcinoma nasofaríngeo, carcinoma laríngeo, hepatoblastoma, sarcoma de Kaposi, melanoma, carcinomas de piel, hemangioma, hemangioma cavernoso, hemangioblastoma, carcinomas de páncreas, retinoblastoma, astrocitoma, glioblastoma, Schwannoma, oligodendroglioma, meduloblastoma, neuroblastoma, rabdomiosarcoma, sarcoma osteogénico, leiomiosarcomas, carcinomas del tracto urinario, carcinomas tiroideos, tumor de Wilm, carcinoma de células renales, carcinoma de próstata, proliferación vascular anormal asociada con facomatosis, edema (tal como el asociado con tumores cerebrales), y síndrome de Meig.

Las afecciones no neoplásicas que son susceptibles al tratamiento incluyen artritis reumatoide, psoriasis, arteriosclerosis, retinopatías diabéticas y otras retinopatías proliferativas que incluyen retinopatía del prematuro, fibroplasia retrolental, glaucoma neovascular, degeneración macular relacionada con la edad, hiperplasias tiroideas (incluyendo la enfermedad de Grave), trasplante corneal y transplante de otros tejidos, inflamación crónica, inflamación pulmonar, síndrome nefrótico, preeclampsia, ascitis, efusión pericárdica (tal como la asociada con pericarditis), y efusión pleural.

La degeneración macular relacionada con la edad (AMD) es una causa que conduce a la pérdida de vista grave en población anciana. La forma exudativa de AMD está caracterizada por neovascularización coroidal y desprendimiento de células del epitelio de pigmentario retinal. Como la neovascularización coroidal está asociada con un empeoramiento drástico en la prognosis, se espera que los anticuerpos anti-VEGF de la presente invención sean especialmente útiles en reducir la gravedad de AMD.

Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, aproximadamente 1 \mug/kg a aproximadamente 50 mg/kg (por ejemplo, 0,1-20 mg/kg) de anticuerpo es una dosificación candidata inicial para la administración al paciente, tanto, por ejemplo, por una o mas administraciones por separado, o por infusión continua. Una dosificación típica diaria o semanal podría variar de aproximadamente 1 \mug/kg a aproximadamente 20 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones por repetido el tratamiento se repite varios días o más, dependiendo de la afección, hasta que sucede la supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación. El progreso de esta terapia se controla fácilmente por técnicas y ensayos convencionales, incluyendo, por ejemplo, imágenes radiográficas tumorales.

La eficacia del anticuerpo en prevenir y tratar la enfermedad puede mejorarse administrando el anticuerpo de manera seriada o en combinación con otro agente que es eficaz para esos propósitos, tal como factor de necrosis tumoral (TNF), un anticuerpo capaz de inhibir o neutralizar la actividad angiogénica del factor de crecimiento de fibroblastos ácido o básico (FGF) o el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), un anticuerpo capaz de inhibir o neutralizar las actividades coagulantes del factor tisular, la proteína C, o la proteína S (véase Esmon et al., Publicación de Patente PCT Nº WO 91/01753, publicada el 21 de febrero de 1991), un anticuerpo capaz de unirse al receptor HER2 (véase Hudziak et al., Publicación de Patente PCT Nº WO 89/06692, publicada el 27 de julio de 1989), o uno o más agentes terapéuticos convencionales tales como, por ejemplo, agentes alquilantes, antagonistas de ácido fólico, antimetabolitos del metabolismo de ácidos nucleicos, antibióticos, análogos de pirimidina, 5-fluoroacilo, cisplatino, nucleósidos de purina, aminas, aminoácidos, nucleósidos de tiazol, o corticoesteroides. Estos otros agentes pueden estar presentes en la composición que se está administrando o pueden administrase por separado. Además, el anticuerpo se administra apropiadamente de manera seriada o en combinación con tratamientos radiológicos, que implican tanto irradiación como administración de sustancias radiactivas.

La vascularización de tumores puede combatirse en terapia de combinación. Se administran el anticuerpo y uno o más antagonistas anti-VEGF diferentes a los pacientes que tienen tumor a dosis terapéuticamente eficaces como se determina, por ejemplo, observando la necrosis del tumor o sus focos metastásicos, si los hay. Esta terapia se continúa hasta que no se observan más efectos beneficiosos o los exámenes clínicos no muestran rastro del tumor o cualquier foco metastásico. Entonces se administra TNF, solo o en combinación con una agente auxiliar tal como interferón alfa, beta o gamma, anticuerpo anti-HER2, heregulina, anticuerpo anti-heregulina, factor D, interleuquina-1 (IL-1), interleuquina-2 (IL-2), factor de estimulación de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), o reactivos que promueven la coagulación vascular en tumores, tales como anticuerpo anti-proteína C, anticuerpo anti-proteína S, o proteína de unión C4b (véase Esmon et al., Publicación de Patente PCT Nº WO 91/01753, publicada el 21 de Febrero de 1991), o calor o radiación.

Como los agentes auxiliares variarán en su eficacia, es deseable comparar su impacto en el tumor por exploración de matriz de un modo convencional. La administración de anticuerpo anti-VEGF y TNF se repite hasta que se consigue el efecto clínico deseado. Como alternativa, el anticuerpo anti-VEGF se administra junto con TNF y, opcionalmente, agente o agentes auxiliares. En ocasiones, cuando se encuentran tumores sólidos en las extremidades o en otras localizaciones susceptibles de asilamiento de la circulación general, los agentes terapéuticos directos en este documento se administran al tumor u órgano asilado. Puede administrarse un antagonista de FGF o factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), tal como un anticuerpo neutralizante anti-FGF o anti-PDGF, al paciente junto con el anticuerpo anti-VEGF. El tratamiento con anticuerpos anti-VEGF puede suspenderse de manera óptima durante periodos de curación de heridas o neovascularización deseada.

G. Artículos de fabricación

Se contempla un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y un marcador. Los recipientes apropiados incluyen, por ejemplo, botes, viales, jeringas, y tubos de ensayo. Los recipientes pueden formarse de una diversidad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es eficaz para el tratamiento de la afección y puede tener una vía de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa o un vial de solución intravenosa que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). El agente activo en la composición es el anticuerpo anti-VEGF. El marcador en, o en asociación con, el recipiente indica que la composición se usa para tratar la afección de elección. El artículo de fabricación puede comprender adicionalmente un segundo recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como una solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. También puede incluir otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y útil, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas, y prospectos con instrucciones para su uso.

Ejemplo 1

Este ejemplo describe la producción de anticuerpos anti-VEGF humanizados con propiedades deseables desde un punto de vista terapéutico.

Materiales y métodos

Clonación de MAb A.4.6.1 Murino y Construcción de Fab Quimérico de Ratón-Humano: El mAb A.4.6.1 anti-VEGF murino se ha descrito previamente por Kim et al., Growth Factors 7:53 (1992) y Kim et al., Nature 362:841 (1993). Se asiló el ARN total de células de hibridoma que producen el Mab A.4.6.1. anti-VEGF usando RNAsol (TEL-TEST) y se transcribió a la inversa a ADNc usando el cebador Oligo-dT y el sistema SuperScript II (GIBCO BRL, Gaithersburg), MD). Las combinaciones de cebadores oligonucleotídicos degenerados, basados en las secuencias de aminoácidos N-terminales de las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo, se sintetizaron y se usaron como cebadores directos. Los cebadores inversos se basaron en las 4 secuencias flanqueantes obtenidas del subgrupo kV de cadenas ligeras y el subgrupo II de cadenas pesadas murinas (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5ª ed Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Después de la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), los fragmentos de ADN se ligaron a un vector de clonación TA (Invitrogen, San Diego, CA). Se secuenciaron ocho clones de cada una de las cadenas pesada y ligera. Se subclonaron un clon con una secuencia consenso para el domino VL de la cadena ligera y uno con una secuencia consenso para el domino VH de la cadena pesada, respectivamente, en el vector pEMX1 que contiene los dominios CL y CH1 humanos (Werther et al., J. Immunol. 157:4986-4995 (1996)), generando una quimera ratón- humano. Este F(ab) quimérico consta del domino VH A.4.6.1 murino completo fusionado a un domino CH1 humano en el aminoácido SerH113 y el dominio VL A.4.6.1 murino completo fusionado a un dominio CL humano en el aminoácido LisL107. La expresión y purificación del F(ab) quimérico fueron idénticas a las de los F(ab) humanizados. El F(ab) quimérico se usó como patrón en los ensayos de unión.

Modelos Gráficos Informáticos de F(ab) Humanizados y Murinos: Las secuencias de los dominios VL y VH (Figuras 1A y 1B) se usaron para construir un modelo gráfico informático de los dominios VL-VH A.4.6.1 murinos. Este modelo se usó para determinar qué restos flanqueantes deben incorporarse en el anticuerpo humanizado. También se construyó un modelo del F(ab) humanizado para verificar la selección correcta de los restos flanqueantes murinos. La construcción de los modelos se realizó como se ha descrito previamente (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-4289 (1992) y Eigenbrot et al., J. Mol. Biol. 229:969-995 (1993)).

Construcción de F(ab) humanizados: El plásmido pEMX1 usado para mutagénesis y expresión de F(ab) en E. coli se ha descrito previamente (Werther et al., supra). Brevemente, el plásmido contiene un fragmento de ADN que codifica una secuencia consenso del subgrupo I de cadenas ligeras \kappa humanas (VL\kappaI-CL) y una secuencia consenso del subgrupo III de cadenas pesadas humanas (VHIII-CHI) y un promotor de fosfatasa alcalina. El uso de las secuencias consenso para VL y VH se ha descrito previamente (Carter et al., supra).

Para construir la primera variante de F(ab) de A.4.6.1. humanizado, F(ab)-1, se realizó mutagénesis dirigida de sitio (Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985)) en un molde de pEMX1 que contiene desoxiuridina. Los seis CDR de acuerdo con Kabat et al., supra, se cambiaron a la secuencia de A.4.6.1 murino. Por lo tanto, F(ab)-1 consta de una región flanqueante humana completa (VL \kappa subgrupo I y VH subgrupo III) con las seis secuencias CDR murinas completas. Se construyeron plásmidos para todas las otras variantes de F(ab) a partir del molde plasmídico de F(ab)-1. Los plásmidos se transformaron en la cepa XL-1 Blue de E. coli (Stratagene, San Diego, CA) para la preparación de ADN de cadena doble y cadena simple. Para cada variante, se secuenció completamente el ADN que codifica las cadenas ligera y pesada usando el método de dideoxinucleótidos (Sequenase, U.S. Biochemical Corp., Cleveland, OH). Los plásmidos se transformaron en la cepa 16C9 de E. coli, un derivado de MM294, se sembraron en placas de caldo Luria que contenían 50 \mug/ml de carbenicilina, y se seleccionó una colonia simple para la expresión de proteína. La colonia simple se hizo crecer en 5 ml de caldo Luria-100 mg/ml de carbenicilina durante 5-8 horas a 37ºC. Los 5 ml de cultivo se añadieron a 500 ml de AP5-50 \mug/ml de carbenicilina y se dejaron crecer durante 20 horas en un matraz de agitación impedida de 4 litros a 30ºC. El medio AP5 consta de 1,5 g de glucosa, 11,0 g de Hycase SF, 0,6 g de extracto de levadura (certificado), 0,19 g de MgSO_{4} (anhidro), 1,07 g de NH_{4}Cl, 3,73 g de KCl, 1,2 g de NaCl, 120 ml de trietanolamina 1 M, pH 7,4, a 1 litro de agua y después se filtró en esterilidad a través de un filtro Sealkeen de 0,1 mm. Las células se recogieron por centrifugación en un bote de centrifugado de 1 litro a 3000 x g y se recogió el sobrenadante. Después de congelar durante 1 hora, el sedimento se resuspendió en 25 ml de Tris 10 mM-EDTA 1 mM-sacarosa al 20%, pH 8,0, frío. Se añadieron 250 ml de benzamidina 0,1 M (Sigma. St Louis, MO) para inhibir la proteolisis. Después de agitar suavemente en hielo durante 3 horas, la muestra se centrifugo a 40.000 x g durante 15 minutos. Después se aplicó el sobrenadante a 1 columna de proteína G-Sepharose CL-4B (Pharmacia, Uppsala, Suecia) (volumen de lecho 0,5 ml) equilibrada con Tris 10 mM-EDTA 1 mM, pH 7,5. La columna se lavó con 10 ml de Tris 10 mM-EDTA 1 mM, pH 7,5, y se eluyó con 3 ml de glicina 0,3 M, pH 3,0, en 125 ml de Tris 1 M, pH 8,0. Después se intercambió el tampón de F(ab) por PBS usando un Centricon 30 (Amicon, Beberly, MA) y se concentró a un volumen final de 0,5 ml. Se corrieron geles SDS-PAGE para todos los F(ab) para determinar la pureza y el peso molecular de cada variante se verificó por espectrometría de masas por electronebulización.

