BRPI0720552A2

BRPI0720552A2 - Antagonistas específicos de vegf para terapia adjuvante e neoadjuvante e o tratamento de tumores em estágio precoce

Info

Publication number: BRPI0720552A2
Application number: BRPI0720552-0A2A
Authority: BR
Inventors: Napoleone Ferrara; Nina Korsisaari; Robert D Mass
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2006-12-19
Filing date: 2007-12-18
Publication date: 2014-01-07
Also published as: CR10940A; TW201525003A; US20110052576A1; MA31150B1; CA2671734A1; CO6210829A2; DK2101807T3; WO2008077077A2; US20120148584A1; JP2010513566A; NZ578472A; EP3095455A1; WO2008077077A3; US20140178363A1; HUE029445T2; JP2013189452A; TWI577695B; PL2101807T3; SI2101807T1; KR20140031996A

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTAGO- NISTAS ESPECÍFICOS DE VEGF PARA TERAPIA ADJUVANTE E NEO- ADJUVANTE E O TRATAMENTO DE TUMORES EM ESTÁGIO PRECO- CE".

Antecedentes

O câncer é um das maiores ameaças de morte para a saúde humana. Nos Estados Unidos apenas, o câncer afeta quase 1,3 milhões de novos pacientes a cada ano, e é a segunda causa indutora de morte após doença cardiovascular, montando em aproximadamente 1 a 4 mortes 4. Os tumores sólidos são responsáveis pela maioria daquelas mortes. Embora tenham havido significantes avanços no tratamento médico de certos cânce- res, a taxa total de sobrevivência de 5 ao ano para todos os cânceres melho- rou apenas em torno de 10% nos últimos 20 anos. Os cânceres, ou tumores malignos, metastatizam e desenvolvem-se rapidamente de uma maneira descontrolada, tornando a detecção e o tratamento convenientes extrema- mente difíceis.

Os métodos de tratamento de câncer atuais são relativamente não seletivos e geralmente alvejam o tumor após o câncer ter progredido para um estado mais maligno. A cirurgia remove o tecido doente; a radiote- rapia reduz os tumores sólidos; e a quimioterapia mata as células em rápida divisão. A quimioterapia, em particular, resulta em numerosos efeitos colate- rais, em alguns casos muito severos, a fim de limitar a dosagem que pode ser dada, e desse modo impedo uso de fármacos potencialmente eficazes. Além disso, os cânceres frequentemente desenvolvem resistência a fárma- cos quimioterápicos. O tratamento de estágio precoce ou tumores benigno seria desejável para prevenir o progresso para um estado maligno ou metas- tático, desse modo reduzindo a morbidez e mortalidade associada com cân- cer.

Para a maioria dos pacientes recentemente diagnosticados com câncer operável, o tratamento padrão é cirurgia definitiva seguida por quimi- oterapia. Tal tratamento ajuda a remover tanto doença primária e metastáti- ca quanto possível, a fim de prevenir a recorrência e melhorar a sobrevivên- cia. Realmente, a maioria destes pacientes não tem nenhuma evidência ma- croscópica de rumo residual tumor após cirurgia. Entretanto, muitos deles desenvolveriam posteriormente recorrência e podem eventualmente morrer de suas doenças. Isto ocorre por que um pequeno número de células de tu- mor viáveis tornaram-se metastáticas antes da cirurgia, escaparam da cirur- gia e ficaram indetectáveis após a cirurgia, devido à limitação de técnicas de detecção de corrente.

Portanto, tratamentos adjuvantes pós-operatórios tornam-se im- portantes como como armas auxiliares para cirurgia, a fim de eliminar estas células de câncer micrometastáticas residuais antes delas tornarem-se re- populadas e refratárias. Durante as últimas diversas décadas, avanços em terapia adjuvante têm sido de modo geral incrementai, centralizando-se so- bre o uso de vários agentes quimioterápicos. Muitos regimes de quimiotera- pia mostraram benefícios clínicos em pacientes em tratamento adjuvante com indicações de câncer maior em estágio precoce tal como cânceres de pulmão, mama e colorretal. Strauss e outro, J Clin Oncol 22:7019 (2004); International Adjuvant Lung Cancer Trial Collaboration Group N Engl J Med 350:351-60 (2004). Moertel e outro, Ann Intern Med 122:321-6 (1995); IM- PACT Lancet 345:939-44 (1995); Citron e outro, J Clin Oncol 21:1431-9 (2003).

A despeito de benefícios estabelecidos de terapia adjuvante quimiobaseadas, uma maior limitação associada com quimioterapia de qual- quer tipo são as toxicidades significantes. Geralmente, fármacos quimioterá- picos não são alvejados para o sítio de tumor, e são incapazes de discrimi- nar entre células normais e de tumor. A apresentação de toxicidades está especialmente desafiando em cenários adjuvantes, por causa do tratamento prolongado e seu impacto duradouro sobre a qualidade de vida dos pacien- tes. Além disso, benefícios de quimioterapia adjuvante em pacientes com menor risco de recorrência permanece obscuro, tornando questionável se é válido para eles sofrerem os efeitos colaterais de quimioterapia.

Terapia neoadjuvante, uma terapia adjuntiva dada antes da ci- rurgia definitiva principal, surgiu como outra parte importante de terapia de câncer. Existem diversas vantagens em fornecer tratamento neoadjuvante antes de uma cirurgia definitiva. Primeiramente, ele pode ajudar a melhorar o estado de desempenho do paciente antes da cirurgia, devido à redução do volume do tumor, ascites e efusão pleural. Em segundo lugar, a redução de 5 volume de tumor pode permitir uma cirurgia menos extensa portanto preser- vando o órgão do paciente e a função do mesmo. Isto é particularmente vali- oso, por exemplo, pacientes de câncer de mama. Além disso, a redução de volume de tumor pode possibilitar a cirurgia de tumores de outro modo ino- perável. Por fim, a terapia adjuvante pode melhorar a chance de completa- 10 mente remover o tumor por cirurgia, desse modo melhorando a sobrevivên- cia. Durante a última década, neste contexto houve muitas experiências clí- nicas sobre uma terapia adjuvante usando vários agentes quimioterápicos e ou radiação para tratar pacientes com tais cânceres como câncer de mama, câncer de cabeça e pescoço, câncer retal, câncer de bexiga, câncer de pul- 15 mão de célula não pequena, câncer cervical, câncer esofágeco e gástrico e câncer de próstata. Para uma revisão, veja Tanvetyanon e outro, Soutern Med. J. 98:338-344 (2005).

Como explicado acima, uma maior limitação associada com quimioterapia de qualquer tipo são as toxicidades significantes. Muitos regi- 20 mes de quimioterapia neoadjuvante são embaraçosos, requerendo freqüen- tes tratamentos sobre um longo período de tempo. Além disso, benefícios, especialmente benefícios de sobrevivência, de quimioterapia neoadjuvante em pacientes com menor risco de recorrência permanecem obscuros, tor- nando questionável se é válido para eles esperar em vez de cirurgia imedia- 25 ta.

Angiogênese é um importante evento celular em que células en- doteliais vasculares proliferam-se, podam-se, e se reorganizam para formar novos vasos a partir de entrecruzamento vascular preexistente. Existe evi- dência constrangedora de que o desenvolvimento de um suprimento vascu- 30 Iar é essencial para processos proliferativos normais e patológicos. Libera- ção de oxigênio e nutrientes, bem como a remoção de produtos catabólicos, representam etapas Iimitantes da taxa na maioria dos processos de cresci- I

mento que ocorrem em organismos multicelulares.

L

Enquanto a indução de novos vasos sanguíneos é consideradas ser o modo predominante de angiogênese de tumor, recentes dados têm indicado que alguns tumores podem desenvolver-se por cooperação de va- 5 sos sanguíneos de hospedeiros existentes. A vasculatura cooperada então regride, induzindo à regressão do tumor que é eventualmente revertido por angiogênese induzida por hipoxia na margem do tumor.

Um dos reguladores positivos chave de angiogênese tanto nor- mal quanto anormal é o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF)-A. 10 VEGF-A é parte de uma família de gene incluindo VEGF-B, VEGF-C, VEGF- D, VEGF-E, VEGF-F, e PIGF. VEGF-A primariamente liga-se a duas tirosina cinases receptoras de alta afinidade, VEGFR-1 (Flt-1) e VEGFR-2 (Flk- 1/KDR), o último sendo o principal transmissor de sinais mitogênicos de cé- lula endotelial vascular de VEGF-A. Adicionalmente, a neurofilina-1 foi identi- 15 ficada como um receptor para isoformas de VEGF-A de ligação à heparina, e podem desempenhar um papel em desenvolvimento vascular.

Além de ser um fator angiogênico, VEGF, como um fator de crescimento peiotrópico, exibe múltiplos efeitos biológicos em outros proces- sos fisiológicos, tais como sobrevivência e proliferação de célula endotelial, 20 permeabilidade e vasodilatação de vaso, quimiotaxia de monócito, e influxo de cálcio. Além disso, outros estudos reportaram efeitos mitogênicos de VEGF sobre alguns tipos de célula não endotelial, tais como células epiteli- ais de pigmento retinal, células de duto pancreático, e células Schwann.

O reconhecimento de VEGF como um regulador primário de an- giogênese em condições patológicas tem induzido à numerosas tentativas de bloquear as atividades de VEGF em condições que envolvem angiogêne- se patológica.

A expressão de VEGF é superregulada em uma maioria de ma- Iignidades e a superexpressão de VEGF correlaciona-se com um estágio mais avançado ou com um prognóstico inferior em muitos tumores sólidos. Portanto, moléculas que inibem as séries de reação de VEGF foram usadas para o tratamento de tumores sólidos relativamente avançados em que a angiogênese patológica é observada.

A despeito da evidencia que implica o papel de VEGF no desen- volvimento de condições ou doenças que envolvem a angiogênese patológi- ca, incluindo tumores de estágio tardio e metastático ou invasivo, menos é 5 conhecido sobre o papel de VEGF em tumores de estágio precoce ou benig- no, a recorrência de tumores após inatividade, ou no desenvolvimento de tumores de sítio secundário de tumores inativo, tumores malignos, ou mi- crometástases. A invenção trata estas e outras necessidades, como será evidente na revisão da seguinte descrição.

Sumário da Invenção

O uso de antagonistas específicos de VEGF em combinação com quimioterapia foi mostrado ser benéfico em pacientes com câncer color- retal metastático e de pulmão de célula não pequena, entre outros, porém pouco é conhecido a cerca do impacto de antagonista específico de terapia 15 de VEGF sobre tumores benigno os ou de estágio precoce; a recorrência de tumores após inatividade, cirúrgica, ou outra intervenção; o desenvolvimento de tumores de sítio secundário de tumores inativos, tumores malignos, ou micrometástases; ou no cenário adjuvante ou neoadjuvante. Fornecemos aqui resultados que demonstram que antagonistas específicos de VEGF po- 20 dem ser usados para o tratamento de tumores de estágio precoce incluindo tumores benignos, pré-cancerosos, não-metastáticos, e operáveis. Os resul- tados também demonstram que antagonistas específicos de VEGF podem ser usados para terapia adjuvante de câncer (por exemplo, cânceres benig- nos os ou malignos) ou para prevenir e/ou reduzir a probabilidade de recor- 25 rência de câncer (por exemplo, cânceres benignos ou malignos), incluindo métodos de terapia adjuvante. A invenção constitui um avanço médico signi- ficante provendo cuidados menos tóxicos, mais efetivos de pacientes com câncer, incluindo cânceres benignos, de estágio precoce, e operáveis (antes de e após cirurgia).

Consequentemente, a invenção caráteriza métodos de tratar um

câncer benigno, pré-canceroso ou não-metastático em um indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um antago- I

nista específico de VEGF. Em certas modalidades, a administração do anta- gonista específico de VEGF previne o câncer benigno, pré-canceroso, ou não-metastático de se tornar um câncer invasivo ou metastático. Por exem- plo, o câncer benigno, pré-canceroso ou não-metastático pode ser um cân- 5 cer de estágio 0, estágio I, ou estágio II, e em certas modalidades, a admi- nistração do antagonista específico de VEGF previne o câncer benigno, pré- canceroso ou não-metastático de progredir para o(s) estágio(s) seguinte(s), por exemplo, um câncer de estágio I, um de estágio II, um de estágio Ill ou estágio IV. Em certas modalidades, o antagonista específico de VEGF é ad- 10 ministrado durante um tempo e em uma quantidade suficiente para tratar o tumor benigno, pré-canceroso, ou não-metastático no indivíduo ou para pre- venir o tumor benigno, pré-canceroso, ou não-metastático de se tornar um câncer invasivo ou metastático. Em certas modalidades, a administração do antagonista específico de VEGF reduz o tamanho do tumor, carga de tumor, 15 ou o número de tumor do benigno, pré-canceroso, ou não-metastático. O antagonista específico de VEGF pode também ser administrado em uma quantidade e durante um tempo para diminuir a densidade vascular no tumor benigno, pré-canceroso, ou não-metastático.

Como aqui descrito, os métodos da invenção podem ser usados para tratar, por exemplo, um câncer de estágio 0 (por exemplo, um carcino- ma in situ), estágio I, ou estágio II. Os métodos de terapia neoadjuvante e adjuvante podem ser usados para tratar qualquer tipo de câncer, por exem- plo, benigno ou maligno. Em certas modalidades da invenção, o câncer é um tumor sólido de célula epitelial, incluindo, porém não-limitado a, câncer gas- trointestinal, câncer de cólon, câncer de mama, câncer de próstata, câncer renal, câncer de pulmão (por exemplo, câncer de pulmão de célula não pe- quena), melanoma, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer de cabeça e pescoço, câncer de fígado e cânceres de tecido macio (por exemplo, Iin- fomas de célula B tais como NHL e mieloma múltiplo e Ieucemias tais como leucemia linfocítica crônica). Em outra modalidade, o tumor benigno, pré- canceroso, ou não-metastático é um pólipo, adenoma, fibroma, lipoma, gas- trinoma, insulinoma, chondroma, osteoma, hemangioma, linfangioma, me- ningioma, leiomioma, rhabdomioma, papiloma de célula escamosa, neuro- mas acústicos, neurofibroma, cistanoma de duto de bile, leiomiomas, meso- teliomas, teratomas, mixomas, tracomas, granulomas, hamartoma, papiloma de célula transicional, adenoma pleiomórfico da glândula salivar, tumor des- 5 moide, cistopapiloma dermoide, cistadenoma, hiperplasia nodular focal, ou uma hiperplasia regenerativa nodular. Em outra modalidade, o método é de- sejavelmente usado para tratar um adenoma. Exemplos não-limitantes de adenomas incluem adenoma de célula de fígado, adenoma renal, adenoma metanéfrico, adenoma brônquico, adenoma alveolar, adenoma adrenal, ade- 10 noma pituitário, adenoma paratireóide, adenoma pancreático, adenoma de glândula salivar, adenoma hepatocelular, adenoma gastrointestinal, adeno- ma tubular, e adenoma de duto de bile.

A invenção também caráteriza métodos que compreendem ad- ministrar a um indivíduo uma quantidade eficaz de um antagonista específico 15 de VEGF para prevenir a ocorrência ou recorrência de um câncer benigno, pré-canceroso, ou não-metastático no indivíduo. Em certas modalidades da invenção, o indivíduo está em risco de câncer, pólipos, ou uma síndrome de câncer. Em um exemplo, o indivíduo tem uma história de família de câncer, pólipos, ou uma síndrome de câncer herdada (por exemplo, neoplasia endó- 20 crina múltipla tipo 1 (MEN1)). Em certos aspectos da invenção, o indivíduo está em risco de desenvolver um tumor benigno, pré-canceroso, ou não- metastático gastrointestinal, um tumor desmoide, ou um adenoma (por e- xemplo, a adenoma gastrointestinal, a adenoma pituitário, ou a adenoma pancreático). Em certas modalidades, o método previne a ocorrência ou re- 25 corrência do referido câncer benigno, pré-canceroso ou não-metastático em um indivíduo que nunca teve um tumor, um indivíduo que nunca teve um tumor clinicamente detectável, ou um indivíduo que teve apenas um tumor benigno.

Em outro aspecto, a invenção caráteriza um método de tratar um tumor gastrointestinal de estágio 0, estágio I, ou estágio Il em um indivíduo que inclui administrar ao indivíduo um antagonista específico de VEGF du- rante um tempo e em uma quantidade suficiente para tratar o tumor gastroin- testinal de estágio 0, estágio I, ou estágio Il no indivíduo. O tumor gastroin- testinal pode ser qualquer câncer de estágio 0, estágio I, ou estágio Il do sistema gastrointestinal incluindo, câncer anal, câncer colorretal, câncer re- tal, câncer esofágico, câncer de vesícula biliar, câncer gástrico, câncer do fígado, câncer pancreático, e câncer do intestino delgado. Em uma modali- dade, o tumor gastrointestinal é um tumor de estágio 0 (por exemplo, um adenoma de grau elevado) ou estágio I. Em uma modalidade, o indivíduo não sofreu anteriormente uma excisão para tratar o tumor gastrointestinal.

Em outro aspecto, a invenção caráteriza um método de tratar um indivíduo em risco de desenvolver um tumor gastrointestinal que inclui admi- nistrar ao indivíduo um antagonista específico de VEGF durante um tempo e em uma quantidade suficiente para prevenir a ocorrência ou reocorrência do tumor gastrointestinal no indivíduo. O tumor gastrointestinal pode ser qual- quer tumor gastrointestinal incluindo, porém não-limitado a um adenoma, um ou mais pólipos, ou um câncer de estágio 0, I, ou II.

Em certas modalidades dos métodos acima, o indivíduo é um humano acima da idade de 50 anos, tem uma síndrome de câncer herdada, ou tem uma história de família de câncer de cólon ou pólipos. Exemplos não- Iimitantes de síndromes gastrointestinais de câncer herdado incluem polipo- se adenomatosa familiar (FAP), síndrome de Gardner, câncer pancreático, e câncer colorretal de não polipose hereditário (HNPCC). Em certas modalida- des, o indivíduo pode ou não ter passado anteriormente por uma colonosco- pia. Em uma modalidade, o antagonista específico de VEGF é administrado em uma quantidade e durante um tempo para reduzir o número de pólipos colorretais adenomatosos em um indivíduo tendo FAP.

Em outro aspecto, a invenção caráteriza um método de prevenir ou reduzir a probabilidade de recorrência de um câncer em um indivíduo que inclui administrar ao indivíduo um antagonista específico de VEGF durante um tempo e em uma quantidade suficiente para prevenir ou reduzir a proba- bilidade de recorrência de câncer no indivíduo. A invenção inclui um método de prevenir a recorrência de um câncer em um indivíduo tendo um tumor que inclui as etapas de remover o tumor (por exemplo, usando cirurgia defi- nitiva) e em seguida administrar ao indivíduo um antagonista específico de VEGF. A invenção inclui métodos de prevenir o novo crescimento de um tu- mor em um indivíduo que inclui as etapas de remover o tumor (por exemplo, usando cirurgia definitiva) e em seguida administrar ao indivíduo um antago- 5 nista específico de VEGF. Em um aspecto relacionado, a invenção inclui um método de prevenir a recorrência de câncer em um indivíduo ou reduzir a probabilidade de recorrência de câncer em um indivíduo que opcionalmente inclui administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um antagonista es- pecífico de VEGF antes da cirurgia, realizando cirurgia definitiva, e adminis- 10 trando uma quantidade eficaz de um antagonista específico de VEGF se- guindo a cirurgia em que a adminstração do antagonista específico de VEGF após a cirurgia previne a recorrência do câncer ou reduz a probabilidade de recorrência do câncer. Em outro aspecto relacionado, a invenção inclui um método de prevenir a recorrência de câncer em um indivíduo ou reduzir a 15 probabilidade de recorrência de câncer em um indivíduo que inclui adminis- trar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um antagonista específico de VEGF na ausência de qualquer agente terapêutico anticâncer adicional , em que a administração previne recorrência de câncer em um indivíduo ou re- duz a probabilidade de recorrência de câncer em um indivíduo.

Para cada um dos aspectos acima, o tumor pode ser qualquer

tipo de tumor incluindo, porém não-limitado a tumores sólidos, e particular- mente os tumores e adenomas, descritos aqui. O indivíduo pode ter um tu- mor inativo ou micrometástases, que podem ou não ser clinicamente detec- tável. Em uma modalidade deste aspecto, o antagonista específico de VEGF 25 é administrado durante um tempo e em uma quantidade suficiente para re- duzir neovascularização de um tumor inativo ou micrometástases. Em outra modalidade, o antagonista específico de VEGF é administrado durante um tempo e em uma quantidade suficiente para prevenir a ocorrência de um tumor clinicamente detectável, ou metástase do mesmo, ou para aumentar a 30 duração de sobrevivência do indivíduo.

Em uma modalidade, o antagonista específico de VEGF é uma monoterapia. Em outra modalidade, o indivíduo já foi anteriormente tratado I

do tumor, por exemplo, usando uma terapia anticâncer. Em um exemplo, a terapia anticâncer é cirurgia. Em outra modalidade, o indivíduo pode ser também tratado com uma terapia anticâncer adicional antes, durante (por exemplo, simultaneamente), ou após a administração do antagonista especí- 5 fico de VEGF. Exemplos de terapias anticâncer incluem, sem limitação, ci- rurgia, terapia de radiação (radioterapia), bioterapia, imunoterapia, quimiote- rapia, ou uma combinação destas terapias.

Em modalidades onde o indivíduo já passou por cirurgia definiti- va, o antagonista específico de VEGF é geralmente administrado após um período de tempo em que o indivíduo já se recuperou da cirurgia. Este perí- odo de tempo pode incluir o período requerido para cicatrização de ferimento ou cicatrização da incisão cirúrgica, o período de tempo requerido para re- duzir o risco de deiscência do ferimento, ou o período de tempo requerido para o indivíduo retornar a um nível de saúde essencialmente similar a ou melhor do que o nível de saúde antes da cirurgia. O período entre a conclu- são da cirurgia definitiva e a primeira administração do antagonista específi- co de VEGF pode também incluir o período necessário para uma holidia de fármaco, em que o indivíduo requer ou solicita um período de tempo entre regimes terapêuticos. Geralmente, o período de tempo entre conclusão de cirurgia definitiva e o início do antagonista específico de terapia de VEGF pode incluir menos do que uma semana, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas,

4 semanas (28 dias), 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 3 me- ses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 1 ano, 2 anos, 3 anos, ou mais. Em uma modalidade, o período de tempo entre cirurgia definitiva e a administração do antagonista específico de VEGF é maior do que 2 semanas e menor do que 1 ano.

Cada um dos aspectos acima pode também incluir a monitora- ção do indivíduo quanto à recorrência do câncer.

A invenção também fornece métodos de terapia adjuvante antes da remoção cirúrgica de câncer operável em um indivíduo, por exem- plo, um paciente humano, compreendendo administrar ao paciente uma quantidade eficaz de um antagonista específico de VEGF, por exemplo, be- vacizumab, onde o paciente foi diagnosticado com um tumor ou câncer. O antagonista específico de VEGF pode ser administrado sozinho ou em com- binação com pelo menos um agente quimioterápico.

A invenção também inclui um método de tratar um indivíduo com 5 câncer operável que inclui administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um antagonista específico de VEGF antes da cirurgia e em seguida reali- zando cirurgia, desse modo o câncer é removido. Em uma modalidade, o método também inclui a etapa de administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um antagonista específico de VEGF após a cirurgia para prevenir a 10 recorrência do câncer.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método de terapia adjuvante compreendendo administrar, a um indivíduo com câncer operável, uma quantidade eficaz de um antagonista específico de VEGF, por exemplo, bevacizumab, e pelo menos um agente quimioterápico antes da cirurgia de- 15 finitiva. O método pode ser usado para estender a sobrevivência livre de do- ença (DFS) ou sobrevivência geral (OS) no indivíduo. Em uma modalidade, o DFS ou o OS é avaliado durante 2 a 5 anos após o início do tratamento.

Em outro aspecto, a invenção inclui um método de reduzir o ta- manho do tumor em um indivíduo tendo um tumor não removível compreen- 20 dendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um antagonista específico de VEGF em que a administração reduz o tamanho do tumor des- se modo permitindo a completa remoção do tumor. Em uma modalidade, o método também inclui administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um antagonista específico de VEGF após a completa remoção do tumor.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método de tratar

câncer em um indivíduo compreendendo as seguintes etapas: a) um primei- ro estágio compreendendo uma pluralidade de ciclos de tratamento em que cada ciclo compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um antagonista específico de VEGF, por exemplo, bevacizumab, e pelo me- 30 nos um agente quimioterápico em um intervalo predeterminado; b) a cirurgia definitiva pela qual o câncer é removido; e c) um segundo estágio compre- endendo uma pluralidade de ciclos de manutenção em que cada ciclo com- I

preende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um antagonista específico de VEGF, por exemplo, bevacizumab, sem qualquer agente qui- mioterápico em um intervalo predeterminado. Em uma modalidade, o primei- ro estágio compreende uma primeira pluralidade de ciclos de tratamento em 5 que um antagonista específico de VEGF, por exemplo, bevacizumab, e um primeiro regime de quimioterapia são administrados seguido por uma se- gunda pluralidade de ciclos de tratamento em que um antagonista específico de VEGF, por exemplo, bevacizumab, e um segundo regime de quimiotera- pia são administrados. Em uma modalidade, se o câncer a ser tratado para 10 câncer de mama, o primeiro regime de quimioterapia compreende doxorubi- cina e ciclofosfamida e o segundo regime de quimioterapia compreende pa- clitaxel.

A invenção fornece métodos compreendendo administrar a um indivíduo com câncer metastático ou não-metastático, em seguida à cirurgia 15 definitiva, uma quantidade eficaz de um antagonista específico de VEGF, por exemplo, bevacizumab. Em uma modalidado método também inclui o uso de pelo menos um agente quimioterápico. O método pode ser usado para es- tender DFS ou OS no indivíduo. Em uma modalidade, o DFS ou o OS é ava- liado durante 2 a 5 anos após o início do tratamento. Em uma modalidade, o 20 indivíduo está livre de doença durante pelo menos 1 a 5 anos após trata- mento.

Em um aspecto, o método compreende as seguintes etapas: a) um primeiro estágio compreendendo uma pluralidade de ciclos de tratamen- to em que cada ciclo compreende administrar ao indivíduo uma quantidade 25 eficaz de um antagonista específico de VEGF, por exemplo, bevacizumab, e pelo menos um agente quimioterápico em um intervalo predeterminado; e b) um segundo estágio compreendendo uma pluralidade de ciclos de manuten- ção em que cada ciclo compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um antagonista específico de VEGF, por exemplo, bevacizumab, 30 sem qualquer agente quimioterápico em um intervalo predeterminado; em que os primeiro e segundo estágios combinados permanecem durante pelo menos um ano após o tratamento pós-operativo inicial. Em uma modalidade, o primeiro estágio compreende uma primeira pluralidade de ciclos de trata- mento em que um antagonista específico de VEGF, por exemplo, bevacizu- mab, e um primeiro regime de quimioterapia são administrados, seguido por uma segunda pluralidade de ciclos de tratamento em que um antagonista 5 específico de VEGF, por exemplo, bevacizumab, e um segundo regime de quimioterapia são administrados. Se o câncer a ser tratado para câncer de mama, por exemplo, o primeiro regime de quimioterapia compreende doxo- rubicina e ciclofosfamida e o segundo regime de quimioterapia compreende paclitaxel.

Em certas modalidades de cada um dos aspectos acima, o an-

tagonista específico de VEGF é um composto que liga-se a VEGF ou reduz a expressão de VEGF ou atividade biológica. O antagonista específico de VEGF pode ser qualquer um dos seguintes compostos exemplares: um poli- peptídeo que especificamente se liga a VEGF, uma ribozima específica de 15 VEGF, um pepticorpo específico de VEGF, um oligômero de nucleobase an- tissentido complementar a pelo menos uma porção de uma molécula de áci- do nucléico codificando um polipeptídeo de VEGF, uma pequena molécula de RNA complementar a pelo menos uma porção de uma molécula de ácido nucléico codificando um polipeptídeo de VEGF, ou um aptâmero. O polipep- 20 tídeo que especificamente se liga a VEGF pode ser uma proteína receptora de VEGF solúvel, ou fragmento de ligação de VEGF do mesmo, ou uma pro- teína receptora de VEGF quimérica tais como Flt-1/Fc, KDR/Fc, ou Flt/KDR/Fc. O polipeptídeo que especificamente se liga a VEGF pode tam- bém ser um anticorpo anti-VEGF ou fragmento de ligação a antígeno do 25 mesmo. O anticorpo anti-VEGF, ou fragmento de ligação a antígeno do mes- mo, pode ser um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticor- po totalmente humano, ou um anticorpo humanizado. Anticorpos exemplares úteis nos métodos da invenção incluem bevacizumab (AVASTIN®), G6-31, B20-4.1, e fragmentos do mesmo. O anticorpo, ou fragmento de ligação a 30 antígeno do mesmo, pode também ser um anticorpo que não possui uma porção Fe, um F(ab')2, um Fab, ou uma estrutura Fv.

Dependendo do tipo e severidade da doença, dosagens preferi- I 14

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das para o antagonista específico de VEGF, por exemplo, bevacizumab, são descritos aqui e podem variar de cerca de 1 μg/kg a cerca de 50 mg/kg, mais preferivelmente de cerca de 5 mg/kg a cerca de 15 mg/kg, incluindo porém não-limitado a 7,5 mg/kg ou 10 mg/kg. A frequência de administração variará dependendo do tipo e severidade da doença. Para administrações repetidas durante diversos dias ou maior, dependendo da condição, o tratamento é prolongado até o câncer ser tratado ou o efeito terapêutico desejado ser ob- tido, como avaliado pelos métodos descritos aqui ou conhecidos na técnica. Em um exemplo, o antagonista específico de VEGF (por exemplo, um anti- corpo) da invenção é administrado uma vez a cada semana, cada duas se- manas, ou a cada três semanas, em uma faixa de dose de cerca de 5 mg/kg a cerca de 15 mg/kg, incluindo porém não-limitado a 7,5 mg/kg ou 10 mg/kg. Entretanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis. O progresso da terapia da invenção é facilmente monitorada por ensaios e técnicas conven- cionais.

Em modalidades adicionais de cada um dos aspectos acima, o antagonista específico de VEGF é administrado local ou sistemicamente (por exemplo, oral ou intravenosamente). Em uma modalidade, o tratamento com um antagonista específico de VEGF é prolongado até o paciente ter ficado 20 livre do câncer durante um período de tempo selecionado do grupo que con- siste em, 1 ano, 2 anos, 3 anos, 4 anos 5 anos, 6 anos, 7 anos, 8 anos, 9 anos, 10 anos, 11 anos, e 12 anos.

Embora o indivíduo possa ser tratado de diversas maneiras dife- rentes antes de, durante, ou após a administração do antagonista específico 25 de VEGF, em urna modalidade de cada um dos aspectos da invenção, o in- divíduo é tratado sem cirurgia ou quimioterapia. Em outras modalidades, tra- tamento com o antagonista específico de VEGF é uma monoterapia ou uma monoterapia durante a duração do antagonista específico de Período de tra- tamento de VEGF, como avaliado pelo médico ou descrito aqui.

Em outras modalidades, tratamento com o antagonista específi-

co de VEGF é em combinação com uma terapia anticâncer adicional, inclu- indo porém não-limitado a, cirurgia, terapia de radiação, quimioterapia, tera- pia de diferenciação, bioterapia, terapia imune, um inibidor de angiogênese, e um composto antiproliferativo. Tratamento com o antagonista específico de VEGF pode também incluir qualquer combinação dos tipos acima de regi- mes terapêuticos. Além disso, agentes citotóxicos, agentes antiangiogênicos 5 e antiproliferativos podem ser usados em combinação com o antagonista específico de VEGF. Em uma modalidade, a terapia anticâncer é quimiote- rapia. Por exemplo, o agente quimioterápico é selecionado de, por exemplo, agentes de alquilação, antimetabólitos, análogos de ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina e inibidores relacionados, alcalóides vinca, 10 epipodopilotoxinas, antibióticos, L-Asparaginase, inibidores de topoisomera- se, interferons, complexos de coordenação de platina, ureia substituída po- rantracenodiona, derivados de metil hidrazina, supressores adrenocorticais, adrenocorticosteroides, progestinas, estrogênios, antiestrogênio, androgê- nios, antiandrogênio, análogo de hormônio de liberação de gonadotropina, 15 etc. Em alguns aspectos, o agente quimioterápico e o antagonista específico de VEGF são administrados concomitantemente.

Nas modalidades que incluem uma terapia anticâncer adicional, o indivíduo pode ser também tratado com a terapia anticâncer adicional an- tes, durante (por exemplo, simultaneamente), ou após a administração do 20 antagonista específico de VEGF. Em uma modalidade, a terapia anticâncer é quimioterapia que inclui a administração de irinotecan, fluorouracila, Ieucovo- rina, gencitabina ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o antagonista específico de VEGF, administrado ou sozinho ou com uma tera- pia anticâncer, pode ser administrado como terapia de manutenção. Em um 25 aspecto, a terapia anticâncer para o câncer de próstata, câncer ovariano e câncer de mama pode ser terapia de hormônio. Em uma modalidade exem- plar, o antagonista específico de VEGF é administrado em combinação com uma terapia anticâncer que não inclui um anticorpo anti-Her2, ou fragmento ou derivado do mesmo (por exemplo, o anticorpo Herceptin®).

Os métodos da invenção são particularmente vantajosos no tra-

tamento e prevenção de tumores de estágio precoce, desse modo prevenin- do o progresso para os estágios mais avançados resultando em uma redu- I

ção em morbidez e mortalidade associada com câncer avançado. Os méto- dos da invenção são também vantajosos na prevenção da recorrência de um tumor ou o novo crescimento de um tumor, por exemplo, um tumor inativo que persiste após a remoção do tumor primário, ou na redução ou preven- 5 ção da ocorrência ou proliferação de micrometástases.

Para os métodos da invenção, o câncer pode ser um tumor sóli- do, por exemplo, tal como, câncer de mama, câncer colorretal, câncer retal, câncer de pulmão, câncer de célula renal, um glioma (por exemplo, astroci- toma anaplásico, oligoastrocitoma anaplásico, oligodendroglioma anaplásico, 10 glioblastoma multiforme), câncer de rim, câncer de próstata, câncer do fíga- do, câncer pancreático, sarcoma de tecido mole, carcinoma carcinoide, cân- cer de cabeça e pescoço, melanoma, e câncer ovariano. Em uma modalida- de, o câncer é um câncer gastrointestinal.

Em modalidades adicionais de cada um dos aspectos acima da invenção, o antagonista específico de VEGF é administrado em uma quanti- dade ou durante um tempo (por exemplo, durante um regime terapêutico particular em tempo prolongado) para reduzir (por exemplo, em 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais) o número de células de câncer no tumor ou câncer, incluindo, porém não-limitado a cânceres benig- nos, pré-cancerosos, ou não-metastáticos; para reduzir o tamanho do tumor, pólipo, ou adenoma; para reduzir a carga do tumor; para inibir (isto é, para diminuir em alguma extensão e/ou interromper) a infiltração de célula de câncer em órgãos periféricos; para reduzir secreção hormonal; para reduzir o número de pólipos; para reduzir densidade de vaso no tumor ou câncer incluindo, porém não-limitado a cânceres benignos, pré-cancerosos, ou não- metastáticos; para inibir metástase de tumor; para reduzir ou inibir o cresci- mento de tumor ou proliferação de célula de tumor; para reduzir ou prevenir o crescimento de um tumor inativo; para reduzir ou prevenir o crescimento ou proliferação de uma micrometástase; para reduzir ou prevenir o novo crescimento de um tumor após tratamento ou remoção; para aumentar ou estender o DFS ou OS de um indivíduo suscetível a ou diagnosticado com um tumor benigno, pré-canceroso, ou não-metastático; e/ou para aliviar em alguma extensão um ou mais dos sintomas associados com o câncer. Em um exemplo, a sobrevivência é medida como DFS ou OS no indivíduo, em que o DFS ou o OS é avaliado durante 2 a 5 anos após o início do tratamen- to. Em algumas modalidades adicionais, o antagonista específico de VEGF é

5 usado para prevenir a ocorrência ou reocorrência de câncer no indivíduo. Em um exemplo, a prevenção de recorrência de câncer é avaliada em uma população de indivíduos após cerca de quatro anos para confirmar que ne- nhuma recorrência de doença ocorreu em pelo menos cerca de 80% da po- pulação. Em outro exemplo, o antagonista específico de VEGF usado para 10 reduzir a probabilidade de recorrência de um tumor ou câncer em um indiví- duo. Em um exemplo, a recorrência de câncer é avaliada em cerca de 3 a- nos, em que recorrência de câncer é diminuída em pelo menos cerca de 50% em comparação aos indivíduos tratados com quimioterapia apenas.

Os métodos da invenção podem também incluir a monitoração do indivíduo quanto à recorrência do câncer ou tumor.

Outras caráterísticas e vantagens da invenção serão evidentes a partir da seguinte Descrição Detalhada, dos desenhos e das reivindicações. Breve Descrição dos Desenhos

Figuras 1A-1F são uma série de fotomicrógrafos mostrando a 20 expressão de VEGF-A em Apcmin/+ adenomas e vilo normal. Hibridização in situ com sonda VEGF-A em um adenoma intestinal do intestino delgado (Fi- guras 1A, 1D) e grosso (Figuras 1B, 1E), bem como vilos normais (Figuras 1C, 1F) de um camundongo Apcmin/+ de 14 semanas de idade demonstra expressão de VEGF-A nas células epiteliais (setas) e estromais (pontas de 25 seta). Campo brilhante; Figuras 1A-1C, campo escuro; Figuras 1D-1F.

Figuras 2A-2F são uma série de gráficos mostrando que a inibi- ção de VEGF-A reduz a carga de tumor e estende a sobrevivência. Figura 2A é um gráfico mostrando a carga de tumor de camundongos individuais no grupo. A carga de tumor é indicada por barras do valor maior para o menor 30 de carga de tumor. As cruzes brancas indicam médias de grupos. *P<0.008, **p<5.3x 10'5. N designa o número de animais. Figura 2B é uma série de gráficos mostrando a distribuição de tumores por diâmetro e como percentu- al do número total de tumores. N designa o número de tumores em um gru- po. A Figura 2C é uma série de gráficos mostrando a sobreposição de tarpa- nho das frequências de tumor após 3 semanas de tratamento (topo) e após

6 semanas de tratamento (meio). O gráfico de base mostra uma sobreposi- ção de de frequência de tamanho de tumor em comparação ao dia 0 (base). As barras verticais ilustram o tamanho menor ou igual de cujo tumor a fre- quência é maior em animais tratados com mAb G6-31; 1 mm em grupo de tratamento de 3 semanas e 1,2 mm de tratamento de 6 semanas. A Figura 2D é um gráfico mostrando o diâmetro médio de tumor plotado contra a Ioca- lização intestinal. N designa o número de tumores por grupo na primeira, segunda, terceira, e quarta parte intestinal, respectivamente. O grupo de dia 0 continha doze animais, outros grupos dez. S; estômago, C; ceco, R; reto. As barras representam SEM. *P<1,0 x 10'10, **p<0,002 em comparação com mAb G6-31, 3 ou 6 semanas. Figura 2E é um gráfico mostrando o diâmetro médio de tumor de catorze Apcmm/+;ViIIin-Cre (colunas pretas) e Apc- m|n/+;vegFlox; Camundongos Villin-Cre (colunas cinzas) apresentados em uma ordem descendente. As barras representam o desvio padrão (SD). Fi- gura 2F é um gráfico mostrando o Kaplan-Meier de camundongos tratados com mAb G6-31 (linha cinza) - ou IgG de controle (linha preta). A seta aberta designa a duração dos tratamentos. A sobrevivência média é indicada com setas cinzas. *P<2.4 x 10‘3. N designa o número de camundongos em um grupo.

As Figuras 3A-3L mostram os efeitos de tratamento anti-VEGF-A na alteração da morfologia de tumor porém não o índice proliferativo. As Fi- 25 guras 3A-3B são fotomicrógrafos de um segmento jejunal de intestino delga- do manchado de azul de metileno. As Figuras 3C-3D são fotomicrógrafos mostrando imagens de baixa magnificação de uma seção de jejuno man- chada de H&E. As Figuras 3E-3F são fotomicrógrafos mostrando imagens de alta magnificação de uma seção de tumor de jejuno manchada de H&E. 30 As Figuras 3G-3J são fotomicrógrafos mostrando manchamento imuno- histoquímico com anticorpo Ki-67 de tecido de tumor e normal mucosa. Con- tramanchamento com H&E. Figura 3K é um gráfico mostrando o índice proli- ferativo expresso como percentual de núcleos positivos para Ki-67 relativo ao número total de núcleos. As barras representam SEM. A Figura 3L é uma análise de mancha do oeste de Iisados mucosais normais de animais trata- dos com IgG de controle (N1-N4) ou mAb G6-31 (N5-N8). Lisados de tumor 5 de animais tratados com IgG de controle (T1-T4) ou mAb G6-31 (T5-T8).

