ES2582656T3 - Antagonistas específicos del VEGF para terapia adyuvante y neoadyuvante, y el tratamiento de tumores en fase temprana - Google Patents

Antagonistas específicos del VEGF para terapia adyuvante y neoadyuvante, y el tratamiento de tumores en fase temprana Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo anti-VEGF, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, para su uso en un método de tratamiento, en donde: (1) el anticuerpo anti-VEGF o el fragmento de unión al antígeno del mismo bloquean la unión de VEGF a más de un receptor de VEGF; y (2) el uso es en la reducción o la prevención de la aparición de un cáncer benigno, precanceroso o no metastásico en un sujeto con antecedentes familiares de cáncer, pólipos o síndrome canceroso heredado, en donde el sujeto nunca ha tenido un cáncer clínicamente detectable.

Description

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DESCRIPCION
Antagonistas espedficos del VEGF para terapia adyuvante y neoadyuvante, y el tratamiento de tumores en fase temprana
Antecedentes
El cancer es una de las amenazas mas letales para la salud humana. Solo en EE.UU., el cancer afecta a casi 1,3 millones de nuevos pacientes al ano, y es la segunda causa de mortalidad detras de las enfermedades cardiovasculares, lo que representa aproximadamente 1 de cada 4 muertes. Los tumores solidos son responsables de la mayor parte de esas muertes. Aunque se han producido avances significativos en el tratamiento medico de ciertos tipos de cancer, la tasa global de supervivencia a los 5 anos para todos los tipos de cancer ha mejorado solo aproximadamente un 10 % en los ultimos 20 anos. Los canceres o tumores malignos, se vuelven metastasicos y crecen rapidamente de una manera incontrolada, dificultando sumamente la deteccion y el tratamiento a tiempo.
Los metodos actuales de tratamiento del cancer son relativamente no selectivos y, en general, se dirigen al tumor una vez que el cancer ha progresado hasta un estado mas maligno. La cirugia elimina el tejido enfermo; la radioterapia reduce los tumores solidos; y la quimioterapia mata las celulas que se dividen con rapidez. La quimioterapia, en particular, produce numerosos efectos secundarios, en algunos casos, tan graves como para limitar la dosis que se puede administrar y, por lo tanto, para impedir el uso de farmacos potencialmente eficaces. Por otra parte, los canceres suelen desarrollar resistencia a los farmacos quimioterapeuticos. El tratamiento de tumores benignos o en fase temprana seria deseable para prevenir la progresion a un estado maligno o metastasico, reduciendo asi la morbilidad y la mortalidad asociadas con el cancer.
Para la mayoria de los pacientes recien diagnosticados con cancer operable, el tratamiento convencional es la cirugia definitiva, seguida de la quimioterapia. Dicho tratamiento tiene como objetivo la eliminacion de la enfermedad primaria y metastasica en la mayor medida posible con el fin de prevenir la reaparicion y mejorar la supervivencia. De hecho, la mayoria de estos pacientes no tiene ninguna evidencia macroscopica de tumor residual tras la cirugia. Sin embargo, muchos de ellos desarrollan mas tarde reaparicion y pueden llegar a morir de sus enfermedades. Esto se debe a que un pequeno numero de celulas tumorales viables se vuelven metastasicas antes de la cirugia, escapando de la cirugia y no siendo detectadas despues de la cirugia debido a la limitacion de las tecnicas de deteccion actuales.
Por lo tanto, los tratamientos adyuvantes postoperatorios cobran importancia como armas auxiliares a la cirugia para eliminar estas celulas de cancer micrometastasicas residuales antes de su repoblacion y de que sean refractarias. Durante las ultimas decadas, los avances en la terapia adyuvante han sido, en general, graduales, centrandose en el uso de diversos agentes quimioterapeuticos. Muchos regimenes quimioterapeuticos han demostrado beneficios clinicos como adyuvantes en el tratamiento de pacientes con indicaciones de cancer primario en fase temprana, tales como los canceres de pulmon, de mama y colorrectal. Strauss et al. J Clin Oncol 22:7019 (2004); International Adjuvant Lung Cancer Trial Collaboration Group, N Engl J Med 350:351-60 (2004). Moertel et al. Ann Intern Med 122:321-6 (1995); IMPACT Lancet 345:939-44 (1995); Citron et al. J Clin Oncol 21:1431-9 (2003).
A pesar de los beneficios establecidos de la terapia adyuvante a base de quimioterapia, una limitacion principal asociada con la quimioterapia de cualquier tipo es la de las toxicidades significativas. En general, los farmacos quimioterapeuticos no estan dirigidos al sitio del tumor, y son incapaces de diferenciar entre celulas normales y tumorales. El sujeto de la toxicidad es especialmente dificil en el contexto adyuvante debido al largo tratamiento y a su impacto duradero en la calidad de vida de los pacientes. Por otra parte, los beneficios de la quimioterapia adyuvante en pacientes con menor riesgo de reaparicion siguen sin estar claros, por lo que es cuestionable si merece la pena para ellos sufrir los efectos secundarios de la quimioterapia.
La terapia neoadyuvante, un tratamiento adyuvante administrado antes de la cirugia definitiva principal, ha emergido como otra parte importante de la terapia del cancer. Hay varias ventajas en la administracion de tratamiento neoadyuvante antes de la cirugia definitiva. En primer lugar, puede ayudar a mejorar el estado funcional del paciente antes de la cirugia, debido a la reduccion del volumen del tumor, ascitis y efusion pleural. En segundo lugar, la reduccion del volumen del tumor puede permitir una cirugia menos extensa, preservando asi el organo del paciente y la funcion del mismo. Esto es particularmente valioso para, por ejemplo, los pacientes con cancer de mama. Ademas, la reduccion del volumen del tumor puede permitir la cirugia de tumores que antes no se podian operar. Por ultimo, la terapia neoadyuvante puede mejorar la posibilidad de eliminar el tumor por completo mediante cirugia, mejorando asi la supervivencia. Durante la ultima decada, ha habido muchos ensayos clinicos de terapia neoadyuvante usando diversos agentes quimioterapeuticos y/o radiacion para tratar a pacientes con canceres tales como cancer de mama, cancer de cabeza y cuello, cancer de recto, cancer de vejiga, cancer de pulmon no microcitico, cancer de cuello de utero, cancer de esofago y gastrico, y cancer de prostata. Para una revision, vease Tanvetyanon et al., Southern Med. J. 98:338-344 (2005).
Como se ha explicado anteriormente, una de las principales limitaciones asociadas a la quimioterapia de cualquier tipo es la de las toxicidades significativas. Muchos regimenes quimioterapeuticos neoadyuvantes son incomodos, lo
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que requiere tratamientos frecuentes durante un largo periodo de tiempo. Por otra parte, los beneficios, especialmente los beneficios para la supervivencia, de la quimioterapia neoadyuvante en pacientes con menor riesgo de reaparicion siguen sin estar claros, por lo que es cuestionable si merece la pena esperar en lugar de someterse a una cirugia de inmediato.
La angiogenesis es un importante acontecimiento celular en el que las celulas endoteliales vasculares proliferan, se reducen y se reorganizan para formar nuevos vasos a partir de la red vascular preexistente. Hay pruebas convincentes de que el desarrollo de un suministro vascular es esencial para los procesos proliferativos normales y patologicos. La entrega de oxigeno y nutrientes, asi como la eliminacion de los productos catabolicos, representan etapas limitantes de la velocidad en la mayoria de los procesos de crecimiento que se producen en los organismos multicelulares.
Aunque se considera que la induccion de nuevos vasos sanguineos es el modo predominante de angiogenesis tumoral, datos recientes han indicado que algunos tumores pueden crecer optando junto con los vasos sanguineos existentes del huesped. La vasculatura cooptada luego retrocede, lo que conduce a la regresion del tumor que finalmente es revertido por la angiogenesis inducida por hipoxia en el margen del tumor.
Uno de los reguladores positivos clave de la angiogenesis tanto normal como anormal es el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)-A. VEGF-A forma parte de una familia de genes que incluye VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F y PlGF. VEGF-A se une principalmente a dos receptores tirosina quinasa de alta afinidad, VEGFR-1 (Flt-1) y VEGFR-2 (Flk-1/KDR), siendo este ultimo el principal transmisor de senales mitogenicas de las celulas endoteliales vasculares de VEGF-A. Ademas, la neuropilina-1 se ha identificado como un receptor para las isoformas de VEGF-A de union a la heparina, y puede desempenar un papel en el desarrollo vascular.
Ademas de ser un factor angiogenico, el VEGF, como factor de crecimiento pleiotropico, presenta multiples efectos biologicos en otros procesos fisiologicos tales como la supervivencia y la proliferacion de las celulas endoteliales, la permeabilidad y la vasodilatacion de los vasos, la quimiotaxis de los monocitos y la entrada de calcio. Por otra parte, otros estudios han informado de efectos mitogenos del VEGF en unos cuantos tipos de celulas no endoteliales tales como las celulas epitaliales pigmentarias de la retina, celulas del conducto pancreatico y celulas de Schwann.
El reconocimiento de VEGF como regulador primario de la angiogenesis en condiciones patologicas ha conducido a numerosos intentos de bloquear las actividades de VEGF en las condiciones que implican la angiogenesis patologica.
La expresion de VEGF esta regulada positivamente en la mayoria de los tumores malignos, y la sobreexpresion de VEGF se correlaciona con una fase mas avanzada o con un peor pronostico en muchos tumores solidos. Por lo tanto, las moleculas que inhiben las vias de senalizacion de VEGF se han usado para el tratamiento de tumores solidos relativamente avanzados en los que se observa angiogenesis patologica.
A pesar de las pruebas que implican el papel de VEGF en el desarrollo de afecciones o enfermedades que implican angiogenesis patologica, incluyendo tumores en fase final, metastasicos o invasivos, se sabe menos sobre el papel de VEGF en los canceres en fase temprana y benignos, en la reaparicion de los tumores tras un periodo de latencia o en el desarrollo de tumores en sitios secundarios de tumores latentes, tumores malignos o micrometastasis. La invention aborda estas y otras necesidades, como sera evidente tras la revision de la siguiente divulgation.
Sumario de la invencion
El uso de antagonistas especificos del VEGF en combination con la quimioterapia ha demostrado ser beneficioso en pacientes con cancer colorrectal y cancer de pulmon no microcitico metastasicos, entre otros, pero se sabe poco sobre el impacto de la terapia con antagonistas especificos del VEGF en tumores benignos o en fase temprana; en la reaparicion de tumores tras la latencia, cirugia u otra intervention; en el desarrollo de tumores en sitios secundarios de tumores latentes, tumores malignos o micrometastasis; o en el entorno adyuvante o neoadyuvante. En el presente documento, se proporcionan resultados que demuestran que los antagonistas especificos del VEGF se pueden usar para el tratamiento de tumores en fase temprana, incluyendo tumores benignos, precancerosos, no metastasicos y operables. Los resultados demuestran ademas que los antagonistas especificos del VEGF se pueden usar para la terapia neoadyuvante del cancer (por ejemplo, canceres benignos y malignos) o para prevenir y/o reducir la probabilidad de reaparicion del cancer (por ejemplo, canceres benignos y malignos), incluyendo metodos de terapia adyuvante. Estos resultados constituyen un avance medico significativo para proporcionar un cuidado mas eficaz, y menos toxico, de los pacientes con cancer, incluyendo los canceres benignos, en fase temprana y operables (tanto antes como despues de la cirugia).
Se desvelan metodos de tratamiento de un cancer benigno, precanceroso o no metastasico en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto una cantidad eficaz de un antagonista especifico del VEGF. En ciertas realizaciones, la administration del antagonista especifico del VEGF evita que el cancer benigno, precanceroso o no metastasico se convierta en un cancer invasivo o metastasico. Por ejemplo, el cancer benigno, precanceroso o no metastasico puede ser un cancer en fase 0, fase I o fase II, y en ciertas realizaciones, la administracion del
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antagonista espedfico del VEGF evita la progresion del cancer benigno, precanceroso o no metastasico al/a las siguiente/s fase/s, por ejemplo, a un cancer en fase I, fase II, fase III o fase IV. En ciertas realizaciones, el antagonista espedfico del VEGF se administra durante un tiempo y en una cantidad suficientes para tratar el tumor benigno, precanceroso o no metastasico en el sujeto o para prevenir que el tumor benigno, precanceroso o no metastasico se convierta en un cancer invasivo o metastasico. En ciertas realizaciones, la administracion del antagonista espedfico del VEGF reduce el tamano tumoral, la carga tumoral o el numero de tumores del tumor benigno, precanceroso o no metastasico. El antagonista espedfico del VEGF tambien se puede administrar en una cantidad y durante un tiempo para disminuir la densidad vascular en el tumor benigno, precanceroso o no metastasico.