Construcción y Expresión de IgG Quimérico y Humanizado: Para la generación de variantes de IgG humanas de A.4.6.1 quiméricos (chIgG1) y humanizados (huIgG1), se subclonaron los dominios VL y VH murinos o humanizados apropiados (F(ab)-12, Tabla 2) en vectores pRK descritos previamente, por separado (Eaton et al., Biochemistry 25:8343-8347 (1986)). El AND que codifica la cadena ligera y pesada completas de cada variante se verificó por secuenciación de dideoxinucleótidos.

Para la expresión transitoria de las variantes, los plásmidos de la cadena pesada y ligera se cotrasfectaron en células 293 humanas (Graham et al., Gen. Virol. 36:59-74 (1977)), usando un procedimiento de alta eficacia (Gorman et al., DNA Prot. Eng. Tech. 2:3-10 (1990)). El medio se cambió a uno libre de suero y se recogió diariamente durante hasta cinco días. Los anticuerpos se purificaron de los sobrenadantes combinados usando proteína- Sepharose CL-4B (Pharmacia). Se intercambió el tampón del anticuerpo eluido por PBS usando un Centricon-30 (Amicon), se concentró a 0,5 ml, se filtró en condiciones estériles usando un Millex-GV (Millipore, Bedford, MA) y se almacenó a 4ºC.

Para la expresión estable de la variante de IgG1 humanizada final (rhuMAb VEGF), se transfectaron células de ovario de hámster chino (CHO) con vectores dicistrónicos diseñados para coexpresar tanto la cadena pesada como la ligera (Lucas et al., Nucleic Acid Res. 24:1774-79 (1996)). Los plásmidos se introdujeron en células DP12, un derivado patentado de la línea celular CHO-KI DUX B11 desarrollado por L. Chasin (Columbia University), mediante lipofección y se seleccionó para el crecimiento en medio libre de GHT (Chisholm, V. High efficiency gene transfer in mammalian cells. In: Glover, DM, Hames, BD. DNA Cloning 4. Mammalian systems. Oxford Univ. Press, Oxford pág 1-41 (1996)). Se eligieron aleatoriamente aproximadamente 20 clones no amplificados y se resembraron en placas de 96 pocillos. La productividad relativa específica de cada clon se controló usando un ELISA para cuantificar la IgG humana de longitud completa acumulada en cada pocillo después de 3 días, y una tinción fluorescente, Calcein AM, como marcador sustituto de la cantidad de células viables por pocillo. En base a estos datos, se eligieron varios clones no amplificados para amplificación adicional en presencia de concentraciones en aumento de metotrexato. Se eligieron clones individuales que sobrevivieron a metotrexato 10, 50 y 100 nM y se transfectaron a placas de 96 pocillos para la exploración de productividad. Se expandió un clon, que mostraba de manera reproducible una productividad específica alta, en matraces T y se usó para inocular un cultivo giratorio. Después de varios pases, se usaron las células adaptadas a suspensión para inocular cultivos de producción en medios libres de suero que contienen GHT, suplementados con diversas hormonas e hidrolizados proteicos. El fluido de cultivo celular recogido, que contenía rhuMAb VEGF, se purificó usando proteína A-Sepharose CL-4B. La pureza después de esta etapa fue de \sim99%. La purificación posterior a homogeneidad se realizó usando una etapa de cromatografía de intercambio iónico. El contenido de endotoxina del anticuerpo purificado final fue de < 0,10 eu/mg.

Cuantificación de F(ab) e IgG: Para cuantificar las moléculas de F(ab), se recubrieron placas ELISA con 2 \mug/ml de F(ab) de cabra anti-IgG humana (Organon Teknika, Durham, NC) en tampón carbonato 50 mM, pH 9,6, a 4ºC durante una noche y se bloquearon con PBS-albúmina de suero bovino al 0,5% (tampón de bloqueo) a temperatura ambiente durante 1 hora. Los patrones (0,78-50 ng/ml de F(ab) humana) se adquirieron de Chemicon (Temecula, CA). Se incubaron diluciones seriadas de las muestras en PBS-albúmina de suero bovino al 0,5%-polisorbato 20 al 0,05% (tampón de ensayo) en las palcas durante 2 horas. La unión de F(ab) se detectó usando F(ab) de cabra anti-IgG humana marcada con peroxidasa de rábano rusticano (Organon Teknika), seguido de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) como sustrato. Las placas se lavaron entre las etapas. Se leyó la absorbancia a 450 nm en un lector de placa Vmax (Molecular Devices, Menlo Park, CA). La curva patrón se ajustó usando un programa de ajuste de curva de regresión no lineal de cuatro parámetros. Los datos puntuales que cayeron en el intervalo de la curva patrón se usaron para calcular las concentraciones de F(ab) de las muestras. La concentración del anticuerpo de longitud completa se determinó usando Fc de cabra anti-IgG humana (Cappel, Westchester, PA) para la captura y Fc de cabra anti-IgG humana marcada con peroxidasa de rábano rusticano (Cappel) para la detección. Se usó IgG1 humana (Chemicon) como patrón.

Ensayo de Unión a VEGF: Para medir la actividad de unión a VEGF de F(ab), se recubrieron placas ELISA con 2 \mug/ml de F(ab')_{2} de conejo contra Fc de IgG humana (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) y se bloquearon con tampón de bloqueo (descrito anteriormente). El medio condicionado diluido que contenía 3 ng/ml de KDR-IgG (Park et al., J. Biol. Chem. 296:25646-25645 (1994)) en tampón de bloqueo, se incubó en la paca durante 1 hora. Se incubaron patrones (6,9-440 ng/ml de F(ab) quimérico) y diluciones seriadas de dos veces de las muestras con VEGF biotinilado 2 nM durante 1 hora en tubos. Después se transfirieron las soluciones de los tubos a las placas ELISA y se incubaron durante 1 hora. Después de lavar, se detectó el VEGF biotinilado unido a KDR usando estreptavidina marcada con peroxidasa de rábano rusticano (Zymed, South San Francisco, CA o Sigma, St Louis, MO) seguido de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina como sustrato. Las curvas de titulación se ajustaron con un programa de ajuste de curva de regresión no lineal de cuatro parámetros (KaleidaGraph, Synergy Software, Reading PA). Se calcularon las concentraciones de las variantes de F(ab) que correspondían al punto medio de absorbancia en la curva de titulación del patrón, y después de dividieron por la concentración del patrón que corresponde al punto medio de absorbancia de la curva de titulación patrón. Los ensayos para IgG de longitud completa fueron iguales que para los F(ab) excepto en que el tampón de ensayo contenía suero humano al 10%.

Ensayo de Biosensor BIAcore™: La unión a VEGF de los F(ab) humanizados y quiméricos se comparó usando un biosensor BIAcore™ (Karlsson et al., Methods: A Comparison to Methods in Enzymology 6:97-108 (1994)). Las concentraciones de F(ab) se determinaron por análisis cuantitativo de aminoácidos. VEGF se unió a un chip biosensor CM-5 a través de los grupos amina primaria de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Pharmacia). La cinética de disociación se midió saturando el chip con F(ab) (35 \mul de F(ab) 2 \muM a una velocidad de flujo de 20 \mul/min) y después cambiando a tampón (PBS-polisorbato 20 al 0,05%). Los datos puntuales de 0-4500 segundos se usaron para el análisis de cinética de disociación. La constante de velocidad de disociación (k_{off}) se obtuvo de la pendiente de la gráfica de ln(R0/R) versus tiempo, donde R0 es la señal a t=0 y R es la señal a cada tiempo puntual.

La cinética de asociación se midió usando diluciones seriadas de dos veces de F(ab) (0,0625-2 mM). La pendiente, K_{s}, se obtuvo de la gráfica de ln(-dR/dt) versus tiempo para cada concentración de F(ab) usando el programa de evaluación de cinética BIAcore™ descrito en el manual Pharmacia Biosensor. R es la señal a tiempo t. Los datos entre 80 y 168, 148, 128, 114, 102, y 92 segundos se usaron para F(ab) 0,0625, 0,125, 0,25, 0,5, 1, y 2 mM respectivamente. La constante de velocidad de asociación (k_{on}) se obtuvo de la pendiente de la gráfica de K_{s} versus concentración de F(ab). Al final de cada ciclo, se retiró el F(ab) unido inyectando 5 \mul de HCl 50 mM a una velocidad de flujo de 20 \mul/min para regenerar el chip.

Ensayo de Crecimiento Celular Endotelial: Se cultivaron células de endotelio capilar obtenidas de corteza adrenal bovina en presencia de medio de Eagle modificado por Dulbecco bajo en glucosa (DMEM) (GIBCO) suplementado con suero de ternera al 10%, glutamina 2 mM, y antibióticos (medio de crecimiento), esencialmente como se ha descrito previamente (Leung et al., Science 246:1306-1309 (1989)). Para ensayos mitogénicos, las células endoteliales se sembraron a una densidad de 6 x 10^{3} células por pocillo, en placas de 6 pocillos, en medio de crecimiento. Después se añadieron muMAb VEGF A.4.6.1 o rhuMAb VEGF a concentraciones que varían entre 1 y 5000 ng/ml. Después de 2-3 horas, se añadió rhVEGF165 expresado por E. coli a una concentración final de 3 ng/ml. Para el control de la especificidad, se añadió cada anticuerpo a las células endoteliales a la concentración de 5000 ng/ml, solas o en presencia de 2 ng/ml de bFGF. Después de cinco o seis días, las células de disociaron por exposición a tripsina y se contaron en un contador Cuolter (Coulter Electronics, Hialeah, FL). La variación de la media no excedió el 10%. Los datos se analizaron por un programa de ajuste de curva de cuatro parámetros (KaleidaGraph).

Estudios de Tumor In Vivo : Se cultivaron células A673 de rabdomiosarcoma humano (ATCC; CRL 1598) como se ha descrito previamente, en DMEM/F12 suplementado con suero bovino fetal al 10%, glutamina 2 mM y antibióticos (Kim et al., Nature 362:841-844 (1993) y Borgström et al., Cancer Res. 56:4032-4039 (1996)). Se inyectaron por vía subcutánea ratones desnudos BALB/c hembras de 6-10 semanas de edad, con 2 x 10^{6} células tumorales en el área dorsal en un volumen de 200 \mul. Después, los animales se trataron con muMAb VEGF A.4.6.1, rhuMAb VEGF o un MAb control dirigido contra la proteína gp120 (Kim et al., Nature 362:841-844 (1993)). Se administraron ambos MAb anti-VEGF a las dosis de 0,5 y 5 mg/kg; el MAb control se dio a la dosis de 5 mg/kg. Cada MAb se administró dos veces a la semana por vía intraperitoneal en un volumen de 100 \mul, comenzando 24 horas después de la inoculación de células tumorales. Cada grupo constaba de 10 ratones. El tamaño del tumor se determinó a intervalos semanales. Cuatro semanas después de la inoculación de células tumorales, los animales se sometieron a eutanasia y los tumores se retiraron y se pesaron. El análisis estadístico se realizó por ANOVA.