As Figuras 4A-4C mostram a densidade de área de vaso de tu- mor reduzida em tratamento de mAb G6-31. A Figuras 4A-4B são imagens confocais de seções de 80 pm de manchamento imuno-histoquímico de tu- mores de jejuno. Células endoteliais Verde - CD31; células epiteliais azul - 10 E-caderina; actina de músculo liso vermelha. A Figura 4C é um gráfico mos- trando a densidade vascular expresso como área percentual positiva para CD31 relativa à área de tumor total analisada. As barras representam SEM; n designa o número de tumores analisados.

As Figuras 5A-5D são uma série de gráficos mostrando trata- mento anti-VEGF-A inibe crescimento de tumor pituitário. Figura 5A é um gráfico mostrando o volume de tumor médio de grupos tratados com IgG de controle (linha preta) e mAb G6-31 (linha cinza) em 9, 25, 39, 53, e 67 dias de tratamento. As barras representam SEM. N designa o número de camun- dongos no grupo. A Figura 5B é um gráfico mostrando os volumes de tumor de camundongos individuais tratados com IgG de controle (linhas sólidas) ou mAb G6-31 (linhas quebradas). Sete camundongos foram eutanizados antes do término do estudo devido a saúde insatisfatória (linhagens terminando antes do tempo de 67 dias). A Figura 5C é um gráfico mostrando o tumor a sobrevivência de IgG de controle livre de duplicação (linha preta) e grupos tratados com mAb G6-31 (linha cinza) avaliados a 9, 25, 39, 53, e 67 dias após o início do tratamento. A Figura 5D é um gráfico mostrando medições de volume de tumor de transplantes de tumor de pituitária subcutâneos tra- tacos com IgG de controle (linha preta) e mAb G6-31 (linha cinza) em 1, 7,

14, 21, 28, e 35 dias de tratamento. As barras representam SEM. N designa o número de camundongos no grupo.

A Figura 6 é um gráfico mostrando que a glândula pituitária e adenomas pituitários Men1+/' expressam VEGF-A1 VEGFR-1, e VEGFR-2. A I

expressão relativa de VEGF-A, VEGFR-1, e VEGFR-2 é mostrada para a glândula pituitária do tipo selvagem (coluna preta), tecido de glândula pituitá- ria não tumorosa de Men1+/' (cinza), adenomas pituitários não tratados pe- quenos, tumores pituitários tratados com IgG de controle (vermelho), e trata- 5 dos com mAb G6-31 (azul) de camundongos Men1+/'. As barras representam SEM. Ns; não significante.

A Figura 7 é uma série de imagens de MRI de tumores pituitários representativos camundongos Men1+/'. Seções coronais com adenomas pi- tuitários de camundongos tratados com IgG de controle e mAb G6-31 nos 9, 10 39, e 67 dias de tratamento são mostrados. Para o dia nove, as bordas do adenoma pituitários foram realçadas com asteriscos amarelos. O volume do tumor tratado com IgG de controle foi 23,2, 55,9, e 142,0 mm3, e aquele do tumor tratado por mAb G6-31 foi de 18,9, 27,2, e 35,3 mm3 em 9, 39, e 67 dias após o início do tratamento, respectivamente.

As Figuras 8A-8H são uma série de imagens mostrando exame

histológico de tumores pituitários e pancreáticos de camundongos Men1+/". As Figuras 8A-8B mostram tumores pituitários manchados com H&E e as Figuras 8E-8F mostram tumores pancreáticos manchados com H&E. As Fi- guras 8C-8D mostram manchamento de imuno-histoquímica de tumores pi- 20 tuitários in situ com marcador panendotelial MECA-32 e as Figuras 8G-8H mostram manchamento de imuno-histoquímica de tumores pancreáticos in situ com marcador panendotelial MECA-32. A Figura 81 é um gráfico mos- trando o resultado de ensaio de densidade vascular em tumores pituitários e a Figura 8J é um gráfico mostrando o resultado de ensaiar a densidade vas- 25 cular em tumores pancreáticos em anrmais tratados com IgG de controle e anti-VEGF. As barras representam SD. Ns = não significante.

As Figuras 9A-9D são uma série de imagens mostrando que tu- mores pituitários de camundongos Men1+/' e transplantes de tumor pituitário mancham positivo para prolactina. Manchamento de imuno-histoquímica é 30 mostrado para tumores pituitários in situ (Figuras 9A-9B) e transplantes de tumor pituitário subcutâneo (Figuras 9C-9D) com anticorpo anti-prolactina. As Figuras 9E e 9F são imagens mostrando que tumor pituitário transplanta- do adjacente à glândula mamária mostram mudandas secretoras induzidas por prolactina (lado esquerdo da imagem).

As Figuras 10A-10D mostram que os níveis de prolactina de so- ro e hormônio de crescimento são elevados em camundongos com tumores

5 pituitários e transplantes de tumor pituitário. A Figura 10A é um gráfico mos- trando o nível de PRL de soro (ng/ml) plotado contra volume de tumor pitui- tário (mm3) de 19 camundongos Men1+/' transportando tumor, não tratados, ilustrando correlação positiva. A Figura 10B é um gráfico mostrando o nível de PRL de soro plotado contra o volume de tumor pituitário de camundongos 10 Men1+/' tratados com IgG de controle (triângulos pretos) e tratados com mAb G6-31 (esferas cinza) no término do estudo. As Figuras 10C-10D são gráfi- cos mostrando os níveis de prolactina de soro (C) e hormônio de crescimen- to (D) de camundongos com transplantes pituitários de adenoma no dia 1 e dia 35 de tratamento.

Figura 11 um gráfico mostrando os efeitos de tratamento anti-

VEGF ("intervenção") durante o progresso de tumor de estágio precoce no modelo Rip-TpAg de camundongo de desenvolvimento de tumor de ilhota pancreática. O gráfico mostra o decréscimo em angiogênese de tumor como avaliado pelo número médio de ilhotas angiogênicas após o tratamento com 20 um anticorpo anti-VEGF em 9 a 11 semanas quando em comparação com tratamento com um anticorpo monoclonal de controle pareado com o isótipo.

As Figuras 12A e 12B mostram o resultado de experiências de regressão onde nenhuma diferença significante em carga de tumor ou so- brevivência foi detectada entre tratamento com um anticorpo anti-VEGF e 25 um anticorpo monoclonal pareado com isótipo no modelo Rip-TpAg de ca- mundongo de desenvolvimento de tumor de ilhota pancreática. A Figura 12A é um gráfico mostrando' a carga do tumor em camundongos tratados com um anticorpo anti-VEGF quando em comparação com aqueles tratados com um anticorpo monoclonal de controle pareado com isótipo. A Figura 12B é 30 um gráfico mostrando a sobrevivência em tempo prolongado de camundon- gos tratados com um anticorpo anti-VEGF quando em comparação com a- queles tratados com um anticorpo monoclonal de controle pareado com isó- tipo.

A Figura 13 é um gráfico mostrando a eficácia de terapia anti- VEGF prolongada para suprimir o novo crescimento de tumores seguindo citorredução com taxanos ou gencitabina.

5 As Figuras 14A-14D são uma série de imagens mostrando que

adenoma pituitários não tratados primários (Figura 14A, linha pontilhada a- cima) são invariavelmente e pouco positivos quanto ao hormônio de cresci- mento em comparação com a pituitária anterior normal adjacente (linha pon- tilhada abaixo). Um de quatro tumores de pituitária transplantados (tratados 10 com IgG de controle) foi pouco positivo quanto ao hormônio de crescimento (Figura 14B). Tumores de pituitária primários de camundongos tratados com mab G6-31 (Figura 14C) ou IgG de controle (Figura 14D) são focalmente positivos quanto ao hormônio de crescimento.

Descrição Detalhada I. I. Definições

O termo "VEGF" ou "VEGF-A” é usado para referir-se ao fator de crescimento de célula endotelial vascular humano de aminoácido 165 e fato- res de crescimento de célula endotelial vascular humano de aminoácidos 121, 145, 189 e 206 relacionados, como descrito, por exemplo, por Leung e 20 outro, Science, 246:1306 (1989), e Houck e outro, Mol. Endocrin., 5:1806 (1991), juntamente com as formas alélicas e processadas de ocorrência na- tural dos mesmos. VEGF-A é parte de uma família de gene incluindo VEGF- B, VEGF-C, VEGF-D1 VEGF-E, VEGF-F, e PIGF. VEGF-A primariamente liga-se a duas tirosina cinases receptoras de alta afinidade, VEGFR-1 (Flt-1) 25 e VEGFR-2 (Flk-1/KDR), o último sendo o principal transmissor de sinais mitogênicos de célula endotelial vascular de VEGF-A. Adicionalmente, a neurofilina-1 foi identificada como um receptor para isoformas de VEGF-A de ligação à heparina, e pode desempenhar um papel no desenvolvimento vas- cular. O termo "VEGF" ou "VEGF-A" também refere-se aos VEGFs de espé- 30 cies não humanas tais como camundongo, rato ou primata. Algumas vezes o VEGF da espécie específica é indicado por termos tais como hVEGF para VEGF humano ou mVEGF para VEGF murino. O termo "VEGF" é também usado para referir-se à formas truncadas ou fragmentos do polipeptídeo compreendendo aminoácidos 8 a 109 ou 1 a 109 do fator de crescimento de célula endotelial vascular humano de aminoácido 165. Referência a quais- quer tais formas de VEGF podem ser identificadas no presente pedido, por 5 exemplo, por "VEGF (8-109)," "VEGF (1-109)" ou "VEGF165." As posições de aminoácido para um VEGF nativo "truncado" são numeradas como indicado na seqüência de VEGF nativo. Por exemplo, a posição de aminoácido 17 (metionina) no VEGF nativo truncado é também posição 17 (metionina) em VEGF nativo. O VEGF nativo truncado tem afinidade de ligação para os re- 10 ceptores KDR e Flt-1 comparáveis ao VEGF nativo.

O termo "variante de VEGF" como aqui usado refere-se a um polipeptídeo de VEGF que inclui uma ou mais mutações de aminoácido na seqüência de VEGF nativa, opcionalmente, a uma ou mais mutações de a- minoácido incluem substituição(ões) de aminoácido. Para os propósitos de 15 designação abreviada de variantes de VEGF descritas aqui, observa-se que os números referem-se à posição do resíduo de aminoácido ao longo da se- qüência de aminoácido do VEGF nativo putativo (fornecido em Leung e ou- tro, supra e Houck e outro, supra.).

Um polipeptídeo de "seqüência nativa" compreende um polipep- 20 tídeo tendo a mesma seqüência de aminoácido como um polipeptídeo natu- ralmente derivado. Desse modo, um polipeptídeo de seqüência nativa pode ter a seqüência de aminoácido de polipeptídeo de ocorrência natural de qualquer mamífero. Tal polipeptídeo de seqüência nativa pode ser isolado da natureza ou pode ser produzido por métodos recombinantes ou sintéticos. O 25 termo polipeptídeo de "seqüência nativa" especificamente abrange formas secretadas ou truncadas de ocorrência natural do polipeptídeo (por exemplo, uma seqüência de domínio extracelular), formas variantes de ocorrência na- tural (por exemplo, formas alternativamente unidas) e variantes do polipeptí- deo alélicas de ocorrência não natural.

Uma "variante" de polipeptídeo significa um polipeptídeo biologi-

camente ativo tendo pelo menos cerca de 80% de identidade de seqüência de aminoácido com o polipeptídeo de seqüência nativa. Tais variantes inclu- I

em, por exemplo, polipeptídeos em que um ou mais resíduos de aminoácido são adicionados, ou deletados, na terminal N ou C do polipeptídeo. Ordinari- amente, uma variante terá pelo menos cerca de 80% de identidade de se- qüência de aminoácido, mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% de 5 identidade de seqüência de aminoácido, e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% de identidade de seqüência de aminoácido com o poli- peptídeo de seqüência nativa.

"Atividade biológica de VEGF" inclui ligação a qualquer receptor de VEGF ou qualquer atividade de sinalização de VEGF, tal como a regula- ção tanto de angiogênese e vasculogênese normais quanto anormais (Ferra- ra e Davis-Smyth (1997) Endocrine Rev. 18:4-25; Ferrara (1999) J. Moi Med. 77:527-543); promoção de angiogênese e vasculogênese embriônica (Carmeliet e outro, (1996) Nature 380:435-439; Ferrara e outro, (1996) Natu- re 380:439-442); e modulação da proliferação de vaso sanguíneo cíclico no trato reprodutivo feminino e para crescimento ósseo e formação de cartila- gem (Ferrara e outro, (1998) Nature Med. 4:336-340; Gerber e outro, (1999) Nature Med. 5:623-628). Além de ser um fator angiogênico em angiogênese e vasculogênese, VEGF, como um fator de crescimento pleiotrópico, exibe múltiplos efeitos biológicos em outros processos fisiológicos, tais como so- brevivência celular endotelial, permeabilidade e vasodilatação de vaso, qui- miotaxia de monócito e influxo de cálcio (Ferrara e Davis-Smyth (1997), su- pra e Cebe-Suarez e outro, Cell. Mol. Life Sei. 63:601-615 (2006)). Além dis- so, recentes estudos reportaram efeitos mitogênicos de VEGF sobre alguns tipos de célula não endotelial, tais como células epiteliais de pigmento reti- nal, células de duto pancreático, e células Schwann. Guerrin e outro, (1995) J. Ceil Physioi 164:385-394; Oberg-Welsh e outro, (1997) Mol. Cell. Endo- crinol. 126:125-132; Sondell e outro, (1999) J. Neurosci. 19:5731-5740.

Um "antagonista específico de VEGFt" é descrito aqui na Seção

III.

Um "anticorpo anti-VEGF" é um anticorpo que se liga ao VEGF

com suficiente afinidade e especificidade. O anticorpo selecionado normal- mente terá uma afinidade de ligação suficientemente forte para VEGF, por exemplo, o anticorpo pode ligar-se a hVEGF com um valor de Kd entre 100 nM-1 pM. As afinidades de anticorpo podem ser determinadas por um ensaio com base em ressonância de plasmônio de superfície (tal como o ensaio BIAcore como descrito na Publicação de Pedido PCT n° W02005/012359);

5 ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA); e ensaios de competição (por exemplo, RIA's), por exemplo. Em certas modalidades, o anticorpo anti- VEGF da invenção pode ser usado como um agente terapêutico em alveja- mento e interferência com doenças ou condições em que a atividade de VEGF está envolvida. Além disso, o anticorpo pode ser submetido a outros 10 ensaios de atividade biológica, por exemplo, a fim de avaliar sua eficácia como um terapêutico. Tais ensaios são conhecidos na técnica e dependem do antígeno alvo e uso pretendido para o anticorpo. Exemplos incluem o en- saio de inibição HUVEC (como descrito nos exemplos abaixo); ensaios de inibição de crescimento de célula de tumor (como descrito no WO 89/06692, 15 por exemplo); citotoxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC) e en- saios de citotoxicidade mediada por complemento (CDC) (Patente dos Esta- dos Unidos n° 5.500.362); e atividade agonística ou ensaios de hematopoie- se (veja WO 95/27062). Um anticorpo anti-VEGF usualmente não se ligará a outros homólogos de VEGF tais como VEGF-B ou VEGF-C, nem outros fato- 20 res de crescimento tais como PIGF, PDGF ou bFGF. Informação adicional considerando anticorpos anti-VEGF pode ser encontrada na seção III, A.

Em toda a presente especificação e reivindicações, a numeração dos resíduos em uma cadeia pesada de imunoglobulina é aquela do índice EU como em Kabat e outro, Sequences de proteínas de Immunological Inte- 25 rest, 5a Edição Public Health Service, National Institutes de Health, Betesda, Md. (1991), expressamente incorporado aqui por referência. O "EU index as in Kabat" refere-se à numeração de resíduo do anticorpo EU de IgGI huma- no.

O termo "anticorpo" é usado no sentido mais amplo e especifi- camente abrange anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de tamanho natural), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), e fragmentos de anticorpo contanto que I

eles exibam a atividade biológica desejada.

O "Kd" ou "valor Kd" de acordo com esta invenção está em uma modalidade avaliada por um ensaio de ligação de VEGF radiorrotulado (RIA) realizado com a versão Fab do anticorpo e uma molécula de VEGF como 5 descrito pelo seguinte ensaio que avalia a afinidade de ligação de solução de Fabs para VEGF equilibrando Fab com uma concentração mínima de VEGF (109) rotulado por (125I) na presença de uma série detitulação de VEGF não rotulado, em seguida capturando o VEGF preso com uma placa revestida por anticorpo anti-Fab (Chen, e outro, (1999) J. Mol Biol 293:865- 10 881). Para estabelecer condições para o ensaio, placas de microtítulo (Dy- nex) são revestidas durante a noite com 5 ug/ml de um anticorpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) em 50 mM de carbonato de sódio (pH 9,6), e subse- quentemente bloqueadas com 2% (p/v) albumina de soro bovino em PBS durante duas a cinco horas em temperatura ambiente (aproximadamente 15 23°C). Em uma placa não adsorvente (Nunc #269620), 100 pM ou 26 pM [125|]VEGF(109) são misturados com diluições seriais de um Fab de interes- se, por exemplo, Fab-12 (Presta e outro, (1997) Cancer Res. 57:4593-4599). O Fab de interesse é em seguida incubado durante a noite; entretanto, a incubação pode continuar durante 65 horas para assegurar que o equilíbrio 20 seja alcançado. A seguir, as misturas são transferidas para a placa de captu- ra para incubação em temperatura ambiente durante uma hora. A solução é em seguida removida e a placa lavada oito vezes com Tween-20 a 0,1% em PBS. Quando as placas secaram, 150 ul/cavidade de cintilante (MicroScint- 20; Packard) são adicionados, e as placas são contadas em uma registrado- 25 ra gama Topcount (Packard) durante dez minutos. As concentrações de ca- da Fab que fornece menos do que ou igual a 20% de ligação máxima são escolhidas para uso em ensaios de ligação competitiva. De acordo com ou- tra modalidado Kd ou valor Kd é medido usando ensaios de ressonância de plasmônio de superfície usando a BIAcore®-2000 ou a BIAcore®-3000 (BIA- 30 core, Inc., Piscataway, NJ) a 25°C com hVEGF imobilizado (8-109) CM5 chips em ~10 unidades de resposta (RU). Em síntese, chips biosensores de dextrana carboximetilados (CM5, BIAcore Inc.) são ativados com cloridrato de /V-etil-Λ/- (3-dimetilaminopropil)-carbodi-imida (EDC) e N- hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fabricante. VEGF humano é diluído com 10 mM de acetato de sódio, pH 4,8, em 5 ug/ml (-0,2 uM) antes da injeção em uma taxa de fluxo de 5 ul/minuto para obter apro- 5 ximadamente 10 unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Em se- guida à injeção de human VEGF, 1M de etanolamina é injetado para bloque- ar grupos não reagidos. Para avaliações cinéticas, diluições seriais duplas de Fab (0,78 nM a 500 nM) são injetadas em PBS com 0,05% de Tween 20 (PBST) a 25°C em uma taxa de fluxo de aproximadamente 25 ul/min. Taxas 10 de associação (kon) e taxas de dissociação (k0ff) são calculadas usando um modelo de ligação Langmuir um a um, simples (BIAcore Evaluation Software versão 3,2) por ajuste simultâneo o sensorgrama de associação e dissocia- ção. A constante de dissociação de equilíbrio (Kd) foi calculada como a rela- ção kotf/kon. Veja, por exemplo, Chen1 Y., e outro, (1999) J. Mol Biol 293:865- 15 881. Se a classificação exceder 106 M'1 S'1 pelo ensaio de ressonância de plasmônio de superfície acima, então a classificação deve ser determinada usando uma técnica de saciamento fluorescente que medo aumento ou de- créscimo em intensidade de emissão de fluorescência (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, 16 nm passagem de faixa) a 25°C de 20 nM de anticorpo 20 anti-VEGF (Fab form) em PBS, pH 7,2, na presença de concentrações cres- centes de forma curta de VEGF humano (8-109) ou VEGF de camundongo como medido em um espectrômetro, tal como um espectrofotômetro equipa- do com interrompedor de fluxo (Aviv Instruments) ou um espectrofotômetro SLM-Aminco série 8000 (TermoSpectronic) com uma cubeta agitada.

Um anticorpo "de bloqueio" ou um anticorpo "antagonista" é um

que inibe ou reduz a atividade biológica do antígeno ao qual liga-se. Por e- xemplo, um antagonista específico de anticorpo de VEGF liga-se a VEGF e inibe a capacidade de VEGF induzir a proliferação celular endotelial vascu- lar. Anticorpos de bloqueio ou anticorpos antagonistas preferidos inibem completamente a atividade biológica do antígeno.

A menos que de outro modo indicado, a expressão "anticorpo multivalente" é usada em toda esta especificação para denotar um anticorpo I 28

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compreendendo três ou mais sítios de ligação de antígeno. Por exemplo, o anticorpo multivalente é construído para ter três ou mais sítios de ligação de antígeno e geralmente não é um anticorpo de IgM ou IgA de seqüência nati- va.

5 Um fragmento "Fv" é um fragmento de anticorpo que contém um

sítio de ligação e reconhecimento de antígeno completo. Esta região consis- te em um dímero de um domínio variável de uma cadeia pesada e uma leve em associação estreita, que pode ser de natureza covalente, por exemplo, em scFv. Inclui-se nesta configuração que as três CDRs de cada domínio 10 variável interagem para definir um sítio de ligação de antígeno sobre a su- perfície do dímero Vh-Vl. Coletivamente, as seis CDRs ou um subgrupo das mesmas conferem especificidade de ligação de antígeno para o anticorpo. Entretanto, mesmo um domínio variável único (ou metade de uma Fv com- preendendo apenas três CDRs específicas para um antígeno) tem a capaci- 15 dade de reconhecer e ligar-se ao antígeno, embora geralmente em uma me- nor afinidade do que o sítio de ligação inteiro.

Como aqui usado, "domínio variável de anticorpo" refere-se à porções das cadeias leve e pesada de moléculas de anticorpo que incluem seqüências de aminoácido de Regiões de Determinação de Complementari- 20 dade (CDRs; isto é, CDR1, CDR2, e CDR3), e Regiões de Estrutura (FRs). Vh refere-se ao domínio variável da cadeia pesada. Vl refere-se ao domínio variável da cadeia leve. De acordo com o métodos usado nesta invenção, as posições de aminoácido designadas para CDRs e FRs podem ser definidas de acordo com Kabat (Sequences de proteínas de Immunological Interest 25 (National Institutes de Health, Betesda, Md., 1987 e 1991)). A numeração de aminoácido de anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno é também de acordo com aquela de Kabat.

Como aqui usado, o termo "Regiões de Determinação de Com- plementaridade" (CDRs; isto é, CDR1, CDR2, e CDR3) refere-se a resíduos de aminoácido de um domínio variável de anticorpo, a presença dos quais é necessária para ligação de antígeno. Cada domínio variável tipicamente tem três regiões CDR identificadas como CDR1, CDR2 e CDR3. Cada região de determinação de complementaridade pode compreender resíduos de amino- ácido de uma "região de determinação de complementaridade" como defini- do por Kabat (isto é, aproximadamente os resíduos 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 31-35 (H1), 50-65 (H2) e 95- 5 102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Kabat e outro, Sequences de proteínas de Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, Natio- nal Institutes de Health, Betesda, MD. (1991)) e/ou aqueles resíduosde alça hipervariável (isto é, aproximadamente os resíduos 26-32 (L1), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96- 10 101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Chothia e Lesk J. MoL Biol. 196:901-917 (1987)). Em alguns casos, a região de determinação de com- plementaridade pode incluir aminoácidos tanto de uma região de CDR defi- nida de acordo com Kabat quanto uma alça hipervariável. Por exemplo, o CDRH1 da cadeia pesada de anticorpo 4D5 inclui aminoácidos 26 a 35.

"Regiões de estrutura" (a seguir FR) são aqueles domínio variá-

vel resíduos exceto os resíduos de CDR. Cada domínio variável tipicamente tem quatro FRs identificadas como FR1, FR2, FR3 e FR4. Se as CDRs são definidas de acordo com Kabat, os resíduos FR de cadeia leve são posicio- nados em cerca de resíduos 1-23 (LCFR1), 35-49 (LCFR2), 57-88 (LCFR3), 20 e 98-107 (LCFR4) e os resíduos FR de cadeia pesada são posicionados a- proximadamente nos resíduos 1-30 (HCFR1), 36-49 (HCFR2), 66-94 (HC- FR3), e 103-113 (HCFR4) nos resíduos de cadeia pesada. Se as CDRs compreenderem resíduos de aminoácido de alças hipervariáveis, os resí- duos FR de cadeia leve são posicionados aproximadamente nos resíduos 1- 25 25 (LCFR1), 33-49 (LCFR2), 53-90 (LCFR3), e 97-107 (LCFR4) os resíduos FR de cadeia leve e os de cadeia pesada são posicionados aproximadamen- te nos resíduos 1-25 (HCFR1), 33-52 (HCFR2), 56-95 (HCFR3), e 102-113 (HCFR4) nos resíduos de cadeia pesada. Em alguns casos, quando a CDR compreende aminoácidos tanto dse uma CDR como definido por Kabat 30 quanto aquelas de uma alça hipervariável, os resíduos de FR serão ajusta- dos consequentemente. Por exemplo, quando CDRH1 inclui aminoácidos H26-H35, os resíduos de FR1 de cadeia pesada estão nas posições 1-25 e I

os resíduos de FR2 estão nas posições 36-49.

O fragmento "Fab" contém um domínio variável e constante da cadeia leve e um domínio variável e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Os fragmentos de anticorpo F(ab’)2 compreendem um par de 5 fragmentos fab que são geralmente covalentemente ligados próximo de sua terminação carbóxi por cisteínas de articulação entre eles. Outros acopla- mentos químicos de fragmentos de anticorpo são também conhecidos na técnica.

Fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia curta" ou "scFv" com- 10 preendem os domínios de anticorpo Vh e VL, em que estes domínios são presentes em uma única cadeia de polipeptídeo. Geralmente o polipeptídeo Fv também compreende um Iigador de polipeptídeo entre os domínios Vh e VL, que possibilita o scFv formar a estrutura desejada para ligação de antí- geno. Para uma revisão de scFv, veja Pluckthun no Pharmacology de Anti- 15 corpos monoclonais, Vol 113, Rosenburg e Moore eds. Springer-Verlag, No- va Iorque, pp. 269-315 (1994).

O termo "diacorpos" refere-se a pequenos fragmentos de anti- corpo com dois sítios de ligação a antígeno, cujos fragmentos compreendem o domínio variável de cadeia pesada (Vh) conectado a um domínio variável 20 de cadeia leve (Vl) na mesma cadeia de polipeptídeo (VH e VL). Usando um Iigador que é bastante curto para permitir o pareamento entre os dois domí- nios sobre a mesma cadeia, os domínios são forçados a formar pares com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação a antígeno. Os diacorpos são descritos mais completamente, por exemplo, na 25 EP 404,097; WO 93/11161; e Hollinger e outro, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993).

A expressão "anticorpos lineares" refere-se aos anticorpos des- critos em Zapata e outro, Proteína Eng., 8(10): 1057-1062 (1995). Em sínte- se, estes anticorpos compreendem um par de segmentos Fd tandem (VH- 30 CH1-Vh-ChI) que, juntamente com polipeptídeos de cadeia leve complemen- tar, formam um par de regiões de ligação de antígeno. Anticorpos lineares podem ser biespecíficos ou monoespecíficos. O termo "monoclonal anticorpo" como aqui usado refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homo- gêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos exceto para possíveis mutações de ocorrência natural que podem 5 estar presente em quantidades menores. Anticorpos monoclonais são alta- mente específicos, sendo direcionados a um único sítio antigênico. Além disso, ao contrário de preparações de anticorpo convencionais (policlonais) que tipicamente incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes deeterminantes (epítopes), cada anticorpo monoclonal é direcionado para 10 uma única determinante no antígeno. O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser construído como requerendo pro- dução do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticor- pos monoclonais a serem usados de acordo com a invenção podem ser pre- 15 parados pelo método de hibridoma primeiro descrito por Kohler e outro, Na- ture 256:495 (1975), ou podem ser preparados por métodos de DNA recom- binante (veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos n° 4.816.567). Os "anticorpos monoclonais" podem também ser isolados de bibliotecas de anti- corpo de fago usando as técnicas descritas em Clackson e outro, Nature 20 352:624-628 (1991) e Marks e outro, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), por exemplo.

Os anticorpos monoclonais aqui especificamente incluem anti- corpos "quiméricos" (imunoglobulinas) em que uma porção da cadeia pesa- da e/ou leve é idêntica a ou homóloga às seqüências correspondentes em 25 anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencentes a uma clas- se ou subclasse de anticorpo particular, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico a ou homólogo às seqüências correspondentes em anticorpos de- rivados de outras espécies ou pertencentes à outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como fragmentos de tais anticorpos, contanto que eles exi- 30 bam a atividade biológica desejada (Patente dos Estados Unidos n° 4.816.567; e Morrison e outro, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:6851-6855

(1984)). As formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por e- xemplo, murino) são anticorpos quiméricos que contêm derivados se se- qüência mínima de imunoglobulina não humana. Para a maior parte, anticor- pos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) em que 5 resíduos de uma região hipervariável do receptor são substituídos por resí- duos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato, coelho ou primata não humano tendo a especificidade, afinidade, e capacidade desejadas. Em alguns casos, resí- duos de região de estrutura de Fv (FR) da imunoglobulina humana são subs- 10 tituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Estas modificações são feitas para também refinar desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo huma- nizado compreenderá substancialmente o todo de pelo menos um, e tipica- 15 mente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as alças hipervariáveis correspondem àqueles de uma imunoglobulina não hu- mana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma seqüência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcional- mente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região cons- 20 tante de imunoglobulina (Fe), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para maiores detalhes, veja Jones e outro, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann e outro, Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

Um "anticorpo humano" é um que possui uma seqüência de a- 25 minoácido que corresponde àquela de um anticorpo produzido por um hu- mano e/ou foi preparado usando quaisquer técnicas para preparação de an- ticorpos humanos como aqui descrito. Esta definição de um humano anticor- po especificamente exclui um anticorpo humanizado compreendendo resí- duos de ligação de antígeno não humano. Anticorpos humanos podem ser 30 produzidos usando várias técnicas conhecidas na arte. Em uma modalidade, o anticorpo humano é selecionado de uma biblioteca de fago, onde a biblio- teca de fago expressa anticorpos humanos (Vaughan e outro, Nature Biote- chnology 14:309-314 (1996): Sheets e outro, Proc. Natl. Acad. Sei. 95:6157- 6162 (1998)); Hoogenboom e Winter, J. Moi Bioi., 227:381 (1991); Marks e outro, J. Moi Bioi., 222:581 (1991)). Anticorpos humanos podem também ser feitos introduzindo Iocos de imunoglobulina humana em animais transgêni- cos, por exemplo, camundongos em que os genes de imunoglobulina endó- genos foram parcialmente ou completamente inativados. Em desafio, a pro- dução de anticorpo humano é observada, o que intimamente parece com o observado em humanos em todos os aspectos, incluindo redisposição de gene, montagem, e repertório de anticorpo. Este método é descrito, por e- xemplo, nas Patentes dos Estados Unidos n°s 5.545.807, 5.545.806, 5.569.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016, e nas seguintes publicações científicas: Marks e outro, Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg e outro, Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fi- shwild e outro, Nature Biotechnoiogy 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnoiogy 14: 826 (1996); Lonberg e Huszar, lntern. Rev. Immunoi 13:65-93 (1995). Alternativamente, o anticorpo humano pode ser preparado por meio de imortalização de linfócitos B humanos produzindo um anticorpo direcionado a um antígeno alvo (tal como linfócitos B podem ser recupera- dos de um indivíduo ou podem ser imunizados in vitro). Veja, por exemplo, Cole e outro, Monoclonais Antibodies e Cancer Terapia, Alan R. Liss, p. 77

(1985); Boerner e outro, J. Immunol., 147 (1):86-95 (1991); e Patente dos Estados Unidos n° 5.750.373.

Um anticorpo "maturado por afinidade" é um com uma ou mais alterações em uma ou mais CDRs do mesmo que resultam em uma melhora 25 na afinidade do anticorpo para antígeno, em comparação com um anticorpo origem que não possui aquela(s) alteração(ões). Anticorpos maturados por afinidade preferidos terão afinidades nanomolares ou mesmo picomolares para o antígeno alvo. Os anticorpos maturados por afinidade são produzidos por procedimentos conhecidos na técnica. Marks e outro, Bio/Technology 30 10:779-783 (1992) descreve a maturação por afinidade por embaralhamento de domínio de VH e VL. Mutagênese aleatória de CDR e/ou resíduos de es- trutura são descritos por: Barbas e outro, Proe Nat. Acad. Sei, USA 91:3809- t

3813 (1994); Schier e outro, Gene 169:147-155 (1995); Yelton e outro, J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson e outro, J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); e Hawkins e outro, J. MoL Biol. 226:889-896 (1992).

Um "sítio de ligação de antígeno funcional" de um anticorpo é um que é capaz de ligação a antígeno alvo. A afinidade de ligação de antí- geno do sítio de antígeno ligação não é necessariamente tão forte quanto o anticorpo origem do qual o sítio de ligação de antígeno é derivado, porém a capacidade de ligar-se ao antígeno deve ser mensurável usando qualquer um de uma variedade de métodos conhecidos para avaliar a ligação de anti- corpo a um antígeno. Além disso, a afinidade de ligação do antígeno de ca- da do sítios de ligação de antígeno de um anticorpo multivalente aqui não necessita ser quantitativamente a mesma. Para os anticorpos multiméricos aqui, o número de sítios de ligação de antígeno funcionais pode ser avaliada usando análise de ultracentrifugação como descrito no exemplo 2 da Publi- cação de Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 20050186208. De a- cordo com este método de análise, diferentes relações de antígeno alvo para anticorpo multimérico são combinadas e o peso molecular médio dos com- plexos é calculado assumindo diferentes números de sítios de ligação fun- cional. Estes valores teóricos são em comparação com os valores experi- mentais reais obtidos a fim de avaliar o número de sítios de ligação funcio- nal.

Um anticorpo tendo uma "caráterística biológica" de um anticor- po designado é um que possui uma ou mais das caráterísticas biológicas de que o anticorpo que o distingue de outros anticorpos que ligam-se ao mesmo antígeno.

A fim de avaliar quanto aos anticorpos que se ligam a um epíto- po em uma ligação de antígeno por um anticorpo de interesse, um ensaio de interbloqueio de rotina tal como aqueles descritos em Antibodies, A Labora- tory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow e David Lane (1988), pode ser realizado.

A "anticorpo dependente da espécie" é uma que tem uma afini- dade de ligação mais forte para um antígeno de uma primeira espécie mamí- fera, do que tem para um homólogo daquele antígeno de uma segunda es- pécie mamífera. Normalmente, o anticorpo dependente da espécie "liga-se especificamente" a um antígeno humano (isto é, tem um valor de afinidade de ligação (Kd) de no mais do que cerca de 1 x 10'7 M, preferivelmente não 5 mais do que cerca de 1 x 10'8 M e mais preferivelmente não mais do que cerca de 1 x 10'9 M) porém tem uma afinidade de ligação para um homólogo do antígeno de uma segunda espécie mamífera não humana que é pelo me- nos cerca de 50 vezes, ou pelo menos cerca de 500 vezes, ou pelo menos cerca de 1000 vezes, mais fraca do que sua afinidade de ligação para o an- 10 tígeno humano. O anticorpo dependente da espécie pode ser qualquer dos vários tipos de anticorpos como acima definido, porém tipicamente é um an- ticorpo humanizado ou humano.

Como aqui usado, "mutante de anticorpo" ou "variante de anti- corpo" refere-se a uma seqüência de aminoácido variante do anticorpo de- pendente da espécie em que um ou mais dos resíduos de aminoácido do anticorpo dependente da espécie foram modificados. Tais mutantes neces- sariamente têm menos do que 100% identidade de seqüência ou similarida- de com o anticorpo dependente da espécie. Em uma modalidade, o anticor- po mutante terá uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos 75% de identidade de seqüência de aminoácido ou similaridade com a seqüência de aminoácido de domínio variável de cadeia pesada ou leve do anticorpo de- pendente da espécie, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferi- velmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, e mais preferivelmente pelo menos 95%. Identidade ou similaridade com respeito a esta seqüência é definida aqui como a percentagem de resíduos de aminoá- cido na seqüência candidato que são idênticos (isto é, o mesmo resíduo) ou similar (isto é, resíduo de aminoácido do mesmo grupo com Bse em proprie- dades de cadeia lateral, veja abaixo) com os resíduos de anticorpo depen- dente da espécie, após alinhar as seqüências e introduzir lacunas, se ne- cessário, para obter a identidade de seqüência percentual máxima. Nenhu- ma das extensões, deleções ou inserções de terminal N, terminal C, ou in- ternas na seqüência de anticorpo fora do domínio variável deve ser construí- I 36

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da como afetando a identidade de seqüência ou similaridade.

Para aumentar a meia-vida do anticorpo ou polipeptídeo conten- do as seqüências de aminoácido desta invenção, ele pode unir um epítopo de ligação de receptor de salvamento ao anticorpo (especialmente um frag- mento de anticorpo), como descrito, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos n° 5.739.277. Por exemplo, uma molécula de ácido nucléico codifi- cando o epítopo de ligação de receptor de salvamento pode ser ligada em estrutura a um ácido nucléico codificando uma seqüência de polipeptídeo desta invenção de modo que a proteína de suão expressa pela molécula de ácido nucléico construída compreendo epítopo de ligação de receptor de salvamento e um seqüência de polipeptídeo desta invenção. Como aqui u- sado, o termo "epítopo de ligação de receptor de salvamento" refere-se a um epítopo da região Fc de uma molécula de IgG (por exemplo, IgGi, IgG2, lgG3, ou IgG4) que é responsável pelo aumento da meia-vida de soro in vivo da molécula de IgG (por exemplo, Ghetie e outro, Ann. Rev. Immunol. 18:739-766 (2000), Tabela 1). Anticorpos com substituições em uma região Fc do mesmo e meias-vidas de soro aumentadas são também descritos nos WO 00/42072, WO 02/060919; Shields e outro, J. Biol. Chem. 276:6591- 6604 (2001); Hinton, J. Biol. Chem. 279:6213-6216 (2004)). Em outra moda- lidade, a meia-vida de soro pode também ser aumentada, por exemplo, por ligação à outras seqüências de polipeptídeo. Por exemplo, anticorpos ou outros polipeptídeos úteis nos métodos da invenção podem ser ligados à albumina de soro ou uma porção de albumina de soro que se liga ao recep- tor de FcRn ou um peptídeo de ligação de albumina de soro, de modo que a albumina de soro se ligue ao anticorpo ou polipeptídeo, por exemplo, tais seqüências de polipeptídeo são descritas no WO 01/45746. Em uma modali- dade, o peptídeo de albumina de soro a ser ligado compreende uma se- qüência de aminoácido de DICLPRWGCLW. Em outra modalidade, a meia- vida de um Fab é aumentada por estes métodos. Veja também, Dennis e outro, J. Biol. Chem. 277:35035-35043 (2002) para seqüências de peptídeo de ligação à albumina.

Uma "proteína receptora de VEGF quimérica" é uma molécula receptora de VEGF tendo seqüências de aminoácido derivadas de pelo me- nos duas diferentes proteínas, pelo menos uma das quais é como proteína receptora de VEGF. Em certas modalidades, a proteína receptora de VEGF quimérica é capaz de ligação a, e inibe a atividade biológica de VEGF.

5 Um polipeptídeo "isolado" ou anticorpo "isolado" é um que foi

identificado e separado e/ou recuperado de um componente de seu ambien- te natural. Os componentes contaminantes de seu ambiente natural são ma- teriais que interferem com usos diagnósticos ou terapêuticos para o polipep- tídeo ou anticorpo, e podem incluir enzimas, hormônios, e outros solutos pro- 10 teináceos ou não proteináceos. Em certas modalidades, o polipeptídeo ou anticorpo será purificado (1) para mais do que 95% em peso de polipeptídeo ou anticorpo como determinado pelo método Lowry, e mais preferivelmente mais do que 99% em peso, (2) em um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de seqüência de terminal N ou interna de aminoácido pelo uso 15 de um sequenciador de xícara giratória, ou (3) para homogeneidade por SDS-PAGE sob condições de redução ou não redução usando mancha azul Coomassie ou, prata. O anticorpo ou polipeptídeo isolado inclui o polipeptí- deo ou anticorpo in situ dentro de células recombinantes visto que pelo me- nos um componente do ambiente natural do polipeptídeo não estará presen- 20 te. Ordinariamente, entretanto, anticorpo ou polipeptídeo isolado será prepa- rado por pelo menos uma etapa de purificação.

Por "fragmento" entende-se uma porção de um polipeptídeo ou molécula de ácido nucléico que contém, preferivelmente, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou mais do comprimento 25 inteiro da molécula de ácido nucléico de referência ou polipeptídeo. Um frag- mento podem contain 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou 100, 200, 300, 400, 500, 600, ou mais nucleotídeos ou 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 190, 200 aminoácidos ou mais.

