TWI577695B - 用於輔助及先導性輔助療法之血管內皮生長因子（ｖｅｇｆ）-特異性拮抗劑及早期腫瘤之治療 - Google Patents

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Description

用於輔助及先導性輔助療法之血管內皮生長因子(VEGF)-特異性拮抗劑及早期腫瘤之治療
癌症係人類健康之最致命性威脅之一。僅僅在美國，癌症每年會侵襲到將近130萬新患者，且成為繼心血管疾病之後的第二主要死亡原因，約在四例死亡中有一例係由癌症引起。實體腫瘤係造成大多數彼等死亡之原因。儘管已在某些癌症之醫學治療方面有顯著進展，但對於所有癌症而言，在過去20年中，5年總存活率僅僅提高約10%。癌症或惡性腫瘤以非受控方式迅速轉移及生長，使得及時偵測及治療極為困難。
當前癌症治療方法係相對非選擇性的且一般靶向在癌症已進展至較高惡性狀態之後的腫瘤。手術移除患病組織；放射線療法縮小實體腫瘤；而化學療法迅速殺死分裂細胞。詳言之，化學療法導致眾多副作用，在某些情況下副作用過於嚴重以致限制可給出之劑量且為此阻止潛在有效性藥物之使用。此外，癌症常常對化學治療藥物產生抗性。為防止進展至惡性或轉移性狀態，早期或良性腫瘤之治療將會為理想的，藉此降低與癌症相關之發病率及死亡率。
對於新近經診斷患有手術可治癌症之大多數患者而言，標準治療為確定性手術、繼之以化學療法。此類治療旨在儘可能地除去原發 性及轉移性疾病，從而防止復發及延長存活期。實際上，在手術之後大多數此等患者無殘餘腫瘤之肉眼可見跡象。然而，該等患者中有很多人隨後會出現復發且可能最終死於其疾病。此會發生係因為少量活腫瘤細胞會在手術之前已轉移，避開手術且在手術之後由於當前偵測技術之限制而未被偵測到。
因此，為了在此等殘餘微轉移癌細胞變成再增殖及難治癒者之前將其消除，術後輔助治療作為手術之輔助武器變得很重要。在過去幾十年裏，輔助療法已大體上逐步增多，其集中於各種化學治療劑之使用。許多化學療法方案已顯示在輔助治療患有早期主要癌症適應症(諸如肺癌、乳癌及結腸直腸癌)之患者中的臨床益處。Strauss等人，J Clin Oncol 22：7019(2004)；International Adjuvant Lung Cancer Tiral Collaboration Group N Engl J Med 350：351-60(2004)。Moertel等人，Ann Intern Med 122：321-6(1995)；IMPACT Lancet 345：939-44(1995)；Citron等人，J Clin Oncol 21：1431-9(2003)。
儘管化學輔助療法有既定之益處，但一個與任何類型之化學療法相關的主要限制為顯著毒性。通常，化學治療藥物不靶向腫瘤部位，且不能區分正常細胞與腫瘤細胞。由於漫長之治療及其對患者生活品質之持久影響，因此毒性問題在輔助環境中尤具挑戰性。此外，輔助化學療法在具較低復發危險之患者中的益處尚不清楚，因而對其而言，是否值得遭受化學療法之副作用令人懷疑。
先導性輔助療法，即一種在主要確定性手術之前提供的輔助療法，已作為癌症療法之另一重要部分而出現。在確定性手術之前提供先導性輔助治療有若干優勢。首先，其可由於腫瘤體積減小、腹水及胸膜滲出液減少而有助於改善患者手術前之行為狀態。其次，腫瘤體積減小可允許較小範圍之手術，因此保留患者之器官及其功能。對於(例如)乳癌患者而言，此尤為重要。而且，腫瘤體積減小可使否則手 術不可治腫瘤之手術治療成為可能。最後，先導性輔助療法可提高藉由手術完全移除腫瘤之機會，藉此延長存活期。在過去十年中，已有許多關於使用各種化學治療劑及/或輻射來治療患有諸如乳癌、頭頸癌、直腸癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、子宮頸癌、食道癌及胃癌以及前列腺癌之癌症的患者之先導性輔助療法的臨床試驗。有關綜述，參見Tanvetyanon等人，Southern Med.J.98：338-344(2005)。
如以上所解釋，一個與任何類型之化學療法相關的主要限制為顯著毒性。許多先導性輔助化學療法方案係麻煩的，需要長時段內之頻繁治療。此外，先導性輔助化學療法在具較低復發危險之患者中的益處，尤其存活期益處尚不清楚，因而對其而言，是否值得等待而非立即手術令人懷疑。
血管生成係重要細胞事件，其中血管內皮細胞增殖、修剪且重組以自先存血管網路形成新脈管。存在有血管供應之發展對於正常及病理性增殖過程而言必不可少的令人信服之證據。氧及營養素之傳遞以及分解代謝產物之移除在多細胞有機體中存在之大多數生長過程中呈現速率限制步驟。
儘管認為新血管之誘導為腫瘤血管生成之主要模式，但近期資料已表明一些腫瘤可藉由選取現存宿主血管而生長。所選取血管結構因而消退，導致腫瘤消退，此最終因低氧誘導腫瘤邊緣處之血管生成而逆轉。
正常及異常血管生成之關鍵正調節因子之一為血管內皮細胞生長因子(VEGF)-A。VEGF-A屬於包括VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F及PlGF之基因家族。VEGF-A主要與兩種高親和力受體酪胺酸激酶結合，亦即VEGFR-1(Flt-1)及VEGFR-2(Flk-1/KDR)，後者係VEGF-A之血管內皮細胞促有絲分裂信號的主要傳遞物。另外，神經菌毛素-1已被鑑別為肝素結合VEGF-A同功異型物之受體， 且可在血管發育中起作用。
除了作為血管生成因子之外，VEGF作為多效性生長因子在其他生理學過程中展現多種生物學效應，諸如內皮細胞存活及增殖、血管通透性及血管擴張、單核細胞趨化性及鈣流入。此外，其他研究已報導VEGF對少數非內皮細胞類型(諸如視網膜色素上皮細胞、胰管細胞及許旺(Schwann)細胞)之促有絲分裂效應。
對VEGF在病理性病狀中作為血管生成之主要調節因子的認可已產生眾多對於在涉及病理性血管生成之病狀中阻斷VEGF活性的嘗試。
VEGF表現在大多惡性腫瘤中上調，且VEGF之過度表現在許多實體腫瘤中與較晚期或與不良預後有關。因此，已將抑制VEGF信號轉導途徑之分子用於治療病理性血管生成顯著之相對晚期的實體腫瘤。
儘管有證據暗示VEGF在涉及病理性血管生成之病狀或疾病(包括晚期及轉移性或侵襲性腫瘤)之發展中的作用，但較少知道關於VEGF在早期或良性癌症、休眠後腫瘤之復發中或在第二部位腫瘤自休眠腫瘤、惡性腫瘤或微轉移之發展中的作用。本發明滿足此等及其他需要，此將在閱讀以下揭示內容之後明瞭。
VEGF-特異性拮抗劑與化學療法組合使用已展示尤其有益於患有轉移性結腸直腸癌及非小細胞肺癌之患者，但較少知道關於VEGF-特異性拮抗劑療法對於以下情形之影響：良性或早期腫瘤；在休眠、手術或其他介入診療之後腫瘤之復發；第二部位腫瘤自休眠腫瘤、惡性腫瘤或微轉移之發展；或在輔助或先導性輔助環境中。吾人在本文中提供顯示VEGF-特異性拮抗劑可用於治療包括良性、癌前、非轉移性及手術可治腫瘤之早期腫瘤的結果。該等結果進一步顯示VEGF-特異 性拮抗劑可用於癌症(例如良性或惡性癌症)之先導性輔助療法或用於防止及/或減小癌症(例如良性或惡性癌症)復發之可能性，包括輔助療法之方法。本發明構成一項重大醫療突破，其向患有包括良性、早期及手術可治癌症(在手術之前以及在手術之後)之癌症的患者提供更加有效、較小毒性之醫護。
因此，本發明之特徵為治療個體之良性、癌前或非轉移性癌症的方法，其包含向該個體投與有效量之VEGF-特異性拮抗劑。在某些實施例中，VEGF-特異性拮抗劑之投與可防止該良性、癌前或非轉移性癌症變成侵襲性或轉移性癌症。舉例而言，該良性、癌前或非轉移性癌症可為第0期、第I期或第II期癌症，且在某些實施例中，VEGF-特異性拮抗劑之投與可防止該良性、癌前或非轉移性癌症進展至下一期，例如第I期、第II期、第III期或第IV期癌症。在某些實施例中，以足以治療個體之良性、癌前或非轉移性腫瘤或足以防止該良性、癌前或非轉移性腫瘤變成侵襲性或轉移性癌症的時間及量投與VEGF-特異性拮抗劑。在某些實施例中，投與VEGF-特異性拮抗劑可減小良性、癌前或非轉移性腫瘤之腫瘤大小、腫瘤負荷或者腫瘤數目。VEGF-特異性拮抗劑亦可以一定量及一定時間投與以降低良性、癌前或非轉移性腫瘤之血管密度。
如本文中所描述，本發明方法可用於治療(例如)第0期(例如原位癌)、第I期或第II期癌症等。先導性輔助及輔助療法之方法可用於治療任何類型之癌症，例如良性或惡性癌症。在本發明之某些實施例中，該癌症為上皮細胞實體腫瘤，包括(但不限於)胃腸癌、結腸癌、乳癌、前列腺癌、腎癌、肺癌(例如非小細胞肺癌)、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、頭頸癌、肝癌及軟組織癌(例如B細胞淋巴瘤，諸如NHL；及多發性骨髓瘤；及白血病，諸如慢性淋巴球性白血病)。在另一實施例中，該良性、癌前或非轉移性腫瘤為息肉、腺瘤、纖維 瘤、脂肪瘤、胃泌素瘤、胰島素瘤、軟骨瘤、骨瘤、血管瘤、淋巴管瘤、腦膜瘤、平滑肌瘤、橫紋肌瘤、鱗狀細胞乳頭狀瘤、聽神經瘤、神經纖維瘤、膽管囊腺瘤、平滑肌瘤、間皮瘤、畸胎瘤、黏液瘤、沙眼、肉芽腫、錯構瘤、移行細胞乳頭狀瘤、唾液腺多形性腺瘤、硬纖維瘤、皮樣囊乳頭狀瘤、囊腺瘤、局灶性結節性增生或結節性再生性增生。在另一實施例中，該方法理想地為用於治療腺瘤。腺瘤之非限制性實例包括肝細胞腺瘤、腎腺瘤、後腎腺瘤、支氣管腺瘤、肺泡腺瘤、腎上腺腺瘤、垂體腺瘤、甲狀旁腺腺瘤、胰腺腺瘤、唾液腺腺瘤、肝細胞腺瘤、胃腸腺瘤、管狀腺瘤及膽管腺瘤。
本發明之特徵亦為包含向個體投與有效量之VEGF-特異性拮抗劑以防止該個體中良性、癌前或非轉移性癌症之存在或復發的方法。在本發明之某些實施例中，該個體處於癌症、息肉或癌症症候群之危險中。舉例而言，該個體具有癌症、息肉家族史或遺傳性癌症症候群(例如多發性內分泌瘤形成1型(MEN1))。在本發明之某些態樣中，該個體處於患上良性、癌前或非轉移性胃腸腫瘤、硬纖維瘤或腺瘤(例如胃腸腺瘤、垂體腺瘤或胰腺腺瘤)之危險中。在某些實施例中，該方法防止該良性、癌前或非轉移性癌症在從未具有腫瘤之個體、從未患有臨床上可偵測之癌症之個體或僅具有良性腫瘤之個體中的存在或復發。
在另一態樣中，本發明之特徵為一種治療個體中之第0期、第I期或第II期胃腸腫瘤的方法，其包括以足以治療該個體中之該第0期、第I期或第II期胃腸腫瘤的時間及量向該個體投與VEGF-特異性拮抗劑。該胃腸腫瘤可為胃腸系統之任何第0期、第I期或第II期癌症，包括肛門癌、結腸直腸癌、直腸癌、食道癌、膽囊癌、胃癌、肝癌、胰腺癌及小腸癌症。在一實施例中，該胃腸腫瘤為第0期(例如高等級腺瘤)或第I期腫瘤。在一實施例中，該個體先前未經受用以治療該胃腸 腫瘤之切除術。
在另一態樣中，本發明之特徵為一種治療處於患上胃腸腫瘤之危險中之個體的方法，其包括以足以防止該個體中該胃腸腫瘤之存在或復發的時間及量向該個體投與VEGF-特異性拮抗劑。該胃腸腫瘤可為任何胃腸腫瘤，包括(但不限於)腺瘤、一或多種息肉或第0期、第I期或第II期癌症。
在上述方法之某些實施例中，個體為年齡在50歲以上之人類，具有遺傳性癌症症候群或具有結腸癌或息肉家族史。遺傳性胃腸癌症候群之非限制性實例包括家族性腺瘤性息肉病(FAP)、嘉德耐氏症候群(Gardner's syndrome)、胰腺癌及遺傳性非息肉病性結腸直腸癌(HNPCC)。在某些實施例中，該個體可能先前已經受結腸鏡檢查或可能先前未經受結腸鏡檢查。在一實施例中，以一定量及一定時間投與VEGF-特異性拮抗劑以減少患有FAP之個體中腺瘤性結腸直腸息肉之數目。
在另一態樣中，本發明之特徵為防止或減小個體中癌症復發之可能性的方法，其包括以足以防止或減小該個體中癌症復發之可能性的時間及量向該個體投與VEGF-特異性拮抗劑。本發明包括一種防止具有腫瘤之個體中癌症復發的方法，其包括以下步驟：移除該腫瘤(例如使用確定性手術)且此後向該個體投與VEGF-特異性拮抗劑。本發明包括防止個體中之腫瘤再生長之方法，其包括以下步驟：移除該腫瘤(例如使用確定性手術)且此後向該個體投與VEGF-特異性拮抗劑。在一相關態樣中，本發明包括一種防止個體中之癌症復發或減小個體中癌症復發之可能性的方法，其視情況包括在手術之前向該個體投與有效量之VEGF-特異性拮抗劑；執行確定性手術；及繼該手術之後投與有效量之VEGF-特異性拮抗劑，其中該VEGF-特異性拮抗劑在該手術之後的投與可防止癌症之復發或減小癌症復發之可能性。在另 一相關態樣中，本發明包括一種防止個體中之癌症復發或減小個體中癌症復發之可能性的方法，其包括在不存在任何其他抗癌治療劑之情況下向該個體投與有效量之VEGF-特異性拮抗劑，其中該投與可防止個體中癌症之復發或減小個體中癌症復發之可能性。
對於以上態樣中之每一者而言，腫瘤可為任何類型之腫瘤，包括(但不限於)實體腫瘤，且尤其為本文中所描述之腫瘤及腺瘤。個體可具有休眠腫瘤或微轉移，其可能為臨床上可偵測的或可能為臨床上不可偵測的。在此態樣之一實施例中，以足以減少休眠腫瘤或微轉移之新血管生成的時間及量投與VEGF-特異性拮抗劑。在另一實施例中，以足以防止臨床上可偵測之腫瘤或其轉移之存在或足以增加個體存活持續時間的時間及量投與VEGF-特異性拮抗劑。
在一實施例中，VEGF-特異性拮抗劑為單一療法。在另一實施例中，先前已針對腫瘤對個體進行過治療，例如使用抗癌療法治療過。在一實例中，該抗癌療法為手術。在另一實施例中，個體可另外在投與VEGF-特異性拮抗劑之前、期間(例如同時)或之後用其他抗癌療法治療。抗癌療法之實例包括(但不限於)手術、放射療法(放射線療法)、生物療法、免疫療法、化學療法或此等療法之組合。
在個體已經受確定性手術之實施例中，通常在個體已自該手術恢復之時段之後投與VEGF-特異性拮抗劑。此時段可包括創傷癒合或手術切口癒合所需之時段、減小創口開裂之危險所需之時段或個體恢復至健康水準基本上類似於或優於手術前之健康水準所需的時段。介於完成確定性手術與首次投與VEGF-特異性拮抗劑之間的時段亦可包括藥物假期所需之時段，其中個體需要或請求介於治療方案之間的時段。一般而言，介於完成確定性手術與開始VEGF-特異性拮抗劑療法之間的時段可包括小於一週、1週、2週、3週、4週(28天)、5週、6週、7週、8週、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個 月、10個月、11個月、1年、2年、3年或3年以上。在一實施例中，介於確定性手術與投與VEGF-特異性拮抗劑之間的時段大於2週且小於1年。
上述態樣中之每一者可另外包括針對癌症之復發對個體進行監測。
本發明亦提供在個體(例如人類患者)中在手術移除手術可治癌症之前進行先導性輔助療法的方法，其包含向該患者投與有效量之VEGF-特異性拮抗劑，例如貝伐單抗(bevacizumab)，其中該患者已經診斷患有腫瘤或癌症。VEGF-特異性拮抗劑可單獨投與或與至少一種化學治療劑組合投與。
本發明亦包括一種治療患有手術可治癌症之個體的方法，其包括在手術之前向該個體投與有效量之VEGF-特異性拮抗劑且此後執行手術，由此切除該癌症。在一實施例中，該方法另外包括以下步驟：在手術之後向該個體投與有效量之VEGF-特異性拮抗劑以防止該癌症復發。
在另一態樣中，本發明係關於一種先導性輔助療法之方法，其包含在確定性手術之前向患有手術可治癌症之個體投與有效量之VEGF-特異性拮抗劑(例如貝伐單抗)及至少一種化學治療劑。該方法可用於延長該個體之無病存活期(DFS)或總存活期(OS)。在一實施例中，該DFS或該OS係在治療開始之後約2至5年內加以評估。
在另一態樣中，本發明包括一種減小具有不可切除之腫瘤的個體中之腫瘤大小的方法，其包含向該個體投與有效量之VEGF-特異性拮抗劑，其中該投與減小該腫瘤大小，藉此允許完全切除該腫瘤。在一實施例中，該方法另外包括在完全切除該腫瘤之後向該個體投與有效量之VEGF-特異性拮抗劑。
在另一態樣中，本發明係關於一種治療個體中之癌症的方法， 其包含以下步驟：a)第一階段，其包含複數個治療週期，其中各週期包含以預定時間間隔向該個體投與有效量之VEGF-特異性拮抗劑(例如貝伐單抗)及至少一種化學治療劑；b)確定性手術，藉此移除該癌症；及c)第二階段，其包含複數個維持週期，其中各週期包含在無任何化學治療劑之情況下以預定時間間隔向該個體投與有效量之VEGF-特異性拮抗劑(例如貝伐單抗)。在一實施例中，該第一階段包含第一複數個治療週期，其中投與VEGF-特異性拮抗劑(例如貝伐單抗)及第一化學療法方案，繼之以第二複數個治療週期，其中投與VEGF-特異性拮抗劑(例如貝伐單抗)及第二化學療法方案。在一實施例中，若待治療之癌症為乳癌，則該第一化學療法方案包含阿黴素(doxorubicin)及環磷醯胺且該第二化學療法方案包含太平洋紫杉醇(paclitaxel)。
本發明提供如下方法，其包含在確定性手術之後向患有轉移性或非轉移性癌症之個體投與有效量之VEGF-特異性拮抗劑(例如貝伐單抗)。在一實施例中，該方法另外包括使用至少一種化學治療劑。該方法可用於延長個體之DFS或OS。在一實施例中，該DFS或該OS係在治療開始之後約2至5年內加以評估。在一實施例中，該個體在治療之後至少1至5年內無病。
在一態樣中，該方法包含以下步驟：a)第一階段，其包含複數個治療週期，其中各週期包含以預定時間間隔向個體投與有效量之VEGF-特異性拮抗劑(例如貝伐單抗)及至少一種化學治療劑；及b)第二階段，其包含複數個維持週期，其中各週期包含在無任何化學治療劑之情況下以預定時間間隔向該個體投與有效量之VEGF-特異性拮抗劑(例如貝伐單抗)；其中所組合之第一階段及第二階段在初始術後治療之後持續至少一年。在一實施例中，該第一階段包含第一複數個治療週期，其中投與VEGF-特異性拮抗劑(例如貝伐單抗)及第一化學療法方案，繼之以第二複數個治療週期，其中投與VEGF-特異性拮抗劑 (例如貝伐單抗)及第二化學療法方案。例如，若待治療之癌症為乳癌，則該第一化學療法方案包含阿黴素及環磷醯胺且該第二化學療法方案包含太平洋紫杉醇。
在以上態樣中之每一者的某些實施例中，VEGF-特異性拮抗劑為可與VEGF結合或可降低VEGF表現或生物活性之化合物。VEGF-特異性拮抗劑可為以下例示性化合物中之任一者：與VEGF特異性結合之多肽、VEGF-特異性核酶、VEGF-特異性肽體(peptibody)、與編碼VEGF多肽之核酸分子之至少一部分互補的反義核鹼基寡聚物、與編碼VEGF多肽之核酸分子之至少一部分互補的小RNA分子，或適體。與VEGF特異性結合之多肽可為可溶性VEGF受體蛋白或其VEGF結合片段或嵌合VEGF受體蛋白，諸如Flt-1/Fc、KDR/Fc或Flt/KDR/Fc。與VEGF特異性結合之多肽亦可為抗VEGF抗體或其抗原結合片段。抗VEGF抗體或其抗原結合片段可為單株抗體、嵌合抗體、完全人類抗體或人類化抗體。適用於本發明之方法的例示性抗體包括貝伐單抗(AVASTIN®)、G6-31、B20-4.1及其片段。該抗體或其抗原結合片段亦可為缺乏Fc部分、F(ab')2、Fab或Fv結構之抗體。
視疾病之類型及嚴重程度而定，VEGF-特異性拮抗劑(例如貝伐單抗)之較佳劑量在本文中進行了描述，且其範圍可介於約1μg/kg至約50mg/kg，最佳介於約5mg/kg至約15mg/kg，包括(但不限於)7.5mg/kg或10mg/kg。投與頻率應視疾病之類型及嚴重程度而變化。對於歷經數天或更久時間之反覆投與而言，視病狀而定，持續治療直至癌症得以治療或所需治療效果得以達成，此如由本文中所描述或此項技術中已知之方法所量測。在一實例中，每週一次、每兩週一次或每三週一次以約5mg/kg至約15mg/kg之劑量範圍(包括(但不限於)7.5mg/kg或10mg/kg)投與本發明之VEGF-特異性拮抗劑(例如抗體)。然而，其他給藥方案可為適用的。本發明之療法的進程易於藉由習知技 術及檢定來監測。
在以上態樣中之每一者的其他實施例中，局部地或全身地(例如經口或靜脈內)投與VEGF-特異性拮抗劑。在一實施例中，延長VEGF-特異性拮抗劑之治療直至患者已無癌症達選自由1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年及12年組成之群的時段。
儘管個體可在投與VEGF-特異性拮抗劑之前、期間或之後以若干不同方式治療，但在本發明態樣中之每一者的一實施例中，個體係在未進行手術或化學療法之情況下被治療。在其他實施例中，VEGF-特異性拮抗劑之治療為單一療法，或在VEGF-特異性拮抗劑治療期之持續時間內為單一療法，此如由臨床醫師或本文中所描述來評估。
在其他實施例中，將VEGF-特異性拮抗劑之治療與其他抗癌療法組合，該其他抗癌療法包括(但不限於)手術、放射療法、化學療法、分化誘導(differentiating)療法、生物療法、免疫療法、血管生成抑制劑及抗增殖化合物。VEGF-特異性拮抗劑之治療亦可包括上述類型之治療方案的任何組合。另外，細胞毒性劑、抗血管生成劑及抗增生劑可與VEGF-特異性拮抗劑組合使用。在一實施例中，抗癌療法為化學療法。舉例而言，化學治療劑係選自(例如)烷化劑、抗代謝物、葉酸類似物、嘧啶類似物、嘌呤類似物及相關抑制劑、長春花生物鹼、表鬼臼毒素、抗生素、L-天冬醯胺、拓撲異構酶抑制劑、干擾素、鉑配位錯合物、經蒽二酮取代之脲、甲基肼衍生物、腎上腺皮質抑制劑、腎上腺皮質類固醇、孕酮、雌激素、抗雌激素、雄激素、抗雄激素、促性腺激素釋放激素類似物等。在一些態樣中，化學治療劑與VEGF-特異性拮抗劑係共同投與。
在包括其他抗癌療法之實施例中，個體可在投與VEGF-特異性拮抗劑之前、期間(例如同時)或之後另外用該其他抗癌療法治療。在一 實施例中，該抗癌療法為化學療法，其包括投與伊立替康(irinotecan)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、甲醯四氫葉酸、吉西他濱(gemcitabine)或其組合。在一實施例中，可投與單獨投與抑或與抗癌療法一起投與之VEGF-特異性拮抗劑作為維持療法而投與。在一態樣中，對於前列腺癌、卵巢癌及乳癌而言，該抗癌療法可為激素療法。在一例示性實施例中，將VEGF-特異性拮抗劑與不包括抗Her2抗體或其片段或衍生物(例如Herceptin®抗體)之抗癌療法組合投與。
本發明之方法尤其有利於治療及預防早期腫瘤，藉此防止進展至較晚期，從而減少與晚期癌症相關之發病率及死亡率。本發明之方法亦有利於防止腫瘤之復發或腫瘤(例如在移除原發腫瘤之後繼續存在之休眠腫瘤)之再生長或有利於減少或防止微轉移之存在或增殖。
對於本發明之方法而言，癌症可為實體腫瘤，例如乳癌、結腸直腸癌、直腸癌、肺癌、腎細胞癌、神經膠質瘤(例如退行性星形細胞瘤、退行性寡星形細胞瘤、退行性寡樹突細胞瘤、多形性膠質母細胞瘤)、腎癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、軟組織肉瘤、類癌瘤癌、頭頸癌、黑色素瘤及卵巢癌。在一實施例中，癌症為胃腸癌。
在本發明之以上態樣中之每一者的其他實施例中，以一定量或一定時間(例如對於隨時間之特定治療方案而言)投與VEGF-特異性拮抗劑以使包括(但不限於)良性、癌前或非轉移性癌症之腫瘤或癌症中的癌細胞數目減少(例如減少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或更多)；以減小腫瘤、息肉或腺瘤之大小；以減小腫瘤負荷；以抑制(亦即以在某種程度上減少及/或阻止)癌細胞浸潤至周邊器官中；以減少激素分泌；以減少息肉數目；以減小包括(但不限於)良性、癌前或非轉移性癌症之腫瘤或癌症之血管密度；以抑制腫瘤轉移；以降低或抑制腫瘤生長或腫瘤細胞增殖；以減少或防止休眠腫瘤之生長；以降低或防止微轉移之生長或增殖；以降低或防止 在治療或移除之後腫瘤之再生長；以增加或延長易患有或經診斷患有良性、癌前或非轉移性腫瘤之個體的DFS或OS；及/或以在某種程度上減輕與癌症相關之症狀中的一或多個症狀。在一實例中，存活期係以個體之無病存活期(DFS)或總存活期(OS)來衡量，其中該DFS或該OS係在治療開始之後約2至5年內評估。在一些其他實施例中，使用VEGF-特異性拮抗劑來防止個體中癌症之存在或復發。在一實例中，癌症復發之防止係於個體群體中在約四年之後進行評估，以證實該群體中有至少約80%未出現疾病復發。在另一實例中，使用VEGF-特異性拮抗劑來減小個體中腫瘤或癌症復發之可能性。在一實例中，癌症復發係在約3年時評估，其中與單獨以化學療法治療的個體相比，癌症復發得以減少至少約50%。
本發明之方法亦可包括針對癌症或腫瘤之復發對個體進行監測。
根據以下[實施方式]、圖式及申請專利範圍，本發明之其他特徵及優勢將顯而易見。
圖1A-1F為一系列顯示Apcmin/+腺瘤及正常絨毛中之VEGF-A表現的顯微照片。在14週齡Apcmin/+小鼠之小腸(圖1A、圖1D)及大腸(圖1B、圖1E)之腸腺瘤以及正常絨毛(圖1C、圖1F)上以VEGF-A探針進行的原位雜交展示在上皮(箭頭)及基質細胞(箭頭頭部)中之VEGF-A表現。明視野：圖1A-1C；暗視野：圖1D-1F。
圖2A-2F為一系列顯示抑制VEGF-A可降低腫瘤負荷及延長存活期的圖。圖2A為顯示組群中個別小鼠之腫瘤負荷的圖。腫瘤負荷係由自最大腫瘤負荷值至最小腫瘤負荷值之線條所指示。白色十字指示組群平均值。*P<0.008，**p<5.3×10-5。n表示動物之數目。圖2B為一系列針對腫瘤直徑及佔腫瘤總數之百分數而顯示腫瘤分布之圖。n表 示組群中腫瘤之數目。圖2C為一系列顯示在治療3週(頂部)之後及治療6週(中間)之後腫瘤大小頻率之覆蓋的圖。底部圖顯示與第0天相比腫瘤大小頻率之覆蓋(底部)。垂直線條說明小於或等於腫瘤頻率在經mAb G6-31治療之動物中為較大時之大小的大小；在3週治療組中為1mm且在6週治療組中為1.2mm。圖2D為針對腸位置繪製顯示平均腫瘤直徑之圖。n表示每組分別在腸第一四分之一段、第二四分之一段、第三四分之一段及第四四分之一段中腫瘤之數目。第0天組含有十二隻動物，其他組含有10隻。S：胃；C：盲腸；R：直腸。線條表示SEM。與mAb G6-31 3或6週相比，*P<1.0×10-10，**p<0.002。圖2E為顯示以遞減次序呈現之十四隻Apcmin/+；Villin-Cre(黑色柱)及Apcmin/+；VEGFlox；Villin-Cre(灰色柱)小鼠之平均腫瘤直徑的圖。線條表示標準差(SD)。圖2F為顯示經mAb G6-31(灰線)或經對照IgG(黑線)治療之小鼠之卡本-麥爾(Kaplan-Meier)分析結果的圖。空心箭頭表示治療之持續時間。中值存活期係以灰色箭頭指示。*P<2.4×10-3。n表示組群中小鼠之數目。
圖3A-3L顯示抗VEGF-A治療在改變腫瘤形態而非增殖指數方面之效應。圖3A-3B為經亞甲基藍染色之小腸之空腸區段的顯微照片。圖3C-3D為顯示來自空腸之H&E染色切片之低放大率影像的顯微照片。圖3E-3F為顯示來自空腸之H&E染色腫瘤切片之高放大率影像的顯微照片。圖3G-3J為顯示以Ki-67抗體對腫瘤組織及正常黏膜之免疫組織化學染色的顯微照片。以H&E進行對比染色。圖3K為顯示以對於Ki-67呈陽性之細胞核相對於細胞核總數之百分數表示的增殖指數之圖。線條表示SEM。圖3L為對來自用對照IgG(N1-N4)或mAb G6-31(N5-N8)治療之動物的正常黏膜溶胞物、來自用對照IgG(T1-T4)或mAb G6-31(T5-T8)治療之動物的腫瘤溶胞物之西方墨點分析結果。
圖4A-4C顯示在mAb G6-31治療後腫瘤血管面積密度減小。圖 4A-4B為來自空腸腫瘤之免疫組織化學染色的80μm切片之共焦影像。綠色-CD31，血管內皮細胞；藍色-E-鈣黏附蛋白，上皮細胞；紅色-平滑肌肌動蛋白。圖4C為顯示以對於CD31呈陽性之面積相對於所分析之總腫瘤面積的百分數表示之血管密度的圖。線條表示SEM；n表示所分析之腫瘤的數目。
圖5A-5D為一系列顯示抗VEGF-A治療抑制垂體腫瘤生長之圖。圖5A為顯示對照IgG(黑線)及mAb G6-31(灰線)治療組在治療第9天、第25天、第39天、第53天及第67天時之平均腫瘤體積的圖。線條表示SEM。n表示組群中小鼠之數目。圖5B為顯示用對照IgG(實線)或mAb G6-31(虛線)治療之個別小鼠之腫瘤體積的圖。在研究終點之前由於健康不良而將7隻小鼠施以安樂死(在67天時點之前終止的線)。圖5C為顯示在治療開始後於第9天、第25天、第39天、第53天及第67天評估之對照IgG(黑線)及mAb G6-31(灰線)治療組之無腫瘤倍增存活期的圖。圖5D為顯示經對照IgG(黑線)及經mAb G6-31(灰線)治療之皮下垂體腫瘤移植物在治療第1天、第7天、第14天、第21天、第28天及第35天時之腫瘤體積量測結果的圖。線條表示SEM。n表示組群中小鼠之數目。
圖6為顯示垂體腺及Men1+/-垂體腺瘤表現VEGF-A、VEGFR-1及VEGFR-2之圖。針對野生型垂體腺(黑色柱)、Men1+/-小鼠之非腫瘤性垂體腺組織(灰色)、Men1+/-小鼠之未經治療之小垂體腺瘤、經對照IgG治療之垂體腫瘤(紅色)及經mAb G6-31治療之垂體腫瘤(藍色)顯示VEGF-A、VEGFR-1及VEGFR-2之相對表現。線條表示SEM。ns：不顯著。
圖7為一系列Men1+/-小鼠之代表性垂體腫瘤之MRI影像。顯示經對照IgG及經mAb G6-31治療之小鼠在治療第9天、第39天及第67天時之垂體腺瘤的冠狀切片。對於第9天而言，以黃色星號突出垂體腺瘤 之邊緣。在治療開始後第9天、第39天及第67天時，經對照IgG治療之腫瘤的體積分別為23.2mm3、55.9mm3及142.0mm3，且mAb G6-31治療之腫瘤的體積分別為18.9mm3、27.2mm3及35.3mm3。
圖8A-8H為一系列顯示Men1+/-小鼠之垂體及胰腺腫瘤之組織檢驗結果的影像。圖8A-8B顯示經H&E染色之垂體腫瘤且圖8E-8F顯示經H&E染色之胰腺腫瘤。圖8C-8D顯示以全內皮標誌MECA-32對原位垂體腫瘤之免疫組織化學染色，且圖8G-8H顯示以全內皮標誌MECA-32對原位胰腺腫瘤之免疫組織化學染色。圖8I為顯示在對照IgG及抗VEGF治療之動物中檢定垂體腫瘤之血管密度之結果的圖且圖8J顯示在經對照IgG及經抗VEGF治療之動物中檢定胰腺腫瘤之血管密度之結果的圖。線條表示SD。ns：不顯著。
圖9A-9D為一系列顯示來自Men1+/-小鼠之垂體腫瘤及垂體腫瘤移植物對於泌乳素呈染色陽性的影像。顯示以抗泌乳素抗體對原位垂體腫瘤(圖9A-9B)及皮下垂體腫瘤移植物(圖9C-9D)之免疫組織化學染色。圖9E及圖9F為顯示鄰近於乳腺之移植垂體腫瘤展示泌乳素誘導之分泌變化(影像左側)的影像。
圖10A-10D顯示血清泌乳素及生長激素含量在具有垂體腫瘤及垂體腫瘤移植物之小鼠中升高。圖10A為針對19隻未經治療、具有腫瘤之Men1+/-小鼠的垂體腫瘤體積(mm3)繪製顯示血清PRL含量(ng/ml)之圖，其說明正相關性。圖10B為針對在研究終點時經對照IgG(黑色三角形)及經mAb G6-31(灰色球形)治療之Men1+/-小鼠的垂體腫瘤體積繪製顯示血清PRL含量之圖。圖10C-10D為顯示具有垂體腺瘤移植物之小鼠在治療第1天及第35天時之血清泌乳素(C)及生長激素(D)含量的圖。
圖11為顯示在小鼠胰小島腫瘤發展Rip-TβAg模型中在早期腫瘤發展期間抗VEGF治療("介入")之效果的圖。該圖顯示與用同型匹配對 照單株抗體治療相比，在用抗VEGF抗體治療之後在9至11週時腫瘤血管生成降低，如由平均血管生成小島數目所量測。
圖12A及圖12B顯示消退試驗之結果，其中在小鼠胰小島腫瘤發展Rip-TβAg模型中在用抗VEGF抗體治療與用同型匹配對照單株抗體治療之間偵測到在腫瘤負荷或存活期方面無顯著差異。圖12A為顯示與用同型匹配對照單株抗體治療之小鼠相比用抗VEGF抗體治療之小鼠之腫瘤負荷的圖。圖12B為顯示與用同型匹配對照單株抗體治療之小鼠相比用抗VEGF抗體治療之小鼠的隨時間之存活期的圖。
圖13為顯示繼用紫杉烷或吉西他濱減滅細胞之後延長之抗VEGF療法抑制腫瘤再生長之有效性的圖。
圖14A-14D為一系列顯示與相鄰正常垂體前葉(虛線以下)相比未經治療之原發垂體腺瘤(圖14A，虛線以上)對生長激素不定地且微弱地呈陽性的影像。四個移植垂體腫瘤中之一者(經對照IgG治療)對生長激素呈弱陽性(圖14B)。用mab G6-31(圖14C)或對照IgG(圖14D)治療之小鼠的原發垂體腫瘤對生長激素局部地呈陽性。
I. 定義
術語"VEGF"或"VEGF-A"係用來指具有165個胺基酸之人類血管內皮細胞生長因子及相關具有121個、145個、189個及206個胺基酸之人類血管內皮細胞生長因子，如由(例如)Leung等人，Science,246：1306(1989)及Houck等人，Mol.Endocrin.,5：1806(1991)所述；以及其天然產生之對偶基因及經加工形式。VEGF-A屬於包括VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F及PlGF之基因家族。VEGF-A主要與兩種高親和力受體酪胺酸激酶結合，亦即VEGFR-1(Flt-1)及VEGFR-2(Flk-1/KDR)，後者係VEGF-A之血管內皮細胞促有絲分裂信號的主要傳遞物。另外，神經菌毛素-1已被鑑別為肝素結合VEGF-A 同功異型物之受體，且可在血管發育中起作用。術語"VEGF"或"VEGF-A"亦係指來自諸如小鼠、大鼠或靈長類動物之非人類物種的VEGF。有時，來自特定物種之VEGF係由諸如針對人類VEGF之hVEGF或針對鼠類VEGF之mVEGF之術語指示。術語"VEGF"亦係用來指包含具有165個胺基酸之人類血管內皮細胞生長因子之胺基酸8至109或1至109的多肽之截短形式或片段。對任何該等形式之VEGF的提及可在本申請案中(例如)以"VEGF(8-109)"、"VEGF(1-109)"或"VEGF165"標識。對於"截短"天然VEGF而言，胺基酸位置係如天然VEGF序列中所指示來編號。舉例而言，截短天然VEGF中之胺基酸位置17(甲硫胺酸)亦為天然VEGF中之位置17(甲硫胺酸)。截短天然VEGF對KDR及Flt-1受體具有與天然VEGF相當之結合親和力。