Resultados

Humanización: Se usó la secuencia consenso para el subgrupo III de cadenas pesadas humanas y el subgrupo k I de cadenas ligeras humanas como región flanqueante para la humanización (Kabat et al., supra) (Figuras. 1A y 1B). Esta región flanqueante se ha usado de manera exitosa en la humanización de otros anticuerpos murinos (Werther et al., supra; Carter et al., supra; Presta et al., J. Immunol. 151:2623-2632 (1993); y Eigenbrot et al., Proteins 18:49-62 (1994)). CDR-H1 incluyó los restos H26-H35. Los otros CDR fueron de acuerdo con Kabat et al., supra. Todas las variantes humanizadas se hicieron en un principio y se exploraron para la unión como los F(ab) expresados en E. coli. Los rendimientos típicos de los matraces de agitación de 500 ml fueron de 0,1-0,4 mg de F(ab).

Se usó F(ab) quimérico como patrón en los ensayos de unión. En la variante inicial, F(ab)-1, los restos de CDR se transfirieron del anticuerpo murino a la región flanqueante humana y, en base a los métodos de los F(ab) murinos y humanizados, el resto en la posición H49 (Ala en humano) se cambió al Gly murina. Además, los F(ab) que constan de la cadena pesada quimérica/cadena ligera de F(ab)-1 (F(ab)-2) y la cadena pesada de F(ab)-1/cadena ligera quimérica (F(ab)-3) se generaron y se ensayaron para la unión. F(ab)-1 mostró una afinidad más de 1000 veces reducida que la de F(ab) quimérico (Tabla 2). Comparando las afinidades de unión de F(ab)-2 y F(ab)-3 se sugiere que los restos de la región flanqueante en el domino VH de F(ab)-1 necesitan alterarse para aumentar la unión.

TABLA 2 Unión de Variantes de F(ab) Anti-VEGF Humanizado a VEGF^{a}

3

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \begin{minipage}{150mm}  ^{a}  Las variantes de F(ab)
anti-VEGF se incubaron con VEGF biotinilado y
después se transfirieron a placas ELISA recubiertas con
KDR-IgG (Park  et al., 
supra ).\end{minipage} \cr  \begin{minipage}{150mm}
 ^{b}  Los restos murinos están subrayados; los números de resto son
de acuerdo con Kabat  et al., supra .\end{minipage} \cr
 \begin{minipage}{150mm}  ^{c}  La media y desviación estándar
son el promedio de las proporciones calculadas para cada uno de los
ensayos independientes; el EC50 para F(ab) quimérico fue
0,049  \pm  0,013 mg/ml (1,0
nM).\end{minipage} \cr}

Cambiando los restos humanos H71 y H72 a sus equivalentes murinos en F(ab)-4 se mejora la unión en 4 veces (Tabla 2). La inspección de los modelos de los F(ab) murinos y humanizados se sugiere que el resto L46, internado en la superficie de contacto VL-VH y que interacciona con CDR-H3 (Figura 2), también podría jugar un papel en la determinación de la conformación de CDR-H3 y/o afectar a la relación de los dominios VL y VH. Cuando la Val murina se intercambia por la Leu humana en L46 (F(ab)-5), la afinidad de unión aumenta en casi 4 veces (Tabla 2). Se evaluaron otros tres restos internados en la región flanqueante en base a los modelos moleculares: H49, H69 y H78. La posición H69 puede afectar a la conformación de CD- H2 mientras que la posición H78 puede afectar a la conformación de CDR-H1 (Figura 2). Cuando se cambió cada uno individualmente del equivalente humano al murino, la unión mejoró en 2 veces en cada caso (F(ab)-6 y F(ab)-7, Tabla 2). Cuando ambos se cambiaron de manera simultánea, la mejora en la unión fue de 8 veces (F(ab)-8, Tabla2). El resto H49 se incluyó en un principio como la Gly murina; cuando se cambió a la Ala equivalente consenso humana, la unión se redujo en 15 veces (F(ab)-9, Tabla 2).

En F(ab)-10 y F(ab)-11 se cambiaron dos restos en el bucle flanqueante 3, FR-3, a sus equivalentes murinos: AsnH76 a Ser murina (F(ab)-10) y LysH75 a Ala murina (F(ab)-11). Ambos lograron una mejora relativamente pequeña en la unión (Tabla 2). Finalmente, en la posición H94 las secuencias humana y murina tiene, de la manera más frecuente, una Arg (Kabat et al., supra). En F(ab)-12, esta Arg se reemplaza por la Lys poco común encontrada en el anticuerpo murino (Figura 1A) y esto da como resultado una unión que fue 2 veces menor que la de F(ab) quimérico (Tabla 2). El F(ab)-12 también se comparó con el F(ab) quimérico usando el sistema BIAcore™ (Pharmacia). Usando esta técnica, el K_{d} del F(ab)-12 humanizado fue 2 veces más débil que el de F(ab) quimérico debido a una K_{on}más lenta y una K_{off} más rápida (Tabla 3).

TABLA 3 Unión de Variantes de F(ab) Anti-VEGF a VEGF Usando el Sistema^{a} BIAcore^{TM}

5

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \begin{minipage}{150mm}  ^{a}  La cantidad de F(ab)
unido, en unidades de resonancia (RU), se midió usando un sistema
BIAcore ^{TM}  cuando se inyectaron 2  \mu g de F(ab) en un
chip que contenía 2480 RU de VEGF inmovilizadas. La cinética de
disociación (k _{off} ) se midió saturando el chip con F(ab)
y después controlando la disociación después de cambiar el tampón.
La cinética asociación (k _{on} ) se midió usando diluciones
seriadas de dos veces de F(ab). La constante de  equilibrio
de disociación K _{d}  se calculó como
k _{off} /k _{on} .\end{minipage} \cr
 \begin{minipage}{150mm}  ^{b} 
quim-F(ab) es un F(ab) quimérico con
dominios VL y VH murinos fusionados a dominios CL y CH1 de la cadena
pesada
humana.\end{minipage} \cr}

Se construyeron mAB de longitud completa fusionando los dominios VL y VH del F(ab) quimérico y la variante F(ab)-12 a los dominios constantes de la cadena ligera k humana y la cadena pesada de IgG1 humana. El 12-IgG1 de longitud completa (F(ab)-12 fusionado a IgG1 humana) mostró una unión que fue 1,7 veces más débil que la de IgG1 quimérica (Tabla 4). Tanto 12-IgG1 como la IgG1 quimérica se unieron ligeramente menos bien que el MAb A.4.6.1 murino original (Tabla 4).

TABLA 4 Unión de Variantes de IgG Anti-VEGF a VEGF^{a}

6

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \begin{minipage}{150mm}  ^{a}  Las variantes de IgG
anti-VEGF se incubaron con VEGF biotinilado y
después se transfirieron a placas ELISA recubiertas con
KDR-IgG (Park  et  al ., (1994),
 supra ).\end{minipage} \cr  \begin{minipage}{150mm}
 ^{b}  chIgG1 es una IgG1 quimérica con dominios VL y VH murinos
fusionados a CL y cadenas pesadas de IgG1 humanas; el EC50 para
chIgG1 fue 0,113  \pm   0,013  \mu g/ml (0,75
nM).\end{minipage} \cr  \begin{minipage}{150mm}  ^{c} 
murIgG1 es un muMabVEGF A.4.6.1 purificado de fluido
ascítico.\end{minipage} \cr  \begin{minipage}{150mm}  ^{d} 
12-IgG1 es los dominios VL y VH de
F(ab)-12 fusionados a CL y cadenas pesadas de
IgG1
humanas.\end{minipage} \cr}

Estudios Biológicos: rhuMAb VEGF y muMAb VEGF A.4.6.1 se compararon para su capacidad de inhibir la proliferación de células del endotelio capilar bovino en respuesta a una concentración de eficacia máxima de VEGF (3 ng/ml). Como se ilustra en la Figura 3, los dos MAb eran esencialmente equivalentes, tanto en potencia como en eficacia. Los valores ED50 fueron respectivamente 50 \pm 5 ng/ml y 48 \pm 8 ng/ml (\sim0,3 nM). En ambos casos se consiguió una inhibición de 90% a la concentración de 500 ng/ml (\sim3 nM). Ni muMAb VEGF A.4.6.1 ni rhuMAb VEGF tuvieron ningún efecto en la proliferación basal o estimulada por bFGF de células del endotelio capilar, confirmando que la inhibición es específica para VEGF.

Para determinar si dicha equivalencia también se aplica a un sistema in vivo, los dos anticuerpos se compararon para su capacidad de suprimir el crecimiento de células A673 de rabdomiosarcoma humano en ratones desnudos. Los estudios previos han mostrado que muMAb VEGF A.4.6.1 tiene un efecto inhibidor drástico en este modelo tumoral (Kim et al., Nature 362:841-844 (1993) y Borgström et al., Cancer Res 56:4032-4039 (1996)). Como se muestra en la Figura 4, a ambas dosis ensayadas (0,5 y 5 mg/kg), los dos anticuerpos suprimieron de manera marcada el crecimiento del tumor como se evalúa por las mediciones de peso del tumor 4 semanas después de la inoculación celular. La disminución en el peso del tumor en comparación con el grupo control fue respectivamente del 85% y el 93% a cada dosis en los animales tratados con muMAb VEGF A.4.6.1 versus el 90% y el 95% en los tratados con rhuMAb VEGF. Se obtuvieron resultados similares con la línea celular de carcinoma de mama MDA-MB 435.

Ejemplo 2

Antecedente

En este ejemplo, el anticuerpo A.4.6.1 anti-VEGF murino analizado anteriormente se humanizó por aleatorización de una pequeña serie de restos flanqueantes y por presentación monovalente de la biblioteca resultante de moléculas de anticuerpo en la superficie de fagos filamentosos para identificar la secuencias flanqueantes de alta afinidad mediante selección basada en afinidad.

Materiales y métodos

Construcción del Vector Fagémido Anti-VEGF, pMB4-19: El mAb A.4.6.1 anti-VEGF murino se ha analizado anteriormente en el Ejemplo 1. La primera variante de F(ab) de A.4.6.1 humanizado, hu2.0, se construyó por mutagénesis dirigida de sitio usando un molde del plásmido pAK2 que contenía desoxiuridina (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285-4289 (1992)) que codifica una cadena ligera V_{L}\kappaI-C\kappa_{1} y un fragmento Fd de la cadena pesada V_{H}III-C_{H}I\gamma. La secuencias CDR A.4.6.1 trasplantadas se eligieron de acuerdo con la definición de secuencia de Kabat et al., supra, excepto para CDR-H1 que incluyó los restos 26-35. La secuencia codificante de Fab subclonó en el vector fagémido phGHamg3 (Bass et al., Proteins 8:309-314 (1990) y Lowman et al., Biochemistry 30:10832-10838 (1991)). Esta construcción, pMB4-19, codifica el Fab de A.4.6.1 humanizado inicial, hu2.0, con el C-terminal de la cadena pesada fusionada de manera precisa a la porción carboxilo de la proteína de cubierta del gen III de M13. pMB4-19 es similar en construcción a pDH188, un plásmido descrito previamente para la presentación monovalente de fragmentos Fab (Garrard et al., Biotechnology 9:1373-1377 (1991)). Las diferencias notables entre pMB4-19 y pDH188 incluyen un segmento más corto del gen III de M13 (codones 249-406) y el uso de un codón de parada ámbar inmediatamente después del fragmento Fd de la cadena pesada del anticuerpo. Esto permite la expresión de la cadena pesada secretada o las fusiones cadena pesada-gen III en las cepas supresoras supE de E. coli.