"Agente antiangiogênese" ou "inibidor de angiogênese" refere-se a uma substância de pequeno peso molecular, um polinucleotídeo, um poli- peptídeo, uma proteína isolada, uma proteína recombinante, um anticorpo, ou conjugados ou proteínas de fusão do mesmo, que inibe a angiogênese, I

vasculogênese, ou permeabilidade vascular indesejável, direta ou indireta-

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mente. Deve-se entender que o agente antiangiogênese inclui aqueles agen- tes que se ligam a e bloqueiam a atividade angiogênica do fator angiogênico ou seu receptor. Por exemplo, um agente antiangiogênese é um anticorpo ou outro antagonista a um agente angiogênico como acima definido, por e- xemplo, anticorpos para VEGF-A ou para o receptor de VEGF-A (por exem- plo, receptor KDR ou receptor Flt-1), inibidores anti-PDGFR tais como Glee- vec® (Imatinib Mesylate). Agentes antiangiogênese também incluem inibido- res de angiogênese nativos, por exemplo, angioestatina, endoestatina, etc. Veja, por exemplo, Klagsbrun e D1Amais, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991); Streit e Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003) (por exemplo, a Tabela 3 lista terapia antiangiogênica em melanoma maligno); Ferrara & Ali- talo, Nature Medicine 5:1359-1364 (1999); Tonini e outro, Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (por exemplo, a Tabela 2 lista fatores antiangiogênicos ^5 conhecidos); e Sato. Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003) (por exemplo, a Tabela 1 lista agentes anti-angiogênicos usados em experiências clinicas).

"Tratamento" refere-se tanto a tratamento terapêutico quanto profilático ou medidas preventivas. Aqueles em necessidade de tratamento incluem aqueles já tendo um câncer benigno, pré-canceroso, ou não- metastático bem como aqueles em que a ocorrência ou recorrência de cân- cer deve ser prevenida.

O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade de um antagonista específico de VEGF para tratar ou prevenir uma doença ou distúrbio em um mamífero. No caso de tumores pré- 25 cancerosos, benignos, ou em estágio precoce, a quantidade terapeuticamen- te eficaz do antagonista específico de VEGF pode reduzir o número de célu- las de câncer; reduzir o tamanho do tumor primário; inibir (isto é, tornar mais lenta em alguma extensão e preferivelmente interromper) a infiltração de célula de câncer em órgãos periféricos; inibir (isto é, tornar lenta em alguma 30 extensão e preferivelmente interromper) a metástase de tumor; inibir, em alguma extensão, o crescimento de tumor; e/ou aliviar em alguma extensão um ou mais dos sintomas associados com o distúrbio. Para o tratamento de inatividade do tumor ou micrometástases, a quantidade terapeuticamente eficaz do antagonista específico de VEGF pode reduzir o número ou prolife- ração de micrometástases; reduzir ou prevenir o crescimento de um tumor inativo; ou reduzir ou prevenir a recorrência de um tumor após o tratamento 5 ou remoção (por exemplo, usando uma terapia anticâncer tal como cirurgia, terapia de radiação, ou quimioterapia). Na medida em que o fármaco pode prevenir o crescimento e/ou matar células de câncer existentes, ele pode ser citostático e/ou citotóxico. Para terapia de câncer, a eficácia in vivo pode, por exemplo, ser avaliada estimando-se a duração de sobrevivência, tempo para 10 o progresso das doença (TTP), as taxas de resposta (RR), duração de res- posta, tempo em remissão, e/ou qualidade de vida. A quantidade eficaz pode melhorar a sobrevivência sem doença (DFS), melhorar a sobrevivência geral (OS), diminuir a probabiliade de recorrência, extender o tempo para recor- rências, extender o tempo para distanciar a recorrência (isto é, recorrência 15 fora do sítio primário), curar o câncer, melhorar os sintomas de câncer (por exemplo, como estimado usando um exame específico de câncer), reduzir o aparecimento de segundo câncer primário, etc.

Câncer "operável" é câncer que é confinado no órgão primário e adequado para cirurgia.

"Sobrevivência" refere-se ao paciente que permanece vivo, e

inclui sobrevivência livre de doença (DFS), sobrevivência livre de progresso (PFS) e sobrevivência geral (OS). A sobrevivência pode ser estimada pelo método Kaplan-Meier, e quaisquer diferenças em sobrevivência são compu- tadas usando o teste de classificação Iog estratificado.

"Sobrevivência livre de doença (DFS)" refere-se ao paciente que

permanece vivo, sem retorno do câncer, durante um período de tempo defi- nido tal como cerca de 1 ano, cerca de 2 anos, cerca de 3 anos, cerca de 4 anos, cerca de 5 anos, cerca de 10 anos, etc., de início de tratamento ou de diagnose inicial. Em um aspecto da invenção, DFS é analisado de acordo 30 com o princípio destinado-a-tratar, isto é, os pacientes são avaliados com base em sua terapia designada. Os eventos usados na análise de DFS pode incluir recorrência de câncer local, reqional e distante, ocorrência de câncer ♦

secundário, e morte de qualquer causa em pacientes sem um evento anteri- or (por exemplo, recorrência de câncer de mama ou segundo câncer primá- rio).

"Sobrevivência total" refere-se ao paciente que permanece vivo 5 durante um período de tempo definido, tal como cerca de 1 ano, cerca de 2 anos, cerca de 3 anos, cerca de 4 anos, cerca de 5 anos, cerca de 10 anos, etc., de início de tratamento ou de diagnose inicial. No estudo embasando a invenção o evento usado para análise de sobrevivência foi a morte de qual- quer causa.

Por "extendendo a sobrevivência" entende-se aumentar DFS

e/ou OS em um paciente tratado com relação a um paciente não tratado (isto é, com relação a um paciente não tratado com um antagonista específico de VEGF, por exemplo, um anticorpo de VEGF), ou com relação a um protocolo de tratamento de controle, tal como tratamento apenas com o agente quimio- 15 terápico, tal como paclitaxel. A sobrevivência é monitorada durante pelo me- nos cerca de seis meses, ou pelo menos cerca de 1 ano, ou pelo menos cerca de 2 anos, ou pelo menos cerca de 3 anos, ou pelo menos cerca de 4 anos, ou pelo menos cerca de 5 anos, ou pelo menos cerca de 10 anos, etc., seguindo o início de tratamento ou seguindo o diagnóstico inicial.

"Relação de risco" em análise de sobrevivência é um sumário da

diferença entre duas curvas de sobrevivência, representando a redução no risco de morte em tratamento em comparação com o control, durante um período de seguimento. A relação de risco é uma definição estatística para taxas de eventos. Para o propósito da invenção, relação de risco é definida 25 como representando a probabilidade de um evento no caso experimental dividido por uma probabilidade de um evento no caso de control em qualquer ponto específico do tempo.

O termo "concomitantemente" é usado aqui para referir-se à administração de dois ou mais agentes terapêuticos, onde pelo menos parte da administração sobrepõe-se em tempo. Consequentemente, a administra- ção concomitante inclui um regime de dosagem quando a administração de um ou mais agente(s) continua após a descontinuação da administração de um ou mais outros agente(s).

Por "monoterapia" entende-se um regime terapêutico que inclui apenas um único agente terapêutico para o tratamento do câncer ou tumor durante o período do tratamento. Monoterapia usando um antagonista espe- 5 cífico de VEGF meios que o antagonista específico de VEGF é administrado na ausência de uma terapia anticâncer adicional durante aquele período de tratamento.

Por "terapia de manutenção" entende-se um regime terapêutico que é administrado para reduzir a probabilidade de recorrência ou progresso 10 de doença. A terapia de manutenção pode ser provida durante qualquer pe- ríodo de tempo, incluindo períodos de tempo prolongados até o ciclo de vi- das do indivíduo. A terapia de manutenção pode ser provida após a terapia inicial ou em conjunto com terapias iniciais ou adicionais. Dosagens usadas para terapia de manutenção podem variar e podem incluir dosagens diminu- 15 idas quando em comparação com dosagens usadas para outros tipos de terapia.

"Terapia neoadjuvante" ou "terapia preoperativa" aqui refere-se a terapia administrada antes da cirurgia. O objetivo da terapia adjuvante é fornecer tratamento sistêmico imediato, potencialmente erradicando micro- 20 metástases que de outro modo proliferariam se a seqüência padrão de cirur- gia seguida por terapia sistêmica fosse seguida. A terapia adjuvante pode também ajudar a reduzir o tamanho do tumor, desse modo permitindo com- pleta ressecção de tumor inicialmente não removíveis ou preservando por- ções do órgão e suas funções. Além disso, a terapia adjuvante permite uma 25 avaliação in vivo de eficácia de fármaco, que pode orientar a escolha de tra- tamentos subsequentes.

"Terapia adjuvante" aqui refere-se à terapia administrada após cirurgia, onde nenhuma evidência de doença residual pode ser detectada, de modo a reduzir o risco de recorrência de doença. O objetivo de terapia adju- vante é prevenir a recorrência do câncer e, portanto, reduzir a chance de morte relacionada com o câncer.

Aqui, quimioterapia "padrão de cuidado" refere-se aos agentes quimioterápicos rotineiramente usados para tratar um câncer particular. "Cirurgia definitiva" é usada quando aquele termo é usado den- tro da comunidade médica. A cirurgia definitiva inclui, por exemplo, procedi- mentos, cirúrgicos ou de outro modo, que resultam em remoção ou ressec- ção do tumor, incluindo aquelas que resultam na remoção ou ressecção de todo tumor totalmente visível. A cirurgia definitiva inclui, por exemplo, res- secção completa ou curativa ou remoção do tumor maciçamente completa. A cirurgia definitiva inclui procedimentos que ocorrem em um ou mais estágios, e inclui, por exemplo, procedimentos cirúrgicos de múltiplos estágios onde um ou mais procedimentos cirúrgicos ou outros são realizados antes da re- moção do tumor. A cirurgia definitiva inclui procedimentos para remoção ou ressecção do tumor incluindo órgãos envolvidos, partes de órgãos e tecidos, bem como órgãos circundantes, tais como linfonodos, partes de órgãos, ou tecidos.

Os termos "câncer" e "canceroso" referem-se a ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caráterizada por cres- cimento celular desregulado. Incluídos nesta definição estão os cânceres benigno e maligno, bem como tumores inativos ou micrometástases. Por "câncer de estágio precoce" ou "tumor de estágio precoce" entende-se um câncer que não é invasivo ou metastático ou é classificado como um câncer de estágio Ο, I, ou II.

O termo "pré-canceroso" refere-se a uma condição ou um cres- cimento que tipicamente precede ou desenvolve-se em um câncer. Um cres- cimento "pré-canceroso" terá células que são caracterizadas por regulação, proliferação, ou diferenciação de ciclocelular anormal, que podem ser deter- minadas por marcadores de regulação do ciclocelular, proliferação ou dife- renciação.

Por "displasia" entende-se qualquer crescimento ou desenvolvi- mento anormal de tecido, órgão ou células. Preferivelmente, a displasia é de grau elevado ou pré-canceroso.

Por "metástase" entende-se a dispersão de câncer de seu sítio primário para outros locais no corpo. Células de câncer podem desprender- se de um tumor primário, penetrar em vasos linfásticos e sanguíneos, circu- lar através da corrente sanguínea, e desenvolver-se em um foco distante (metastatizar) em tecidos normais em outro lugar no corpo. A metástase po- de ser local ou distante. A metástase é um processo seqüencial, contingente 5 em células de tumor rompidas do tumor primário, viajando através da corren- te sanguínea, e parando em um sítio distante. No novo sítio, as células esta- belecem um suprimento sanguíneo e podem desenvolver-se para formar uma massa desafiadora da vida. Séries de reação molecular tanto estimula- tória quanto inibidora dentro da célula de tumor regulam este comportamen- 10 to, e interações entre a célula de tumor e células hospedeiras no sítio distan- te são também significantes.

Por "micrometástases" entende-se um pequeno número de célu- las que se dispersaram do tumor primário para outras partes do corpo. A micrometástase pode ou não ser detectada em um teste de avaliação ou diagnóstico.

Por "não-metastático" entende-se um câncer que é benigno ou que permanece no sítio primário e não penetrou no sistema linfático ou vaso sanguíneo ou em tecidos exceto o sítio primário. Geralmente, um câncer não metastástico é qualquer câncer que é um câncer de estágio 0, I, ou II, e oca- sionalmente um câncer de estágio III.

Referência a um tumor ou câncer como um "Estágio 0," "Estágio

I," "Estágio II," "Estágio III," ou "Estágio IV" indica a classificação do tumor ou câncer usando métodos de Agrupamento de Estágio Total ou Classifica- ção Numeral Romana conhecidos na técnica. Embora o estágio real do cân- 25 cer seja dependente do tipo de câncer, em geral, um câncer de estágio 0 é uma lesão in situ, um câncer de estágio I é tumor localizado pequeno, um câncer de estágio Il e Ill é um tumor local avançado que exibe envolvimento dos Iinfonodos locais, e um câncer de estágio IV representa câncer metastá- tico. Os estágios específicos para cada tipo de tumor são conhecidos pelo 30 médico experiente.

"Tumor", como aqui usado, refere-se a todo crescimento e proli- feração de célula neoplásica, seja maligna ou benigna, e todas as células e I

tecidos pré-cancerosos e cancerosos.

Por "tumor primário" ou "câncer primário" entende-se o câncer original e não uma lesão metastática localizadas em outro tecido, órgão, ou localização no corpo do indivíduo.

Por "tumor benigno" ou "câncer benigno" entende-se um tumor

que permanece localizado no sítio de origem e não tem a capacidade de infiltrar, invadir, ou metastatizar para um sítio distante.

"Recorrência de câncer" aqui refere-se a um retorno de câncer seguindo tratamento, e inclui retorno de câncer no órgão primário, bem como recorrência distante, onde câncer retorna fora do órgão primário.

Por "dormência de tumor" entende-se um estado de inatividade prolongada em que as células de tumor estão presentes, porém o progresso do tumor não é clinicamente aparente. Um tumor inativo pode ou não ser detectado em um teste de avaliação ou diagnóstico.

Por "carga de tumor" entende-se o número de células de câncer,

o tamanho de um tumor, ou a quantidade de câncer no corpo. A carga de tumor é também referida como a carga de tumor.

Por "número de tumor" entende-se o número de tumores.

Por "indivíduo" entende-se um mamífero, incluindo, porém não- limitado a, um mamífero humano ou não humano, tais como um bovino, e- quino, canino, ovino, ou felino. Preferivelmente, o indivíduo é um humano.

Uma "população" de indivíduos refere-se a um grupo de indiví- duos com câncer, tal como em uma experiência clínica, ou como observado por oncologistas seguindo a aprovação do FDA para uma indicação particu- lar, tal como terapia adjuvante de câncer. Em uma modalidade, a população compreende pelo menos 3000 indivíduos.

O termo "terapia anticâncer" refere-se a uma terapia útil no tra- tamento de câncer. Exemplos de agentes terapêuticos anticâncer incluem, porém são limitados a, por exemplo, cirurgia, agentes quimioterápicos, agen- 30 tes inibidores de crescimento, agentes citotóxicos, agentes usados em tera- pia de radiação, agentes antiangiogênese, agentes apoptóticos, agentes an- titubulina, e outros agentes para tratar câncer, tais como anticorpos anti- HER-2, anticorpos anti-CD20, um antagonista de receptor de fator de cres- cimento epidérmico (EGFR) antagonista (por exemplo, um inibidor de tirosi- na cinase), inibidor de HER1/EGFR (por exemplo, erlotinib (Tarceva®), inibi- dores de fator de crescimento derivados de plaqueta (por exemplo, Gleevec® 5 (lmatinib Mesylate)), um inibidor de COX-2 (por exemplo, celecoxib), interfe- rons, citocines, antagonistas (por exemplo, anticorpos neutralizantes) que se ligam a um ou mais dos seguintes receptores ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR- beta, BIyS, APRIL, BCMA ou VEGF alvo(s), TRAIL/Apo2, e outros agentes químicos bioativos e orgânicos, etc. Combinações dos mesmos são também 10 incluídas na invenção.

O termo "agente citotóxico" como aqui usado refere-se a uma substância que inibe ou previne a função de células e/ou causa a destruição de células. O termo destina-se a incluir isótopos radioativos (por exemplo, I131, |125^ γ9ο e pei86^ gggntes quimioterápicos, e toxinas tais como toxinas 15 enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, planta ou animal, ou fragmentos do mesmo.

Um "agente quimioterápico" é um composto químico útil no tra- tamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterápicos incluem agentes de alquilação tais como tiotepa e CITOXAN® ciclosfosfamida; sulfonatos de 20 alquila tais como busulfan, improsulfan e piposulfan; aziridinas tais como benzodopa, carboquone, meturedopa, e uredopa; etileniminas e metilame- Iaminas incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenefosforamida, trieti- Ienotiofosforamida e trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bula- tacina e bulatacinona); uma camptotecina (incluindo o análogo sintético topo- 25 tecan); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina); criptofcinas (particularmente criptofi- cina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sin- téticos, KW-2189 e CB1-®1); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictiína; espongistatina; mostardas de nitrogênio tais como clorambucila, clornafazi- 30 na, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalan, novembiquina, fenesterina, prednimusti- na, trofosfamida, mostarda de uracila; nitrosureias tais como carmustina, ♦

clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, e ranimnustina; antibióticos tais como os antibióticos de enediína (por exemplo, caliqueamicina, especi- almente caliqueamicina gamall e caliqueamicina ômegall (veja, por exemplo, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); dinemicina, incluindo di- 5 nemicina A; bisfosfonatos, tais como clodronato; uma esperamicina; bem como cromóforo de neocarzinostatina e cromóforos antibióticos de enediína de cromoproteína relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofili- na, cromomicinis, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo- 10 L-norleucina, ADRIAMYCIN® doxorubicina (incluindo morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina e deoxidoxorubicina), epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tais como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estrep- 15 tozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabólitos tais como metotrexato e 5-fluorouracila (5-FU); análogos de ácido fólico tais co- mo denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabi- 20 na, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; androgênios tais como calusterona, proprionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiosta- no, testolactona; antiadrenais tais como aminoglutetimida, mitotano, trilosta- no; reabastecedores de ácido fólico tais como ácido frolínico; aceglatona; glicosídeo de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracila; amsacrina; 25 bestrabucila; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptínio; uma epotilona; etoglucid; nitrato de gálio; hi- droxiureia; lentinan; lonidainina; maitansinoides tais como maitansina e an- samitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostati- na; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; 30 procarbazina; complexo de polissacarídeo PSK® (JHS Natural Products, Eu- gene, OR); razoxana; rizoxina; sizofiran; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T- 2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosida ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxóidees, por exemplo, TAXOL® paclitaxel (Bristol- Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE® Cremophor- 5 free, formulação de paclitaxel de nanoparticula construído de albumina (A- merican Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), e doxetaxel TAXO- TERE® (Rhône- Poulenc Rorer, Antony, France); clorambucila; gencitabina GEMZAR®; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposida (VP-16); 10 ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina NAVELBINE®; novantrona; teniposida; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; iri- notecan (Camptosar, CPT-11) (incluindo o regime de tratamento de irinote- can com 5-FU e leucovorina); inibidores de topoisomerase RFS 2000; difluo- rometilornitina (DMFO); retinoides tais como ácido retinóico; capecitabina; 15 combretastatina; leucovorina (LV); oxaliplatina, incluindo o regime de trata- mento de oxaliplatina (FOLFOX); inibidores de PKC-alfa, Raf, H-Ras, EGFR (por exemplo, erlotinib (Tarceva®)) e VEGF-A que reduzem a proliferação celular e sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de qual- quer dos acima mencionados.

São também incluídos nesta definição os agentes anti-

hormonais que agem para regular ou inibir a ação de hormônio sobre tumo- res tais como antiestrogênios e moduladores de receptor de estrogênio sele- tivos (SERMs), incluindo, por exemplo, tamoxifeno (incluindo tamoxifeno NOLVADEX®), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, ceoxi- 25 feno, LY117018, onapristona, e FARESTON· toremifeno; inibidores de aro- matase que inibem a enzima aromatase, que regula a produção de estrogê- nio nas glândulas adrenais, tais como, por exemplo, 4(5)-imidazois, amino- glutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestanie, fadrozol, vorozol RIVISOR®, Ietrozol FEMARA®, e anastrozol 30 ARIMIDAX®; e anti-androgênios tais como flutamida, nilutamida, bicalutami- da, leuprolida, e goserelina; bem como troxacitabina (um análogo de citosina de núcleosida de 1,3-dioxolano); oligonucleotídeos antissentido, particular- I 48

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mente aqueles que inibem a expressão de genes em séries de reação de sinalização implicadas em proliferação de célula aberrante, tal como, por exemplo, PKC-alfa, Raf e H-Ras; ribozimas tais como um inibidor de expres- são de VEGF (por exemplo, ribozima de ANGIOZYME®) e um inibidor de 5 expressão de HER2; vacinas tais como vacinas de terapia de gene, por e- xemplo, vacina ALLOVECTIN®, vacina LEUVECTIN®, e vacina VAXID®; PROLEUKIN® rlL-2; inibidor de topoisomerase 1 LURTOTECAN®; ABARE- LIX® rmRH; Vinorelbina e Esperamicinas (veja Patente dos Estados Unidos n° 4.675.187), e sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de 10 qualquer dos acima mencionados.

Um "agente inibidor de crescimento" como usado aqui refere-se a um composto ou composição que inibe o crescimento de uma célula in vitro e/ou in vivo. Desse modo, o agente inibidor de crescimento pode ser um que significantemente reduz a percentagem de células na fase S. Exemplos 15 de agentes inibidores de crescimento incluem agentes que bloqueiam o pro- gresso do ciclocelular (em um local exceto a fase S), tais como agentes que induzem a interrupção de G1 e interrupção de fase M. Os bloqueadores de fase M clássicos incluem o vincas (vincristina e vinblastina), TAXOL®, e ini- bidores de topo Il tais como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etopo- 20 sida, e bleomicina. Aqueles agentes que interrompem G1 também transbor- dam na interrupção da fase S, por exemplo, agentes de alquilação de DNA tais como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluoro ura cila, e ara-C. Outra informação pode ser encontrada na Base Molecular de Câncer, Mendelsohn e Israel, eds., Capítulo 1, entitu- 25 lado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastics drugs" por Mura- kami e outro, (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente p. 13.

O termo "citocina" é um termo genérico para proteínas liberadas por uma população celufar que age sobre outra célula como mediadores in- tercelulares. Exemplos de tais citocinas são linfocinas, monocinas, e hormô- 30 nios de polipeptídeo tradicionais. São incluídos entre as citocinas os hormô- nios de crescimento tais como hormônio de crescimento humano, hormônio de crescimento humano N-metionila, e hormônio de crescimento bovino; hormônio paratireoide; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormônios de glicoproteína tais como hormônio de estimulação do folículo (FSH), hormônio de estimulação da tireóide (TSH), e hormônio de Iuteiniza- ção (LH); fator de crescimento epidérmico; fator de crescimento hepático;

5 fator de crescimento fibroblasto; prolactina; lactogênio placental; fator alfa e beta de necrose de tumor; substância inibidora de mulerian; peptídeo asso- ciado com gonadotropina de camundongo; inibina; activina; fator de cresci- mento endotelial vascular; integrina; trombopoietina (TPO); fatores de cres- cimento de nervo tais como NGF-alfa; fator de crescimento de plaqueta; fato- 10 res de crescimento transformante (TGFs) tais como TGF-alfa e TGF-beta; fator I e Il de crescimento tipo insulina; eritropoietina (EPO); fatores osteoin- dutivos; interferons tais como fatores estimulantes de colônia de interferon alfa, beta e gama (CSFs) tais como macrófago-CSF (M-CSF); granulócito- macrófago-CSF (GM-CSF); e granulócito-CSF (G-CSF); interleucinas (ILs) 15 tais como IL-1, IL-lalfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL- 11, IL-12; um fator de necrose de tumor tal como TNF-alfa ou TNF-beta; e outros fatores de polipeptídeo incluindo LIF e Iigante de kit (KL). Como aqui usado, o termo citocina inclui proteínas de fontes naturais ou de cultura de célula recombinante e equivalentes biologicamente ativos das citocinas de 20 seqüência nativa.

O termo "profármaco" como usado neste pedido refere-se a um precursor ou forma derivada de uma substância farmaceuticamente ativa que é menos citotóxica para as células de tumor em comparação com o fár- maco origem e é capaz de ser enzimaticamente ativada ou convertida na 25 forma origem mais ativa. Veja, por exemplo, Wilman, "Prodrug in cancer- chemiterapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Mee- ting Belfast (1986) e Stella e outro, "Prodrugs: A Chemical Approach to Tar- ged Drug Delivery," direcionados Drug Delivery, Borchardt e outro, (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985). O profármacos desta invenção incluem, po- 30 rém não estão limitados a, profármacos contendo fosfato, profármacos con- tendo tiofosfato, profármacos contendo sulfato, profármacos contendo peptí- deo, Profármacos modificados por D-aminoácido , profármacos glicosilados, I

profármacos contendo β-lactam, Profármacos contendo fenoxiacetamida opcionalmente substituída ou profármacos contendo fenilacetamida opcio- nalmente substituída, 5-fluorocitosina e outros profármacos de 5- fluorouridina que podem ser convertidos no fármaco livre de citotóxico mais 5 ativo. Exemplos de fármacos citotóxicos que podem ser derivatizados em uma forma de profármaco para uso nesta invenção incluem, porém não es- tão limitados a, aqueles agentes quimioterápicos descritos acima.

Por "terapia de radiação" entende-se o uso de raios gama ou raios beta direcionados para induzir dano suficiente a uma célula a fim de 10 limitar sua capacidade de funcionar normalmente ou destruir a célula total- mente. Será apreciado que existam muitas maneiras conhecidos na técnica de determinar a dosagem e Duração de tratamento. Tratamentos típicos são administrados como uma administração do tempo e as dosagens típicas va- riam de 10 a 200 unidades (Grays) por dia.

Por "reduzir ou inibir" entende-se a capacidade de causar um

decréscimo geral preferivelmente de 20% ou mais, mais preferivelmente de 50% ou mais, e mais preferivelmente de 75%, 85%, 90%, 95%, ou mais. Re- duzir ou inibir pode referir-se aos sintomas do distúrbio eu está sendo trata- do, a presença ou tamanho de metástases ou micrometástases, o tamanho 20 do tumor primário, a presença ou o tamanho do tumor inativo, ou o tamanho ou número de vasos sanguíneos em distúrbios angiogênicos.

Por "oligômero de nucleobase antissentido" entende-se um oli- gômero de nucleobase, independente do tamanho, que é complementar a pelo menos uma porção do filamento de codificação ou mRNA de um gene. Por um "oligômero de nucleobase" entende-se um composto que

inclui uma cadeia de pelo menos oito nucleobases, preferivelmente pelo me- nos doze, e mais preferivelmente pelo menos dezesseis bases, ligadas entre si por grupos de ligação. Estão incluídos nesta definição os oligonucleotí- deos naturais e não naturais, tanto modificados quanto não modificados, 30 bem como os miméticos de oligonucleotídeo tais como ácidos nucléicos de proteína, ácidos nucléicos fechados, e ácidos arabinonucléicos. Numerosas nucleobases e grupos de ligação podem ser empregados nos oligômeros de nucleobase da invenção, incluindo aqueles descritos nas Publicações de Patente dos Estados Unidos n°s 20030114412 (veja por exemplo, parágra- fos 27-45 da publicação) e 20030114407 (veja por exemplo, parágrafos 35- 52 da publicação), incorporadas aqui por referência. O oligômero de nucleo- 5 base pode também ser alvejado para os sítios de início e paralisação trans- lacional. Em certas modalidades, o oligômero de nucleobase antissentido compreende de cerca de 8 a 30 nucleotídeos. O oligômero de nucleobase antissentido pode também conter pelo menos 40, 60, 85, 120, ou mais nu- cleotídeos consecutivos que são complementares ao DNA ou mRNA de 10 VEGF, e podem sertão longos quanto o mRNA ou gene de tamanho natural.

Por "RNA pequeno" entende-se qualquer molécula de RNA, ou de filamento único ou de filamento duplo, que é pelo menos de 15 nucleotí- deos, preferivelmente, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, ou 35, nucleotídeos de comprimento e mesmo até 50 ou 100 . - 15 nucleotídeos de comprimento (inclusive de de todos os números inteiros en- tre eles). Em certas modalidades, o RNA pequeno é capaz de mediar o RNAi. Como aqui usada a frase "media o RNAi" refere-se à capacidade de distinguir que os RNAs devem ser degradados pelo mecanismo ou processo do RNAi. Estão incluídos no termo RNA pequeno os "RNAs de interferência 20 pequenos" e "microRNA." Em geral, os microRNAs (miRNAs) são RNAs de não codificação de filamento único pequeno (por exemplo, 17-26 nucleotí- deos), que são processados de aproximadamente RNAs precursores de grampo de cabelo de nucleotídeo 70 por Dicer. Os RNAs de interferência pequenos (siRNAs) são de um tamanho similar e são também de não codifi- 25 cação; entretanto, os siRNAs são processados de dsRNAs longos e são ge- ralmente de filamento duplo. Os siRNAs podem também incluir RNAs gram- po de cabelo curtos, em que ambos os filamentos de um siRNA dúplex são incluídos dentro de uma única molécula de RNA. Os RNAs pequenos podem ser usados para descrever ambos os tipos de RNA. Estes termos incluem 30 RNA de filamento duplo, RNA de filamento único, RNA isolado (parcialmente RNA purificado, RNA essencialmente puro, RNA sintético, RNA recombinan- temente produzido), bem como RNA alterado que difere de RNA de ocorrên- I

cia natural pela adição, deleção, substituição e/ou alteração de um ou mais

i

nucleotídeos. Tais alterações podem incluir a adição de material não nucleo- tídeo, tal como à(s) extremidade(s) do RNA pequeno ou internamente (em um ou mais nucleotídeos do RNA). Os nucleotídeos nas moléculas de RNA 5 da invenção podem também compreender nucleotídeos não padrões, inclu- indo nucleotídeos de ocorrência não natural ou deoxiribonucleotídeos. Veja "oligômeros de nucleobase" acima para modificações adicionais às molécu- las de ácido nucléico. Em uma modalidade, as moléculas de RNA contêm um grupo 3' hidroxila.

10 O termo "infusão intravenosa" refere-se à introdução de um fár-

maco na veia de um paciente animal ou humano durante um período de tempo maior do que aproximadamente 5 minutos, preferivelmente entre a- proximadamente 30 a 90 minutos, embora, de acordo com a invenção, infu- são intravenosa seja alternativamente administrada durante 10 horas ou . - 15 menos.

O termo "bolo intravenoso" ou "impulso intravenoso" refere-se à administração de fármaco dentro de uma veia de um animal ou humano, de modo que o corpo receba o fármaco em aproximadamente 15 minutos ou menos, preferivelmente 5 minutos ou menos.

20 O termo "administração subcutânea" refere-se à introdução de

v.*·

um fármaco sob a pele de um paciente animal ou humano, preferivelmente dentro de uma bolsa entre a pele e tecido subjacente, por liberação relativa- mente lenta, sustentada de um receptáculo de fármaco. A bolsa pode ser criadapinçando ou puxando a pele para cima e longe do tecido subjacente.

25 O termo "infusão subcutânea" refere-se à introdução de um fár-

maco sob a pele de um paciente animal ou humano, preferivelmente dentro de uma bolsa entre a pele e tecido subjacente, por liberação relativamente lenta, sustentada de um receptáculo de fármaco for um período de tempo incluindo, porém não-limitado a, 30 minutos ou menos, ou 90 minutos ou 30 menos. opcionalmente, a infusão pode ser preparada por implante subcutâ- neo de uma bomba de liberação de fármaco implantada sob a pele do paci- ente animal ou humano, em que a bomba libera uma quantidade predeter- minada de fármaco durante um período de tempo predeterminado, tal como 30 minutos, 90 minutos, ou um período detempo que abrange o período do regime de tratamento.

O termo "bolo subcutâneo" refere-se uma administração de fár- 5 maco debaixo da pele de um paciente animal ou humano, onde a liberação de fármaco em bolo é preferivelmente menor do que aproximadamente 15 minutos, mais preferivelmente menor do que 5 minutos, e mais preferivel- mente menor do que 60 segundos. A administração é preferivelmente dentro de uma bolsa entre a pele e tecido subjacente, onde a bolsa é criada, por 10 exemplo, pinçando ou puxando a pele para cima e longe do tecido subjacen- te.

A palavra "rótulo" quando usada aqui refere-se a um composto ou composição detectável que é conjugado direta ou indiretamente ao poli- peptídeo. O rótulo pode ser por si só detectável (por exemplo, rótulos de ra- . . 15 dioisótopo ou rótulos fluorescentes) ou, no caso de um rótulo enzimático, pode catalisar alteração química de um composto ou composição substrato que é detectável.

II. II. Uso de Antagonistas Específicos de VEGF para Tratamento

de Tumor em Estágio Precoce e Terapia Neoadjuvant e Adjuvante 20 A invenção caráteriza o uso de antagonistas específicos de

VEGF para tratar um indivíduo tendo a tumor benigno, pré-canceroso, ou não-metastático; para tratar um indivíduo tendo um tumor inativo ou micro- metástases; ou para tratar um indivíduo tendo ou para tratar um indivíduo em risco de desenvolver câncer. Por exemplo, usando dois métodos inde- 25 pendentes para inibir VEGF, a saber, monoterapia com um anticorpo mono- clonal (mAb) alvejando VEGF-A e deleção genética de VEGF-A, demons- tramos, o uso de modelo de camundongo Apcmin/+ de formação de adenoma intestinal precoce, cuja inibição de sinalização de VEGF é suficiente para a cessação do crescimento de tumor e confere um benefício de sobrevivência 30 a longo prazo em um modelo de adenoma intestinal. Demonstramos tam- bém, o uso de um anticorpo monoclonal (mAb) alvejando VEGF-A, cuja ini- bição de VEGF-A foi suficiente para inibir o crescimento de adenoma pituitá- f

rio e para reduzir o excesso de secreção hormonal em um modelo de ca- mundongo de neoplasia endócrina múltipla tipo 1 (MEN1). Além disso, de- monstramos, o uso um modelo de tumor de ilhota pancreática de camun- dongo (RIP-TpAg) e um anticorpo monoclonal (mAb) alvejando VEGF-A, 5 cuja inibição de VEGF causa uma redução dramática de tumor angiogênese e, quando usado como uma terapia seguindo citorredução usando cirurgia ou agentes quimioterápicos, suprime o novo crescimento de tumores. A in- venção também caráteriza o uso de antagonistas de VEGF no cenário neo- adjuvante e adjuvante.

III. III. Antagonistas Específicos de VEGF

A antagonista específico de VEGF refere-se a uma molécula (peptidila ou não peptidila) capaz de ligação a VEGF, reduzindo a expressão de níveis de VEGF, ou neutralizando, bloqueio, inibição, anulando, reduzin- do, ou interferindo com atividades biológicas de VEGF, incluindo a ligação 15 de VEGF a um ou mais receptores de VEGF e angiogênese mediada por VEGF e sobrevivência ou proliferação de célula endotelial. Preferivelmente, o antagonista específico de VEGF reduz ou inibe, em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais, o nível de expressão ou atividade biológica de VEGF. Preferivelmente, o VEGF inibido pelo antago- 20 nista específico de VEGF é uma isoforma de VEGF ou isoformas de VEGF múltiplas, por exemplo, VEGF (8-109), VEGF (1-109), VEGFi6S1 VEGF12I1 VEGF145, VEGF189, ou VEGF206

Antagonistas específicos de VEGF úteis nos métodos da inven- ção incluem compostos de peptidila ou não peptidila que especificamente se 25 ligam VEGF, tal como anticorpos anti-VEGF e fragmentos de ligação a antí- geno do mesmo, variantes de antagonista de polipeptídeos de VEGF, ou fragmentos do mesmo que especificamente se ligam a VEGF, e moléculas receptoras e derivados que se ligam especificamente a VEGF desse modo seqüestrando sua ligação a um ou mais receptores (por exemplo, proteínas 30 receptoras de VEGF solúveis, ou fragmentos do mesmo de ligação de VEGF , ou proteína receptora de VEGF quiméricas), proteínas de fusões (por e- xemplo, VEGF-Trap (Regeneron)), e VEGF121-gelonina (Peregrine). Antago- nistas específicos de VEGF também incluem oligômero de nucleobase antis- sentido complementar a pelo menos um fragmento de uma molécula de áci- do nucléico codificando um polipeptídeo de VEGF; RNAs pequenos com- plementar a pelo menos um fragmento de uma molécula de ácido nucléico 5 codificando um polipeptídeo de VEGF; ribozimas que alvejam VEGF; pepti- corpos para VEGF; e aptâmeros de VEGF.

A. Anticorpos anti-VEGF

Anticorpos anti-VEGF que são úteis nos métodos da invenção incluem qualquer anticorpo, ou antígeno ligação fragmento do mesmo, que 10 se liga com suficiente afinidade e especificidade a VEGF e pode reduzir ou inibir a atividade biológica de VEGF. Um anticorpo anti-VEGF geralmente não se ligará a outros homologues de VEGF tais como VEGF-B ou VEGF-C1 nem outros fatores de crescimento tais como PIGF, PDGF, ou bFGF.

Em certas modalidades da invenção, os anticorpos anti-VEGF . -15 incluem, porém não estão limitados a, um anticorpo monoclonal que se liga ao mesmo epítopo como o anticorpo monoclonal anti-VEGF A4.6.1 produzi- do por hibridoma ATCC HB 10709; um anticorpo monoclonal anti-VEGF hu- manizado recombinante gerado de acordo com Presta e outro, (1997) câncer Res. 57:4593-4599, incluindo porém não-limitado aos anticorpo conhecidos 20 como bevacizumab (BV; Avastin®). Bevacizumab inclui Regiões de Estrutura de IgGI humanas mutadas e regiões de determinação de complementarida- de de ligação a antígeno do anticorpo monoclonal anti-hVEGF murino

A.4.6.1 que bloqueia a ligação de VEGF humano a seus receptores. Aproxi- madamente 93% da seqüência de aminoácido de bevacizumab, incluindo a 25 maioria das regiões de estrutura, são derivados de IgGI humano, e cerca de 7% da seqüência são derivados doanticorpo murino A4.6.1. Bevacizumab tem uma massa molecular de cerca de 149.000 daltons e é glicosilado. Be- vacizumab e outros anticorpos humanizados anti-VEGF são também descri- tos na Patente dos Estados Unidos n° 6.884.879 emitida em 26 de fevereiro 30 de 2005. Exemplos adicionais de anticorpos incluem, porém não estão limi- tados aos anticorpos da série G6 ou B20 (por exemplo, G6-31, B20-4.1), como descrito na Publicação de Pedido PCT n° W02005/012359. Para anti- I

corpos adicionais veja as Patentes dos Estados Unidos n°s 7.060.269, 6.582.959, 6.703.020, 6. 342.219, 6.054.297, W098/45332, WO 96/30046, W094/10202, EP 0666868B1, Publicação de Pedido de Patente dos Esta- dos Unidos nos 2006009360, 20050186208, 20030206899, 20030190317, 5 20030203409, e 20050112126; e Popkov e outro, Journal de Immunological Métodos 288:149-164 (2004). Outros exemplos de anticorpos que podem ser usados na invenção incluem aqueles que se ligam a um epítopo funcional no VEGF humano compreendendo de resíduos F17, M18, D19, Y21, Y25, Q89, 191, K101, E103, e C104 ou, alternativamente, compreendendo resíduos 10 F17, Y21, Q22, Y25, D63, I83 e Q89.

Um anticorpo série G6 de acordo com esta invenção é um anti- corpo anti-VEGF que é derivado de uma seqüência de um anticorpo G6 ou anticorpo derivado de G6 de acordo com qualquer uma das Figuras 7, 24-26, e 34-35 de Publicação de Pedido PCT n° W02005/012359. Em uma modali- . . 15 dade, o anticorpo de série G6 liga-se a um epítopo funcional em VEGF hu- mano compreendendo resíduos F17, Y21, Q22, Y25, D63, I83 e Q89.

Um anticorpo da série B20 de acordo com esta invenção é um anticorpo anti-VEGF que é derivado de uma seqüência do anticorpo B20 ou um anticorpo derivado de B20 de acordo com qualquer uma das Figuras 27- 20 29 de Publicação de Pedido PCT n° W02005/012359. Em uma modalidade,

o anticorpo série B20 liga-se a um epítopo funcional em VEGF humano compreendendo resíduos F17, M18, D19, Y21, Y25, Q89, 191, K101, E103, e C104.