如本文中所用之術語"VEGF變異體"係指包括天然VEGF序列中之一或多個胺基酸突變的VEGF多肽。視情況，該或該等胺基酸突變包括胺基酸取代。為了簡寫標示本文中所描述之VEGF變異體，應注意編號係指沿推定天然VEGF胺基酸序列(在Leung等人，同上文及Houck等人，同上文中提供)之胺基酸殘基位置。
"天然序列"多肽包含具有與源自自然界之多肽相同之胺基酸序列的多肽。因此，天然序列多肽可具有來自任何哺乳動物之天然產生之多肽的胺基酸序列。該天然序列多肽可自自然界分離或可藉由重組或合成方法產生。術語"天然序列"多肽特定言之涵蓋多肽之天然產生之截短或分泌形式(例如胞外域序列)、多肽之天然產生之變異體形式(例如別樣剪接形式)及多肽之天然產生之對偶基因變異體。
多肽"變異體"意謂與天然序列多肽具有至少約80%胺基酸序列一致性之生物活性多肽。該等變異體包括(例如)在多肽之N末端或C末端處添加或刪除一或多個胺基酸殘基的多肽。通常，變異體與天然序列多肽將具有至少約80%胺基酸序列一致性，更佳具有至少約90%胺基 酸序列一致性，且甚至更佳具有至少約95%胺基酸序列一致性。
"VEGF生物活性"包括與任何VEGF受體結合或任何VEGF信號轉導活性，諸如調節正常及異常血管生成及血管發生(Ferrara及Davis-Smyth(1997)Endocrine Rev.18：4-25；Ferrara(1999)J.Mol.Med.77：527-543)；促進胚胎血管發生及血管生成(Carmeliet等人，(1996)Nature 380：435-439；Ferrara等人，(1996)Nature 380：439-442)；及調節雌性生殖道中之循環血管增生以及調節骨生長及軟骨形成(Ferrara等人，(1998)Nature Med.4：336-340；Gerber等人，(1999)Nature Med.5：623-628))。除了作為血管生成及血管發生中之血管生成因子之外，VEGF作為多效性生長因子在其他生理學過程中展現多種生物學效應，諸如內皮細胞存活、血管通透性及血管擴張、單核細胞趨化性及鈣流入(Ferrara及Davis-Smyth(1997)，同上文，以及Cebe-Suarez等人，Cell.Mol.LifeSci.63：601-615(2006))。此外，最近研究已報導VEGF對少數非內皮細胞類型(諸如視網膜色素上皮細胞、胰管細胞及許旺細胞)之促有絲分裂效應。Guerrin等人，(1995)J.Cell Physiol.164：385-394；Oberg-Welsh等人，(1997)Mol.Cell.Endocrinol.126：125-132；Sondell等人，(1999)J.Neurosci.19：5731-5740。
"VEGF-特異性拮抗劑"在本文中係在第III部分進行描述。
"抗VEGF抗體"係能以足夠親和力及特異性與VEGF結合之抗體。所選抗體正常地應對VEGF具有足夠強之結合親和力，舉例而言，該抗體可在介於100nM-1pM之Kd值下結合hVEGF。抗體親和力可(例如)藉由基於表面電漿共振之檢定(諸如如PCT申請公開案第WO2005/012359號中所述之BIAcore檢定)、酶聯結免疫吸附檢定(ELISA)及競爭檢定(例如RIA檢定)測定。在某些實施例中，本發明之抗VEGF抗體可作為治療劑用於靶向及干擾涉及VEGF活性之疾病或病狀。而且，該抗體可經受其他生物活性檢定(例如)以便評估其作為治 療劑之有效性。該等檢定在此項技術中係已知的，且係視該抗體之靶抗原及意欲用途而定。實例包括HUVEC抑制檢定(如以下實例中所述)；腫瘤細胞生長抑制檢定(舉例而言，如WO 89/06692中所述)；抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及補體介導之細胞毒性(CDC)檢定(美國專利5,500,362)；以及促效活性或血細胞生成檢定(參見WO 95/27062)。抗VEGF抗體通常不會與其他VEGF同系物結合，諸如VEGF-B或VEGF-C，亦不會與其他生長因子結合，諸如P1GF、PDGF或bFGF。關於抗VEGF抗體之其他資訊可見於第III部分，A。
貫穿本說明書及申請專利範圍，在免疫球蛋白重鏈中殘基之編號為如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中之EU指數的編號，該文獻以引用之方式明確地併入本文中。"如Kabat中之EU指數"係指人類IgG1 EU抗體之殘基編號。
術語"抗體"係在最廣泛意義上加以使用且特定言之覆蓋單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，其限制條件為其展現所需生物活性。
根據本發明之"Kd"或"Kd值"在一實施例中係藉由用抗體之Fab形式及VEGF分子執行的放射性標記VEGF結合檢定(RIA)來量測，如由以下檢定所述：藉由在連續滴定之未標記VEGF存在下使Fab與最小濃度之(125I)標記VEGF(109)平衡，接著用塗有抗Fab抗體之板捕捉結合VEGF，從而量測Fab對VEGF之溶液結合親和力(Chen等人，(1999)J.Mol Biol 293：865-881)。為建立檢定之條件，用50mM碳酸鈉(pH 9.6)中之5μg/ml捕捉抗Fab抗體(Cappel Labs)塗佈微量滴定盤(Dynex)隔夜，且隨後於室溫(約23℃)下用PBS中之2%(重量/體積)牛血清白蛋白阻斷2至5小時。在無吸附劑板(Nunc #269620)中，將100pM或26pM[125I]VEGF(109)與連續稀釋之所關注Fab(例如Fab-12)混合(Presta等 人，(1997)Cancer Res.57：4593-4599)。接著將所關注Fab培養隔夜；然而，該培養可持續65小時以確保達到平衡。此後，將混合物轉移至捕捉板上以於室溫下培養一小時。接著移除溶液且用PBS中之0.1% Tween-20將板洗滌八次。當板已乾燥時，添加150微升/孔之閃爍體(MicroScint-20；Packard)，且將板以Topcount γ計數器(Packard)計數歷時十分鐘。選擇產生小於或等於最大結合之20%的各Fab濃度用於競爭性結合檢定。根據另一實施例，Kd或Kd值係藉由用表面電漿共振檢定，於25℃下使用BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)以約10反應單位(RU)之固定hVEGF(8-109)CM5晶片來測定。簡言之，根據供應商之說明，用N-乙基-N'-(3-二甲胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物感測器晶片(CM5,BIAcore Inc.)。用10mM乙酸鈉(pH 4.8)將人類VEGF稀釋為5μg/ml(約0.2μM)，隨後以5微升/分鐘之流動速率注射以獲得約10反應單位(RU)之偶合蛋白。在注射人類VEGF之後，注射1M乙醇胺以阻斷未反應之基團。對於動力學量測，於25℃下將兩倍連續稀釋之Fab(0.78nM至500nM)以約25μl/min之流動速率注入具有0.05% Tween 20之PBS(PBST)中。使用簡單一對一朗繆爾結合模型(Langmuir binding model)(BIAcore評估軟體(BIAcore Evaluation Software)版本3.2)，藉由同時擬合締合及解離感應圖來計算締合速率(kon)及解離速率(koff)。將平衡解離常數(Kd)計算為比率koff/kon。參見(例如)Chen,Y.，等人，(1999)J.Mol Biol 293：865-881。若藉由上述表面電漿共振檢定得知，締合速率超過106M-1S-1，則可藉由使用於25℃下量測於PBS(pH 7.2)中之20nM抗VEGF抗體(Fab形式)之螢光發射強度之增減(激發=295nm；發射=340nm，16nm帶通)的螢光淬滅技術在如光譜計所量測之增加濃度的人類VEGF短形式(8-109)或小鼠VEGF存在下測定締合速率，該光譜計諸如具有經攪拌比色皿之停流 配備光譜光度計(Aviv Instruments)或8000系列SLM-Aminco光譜光度計(ThermoSpectronic)。
"阻斷"抗體或抗體"拮抗劑"為可抑制或降低所結合之抗原之生物活性的抗體。舉例而言，VEGF-特異性拮抗劑抗體結合VEGF且抑制VEGF誘導血管內皮細胞增生之能力。較佳阻斷抗體或拮抗劑抗體完全抑制抗原之生物活性。
除非另外指明，否則貫穿本說明書，表述"多價抗體"係用來指包含3個或3個以上抗原結合位點之抗體。舉例而言，多價抗體係經工程化而具有3個或3個以上抗原結合位點，且一般並非天然序列IgM或IgA抗體。
"Fv"片段為含有全抗原識別及結合位點之抗體片段。此區域由緊密締合之一個重鏈可變域及一個輕鏈可變域的二聚體組成，其本質上可為共價的，例如在scFv中。在此構型中，各可變域之三個CDR相互作用以界定該VH-VL二聚體表面上之抗原結合位點。總而言之，六個CDR或其子集賦予抗體抗原結合特異性。然而，即使單一可變域(或僅包含三個對抗原具特異性之CDR的一半Fv)仍具有識別及結合抗原之能力，但通常其親和力比完整結合位點低。
如本文中所用，"抗體可變域"係指包括互補判定區(CDR；亦即CDR1、CDR2及CDR3)及構架區(FR)之胺基酸序列的抗體分子之輕鏈及重鏈的部分。VH係指重鏈可變域。VL係指輕鏈可變域。根據本發明中所用之方法，對於CDR及FR指定之胺基酸位置可根據Kabat(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1987年及1991年))定義。抗體或抗原結合片段之胺基酸編號亦根據Kabat之編號。
如本文中所用，術語"互補判定區"(CDR；亦即CDR1、CDR2及CDR3)係指抗體可變域之胺基酸殘基，其存在對於抗原結合而言係必 需的。各可變域通常具有三個CDR區，其被標識為CDR1、CDR2及CDR3。各互補判定區可包含來自如由Kabat所定義之"互補判定區"之胺基酸殘基(亦即輕鏈可變域中之約殘基24-34(L1)、50-56(L2)及89-97(L3)以及重鏈可變域中之殘基31-35(H1)、50-65(H2)及95-102(H3)；Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))及/或來自"高變環"之彼等殘基(亦即輕鏈可變域中之約殘基26-32(L1)、50-52(L2)及91-96(L3)以及重鏈可變域中之26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)；Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。在某些情況下，互補判定區可包括來自根據Kabat定義之CDR區及高變環的胺基酸。例如，抗體4D5之重鏈之CDRH1包括胺基酸26至35。
"構架區"(下文中稱為FR)為除CDR殘基以外之彼等可變域殘基。各可變域通常具有四個FR，其被標識為FR1、FR2、FR3及FR4。若CDR係根據Kabat定義，則輕鏈FR殘基係位於約殘基1-23(LCFR1)、35-49(LCFR2)、57-88(LCFR3)及98-107(LCFR4)處，且重鏈FR殘基係位於重鏈殘基中約殘基1-30(HCFR1)、36-49(HCFR2)、66-94(HCFR3)及103-113(HCFR4)處。若CDR包含來自高變環之胺基酸殘基，則輕鏈FR殘基係位於輕鏈中約殘基1-25(LCFR1)、33-49(LCFR2)、53-90(LCFR3)及97-107(LCFR4)處，且重鏈FR殘基係位於重鏈殘基中約殘基1-25(HCFR1)、33-52(HCFR2)、56-95(HCFR3)及102-113(HCFR4)處。在某些情況下，當CDR包含來自如由Kabat所定義之CDR及高變環的胺基酸時，FR殘基將作相應調整。例如，當CDRH1包括胺基酸H26-H35時，重鏈FR1殘基係在位置1-25處且FR2殘基係在位置36-49處。
"Fab"片段含有輕鏈之可變域及恆定域以及重鏈之可變域及第一 恆定域(CH1)。F(ab')2抗體片段包含一對Fab片段，其在靠近其羧基末端處一般以介於其之間的鉸鏈半胱胺酸共價鍵聯。抗體片段之其他化學偶合在此項技術中亦為已知。
"單鏈Fv"或"scFv"抗體片段包含抗體之VH域及VL域，其中此等域存在於單一多肽鏈中。一般而言，Fv多肽另外包含介於VH域與VL域之間的多肽連接子，其使scFv能夠形成抗原結合所需之結構。關於scFv之綜述，參見Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編，Springer-Verlag,New York，第269-315頁(1994)。
術語"雙功能抗體"係指具有兩個抗原結合位點之小抗體片段，該等片段包含在同一多肽鏈(VH及VL)中與輕鏈可變域(VL)連接之重鏈可變域(VH)。藉由使用過短而使得同一鏈上之兩個域之間不可配對的連接子，迫使該等域與另一鏈之互補域配對，且產生兩個抗原結合位點。雙功能抗體更充分地描述於(例如)EP 404,097、WO 93/11161及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993)中。.表述"線性抗體"係指Zapata等人，Protein Eng.,8(10)：1057-1062(1995)中所描述之抗體。簡言之，此等抗體包含一對串聯Fd區段(VH-CH1-VH-CH1)，其連同互補輕鏈多肽形成一對抗原結合區。線性抗體可為雙特異性或單特異性的。
如本文中所用之術語"單株抗體"係指自一群大體上同質之抗體獲得之抗體，亦即構成該群之個別抗體除可以微量存在之可能天然產生之突變以外為相同的。單株抗體針對單一抗原位點具高度特異性。此外，與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的習知(多株)抗體製劑不同，每一單株抗體係針對抗原上之單一決定子。修飾語"單株"表明抗體之特徵為其係獲自一群大體上同質之抗體，而不應被理解為需要藉由任何特定方法來產生抗體。舉例而言，根據本發 明待使用之單株抗體可藉由由Kohler等人，Nature 256：495(1975)首先描述之融合瘤方法製造，或可藉由重組DNA方法(參見(例如)美國專利第4,816,567號)製造。"單株抗體"亦可使用(例如)Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)及Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)中所述之技術自噬菌體抗體庫分離。
本文中之單株抗體具體言之包括"嵌合"抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈及/或輕鏈之一部分與源自特定物種或屬於特定抗體種類或亞類之抗體中的相應序列一致或同源，而鏈之其餘部分與源自另一物種或屬於另一抗體種類或亞類之抗體中的相應序列一致或同源；以及該等抗體之片段，其限制條件為其展現所需生物活性(美國專利第4,816,567號；及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。
非人類(例如鼠類)抗體之"人類化"形式為含有源自非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合抗體。多半而言，人類化抗體為如下人類免疫球蛋白(接受抗體)：其中來自接受抗體之高變區的殘基由具有所需特異性、親和力及能力的來自諸如小鼠、大鼠、兔子或非人類靈長類動物之非人類物種(供體抗體)之高變區的殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之Fv構架區(FR)殘基由相應非人類殘基置換。此外，人類化抗體可包含既不見於接受抗體中亦不見於供體抗體中之殘基。作此等修飾以進一步改進抗體效能。一般而言，人類化抗體將包含至少一個且通常兩個可變域之大體上全部，其中所有或大體上所有高變環對應於非人類免疫球蛋白之彼等者且所有或大體上所有FR區為人類免疫球蛋白序列之彼等者。人類化抗體視情況亦將包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，通常為人類免疫球蛋白之至少一部分。關於其他詳情，參見Jones等人，Nature 321；522-525(1986)；Riechmarn等人，Nature 332：323-329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol. 2：593-596(1992)。
"人類抗體"為具有對應於由人類產生之抗體之胺基酸序列的胺基酸序列及/或使用如本文所揭示用於製造人類抗體之任何技術製造的抗體。人類抗體之此定義明確地排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。人類抗體可使用此項技術中已知之各種技術來產生。在一實施例中，人類抗體係選自噬菌體庫，其中彼噬菌體庫表現人類抗體(Vaughan等人，Nature Biotechnology 14：309-314(1996)：Sheets等人Proc.Natl.Acad.Sci.95：6157-6162(1998)；Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227：381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.,222：581(1991))。人類抗體亦可藉由將人類免疫球蛋白基因座引入轉殖基因動物(例如小鼠)中來製造，在該等動物中內因性免疫球蛋白基因已部分或完全失活。在激發後，觀察到人類抗體產生，其在包括基因重排、裝配及抗體譜之所有方面密切地類似於人類中所見。此途徑(例如)描述於美國專利第5,545,807號、第5,545,806號、第5,569,825號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,661,016號以及以下科學出版物中：Marks等人，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg等人，Nature 368：856-859(1994)；Morrison,Nature 368：812-13(1994)；Fishwild等人，Nature Biotechnology 14：845-51(1996)；Neuberger,Nature Biotechnology 14：826(1996)；Lonberg及Huszar,Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。或者，人類抗體可經由人類B淋巴細胞之永生化從而產生針對靶抗原之抗體來製備(該等B淋巴細胞可自個體回收或可已被活體外免疫)。參見(例如)Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss，第77頁(1985)；Boerner等人，J.Immunol.,147(1)：86-95(1991)；及美國專利第5,750,373號。
"親和力成熟"抗體為如下抗體：在其一或多個CDR中具有一或多 個變化，導致該抗體與不具有彼等變化之親本抗體相比對抗原之親和力有所改善。較佳之親和力成熟抗體將對靶抗原具有奈莫耳濃度或甚至皮莫耳濃度之親和力。親和力成熟抗體係藉由此項技術中已知之程序產生。Marks等人，Bio/Technology 10：779-783(1992)描述藉由VH及VL域改組引起之親和力成熟。CDR及/或構架殘基之隨機突變誘發係由以下文獻描述：Barbas等人，Proc Nat.Acad.Sci,USA 91：3809-3813(1994)；Schier等人，Gene 169：147-155(1995)；Yelton等人，J.Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson等人，J.Immunol.154(7)：3310-9(1995)；及Hawkins等人，J.Mol.Biol.226：889-896(1992)。
抗體之"功能性抗原結合位點"為能夠結合靶抗原之位點。該抗原結合位點之抗原結合親和力並非必須如該抗原結合位點所源自之親本抗體一樣強，但其結合抗原之能力必須可使用已知用於評估抗體與抗原之結合的多種方法中之任一種方法來量測。此外，本文中之多價抗體的抗原結合位點中之每一者的抗原結合親和力無需在數值上相同。對於本文中之多聚抗體而言，功能性抗原結合位點之數目可使用如美國專利申請公開案第20050186208號之實例2中所述之超速離心分析來估算。根據此分析方法，將不同比率之靶抗原與多聚抗體組合且假定功能性結合位點之不同數目而計算錯合物之平均分子量。將此等理論值與所獲得之實際實驗值比較，以便估算功能性結合位點之數目。
具有指定抗體之"生物學特徵"之抗體為具有使得彼抗體區別於可與同一抗原結合之其他抗體的生物學特徵中之一或多種特徵的抗體。
為了對與所關注抗體所結合之抗原上之抗原決定基結合的抗體進行篩選，可進行諸如Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow及David Lane(1988)中所述之常規交叉阻斷檢定。
"物種依賴性抗體"為對來自第一哺乳動物物種之抗原具有比對來自第二哺乳動物物種之彼抗原同系物強之結合親和力的抗體。通常，物種依賴性抗體與人類抗原"特異性結合"(亦即具有不超過約1×10-7M、較佳不超過約1×10-8M且最佳不超過約1×10-9M之結合親和力(Kd)值)，但對來自第二非人類哺乳動物物種之抗原同系物具有比其對人類抗原之結合親和力弱至少約50倍或至少約500倍或至少約1000倍的結合親和力。物種依賴性抗體可為上述各種抗體中之任一種抗體，但通常為人類化或人類抗體。
如本文所用，"抗體突變體"或"抗體變異體"係指物種依賴性抗體之胺基酸序列變異體，其中物種依賴性抗體之胺基酸殘基中的一或多個殘基已發生改變。該等突變體必須與物種依賴性抗體具有小於100%之序列一致性或相似性。在一實施例中，抗體突變體將具有與物種依賴性抗體之重鏈抑或輕鏈可變域之胺基酸序列有至少75%胺基酸序列一致性或相似性、更佳至少80%、更佳至少85%、更佳至少90%胺基酸序列一致性或相似性且最佳至少95%胺基酸序列一致性或相似性的胺基酸序列。關於此序列之一致性或相似性在本文中係定義為在比對序列及引入間隙(若必要)以達成最大序列一致性百分比之後候選序列中與物種依賴性抗體殘基一致(亦即相同殘基)或相似(亦即基於共有側鏈特性來自同一群之胺基酸殘基，參見下文)之胺基酸殘基所佔的百分比。應認為，在可變域以外抗體序列之N末端、C末端或內部延伸、刪除或插入皆不影響序列一致性或相似性。
為增加含有本發明之胺基酸序列的抗體或多肽之半衰期，吾人可將補救受體結合抗原決定基連接至抗體(特定言之抗體片段)，例如，如美國專利5,739,277中所述。舉例而言，可將編碼補救受體結合抗原決定基之核酸分子同框連接至編碼本發明之多肽序列之核酸，以使得由工程化核酸分子所表現之融合蛋白包含補救受體結合抗原決定 基及本發明之多肽序列。如本文中所使用之術語"補救受體結合抗原決定基"係指引起IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)之活體內血清半衰期增加的IgG分子之Fc區之抗原決定基(例如Ghetie等人，Ann.Rev.Immunol.18：739-766(2000)，表1)。在其Fc區中具有取代且具有增加之血清半衰期的抗體亦描述於以下文獻中：WO 00/42072、WO 02/060919；Shields等人，J.Biol.Chem.276：6591-6604(2001)；Hinton,J.Biol.Chem.279：6213-6216(2004)。在另一實施例中，血清半衰期亦可例如藉由連接其他多肽序列而增加。舉例而言，可將適用於本發明之方法的抗體或其他多肽連接至與FcRn受體或血清白蛋白結合肽結合之血清白蛋白或血清白蛋白之一部分，以使得血清白蛋白與抗體或多肽結合，例如該等多肽序列揭示於WO 01/45746中。在一實施例中，待連接之血清白蛋白肽包含DICLPRWGCLW之胺基酸序列。在另一實施例中，藉由該等方法使Fab之半衰期增加。關於血清白蛋白結合肽序列，亦參見Dennis等人，J.Biol.Chem.277：35035-35043(2002)。
"嵌合VEGF受體蛋白"為具有源自至少兩種不同蛋白質且其中至少一者為VEGF受體蛋白之胺基酸序列的VEGF受體分子。在某些實施例中，嵌合VEGF受體蛋白能夠與VEGF結合且能夠抑制VEGF之生物活性。
"經分離"多肽或"經分離"抗體為已自其自然環境之組份中鑑別且分離及/或回收之多肽或抗體。其自然環境之污染物組份為會干擾多肽或抗體之診斷性或治療性用途的物質，且可包括酶、激素及其他蛋白質性或非蛋白質性溶質。在某些實施例中，多肽或抗體將被純化(1)至如勞立法(Lowry method)所測定之大於95重量%之多肽或抗體，且最佳至大於99重量%；(2)至足以藉由使用轉杯式測序儀獲得N末端或內部胺基酸序列之至少15個殘基的程度；或(3)至藉由在還原或非 還原條件下使用庫馬斯藍(Coomassie blue)或銀染色之SDS-PAGE得知的均質性。經分離多肽或抗體包括重組細胞內之原位多肽或抗體，此係因為多肽自然環境中之至少一個組份將不會存在。然而，經分離多肽或抗體通常將藉由至少一個純化步驟來製備。
"片段"係意謂較佳含有參考核酸分子或多肽之全長之至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或95%以上的多肽或核酸分子之一部分。片段可含有10、20、30、40、50、60、70、80、90或100、200、300、400、500、600個或600個以上之核苷酸或10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、190、200個或200個以上之胺基酸。
"抗血管生成劑"或"血管生成抑制劑"係指能直接抑或間接地抑制血管生成、血管發生或不良血管通透性之小分子量物質、聚核苷酸、多肽、經分離蛋白、重組蛋白、抗體或其接合物或融合蛋白。應瞭解，抗血管生成劑包括結合血管生成因子及其受體以及阻斷血管生成因子及其受體之血管生成活性的彼等藥劑。舉例而言，抗血管生成劑為如上定義之血管生成劑之抗體或其他拮抗劑，例如VEGF-A或VEGF-A受體(例如KDR受體或Flt-1受體)之抗體、抗PDGFR抑制劑，諸如GleevecTM(伊馬替尼甲磺酸鹽，Imatinib Mesylate)。抗血管生成劑亦包括天然血管生成抑制劑，例如血管抑制素、內皮抑制素等。參見(例如)Klagsbrun及D'Amore,Annu.Rev.Physiol.,53：217-39(1991)；Streit及Detmar,Oncogene，22：3172-3179(2003)(例如表3列舉對惡性黑色素瘤之抗血管生成療法)；Ferrara & Alitalo,Nature Medicine 5：1359-1364(1999)；Tonini等人，Oncogene,22：6549-6556(2003)(例如表2列舉已知抗血管生成因子)；及Sato.Int.J.Clin.Oncol.,8：200-206(2003)(例如表1列舉臨床試驗中所用之抗血管生成劑)。
"治療"係指治療性治療及預防性或防護性措施。需要治療之彼等 者包括已具有良性、癌前或非轉移性腫瘤之彼等者以及有待防止腫瘤之存在或復發之彼等者。
術語"治療有效量"係指VEGF-特異性拮抗劑可治療或預防哺乳動物之疾病或病症所要的量。在癌前、良性或早期腫瘤之情況下，治療有效量之VEGF-特異性拮抗劑可減少癌細胞數目；減小原發腫瘤大小；抑制(亦即在某種程度上減緩且較佳阻止)癌細胞浸潤至周邊器官中；抑制(亦即在某種程度上減緩且較佳阻止)腫瘤轉移；在某種程度上抑制腫瘤生長；及/或在某種程度上減輕與病症相關之症狀中的一或多個症狀。對於治療腫瘤休眠或微轉移而言，治療有效量之VEGF-特異性拮抗劑可減少微轉移之數目或增殖；降低或防止休眠腫瘤之生長；或減少或防止在治療或移除(例如使用抗癌療法，諸如手術、放射療法或化學療法)之後腫瘤之復發。就藥物可防止及/或殺死現有癌細胞而言，其可為細胞抑制劑或細胞毒性劑。對於癌症療法而言，活體內功效可(例如)藉由評估存活持續時間、疾病進展時間(TTP)、反應率(RR)、反應持續時間、緩減時間及/或生活品質來量度。有效量可延長無病存活期(DFS)；延長總存活期(OS)；降低復發可能性；延長復發時間；延長遠端復發(亦即原發部位以外之復發)之時間；治癒腫瘤；改善癌症症狀(例如，如利用癌症特別調查所評定)；減少第二原發癌症之出現等。
"手術可治"癌症為限於原發器官且適合手術治療之癌症。
"存活期"係指患者保持存活，且包括無病存活期(DFS)、無進展存活期(PFS)及總存活期(OS)。存活期可藉由卡本-麥爾(Kaplan-Meier)方法估算，且存活期之任何差異係使用分層對數秩和(log-rank)測試來計算。
"無病存活期(DFS)"係指自治療開始起或自初始診斷起在確定時段(諸如約1年、約2年、約3年、約4年、約5年、約10年等)內於癌症 沒有再發之情況下患者保持存活。在本發明之一態樣中，DFS係根據意向治療原則來分析，亦即患者係基於其指定療法加以評估。DFS之分析中所用之事件可包括癌症之局部復發、區域性復發或遠端復發、第二癌症之發生及無先前事件(例如乳癌復發或第二原發癌症)之患者中由任何病因所致的死亡。
"總存活期"係指自治療開始起或自初始診斷起在確定時段(諸如約1年、約2年、約3年、約4年、約5年、約10年等)內患者保持存活。在本發明之研究中，存活期分析所用之時間為由於任何病因所致的死亡。
"延長存活期"係意謂相對於未經治療之患者(亦即相對於未以VEGF-特異性拮抗劑(例如VEGF抗體)治療之患者)而言或相對於對照治療方案(諸如僅以化學治療劑(諸如太平洋紫杉醇)治療)而言，經治療患者之DFS及/或OS增加。在治療開始之後或在初始診斷之後監測至少約6個月，或至少約1年，或至少約2年，或至少約3年，或至少約4年，或至少約5年，或至少約10年等內之存活期。
在存活期分析中"風險比"為兩存活曲線之間的差異之總結，表示在追蹤期內與對照組相比治療之後死亡危險之降低。出於本發明之目的，風險比係定義為表示在任何特定時點實驗組中之事件可能性除以對照組中之事件可能性所得的值。
術語"共同"在本文中係用來指兩種或兩種以上治療劑之投與，其中至少部分投與在時間上重疊。相應地，共同投與包括在停止一或多種藥劑之投與之後繼續一或多種其他藥劑之投與時的給藥方案。
"單一療法"係意謂在治療期過程期間對於治療癌症或腫瘤僅包括單一治療劑之治療方案。使用VEGF-特異性拮抗劑之單一療法意謂在彼治療期內在不存在其他抗癌療法的情況下投與VEGF-特異性拮抗劑。
"維持療法"係意謂為減小疾病復發或進展之可能性而給予的治療方案。維持療法可被提供歷時任何長度之時間，包括延長之時段直至個體之壽命期。維持療法可在初始療法之後提供或與初始療法或其他療法一起提供。維持療法所用之劑量可變化且可包括與其他類型之療法所用之劑量相比減少之劑量。
"先導性輔助療法"或"術前療法"在本文中係指在手術前給予之療法。先導性輔助療法之目的為提供即時全身治療，若按照先手術然後進行全身療法之標準次序，則其可能根除否則會增殖之微轉移。先導性輔助療法亦可有助於減小腫瘤大小，藉此允許完全切除最初不可切除之腫瘤或保留部分器官或其功能。此外，先導性輔助療法允許活體內評估藥物功效，此可引導後續治療之選擇。
"輔助療法"在本文中係指在手術之後給予之療法，其中未能偵測到殘留疾病之跡象，從而降低疾病復發之危險。輔助療法之目的為防止癌症復發，且因此降低癌症相關性死亡之概率。
在本文中，"標準醫護"化學療法係指將常規所用之化學治療劑用於治療特定癌症。
"確定性手術"係作為醫學界範圍內使用之彼術語而使用。確定性手術包括(例如)導致移除或切除腫瘤之程序、手術或其他方式，包括導致移除或切除所有大體可見之腫瘤之彼等者。確定性手術包括(例如)完全或治癒性切除或者大體完全切除腫瘤。確定性手術包括以一或多個階段發生之程序，且包括(例如)多階段手術程序，其中在切除腫瘤之前執行一或多個手術或其他程序。確定性手術包括移除或切除腫瘤(包括受累器官、器官及組織之部分以及器官周圍，諸如淋巴結、器官或組織之部分)之程序。