Como se describe en el presente documento, los metodos se pueden usar para tratar, por ejemplo, un cancer en fase 0 (por ejemplo, un carcinoma in situ), fase I o fase II. Los metodos de terapia neoadyuvante y adyuvante se pueden usar para tratar cualquier tipo de cancer, por ejemplo, benigno o maligno.
La invencion, como se define en las reivindicaciones, proporciona un anticuerpo anti-VEGF o un fragmento de union al antigeno del mismo que bloquea la union de VEGF a mas de un receptor de VEGF, para su uso en un metodo de tratamiento para prevenir la aparicion de un cancer benigno, precanceroso o no metastasico en un sujeto con antecedentes familiares de cancer, polipos o un sindrome de cancer hereditario (por ejemplo, neoplasia endocrina multiple de tipo 1 (MEN1)). En ciertos aspectos de la invencion, el sujeto esta en riesgo de desarrollar un tumor gastrointestinal benigno, precanceroso o no metastasico, un tumor desmoide o un adenoma (por ejemplo, un adenoma gastrointestinal, un adenoma hipofisario o un adenoma de pancreas). De acuerdo con la invencion, el sujeto nunca ha tenido un cancer detectable clinicamente.
En ciertas realizaciones de la invencion, la cancer es un tumor solido de celulas epiteliales, incluyendo, pero sin limitacion, cancer gastrointestinal, cancer de colon, cancer de mama, cancer de prostata, cancer de rinon, cancer de pulmon (por ejemplo, cancer de pulmon no microdtico), melanoma, cancer de ovario, cancer de pancreas, cancer de cabeza y cuello, cancer de higado y canceres de tejidos blandos (por ejemplo, linfomas de linfocitos B tal como LNH y mieloma multiple, y leucemias tales como leucemia linfodtica cronica). En otra realizacion, el tumor benigno, precanceroso o no metastasico es un polipo, adenoma, fibroma, lipoma, gastrinoma, insulinoma, condroma, osteoma, hemangioma, linfangioma, meningioma, leiomioma, rabdomioma, papiloma de celulas escamosas, neuromas acusticos, neurofibromas, cistanoma del conducto biliar, leiomiomas, mesoteliomas, teratomas, mixomas, tracomas, granulomas, hamartoma, papiloma de celulas transicionales, adenoma pleiomorfico de la glandula salival, tumor desmoide, quistpapiloma dermoide, cistoadenoma, hiperplasia nodular focal o una hiperplasia nodular regenerativa. En otra realizacion, la invencion es deseable para su uso en el tratamiento de un adenoma. Los ejemplos no limitantes de adenomas incluyen adenoma celular hepatico, adenoma renal, adenoma metanefrico, adenoma bronquial, adenoma alveolar, adenoma adrenal, adenoma hipofisario, adenoma de paratiroides, adenoma pancreatico, adenoma de la glandula salival, adenoma hepatocelular, adenoma gastrointestinal, adenoma tubular y adenoma de conducto biliar.
Tambien se desvela un metodo de tratamiento de un tumor gastrointestinal en fase 0, fase I o fase II en un sujeto que incluye administrar al sujeto un antagonista espedfico del VEGF durante un tiempo y en una cantidad suficientes para tratar el tumor gastrointestinal en fase 0, fase I o fase II en el sujeto. El tumor gastrointestinal puede ser cualquier cancer en fase 0, fase I o fase II del sistema gastrointestinal, incluyendo cancer anal, cancer colorrectal, cancer de recto, cancer de esofago, cancer de vesicula biliar, cancer gastrico, cancer de higado, cancer de pancreas y cancer de intestino delgado. En una realizacion, el tumor gastrointestinal es un tumor en fase 0 (por ejemplo, un adenoma de alto grado) o un tumor en fase I. En una realizacion, el sujeto no ha sido sometido a una reseccion para tratar el tumor gastrointestinal.
Tambien se desvela un metodo de tratamiento de un sujeto en riesgo de desarrollar un tumor gastrointestinal que incluye la administracion al sujeto de un antagonista espedfico del VEGF durante un tiempo y en una cantidad suficientes para prevenir la aparicion o la reaparicion del tumor gastrointestinal en el sujeto. El tumor gastrointestinal puede ser cualquier tumor gastrointestinal incluyendo, pero sin limitacion, un adenoma, uno o mas polipos, o un cancer en fase 0, I o II.
En ciertas realizaciones de los metodos anteriores, el sujeto es un ser humano de aproximadamente 50 anos, tiene un sindrome de cancer hereditario o tiene antecedentes familiares de cancer de colon o polipos. Los ejemplos no limitantes de los sindromes de cancer gastrointestinal hereditarios incluyen poliposis adenomatosa familiar (PAF), sindrome de Gardner, cancer de pancreas y cancer colorrectal sin poliposis hereditario (HNPCC). En ciertas realizaciones, el sujeto puede o no haber sido sometido previamente a una colonoscopia. En una realizacion, el antagonista espedfico del VEGF se administra en una cantidad y durante un tiempo para reducir el numero de polipos colorrectales adenomatosos en un sujeto que tiene PAF.
Tambien se desvela un metodo de prevencion o de reduccion de la probabilidad de reaparicion de un cancer en un sujeto que incluye la administracion al sujeto de un antagonista espedfico del VEGF durante un tiempo y en una cantidad suficientes para prevenir o reducir la probabilidad de reaparicion del cancer en el sujeto. Tambien se desvela un metodo de prevencion de la reaparicion de un cancer en un sujeto que tiene un tumor que incluye las
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etapas de extirpar el tumor (por ejemplo, usando cirugia definitiva) y, posteriormente, administrar al sujeto un antagonista espedfico del VEGF. Tambien se desvelan metodos de prevencion del rebrote de un tumor en un sujeto que incluyen las etapas de extirpar el tumor (por ejemplo, usando cirugia definitiva) y, posteriormente, administrar al sujeto un antagonista espedfico del VEGF. Tambien se desvela un metodo de prevencion de la reaparicion del cancer en un sujeto o la reduccion de la probabilidad de reaparicion del cancer en un sujeto que opcionalmente incluye administrar al sujeto una cantidad eficaz de un antagonista espedfico del VEGF antes de la cirugia, realizar la cirugia definitiva y administrar una cantidad eficaz de un antagonista espedfico del VEGF despues de la cirugia, en el que el administracion del antagonista espedfico del VEGF despues de la cirugia previene la reaparicion del cancer o reduce la probabilidad de reaparicion del cancer. Tambien se desvela un metodo de prevencion de la reaparicion del cancer en un sujeto o la reduccion de la probabilidad de reaparicion del cancer en un sujeto que incluye administrar al sujeto una cantidad eficaz de un antagonista espedfico del VEGF en ausencia de cualquier agente terapeutico contra el cancer adicional, en el que la administracion previene la reaparicion del cancer en un sujeto o reduce la probabilidad de reaparicion del cancer en un sujeto.
Para cada uno de los aspectos anteriores, el tumor puede ser cualquier tipo de tumor, incluyendo pero sin limitation, los tumores solidos y, en particular, los tumores y adenomas que se describe en el presente documento. El sujeto puede tener un tumor latente o micrometastasis que no sean detectables clinicamente. En una realization de este aspecto, el antagonista espedfico del VEGF se administra durante un tiempo y en una cantidad suficientes para reducir la neovascularization de un tumor latente o micrometastasis. En otra realizacion, el antagonista espedfico del VEGF se administra durante un tiempo y en una cantidad suficientes para evitar la aparicion de un tumor detectable clinicamente, o metastasis de los mismos, o para aumentar la duration de la supervivencia del sujeto.
En una realizacion, el antagonista espedfico del VEGF es una monoterapia. En otra realizacion, el sujeto ha sido tratado previamente del tumor, por ejemplo, usando una terapia contra el cancer. En un ejemplo, la terapia contra el cancer es cirugia. En otra realizacion, el sujeto se puede tratar ademas con una terapia adicional contra el cancer antes, durante (por ejemplo, simultaneamente) o despues de la administracion del antagonista espedfico del VEGF. Los ejemplos de terapias contra el cancer incluyen, sin limitacion, cirugia, terapia de radiation (radioterapia), bioterapia, inmunoterapia, quimioterapia o una combination de estas terapias.
En realizaciones en las que el sujeto ha sido sometido a cirugia definitiva, el antagonista espedfico del VEGF se administra, en general, despues de un periodo de tiempo en el que el sujeto se ha recuperado de la cirugia. Este periodo de tiempo puede incluir el tiempo necesario para la cicatrization de la herida o la cicatrization de la incision quirurgica, el periodo de tiempo necesario para reducir el riesgo de dehiscencia de la herida o el periodo de tiempo necesario para que el sujeto recupere un nivel de salud esencialmente similar al o mejor que el nivel de la salud previo a la cirugia. El periodo comprendido entre la finalization de la cirugia definitiva y la primera administracion del antagonista espedfico del VEGF tambien puede incluir el tiempo necesario para un descanso del farmaco, en el que el sujeto requiere o solicita un periodo de tiempo entre los regimenes terapeuticos. En general, el periodo de tiempo entre la finalizacion de la cirugia definitiva y el inicio de la terapia con el antagonista espedfico del VEGF puede incluir menos de una semana, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas (28 dias), 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 1 ano, 2 anos, 3 anos, o mas. En una realizacion, el periodo de tiempo entre la cirugia definitiva y la administracion del antagonista espedfico del VEGF es superior a 2 semanas e inferior a 1 ano.
Cada uno de los aspectos anteriores puede incluir ademas monitorizar al sujeto para determinar la reaparicion del cancer.
Tambien se desvelan metodos de terapia neoadyuvante previos a la extirpation quirurgica del cancer operable en un sujeto, por ejemplo, un paciente humano, que comprenden administrar al paciente una cantidad eficaz de un antagonista espedfico del VEGF, por ejemplo, bevacizumab, donde el paciente ha sido diagnosticado de un tumor o de cancer. El antagonista espedfico del VEGF se puede administrar solo o en combinacion con al menos un agente quimioterapeutico.
Tambien se desvela un metodo de tratamiento de un sujeto con cancer operable que incluye administrar al sujeto una cantidad eficaz de un antagonista espedfico del VEGf antes de la cirugia y, posteriormente, realizar la cirugia mediante la que se extirpa el cancer. En una realizacion, el metodo incluye ademas la etapa de administrar al sujeto una cantidad eficaz de un antagonista espedfico del VEGF tras la cirugia para prevenir la reaparicion del cancer.
Tambien se desvela un metodo de terapia neoadyuvante que comprende administrar a un sujeto con cancer operable una cantidad eficaz de un antagonista espedfico del VEGF, por ejemplo, bevacizumab, y al menos un agente quimioterapeutico antes de la cirugia definitiva. El metodo se puede usar para prolongar la supervivencia libre de enfermedad (SLE) o la supervivencia global (SG) en el sujeto. En una realizacion, la SLE o la SG se evaluan de aproximadamente 2 a 5 anos despues del inicio del tratamiento.
Tambien se desvela un metodo de reduccion del tamano tumoral en un sujeto que tiene un tumor no resecable que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un antagonista espedfico del VEGF, en el que la administracion reduce el tamano del tumor, permitiendo asi la resection completa del tumor. En una realizacion, el
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metodo incluye ademas administrar al sujeto una cantidad eficaz de un antagonista espedfico del VEGF despues de la reseccion completa del tumor.
Tambien se desvela un metodo de tratamiento del cancer en un sujeto que comprende las siguientes etapas: a) una primera fase que comprende una pluralidad de ciclos de tratamiento, en la que cada ciclo comprende la administracion al sujeto de una cantidad eficaz de un antagonista especifico del VEGF, por ejemplo, bevacizumab, y al menos un agente quimioterapeutico en un intervalo predeterminado; b) una cirugia definitiva mediante la que se elimina el cancer; y c) una segunda fase que comprende una pluralidad de ciclos de mantenimiento, en la que cada ciclo comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un antagonista especifico del VEGF, por ejemplo, bevacizumab, sin ningun agente quimioterapeutico en un intervalo predeterminado. En una realizacion, la primera fase comprende una primera pluralidad de ciclos de tratamiento, en la que se administran un antagonista especifico del VEGF, por ejemplo, bevacizumab, y un primer regimen quimioterapeutico, seguidos de una segunda pluralidad de ciclos de tratamiento, en la que se administran un antagonista especifico del VEGF, por ejemplo, bevacizumab, y un segundo regimen quimioterapeutico. En una realizacion, si el cancer que se va a tratar es cancer de mama, el primer regimen quimioterapeutico comprende doxorrubicina y ciclofosfamida, y el segundo regimen quimioterapeutico comprende paclitaxel.