Um "epítopo funcional" de acordo com esta invenção refere-se a 25 resíduos de aminoácido de um antígeno que contribui energicamente para a ligação de um anticorpo. Mutação de qualquer um dos resíduos do antígeno de contribuição energética (Por exemplo, mutação de VEGF tipo selvagem por mutação de homólogo ou alanina) romperá a ligação do anticorpo tal que a relação de afinidade relativa (IC50 de VEGF mutante/IC50 VEGF tipo sel- 30 vagem) do anticorpo seja maior do que 5 (veja exemplo 2 de W02005/012359). Em uma modalidade, a relação de afinidade relativa é determinada por um ELISA exibindo fago de ligação de solução. Em síntese, imunoplacas Maxisorp de 96 cavidades (NUNC) são revestidas durante a noite a 4°C com uma forma Fab do anticorpo a ser testado em uma concen- tração de 2 ug/ml em PBS1 e bloqueada com PBS1 0.5% BSA1 e 0,05% de Tween20 (PBT) durante 2 horas em temperatura ambiente. Diluições seriais de fago exibindo mutantes de ponto de alanina de hVEGF (forma de 8-109 resíduos) ou hVEGF tipo selvagem (8-109) em PBT são primeiro incubadas sobre as placas revestidas por Fab durante 15 minutos em temperatura am- biente, e as plates são lavadas com PBS, 0,05% de Tween20 (PBST). O fago preso é detectado com um conjugado de rábano picante peroxidase monoclonal de anticorpo anti-M13 (Amersham Pharmacia) diluído 1:5000 em PBT, desenvolvido com substrato de 3,3', 5,5'-tetrametilbenzidina (®B, Kirke- gaard & Perry Labs, Gaitersburg, MD) durante aproximadamente 5 minutos, saciado com 1.0 M H3P04, e lido espectrofotometricamente a 450 nm. O relação de valores IC50 (IC50, ala/IC50, wt) representa o volume de redução em afinidade de ligação (a afinidade de ligação relativa).

B. Moléculas Receptoras de VEGF

Os dois receptores de VEGF melhor caráterizados são VEGFR1 (também conhecidos como Flt-1) e VEGFR2 (também conhecidos como KDR e FLK-1 para o homólogo murino). A especificidade de cada receptor para cada membro da família VEGF varia, porém VEGF-A liga-se tanto a Flt-

1 quanto KDR. O receptor Flt-1 de tamanho natural inclui um domínio extra- celular que tem sete domínios de Ig1 um domínio de transmembrana, e um domínio intracelular com atividade de tirosina cinase. O domínio extracelular está envolvido na ligação de VEGF e o domínio intracelular está envolvido em transdução de sinal.

Moléculas receptoras de VEGF, ou fragmentos do mesmo, que especificamente se ligam a VEGF podem ser usadas nos métodos da inven- ção para ligar e seqüestrar a proteína de VEGF, desse modo prevenindo-a de sinalização. Em certas modalidades, a molécula receptora de VEGF, ou 30 fragmento de ligação de VEGF da mesma, é uma forma solúvel, tais como sFlt-1. Uma forma solúvel do receptor exerce um efeito inibidor sobre a ativi- dade biológica da proteína de VEGF por liqação a VEGF, desse modo pre- I

venindo-a de ligação a seus receptores naturais presentes sobre a superfície

i

das células alvo. São também incluídas as proteínas de fusão receptoras de VEGF, exemplos das quais são descritos abaixo.

A proteína receptora de VEGF quimérica é uma molécula recep- tora tendo seqüências de aminoácido derivadas de pelo menos duas diferen- tes proteínas, pelo menos uma das quais é uma proteína receptora de VEGF (por exemplo, o receptor de flt-1 ou KDR), que é capaz de ligação a e inibi- ção da atividade biológica de VEGF. Em certas modalidades, a proteína re- ceptora de VEGF quimérica da invenção consiste em seqüências de amino- ácido derivadas de apenas duas diferentes moléculas receptoras de VEGF; entretanto, seqüências de aminoácido compreendendo um, dois, três, qua- tro, cinco, seis, ou todos os sete domínios semelhantes a Ig da região de ligação a Iigante extracelular do receptor flt-1 e/ou KDR podem ser ligados às seqüências de aminoácido de outras proteínas não relacionadas, por e- -15 xemplo, seqüências de imunoglobulina. Outras seqüências de aminoácido a cujos domínios semelhantes a Ig são combinadas serão facilmente eviden- tes para aqueles versados na técnica. Exemplos de proteína receptora de VEGF quiméricas incluem, por exemplo, Flt-1 /Fe, KDR/Fc, ou FLt-1/KDR/Fc solúvel (também conhecidos como Armadilha de VEGF). (Veja, por exemplo, Publicação de Pedido PCT n° W097/44453)

Uma proteína receptora de VEGF solúvel ou proteína receptora de VEGF quimérica da invenção inclui proteínas receptoras de VEGF que não são fixadas à superfície das células por meio de um domínio de trans- membrana. Como tal, formas solúveis do receptor de VEGF, incluindo prote- 25 ínas receptoras quiméricas, enquanto que capaz de ligação a, e inativando VEGF, não compreendem um domínio de transmembrana e desse modo geralmente não se tornam associadas com a membrana celular de células em que a molécula é expressa.

C. Ribozimas

Ribozimas são moléculas de RNA enzimáticas capazes de cata-

lisar a clivagem específica de RNA. Ribozimas agem por hibridização espe- cífica da seqüência ao RNA alvo complementar, seguido por clivagem endo-' nucleolítica. Sítios de clivagem de ribozima específicos dentro de um alvo de RNA potencial podem ser identificados por técnicas conhecidas. Para maio- res detalhes veja, por exemplo, Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994) e Publicação de Pedido PCT n0 WO 97/33551. Uma ribozima exemplar que 5 alveja a expressão de VEGF é Angiozyme®. (Veja, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 20060035278.)

D. Aptâmeros

Aptâmeros são moléculas de ácido nucléico que formam estrutu- ras terciárias que especificamente se ligam a uma molécula alvo, tais como 10 um polipeptídeo de VEGF. A geração e uso terapêutico de aptâmeros são bem estabelecidos na técnica. Veja, por exemplo, Patente dos Estados Uni- dos n° 5.475.096. Um aptâmero de VEGF é um oligonucleotídeo modificado pegilado, que adota uma conformação tridimensional que o possibilita ligar- se a VEGF extracelular. Um exemplo de um aptâmero terapeuticamente efi- . - 15 caz que alveja o VEGF para tratar a degeneração macular relacionada com a idade é pegaptanib (Macugen®, Eyetech, Nova Iorque). A informação adi- cional em aptâmeros pode ser encontrada em Publicação de Pedido de Pa- tente dos Estados Unidos n° 20060148748.

E. Pepticorpos

20 Um pepticorpo é uma seqüência de peptídeo ligada a uma se-

qüência de aminoácido codificando um fragmento ou porção de uma molécu- la de imunoglobulina. Polipeptídeos podem ser derivados de seqüências randomizadas selecionadas por qualquer método para ligação específica, incluindo, porém não-limitado a, tecnologia de exibição de fago. Em uma 25 modalidade, o polipeptídeo selecionado pode ser ligado a uma seqüência de aminoácido codificando a porção Fc de uma imunoglobulina. Pepticorpos que especificamente se ligam a e antagonizam VEGF são também úteis nos métodos da invenção.

F. Antagonista Específico de Moléculas de Ácido Nucléico VEGFic

30 Os métodos da invenção também representam o uso de antago-

nista específico de moléculas VEGFic de ácido nucléico incluindo oligômeros de nucleobase antissentido e pequenos RNAs. I

Em uma modalidade, a invenção caráteriza o uso de oligômero de nucleobase antissentidos direcionados a RNA de VEGF. Por ligação à seqüência de ácido nucléico complementar (o filamento de codificação ou sentido), oligômeros de nucleobase antissentido são capazes de inibir a ex- 5 pressão de proteína presumivelmente por meio da clivagem enzimática do filamento de RNA por RNAse H.

Um exemplo de um oligômero de nucleobase antissentido parti- cularmente útil no método e composições da invenção é um oligômero de morfolino. Morfolinos são usados para bloquear o acesso de outras molécu- 10 Ias às seqüências específicas dentro de moléculas de ácido nucléico. Eles podem bloquear o acesso de outras moléculas a regiões pequenas (-25 ba- se) de ácidos ribonucléicos (RNA). Morfolinos são algumas vezes referidos como PMO1 um acrônimo para morfolino oligo de fosforodiamidato.

Morfolinos são usados para nocautear a função de gene preve- , - 15 nindo as células de formarem uma proteína alvejada ou modificando a união de pre-mRNA. Morfolinos são moléculas sintéticas que se ligam à seqüên- cias complementares de RNA por pareamento de base de ácidos nucléicos padrões. Enquanto morfolinos têm bases de ácido nucléico padrão, aquelas bases são ligadas a aneis de morfolina em vez de aneis de deoxiribose e 20 ligados por meio de grupos de fosforodiamidato de fosfatos. Substituição de fosfatos aniônicos com os grupos de fosforodiamidato não carregados elimi- na a ionização na faixa de pH fisiológico usual, então morfolinos em orga- nismos ou células são moléculas não carregadas.

Morfolinos agem por "bloqueio estérico" ou ligação a uma se- 25 quência alvo dentro de um RNA e moléculas de bloqueio que podem de ou- tro modo interagir com o RNA. Por causa de seus esqueletos completamen- te não naturais, os morfolinos Nõ são reconhecidos por proteínas celulares. Nucleases não degradam morfolinos e morfolinos não ativam receptores tipo dobre de sino e desse modo eles não ativam respostas imunes inatas tais 30 como o sistema de interferon ou a resposta de inflamação mediada por NF- kB. Morfolinos são também não conhecidos modificar a metilação de DNA. Portanto, os morfolinos direcionados a qualquer parte de VEGF que podem reduzir ou inibir os níveis de expressão ou atividade biológica de VEGF são particularmente úteis nos métodos e composições da invenção.

A invenção também caráteriza o uso de interferência de RNA (RNAi) para inibir a expressão de VEGF. RNAi é a forma de silenciamento 5 de gene pos-transcricional iniciado pela introdução de RNA de filamento du- plo (dsRNA). RNAs de filamento duplo de curto de 15 a 32 nucleotídeos, co- nhecidos geralmente como "siRNAs," "RNAs pequenos," ou "microRNAs" são eficazes em subregulamento de expressão de gene em nematódeos (Zamais e outro, Cell 101: 25-33) e em linhagens celulares de cultura de te- 10 cido mamífero (Elbashir e outro, Nature 411:494-498, 2001, pelo presente incorporadas por referência). A eficácia terapêutica deste método em mamí- feros foi demonstrada in vivo por McCaffrey e outro, (Nature 418:38-39. 2002). O RNAs pequenos são de pelo menos 15 nucleotídeos, preferivel- mente, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,

- -15 35, nucleotídeos de comprimento e mesmo até 50 ou 100 nucleotídeos de comprimento (inclusive de todos os números inteiros entre eles). Tais RNAs pequenos que são substancialmente idênticos a ou complementares a qual- quer região de VEGF, são incluídos como antagonistas específicos de VEGF da invenção.

20 Os requisitos específicos e modificações de RNA pequeno são

conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, na Publicação de Pedi- do PCT n° W001/75164 e Publicação de Pedido dos Estados Unidos núme- ros 20060134787, 20050153918, 20050058982, 20050037988, e 20040203145, as porções relevantes dos quais são aqui incorporadas por 25 referência. Em modalidades particulares, siRNAs podem ser sintetizados ou gerados por processamento de RNAs de filamento duplo mais longo, por exemplo, na presença do "dicer" de enzima sob condições em que o dsRNA é processado em moléculas RNA de cerca de 17 a cerca de 26 nucleotí- deos. siRNAs podem também ser gerados por expressão do correspondente 30 fragmento de DNA (por exemplo, um constructo de DNA de grampo de cabe- lo). Geralmente, o siRNA tem extremidades de projeção 3' de 2 a 3 nucleotí- deos caráterísticos, preferivelmente estes são (2'-deoxi) timidina ou uracila. Os siRNAs tipicamente compreendem um grupo 3' hidroxila. Em algumas modalidades, filamento único siRNAs ou dsRNA de extremidade embotada são usados. A fim de também realçar a capacidade do RNA, as projeções 3'são estabilizadas contra degradação. Em uma modalidade, o RNA é esta- bilizado incluindo nucleotídeos de purina, tais como adenosina ou guanosi- na. Alternativamente, substituição de nucleotídeos de pirimidina por análo- gos modificados, por exemplo, substituição de projeções de 2-nucleotídeo de uridina por (2'-deoxi)timida é tolerada e não afeta a eficiência de RNAi. A ausência de um grupo de 2' hidroxila significantemente realça a resistência à nuclease da projeção em meio e cultura de tecido.

As moléculas de siRNA podem ser obtidas por meio de uma va- riedade de protocolos incluindo síntesse química ou produção recombinante usando um sistema Drosophila in vitro. Eles podem ser comercialmente obti- dos de companhias tais como Dharmacon Research Inc. ou Xeragon Inc., ou eles podem ser sintetizados usando kits comercialmente disponíveis tais como o Silencer0 siRNA Construction Kit of Ambion (catálogo número 1620) ou HiScribe® RNAi Transcription Kit of New England BioLabs (catálogo nú- mero E2000S).

Alternativamente, siRNA pode ser preparado usando procedi- mentos padrão para transcrição in vitro de procedimentos de anelamento de RNA e dsRNA tais como aqueles descritos em Elbashir e outro, (Genes & Dev. 15:188-200, 2001), Girard e outro, {Nature 442:199-202 (2006)), Aravin e outro, (Nature 442:203-207 (2006)), Grivna e outro, (Genes Dev. 20:1709- 1714 (2006))), e Lau e outro, (Science 313:363-367 (2006)).

RNAs de grampo de cabelo curtos (shRNAs), como descrito em Yu e outro, (Proc. Natl. Acad. Sci USA, 99:6047-6052, 2002) ou Paddison e outro, (Genes & Dev, 16:948-958, 2002), podem também ser usados nos métodos da invenção. shRNAs são designados tal que ambos os filamentos de sentido e antissentido sejam incluídos dentro de uma molécula de RNA única e conectados por uma alça de nucleotídeos (3 ou mais). shRNAs po- dem ser sintetizados e purificados usando síntese de transcrição T7 in vitro padrão como descrito acima e em Yu e outro, supra. shRNAs pode também ser subclonados em um vetor de expressão que tem as seqüências promoto- ras de U6 de camundongo que podem então ser transfectadas em células e usadas para expressão in vivo do shRNA.

Uma variedade de métodos está disponível para transfecção, ou introdução, de dsRNA em células mamíferas. Por exemplo, existem diversos reagentes de trasnsfecção comercialmente disponíveis úteis para transfec- ção de siRNAs com base em lipídeo incluindo, porém não-limitados a, Tran- sIT-TKO® (Mirus, Cat. # MIR 2150), Transmessenger® (Qiagen, Cat. # 301525), Oligofectamina® e Lipofectamina® (Invitrogen, Cat. # MIR 12252- 011 e Cat. #13778-075), siPORT® (Ambion, Cat. #1631), DharmaFECT^ (Fi- sher Scientific, Cat. # T-2001-01). Agentes estão também comercialmente disponíveis para métodos com base em eletroporação para transfecção de siRNA, tais como siPORTer® (Ambion Inc. Cat. # 1629). Técnicas de micro- injeção podem também ser usadas. O RNA pequeno pode também ser ' 15 transcrito de um constructo de expressão introduzida nas células, onde o constructo de expressão inclui uma seqüência de codificação para transcre- ver o RNA pequeno operavelmente ligado a uma ou mais seqüências regu- ladoras transcricionais. Onde desejado, plasmídeos, vetores, ou vetores vi- rais podem também ser usados para a liberação de dsRNA ou siRNA e tais vetores são conhecidos na técnica. Protocolos para cada reagente de trans- fecção são disponibilizados pelo fabricante.

IV. Usos Terapêuticos

A despeito da informação extensiva considerando o papel de VEGF em an- giogênese, relativamente pouco é conhecido a cerca do paspel de VEGF em 25 cânceres benignos, pré-cancerosos, ou não-metastáticos ou no cenário ad- juvante ou neoadjuvante. Descobrimos que antagonistas específicos de VEGF podem ser usados para o tratamento de cânceres benignos, pré- cancerosos, ou não-metastáticos; para o tratamento de tumores inativos ou micrometástases; para a prevenção de recorrência ou novo crescimento de 30 tumor; ou para o tratamento ou a prevenção de câncer em um indivíduo em risco de desenvolver câncer. Antagonistas específicos de VEGF podem também ser usados para terapia adjuvante para o tratamento de um indiví- I

duo com câncer não-metastático, em seguida à cirurgia definitiva ou para

i

terapia adjuvante para o tratamento de um indivíduo com um câncer operá- vel onde a terapia é provida antes da remoção cirúrgica de câncer operável no indivíduo. Enquanto as aplicações terapêuticas são separadas abaixo 5 terapia, prevenção, terapia neoadjuvante, e terapia adjuvante, será aprecia- do pelo técnico versado que estes categorias não sejam necessariamente mutuamente exclusivas.

A. Classificação de Tumores

O termo câncer abrange uma coleção de distúrbios proliferati- 10 vos, incluindo porém não-limitados a crescimentos pré-cancerosos, tumores benignos, tumores malignos, e tumores inativos. Tumores benignos perma- necem localizados no sítio de origem e não têm a capacidade de infiltrar, invadir, ou metastatizar para sítios distantes. Tumores malignos invadirão e danificarão outros tecidos em torno deles. Eles podem também ganhar a _ -15 capacidade de romper do sítio original e disseminarem-se para outras partes do corpo (metastatizar), geralmente através da corrente sanguínea ou atra- vés do sistema linfático onde os Iinfonodos estão localizados. Tumores inati- vos são tumores silenciosos em que as células de tumor estão presentes, porém o progresso do tumor não é clinicamente aparente.

20 Tumores primários são classificados pelo tipo de tecido de que

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eles originam-se; tumores metastáticos são classificados pelo tipo de tecido de que as células de câncer são derivadas. Em tempo prolongado, as célu- las de um tumor maligno tornam-se mais anormais e parecem menos seme- lhantes às células normais. Esta mudança no aparecimento de células de 25 câncer é chamada o grau de tumor, e células de câncer são descritas como sendo bem diferenciadas (grau baixo), moderadamente diferenciado, pouco diferenciado, ou não diferenciado (alto grau). Células bem diferenciadas são bastante normais mostrando-se e parecendo com as células normais das quais elas são originadas. As células não diferenciadas são células que se 30 tornaram desse modo anormais, que não é mais possível determinar a ori- gem das células.

Os sistemas de classificação de estágio de câncer descrevem quão longe o câncer já se disseminou anatomicamente e tentativas de colo- car pacientes com prognósticos similares e tratamento no mesmo grupo de classificação de estágio. Diversos testes podem ser realizados para ajudar a classificar o estágio do câncer incluindo biopsia e certos testes de imagea- 5 mento tais como um raio-X do peito, mamograma, varredura óssea, varredu- ra de CT, e varredura de MRI. Testes de sangue e uma avaliação clínica são também usados para avaliar a saúde geral do paciente e detectar se o cân- cer já se disseminou para certos órgãos.

Para classificar o estágio do câncer, o American Joint Committee 10 on Cancer primeiro coloca o câncer, particularmente tumores sólidos, em uma categoria de letra usando o sistema de classificação TNM. Os cânceres são designados com a letra T (tamanho de tumor), N (nodos palpáveis), e/ou M (metástases). T1, T2, T3, e T4 descrevem o tamanho crescente da lesão primária; NO, N1, N2, N3 indica o avanço progressivo de envolvimento de „ . 15 nodo; e MO e M1 refletem a ausência ou presença de metástases distantes.

No segundo método de classificação de estágii, também conhe- cido como o Agrupamento de Estágio Geral ou Classificação de Estágio Numeral Romano, os cânceres são divididos em estágios O a IV, incorporan- do o tamanho de lesões primárias bem como a presença de disseminação 20 de nodos e de metástases distantes. Neste sistema, casos são agrupados em quatro estágios denotados por números romanos I a IV, ou são classifi- cados como "recorrentes." Para alguns cânceres, o estágio 0 é referido co- mo "in situ" ou "Tis," tal como carcinoma dutal in situ ou carcinoma Iobular in situ para câncer de mama. Adenoma de grau elevado pode também ser 25 classificado como estágio 0. Em geral, cânceres de estágio I são cânceress localizados pequenos que são geralmente curáveis, enquando que o estágio IV geralmente representa câncer inoperável ou metastático. Os cânceres de estágio Il e Ill são geralmente localmente avançados e/ou exibem envolvi- mento de Iinfonodos locais. Em geral, os números maiores de estágio indi- 30 cam doença mais extensa, incluindo maior tamanho do tumor e/ou dissemi- nação do câncer para próximo aos Iinfonodos e/ou órgãos adjacentes ao tumor primário. Estes estágios são definidos precisamente, porém a defini- f

ção é diferente para cada tipo de câncer e é conhecida pelo técnico versado.

Muitos registros de câncer, tais como o NCI's Surveillance, Epi- demiology, e End Results Program (VEJAR), usam a classificação por está- gio do sumário. Este sistema é usado para todos os tipos de câncer. Ele a- grupa casos de câncer em cinco categorias principais:

Câncer in situ precoce que está presente apenas na camada de células em que ele começou.

Localizado é o câncer que está limitado ao órgão em que ele começou, sem evidência de disseminação.

Regional é câncer que se disseminou além do sítio original (pri-

mário) até próximo de Iinfonodos ou órgãos e tecidos.

Distante é câncer que se disseminou do sítio primário para ór- gãos distantes ou Iinfonodos distantes.

Desconhecidos é usado para descrever casos para os quais não existe informação suficiente para indicar um estágio.

Além disso, é common para câncer retornar meses ou anos a- pós o tumor primário ter sido removido. O câncer que recorre após todos os tumores visíveis terem sido erradicados, é chamado doença recorrente. Do- ença que recorre na área do tumor primário é localmente recorrente, e a do- 20 ença que recorre como metástases é referida como uma recorrência distan- te. Um tumor inativo é um tumor que existe em um estado silencioso em que as células de tumor estão presentes, porém o progresso de tumor não é cli- nicamente aparente. Micrometástases são uma pequena metástase ou um número de células que se disseminou do tumor primário para outras partes 25 do corpo. Micrometástase pode ou não ser detectada em um teste de avalia- ção ou diagnóstico. Os métodos da invenção são úteis para prevenir a ocor- rência de tumores inativos ou micrometástases ou a recorrência do tumor, por exemplo, em um cenário onde um tumor inativo ou micrometástase está presente, porém pode ou não ser clinicamente detectado.

Os métodos da invenção são também úteis para o tratamento de

cânceres precoces incluindo, porém não-limitados a tumores benignos, pré- cancerosos, ou não-metastáticos. Isto inclui qualquer tumor de estágio Ο, I, ou II; qualquer tumor não-metastático de estágio II; qualquer condição que tipicamente precede ou desenvolve-se dentro de um câncer, incluindo, po- rém não-limitado a, displasia; e qualquer tumor que permanece localizado no sítio de origem e não infiltrou-se, invadiu, ou metastatizou para sítios distan- 5 tes. Exemplos de tumores benignos, pré-cancerosos, ou não-metastáticos incluem um pólipo, adenoma, fibroma, lipoma, gastrinoma, insulinoma, chondroma, osteoma, hemangioma, linfangioma, meningioma, leiomioma, rhabdomioma, papiloma de célula escamosa, neuromas acústicos, neurofi- broma, cistanoma de duto de bile, leiomiomas, mesoteliomas, teratomas, 10 mixomas, tracomas, granulomas, hamartoma, papiloma de célula transicio- nal, adenoma pleiomórfico da glândula salivar, tumor desmoide, cistopapilo- ma dermoide, cistadenoma, hiperplasia nodular focal, e hiperplasia regene- rativa nodular.

Porque a angiogênese está envolvida tanto em crescimento pri-

- -15 mário de tumor quanto metástase, o tratamento antiangiogênico fornecido pela invenção é capaz de inibir o crescimento neoplásico de tumor no sítio primário, bem como prevenir a metástase de tumores nos sítios secundários, portanto, permitindo o ataque dos tumores por outros produtos terapêuticos. Exemplos de câncer a ser tratados aqui incluem tumores tanto sólidos quan- 20 to não sólidos ou de tecido macio. Exemplos incluem, porém não estão limi- tados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, e leucemia. Exemplos mais particulares de tais cânceres incluem câncer de célula escamosa; câncer de pulmão (incluindo câncer de pulmão de célula pequena, câncer de pulmão de célula não pequena, adenocarcinoma do pulmão, e carcinoma do pulmão 25 escamoso); câncer do peritôneo, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou do estômago (incluindo câncer gastrointestinal); câncer pancreático; giioblasto- ma; câncer cervical; câncer ovariano; câncer do fígado; câncer de bexiga; hepatoma; câncer de mama; câncer de cólon; câncer colorretal; carcinoma endometrial ou uterino; carcinoma de glândula salivar; câncer dos rins ou 30 renal; câncer do fígado; câncer de próstata; câncer vulgar; câncer de tireói- de; carcinoma hepático; e vários tipos de câncer de cabeça e pescoço, bem como linfoma de célula B (incluindo linfoma de não Hodgkin de baixo I

grau/folicular (NHL); linfocítico pequeno (SL) NHL; NHL folicular/grau inter- mediário; NHL difuso de grau intermediário; NHL imunoblástico de alto gru; NHL linfoblástico de alto grau; NHL de célula não clivada pequena de alto grau; NHL de doença maciça; linfoma de célula manto; linfoma relacionado com a AIDS; e Macroglobulinemia de Waldenstrom); leucemia Iinfocitica crô- nica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de célula pilosa; leucemia nieloblástica crônica; e distúrbio Iinfoproliferativo pós-transplante (PTLD), bem como proliferação vascular anormal associada com facomato- ses, edema (tal como aquelas associadas com tumores cerebrais), e sín- drome de Meigs. Mais particularmente, cânceres que são receptíveis ao tra- tamento pelos antagonistas específicos de VEGF da invenção incluem cân- cer de mama, câncer colorretal, câncer retal, câncer de pulmão de célula não pequena, Iinfomade não Hodgkins (NHL), câncer de célula renal, câncer de próstata, câncer do fígado, câncer pancreático, sarcoma de tecido mole, sarcoma de Kaposi, carcinoma carcinoide, câncer de cabeça e pescoço, tu- mores cerebrais, gliomas (por exemplo, astrocitoma anaplásico, oligoastroci- toma anaplásico, oligodendroglioma anaplásico, glioblastoma multiforme), melanoma, câncer ovariano, mesotelioma, e mieloma múltiplo. Mais preferi- velmente, os métodos da invenção são usados para tratar câncer colorretal em um paciente humano.

B. Adenomas

Em uma modalidade, os métodos da invenção são usados para o tratamento de um tumor de célula epitelial benigno conhecido como um adenoma. Um adenoma é um tumor benigno que tem uma origem glandular. 25 Adenomas tipicamente originam-se de células epiteliais usadas para secre- ção. Células epiteliais são localizadas em todo o corpo, porém apenas um subgrupo de tais células é usado para a secreção. Células epiteliais que são usadas para a secreção formam partes específicas do corpo referidas como glândulas. As glândulas têm o papel de formar diversas substâncias no cor- 30 po incluindo, porém não-limitadas a, suor, saliva, leite da mama, muco, e hormônios. Um adenoma pode formar-se da maioria das células glandulares no corpo. Um adenoma pode formar-se de uma maneira similar em um tumor maligno ou canceroso. Adenomas são benignos e, portanto, não me- tastatizam ou disseminam-se para outros órgãos ou tecidos. Embora a maio- ria dos adenomas permaneçam benignos, alguns adenomas podem se de- 5 senvolver em malignidades, e, se isto ocorrer, o adenoma recentemente ma- ligno é chamado um adenocarcinoma. Por exemplo, câncer de cólon e retais podem começar como adenomas ou pólipos e posteriormente desenvolve- rem-se em adenocarcinomas; adenomas brônquicos podem desenvolver-se em câncer de pulmão.

10 Frequentemente, adenomas têm um efeito notável sobre os ór-

gãos ou tecido de glândula em que eles se desenvolvem. Frequentemente, os adenomas secretam níveis excessivos de hormônios. Quando isto ocorre, os efeitos podem ser bastante desconfortáveis para o indivíduo afetado. Em certas situações, os efeitos podem ser desafiadores da vida. Entretanto, al- J - 15 guns adenomas desenvolvem-se sem quaisquer efeitos demonstráveis.

Existem certos tipos adenomas que são mais comuns em mulhe- res, tais como adenomas do fígado. Outros, tais como adenomas de cólon, são mais comuns em adultos de idade avançada, por exemplo, acima dos cinqüenta anos. Além disso, existem fatores que predispõem um paciente ao 20 desenvolvimento de um adenoma. Por exemplo, mulheres que usam contra- ceptivos orais podem estar em risco aumentado de desenvolver adenomas de fígado. Certos tipos de adenomas, por exemplo, adenomas de cólon, po- dem ser herdáveis.

Sintomas relacionados com adenomas variam amplamente. Por 25 exemplo, um adenoma de mama, chamado um fibroadenoma, tipicamente não causa nenhum sintoma e pode ser tão pequeno que o indivíduo afetado é incapaz de detectá-lo. Outros adenomas de mama, entretanto, podem ser suficientemente grandes para ser percebíveis pelo toque. Ao contrário, um adenoma de pulmão pode causar febre, calafrios, brevidade de respiração, e 30 uma tosse sangrenta.

Adenomas são diagnosticados usando uma variedade de técni- cas, incluindo a coleta de amostras de sangue e urina, imageamento por I

ultrassom, varredura por tomografia computadorizada (CT)1 e imageamento por ressonância magnética (MRI). Biópsias são tipicamente empregadas para determinar se o tumor é benigno ou maligno. Os métodos da invenção são particularmente úteis para o tratamento de adenomas, o tratamento ou a 5 prevenção de recorrência de adenoma, por exemplo, em um indivíduo tendo um tumor inativo ou micrometástases, ou para a prevenção de adenomas em um indivíduo tendo quaisquer dos fatores de risco associados com ade- nomas.

C. Tumores Gastrointestinais Em outra modalidade, os métodos da invenção são usados para

o tratamento de um tumor benigno, pré-canceroso, não-metastático, ou gas- trointestinal inativo, ou micrometástases de um tumor gastrointestinal. Isto inclui qualquer tumor de estágio 0, I, ou II; qualquer tumor ou condição que tipicamente precede ou desenvolve-se em um câncer gastrointestinal; e 15 qualquer tumor gastrointestinal que permanece localizado no sítio de origem e não infiltrou-se, invadiu, ou metastatizou para sítios distantes. Está incluído em tumor gastrointestinal qualquer pólipo, adenoma, tumor, ou câncer do sistema digestivo, especificamente o esôfago, estômago, fígado, trato biliar (vesícula biliar, dutos de bile, ampulla de vater), intestinos, pâncreas, cólon, 20 reto, e anus. Estes são descritos em detalhes abaixo.

(i) Câncer Anal

Câncer anal é um tumor maligno de canal anal ou borda anal. Cânceres anais frequentemente começam como displasia anal. A displasia anal é formada de células do anus que têm alterações anormais, porém não 25 mostram evidência de invasão dentro do tecido circundante. A forma mais severa de displasia anal é chamada carcinoma in situ onde as células pare- cem como células de câncer, porém não invadiram além do local onde as células normais situam-se. Em tempo prolongado, a displasia anal eventu- almente muda para o ponto onde as células tornam-se invasivas e ganham a 30 capacidade de metastatizar, ou espalham-se para outras partes do corpo. A displasia anal é algumas vezes referida como neoplasia intraepitelial anal (AIN). Quando câncer anal dissemina-se, é geralmente por meio de invasão direta dentro do tecido circundante ou através do sistema linfático. A disse- minação de câncer anal através do sangue é menos comum, embora possa ocorrer.

Diversos fatores foram associados com câncer anal. De modo mais importante, a infecção com o papiloma vírus humano (HPV) foi mostra- da estar relacionada com cânceres anais e foi associada com diversos ou- tros cânceres incluindo câncer cervical e cânceres da cabeça e pescoço. Outro vírus sexualmente transmitido, o vírus da imunodeficiência humana (HIV), foi ligado aos cânceres anais, e indivíduos infectdos com HIV estão em risco aumentado de infecção com HPV. Por que o câncer anal parece primeiro iniciar como displasia anal antes de progredir para câncer anal, pa- cientes com uma história de AIN estão em risco aumentado de desenvolver câncer anal. Além disso, neste contexto parece existir uma taxa aumentada de câncer anal em pacientes que têm condições anais benignas tais como fístulas anais, fissuras anais, abscessos perianais, ou hemorróidas.

Os métodos da invenção são particularmente úteis para o trata- mento de estágio precoce câncer anal, o tratamento ou a prevenção de re- corrência de câncer anal, por exemplo, em um indivíduo tendo um tumor ina- tivo ou micrometástases, ou para a prevenção de câncer anal em um indiví- duo tendo qualquer dos fatores de risco associados com câncer anal.

(ii) Cânceres Colorretais e Retais

O colon é a parte mais longe do intestino grosso, também co- nhecido como o intestino grosso. Câncer de cólon é a terceira causa mais comum de câncer, tanto em machos quanto em fêmeas, no Muno ocidental. 25 A incidência é maior em Americanos Africanos, que são também mais pro- váveis de morrer da doença. O risco de câncer de cólon aumenta substanci- almente após a idade de 50 anos, porém a cada ano existem numerosos casos reportados em pessoas mais jóvens. Em geral, os cânceres de cólon e retal são agrupados juntos e têm os mesmos fatores de risco associados 30 com eles. Indivíduos com uma história pessoal ou de história de família de câncer de cólon, pólipos, ou síndromes de câncer de cólon herdadas (por exemplo, FAP e HNPCC), bem como pacientes com colite ulcerativa ou do- ença de Crohn1 estão todos e maior risco e podem requerer avaliação em uma idade menor do que a população geral. Uma pessoa com um primeiro grau relativo (pais, irmãos ou filhos) com câncer de cólon é 2 a 3 vezes mais prováveis de desenvolver o câncer do que alguém que não teve um parente afetado.

Câncer de cólon pode ser diagnosticado usando uma variedade de técnicas conhecidas pelo médico. Os testes de avaliação são o método mais eficaz de diagnosticar o câncer de cólon nos estágios precoces (por exemplo, pólipos ou adenomas) quando estes estágios freqüentemente não estão associados com quaisquer sintomas. É geralmente quando o pólipo desenvolve-se em um tumor que ele pode sangrar ou obstruir o cólon cau- sando sintomas. Estes sintomas incluem o sangramento do reto, sangue na evacuação ou vaso sanitário após o movimento do intestino, uma mudança na forma da evacuação (isto é, escasseamento), dor de cólicas no abdome, e sensação da necessidade de ter um movimento do intestino em momentos em que o movimento do intestino não é necessário. Para tumores e pólipos que podem sangrar intermitantemente, o sangue pode ser detectado em amostras de evacuação por um feste chamado teste de sangue oculto fecal (FOBT). Sozinho, o FOBT apenas encontra cerca de 24% de cânceres. Uma sigmoidoscopia flexível ou uma colonoscopia pode também ser usada para diagnosticar cânceres colorretais.

Geralmente, o câncer colorretal é classificado como segue:

Estágio O (também chamado carcinoma in situ ) - o câncer é confinado à porção mais externa da parede do cólon.

Estágio I - o câncer disseminado para a segunda e terceira ca- madas da parede cólon, porém não para a parede externa do cólon ou além. Este é também chamado câncer de cólon Dukes A.

Estágio Il - o câncer disseminou-se através da parede do cólon, porém não invadiu quaisquer Iinfonodos (estes são estruturas pequenas que ajudam no combate de infecção e doença). Este é também chamado câncer de cólon Dukes'B.

Estágio Ill - o câncer disseminou-se através da parede do cólon * e dentro de linfonodos, porém não se disseminou para outras áreas do cor- po. Este é também chamado câncer de cólon Dukes1C.

Estágio IV - o câncer disseminou-se para outras áreas do corpo (isto é, fígado e pulmões). Este é também chamado de câncer de cólon Du- kes'D.

Os métodos da invenção são particularmente úteis para o trata- mento de câncer colorretal de estágio precoce, o tratamento ou a prevenção de recorrência de câncer colorretal, por exemplo, em um indivíduo tendo um tumor inativo ou micrometástases, ou para a prevenção de câncer colorretal em um indivíduo tendo quaisquer dos fatores de risco de câncer colorretal, tais como aqueles descritos acima, (iü) Câncer Esofáqico

O esôfago é um tubo muscular que conecta a garganta ao estô- mago. A vasta maioria de cânceres esofágicos desenvolve-se a partir do revestimento interno (mucosa) do esôfago e não das células de músculo ou cartilagem que formam o resto do esôfago. O revestimento do esôfago é um tanto único no fato de que ele muda quando vai da garganta ao estômago. No esôfago superior (proximal) , o revestimento do esôfago assemelha-se ao revestimento da garganta, composto de células escamosas. Portanto, quan- do cânceres desenvolvem-se nesta região, eles são geralmente carcinomas de célula escamosa. No esôfago inferior (distai), o tipo de câncer mais co- mun é chamado adenocarcinoma.

Além dos cânceres invasivos, pacientes são algumas vezes di- agnosticados com lesões pré-cancerosas, chamadas carcinoma in situ. Es- tas lesões pré-cancerosas podem ser observadas antes do desenvolvimento de qualquer carcinoma ou adenocarcinoma de célula escamosa. Carcinoma in situ ocorre quando o revestimento do esôfago sofre mudanças similares às mudanças cancerosas sem qualquer invasão nos tecidos mais profundos. Portanto, enquanto as próprias células têm qualidades semelhantes ao cân- cer, não existe nenhum risco de disseminação, assim como nenhuma inva- são ocorre. Outro tipo de lesão que é considerada ser um precursor do pró- prio câncer é chamada esôfago de Barrett, que é explicada a fundo abaixo. Câncer esofágico ocorre em aproximadamente 13.500 America- nos por ano, causando cerca de 12.500 mortes. A maioria dos pacientes é diagnosticada em seus 50 ou 60 anos de idade, com aproximadamente qua- tro vezes mais homens diagnosticados do que mulheres. No passado, a vas- ta maioria 85%) dos cânceres esofágicos diagnosticados foram cânceres de célula escamosa que ocorreram no esôfago superior. Fatores de risco para este tipo de câncer incluem o uso e uso de álcool. Embora ambos se- jam supostos ser fatores de risco independentes (com o fumo sendo o mais forte), deve-se observar a existência de um efeito sinérgico entre os dois para o desenvolvimento de câncer esofágico. Outros carcinógenos potenci- ais para o desenvolvimento de carcinoma de célula escamosa do esôfago são nitrosaminas, fibras de asbesto, e produtos de petróleo.

Isto é contrastado com o grupo de pacientes em risco de adeno- carcinoma, geralmente do esôfago inferior. Adenocarcinoma foi anteriormen- te uma doença menos comum quando em comparação com carcinoma de célula escamosa. Entretanto, ele tornou-se recentemente ainda mais predo- minante do que o carcinoma de célula escamosa. Adenocarcinoma é supos- to de modo geral surgir no ambiente do esôfago de Barrett, que é uma con- dição em que o revestimento normal do esôfago é substituído por revesti- mento que se assemelha ao estômago. O esôfago de Barrett é diagnostica- do por endoscopia, em que uma câmera fiberóptica é usada para examinar dentro do esôfago e para biópsia de quaisquer áreas suspeitas. O esôfago de Barrett é suposto ser causado pela exposição do esôfago inferior ao áci- do gástrico. Esta exposição acontece em pacientes com doença de refluxo gastroesofágica (GERD), que causa ao paciente sintomas de azia, distensão abdominal, perda de apetite, ou dores do estômago com alimento ou à noite durante o sono. Pacientes com GERD crônica estão em risco de desenvol- ver esôfago de Barrett e portanto, estão em maior risco de desenvolver ade- nocarcinoma do esôfago.

Embora o esôfago de Barrett, por definição, ocorra quando o revestimento do esôfago está anormal, pode existir níveis variados do grau de anormalidades. Isto é classificado em termos de displasia, que é usado para determinar quão provável o esôfago de Barretfs está de progredir para o câncer. Pacientes com esôfago de Barrett com alto grau de displasia de- vem ser acompanhados por endoscopia a cada 3 meses ou realmente pas- sar por tratamento, quando esta é considerada como alterações premalignas que têm uma alta probabilidade de progredir para o câncer. O teste mais sensível para documentar o câncer esofágico local displasia é endoscopia. Com a endoscopia, a área de envolvimento no esôfago pode ser observada diretamente com a câmera de fibra ótica, e a localização da anormalidade, a presença ou ausência de sangramento, e a quantidade de obstrução pode ser visualizada. O desempenho de uma Iaringoscopia (observando a gargan- ta) ou uma broncoscopia (observando a traquéia e vias aéreas) podem tam- bém ser requerido dependendo da localização e extensão do câncer esofá- gico. O padrão de cuidados atualmente também inclui a realização de um ultrassom durante a endoscopia, chamado de um exame de ultrassom en- -15 doscópico (EUS). Uma varredura de CT, um teste de deglutição de bário, um raio-x, e outros mais testes de rotina, incluindo testes de avaliação de san- gue, são tipicamente realizados para apropriadamente diagnosticar o estágio do câncer.