術語"癌症"及"癌性"係指或描述哺乳動物中通常特徵為不受調節之細胞生長的病症。此定義中包括良性及惡性癌症以及休眠腫瘤或微 轉移。"早期癌症"或"早期腫瘤"係意謂並非侵襲性或轉移性的或歸類為第0期、第I期或第II期癌症之癌症。
術語"癌前"係指通常先於癌症發生或會發展成為癌症之病狀或生長。"癌前"生長將具有特徵為異常細胞週期調節、增殖或分化之細胞，其可藉由細胞週期調節、細胞增殖或分化之標誌來測定。
"發育不良"係意謂組織、器官或細胞之任何異常生長。較佳地，發育不良為高等級或癌前的。
"轉移"係意謂癌症在體內自其原發部位擴散至其他位置。癌細胞可脫離原發腫瘤，滲透到淋巴及血管中，經由血流循環，且生長(轉移)至體內別處正常組織中之遠端病灶中。轉移可為局部或遠端的。轉移為連續過程，伴隨發生腫瘤細胞自原發腫瘤脫落，經由血流行進且停留在遠端部位處。在新部位處，細胞建立血液供應，且可生長而形成危及生命之塊狀物。腫瘤細胞內之刺激性及抑制性分子路徑調節此行為，且在遠端部位處腫瘤細胞與宿主細胞之間的相互作用亦為顯著的。
"微轉移"係意謂少量細胞已自原發腫瘤擴散到身體之其他部分。微轉移在篩查或診斷測試中可能偵測得到或可能偵測不到。
"非轉移性"係意謂為良性或保留在原發部位處且尚未滲透到除原發部位以外之淋巴或血管系統或組織中的癌症。一般而言，非轉移性癌症係為第0期、第I期或第II期癌症且有時為第III期癌症之任何癌症。
提及腫瘤或癌症為"第0期"、"第I期"、"第II期"、"第III期"或"第IV期"係指示使用此項技術中已知之總分期(Overall Stage Grouping)或羅馬數字分級(Roman Numeral Staging)方法對腫瘤或癌症的分類。儘管實際癌症期係視癌症之類型而定，但一般而言，第0期癌症為原位病變，第I期癌症為侷限性小腫瘤，第II期及第III期癌症為展現局部 淋巴結受累之局部晚期腫瘤，且第IV期癌症為轉移性癌症。各類腫瘤之具體期為熟習臨床醫師所知。
如本文中所用之"腫瘤"係指所有無論惡性或是良性的贅生性細胞生長及增殖以及所有癌前及癌性細胞及組織。
"原發腫瘤"或"原發癌症"係意謂個體體內之最初癌症，而非位於另一組織、器官或位置之轉移病變。
"良性腫瘤"或"良性癌症"係意謂保留侷限於起源部位而並不具有浸潤、侵襲或轉移至遠端部位之能力的腫瘤。
"癌症復發"在本文中係指繼治療之後癌症之再發，且包括癌症在原發器官之再發以及癌症在原發器官以外再發之遠端復發。
"腫瘤休眠"係意謂存在腫瘤細胞但腫瘤進展在臨床上不明顯之長期靜止狀態。休眠腫瘤在篩查或診斷測試中可能偵測得到或可能偵測不到。
"腫瘤負荷"係意謂體內癌細胞之數目、腫瘤之大小或癌瘤之量。腫瘤負荷亦被稱為腫瘤負載。
"腫瘤數目"係意謂腫瘤之數目。
"個體"係意謂哺乳動物，包括(但不限於)人類或非人類哺乳動物，諸如牛、馬、犬、綿羊或貓。較佳地，個體為人類。
個體"群體"係指諸如在臨床實驗中或如由癌症學家按照FDA對於特殊指示(諸如癌症先導性輔助療法)之核準所判定的一群患有癌症之個體。在一實施例中，群體包含至少3000位個體。
術語"抗癌療法"係指適用於治療癌症之療法。抗癌治療劑之實例包括(但不限於)(例如)手術、化學治療劑、生長抑制劑、細胞毒性劑、放射療法中所用之藥劑、抗血管生成劑、細胞凋亡劑、抗微管蛋白劑及其他用以治療癌症之藥劑，諸如抗HER-2抗體、抗CD20抗體、表皮生長因子受體(EGFR)拮抗劑(例如酪胺酸激酶抑制劑)、 HER1/EGFR抑制劑(例如埃羅替尼(erlotinib)(TarcevaTM))、血小板衍生生長因子抑制劑(例如GleevecTM(伊馬替尼甲磺酸鹽))、COX-2抑制劑(例如賽利克西(celecoxib))、干擾素、細胞因子(cytokines)、與以下靶ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA或VEGF受體中之一或多者結合之拮抗劑(例如中和抗體)、TRAIL/Apo2以及其他生物活性及有機化學劑等。本發明亦包括其組合。
如本文中所用之術語"細胞毒性劑"係指能抑制或阻止細胞之功能及/或導致細胞破壞之物質。該術語意欲包括放射性同位素(例如I131、I125、Y90及Re186)、化學治療劑及毒素，諸如細菌、真菌、植物或動物來源之酶促活性毒素，或其片段。
"化學治療劑"為適用於治療癌症之化學化合物。化學治療劑之實例包括適用於治療癌症之化學化合物。化學治療劑之實例包括烷基化劑，諸如塞替派(thiotepa)及CYTOXAN®環磷醯胺；烷基磺酸鹽，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶類，諸如苯佐多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)及尤利多巴(uredopa)；伸乙基亞胺類及甲基三聚氰胺類，包括六甲密胺(altretamine)、三伸乙基三聚氰胺、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫基磷醯胺及三羥甲基三聚氰胺；乙醯精寧(acetogenin)(尤其布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone))；喜樹鹼(包括合成類似物拓朴替康(topotecan))；苔蘚蟲素(bryostatin)；卡利他汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)及比折來新(bizelesin)合成類似物)；自念珠藻環肽(cryptophycin)(詳言之自念珠藻環肽1及自念珠藻環肽8)；海兔毒素(dolastatin)；多卡米辛(duocarmycin)(包括合成類似物，KW-2189及CB1-TM1)；艾榴素(eleutherobin)；水鬼蕉鹼(pancratistatin)；沙考的汀(sarcodictyin)；海綿他汀(spongistatin)；氮 芥類(nitrogen mustards)，諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷醯胺、雌莫司汀(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、氮芥氧化物鹽酸鹽、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、膽甾醇對苯乙酸氮芥(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲洛磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亞硝基脲(nitrosurea)，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲黴素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及瑞甯司汀(ranimnustine)；抗生素，諸如烯二炔(enediyne)抗生素(例如卡奇黴素(calicheamicin)，尤其卡奇黴素γ1I及卡奇黴素ωI1(參見(例如)Agnew,Chem Intl.Ed.Engl.,33：183-186(1994))；達內黴素(dynemicin)，包括達內黴素A；雙膦酸鹽，諸如氯屈膦酸鹽(clodronate)；埃斯培拉黴素(esperamicin)；以及新製癌菌素(neocarzinostatin)發色團及相關色蛋白烯二炔抗生素發色團、阿克拉黴素(aclacinomycin)、放線菌素(actinomycin)、奧斯拉米辛(authramycin)、偶氮絲胺酸(azaserine)、博萊黴素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、卡拉比辛(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌黴素(carzinophilin)、色黴素(chromomycin)、放線菌素D(dactinomycin)、柔紅黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、ADRIAMYCIN®阿黴素(doxorubicin)(包括嗎啉基-阿黴素、氰基嗎啉基-阿黴素、2-吡咯啉基-阿黴素及脫氧阿黴素(deoxydoxorubicin))、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、去甲氧基柔紅黴素(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycin)(諸如絲裂黴素C)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾拉黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、泊非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、三鐵阿黴素 (quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑黴素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如甲胺喋呤(methotrexate)及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如迪諾特寧(denopterin)、甲胺喋呤、蝶羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤、噻咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素，諸如卡普睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)或睾內酯(testolactone)；抗腎上腺類，諸如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如夫羅林酸(frolinic acid)；醋葡醛內酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；胺基乙醯丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；貝司他布(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；艾達曲卡(edatraxate)；得弗伐胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾弗尼辛(elfornithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；埃坡黴素(epothilone)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；蘑菇多糖(lentinan)；羅尼代寧(lonidainine)；美登素類(maytansinoids)，諸如美登素(maytansine)及美登木素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫比旦莫耳(mopidanmol)；硝爾靈(nitraerine)；噴司他丁(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；足葉草酸(podophyllinic acid)；2-乙基醯肼；丙 卡巴肼(procarbazine)；PSK®多醣複合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)；雷佐生(razoxane)；根瘤菌素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；單端孢黴烯族毒素(trichothecene)(尤其T-2毒素、韋拉庫林A(verracurin A)、桿孢菌素A(roridin A)及安奎定(anguidine))；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；伽托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)("Ara-C")；環磷醯胺；塞替派；紫杉醇類，例如TAXOL®太平洋紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、ABRAXANETM太平洋紫杉醇之不含克列莫佛(Cremophor)、白蛋白工程化之奈米粒子調配物(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Illinois)及TAXOTERE®多西他賽(doxetaxel)(Rhône-Poulenc Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；GEMZAR®吉西他濱(gemcitabine)；6-硫鳥嘌呤；巰嘌呤；甲胺喋呤；鉑類似物，諸如順鉑(cisplatin)及卡鉑(carboplatin)；長春鹼(vinblastine)；鉑；依託泊苷(etoposide)(VP-16)；異環磷醯胺；米托蒽醌；長春新鹼(vincristine)；NAVELBINE®長春瑞賓(vinorelbine)；諾凡特龍(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依達曲沙(edatrexate)；道諾黴素(daunomycin)；胺基喋呤(aminopterin)；希羅達(xeloda)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(Camptosar，CPT-11)(包括伊立替康與5-FU及甲醯四氫葉酸之治療方案)；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；類視色素，諸如視黃酸；卡培他濱(capecitabine)；康普瑞汀(combretastatin)；甲醯四氫葉酸(LV)；奧賽力鉑(oxaliplatin)，包括奧賽力鉑治療方案(FOLFOX)；能降低細胞增殖之PKC-α、Raf、H- Ras、EGFR(例如埃羅替尼(TarcevaTM))及VEGF-A之抑制劑；上述任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。
此定義亦包括能起到調節或抑制對於腫瘤之激素作用的抗激素劑，諸如抗雌激素及選擇性雌激素受體調節劑(SERM)，包括(例如)他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX®他莫昔芬)、雷諾昔酚(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)及FARESTON托瑞米芬(toremifene)；可抑制酶芳香酶之芳香酶抑制劑，其能調節腎上腺中之雌激素產生，諸如4(5)-咪唑、胺魯米特(aminoglutethimide)、MEGASE®醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、AROMASIN®依西美坦(exemestane)、弗米斯坦(formestanie)、法屈唑(fadrozole)、RIVISOR®伏羅唑(vorozole)、FEMARA®來曲唑(letrozole)及ARIMIDEX®安美達錠(anastrozole)；及抗雄激素，諸如氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)及戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他濱(troxacitabine)(1,3-二氧戊環核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，詳言之能抑制黏附(abherant)細胞增殖中所涉及之信號轉導途徑中之基因表現的彼等者，諸如PKC-α、Raf及H-Ras；核酶，諸如VEGF表現抑制劑(例如ANGIOZYME®核酶)及HER2表現抑制劑；疫苗，諸如基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN®疫苗、LEUVECTIN®疫苗及VAXID®疫苗；PROLEUKIN® rIL-2；LURTOTECAN®拓撲異構酶1抑制劑；ABARELIX® rmRH；長春瑞賓(vinorelbine)及埃斯培拉黴素(esperamicin)(參見美國專利第4,675,187號)，以及上述任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。
"生長抑制劑"當在本文中使用時係指在活體外及/或活體內可抑制細胞生長之化合物或組合物。因此，生長抑制劑可為顯著降低S期 中細胞百分比的藥劑。生長抑制劑之實例包括能阻斷細胞週期進程(在S期以外之階段)之藥劑，諸如誘導G1停滯及M期停滯之藥劑。典型M期阻斷劑包括長春鹼類(vincas)(長春新鹼(vincristine)及長春鹼(vinblastine))，TAXOL®；及拓撲異構酶(topo)II抑制劑，諸如阿黴素(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔紅黴素(daunorubicin)、依託泊苷(etoposide)及博萊黴素(bleomycin)。能使G1停滯之藥劑亦擴及引起S期停滯，例如DNA烷化劑，諸如他莫昔芬(tamoxifen)、潑尼松(prednisone)、達卡巴嗪(dacarbazine)、氮芥(mechlor-ethamine)、順鉑(cisplatin)、甲胺喋呤、5-氟尿嘧啶及ara-C。其他資訊可見於The Molecular Basis of Cancer,Mendelsohn及Israel編，第1章，題為"Cell cycle regula-tion,oncogenes,and antineoplastic drugs",Murakami等人(WB Saunders：Philadelphia,1995)，尤其第13頁中。
術語"細胞因子(cytokine)"為一個細胞群體所釋放作為細胞間介體作用於另一個細胞之蛋白質的通用術語。該等細胞因子之實例為淋巴因子(lymphokines)、單核因子(monokines)及傳統多肽激素。該等細胞因子中包括生長激素，諸如人類生長激素、N-甲硫胺醯基人類生長激素及牛生長激素；甲狀旁腺激素；甲狀腺素；胰島素；前胰島素；鬆弛素；前鬆弛素；醣蛋白激素，諸如濾泡刺激激素(FSH)、甲狀腺刺激激素(TSH)及促黃體激素(LH)；表皮生長因子；肝生長因子；纖維母細胞生長因子；泌乳素；胎盤生乳素；腫瘤壞死因子-α及腫瘤壞死因子-β；苗勒氏抑制物質(mullerian-inhibiting substance)；小鼠促性腺激素相關肽；抑制素(inhibin)；活化素(activin)；血管內皮生長因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神經生長因子，諸如NGF-α；血小板生長因子；轉化生長因子(TGFs)，諸如TGF-α及TGF-β；胰島素樣生長因子-I及胰島素樣生長因子-II；紅血球生成素(EPO)；骨誘導因子；干擾素，諸如干擾素-α、干擾素-β及干擾素-γ；群落刺激因子 (CSFs)，諸如巨噬細胞-CSF(M-CSF)；顆粒球-巨噬細胞-CSF(GM-CSF)；及顆粒球-CSF(G-CSF)；介白素(ILs)，諸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；腫瘤壞死因子，諸如TNF-α或TNF-β；及其他多肽因子，包括LIF及套組配位體(KL)。如本文中所用，術語細胞因子包括天然來源或重組細胞培養物的蛋白質及天然序列細胞因子之生物活性相等物。
如本申請案中所用之術語"前藥"係指醫藥活性物質之前驅物或衍生物形式，與母體藥物相比對腫瘤細胞之細胞毒性較低，能夠被酶活化或轉化為更具活性之母體形式。參見例如Wilman,"Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions,14，第375-382頁，615th Meeting Belfast(1986)，及Stella等人，"Prodrugs：A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery,"Directed Drug Delivery,Borchardt等人(編)，第247-267頁，Humana Press(1985)。本發明之前藥包括(但不限於)含有磷酸鹽之前藥、含有硫代磷酸鹽之前藥、含有硫酸鹽之前藥、含有肽之前藥、經D-胺基酸修飾之前藥、糖基化前藥、含有β-內醯胺之前藥、含有視情況經取代之苯氧基乙醯胺的前藥或含有視情況經取代之苯基乙醯胺的前藥、5-氟胞嘧啶及其他5-氟尿核苷前藥，其可轉化為更具活性之細胞毒性游離藥物。可衍生成前藥形式用於本發明的細胞毒性藥物之實例包括(但不限於)上述該等化學治療劑。
"放射療法"係意謂使用定向γ射線或β射線來誘導對細胞之足夠破壞，以便限制其正常起作用之能力或完全破壞該細胞。應瞭解存在許多此項技術中已知用以確定治療劑量及持續時間之方法。典型治療係以一次投藥來給予且典型劑量範圍介於每天10至200單位(戈雷(Gray))。
"降低或抑制"係意謂導致總共降低較佳20%或20%以上、更佳 50%或50%以上且最佳75%、85%、90%、95%或95%以上之能力。降低或抑制可涉及正被治療之病症的症狀、轉移或微轉移之存在或大小、原發腫瘤之大小、休眠腫瘤之存在或大小或血管生成病症中血管之大小或數目。
"反義核鹼基寡聚物"係意謂與基因編碼鏈或mRNA之至少一部分互補的核鹼基寡聚物而與其長度無關。"核鹼基寡聚物"係意謂包括藉由鍵聯基團結合在一起之至少8個核鹼基、較佳至少12個核鹼基且最佳至少16個核鹼基之鏈的化合物。此定義中包括經修飾及未經修飾之天然及非天然寡核苷酸，以及寡核苷酸模擬物，諸如蛋白核酸、鎖核酸及阿糖核酸(arabinonucleic acid)。在本發明之核鹼基寡聚物中可使用眾多核鹼基及鍵聯基團，包括美國專利公開案第20030114412號(參見(例如)該公開案之第27-45段落)及第20030114407號(參見(例如)該公開案之第35-52段落)中所述之彼等者，該等文獻以引用之方式併入本文中。核鹼基寡聚物亦可靶向轉譯起始位點及終止位點。在某些實施例中，反義核鹼基寡聚物包含約8至30個核苷酸。反義核鹼基寡聚物亦可含有至少40、60、85、120個或120個以上與VEGF mRNA或DNA互補且可與全長mRNA或基因一樣長之連續核苷酸。
"小RNA"係意謂單鏈抑或雙鏈之任何RNA分子，其在長度上為至少15個核苷酸，較佳為17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35個核苷酸，且在長度上甚至高達50或100個核苷酸(包括介於之間之所有整數)。在某些實施例中，小RNA能夠介導RNAi。如本文中所用，短語"介導RNAi"係指有別於RNA將由RNAi作用或過程降解之能力。術語小RNA包括"小干擾RNA"及"microRNA"。一般而言，microRNA(miRNA)為小的(例如17-26個核苷酸)單鏈非編碼RNA，其係由Dicer自約70個核苷酸之髮夾前驅體RNA加工而成。小干擾RNA(siRNA)具有類似大小且亦為非編碼 的；然而，siRNA係自長dsRNA加工而成且通常為雙鏈的。siRNA亦可包括短髮夾RNA，其中siRNA雙鏈體之兩鏈包括於單個RNA分子內。小RNA可用於描述兩類RNA。此等術語包括雙鏈RNA、單鏈RNA、經分離RNA(經部分純化之RNA、大體上純的RNA、合成RNA、重組產生之RNA)以及因一或多個核苷酸之添加、刪除、取代及/或改變而不同於天然產生之RNA的經改變RNA。該等改變可包括添加非核苷酸物質，諸如添加至小RNA末端或內部(在RNA之一或多個核苷酸處)。在本發明之RNA分子中的核苷酸亦可包含非標準核苷酸，包括非天然產生之核苷酸或脫氧核糖核苷酸。關於核酸分子之其他資訊，參見以上"核鹼基寡聚物"。在一實施例中，RNA分子含有3'羥基。
術語"靜脈內輸注"係指經大於約5分鐘、較佳介於約30至90分鐘間之時段將藥物引入動物或人類患者之靜脈內，儘管根據本發明，或者可靜脈內輸注投與10小時或10小時以內。
術語"靜脈內團注"或"靜脈內推注"係指將藥物投與至動物或人類之靜脈中，以便使體內在15分鐘或15分鐘以內、較佳5分鐘或5分鐘以內接受該藥物。
術語"皮下投與"係指藉由自藥物容器相對緩慢地持續傳遞將藥物引入動物或人類患者之皮膚下，較佳引入到介於皮膚與下伏組織之間的囊袋(pocket)內。該囊袋可藉由將皮膚向上捏起或提拉起且使其遠離下伏組織而形成。
術語"皮下輸注"係指在包括(但不限於)30分鐘或30分鐘以內或90分鐘或90分鐘以內之時段內藉由自藥物容器相對緩慢地持續傳遞將藥物引入動物或人類患者之皮膚下，較佳引入到介於皮膚與下伏組織之間的囊袋內。視情況，該輸注可藉由皮下植入於動物或人類患者皮膚下植入之藥物傳遞泵來進行，其中該泵在預定時段(諸如30分鐘、90 分鐘)或跨越治療方案持續時間之時段內傳遞預定量之藥物。
術語"皮下團注"係指將藥物投與動物或人類患者之皮膚下，其中團注藥物傳遞較佳為少於約15分鐘，更佳少於5分鐘，且最佳少於60秒。投與較佳係在介於皮膚與下伏組織之間的囊袋內進行，其中該囊袋係例如藉由將皮膚向上捏起或提拉起且使其遠離下伏組織而形成。
詞語"標記"當在本文中使用時係指直接或間接與多肽接合之可偵測化合物或組合物。標記本身可為可偵測的(例如放射性同位素標記或螢光標記)，或在酶促標記之情況下可催化可偵測之受質化合物或組合物之化學變化。
II. 將VEGF-特異性拮抗劑用於早期腫瘤治療以及先導性輔助及輔助療法
本發明特徵為將VEGF-特異性拮抗劑用於治療患有良性、癌前或非轉移性腫瘤之個體；用於治療具有休眠腫瘤或微轉移之個體；或用於治療患有癌症之個體或用於治療處於患上癌症之危險中的個體。舉例而言，使用兩種獨立途徑來抑制VEGF，亦即靶向VEGF-A之單株抗體(mAb)的單一療法與VEGF-A之基因刪除，吾人利用Apcmin/+小鼠早期腸腺瘤形成模型已證實在腸腺瘤模型中抑制VEGF信號轉導足以使腫瘤生長停止且賦予長期生存之益處。吾人使用靶向VEGF-A之單株抗體(mAb)亦已證實在小鼠多發性內分泌瘤形成1型(MEN1)模型中抑制VEGF-A足以抑制垂體腺瘤生長且足以降低過度激素分泌。此外，吾人使用小鼠胰小島腫瘤模型(RIP-TβAg)及靶向VEGF-A之單株抗體(mAb)已證實抑制VEGF可使得腫瘤血管生成顯著降低，且當作為繼使用手術或化學治療劑減滅細胞後之療法使用時能抑制腫瘤再生長。本發明之特徵亦為VEGF拮抗劑在先導性輔助及輔助環境中之用途。
III. VEGF-特異性拮抗劑
VEGF-特異性拮抗劑係指能夠與VEGF結合、降低VEGF表現水平 或中和、阻斷、抑制、消除、降低或干擾VEGF生物活性(包括VEGF與一或多種VEGF受體結合以及VEGF介導之血管生成及內皮細胞存活或增殖)之分子(肽醯基或非肽醯基)。較佳地，VEGF-特異性拮抗劑可將VEGF之表現水平或生物活性的降低或抑制達至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或90%以上。較佳地，由VEGF-特異性拮抗劑抑制之VEGF為VEGF同功異型物或多種VEGF同功異型物，例如VEGF(8-109)、VEGF(1-109)、VEGF165、VEGF121、VEGF145、VEGF189或VEGF206。
適用於本發明方法之VEGF-特異性拮抗劑包括特異性結合VEGF之肽醯基或非肽醯基化合物(諸如抗VEGF抗體及其抗原結合片段)、與VEGF特異性結合之VEGF多肽拮抗劑變異體或其片段，以及與VEGF特異性結合從而隔離其與一或多種受體之結合的受體分子及衍生物(例如可溶性VEGF受體蛋白或其VEGF結合片段或嵌合VEGF受體蛋白)、融合蛋白(例如VEGF-Trap(Regeneron))及VEGF121-介樂寧(Peregrine)。VEGF-特異性拮抗劑亦包括與編碼VEGF多肽之核酸分子之至少一片段互補的反義核鹼基寡聚物；與編碼VEGF多肽之核酸分子之至少一片段互補的小RNA；靶向VEGF之核酶；VEGF之肽體；及VEGF適體。
A. 抗VEGF抗體
適用於本發明之方法的抗VEGF抗體包括可以足夠親和力及特異性與VEGF結合且能降低或抑制VEGF之生物活性的任何抗體或其抗原結合片段。抗VEGF抗體通常不會與其他VEGF同系物(諸如VEGF-B或VEGF-C)結合，亦不會與其他生長因子(諸如PlGF、PDGF或bFGF)結合。
在本發明之某些實施例中，抗VEGF抗體包括(但不限於)結合至與由融合瘤ATCC HB 10709產生之單株抗VEGF抗體A4.6.1相同之抗 原決定基的單株抗體；根據Presta等人(1997)Cancer Res.57：4593-4599產生之重組人類化抗VEGF單株抗體，包括(但不限於)稱為貝伐單抗(BV；Avastin®)之抗體。貝伐單抗包括突變人類IgG1構架區及來自能阻斷人類VEGF與其受體結合之鼠類抗hVEGF單株抗體A.4.6.1之抗原結合互補判定區。貝伐單抗之約93%胺基酸序列，包括大部分構架區，係源自人類IgG1，且約7%序列係源自鼠類抗體A4.6.1。貝伐單抗具有約149,000道爾頓之分子質量且已糖基化。貝伐單抗及其他人類化抗VEGF抗體被進一步描述於2005年2月26日頒布之美國專利第6,884,879號中。抗體之其他實例包括(但不限於)G6或B20系列抗體(例如G6-31、B20-4.1)，其如PCT申請公開案第WO2005/012359號中所述。關於其他抗體，參見美國專利第7,060,269號、第6,582,959號、第6,703,020號、第6,342,219號、第6,054,297號；WO98/45332；WO96/30046；WO94/10202；EP 0666868B1；美國專利申請公開案第2006009360號、第20050186208號、第20030206899號、第20030190317號、第20030203409號及第20050112126號；以及Popkov等人，Journal of Immunological Methods 288：149-164(2004)。可用於本發明中之抗體的其他實例包括與包含殘基F17、M18、D19、Y21、Y25、Q89、I91、K101、E103及C104或者包含殘基F17、Y21、Q22、Y25、D63、I83及Q89之人類VEGF上之功能性抗原決定基結合的彼等者。
根據本發明之G6系列抗體為根據PCT申請公開案第WO2005/012359號之圖7、圖24-26及圖34-35中之任一者的源自G6抗體或G6源性抗體之序列的抗VEGF抗體。在一實施例中，G6系列抗體與包含殘基F17、Y21、Q22、Y25、D63、I83及Q89之人類VEGF上之功能性抗原決定基結合。
根據本發明之B20系列抗體為根據PCT申請公開案第 WO2005/012359號之圖27-29中之任一者的源自B20抗體或B20源性抗體之序列的抗VEGF抗體。在一實施例中，B20系列抗體與包含殘基F17、M18、D19、Y21、Y25、Q89、I91、K101、E103及C104之人類VEGF上之功能性抗原決定基結合。
根據本發明之"功能性抗原決定基"係指強力促成抗體結合之抗原之胺基酸殘基。抗原之強力促成性殘基中之任一者的突變(例如由丙胺酸引起之野生型VEGF的突變或同源突變)會破壞抗體之結合以至於抗體之相對親和力比率(IC50突變體VEGF/IC50野生型VEGF)會大於5(參見WO2005/012359之實例2)。在一實施例中，相對親和力比率係藉由溶液結合噬菌體呈現ELISA來測定。簡言之，在4℃下將96孔Maxisorp免疫板(NUNC)用待測試抗體之Fab形式以PBS中2μg/ml之濃度塗佈隔夜，且在室溫下用PBS,0.5% BSA及0.05% Tween20(PBT)將其阻斷2小時。首先在室溫下將PBT中連續稀釋之噬菌體呈現hVEGF丙胺酸點突變體(殘基8-109形式)或野生型hVEGF(8-109)於經Fab塗佈之板上培養15min，且將板用PBS,0.05% Tween20(PBST)洗滌。用PBT中1：5000稀釋之抗M13單株抗體辣根過氧化物酶(Amersham Pharmacia)接合物偵測所結合之噬菌體，用3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB,Kirkegaard & Perry Labs,Gaithersburg,MD)受質使其顯色歷時約5min，用1.0M H3PO4將其中止，且在450nm下以分光光度法對其讀數。IC50值之比率(IC50,ala/IC50,wt)表示結合親和力降低之倍數(相對結合親和力)。