Expresión y Purificación del Fragmento Fab de A.4.6.1 humanizado: La cepa 34B8 de E. coli, una cepa no supresora, se transformó con el fagémido pMB4-19 o variantes del mismo. Las colonias simples se hicieron crecer durante una noche a 37ºC en 2 ml de 2YT que contenía 50 \mug/ml de carbenicilina. Estos cultivos se diluyeron en 200 ml de medio AP5 (Chang et al. Gene 55:189-196 (1987)) que contenía 20 \mug/ml de carbenicilina y se incubaron durante 26 horas a 30ºC. Las células se sedimentaron a 4000 x g y se congelaron a -20ºC durante al menos 2 horas. Después se resuspendieron los sedimentos celulares en 5 ml de Tris-HCl 10 mM (pH 7,6) que contenía EDTA 1 mM, se agitaron a 4ºC durante 90 minutos y se centrifugaron a 10.000 x g durante 15 minutos. El sobrenadante se aplicó a una columna proteína G de estreptococos-Sepharose de 1 ml (Pharmacia) y se lavó con 10 ml de MES 10 mM (pH 5,5). El fragmento Fab unido se eluyó con 2,5 ml de ácido acético 100 mM y se neutralizó inmediatamente con 0,75 ml de Tris-HCl 1 M, pH 8,0. Se intercambió el tampón de las preparaciones de Fab por PBS y se concentraron usando concentradores Centricon-30 (Amicon). Los rendimientos típicos de Fab fueron \sim1 mg/l de cultivo, después de la purificación de proteína G. Las muestras de Fab purificadas se caracterizaron por espectrometría de masa por electronebulización, y las concentraciones se determinaron por análisis de aminoácidos.

Construcción de la Biblioteca de Fagémidos Fab Anti-VEGF: La biblioteca de fagémidos A.4.6.1 humanizados se construyó por mutagénesis dirigida de sitio de acuerdo con el método de Kunkel et al., Methods Enzymol. 204:125-139 (1991). Se preparó un derivado de pMB4-19 que contenía tripletes de parada TAA en los codones de V_{H} 24, 37, 67 y 93 para usar como el molde de mutagénesis (toda la numeración de secuencia de acuerdo con Kabat et al., supra). La modificación fue para evitar la contaminación de fondo posterior por secuencias de tipo silvestre. Los codones fijados como objetivo para aleatorización fueron 4 y 71 (cadena ligera) y 24, 37, 67, 69, 71, 73, 75, 76, 78, 93 y 94 (cadena pesada).

Para aleatorizar los codones de la cadena pesada 67, 69, 71, 73, 75, 76, 78, 93, y 94 con un oligonucleótido mutagénico único, primero se pre-ensamblaron dos oligonucleótidos 126-mérico a partir de fragmentos 60 y 66-méricos por ligamiento enzimático asistido por molde. Específicamente, se combinaron 1,5 nmol del oligonucleótido 5'fosforilado 503-1 (5'-GAT TTC AAA CGT CGT NYT ACT WTT TCT AGA GAC AAC TCC AAA AAC ACA BYT TAC CTG CAG ATG AAC-3' (SEC.ID.Nº 22)) o 503-2 (5'-GAT TTC AAA CGT CGT NYT ACT WTT TCT TTA GAC ACC TCC GCA AGC ACA BYT TAC CTG CAG ATG AAC-3' (SEC.ID.Nº 23)) con 1,5 nmol de 503-3 (5'-AGC CTG CGC GCT GAG GAC ACT GCC GTC TAT TAC TGT DYA ARG TAC CCC CAC TAT TAT GGG-3' (SEC.ID.Nº 24)) (codones aleatorizados subrayados; N=A/G/T/C; W=A/T; B=G/T/C; D=G/A/T; R=A/G; Y=C/T). Después, se añadieron 1,5 nmol del oligonucleótido molde (5'-CTC AGC GCG CAG GCT GTT CAT CTG CAG GTA-3' (SEC.ID.Nº 25)), con la secuencia complementaria al extremo 5' de 503-1/2 y el extremo 3' de 503-3, para hibridar a cada extremo de la unión de ligamiento. Se añadió Taq ligasa (ligasa termoestable de New England Biolabs) y tampón, y la mezcla de reacción se sometió a 40 rondas de ciclación térmica, (95ºC durante 1,25 minutos; 50ºC durante 5 minutos) para ciclar el oligonucleótido molde entre las uniones ligadas y no ligadas. El producto de los oligonucleótidos 126-méricos se purificó en un gel de urea al 6%/TBE poliacrilamida y se extrajo de la poliacrilamida en tampón. Los dos productos 126-méricos se combinaron en una proporción igual, se precipitaron en etanol y finalmente se solubilizaron en Tris-HCl 10 mM, EDTA 1mM. El producto de los oligonucleótidos 126-méricos fue 504-01 marcado.

La aleatorización de los codones flanqueantes seleccionados (V_{L}, 4, 71, V_{H}, 24, 37, 67, 69, 71, 73, 75, 76, 93, 94) se logró en dos etapas. Primero, se consiguió la aleatorización de V_{L} preparando tres derivados adicionales del molde pMB4-19 modificado. Los codones flanqueantes 4 y 71 de la cadena ligera se reemplazaron individualmente o por pares usando los dos oligonucleótidos mutagénicos 5'-GCT GAT ATC CAG TTG ACC CAG TCC CCG-3' (SEC.ID.Nº 26) y 5'-TCT GGG ACG GAT TAC ACT CTG ACC ATC-3' SEC.ID.Nº 27).El molde que contiene desoxiuridina se preparó a partir de cada uno de estos nuevos derivados. Junto con el molde original, estas cuatro construcciones codificaban cada una de las cuatro posibles combinaciones de secuencias flanqueantes de la cadena ligera (Tabla 5).

Se usaron los oligonucleótidos 504-1, una mezcla de dos oligonucleótidos 126-méricos (véase lo anterior), y 5'-CGT TTG TCC TGT GCA RYT TCT GGC TAT ACC TTC ACC AAC TAT GGT ATG AAC TGG RTC CGT CAG GCC CCG GGT AAG-3' (SEC.ID.Nº 28) para aleatorizar los codones flanqueantes de la cadena pesada usando cada uno de los moldes recién descritos. Las cuatro bibliotecas se electroporaron en células XL-1 Blue de E. coli (Stratagene) y se combinaron. La cantidad total de transformantes independientes se estimó a >1,2 x 10^{8}, aproximadamente 1500 veces mayor que la cantidad máxima de secuencias de ADN en la biblioteca.

Se ha desarrollado una diversidad de sistemas para presentar de manera funcional los fragmentos de anticuerpo en la superficie de fagos filamentosos. Winter et al., Ann. Rev. Immunol. 12, 433 (1994). Estos incluyen presentar los fragmentos Fab o Fv de cadena simple (scFv) como fusiones a las proteínas de cubierta del gen III o el gen VIII del bacteriófago M13. El sistema seleccionado en este documento es similar al descrito por Garrard et al., Biotechn, 9, 1373 (1991) en el que un fragmento Fab se presenta de manera monovalente como una fusión del gen III (Figura 7). Este sistema tiene dos características notables. En particular, a diferencia de scFv, los fragmentos Fab no tienen tendencia a formar especies diméricas, la presencia de las cuales puede evitar la selección de los aglutinantes más fuertes debido a los efectos de avidez. Adicionalmente, la monovalencia de la proteína presentada elimina una fuente secundaria potencial de efectos de avidez que podrían ser, de otro modo, el resultado de la presencia de múltiples copias de una proteína en cada partícula fagémida. Bass y Wells, Proteins 8:309 (1990) y Lowman et al., Biochemistry 30:10832 (1991).

Las partículas fagémidas que presentan los fragmentos Fab de A.4.6.1 humanizado se propagaron en células XL-1 Blue de E. coli. Brevemente, las células que contenían la construcción pMB4-19 aleatorizada se hicieron crecer durante una noche a 37ºC en 25 ml de medio 2YT que contenía 50 \mug/ml de carbenicilina y aproximadamente 10^{10} fagos auxiliares M13KO7 (Vieira & Messing Methods Enzymol. 153:3-11 (1987)). Las soluciones madre de fagémidos se purificaron de los sobrenadantes del cultivo por precipitación con una solución de polietilenglicol salina, y se resuspendieron en 100 \mul de PBS (\sim10^{14} fagémidos/ml).

Selección de Variantes de Fab de A.4.6.1 Humanizado: El VEGF_{121} purificado (100 \mul a 10 \mug/ml en PBS) se recubrió en un pocillo de placa de microtitulación durante una noche a 4ºC. La solución de recubrimiento se desechó y este pocillo, además de un pocillo no recubierto, se bloquearon con leche desnatada al 6% durante 1 hora y se lavaron con PBS que contenía TWEEN 20™ al 0,05% (detergente). Después, se añadieron 10 \mul de solución madre de fagémido, diluida a 100 \mul con Tris 20 mM (pH 7,5) que contenía BSA al 0,1% y TWEEN 20™ al 0,05% a cada pocillo. Después de 2 horas se lavaron los pocillos y el fago unido se eluyó con 100 \mul de glicina 0,1 M (pH 2,0), y se neutralizó con 25 \mul de Tris 1 M pH 8,0. Se usó una alícuota de esto para titular la cantidad de fago eluido. El fago restante eluido del pocillo recubierto con VEGF se propagó para usar en el siguiente ciclo de selección. Se realizaron un total de 8 rondas de selección después de lo que se seleccionaron 20 clones individuales y se secuenciaron (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:5463-5467(1977)).

Determinación de Afinidades de Unión a VEGF: Las constantes de velocidad de asociación (k_{on}) y de disociación (k_{off}) para la unión de variantes de Fab de A.4.6.1 humanizado a VEGF_{121} se midieron por resonancia de plasmón superficial (Karlsson et al., J. Immun. Methods 145:229-240 (1991)) en un instrumento Pharmacia BIAcore. El VEGF_{121} se inmovilizó de manera covalente en el chip biosensor mediante grupos amino primario. La unión de las variantes de Fab de A.4.6.1 humanizado se midieron por soluciones fluyentes de Fab en PBS/TWEEN 20™ al 0,05% sobre el chip a una velocidad de flujo de 20 \mul/min. Después de cada medida de unión, se extrajo el Fab residual del ligando inmovilizado lavando con 5 \mul de HCl acuoso 50 mM a 3 \mul/min. Los perfiles de unión se analizaron por regresión no lineal usando un modelo de unión monovalente simple (programa BIAevaluation v2.0;
Pharmacia).

Resultados

Construcción de A.4.6.1 Humanizado: Se construyó un fragmento Fab de A.4.6.1 humanizado (hu2.0, Figuras 5A y 5B), en el que los CDR de A.4.6.1 se injertan en una región flanqueante V_{L}\kappaI-V_{H}III humana. Todos los otros residuos en hu2.0 se mantuvieron como la secuencia humana. La unión de esta variante a VEGF fue tan débil como para ser indetectable. En base a la afinidad relativa de otras variantes de A.4.6.1 humanizado de unión débil, el K_{D} para la unión de hu2.0 se estimó a >7 \muM. Esto contrasta con una afinidad de 1,6 nM para una construcción Fab quimérica que consta de los dominios V_{L} y V_{H} intactos a partir de A.4.6.1 murino y los dominios constantes humanos. Por tanto la unión de hu2.0 a VEGF fue al menos 4000 veces reducida en relación con la quimera.