Os métodos da invenção são particularmente úteis para o trata- mento de estágio precoce câncer esofágico, o tratamento ou a prevenção de recorrência de câncer esofágico, por exemplo, em um indivíduo tendo um tumor inativo ou micrometástases, ou para a prevenção de câncer esofágico em um indivíduo tendo qualquer dos fatores de risco associados com câncer esofágico, tais como aqueles descritos acima. (iv) Câncer de Vesícula Biliar

A vesícula biliar é um órgão em forma de pera pequeno que ar- mazena e concentra bile. A vesícula biliar e fígado são conectados pelo duto hepático. O câncer primário da vesícula biliar afeta cerca de 6000 adultos nos Estados Unidos a cada ano. A maioria destes cânceres é adenocarci- noma, com subtipos tais como papilar, nodular, e tubular, dependendo do aparecimento de células de tumor sob o microscópio. Subtipos menos co- muns incluem células escamosas, célula anel com sinete, e adenoescamosa - - - 15

(adenoacantoma).

Câncer de vesícula biliar é mais freqüentemente observado em pacientes mais idosos, com uma idade mediana em diagnóstico de 62 a 66 anos. Ele ocorre mais freqüentemente em fêmeas, com uma relação de fê- mea-para-macho de cerca de 3:1.

A causa de câncer de vesícula biliar é desconhecida, embora tenha sido associada com cálculos biliares, níveis elevados de estrogênio, fumo de cigarro, álcool, obesidade, e o sexo feminino. Além disso, pacientes com doença do intestino inflamatória (colite ulcerativa e Doença de Crohn) são 10 vezes mais prováveis de desenvolver câncer do trato biliar extra- hepático.

Em geral, câncer de vesícula biliar é diagnosticado através da história e exame físico e trabalho de laboratório que inclui grupos de função de química metagólica e função de fígado para observar quanto aos níveis anormais de várias substâncias no sangue que são sugestivas de doença hepatobiliar geral. Uma urinálise é geralmente feita para avaliar os níveis urinários de algumas destas substâncias também. Técnicas adicionais tais como ultrassom, MRI, colangiografia, e varreduras de CT podem também ser usadas.

Os métodos da invenção são particularmente úteis para o trata-

mento de estágio precoce câncer de vesícula biliar, o tratamento ou a pre- venção de recorrência de câncer de vesícula biliar, por exemplo, em um in- divíduo tendo um tumor inativo ou micrometástases, ou para a prevenção de câncer de vesícula biliar em um indivíduo tendo qualquer dos fatores de ris- co associados com câncer de vesícula biliar, tais como aqueles descritos acima.

(v) Câncer Gástrico

Câncer gástrico é câncer do estômago. Nos Estados Unidos, o câncer gástrico atualmente está no nível do 14° câncer mais comum. É raro observar o câncer gástrico antes da idade de 40 anos, e sua incidência au- menta com a idade posteriormente.

Mais de 90% de cânceres gástricos surgem do revestimento der estômago. Uma vez que este revestimento tem glândulas, o câncer que sur- ge dele é chamado de um adenoma ou, para formas mais avançadas, um adenocarcinoma. Embora existam outros cânceres que podem surgir no es- tômago (linfomas - de tecido de linfa, Ieiomiosarcoma - de tecido de múscu- lo, carcinoma de célula escamosa - de revestimento sem glândulas), a vasta maioria é de adenocarcinomas.

Estudos também ligaram infecção com Helicobacter pylori com câncer gástrico. H. pylori está associado com úlceras gástricas e gastrite atrófica crônica, o que pode explicar a alta incidência de câncer gástrico em pacientes infectados com H. pylori. Entretanto, o papel exato de H. pylori no desenvolvimento de câncer gástrico permanece não claro.

Uma variedade de testes é usada para precisamente identificar cânceres gástricos, incluindo radiografias de bário de duplo contraste (assim chamadas "super Gls" ou "deglutições de bário") e endoscopias superiores. Outros procedimentos incluindo varreduras e CT, varreduras de PET, e Iapa- roscopia são usados para o diagnóstico de câncer gástrico.

Os métodos da invenção são particularmente úteis para o trata- mento de estágio precoce câncer gástrico, o tratamento ou a prevenção de recorrência de câncer gástrico, por exemplo, em um indivíduo tendo um tu- mor inativo ou micrometástases, ou para a prevenção de câncer gástrico em um indivíduo tendo quaisquer dos fatores de risco associados com câncer gástrico, tais como aqueles descritos acima, (vi) Câncer do Fígado

Existem diversos tumores de fígado benigno. Hemangiomas são o tumor do fígado benigno mais comum e ocorrem quando um tumor carre- gado de sangue, benigno forma-se dentro do fígado. Outros tumores benig- nos incluem adenomas e hiperplasia nodular focai. Embora estes tumores não invadam os tecidos circundantes ou metastatizam, é freqüentemente difícil dizer a diferença entre tumores benignos e malignos em imageamento radiográfico.

Carcinoma hepatocelular (HCC)1 um câncer que surge dos hepa- tócitos, é o tipo mais comum de câncer de fígado primário e monta em torno ι

- -15

de 70% de todos os cânceres do fígado. Cânceres que surgem dos dutos de bile dentro do fígado são conhecidos como colangiocarcinomas e represen- tam 10 a 20% de todos os cânceres do fígado. Estes cânceres podem surgir dos dutos de bile dentro do fígado (conhecidos como colangiocarcinomas intraepáticos) ou de dentro dos dutos de bile quando eles disseminam-se do fígado (conhecidos como colangiocarcinomas extra-hepátícos). Outros tipos de cânceres raros podem ocorrer dentro do fígado. Estes incluem hemangi- ossarcomas (tumores carregados de sangue malignos) e hepatoblastoma (um câncer raro que se desenvolve em crianças muito jovens). Existem diversos fatores de risco que estão associados com

câncer do fígado. Nos Estados Unidos, o fator de risco mais comum para câncer de fígado é a cirrose hepática. A infecção crônica com o vírus da he- patite C (HCV) é também uma causa comum de câncer de fígado nos Esta- dos Unidos. Mundialmente, outros fatores de risco, tais como infecção crôni- ca com vírus da hepatite B (HBV) e contaminação de alimento por aflatoxina B1 são mais comuns.

Existem diversos testes de avaliação que são usados para de- tectar o câncer do fígado. Um potente teste de avaliação envolve a detecção de níveis sangüíneos de alfa-fetoproteína (AFP). AFP é a proteína que é en- contrada em níveis elevados em sangue fetal, porém normalmente desapa- rece após o nascimento. Os níveis de AFP aumentam na presença de HCC e podem ser um sinal do desenvolvimento de câncer do fígado. Enquanto alguns pacientes alguns pacientes que estão em risco elevado de desenvol- ver câncer de fígado são rotineiramente testados quanto aos níveis de AFP, nem todos os cânceres do fígado produzem níveis elevados de AFP no san- gue, e quando a maioria dos pacientes são descobertos terem níveis eleva- dos de AFP, o tumor já está em um estágio avançado. Outras proteínas de sangue podem potencialmente ser usadas como ferramentas de avaliação do câncer do fígado. Diversos estudos mostraram o uso de proteínas tais como protrombina de des-gama-carbóxi (DCP) e fração reativa de aglutinina Lens culinaris (AFP-L3) pode também ser utilizado como sinalizadores de formação de câncer de fígado; entretanto, na prática, estes raramente usa- dos.

Além disso, quando o câncer de fígado é suspeito, ultrassom, varreduras de CT, MRI1 angiografia, tomografia por emissão de fluorodeoxi- glicose-positron (FDG-PET), biópsia, e Iaporatomia exploratória são realiza- dos para outro diagnóstico e classificação do câncer do fígado.

Os métodos da invenção são particularmente úteis para o trata- mento de estágio precoce câncer do fígado, o tratamento ou a prevenção de recorrência de câncer de fígado, por exemplo, em um indivíduo tendo um tumor inativo ou micrometástases, ou para a prevenção de câncer de fígado em um indivíduo tendo quaisquer dos fatores de risco associados com cân- cer do fígado, tais como aqueles descritos acima, (vii) Câncer Pancreático

O pâncreas é uma glândula em forma de pera, cerca de 15,24 cm de comprimento, localizado no fundo do abdome, entre o estômago e a - .15 espinha dorsal. Ele é referido em três partes: a parte mais ampla é chamada a cabeça, a seção mediana é o corpo, e a extremidade fina é chamada a calda. O pâncreas é responsável pela preparação de hormônios, incluindo insulina, que ajuda a regular os níveis de açúcar do sangue, e enzimas, que são usadas pelo intestino para a digestão do alimento. Estas enzimas são transportadas através dos dutos para dentro do pâncreas, esvaziado dentro do duto de bile comum, que transporta as enzimas para dentro do intestino. A incidência de câncer pancreático é maior entre 60 e 80 anos de idade, e é apenas raramente observado em pessoas abaixo dos 40 anos de idade. Ela é observada aproximadamente igualmente em homens e mulheres, embora as taxas em mulheres tenham subido nos últimos anos, o que podem ser devido a taxas mais elevadas de fumo em mulheres. Fumantes de cigarro são duas a três vezes mais prováveis de desenvolver câncer pancreático. Um risco da pessoa triplica se sua mãe, pai, ou irmãos já tiveram a doença. Uma história de família de câncer de mama ou de cólon também aumenta o risco. Este risco aumentado é devido à mutações herdadas em genes cau- sadores do câncer. A causa real desta doença não é conhecida, porém é suposta ser um resultado de uma combinação de alterações genéticas her- dadas e alterações causadas por exposições ambientais.

Quando um médico suspeita de que um paciente pode ter cân- cer pancreático, ultrassom, uma varredura de CT, e endoscopia são usados para diagnosticar e classificar o câncer. Alguns pacientes com câncer pan- creático podem ter um nível elevado de antígeno de carboidrato 19-9 (CA 19-9). Em pacientes que têm um nível elevado, ele é útil na confirmação de um diagnóstico em conjunto com outros testes e para monitorar a doença durante o tratamento. O nível pode ser periodicamente checado durante o tratamento para observar se o câncer está estável ou piorando.

Os métodos da invenção são particularmente úteis no tratamen- to de câncer pancreático de estágio precoce, o tratamento ou a prevenção de recorrência de câncer pancreático, por exemplo, em um indivíduo tendo um tumor inativo ou micrometástases, ou para a prevenção de câncer pan- creático em um indivíduo tendo qualquer do fatores de risco associadas com câncer pancreático, tais como aqueles descritos acima, (viii) Câncer de Intestino Delgado

O intestino delgado, também conhecidos como o intestino pe- queno, é a parte do trato digestiva que conecta o estômago e o intestino grosso, também chamado o cólon. Existem três partes distintas do intestino delgado: 1) o duodeno, 2) o jejuno e 3) o íleo. Surpreendentemente, a des- peito do surpreendente tamanho longo do intestino delgado em comparação com o restante do trato digestivo, o câncer de intestino delgado é muito mais raro. Isto inclui cânceres que iniciam no intestino ou cânceres que se disse- minam dali para outro sítio do corpo. Especificamente, cânceres do intestino delgado representam menos do que 5% de todos os cânceres do intestino e cerca de 0,5% de todos os cânceres diagnosticados nos Estados Unidos.

A causa da maioria dos cânceres do intestino delgado é desco- nhecida. Existem, entretanto, alguns possíveis fatores de risco que podem aumentar a chance de desenvolver câncer de intestino delgado. Alguns e- xemplos incluem a Doença de Crohn, doença de espru celíaco, síndrome de Peutz-Jegher, e polipose intestinal.

Existem quatro principais tipos de câncer de intestino delgado, dependendo do aparecimento sob o microscópio e a célula de origem. O adenocarcinoma é o tipo mais comum. Ele tipicamente começa no revesti- mento ou dentro da camada do intestino, e geralmente ocorre no duodeno. Outro tipo é sarcoma e o subtipo típico é o leiomiossarcoma, que começa na parede muscular do intestino delgado e geralmente ocorre no íleo. O terceiro tipo é o carcinoide, que começa nas células de formação de hormônio espe- ciais do intestino delgado e geralmente ocorre no íleo, algumas vezes no apêndice (que é a primeira parte do intestino grosso). O quarto tipo é Iinfo- ma, que começa no tecido linfático do intestino delgado e geralmente ocorre no jejuno. O subtipo mais típico de Iinfoma é Iinfoma de não Hodgkin. Um subtipo incomum de câncer de intestino delgado é o tumor estromal gastroin- testinal, que pode ocorrer em qualquer das três partes do intestino delgado.

O câncer de intestino delgado é geralmente diagnosticado usan- do uma história médica completa, um exame físico e uma amostra de eva- cuação, endoscopia ou colonoscopia, raios-C de bário, varreduras de CT, ultrassom, ou outros raios-x.

Os métodos da invenção são particularmente úteis para o trata- mento de estágio precoce câncer do intestino delgado, o tratamento ou a prevenção de recorrência de câncer do intestino delgado, por exemplo, em um indivíduo tendo um tumor inativo ou micrometástases, ou para a preven- ção de câncer do intestino delgado em um indivíduo tendo qualquer do fato- res de risco associados com câncer do intestino delgado, tais como aqueles descritos acima. V. Prevenção

Em um outro aspecto da invenção, descobriu-se que antagonis- tas específicos de VEGF podem ser usados para o tratamento de cânceres benignos, pré-cancerosos, ou de estágio precoce, ou para o tratamento ou a prevenção de recorrência de tumor. Os métodos podem ser usados para tratar o próprio câncer ou para prevenir o progresso do câncer para um es- tágio metastático ou invasivo ou para um estágio ou grau maior. Por exem- plo, os métodos da invenção podem ser usados para tratar um indivíduo com câncer de estágio O ou pólipos a fim de prevenir o progresso para um tumor de estágio I ou estágio maior. Similarmente, em um paciente tendo câncer de estágio II, os métodos podem ser usados para prevenir o progresso do câncer para um câncer de estágio Il ou estágio IV.

Antagonistas específicos de VEGF podem também ser usados para prevenir a recorrência de um tumor. Por exemplo, se um tumor foi iden- tificado e tratado (por exemplo, com quimioterapia ou cirurgicamente remo- vido), antagonistas específicos de VEGF podem ser usados para prevenir a recorrência do tumor colorretal localmente ou uma metástase do tumor color- retal. Para a prevenção da recorrência do tumor, os antagonistas específicos de VEGF podem ser usados, por exemplo, para tratar um tumor inativo ou micrometástases, ou para prevenir o crescimento ou novo crescimento de um tumor inativo ou micrometástases, que podem ou não ser clinicamente detectáveis.

Descobriu-se também que antagonistas específicos de VEGF -15 podem ser usados para a prevenção de câncer em um indivíduo que nunca teve câncer ou que está em risco de desenvolver um câncer. Existe uma variedade de fatores de risco conhecidos estarem associados com câncer e muitos deles são descritos acima. Fatores de risco exemplares incluem ida- de avançada (isto é, acima da idade dos cinqüenta anos), uma história de família de câncer, infecção viral com HPV, HIV, HBV, e HCV, uso contracep- tivo oral, cirrose, colite ulcerativa, esôfago de Barrett, infecção por H. pylorí, e a presença de pólipos ou displasia. Além disso, um indivíduo conhecido ter uma síndrome de câncer herdada é considerado estar em risco de desen- volver um câncer. Exemplos não-limitantes de tais síndromes incluem APC, HNPCC, síndrome de Gardner, e MEN1. Fatores de risco adicionais para desenvolvimento de cânceres podem ser determinados em avaliação clínica e incluem níveis elevados de hormônios ou proteínas de sangue tais como PSA (câncer de próstata) CA-125 (câncer de ovário), AFP (câncer do fíga- do), DCP (câncer do fígado), e CA 19-9 (câncer pancreático). VI. Terapia Neoadiuvante

A invenção fornece um método de terapia adjuvante antes da remoção cirúrgica de câncer operável em um indivíduo, por exemplo, um paciente humano, compreendendo administrar ao paciente (por exemplo, onde o paciente foi diagnosticado com um tumor e/ou câncer) uma quanti- dade eficaz de um antagonista específico de VEGF, por exemplo, um anti- corpo de VEGF. opcionalmente, o antagonista específico de VEGF é admi- nistrado em combinação com pelo menos um agente quimioterápico. A eta- pa adicional de administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anta- gonista específico de VEGF após a cirurgia para prevenir a recorrência do câncer pode também ser empregada com as terapias neoadjuvantes descri- tas aqui. Para os métodos que incluem a etapa adicional de administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um antagonista específico de VEGF a- pós cirurgia, quaisquer dos métodos adjuvantes descritos aqui podem ser usados.

Por exemplo, um método inclui tratar câncer em um indivíduo compreendendo as seguintes etapas: a) um primeiro estágio compreenden- do uma pluralidade de ciclos de tratamento em que cada ciclo compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um antagonista específico de VEGF, por exemplo, bevacizumab, e, opcionalmente, pelo menos um a- gente quimioterápico em um intervalo predeterminado; b) a cirurgia definitiva pela qual o câncer é removido; e, opcionalmente, c) um segundo estágio compreendendo uma pluralidade de ciclos de manutenção em que cada ci- clo compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anta- gonista específico de VEGF, por exemplo, bevacizumab, com ou sem qual- quer agente quimioterápico em um intervalo predeterminado.

Para terapia adjuvante, o antagonista específico de VEGF pode ser administrado em uma quantidade ou durante um tempo (por exemplo, durante um regime terapêutico particular em tempo prolongado) para reduzir (por exemplo, em 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais) o número de células de câncer no tumor; para reduzir o tamanho do tumor (por exemplo, para permitir remoção); para reduzir a carga do tumor; para inibir (isto é, para diminuir em alguma extensão e/ou interromper) a infil- tração de célula de câncer em órgãos periféricos; para reduzir densidade de vaso no tumor; para inibir metástase de tumor; para reduzir ou inibir o crês- ι

cimento de tumor ou proliferação de célula de tumor; para reduzir ou preve- nir o crescimento de um tumor inativo; para reduzir ou prevenir o crescimen- to ou proliferação de uma micrometástase; para aumentar ou estender o DFS ou OS de um indivíduo suscetível a ou diagnosticado com um tumor benigno, pré-canceroso, ou não-metastático; e/ou para aliviar em alguma extensão um ou mais dos sintomas associados com o câncer.

Em um exemplo, uma terapia adjuvante é administrada para es- tender a DFS ou a OS, em que a DFS ou a OS é avaliada durante 2 a 5 a- nos após uma administração inicial do anticorpo. Em certas modalidades, a DFS ou a OS do indivíduo é avaliada durante 3 a 5 anos, cerca de 4 a 5 a- nos, ou pelo menos cerca de 4, ou pelo menos cerca de 5 anos após início de tratamento ou após diagnose inicial. Tipicamente, o antagonista específi- co de VEGF é um anticorpo de VEGF tal como bevacizumab.

Em outro exemplo, administração do anticorpo e/ou quimiotera- pia pode diminuir a recorrência da doença (recorrência de câncer no órgão primário e/ou recorrência distante), em uma população de indivíduos em cerca de 50% em 3 anos (onde "cerca de 50%" aqui, inclui uma faixa de cer- ca de 45% a cerca de 70%), por exemplo, diminui a recorrência no órgão primário em cerca de 52% em 3 anos, e/ou diminui recorrência distante em cerca de 53% em 3 anos, em comparação com indivíduos tratados com qui- mioterapia (por exemplo, taxóide, tais como paclitaxel) sozinho.

O antagonista específico de VEGF, por exemplo, um anticorpo VEGF, é administrado a um indivíduo, por exemplo, um paciente humano, em acordo com métodos conhecidos, tais como administração intravenosa, por exemplo, como um bolo ou por infusão contínua durante um período de tempo, por rotinas intramuscular, intraperitoneal, intracerobrospinha!, subcu- tânea, intra-articular, intrassinovial, intratecal, oral, tópica, ou inalação. A administração intravenosa do anticorpo é preferida.

Enquanto o antagonista específico de VEGF, por exemplo, um anticorpo de VEGF, pode ser administrado como um único agente, o pacien- te é opcionalmente tratado com uma combinação do anticorpo VEGF, e um ou mais agente(s) quimioterápico(s). Em uma modalidade, pelo menos um dos agentes quimioterápicos é um taxóide. A administração combinada inclui coadministração ou administração concomitante, usando formulações sepa- radas ou uma única formulação farmacêutica, e administração consecutiva em qualquer ordem, em que preferivelmente existe um período de tempo enquanto ambos (ou todos) os agentes ativos simultaneamente exercem suas atividades biológicas. Desse modo, o agente quimioterápico pode ser administrado antes de, ou em seguida a, administração do antagonista es- pecífico de VEGF, por exemplo, anticorpo de VEGF. Nesta modalidade, o tempo entre pelo menos uma administração do agente quimioterápico e pelo menos uma administração do antagonista específico de VEGF, por exemplo, um anticorpo de VEGF, é preferivelmente de aproximadamente 1 mês ou menos e mais preferivelmente de aproximadamente 2 semanas ou menos. Alternativamente, o agente quimioterápico e o antagonista específico de VEGF, por exemplo, um anticorpo de VEGF são administrados concomitan- temente ao paciente, em uma única formulação ou formulações separadas. Tratamento com a combinação do agente quimioterápico (por exemplo, ta- xóide) e o anticorpo VEGF (por exemplo, bevacizumab) pode resultar em um benefício sinérgico, ou mais do que aditivo, terapêutico ao paciente.

O agente quimioterápico, se administrado, é geralmente admi- nistrado em dosagens conhecidas para o mesmo, ou opcionalmente reduzi- da devido à ação combinada dos fármacos ou efeitos colaterais negativos atribuíveis para administração do agente quimioterápico antimetabólito. Pre- paração e escalas de dosagem para tais agentes quimioterápicos podem ser usadas de acordo com as instruções do fabricante ou como determinado empiricamente pelo médico experiente. Onde o agente quimioterápico é o paclitaxel, preferivelmente, ele é administrado a cada semana (por exemplo, a 80 mg/m2) ou a cada 3 semanas (por exemplo, em 175 mg/m2 ou 135 mg/m2). Dosagens de docetaxel adequadas incluem 60 mg/m2, 70 mg/m2, 75 mg/m2, 100 mg/m2 (a cada 3 semanas); ou 35 mg/m2 ou 40 mg/m2 (a cada semana).

Vários agentes quimioterápicos que podem ser combinados são descritos acima. Em certas modalidades da invenção, o agente quimioterá- ~ pico a ser combinado com o antagonista específico de VEGF1 por exemplo, um anticorpo de VEGF1 inclui, porém não está limitado a, por exemplo, um taxóide (incluindo docetaxel e paclitaxel), vinca (tal como vinorelbina ou vin- blastina), composto de platina (tal como carboplatina ou cisplatina), inibidor de aromatase (tal como letrozol, anastrazol, ou exemestano), antiestrogênio (por exemplo, fulvestrant ou tamoxifeno), etoposida, tiotepa, ciclofosfamida, metotrexato, doxorubicina lipossômica, doxorubicina lipossômica pegilada, capecitabina, gencitabina, inibidor de COX-2 (por exemplo, celecoxib), ou inibidor de proteossoma (por exemplo, PS342).

Onde uma antraciclina (por exemplo, doxorubicina ou epirubici- na) é administrada ao indivíduo, preferivelmente esta é administrada antes da e/ou em seguida à administração do antagonista específico de VEGF, por exemplo, bevacizumab. Entretanto, uma antraciclina modificada, tal como doxorubicina lipossômica (TLC D-99 (MIOCET®), doxorubicina lipossômica pegilada (CAELYX®), ou epirubicina, com toxicidade cardíaca reduzida, pode ser combinada com o antagonista específico de VEGF, por exemplo, bevaci- zumab.

Em uma modalidade de uma escala de administração, a terapia adjuvante da invenção compreende uma primeira etapa em que um antago- nista específico de VEGF, por exemplo, bevacizumab, e um ou mais agentes quimioterápicos são administrados aos pacientes em uma pluralidade de ciclos neoadjuvantes, seguido por uma cirurgia para definitivamente remover o tumor. Cada ciclo neoadjuvante consiste em uma a três semanas, depen- dendo do plano de tratamento particular. Por exemplo, um ciclo de tratamen- to pode ser de três semanas, no qual se pretende que os pacientes recebam uma dose de quimioterapia e uma dose de bevacizumab a cada três sema- nas. Um ciclo de tratamento pode também ser duas semanas, no qual se pretende que os pacientes recebam uma dose de quimioterapia e uma dose de bevacizumab semana sim, semana não. O primeiro estágio inteiro de tra- tamento neoadjuvante pode estender-se por cerca de 4 a 8 ciclos. Em certas modalidades da invenção, a terapia adjuvante estende-se por menos de um ano, em uma modalidade, menos do que seis meses antes da cirurgia. De- pendendo do tipo e severidade da doença, dosagens preferidas para o anta- gonista específico de VEGF1 por exemplo, bevacizumab, são na faixa de cerca de Vg/kg a cerca de 50 mg/kg, mais preferivelmente de cerca de 5 mg/kg a cerca de 15 mg/kg, incluindo porém não-limitado a 7,5 mg/kg ou 10 mg/kg. Em alguns aspectos, o regime de quimioterapia envolve a adminis- tração tradicional intermitente de alta dose. Em alguns outros aspectos, o agente quimioterápico é administrado usando doses menores e mais fre- qüentes sem interrupções da escala ("quimioterapia metronômica"). O pro- gresso da terapia da invenção é facilmente monitorada por ensaios e técni- cas convencionais.

Com exceção do anticorpo VEGF e do agente quimioterápico, outros regimes terapêuticos podem ser combinados com eles. Por exemplo, um segundo (terceiro, quarto, etc) agente(s) quimioterápico(s) pode(m) ser administrado(s), em que o segundo agente quimioterápico é ou outro, agente quimioterápico taxoide diferente, ou um agente quimioterápico que não é um taxóide. Por exemplo, o segundo agente quimioterápico pode ser um taxóide (tal como paclitaxel ou docetaxel), um vinca (tal como vinorelbina), a com- posto de platina (tal como cisplatina ou carboplatina), um agente anti- hormonal (tal como um inibidor de aromatase ou antiestrogênio), gencitabi- na, capecitabina, etc. Combinações exemplares incluem composto de plati- na/taxoide, gencitabina/taxóide, gencitabina/vinorelbina, vinorelbina/taxóide, capecitabina/taxóide, etc. "Coqueteis" de diferentes agentes quimioterápicos podem ser administrados.

Outros agentes terapêuticos que podem ser combinados com o anticorpo VEGF incluem qualquer um ou mais de: outro antagonista de VEGF ou um antagonista de receptor de VEGF tal como um segundo anti- corpo anti-VEGF, variantes de VEGF, fragmentos de receptor de VEGF so- lúveis, aptâmeros capazes de bloqueio VEGF ou VEGFR, anticorpos anti- VEGFR neutralizantes, inibidores de VEGFR tirosina cinases e quaisquer combinações dos mesmos. Outros agentes terapêuticos úteis para terapia de tumor de combinação com o anticorpo da invenção incluem antagonista de outros fatores que são envolvidos em crescimento de tumor, tais como EGFR, ErbB2 (também conhecidos como Her2) ErbB3, ErbB4, ou TNF. Em uma modalidade exemplar, a composição para o antagonista específico de VEGF não inclui um anti-ErbB2 anticorpo, ou fragmento ou derivado do mesmo (por exemplo, o Herceptin® anticorpo). Em certas modalidades da invenção, o anticorpo anti-VEGF pode ser usado em combinação com inibi- dores de tirosina cinase receptora de molécula pequena (RTKIs) que alve- jam um ou mais receptores de tirosina cinase tais como receptores de VEGF, receptores de FGF, receptores de EGF e receptores de PDGF. Mui- tos RTKIs de molécula pequena terapêuticos são conhecidos na técnica, incluindo, porém não estão limitados a, vatalanib (PTK787), erlotinib (TAR- CEVA®), OSI-7904, ZD6474 (ZACTIMA®), ZD6126 (ANG453), ZD1839, suni- tinib (SUTENT®), semaxanib (SU5416), AMG706, AG013736, Imatinib (GLEEVEC®), MLN-518, CEP-701, PKC- 412, Lapatinib (GSK572016), VEL- CADE®, AZD2171, sorafenib (NEXAVAR®), XL880, e CHIR-265.

Dosagens adequadas para quaisquer dos agentes coadministra- dos acima são aquelas atualmente usadas e podem ser reduzidas devido à ação combinada (sinergia) do agente e anticorpo de VEGF.

Em adição aos regimes terapêuticos acima, o paciente pode ser submetido à terapia de radiação.

Em certas modalidades da invenção, o anticorpo VEGF adminis- trado é um anticorpo nu intacto. Entretanto, o anticorpo VEGF pode ser con- jugado com um agente citotóxico. Em certas modalidades, o anticorpo con- jugado e/ou antígeno ao qual ele é ligado é/são internalizados pela célula, resultando em eficácia terapêutica aumentada do conjugado em matar a cé- lula de câncer à qual ele liga-se. Em uma modalidade, o agente cititóxico alveja ou interfere com ácido nucléico na célula de câncer. Exemplos de tais agentes citotóxicos incluem maytansinoides, caliqueamicinas, ribonucleases e DNA endonucleases. VII. Terapia Adiuvante

A invenção fornece um método de terapia adjuvante compreen- dendo administrar um antagonista específico de VEGF, por exemplo, um anticorpo de VEGF, a um indivíduo com câncer não-metastático, em seguida· à cirurgia definitiva.

Por exemplo, um método pode incluir as seguintes etapas: a) um primeiro estágio compreendendo uma pluralidade de ciclos de tratamento em que cada ciclo compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um antagonista específico de VEGF1 por exemplo, bevacizumab, e opcionalmente, pelo menos um agente quimioterápico em um intervalo pre- determinado; e b) um segundo estágio compreendendo uma pluralidade de ciclos de manutenção em que cada ciclo compreende administrar ao indiví- duo uma quantidade eficaz de um antagonista específico de VEGF, por e- xemplo, bevacizumab, sem qualquer agente quimioterápico em um intervalo predeterminado; em que os primeiro e segundo estágios combinados esten- dem-se por pelo menos um ano após o tratamento pós-operatório inicial. Em uma modalidade, o primeiro estágio compreende uma primeira pluralidade de ciclos de tratamento em que um antagonista específico de VEGF, por exemplo, bevacizumab, e um primeiro regime de quimioterapia são adminis- trados, seguido por uma segunda pluralidade de ciclos de tratamento em que um antagonista específico de VEGF, por exemplo, bevacizumab, e um segundo regime de quimioterapia são administrados.

Para terapia adjuvante, o antagonista específico de VEGF pode ser administrado em uma quantidade ou durante um tempo (por exemplo, durante um regime terapêutico particular em tempo prolongado) para reduzir (por exemplo, de 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais) o número de células de câncer no tumor; para reduzir o tamanho do tumor; para reduzir a carga do tumor; para inibir (isto é, para diminuir em alguma extensão e/ou interromper) a infiltração de célula de câncer em ór- gãos periféricos; para reduzir densidade de vaso no tumor; para inibir metás- tase de tumor; para reduzir ou inibir o crescimento de tumor ou proliferação de célula de tumor; para reduzir ou prevenir o crescimento de um tumor ina- tivo; para reduzir ou prevenir o crescimento ou proliferação de uma microme- tástase; para reduzir ou prevenir o novo crescimento de um tumor após tra- tamento ou remoção; e/ou para aliviar em alguma extensão um ou mais dos sintomas associados com o câncer. Em algumas modalidades adicionais, o antagonista específico de VEGF pode ser usado para prevenir a ocorrência ou recorrência de câncer no indivíduo. Em um exemplo, a prevenção de re- corrência de câncer é avaliada em uma população de indivíduos após cerca de quatro anos para confirmar que nenhuma recorrência de doença ocorreu em pelo menos cerca de 80% da população. Em outro exemplo, a prevenção de recorrência da doença é avaliada em cerca de 3 anos, em que a recor- rência da doença é diminuída em pelo menos cerca de 50% em comparação aos indivíduos tratados com quimioterapia apenas.

O antagonista específico de VEGF é geralmente administrado após um período de tempo em que o indivíduo já se recuperou da cirurgia. Este período de tempo pode incluir o período requerido para cicatrização de ferimento ou cicatrização da incisão cirúrgica, o período de tempo requerido para reduzir o risco de deiscência do ferimento, ou o período de tempo re- querido para o indivíduo retornar a um nível de saúde essencialmente similar a ou melhor do que o nível de saúde antes da cirurgia. O período entre a conclusão da cirurgia definitiva e a primeira administração do antagonista específico de VEGF pode também incluir o período necessário para um feri- dado de fármaco, em que o indivíduo requer ou solicita um período de tempo entre os regimes terapêuticos. Geralmente, o período de tempo entre con- clusão de cirurgia definitiva e o início do antagonista específico de terapia de VEGF pode incluir menos do que uma semana, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas (28 dias), 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 se- manas, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, meses, 11 meses, 1 ano, 2 anos, 3 anos, ou mais. Em uma modalidade, o período de tempo entre cirurgia definitiva e a administração do antagonista específico de VEGF é maior do que 2 semanas e menor do que 1 ano.

Em um exemplo, o antagonista específico de VEGF, por exem- plo, um anticorpo de VEGF, é administrado em uma quantidade eficaz para estender a sobrevivência livre de doença (DFS) ou sobrevivência geral (OS), em que o DFS ou o OS é avaliado durante 2 a 5 anos após um initial admi- nistração do anticorpo. Em certas modalidades, o indivíduo DFS ou OS é avaliado durante 3-5 anos, cerca de 4-5 anos, ou pelo menos cerca de 4, ou - -15

pelo menos cerca de 5 anos após início de tratamento ou após diagnóstico inicial.

O antagonista específico de VEGF, por exemplo, um anticorpo de VEGF, é administrado a um indivíduo, por exemplo, um paciente humano, de acordo com métodos conhecidos, tais como administração intravenosa, por exemplo, como um bolo ou por infusão contínua durante um período de tempo, por rotinas intramuscular, intraperitoneal, intracerobrospinhal, subcu- tânea, intra-articular, intrassinovial, intratecal, oral, tópica, ou inalação. Ad- ministração intravenosa do anticorpo é preferida. O antagonista específico de VEGF podem ser administrado co-

mo um único agente. Em outras modalidades o paciente é tratado com a combinação do antagonista específico de VEGF, e um ou mais agente(s) quimioterápico(s). Em algumas modalidades, pelo menos um dos agentes quimioterápicos é um taxóide. A administração combinada inclui coadminis- tração ou administração concomitante, usando formulações separadas ou uma única formulação farmacêutica, e administração consecutiva em qual- quer ordem, em que opcionalmente existe um período de tempo enquanto ambos (ou todos) os agentes ativos simultaneamente exercem suas ativida- des biológicas. Desse modo, o agente quimioterápico pode ser administrado antes de, ou em seguida a, administração do antagonista específico de VEGF, por exemplo, um anticorpo de VEGF. Nesta modalidade, o tempo entre pelo menos uma administração do agente quimioterápico e pelo menos uma administração do antagonista específico de VEGF, por exemplo, um anticorpo de VEGF, é preferivelmente aproximadamente 1 mês ou menos, e mais preferivelmente aproximadamente 2 semanas ou menos. Alternativa- mente, o agente quimioterápico e o anticorpo VEGF são administrados con- comitantemente ao paciente, em uma única formulação ou formulações se- paradas. tratamento com a combinação do agente quimioterápico (por e- xemplo, taxóide) e o anticorpo VEGF (por exemplo, bevacizumab) pode resultar em um benefício sinérgico, ou mais do que aditivo, terapêutico ao paciente. O agente quimioterápico, se administrado, é geralmente admi- nistrado em dosagens conhecidas para o mesmo, ou opcionalmente reduzi- - 15 92

da devido à ação combinada dos fármacos ou efeitos colaterais negativos atribuíveis para administração do agente quimioterápico antimetabólito. Pre- paração e escalas de dosagem para tais agentes quimioterápicos podem ser usadas de acordo com as instruções do fabricante ou como determinado empiricamente pelo médico experiente. Onde o agente quimioterápico é o paclitaxel, preferivelmente, ele é administrado a cada semana (por exemplo, a 80 mg/m2) ou a cada 3 semanas (por exemplo, a 175 mg/m2 ou 135 mg/m2). Dosagens de docetaxel adequadas incluem 60 mg/m2, 70 mg/m2, 75 mg/m2, 100 mg/m2 (a cada 3 semanas); ou 35 mg/m2 ou 40 mg/m2 (a cada semana).

Vários agentes quimioterápicos que podem ser combinados são descritos acima. Exemplos de agentes quimioterápicos a serem combinados com o anticorpo VEGF incluem, porém não estão limitados a, por exemplo, um taxóide (incluindo docetaxel e paclitaxel), vinca (tal como vinorelbina ou vinblastina), composto de platina (tal como carboplatina ou cisplatina), inibi- dor de aromatase (tal como letrozol, anastrazol, ou exemestano), antiestro- gênio (por exemplo, fulvestrant ou tamoxifeno), etoposida, tiotepa, ciclofos- famida, metotrexato, doxorubicina lipossômica, doxorubicina lipossômica pegilada, capecitabina, gencitabina, inibidor de COX-2 (por exemplo, celeco- xib), ou inibidor de proteossoma (por exemplo, PS342).

Onde uma antraciclina (por exemplo, doxorubicina ou epirubici- na) é administrada ao indivíduo, preferivelmente esta é administrada antes da e/ou em seguida à administração do anticorpo VEGF, tal como nos proto- colos descritos no exemplo abaixo onde uma combinação de antracicli- na/ciclofosfomida foi administrada ao indivíduo em seguida à cirurgia, porém antes da administração do anticorpo VEGF e taxóide. Entretanto, uma antra- ciclina modificada, tais como doxorubicina lipossômica (TLC D-99 (MIO- CET®), doxorubicina lipossômica pegilada (CAELYX®), ou epirubicina, com toxicidade cardíaca reduzida, podem ser combinadas com o anticorpo VEGF.

Em uma escala de administração, a terapia adjuvante da inven- ção compreende um primeiro estágio em que um antagonista específico de VEGF1 por exemplo, um anticorpo de VEGF, e um ou mais agentes quimio- terápicos são administrado aos pacientes em uma pluralidade de tratamento ciclos; e um segundo estágio em que um antagonista específico de VEGF, por exemplo, um anticorpo de VEGF, é usado como um agente individual em uma pluralidade de ciclos de manutenção. Cada ciclo de tratamento consiste em uma a três semanas, dependendo do plano de tratamento particular. Por exemplo, um ciclo de tratamento pode incluir bevacizumab como o antago- nista específico de VEGF e pode ser de três semanas, no qual se pretende que os pacientes recebam uma dose de quimioterapia e uma dose de beva- cizumab a cada três semanas. Um ciclo de tratamento pode também ser de duas semanas, no qual se pretende que os pacientes recebam uma dose de quimioterapia e uma dose de bevacizumab, semana sim, semana não. O primeiro estágio de tratamento inteiro pode estender-se por cerca de 4 a 8 ciclos. Durante o segundo, estágio de manutenção, o bevacizumab é admi- nistrado duas vezes ou três vezes por semana, dependendo da duração do ciclo particular, e durante um total de cerca de 30 a 50 ciclos. Em certas mo- dalidades, a terapia adjuvante estende-se por pelo menos um ano a partir do início do tratamento, e o progresso do indivíduo será seguido após aquele tempo. Dependendo do tipo e severidade da doença, dosagens preferidas para o anticorpo VEGF são na faixa de cerca de 1 ug/kg a cerca de 50 mg/kg, mais preferivelmente de cerca de 5 mg/kg a cerca de 15 mg/kg, inclu- indo porém não-limitado a 7,5 mg/kg ou 10 mg/kg. Em alguns aspectos, o regime de quimioterapia envolve um administração tradicional intermitente de alta dose. Em alguns outros aspectos, o agente quimioterápico é adminis- trado usando doses menores e mais freqüentes sem interrupções da escala ("quimioterapia metronômica"). O progresso da terapia da invenção é facil- mente monitorada por ensaios e técnicas convencionais.

A administração do anticorpo e a quimioterapia podem diminuir a probabilidade de recorrência da doença (recorrência de câncer no órgão primário e/ou recorrência distante), em uma população de indivíduos em cerca de 50% em 3 anos (onde "cerca de 50%" aqui, inclui uma faixa de cer- ca de 45% a cerca de 70%), por exemplo, diminui a recorrência no órgão primário em cerca de 52% em 3 anos, e/ou diminui recorrência distante em cerca de 53% em 3 anos, em comparação com indivíduos tratados com qui- mioterapia (por exemplo, taxóide, tais como paclitaxel) sozinho.

A invenção aqui fornece um método de cura de câncer não- metastático em uma população de indivíduos humanos com câncer não- metastático compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um anta- gonista específico de VEGF1 por exemplo, um anticorpo de VEGF1 e pelo menos um agente quimioterápico ao indivíduo em seguida à cirurgia definiti- va, e avaliar o indivíduo após quatro ou mais anos para confirmar que ne- nhuma recorrência de doença ocorreu após cerca de 4 anos em pelo menos cerca de 80% (preferivelmente pelo menos cerca de 85%) dos indivíduos. A população pode compreender 3000 ou mais indivíduos humanos.

A invenção também refere-se a um método de reduzir a probabi- lidade de recorrência da doença em uma população de indivíduos humanos com câncer não-metastático compreendendo administrar uma quantidade eficaz de bevacizumab e pelo menos um agente quimioterápico ao indiví- duos em seguida à cirurgia definitiva, em que a probabilidade de recorrência da doença é reduzida em pelo menos cerca de 50% em 3 anos em compa- ração com indivíduos tratados com taxóide sozinho.