B. VEGF受體分子
兩種最佳經表徵之VEGF受體為VEGFR1(亦稱為Flt-1)及VEGFR2(亦稱為KDR及FLK-1(對於鼠類同源物而言))。各受體對各VEGF家族成員之特異性不同，但VEGF-A與Flt-1及KDR兩者結合。全長Flt-1受體包括具有7個Ig結構域之細胞外域、跨膜域及具有酪胺 酸激酶活性之細胞內域。細胞外域與結合VEGF有關且細胞內域與信號轉導有關。
與VEGF特異性結合之VEGF受體分子或其片段可在本發明方法中用於與VEGF蛋白結合且隔離該VEGF蛋白，藉此防止其信號轉導。在某些實施例中，VEGF受體分子或其VEGF結合片段為可溶形式，諸如sFlt-1。可溶形式之受體藉由與VEGF結合從而防止其與其存在於靶細胞表面上之天然受體結合來發揮對VEGF蛋白生物活性之抑制作用。亦包括VEGF受體融合蛋白，其實例在下文中進行描述。
嵌合VEGF受體蛋白為具有源自至少兩種不同蛋白質且其中至少一者為VEGF受體蛋白(例如flt-1或KDR受體)之胺基酸序列的受體分子，其能夠與VEGF結合且抑制VEGF生物活性。在某些實施例中，本發明之嵌合VEGF受體蛋白由源自僅兩種不同VEGF受體分子之胺基酸序列組成；然而，包含來自flt-1及/或KDR受體之細胞外配位體結合區的1個、2個、3個、4個、5個、6個或所有7個Ig樣結構域之胺基酸序列可連接至來自其他無關蛋白之胺基酸序列(例如免疫球蛋白序列)。Ig樣結構域所組合之其他胺基酸序列對熟習此項技術者而言應顯而易見。嵌合VEGF受體蛋白之實例包括(例如)可溶Flt-1/Fc、KDR/Fc或FLt-1/KDR/Fc(亦稱為VEGF Trap)。(參見(例如)PCT申請公開案第WO97/44453)。
本發明之可溶VEGF受體蛋白或嵌合VEGF受體蛋白包括並未經由跨膜域固定至細胞表面之VEGF受體蛋白。因而，可溶形式之VEGF受體(包括嵌合受體蛋白)儘管能與VEGF結合且使VEGF失活，但並不包含跨膜域且因此通常不會變為與表現分子之細胞的細胞膜相關。
C. 核酶
核酶為能夠催化RNA特異性分裂之酶促RNA分子。核酶藉由與互補靶RNA序列特異性雜交、繼之以內切核苷酸分裂而起作用。潛在 RNA靶內之特異性核酶分裂位點可藉由已知技術識別。關於其他詳情，參見(例如)Rossi,Current Biology,4：469-471(1994)及PCT申請公開案第WO 97/33551號。一種靶向VEGF表現之例示性核酶為AngiozymeTM。(參見(例如)美國專利申請公開案第20060035278號)。
D. 適體
適體為形成與靶分子(諸如VEGF多肽)特異性結合之三級結構的核酸分子。適體之產生及治療用途在此項技術中係經充分確認的。參見(例如)美國專利第5,475,096號。VEGF適體為聚乙二醇化修飾寡核苷酸，其呈現三維構形，使其能夠與細胞外VEGF結合。對於治療年齡相關之黃斑部變性而言靶向VEGF之治療有效性適體的一實例為哌加他尼(pegaptanib)(MacugenTM,Eyetech,New York)。關於適體之其他資訊可見於美國專利申請公開案第20060148748號。
E. 肽體
肽體為連接至編碼免疫球蛋白分子之片段或部分之胺基酸序列的肽序列。多肽可源自藉由針對特異性結合之任何方法所選的隨機序列，該等方法包括(但不限於)噬菌體呈現技術。在一實施例中，所選多肽可連接至編碼免疫球蛋白之Fc部分的胺基酸序列。與VEGF特異性結合且拮抗VEGF之肽體亦適用於本發明之方法。
F. VEGF-特異性拮抗性核酸分子
本發明方法之特徵亦為使用VEGF-特異性拮抗性核酸分子，包括反義核鹼基寡聚物及小RNA。
在一實施例中，本發明之特徵為使用針對VEGF RNA之反義核鹼基寡聚物。藉由與互補核酸序列(有義鏈或編碼鏈)結合，反義核鹼基寡聚物能夠大概經由由RNAse H使RNA酶促分裂來抑制蛋白質表現。
特別適用於本發明之方法及組合物中之反義核鹼基寡聚物的一實例為嗎啉基寡聚物。將嗎啉基寡聚物用於阻斷其他分子接近核酸分 子內之特異性序列。其可阻斷其他分子接近核糖核酸(RNA)之小(約25個鹼基)區域。嗎啉基寡聚物有時被稱為PMO，其為磷醯二胺酸嗎啉基寡聚物之縮寫。
使用嗎啉基寡聚物藉由防止細胞形成靶蛋白或藉由修飾pre-mRNA之剪接來剔除基因功能。嗎啉基寡聚物為藉由標準核酸鹼基配對與RNA互補序列結合之合成分子。儘管嗎啉基寡聚物具有標準核酸鹼基，但彼等鹼基與嗎啉環而非脫氧核糖環結合且經由磷醯二胺酸基團而非磷酸根連接。以不帶電荷之磷醯二胺酸基團置換陰離子磷酸根消除了通常生理pH值範圍內之離子化，因此有機體或細胞內之嗎啉基寡聚物為不帶電分子。
嗎啉基寡聚物藉由"空間阻斷"或與RNA內之靶序列結合且阻斷可能另外與RNA相互作用之分子而起作用。由於其完全非天然之骨架，嗎啉基寡聚物不為細胞蛋白所識別。核酸酶不使嗎啉基寡聚物降解且嗎啉基寡聚物並不活化toll樣受體並因此其並不激活先天免疫反應，諸如干擾素系統或NF-κB介導之發炎反應。對於修飾DNA之甲基化而言，嗎啉基寡聚物亦為不明的。因此，可降低或抑制VEGF之表現水平或生物活性的針對VEGF之任何部分之嗎啉基寡聚物特別適用於本發明之方法及組合物中。
本發明之特徵亦為使用RNA干擾作用(RNAi)來抑制VEGF之表現。RNAi為一種由引入雙鏈RNA(dsRNA)所引起之後轉錄基因沉默的形式。具有15至32個核苷酸之短雙鏈RNA(一般稱為"siRNA"、"小RNA"或"microRNA")有效地下調線蟲(Zamore等人，Cell 101：25-33)及哺乳動物組織培養細胞株(Elbashir等人，Nature 411：494-498,2001，其以引用之方式併入本文中)中之基因表現。此途徑在哺乳動物中之其他治療有效性係由McCaffrey等人(Nature 418：38-39.2002)在活體內證實。小RNA之長度為至少15個核苷酸，較佳為17、18、19、 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35個核苷酸，且其長度甚至高達50或100個核苷酸(包括介於之間的所有整數)。包括與VEGF之任何區域大體上一致或與VEGF之任何區域互補的此等小RNA作為本發明之VEGF-特異性拮抗劑。
小RNA之特定要求及修飾在此項技術中係已知的，且(例如)已描述於PCT申請公開案第WO01/75164號及美國申請公開案第20060134787號、第20050153918號、第20050058982號、第20050037988號及第20040203145號中，該等文獻之相關部分以引用之方式併入本文中。在特定實施例中，siRNA可藉由(例如)在酶dicer之存在下在將dsRNA加工為具有約17至約26個核苷酸之RNA分子的條件下加工較長雙鏈RNA來合成或產生。siRNA亦可藉由相應DNA片段(例如髮夾DNA構建體)之表現來產生。一般而言，siRNA具有特有2-至3-核苷酸3'懸端，較佳為該等者為(2'-脫氧)胸苷或尿嘧啶。siRNA通常包含3'羥基。在一些實施例中，使用單鏈siRNA或平端dsRNA。為進一步增強RNA之穩定性，使3'懸端穩定而免於降解。在一實施例中，藉由包括嘌呤核苷酸(諸如腺苷或尿嘧啶)使RNA穩定。或者，容許以經修飾類似物取代嘧啶核苷酸(例如以(2'-脫氧)胸腺嘧啶核苷((2'-deoxy)thymide)取代尿苷2-核苷酸懸端)且不影響RNAi之功效。無2'羥基顯著增強組織培養基中懸端之核酸酶抗性。
siRNA分子可經由各種方案(包括化學合成或重組產生)使用果蠅(Drosophila)活體外系統獲得。其可自諸如Dharmacon Research Inc.或Xeragon Inc.之公司購得，或其可使用市售套組(諸如SilencerTM siRNA構建套組，得自Ambion(目錄號1620)；或HiScribeTM RNAi轉錄套組，得自New England BioLabs(目錄號E2000S))合成。
或者，siRNA可使用活體外轉錄RNA之標準程序及dsRNA黏接程序來製備，諸如Elbashir等人(Genes & Dev.15：188-200,2001)、Girard 等人(Nature 442：199-202(2006))、Aravin等人(Nature 442：203-207(2006))、Grivna等人(Genes Dev.20：1709-1714(2006))及Lau等人(Science 313：363-367(2006))中所述之彼等者。
如Yu等人(Proc.Natl.Acad.Sci USA,99：6047-6052,2002)或Paddison等人(Genes & Dev,16：948-958,2002)中所述之短髮夾RNA(shRNA)亦可用於本發明之方法中。對shRNA進行設計以使得有義鏈及反義鏈皆包括於單個RNA分子內且係由核苷酸(3個或3個以上)之環連接。shRNA可使用如上文及Yu等人，同上文中所述之標準活體外T7轉錄合成來合成及純化。shRNA亦可被次選殖至具有小鼠U6啟動子序列之表現載體中，隨後使該表現載體轉染至細胞中且將其用於shRNA之活體內表現。
各種方法可用於將dsRNA轉染或引入至哺乳動物細胞中。舉例而言，存在若干適用於基於脂質轉染siRNA之市售轉染試劑，其包括(但不限於)TransIT-TKOTM(Mirus，目錄號MIR 2150)、TransmessengerTM(Qiagen，目錄號301525)、OligofectamineTM及LipofectamineTM(Invitrogen，目錄號MIR 12252-011及目錄號13778-075)、siPORTTM(Ambion，目錄號1631)、DharmaFECTTM(Fisher Scientific，目錄號T-2001-01)。對於基於電穿孔轉染siRNA之方法的試劑亦為市售者，諸如siPORTerTM(Ambion Inc.目錄號1629)。亦可使用顯微注射技術。小RNA亦可自引入細胞中之表現構建體轉錄，其中表現構建體包括用於轉錄可操作地連接至一或多個轉錄調節序列之小RNA的編碼序列。在恰當處，質體、載體或病毒載體亦可用於傳遞dsRNA或siRNA，且該等載體在此項技術中係已知的。對於各轉錄試劑之方案可自製造商獲得。
IV. 治療用途
儘管關於VEGF在血管生成中之作用的資訊廣泛，但關於VEGF 在良性、癌前或非轉移性癌症中或在輔助或先導性輔助環境中之作用知道得相對較少。吾人已發現VEGF-特異性拮抗劑可用於治療良性、癌前或非轉移性癌症；用於治療休眠腫瘤或微轉移；用於防止腫瘤復發或再生長；或用於治療或預防處於患上癌症之危險中之個體的癌症。VEGF-特異性拮抗劑亦可用於輔助療法以繼確定性手術之後治療患有非轉移性癌症之個體或用於先導性輔助療法以治療患有手術可治癌症之個體，其中該療法係在手術移除個體之手術可治癌症之前提供。儘管下文中將治療應用分成治療、預防、先導性輔助療法及輔助療法，但熟習此項技術者應瞭解此等類別並非必定相互排斥。
A. 腫瘤之分類
術語癌症涵蓋增殖病症之集合，包括(但不限於)癌前生長、良性腫瘤、惡性腫瘤及休眠腫瘤。良性腫瘤保留侷限於起源部位而並不具有浸潤、侵襲或轉移至遠端部位之能力。惡性腫瘤會侵襲且破壞其周圍其他組織。其亦可能獲得脫離原始部位且通常經由血流或經由淋巴結所位於之淋巴系統擴散(轉移)到身體其他部分的能力。休眠腫瘤為存在腫瘤細胞但腫瘤進展在臨床上不明顯之靜止腫瘤。
原發腫瘤係按照其所源自之組織類型分類；轉移性腫瘤係按照癌細胞所源自之組織類型分類。惡性腫瘤之細胞隨時間變得更加異常且似乎越不像正常細胞。癌細胞外觀之此變化被稱為腫瘤等級，且將癌細胞描述為高度分化(低等級)、中度分化、低分化或未分化(高等級)。高度分化細胞具有相當正常之外觀且類似其所源自之正常細胞。未分化細胞為已變得很異常以至於不再有可能判定細胞之來源的細胞。
癌症分期系統描述癌症在解剖學上擴散到何種程度且嘗試將具有類似預後及治療之患者歸於同一期別組。可執行若干測試以有助於對癌症分期，包括活組織檢查及某些成像測試，諸如胸x-光、乳房x 光照片、骨掃描、CT掃描及MRI掃描。亦使用血液測試及臨床評估來評估患者整體健康狀況且偵測癌症是否已擴散至某些器官。
為對癌症分期，美國癌症聯合委員會(American Joint Committee on Cancer)首先使用TNM分類系統將癌症、尤其實體腫瘤按字母類別分類。將癌症指定為字母T(腫瘤大小)、N(可觸知結節)及/或M(轉移)。T1、T2、T3及T4描述原發病變之漸增大小；N0、N1、N2、N3指示逐步進行性結節受累；且M0及M1反映有無遠端轉移。
在第二分期方法(亦稱為總分期法或羅馬數字分級法)中，將癌症分為第0期至第IV期，包括原發病變之大小以及結節擴散及遠端轉移之存在。在此系統中，將各種病例歸為由羅馬數字I至IV表示之四個期，或歸類為"復發"。對於一些癌症而言，第0期被稱為"原位"或"Tis"，諸如對於乳癌而言有原位導管癌或原位小葉癌。高等級腺瘤亦可被分成第0期。一般而言，第I期癌症為侷限性小癌症，其通常為可治的，而第IV期通常表示手術不可治或轉移性癌症。第II期及第III期癌症通常為局部晚期及/或展現局部淋巴結受累。一般而言，較高期號指示較大範圍之疾病，包括較大腫瘤大小及/或癌症擴散至原發腫瘤附近之鄰近淋巴結及/或器官。準確地界定該等期，但界定對於各類癌症而言係不同的且為熟習此項技術者所知。
許多癌症登記，諸如NCI監測、流行病學及最終結果程式(NCI's Surveillance,Epidemiology,and End Results Program,SEER)，使用概括分期。此系統被用於所有類型之癌症。其將癌症病例歸為五大主要類別："原位"為僅存在於所開始之細胞之層中的早期癌症。
"侷限性"為限於所開始之器官而無擴散跡象之癌症。
"區域性"為已超出原始(原發)部位擴散至附近淋巴結或器官及組織之癌症。
"遠端"為已自原發部位擴散至遠端器官或遠端淋巴結之癌症。
"不明"用於描述無足夠資訊以指示期別之病例。
另外，癌症在原發腫瘤已移除之後數月或數年再發係常見的。在所有可見腫瘤已經根除之後復發的癌症被稱為復發性疾病。在原發腫瘤區域內復發之疾病為局部復發，且以轉移形式復發之疾病被稱為遠端復發。休眠腫瘤為存在腫瘤細胞但腫瘤進展在臨床上不明顯的以靜止狀態存在之腫瘤。微轉移為少量轉移或許多細胞自原發腫瘤擴散至身體其他部分。微轉移在篩查或診斷測試中可能偵測得到或可能偵測不到。本發明之方法適用於預防休眠腫瘤或微轉移之存在或腫瘤之復發，例如在存在休眠腫瘤或微轉移但可能在臨床上偵測得到或可能偵測不到之環境中。
本發明之方法亦適用於治療早期腫瘤，包括(但不限於)良性、癌前或非轉移性腫瘤。其包括任何第0期、第I期或第II期腫瘤；任何非轉移性第II期；通常先於癌症發生或可發展成為癌症之任何病狀，包括(但不限於)發育不良；及保留侷限於起源部位而尚未浸潤、侵襲或轉移到遠端部位之任何腫瘤。良性、癌前或非轉移性腫瘤之實例包括(但不限於)息肉、腺瘤、纖維瘤、脂肪瘤、胃泌素瘤、胰島素瘤、軟骨瘤、骨瘤、血管瘤、淋巴管瘤、腦膜瘤、平滑肌瘤、橫紋肌瘤、鱗狀細胞乳頭狀瘤、聽神經瘤、神經纖維瘤、膽管囊腺瘤、平滑肌瘤、間皮瘤、畸胎瘤、黏液瘤、沙眼、肉芽腫、錯構瘤、移行細胞乳頭狀瘤、唾液腺多形性腺瘤、硬纖維瘤、皮樣囊乳頭狀瘤、囊腺瘤、局灶性結節性增生及結節性再生性增生。
由於血管生成與原發腫瘤生長及轉移有關，故本發明提供之抗血管生成治療能夠抑制腫瘤在原發部位處之贅生性生長且防止腫瘤在第二部位處之轉移，因此允許以其他治療劑攻擊腫瘤。本文中待治療之癌症之實例包括實體腫瘤及非實體或軟組織腫瘤。實例包括(但不 限於)：癌、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤及白血病。該等癌症之更具體實例包括鱗狀細胞癌；肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺部腺癌及肺部鱗狀癌)；腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(包括胃腸癌)；胰腺癌；膠質母細胞瘤；子宮頸癌；卵巢癌；肝癌；膀胱癌；肝細胞瘤；乳癌；結腸癌；結腸直腸癌；子宮內膜癌或子宮癌；唾液腺癌；腎癌；肝癌(liver cancer)；前列腺癌；外陰癌；甲狀腺癌；肝癌(hepatic carcinoma)；及各類頭頸癌，以及B細胞淋巴瘤(包括低等級/濾泡性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴球性(SL)NHL；中等級/濾泡性NHL；中等級彌漫NHL；高等級免疫母細胞性NHL；高等級淋巴母細胞性NHL；高等級小無裂細胞NHL；腫塊性病變NHL；套細胞淋巴瘤；AIDS相關性淋巴瘤；及瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(Waldenstrom's Macroglobulinemia))；慢性淋巴細胞白血病(CLL)；急性淋巴母細胞性白血病(ALL)；毛細胞白血病；慢性骨髓母細胞白血病；及移植後淋巴增生性病症(PTLD)以及與母斑病、水腫相關(諸如與腦腫瘤相關)之異常血管增生及梅格氏症候群(Meigs' syndrome)。更特定言之，能用本發明之VEGF-特異性拮抗劑治療的癌症包括乳癌、結腸直腸癌、直腸癌、非小細胞肺癌、非霍奇金(Hodgkin)淋巴瘤(NHL)、腎細胞癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、軟組織肉瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、類癌瘤癌、頭頸癌、腦腫瘤、神經膠質瘤(例如退行性星形細胞瘤、退行性寡星形細胞瘤、退行性寡樹突細胞瘤、多形性膠質母細胞瘤)、黑色素瘤、卵巢癌、間皮瘤及多發性骨髓瘤。更佳地，將本發明之方法用於治療人類患者之結腸直腸癌。
B. 腺瘤
在一實施例中，本發明之方法用於治療稱為腺瘤之良性上皮細胞腫瘤。腺瘤為具有腺性起源之良性腫瘤。腺瘤通常源自於用於分泌之上皮細胞。上皮細胞位於身體各處，但該等細胞中僅一子集用於分 泌。用於分泌之上皮細胞構成身體之特定部分，稱為腺。腺負責在體內形成眾多物質，包括(但不限於)汗、唾液、乳汁、黏液及激素。腺瘤可由體內大多數腺細胞形成。
腺瘤可以類似於惡性腫瘤或癌性腫瘤之方式形成。腺瘤為良性的，且因此並不轉移或擴散到其他器官或組織。儘管大多數腺瘤保留為良性，但一些腺瘤可發展成為惡性腫瘤，且若此發生，則將新近成為惡性之腺瘤稱為腺癌。舉例而言，結腸癌及直腸癌作為腺瘤或息肉可為良性且後來可發展成為腺癌；支氣管腺瘤可發展成為肺癌。
通常，腺瘤對產生其之器官或腺組織具有顯著影響。腺瘤往往分泌過量激素。當此發生時，該等影響可能會使受影響個體感到相當不適。在某些情形下，該等影響可危及生命。然而，一些腺瘤在無任何可證實之影響的情況下產生。
存在某些類在女性中更為常見之腺瘤，諸如肝腺瘤。其他諸如結腸腺瘤之腺瘤在高齡(例如50歲以上)成人中最為常見。另外，存在易於使患者患上腺瘤之因素。舉例而言，使用口服避孕藥之女性患上肝腺瘤之危險性可能增加。某些類腺瘤(例如結腸腺瘤)可為遺傳性的。
與腺瘤有關之症狀普遍不同。舉例而言，稱為纖維腺瘤之乳腺腺瘤通常不引起任何症狀且可能足夠小以至於受影響個體不能察覺到其之存在。然而，其他乳腺腺瘤可能大得足以能藉由接觸而察覺到。相反，肺腺瘤可導致發熱、寒冷、呼吸急促及咳血。
腺瘤係使用各種技術來診斷，包括收集血樣及尿樣、超音成像、電腦斷層攝影術(CT)掃描及磁共振成像(MRI)。通常採用活組織檢查來確定腫瘤為良性或為惡性。本發明之方法特別適用於治療腺瘤、治療或防止腺瘤復發(例如在具有休眠腫瘤或微轉移之個體中)或適用於預防具有與腺瘤相關之危險因素中之任一者的個體之腺瘤。
C. 胃腸腫瘤
在另一實施例中，本發明之方法用於治療良性、癌前、非轉移性或休眠胃腸腫瘤或胃腸腫瘤之微轉移。其包括任何第0期、第I期或第II期腫瘤；通常可先於胃腸癌發生或可發展成為胃腸癌之任何腫瘤或病狀；及保留侷限於起源部位而尚未浸潤、侵襲或轉移至遠端部位之任何胃腸腫瘤。胃腸腫瘤中包括消化系統(特定言之食道、胃、肝、膽道(膽囊、膽管、法特氏壺腹(ampulla of vater))、腸、胰腺、結腸、直腸及肛門)之任何息肉、腺瘤、腫瘤或癌症。下文中對此等進行詳細描述。
(i)肛門癌
肛門癌為肛管抑或肛緣之惡性腫瘤。肛門癌常常自肛門發育不良開始。肛門發育不良係由具有異常變化但不顯示侵襲至周圍組織之跡象的肛門細胞構成。肛門發育不良之最嚴重形式稱為原位癌，其中細胞顯得象癌細胞，但並不侵襲到正常細胞所處之處。肛門發育不良隨著時間最終變至細胞變得具侵襲性且獲得轉移或轉位至身體其他部分之能力的程度。肛門發育不良有時被稱為肛門上皮內瘤病變(anal intraepithelial neoplasia,AIN)。當肛門癌擴散時，其通常經由直接侵襲達至周圍組織或經由淋巴系統。肛門癌經由血液之擴散較為少見，但其可發生。
若干因素與肛門癌相關。最重要的是，已顯示人類乳頭狀瘤病毒(HPV)感染與肛門癌有關且與包括子宮頸癌及頭頸癌之若干其他癌症相關。另一種性傳播性病毒，即人類免疫缺乏病毒(HIV)與肛門癌有關聯，且感染HIV個體感染HPV之危險性增加。因為肛門癌顯現首先自肛門發育不良開始然後進展成肛門癌，故具有AIN病史之患者患上肛門癌之危險性增加。另外，顯現具有良性肛門病狀(諸如肛瘺、肛門裂、肛周膿腫或痔)之患者的肛門癌患病率增加。
本發明之方法特別適用於治療早期肛門癌、治療或防止肛門癌復發(例如在具有休眠腫瘤或微轉移之個體中)或適用於預防具有與肛門癌相關之危險因素中之任一者的個體之肛門癌。
(ii)結腸直腸癌及直腸癌
結腸為大腸(large intestine,large bowel)之最長部分。結腸癌在西方世界中為女性及男性兩者中第三最常見類型之癌症。其在非裔美國人中發生率最高，該等非裔美國人亦更可能死於該疾病。結腸癌之危險性在50歲之後大體上上升，但每年報導有年輕人之眾多病例。一般而言，結腸癌及直腸癌被歸類在一起且具有與其相關之相同危險因素。具有結腸癌、息肉之個人病史或家族病史或遺傳性結腸癌症候群(例如FAP及HNPCC)的個體以及患有潰瘍性結腸炎或克隆氏病(Crohn's disease)之患者與一般群體相比皆處於較高危險中且在較年輕時可能需要篩查。具有一個患有結腸癌之一級親屬(父母、同胞或子女)的個人患上該癌症之可能性為不具有罹病親屬之個人的2至3倍。
結腸癌可使用臨床醫師已知之各種技術來診斷。篩查測試為診斷早期結腸癌(例如息肉或腺瘤)之最有效方法，此係因為該等期別往往不與任何症狀相關。當息肉長成為腫瘤時通常其可能出血或阻塞結腸，從而造成症狀。此等症狀包括自直腸出血、排便後大便或廁所中帶血、大便形狀之變化(亦即稀化)、腹部絞痛及在不需要排便時有需要排便之感覺。對於可能會間歇性出血之腫瘤及息肉而言，可藉由稱為糞便潛血測試(FOBT)之測試來偵測便樣中之血液。單獨FOBT僅發現約24%癌症。靈活性乙狀結腸鏡檢法或結腸鏡檢法亦可用於診斷結腸直腸癌。
一般而言，將結腸直腸癌如下分期：
第0期(亦稱為原位癌)-癌症限於結腸壁之最外部分。
第I期-癌症已擴散至結腸壁之第二及第三層，但並未達至外結腸 壁或以外。此亦被稱為杜克氏A結腸癌(Dukes' A colon cancer)。
第II期-癌症已經由結腸壁擴散，但尚未侵襲任何淋巴結(此等為有助於對抗感染及疾病之小結構)。此亦被稱為杜克氏B結腸癌(Dukes' B colon cancer)。
第III期-癌症已經由結腸壁擴散且達至淋巴結，但尚未擴散至身體其他區域。此亦被稱為杜克氏C結腸癌(Dukes' C colon cancer)。
第IV期-癌症已擴散至身體其他區域(亦即肝及肺)。此亦被稱為杜克氏D結腸癌(Dukes' D colon cancer)。
本發明之方法特別適用於治療早期結腸直腸癌、治療或防止結腸直腸癌復發(例如在具有休眠腫瘤或微轉移之個體中)或適用於預防具有與結腸直腸癌(諸如上述彼等者)相關之危險因素中之任一者的個體之結腸直腸癌。
(iii)食道癌
食道為將喉嚨連接至胃之肌肉管。絕大多數食道癌發生於食道之內膜(黏膜)而非發生於構成食道其餘部分之肌細胞或軟骨細胞。食道內膜有點獨特，在於其隨著自喉嚨達至胃而有所變化。在上(近端)食道中，食道內膜類似於喉嚨內膜，由鱗狀細胞組成。因此，當癌症產生於此區域中時，其通常為鱗狀細胞癌。在下(遠端)食道中，癌症之較常見類型稱為腺癌。
除了侵襲性癌症以外，患者有時被診斷為具有癌前病變，稱為原位癌。該等癌前病變可在患上鱗狀細胞癌抑或腺癌之前發現。當食道內膜經歷類似於癌性變化之變化但對較深組織無任何侵襲時發生原位癌。因此，儘管細胞本身具有類似癌症之性質，但無擴散之危險，此係因為無侵襲發生。另一類被視為癌症本身之先兆之病變被稱為巴瑞特氏食道(Barrett's esophagus)，下文對其作深入解釋。
食道癌每年在約13,500位美國人中發生，導致約12,500例死亡。 大多數患者係在其50多歲或60多歲時被診斷出患有該病，經診斷患有該病之男性比女性多約4倍。在過去，絕大多數(約85%)的經診斷之食道癌為發生於上食道中的鱗狀細胞癌。此類癌症之危險因素包括吸煙及酒精使用。儘管據悉兩者為非依賴性危險因素(其中吸煙影響較強)，但似乎兩者間對食道癌之進展有協同效應。對於食道鱗狀細胞癌之進展而言，其他潛在致癌原為亞硝胺、石棉纖維及石油產品。
將此鱗狀細胞癌與處於患通常在下食道之腺癌之危險中的患者群對比。以前，腺癌與鱗狀細胞癌相比為較不常見之疾病。然而，其近來變得比鱗狀細胞癌甚至更為普遍。據悉腺癌一般產生於巴瑞特氏食道之環境中，該巴瑞特氏食道為一種食道之正常內膜由類似胃之內膜替代的病狀。巴瑞特氏食道係藉由內窺鏡檢法診斷，其中使用光纖攝影機來窺視食道且活檢任何可疑區域。據悉巴瑞特氏食道係由下食道長期暴露於胃酸所引起。此暴露發生於患有胃食道逆流病(GERD)之患者中，該疾病導致患者以下症狀：胃灼熱、胃氣脹、食慾缺乏或進食時或晚上睡覺時之胃痛。患有慢性GERD之患者處於患巴瑞特氏食道之危險中且因此處於患上食道腺癌之較高危險中。
儘管根據定義，巴瑞特氏食道在食道內膜異常時發生，但異常性程度水平可不同。此係就發育不良而言來分等級，使用發育不良來確定巴瑞特氏食道如何有可能地進展成癌症。具有巴瑞特氏食道且具有高等級發育不良之患者應每3個月緊隨進行內窺鏡檢查或實際上經受治療，此係因為該等情況被視為具有進展成癌症之高可能性的惡變前變化。用以證明局部食道癌或發育不良之最敏感性測試為內窺鏡檢法。在內窺鏡檢查之情況下，可用光纖攝影機直接檢視食道中所關注之區域，且可目測異常性之位置、出血之有無及阻塞之數量。亦可視食道癌之位置及程度而定需要執行喉鏡檢查(查看喉嚨)或支氣管鏡檢查(查看氣管及導氣管)。當今標準醫護亦包括在內窺鏡檢查期間執行 超音操作，稱為內窺鏡超音檢查(EUS)。通常執行CT掃描、吞鋇測試、x-光及其他較常規性測試(包括血液篩查測試)來適當地診斷該癌症且對該癌症分期。
本發明之方法特別適用於治療早期食道癌、治療或防止食道癌復發(例如在具有休眠腫瘤或微轉移之個體中)或適用於預防具有與食道癌(諸如上述彼等者)相關之危險因素中之任一者的個體之食道癌。
(iv)膽囊癌
膽囊為儲存及集中膽汁之梨形小器官。膽囊及肝係由肝管連接。在美國，原發膽囊癌每年侵襲約6000位成人。大部分該等癌症為腺癌，亞型諸如有乳突狀、結節狀及管狀腺癌，視顯微鏡下腫瘤細胞之外觀而定。較不常見之亞型包括鱗狀細胞腺癌、印戒細胞腺癌及腺鱗癌(腺棘皮癌)。
膽囊癌最常見於年長患者中，診斷時中值年齡為62-66歲。其更經常在女性中發生，女性與男性比率為約3：1。
膽囊癌之病因不明，但其與膽石、高雌激素含量、吸煙、酒精、肥胖及雌性性別相關聯。而且，患有發炎性腸病(潰瘍性結腸炎及克隆氏病)之患者更有可能患肝外膽道癌，可能性為不患有該疾病之患者的10倍。
一般而言，膽囊癌係經由病史與身體檢查以及實驗室研究來診斷，該實驗室研究包括代謝化學及肝功能組別測試以檢查各種物質在血液中之異常含量，該等異常含量暗示一般肝膽疾病。通常亦進行尿分析以評估一些該等物質之尿含量。其他諸如超音、MRI、膽管造影術及CT掃描之技術亦可使用。
本發明之方法特別適用於治療早期膽囊癌、治療或防止膽囊癌復發(例如在具有休眠腫瘤或微轉移之個體中)或適用於預防具有與膽囊癌(諸如上述彼等者)相關之危險因素中之任一者的個體之膽囊癌。
(v)胃癌
胃癌為胃部癌症。在美國，胃癌現列為第14種最常見癌症。胃癌在40歲以前很少見，但此後其發生率隨著年齡之增加而增大。
90%以上胃癌產生於胃內膜。由於此內膜具有腺，故源自其之癌症稱為腺瘤或對於更晚期形式而言，稱為腺癌。儘管存在其他可在胃中產生之癌症(淋巴瘤-源自淋巴組織；平滑肌肉瘤-源自肌肉組織；鱗狀細胞癌-源自無腺之內膜)，但絕大多數為腺癌。
研究亦已將幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)與胃癌相聯繫。幽門螺旋桿菌與胃潰瘍及慢性萎縮性胃炎相關聯，此可解釋胃癌在感染幽門螺旋桿菌之患者中的高發生率。然而，幽門螺旋桿菌在罹患胃癌過程中之確切作用尚未明瞭。
使用各種測試來準確地鑑別胃癌，包括雙對比X線鋇餐檢查術(barium radiograph)(所謂"上部GI"或"吞鋇")及上內窺鏡檢查術。使用包括CT掃描、PET掃描及腹腔鏡檢法之其他程序來診斷胃癌。
本發明之方法特別適用於治療早期胃癌、治療或防止胃癌復發(例如在具有休眠腫瘤或微轉移之個體中)或適用於預防具有與胃癌(諸如上述彼等者)相關之危險因素中之任一者的個體之胃癌。
(vi)肝癌
存在眾多良性肝腫瘤。血管瘤為肝之最常見良性腫瘤且當在肝內形成良性充血腫瘤時出現。其他良性腫瘤包括腺瘤及局灶性結節性增生。儘管該等腫瘤不侵襲周圍組織或不轉移，但往往難以以放射攝影成像來辨別良性腫瘤與惡性腫瘤之間的差異。
肝細胞癌(HCC)，即一種自肝細胞產生之癌症，為原發肝癌之最常見類型且在所有肝癌中占約70%。自肝內膽管產生之癌症被稱為膽管癌且在所有肝癌中占10-20%。該等癌症可能自肝內膽管產生(稱為肝內膽管癌)或可能在膽管通向遠離肝之處自該等膽管內產生(稱為肝 外膽管癌)。其他類型之罕見癌症可在肝內發生。該等者包括血管肉瘤(惡性充血腫瘤)及肝胚細胞瘤(一種在極幼小兒童中產生之罕見癌症)。
存在許多與肝癌相關之危險因素。在美國，肝癌之最常見危險因素為肝硬化。C型肝炎病毒(HCV)慢性感染在美國亦為肝癌之常見病因。在世界範圍內，其他危險因素(諸如B型肝炎病毒(HBV)慢性感染及黃曲毒素B1食物污染)更為常見。
存在若干用於偵測肝癌之篩查技術。一種電位篩查測試涉及偵測α-胎蛋白(AFP)之血液含量。AFP為一種據發現在胎兒血中具高含量但通常在出生之後消失的蛋白質。AFP含量在HCC之存在下增加且可為肝癌發展之標誌。當常規測試處於患上肝癌之高危險中的一些患者之AFP含量時，並非所有肝癌在血液中產生高含量AFP，且當發現具有高AFP含量時，大多數患者之腫瘤已處於晚期。其他血液蛋白可潛在用作肝癌之篩查工具。若干研究已顯示諸如脫-γ-羧基凝血酶原(DCP)及扁豆(Lens culinaris)凝集素反應性部分(AFP-L3)之蛋白質亦可用作肝癌形成之標誌；然而，在實際中，很少使用該等者。
另外，當懷疑有肝癌時，執行超音、CT掃描、MRI、血管攝影術、氟脫氧葡萄糖-正電子發射斷層攝影術(FDG-PET)、活組織檢查及探測腹腔鏡法(exploratory laporatomy)以進一步診斷肝癌且對肝癌分期。
本發明之方法特別適用於治療早期肝癌、治療或防止肝癌復發(例如在具有休眠腫瘤或微轉移之個體中)或適用於預防具有與肝癌(諸如上述彼等者)相關之危險因素中之任一者的個體之肝癌。
(vii)胰腺癌
胰腺為梨形腺，約6吋長，位於介於胃與脊柱之間腹部內的較深處。其係以三個部分來提及：最寬部分稱為頭部，中間部分為主體， 且細端稱為尾部。胰腺負責形成有助於調節血糖含量之激素(包括胰島素)及由腸用於消化食物之酶。此等酶係經由胰腺內導管輸送，流注入膽總管中，該膽總管將酶運送至腸中。胰腺癌之發生率在60歲與80歲之間最高，且僅在40歲以下之人中很少見。發生率在男性及女性中大致相同，但近年來，女性患病率上升，此可能歸因於女性吸煙之比率升高之故。吸煙者更有可能患胰腺癌，可能性為不吸煙者之2到3倍。若個人之父親、母親或同胞患有該疾病，則該個人之患病危險性為不具有此狀況之個人的3倍。乳癌或結腸癌家族史亦會使危險性增加。此增加的危險性係歸因於致癌基因之遺傳突變。此疾病之實際病因不明，但據悉為遺傳基因變化與由環境暴露所引起之變化之組合的結果。
當醫師懷疑患者可能患有胰腺癌時，使用超音、CT掃描及內窺鏡檢法來診斷該癌症且對該癌症分期。一些胰腺癌患者可能具有高含量之碳水化合物抗原19-9(CA 19-9)。在具有高含量之患者中，在治療期間結合其他測試確認診斷且監測疾病係有效的。可在治療期間定期地檢查該含量以判斷癌症是否為穩定的或正在惡化。
本發明之方法特別適用於治療早期胰腺癌、治療或防止胰腺癌復發(例如在具有休眠腫瘤或微轉移之個體中)或適用於預防具有與胰腺癌(諸如上述彼等者)相關之危險因素中之任一者的個體之胰腺癌。
(viii)小腸癌
小腸(small bowel,small intestine)為消化道中連接胃及大腸(亦稱為結腸)之部分。小腸中存在三個不同部分：1)十二指腸、2)空腸及3)回腸。令人驚訝的是，儘管小腸之長度與消化道之其餘部分相比非常長，但小腸癌極其少見。其包括始於小腸中之癌症抑或自另一身體部位擴散到小腸之癌症。特定言之，小腸癌在所有腸癌中占不到5%且在美國所診斷之所有癌症中占約0.5%。