Diseño de Biblioteca de Anticuerpos: El grupo de cambios de la región flanqueante en la secuencia flanqueante humana en este documento se muestra en la Tabla 5 y en la Figura 6.

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TABLA 5 Restos Flanqueantes Clave Importantes para la Unión de Antígeno y Marcados para Aleatorización

7

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  ^{a}  Diversidad de aminoácido en biblioteca de fagémidos.\cr
 \begin{minipage}{150mm}  ^{b}  Se aleatorizaron V _{H} 71, 73,
75, 76 para producir la tétrada V _{H} III murina completa
(L71/T73/A75/S76) o humana completa
(R71/D73/K75/N76).\end{minipage} \cr}

Una preocupación en el diseño de la biblioteca de fagémidos de A.4.6.1 humanizado fue que los restos fijados como objetivo para aleatrorización estaban distribuidos ampliamente a lo largo de las secuencias V_{L}y V_{H}. Las limitaciones en la longitud de los oligonucleótidos sintéticos requiere que la aleatorización simultánea de cada una de estas posiciones flanqueantes pueda sólo conseguirse a través del uso de oligonucleótidos múltiples. Sin embargo, como la cantidad total de oligonucleótidos aumenta, la eficacia de la mutagénesis disminuye (es decir, la proporción de mutantes obtenidos que incorporan la secuencia obtenida de todos los oligonucleótidos mutagénicos). Para evitar este problema, se incorporaron dos elementos en la construcción de la biblioteca. El primero fue preparar cuatro moldes de mutagénesis diferentes que codifican cada una de las posibles combinaciones flanqueantes de V_{L}. Esto fue simple de hacer dada la limitada diversidad de la región flanqueante de la cadena ligera (solo 4 secuencias diferentes), pero fue beneficioso en que se eliminó la necesidad de dos oligonucleótidos de la estrategia de mutagénesis. El segundo, fue que se pre-ensamblaron dos oligonucleótidos de 126 bases a partir de fragmentos sintéticos más pequeños. Esto hizo posible la aleatorización de los codones 67, 69, 71, 73, 75, 76, 93 y 94 de V_{H} con un único oligonucleótido largo, en lugar de los dos más pequeños. Por lo tanto, la estrategia de mutagénesis por aleatorización final empleó sólo dos oligonucleótidos de manera simultánea en cuatro moldes diferentes.

Selección de Fab de A.4.6.1 Humanizado de Unión Fuerte: Las variantes de la biblioteca de fagémidos Fab de A.4.6.1 humanizado se seleccionó en base a la unión a VEGF. El enriquecimiento del fagémido funcional medido por comparación de los títulos del fago eluido de un pocillo de la placa de microtitulación recubierta con VEGF versus eluido de un pocillo de la placa de microtitulación no recubierta, aumentó hasta la séptima ronda de encuadramiento de la afinidad. Después de una ronda adicional de clasificación, se secuenciaron 20 clones para identificar los restos flanqueantes preferidos seleccionados en cada posición aleatorizada. Estos resultados, resumidos en la Tabla 6, muestran un fuerte consenso entre todos los clones seleccionados. Diez de los veinte clones tenían la secuencia de ADN idéntica, denominada hu2.10. De las trece posiciones flanqueantes aleatorizadas, se seleccionaron ocho sustituciones en hu2.10 (V_{L}, 71; V_{H}, 37, 71, 73, 75, 76, 78 y 94). Es interesante observar que los restos V_{H} 37 (Ile) y 78 (Val) no se seleccionaron ni en la secuencia V_{H}III humana ni en la secuencia A.4.6.1 murina. Este resultado sugiere que algunas posiciones flanqueantes pueden beneficiarse del aumento de la diversidad más allá de las secuencias flanqueantes humana y murina parental diana.

TABLA 6 Secuencias Seleccionadas de la Biblioteca de Fab Fagémidos A.4.6.1 Humanizados

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Las diferencias entre los anticuerpos hu2.0 y A.4.6.1 murino están subrayadas. La cantidad de clones idénticos que identifica cada secuencia seleccionada por fago se indica en paréntesis. Las rayas en las secuencias de los clones seleccionados por fago indican la selección de la secuencia flanqueante V_{L}\kappaI-V_{H}III humana (es decir, como en hu2.0).

Hubo cuatro secuencias de amino ácidos únicas distintas entre los diez clones restantes analizados: hu2.1, hu2.2, hu2.6 y hu2.7. Todos estos clones, además de hu2.10, contenían sustituciones en la región flanqueante idénticas en las posiciones 37 (Ile), 78 (Val) y 94 (Lys) de V_{H}, pero mantuvieron la secuencia consenso V_{H}III humana en las posiciones 24 y 93. Cuatro clones habían perdido la secuencia codificante de la cadena ligera y no se unían a VEGF cuando se ensayaron en un ensayo ELISA con fagos (Cunningham et al. EMBO J. 13:2508-251 (1994)). Dichos artefactos a menudo pueden minimizarse reduciendo la cantidad de ciclos de clasificación o propagando las bibliotecas en medios sólidos.

Expresión y Afinidad de Unión de Variantes de A.4.6.1 Humanizado: Las variantes seleccionadas por fago hu2.1, hu2.2, hu2.6, hu2.7 y hu2.10 se expresaron en E. coli usando matraces de agitación y los fragmentos Fab se purificaron de los extractos periplásmicos por cromatografía de afinidad a proteína G. Los rendimientos recuperados de Fab para estos cinco clones variaron de 0,2 (hu2.6) a 1,7 mg/l (hu2.1). La afinidad de cada una de estas variantes por el antígeno (VEGF) se midió por resonancia de plasmón superficial en un instrumento BIAcore (Tabla 7). El análisis de estos datos de unión muestra que el clon consenso hu2.10 poseía la afinidad más alta por VEGF entre las cinco variantes ensayadas. Por tanto, la biblioteca de fagémidos Fab se enriqueció selectivamente para el clon de unión más fuerte. El K_{D} calculado para hu2.10 fue 55 nM, al menos 125 veces más fuerte que para hu2.0 que no contiene cambios en la región flanqueante (K_{D}>7 \muM). Las otras cuatro variantes seleccionadas mostraron todas una unión mas débil a VEGF, variando por debajo de un K_{D} de 360 nM para la más débil (hu2.7). Es interesante observar que el K_{D} para hu2.6, 67 nM, fue sólo ligeramente inferior que el de hu2.10 y además solo se encontró una copia de este clon entre los 20 clones secuenciados. Esto puede deberse al bajo nivel de expresión y presentación, como fue el caso cuando se expresó el Fab soluble de esta variante. Sin embargo, a pesar de la proporción de expresión más baja, esta variante es útil como anticuerpo humanizado.

TABLA 7 Afinidad de unión a VEGF de variantes de Fab A.4.6.1 humanizado

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* hu2.10V = hu2.10 con la mutación V_{L} Leu\rightarrow Val

Los valores estimados en las mediciones de unión de Biacore son+/- 25%.

** Demasiado débil para medir; estimación de enlace inferior.

Mejora Adicional de la Variante hu2.1 Humanizada: A pesar de la gran mejora en la afinidad de antígeno sobre la variante humanizada inicial, la unión de hu2.10 a VEGF aún era 35 veces más débil que un fragmento Fab quimérico que contenía los dominios V_{L}y V_{H} de A.4.6.1 murino. Esta diferencia considerable sugería que la optimización adicional de la región flanqueante humanizada podría ser posible a través de mutaciones adicionales. De los restos Vernier identificados por Foote & Winter J. Mol. Biol. 224:487-499 (1992), sólo los restos V_{L} 46, V_{H}2 y V_{H} 48 difieren en la región flanqueante de A.4.6.11 versus la región flanqueante V_{L}\gammaI-V_{H}III humana (Figuras 5A y 5B) pero no se aleatorizaron en la biblioteca de fagémidos. Un modelo molecular del fragmento Fv de A.4.6.1 humanizado mostró que V_{L}46 se sitúa en la superficie de contacto V_{L}-V_{H} y podría influenciar la conformación de CDR-H3. Además, este aminoácido es casi siempre leucina en la mayoría de las regiones flanqueantes V_{L}\kappa (Kabat et al., supra), pero es valina en A.4.6.1. Por consiguiente, se hizo una sustitución Leu\rightarrowVal en esta posición en el antecedente de hu2.10. El análisis de cinética de unión para esta nueva variante, hu2.10V, indicó una mejora adicional de 6 veces en el K_{D} para la unión a VEGF, demostrando la importancia de la valina en la posición V_{L} 46 en el anticuerpo A.4.6.1. El K_{D} para hu2.10V (9,3 nM) fue por tanto 6 veces el de la quimera. En contraste con V_{L} 46, no se observó mejora en la afinidad de unión de hu2.10 para el reemplazamiento de V_{H}2 o V_{H} 48 con el resto correspondiente de A.4.6.1 murino.

Ejemplo 3

En este ejemplo, se usó aleatorización de CDR, maduración de afinidad por presentación monovalente en fagos Fab, y combinación acumulativa de mutaciones para potenciar la afinidad de un anticuerpo anti-VEGF humanizado.

Construcción del Anticuerpo pY0101 Humanizado: El vector de anticuerpo presentado por fago phMB4-19-1.6 (véanse figuras 8A-E) se usó como parental. En esta construcción, la función anti-VEGF se expresa como un fragmento Fab con su cadena pesada fusionada al N-terminal del g3p truncado. Tanto la cadena pesada como la ligera están bajo el control del promotor phoA con una secuencia señal stII cadena arriba para la secreción en el periplasma. Se hicieron mutaciones puntuales fuera de las regiones CDR por mutagénesis dirigida de sitio para mejorar la afinidad por VEGF con oligonucleótidos HL-242, HL-243, HL-245, HL-246, HL-254, HL-256, y HL-257 como se muestra en la Tabla 8 a continuación:

TABLA 8 Oligos para Mutaciones Dirigidas

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La variante resultante se llamó Y0101 (figuras 9A y 9B).

Construcción de la Primera Generación de Bibliotecas Anticuerpo-Fago: Para evitar la contaminación por secuencia de tipo silvestre, se prepararon moldes con el codón de parada TAA en los sitios fijados como objetivo para aleatorización y se usaron para construir bibliotecas por mutagénesis dirigida de sitio con oligonucleótidos que usan el codón NNS degenerado (donde N es una mezcla igual de A, G, C, y T mientras que S es una mezcla igual de G y C) para mutagénesis por saturación. Se eligieron VL1 y VH1 como candidatos potenciales para el potenciamiento de afinidad (Figuras 9A y 9B). En los CDR, se construyeron dos bibliotecas a partir del molde pY0101. VL1 se mutó usando los oligonucleótidos de parada del molde HL-248 y HL-249 (Tabla 9) y los oligonucleótidos de biblioteca HL-258 y HL-259 (Tabla 10). De manera similar, se construyeron tres bibliotecas para VH3 usando los oligonucleótidos del molde de parada HL-250, HL-251, y HL-252 (Tabla 9), y los oligonucleótidos de biblioteca HL-260, HL-261, y HL-262 (Tabla 10). La construcción de bibliotecas se resume en las Tablas 9 y 10 a continuación.

TABLA 9 Oligos de molde para mutagénesis

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TABLA 10 Oligos Aleatorios para Construcción de Bibliotecas

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Los productos de las reacciones de mutagénesis aleatoria se electroporaron en células XL1-Blue de E. coli (Stratagene) y se amplificaron haciéndolas crecer 15-16 horas con el fago auxiliar M13KO7. La complejidad de cada biblioteca, que varía de 2 x 10^{7} a 1,5 x 10^{8}, se estimó en base a la siembra de la transformación inicial en placas de carbenicilina.