Tambien se desvelan metodos que comprenden administrar a un sujeto con cancer metastasico o no metastasico, despues de la cirugia definitiva, una cantidad eficaz de un antagonista especifico del VEGF, por ejemplo, bevacizumab. En una realizacion, el metodo incluye ademas el uso de al menos un agente quimioterapeutico. El metodo se puede usar para prolongar la SLE o la Sg en el sujeto. En una realizacion, la SLE o la SG se evalua de aproximadamente 2 a 5 anos despues del inicio del tratamiento. En una realizacion, el sujeto esta sano durante al menos 1 a 5 anos despues del tratamiento.
En un aspecto, el metodo comprende las siguientes etapas: a) una primera fase que comprende una pluralidad de ciclos de tratamiento, en la que cada ciclo comprende la administracion al sujeto de una cantidad eficaz de un antagonista especifico del VEGf, por ejemplo, bevacizumab, y al menos un agente quimioterapeutico en un intervalo predeterminado; y b) una segunda fase que comprende una pluralidad de ciclos de mantenimiento, en la que cada ciclo comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un antagonista especifico del VEGF, por ejemplo, bevacizumab, sin ningun agente quimioterapeutico en un intervalo predeterminado, en el que la primera y la segunda fase combinadas duran al menos un ano despues del tratamiento postoperatorio inicial. En una realizacion, la primera fase comprende una primera pluralidad de ciclos de tratamiento, en la que se administran un antagonista especifico del VEGF, por ejemplo, bevacizumab, y un primer regimen quimioterapeutico, seguido de una segunda pluralidad de ciclos de tratamiento, en la que se administran un antagonista especifico del VEGF, por ejemplo, bevacizumab, y un segundo regimen quimioterapeutico. Si el cancer que se va a tratar es cancer de mama, por ejemplo, el primer regimen quimioterapeutico comprende doxorrubicina y ciclofosfamida, y el segundo regimen quimioterapeutico comprende paclitaxel.
De acuerdo con la invencion, el anticuerpo anti-VEGF, o el fragmento de union al antigeno del mismo, puede ser un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimerico, un anticuerpo completamente humano o un anticuerpo humanizado. Los ejemplos de anticuerpos utiles en la invencion incluyen bevacizumab (AVASTIN®), G6-31, B20- 4.1, y fragmentos de los mismos. El anticuerpo, o fragmento de union al antigeno del mismo, tambien puede ser un anticuerpo que carezca de una porcion Fc, un F(ab')2, un Fab o una estructura Fv.
Dependiendo del tipo y de la gravedad de la enfermedad, las dosis preferidas para el antagonista especifico del VEGF, por ejemplo, bevacizumab, se describen en el presente documento y pueden variar de aproximadamente 1 Mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, mas preferentemente de aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 15 mg/kg, incluyendo, pero sin limitacion, 7,5 mg/kg o 10 mg/kg. La frecuencia de administracion variara en funcion del tipo y de la gravedad de la enfermedad. Para administraciones repetidas durante varios dias o mas tiempo, dependiendo de la afeccion, el tratamiento se mantiene hasta que el cancer se trata o se obtiene el efecto terapeutico deseado, medido mediante los metodos descritos en el presente documento o conocidos en la tecnica. En un ejemplo, el anticuerpo antagonista especifico del VEGF de la invencion se administra una vez a la semana, cada dos semanas o cada tres semanas, a una dosis que varia de aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 15 mg/kg, incluyendo, pero sin limitacion, 7,5 mg/kg o 10 mg/kg. Sin embargo, pueden ser utiles otras pautas posologicas. El progreso de la terapia de la invencion se monitoriza facilmente mediante tecnicas y ensayos convencionales.
En realizaciones adicionales de cada uno de los aspectos anteriores, el antagonista especifico del VEGF se administra de forma local o sistemica (por ejemplo, por via oral o por via intravenosa). En una realizacion, el tratamiento con un antagonista especifico del VEGF se prolonga hasta que el paciente ha estado sin cancer durante un periodo de tiempo seleccionado del grupo que consiste en 1 ano, 2 anos, 3 anos, 4 anos, 5 anos, 6 anos, 7 anos, 8 anos, 9 anos, 10 anos, 11 anos y 12 anos.
Aunque el sujeto se puede tratar en una serie de diferentes formas antes, durante o despues de la administracion del antagonista especifico del VEGF, en una realizacion de cada uno de los aspectos de la invencion, el sujeto se trata sin cirugia o quimioterapia. En otras realizaciones, el tratamiento con el antagonista especifico del VEGF es
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una monoterapia o una monoterapia para la duracion del periodo de tratamiento con antagonista espedfico del VEGF, segun lo evaluado por el medico clinico o descrito en el presente documento.
En otras realizaciones, el tratamiento con el antagonista espedfico del VEGF esta en combinacion con una terapia adicional contra el cancer, incluyendo, pero sin limitacion, la cirugia, la radioterapia, la quimioterapia, la terapia de diferenciacion, la bioterapia, la terapia inmune, un inhibidor de la angiogenesis y un compuesto antiproliferativo. El tratamiento con el antagonista espedfico del VEGF tambien puede incluir cualquier combinacion de los anteriores tipos de regimenes terapeuticos. Ademas, se pueden usar agentes citotoxicos, agentes antiangiogenicos y agentes antiproliferativos en combinacion con el antagonista espedfico del VEGF. En una realizacion, la terapia contra el cancer es quimioterapia. Por ejemplo, el agente quimioterapeutico se selecciona entre, por ejemplo, agentes, de alquilacion, antimetabolitos, analogos de acido folico, analogos de pirimidina, analogos de purina e inhibidores relacionados, alcaloides de la vinca, epipodopilotoxinas, antibioticos, L-asparaginasa, inhibidor de la topoisomerasa, interferones, complejos de coordinacion de platino, urea sustituida con antracenediona, derivados de metilhidrazina, supresor adrenocortical, adrenocorticosteroides, progestinas, estrogenos, antiestrogenos, androgenos, antiandrogenos, analogo de la hormona liberadora de gonadotropina, etc. En algunos aspectos, el agente quimioterapeutico y el antagonista espedfico del VEGF se administran al mismo tiempo.
En las realizaciones que incluyen una terapia adicional contra el cancer, el sujeto se puede tratar ademas con la terapia adicional contra el cancer antes, durante (por ejemplo, simultaneamente) o despues de la administracion del antagonista espedfico del VEGF. En una realizacion, la terapia contra el cancer es quimioterapia que incluye la administracion de irinotecan, fluorouracilo, leucovorina, gemcitabina o una combinacion de los mismos. En una realizacion, el antagonista espedfico del VEGF, administrado solo o con una terapia contra el cancer, se puede administrar como terapia de mantenimiento. En un aspecto, la terapia contra el cancer para el cancer de prostata, cancer de ovario y cancer de mama puede ser terapia hormonal. En una realizacion ilustrativa, el antagonista espedfico del VEGF se administra en combinacion con una terapia contra el cancer que no incluye un anticuerpo anti-HER2, o fragmento o derivado del mismo (por ejemplo, el anticuerpo Herceptin®).
Los tratamientos de la invencion son particularmente ventajosos en la prevencion de los tumores en fase temprana, previniendose asi la progresion a las fases mas avanzadas, lo que da lugar a una reduccion de la morbilidad y la mortalidad asociadas con el cancer avanzado.
Para los tratamientos de la invencion, el cancer puede ser un tumor solido, por ejemplo, tal como cancer de mama, cancer colorrectal, cancer rectal, cancer de pulmon, cancer de celulas renales, un glioma (por ejemplo, el astrocitoma anaplasico, oligoastrocitoma anaplasico, oligodendroglioma anaplasico, glioblastoma multiforme), cancer de rinon, cancer de prostata, cancer de higado, cancer de pancreas, sarcoma de tejidos blandos, carcinoma carcinoide, cancer de cabeza y cuello, melanoma y cancer de ovario. En una realizacion, el cancer es un cancer gastrointestinal.
En realizaciones adicionales de cada uno de los aspectos anteriores, el antagonista espedfico del VEGF se administra en una cantidad o durante un tiempo (por ejemplo, para un determinado regimen terapeutico a lo largo del tiempo) para reducir (por ejemplo, un 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % , 90 %, 100 % o mas) el numero de celulas cancerosas del tumor o del cancer, incluyendo, pero sin limitacion, los canceres benignos, precancerosos o no metastasicos; para reducir el tamano del tumor, polipo o adenoma; para reducir la carga tumoral; para inhibir (es decir, para disminuir en cierta medida y/o detener) la infiltracion de celulas cancerosas en organos perifericos; para reducir la secrecion hormonal; para reducir el numero de polipos; para reducir la densidad de los vasos en el tumor o cancer, incluyendo, pero sin limitacion, el cancer benigno, precanceroso o no metastasico; para inhibir la metastasis tumoral; para reducir o inhibir el crecimiento tumoral o la proliferacion de celulas tumorales; para reducir o prevenir el crecimiento de un tumor latente; para reducir o prevenir el crecimiento o la proliferacion de una micrometastasis; para reducir o prevenir la rebrote de un tumor tras su tratamiento o eliminacion; para aumentar o prolongar la SLE o SG de un sujeto susceptible de padecer o diagnosticado de un tumor benigno, precanceroso o no metastasico; y/o para aliviar en cierta medida uno o mas de los sintomas asociados con el cancer. En un ejemplo, la supervivencia se mide como la SLE o la SG en el sujeto, en el que la SLE o la SG se evaluan aproximadamente de 2 a 5 anos despues del inicio del tratamiento. De acuerdo con la invencion, el antagonista espedfico del VEGF se usa para prevenir la aparicion de cancer en el sujeto.
Otras caracteristicas y ventajas de la invencion seran evidentes a partir de la siguiente description detallada, de las figuras y de las reivindicaciones.
Breve descripcion de las figuras
Las FIGURAS 1A-1F son una serie de microfotografias que muestran la expresion de VEGF-A en adenomas Apcmin/+ y vellosidades normales. La hibridacion in situ con sonda de VEGF-A en un adenoma intestinal de intestino delgado (FIGURAS 1A, 1D) y de intestino grueso (FIGURAS 1B, 1E), asi como en vellosidades normales (FIGURAS 1C, 1F) de un raton Apcmin/+ de 14 semanas de vida demuestra la expresion de VEGF-A en las celulas epiteliales (flechas) y del estroma (puntas de flecha). Campo claro; FIGURAS 1A-1C, campo oscuro; FIGURAS 1D-1F.
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Las FIGURAS 2A-2F son una serie de graficas que muestran que la inhibicion de VEGF-A disminuye la carga tumoral y prolonga la supervivencia. La FIGURA 2A es una grafica que muestra la carga tumoral de cada raton del grupo. La carga tumoral se indica mediante barras desde el mayor valor al minimo valor de carga tumoral. Las cruces blancas indican las medias de los grupos. *P < 0,008, **p < 5,3 x 10-5. N designa el numero de animales. La FIGURA 2B es una serie de graficas que muestran la distribucion de los tumores por diametro y como el porcentaje del numero total de tumores. N designa el numero de tumores de un grupo. La FIGURA 2C es una serie de graficas que muestran la superposicion de las frecuencias del tamano tumoral tras 3 semanas de tratamiento (parte superior) y tras 6 semanas de tratamiento (mitad). El grafica inferior muestra una superposicion de la frecuencia del tamano tumoral en comparacion con el dia 0 (parte inferior). Las barras verticales ilustran el tamano mas pequeno o igual del que la frecuencia del tumor es mayor en animales tratados con mAb G6-31; 1 mm en el grupo de tratamiento de 3 semanas y 1,2 mm en el grupo de tratamiento de 6 semanas. La FIGURA 2D es una grafica que muestra el diametro medio del tumor representado frente a la ubicacion en el intestino. N designa el numero de tumores por grupo en el primer, segundo, tercer y cuarto cuarto intestinal, respectivamente. El grupo del Dia 0 contenia doce animales, el resto de grupos, diez. S: estomago, C: ciego, R: recto. Las barras representan el ETM. *P < 1,0 x 10-10, **p < 0,002 en comparacion con Ab G6-31 3 o 6 semanas. La FIGURA 2E es una grafica que muestra el diametro medio del tumor de catorce ratones Apcmin/+; Villin-Cre (columnas negras) y Apcmin/+; vEGFlox; Villin-Cre (columnas grises) presentado en orden decreciente. Las barras representan la desviacion estandar (DE). La FIGURA 2F es una grafica que muestra el de Kaplan- Meier de ratones tratados con mAb G6-31 (linea gris) o IgG de control (linea negra). La flecha sin colorear designa la duracion de los tratamientos. La mediana de la supervivencia se indica con las flechas de color gris. *P < 2,4 x 10-3. N designa el numero de ratones de un grupo.