大多數小腸癌之病因不明。然而，存在一些可能會增加患上小腸癌之幾率的可能危險因素。一些實例包括克隆氏病、口炎性腹瀉病、普茲傑格氏症候群(Peutz-Jegher's syndrome)及腸息肉病。
存在有四種主要類型之小腸癌，其視顯微鏡下外觀及起源細胞而定。腺癌為最常見類型。其通常始於腸內膜或內層中，且常常在十二指腸中發生。另一類型為肉瘤且典型亞型為平滑肌肉瘤，其始於小腸肌肉壁中且常在回腸中發生。第三類型為類癌，其始於小腸之專門產生激素之細胞中且常在回腸中發生，有時在闌尾(其為大腸之第一部分)中發生。第四類型為淋巴瘤，其始於小腸淋巴組織中且通常在空腸中發生。淋巴瘤之最典型亞型為非霍奇金氏淋巴瘤。小腸癌之不常見亞型為胃腸基質瘤，其可發生在小腸三個部分中之任一部分中。
小腸癌通常係使用完整病史、身體檢查及便樣、內窺鏡檢法或結腸鏡檢法、鋇C-射線、CT掃描、超音或其他射線來診斷。
本發明之方法特別適用於治療早期小腸癌、治療或防止小腸癌復發(例如在具有休眠腫瘤或微轉移之個體中)或適用於預防具有與小腸癌(諸如上述彼等者)相關之危險因素中之任一者的個體之小腸癌。
V. 預防
在本發明之另一態樣中，吾人已發現，VEGF-特異性拮抗劑可用於治療良性、癌前或早期癌症或用於治療或防止腫瘤復發。該等方法可用於治療癌症本身或防止該癌症進展至轉移期或侵襲期或進展至較高等級或較高期。舉例而言，本發明之方法可用於治療患有第0期癌症或息肉症之個體以便防止進展至第I期或更高期腫瘤。類似地，在患有第II期癌症之患者中，該等方法可用於防止該癌症進展至第III期或第IV期癌症。
VEGF-特異性拮抗劑亦可用於防止腫瘤復發。舉例而言，若腫瘤已被識別且治療(例如用化學療法或手術移除)，則VEGF-特異性拮抗 劑可用於防止結腸直腸腫瘤局部復發抑或結腸直腸腫瘤轉移。為防止腫瘤復發，可使用VEGF-特異性拮抗劑(例如)治療休眠腫瘤或微轉移或防止臨床上可能偵測得到或可能偵測不到之休眠腫瘤或微轉移之生長或再生長。
吾人亦已發現VEGF-特異性拮抗劑可用於預防從未患有癌症或處於患上癌症之危險中之個體的癌症。存在多種已知與癌症相關之危險因素，且其中有許多因素已在上文描述。例示性危險因素包括高齡(亦即50歲以上)、癌症家族史、HPV、HIV、HBV及HCV之病毒感染、口服避孕藥使用、硬化、潰瘍性結腸炎、巴瑞特氏食道、幽門螺旋桿菌感染及息肉或發育不良之存在。另外，認為具有遺傳性癌症症候群之個體處於患上癌症之危險中。該等症候群之非限制性實例包括APC、HNPCC、嘉德耐氏症候群及MEN1。患上癌症之其他危險因素可針對臨床評估來判定且包括高含量之激素或血液蛋白，諸如PSA(前列腺癌)、CA-125(卵巢癌)、AFP(肝癌)、DCP(肝癌)及CA 19-9(胰腺癌)。
VI. 先導性輔助療法
本發明提供一種在個體(例如人類患者)中在手術移除手術可治癌症之前進行先導性輔助療法的方法，其包含向該患者投與(例如在患者已經診斷具有腫瘤及/或癌症之狀況下)有效量之VEGF-特異性拮抗劑(例如VEGF抗體)。視情況，將該VEGF-特異性拮抗劑與至少一種化學治療劑組合投與。在手術之後向個體投與有效量之VEGF-特異性拮抗劑以防止癌症復發的其他步驟亦可與本文中所述之先導性輔助療法一起使用。對於包括在手術之後向個體投與有效量之VEGF-特異性拮抗劑之其他步驟的方法而言，可使用本文中所述之輔助方法中的任一種方法。
舉例而言，一種方法包括治療個體中之癌症，其包含以下步 驟：a)第一階段，其包含複數個治療週期，其中各週期包含以預定時間間隔向該個體投與有效量之VEGF-特異性拮抗劑(例如貝伐單抗)及(視情況)至少一種化學治療劑；b)確定性手術，藉此移除該癌症；及(視情況)c)第二階段，其包含複數個維持週期，其中各週期包含在有或無任何化學治療劑之情況下以預定時間間隔向該個體投與有效量之VEGF-特異性拮抗劑(例如貝伐單抗)。
對於先導性輔助療法而言，可以一定量或一定時間(例如對於隨時間之特定治療方案而言)投與VEGF-特異性拮抗劑以使腫瘤中癌細胞之數目減少(例如減少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或更多)；以減小腫瘤大小(例如以允許切除)；以減小腫瘤負荷；以抑制(亦即以在某種程度上減少及/或阻止)癌細胞浸潤至周邊器官中；以降低腫瘤之血管密度；以抑制腫瘤轉移；以降低或抑制腫瘤生長或腫瘤細胞增殖；以減少或防止休眠腫瘤之生長；以降低或防止微轉移之生長或增殖；以增加或延長易患有或經診斷患有良性、癌前或非轉移性腫瘤之個體的DFS或OS；及/或以在某種程度上減輕與癌症相關之症狀中的一或多個症狀。
在一實例中，投與先導性輔助療法以延長無病存活期(DFS)或總存活期(OS)，其中該DFS或該OS係在初始投與抗體之後約2-5年內加以評估。在某些實施例中，個體之DFS或OS係在開始治療之後或在初始診斷之後約3-5年、約4-5年，或至少約4年或至少約5年內加以評估。通常，VEGF-特異性拮抗劑為VEGF抗體，諸如貝伐單抗。
在另一實例中，與單獨以化學療法(例如紫杉醇，諸如太平洋紫杉醇)治療之個體相比，投與抗體及/或化學療法可使患者群體之疾病復發(原發器官之癌症復發及/或遠端復發)在3年時減少約50%(此處"約50%"在本文中包括約45%至約70%之範圍)，例如使原發器官之復發在3年時減少約52%，及/或使遠端復發在3年時減少約53%。
根據已知方法，諸如靜脈內投藥(例如以團注途徑或藉由經一段時間連續輸注)、以肌肉內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、關節內、滑膜內、鞘內、口服、局部或吸入途徑將VEGF-特異性拮抗劑(例如VEGF抗體)投與個體(例如人類患者)。抗體之靜脈內投藥較佳。
儘管VEGF-特異性拮抗劑(例如VEGF抗體)可作為單一藥劑投與，但視情況可用VEGF抗體與一或多種化學治療劑之組合治療患者。在一實施例中，該等化學治療劑中之至少一者為紫杉醇。組合投與包括使用獨立調配物或單一醫藥調配物共投與或共同投與及以任一順序連續投與，其中較佳存在兩種(或所有)活性劑同時發揮其生物活性之時段。因此，化學治療劑可在投與VEGF-特異性拮抗劑(例如VEGF抗體)之前或之後投與。在此實施例中，介於化學治療劑之至少一次投與與VEGF-特異性拮抗劑(例如VEGF抗體)之至少一次投與之間的時間間隔較佳為約1個月或以內且最佳為約2週或以內。或者，將化學治療劑及VEGF-特異性拮抗劑(例如VEGF抗體)以單一調配物或獨立調配物形式共同投與患者。化學治療劑(例如紫杉醇)與VEGF抗體(例如貝伐單抗)之組合治療對於患者而言可產生協同性或大於累加性之治療益處。
化學治療劑(若投與)通常係以關於其已知之劑量投與或視情況由於藥物之組合作用或可歸因於投與抗代謝物化學治療劑之不利副作用而降低劑量。可根據製造商之說明或如由熟習開業醫師憑經驗所判定來使用該等化學治療劑之製劑及給藥進度。在化學治療劑為太平洋紫杉醇時，其較佳係每週(例如以80mg/m2)或每3週(例如以175mg/m2或135mg/m2)投與。合適多烯紫杉醇(docetaxel)劑量包括60mg/m2、70mg/m2、75mg/m2、100mg/m2(每3週)；或35mg/m2或40mg/m2(每週)。
可加以組合之各種化學治療劑係如上揭示。在本發明之某些實 施例中，待與VEGF-特異性拮抗劑(例如VEGF抗體)組合之化學治療劑包括(但不限於)(例如)紫杉醇(包括多烯紫杉醇及太平洋紫杉醇)、長春鹼類(諸如長春瑞賓或長春鹼)、鉑化合物(諸如卡鉑或順鉑)、芳香酶抑制劑(諸如來曲唑、阿那曲唑(anastrazole)或依西美坦)、抗雌激素(例如氟維司群(fulvestrant)或他莫昔芬)、依託泊苷、塞替派、環磷醯胺、甲胺喋呤、脂質阿黴素、聚乙二醇化脂質阿黴素、卡培他濱、吉西他濱、COX-2抑制劑(例如賽利克西)或蛋白體抑制劑(例如PS342)。
當向個體投與蒽環黴素(anthracycline)(例如阿黴素或表柔比星)時，其較佳係在投與VEGF-特異性拮抗劑(例如貝伐單抗)之前及/或之後給予。然而，具有降低之心臟毒性的經修飾蒽環黴素(諸如脂質阿黴素(TLC D-99)(MYOCET®)、聚乙二醇化脂質阿黴素(CAELYX®)或表柔比星)可與VEGF-特異性拮抗劑(例如貝伐單抗)組合。
在投藥進度之一實施例中，本發明之先導性輔助療法包含第一步驟，其中在複數個先導性輔助週期中將VEGF-特異性拮抗劑(例如貝伐單抗)及一或多種化學治療劑投與患者，接著進行手術以確定性地移除腫瘤。各先導性輔助週期由一至三週組成，此視特定治療計劃而定。舉例而言，治療週期可為3週，此意謂患者每3週接受一個劑量之化學療法及一個劑量之貝伐單抗。治療週期亦可為2週，此意謂患者每隔1週接受一個劑量之化學療法及一個劑量之貝伐單抗。先導性輔助治療之整個第一階段可持續約4-8個週期。在本發明之某些實施例中，先導性輔助療法在手術之前持續不到一年，在一實施例中，不到6個月。視疾病之類型及嚴重性而定，VEGF-特異性拮抗劑(例如貝伐單抗)之較佳劑量係在約1μg/kg至約50mg/kg、最佳約5mg/kg至約15mg/kg之範圍內，包括(但不限於)7.5mg/kg或10mg/kg。在一些態樣中，化學療法方案包括傳統高劑量間隙性投藥。在一些其他態樣 中，化學治療劑係使用較小且較頻繁之劑量在無預定間斷之情況下投與("節奏性化學療法")。本發明之療法進程易於藉由習知技術及檢定來監控。
除VEGF抗體及化學治療劑以外，可將其他治療方案與之組合。舉例而言，可投與第二(第三、第四等)化學治療劑，其中第二化學治療劑為另一不同之紫杉醇化學治療劑抑或非紫杉醇化學治療劑。舉例而言，第二化學治療劑可為紫杉醇(諸如太平洋紫杉醇或多烯紫杉醇)、長春鹼類(諸如長春瑞賓)、鉑化合物(諸如順鉑或卡鉑)、抗激素劑(諸如芳香酶抑制劑或抗雌激素)、吉西他濱、卡培他濱等。例示性組合包括紫杉醇/鉑化合物、吉西他濱/紫杉醇、吉西他濱/長春瑞賓、長春瑞賓/紫杉醇、卡培他濱/紫杉醇等。可投與不同化學治療劑之"混合液(Cocktail)"。
可與VEGF抗體組合之其他治療劑包括下列各物中之任何一或多者：另一VEGF拮抗劑或VEGF受體拮抗劑(諸如第二抗VEGF抗體)、VEGF變異體、可溶性VEGF受體片段、能夠阻斷VEGF或VEGFR之適體、中和抗VEGFR抗體、VEGFR酪胺酸激酶抑制劑及其任何組合。其他適用於本發明抗體之組合腫瘤療法的治療劑包括與腫瘤生長有關之其他因子(諸如EGFR、ErbB2(亦稱為Her2)、ErbB3、ErbB4或TNF)的拮抗劑。在本發明之某些實施例中，抗VEGF抗體可與靶向一或多種酪胺酸激酶受體(諸如VEGF受體、FGF受體、EGF受體及PDGF受體)之小分子受體酪胺酸激酶抑制劑(RTKI)組合使用。許多治療性小分子RTKI在此項技術中係已知的，包括(但不限於)瓦他拉尼(vatalanib)(PTK787)、埃羅替尼(TARCEVA®)、OSI-7904、ZD6474(ZACTIMA®)、ZD6126(ANG453)、ZD1839、舒尼替尼(sunitinib)(SUTENT®)、司馬沙尼(semaxanib)(SU5416)、AMG706、AG013736、伊馬替尼(GLEEVEC®)、MLN-518、CEP-701、PKC- 412、拉帕替尼(Lapatinib)(GSK572016)、VELCADE®、AZD2171、索拉非尼(sorafenib)(NEXAVAR®)、XL880及CHIR-265。
上述共投與之藥劑中之任一者的合適劑量為目前所用之彼等劑量且可由於藥劑與VEGF抗體之組合作用(協同作用)而降低劑量。
除上述治療方案以外，患者可經受放射療法。
在本發明之某些實施例中，所投與之VEGF抗體為完整裸抗體。然而，VEGF抗體可與細胞毒性劑接合。在某些實施例中，接合抗體及/或其所結合之抗原由細胞內在化，從而使得接合物殺死其所結合之癌細胞的治療功效增強。在一實施例中，細胞毒性劑靶向或干擾癌細胞中之核酸。該等細胞毒性劑之實例包括美登素類、卡奇黴素、核糖核酸酶及DNA核酸內切酶。
VII. 輔助療法
本發明提供一種輔助療法之方法，其包含向非轉移性癌症個體在確定性手術之後投與VEGF-特異性拮抗劑(例如VEGF抗體)。
舉例而言，一種方法可包括以下步驟：a)第一階段，其包含複數個治療週期，其中各週期包含以預定時間間隔向個體投與有效量之VEGF-特異性拮抗劑(例如貝伐單抗)及(視情況)至少一種化學治療劑；及b)第二階段，其包含複數個維持週期，其中各週期包含在無任何化學治療劑之情況下以預定時間間隔向該個體投與有效量之VEGF-特異性拮抗劑(例如貝伐單抗)；其中所組合之第一階段及第二階段在初始術後治療之後持續至少一年。在一實施例中，該第一階段包含第一複數個治療週期，其中投與VEGF-特異性拮抗劑(例如貝伐單抗)及第一化學療法方案，繼之以第二複數個治療週期，其中投與VEGF-特異性拮抗劑(例如貝伐單抗)及第二化學療法方案。
對於輔助療法而言，可以一定量或一定時間(例如對於隨時間之特定治療方案而言)投與VEGF-特異性拮抗劑以使腫瘤中癌細胞之數 目減少(例如減少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或更多)；以減小腫瘤大小；以減小腫瘤負荷；以抑制(亦即以在某種程度上減少及/或阻止)癌細胞浸潤至周邊器官中；以降低腫瘤之血管密度；以抑制腫瘤轉移；以降低或抑制腫瘤生長或腫瘤細胞增殖；以減少或防止休眠腫瘤之生長；以降低或防止微轉移之生長或增殖；以減少或防止在治療或移除之後腫瘤之再生長；及/或以在某種程度上減輕與癌症相關之症狀中的一或多個症狀。在一些其他實施中，可使用VEGF-特異性拮抗劑來防止個體中癌症之發生或復發。在一實例中，癌症復發之防止係在個體群體中在約4年之後進行評估，以證實該群體中有至少約80%未出現疾病復發。在另一實例中，疾病復發之防止係在約3年時評估，其中與單獨以化學療法治療之個體相比，疾病復發得以減少至少約50%。
VEGF-特異性拮抗劑一般係在個體已自手術恢復之時段之後投與。此時段可包括創傷癒合或手術切口癒合所需之時段、減小創口開裂之危險所需之時段或個體恢復至健康水準基本上類似於或優於手術前之健康水準所需的時段。介於完成確定性手術與首次投與VEGF-特異性拮抗劑之間的時段亦可包括藥物假期所需之時段，其中個體需要或請求介於治療方案之間的時段。一般而言，介於完成確定性手術與開始VEGF-特異性拮抗劑療法之間的時段可包括小於一週、1週、2週、3週、4週(28天)、5週、6週、7週、8週、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、1年、2年、3年或3年以上。在一實施例中，介於確定性手術與投與VEGF-特異性拮抗劑之間的時段大於2週且小於1年。
在一實例中，VEGF-特異性拮抗劑(例如VEGF抗體)係以有效延長無病存活期(DFS)或總存活期(OS)之量投與，其中該DFS或該OS係在初始投與抗體之後約2至5年內加以評估。在某些實施例中，個體之 DFS或OS係在開始治療之後或在初始診斷之後約3-5年、約4-5年，或至少約4年或至少約5年內加以評估。
根據已知方法，諸如靜脈內投藥(例如以團注途徑或藉由經一段時間連續輸注)、以肌肉內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、關節內、滑膜內、鞘內、口服、局部或吸入途徑將VEGF-特異性拮抗劑(例如VEGF抗體)投與個體(例如人類患者)。抗體之靜脈內投藥較佳。
VEGF-特異性拮抗劑可作為單一藥劑投與。在其他實施例中，用VEGF-特異性拮抗劑與一或多種化學治療劑之組合治療患者。在一些實施例中，該等化學治療劑中之至少一者為紫杉醇。組合投與包括使用獨立調配物或單一醫藥調配物共投與或共同投與及以任一順序連續投與，其中視情況存在兩種(或所有)活性劑同時發揮其生物活性之時段。因此，化學治療劑可在投與VEGF-特異性拮抗劑(例如VEGF抗體)之前或之後投與。在此實施例中，介於化學治療劑之至少一次投與與VEGF-特異性拮抗劑(例如VEGF抗體)之至少一次投與之間的時間間隔較佳為約1個月或以內且最佳為約2週或以內。或者，將化學治療劑及VEGF抗體以單一調配物或獨立調配物形式共同投與患者。化學治療劑(例如紫杉醇)與VEGF抗體(例如貝伐單抗)之組合治療對於患者而言可產生協同性或大於累加性之治療益處。
化學治療劑(若投與)通常係以關於其已知之劑量投與或視情況由於藥物之組合作用或可歸因於投與抗代謝物化學治療劑之不利副作用而降低。可根據製造商之說明或如由熟習開業醫師憑經驗所判定來使用該等化學治療劑之製劑及給藥進度。在化學治療劑為太平洋紫杉醇時，其較佳係每週(例如以80mg/m2)或每3週(例如以175mg/m2或135mg/m2)投與。合適多烯紫杉醇劑量包括60mg/m2、70mg/m2、75mg/m2、100mg/m2(每3週)；或35mg/m2或40mg/m2(每週)。
可加以組合之各種化學治療劑係如上揭示。待與VEGF抗體組合 之化學治療劑的實例包括(但不限於)(例如)紫杉醇(包括多烯紫杉醇及太平洋紫杉醇)、長春鹼類(諸如長春瑞賓或長春鹼)、鉑化合物(諸如卡鉑或順鉑)、芳香酶抑制劑(諸如來曲唑、阿那曲唑或依西美坦)、抗雌激素(例如氟維司群或他莫昔芬)、依託泊苷、塞替派、環磷醯胺、甲胺喋呤、脂質阿黴素、聚乙二醇化脂質阿黴素、卡培他濱、吉西他濱、COX-2抑制劑(例如賽利克西)或蛋白體抑制劑(例如PS342)。
當向個體投與蒽環黴素(例如阿黴素或表柔比星)時，其較佳係在投與VEGF抗體之前及/或之後給予，諸如在下述實例中所揭示之方案中，其中將蒽環黴素/環磷醯胺組合在手術之後但在投與VEGF抗體及紫杉醇之前投與個體。然而，具有降低之心臟毒性的經修飾蒽環黴素(諸如脂質阿黴素(TLC D-99)(MYOCET®)、聚乙二醇化脂質阿黴素(CAELYX®)或表柔比星)可與VEGF抗體組合。
在一投藥進度中，本發明之輔助療法包含第一階段，其中在複數個治療週期中將VEGF-特異性拮抗劑(例如VEGF抗體)及一或多種化學治療劑投與患者；及第二階段，其中在複數個維持週期中將VEGF-特異性拮抗劑(例如VEGF抗體)作為單一藥劑使用。各治療週期由一至三週組成，此視特定治療計劃而定。舉例而言，治療週期可包括貝伐單抗作為VEGF-特異性拮抗劑且可為3週，此意謂患者每3週接受一個劑量之化學療法及一個劑量之貝伐單抗。治療週期亦可為2週，此意謂患者每隔1週接受一個劑量之化學療法及一個劑量之貝伐單抗。治療之整個第一階段可持續約4-8個週期。在第二階段(即維持階段)期間，貝伐單抗係視特定週期之長短而定每兩週一次或每三週一次給予，且總共持續約30-50個週期。在某些實施例中，輔助療法自治療開始起持續至少一年，且在彼時間之後將緊隨個體之進程。視疾病之類型及嚴重性而定，VEGF抗體之較佳劑量係在約1μg/kg至約50mg/kg、最佳約5mg/kg至約15mg/kg之範圍內，包括(但不限於)7.5 mg/kg或10mg/kg。在一些態樣中，化學療法方案包括傳統高劑量間隙性投藥。在一些其他態樣中，化學治療劑係使用較小且較頻繁之劑量在無預定間斷之情況下投與("節奏性化學療法")。本發明之療法進程易於藉由習知技術及檢定來監控。
與單獨以化學療法(例如紫杉醇，諸如太平洋紫杉醇)治療之個體相比，投與抗體與化學療法可使個體群體疾病復發(原發器官之癌症復發及/或遠端復發)之可能性在3年時減少約50%(此處"約50%"在本文中包括約45%至約70%之範圍)，例如使原發器官之復發在3年時減少約52%，及/或使遠端復發在3年時減少約53%。
在本文中，本發明提供一種治癒患有非轉移性癌症之人類個體群體之非轉移性癌症的方法，其包含在確定性手術之後向該等個體投與有效量之VEGF-特異性拮抗劑(例如VEGF抗體)及至少一種化學治療劑，及在4年或4年以上之後評估該等個體以證實該等個體中在約4年之後有至少約80%(較佳至少約85%)未出現疾病復發。該群體可包含3000位或3000位以上人類個體。
本發明另外係關於一種減少患有非轉移性癌症之人類個體群體之疾病復發的方法，其包含在確定性手術之後向該等個體投與有效量之貝伐單抗及至少一種化學治療劑，其中與單獨以紫杉醇治療之個體相比，在3年時疾病復發得以減少至少約50%。
除VEGF抗體及化學治療劑以外，可將其他治療方案與之組合。舉例而言，可投與第二(第三、第四等)化學治療劑，其中第二化學治療劑為另一不同之紫杉醇化學治療劑抑或非紫杉醇化學治療劑。舉例而言，第二化學治療劑可為紫杉醇(諸如太平洋紫杉醇或多烯紫杉醇)、長春鹼類(諸如長春瑞賓)、鉑化合物(諸如順鉑或卡鉑)、抗激素劑(諸如芳香酶抑制劑或抗雌激素)、吉西他濱、卡培他濱等。例示性組合包括紫杉醇/鉑化合物、吉西他濱/紫杉醇、吉西他濱/長春瑞賓、 長春瑞賓/紫杉醇、卡培他濱/紫杉醇等。可投與不同化學治療劑之"混合液"。
可與VEGF抗體組合之其他治療劑包括下列各物中之任何一或多者：另一VEGF拮抗劑或VEGF受體拮抗劑(諸如第二抗VEGF抗體)、VEGF變異體、可溶性VEGF受體片段、能夠阻斷VEGF或VEGFR之適體、中和抗VEGFR抗體、VEGFR酪胺酸激酶抑制劑及其任何組合。其他適用於本發明抗體之組合腫瘤療法的治療劑包括與腫瘤生長有關之其他因子(諸如EGFR、ErbB2(亦稱為Her2)、ErbB3、ErbB4或TNF)的拮抗劑。在某些實施例中，抗VEGF抗體可與靶向一或多種酪胺酸激酶受體(諸如VEGF受體、FGF受體、EGF受體及PDGF受體)之小分子受體酪胺酸激酶抑制劑(RTKI)組合使用。許多治療性小分子RTKI在此項技術中係已知的，包括(但不限於)瓦他拉尼(PTK787)、埃羅替尼(TARCEVA®)、OSI-7904、ZD6474(ZACTIMA®)、ZD6126(ANG453)、ZD1839、舒尼替尼(SUTENT®)、司馬沙尼(SU5416)、AMG706、AG013736、伊馬替尼(GLEEVEC®)、MLN-518、CEP-701、PKC-412、拉帕替尼(GSK572016)、VELCADE®、AZD2171、索拉非尼(NEXAVAR®)、XL880及CHIR-265。
上述共投與之藥劑中之任一者的合適劑量為目前所用之劑量，且由於該藥劑與VEGF抗體之組合作用(協同作用)而可降低劑量。
除上述治療方案以外，患者可經受放射療法。
在某些實施例中，所投與之VEGF抗體為完整裸抗體。然而，VEGF抗體可與細胞毒性劑接合。在某些實施例中，接合之抗體及/或其所結合之抗原由細胞內在化，使得接合物殺死其所結合之癌細胞的治療功效增強。在一個實施例中，細胞毒性劑靶向或干擾癌細胞中之核酸。該等細胞毒性劑之實例包括美登素類、卡奇黴素、核糖核酸酶及DNA核酸內切酶。
VIII. 劑量、調配物及持續時間
VEGF-特異性拮抗劑組合物將以一種符合良好醫學實踐之方式來調配、給藥及投藥。就此而言，考慮因素包括所治療之特定病症、所治療之特定個體、個別患者之臨床病狀、病症原因、藥劑傳遞部位、投藥方法、投藥時間表及開業醫師已知之其他因素。欲投與之VEGF-特異性拮抗劑之"治療有效量"應由該等考慮因素所支配，例如在先導性輔助或輔助治療中，為預防、改善或治療或穩定良性、癌前或早期癌症，或治療或防止腫瘤、休眠腫瘤或微轉移之發生或復發所需之最小量。VEGF-特異性拮抗劑無需，但視情況，與一或多種目前用於預防或治療癌症或發生癌症危險的藥劑調配。該等其他藥劑之有效量係視調配物中所存在之VEGF-特異性拮抗劑的量、病症或治療之類型及上述其他因素而定。該等一般係以上文所用相同之劑量及投藥途徑使用，或以約為迄今所用劑量之1至99%的劑量使用。
視疾病類型及嚴重性而定，約1μg/kg至100mg/kg(例如0.1-20mg/kg)之VEGF-特異性拮抗劑為投與患者之初始候選劑量，無論是例如藉由一或多次各別投藥或藉由連續輸注。視上述因素而定，典型每日劑量範圍可介於約1μg/kg至約100mg/kg或以上。特別可取之劑量包括例如7.5mg/kg、10mg/kg及15mg/kg。對於數天或更久之反覆投與，視病狀而定，持續治療至癌症得以治療，如上文所述或此項技術中已知之方法所測量。然而，其他劑量方案可能適用。在一個實例中，若VEGF-特異性拮抗劑為抗體，則本發明之抗體係每週一次、每兩週一次或每三週一次以約5mg/kg至約15mg/kg之劑量範圍，包括(但不限於)7.5mg/kg或10mg/kg投與。本發明療法之進程容易藉由習知技術及檢定來監控。
在一實例中，貝伐單抗為VEGF-特異性拮抗劑。對於治療性使用而言，貝伐單抗係以100mg及400mg不含防腐劑之單次使用型小瓶供 給以傳遞4ml或16ml貝伐單抗(25mg/ml)。將100mg產物調配於240mg α，α-海藻糖脫水物、23.2mg磷酸二氫鈉(單水合物)、4.8mg磷酸氫二鈉(無水)、1.6mg聚山梨醇酯20及注射用水(USP)中。將400mg產物調配於960mg α，α-海藻糖脫水物、92.8mg磷酸二氫鈉(單水合物)、19.2mg磷酸氫二鈉(無水)、6.4mg聚山梨醇酯20及注射用水(USP)中。
療法持續時間應持續長達醫學指定之時間或直至獲得所要治療效果(例如本文所述之彼等者)為止。在某些實施例中，VEGF-特異性拮抗劑療法持續2個月、4個月、6個月、8個月、10個月、1年、2年、3年、4年、5年或達至個體壽命期之年段。
一般而言，良性、癌前或早期癌症之緩解或治療或癌症(良性或惡性)之輔助或先導性輔助療法包括減少與癌症相關之一或多個症狀或醫學問題。治療有效量之藥物可實現下列目標中之一者或組合：使腫瘤中癌細胞之數目減少(例如減少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或更多)；減小腫瘤大小；減小腫瘤負荷；抑制(亦即在某種程度上減少及/或阻止)癌細胞浸潤至周邊器官中；降低腫瘤之血管密度；抑制腫瘤轉移；降低或抑制腫瘤生長或腫瘤細胞增殖；減少或防止休眠腫瘤之生長；降低或防止微轉移之生長或增殖；減少或防止在治療或移除之後腫瘤之再生長(例如在輔助療法中)；增加或延長易患有或經診斷患有良性、癌前或非轉移性腫瘤或惡性腫瘤之個體的DFS或OS；減小腫瘤大小以允許手術(例如在先導性輔助療法中)；及/或在某種程度上減輕與癌症相關之症狀中的一或多個症狀。在一些其他實施例中，VEGF-特異性拮抗劑可用於防止個體中癌症之發生或復發。在一實例中，癌症復發之防止係在個體群體中在約4年之後進行評估，以證實該群體中有至少約80%未出現疾病復發。在另一實例中，在約3年時評估疾病復發之防止，其中與單獨以化學 療法治療之個體相比，疾病復發得以減少至少約50%。
在一實例中，VEGF-特異性拮抗劑(例如VEGF抗體)係以有效延長無病存活期(DFS)或總存活期(OS)之量投與，其中該DFS或該OS係在最初投與該抗體之後約2至5年內評估。在某些實施例中，個體之DFS或OS係在開始治療之後或在初始診斷之後約3-5年、約4-5年，或至少約4年或至少約5年內加以評估。
在一實施例中，本發明可用於增加易於患有或經診斷患有良性、癌前或非轉移性腫瘤之個體的存活持續時間。存活持續時間係定義為自最初投與藥物至死亡之時間。存活持續時間亦可由治療組較之對照組之分層風險比(HR)來量度，其中該風險比表示治療期間患者死亡之危險性。
在又一實施例中，本發明之治療顯著增加易於患有或經診斷患有癌症且已用各種抗癌療法治療之個體(例如人類患者)群體的反應率。反應率係定義為對治療起反應之被治療患者所占的百分比。在一態樣中，與單獨用手術、放射療法或化學療法治療之患者群相比，本發明使用VEGF-特異性拮抗劑及手術、放射療法或一或多種化學治療劑之組合治療顯著增加被治療之患者群的反應率，該增加具有小於0.005之X(Chi)平方p值。
腫瘤、休眠腫瘤或微轉移之發生或復發之治療或防止包括通常在初始治療或移除腫瘤(例如使用抗癌療法，諸如手術、化學療法或放射療法)之後防止腫瘤或轉移形成。手術可能留下殘餘腫瘤細胞或休眠微轉移瘤，其具有恢復"血管生成程式"且促進更高指數級腫瘤生長之潛力。儘管休眠腫瘤或微轉移之存在並非必定可使用臨床量測或篩查偵測得到，但治療有效量為足以防止或減少可使用臨床醫師已知之技術偵測得到之休眠腫瘤、微轉移、轉移或腫瘤復發的量。在一實例中，隨後用VEGF-特異性拮抗劑治療已針對腫瘤藉由手術移除該腫 瘤而治療過之個體且隨時間監測該個體以偵測休眠腫瘤、微轉移或腫瘤復發。VEGF-特異性拮抗劑可與另一抗癌療法組合投與(例如在VEGF-特異性拮抗劑之前、同時或之後)且一或兩種療法可以維持療法形式持續進行。
對癌症治療之治療功效的其他量測係描述於美國專利申請公開案第20050186208號中。
治療性調配物係使用此項技術中已知之標準方法藉由將具有所要純度之活性成分與視情況之生理學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑混合來製備(Remington's Pharmaceutical Sciences(第20版)，A.Gennaro編，2000,Lippincott,Williams & Wilkins,Philadelphia,PA)。可接受之載劑包括鹽水或緩衝液，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖醇，諸如甘露糖醇或山梨糖醇；鹽形成平衡離子，諸如鈉；及/或非離子界面活性劑，諸如TWEENTM、PLURONICSTM或PEG。
視情況但並非較佳地，調配物含有醫藥學上可接受之鹽，通常例如為氯化鈉且較佳為約生理學濃度。視情況，本發明之調配物可含有醫藥學上可接受之防腐劑。在一些實施例中，防腐劑濃度範圍介於0.1至2.0%，通常為體積/體積。合適防腐劑包括醫藥技術中已知之彼等者。苄醇、苯酚、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯及對羥基苯甲酸丙酯為防腐劑之實例。視情況，本發明之調配物可包括濃度為0.005%至0.02%的醫藥學上可接受之界面活性劑。
在本文中調配物亦可含有一種以上為所治療之特定適應症所必 需之活性化合物，較佳為具有不會不利地彼此影響之互補活性的彼等者。該等分子適合以有效於所欲目的之量以組合形式存在。
亦可將活性成分包埋於(例如)藉由凝聚技術或藉由界面聚合所製備之微膠囊中，例如分別在膠狀藥物傳遞系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)中或巨乳液中之羥基甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊。該等技術已揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences，同上文中。
可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之合適實例包括含有抗體之固體疏水性聚合物之半透性基質，該等基質呈成型物品(例如薄膜或微膠囊)之形式。持續釋放基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利第3,773,919號)、L-麩胺酸與L-麩胺酸γ-乙酯之共聚物、不可降解乙烯-乙酸乙烯酯、諸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)組成之可注射微球體)之可降解乳酸-乙醇酸共聚物及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。雖然諸如乙烯-乙酸乙烯酯及乳酸-乙醇酸之聚合物使分子能夠釋放100天以上，但某些水凝膠在較短時段內釋放蛋白質。當囊封抗體保留於體內較長時間時，其可能由於暴露於37℃下之濕氣而變性或聚集，從而導致生物活性之損失及免疫原性之可能變化。可視所涉及之機制而定設計合理穩定化策略。舉例而言，若發現聚集機制為經由硫基-二硫化物互換形成分子間S-S鍵，則穩定化可藉由修飾氫硫基殘基、自酸性溶液凍乾、控制濕氣含量、使用適當添加劑及開發特定聚合物基質組合物來達成。
根據已知方法，諸如靜脈內投藥(例如以團注途徑或藉由經一段時間連續輸注)、以肌肉內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、關節內、滑膜內、鞘內、口服、局部或吸入途徑將本發明之VEGF-特異性拮抗劑投與個體，例如人類患者。若大範圍副作用或毒性與VEGF拮抗作用 相關，則局部投藥尤其為可取的。離體策略亦可用於治療性應用。離體策略包括以編碼VEGF拮抗劑之聚核苷酸轉染或轉導獲自個體之細胞。隨後將經轉染或轉導之細胞返回至個體。該等細胞可為各種類型中之任一種細胞，包括(但不限於)造血細胞(例如骨髓細胞、巨噬細胞、單核細胞、樹突狀細胞、T細胞或B細胞)、纖維母細胞、上皮細胞、內皮細胞、角質細胞或肌細胞。
舉例而言，若VEGF-特異性拮抗劑為抗體，則該抗體係藉由任何合適方式投與，包括：非經腸、皮下、腹膜內、肺內及鼻內方式，且若希望局部免疫抑制性治療，則係藉由病灶內投藥而投與。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投藥。另外，抗體適合以脈衝輸注投與，下降劑量之抗體尤其如此。在某種程度上視投藥為短期或長期而定，較佳為給藥係以注射方式來提供，最佳以靜脈內或皮下注射方式來提供。
在另一實例中，當病症或腫瘤位置允許時，將VEGF-特異性拮抗劑化合物(例如)以直接注射局部投與，且注射可定期反覆進行。亦可將VEGF-特異性拮抗劑全身地傳遞至個體或直接傳遞至腫瘤細胞，例如傳遞至腫瘤或手術切除腫瘤之後的腫瘤床，以便防止或降低(例如)休眠腫瘤或微轉移之局部復發或轉移。