Com exceção do anticorpo VEGF e o agente quimioterápico, outros regimes terapêuticos podem ser combinados com eles. Por exemplo, um segundo (terceiro, quarto, etc) agente(s) quimioterápico(s) pode(m) ser administrado(s), em que o segundo agente quimioterápico é ou outro agente quimioterápico taxóide diferente, ou um agente quimioterápico que não é um taxóide. Por exemplo, o segundo agente quimioterápico pode ser um taxóide (tal como paclitaxel ou docetaxel), um vinca (tal como vinorelbina), um com- posto de platina (tal como cisplatina ou carboplatina), um agente anti- hormonal (tal como um inibidor de aromatase ou antiestrogênio), gencitabi- na, capecitabina, etc. Combinações exemplares incluem composto de plati- na/taxoide, gencitabina/taxóide, gencitabina/vinorelbina, vinorelbina/taxóide, capecitabina/taxóide, etc. "Coqueteis" de diferentes agentes quimioterápicos podem ser administrados. - - 15

Outros agentes terapêuticos que podem ser combinados com o anticorpo VEGF incluem qualquer um ou mais de: outro VEGF antagonista ou um antagonista de receptor de VEGF tal como um segundo anticorpo an- ti-VEGF, variantes de VEGF, fragmentos de receptor de VEGF solúveis, ap- tâmeros capazes de bloquear VEGF ou VEGFR, anticorpos anti-VEGFR neutralizantes, inibidores de VEGFR tirosina cinases e quaisquer combina- ções dos mesmos. Outros agentes terapêuticos úteis para terapia de tumor de combinação com o anticorpo da invenção incluem antagonista de outros fatores que são envolvidos em crescimento de tumor, tais como EGFR, ErbB2 (também conhecidos como Her2) ErbB3, ErbB4, ou TNF. Em uma modalidade exemplar, a composição para o antagonista específico de VEGF não inclui um anti-ErbB2 anticorpo, ou fragmento ou derivado do mesmo (por exemplo, o Herceptin® anticorpo). Em certas modalidades, o anticorpo anti- VEGF pode ser usado em combinação com inibidores de tirosina cinase re- ceptora de molécula pequena (RTKIs) que alvejam um ou mais receptores de tirosina cinase tais como receptores de VEGF, receptores de FGF, recep- tores de EGF e receptores de PDGF. Muitos RTKIs de molécula pequena terapêuticos são conhecidos na técnica, incluindo, porém não estão limita- dos a, vatalanib (PTK787), erlotinib (TARCEVA®), OSI-7904, ZD6474 (ZAC- ΤΙΜΑ®), ZD6126 (ANG453), ZD1839, sunitinib (SUTENT®), semaxanib (SU5416), AMG706, AG013736, Imatinib (GLEEVEC®), MLN-518, CEP-701, PKC- 412, Lapatinib (GSK572016), VELCADE®, AZD2171, sorafenib (NE- XAVAR®), XL880, e CHIR-265.

Em certas modalidades, o anticorpo de VEGF administrado é um anticorpo nu intacto. Entretanto, o anticorpo de VEGF pode ser conjugado com um agente citotóxico. Em certas modalidades, o anticorpo conjugado e/ou antígeno ao qual ele é ligado é/são internalizados pela célula, resultan- do em eficácia terapêutica aumentada do conjugado em matar a célula de câncer à qual ele liga-se. Em uma modalidade, o agente cititóxico alveja ou interfere com ácidos nucléicos na célula de câncer. Exemplos de tais agen- tes citotóxicos incluem maitansinoides, caliqueamicinas, ribonucleases e DNA endonucleases. VIII. Dosaqes. Formulações, e Duração

O antagonista específico de composição de VEGF será formula- do, dosado, e administrado de um modo consistente em boa prática médica. Fatores para consideração neste contexto incluem o distúrbio particular que está sendo tratado, o indivíduo particular que está sendo tratado, a condição clínica do paciente individual, a causa do distúrbio, o sítio de liberação do agente, o método de administração, a escala de administração, e outros fa- tores conhecidos pelo práticos médicos. A "quantidade terapeuticamente eficaz" do antagonista específico de VEGF a ser administrada será regulada por tais considerações, e é a quantidade mínima necessária para prevenir, melhorar, ou tratar, ou estabilizar, um câncer benigno, pré-canceroso, ou de estágio precoce; ou para tratar ou prevenir a ocorrência ou recorrência de um tumor, um tumor inativo, ou a micrometástases, por exemplo, no cenário neoadjuvante ou adjuvante. O antagonista específico de VEGF não necessi- ta ser, porém é opcionalmente, formulado com um ou mais agentes conco- mitantemente usados para prevenir ou tratar câncer ou um risco de desen- volver um câncer. A quantidade eficaz de tais outros agentes depende da quantidade de antagonista específico de VEGF presente na formulação, o tipo de distúrbio ou tratamento, e outros fatores descritos acima. Estes são geralmente usados nas mesmas dosagens e com rotinas de administração como aqui usado antes ou cerca de 1 a 99% das dosagens até agora em- pregadas.

Dependendo do tipo e severidade da doença, cerca de 1 μg/kg a 100 mg/kg (por exemplo, 0,1 a 20 mg/kg) de antagonista específico de VEGF é uma dosagem candidata inicial para administração ao paciente, se- ja, por exemplo, por uma ou mais administrações separatas, ou por infusão contínua. Uma dosagem diária típica pode variar de cerca de 1 μg/kg a cerca de 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. As do- sagens particularmente desejáveis incluem, por exemplo, 7,5 mg/kg, 10 mg/kg, e 15 mg/kg. Para administrações repetidas durante diversos dias ou maios, dependendo da condição, o tratamento é prolongado até o câncer ser tratado, como avaliado pelos métodos descritos acima ou conhecidos na técnica. Entretanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis. Em um exemplo, se o antagonista específico de VEGF for um anticorpo, o anticorpo da invenção é administrado uma vez a cada semana, cada duas semanas, ou a cada três semanas, em uma faixa de dose de cerca de 5 mg/kg a cerca de 15 mg/kg, incluindo porém não-limitado a 7,5 mg/kg ou 10 mg/kg. O pro- gresso da terapia da invenção é facilmente monitorada por ensaios e técni- cas convencionais.

Em um exemplo, bevacizumab é o antagonista específico de VEGF. Bevacizumab é fornecido para usos terapêuticos em frasconetes de -15 uso único, livres de preservativo de 100 mg e 400 mg, para liberar 4 ml ou 16 ml de bevacizumab (25 mg/ml). Os 100 mg de produto são formulados em 240 mg de-hidrato de α,α-trealose, 23,2 mg de fosfato de sódio (mono- básico, mono-hidrato), 4,8 mg de fosfato de sódio (dibásico, anidroso), 1,6 mg de polissorbato 20, e água para injeção, USP. Os 400 mg de produto são formulados em 960 mg de-hidrato de α,α-trealose, 92,8 mg de fosfato de sódio (mono-hidrato monobásico), 19,2 mg de fosfato de sódio (dibásico, anidroso), 6,4 mg de polissorbato 20, e água para injeção, USP.

A duração da terapia continuará contanto que medicamente indi- cada ou até um efeito terapêutico desejado (por exemplo, aqueles descritos aqui) ser obtido. Em certas modalidades, o antagonista específico de terapia de VEGF é continuado durante 2 meses, 4 meses, 6 meses, 8 meses, 10 meses, 1 ano, 2 anos, 3 anos, 4 anos, 5 anos, ou durante toda a vida do in- divíduo.

Geralmente, o alívio ou tratamento de um câncer benigno, pré- canceroso, ou de estágio precoce ou o adjuvante ou terapia adjuvante de um câncer (benigno ou maligno) envolve a redução de um ou mais sintomas ou problemas médicos associados com o câncer. A quantidade terapeuticamen- ι

te eficaz do fármaco pode realizar um ou uma combinação dos seguintes para reduzir (por exemplo, em 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais) o número de células de câncer no tumor; para reduzir o ta- manho do tumor; para reduzir a carga do tumor; para inibir (isto é, para dimi- nuir em alguma extensão e/ou interromper) a infiltração de célula de câncer em órgãos periféricos; para reduzir densidade de vaso no tumor; para inibir a metástase de tumor; para reduzir ou inibir o crescimento de tumor ou prolife- ração de célula de tumor; para reduzir ou prevenir o crescimento de um tu- mor inativo; para reduzir ou prevenir o crescimento ou proliferação de uma micrometástase; para reduzir ou prevenir o novo crescimento de um tumor após tratamento ou remoção (por exemplo, em terapia adjuvante); para au- mentar ou estender o DFS ou OS de um indivíduo suscetível a ou diagnosti- cado com um tumor benigno, pré-canceroso, ou não-metastático ou maligno; para reduzir o tamanho de um tumor para permitir a cirurgia (por exemplo, - - 15 em terapia adjuvante ); e/ou para aliviar em alguma extensão um ou mais dos sintomas associados com o câncer. Em algumas modalidades adicio- nais, o antagonista específico de VEGF pode ser usado para prevenir a o- corrência ou recorrência de câncer no indivíduo. Em um exemplo, a preven- ção de recorrência de câncer é avaliada em uma população de indivíduos após cerca de quatro anos para confirmar que nenhuma recorrência de do- ença ocorreu em pelo menos cerca de 80% da população. Em outro exem- plo, a prevenção de recorrência da doença é avaliada em cerca de 3 anos, em que recorrência da doença é diminuída em pelo menos cerca de 50% em comparação aos indivíduos tratados com quimioterapia apenas. Em um exemplo, o antagonista específico de VEGF, por exem-

plo, um anticorpo de VEGF, é administrado em uma quantidade eficaz para estender a DFS ou OS, em que a DFS ou a OS é avaliada durante 2 a 5 a- nos após uma administração inicial do anticorpo. Em certas modalidades, a DFS

ou OS do indivíduo é avaliada durante 3 a 5 anos, cerca de 4 a 5 anos, ou pelo menos cerca de 4, ou pelo menos cerca de 5 anos após início de tratamento ou após diagnóstico inicial.

Em uma modalidade, a invenção pode ser usada para aumentar o tempo de sobrevivência de um indivíduo suscetível a ou diagnosticado com um tumor benigno, pré-canceroso, ou não-metastático. O tempo de so- brevivência é definido como o tempo desde a primeira administração do fár- maco até a morte. O tempo de sobrevivência pode também ser medido por relação estratificada de risco (HR) do grupo de tratamento versus o grupo de controle, que representa o risco de morte para um paciente durante o trata- mento.

Todavia em outra modalidade, o tratamento da invenção signifi- cantemente aumenta a taxa de resposta em um grupo de indivíduos, por exemplo, pacientes humanos, suscetíveis a ou diagnosticados com um cân- cer, que são tratados com várias terapias anticâncer. A taxa de resposta é definida como a percentagem de pacientes tratados que responderam ao tratamento. Em um aspecto, um tratamento de combinação da invenção u- sando um antagonista específico de VEGF e cirurgia, terapia de radiação, ou um ou mais agentes quimioterápicos significantemente aumenta a taxa de resposta no grupo de pacientes tratados em comparação com o grupo trata- do com cirurgia, terapia de radiação, ou quimioterapia apenas, o aumento tendo um valor-p Qui-quadrado menor do que 0,005.

O tratamento ou prevenção da ocorrência ou recorrência de um tumor, um tumor inativo, ou uma micrometástase envolve a prevenção de tumor ou formação de metástases, geralmente após tratamento inicial ou remoção de um tumor (por exemplo, usando uma terapia anticâncer tal como cirurgia, quimioterapia, ou terapia de radiação). A cirurgia pode deixar para trás células de tumor residuais, ou nódulos micrometastáticos inativos, que têm o potential de reativar o "programa angiogênico" e facilitar crescimento mais exponencial. Embora a presença de um tumor inativo ou micrometásta- ses não seja necessariamente detectável usando medições ou avaliações clínicas, uma quantidade terapeuticamente eficaz é aquela que é suficiente para prevenir ou reduzir a detecção de tumor inativo, micrometástases, me- tástases, ou recorrência de tumor usando técnicas conhecidas pelo médico. Em um exemplo, um indivíduo que é tratado de um tumor por remoção cirúr- gica do tumor é em seguida tratado com um antagonista específico de VEGF e monitorado em tempo prolongado quanto à detecção de um tumor inativo, micrometástases, ou recorrência de tumor. O antagonista específico de VEGF pode ser administrado em combinação com outra terapia anticâncer (por exemplo, antes de, com, ou após o antagonista específico de VEGF) e uma ou ambas as terapias podem ser continuadas como uma terapia de manutenção.

Avaliações adicionais da eficácia terapêutica no tratamento de cânceres são descritas na Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 20050186208.

Formulações terapêuticas são preparadas usando métodos pa- drões conhecidos na técnica misturando-se o ingrediente ativo tendo o grau de pureza desejado com veículos, excipientes ou estabilizantes fisiologica- mente aceitáveis opcionais (Remington1S Pharmaceutical Sciences (20a edi- ção), ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Filadélfia, PA). Portadores aceitáveis, incluem salina, ou tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico; polipeptí- deos de baixo peso molecular (menos do que cerca de 10 resíduos); proteí- nas, tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona, aminoácidos tais como glicina, glu- tamina, asparaginas, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelan- tes tal como EDTA; álcoois de açúcar tais como manitol ou sorbitol; contraí- ons formadores de sal tal como sódio; e/ou tensoativos não iônicos tais co- mo TWEEN®, PLURONICS®, ou PEG.

Opcionalmente, porém preferivelmente, a formulação contém um sal farmaceuticamente aceitável, tipicamente, por exemplo, cloreto de sódio, e preferivelmente em cerca de concentrações fisiológicas. Opcionalmente, as formulações da invenção podem conter um preservativo farmaceutica- mente aceitável. Em algumas modalidades a concentração de preservativo varia de 0,1 a 2,0%, tipicamente v/v. Os preservativos adequados incluem aqueles conhecidos nas técnicas farmacêuticas. Álcool benzílico, fenol, m- cresol, metilparabeno, e propilparabeno são exemplos de preservatives. Op- cionalmente, as formulações da invenção podem incluir um tensoativo far- maceuticamente aceitável em uma concentração de 0,005 a 0,02%.

A formulação inclusa pode também conter mais do que um com- posto ativo como necessário para a indicação particular que está sendo tra- tada, preferivelmente aqueles com atividades complementares que não se afetam adversamente um ao outro. Tais moléculas estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o propósi- to pretendido.

Os ingredientes ativos podem também ser apreendidos em mi- crocápsula preparada, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por po- limerização interfacial, por exemplo, microcápsula de gelatina ou hidroxime- tilcelulose e microcápsula de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de liberação de fármaco coloidal (por exemplo, lipossomas, micro- esferas de albumina, microemulsões, nano-partículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são descritas em Remington's Pharma- ceutical Sciences, supra.

Preparações de liberação sustentada podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem ma- trizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anticor- po, cujas matrizes são na forma de artigos modelados, por exemplo, pelícu- las, ou microcápsula. Exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogeis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), ou po- li(vinilálcool)), polilactidas (Patente dos Estados Unidos n° 3.773.919), copo- límeros de ácido L-glutâmico e γ etil-L-glutamato, não acetato de etileno- vinila degradável, copolímeros de ácido lático-ácido glicólico degradáveis tais como o LUPRON DEPOT® (microesferas injetáveis compostas de copo- límero de ácido lático-ácido glicólico e acetato de leuprolida), e ácido poli-D- (-)-3-hidroxibutírico. Enquanto polímeros tais como acetato etileno-vinila e ácido lático-ácido glicólico possibilitam a liberação de moléculas por mais de 100 dias, certos hidrogeis liberam proteínas durante períodos de tempo me- nores. Quando anticorpos encapsulados permanecem no corpo durante um longo tempo, eles podem desnaturar ou agregar-se como um resultado de exposição à umidade a 37°C, resultando em uma perda de atividade biológi- ca e possíveis mudanças em imunogenicidade. Estratégias racionais podem ser planejadas para estabilização dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se o mecanismo de agregação for descoberto ser formação de li- gação S-S intermolecular por meio de altemação de tio-dissulfeto, a estabili- zação pode ser obtida por modificação de resíduos de sulfidrila, liofilização de soluções acídicas, controle de teor de umidade, usando aditivos apropri- ados, e desenvolvimento de composições de matriz polímera específicas.

Os antagonistas específicos de VEGF da invenção são adminis- trados a um indivíduo, por exemplo, um paciente humano, de acordo com métodos conhecidos, tais como administração intravenosa como um bolo ou por infusão contínua durante um período de tempo, por rotinas intramuscula- res, intraperitoneais, intracerobrospinhais, subcutâneas, intra-articulares, intrassinoviais, intratecais, orais, tópicas, ou inalação. A administração local é particularmente desejada se efeitos colaterais ou toxicidade extensos são associados com antagonismo de VEGF. Uma estratégia ex vivo pode tam- bém ser usada para aplicações terapêuticas. Estratégias ex vivo involvem transferir ou transduzir células obtidas do indivíduo com um polinucleotídeo codificando um antagonista de VEGF. As células transfectadas ou transduzi- das são então retornadas ao indivíduo. As células podem ser quaisquer de uma ampla faixa de tipos incluindo, sem limitação, células hematopoiéticas (por exemplo, células da medula óssea, macrófagos, monócitos, células dendríticas, células T, ou células B), fibroblastos, células epiteliais, células endoteliais, ceratinócitos, ou células musculares.

Por exemplo, se o antagonista específico de VEGF é um anti- corpo, o anticorpo é administrado por quaisquer métodos adequados, inclu- indo parenteral, subcutâneo, intraperitoneal, intrapulmonar, e intranasal, e, se desejado para tratamento imunossupressivo local, administração intrale- sional. Infusões parenterais incluem administração intramuscular, intraveno- sa, intraarterial, intraperitoneal, ou subcutânea. Além disso, o anticorpo é adequadamente administrado por infusão por pulso, particularmente com declínio de doses do anticorpo. Preferivelmente a dosagem é administrada por injeções, mais preferivelmente injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte de se a administração é breve ou crônica.

Em outro exemplo, o antagonista específico de composto de VEGF é administrado localmente, por exemplo, por injeções diretas, quando o distúrbio ou localização do tumor permite, e as injeções podem ser repeti- das periodicamente. O antagonista específico de VEGF pode também ser liberado sistemicamente ao indivíduo ou diretamente às células de tumor, por exemplo, a um tumor ou um leito de tumor em seguida à incisão cirúrgica do tumor, a fim de prevenir ou reduzir a recorrência local ou metástase, por exemplo, de um tumor inativo ou micrometástases.

Alternativamente, um inibidor de molécula de ácido nucléico ou polinucleotídeo contendo uma seqüência de ácido nucléico codificando um antagonista específico de VEGF pode ser liberado para as células apropria- das no indivíduo. Em certas modalidades, os ácidos nucléicos podem ser direcionados para o próprio tumor.

Os ácidos nucléicos podem ser introduzidos nas células por quaisquer métodos apropriados para o vetor empregado. Muitos dos tais métodos são bem conhecidos na técnica (Sambrook e outro, supra, e Wat- son e outro, Recombinant DNA, Capítulo 12, 2a edição, Scientific American Books, 1992). Exemplos de métodos de liberação de gene incluem transfec- ção mediada por lipossoma, eletroporação, métodos de fosfato de cál- cio/dextrana de DEAE, pistola de gene, e microinjeção. IX. Terapias de Combinação

A invenção também caráteriza o uso de uma combinação de dois ou mais antagonistas específicos de VEGF da invenção ou a combina- ção de pelo menos um antagonista específico de VEGF com uma ou mais terapias anticâncer adicionais. Exemplos de terapias anticâncer incluem, sem limitação, cirurgia, terapia de radiação (radioterapia), bioterapia, imuno- terapia,quimioterapia, ou uma combinação destas terapias. Além disso, a- gentes citotóxicos, agentes antiangiogênicos e antiproliferativos podem ser usados em combinação com o antagonista específico de VEGF.

Em um exemplo, o antagonista específico de VEGF é usado como terapia adjuvante para o tratamento de um câncer não-metastático em seguida à cirurgia definitiva. Neste exemplo, o antagonista específico de VEGF pode ser fornecido com ou sem pelo menos um agente quimioterápico adicional.

Em outro exemplo, o antagonista específico de VEGF é usado como terapia adjuvante para o tratamento de um câncer operável antes da cirurgia. Neste exemplo, o antagonista específico de VEGF pode ser forneci- do antes da cirurgia com ou sem pelo menos um agente quimioterápico adi- cional.

Em um exemplo, a invenção caráteriza o uso de um antagonista específico de VEGF com um ou mais agentes quimioterápicos (por exemplo, um coquetel). Exemplos não-limitantes de agentes quimioterápicos incluem irinotecan, fluorouracil, leucovorina, ou qualquer combinação dos mesmos. A administração combinada inclui administração simultânea, usando formula- ções separadas ou uma única formulação farmacêutica, e administração consecutiva em qualquer ordem, em que preferivelmente existe um período de tempo enquanto ambos (ou todos) os agentes ativos simultaneamente exercem suas atividades biológicas. Preparação e escalas de dosagem para tais agentes quimioterápicos podem ser usadas de acordo com as instruções do fabricante ou como determinado empiricamente pelo médico experiente. Preparação e escalas de dosagem forquimioterapia são também descritas em Chemotherapy Service Ed., M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimais, Md. (1992). O agente quimioterápico podem preceder, ou seguir a adminis- tração do antagonista específico de VEGF ou pode ser administrado simul- taneamente com ele.

A formulação aqui pode também conter mais do que um com- posto ativo como necessário para a indicação particular que está sendo tra- tada, preferivelmente aqueles com atividades complementares que não se afetam adversamente mutuamente. Por exemplo, pode ser desejável tam- bém fornecer anticorpos que se ligam ao EGFR, VEGF (por exemplo, um anticorpo que se liga a diferentes epítopos em VEGF), VEGFR, ou ErbB2 (por exemplo, Herceptin®) em uma formulação. Em uma modalidade exem- plar, a composição para o antagonista específico de VEGF não inclui um anticorpo anti-ErbB2, ou fragmento ou derivado do mesmo (por exemplo, o anticorpo Herceptin®). Alternativamente, ou além disso, a composição pode compreender um agente citotóxico, citocina, agente inibidor de crescimento e/ou antagonista de VEGFR de molécula pequena. Tais moléculas estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são efica- zes para o propósito pretendido.

Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropri- ada de antagonista específico de VEGF dependerá do tipo de doença a ser tratada, como acima definido, a severidade e curso da doença, se o antago- nista específico de VEGF for administrado para os propósitos preventivos ou terapêuticos, terapia prévia, a história clínica do paciente e resposta ao an- tagonista específico de VEGF, e a discreção do medido atendente. O anta- gonista específico de VEGF é adequadamente administrado ao paciente de uma só vez ou durante uma série de tratamentos. Em um regime de terapia de combinação, o antagonista específico de VEGF e o um ou mais agente terapêutico anticâncer da invenção são administrados em uma quantidade terapeuticamente eficaz ou sinérgica. Como aqui usado, uma quantidade terapeuticamente eficaz é tal que a coadministração de um antagonista es- pecífico de VEGF e um ou mais outros agentes terapêuticos, ou a adminis- tração de uma composição da invenção, resulte em redução ou inibição do câncer como descrito acima. Uma quantidade terapeuticamente sinérgica é aquela quantidade de um antagonista específico de VEGF e um ou mais ou- tros agentes terapêuticos necessária para sinérgica ou significantemente reduzir ou eliminar condições ou sintomas associados com uma doença par- ticular.

O antagonista específico de VEGF e o um ou mais outros agen- tes terapêuticos podem ser administrados simultanea ou seqüencialmente em uma quantidade e durante um tempo suficiente para reduzir ou eliminar a ocorrência ou recorrência de um tumor, um tumor inativo, ou a micrometás- tases. O antagonista específico de VEGF e um ou mais outros agentes tera- pêuticos podem ser administrados como terapia de manutenção para preve- nir ou reduzir a probabilidade de recorrência do tumor.

O antagonista específico de VEGF pode ser embalado sozinho ou em combinação com outros compostos terapêuticos anticâncer como um kit. O kit pode incluir componentes opcionais que auxiliam na administração da dose unitária aos pacientes, tais como frasconetes para formas de pó para reconstituição, seringas para injeção, sistemas de liberação IV customi- zada, inalantes, etc. Adicionalmente, o kit de dose unitária pode conter ins- truções para preparação e administração das composições. O kit pode ser fabricado como uma dose unitária de uso individual para um paciente, múlti- plos usos para um paciente particular (em uma dose constante ou em que os compostos individuais podem variar em potência quando a terapia prosse- gue); ou o kit pode conter múltiplas doses adequadas para administração a múltiplos pacientes ("embalagem a granel"). Os componentes do kit podem ser agrupados em cartões, pacotes de empolas, frascos, tubos, e similares. X. Artigos de Fabricação

Em outra modalidade da invenção, é fornecido um artigo de fa- bricação contendo materiais úteis para o tratamento dos distúrbios descritos acima. O artigo de fabricação compreende um recipiente, um rótulo e um suplemento de embalagem. Recipientes adequados incluem, por exemplo, frascos, frasconetes, seringas, etc. Os recipientes podem ser formados de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. O recipiente retém uma composição que é eficaz para tratar a condição e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução in- travenosa ou um frasconete tendo um tampão perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um an- ticorpo anti-VEGF. O rótulo sobre, ou associado com, o recipiente indica que a composição é usada para tratar a condição de escolha. O article de fabri- cação pode também compreender um segundo recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como salina tamponada por fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Ele pode também incluir outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, e seringas. Além disso, o article de fabricação compreende um suplemento de embalagem com ins- truções para uso, incluindo, por exemplo, um aviso de que a composição não deve ser usada em combinação com outra composição, ou instruindo o usuário da composição para administrar a composição de anticorpo anti- VEGF sozinha ou em combinação com uma composição anticâncer a um paciente. O termo "instruções para uso" significa fornecer direções para te- rapia aplicável, medicação, tratamento, regimes de tratamento, e similares, por quaisquer métodos, por exemplo, em escrita, tal como na forma de su- plementos de embalagem ou outros materiais promocionais escritos. X. Depósito de Materiais

A seguinte linhagem de célula de hibridoma foi depositada sob as provisões do Tratado de Budapest com a American Type Culture Collecti- on (ATCC), Manassas, VA, USA: Designação Anticorpo ATCC N0 Data Depósito A4.6.1 ATCC HB-10709 29 de março 1991 EXEMPLOS

Exemplo 1: Inibição de VEGF-A resulta em Interrupção de Crescimento de Adenoma Intestinal e Sobrevivência a Longo Prazo de Camundongos Apc-

min/+

A síndrome de Polipose adenomatosa familiar (FAP) e a maioria de cânceres colorretais esporádicos é causada por mutações no gene APC. Pacientes de FAP desenvolvem centenas a milhares de pólipos adenomato- sos em seu trato gastrointestinal inferior (GI)1 além de tumores extra- colônicos, que incluem desmoides e tumores do trato Gl superior. Camun- dongos Apcm,n/+ com um alelo de truncação heterozigoto no códon 850 imi- tam algumas caráterísticas da polipose de pacientes de FAP com mutação APC de linha germinativa (Moser e outro, Science 247:322-324 (1990), Su e outro, Science 256:668-670 (1992)). O início de formação de tumor em ca- mundongos Apcmin/+ é na idade adulta precoce e os animais tipicamente de- senvolvem 60 a 150 pólipos intestinais em uma base genética de C57BL/6. O desenvolvimento de tumor resulta em uma longevidade severamente comprometida dos camundongos, geralmente resultando em morte por a- nemia e/ou hipoproteinemia (Moser e outro, Science 247:322-324 (1990)) em torno da idade de cinco meses. Enquanto humanos com FAP tipicamen- te desenvolvem colônicos, camundongos Apcmin/+, por razões que não são completamente entendidas, desenvolvem vasta maioria de pólipos no intes- tino pequeno. Estes pólipos atingem um tamanho de 1 a 2 mm em diâmetro, enquanto pólipos maiores (até 4 mm em diâmetro) surgem em uma menor freqüência. Apenas adenomas colônicos ocasionais são observados, com apenas 0 a 3 por animal.

Apc foi reportado estar envolvido em processos celulares inclu- indo proliferação, apoptose, migração celular, adesão celular, montagem de microtúbulo, transdução de sinal, e segregação de cromossoma (revisado em Nathke, Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 20:337-366 (2004)). A função de Apc melhor estudada é seu papel como um regulator de beta-catenina sobre a trilha de sinalização Wnt (revisada em Nathke, Mol. Pathol. 52:169-173 (1999)). Em síntese, na ausência de sinalização de Wnt, Apc liga-se à axina e GSK-3beta cinase para formar um complexo de destruição para beta- catenina citoplásmica, desse modo prevenindo sua translocação nuclear e a subsequente ativação da família de fator de célula T/fator realçador Iinfoide (TCF/LEF) de fatores de transcrição. O alvo transcricional de TCF/LEF inclui moléculas envolvidas em trilhas celulares acima mencionadas.

A investigação dos mecanismos de crescimento de tumor em xenoenxertos tem algumas limitações, visto que estes modelos não recapitu- Iam o desenvolvimento de tumor em um cenário natural. Para examinar os efeitos de terapia antiangiogênica sobre um modelo de tumor não maligno geneticamente predisposto de ocorrência natural, estudamos o modelo Apc- min/+ de adenomatose intestinal. No seguinte exemplo, o fenótipo de tumor de camundongos Apcmm/+ foi analisado após tratamento a curto e longo prazo com o antagonista específico exemplar de VEGF, anti-VEGF-A mAb, bem como após uma deleção genética de VEGF-A por tecnologia Cre-LoxP em células epiteliais intestinais.

Para os experimentos descritos abaixo, camundongos Apcmin/+ (número de estoque 002020, 5) e camundongos 12.4KbVilCre (número de estoque 004586, daqui em diante ViIIinCre1 Madison e outro, J. Biol. Chem. 277:33275-33283 (2002)) foram obtidos do Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Camundongos VEGFl0X/l0X (daqui em diante VEGFlox) foram anteriormn- te publicados (Gerber e outro, Development 126:1149-1159 (1999)). Ca- mundongos foram alojados em microgaiolas isoladoras em uma facilidade de barreira e alimentados ad libitum. A manutenção de animais e protocolos experimentais foram conduzidos seguindo regulações federais e aprovados pelo Institutional Animal Care e Use Committee. Expressão de VEGF-A nos Adenomas Intestinais de Apcmin/+

Para investigar o padrão de expressão de VEGF-A em tumores intestinais de camundongo Apcmin/+, realizamos hibridização in situ em ade- nomas de camundongos com 14 semanas de idade. Para estes experimen- tos, hibridização in situ foi realizada como anteriormente descrito (Ferrara e outro, Am. J. Pathol. 162:1881-1893 (2003)). Em síntese, cortes de tecido intestinal embutidos em formalina tamponada neutra fixada, desidratada, e parafina foram desparafinizados e hidratados antes da desproteinação em Mg/ml de proteinase K durante 15 minutos a 37°C. Ribosondas de sentido e antissentido rotuladas por [33P]UTP foram hibridizadas a 55°C durante a noite, seguido por uma lavagem de alta rigorosidade a 55°C em 0.1 X de ci- trato de salina padrão durante 2 horas. As lâminas de vidro secas foram ex- postas durante 3 dias em temperatura ambiente a filme autoradiográfico Ko- dak BioMax MR (Eastman Kodak Co., Rochester, NY), seguido por mergu- Ihamento em emulsão de rastreamento nuclear NTB2 (Eastman Kodak Co.), exposição em caixas de lâminas de plástico seladas contendo dessecante durante 28 dias a 4°C, desenvolvimento, e contramanchamento com (hema- toxilina eosina) H&E. Sonda de VEGF-A foi preparada como anteriormente descrito (Ferrara e outro, Am. J. Pathol. 162:1881-1893 (2003)). O compri- mento da sonda de VEGF-A foi de 349 nucleotídeos correspondendo aos nucleotídeos 297-645 de NM_031836. A seqüência iniciadora superior foi 5'- CAA CGT CAC TAT GCA GAT CAT GCG (SEQ ID NO: 1); a seqüência ini- ciadora inferior foi 5 - GGT CTA GTT CCC GAA ACC CTG AG (SEQ ID NO: 2). Nestes experimentos de hibridização in situ, a expressão de VEGF-A foi observada nas células epiteliais com intensidade variável em comparação com epitélio viloso intestinal normal, enquanto que um sinal fo- calmente proeminente foi observado em células estromais dos adenomas, bem como na estroma dos vilos normais (Figuras 1A-F). Inibicão de VEGF-A Reduz a Carga de Tumor de Camundonaos Apcmin/*

Para determinar se terapia anti-VEGF-A seria eficaz na redução da carga de tumores intestinais benigno no camundongo, trata-se os ca- mundongos Apcmin/+ com o mAb G6-31 anti-VEGF-A em uma forma quiméri- ca humana-camundongo, para reduzir a possibilidade de eliciar uma respos- ta imune. O mAb G6-31 anti-VEGF-A foi derivado de bibliotecas de fago Fab humano como descrito (Liang e outro, J. Biol. Chem. 281:951-961 (2006)). Para gerar um anticorpo adequado para administração a longo prazo em camundongos, os domínios variáveis foram enxertados em domínio constan- te de lgG2a murino. mAb G6-31 (Liang e outro, J. Biol. Chem. 281:951-961 (2006)) ou lgG2a de murino de controle pareado com isótipo (anti-GP120), ambos na dose de 5 mg/kg, foi administrado intraperitonealmente uma vez por semana em um volume de 90-140 μΙ em PBS. Tratamentos foram conti- nuaram durante 3 semanas, 6 semanas, até um ano, ou até os camundon- gos serem encontrados morimbundos. Tratamento de 5 a 14 camundongos por cada grupo foi iniciado em 91 ±3 dias de idade.

Escolhe-se mAb G6-31 por causa de sua capacidade para po- tencialmente bloquear VEGF-A tanto de camundongo quanto humano (Liang e outro, J. Biol. Chem. 281:951-961 (2006)). Isto é diferende do mAb A.4.6.1 anti-VEGF bem caráterizado, que inibe VEGF-A humano, porém não de ca- mundongo (Gerber e outro, Câncer Res. 60:6253-6258 (2000), Liang e outro, J. Biol. Chem. 281:951-961 (2006)). Para estimar o feito a curto prazo de mAb G6-31 sobre a carga de tumor, tratamento de dez camundongos por coorte foi iniciado em treze semanas de idade e continuado durante 3 ou 6 semanas. Para determinar o fenótipo de tumor na idade de início de trata- mento, um um grupo de controle não tratado de doze camundongos foi ana- lisado em treze semanas de idade (dia 0). Tratamento com mAb anti-VEGF-A durante 3 ou 6 semanas sig- nificantemente reduziu a carga total de tumor nos camundongos Apcmin/+. No dia O, a carga média de tumor de camundongos Apcmin/+ foi de 39,3 mm3 (va- riando de 12,3 mm3 a 97,0 mm3) (Figura 2A). A carga média de tumor de camundongos tratados com IgG de controle durante três semanas foi de 96,8 mm3 (47,1-299,9 mm3), ao passo que a carga média de tumor de ca- mundongos tratados durante 3 semanas com mAb G6-31 foi de 23,5 mm3 (4,5-58,2 mm3). Esta foi uma redução estatisticamente significante de 76%, ou 4-vezes, em carga média de tumor em tratamento de mAb G6-31, com um p<0,008. Após seis semanas de administração com IgG de controle, a carga do tumor atingiu uma média de 198,6 mm3 (40,5 - 315,7 mm3), en- quanto a carga do tumor em camundongos tratados com mAb G6-31 perma- neceu baixa a 28,4 mm3 (3,2-75,9 mm3), exibindo uma redução significante de 86%, ou 7 vezes em carga média de tumor com um p<5,3 χ 10"5 (Figura 2A).

O decréscimo expressivo em carga de tumor após ambos três e seis semanas de tratamento com mAb G6-31 foi devido a um tamanho de adenoma diminuído, quando em oposição a um número diminuído de ade- nomas. Após três semanas de tratamento com IgG de controle, o número de tumor médio foi de 116±9 (±SEM), enquanto que após a administração de mAb G6-31 o número de tumor médio foi de 107±11 (p<0,28). Após seis semanas de tratamento com IgG de controle, o número de tumor médio foi de 120±11, enquanto que após a administração de mAb G6-31 ele foi de 100±10 (p<0.09). No dia 0, os camundongos tiveram uma média de 100±9 tumores.

Para a análise de tamanho e número de tumor, o trato intestinal de estômago glandular ao reto foi aberto longitudinalmente, enxaguado e estendido horizontalmente sobre um papel filtro. Seguindo durante a noite a fixação com Notox Histo Fixative (Scientific Design Laboratory Inc., Des Plaines, IL) e manchamento com solução aquosa a 0,1% de azul de metile- no, o número, localização e diâmetro de cada adenoma intestinal do intesti- no delgado e grosso foram classificados por um único observador, cegados para o tratamento, por meio de uma escala ocular sob magnificação de 20x em um microscópio de dissecação Leica. Por este método, pólipos com um diâmetro de 0,3 mm ou maior foram registrados com segurança. Os volumes de tumor foram calculados como hemisférios. A carga de tumor para cada camundongo foi calculada como uma soma de seus volumes de tumor. Os valores P foram calculados com um teste t de Student de duas caldas. Um grupo não tratado de camundongos (dia 0) foi analisado na idade de início de tratamento (13 semanas) como um controle para os camundongos trata- dos com o anticorpo.

Não houve nenhuma evidência de que o crescimento adenoma escapou do tratamento anti-VEGF-A durante 3 ou 6 semanas de tratamento: tumores em camundongos tratados com mAb G6-31 tiveram uma distribui- ção de tamanho mais compacto (Figura 2B, gráfico mediano e de base) em comparação com a distribuição de tamanho mais amplo de tumores de ca- mundongos tratados com IgG de controle (Figura 2B, segundo e quarto grá- ficos do topo). O diâmetro de pólipo médio em camundongos administrados durante três semanas com IgG de controle foi de 1,28 mm, e com mAb G6-31 0,85 mm (p<9,2 χ 10"117), enquanto que o diâmetro de pólipo médio em camundongos administrados durante seis semanas com IgG de controle foi de 1,64 mm, e com mAb G6-31 0,86 mm (p<2,7 χ 10"214). O diâmetro de tumor médio no dia 0 foi de 0,97 mm.

Interessantemente, tratamento anti-VEGF-A pareceu inibir o crescimento de tumores de todos os tamanhos. Após um tratamento de 3 semanas com mAb G6-31, a freqüência de tumores pequenos, 0,3 - 1,0 mm em diâmetro (durante 6 semanas de tratamento 0,3 a 1,2 mm) foi maior do que no grupo tratado com o controle, enquanto que a freqüência de tumores com mais do que 1,0 mm de diâmetro (durante 6 semanas >1,2 mm) foi di- minuída (Figura 2C, gráficos de topo e mediano). A comparação à distribui- ção de tamanho do tumor no dia 0 (Figura 2C, gráfico de base) sugeriu que o crescimento dos adenomas foi essencialmente interrompido no início das administração de mAb G6-31.

Além disso, mAb G6-31 anti-VEGF-A foi eficaz na supressão do crescimento de adenoma em todas as áreas intestinais pequenas. Um diâ- metro de tumor significantemente menor foi observado no tratamento de mAb G6-31 em comparação com IgG de tratamento de controle após tanto três quanto seis semanas de terapia (Figura 2D). Além disso, o diâmetro de adenoma médio no primeiro quarto intestina de camundongos tratados com mAb G6-31 foi significantemente reduzido a partir daquele observado em camundongos no dia 0 (duplo asterisco na Figura 2D). A redução do diâme- tro de tumor médio dos adenomas colônicos não atinge a significância esta- tística (Figura 2D). O diâmetro médio dos pólipos do intestino grosso em camundongos tratados com mAb G6-31 durante três semanas foi de 1,3 ± 0,3 mm (±SEM), enquanto que o diâmetro médio no controle de camundon- gos tratados com IgG foi de 2,5±0,4 mm, com um p<0,064. O diâmetro mé- dio de tumores do intestino grosso após seis semanas de tratamento com mAb G6-31 foi de 2,2±0,3 mm e 2,6±0,3 mm após a administração com IgG de controle, com um p<0,37.

Deleção de VEGF-A em Células Epiteliais Intestinais Reduz o Diâmetro de Tumor Médio

Em seguida procuramos dissecar a contribuição de VEGF-A de fontes epiteliais intestinais para o desenvolvimento de adenoma no modelo de Apcmin/+. Para esta finalidade, o diâmetro e número de tumor foram esti- mados, como descrito acima, em camundongos Apcmin/+ com 13 semanas de idade, que foram cruzados com camundongos em que VEGF-A foi condicio- nalmente deletado em intestinal células epiteliais com tecnologia Cre/loxP (VEGFlox; Camundongos Vilina-Cre). Camundongos Apcmin/+;Vilina-Cre e Apcm,n/+;VEGFlox;Vilina-Cre foram analisados em treze semanas de idade.