Las FIGURAS 3A-3L muestran los efectos del tratamiento anti-VEGF-A en la alteracion de la morfologia del tumor, pero no el indice de proliferacion. Las FIGURAS 3A-3B son microfotografias de un segmento yeyunal de intestino delgado tenido con azul de metileno. Las FIGURAS 3C-3D son microfotografias que muestran imagenes de bajo aumento de un corte tenido con H&E de yeyuno. Las FIGURAS 3E-3F son fotomicrografias que muestran imagenes de alta magnificacion de un corte de tumor tenido con H&E de yeyuno. Las FIGURAS 3G-3J son fotomicrografias que muestran la tincion inmunohistoquimica con anticuerpo Ki-67 de tejido tumoral y mucosa normal. Contratincion con H&E. La FIGURA 3K es una grafica que muestra el indice de proliferacion expresado como el porcentaje de nucleos positivos para Ki-67 con respecto al numero total de nucleos. Las barras representan el ETM. La FIGURA 3L es un analisis de transferencia Western de lisados de mucosas normales de animales tratados con IgG de control (N1-N4) o mAb G6-31 (N5-N8). Lisados tumorales de animales tratados con IgG de control (T1-T4) o mAb G6-31 (T5-T8).
Las FIGURAS 4A-4C muestran la reduction de la densidad de la superficie de los vasos tumorales tras el tratamiento con mAb G6-31. Las FIGURAS 4A-4B son imagenes confocales de cortes de 80 |jm de tincion inmunohistoquimica de tumores de yeyuno. Verde - CD31, celulas endoteliales vasculares; azul - E-cadherina, celulas epiteliales; rojo - actina de musculo liso. La FIGURA 4C es una grafica que muestra la densidad vascular expresada como el porcentaje de superficie positiva para CD31 con respecto a la superficie total del tumor analizado. Las barras representan el ETM; n designa el numero de tumores analizados.
Las FIGURAS 5A-5D son una serie de graficas que muestran que el tratamiento anti-VEGF-A inhibe el crecimiento tumoral hipofisario. La FIGURA 5A es una grafica que muestra el volumen tumoral medio de los grupos tratados con la IgG de control (linea negra) y mAb G6-31 (linea gris) los dias 9, 25, 39, 53 y 67 del tratamiento. Las barras representan el ETM. N designa el numero de ratones del grupo. La FIGURA 5B es una grafica que muestra los volumenes tumorales de ratones individuales tratados con IgG de control (lineas continuas) o con mAb G6-31 (lineas discontinuas). Se sacrificaron siete ratones antes del punto final del estudio debido a su mala salud (lineas que terminan antes del punto temporal de los 67 dias). La FIGURA 5C es una grafica que muestra la duplication de la supervivencia sin tumor de los grupos tratados con la IgG de control (linea negra) y con mAb G6-31 (linea gris) evaluados a los 9, 25, 39, 53 y 67 dias de iniciarse el tratamiento. La FIGURA 5D es una grafica que muestra las mediciones del volumen tumoral de los transplantes subcutaneos de tumor hipofisario tratados con la IgG de control (linea negra) y con mAb G6-31 (linea gris) a los 1, 7, 14, 21,28 y 35 dias de tratamiento. Las barras representan el ETM. N designa el numero de ratones del grupo.
La FIGURA 6 es una grafica que muestra que los adenomas de hipofisis y los adenomas hipofisarios Men1+/- expresan VEGF-A, VEGFR-1 y VEGFR-2. Se muestra la expresion relativa de VEGF-A, VEGFR-1 y VEGFR-2 para la hipofisis de tipo silvestre (columna negra), tejido no tumoral de hipofisis de ratones Men1+/- (gris), adenomas hipofisario de pequeno tamano sin tratar, tumores hipofisarios tratados con IgG de control (rojo) y con mAb G6-31 (azul) de ratones Men1+/-. Las barras representan el ETM. Ns; no significativo.
La FIGURA 7 es una serie de imagenes de MRI de tumores hipofisarios representativos de ratones Men1+/-. Se muestran cortes coronales con adenomas hipofisarios de un raton tratado con IgG de control y con mAb G6-31 a los 9, 39 y 67 dias del tratamiento. Para el dia nueve, los bordes de los adenomas hipofisarios se han destacado con asteriscos amarillos. El volumen del tumor tratado con IgG de control fue de 23,2; 55,9 y 142,0 mm3, y el del tumor tratado con mAb G6-31 de 18,9; 27,2 y 35,3 mm3 a los 9, 39 y 67 dias de iniciarse el tratamiento, respectivamente.
Las FIGURAS 8A-8H son una serie de imagenes que muestran el examen histologico de tumores hipofisarios y de pancreas de ratones Men1+/-. Las FIGURAS 8A-8B muestran tumores hipofisarios tenidos con H&E, y las FIGURAS 8E-8F muestran tumores pancreaticos tenidos con H&E. Las FIGURAS 8C-8D muestran la tincion inmunohistoquimica de tumores hipofisarios in situ con marcador panendotelial MECA-32, y las FIGURAS 8G-8H muestran la tincion inmunohistoquimica de tumores de pancreas in situ con marcador panendotelial MECA-32.
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La FIGURA 8I es una grafica que muestra los resultados del ensayo de la densidad vascular en los tumores hipofisarios, y la FIGURA 8J es una grafica que muestra los resultados del ensayo de la densidad vascular en los tumores pancreaticos en animales tratados con IgG de control y anti-VEGF. Las barras representan la DE. Ns = no significativo.
Las FIGURAS 9A-9D son una serie de imagenes que muestran que los tumores hipofisarios de ratones Men1+/- y trasplantes de tumores hipofisarios se tinen positivos para la prolactina. Se muestra la tincion inmunohistoquimica para tumores hipofisarios in situ (FIGURAS 9A-9B) y los trasplantes subcutaneos de tumores hipofisarios (FIGURAS 9C-9D) con anticuerpo anti-prolactina. La FIGURA 9E y 9F son imagenes que muestran que el tumor hipofisario trasplantado adyacente a la glandula mamaria muestra cambios en la secrecion inducida por la prolactina (lado izquierdo de la imagen).
Las FIGURAS 10A-10D muestran que los niveles de prolactina y hormona del crecimiento en suero son elevados en ratones con tumores hipofisarios y trasplantes de tumores hipofisarios. La FIGURA 10A es una grafica que muestra el nivel de PRL en suero (ng/ml) representado frente al volumen del tumor hipofisario (mm3) de 19 ratones Men1+/- no tratados, portadores de tumores, ilustrando una correlacion positiva. La FIGURA 10B es una grafica que muestra el nivel de PRL en suero representado frente al volumen del tumor hipofisario de ratones Men1+/- tratados con la IgG de control (triangulos negros) y mAb G6-31 (esferas grises) en el punto final del estudio. Las FIGURAS 10C-10D son graficas que muestran los niveles de prolactina (C) y de hormona del crecimiento (D) en suero de los ratones con trasplantes de adenoma hipofisario el dia 1 y el dia 35 del tratamiento.
La FIGURA 11 es una grafica que muestra los efectos del tratamiento anti-VEGF ("intervencion") durante la progresion del tumor en fase temprana en el modelo de ratones Rip-TpAg del desarrollo de tumores de los islotes pancreaticos. La grafica muestra la reduccion de la angiogenesis tumoral, medida por el numero medio de islotes angiogenicos despues del tratamiento con un anticuerpo anti-VEGF a las 9 a 11 semanas, en comparacion con el tratamiento con un anticuerpo monoclonal de control de isotipo coincidente.
Las FIGURAS 12A y 12B muestran los resultados del ensayo de regresion, en el que no se detectaron diferencias significativas en la carga tumoral ni en la supervivencia entre el tratamiento con un anticuerpo anti- VEGF y un anticuerpo monoclonal de control de isotipo coincidente en el modelo de ratones Rip-TpAg de desarrollo de tumores de los islotes pancreaticos. La FIGURA 12A es una grafica que muestra la carga tumoral en los ratones tratados con un anticuerpo anti-VEGF en comparacion con los tratados con un anticuerpo monoclonal de control de isotipo coincidente. La FIGURA 12B es una grafica que muestra la supervivencia a lo largo del tiempo de los ratones tratados con un anticuerpo anti-VEGF en comparacion con los tratados con un anticuerpo monoclonal de control de isotipo coincidente.
La FIGURA 13 es una grafica que muestra la eficacia de la terapia anti-VEGF prolongada para suprimir el nuevo brote de tumores despues de la citorreduccion con taxanos o gemcitabina.
Las FIGURAS 14A-14D son una serie de imagenes que muestran que el adenoma hipofisario primario sin tratar (FIGURA 14A, encima de la linea de puntos) es variable y debilmente positivo para la hormona del crecimiento en comparacion con la hipofisis anterior normal adyacente (por debajo de la linea de puntos). Uno de los cuatro tumores hipofisarios trasplantados (tratado con IgG de control) fue debilmente positivo de la hormona del crecimiento (FIGURA 14B). Los tumores hipofisarios primarios de los ratones tratados con mAb G6-31 (FIGURA 14C) o IgG de control (FIGURA 14D) son focalmente positivos para la hormona del crecimiento.
Descripcion detallada
I. Definiciones
El termino "VEGF" o "VEGF-A" se usa para referirse al factor de crecimiento de celulas endoteliales vasculares humano de 165 aminoacidos y a los factores de crecimiento de celulas endoteliales vasculares humanos relacionados de 121, 145, 189 y 206 aminoacidos, segun lo descrito por, por ejemplo, Leung et al. Science, 246:1306 (1989), y Houck et al. Mol. Endocrin., 5:1806 (1991), junto con las formas alelicas de origen natural y las formas procesadas de los mismos. VEGF-A forma parte de la familia de genes que incluye el VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F y PIGF. VEGF-A se une principalmente a dos receptores tirosina quinasa de alta afinidad, VEGFR-1 (Flt-1) y VEGFR-2 (FIk- 1/KDR), siendo este ultimo el principal transmisor de senales mitogenicas de celulas endoteliales vasculares del VEGF-A. Ademas, la neuropilina-1 se ha identificado como un receptor para las isoformas de VEGF-A de union a la heparina, y puede desempenar un papel en el desarrollo vascular. El termino "VEGF" o "VEGF-A" tambien se refiere a los VEGF de especies no humanas tales como de raton, rata o primate. A veces, el VEGF de una determinada especie se indica mediante terminos tales como hVEGF para el VEGF humano o mVEGF para el VEGF murino. El termino "VEGF" tambien se usa para hacer referencia a las formas truncadas o los fragmentos polipeptidicos que comprenden los aminoacidos 8 a 109 o 1 a 109 del factor de crecimiento de celulas endoteliales vasculares humano de 165 aminoacidos. La referencia a cualquiera de dichas formas de VEGF se puede identificar en la presente solicitud, por ejemplo, mediante "VEGF (8-109)", "VEGF (1-109)" o "VEGF165”. Las posiciones de los aminoacidos para un VEGF nativo “truncado" se numeran como se indica en la secuencia del VEGF nativo. Por ejemplo, la posicion del aminoacido 17 (metionina) en el VEGF nativo truncado tambien es la posicion 17 (metionina) en el VEGF nativo. El VEGF nativo truncado tiene afinidad de union por los receptores KDR y Flt-I comparable al VEGF nativo.