Selecciones de Afinidad Inicial: Para cada ronda de selección, se exploraron aproximadamente 10^{9}-10^{10} fagos para la unión a placas (Nunc Maxisorp 96 pocillos) recubiertas con 2 \mug/ml de VEGF (recombinante; versión de los restos 9-109) en tampón carbonato 50 mM, pH 9,6, y se bloquearon con leche en polvo al 5% en tampón carbonato 50 mM, pH 9,6. Después de una unión de 1-2 horas a temperatura ambiente, en presencia de albúmina de suero bovino al 0,5% y TWEEN 20™ al 0,05% en PBS, se retiró la solución de fagos, y la placa se lavó diez veces con PBS/TWEEN™ (TWEEN 20™ al 0,05% en tampón PBS). Típicamente, para seleccionar las variantes de afinidad potenciada con velocidades de disociación lentas, se incubaron las placas con tampón PBS/TWEEN™ durante un periodo de tiempo que se alargó progresivamente para cada ronda de selección (de 0 minutos para la primera ronda, a 3 horas para la novena ronda de selección). Después de retirar el tampón PBS/TWEEN™, los fagos restantes se eludieron con HCl 0,1 M y se neutralizaron inmediatamente con 1/3 volúmenes de Tris 1 M, pH 8,0. Los fagos eluidos se propagaron infectando células XL1-Blue de E. coli (Stratagene) para el siguiente ciclo de selección.

Los datos de secuenciación mostraron que ambas bibliotecas VL1, incluso después de la octava/novena ronda de clasificación, permaneció variada, tolerando varios tipos de restos en los sitios de aleatorización. En contraste, las bibliotecas VH3 mantuvieron solo los restos de tipo silvestre o tuvieron sustituciones muy conservativas. Esto sugirió que el VL1 estaba más expuesto al disolvente y caía fuera de la superficie de contacto de unión. En contraste, VH3 no mostró sustituciones de cadenas laterales drásticamente diferentes y, por tanto, podría estar mas íntimamente implicada en la unión a antígeno.

Ensayo de ELISA de Fagos de Afinidades de Unión: Para cada una de estas bibliotecas, se ensayaron clones representativos (los representados por secuencias abundantes) para sus afinidades en relación con el clon parental pY0101 en un ensayo ELISA de fagos. En dicho ensayo, los fagos primero se diluyen en serie para determinar un título de saturación fraccional que después se mantuvo constante y se usó para incubar con concentraciones variadas de VEGF (comenzando a 200 nM a 0 nM) en solución. Después la mezcla se transfirió en una placa pre-recubierta con VEGF (2 \mug/ml) y se bloqueó con leche en polvo al 5%, y se dejó equilibrarse durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente, la solución de fagos se retiró y los fagos unidos restantes se detectaron con una solución de anticuerpo de conejo anti-fago mezclada con un conjugado de cabra anti-conejo de peroxidasa de rábano rusticano. Después de una hora de incubación a temperatura ambiente, la placa se reveló con un sustrato cromogénico, o-fenilendiamina (Sigma). La reacción se paró con adición de ½ volumen de H_{2}SO_{4} 2,5 M. Se midió la densidad óptica a 492 nm en un lector de placa espectrofotométrico.

Aunque todos los clones seleccionados de estas cinco bibliotecas mostraron afinidades similares o más débiles que las del tipo silvestre pY0101 en el ensayo ELISA de fagos, una variante particular (pY0192) de la biblioteca HL-258 mostró una ventaja aparente (aproximadamente 10 veces) en el nivel de expresión o presentación del fago en relación con pY0101. Este clon contenía mutaciones S24R, S26N, Q27E, D28Q, e I29L en la región VL (Figura 9A). Además, se descubrió que esta variante tenía una mutación falsa, M34I, en VH. Esta variante no mostró diferencias significativas en la afinidad de unión a VEGF en comparación con la variante pY0101. Para mejorar el nivel de presentación de Fab en el fago, y la proporción señal-ruido para los ensayos ELISA de fagos, se incorporaron las sustituciones correspondientes en pY0192 en VL1 en el molde antecedente para construir tanto CDR Ala-mutantes como la segunda generación de bibliotecas anti-VEGF.

Exploración de Ala de los CDR de Anti-VEGF: Para determinar la energética con la que contribuye cada uno de los aminoácidos en las regiones CDR y por tanto seleccionar mejor los restos diana para aleatorización, las regiones CDR se exploraron sustituyendo alanina para cada resto. Cada mutante de Ala se construyó usando mutagénesis dirigida de sitio con un oligonucleótido sintético que codifica la sustitución de alanina especifica. Cuando Ala era el resto de tipo silvestre, se sustituyó Ser para ensayar el efecto de una sustitución de cadena lateral. Los clones fágicos que tenían una mutación Ala única se purificaron y se ensayaron en ELISA de fagos como se ha descrito anteriormente. Los resultados de la exploración de Ala demostraron que una sustitución de Ala en diversas posiciones puede tener un efecto, que varía de reducciones de 2 a >150 veces, en la afinidad de unión al antígeno en comparación con pY0192. Además, se confirmó una observación previa de que VH3, pero no VL1, está implicada en la unión de antígeno. Los resultados de la exploración de Ala de CDR se resumen en la Tabla 11 a continuación.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 11 Afinidades relativas de VEGF de variantes Fab de exploración de Ala

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Todas las variantes están en el antecedente de pY0192 ("wt"; véanse Figuras 9A-B). IC50 se determinaron en un ensayo ELISA de fagos competitivo.

Los mayores efectos de las sustituciones de Ala se ven en los CDR H1, H2, y H3, incluyendo Y27A (reducción de la afinidad de 34 veces), N31A, Y32A, W50A, N52A, Y99A, S106A y W108A (cada uno reducción de >150 veces); N35A (reducción de 62 veces), P100A (reducción de 38 veces) y F110A (reducción de 25 veces). En contraste, sólo una solución en VL tubo un impacto grande en la afinidad de unión, W96A (reducción de >150 veces). Estos resultados señalan a los tres CDR de VH como los determinantes energéticos principales de la unión de Fab a VEGF, con alguna contribución de VL3.

Diseño de las Bibliotecas de Mutación de CDR de Segunda Generación: Se diseñaron dos bibliotecas adicionales que se aleatorizaron en los restos existentes en la versión Y0192 anti-VEGF, en base a la inspección de la estructura cristalina. En VH2, se aleatorizaron los restos 52-55 porque caen en la superficie de contacto de unión con VEGF. También se fijó como objetivo para aleatorización una región adicional del Fab, llamada "CDR7" (véase Figura 10B), porque varios restos en este bucle, que no contactan con VEGF, tienen contactos con los bucles VH del anticuerpo. Estos representan sitios potenciales para la mejora de afinidad a través de efectos secundarios en los restos de la superficie de contacto. Se aleatorizaron los restos L72, T74, y S77 en esta biblioteca CDR7.

También en base a la estructura cristalina, se reconstruyó una de las bibliotecas CDR originales para re-ensayar el potencial para la maduración de afinidad en el CDR de VH1. Se aleatorizaron los restos 27, 28, y 30-32 usando el nuevo antecedente de Y0192.

Selecciones de Segunda Generación de Bibliotecas Anti-VEGF: en base a los resultados de exploración de Ala así como a la estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo (F(ab)-12), se construyeron un total de diecisiete bibliotecas usando el molde pY0192 y los oligonucleótidos de parada del molde (que codifican un codón de parada en los sitios fijados como objetivo para aleatorización) YC-80, YC-100, YC-102, HL-263, y HL-264 (Tabla 9 anterior). Los oligonucleótidos de aleatorización correspondientes (que emplean NNS en los sitios fijados como objetivo para aleatorización) fueron YC81, YC-101, YC-103, HL-265, y HL-266 (Tabla 10 anterior). Los transformantes resultantes produjeron bibliotecas con complejidades que varían de 6 x 10^{7} a 5 x 10 que sugiere que las bibliotecas son completas en cubrir todas las posibles variantes. Las bibliotecas de fagos se clasifican para 7-8 rondas usando condiciones descritas en la Tabla 12 a continuación.

TABLA 12 Condiciones para Selecciones Secundarias de Variantes de Fab

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El tampón ELISA contenía albúmina de suero bovino al 0,5% y TWEEN 20™ al 0,05% en PBS. Se incluyó VEGF en el tampón de incubación para minimizar la re-unión de los fagos a VEGF recubierto en la superficie de la placa. La clasificación de estas bibliotecas produjo enriquecimientos de fago durante 7 a 8 rondas de selección.

Ensayos ELISA de Fagos en Clones de Segunda Generación: Después de ocho rondas de selección, se aislaron de diez a veinte clones de cada biblioteca de placas que contenían carbenicilina que albergaban colonias de E. coli. (XL1) que se habían infectado con una combinación de fagos eluidos. Las colonias se asilaron y se hicieron crecer con fago auxiliar para obtener ADN de cadena simple para secuenciarla. Las sustituciones en CDR seleccionadas para la unión más favorable a VEGF se dedujeron de la secuencias de AND de los clones fagémidos. Se muestra un muestreo de los clones seleccionados en la Tabla 13 a continuación.

TABLA 13 Secuencias proteicas de variantes Anti-VEGF de bibliotecas de fagos Fab de segunda generación

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La secuencia de la región aleatorizada solo se muestra deducida de la secuenciación de ADN.

Cuando se ensayaron varios clones junto con el clon parental pY10192 en ensayo ELISA de fagos, ninguno mostró una mejora distintiva sobre el clon parental. Esto podría explicarse por el tiempo en escala en el que el ensayo se realizó (<3 horas).

Para cuantificar la mejora en la unión a antígeno sobre el clon parental, se trasformaron varios ADN de las variantes anti-VEGF en la cepa 34B8 de E. coli, expresadas como Fab, y se purificaron pasando la descarga periplásmica a través de una columna de proteína G (Pharmacia) como se ha descrito en el Ejemplo 2 anterior.

Variantes de Combinación de CDR: Para mejorar más la afinidad de unión a VEGF, se combinaron mutaciones encontradas en la presentación de fago en diferentes CDR para crear mutantes CDR múltiples. En particular, se combinaron las mutaciones identificadas en las variantes de fago de las bibliotecas VH1, VH2, y VH3 de afinidad más mejorada (Tabla 14) para ensayar la avidez de sus contribuciones a la afinidad de unión.

TABLA 14 Variantes Anti-VEGF de combinación CDR

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Las mutaciones de los vectores parentales indicados se combinaron con las de los oligonucleótidos indicados por mutagénesis dirigida de sitio para producir las variantes de combinación enumeradas.

La versión Y0317 es equivalente a Y0313-1 excepto en que la mutación de fondo en VL1 se retiró y su secuencia revertió a la de Y0101. Los efectos de mutar H101Y y S105T se ensayaron construyendo un mutante de reversión a partir de Y0238-3.

Análisis BIAcore: Las afinidades de unión a VEGF de los fragmentos Fab se calcularon a partir de las constantes de velocidad de asociación y disociación medidas usando un sistema de resonancia de plasmón superficial BIAcore-2000™ (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ). Se activó un chip biosensor para el acoplamiento covalente de VEGF usando clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ). Se intercambió el tampón de VEGF por acetato sódico 20 mM, pH 4,8, y se diluyó aproximadamente a 50 \mug/ml. Se inyectó una alícuota (35 \mul) a una velocidad de flujo de 2 \mul/min para conseguir aproximadamente 700-1400 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Finalmente, se inyectó etanolamina 1 M como agente de bloqueo.