或者，可將含有編碼VEGF-特異性拮抗劑之核酸序列的抑制性核酸分子或聚核苷酸傳遞至個體體內之適當細胞。在某些實施例中，核酸可針對腫瘤本身。
可藉由對於所用載體而言適當之任何方式將核酸引入細胞中。許多該等方法在此項技術中係熟知的(Sambrook等人，同上文及Watson等人，Recombinant DNA，第12章，第2版，Scientific American Books,1992)。基因傳遞方法之實例包括脂質體介導之轉染、電穿孔、磷酸鈣/DEAE葡聚糖方法、基因槍及顯微注射。
IX. 組合療法
本發明之特徵亦為使用兩種或兩種以上本發明之VEGF-特異性拮抗劑之組合或至少一種VEGF-特異性拮抗劑與一或多種其他抗癌療法之組合。抗癌療法之實例包括(但不限於)手術、放射療法(放射線療法)、生物療法、免疫療法、化學療法或此等療法之組合。另外，可將細胞毒性劑、抗血管生成劑及抗增殖劑與VEGF-特異性拮抗劑組合使用。
在一實例中，將VEGF-特異性拮抗劑以輔助療法形式繼確定性手術之後用於治療非轉移性癌症。在此實例中，VEGF-特異性拮抗劑可在有或無至少一種其他化學治療劑之情況下提供。
在另一實例中，將VEGF-特異性拮抗劑以先導性輔助療法形式在手術之前用於治療手術可治癌症。在此實例中，VEGF-特異性拮抗劑可在有或無至少一種其他化學治療劑之情況下在手術之前提供。
在一實例中，本發明之特徵為使用VEGF-特異性拮抗劑與一或多種化學治療劑(例如混合液)。化學治療劑之非限制性實例包括伊立替康、氟尿嘧啶、甲醯四氫葉酸或其任何組合。組合投與包括使用獨立調配物或單一醫藥調配物同時投與及以任一順序連續投與，其中較佳存在兩種(或所有)活性劑同時發揮其生物活性之時段。可根據製造商之說明或如由熟習開業醫師憑經驗所判定來使用該等化學治療劑之製劑及給藥進度。化學療法之製劑及給藥進度亦描述於Chemotherapy Service Ed.,M.C.Perry,Williams & Wilkins,Baltimore,Md.(1992)中。化學治療劑可在投與VEGF-特異性拮抗劑之前或之後投與，或可與其同時給予。
在本文中調配物亦可含有一種以上為所治療之特定適應症所必需之活性化合物，較佳為具有不會不利地彼此影響之互補活性的彼等者。舉例而言，可希望在一調配物中另外提供與EGFR、VEGF(例如 結合VEGF上之不同抗原決定基的抗體)、VEGFR或ErbB2(例如Herceptin®)結合之抗體。或者或另外，組合物可包含細胞毒性劑、細胞因子、生長抑制劑及/或小分子VEGFR拮抗劑。該等分子適合以有效於所欲目的之量以組合形式存在。
對於預防或治療疾病而言，VEGF-特異性拮抗劑之適當劑量應視如上文定義之所治療之疾病的類型、疾病之嚴重性及病程、VEGF-特異性拮抗劑係出於預防性或治療性目的而投與、先前療法、患者臨床病史及對VEGF-特異性拮抗劑之反應及主治醫師之判斷而定。適合一次性地或經一系列治療將VEGF-特異性拮抗劑投與患者。在組合療法方案中，以治療有效量或治療協同量投與本發明之VEGF-特異性拮抗劑與一或多種抗癌治療劑。如本文中所用，治療有效量為使得VEGF-特異性拮抗劑與一或多種其他治療劑之共投與或本發明組合物之投與產生對如上文所述之癌症之減少作用或抑制作用的量。治療協同量為VEGF-特異性拮抗劑與一或多種其他治療劑協同地或顯著地減少或消除與特定疾病相關之病狀或症狀所必需的量。
VEGF-特異性拮抗劑與一或多種其他治療劑可以足以減少或消除腫瘤、休眠腫瘤或微轉移之發生或復發的量及時間同時或依序投與。VEGF-特異性拮抗劑與一或多種其他治療劑可以維持療法形式投與以防止腫瘤復發。
VEGF-特異性拮抗劑可單獨包裝或與其他抗癌治療化合物組合包裝成套組。該套組可包括有助於向患者投與單位劑量之可選組分，諸如供粉末形式復水用之小瓶、注射用注射器、定製IV傳遞系統、吸入器等。另外，單位劑量套組可含有關於組合物之製劑及投藥的說明。套組可製造成供一個患者用之單次使用單位劑量、供特定患者用之多次使用劑量(劑量恆定或其中個別化合物之效力可隨療法進程而變化)；或套組可含有適合投與多個患者之多個劑量("散裝")。套組組 分可被裝配於紙盒、發泡包裝、瓶、管及其類似物中。
IX. 製品
在本發明之另一實施例中，提供一種含有適用於治療上述病症之物質的製品。該製品包含容器、標籤及包裝插頁。合適容器包括(例如)瓶、小瓶、注射器等。該等容器可由各種材料形成，諸如玻璃或塑料。容器容納可有效治療病狀之組合物且可具有無菌進入孔(例如，容器可為靜脈注射溶液袋或具有可被皮下注射針刺入之塞子的小瓶)。組合物中至少一種活性劑為抗VEGF抗體。容器上或與容器相關之標籤指示組合物用於治療所選病狀。製品可進一步包含第二容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝液，諸如磷酸鹽緩衝生理食鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。製品可進一步包括自商業及用戶觀點所需之其他物質，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針及注射器。另外，製品包含關於使用說明之包裝插頁，其包括(例如)警告組合物不應與另一組合物組合使用或指示組合物使用者將抗VEGF抗體組合物及抗贅生性組合物投與患者。術語"使用說明"意謂藉由(例如)以書面形式、諸如以包裝插頁或其他書寫推廣材料形式之任何方式提供對適用療法、藥物、治療、治療方案及其類似事項之指示說明。
X. 材料之寄存
以下融合瘤細胞株已根據布達佩斯條約(Budapest Treaty)寄存於美國菌種保存中心(American Type Culture Collection,ATCC),Manassas,VA,USA。
實例 實例1.抑制VEGF-A導致Apc min/+ 小鼠之腸腺瘤生長停止且產生長期存 活期
家族性腺瘤性息肉病(FAP)症候群及大部分散發性結腸直腸癌係由APC基因中之突變所引起。FAP患者除包括上腸胃(GI)道之硬纖維瘤及腫瘤之結腸外腫瘤以外，在其下腸胃道內長有數百至數千個腺瘤性息肉。在密碼子850處具有雜合截短等位基因之Apcmin/+小鼠模擬具有生殖系APC突變之FAP患者之息肉病的一些特徵(Moser等人，Science 247：322-324(1990)；Su等人，Science 256：668-670(1992))。在Apcmin/+小鼠中腫瘤形成係始於早期成年期且動物在C57BL/6遺傳背景中通常長有60-150個腸息肉。腫瘤成長導致嚴重折損小鼠壽命，通常導致年齡在約5個月時死於貧血及/或低蛋白血(Moser等人，Science 247：322-324(1990))。儘管患有FAP之人類通常長有結腸腺瘤，但Apcmin/+小鼠由於未被充分瞭解之原因而在小腸中長有絕大多數之息肉。該等息肉之直徑大小達到1-2mm，而較大息肉(直徑達4mm)以較低頻率出現。通常每隻動物僅觀察到0-3個偶發性結腸腺瘤。
據報導Apc與包括增殖、細胞凋亡、細胞遷移、細胞黏附、微管組裝、信號轉導及染色體分離之細胞過程有關(綜述於Nathke,Annu.Rev.Cell.Dev.Biol.20：337-366(2004)中)。研究最為深入之Apc功能為其作為β-索烴素調節劑針對Wnt信號轉導路徑之作用(綜述於Nathke,Mol.Pathol.52：169-173(1999)中)。簡言之，在沒有Wnt信號轉導之情況下，Apc與軸蛋白(axin)及GSK-3β激酶結合以形成針對細胞質β-索烴素之破壞錯合物，藉此防止其核移位及轉錄因子之T-細胞因子/淋巴增強因子(TCF/LEF)家族的後續活化。TCF/LEF之轉錄靶包括與上述細胞路徑有關之分子。
研究異種移植中腫瘤生長之機制具有某些限制性，此係因為此等模型並不再現天然環境中之腫瘤生長。為檢驗抗血管生成療法對天然產生之遺傳易感性非惡性腫瘤模型的影響，吾人研究Apcmin/+腸腺 瘤病模型。在下列實例中，在用例示性VEGF-特異性拮抗劑(抗VEGF-A mAb)短期及長期治療之後以及在腸上皮細胞中藉由Cre-LoxP技術使VEGF-A基因刪除之後分析Apcmin/+小鼠之腫瘤表型。
對於下述實驗而言，Apcmin/+小鼠(品系002020,5)及12.4KbVilCre小鼠(品系004586，下文稱為Vi1linCre,Madison等人，J.Biol.Chem.277：33275-33283(2002))係獲自The Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME)。VEGFlox/lox小鼠(下文稱為VEGFlox)先前已被公開(Gerber等人，Development 126：1149-1159(1999))。將小鼠養在障壁設施內之微小隔離籠(micro isolator cages)中且隨意餵食。動物飼養及實驗方案係遵循聯邦法規進行且為實驗動物管理及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee)所批准。
VEGF-A在Apc min/+ 腸腺瘤中之表現
為研究VEGF-A在Apcmin/+小鼠腸腫瘤中之表現模式，吾人對14週齡小鼠之腺瘤執行原位雜交。對於此等實驗而言，如先前所述執行原位雜交(Ferrara等人，Am.J.Pathol.162：1881-1893(2003))。簡言之，將經中性緩衝福馬林固定、經脫水且經石蠟包埋之腸組織切片去除石蠟且水化，然後在37℃下於20μg/ml蛋白酶K中脫蛋白，歷時15min。使經[33P]UTP-標記之有義及反義RNA探針(riboprobe)在55℃下雜交隔夜，接著在55℃下於0.1X標準檸檬酸鹽溶液中高度嚴謹地洗滌2小時。使乾燥玻璃載片在室溫下暴露於Kodak BioMax MR自動放射攝影膠片(Eastman Kodak Co.,Rochester,NY)3天，接著浸漬於NTB2核徑跡乳膠(nuclear track emulsion)(Eastman Kodak Co.)中，在4℃下於含有乾燥劑之密封塑料載片盒中暴露28天，顯影且用(蘇木精-曙紅)H&E對比染色。如先前所述製備VEGF-A探針(Ferrara等人，Am.J.Pathol.162：1881-1893(2003))。VEGF-A探針長度為對應於NM_031836之核苷酸297-645的349個核苷酸。上引子序列為5'-CAA CGT CAC TAT GCA GAT CAT GCG(SEQ ID NO：1)；下引子序列為5'-GGT CTA GTT CCC GAA ACC CTG AG(SEQ ID NO：2)。
在此等原位雜交實驗中，與正常腸絨毛上皮相比，在上皮細胞中觀測到具有不同強度之VEGF-A表現，而在腺瘤基質細胞以及正常絨毛基質中觀測到局部突出信號(圖1A-F)。
抑制VEGF-A可降低Apc min/+ 小鼠之腫瘤負荷
為判定抗VEGF-A療法是否會有效地降低小鼠中良性腸腫瘤之腫瘤負荷，吾人用小鼠-人類嵌合形式之抗VEGF-A mAb G6-31治療Apcmin/+小鼠，以減小引起免疫反應之可能性。該抗VEGF-A mAb G6-31係源自人類Fab噬菌體庫，其如(Liang等人，J.Biol.Chem.281：951-961(2006))中所述。為產生適用於長期投與小鼠之抗體，將可變域嫁接至鼠類IgG2a恆定域。以PBS中之90-140μl體積每週一次腹膜內投與mAb G6-31(Liang等人，J.Biol.Chem.281：951-961(2006))或同型匹配對照鼠類IgG2a(抗GP120)(劑量皆為5mg/kg)。持續治療3週、6週、達1年或直至發現小鼠瀕死為止。在91±3天年齡時開始對每組5-14隻小鼠的治療。
吾人選擇mAb G6-31係由於其可有效阻斷小鼠及人類VEGF-A之能力(Liang等人，J.Biol.Chem.281：951-961(2006))。此不同於經充分表徵之抗VEGF mAb A.4.6.1，其能抑制人類VEGF-A但不抑制小鼠VEGF-A(Gerber等人，Cancer Res.60：6253-6258(2000),Liang等人，J.Biol.Chem.281：951-961(2006))。為評估mAb G6-31對腫瘤負荷之短期影響，在13週齡時開始對每隊列10隻小鼠之治療，且持續3週或6週。為測定在治療開始之年齡時的腫瘤表型，在13週齡(第0天)時分析未經治療之12隻小鼠組成的對照組。
用抗VEGF-A mAb治療3週抑或6週顯著降低Apcmin/+小鼠之總腫瘤負荷。在第0天時，Apcmin/+小鼠之平均腫瘤負荷為39.3mm3(範圍介 於12.3mm3至97.0mm3)(圖2A)。用對照IgG治療3週之小鼠的平均腫瘤負荷為96.8mm3(47.1-299.9mm3)，而用mAb G6-31治療3週之小鼠的平均腫瘤負荷為23.5mm3(4.5-58.2mm3)。此即為在mAb G6-31治療之後平均腫瘤負荷在統計學上顯著降低76%或4倍，其中p<0.008。在用對照IgG投與6週後，腫瘤負荷達到平均值198.6mm3(40.5-315.7mm3)，而用mAb G6-31治療之小鼠的腫瘤負荷仍低達28.4mm3(3.2-75.9mm3)，展現平均腫瘤負荷顯著降低86%或7倍，其中p<5.3×10-5(圖2A)。
在用mAb G6-31治療3週及6週之後腫瘤負荷之明顯減小係歸因於腺瘤大小之減小，此與腺瘤數目之減少相反。在用對照IgG治療3週之後，平均腫瘤數目為116±9個(±SEM)，而在mAb G6-31投與之後平均腫瘤數目為107±11個(p<0.28)。在用對照IgG治療6週之後，平均腫瘤數目為120±11個，而在mAb G6-31投與之後其為100±10個(p<0.09)。在第0天時，小鼠平均具有100±9個腫瘤。
為分析腫瘤大小及數目，將自腺胃至直腸之腸道縱向地切開，清洗且平展於濾紙上。在用Notox Histo固定劑(Scientific Design Laboratory Inc.,Des Plaines,IL)隔夜固定且用亞甲基藍0.1%水溶液染色之後，由對治療不知情之單一觀測者用Leica解剖顯微鏡在20倍放大率下經由目鏡標尺(ocular scale)對小腸與大腸之各腸腺瘤的數目、位置及直徑計分。藉由此方法，可靠地記錄直徑為0.3mm或以上之息肉。腫瘤體積係以半球體來計算。各小鼠之腫瘤負荷係以其腫瘤體積之總和來計算。P值係以雙尾司徒頓t測試(Student's t-test)來計算。在治療開始之年齡(13週齡)時分析未經治療之組的小鼠(第0天)作為與抗體治療之小鼠的對照。
無跡象表明在3週或6週治療期間腺瘤生長逃避抗VEGF-A治療：與用對照IgG治療之小鼠腫瘤之較寬大小分布(圖2B，從頂圖起之第二 圖及第四圖)相比，用mAb G6-31治療之小鼠的腫瘤具有較緊湊之大小分布(圖2B，中間圖及底部圖)。用對照IgG投與3週之小鼠的平均息肉直徑為1.28mm且用mAb G6-31投與3週之小鼠的平均息肉直徑為0.85mm(p<9.2×10-117)，而用對照IgG投與6週之小鼠的平均息肉直徑為1.64mm且用mAb G6-31投與6週之小鼠的平均息肉直徑為0.86mm(p<2.7×10-214)。在第0天時，平均腫瘤直徑為0.97mm。
有趣的是，抗VEGF-A治療似乎抑制所有大小之腫瘤的生長。在mAb G6-31進行3週治療之後，小腫瘤(直徑0.3-1.0mm，對於6週治療而言為0.3-1.2mm)之頻率大於對照治療組，而直徑大於1.0mm(對於6週而言>1.2mm)之腫瘤頻率發生降低(圖2C，頂部圖及中間圖)。對第0天之腫瘤大小分布的比較(圖2C，底部圖)表明腺瘤之生長在mAb G6-31投藥開始之後已基本上停止。
此外，抗VEGF-A mAb G6-31有效地抑制所有小腸區域之腺瘤生長。與對照IgG治療相比，在mAb G6-31進行3週與6週治療之後皆觀測到顯著較低之平均腫瘤直徑(圖2D)。此外，在用mAb G6-31治療之小鼠的腸第一四分之一段中之平均腺瘤直徑自小鼠中第0天時觀測到之平均腺瘤直徑顯著降低(圖2D中之雙星)。結腸腺瘤之平均腫瘤直徑的降低未達到統計顯著性(圖2D)。用mAb G6-31治療3週之小鼠的大腸息肉之平均直徑為1.3±0.3mm(±SEM)，而用對照IgG治療之小鼠的平均直徑為2.5±0.4mm，其中p<0.064。在用mAb G6-31治療6週之後大腸腫瘤之平均直徑為2.2±0.3mm，而在投與對照IgG 6週之後為2.6±0.3mm，其中p<0.37。
VEGF-A在腸上皮細胞中之刪除可減小平均腫瘤直徑
吾人接著設法剖析在Apcmin/+模型中腸上皮來源之VEGF-A對腺瘤生長的促進作用。為此，如上所述評估與藉由Cre/loxP技術在腸上皮細胞中有條件地刪除VEGF-A之小鼠(VEGFlox；Villin-Cre小鼠)雜交的 13週齡Apcmin/+小鼠之腫瘤直徑及數目。在13週齡時分析Apcmin/+；Villin-Cre及Apcmin/+；VEGFlox；Villin-Cre小鼠。
Villin(一種肌動蛋白結合蛋白且為特定化吸收細胞之刷狀緣的主要結構組分)之表現在胚胎發生期間於腸之後腸內胚層中開始，且隨後擴展遍及整個小腸及大腸內胚層(Braunstein等人，Dev.Dyn.224：90-102(2002)、Ezzell等人，Development 106：407-419(1989)、Maunoury等人，EMBO J.7：3321-3329(1988)及Maunoury等人，Development 115：717-728(1992))。在成人中，Villin分布變得分散，其中在隱窩之未成熟增殖細胞中中度頂端極化且在小腸絨毛內襯著之完全分化的細胞之刷狀緣中強極化(Robine等人，Proc.Natl.Acad.Sci.82：8488-8492(1985))。由Villin啟動子驅動之Cre重組酶(Villin-Cre)的表現先前已經由再現Villin基因在自隱窩至絨毛尖端及十二指腸至結腸之腸上皮的每一個細胞內之表現模式來表徵(Madison等人，J.Biol.Chem.277：33275-33283(2002))。
表型分析展現對照Apcmin/+；Villin-Cre小鼠之平均腫瘤直徑為1.02±0.3mm(±SEM)，而Apcmin/+；VEGFlox；Villin-Cre小鼠之平均腫瘤直徑為0.82±0.3mm(圖2E)，此表示19.8%之減小(p<7.2×10-5)。兩組之間腫瘤數目並不顯著不同。雖然Apcmin/+；Villin-Cre小鼠具有137±11個腸腺瘤，但Apcmin/+；VEGFlox；Villin-Cre小鼠具有150±17個腺瘤(p<0.27)。
此等資料指示自十二指腸至結腸及隱窩至絨毛尖端之所有腸上皮細胞中的VEGF-A之刪除導致對腫瘤生長之顯著抑制，但程度較之由全身投與抗VEGF-A抗體所產生之抑制要低。為此，此等資料表明VEGF-A之上皮外來源促進Apcmin/+小鼠腸腺瘤之生長。
抑制VEGF-A可延長Apc min/+ 小鼠之中值存活期
已知抗VEGF-A治療對腫瘤生長抑制之有效性，吾人希望研究用 mAb G6-31治療是否能產生針對Apcmin/+小鼠之長期益處。為此，持續投與mAb G6-31或對照IgG達52週或直至觀察到小鼠瀕死為止。有趣的是，mAb G6-31治療使中值存活期自對照IgG之24.0週增加至mAb G6-31之33.6週，其中對數秩和p值<2.4×10-3(圖2F)。
在32、51、64或66週齡時(分別在用mAb G6-31治療19、38、51或53週後)在施以安樂死之後分析用mAb G6-31治療之四隻小鼠的腫瘤表型。如表1中所示，平均腫瘤直徑仍為接近於19週齡小鼠中所見之水平(在用對照IgG治療6週之小鼠中為1.64mm)。類似地，腫瘤數目仍與13週齡小鼠之腫瘤數目相當(第0天組之小鼠具有59-161個腸腺瘤，平均為100個)。在組織分析中於切面處發現之15個結腸腺瘤(小鼠1-4中所鑑別之總數目)中有三個(來自表1之小鼠2、3及4中之每隻小鼠有一個)展現無惡性轉化。
總之，長期抗VEGF-A治療通常耐受性極好且產生增加之Apcmin/+小鼠存活期。此外，鑒於小鼠年齡，用mAb G6-31長期治療之小鼠的腫瘤數目及平均腫瘤直徑依然顯著較低，此與新腺瘤形成及腺瘤生長之抑制一致。
在用抗VEGF-A治療之Apc min/+ 小鼠中的正常血清總蛋白、白蛋白及甘油三酯含量以及降低之脾骨髓外造血
根據大體觀察，用mAb G6-31治療之Apcmin/+小鼠顯現比用對照 IgG治療之小鼠顯著更警覺且反應更靈敏。此外，在用對照IgG治療之動物中經常觀察到暗示有最初由Moser等人(Moser等人，Science 247：322-324(1990))所報導之進行性貧血的爪子蒼白現象，但在用mAb G6-31治療之動物中並不如此。與此觀察結果一致，以對照IgG投與之Apcmin/+小鼠的平均總血清蛋白及血清白蛋白發生降低，而用mAb G6-31治療之小鼠中總蛋白及白蛋白含量處於正常範圍內(表2)。
如關於Apcmin/+小鼠所報導(Moser等人，Science 247：322-324(1990))且與低蛋白血一致，平均甘油三酯含量在用對照IgG治療之動物中上升，但其在用mAb G6-31治療後降低至與參考值相當之水平(表2)。
儘管在治療3週或6週之後在身體質量方面無治療相關之差異性，但在用對照IgG治療之小鼠中平均脾質量顯著(p<2.3×10-3)增加。在用對照IgG投與3週之後，小鼠具有0.26g或身體質量之1.17%的平均脾質量，而在用mAb G6-31治療3週之小鼠中平均脾質量為0.11g(身體質量之0.49%)。用對照IgG治療之小鼠的平均脾質量之增加與骨髓外造血(EMH，代償性紅血球生成，在此情形下繼發腸出血)一 致，此係藉由脾之組識檢驗來證實。用對照IgG治療6週之十隻小鼠皆顯示顯著EMH，而用mAb G6-31治療之2隻小鼠具有中度EMH，五隻具有輕度EMH，且3隻在其脾中無診斷性變化。用mAb G6-31治療18-53週之五隻小鼠中的四隻經診斷在脾中具有輕度至廣泛之EMH。
在用mAb G6-31短期治療之小鼠脾中EMH之程度降低表明抗VEGF-A療法對減少腸出血具有有益效果。
在用mAb G6-31長期治療之後的腎臟變化
為研究與投與高親和力抗VEGF-A mAb G6-31有關之潛在毒性，在短期(3-6週)及長期(18-53週)治療之後針對組織學分析胰腺、肝及腎臟。對於組織學分析而言，將Notox固定之腸組織脫水且包埋於石蠟中，切片且用H&E染色以供遵循標準方案之組織學分析使用。
注意到在治療3-6週之動物中無顯著毒性。在用mAb G6-31長期治療之後，五隻小鼠皆顯示可變(輕度至重度)彌漫性全球性腎小球硬化(diffuse global glomerulosclerosis)及中度胰腺基質水腫(反映低蛋白血)。該等觀測結果與先前觀察到由mAb G6-31長期投與產生之毒性一致。重要的是，由增加之中值存活期所反映之健康狀況的整體改良效果優於不利影響。
在mAb G6-31治療後腫瘤形態改變不伴隨增殖指數之變化
為進一步表徵在用抗VEGF-A mAb G6-31治療之後的Apcmin/+小鼠之腸息肉，如上所述進行宏觀及組織分析。用mAb G6-31治療之息肉的總體形態顯著不同於用對照IgG治療之息肉的總體形態(圖3A-B)。儘管用對照IgG投藥之小鼠的腫瘤通常具有相對完整之光滑表面，但用mAb G6-31治療之動物的腫瘤在其表面上顯現有較深內陷。組織分析揭示mAb G6-31與對照IgG治療之小鼠的腫瘤為管狀腺瘤(圖3C-F)。用對照IgG治療之小鼠的腺瘤具有明顯的絨毛內上皮增殖，伴隨縱向及橫向擴張，且通常自其基底至腔面變寬2倍以上。存在最少纖維基 質。用mAb G6-31治療之小鼠的腺瘤在特徵上具有較少絨毛內上皮細胞，在腔面處不太寬，較淺，且包括較少相鄰絨毛。對兩治療組之結腸息肉的組織分析顯示帶蒂(pendunculated)管狀腺瘤，其具有豐富纖維血管基質及可變量(至多100%)之發育不良上皮。
為評估在腫瘤組織及正常黏膜中之增殖程度，執行Ki-67抗體之間接免疫組織化學染色(圖3G-J)。對於此等實驗而言，將經Notox固定、經脫水且經石蠟包埋之腸組織切片去除石蠟且水化，然後在99℃下於Target Retrieval(DAKO,Glostrup,Denmark)中培育，接著中止內因性過氧化酶活性且阻斷抗生物素蛋白及生物素(Vector,Burlingame,CA)。將切片進一步用具有3%牛血清白蛋白之PBS中的10%阻斷血清阻斷30分鐘。將組織切片與稀釋於阻斷血清中之第一抗體一起培育60min，用TBST緩衝液(DAKO)洗滌且與第二抗體一起培育30min，用TBST洗滌，且於ABC Elite Reagent(Vector)中培育30min，接著於Metal Enhanced DAB(Pierce,Rockford,IL)中培育且用邁爾蘇木精(Mayer's hematoxylin)對比染色。所用第一抗體為抗Ki-67兔多株抗體(SP6,1：200,Lab Vision,Fremont,CA)。所用第二抗體為生物素標記山羊抗兔抗體(7.5μg/ml,Vector)。所有步驟在室溫下執行。
定量分析顯示在用對照IgG抑或用mAb G6-31治療之小鼠的腫瘤中Ki-67陽性細胞之數目類似。同樣地，兩治療的正常近旁黏膜之增殖指數相當(圖3K)。增殖指數係利用Kisight檢定(Ariol Review(v2.6))自用Ariol SL50載片掃描顯微鏡系統(Applied Imaging,Inc.,San Jose,CA)獲得的腫瘤組織與正常黏膜之5μm石蠟切片影像量化。以手鑑別腫瘤組織與正常黏膜之區域且用盲化檢驗機(blinded examiner)劃定界限。量度為Ki-67陽性細胞核相對於總細胞核之百分比的增殖指數係在界定陽性臨限值後基於細胞核顏色以半自動化方式量化。增殖指數量測包括分析皆被治療6週的mAb G6-31治療組(n=3)中之29個腫瘤及 對照IgG組(n=3)中之44個腫瘤。
為判斷mAb G6-31對生長之抑制是否伴隨主要信號轉導路徑之分子部分之表現水平的變化，執行西方墨點(Western blot)分析。以解剖刀採集mAb G6-31及對照抗體治療之小鼠的空腸腺瘤與正常近旁黏膜且將其於RIPA溶胞緩衝液中以OMNI TH115均質器機械地均質化。所用第一抗體為抗p38 MAPK、磷光體-p38 MAPK、p42/p44 MAPK、磷光體-p42/p44 MAPK、PTEN、Akt、磷光體-Akt及磷光體-GSK3α/β之兔多株抗體(皆為1：1000,Cell Signaling,Danvers,MA)。所用第二抗體為辣根過氧化物酶接合抗兔抗體(1：5000,Chemicon)。
儘管在用mAb G6-31治療之後所測試之許多分子的表現水平無變化，但觀測到在四個腫瘤樣品中有三個樣品之磷光體-p38 MAPK含量相對於見於正常黏膜之彼等者而言適當恢復(圖3L；p-p38，將T5-T8與N5-N8比較)。
mAb G6-31治療之腫瘤之血管密度降低
已知VEGF-A為利用VEGFR-2信號轉導之血管內皮細胞的有絲分裂原，吾人藉由以抗CD31抗體對厚組織切片進行免疫組織化學染色來檢驗用Mab G6-31及對照IgG治療之小鼠的腫瘤血管網路(圖4A-B)。出於共焦顯微鏡成像目的，將小鼠在異螢烷(isofluorane)麻醉之情況下以PBS中之1%聚甲醛(PFA)灌注固定，將腸道平展於濾紙上，用4% PFA後固定，且在4℃下浸沒於PBS中之30%蔗糖中隔夜，然後包埋於O.C.T.中且以乾冰冷凍。切割80μm之冷凍切片(Cryosections)，將其於4% PFA中固定10min，用PBS中之0.2% Triton-X-100滲透化，且用具有0.2% Triton-X-100之PBS中之5%正常山羊血清阻斷30min。將阻斷緩衝液中之第一抗體培育隔夜，將第二抗體培育5-6h，用PBS洗滌且用Hoechst 33342(0.5mg/ml；Sigma,St.Louis,MO)對比染色。所用第一抗體為抗CD31倉鼠單株抗體(1：500,Chemicon,Temecula,CA)、 抗E-鈣黏附蛋白(cadherin)大鼠單株抗體(1：2500,Zymed,South San Francisco,CA)及抗平滑肌肌動蛋白之Cy3接合小鼠單株抗體(1：1000,Sigma)。所用第二抗體為Cy5接合抗美國倉鼠抗體(1：500,Jackson Immunoresearch,Cambridgeshire,UK)及ALEXA 488接合抗大鼠抗體(1：500,Molecular Probes,Eugene,OR)。
Apcmin/+小鼠之腫瘤的血管密度係以Zeiss Axioplan2螢光顯微鏡(Thornwood,NY)自用CCD攝影機獲得之數位影像量化。四組中之每一組(用對照IgG或mAb G6-31治療3週或6週之小鼠)由2隻小鼠組成，且分析各組之11-22個腫瘤。80-μm腫瘤切片之血管面積係使用ImageJ v.1.36(http：//rsb.info.nih.gov/ij/)經由對CD31陽性螢光進行基於臨限值之分割來計算。接著將血管密度計算為CD31陽性像素與總腫瘤面積之比率。對各組之所有腫瘤的值求平均值以得到該組的平均值。
血管密度之量化顯示：與對照IgG治療之小鼠中所見相比，mAb G6-31治療之小鼠的腫瘤之血管成分得到減少(圖4C)。在用對照IgG投與3週之後，平均腫瘤血管面積密度為23.2%，而在投與mAb G6-31後其得以減少至18.6%。用對照IgG治療6週之腫瘤的平均血管面積密度為25.5%，而用mAb G6-31治療之小鼠的腫瘤之平均血管面積密度為19.7%。
討論
吾人使用Apcmin/+小鼠來研究VEGF-A在良性腸腫瘤形成中之作用。在第一部分中，對實驗進行設計以量測短期及長期抗VEGF-A治療對經歷迅速生長之既定腸腺瘤的影響。已顯示用抗VEGF-A mAb G6-31治療顯著降低Apcmin/+小鼠之腫瘤負荷且延長其存活期。
已針對膳食及化學治療劑(包括非甾類抗炎藥物(NSAID))對Apcmin/+小鼠腫瘤負荷之影響執行若干研究(綜述於Corpet等人，Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.12：391-400(2003))，其更新列表 存在於http：//corpet.net/min。該等研究中有許多報導腫瘤數目之顯著減少。除選擇性COX-2抑制劑(諸如賽利克西(Jacoby等人，Cancer Res.60：5040-5044(2000))及A-285969(Wagenaar-Miller等人，Br.J.Cancer 88：1445-1452(2003)))以外，靶向COX-1及COX-2之NSAID(諸如吡羅昔康(piroxicam)及舒林酸(sulindac))已在抑制Apcmin/+小鼠之腫瘤形成的最有效藥劑之列(Boolbol等人，Cancer Res.56：2556-2560(1996)、Chiu等人，Cancer Res.57：4267-4273(1997)、Hansen-Petrik等人，Cancer Lett.175：157-163(2002)、Ritland等人，Carcinogenesis 20：51-58(1999))。亦已成功地使用組合療法來減少腫瘤數目。Torrance等人利用特異性表皮生長因子受體抑制劑EKI-785與舒林酸之組合，且顯示腫瘤數目近於完全清除(Torrance等人，Nat.Med.6：1024-1028(2000))。類似地，化學治療劑雷替曲塞(raltitrexed)(RTX)及5-氟尿嘧啶(FU)之聯合效應使得Apcmin/+腫瘤數目顯著(37%)減少(Murphy等人，Cancer Biol.Ther.3：1169-1176(2004))。近來，受體酪胺酸激酶(RTK)抑制劑AZD2171之短期投與顯示在Apcmin/+模型中腫瘤負荷降低(Goodlad等人，Carcinogenesis 27：2133-2139(2006))。注意到用AZD2171開始早期治療(在6週時)能夠減少腫瘤數目，而後來介入(在10週時)僅減小腫瘤大小(Goodlad等人，同上文)。然而，治療對血管密度無影響(Goodlad等人，同上文)。AZD2171抑制若干RTK，包括(但不限於)VEGFR-1、VEGFR-2及VEGFR-3(Wedge等人，Cancer Res.65：4389-4400(2005))。
吾人觀察到在13週時投與之抗VEGF-A mAb G6-31並不減少現有腫瘤之數目，但其減小腫瘤大小且顯現抑制新腺瘤形成。該等結果與所觀察到之存活期增加有關。然而，吾人相信抗VEGF特異性腫瘤預防途徑(就早期治療開始而言)有可能比吾人研究中所使用之腫瘤介入途徑(就後來治療開始而言)潛在地更有效減少腫瘤數目。無論如何， 抗VEGF特異性抑制在腫瘤生長之所有階段時係有效的。