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El termino "variante de VEGF", como se usa en el presente documento, se refiere a un polipeptido VEGF que incluye una o mas mutaciones de aminoacidos en la secuencia de VEGF nativa. Opcionalmente, las una o mas mutaciones de aminoacidos incluyen una o varias sustituciones de aminoacidos. A los efectos de designar de manera abreviada las variantes de VEGF descritas en el presente documento, cabe senalar que los numeros hacen referencia a la posicion del resto de aminoacido a lo largo de la secuencia de aminoacidos del VEGF nativo putativo (proporcionado en Leung et al., supra y Houck et al., supra).
Un polipeptido de "secuencia nativa" comprende un polipeptido que tiene la misma secuencia de aminoacidos que un polipeptido obtenido de la naturaleza. Por lo tanto, un polipeptido de secuencia nativa puede tener la secuencia de aminoacidos del polipeptido de origen natural de cualquier mamifero. Dicho polipeptido de secuencia nativa puede aislarse de la naturaleza o puede producirse mediante medios recombinantes o sinteticos. La expresion polipeptido de "secuencia nativa" abarca especificamente las formas truncadas o secretadas de origen natural del polipeptido (por ejemplo, una secuencia de dominio extracelular), las formas de variantes de origen natural (por ejemplo, las formas cortadas y empalmadas de manera alternativa) y las variantes alelicas de origen natural del polipeptido.
Una "variante" de polipeptido significa un polipeptido biologicamente activo que tiene al menos aproximadamente el 80 % de identidad de secuencia de aminoacidos con el polipeptido de secuencia nativa. Dichas variantes incluyen, por ejemplo, polipeptidos en los que se anaden, o se eliminan, uno o mas restos de aminoacidos en el extremo N- o C-terminal del polipeptido. Habitualmente, una variante tendra al menos aproximadamente el 80 % de identidad de secuencia de aminoacidos, mas preferentemente al menos aproximadamente el 90 % de identidad de secuencia de aminoacidos, e incluso mas preferentemente al menos aproximadamente el 95 % de identidad de secuencia de aminoacidos con el polipeptido de secuencia nativa.
"Actividad biologica de VEGF" incluye la union a cualquier receptor del VEGF o cualquier actividad de senalizacion de VEGF como la regulacion de la angiogenesis y vasculogenesis normal y anormal (Ferrara y Davis-Smyth (1997) Endocrine Rev. 18:4-25; Ferrara (1999) J. Mol. Med. 77:527-543); la potenciacion de la vasculogenesis y la angiogenesis embrionarias (Carmeliet et al. (1996) Nature 380:435-439; Ferrara et al. (1996) Nature 380:439-442); y la modulacion de la proliferacion de los vasos sanguineos ciclicos en el tracto reproductivo femenino y para el crecimiento oseo y la formacion de cartilago (Ferrara et al. (1998) Nature Med. 4:336-340; Gerber et al,. (1999) Nature Med. 5:623-628). Ademas de ser un factor angiogenico en la angiogenesis y la vasculogenesis, el VEGF, como un factor de crecimiento pleiotropico, presenta multiples efectos biologicos en otros procesos fisiologicos tales como la supervivencia de celulas endoteliales, la permeabilidad y la vasodilatacion de los vasos, la quimiotaxis de los monocitos y la entrada de calcio (Ferrara y Davis-Smyth (1997), supra y Cebe-Suarez et al., Cell. Mol. Life Sci. 63:601-615 (2006)). Por otra parte, estudios recientes han informado de efectos mitogenicos del VEGF en unos cuantos tipos de celulas no endoteliales tales como las celulas epiteliales pigmentarias de la retina, celulas del conducto pancreatico y celulas de Schwann. Guerrin et al (1995) J. Cell Physiol. 164:385-394; Oberg-Welsh et al. (1997) Mol. Cell. Endocrinol. 126:125-132; Sondell et al. (1999) J. Neurosci. 19:5731-5740.
En el presente documento, se describe un "antagonista especifico del VEGF", en el apartado III.
Un "anticuerpo anti-VEGF" es un anticuerpo que se une al VEGF con suficiente afinidad y especificidad. El anticuerpo seleccionado normalmente tendra una afinidad de union suficientemente fuerte por VEGF, por ejemplo, el anticuerpo puede unirse a hVEGF con un valor de Kd de entre 100 nM y 1 pM. Las afinidades de los anticuerpos se pueden determinar mediante un ensayo basado en resonancia de plasmon superficial (tal como el ensayo BIAcore como se describe en la publicacion de solicitud PCT n.° WO2005/012359); ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELISA); y ensayos de competicion (por ejemplo, RIA), por ejemplo. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-VEGF de la invencion se puede usar como un agente terapeutico en la direccion e interferencia con enfermedades o afecciones en las que participa la actividad del VEGF. Ademas, el anticuerpo puede someterse a otros ensayos de actividad biologica, por ejemplo, para evaluar su eficacia como agente terapeutico. Dichos ensayos son conocidos en la tecnica y dependen del antigeno diana y del uso previsto para el anticuerpo. Los ejemplos incluyen el ensayo de inhibicion de HUVEC (como se describe en los Ejemplos que se presentan a continuacion); ensayos de inhibicion del crecimiento de celulas tumorales (como se describe en el documento WO 89/06692, por ejemplo); ensayos de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y citotoxicidad mediada por el complemento (CDC) (patente de EE.UU. n.° 5.500.362); y ensayos de actividad agonista o hematopoyesis (vease el documento WO 95/27062). Un anticuerpo anti-VEGF, por lo general, no se unira a otros homologos de VEGF tales como el VEGF-B o VEGF-C, ni a otros factores de crecimiento tales como PlGF, PDGF o bFGF. Se puede encontrar informacion adicional acerca de los anticuerpos anti-VEGF en el apartado III, A.
A lo largo de la presente memoria descriptiva y de las reivindicaciones, la numeracion de los restos en una cadena pesada de inmunoglobulina es la del indice Eu como en Kabat et al., “Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991). El "indice EU como en Kabat” se refiere a la numeracion de los restos del anticuerpo IgG1 UE humano.
El termino "anticuerpo" se usa en el sentido mas amplio y cubre, en concreto, los anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecificos
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(por ejemplo, anticuerpos biespedficos) y fragmentos de anticuerpos, siempre que muestren la actividad biologica deseada.
La “Kd" o "valor de Kd" de acuerdo con la presente invencion, en una realization, se mide mediante un ensayo de union al VEGF radiomarcado (RIA) realizado con la version Fab del anticuerpo y una molecula de VEGF como se describe mediante el siguiente ensayo, que mide la afinidad de union en solution de Fab hacia VEGF equilibrando los Fab con una concentration minima de VEGF(109) marcado con 125I en presencia de una serie de valoracion de VEGF no marcado, a continuation, capturando el VEGF unido con una placa recubierta de anticuerpo anti-Fab (Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293;865-881). Para establecer las condiciones para el ensayo, se recubren placas de microvaloracion (Dynex) durante la noche con 5 ug/ml de un anticuerpo de captura anti-Fab (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (pH 9,6) y, posteriormente, se bloquean con albumina de suero bovino al 2 % (p/v) en PBS durante dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C). En una placa no adsorbente (Nunc n.° 269620), se mezclan VEGF(109) marcado con 125I 100 pM o 26 pM con diluciones en serie de un Fab de interes, por ejemplo, Fab-12 (Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599). Luego, se incuba el Fab de interes durante la noche, aunque la incubation puede continuar durante 65 horas para asegurar que se alcance el equilibrio. A continuacion, se transfieren las mezclas a la placa de captura para la incubacion a temperatura ambiente durante una hora. Despues, se retira la solucion y se lava la placa ocho veces con Tween-20 al 0,1 % en PBS. Cuando las placas se han secado, se anaden 150 ul/pocillo de agente de centelleo (MicroScint-20; Packard), y se realiza el recuento de las placas en un contador gamma Topcount (Packard) durante diez minutos. Las concentraciones de cada Fab que dan menos del o igual al 20 % de la union maxima se seleccionan para su uso en ensayos de union competitiva. De acuerdo con otra realizacion, la Kd o el valor de Kd se mide usando ensayos de resonancia de plasmon superficial usando un BIAcoreTM-2000 o un BIAcoreTM-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 °C con chips CM5 con hVEGF(8-109) inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (UR). En resumen, se activan chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) con clorhidrato de N-etil-N-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se diluye vEgF humano con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, en 5 ug/ml (~0,2 um) antes de la inyeccion a un caudal de 5 ul/minuto para conseguir aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de proteina acoplada. Tras la inyeccion del VEGF humano, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos sin reaccionar. Para las mediciones de cinetica, se inyectan diluciones en serie con factor de dilution 2 de Fab (0,78 nM a 500 nM) en PBS con Tween 20 al 0,05 % (PBSt) a 25 °C a un caudal de aproximadamente 25 ul/min. Se calculan las velocidades de asociacion (kas) y las velocidades de disociacion (Kdis) usando un modelo de union de Langmuir de uno a uno sencillo (software de evaluation BIAcore, version 3.2) ajustando simultaneamente los sensogramas de asociacion y disociacion. La constante de disociacion de equilibrio (Kd) se calculo como la proportion de kdis/kas. Vease, por ejemplo, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Si la velocidad de asociacion es superior a 106 M-1 S-1 mediante el ensayo de resonancia de plasmon superficial anterior, la velocidad de asociacion se puede determinar usando una tecnica de inactivation fluorescente que mida el aumento o la disminucion en la intensidad de emision de fluorescencia (excitation = 295 nm; emision = 340 nm, paso de banda de 16 nm) a 25 °C de un anticuerpo anti- VEGF 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de forma corta de VEGF humano (8-109) o VEGF de raton medidas en un espectrometro, tal como un espectrofotometro dotado de detention de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotometro SLM-Aminco serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.
Un anticuerpo "bloqueante" o un anticuerpo "antagonista" es aquel que inhibe o reduce la actividad biologica del antigeno al que se une. Por ejemplo, un anticuerpo antagonista especifico del VEGF se une al VEGF e inhibe la capacidad del VEGF para inducir la proliferation de celulas endoteliales vasculares. Los anticuerpos bloqueantes preferidos o anticuerpos antagonistas inhiben completamente la actividad biologica del antigeno.
A menos que se indique lo contrario, la expresion "anticuerpo multivalente" se usa a lo largo de la presente memoria descriptiva para denotar un anticuerpo que comprende tres o mas sitios de union al antigeno. Por ejemplo, el anticuerpo multivalente se disena para que tenga los tres o mas sitios de union al antigeno y, en general, no es un anticuerpo IgM o IgA de secuencia nativa.
Un fragmento "Fv" es un fragmento de anticuerpo que contiene un sitio de reconocimiento y de union al antigeno completo. Esta region consiste en un dimero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera estrechamente asociado, que puede ser de naturaleza covalente, por ejemplo, en scFv. Es en esta configuration que las tres CDR de cada dominio variable interactuan para definir un sitio de union al antigeno en la superficie del dimero Vh-Vl. En conjunto, las seis CDR o un subconjunto de las mismas confieren especificidad de union al antigeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres CDR especificas de un antigeno) tiene la capacidad de reconocer y de unirse al antigeno, aunque normalmente a una afinidad menor que el sitio de union entero.
Como se usa en el presente documento, "dominio variable de anticuerpo" se refiere a las porciones de la cadenas ligera y pesada de moleculas de anticuerpo que incluyen secuencias de aminoacidos de regiones determinantes de la complementariedad (CDR; es decir, CDR1, CDR2 y CDR3) y regiones marco conservadas (FR). Vh se refiere al dominio variable de la cadena pesada. Vl se refiere al dominio variable de la cadena ligera. De acuerdo con los metodos usados en la presente invencion, las posiciones de aminoacidos asignadas a las CDR y FR se pueden
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definir de acuerdo con Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 y 1991)). La numeracion de los aminoacidos de los anticuerpos o de los fragmentos de union al antigeno tambien se realiza de acuerdo con la de Kabat.
Como se usa el presente documento, la expresion "regiones determinantes de la complementariedad" (CDR; es decir, CDR1, CDR2 y CDR3) se refiere a los restos de aminoacidos de un dominio variable de anticuerpo, cuya presencia es necesaria para la union al antigeno. Cada dominio variable normalmente tiene tres regiones cDr identificadas como CDR1, CDR2 y CDR3. Cada region determinante de la complementariedad puede comprender restos de aminoacidos de una "region determinante de la complementariedad" segun lo definido por Kabat (es decir, aproximadamente los restos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) del dominio variable de cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) del dominio variable de la cadena pesada; Kabat et al., “Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5a Ed. Public Health Service. National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o los restos de un "bucle hipervariable" (es decir, aproximadamente los restos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) del dominio variable de cadena ligera, y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) del dominio variable de cadena pesada; Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). En algunos casos, una region determinante de la complementariedad puede incluir aminoacidos de tanto una region CDR definida de acuerdo con Kabat como de un bucle hipervariable. Por ejemplo, CDRH1 de la cadena pesada del anticuerpo 4D5 incluye los aminoacidos 26 a 35.