Para las medidas de cinética, se inyectaron diluciones seriadas de dos veces de Fab en tampón PBS/TWEEN™ (TWEEN 20™ al 0,05% en solución salina tamponada con fosfato) y 25ºC a una velocidad de flujo de 10 \mul/min. Las velocidades de asociación y disociación se calcularon usando protocolos convencionales (Karlsson et al. J. Immun. Methods 145:229-240 (1991)). Se calcularon las constantes de equilibrio de disociación, Kd, a partir de las medidas de resonancia de plasmón superficial (SPR) como koff/kon. Los datos se muestran en la Tabla 15 a continuación.

24

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \begin{minipage}{150mm} * La velocidad de disociación observada
probablemente refleja un límite superior para la velocidad de
disociación real en estos experimentos, aunque la  velocidad de
disociación se aproxima al límite de detección por
BIAcore.\end{minipage} \cr}

Los datos BIAcore™ de la Tabla 15 muestran que en varias variantes tienen una afinidad mejorara sobre Y0192. Por ejemplo, una variante de CDRH1, Y0243-1, mostró una afinidad potenciada 4,1 veces, que surge de las mutaciones T28D y N31H. La variante Y0238-3 mostró al menos una mejora de 14 veces en la afinidad de unión sobre Y0192. Ambas mutaciones de CDRH3 contribuyen a la afinidad mejorada de Y0238-3 porque la reversión de T105 a S (variante Y0313-3) reduce la afinidad de Y0238-3 de 0,15 nM a 0,65 nM (véase Tabla 15). La potenciación de afinidad mayor en relación con Y0192 se vio para Y0313-1, que contenía mutaciones en CDRH3 combinadas con mutaciones en CDRH1.

Ensayo Basado en Células de Inhibición de VEGF: Se ensayaron varias versiones del anticuerpo A.4.6.1 anti-VEGF para su capacidad de antagonizar VEGF (recombinante; versión 1-165) en la inducción del crecimiento de HuVEC (células endoteliales de la vena umbilical humana). Se sembraron placas de 96 pocillos con 1000 HuVEC por pocillo y se dejaron en medio de ensayo (F12:DMEM 50:50 suplementado con suero bovino fetal diafiltrado al 1,5%) durante 24 horas. La concentración de VEGF usada para inducir las células se determinó titulando primero la cantidad de VEGF que puede estimular el 80% de la síntesis máxima de ADN. Después se añadió medio de ensayo nuevo que contenía cantidades fijadas de VEGF (concentración final 0,2 nM), y concentraciones en aumento de Fab o Mab anti-VEGF. Después de 40 horas de incubación, se midió la síntesis de ADN por incorporación de timidina tritiada. Las células se pulsaron con 0,5 \muCi por pocillo de [3H]-timidina durante 24 horas y se recogieron para contarlas, usando un contador gamma TopCount.

Los resultados (Figura 11) muestran que la forma de IgG de longitud completa de F(ab)-12 era significativamente más potente en la actividad de inhibición de VEGF que la forma Fab (aquí, se usó Y0192). Sin embargo, ambas variantes Y0238-3 e Y0313-1 mostraron una actividad de inhibición de VEGF incluso más potente que la de Fab de Y0192 o Mab de F(ab)-12. Comparando las formas Fab, la variante Y0313-1 pareció >30 más potente que el Fab de tipo silvestre. Debe observarse que la cantidad de VEGF (0,2 nM) usada en este ensayo es potencialmente limitante para la determinación de un IC50 exacto para el mutante. Por ejemplo, si la afinidad de unión (Kd) del mutante es de hecho <0,2 nM, el IC50 en este experimento será mayor que en condiciones de concentración inferior de VEGF. Por tanto el resultado mantiene la conclusión de que la variante de afinidad mejorada tiene al menos una mejora de 30 veces en la afinidad para VEGF, y que efectivamente bloquea la activad de VEGF in vitro. Como la variante Y0317 difiere de Y0313-1 sólo en la reversión de la secuencia VL1 al tipo silvestre (Figura 10A), se predice que Y0317 tendrá una actividad similar a Y0313-1.

Se compararon la variante Y0317 (Fab) y la variante F(ab)-12 humanizada del Ejemplo 1 (longitud completa y Fab) para su capacidad de inhibir la proliferación de células del endotelio capilar en respuesta a una concentración de eficacia casi máxima de VEGF usando el ensayo descrito en el Ejemplo 1. Como se ilustra en la Figura 12, Y0317 fue marcadamente más eficaz en la inhibición de la proliferación de células del endotelio capilar bovino que las formas de longitud completa y Fab de F(ab)-12 en este ensayo. El Fab de afinidad madura de Y0317 mostró un valor ED50 en este ensayo que fue al menos aproximadamente 20 veces inferior que el Fab de F(ab)-12.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE:

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(A): NOMBRE: Genentech, Inc.

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(B): CALLE: One DNA Way

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(C): CIUDAD: South San Francisco

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(E): PAÍS: EEUU

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(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): CA 94080

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Anticuerpos Anti-VEGF

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 130

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(iv): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A): TIPO DE MEDIO: Disco flexible

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(B): ORDENADOR: PC IBM compatible

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(E): PROGRAMA: PatentIn Release Nº 1.0, Versión Nº 1.30

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(v): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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: NÚMERO DE SOLICITUD: EP 03004199.0

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(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US98/06604

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 03-ABR-1998

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(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/833,504

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 07-ABR-1997

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/908,469

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 06-AGO-1997

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe Lys}

\sac{Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Thr Ser Ser Leu His Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 123 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 108 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:

27

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 123 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 108 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 113 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:

31

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 108 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 12:

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 107 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 13:

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 123 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 14:

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 107 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 15:

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 123 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 16:

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Lys Asn Ser Ser Met Ile Ser Asn Thr Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Gln Ser Leu Thr Gly Thr Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 19

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Gln Asn Leu Ser Asp Gly Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Gln Asn Ile Ser Asp Gly Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Ile Ser Ser His Leu Gly Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 67 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATTTCAAAC GTCGTNYTAC TWTTTCTAGA GACAACTCCA AAAACACABY TTACCTGCAG

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGAAAC

\hfill

67

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 66 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATTTCAAAC GTCGTNYTAC TWTTTCTTTA GACACCTCCG CAAGCACABY TTACCTGCAG

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGAAC

\hfill

66

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 60 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCCTGCGCG CTGAGGACAC TGCCGTCTAT TACTGTDYAA RGTACCCCCA CTATTATGGG

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCAGCGCGC AGGCTGTTCA TCTGCAGGTA

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 26:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTGATATCC AGTTGACCCA GTCCCCG

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 27:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCTGGGACGG ATTACACTCT GACCATC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 75 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 28:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGTTTGTCCT GTGCARYTTC TGGCTATACC TTCACCAACT ATGGTATGAA CTGGRTCCGT

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGGCCCCGG GTAAG

\hfill

75

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 29:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATATCCAGT TGACCCAGTC CCCG

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 30:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTCCGAAAG TACTGATTTA C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 54 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 31:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGTCGTTTCA CTTTTTCTGC AGACACCTCC AGCAACACAG TATACCTGCA GATG

\hfill

54

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 32:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTATTACTGT GCAAAGTACC CCCAC

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 33:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGACGGATT TCACTCTGAC CATC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 34:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTATGAACT GGGTCCGTCA GGCCCC

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 57 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 35:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGTCGTTTCA CTTTTTCTTT AGACACCTCC AAAAGCACAG CATACCTGCA GATGAAC

\hfill

57

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 53 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 36:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGTCACCAT CACCTGCTAA GCATAATAAT AATAAAGCAA CTATTTAAAC TGG

\hfill

53

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 52 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 37:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGCAAGTCA GGATATTTAA TAATAATAAT AATGGTATCA ACAGAAACCA GG

\hfill

52

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 48 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 38:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCTATTACT GTGCAAAGTA ATAACACTAA TAAGGGAGCA GCCACTGG

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 49 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 39:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTACCCCCA CTATTATTAA TAATAATAAT GGTATTTCGA CGTCTGGGG

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 53 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 40:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACTATTATG GGAGCAGCCA CTAATAATAA TAAGTCTGGG TCAAGGAACC CTG

\hfill

53

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 53 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 41:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCTGTGCAG CTTCTGGCTA ATAATTCTAA TAATAAGGTA TGAACTGGGT CCG

\hfill

53

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 52 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 42:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAATGGGTTG GATGGATTA CTAATAATAA GGTTAACCGA CCTATCGTGC GG

\hfill

52

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 49 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 43:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGTGCAAAG TACCCGTAAT ATTAATAATA ATAACACTGG TATTTCGAC

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 48 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 44:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGTTTCACTT TTTCTTAGA CTAATCCAAA TAAACAGCAT ACCTGCAG

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 46 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 45:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAATGGGTTG GATGGATTTA ATAATAATAA GGTGAACCGA CCTATG

\hfill

46

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 53 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 46:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGTCACCAT CACCTGCNNS GCANNSNNSN NSNNSAGCAA CTATTTAAAC TGG

\hfill

53

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 52 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 47:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGCAAGTCA GGATATTNNS NNSNNSNNSN NSTGGTATCA ACAGAAACCA GG

\hfill

52

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 48 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 48:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCTATTACT GTGCAAAGNN SNNSCACNNS NNSGGGAGCA GCCACTGG

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 49 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 49:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTACCCCCA CTATTATNNS NNSNNSNNST GGTATTTCGA CGTCTGGGG

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 50:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 54 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 50:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACTATTATG GGAGCAGCCA CNNSNNSNNS NNSGTCTGGG GTCAAGGAAC CCTG

\hfill

54

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 51:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 53 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 51:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCTGTGCAG CTTCTGGCNN SNNSTTCNNS NNSNNSGGTA TGAACTGGGT CCG

\hfill

53

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 52:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 52 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 52:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAATGGGTTG GATGGATTAA CNNSNNSNNS GGTNNSCCGA CCTATGCTGC GG

\hfill

52

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 53:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 49 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 53:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGTGCAAAG TACCCGNNST ATNNSNNSNN SNNSCACTGG TATTTCGAC

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 54:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 48 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 54:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGTTTCACTT TTTCTNNSGA CNNSTCCAAA NNSACAGCAT ACCTGCAG

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 55:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 47 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 55:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAATGGGTTG GATGGATTNN NSNNSNNSNN SGGTGAACCG ACCTATG

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 56:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 56:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Arg Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 57:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 57:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Ile Asn Lys Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 58:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 58:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 59:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 59:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Asn Gly Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 60:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 60:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Ile Ala Lys Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 61:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 61:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Arg Asp Asn Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 62:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 62:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Trp Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 63:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 63:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Arg Gln Asn Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 64:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 64:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Arg Gln Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 65:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 65:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Arg Asn Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 66:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 66:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Lys Asn Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 67:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 67:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Ile Glu Arg Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 68:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 68:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Arg Asn Ala Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 69:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 69:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Thr Thr Arg Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 70:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 70:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Glu Gly Thr Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 71:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 71:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Arg Gln Arg Gly His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 72:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 72:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Thr Gly Arg Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 73:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 73:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Thr Asn Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 74:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 74:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Arg Lys Gly Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 75:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 75:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Thr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 76:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 76:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Arg Ser Gly Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 77:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 77:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Thr Asn Arg Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 78:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 78:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Arg Asn Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 79:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 79:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Lys Glu Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 80:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 80:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Arg Asp Ala Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 81:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 81:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Arg Gln Lys Gly His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 82:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 82:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Lys Gly Gly Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 83:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 83:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Gly Ala Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 84:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 84:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Arg Gly Glu Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 85:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 85:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Arg Ser Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 86:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 86:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr Gly Met Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 87:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 87:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Tyr Glu Phe Gln His Tyr Gly Met Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 88:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 88:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Tyr Glu Phe Thr His Tyr Gly Met Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 89:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 89:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Tyr Asp Phe Gly His Tyr Gly Met Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 90:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 90:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Tyr Asp Phe Ser His Tyr Gly Met Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 91:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 91:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Tyr Glu Phe Ser His Tyr Gly Met Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 92:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 92:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Ser Val Asp Val Ser Lys Ser Thr Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 93:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 93:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Ser Leu Asp Lys Ser Lys Ser Thr Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 94:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 94:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Ser Leu Asp Val Trp Lys Ser Thr Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 95:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 95:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Ser Ile Asp Lys Ser Lys Ser Thr Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 96:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 42 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 96:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCAAAGTACC CGTACTATTA TGGGACGAGC CACTGGTATT TC