A expressão de Vilina, uma proteína de ligação à actina e um componente estrutural maior da borda de escova das células absortivas es- pecializadas, começa durante a embriogênese no endoderma intestinal do intestino posterior, e posteriormente estende-se por todo o endoderma do intestino delgado e grosso (Braunstein e outro, Dev. Dyn. 224:90-102 (2002), Ezzell e outro, Development 106:407-419 (1989), Maunoury e outro, EMBO J. 7:3321-3329 (1988), e Maunoury e outro, Development 115:717-728 (1992)). No adulto, a distribuição de Vilina torna-se difusa comp polarização apical moderada em células proliferativas imaturas, das criptas, e forte pola- rização em bordas de escova de revestimento de células completamente diferenciadas os vilos do intestino delgado Robine e outro, Proc. Nati Acad. Sei. 82:8488-8492 (1985)). A expressão de Cre recombinase direcionada pelo promotor de Vilina (ViIina-Cre) foi previamente caráterizada recapitulan- do o padrão de expressão do gene Vilina em toda célula do epitélio intestinal de cripta para a ponta do vilo e duodeno através do cólon, Madison e outro, J. Biol. Chem. 277:33275-33283 (2002).

Análise fenotípica revelou que o diâmetro médio de tumor de Apcmin/+ de controle; camundongos Vilina-Cre foi de 1,02±0,3 mm (±SEM), ao passo que o diâmetro médio de tumor de Apcmin/+; VEGFlox; camundongos Vilina-Cre camundongos foi de 0,82±0,3 mm (Figura 2E), demonstrando uma redução de 19,8% (p<7,2 χ 10"5). O número de tumor não foi significante- mente diferente entre o dois grupos. Enquanto que Apcmin/+; camundongos Vilina-Cre tiveram 137±11 adenomas intestinais, Apcmin/+; VEGFlox; camun- dongos Vilina-Cre tiveram 150±17 adenomas (p<0,27).

Estes dados indicam que a deleção de VEGF-A de todas as cé- lulas epiteliais intestinais de duodeno através do cólon, e cripta à ponta do vilo resulta em uma significante inibição de crescimento de tumor, embora um grau reduzido em comparação com aquele resultante de administração sistêmica de anticorpo anti-VEGF-A. Desse modo, estes dados sugerem que fontes extra-epiteliais de VEGF-A contribuem para o crescimento de Adeno- mas Intestinais de camundongos Apcmin/+.

Inibição de VEGF-A Estende a Sobrevivência Média de Camundongos Apc-

min/+

Devido à eficácia de tratamento anti-VEGF-A em inibição do crescimento de tumor, quisemos investigar se o tratamento com mAb G6-31 poderia produzir benefícios a longo prado para camundongos Apcm,n/+. Para esta finalidade, administração com mAb G6-31 ou IgG de controle foi conti- nuada até 52 semanas ou até os camundongos serem observados estarem moribundos. De modo interessante, o tratamento com mAb G6-31 aumentou a sobrevivência média de 24,0 semanas com IgG de controle para 33,6 se- manas com mAb G6-31 com classificação Iog p<2,4 χ 10'3 (Figura 2F).

Fenótipo de tumor de quatro camundongos tratados com mAb G6-31 foi analisado em eutanização na idade de 32, 51, 64, ou 66 semanas (após 19, 38, 51, ou 53 semanas de tratamento com mAb G6-31, respecti- vamente). Como é mostrado na Tabela 1, o diâmetro médio de tumor per- maneceu em um nível próximo àquele observado em camundongos com dezenove semanas de idade (1,64 mm em camundongos tratados com IgG de controle durante seis semanas). Similarmente, o número de tumor permaneceu comparável àqueles de camundongos com treze semanas de idade (os camundongos do grupo de dia 0 tiveram 59 a 161 adenomas Intestinais com uma média de 100). Três (um de cada camundongo 2, 3, e 4 de Tabela 1) de quinze adenomas colônicos (número total identificado em camundongos 1-4) que foram capturados no plano de corte em análise histológica exibida na transformação maligna.

Tabela 1: Dados de tumor de camundongos em tratamento prolongado com G6-31

Camundongo Idade (semanas) Semanas em G6-31 Número de tumor Diâmetro de tumor médio (mm) Carga de tumor (mm3) 1 32 19 55 0,65 2 51 38 133 1,72 3* 64 51 85 2,21 4* 66 53 150 1,63

* animal sadio eutanizado no término do estudo.

Em síntese, tratamento a longo prazo anti-VEGF-A foi geralmen- te bem tolerado e produzido em uma sobrevivência aumentada de camun- dongos Apcmin/+. Além disso, o número de tumor e diâmetro de tumor médio em camundongos tratados a longo prazo com mAb G6-31 permaneceu rigo- rosamente baixo em vista da idade dos camundongos, consistente em uma inibição de nova formação de adenoma e crescimento de adenoma. Nível de Proteína Total de Soro Normal. Albumina e Triqlicerídeos. e Hema- tcpoiese Extramedular Esolênica Reduzida em Carriuridonqos Apcmin/+ Tra- tados com Anti-VEGF-A

Como uma observação geral, camundongos Apcmin/+ tratados com mAb G6-31 pareceram consideravelmente mais alertas e responsivos do que os camundongos tratados com IgG de controle. Além disso, patas pálidas, sugestivas de anemia progressiva inicialmente reportada por Moser e outro (Moser e outro, Science 247:322-324 (1990)), foram regularmente observadas em animais tratados com IgG de controle, porém não em ani- mais tratados com mAb G6-31. Em linha com esta observação, a proteína de soro total média e albumina de soro de camundongos Apcmin/+ administrados com IgG de controle foram reduzidas, enquanto que os níveis de proteína total e albumina incluíram-se na faixa normal em camundongos tratados com mAb G6-31 (Tabela 2). Tabela 2: Química de Soro

Grupo Proteína total (g/di Γ Albumina (g/dl)** Triglicerídeos (mg/dl)*** IgG de controle 3 semanas (n=10) 3,7±0,2 1,9±0,1 268,9±82,5 G6-31 3 sema- nas (n=10) 4,9±0,2 2,6±0,1 75,5±4,9 IgG de controle 6 semanas (n=10) 3,0±0,3 1,6±0,2 591,1±81,3 G6-31 6 semanas (n=10) 4,9±0,1 2,7±0,1 71,1±4,3

* Valor de Referência 3,9-5,5 g/dl

Valor de Referência 2,3-3,2 g/dl *** Valor de Referência 35-244 mg/dl ± Média de Erros aceitáveis (SEM)

Como reportado para camundongos Apcm,rT/+ (Moser e outro, Science 247:322-324 (1990)), e consistente em hipoproteinemia, o nível de triglicerídeo médio foi elevado em animais tratados com IgG de controle, embora ele fosse reduzido para um nível comparável a um valor de referên- cia em tratamento com mAb G6-31 (Tabela 2).

Ao mesmo tempo que não houve nenhuma diferença relaciona- da com o tratamento em massas corporais após três ou seis semanas de tratamento, as massas de baço médias foram significantemente (p<2.3 χ 10"3) aumentadas em camundongos tratados com IgG de controle. Após três semanas de administração com IgG de controle, os camundongos tiveram uma massa de baço média de 0,26 g, ou 1,17% de massa corporal, enquan- to que a massa de baço média foi de 0,11 g (0,49% de massa corporal) em camundongos tratados com mAb G6-31 para três semanas. O aumento em massa de baço média em camundongos tratados com IgG de controle é consistente em hematopoiese extramedular (EMH, eritropoiese compensató- ria, neste caso secundária ao sangramento intestinal), que foi confirmado por exame histológico do baço. Então dez camundongos tratados durante 6 se- manas com IgG de controle mostraram EMH expressivo, enquanto que dois camundongos tratados com mAb G6-31 teve EMH moderado, cinco tiveram EMH branco, e três não tiveram nenhuma alteração diagnostica em seus baços. Quatro de cinco camundongos tratados com mAb G6-31 durante 18 a 53 semanas foram diagnosticados com EMH brando a extenso no baço.

O menor grau de EMH no baço de camundongos tratados com mAb G6-31 a curto prazo sugere que terapia anti-VEGF-A tem um efeito be- néfico sobre a redução de sangramento intestinal. Alterações no Rim após Tratamnto a Longo prazo com mAb G6-31

Para investigar a toxicidade potencial relacionada à administra- ção de mAb G6-31 anti-VEGF-A de alta afinidade, pâncreas, fígado, e rim foram analisados histologicamente após tratamento a curto (3 a 6 semanas) e longo prazo (18 a 53 semanas). Para a análise histológica, tecido intestinal fixado por Notox foi desidratado e embutido em parafina, seccionado, e manchado com H&E para análise histológica seguindo protocolos padrões.

Nenhuma toxicidade significante foi observada em animais trata- dos durante 3 a 6 semanas. Após tratamento a longo prazo com mAb G6-31, cinco de cinco camundongos mostraram glomerulosclerose global difusa variável (branda a severa) e edema estromal moderado do pâncreas (refle- tindo hipoproteinemia). Estas observações são consistentes em toxicidade previamente observada resultando de administração a longo prazo de mAb G6-31. De modo importante, os efeitos adversos foram excedidos pela me- Ihora geral da saúde refletida pela sobrevivência média aumentada. A morfologia de tumor alterada no tratamento com mAb G6-31 não foi a- companhada por uma alteração no índice Proliferativo

Para também caráterizar pólipos intestinais em camundongos Apcmin/+ seguindo tratamento com mAb G6-31 anti-VEGF-A , análises ma- croscópicas e histológicas foram realizadas como descrito acima. A morfolo- gia total dos pólipos tratados com mAb G6-31 diferiram notavelmente daque- la dos pólipos tratados com IgG de controle (Figuras 3A-B). Ao mesmo tem- po que tumores de camundongos administrado com IgG de controle tipica- mente tiveram uma superfície lisa, relativamente inquebrável, tumores de animais tratados com mAb G6-31 apareceram com invaginações profundas em suas superfícies. Análise histológica revelou tumores de mAb G6-31 e camundongos tratados com IgG de controle serem adenomas tubulares (Fi- guras 3C-F). Adenomas de camundongos tratados com IgG de controle tive- ram proliferação epitelial intravilosa realçada, com expansão vertical e late- ral, e foram tipicamente ampliadas mais do que 2 vezes de sua base para a superfície luminal. Houve estroma fibroso mínimo. Adenomas de camundon- gos tratados com mAb G6-31 caráteristicamente tiveram menos células epi- teliais intravilosas, foram menos amplos na superfície luminal, mais superfi- ciais, e envolvidos menos adjacentes aos vilos. Análise histológica dos póli- pos colônicos em ambos os grupos de tratamento mostrou adenomas tubu- lares pendunculados com estroma fibrovascular abundante e uma quantida- de variável (até 100%) de epitélio displásico.

Para estimar a extensão de proliferação no tecido de tumor e em mucosa normal, um manchamento imuno-histoquímico indireto com anticor- po Ki-67 foi realizado (Figuras 3G-J). Para estes experimentos, cortes de tecido intestinal fixados em Notox, desidratados, e embutidos em parafina foram desparafinizados e hidratados antes da incubação em Target Retrieval (DAKO, Glostrup, Denmark) a 99°C seguidos por saciamento de atividade de peroxidase endógena e bloqueio de avidina e biotina (Vector, Burlingame, CA). Cortes foram também bloqueados durante 30 minutos com soro de blo- queio a 10% em PBS com albumina de soro bovino a 3%. Cortes de tecido foram incubados com anticorpos primários diluídos no soro de bloqueio du- rante 60 minutos, lavados com tampão de TBST (DAKO) e incubados com anticorpos secundários durante 30 minutos, lavados com TBST, e incubados em Reagente ABC Elite (Vector) durante 30 minutos seguidos por uma incu- bação em Metal Enhanced DAB (Pierce, Rockford, IL) e contramanchamento com hematoxilina de Mayer. O anticorpo primário usado foi policlonal de coe- lho contra Ki-67 (SP6, 1:200, Lab Vision, Fremont, CA). Anticorpo secundá- rio usado foi anticoelho de cabra biotinilado (7,5 pg/ml, Vector). Todas as etapas foram realizadas em temperatura ambiente.

Análise quantitativa revelou quantidades similares de células de Ki-67 positivo em tumores de camundongos tratados com ou IgG de controle ou com mAb G6-31. Igualmente, o índice proliferativo da mucosa adjacente normal foi comparável entre ambos os tratamentos (Figura 3K). O índice pro- liferativo foi quantificado de imagens de 5 pm de cortes de parafina de tecido de tumor e mucosa normal adquirida com um sistema de microscópio de varredura de lâmina Ariol SL50 (Applied Imaging, Inc., San Jose, CA) utili- zando o ensaio de Kisight (Ariol Review (v2.6)). Regiões de tecido de tumor e mucosa normal foram manualmente identificados e circunscritos por um exame cego. índice proliferativo, medido como o percentual de núcleos posi- tivos de Ki-67 com relação aos núcleos totais, foi quantificado de um modo semiautomatizado com base na cor do núcleo seguindo a definição de um limite positivo. Medições de índice proliferativo incluíram análise de 29 tumo- res no grupo de tratamento com mAb G6-31 (n=3), e 44 tumores no IgG de controle grupo (n=3), todos tratados durante seis semanas.

Para testar se a inibição do crescimento por mAb G6-31 foi a- companhada por alterações no nível de expressão de molecules parte das trilhas de transdução de sinal maiores, uma análise de mancha do oeste foi realizada. Adenomas jejunais e mucosa adjacente normal de mAb G6-31 e camundongos tratados com anticorpo de controle foram coletados com um bisturi e mecanicamente homogeneizados com homogeneizador OMNI TH115 em tampão de Iise RIPA. Anticorpos primários usados foram policlo- nais de coelho contra p38 MAPK, phosphor-p38 MAPK, p42/p44 MAPK, phosphor-p42/p44 MAPK1 PTEN1 Akt1 phosphor-Akt, e phosphor- GSK3alfa/beta (todos 1:1000, Cell Signaling1 Danvers1 MA). O anticorpo se- cundário usado foi anticoelho conjugado a rábano picante peroxidase (1:5000, Chemicon).

Enquanto o nível de expressão de muitas das moléculas testa- das permaneceu inalterada em tratamento com mAb G6-31, uma restaura- ção modesta de níveis de phospho-p38 MAPK em três de quatro amostras de tumor para aqueles encontrados em mucosa normal foi observada (Figu- ra 3L; p-p38, compare T5-T8 com N5-N8).

Densidade Vascular Reduzida em Tumores Tratados com mAb G6-31

Visto que VEGF-A é conhecido ser um mitógeno para células endoteliais vasculares através da sinalização de VEGFR-2, examina-se as redes vasculares de tumor em camundongos tratados com Mab G6-31 e IgG de controle por manchamento imuno-histoquímico de cortes de tecido grosso com anticorpo anti-CD31 (Figuras 4A-B). Para os propósitos de ima- geamento por microscópio confocal, camundongos foram fixados por perfu- são com paraformaldeído a 1% (PFA) em PBS sob anestesia com isofluora- no, o trato intestinal foi estendido horizontalmente sobre um papel filtro, após ser fixado com PFA a 4%, e submerso em sucarose a 30% em PBS durante a noite a 4°C antes do embutimento em O.C.T. e congelamento sobre gelo seco. Criosecções foram cortadas a 80 pm, fixadas em PFA a 4% durante minutos, permeabilizadas com Triton-X-100 a 0,2% em PBS, e bloquea- das durante 30 minutos com soro de bezerro normal a 5% em PBS com Tri- ton-X-100 a 0,2%. Anticorpos primários em tampão de bloqueio foram incu- bados durante a noite, anticorpos secundários durante 5 a 6 horas, lavados com PBS e contramanchados com Hoechst 33342 (0,5 mg/ml; Sigma, St. Louis, MO). Anticorpos primários usados foram monoclonais de hamster contra CD31 (1:500, Chemicon, Temecula1 CA), monoclonais de rato contra E-caderina (1:2500, Zymed1 South San Francisco, CA), e monoclonal de camundongo conjugado a Cy3 contra actina de músculo liso (1:1000, Sig- ma). Anticorpos secundários usados foram de hamster anti-Armenian conju- gado a Cy5 (1:500, Jackson lmmunoresearch, Cambridgeshire, UK), e antir- rato conjugado a ALEXA 488 (1:500, Molecular Probes1 Eugene, OR).

Densidade de vaso em tumores de camundongos Apcmin/+ foi quantificada de imagens digitais adquiridas com uma câmera CCD em um microscópio de fluorescência Zeiss Axioplan2 (Thornwood, NY). Cada dos quatro grupos (camundongos tratados durante 3 ou 6 semanas com IgG de controle ou mAb G6-31) consistiu em dois camundongos, e 11 a 22 tumores de cada grupo foram analisados. Área de vaso em cortes de tumor de 80 pm foi calculada por meio de uma segmentação com base em limite de fluores- cência de CD31 positivo usando ImageJ v.1.36 (http://rsb.info.nih.gov/ij/). A densidade de vaso foi então calculada como a relação de píxeis de CD31 positivo para a área de tumor total. Valores de todos os tumores de cada grupo tiveram a média calculada para produzir um valor médio para o grupo.

Quantificação da densidade de vaso indicou que o componente vascular de tumores de camundongos tratados com mAb G6-31foi reduzido em comparação com aquele observado em camundongos tratados com IgG de controle (Figura 4C). Após três semanas de administração com IgG de controle a densidade da área de vaso de tumor médio foi de 23,2%, enquan- to que ela foi reduzida para 18,6% após a administração com mAb G6-31. A área de vaso média de tumores tratados com IgG de controle durante seis semanas foi de 25,5%, ao passo que a densidade da área de vaso média de tumores de camundongos tratados com mAb G6-31 foi de 19,7%. Discussão

Usamos camundongos Apcmin/+ para investigar o papel de VEGF-A em tumorigênese intestinal benigna. Na primeira parte, os experi- mentos foram designados para medir os efeitos de tratamento a curto e lon- go prazo com anti-VEGF-A sobre adenomas intestinais estabelecidos pas- sando por crescimento robusto. Mostramos que o tratamento com mAb G6- 31 anti-VEGF-A significantemente reduziu a carga do tumor e estendeu a sobrevivência dos camundongos Apcmin/+.

Diversos estudos foram conduzidos sobre o efeito de agentes dietéticos e quimiopreventivos, incluindo fármacos anti-inflamatórios não es- teroidais (NSAID), sobre a carga de tumor de camundongos Apcmin/+ (revisto em Corpet e outro, Câncer Epidemiol. Biomarkers Prev. 12:391-400 (2003)), dos quais existe uma lista atualizada em http://corpet.net/min. Muitos destes estudos reportam um decréscimo significante em número de tumor. NSAIDs tais como piroxicam e sulindac, que alvejam tanto COX-1 quanto COX-2, têm estado entre os mais potentes agentes em supressão da formação de tumor em camundongos Apcmin/+ (Boolbol e outro, Câncer Res. 56:2556- 2560 (1996), Chiu e outro, Câncer Res. 57:4267-4273 (1997), Hansen-Petrik e outro, Câncer Lett. 175:157-163 (2002), Ritland e outro, Carcinogenesis 20:51-58 (1999)), em adição aos inibidores de COX-2 seletivos tais como celecoxib (Jacoby e outro, Câncer Res. 60:5040-5044 (2000)) e A-285969 (Wagenaar-Miller e outro, Br. J. Câncer 88:1445-1452 (2003)). Terapias de combinação foram também usadas bem sucedidamente para reduzir o nú- mero de tumor. Torrance e outro, utilizaram um inibidor de receptor de fator de crescimento epidérmico específico, EKI-785, em combinação com sulin- dac, e mostrou quase uma total eliminação do número de tumor (Torrance e outro, Nat. Med. 6:1024-1028 (2000)). Similarmente, o efeito combinado de agentes de quimioterapia raltitrexed (RTX) e 5-fluorouracila (FU) resultou em uma redução significante (37%) em números de tumor de Apcmin/+ (Murphy e outro, Câncer Biol. Ter. 3:1169-1176 (2004)). Recentemente, administração a curto prazo do inibidor de tirosina cinase receptora (RTK) AZD2171 de- monstrou uma redução de carga de tumor no modelo de Apcmin/+ (Goodlad e outro, Carcinogenesis 27:2133-2139 (2006)). Eles observaram que o início de tratamento precoce (em 6 semanas) com AZD2171 foi capaz de reduzir o número de tumor, ao passo que intervenção posterior (em 10 semanas) a- penas reduziu o tamanho do tumor (Goodlad e outro, supra). Entretanto, o tratamento não teve nenhum efeito sobre a densidade vascular (Goodlad e outro, supra). AZD2171 inibe diversas RTKs incluindo, porém não-limitado a, VEGFR-1, -2, e -3 (Wedge e outro, Câncer Res. 65:4389-4400 (2005)).

Observa-se que mAb G6-31 anti-VEGF-A administrado em 13 semanas não reduziu o número de tumores existentes, embora ele tenha diminuído o tamanho do tumor e pareceu inibir nova formação de adenoma. Estes resultados correlacionados com um aumento observado em sobrevi- vência. Entretanto, acreditamos que é possível que um método de preven- ção de tumor específico anti-VEGF (com um início de tratamento precoce) possa potencialmente ser mais eficaz na redução do número de tumor, do que um método de intervenção de tumor (com um início de tratamento pos- terior), que foi usado em nosso estudo. Independente, a inibição específica anti-VEGF foi eficaz em todos os estágios de crescimento de tumor.

Nosso estudo conclusivamente mostra que o alvejamento de VEGF-A é suficiente para obter profundos efeitos terapêuticos no modelo de Apcmin/+. Comparação do da inibição de VEGF-A sistêmico com Mab G6-31 a uma deleção genética de VEGF-A no compartimento epitelial intestinal sozi- nho em camundongos Apcmin/+; VEGFlox; Villin-Cre sugere que, em adição às células epiteliais, outras fontes celulares de VEGF-A desempenham um im- portante papel no crescimento de adenoma de Apcmin/+. Estas fontes adicio- nais de VEGF-A potencialmente incluem células mononucleares (Sunayama e outro, Carcinogenesis 23:1351-1359 (2002)) e fibroblastos estromais (Seno e outro, Câncer Res. 62:506-511 (2002), (Williams e outro, J. Clin. Invest. 105:1589-1594 (2000)). Nossa análise in situ indica expressão extra- epitelial de VEGF-A dentro do adenomas e vilos normais, sustentando a ob- servação.

Com base em um corpo extenso de dados, é concebível que muitos dos efeitos antitumor observados de mAb G6-31 é mediado por su- pressão de angiogênese (Wise e outro, Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:3071- 3076 (1999), Zachary e outro, Cardiovase Res. 49:568-581 (2001)). De fato, um suprimento vascular reduzido em resposta ao anticorpo monoclonal anti- VEGF-A tem sido observado em estudos de xenoenxerto de tumor (Borgstrom e outro, Prostate 35:1-10 (1998)). Em concordância com isto, uma redução em densidade de área de vaso dos adsenomas intestinais de Apcmin/+ foi observada após três e seis semanas de administração com mAb G6-31, em comparação com tumores de camundongos tratados com IgG de controle.

O acúmulo significante observado de adenomas menores do que 1 mm em inibição de VEGF-A sugere que nos adenomas intestinais dos ca- mundongos Apcmin/+, mudança angiogênica pode acontecer antes do que geralmente acreditado para o desenvolvimento de tumor, como foi observa- do no modelo de Apcdelta716 (Seno e outro, Câncer Res. 62:506-511 2002)).

Uma importante e inesperada conclusão de nosso estudo é que monoterapia antiangiogênica, alvejando um único fator angiogênico, pode ser altamente eficaz na supressão do crescimento de tumor e pode produzir um benefício de sobrevivência. Isto parece ser, ao contrário do observado, concluído primariamente a partir de investigação de tumores malignos, que o benefício principal de uma tal terapia é "normalizar" os vasos sangüíneos de tumor a fim de facilitar a liberação de quimioterapia (Jain e outro, Nat. Med. 7:987-989 (2001)). É concebível que uma propensão reduzida de tumores benigno adquirirem mutações, potencialmente induzindo à resistência ao tratamento resistance, pode ser considerada, pelo menos em parte, para a diferença. Portanto, nossos dados sugerem a possibilidade de um tratamen- to não cirúrgico para tumores benignos sem a necessidade de agentes qui- mioterápicos.

Exemplo 2: Anticorpo Monoclonal Anti-VEGF-A Inibe o Crescimento de Ade- nomas Pituitários e Reduz o Nível de Prolactina de Soro e Hormônio de Em Um Modelo de Camundongo de Neoplasia Endócrina Múltipla

Neoplasia endócrina múltipla (MEN) é um distúrbio caráterizado pela incidência de tumores envolvendo duas ou mais glândulas endócrinas. Um paciente é classificado com MEN tipo 1 (MEN1) quando uma ocorrência combinada de tumores nas glândulas paratireóide, nas células das ilhotas pancreáticas, e na pituitária anterior é identificada. Mutações no gene de MEN1 foram descobertas acompanharem o distúrbio, que comumente resul- tam em uma truncação ou ausência da proteína menin (revisada em Pannett e outro, Endocr. Relat. Câncer 6:449-473 (1999)). Com a descoberta adicio- nada de uma perda freqüente dos alelos restantes nos tumores, (Bystrom e outro, Proc. Natl. Acad. Sci USA 87:1968-1972 (1990), Debelenko e outro, Câncer Res. 57:2238-2243 (1997), Larsson e outro, Nature 332:85-87 (1988)) MEN1 tem sido classificado como um gene supressor de tumor. En- quanto que MEN1 é largamente herdado como um distúrbio dominante au- tossômico, mutações de novo de gene de MEN1 foram identificadas como a causa de casos esporádicos de MEN1.

A função de menin permanece largamente desconhecida. A pro- teína de aminoácido 610 predominantemente nuclear, ubiquamente expres- so foi sugerida estar envolvida em regulação transcricional, processamento e reparo de DNA, e organização citosqueletal através de suas interações in vitro com parte das proteínas das trilhas acima mencionadas (revisada em Agarwal e outro, Horm. Metab. Res. 37:369-374 (2005)). Nenhuma das inte- rações de proteína identificadas até agora, entretanto, fornece uma explana- ção para a tumorigenicidade em MEN1.

O padrão atual de tratamento para tumores pancreáticos - mais do que 50% dos quais são gastrinomas e 10 a 30% insulinomas - é a redu- ção de produção de ácido basal no case de gastrinomas, enquanto que a cirurgia é vista como o tratamento ideal para insulinomas. O tratamento para tumores pituitários consiste em cirurgia seletiva com terapia médica variável, dependendo do perfil hormonal, enquanto que o tratamento definitivo para tumores paratireóides é uma remoção cirúrgica do glândula super ativa. En- tretanto, existe variabilidde do grau e duração da paratireoidectomia (revisada em Brandi e outro, J. Clin. Endocrinol. Metab. 86:5658-5671 (2001)). Os últimos desenvolvimentos sobre a geração de novos métodos para o diagnóstico e tratamento de MEN1 foram recentemente revisados (Viola e outro, Curr. Opin. Oncol. 17:24-27 (2005)).

Por meio de recombinação homóloga, éxons 3-8 do gene de camundongo Menl foram alvejados para deleção (Crabtree e outro, Proc. NatL Acad. Sei. USA 98:1118-1123 (2001)). Em nove meses de idade, ca- mundongos Men 1 heterozigotos foram reportados desenvolverem lesões de ilhotas pancreáticas com freqüentes observações adicionais de adenomas paratireóides. Tumores mais numerosos maiores, em ilhotas pancreáticas, paratireóides, tireóide, córtex adrenal, e pituitários foram observador em 16 meses de idade (Crabtree e outro, Proc. Natl. Acad. Sci USA 98:1118-1123 (2001)), apresentam-se extraordinariamente similares ao distúrbio humano.

Existe ampla evidência indicando que o bloqueio de angioqêne- se mediada por VEGF-A resulta em supressão de tumor (Gerber e outro, Câncer Res. 60:6253-6258 (2000), Holash e outro, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 99:11393-11398 (2002), Millauer e outro, Nature 367:576-579 (1994), Prewett e outro, Câncer Res. 59:5209-5218 (1999), Wood e outro, Câncer Res. 60:2178-2189 (2000)) como métodos anti-VEGF-A foram usados no tratamento de vários modelos preclínicos derivados de linhagens de célula de câncer maligno humano (revisado em Geber e outro, Câncer Res. 60:2178-2189 (2000)). Xenoenxertos de tumor entretanto pouco recapitulam dodesenvolvimento de tumor em um cenário natural. Além disso, terapia de anticorpo anti-VEGF-A tem sido até aqui tentada na inibição do crescimento de tumors benignos, ou tumores de origem endócrina. Para investigar o pa- pel de VEGF-A no desenvolvimento de adenomas específicos de tecido en- dócrino, examinamos os efeitos de terapia antiangiogênica sobre um modelo de tumor não-maligno de ocorrência natural, o modelo de camundongo Men1+/" de MEN1. O volume de tumor de adenomas pituitaries em camun- dongos Men1+/\ bem como transplantes de tumor pituitário subeutâneo em camundongos nus Balb/c foram analisados após um tratamento a curto pra- zo com o antagonista específico de VEGF exemplar, anticorpo monoclonal anti-VEGF-A (mAb). Além disso, a possibilidade de reduzir os níveis eleva- dos de hormônio associados com MEN1 com mAb anti-VEGF-A foi investi- gada.

Para os experimentos descritos abaixo, camundongos Men 1+/" (número de estoque 004066) foram obtidos do The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME), e os camundongos nus Balb/c de Charles River Laboratories Inc. (Wilmington, MA). Camundongos fêmea Men1+/" experimentais de base de 129-FVB mista foram obtidos por intereruzamento de machos e fêmeas Men1+/". Os camundongos foram alojados em gaiolas microisoladoras em uma facilidade de barreira e alimentados ad libitum. A manutenção de ani- mais e protocolos experimentais foram conduzidos seguindo as regulações federais e aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee. Tratamento com mAb G6-31 Inibe o Crescimento de Adenomas Pituitários de Men1+/" Para investigar se terapia anti-VEGF-A seria eficaz na inibição do crescimento de adenomas pituitários, 125 camundongos Men1+/" fêmeas com onze a treze meses de idade foram submetidos a MRI para identificar camundongos com tumores pituitários. Camundongos transportando tumor foram submetidos a imageamento novamente 14 e 28 dias após estabelecer a taxa de crescimento do adenomas. Um coorte de nove camundongos com crescimento médio de 12,4% de tumor por dia e 15,58 ± 4,0 mm3 (± SEM) de volume de tumor médio no início do estudo recebeu IgG de controle, e um coorte de oito camundongos com 10,2% de crescimento médio de tumor por dia e 16,70 ± 5,7 mm3 de volume de tumor médio no início do estudo rece- beu um mAb G6-31 anti-VEGF-A durante 67 dias ou até os camundongos serem encontrados moribundos. Para o tratamento com anticorpos mAb G6- 31 e IgG de controle, injeção intraperitoneal a 5 mg/kg de anti-VEGF mAb G6-31 (Liang e outro, J. Biol. Chem. 281:951-961 (2005)) ou IgG de controle pareado com isótipo (anti-GP120) foi administrada uma vez por semana em um volume de 100 a 200 μΙ em PBS. A administração de oito (mAb G6-31) ou nove (IgG de controle) camundongos Men1+/" com adenoma pituitário in situ foi iniciada em 13,5 a 14,5 meses de idade e continuada durante 67 dias ou até os camundongos serem encontrados moribundos. O tratamento de 23 (control IgG) ou 35 (mAb G6-31) camundongos nus Balb/c com um trans- plante pituitário de adenoma subcutâneo foi iniciado quatro meses após en- xerto, e continuado durante 35 dias ou até os camundongos serem encon- trados moribundos ou volume de tumor ter atingido o volume de 3000 mm3.

Os animais foram imageados com MRI a cada duas semanas para acompanhar o crescimento de adenoma pituitário in vivo. Imagens de MRI foram adquiridas em um magneto de orifício horizontal de 9,4T (Oxford Instruments Ltd., Oxford, UK) e controladas por um consolo Varian Inova (Varian, Inc., Palo Alto, CA) usando uma espiral de 3 cm de volume para transmissão e recepção (Varian, Inc.). Uma seqüência de imageamento eco de movimento giratório rápido foi empregada com um tempo de repetição de 4 segundos, o comprimento do trem de eco de 8, espaçamento de eco de 12 ms, tempo de eco eficaz de 48 ms, e seis médias. A matriz de imagem foi I 128

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de 128 , com um campo de vista (20 mm)2 e espessura de fenda de 0,5 mm.

i

Os camundongos foram coibidos na posição de bruços com isoflurano a 2% em ar médico, e a temperatura corporal foi monitorada com uma sonda retal e mantidos a 37°C com ar quente durante o período de aquisição de imagem de 15 minutos. Após imageamento, os animais foram deixados recuperarem- se sobre uma superfície aquecida seguido por retorno dos mesmos para a facilidade de alojamento. Os volumes de tumor pituitário primários foram cal- culados a partir de dados de MRI usando regiões tridimensionais de interes- se representadas no software Analyze (AnalyzeDirect, Inc., Lenexa1 KS). Em trinta e nove dias de tratamento, um decréscimo estatistica-

mente significante do volume pituitário médio de tumor foi observado no gru- po tratado com mAb G6-31 em comparação com o grupo tratado com IgG de controle (Figura 5A). No término do estudo (67 dias), houve uma redução estatisticamente significante de 72%, ou 3,7 vezes em volume médio de tu- mor em tratamento de mAb G6-31, com um valor ρ menor do que 0,016. En- quanto a maioria (6 dos 9) dos tumores de Men1+/" tratados com IgG de con- trole continuou a desenvolver-se robustamente durante todo o período de tratamento, o crescimento de 7 dos 8 adenomas pituitários tratados com mAb G6-31 reduziu consideravelmente (Figura 5B). Quatro camundongos tratados com IgG de controle, e três com mAb G6-31 foram eutanizados an- tes do término do estudo devido a saúde insatisfatória , incluindo um camun- dongo tratado com o IgG de controle antes do imageamento em tratamento dia 25. A sobrevivência livre de duplicação de tumor foi significantemente aumentada no grupo tratado com mAb G6-31 com uma classificação Iog p<0,019 (Figura 5C), sugerindo que a inibição de crescimento de tumor pitui- tário melhorou a saúde daqueles camundongos, em comparação com os camundongos tratados com IgG de controle. O volume de tumor de dois ca- mundongos no grupo de tratamento com mAb G6-31 não duplicou no dia 67 de tratamento.

Anticorpo Anti-VEGF-A Inibe o Crescimento de Transplasntes de Adenoma Pituitário Subcutâneo

Para testar a eficácia de tratamento com anticorpo anti-VEGF-A em um modelo de transplante pituitário de adenoma Men1+/", tumores subcu- tâneos foram estabelecidos no flanco de camundongos nus Balb/c fêmeas de 6-8-semanas de idade de acordo com o seguinte procedimento. Para es- tes experimentos, um único adenoma pituitário in situ de um camundongo Men1+/" foi extraído e picado em pedaços de aproximadamente 1 mm3, mis- turados com BD Matrigel Matrix Basement Membrane (BD, Bedford, MA), e inoculados subcutaneamente em volume de 200 μΙ no flanco dorsal de ca- mundongos nus Balb/c. Quatro meses depois, um único tumor subcutâneo (volume aproximado de 900 mm3) foi extraído, picado, misturado com Matri- gel e inoculado como descrito acima para estabelecer um coorte de camun- dongos com transplantes de adenoma pituitário.

O tamanho de tumor de transplantes de adenoma pituitário sub- cutâneo foi medido com uma ferramenta de compasso de calibre (Fred V. Fowler Co. Inc., Newton, MA) coletando o maior diâmetro do tumor e o diâ- metro perpendicular àquele. Volume de tumor foi calculado usando a se- guindo fórmula: V^ab2/6 (a = diâmetro de tumor maior, b = diâmetro per- pendicular).

Um coorte de 35 camundongos com um volume de tumor médio de 515±42 mm3 no início do tratamento recebeu mAb G6-31, e um coorte de 23 camundongos com um volume de tumor médio de 527 ± 64 mm3 no início do estudo recebeu IgG de controle durante 35 dias usando os métodos des- critos acima. No término do estudo, tumores tratados com IgG de controle já quase quadruplicaram seus volumes, para uma média de 2071 ±152 mm3, enquanto que o crescimento de tumor em camundongos tratados com mAb G6-31 foram essencialmente interrompidos; o volume de tumor médio foi de 556 ± 89 mm3 no dia 35 (Figura 5D). Houve uma redução estatisticamente significante de 73%, ou 3,7 vezes em volume de tumor médio em tratamento com mAb G6-31, com um p<1.9 χ 10"12.

Estes dados estabelecem mAb G6-31 anti-VEGF-A eficaz em inibição do crescimento de adenomas pituitários e transplantes de adenoma pituitário subcutâneo semelhantes, predispostos por heterozigosidade de Menl. t

Expressão de VEGF-A, VEGFR-1, e VEGFR-2 em Glândula Pituitária Nor- mal e em Tecido de Tumor Pituitário

Para investigar o nível de expressão de VEGF-A, VEGFR-1, e VEGFR-2 no tecido pituitário, e para examinar se seu nível de expressão foi afetado por tratamento com mAb G6-31, comparamos a expressão relativa média de VEGF-A, VEGFR-1, e VEGFR-2 em cinco adenomas pituitários com IgG de controle (volume médio de 96,2 ± 8,7 mm3) e cinco tratados com mAb G6-31 (35,2 ± 4,0 mm3) in situ, juntamente com cinco adenomas pituitá- rios não tratados pequenos pareados pela idade (9,7 ± 2,9 mm3), quatro glândulas pituitárias normais pareadas pela idade de camundongos Men1+/", e oito amostras de glândula pituitária tipo selvagem comparadas pela idade. A expressão de VEGF-A, VEGFR-1, e VEGFR-2 foi também investigada de cinco transplantes de adenoma pituitário tratados com IgG de controle (vo- lume médio de 2063 ± 205 mm3) e cinco tratados com mAb G6-31 (577 ± 45 mm3).

Para estes experimentos, RNA livre de DNA total foi preparado de adenomas pituitários instantaneamente congelados ou glândulas pituitá- rias normais com kit RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com o protocolo do fabricante. RT-PCR quantitativa de uma etapa foi realizada em um volume total de 50 μΙ com o Kit SuperScript Ill Platinum One-Step qRT- PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA), 100 ng de RNA total, 45 nM de cada inicia- dor de PCR, e 12,5 nM de sonda Taqman. Para detectar a expressão dos genes de interesse, as seguintes misturas de iniciadores de Ensaio de Ex- pressão de Gene TaqMan e sonda (Applied Biosystems, Foster City, CA) foram usadas: VEGF-A (Ensaio ID: Mm00437304_m1), VEGFR-1 (Ensaio ID: Mm00438980_m1), e VEGFR-2 (Assay ID: Mm00440099_m1). A expres- são de GAPDH foi detectada usando iniciadores e sonda Taqman sintetiza- da em facilidade interna (Seqüência iniciadora dianteira: ATGTTCCAGT ATGACTCCAC TCACG (SEQ ID NO: 3); Seqüência iniciadora reversa: GA- AGACACCA GTAGACTCCA CGACA (SEQ ID NO: 4); Seqüência de sonda Taqman: AAGCCCATCA CCATCTTCCA GGAGCGAGA (SEQ ID NO: 5)).

As reações foram realizadas usando Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System, com as seguintes condições: uma etapa de trans- crição reversa (15 minutos a 48°C), seguido por etapa de desnaturação (2 minutos a 95°C), e 40 ciclos de 15 segundos a 95°C e 1 minuto a 60°C. Os níveis de expressão de gene em cada sample foram determinados com um método de quantificação relativa (método ddCt), usando gene GAPDH como um controle endógeno, e RNA total de placenta de camundongo (Clontech, Mountain View, CA) como uma referência.

Notavelmente, a expressão relativa média de VEGF-A foi signifi- cantemente elevada em adenomas in situ tratados com mAb G6-31 em comparação com tumores pituitários tratados com IgG de controle, tumores não tratados pequenos, e glândulas pituitárias normais de camundongos tipo selvagem ou Men1+/" (Figura 6). A expressão de VEGF-A foi comparavel- mente elevada em ambas as amostras de transplante de tumor subcutâneo. O nível elevado observado de transcrição de VEGF-A em tumores tratados com mAb G6-31 é potencialmente um resultado de um mecanismo compen- satório para o sequestrante sistêmico de VEGF-A por mAb G6-31. Entretan- to, parece que VEGF-A elevado não foi suficiente para controlar o cresci- mento de tumor.

Enquanto a expressão relativa média de VEGFR-1 pareceu ra- zoavelmente inalterada dentro das diferentes amostras de tecido, a expres- são relativa média de VEGFR-2 pareceu inferior nas amostras de tumor in situ tratadas com IgG de controle ou mAb G6-31 em comparação com aque- la encontrada em transplantes de tumor, tumores não tratados pequenos, ou glândulas pituitárias normais de camundongos de tipo selvagem e Men1+/" (Figura 6).