Las "regiones marco conservadas" (de aqui en adelante FR) son aquellos restos del dominio variable diferentes de los restos de las CDR. Cada dominio variable normalmente tiene cuatro FR identificadas como FR1, FR2, FR3 y FR4. Si las CDR se definen de acuerdo con Kabat, los restos de FR de la cadena ligera se situan aproximadamente en los restos 1-23 (LCFR1), 35-49 (LCFR2), 5-88 (LCFR3) y 98-107 (LCFR4), y los restos de FR de la cadena pesada se situan aproximadamente en los restos 1-30 (HCFR1), 36-49 (HCFR2), 66-94 (HCFR3) y 103-113 (HCFR4) en los restos de la cadena pesada. Si las CDR comprenden restos de aminoacidos de los bucles hipervariables, los restos de FR de la cadena ligera se situan aproximadamente en los restos 1-25 (LCFR1), 33-49 (LCFR2), 53-90 (LCFR3) y 97-107 (LCFR4) de la cadena ligera, y los restos de FR de la cadena pesada se situan aproximadamente en los restos 1-25 (HCfR1), 33-52 (HCFR2), 56-95 (HCFR3) y 102-113 (HCFR4) en los restos de la cadena pesada. En algunos casos, cuando la CDR comprende los aminoacidos tanto de una CDR segun lo definido por Kabat como de un bucle hipervariable, los restos de FR se ajustaran correspondientemente. Por ejemplo, cuando CDRH1 incluye los aminoacidos H26-H35, los restos de fR1 de cadena pesada estan en las posiciones 1-25 y los restos de FR2 estan en las posiciones 36-49.
El fragmento "Fab" contiene un dominio variable y un dominio constante de la cadena ligera, y un dominio variable y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos de anticuerpo F(ab)2 comprenden un par de fragmentos Fab que, en general, estan unidos covalentemente cerca de sus extremos carboxi por cisteinas bisagra entre ellos. En la tecnica, tambien se conocen otros acoplamientos quimicos de fragmentos de anticuerpos.
Los fragmentos de anticuerpo "Fv monocatenarios" o "scFv" comprenden los dominios Vh y Vl del anticuerpo, en los que estos dominios estan presentes en una sola cadena polipeptidica. En general, el polipeptido de Fv comprende ademas un enlazador polipeptidico entre los dominios Vh y Vl, que permite al scFv formar la estructura deseada para unirse al antigeno. Para una revision de los scFv, vease, por ejemplo, Pluckthun, en “The Pharmacology of Monoclonal Antibodies”, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., (Springer-Verlag, Nueva York, pag. 269-315 (1994).
El termino "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo pequenos con dos sitios de union al antigeno, comprendiendo dichos fragmentos un dominio variable de cadena pesada (Vh) conectado a un dominio variable de cadena ligera (Vl) en la misma cadena polipeptidica (Vh y Vl). Mediante el uso de un enlazador que sea demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, se fuerza a los dominios a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y a crear dos sitios de union al antigeno. Los diacuerpos se describen mas detalladamente, por ejemplo, en los documentos EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 90: 6444-6448 (1993).
La expresion "anticuerpos lineales" se refiere a los anticuerpos descritos en Zapata et al., Protein Eng, 8(10):1057- 1062 (1995). En resumen, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos Fd en tandem (Vh-Ch1-Vh-Ch1) que, junto con los polipeptidos de cadena ligera complementaria, forman un par de regiones de union al antigeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecificos o monoespecificos.
La expresion "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una poblacion de anticuerpos esencialmente homogeneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la poblacion son identicos excepto en posibles mutaciones de origen natural, que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente especificos, estando dirigidos contra un solo sitio antigenico. Ademas, en contraste con los preparados de anticuerpos convencionales (policlonales) que normalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo determinante en el antigeno. El adjetivo "monoclonal" indica el caracter del anticuerpo como aquel obtenido a partir de una poblacion de anticuerpos esencialmente homogenea, y se ha de entender que no requiere la produccion del anticuerpo mediante cualquier metodo en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para su uso de acuerdo con la presente invencion se pueden preparar
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mediante el metodo del hibridoma, descrito por primera vez por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o se pueden preparar mediante metodos de ADN recombinante (vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. n.° 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" tambien pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpos de fagos usando las tecnicas descritas en Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), por ejemplo.
Los anticuerpos monoclonales del presente documento incluyen especificamente anticuerpos "quimericos" en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es identica u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una determinada especie o que pertenecen a una clase o subclase determinada de anticuerpos, mientras que el resto de la/s cadena/s es identico u homologo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, asi como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que muestren la actividad biologica deseada (patente de EE.UU. n.° 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 81:6851-6855 (1984)).
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quimericos que contienen la secuencia minima derivada de inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los restos de una region hipervariable del receptor se reemplazan por restos de una region hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como de raton, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los restos de la region marco conservada Fv (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por restos no humanos correspondientes. Ademas, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se pueden realizar para mejorar mas el rendimiento del anticuerpo. En general, un anticuerpo humanizado comprendera esencialmente todos de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los que todos o esencialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana, y todas o esencialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado tambien comprendera opcionalmente al menos una parte de la region constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Para mas detalles, vease, por ejemplo, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).
Un "anticuerpo humano" es aquel que posee una secuencia de aminoacidos que corresponde con la de un anticuerpo producido por un ser humano y/o que se ha producido usando cualquiera de las tecnicas de produccion de anticuerpos humanos segun lo desvelado en el presente documento. Esta definicion de un anticuerpo humano excluye especificamente a un anticuerpo humanizado que comprende restos de union al antigeno no humanos. Los anticuerpos humanos se pueden preparar usando diversas tecnicas conocidas en la materia. En una realizacion, el anticuerpo humano se selecciona de una biblioteca de fagos, biblioteca de fagos que expresa anticuerpos humanos (Vaughan et al. Nature Biotechnology 14:309-314 (1996): Sheets et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 95:6157-6162 (1998)); Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). Los anticuerpos humanos tambien se pueden producir mediante la introduccion de locus de inmunoglobulina humana en animales transgenicos, por ejemplo, ratones en los que los genes de inmunoglobulina endogena han sido parcial o completamente inactivados. Tras la estimulacion, se observa la produccion de anticuerpos humanos, que se asemeja bastante a la observada en los seres humanos en todos los aspectos, incluyendo el reordenamiento genico, el ensamblaje y el repertorio de anticuerpos. Dicha metodologia se describe, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. n.° 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016, y en las siguientes publicaciones cientificas: Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996); Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995). Como alternativa, el anticuerpo humano se puede preparar a traves de la inmortalizacion de linfocitos B humanos que producen un anticuerpo dirigido contra un antigeno diana (dichos linfocitos B se pueden extraer de un individuo o pueden haber sido inmunizados in vitro). Vease, por ejemplo, Cole et al., “Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", Alan R. Liss, pag. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol, 147 (1):86-95 (1991); y patente de EE.UU. n.° 5.750.373.
Un anticuerpo "madurado por afinidad" es aquel con una o mas alteraciones en una o mas CDR del mismo que mejoran la afinidad del anticuerpo hacia el antigeno, en comparacion con un anticuerpo parental que no posee dicha/s alteracion/es. Los anticuerpos madurados por afinidad preferidos tendran afinidades nanomolares o incluso picomolares por el antigeno diana. Los anticuerpos madurados por afinidad se pueden producir mediante procedimientos conocidos en la tecnica. Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992) describen la maduracion por afinidad mediante el reordenamiento de los dominios VH y VL. La mutagenesis al azar de restos de CDR y/o restos marco ha sido descrita, por ejemplo, por Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. EE.UU. 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); y Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).
Un "sitio de union al antigeno funcional" de un anticuerpo es aquel que es capaz de unirse a un antigeno diana. La afinidad de union del antigeno del sitio de union al antigeno no es necesariamente tan fuerte como el anticuerpo parental del que se obtiene el sitio de union al antigeno, pero la capacidad de unirse al antigeno se debe poder medir usando uno cualquiera de varios metodos conocidos para la evaluacion de la union del anticuerpo a un antigeno. Por otra parte, la afinidad de union al antigeno de cada uno de los sitios de union al antigeno de un
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anticuerpo multivalente, en el presente documento, no tiene por que ser cuantitativamente la misma. Para los anticuerpos multimericos, en el presente documento, el numero de sitios funcionales de union al antigeno se puede evaluar usando el analisis de ultracentrifugacion como se describe en el Ejemplo 2 de la publicacion de la solicitud de patente de EE.UU. n.° 20050186208. De acuerdo con este metodo de analisis, se combinan diferentes proporciones del antigeno diana con respecto al anticuerpo multimerico, y se calcula el peso molecular medio de los complejos suponiendo numero de sitios de union funcionales diferentes. Estos valores teoricos se comparan con los valores experimentales reales obtenidos con el fin de evaluar el numero de sitios de union funcionales.
Un anticuerpo que tiene una "caracteristica biologica" de un anticuerpo designado es aquel que posee una o mas de las caracteristicas biologicas de ese anticuerpo que lo distinguen de otros anticuerpos que se unen al mismo antigeno.
Con el fin de detectar anticuerpos que se unen a un epitopo en un antigeno unido por un anticuerpo de interes, se puede realizar un ensayo habitual de bloqueo cruzado tal como el descrito en “Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lane (1988).
Un "anticuerpo dependiente de la especie" es aquel que tiene una afinidad de union mas fuerte por un antigeno de una primera especie de mamifero que la que tiene por un homologo de ese antigeno de una segunda especie de mamifero. Normalmente, el anticuerpo dependiente de la especie "se une especificamente" a un antigeno humano (es decir, tiene un valor de afinidad de union (Kd) no superior a aproximadamente 1 x 10-7 M, preferentemente no superior a aproximadamente 1 x 10-8 M y, lo mas preferentemente, no superior a aproximadamente 1 x 10-9 M) pero tiene una afinidad de union por un homologo del antigeno de una segunda especie de mamifero no humano, que es al menos aproximadamente 50 veces, o al menos aproximadamente 500 veces o al menos aproximadamente 1.000 veces mas debil que su afinidad de union por el antigeno humano. El anticuerpo dependiente de la especie puede ser cualquiera de los diversos tipos de anticuerpos definidos anteriormente, pero normalmente es un anticuerpo humanizado o humano.
Como se usa el presente documento, "anticuerpo mutante" o "variante de anticuerpo" se refiere a una variante de secuencia de aminoacidos del anticuerpo dependiente de la especie, en la que se han modificado uno o mas de los restos de aminoacidos del anticuerpo dependiente de la especie. Dichos mutantes tienen necesariamente una identidad o similitud de secuencia inferior al 100 % con el anticuerpo dependiente de la especie. En una realizacion, el anticuerpo mutante tendra una secuencia de aminoacidos que tendra al menos el 75 % de identidad o similitud de secuencia de aminoacidos con la secuencia de aminoacidos del dominio variable bien de cadena pesada o de cadena ligera del anticuerpo dependiente de la especie, mas preferentemente al menos el 80 %, mas preferentemente al menos el 85 %, mas preferentemente al menos el 90 %, y lo mas preferentemente al menos el 95 %. La identidad o similitud con respecto a esta secuencia se define en el presente documento como el porcentaje de restos de aminoacidos de la secuencia candidata que son identicos (es decir, mismo resto) o similares (es decir, resto de aminoacido del mismo grupo basado en propiedades comunes de las cadenas laterales, vease mas adelante) a los restos del anticuerpo dependiente de la especie, tras alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el maximo porcentaje de identidad de secuencia. Cualquier extension N-terminal, C-terminal o interna, delecion o insertion en la secuencia del anticuerpo fuera del dominio variable se interpretara como que afecta a la identidad o similitud de las secuencias.