吾人研究最終顯示在Apcmin/+模型中靶向VEGF-A足以獲得深遠的治療效果。將Apcmin/+；VEGFlox；Villin-Cre小鼠中僅在腸上皮室中的Mab G6-31之系統性VEGF-A抑制與VEGF-A之基因刪除比較表明：除上皮細胞以外，VEGF-A之其他細胞來源亦在Apcmin/+腺瘤生長中起重要作用。VEGF-A之此等其他來源潛在包括單核細胞(Sunayama等人，Carcinogenesis 23：1351-1359(2002))及基質纖維母細胞(Seno等人，Cancer Res.62：506-511(2002)；Williams等人，J.Clin.Invest.105：1589-1594(2000))。吾人之原位分析指示腺瘤及正常絨毛內之外上皮VEGF-A表現，其證明該觀察結果。
基於大量資料，可以相信許多所觀察到的mAb G6-31之抗腫瘤效應係藉由抑制血管生成來調節(Wise等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 96：3071-3076(1999),Zachary等人，Cardiovasc Res.49：568-581(2001))。實際上，在腫瘤異種移植研究中已觀察到響應於抗VEGF-A單株抗體的血管供應減少(Borgstrom等人，Prostate 35：1-10(1998))。與此一致，與用對照IgG治療之小鼠的腫瘤相比，在投與mAb G6-313週及6週之後觀察到Apcmin/+腸腺瘤之血管面積密度的降低。
據觀察在抑制VEGF-A之後小於1mm之腺瘤的顯著積聚表明在Apcmin/+小鼠腸腺瘤中，血管生成轉換可能先於通常對於腫瘤發展所認為之血管生成轉換發生，後者如Apcβ716模型中所見(Seno等人，Cancer Res.62：506-511 2002))。
吾人研究之重要且意外的結論為靶向單一血管生成因子之抗血管生成單一療法可極其有效地抑制腫瘤生長且可產生存活期益處。此似乎與主要自惡性腫瘤之研究收集的觀點不同，該療法之主要益處為使腫瘤血管"標準化"以有助於化學療法之傳遞(Jain等人，Nat.Med.7：987-989(2001))。可以相信良性腫瘤達到可能導致治療抗性之突變 的傾向降低可至少部分地說明該差異。因此，吾人之資料表明在無需化學治療劑之情況下非手術治療良性腫瘤的可能性。
實例2.抗VEGF-A單株抗體在小鼠多發性內分泌瘤模型中抑制垂體腺瘤之生長且降低血清泌乳素及生長激素含量
多發性內分泌瘤(MEN)為特徵為涉及兩個或兩個以上內分泌腺之腫瘤病之發生的病症。當鑑別在甲狀旁腺、胰小島細胞及垂體前葉中腫瘤病之並同發生時將患者與MEN 1型(MEN1)列為一類。發現MEN1基因之突變為該病症之基礎，其通常導致蛋白多發性內分泌腺瘤蛋白(menin)之截短或缺乏(綜述於Pannett等人，Endocr.Relat.Cancer 6：449-473(1999))。隨著另外發現腫瘤中其餘等位基因之頻發損失，(Bystrom等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 87：1968-1972(1990),Debelenko等人，Cancer Res.57：2238-2243(1997),Larsson等人，Nature 332：85-87(1988))將MEN1歸類為腫瘤抑制基因。儘管MEN1主要係體染色體顯性病症遺傳，但已將MEN1基因之新突變斷定為MEN1偶發病例之病因。
多發性內分泌腺瘤蛋白之功能很大程度上依然未知。已提出被廣泛表現、主要集中於核之具有610個胺基酸之蛋白經由其在活體外與上述路徑之蛋白部分相互作用而與轉錄調節、DNA加工及修復以及細胞骨架組織有關(綜述於Agarwal等人，Horm.Metab.Res.37：369-374(2005))。然而，迄今為止並無經鑑別之蛋白質相互作用提供對於MEN1中之致瘤性的解釋。
治療胰腺腫瘤(其中50%以上為胃泌素瘤且10-30%為胰島素瘤)之現行標準在胃泌素瘤之情況下為降低基礎酸排出量，而手術被視為胰島素瘤之最佳治療。垂體腫瘤之治療視激素概況而定由選擇性手術與不同藥物療法組成，而甲狀旁腺腫瘤之確定性治療為手術移除過度活躍的腺體。然而，甲狀旁腺切除之程度與時機存在可變性(綜述於 Brandi等人，J.Clin.Endocrinol.Metab.86：5658-5671(2001)中)。產生診療MEN1之新方法的最近發展近來已有綜述(Viola等人，Curr.Opin.Oncol.17：24-27(2005))。
經由同源重組，已靶向小鼠基因Men1之外顯子3-8使其刪除(Crabtree等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：1118-1123(2001))。據報導，年齡達9個月時，雜合Men1小鼠產生胰小島病變，另外經常觀察到甲狀旁腺腺瘤。年齡達16個月時，觀察到胰小島、甲狀旁腺、甲狀腺、腎上腺皮質與垂體中之較大、較多之腫瘤(Crabtree等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 98：1118-1123(2001))，特徵顯著類似於人類病症。
存在有充分證據表明當抗VEGF-A方法被用於治療各種源自人類惡性癌細胞株之臨床前模型(綜述於Geber等人，Cancer Res.60：2178-2189(2000)中)時阻斷VEGF-A介導之血管生成產生腫瘤抑制作用(Gerber等人，Cancer Res.60：6253-6258(2000),Holash等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：11393-11398(2002),Millauer等人，Nature 367：576-579(1994),Prewett等人，Cancer Res.59：5209-5218(1999),Wood等人，CancerRes.60：2178-2189(2000))。然而，腫瘤異種移植物不良地再現天然環境中之腫瘤發展。此外，迄今未曾嘗試將抗VEGF-A抗體療法用於抑制良性腫瘤、內分泌來源之腫瘤的生長。為研究VEGF-A在內分泌組織特異性腺瘤發展中之作用，吾人檢驗抗血管生成療法對天然產生之非惡性腫瘤模型、Men1+/-小鼠MEN1模型之效應。在用例示性VEGF-特異性拮抗劑，即抗VEGF-A單株抗體(mAb)短期治療之後分析Men1+/-小鼠之垂體腺瘤以及Balb/c裸小鼠之皮下垂體腫瘤移植物的腫瘤體積。此外，研究藉由抗VEGF-A mAb降低與MEN1相關之高激素含量的可能性。
對於下述實驗而言，Men1+/-小鼠(品系004066)係獲自Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME)，且Balb/c裸小鼠係得自Charles River Laboratories Inc.(Wilmington,MA)。混合129-FVB背景之實驗Men1+/-雌性小鼠係藉由Men1+/-雄性與雌性雜交來獲得。將小鼠養在障壁設施內之微小隔離籠中且隨意餵食。動物飼養及實驗方案係遵循聯邦法規進行且為實驗動物管理及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee)所批准。
mAb G6-31治療抑制Men1 +/- 垂體腺瘤之生長
為研究抗VEGF-A療法是否會有效抑制垂體腺瘤之生長，使125隻年齡為11個月至13個月的雌性Men1+/-小鼠經受MRI以確認小鼠具有垂體腫瘤。又在之後14天及28天使具有腫瘤之小鼠經受成像以確定腺瘤之生長速率。一隊列在研究開始時具有12.4%平均腫瘤生長/天及15.58±4.0mm3(±SEM)平均腫瘤體積之9隻小鼠接受對照IgG，且一隊列在研究開始時具有10.2%平均腫瘤生長/天及16.70±5.7mm3平均腫瘤體積之8隻小鼠接受抗VEGF-A mAb G6-31歷時67天或直至發現小鼠瀕死為止。對於用mAb G6-31及對照IgG抗體治療而言，抗VEGF mAb G6-31(Liang等人，J.Biol.Chem.281：951-961(2005))或同型匹配對照IgG(抗GP120)之5mg/kg腹膜內注射係每週一次以PBS中之100-200μl體積給予。具有原位垂體腺瘤之8隻(mAb G6-31)或9隻(對照IgG)Men1+/-小鼠的投藥係在年齡為13.5-14.5個月時開始且持續67天或直至發現小鼠瀕死為止。具有皮下垂體腺瘤移植物之23隻(對照IgG)或35隻(mAb G6-31)Balb/c裸小鼠的治療係在移植後4個月開始且持續35天或直至發現小鼠瀕死或腫瘤體積達到3000mm3之體積為止。
每2週藉由MRI使動物經受成像以追蹤活體內垂體腺瘤生長。MRI影像係以9.4 T水平穿孔磁鐵(Oxford Instruments Ltd.,Oxford,UK)獲取且係由Varian Inova控制台(Varian,Inc.,Palo Alto,CA)使用供傳輸及接收使用之3cm體積型線圈(Varian,Inc.)來控制。以4秒之重複時 間、8之回波列長度、12ms之回波間隔、48ms有效回波時間及6個平均來採用快速自旋回波成像序列。影像矩陣為1282，其中視野為(20mm)2且薄片厚度為0.5mm。在醫用空氣中用2%異氟烷使小鼠以俯臥姿勢受束縛，且以直腸探針監測體溫並藉由溫暖空氣使其保持在37℃下歷時15分鐘影像採集之持續時間。在成像之後，使動物在受熱表面上恢復，接著使其返回至飼養設施。原發垂體腫瘤體積係使用以Analyze軟體(AnalyzeDirect,Inc.,Lenexa,KS)繪製之受關注三維區域根據MRI資料計算。
在治療之39天時，與對照IgG治療之組相比，在mAb G6-31治療之組中觀察到平均垂體腫瘤體積之統計顯著性降低(圖5A)。在研究終點(第67天)時，在mAb G6-31治療後平均腫瘤體積統計顯著性地降低72%或3.7倍，其中p值小於0.016。儘管多數(9隻中之6隻)對照IgG治療之Men1+/-腫瘤在整個治療期持續強力生長，但8個mAb G6-31治療之垂體腺瘤中7個的生長明顯減慢(圖5B)。在研究終點之前由於健康不良將四隻對照IgG治療之小鼠及3隻mAb G6-31治療之小鼠施以安樂死，包括將一隻對照IgG治療之小鼠在治療第25天時在成像前施以安樂死。與用對照IgG治療之小鼠相比，無腫瘤倍增存活期在mAb G6-31治療之組中顯著增加，其中對數秩和p<0.019(圖5C)，此表明抑制垂體腫瘤生長可改良彼等小鼠之健康狀況。在mAb G6-31治療組中2隻小鼠之腫瘤體積在治療之第67天時尚未倍增。
抗VEGF-A抗體抑制皮下垂體腺瘤移植物之生長
為測試抗VEGF-A抗體治療對Men1+/-垂體腺瘤移植模型之功效，根據下列程序在6-8週齡雌性Balb/c裸小鼠側腹中建立皮下腫瘤。對於此等實驗而言，自Men1+/-小鼠取得單個原位垂體腺瘤且將其切碎成約1mm3塊，將其與BD Matrigel基質基底膜(Matrix Basement Membrane)(BD,Bedford,MA)混合，且以200μl體積皮下地接種至 Balb/c裸小鼠之背部側腹。四個月後，取出單個皮下腫瘤(近似體積為900mm3)，將其切碎，與Matrigel混合且如前所述進行接種以建立一隊列具有垂體腺瘤移植物之小鼠。
皮下垂體腺瘤移植物之腫瘤大小係用測徑規工具(Fred V.Fowler Co.Inc.,Newton,MA)藉由收集最大腫瘤直徑及垂直於該直徑之直徑來量測。腫瘤體積係使用以下公式計算：V=πab2/6(a=最大腫瘤直徑，b=垂直直徑)。
使用上述方法使一隊列在治療開始時具有515±42mm3平均腫瘤體積之35隻小鼠接受mAb G6-31，且使一隊列在研究開始時具有527±64mm3平均腫瘤體積之23隻小鼠接受對照IgG歷時35天。在研究終點時，對照IgG治療之腫瘤的體積幾乎增加至原來的4倍，平均達至2071±152mm3，而在mAb G6-31治療之小鼠中腫瘤生長基本上停止；在第35天時平均腫瘤體積為556±89mm3(圖5D)。在mAb G6-31治療後平均腫瘤體積統計顯著性地降低73%或3.7倍，其中p<1.9×10-12。
該等資料證實抗VEGF-A mAb G6-31同樣有效地抑制易受Men1雜合性影響之垂體腺瘤及皮下垂體腺瘤移植物之生長。
VEGF-A、VEGFR-1及VEGFR-2在正常垂體腺及垂體腫瘤組織中之表現
為研究VEGF-A、VEGFR-1及VEGFR-2在垂體組織中之表現水平且為檢驗其表現水平是否受到mAb G6-31治療之影響，吾人對VEGF-A、VEGFR-1及VEGFR-2在5個對照IgG治療(平均體積：96.2±8.7mm3)及5個mAb G6-31治療(35.2±4.0mm3)之原位垂體腺瘤以及5個年齡匹配之未經治療之小垂體腺瘤(9.7±2.9mm3)、四個年齡匹配之正常垂體腺(來自Men1+/-小鼠)及8個年齡匹配之野生型垂體腺樣品中的平均相對表現進行比較。亦研究5個對照IgG治療之垂體腺瘤移植物(平均體積：2063±205mm3)及5個mAb G6-31治療之垂體腺瘤移植物(平 均體積：577±45mm3)的VEGF-A、VEGFR-1及VEGFR-2表現。
對於此等實驗而言，根據製造商方案使用RNeasy套組(Qiagen,Hilden,Germany)，自閃凍垂體腺瘤或正常垂體腺製備不含DNA之總RNA。藉由SuperScript III鉑一步式qRT-PCR套組(Invitrogen,Carlsbad,CA)、100ng總RNA、45nM各PCR引子及12.5nM Taqman探針以50μl總體積執行一步式定量RT-PCR。為偵測關注基因之表現，使用以下TaqMan基因表現檢定引子及探針混合物(Applied Biosystems,Foster City,CA)：VEGF-A(檢定ID：Mm00437304_m1)、VEGFR-1(檢定ID：Mm00438980_m1)及VEGFR-2(檢定ID：Mm00440099_m1)。GAPDH表現係使用內部設施(in-house facility)內合成之引子及Taqman探針(前向引子序列：ATGTTCCAGT ATGACTCCAC TCACG(SEQ ID NO：3)；反向引子序列：GAAGACACCA GTAGACTCCA CGACA(SEQ ID NO：4)；Taqman探針序列：AAGCCCATCA CCATCTTCCA GGAGCGAGA(SEQ ID NO：5))來偵測。
使用Applied Biosystems 7500即時PCR系統在下列條件下進行反應：逆轉錄步驟(在48℃下15分鐘)、接著變性步驟(在95℃下2分鐘)及40個在95℃下15秒與在60℃下1分鐘之週期。各樣品中之基因表現水平係藉由相對量化方法(ddCt法)使用GAPDH基因作為內因性對照且使用小鼠胎盤總RNA(Clontech,Mountain View,CA)作為參照來測定。
值得注意的是，與來自野生型或Men1+/-小鼠之經對照IgG治療之垂體腫瘤、未經治療之小腫瘤及正常垂體腺相比，VEGF-A之平均相對表現在mAb G6-31治療之原位腺瘤中顯著升高(圖6)。VEGF-A表現在兩皮下腫瘤移植物樣品中同等較高。在mAb G6-31治療之腫瘤中所觀察到的高水平之VEGF-A轉錄可能為VEGF-A被mAb G6-31系統性隔離之代償機制的結果。然而，似乎增加之VEGF-A不足以促使腫瘤生長。
儘管在不同組織樣品內VEGFR-1之平均相對表現顯現適當地無變化，但與來自野生型及Men1+/-小鼠之腫瘤移植物、未經治療之小腫瘤或正常垂體腺中所見者相比，VEGFR-2之平均相對表現在用對照IgG或mAb G6-31治療之原位腫瘤樣品中似乎降低(圖6)。
MRI允許活體內追蹤腫瘤生長
如前所述使用MRI藉由使動物隔週經受成像來追蹤整個治療期間之原位垂體腺瘤的生長。來自一隻對照IgG治療之Men1+/-小鼠及一隻mAb G6-31治療之小鼠的具有代表性腺瘤之大腦冠狀面的圖展示於圖7中，該等圖係在治療開始後第9天、第39天及第67天取得。
垂體及胰腺腫瘤之組織結構
在mAb G6-31及對照IgG治療之小鼠中Men1+/-垂體腺腺瘤在組織學上係類似的(圖8A-B)。對於此等實驗而言，將經福馬林固定之組織脫水且包埋於石蠟中，切片，且用蘇木精-曙紅(H&E)染色以便遵循標準方案進行組織分析。通常，腫瘤細胞係小的(直徑約10微米)，具有高細胞核/細胞質比率，往往具有有絲分裂活性，每10個625微米直徑之視野達40個有絲分裂像(mitotic figure)。腫瘤不定地為實體或囊性，具有多根鋪襯有內皮細胞之血管、急性出血區域(在非內皮細胞鋪襯之空間內的完整紅血球，缺乏血纖蛋白或細胞組織)及與先前出血一致之充滿擴散血鐵質之巨噬細胞。存在可變單細胞壞死及最少纖維化。腫瘤血管被無規律地隔開，通常在直徑上隔開5-10微米，但在幾乎無非腫瘤血管周基質細胞之情況下很少地大至50微米。
藉由全內皮細胞標誌抗體MECA-32之間接免疫組織化學染色來觀察對照IgG治療之腫瘤與mAb G6-31治療之腫瘤之間的血管型式(圖8C-D)。對於此等實驗而言，將經福馬林固定、石蠟包埋之組織切片去除石蠟，然後中止內因性過氧化酶活性且阻斷抗生物素蛋白及生物素(Vector,Burlingame,CA)。將切片用具有3% BSA之PBS中的10%正 常兔血清阻斷30分鐘。接著將組織切片與第一抗體一起培育60分鐘，與生物素標記第二抗體一起培育30分鐘，且在ABC試劑(Vector,Burlingame,CA)中培育30分鐘，接著在Metal Enhanced DAB(Pierce,Rockford,IL)中培育5分鐘。接著將切片用邁爾蘇木精對比染色。所用第一抗體為山羊抗小鼠泌乳素(0.10μg/ml)(R&D systems,Minneapolis,MN)及大鼠抗小鼠全內皮細胞抗原、純系MECA32(2μg/ml)(BD Biosciences,San Jose,CA)。所用第二抗體為生物素標記兔抗山羊抗體(7.5μg/ml)(Vector,Burlingame,CA)及生物素標記兔抗大鼠抗體(2.5μg/ml)(Vector,Burlingame,CA)。全內皮細胞抗原染色需要在99℃下用Target Retrieval(Dako,Carpenteria,CA)預處理20分鐘。所有其他步驟係在室溫下進行。
藉由mab G6-31治療使血管密度顯著降低至對照IgG治療之腫瘤之血管密度的46%(p值=0.009；圖8I)。在兩治療組中，腫瘤血管分布少於正常近旁垂體前葉中之血管分布。為量化血管密度，用Ariol SL-50載片掃描平臺(Applied Imaging；San Jose,CA)使用10×物鏡來分析MECA-32染色之切片。鑑別垂體腫瘤區域且以手劃定界限。確定對應於MECA-32染色之像素顏色，且相應量測血管面積。腫瘤細胞核係藉由像素顏色及物體形狀來鑑別。接著使血管面積正規化為垂體腫瘤細胞數目。類似地分析胰小島，但使MECA-32染色面積正規化為小島腫瘤面積。
除垂體腫瘤以外，常在經治療之Men1+/-小鼠中鑑別胰小島腫瘤且在研究終點時進行組織分析。小島腫瘤(按切面內大於105μm2界定)通常為實體的，無顯著出血或壞死。用抗VEGF-A mAb G6-31治療之6隻動物的腫瘤(n=32個腫瘤)之平均面積僅為用對照IgG治療之5隻動物的腫瘤(n=45個腫瘤；p值=0.026)之平均面積的39%。用對照IgG治療之胰腺腺瘤(圖8E-F)顯現比mAb G6-31治療之腺瘤(在切面內 腫瘤直徑達5.0mm)大體較大(在切面內達7.0mm)及較多的血管。在用對照IgG治療之7隻小鼠中的四隻中，胰腺腫瘤含有擴張、充血、薄壁、內皮細胞鋪襯之空間，其在直徑上達300μm，而在mAb G6-31治療之小鼠中胰腺腺瘤常缺乏明顯血管分布(圖8G-H)。來自用mAb G6-31治療之8隻小鼠中的一隻小鼠之胰腺腫瘤顯現擴張血管。自任一治療之胰腺腫瘤中間歇地發現充滿血鐵質之巨噬細胞，此暗示小島出血。
藉由G6-31治療使小島腫瘤之血管密度顯著降低至對照IgG治療之小島腫瘤之血管密度的56%(p值=2*10-7)。而且來自Mab G6-31治療之小鼠的"正常"小島(在切面內小於105μm2)具有以較小幅度降低至對照IgG治療動物之血管密度之76%的血管密度(p值=4*10-7；見圖8J)。用對照IgG治療之單隻雄性動物具有單個12mm直徑之腎上腺皮質腫瘤，其為一種在MEN1症候群腺中識別之腫瘤類型。
皮下垂體腺瘤移植物之組織結構與原位垂體腫瘤之組織結構相當，此表明在遠端基因座處內分泌腫瘤生長之成功再現。
Men1垂體腺瘤為泌乳素瘤
在MEN1患者中約60%的垂體腺瘤分泌泌乳素(PRL)，少於25%分泌生長激素(GH)且5%分泌促腎上腺皮質激素(ACTH,Trump等人，QJM 89：653-669(1996))。為研究Men1+/-小鼠之垂體腺瘤是否分泌PRL，針對對照IgG及mAb G6-31治療之原位垂體腺瘤以及垂體腫瘤移植物進行免疫組織化學染色。6個對照IgG治療之垂體腺瘤中之6個及5個mAb G6-31治療之垂體腺瘤中之5個在約50-95%細胞中對泌乳素顯示特異性、陽性染色，從而確定其為泌乳素瘤(圖9A-9B)。與此結果一致，Crabtree等人報導在免疫組織化學染色中Men1TSM/+原發腫瘤對PRL呈陽性(Crabtree等人，Proc.Natl.Sci USA 98：1118-1123(2001))。泌乳素染色對於任一治療之垂體腺瘤移植物亦為陽性(圖9C-9D)。與 自此等腫瘤功能性分泌泌乳素一致，具有經移植垂體腺瘤之雌性小鼠中的乳腺組織在對照IgG及抗VEGF-A治療之動物中總是顯示中度至顯著之泌乳變化(圖9E、圖9F)。
如由免疫組織化學染色所評估，11個未經治療之原發垂體腫瘤中有6個對生長激素局部地且微弱地呈陽性(圖14A)，而四個移植垂體腫瘤中僅一個顯示局部輕度之染色(圖14B)。生長激素表現存在於G6-31及對照IgG治療之原位垂體腫瘤(圖6C、圖6D)中。正常垂體前葉在約20-30%細胞中顯示強反應性(圖14A)。
血清泌乳素含量在未經治療及對照IgG治療之小鼠中與垂體腫瘤體積相關且藉由mAb G6-31治療而降低
藉由免疫組織化學分析已知自Men1+/-小鼠檢驗之所有對照IgG與所有mAb G6-31治療的垂體腺瘤對泌乳素呈陽性，吾人研究血清PRL含量是否在具有Men1+/-垂體腺瘤之小鼠中升高。為此，吾人最初分析46隻未經治療之雌性Men1+/-小鼠的垂體腫瘤狀況及血清PRL含量以及5隻雌性野生型同窩仔對照者之血清PRL含量。藉由Harbor UCLA之National Hormone & Peptide Program(Torrance,CA)分析血清泌乳素量。
該等小鼠之年齡範圍為15.6個月至10.5個月，平均年齡為13.3個月。在野生型小鼠中平均血清PRL含量為43.8±25.3(±SEM)ng/ml。在MRI分析中46隻Men1+/-小鼠中27隻不具有可偵測之垂體腫瘤。在此等小鼠中平均血清PRL含量為69.0±24.6ng/ml。一組10隻小鼠具有小垂體腫瘤，其平均體積為1.7±0.6mm3。在此等小鼠中，血清PRL含量升高至188.7±61.9ng/ml之平均值。具有大垂體腫瘤(平均體積83.1±23.8mm3)之9隻小鼠具有平均為13239.8±3466.5ng/ml之血清PRL。此等資料表明在Men1+/-小鼠中血清PRL含量與垂體腫瘤體積正相關(圖10A)，其中Pearson相關係數R=0.94，此表明血清PRL含量可在確立垂 體腫瘤狀況之評估時適用作診斷工具。
為檢驗抗VEGF-A治療是否對血清PRL含量有影響，吾人分析7隻對照IgG及7隻mAb G6-31治療的具有原位垂體腺瘤之Men1+/-小鼠在研究終點(第67天)時之血清。在對照IgG治療之小鼠中，平均血清PRL含量升至12566.7±3047.4ng/ml且通常隨腫瘤體積(平均值為116.2±18.5mm3)增加而增加，其中R=0.80(p<0.03)。然而，在所分析的mAb G6-31治療之Men1+/-小鼠中，血清PRL含量保持較低，為5163.7±1608.9ng/ml，顯然與腫瘤體積(平均腫瘤體積35.3±6.5mm3)無統計學相關性，R=-0.12，其中p<0.80(圖10B)。但此等數據表明與對照IgG治療之小鼠相比，當mAb G6-31抑制垂體腺瘤生長時，其亦導致平均血清PRL降低，其中p<0.053。
抗VEGF-A治療在具有皮下垂體腫瘤移植物之小鼠中降低血清PRL含量
儘管上述資料指示抗VEGF-A抗體治療在具有腫瘤之Men1+/-小鼠中降低血清PRL含量，但吾人在皮下垂體腺瘤移植物之情況下於Balb/c裸小鼠中對此作進一步研究。量測源自23隻對照IgG治療之小鼠與35隻mAb G6-31治療之小鼠之樣品的血清PRL，其中該等樣品係在治療開始(第1天)時及在研究終點(第35天)時採集。儘管第1天時之平均血清PRL在兩治療之間係相當的，但第35天時，mAb G6-31治療使血清PRL含量顯著降低(分別參見圖10C及圖10D)。
由於MEN1泌乳素瘤之目前治療包括藥物療法或選擇性垂體切除術接著進行放射療法，故表明mAb G6-31治療導致降低PRL血清含量且顯著抑制腫瘤生長之吾人資料向MEN1患者提供一種潛在性新治療方法。
血清胰島素含量在Men1 +/- 小鼠中升高
為檢驗血清胰島素含量是否在Men1+/-小鼠中升高，分析經對照 IgG治療之6隻非禁食小鼠及經mAb G6-31治療之6隻非禁食小鼠的血清樣品，該等小鼠皆在組織分析中經鑑別具有胰腺病變。亦根據製造商說明(Mercodia,Uppsala,Sweden)使用超敏性小鼠胰島素ELISA套組分析5隻非禁食、年齡匹配之野生型小鼠的血清胰島素含量。然而觀察到與治療無相關性，與野生型小鼠(1.4±0.7ng/ml(±SEM))相比，平均血清胰島素在Men1+/-小鼠(對照IgG,3.8±2.6ng/ml；mAb G6-31,3.7±2.4ng/ml)中顯著升高。
討論
吾人資料指示在MEN1小鼠模型中對於良性垂體腺腺瘤之生長而言VEGF-A係需要的，此係因為據顯示，使用抗VEGF-A之單株抗體之療法足以抑制腫瘤生長。
基於可獲文獻，許多所觀察到的mAb G6-31之抗腫瘤效應有可能係藉由抑制VEGFR-2-依賴性血管生成來調節(Wise等人，Proc.Natl.Acad.Sci.96：3071-3076(1999)及Zachary等人，Cardiovasc.Res.49：568-581(2001))。儘管VEGFR-2 mRNA在大垂體腺瘤中之相對平均表現不受抗VEGF-A治療之顯著影響(圖6)，但MECA-32之免疫組織化學染色顯示經Mab G6-31治療之垂體及胰腺腫瘤的血管分布極其顯著地減少(減少約50%)。對於垂體及胰腺腺瘤皆注意到抗VEGF-A治療之腫瘤生長的相應降低。藉由抗VEGF-A治療亦顯著降低正常胰小島之血管密度，儘管變化幅度(自對照IgG治療降低25%)小於胰腺腺瘤中所見者。
在Mab G6-31治療之腫瘤中所觀察到的高水平之VEGF-A轉錄可能為VEGF-A被Mab G6-31系統性隔離之代償機制的結果。然而，似乎該等增加之VEGF-A不足以促使腫瘤生長。
除顯示抗VEGF-A mAb G6-31治療之單一療法藉由有效抑制腺瘤生長而顯著降低Men1+/-小鼠之腫瘤負荷以外，吾人顯示血清泌乳素 含量亦得到降低。因此，吾人資料表明在不使用化學治療劑之情況下藉由中止疾病進展而非手術治療內分泌良性腫瘤的可能性。或者，該VEGF-A阻斷可與藥理學藥劑組合。舉例而言，對於泌乳素分泌腺瘤而言，VEGF-A拮抗劑可與多巴胺促效劑組合。
實例3.在多階段癌發生之RIP-TßAg模型中的抗VEGF介入功效及消退/存活期功效
為了更好地瞭解抗VEGF療法在腫瘤生長之各個期中的作用，吾人轉向若干臨床前腫瘤模型，包括RIP-TβAg。RIP-TβAg(Exelixis,Inc.)為由SV40大T抗原(TAg)(靶向胰腺β細胞，其中TAg藉由結合p53及Rb而充當有力之致癌基因)之轉殖基因表現驅動的小鼠胰小島腫瘤模型之條件變型。RIP-TβAg之表型類似於先前已有描述之RIP-TAg模型(Hanahan,Nature 315：115-122(1985)；Bergers等人，Science 284(808-811),1999)。吾人已發現此模型經由一系列漸具攻擊性之階段(包括在約5週時VEGF信號轉導之活化及"血管生成轉換"(亦即形成新血管過程之開始))發展。達10週時形成小腫瘤，此與其惡性轉化之開始一致。達12週時形成較大侵襲性癌瘤。因此，在10週齡之前，小鼠中之細胞生長不被視為惡性或轉移性的。介於10週齡至12週齡之間的時期通常包括侵襲性癌症之形成。
對於此等實驗而言，根據標準IACUC建議來飼養及治療RIP-TβAg小鼠，向小鼠提供高糖飼料及5%蔗糖水以減輕由胰腺中胰島素分泌β-細胞增加所引起之高胰島素血症的症狀。在9-9.5週齡或11-12週齡時，每週兩次藉由腹膜內注射無菌磷酸鹽緩衝生理食鹽水中之5mg/kg抗VEGF抗體或同型匹配抗豬草對照單株抗體來治療小鼠。在"介入試驗"中，對9-9.5週齡小鼠治療14天且接著對其進行檢查。在"消退試驗"中，在治療7天、14天及21天之後檢驗11-12週齡小鼠。為檢驗存活期，治療另一隊列之小鼠直至小鼠展現發病或死亡為止。在每 一確定時點，在介入及消退試驗中，摘取各小鼠之胰腺及脾且對其拍照。胰腺內之腫瘤數目係藉由剖開各球形腫瘤且對其進行計數來確定。測定腫瘤負荷且量測各腫瘤之兩個最大直徑，且使用橢球體體積計算(x2乘以y)乘以0.52來計算體積。對小鼠胰腺內之所有腫瘤的體積求和以確定總腫瘤負荷。計算平均值及標準偏差，且使用Microsoft Excel v11.3.3(Microsoft,Inc.)對數據作圖。使用司徒頓t-測試(Student's t-test)來進行不同組之腫瘤數目與負荷之間的統計比較。使用JMP 6.0(SAS Institute,Inc.)產生針對存活期分析的卡本-麥爾曲線且使用對數秩和分析進行統計比較。
用抗VEGF抗體治療9週齡動物("介入"試驗)使得腫瘤血管生成急劇減少(圖11)。11週齡動物之治療("消退試驗")使得腫瘤血管分布及增殖減少(圖12A)。然而，與介入試驗不同，僅偵測到腫瘤生長之短暫降低且對存活期無影響(圖12B)。該等研究展示該等早期腫瘤對抗VEGF靶向治療劑之敏感性比晚期腫瘤大。
實例4.抗VEGF與化學療法在臨床前模型中係有效的
手術可能留下殘餘腫瘤細胞或休眠微轉移瘤，其具有恢復"血管生成程式"且促進更高指數級腫瘤生長之潛力。
吾人藉由使用有效化學療法方案與抗VEGF療法共同或依序地來使腫瘤"細胞減滅"，接著用抗VEGF單株抗體進行維持療法而利用小鼠遺傳腫瘤及人類異種移植物來模擬腫瘤休眠。因此，吾人治療小鼠以防止腫瘤復發，而非在腫瘤形成或再形成(包括在一些情況下成為對包括靶向抗VEGF療法之較多治療而言難以醫治、會復發或具抗性的腫瘤)之後追捕該腫瘤。圖13顯示多烯紫杉醇相當有效地降低腫瘤負荷，但休眠細胞在約2個月之後再生長的觀察結果。然而，用抗VEGF共同治療抑制腫瘤再生長，即使該治療自身對較大、較多既定腫瘤之生長幾乎無影響。其他資料顯示長期抗VEGF療法亦可抑制腫 瘤繼用紫杉烷或吉西他濱細胞減滅之後的再生長。該等結果顯示抗VEGF可用於有效地阻斷休眠腫瘤或微轉移之生長或再生長。該等發現與以下事實一致：新血管生成係與肉眼可見腫瘤之形成相關之迅速選殖擴張的前提，且證明使用VEGF-特異性拮抗劑(例如抗VEGF抗體，包括(但不限於)G6或B20系列抗體)在初始治療腫瘤之後及在新腫瘤形成、休眠腫瘤、惡性腫瘤或微轉移再活化之前可維持腫瘤休眠且抑制腫瘤再生長。
實例5.使用貝伐單抗之先導性輔助療法
此實例說明貝伐單抗在對患有可觸知及手術可治乳癌之患者之先導性輔助療法中的用途。
先導性輔助化學療法被廣泛用於治療局部晚期或潛在性手術可治大乳癌。隨機化試驗證實先導性輔助化學療法減少對乳房切除術之需要(藉此保留乳房)，同時總存活期類似於輔助化學療法。Powles等人，J.Clin.Oncol.13：547-52(1995)；Fisher等人，J.Clin.Oncol.16：2672-85(1998)。
本發明療法之主目標為藉由向對患有可觸知及手術可治乳癌之患者之化學療法中添加貝伐單抗來提供改良之臨床益處。具體言之，對先導性輔助療法臨床功效之主要量測之一可為病理完全反應(pathologic complete response,pCR)率。其他量測包括總反應率(OR)、臨床完全反應率(cCR)、無病存活期(DFS)及總存活期(OS)。此外，治療副作用可藉由(例如)手術併發症發生率、毒性、對心臟功能之不利影響來監測。某些基因表現或其他生物標誌活性亦可用作對治療之反應的標誌。
將病理完全反應(pCR)用作治療功效之預後性標誌。pCR係指在手術時在先導性輔助療法之後無腫瘤之殘留組織學跡象。研究已表明獲得pCR之患者的存活期得到顯著延長。然而，尚無用於分級病理反 應之標準方法，且pCR是否可用作功效之代用標誌仍有爭議。
適用於VEGF-特異性拮抗劑先導性輔助療法之患者係基於視治療下之特定癌症類型而變化的預訂標準及準則來選擇。舉例而言，患者可基於其預期壽命、年齡、癌症組織學、血液/肝與心臟功能、治療史、生殖狀況與計劃及精神病或成癮狀態來選擇。更重要的是，原發腫瘤應為可量測及/或可治療的。
治療方案包括化學療法加上VEGF-特異性拮抗劑(例如貝伐單抗)。視情況亦可將其他治療劑用於該方案。通常，將常用於特定癌症類型之化學療法方案(例如標準療法方案)與貝伐單抗組合使用。舉例而言，對於先導性輔助治療乳癌而言，可將多烯紫杉醇、太平洋紫杉醇或阿黴素/環磷醯胺(AC)方案與貝伐單抗組合使用。或者，可將基於多烯紫杉醇或基於太平洋紫杉醇之方案及AC方案作為與貝伐單抗組合之化學療法依序加以使用。對於治療非小細胞肺癌而言，可將順鉑(單獨抑或與其他化學藥劑(諸如吉西他濱、多烯紫杉醇或長春瑞賓)相組合)作為第一化學藥劑與貝伐單抗組合使用。另一方面，對於治療結腸直腸癌而言，可將基於5-FU之方案(諸如FOLFOX)與貝伐單抗組合使用。