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 97:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 48 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 97:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCACCATCA CCTGCAGCGC AAGTCAGGAT ATTAGCAAGT ATTTAAAC

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 98:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 98:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGTACTATT ATGGGAGCAG CCACTGGTAT TTC

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 99:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 6072 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 390..1101

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: mat_péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 459

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1185..2423

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: mat_péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1254

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 99:

38

39

40

41

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 100:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 413 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 100:

43

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 101:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 110 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 101:

45

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 102:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 119 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 102:

46

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 103:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 110 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 103:

47

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 104:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 118 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 104:

48

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 105:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 110 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 105:

49

50

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 106:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 118 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 106:

51

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 107:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 110 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 107:

\vskip1.000000\baselineskip

52

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 108:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 118 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 108:

53

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 109:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 110 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 109:

54

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 110:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 118 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 110:

\vskip1.000000\baselineskip

55

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 111:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 110 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 111:

56

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 112:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 118 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 112:

57

58

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 113:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 110 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 113:

59

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 114:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 118 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 114:

60

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 115:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 110 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 115:

\vskip1.000000\baselineskip

61

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 116:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 118 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 116:

62

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 117:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 3

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 3 representa Ácido aspártico, Treonina o Ácido glutámico".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 4

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 4 representa Fenilalanina, Triptófano o Tirosina".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 5

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 5 representa Treonina, Glutamina, Glicina o Serina".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 6

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 6 representa Histidina o Asparagina".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 9

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 9 representa Metionina o Isoleucina".

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 117:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 118:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 5

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 5 representa Tirosina o Triptófano".

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 118:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp Ile Asn Thr Xaa Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe Lys}

\sac{Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 119:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 3

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 3 representa Histidina o Tirosina".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 5

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 5 representa Tirosina, Arginina, Lisina, Isoleucina, Treonina, Ácido glutámico o Triptófano".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 6

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 6 representa Glicina, Arginina, Alanina, Ácido aspártico, Glutamina, Ácido glutámico, Treonina, Leucina o Serina".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 7

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 7 representa Serina, Treonina, Lisina, Glutamina, Asparagina, Arginina, Alanina, Ácido glutámico o Glicina".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 8

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 8 representa Serina o Glicina".

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 119:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp Pro Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa His Trp Tyr Phe Asp Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 120:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 1 representa Fenilalanina, Isoleucina, Valina, Leucina o Alanina".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 3

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 3 representa Alanina, Leucina, Valina o Isoleucina".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 5

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 5 representa Treonina, Valina o Lisina".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 6

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 6 representa Serina o Triptófano".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 7

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 7 representa Serina o Lisina".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 8

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 8 representa Asparagina o Serina".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 10

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 10 representa Valina, Alanina, Leucina o Isoleucina".

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 120:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Ser Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 121:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 1 representa Arginina o Serina".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 3

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 3 representa Serina o Asparagina".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 4

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 4 representa Glutamina o Ácido glutámico".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 5

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 5 representa Glutamina o Ácido aspártico".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 6

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 6 representa Isoleucina o Leucina".

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 121:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Asn Tyr Leu Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 122:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 122:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Thr Ser Ser Leu His Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 123:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 5

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 5 representa Treonina, Alanina o Asparagina".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 6

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 6 representa Valina o Treonina".

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 123:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Gln Tyr Ser Xaa Xaa Pro Trp Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 124:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 108 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 4

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 4 representa Metionina o Leucina".

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 124:

63

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 125:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 123 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 28

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 28 representa Treonina o Ácido aspártico".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 31

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 31 representa Asparagina o Histidina".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 101

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 101 representa Tirosina o Histidina".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 105

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 105 representa Serina o Treonina".

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 125:

64

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 126:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 126:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr Gly Met Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 127:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 127:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 128:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 3

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 3 representa Treonina o Ácido aspártico".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 6

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 6 representa Asparagina o Histidina".

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 128:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Tyr Xaa Phe Thr Xaa Tyr Gly Met Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 129:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 3

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 3 representa Tirosina o Histidina".

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 7

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 7 representa Serina o Treonina".

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 129:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Xaa Tyr Tyr Gly Xaa Ser His Trp Tyr Phe Asp Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 130:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 237 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 130:

65

Claims

1. Un anticuerpo anti-factor de crecimiento del endotelio vascular que inhibe la angiogénesis inducida por VEGF in vivo y/o se une a VEGF humano con un valor K_{d} de no más de 1 x 10^{-8} M y/o tiene un valor ED50 de no más de 5 nM para inhibir la proliferación inducida por VEGF de células endoteliales in vitro, teniendo el anticuerpo un dominio variable de la cadena pesada que comprende las regiones flanqueantes consenso del subgrupo III de cadenas pesadas humanas como se muestra en SEC.ID.Nº 11 y las regiones hipervariables CDRH1, CDRH2 y CDRH3, teniendo las siguientes secuencias de aminoácidos:

CDRH1: GYX_{1}X_{2}X_{3}X_{4}YGX_{5}N (SEC.ID.Nº 117), donde X_{1} es D, T o E, X_{2} es F, W, o Y, X_{3} es T, Q, G o S, X_{4} es H o N; y X_{5} es M o I;

CDRH2: WINTX_{1}TGEPTYAADFKR (SEC.ID.Nº 118), donde X_{1} es Y o W; y

CDRH3: YPX_{1}YX_{2}X_{3}X_{4}X_{5}HWYFDV (SEC.ID.Nº 119), donde X_{1} es H o Y; X_{2} es Y, R, K, I, T, E, o W, X_{3} es G, N, A, D, Q, E, T, K, o S, X_{4} es S, T, K, Q, N, R, A, E, o G, y X_{5} es S o G;

y teniendo un dominio variable de la cadena ligera que comprende las regiones flanqueantes consenso del subgrupo I de cadenas ligeras kappa como se muestra en SEC.ID.Nº 12 y las regiones hipervariables CDRL1, CDRL2 y CDRL3, teniendo las siguientes secuencias de aminoácidos:

CDRL1: X_{1}AX_{2}X_{3}X_{4}X_{5}SNYLN (SEC.ID.Nº 121), donde X_{1} es R o S, X_{2} es S o N, X_{3} es Q o E, X_{4} es Q o D y X_{5} es I o L;

CDRL2: FTSSLHS (SEC.ID.Nº 122);

CDRL3: QQYSX_{1}X_{2}PWT (SEC.ID.Nº 123), donde X_{1} es T, A o N y X_{2} es V o T,

donde en comparación con SEC.ID.Nº 11 el dominio variable de la cadena pesada tiene una sustitución en uno cualquiera o más de los siguientes restos de las regiones flanqueantes: 37H, 49H, 67H, 69H, 71H, 73H, 75H, 76H, 78H y 94H, y donde en comparación con SEC.ID.Nº 12 el dominio variable de la cadena ligera tiene una sustitución en, y sólo en el resto 46L de las regiones flanqueantes consenso o tiene sustituciones en los restos 4L y 46L de las regiones flanqueantes consenso, donde la numeración de los restos es como se muestra en la Figura 1.

2. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, donde el dominio variable de la cadena ligera tiene una sustitución en, y solo en el resto 46L de las regiones flanqueantes consenso.

3. Un anticuerpo de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, que tiene sustituciones en al menos dos de dichos restos de la cadena pesada.

4. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 3, que tiene sustituciones en al menos tres de dichos restos de la cadena pesada.

5. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 4, que tiene sustituciones en al menos cuatro de dichos restos de la cadena pesada.

6. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 5, que tiene sustituciones en los restos 49H, 69H, 71H, 73H, 76H, 78H y 94H.

7. Un anticuerpo de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, donde:

en CDRH1, X_{1} es D o T, X_{2} es F, X_{3} es T y X_{5} es M;

en CDRH2, X_{1} es Y; y

en CDRH3, X_{2} es Y, X_{3} es G, X_{4} es S o T y X_{5} es S.

8. Un anticuerpo de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, donde:

en CDRL1, X_{1} es S, X_{2} es S, X_{3} es Q, X_{4} es D y X_{5} es I; y

en CDRL3, X_{1} es T y X_{2} es V.

9. Un anticuerpo de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, donde el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos:

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"CDR7": X_{1}SX_{2}DX_{3}X_{4}X_{5}X_{6}TX_{7} (SEC.ID.Nº 120), donde X_{1} es F, I, V, L, o A, X_{2} es A, L, V, o I, X_{3} es T, V o K, X_{4} es S o W, X_{5} es S o K, X_{6} es N o S y X_{7} es V, A, L o I.

10. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 9, donde en CDR7, X_{1} es F, X_{2} es L, X_{3} es T, X_{4} es S, X_{5} es K, X_{6} es S y X_{7} es A.

11. Un anticuerpo de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, que tiene la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada de SEC.ID.Nº 7 y/o la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera de SEC.ID.Nº 8.

12. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 11, que tiene la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada de SEC.ID.Nº 7 y la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera de SEC.ID.Nº 8.

13. Un anticuerpo de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, que se une al factor de crecimiento del endotelio vascular humano (VEGF) con un valor K_{d} de no más de aproximadamente 1 x 10^{-8}M.

14. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 13, que se une al VEGF humano con un valor K_{d} de no más de aproximadamente 5 x 10^{-9}M.

15. Un anticuerpo de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, que es un anticuerpo de longitud completa.

16. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 15, que es una IgG humana.

17. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que es un fragmento de anticuerpo.

18. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 17, que es un Fab.

19. Una composición que comprende el anticuerpo de cualquier reivindicación precedente y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

20. Un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.

21. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 20.

22. Una célula hospedadora que comprende el vector de la reivindicación 21.

23. Un proceso para producir un anticuerpo anti-VEGF humanizado, que comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 22 de modo que se exprese el ácido nucleico.

24. EL proceso de la reivindicación 23, que también comprende recuperar el anticuerpo anti-VEGF humanizado del cultivo de células hospedadoras.

25. Un medicamento que comprende un anticuerpo anti-VEGF humanizado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, para usar en inhibir la angiogénesis inducida por VEGF en un mamífero, donde dicho medicamento puede administrarse en una cantidad terapéuticamente eficaz al mamífero.

26. El medicamento de la reivindicación 25, donde el mamífero es humano.

27. EL medicamento de la reivindicación 25 o reivindicación 26, donde el mamífero tiene un tumor.

28. El medicamento de la reivindicación 25 o reivindicación 26, donde el mamífero tiene un trastorno retinal.

29. Un dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo anti-VEGF, que comprende la secuencia de aminoácidos:

DIQX_{1}TQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDF
TLT ISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR (SEC.ID.Nº 124), donde X_{1} es M o L.

30. Un dominio variable de la cadena pesada de un anticuerpo anti-VEGF, que comprende la secuencia de aminoácidos:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYX_{1}FTX_{2}YGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKR
RF TFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPX_{3}YYGX_{4}SHWYFDVWGQGTLVTVSS (SEC.ID.Nº 125),
donde X_{1} es T o D, X_{2} es N o H, X_{3} es Y o H y X_{4} es S o T.