Para aumentar la semivida de los anticuerpos o del polipeptido que contiene las secuencias de aminoacidos de la presente invention, se puede unir al anticuerpo un epitopo de union al receptor silvestre (especialmente, un fragmento de anticuerpo), como se describe, por ejemplo, en la patente de EE.UU. n.° 5.739.277. Por ejemplo, se puede ligar en marco una molecula de acido nucleico que codifique el epitopo de union al receptor silvestre a un acido nucleico que codifique una secuencia polipeptidica de la presente invencion, de modo que la proteina de fusion expresada por la molecula de acido nucleico disenada comprenda el epitopo de union al receptor silvestre y una secuencia polipeptidica de la presente invencion. Como se usa en el presente documento, la expresion "epitopo de union al receptor silvestre" se refiere a un epitopo de la region Fc de una molecula de IgG (por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3 o IgG4) que es responsable de aumentar la semivida en suero in vivo de la molecula de IgG (por ejemplo, Ghetie et al., Ann. Rev. Immunol. 18:739-766 (2000), Tabla 1). Los anticuerpos con sustituciones en una region Fc de los mismos y mayor semivida en suero in vivo tambien se describen en el documento WO00/42072, WO 02/060919; Shields et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001); Hinton, J. Biol. Chem. 279:6213-6216 (2004)). En otra realizacion, la semivida en suero tambien se puede aumentar, por ejemplo, uniendo otras secuencias polipeptidicas. Por ejemplo, los anticuerpos de la invencion se pueden unir a albumina serica o a una parte de la albumina serica que se une al receptor FcRn o un peptido de union a albumina serica, de modo que la albumina serica se una al anticuerpo o al polipeptido, por ejemplo, dichas secuencias polipeptidicas se describen en el documento WO01/45746. En una realizacion, el peptido de albumina serica que se va a unir comprende una secuencia de aminoacidos de DICLPRWGGLW. En otra realizacion, se aumenta la semivida de un Fab mediante estos metodos. Vease tambien, Dennis et al. J. Biol. Chem. 277:35035-35043 (2002) para las secuencias peptidicas de union a la albumina serica.
Una "proteina quimerica receptora del VEGF" es una molecula receptora del VEGF que tiene secuencias de aminoacidos derivadas de al menos dos proteinas diferentes, siendo al menos una de ellas como la proteina
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receptora del VEGF. En ciertas realizaciones, la protema quimerica receptora del VEGF es capaz de unirse a e inhibir la actividad biologica de VEGF.
Un polipeptido "aislado" o anticuerpo "aislado" es aquel que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirian con los usos diagnosticos o terapeuticos para el polipeptido o anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En ciertas realizaciones, el polipeptido o el anticuerpo se purificara (1) hasta mas del 95 % en peso de polipeptido o anticuerpo determinado mediante el metodo de Lowry, y lo mas preferentemente, mas del 99 % en peso; (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de secuencia de aminoacidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria; o (3) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o tincion de plata. El polipeptido o anticuerpo aislado incluye el polipeptido o el anticuerpo in situ dentro de celulas recombinantes ya que al menos un componente del entorno natural del polipeptido no estara presente. Habitualmente, sin embargo, el polipeptido o el anticuerpo aislado se prepararan mediante al menos una etapa de purificacion.
Por "fragmento" se entiende una parte de un polipeptido o una molecula de acido nucleico que contiene, preferentemente, al menos el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o mas de la longitud completa de la molecula de acido nucleico o polipeptido de referencia. Un fragmento puede contener 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100, 200, 300, 400, 500, 600 o mas nucleotidos, o 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 190, 200 aminoacidos o mas.
Un "agente antiangiogenico" o "inhibidor de la angiogenesis" se refiere a una sustancia de bajo peso molecular, un polinucleotido, un polipeptido, una proteina aislada, una proteina recombinante, un anticuerpo, o conjugados o proteinas de fusion de los mismos, que inhibe la angiogenesis, la vasculogenesis o la permeabilidad vascular no deseada, ya sea directa o indirectamente. Se ha de entender que el agente antiangiogenico incluye aquellos agentes que se unen y bloquean la actividad angiogenica del factor angiogenico o de su receptor. Por ejemplo, un agente antiangiogenico es un anticuerpo o un antagonista de un agente angiogenico definido anteriormente, por ejemplo, los anticuerpos contra el VEGF-A o contra el receptor de VEGF-A (por ejemplo, receptor KDR o receptor Flt-1), inhibidores anti-PDGFR tales como Gleevec™ (mesilato de imatinib). Los agentes antiangiogenicos tambien incluyen inhibidores de la angiogenesis nativos, por ejemplo, angiostatina, endostatina, etc. Vease, por ejemplo, Klagsbrun y D'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991); Streit y Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003) (por ejemplo, la Tabla 3, en la que se enumera la terapia antiangiogenica para el melanoma maligno); Ferrara y Alitalo, Nature Medicine 5:1359-1364 (1999); Tonini et al., Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (por ejemplo, la Tabla 2, en la que se enumeran factores antiangiogenicos conocidos) y Sato. Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003) (por ejemplo, la Tabla 1, en la que se enumeran agentes antiangiogenicos usados en ensayos clinicos).
"Tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapeutico como a medidas profilacticas o preventivas. Los que estan en necesidad de tratamiento incluyen los que ya tienen un tumor benigno, precanceroso o no metastasico, asi como aquellos en los que se ha de evitar la aparicion o reaparicion del cancer.
La expresion "cantidad terapeuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un antagonista especifico del VEGF para tratar o prevenir una enfermedad o un trastorno en un mamifero. En el caso de los tumores precancerosos, benignos o en fase temprana, la cantidad terapeuticamente eficaz del antagonista especifico del VEGF puede reducir el numero de celulas cancerosas; reducir el tamano del tumor primario; inhibir (es decir, ralentizar en cierto grado y, preferentemente, detener) la infiltracion de celulas cancerosas en los organos perifericos; inhibir (es decir, ralentizar en cierto grado y, preferentemente, detener) la metastasis tumoral; inhibir, en cierto grado, el crecimiento del tumor; y/o aliviar en cierto grado uno o mas de los sintomas asociados con el trastorno. Para el tratamiento de la latencia o micrometastasis del tumor, la cantidad terapeuticamente eficaz del antagonista especifico del VEGF puede reducir el numero o la proliferacion de las micrometastasis; reducir o prevenir el crecimiento de un tumor latente; o reducir o prevenir la reaparicion de un tumor despues del tratamiento o de la eliminacion (por ejemplo, usando una terapia contra el cancer tal como cirugia, radioterapia o quimioterapia). En la medida en que el farmaco puede prevenir el crecimiento y/o matar las celulas cancerosas existentes, puede ser citostatico y/o citotoxico. Para la terapia del cancer, la eficacia in vivo se puede medir, por ejemplo, mediante la evaluacion de la duracion de la supervivencia, del tiempo hasta la progresion de la enfermedad (TTP), de las tasas de respuesta (RR), de la duracion de la respuesta, del tiempo en remision y/o de la calidad de vida. La cantidad eficaz puede mejorar la supervivencia libre de enfermedad (SLE), mejorar la supervivencia global (SG), disminuir la probabilidad de reaparicion, prolongar el tiempo hasta la reaparicion, prolongar el tiempo hasta la reaparicion distante (es decir, la reaparicion fuera del sitio primario), curar el cancer, mejorar los sintomas del cancer (por ejemplo, calibrados usando una encuesta especifica del cancer), reducir la aparicion de un segundo cancer primario, etc.
Un cancer "operable" es un cancer que esta confinado al organo primario y es adecuado para la cirugia.
"Supervivencia" se refiere al paciente que permanece con vida, e incluye la supervivencia libre de enfermedad (SLE), la supervivencia libre de progresion (SLP) y la supervivencia global (SG). La supervivencia se puede estimar mediante el metodo de Kaplan-Meier, y cualquier diferencia en la supervivencia se calcula usando la prueba de
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rango logaritmico estratificada.
"Supervivencia libre de enfermedad (SLE)" se refiere al paciente que permanece con vida, sin la reaparicion del cancer, por un periodo de tiempo definido tal como aproximadamente 1 ano, aproximadamente 2 anos, aproximadamente 3 anos, aproximadamente 4 anos, aproximadamente 5 anos, aproximadamente 10 anos, etc., desde el inicio del tratamiento o del diagnostico inicial. En un aspecto de la invencion, la SLE se analiza de acuerdo con el principio de intencion de tratar, es decir, los pacientes se evaluan basandose en su terapia asignada. Los hechos usados en el analisis de la SLE pueden incluir la reaparicion local, regional y distante del cancer, la aparicion de cancer secundario y la muerte por cualquier causa en pacientes sin un hecho previo (por ejemplo, la reaparicion del cancer de mama o de un segundo cancer primario).
"La supervivencia global" se refiere al paciente que permanece con vida durante un periodo definido de tiempo, tal como de aproximadamente 1 ano, aproximadamente 2 anos, aproximadamente 3 anos, aproximadamente 4 anos, aproximadamente 5 anos, aproximadamente 10 anos, etc., desde el inicio del tratamiento o desde el diagnostico inicial. En los estudios subyacentes a la invencion, el hecho usado para el analisis de la supervivencia fue la muerte por cualquier causa.
Por "que prolonga la supervivencia" se entiende el aumento de la SLE y/o de la SG en un paciente tratado con respecto a un paciente sin tratar (es decir, con respecto a un paciente no tratado con un antagonista especifico del VEGF, por ejemplo, un anticuerpo VEGF), o con respecto a un protocolo de tratamiento de control tal como el tratamiento solo con el agente quimioterapeutico, tal como paclitaxel. La supervivencia se monitoriza durante al menos aproximadamente seis meses, o al menos aproximadamente 1 ano, o al menos aproximadamente 2 anos, o al menos aproximadamente 3 anos, o al menos aproximadamente 4 anos, o al menos aproximadamente 5 anos, o al menos aproximadamente 10 anos, etc., tras el inicio del tratamiento o despues del diagnostico inicial.
"Tasa de riesgo", en el analisis de la supervivencia, es un resumen de la diferencia entre dos curvas de supervivencia, que representa la reduccion del riesgo de muerte en el tratamiento en comparacion con el control, durante un periodo de seguimiento. La tasa de riesgo es una definicion estadistica de las tasas de hechos. Para los fines de la invencion, la tasa de riesgo se define como la que representa la probabilidad de un hecho en el brazo experimental dividida entre la probabilidad de un hecho en el brazo de control en cualquier punto especifico en el tiempo.
El termino "simultaneamente" se usa en el presente documento para referirse a la administracion de dos o mas agentes terapeuticos, en la que al menos parte de la administracion se superpone en el tiempo. Por consiguiente, la administracion simultanea incluye una pauta posologica en la que la administracion de uno o mas agentes continua tras la interrupcion de la administracion de uno o mas agentes distintos.
Por "monoterapia" se entiende un regimen terapeutico que solamente incluye un unico agente terapeutico para el tratamiento del cancer o tumor en el curso del periodo de tratamiento. La monoterapia en la que se usa un antagonista especifico del VEGF significa que el antagonista especifico del VEGF se administra en ausencia de una terapia adicional contra el cancer durante ese periodo de tratamiento.
Por "terapia de mantenimiento" se entiende un regimen terapeutico que se administra para reducir la probabilidad de reaparicion o progresion de la enfermedad. La terapia de mantenimiento se puede proporcionar durante cualquier periodo de tiempo, incluyendo los periodos de tiempo prolongados hasta el tiempo de vida del sujeto. La terapia de mantenimiento se puede proporcionar despues de la terapia inicial o en combination con terapias iniciales o adicionales. Las dosis usadas para el tratamiento de mantenimiento pueden variar, y pueden incluir dosis disminuidas en comparacion con las dosis usadas para otros tipos de terapia.
"La terapia neoadyuvante" o "terapia preoperatoria", en el presente documento, se refiere a la terapia administrada antes de la cirugia. El objetivo de la terapia neoadyuvante es proporcionar un tratamiento sistemico inmediato, erradicando potencialmente las micrometastasis que, de otro modo, proliferarian si se siguiera el orden convencional de cirugia seguida de terapia sistemica. La terapia neoadyuvante tambien puede ayudar a reducir el tamano del tumor, permitiendo asi la resection completa de tumores inicialmente no resecables o conservando partes del organo y de sus funciones. Ademas, la terapia neoadyuvante permite una evaluation in vivo de la eficacia del farmaco, que puede guiar la election de los tratamientos posteriores.
"La terapia adyuvante", en el presente documento, se refiere a la terapia administrada despues de la cirugia, donde no se puede detectar ninguna evidencia de enfermedad residual, para reducir el riesgo de reaparicion de la enfermedad. El objetivo de la terapia adyuvante es el de prevenir la reaparicion del cancer y, por lo tanto, reducir la posibilidad de muerte relacionada con el cancer.