將化學治療劑及VEGF-特異性拮抗劑(例如貝伐單抗)以預定劑量及間隔投與患者，歷時若干個週期。舉例而言，可將貝伐單抗每3週以15mg/kg給予，歷時4個週期；或每2週以10mg/kg給予，歷時6個週期。在另一實例中，將VEGF-特異性拮抗劑(例如貝伐單抗)每2週一次或每3週一次以7.5mg/kg投與。在治療期間監測患者反應。在完成先導性輔助療法後，患者經受手術而移除原發腫瘤，該原發腫瘤在先導性輔助療法之前係手術可治的抑或響應於先導性輔助療法變得手術可治。在該手術之後，使患者在有或無化學療法之情況下繼續VEGF-特異性拮抗劑療法(例如貝伐單抗)，此係視患者特定狀況而定。視情 況，患者亦可經受放射療法。在整個治療過程中及治療之後監控患者之病情變化。
亦應嚴密監測及控制與抗VEGF治療相關之不利事件(AE)。自先前研究中已知之主要AE包括高血壓、蛋白尿、出血、血栓栓塞事件、胃腸穿孔/瘺及創傷癒合併發症。某些AE(諸如高血壓)可藉由藥物控制。若AE為嚴重且難以控制的，則應中止治療。
實例6.使用貝伐單抗之輔助療法
此實例說明貝伐單抗與化學療法之組合在對癌症被切除之患者之輔助治療中的用途。
適用於貝伐單抗輔助療法之患者係基於視治療下之特定癌症類型而變化的預定標準及準則來選擇。舉例而言，患者可基於其預期壽命、年齡、癌症組織學、血液/肝與心臟功能、生活方式史、治療史、生殖狀況與計劃及精神病或成癮狀態來選擇。更重要的是，患者在輔助治療之前必須經受完全切除其癌症之手術。所接受之切除術類型係視特定腫瘤類型而定。而且，體現患者癌症特徵之足夠病理學材料應可獲得以供初期分析且供功效測定用。在治療時，手術應為相當近期的，但患者必須自該手術中完全恢復。舉例而言，患者必須在手術後不少於3-6週但不超過8-12週時開始輔助治療。
治療方案包括化學療法加上貝伐單抗。視情況亦可將其他治療劑用於該方案。通常，在治療第一期期間使用化學治療劑與貝伐單抗之組合，接著在剩餘治療期內使用貝伐單抗作為單一藥劑進行維持治療。舉例而言，用化學治療劑與貝伐單抗治療患者約4-12個週期，接著僅用貝伐單抗治療患者達1至2年。化學治療劑+貝伐單抗治療之各週期的持續時間係視所用之特定藥劑及劑量而定。舉例而言，可將貝伐單抗每3週以15mg/kg給予作為一個週期或每2週以5mg/kg給予作為一個週期。在另一實例中，貝伐單抗可每2週或每3週以7.5mg/kg或 10mg/kg給予。
將常用於特定癌症類型之化學療法方案(例如標準療法方案)與貝伐單抗組合使用。舉例而言，對於乳癌之輔助療法而言，可將多烯紫杉醇、太平洋紫杉醇或阿黴素/環磷醯胺(AC)方案與貝伐單抗組合使用。或者，可將基於多烯紫杉醇或基於太平洋紫杉醇之方案及AC方案作為與貝伐單抗組合之化學療法依序加以使用。對於治療非小細胞肺癌而言，可將順鉑(單獨抑或與其他化學藥劑(諸如吉西他濱、多烯紫杉醇或長春瑞賓)相組合)作為第一化學藥劑與貝伐單抗組合使用。另一方面，對於治療結腸直腸癌而言，可將基於5-FU之方案(諸如FOLFOX)與貝伐單抗組合使用。
貝伐單抗輔助治療之目標在於延長患者存活期，較佳為無病存活期。在此同時，應嚴密監測任何與貝伐單抗相關之不利事件，尤其因為輔助治療係長期的。存活期可藉由卡本-麥爾方法估算，且存活期之任何差異係使用分層對數秩和測試來計算。使用利用Cox比例風險模型之多變量分析來評估預後性因素對存活期之同時影響。與預後性因素之相互作用係藉由Cox比例風險模型來檢驗。將SAS統計軟體套件用於所有計算。當P值為0.05或以下時認為資料具統計顯著性。所有統計測試皆為雙側(two-sided)測試。
應嚴密監測及控制與抗VEGF治療相關之不利事件(AE)。自先前研究中已知之主要AE包括高血壓、蛋白尿、出血、血栓栓塞事件、胃腸穿孔/瘺及創傷癒合併發症。某些AE(諸如高血壓)可藉由藥物控制。若AE為嚴重且難以控制的，則應中止治療。
其他實施例
根據之前描述，顯然，可對本文中所描述之本發明作出變更及修改以使其適於各種用途及條件。該等實施例亦屬於以下申請專利範圍之範疇。
本說明書中所提及之所有公開案、專利申請案及專利係以引用之方式併入本文中，該引用程度就如同已特定地及個別地指示將各獨立公開案、專利或專利申請案以引用之方式併入一般。
<110> 美商建南德克公司
<120> 用於輔助及先導性輔助療法之血管內皮生長因子(VEGF)-特異性拮抗劑及早期腫瘤之治療
<130> 50474/014XX6
<140> 096148476
<141> 2007-12-18
<150> US 60/989,397
<151> 2007-11-20
<150> US 60/958,384
<151> 2007-07-05
<150> US 60/919,638
<151> 2007-03-22
<150> US 60/877,267
<151> 2006-12-27
<150> US 60/870,745
<151> 2006-12-19
<150> US 60/870,741
<151> 2006-12-19
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
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Claims (11)

  1. 一種抗血管內皮生長因子(VEGF)抗體或其抗原結合片段的用途，其係用於製造藥物，其中：(1)該抗VEGF抗體或其抗原結合片段阻斷VEGF與一或多種VEGF受體結合；且(2)該藥物降低或防止具有癌症、息肉或遺傳性癌症症候群家族史之個體之良性、癌前或非轉移性癌症的發生，其中該個體從未患有臨床上可偵測之癌症。
  2. 如請求項1之用途，其中該藥物係單一療法。
  3. 如請求項1之用途，其中該個體係進一步被監測該癌症之復發。
  4. 如請求項1之用途，其中該癌症或腫瘤係胃腸、結腸直腸、乳房、卵巢、肺、膠質母細胞瘤或腎之癌症。
  5. 如請求項1之用途，其中該藥物係與其他抗癌療法組合使用，其中該其他抗癌療法視情況為化學療法。
  6. 如請求項1之用途，其中該抗VEGF抗體係單株抗體。
  7. 如請求項6之用途，其中該單株抗體係嵌合抗體、人類化抗體或完全人類抗體。
  8. 如請求項6之用途，其中該單株抗體為貝伐單抗(bevacizumab)。
  9. 如請求項1之用途，其中該抗VEGF抗體或其抗原結合片段與抗VEGF單株抗體A4.6.1相同之抗原決定基結合。
  10. 如請求項1之用途，其中該抗VEGF抗體或其抗原結合片段與包含人類VEGF之殘基F17、M18、D19、Y21、Y25、Q89、I91、K101、E103及C104之人類VEGF上的功能性抗原決定基結合。
  11. 如請求項1之用途，其中該抗VEGF抗體或其抗原結合片段與包含人類VEGF之殘基F17、Y21、Q22、Y25、D63、I83及Q89之人類VEGF上的功能性抗原決定基結合。
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Families Citing this family (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SI2066694T1 (sl) 2006-09-29 2016-02-29 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Sestavki in postopki za diagnosticiranje in zdravljenje raka
TWI580694B (zh) * 2007-11-30 2017-05-01 建南德克公司 抗-ｖｅｇｆ抗體
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
RU2531523C3 (ru) 2008-06-25 2022-05-04 Новартис Аг Стабильные и растворимые антитела, ингибирующие vegf
US8268314B2 (en) * 2008-10-08 2012-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
CA2744158A1 (en) * 2008-11-22 2010-05-27 Genentech, Inc. Anti-angiogenesis therapy for the treatment of breast cancer
US9186336B2 (en) * 2009-02-06 2015-11-17 The General Hospital Corporation Methods of treating vascular lesions
WO2010112193A1 (en) 2009-04-02 2010-10-07 Roche Glycart Ag Multispecific antibodies comprising full length antibodies and single chain fab fragments
PL2417156T3 (pl) 2009-04-07 2015-07-31 Roche Glycart Ag Trójwartościowe, bispecyficzne przeciwciała
AU2010239368A1 (en) * 2009-04-20 2011-11-10 Genentech, Inc. Adjuvant cancer therapy
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
CN102712696A (zh) 2009-09-16 2012-10-03 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 包含卷曲螺旋和/或系链的蛋白质复合体及其用途
DK2488204T3 (en) 2009-10-16 2016-06-06 Oncomed Pharm Inc Therapeutic combination and use of DLL4 antagonist antibodies and blood pressure lowering agents
US9387211B2 (en) 2010-02-01 2016-07-12 Cedars-Sinai Medical Center Methods for treatment of Cushing'S disease and hypercortisolism using gefitinib
WO2011094716A1 (en) * 2010-02-01 2011-08-04 Cedars-Sinai Medical Center Use of tyrosine kinase inhibitors for treatment of prolactinoma
CN102781316B (zh) 2010-03-01 2016-07-06 陶制药有限责任公司 癌症诊断和成像
AR080793A1 (es) 2010-03-26 2012-05-09 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos
TWI426920B (zh) 2010-03-26 2014-02-21 Hoffmann La Roche 雙專一性、雙價抗－ｖｅｇｆ／抗－ａｎｇ－２抗體
US20120100166A1 (en) 2010-07-15 2012-04-26 Zyngenia, Inc. Ang-2 Binding Complexes and Uses Thereof
CN103140761B (zh) * 2010-07-19 2015-11-25 霍夫曼-拉罗奇有限公司 贝伐单抗组合疗法用于治疗胰腺癌的血浆生物标志物
RU2013110875A (ru) 2010-08-24 2014-09-27 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА, СОДЕРЖАЩИЕ СТАБИЛИЗИРОВАННЫЙ ДИСУЛЬФИДОМ ФРАГМЕНТ Fv
US8551479B2 (en) 2010-09-10 2013-10-08 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating melanoma
JP5766296B2 (ja) 2010-12-23 2015-08-19 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ポリペプチド−ポリヌクレオチド複合体、およびエフェクター成分の標的化された送達におけるその使用
EP2681239B8 (en) 2011-02-28 2015-09-09 F. Hoffmann-La Roche AG Antigen binding proteins
BR112013020338A2 (pt) 2011-02-28 2016-10-18 Hoffmann La Roche proteína de ligação de antígeno monovalente, composição farmacêutica, uso da proteína de ligação de antígeno monovalente, método para o tratamento de um paciente com necessidade de terapia, método para a preparação de uma proteína de ligação de antígeno monovalente, ácido nucleico, vetor e célula hospedeira
WO2012135624A1 (en) * 2011-04-01 2012-10-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Treatment of colon cancer using complement inhibitors
WO2012151574A1 (en) 2011-05-05 2012-11-08 Duke University Methods of developing a prognosis for pancreatic cancer and predicting responsiveness to cancer therapeutics
CA2837169C (en) 2011-05-24 2021-11-09 Zyngenia, Inc. Multispecific complexes comprising angiopoietin-2-binding peptide and their uses
US20130064814A1 (en) * 2011-09-12 2013-03-14 Lloyd S. Gray Antagonists of products of the hs.459642 unigene cluster for the inhibition of proliferation, development or differentiation of stem cells including cancer stem cells
AU2013201095C1 (en) 2011-09-23 2019-12-05 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. VEGF/DLL4 binding agents and uses thereof
US20130142796A1 (en) * 2011-12-05 2013-06-06 Subhransu Ray Treatment for angiogenic disorders
BR112014019579A2 (pt) 2012-02-10 2019-10-15 Genentech, Inc Anticorpo de cadeia única, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, método de produção de um anticorpo de cadeia única, heteromultímero e método de produção do heteromultímero
WO2014001325A1 (en) 2012-06-27 2014-01-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for making antibody fc-region conjugates comprising at least one binding entity that specifically binds to a target and uses thereof
BR112014032193A2 (pt) 2012-06-27 2017-06-27 Hoffmann La Roche métodos de produção de anticorpos biespecíficos e de determinação de combinação, anticorpo biespecífico, formulação e uso de anticorpo biespecífico
LT2872534T (lt) 2012-07-13 2018-10-25 Roche Glycart Ag Dvigubai specifiniai anti-vegf/anti-ang-2 antikūnai ir jų panaudojimas akių kraujagyslių ligoms gydyti
WO2014071018A1 (en) 2012-10-31 2014-05-08 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods and monitoring of treatment with a dll4 antagonist
BR112015012548A2 (pt) 2012-12-03 2017-07-11 Koninklijke Philips Nv método
US10150800B2 (en) 2013-03-15 2018-12-11 Zyngenia, Inc. EGFR-binding modular recognition domains
CA2922912A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific domain exchanged common variable light chain antibodies
JP6827415B2 (ja) 2014-10-31 2021-02-10 メレオ バイオファーマ ５ インコーポレイテッド 疾患の処置のための併用療法
WO2016087416A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
CA2999160A1 (en) 2015-09-23 2017-03-30 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treatment of cancer
AU2016381656A1 (en) * 2015-12-30 2018-07-12 Visiongate, Inc. System and method for automated detection and monitoring of dysplasia and administration of chemoprevention
WO2017201166A1 (en) * 2016-05-17 2017-11-23 Duke University Methods of predicting responsiveness of a cancer to a vegf targeting agent and methods of prognosing and treating cancer
SG11202005618WA (en) * 2017-12-19 2020-07-29 Akouos Inc Aav-mediated delivery of therapeutic antibodies to the inner ear
US11026649B2 (en) * 2018-06-25 2021-06-08 Siemens Medical Solutions Usa, Inc. Method and system for determining tumor burden in medical images
US20220135651A1 (en) * 2019-02-18 2022-05-05 Agency For Science, Technology And Research A membrane-bound fit-1 decoy and uses thereof
CA3139162A1 (en) * 2019-05-17 2020-11-26 Cancer Prevention Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating familial adenomatous polyposis
CN112773852A (zh) * 2021-03-16 2021-05-11 宁夏医科大学 一种对细胞有保护作用的中草药组合物的制备工艺
CN113512589B (zh) * 2021-07-14 2023-03-10 复旦大学附属中山医院 Prune1基因检测在多发性骨髓瘤患者预后中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6703020B1 (en) * 1999-04-28 2004-03-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Antibody conjugate methods for selectively inhibiting VEGF
US20050044853A1 (en) * 2003-09-02 2005-03-03 Kazutora Yoshino Ecology system
US20050186208A1 (en) * 2003-05-30 2005-08-25 Genentech, Inc. Treatment with anti-VEGF antibodies

Family Cites Families (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4675187A (en) 1983-05-16 1987-06-23 Bristol-Myers Company BBM-1675, a new antibiotic complex
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
WO1989006692A1 (en) 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
WO1991019813A1 (en) 1990-06-11 1991-12-26 The University Of Colorado Foundation, Inc. Nucleic acid ligands
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
KR100272077B1 (ko) 1990-08-29 2000-11-15 젠팜인터내셔날,인코포레이티드 이종 항체를 생산할 수 있는 전이유전자를 가진 인간이외의 동물
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
CA2095633C (en) 1990-12-03 2003-02-04 Lisa J. Garrard Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
US6582959B2 (en) 1991-03-29 2003-06-24 Genentech, Inc. Antibodies to vascular endothelial cell growth factor
US20030206899A1 (en) 1991-03-29 2003-11-06 Genentech, Inc. Vascular endothelial cell growth factor antagonists
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
JPH07501451A (ja) 1991-11-25 1995-02-16 エンゾン・インコーポレイテッド 多価抗原結合タンパク質
HU225646B1 (en) 1992-10-28 2007-05-29 Genentech Inc Hvegf receptors as vascular endothelial cell growth factor antagonists
US5635388A (en) 1994-04-04 1997-06-03 Genentech, Inc. Agonist antibodies against the flk2/flt3 receptor and uses thereof
IL117645A (en) 1995-03-30 2005-08-31 Genentech Inc Vascular endothelial cell growth factor antagonists for use as medicaments in the treatment of age-related macular degeneration
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6458939B1 (en) 1996-03-15 2002-10-01 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the diagnosis, prevention, and treatment of neoplastic cell growth and proliferation
US6100071A (en) 1996-05-07 2000-08-08 Genentech, Inc. Receptors as novel inhibitors of vascular endothelial growth factor activity and processes for their production
US6884879B1 (en) 1997-04-07 2005-04-26 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
US20020032315A1 (en) 1997-08-06 2002-03-14 Manuel Baca Anti-vegf antibodies
IL132239A0 (en) 1997-04-07 2001-03-19 Genentech Inc Humanized antibodies and methods for forming humanized antibodies
WO1998045331A2 (en) 1997-04-07 1998-10-15 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
US20030114407A1 (en) 2001-12-06 2003-06-19 Monia Brett P. Antisense modulation of G protein-coupled receptor ETBR-LP-2 expression
CN1763097B (zh) 1999-01-15 2011-04-13 杰南技术公司 具有改变的效应功能的多肽变体
EP1185559A2 (en) * 1999-04-28 2002-03-13 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods for cancer treatment by selectively inhibiting vegf
JP2001072587A (ja) * 1999-07-01 2001-03-21 Taisho Pharmaceut Co Ltd Ｖｅｇｆ受容体拮抗剤
DE60042021D1 (de) 1999-07-29 2009-05-28 Gilead Sciences Inc Nukleinsäureliganden für den hepatozytischen wachstumsfaktor/dispersionsfaktor (hgf/sf) und seines c-met rezeptors
DE60030323T2 (de) 1999-12-24 2007-10-11 Genentech, Inc., South San Francisco Verfahren und verbindungen zur verlängerung der halbwertzeiten bei der ausscheidung von biowirksamen verbindungen
US7342016B2 (en) * 2000-08-30 2008-03-11 Schering Corporation Farnesyl protein transferase inhibitors as antitumor agents
PT1355919E (pt) 2000-12-12 2011-03-02 Medimmune Llc Moléculas com semivida longa, composições que as contêm e suas utilizações
WO2005001486A1 (en) 2003-06-06 2005-01-06 Genentech, Inc. Modulating the interaction between hgf beta chain and c-met
US20050106667A1 (en) 2003-08-01 2005-05-19 Genentech, Inc Binding polypeptides with restricted diversity sequences
WO2005123104A2 (en) * 2004-06-10 2005-12-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of vegf inhibitors for the treatment of human cancer
US20060009360A1 (en) 2004-06-25 2006-01-12 Robert Pifer New adjuvant composition
NZ552956A (en) * 2004-07-20 2010-03-26 Genentech Inc Inhibitors of angiopoietin-like 4 protein (ANGPTL4), combinations, and their use for treating cancer

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6703020B1 (en) * 1999-04-28 2004-03-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Antibody conjugate methods for selectively inhibiting VEGF
US20050186208A1 (en) * 2003-05-30 2005-08-25 Genentech, Inc. Treatment with anti-VEGF antibodies
US20050044853A1 (en) * 2003-09-02 2005-03-03 Kazutora Yoshino Ecology system

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