MRI Provê Acompanhamento In Vivo de Crescimento de Tumor

MRI foi usado como descrito acima para acompanhar o cresci- mento dos adenomas pituitários in situ em todo o período de tratamento submetendo os animais a imageamento semana sim, semana não. Gráficos de uma secção coronal do cérebro com um adenoma representativo de um camundongo Men1+/" tratado com IgG de controle e um tratado com mAb G6-31são mostrados na Figura 7, tomados nos dias 9, 39, e 67 após o início do tratamento.

Histologia de Tumores Pituitários e Pancreáticos

Adenomas de glândula pituitária de Men1+/" foram histologica- mente similares em camundongos tratados com mAb G6-31 e IgG de contro- le (Figuras 8A-B). Para estes experimentos, tecido fixado com formalina foi desidratado e embutido em parafina, seccionado, e manchado com hemato- xilina-eosina (H&E) para análise histológica e seguindo protocolos padrões. Tipicamente, células de tumor foram pequenas (-10 mícrons de diâmetro), com uma relação nuclear/citoplásmica elevada, freqüente mitoticamente ati- va, com até 40 figuras mitóticas por dez campos de diâmetro de 625- mícrons. Os tumores foram variavelmente sólidos ou císticos, com vasos revestidos com célula endotelial múltipla, áreas precisamente hemorrágicas (células sangüíneas vermelhas intactas em espaços revestidos com não en- dotelial, ausência de fibrina ou organização celular), e macrófagos carrega- dos com hemosiderina dispersos, consistentes em hemorragia anterior. Houve necrose de célula única variável, e fibrose mínima. Vasos de tumor foram irregularmente espaçados, tipicamente 5 a 10 mícrons de diâmetro embora, raramente, tão grandes quanto 50 mícrons, com poucas células estromais perivasculares de não tumor.

Padrão vascular foi observado entre tumores tratados com IgG de controle e mAb G6-31 por manchamento imuno-histoquímico indireto com anticorpo marcador de célula panendotelial MECA-32 (Figuras 8C-D). Para estes experimentos, cortes de tecido fixados em formalina, embutidos em parafina foram desparafinizados antes do saciamento de atividade de pero- xidase endógena e bloqueio de avidina e biotina (Vector, Burlingame, CA). Os cortes foram bloqueados durante 30 minutos com soro de coelho normal a 10% em PBS com 3% BSA. Cortes de tecido foram então incubados com anticorpos primários durante 60 minutos, anticorpos secundários biotinilados durante 30 minutos, e incubados em reagente ABC (Vector, Burlingame, CA) durante 30 minutos, seguido por uma incubação de 5 minutos em Metal E- nhanced DAB (Pierce, Rockford, IL). Os cortes foram então contramancha- dos com hematoxilina de Mayer. Anticorpos primários usados foram Prolac- tina anticamundongo de cabra a 0,10 pg/ml (R&D systems, Minneapolis1 MN) e antígeno de célula panendotelial anti-camundongo de rato, clone ME- CA32, a 2 pg/ml (BD Biosciences, San Jose, CA). Anticorpos secundários usados foram anti-cabra de coelho biotinilado a 7,5 pg/ml (Vector, Burlinga- me, CA) e antirrato de coelho biotinilado a 2,5 pg/ml (Vector, Burlingame, CA). O manchamento de antígeno de célula panendotelial requereu pretra- tamento com Target Retrieval (Dako, Carpenteria, CA) a 99°C durante 20 minutos. Toas as outras etapas foram realizadas em temperatura ambiente.

A densidade de vaso foi significantemente reduzida por trata- mento com mab G6-31 para 46% aquela de tumores tratados com IgG de controle (valor-p = 0,009; Figura 81). Em ambos os grupos de tratamento, a vascularidade de tumor foi menor do que em pituitária anterior adjacente normal. Para quantificação de densidade vascular, cortes manchados com MECA-32 foram analisados com uma plataforma de varredura de lâmina Ari- ol SL-50 (Applied lmaging; San Jose, CA), usando uma objetiva de 10x. Re- giões de tumor de pituitária foram identificadass e delineadas manualmente. Cores de pixel correspondendo ao manchamento de MECA-32 foram defini- das, e a área vascular medida consequentemente. Núcleos de célula de tu- mor foram identificados por cor do pixel e forma do objeto. A área vascular foi então normalizada para o número de célula de tumor pituitário. As ilhotas pancreáticas foram analisadas similarmente, exceto que a área de man- chasmento de MECA-32 foi normalizada para a área de tumor de ilhota.

Em adição aos tumores pituitários, tumores de ilhotas pancreáti- cas foram freqüentemente identificados nos camundongos Men1+/" tratados e foram histologicamente analisados no término do estudo. Tumores de ilho- ta (definidos como sendo maiores do que 105 μιτι2 no plano de corte) foram tipicamente sólidos, sem hemorragia significante ou necrose. Tumores de seis animais tratados com mAb G6-31 anti-VEGF-A (n=32 tumores) tiveram a média de apenas 39% a área daqueles dos cinco animais tratados com IgG de controle (n=45 tumores; valor-p = 0,026). Adenoma pancreáticos (Fi- guras 8E-F) tratados com IgG de controle pareceram geralmente maiores (até 7,0 mm no plano de corte) e mais vascular do que adenomas tratados com mAb G6-31 (diâmetro de tumor até 5,0 mm em plano de corte). Em qua- tro dos sete camundongos tratados com IgG de controle, os tumores pan- creáticos continham espaços endotelialmente revestidos, de paredes finas, carregados de sangue, dilatados até 300 pm de diâmetro, ao passo que os adenomas pancreáticos em camundongos tratados com mAb G6-31 fre- qüentemente sem vascularidade prominente (Figuras 8G-H). Tumores pan- creáticos de um dos oito camundongos tratados com mAb G6-31 manifesta- ram vasos dilatados. Macrófagos carregados com hemosiderina foram in- termitentemente encontrados em tumores pancreáticos qualquer dos trata- mentos, sugestivos de hemorragia de ilhota.

Densidade vascular em tumores de ilhota foi significantemente reduzida por tratamento com G6-31 para 56% daqueles tumores de ilhota tratados com IgG de controle (valor-p = 2*10"7). Além disso, ilhotas "normais" (menos de dez 105 μΐη2 no plano de corte) de camundongos tratados com Mab G6-31 tiveram uma densidade vascular reduzida, em uma menor mag- nitude, para 76% aquela de animais tratados com IgG de controle (valor-p = 4*10"7; veja a Figura 8J). Um único animal macho, tratado com IgG de con- trole, tiveram um tumor cortical adrenal de 12 mm de diâmetro solitário, um tipo de tumor reconhecido nas glândulas de síndrome de MEN1.

A histologia dos transplantes pituitários de adenoma subcutâneo foi comparável àquela dos tumores pituitários in situ, indicando uma recapitu- lação bem sucedida de crescimento endócrino de tumor em Iocos distantes. Adenoma pituitários Menl são Prolactinomas

Aproximadamente sessenta por cento dos adenomas pituitários em pacientes de MEN1 secretam prolactina (PRL), menos do que 25% de hormônio de crescimento (GH), e 5% de hormônio adrenocorticotrópico (ACTH, Trump e outro, QJM 89:653-669 (1996)). Para investigar se os ade- nomas pituitários de camundongos Men1+/" secretam PRL, manchamento imuno-histoquímico com anticorpos anti-PRL foi realizado em adenomas pi- tuitários in situ tratados com IgG de controle e mAb G6-31, bem como trans- plantes de tumor pituitário. Seis dos seis adenomas pituitários tratados com IgG de controle e five dos cinco tratados com mAb G6-31 mostraram um manchamento positivo específico para prolactina em aproximadamente 50 a 95% das células estabilizando as mesmas como prolactinomas (Figuras 9A - 9B). Em linha com este resultado, Crabtree e outro, reportaram que tumores pituitários de Men1TSM/+foram positivos para PRL em um manchamento imu- no-histoquímico (Crabtree e outro, Proc. Natl. Sci USA 98:1118-1123 (2001)). Manchamento com prolactina foi positivo também nos transplantes de adenoma pituitário com qualquer dos tratamentos (Figuras 9C-9D). Con- sistente com secreção de prolactina funcional destes tumores, tecido mamá- rio em camundongos fêmea transportando adenoma pituitários transplantado invariavelmente mostrou alteração Iactacional moderada à expressiva em ambos os animais tratados com IgG de controle e tratados com anti-VEGF-A (Figura 9 E, F).

Como avaliado por manchamento imuno-histoquímico, 6 de 11 tumores de pituitária primários não tratados focalmente e fracamente positi- vos para hormônio de crescimento (Figura 14A), ao passo que apenas um de quatro tumores de pituitária transplantados mostrou manchamento fraco focai (Figura 14B). A expressão de hormônio de crescimento estava presen- te em ambos os tumores pituitários in situ tratados com G6-31 e IgG de con- trole (Figura 6C, D). Pituitária anterior normal mostrou forte reatividade em -20 a 30% das células. (Figura 14A).

O Nível de Prolactina de Soro Correlaciona-se com o volume de tumor de Pituitária em Camundongos Não Tratados e Tratados com IaG de controle e é Diminuída em Tratamento com Ab G6-31

Devido ao fato dse que todos os adenomas pituitários tratados com IgG de controle e todos tratados com mAb G6-31 examinados de ca- mundongos Men1+/" foram positivos para prolactina por análise imuno- histoquímica, investigamos se os níveis de PRL de soro estavam elevados em camundongos Men1+/" transportando adenoma pituitário. Para esta finali- dade, inicialmente analisamos 46 camundongos fêmea Men1+/" não tratados quanto a seu estado de tumor pituitário e o nível de PRL de soro, e cinco controles de filhotes do tipo selvagem fêmeas quanto ao nível de PRL de soro. As quantidades de prolactina de soro foram analisadas por National ι

Hormone & Peptide Program at Harbor UCLA (Torrance, CA).

i

A faixa de idade destes camundongos foi de 15,6 a 10,5 meses, com uma idade média de 13,3 meses. O nível médio de PRL de soro nos camundongos do tipo selvagem foi de 43,8 ± 25,3 (±SEM) ng/ml. Vinte e se- te dos 46 camundongos Men1+/" não tiveram um tumor pituitário detectável em análise de MRI. O nível de PRL de soro médio nestes camundongos foi de 69,0 ± 24,6 ng/ml. Um grupo de dez camundongos teve um tumor pituitá- rio pequeno com um volume médio de 1,7±0,6 mm3. O nível de PRL de soro nestes camundongos foi elevado em uma média de 188,7±61,9 ng/ml. Nove camundongos que tiveram um tumor pituitário grande (volume médio 83,1 ±23,8 mm3), tiveram uma média de 13239,8 ± 3466,5 ng/ml de PRL de soro. Estes dados estabelecem que existe uma correlação positiva entre os níveis de PRL de soro e o volume de tumor de pituitária nos camundongos Men1+/" (Figura 10A) com coeficiente de correlação de Pearson R=O,94, su- gerindo que o nível de PRL de soro poderia ser útil como uma ferramenta diagnostica na estabilização de uma estimativa do estado do tumor pituitário.

Para examinar se o tratamento anti-VEGF-A teve um efeito so- bre os níveis de PRL de soro, analisa-se o soro de sete camundongos Men 1+/" tratados com IgG de controle e sete tratados com mAb G6-31 com um adenoma pituitário in situ no término do estudo (dia 67). Em camundon- gos tratados com IgG de controle, o nível de PRL de soro médio foi elevado para 12566,7 ± 3047,4 ng/ml e foi de modo geral aumentado com um volume de tumor crescente (média de 116,2 ± 18,5 mm3) com R=O,80 (p<0,03). Em camundongos Men1+/"'tratados com mAb G6-31 analisados, o nível de PRL de soro permaneceu menor, a 5163,7 ± 1608,9 ng/ml, entretanto, nenhuma correlação estatística com o volume de tumor foi aparente (volume médio de tumor 35,3 ± 6,5 mm3), R = -0.12 com p<0,80 (Figura 10B). Todavia, estes dados indicam que enquanto mAb G6-31 inibe o crescimento de adenoma pituitário, ele também induz a um PRL de soro médio diminuído, em compa- ração com camundongos tratados com IgG de controle com p<0,053.

Tratamento Anti-VEGF-A Reduz os Níveis de PRL de Soro em Camundon- gos com Transplantes de Tumor Pituitário Subcutâneo Enquanto os dados acima indicam que o tratamento com o anti- corpo anti-VEGF-A reduz o nível de PRL desoro em camundongos Men1+/" transportanto tumor, também investigam-se isto no contexto de transplantes de adenomas pituitários subcutâneos em camundongos nus Balb/c. PRL de soro foi medido de amostras que se originam de 23 camundongos tratados com IgG de controle e 35 tratados com mAb G6-31, coletados no início do tratamento (dia 1), e no término do estudo (dia 35). Enquanto que o PRL de soro médio no dia 1 foi comparável entre os dois tratamentos, no dia 35 o tratamento com mAb G6-31 teve os níveis dse PRL de soro reduzidos signi- ficantemente (Figura 10 C e D, respectivamente).

Como o tratamento atual de prolactinonas de MEN1 inclui tera- pia médica ou hipofisectomia seletiva seguida por radioterapia, nossos da- dos indicando que o tratamento com mAb G6-31 induz ao nível de soro de PRL menor, com uma proeminente inibição de crescimento de tumor, forne- cem um método terapêutico novo potencial para os pacientes de MEN1. Níveis de Insulina de Soro são Elevados em Camundongos Men1+/"

Para examinar se os níveis de insolina de soro foram elevados nos camundongos Men1+/", amostras de soro foram analisadas de seis ca- mundongos não jejuados tratados com IgG de controle, e seis camundongos não jejuados tratados com mAb G6-31, que foram todos identificados com lesões pancreáticas em análise histológica. Os níveis de insulina de soro foram também analisados de five camundongos não jejuados, tipo selvagem pareados pela idade usando um kit ELISA de Camundongo Ultrasensível de acordo com as instruções do fabricante (Mercodia, Uppsala, Suíça). Nenhu- ma correlação com tratamento foi observada, entretanto, a insulina de soro média foi notavelmente elevada em camundongos Men1+/" (IgG de controle, 3,8 ± 2,6 ng/ml; mAb G6-31, 3,7 ± 2,4 ng/ml) em comparação com camun- dongos tipo selvagem (1,4 ± 0,7 ng/ml (±SEM)). Discussão

Nossos dados indicam que VEGF-A é requerido para o cresci- mento de adenomas de glândula pituitária benignos no modelo de camun- dongo de MEN1, quando a terapia com um anticorpo monoclonal contra VEGF-A mostrou-se suficiente para a inibição de crescimento de tumor.

Com base na literatura disponível, é possível que muitos dos efeitos antitumor observados de mAb G6-31 são mediados por supressão de angiogênese dependente de VEGFR-2 (Wise e outro, Proc. Natl. Acad. Sei. 96:3071-3076 (1999) e Zachary e outro, Cardiovasc. Res. 49:568-581 (2001)). Enquanto que a expressão média relativa de mRNA de VEGFR-2 em adenomas pituitários grandes não foi significantemente afetada por tra- tamento anti-VEGF-A (Figura 6), manchamento imuno-histoquímico para MECA-32 mostrou redução altamente significante em vascularidade (apro- ximadamente 50% de redução) em ambos os tumores pituitário e pancreáti- co tratados com Mab G6-31. A redução correspondente em crescimento de tumor tratado com anti-VEGF-A foi observada em ambos os adenomas pitui- tário e pancreático. Densidade vascular em ilhotas pancreáticas normais foi também significantemente diminuída em tratamento com anti-VEGF-A, em- bora a magnitude da mudança (25% de redução de tratado com IgG de con- trole) fosse menor do que aquela observada em adenomas pancreáticos.

O nível elevado observado de transcrição de VEGF-A em tumo- res tratados com Mab G6-31 é potencialmente um resultado de um meca- nismo compensatório para o sequestramento sistêmico de VEGF-A por Mab G6-31. Entretanto, parece que tal VEGF-A elevado não foi suficiente para controlar o crescimento de tumor.

Além de mostrar que a monoterapia com um tratamento com mAb G6-31 anti-VEGF-A reduziu significantemente a carga do tumor dos camundongos Men1+/" eficazmente inibindo o crescimento do adenoma, mostramos que o nível de prolactina de soro foi também reduzido. Desse modo, nossos dados sugerem a possibilidade de um tratamento não cirúrgi- co para tumores benigno endócrino, com a cessação do progresso da doen- ça sem o uso de agentes quimioterápicos. Alternativamente, tal bloqueio de VEGF-A pode ser combinado com um agente farmacológico. Por exemplo, para adenomas secretadores de prolactina, um antagonista de VEGF-A po- de ser combinado com um agonista de dopamina.

Exemplo 3: Eficácia de Intervenção Anti-VEGF e Eficácia de Regres- são/Sobrevivência no Modelo de RIP-TftAg de Carcinogênese de Múltiplos Estágios.

A fim de melhor entender o papel de terapias anti-VEGF em va- rious estágios de crescimento de tumor, retornamos para um número de modelos de tumor preclínico, incluindo o RIP-TpAg. RIP-TpAg (Exelixis, Inc.) é uma versão condicional de um modelo de tumor de ilhota pancreática de camundongo controlado por expressão transgênica do antígeno T Grande SV40 (TAg) (alvejado pela célula β pancreática, onde TAg funciona como um potente oncogene por ligação a tanto a p53 quanto Rb). O RIP-TpAg é feno- tipicamente similar ao modelo RIP-TAg que foi anteriormente descrito (Ha- nahan, Nature 315:115-122 (1985); Bergers e outro, Science 284 (808-811), 1999). Descobrimos que este modelo progride por meio de uma série de es- tágios crescentemente agressivos, incluindo a ativação de sinalização de VEGF e um "mudança angiogênica" (isto é, início do processo de formação de novos vasos sangüíneos) em aproximadamente 5 semanas. Tumores pequenos formam-se em 10 semanas, coincidindo com o iníciode sua con- versão maligna. Carcinomas invasivos grandes formam-se em 12 semanas. Desse modo, antes de 10 semanas de idade, os crescimentos celulares nos camundongos não são considerados malignos ou metastáticos. O período entre 10 a 12 semanas de idade geralmente inclui a formação de um câncer invasivo.

Para estes experimentos, camundongos RIP-TpAg foram aloja- dos e tratados de acordo com recomendações IACUC padrões, aos camun- dongos foi fornecido ração com alto teor de açúcar e 5% de água de sacaro- se para aliviar os sintomas de hiperinsulinemia causada pelo aumento em células beta secretoras de insulina no pâncreas. Em 9 a 9,5 ou 11 a 12 se- manas de idade, os camundongos foram tratados duas vezes por semana com uma injeção intraperitoneal de 5 mg/kg de anticorpo anti-VEGF ou anti- corpo monoclonal de controle antiambrósia americana pareados por anti- isótipo em salina tamponada por fosfato estéril. Na "experiência de interven- ção," os camundongos com 9 a 9,5 semanas de idade foram tratados duran- te 14 dias e em seguida examinados. Na "experiência de regressão," os ca- mundongos com 11 a 12 semanas de idade foram examinados após 7, 14, e 21 dias de tratamento. Pasra examinar a sobrevivência, outro coorte de ca- mundongos foi tratado até os camundongos exibirem morbidez ou mortali- dade. Em cada ponto do tempo definido nas experiências de intervenção e regressão, o pâncreas e baço de cada camundongo foram removidos e foto- grafados. O número de tumor dentro do pâncreas foi determinado por dis- secção de cada tumor esférico e contagem. A carga de tumor foi determina- da e a medição dos dois diâmetros maiores de cada tumor e o cálculo do volume usando o cálculo de volume esferoide (x2 multiplicando-se por y) multiplicando-se por 0,52. O volume de todos os tumores dentro do pâncreas do camundongo foi somado para determinar a carga total de tumor. Médias e desvios padrões foram calculados, e os dados foram grafados usando o Microsoft Excel v11.3.3 (Microsoft, Inc.). Comparações estatísticas entre o número de tumor e a carga de diferentes grupos foram realizdas usando um teste t de Student. As curvas Kaplan-Meier para análise de sobrevivências foram geradas usando JMP 6.0 (SAS Institute, Inc.) e as comparações esta- tísticas realizadas usando uma análise de classificação log.

O tratamento dos animais com 9 semanas de idade (a experiên- cia de "intervenção") com anticorpos anti-VEGF resultou em uma redução dramática em angiogênese de tumor (Figura 11). O tratamento dos animais com 11 semanas de idade (a "experiência de regressão") resultou em um decréscimo em vascularidade e proliferação de tumor (Figura 12A). Entre- tanto, ao contrário da experiência de intervenção, apenas uma redução tran- sitória em crescimento de tumor foi detectada e não houve nenhum impacto em sobrevivência (Figura 12B). Estes estudos demonstraram que estes tu- mores precoces são mais sensíveis a produtos terapêuticos alvejados por anti-VEGF quando em comparação com tumores avançados. Exemplo 4: Anti-VEGF e Quimioterapia são Eficazes em Modelos Pré- clínicos.

Cirurgia pode deixar para trás células de tumor residuais, ou nó- dulos micrometastáticos inativos, que têm o potencial de reativar o "progra- ma angiogênico" e facilitar crescimento de tumor mais exponencial. Usam-se tumores genéticos de camundongo e xenoenxertos humanos para inatividade de tumor modelo, usando regimes de quimiotera- pia potentes para "citorreduzir" o tumor concomitante ou seqüencialmente com terapias anti-VEGF, seguido por terapia de manutenção com anticorpos anti-VEGF monoclonais. Desse modo, estamos tratando o camundongo para prevenir a recorrência de um tumor, em vez perseguir um tumor após ele ser formado ou reformado, incluindo, em alguns casos, em um tumor que é re- fratário, reincidente ou resistente a mais tratamentos incluindo terapias anti- VEGF alvejadas. A Figura 13 mostra uma observação de que o docetaxel é bastante eficaz na redução de carga de tumor, todavia as células inativas desenvolvem-se novamente após aproximadamente 2 meses. Entretanto tratamento concomitante com anti-VEGF suprime novo crescimento de tu- mor, ainda que ele tenha pouco impacto sobre si próprio sobre o crescimen- to de tumores mais estabelecidos maiores. Dados adicionais demonstram que terapia anti-VEGF prolongada também suprime o novo crescimento de tumores seguindo citorredução com taxanos ou gencitabina. Estes resulta- dos demonstram que anti-VEGF pode ser usado para eficazmente bloquear crescimento ou novo crescimento de tumores inativos ou micrometástases. Estas descobertas são consistentes em o fato de que a neovascularização é um pré-requisito para a rápida expansão clonal associada com a formação de tumores macroscópicos e suporta o uso de antagonistas específicos de VEGF (por exemplo, anticorpos anti-VEGF incluindo porém não-limitados aos anticorpos série G6 ou B20) na manutenção de inatividade de tumor e a supressão de novo crescimento de tumor após tratamento inicial do tumor e antes da formação de novos tumores, reativação de tumores inativos, tumo- res malignos ou micrometástases. Exemplo 5: Terapia adjuvante usando bevacizumab

Este exemplo ilustra o uso de bevacizumab em uma terapia ad- juvante de pacientes com câncer de mama palpável e operável.

Quimioterapia neoadjuvante foi amplamente usada no tratamen- to de cânceres de mama grandes localmente avançados e potencialmente operáveis. Experiências randomizadas têm demonstrado que quimioterapia neoadjuvante reduz a necessidade de mastectomia (desse modo preservan- do a mama), com taxas de sobrevivência geral similares à quimioterapia ad- juvante. Powles e outro, J. Clin. Oncol. 13:547-52 (1995); Fisher e outro, J. Clin. Oncol. 16:2672-85 (1998).

Os objetivos primários da presente terapia são fornecer benefí- cios clínicos melhorados por adição de bevacizumab às quimioterapias em pacientes com câncer de mama palpável e operável. Especificamente, uma das medidas primárias de eficácia clínica de terapia adjuvante pode ser as taxas de resposta completa patológica (pCR). Outras medidas incluem taxas de resposta total (OR), taxas de resposta completa clínica (cCR), sobrevi- vência livre de doença (DFS) e sobrevivência geral (OS). Além disso, efeitos colaterais do tratamento podem ser monitorados por, por exemplo, taxas de complicação cirúrgica, toxicidade, e efeitos adversos sobre a função cardía- ca. Certa expressão de gene ou outras atividades de biomarcador podem também ser usadas como marcadores de resposta ao tratamento.

Resposta completa patológica (pCR) foi usada como um marca- dor prognóstico de eficácia de tratamento. pCR refere-se a uma falta de evi- dência histológica residual de tumor após terapia adjuvante no momento da cirurgia. Estudos têm sugerido que pacientes que obtêm pCR têm uma so- brevivência Significantemente melhorada. Entretanto, não existe nenhum método padrão para graduar resposta patológica, e se pCR pode ser usada como um marcador substituto de eficácia permanece controverso.

Pacientes adequados para uma terapia adjuvante com antago- nistas específicos de VEGF são selecionados com base nas normas e crité- rios predeterminados, que variam dependendo do tipo de câncer particular sob o tratamento. Por exemplo, pacientes podem ser selecionados com base em sua expectativa de vida, idade, histologia do câncer, funções hematoló- gicas/hepáticas e cardíacas, história do tratamento, planejamentos e estado reprodutivo, e estados psiquiátricos ou aditivos. Mais importantemente, o tumor primário deve ser mensurável e ou operável.

Os regimes de tratamento incluem quimioterapia mais antagonis- ta específico de VEGF, por exemplo, bevacizumab. Opcionalmente, agen- te(s) terapêutico(s) adicional(is) podem ser usados no regime também. Tipi- camente, o regime de quimioterapia comumente usado para o tipo de câncer particular (por exemplo, regime de terapia padrão) é usado em combinação com bevacizumab. Por exemplo, para neoadjuvantemente tratar câncer de mama, regime de docetaxel, paclitaxel ou doxorubicina/ciclofosfamida (AC) pode ser usado em combinação com bevacizumab. Alternativamente, regime com base em docetaxel ou com base em paclitaxel e regime de AC podem ser usados seqüencialmente como a quimioterapia combinada com bevaci- zumab. Para tratar câncer de pulmão de célula não pequena, cisplatina (so- zinha ou em combinação com outros quimioagentes tais como gencitabina, docetaxel, ou vinorelbina) pode ser usada como o quimioagente primário em combinação com bevacizumab. Para tratar câncer colorretal, por outro lado, regimes com base em 5-FU (tal como FOLFOX) podem ser usados em com- binação com bevacizumab.

Os agentes quimioterápicos e antagonista específico de VEGF, por exemplo, bevacizumab, são administrados aos pacientes em intervalos e dosagens administradas, durante vários ciclos. Por exemplo, bevacizumab pode ser administrado em 15 mg/kg a cada 3 semanas durante 4 ciclos, ou em 10 mg/kg a cada duas semanas durante 6 ciclos. Em outro exemplo, o antagonista específico de VEGF, por exemplo, bevacizumab, é administrado em 7,5 mg/kg uma vez a cada duas ou três semanas. Os pacientes são mo- nitorados quanto à resposta durante o tratamento. Na conclusão da terapia adjuvante, pacientes passam por cirurgia para remover o tumor primário, que foi operável antes da terapia adjuvante, ou tornou-se operável em resposta à terapia adjuvante. Após a cirurgia, os pacientes continuam sob terapia de antagonista específico de VEGF, por exemplo, bevacizumab, com ou sem quimioterapia, dependendo do estado particular do paciente. Opcionalmente, pacientes podem passar por terapia de radiação também. O progresso do paciente é monitorado durante todo o tratamento e pós-tratamento.

Eventos adversos (AEs) associados com tratamento anti-VEGF devem também ser estritamente monitorados e controlados. AEs principais conhecidos de estudos prévios incluem hipertensão, proteinúria, hemorragia, eventos tromboembólicos, fístula/perfuração gastrointestinal e complicações de cicatrização de ferimento. Certos AEs tal como hipertensão podem ser controlados com medicamento. Se AEs são severos e incontroláveis, o tra- tamento deve ser descontinuado. Exemplo 6: Terapia adjuvante usando bevacizumab

Este exemplo ilustra o uso de bevacizumab combinado com quimioterapia em tratamento adjuvante de pacientes com câncer ressectado.

Os pacientes adequados para a terapia adjuvante com bevaci- zumab são selecionados com base em normas e critérios predeterminados, que variam dependendo do tipo de câncer particular sob o tratamento. Por exemplo, pacientes podem ser selecionados com base em sua expectativa de vida, idade, histologia do câncer, funções hematológicas/hepáticas e car- díacas, história de estilo de vida, história de tratamento, planejamentos e estado reprodutivo, e estados psiquiátricos ou aditivos. Mais importantemen- te, os pacientes devem ter passado por ressecção completa de seu câncer antes do tratamento adjuvante. Tipos aceitos de ressecção dependem dos tipos de tumor particulares. Além disso, material de patologia suficiente re- presentativo de câncer do paciente deve estar disponível para análise do estágio inicial e para determinação da eficácia. No momento do tratamento, a cirurgia deve ser razoavelmente recente, e ainda o paciente deve estar completamente recuperado da cirurgia. Por exemplo, os pacientes devem começar tratamento adjuvante não menos do que 3-6 semanas e não mais do que 8-12 semanas após cirurgia.

Os regimes de tratamento incluem quimioterapia mais bevaci- zumab. Opcionalmente, agente(s) terapêutico(s) adicional(is) pode(m) ser usado(s) no regime também. Tipicamente, o agente quimioterápico em com- binação com bevacizumab é usado durante o primeiro estágio de tratamen- to, seguido por bevacizumab como um tratamento de manutenção de único agente para a fase restante. Por exemplo, pacientes são tratados com agen- tes quimioterápicos e bevacizumab durante cerca de 4 a 12 ciclos, em se- guida com bevacizumab sozinho durante até 1 a 2 anos. Duração de cada ciclo de tratamento quimioterapêutico + bevacizumab depende dos agentes específicos e dosagens usadas. Por exemplo, bevacizumab pode ser admi- nistrado em 15 mg/kg a cada 3 semanas como um ciclo, ou em 5 mg/kg a cada duas semanas como um ciclo. Em outro exemplo, bevacizumab pode ser administrado em 7,5 mg/kg ou 10 mg/kg a cada dois ou a cada três se- manas.

O regime de quimioterapia comumente usado para o tipo de câncer particular (por exemplo, regime de terapia padrão) é usado em com- binação com bevacizumab. Por exemplo, para terapia adjuvante de câncer de mama, regime de docetaxel, paclitaxel ou doxorubicina/ciclofosfamida (AC) podem ser usado em combinação com bevacizumab. Alternativamente, regime com base em docetaxel ou com base em paclitaxel e regime AC po- de ser usado seqüencialmente como quimioterapia combinada com bevaci- zumab. Para tratar câncer de pulmão de célula não pequena, cisplatina (ou sozinha ou em combinação com outros quimioagentes tais como gencitabi- na, docetaxel, ou vinorelbina) pode ser usada como o quimioagente primário em combinação com bevacizumab. Para tratar câncer colorretal, por outro lado, regimes com base em 5-FU (tal como FOLFOX) podem ser usados em combinação com bevacizumab.

O objetivo de tratamento adjuvante com bevacizumab é melho- rar a sobrevivência do paciente, preferivelmente sobrevivência livre de doen- ça. Enquanto isso, quaisquer eventos adversos associados com bevacizu- mab devem ser intimamente monitorados, especialmente por que o trata- mento adjuvante é a longo prazo. A sobrevivência pode ser estimada pelo método Kaplan-Meier, e quaisquer diferenças em sobrevivência são compu- tadas usando o teste de classificação Iog estratificado. Análises multivariá- veis usando o modelo risco proporcional de Cox são usadas para estimar os efeitos simultâneos de fatores prognósticos sobre a sobrevivência. As intera- ções com fatores prognósticos são examinadas com o modelo de risco pro- porcional de Cox. O pacote de software estatístico SAS é usado para todos os cálculos. Os dados são considerados ser estatisticamente significantes quando o valor de P é 0,05 ou menos. Todos os testes estatísticos são de dois lados. Eventos adversos (AEs) associados com tratamento anti-VEGF devem ser estritamente monitorados e controlados. AEs principais conheci- dos de estudos prévios incluem hipertensão, proteinúria, hemorragia, even- tos tromboembólicos, fístula/perfuração gastrointestinal e complicações de cicatrização de ferimento. Certos AEs tal como hipertensão podem ser con- trolados com medicamento. Se AEs são severos e incontroláveis, o trata- mento deve ser descontinuado. Outras Modalidades

A partir da descrição anterior, ficará evidente que variações e modificações podem ser preparadas para a invenção descrita aqui para ado- tá-la para vários usos e condições. Tais modalidades incluem-se também no escopo das seguintes reivindicações.

Todas as publicações, pedidos de patente, e patentes mencio- nadas nesta especificação incluindo os pedidos provisórios dos Estados ti- nidos números 60/870.741, depositado em 19 de dezembro de 2006; 60/870.745, depositado em 19 de dezembro de 2006; 60/877.267, deposita- do em 27 de dezembro de 2006; 60/919.638, depositado em 22 de março de 2007; 60/958.384, depositado em 5 de julho de 2007; e 60/989.397, deposi- tado em 20 de novembro de 2007, são aqui incorporados por referência para a mesma extensão, como se cada publicação independente, patente, ou pe- dido de patente fosse especifica e individualmente indicado para ser incorpo- rado por referência. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA <110> Genentech, Inc. et al.

<120> ANTAGONISTAS ESPECÍFICOS DE VEGF PARA TERAPIA ADJUVANTE E NEOADJUVANTE E O TRATAMENTO DE TUMORES EM ESTÁGIO PRECOCE <130> 504 74/014W06 <150> US 60/989,397 <151> 2007-11-20 <150> US 60/958,384 < 151 > 2007-0.7-05 <150> US 60/919,638 <151> 2007-03-22 <150> US 60/877,267 <151> 2006-12-27 <150> US 60/870,745 <151> 2006-12-19 <150> US 60/870,741 <151> 2006-12-19 <160> 5

<170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 24 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> sintético <400> 1

caacgtcact atgcagatca tgcg <210> 2 <211> 23 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220> <223> Sintético <400> 2

ggtctagttc ccgaaaccct gag <210> 3 <211> 25 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Sintético <400> 3

atgttccagt atgactccac tcacg <210> 4 <211> 25 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Sintético <400> 4

gaagacacca gtagactcca cgaca <210> 5 <211> 29 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223 > Sintético <400> 5

aagcccatca ccatcttcca ggagcgaga

Claims

1. Método de tratar um câncer benigno, pré-canceroso, ou não- metastático em um indivíduo, compreendendo administrar ao referido indiví- duo uma quantidade eficaz de um antagonista específico de VEGF.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a referida administração do antagonista específico de VEGF previne o referido câncer benigno, pré-canceroso, ou não-metastático de se tornar um câncer invasivo ou metastático.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o referido câncer benigno, pré-canceroso, ou não-metastático é um câncer de estágio O, estágio I, ou estágio II.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que a referida administração do antagonista específico de VEGF previne o referido câncer benigno, pré-canceroso ou não-metastático de progredir para um câncer de estágio Il ou estágio IV.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a referida administração do antagonista específico de VEGF reduz o tamanho do tu- mor.

6. Método de tratar um indivíduo com uma história de família de câncer, pólipos, ou uma síndrome de câncer herdada, compreendendo ad- ministrar ao referido indivíduo uma quantidade eficaz de um antagonista es- pecífico de VEGF para prevenir a ocorrência ou recorrência de um câncer benigno, pré-canceroso, ou não-metastático no referido indivíduo.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que o referido método previne a ocorrência ou recorrência do referido câncer benigno, pré- canceroso ou não-metastático em um indivíduo que nunca teve câncer clini- camente detectável ou um indivíduo que teve apenas um câncer benigno.

8. Método de reduzir o tamanho do tumor em um indivíduo tendo um tumor não removível, compreendendo administrar ao referido indivíduo uma quantidade eficaz de um antagonista específico de VEGF, em que a referida administração do antagonista específico de VEGF reduz o tamanho do tumor desse modo permitindo a completa remoção do tumor.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, também compreen- dendo a etapa de administrar ao referido indivíduo uma quantidade eficaz de um antagonista específico de VEGF após a completa remoção do tumor.

10. Método de tratar um indivíduo com câncer operável, com- preendendo administrar ao referido indivíduo uma quantidade eficaz de um antagonista específico de VEGF antes da cirurgia e realizando a cirurgia, desse modo o câncer é removido.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, também compre- endendo a etapa de administrar ao referido indivíduo uma quantidade eficaz de um antagonista específico de VEGF após a cirurgia para prevenir a recor- rência do câncer.

12. Método de acordo com a reivindicação 9 ou 11, em que a referida administração do antagonista específico de VEGF previne a prolife- ração de micrometástases.

13. Método de terapia adjuvante em um indivíduo com câncer operável, compreendendo administrar ao referido indivíduo um antagonista específico de VEGF.

14. Método de prevenir a recorrência de câncer em um indiví- duo, compreendendo administrar ao referido indivíduo um antagonista espe- cífico de VEGF, em que a referida administração previne a recorrência de câncer no referido indivíduo.

15. Método de reduzir a probabilidade de recorrência de câncer em um indivíduo, compreendendo administrar ao referido indivíduo um anta- gonista específico de VEGF, em que a referida administração reduz a pro- babilidade de recorrência de câncer no referido indivíduo.

16. Método de acordo com a reivindicação 14 ou 15, em que a referida administração do antagonista específico de VEGF previne ou reduz a probabilidade de ocorrência de um tumor clinicamente detectável, ou me- tástase do mesmo.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 ou 15, em que o indivíduo já teve cirurgia definitiva antes da referida etapa de administrar um antagonista específico de VEGF.

18.Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1,6, 8, 10, 13, 14, 15, ou 17, em que o antagonista específico de VEGF é uma monoterapia.

19.Método de acordo com qualquer uma das reivindicações1,6, 8, 10, 13, 14, 15 , 17, ou 18, em que o indivíduo já foi anteriormente trata- do com uma terapia anticâncer.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, em que a referida terapia anticâncer compreende terapia antiangiogênica.

21. Método de prevenir o novo crescimento de um tumor em um indivíduo compreendendo as etapas de remover o tumor e em seguida ad- ministrar ao indivíduo um antagonista específico de VEGF.

22. Método de prevenir a recorrência de câncer em um indivíduo tendo um tumor compreendendo as etapas de remover o tumor e em segui- da administrar ao indivíduo um antagonista específico de VEGF.

23. Método de acordo com a reivindicação 21 ou 22, também compreendendo um período de tempo entre a remoção do tumor e a admi- nistração do antagonista específico de VEGF1 em que o período de tempo é maior do que 2 semanas.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, em que o período de tempo é maior do que duas semanas e menor do que 1 ano.

25. Método de acordo com a reivindicação 21 ou 22, também compreendendo um período de tempo entre a remoção do tumor e a admi- nistração do antagonista específico de VEGF em que o período de tempo é de 28 dias.

26. Método de acordo com a reivindicação 21 ou 22, também compreendendo um período de tempo entre a remoção do tumor e a admi- nistração do antagonista específico de VEGF em que o período de tempo é suficiente para a incisão cirúrgica ser totalmente cicatrizada ou para reduzir o risco de deiscência do ferimento.

27. Método de acordo com a reivindicação 21 ou 22, em que o antagonista específico de VEGF é uma monoterapia.

28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, .6, 8, 10, 13, 14, 15, 18, ou 22, também compreendendo monitorar o indiví- duo for recorrência do referido câncer.

29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 6, 8, 10, 13, 14, 15, 18, 21, ou 22, em que o câncer ou tumor é gastrointesti- nal, colorretal, de mama, ovariano, de pulmão ou renal.

30. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 6, 8, 10, 13, 14, 15, 18, 21, ou 22, também compreendendo administrar uma terapia anticâncer adicional.

31. Método de acordo com a reivindicação 30, em que a referida terapia anticâncer adicional é quimioterapia.

32. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 6, 8, 10, 13, 14, 15, 18, 21, ou 22 em que o referido antagonista específico de VEGF é selecionado do grupo que consiste em um polipeptídeo que es- pecificamente se liga a VEGF, uma ribozima, um pepticorpo, um oligômero de nucleobase antissentido, uma pequena molécula de RNA e um aptâmero.

33. Método de acordo com a reivindicação 32, em que o referido polipeptídeo que especificamente se liga a VEGF é uma proteína receptora de VEGF solúvel, ou fragmento de ligação de VEGF do mesmo, ou uma pro- teína receptora de VEGF quimérica.

34. Método de acordo com a reivindicação 33, em que a referida proteína receptora de VEGF quimérica é Flt-1/Fc, KDR/Fc ou Flt/KDR/Fc.

35. Método de acordo com a reivindicação 32, em que o referido polipeptídeo que especificamente se liga a VEGF é um anticorpo anti-VEGF ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo.

36. Método de acordo com a reivindicação 35, em que o referido anticorpo anti-VEGF é um anticorpo monoclonal.

37. Método de acordo com a reivindicação 36, em que o referido anticorpo monoclonal é anticorpo quimérico, humanizado, ou totalmente hu- mano.

38. Método de acordo com a reivindicação 37, em que o referido anticorpo monoclonal é bevacizumab.