En el presente documento, la quimioterapia "de atencion estandar" se refiere a los agentes quimioterapeuticos usados habitualmente para el tratamiento de un determinado cancer.
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"Cirugia definitiva" se usa como la expresion que se usa dentro de la comunidad medica. La cio^a definitiva incluye, por ejemplo, procedimientos, quirurgicos o de otro tipo, que dan lugar a la eliminacion o la reseccion del tumor, incluyendo aquellos que producen la eliminacion o la reseccion de todo el tumor visible macroscopicamente. La cirugia definitiva incluye, por ejemplo, la reseccion completa o curativa, o la reseccion macroscopica completa del tumor. La cirugia definitiva incluye procedimientos que se producen en una o varias fases, e incluyen: por ejemplo, procedimientos quirurgicos de varias fases, en los que se llevan a cabo uno o mas procedimientos quirurgicos, o de otro tipo, antes de la reseccion del tumor. La cirugia definitiva incluye procedimientos para eliminar o resecar el tumor incluyendo los organos, partes de organos y tejidos implicados, asi como los organos circundantes tales como los ganglios linfaticos, partes de organos o tejidos.
Los terminos "cancer" y "canceroso" se refieren o describen la afeccion fisiologica en mamiferos que se caracteriza normalmente por un crecimiento celular no regulado. Se incluyen en esta definition los canceres benignos y malignos, asi como los tumores latentes o la micrometastasis. Por "cancer en fase temprana" o "tumor en fase temprana" se entiende que el cancer no es invasivo ni metastasico o se clasifica como un cancer en fase 0, I o II.
El termino "precanceroso" se refiere a una afeccion o a un crecimiento que normalmente precede o se desarrolla en un cancer. Un crecimiento "precanceroso" tendra celulas que se caractericen por una regulation del ciclo celular, proliferation o diferenciacion anomalas, que se pueden determinar por marcadores de la regulacion del ciclo celular, de la proliferacion celular o la diferenciacion.
Por "displasia" se entiende cualquier crecimiento o desarrollo anomalo de tejido, organos o celulas. Preferentemente, la displasia es de alto grado o precancerosa.
Por "metastasis" se entiende la propagation del cancer desde su sitio primario a otros lugares del cuerpo. Las celulas cancerosas pueden desprenderse de un tumor primario, penetrar en los vasos linfaticos y sanguineos, circular por el torrente sanguineo y crecer en un foco distante (metastasis) de tejidos normales de otras partes del cuerpo. La metastasis puede ser local o distante. La metastasis es un proceso secuencial, depende del desprendimiento de las celulas tumorales del tumor primario, que se desplazan por el torrente sanguineo y se detienen en un sitio distante. En el nuevo sitio, las celulas establecen un suministro sanguineo y pueden crecer hasta formar una masa potencialmente mortal. Las vias moleculares tanto estimulantes como inhibidoras de la celula tumoral regulan este comportamiento, y la interaction entre la celula tumoral y las celulas huesped en el sitio distante tambien son significativas.
Por "micrometastasis" se entiende un pequeno numero de celulas que se han extendido desde el tumor primario a otras partes del cuerpo. La micrometastasis se puede detectar o no en un ensayo de detection o de diagnostico.
Por "no metastasico" se entiende un cancer que es benigno o que permanece en el sitio primario y que no ha penetrado en el sistema linfatico ni de los vasos sanguineos, o en tejidos distintos del sitio primario. En general, un cancer no metastasico es cualquier cancer que sea un cancer en fase 0, I o II, y, en ocasiones, un cancer en fase III.
La referencia a un tumor o a un cancer en "fase 0", "Fase I", "Fase II", "Fase III" o "Fase IV" indica la clasificacion del tumor o del cancer usando los metodos de agrupacion general de fases o de determination de la fase en numeros romanos conocidos en la tecnica. Aunque la fase real del cancer depende del tipo de cancer, en general, un cancer en fase 0 es una lesion in situ, un cancer en fase I es un tumor pequeno localizado, un cancer en fase II y en fase III es un tumor avanzado localizado que afecta a los ganglios linfaticos locales, y un cancer en fase IV representa el cancer metastasico. Las fases especificas para cada tipo de tumor son conocidas por el medico experto.
"Tumor", como se usa en el presente documento, se refiere a todo crecimiento y proliferacion celulares neoplasicos, ya sea maligno o benigno, y todos los tejidos y celulas precancerosos y cancerosos.
Por "tumor primario" o "cancer primario" se entiende el cancer original y no una lesion metastasica situada en otro tejido, organo o ubicacion del cuerpo del sujeto.
Por "tumor benigno" o "cancer benigno" se entiende un tumor que queda localizado en el sitio de origen y no tiene la capacidad de infiltrarse, invadir o producir metastasis en un sitio distante.
"Reaparicion del cancer", en el presente documento, se refiere a una reaparicion del cancer despues del tratamiento, e incluye la reaparicion del cancer en el organo primario, asi como la reaparicion a distancia, donde el cancer reaparece fuera del organo primario.
Por "latencia del tumor" se entiende un estado de reposo prolongado en el que las celulas tumorales estan presentes, pero la progresion del tumor no es clinicamente evidente. Un tumor latente se puede detectar o no en un ensayo de deteccion o de diagnostico.
Por "carga tumoral" se entiende el numero de celulas cancerosas, el tamano de un tumor o la cantidad de cancer del cuerpo.
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Por "numero de tumores" se entiende el numero de tumores.
Por "sujeto" se entiende un mamifero, incluyendo, pero sin limitacion, un mam^fero humano o no humano, tal como un bovino, equino, canino, ovino o felino. Preferentemente, el sujeto es un ser humano.
Una "poblacion" de sujetos se refiere a un grupo de sujetos con cancer, tal como de un ensayo clinico o segun lo observado por los oncologos tras la aprobacion de la FDA para una determinada indication, tal como la terapia neoadyuvante del cancer. En una realization, la poblacion comprende al menos 3.000 sujetos.
La expresion "terapia contra el cancer" se refiere a una terapia util en el tratamiento del cancer. Los ejemplos de agentes terapeuticos contra el cancer incluyen, pero se limitan a, por ejemplo, cirugia, agentes quimioterapeuticos, agentes inhibidores del crecimiento, agentes citotoxicos, agentes usados en radioterapia, agentes antigiogenicos, agentes apoptoticos, agentes anti-tubulina y otros agentes para tratar el cancer, tales como anticuerpos anti-HER-2, anticuerpos anti-CD20, un antagonista del receptor del factor de crecimiento epidermico (EGFR) (por ejemplo, un inhibidor de de tirosina quinasa, inhibidor de HER1/EGFR (por ejemplo, erlotinib (Tarceva™) , inhibidores del factor de crecimiento derivado de plaquetas (por ejemplo, Gleevec™ (mesilato de imatinib)), un inhibidor de COX-2 (por ejemplo, celecoxib), interferones, citocinas, antagonistas (por ejemplo, anticuerpos neutralizantes) que se unen a una o mas de las siguientes dianas: ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-beta, BlyS, APRIL, receptores de BCMA o VEGF, TRAIL/Apo2 y otros agentes bioactivos y quimicos organicos, etc. Las combinaciones de los mismos tambien se incluyen en la invention.
La expresion "agente citotoxico", como se usa en el presente documento, se refiere a una sustancia que inhibe o evita la funcion de las celulas y/o causa la destruction de las celulas. La expresion pretende incluir isotopos radioactivos (por ejemplo, I131, I125, Y90 y Re186), agentes quimioterapeuticos y toxinas tales como las toxinas enzimaticamente activas de origen bacteriano, fungico, vegetal o animal, o los fragmentos de las mismas.
Un "agente quimioterapeutico" es un compuesto quimico util en el tratamiento del cancer. Los ejemplos de agentes quimioterapeuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida CYTOXAN®; sulfonatos de alquilo tales como busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente, bullatacina y bullatacinona); una camptotecina (incluyendo el analogo sintetico topotecan); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus analogos sinteticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (particularmente, criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los analogos sinteticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; esponjistatina; mostazas de nitrogeno tales como clorambucil, clomafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de oxido de mecloretamina, melfalan, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibioticos tales como los antibioticos de enedina (por ejemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gamma ll y caliqueamicina omega ll (vease, por ejemplo, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl, 33: 183-186 (1994)); dinemicina, incluyendo dinemicina A; bifosfonatos tales como clodronato; una esperamicina; asi como cromoforo de neocarzinostatina y cromoforos de antibioticos de enedina y cromoprotemas relacionadas), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L- norleucina, doxorrubicina ADRIAMYCIN® (incluyendo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2- pirrolino-doxorrubicina y desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, acido micofenolico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); analogos del acido folico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; analogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; analogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; androgenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; rellenador de acido folico tal como acido frolinico; aceglatona; glucosido aldofosfamida; acido aminolevulinico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; epotilona; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; acido podofilinico; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo polisacarido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxane; rizoxina; sizofiran; acido tenuazonico de espirogermanio; triazicuona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente, toxina T-2, verracurina A, Roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosido ("Ara C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N. J.), ABRAXANE™ exento de Cremophor, formulation de nanoparticulas disenadas con albumina de paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumburg, Illinois) y docetaxel TAXOTERE® (Rhone-Poulenc Rore Antony, Francia); cloranbucilo; Gemcitabina GEMZAR®; 6-tioguanina; mercaptopurina; analogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etoposido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina NAVELBINE®; novantrona; teniposido; edatrexato; daunomicina; aminopterina;
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xeloda; ibandronato; irinotecan (Camptosar, CPT-11) (incluyendo el regimen de tratamiento de irinotecan con 5-FU y leucovorina); inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tales como acido retinoico; capecitabina; combretastatina; leucovorina (LV); oxaliplatino, incluyendo el regimen de tratamiento con oxaliplatino (FOLFOX); inhibidores de la PKC-alfa, Raf, H-Ras, EGFR (por ejemplo, erlotinib (Tarceva™) y VEGF-A que reducen la proliferacion celular y las sales farmaceuticamente aceptables, acidos o derivados de cualquiera de los anteriores.
Tambien se incluyen en esta definition agentes antihormonales que actuan para regular o inhibir la action hormonal sobre tumores tales como antiestrogenos y moduladores selectivos de receptores estrogenicos (SERM), incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno (incluyendo tamoxifeno NOLVADEX®), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapriston y toremifeno FARESTON; inhibidores de la aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la production de estrogenos en las glandulas suprarrenales tales como, por ejemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, forrnestanie, fadrozol, vorozol RIVISOR®, letrozol FEMARA® y anastrozol ARIMIDEX®; y antiandrogenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; asi como troxacitabina (un analogo nucleosido de citosina 1,3- dioxolano); oligonucleotidos antisentido, particularmente los que inhiben la expresion de los genes en las vias de senalizacion implicadas en la proliferacion de celulas aberrantes, tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf y H-Ras; ribozimas tales como un inhibidor de la expresion de VEGF (por ejemplo, ribozima ANGIOZYME®) y un inhibidor de la expresion de HER2; vacunas tales como vacunas de terapia genica, por ejemplo, la vacuna aLlOVECTIN®, la vacuna LEUVECTIN® y la vacuna VAXID®; rIL-2 PROLEUKIN®; inhibidor de la topoisomerasa 1 LURTOTECAN®; rmRH ABARELIX®; vinorelbina y esperamicinas (vease la patente de EE.UU. n.° 4.675.187), y sales farmaceuticamente aceptables, acidos o derivados de cualquiera de los anteriores.
Un "agente inhibidor del crecimiento", cuando se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto o a una composition que inhibe el crecimiento de una celula in vitro y/o in vivo. Por lo tanto, el agente inhibidor del crecimiento puede ser aquel que reduce significativamente el porcentaje de celulas en fase S. Los ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean la progresion del ciclo celular (en un lugar distinto de la fase S), tales como agentes que inducen la detention de G1 y la detention de la fase M. Los bloqueantes clasicos de la fase M incluyen las vincas (vincristina y vinblastina), TaXOL® e inhibidores de la topo Il tales como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etoposido y bleomicina. Aquellos agentes que detienen G1 tambien se extienden a la detencion de la fase S, por ejemplo, los agentes alquilantes de ADN tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo y ara-C. Se puede encontrar mas information en “The Molecular Basis of Cancer”, Mendelsohn and Israel, eds., Capitulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" por Murakami et al. (WB Saunders: Filadelfia, 1995), especialmente, la pag. 13.
El termino "citocina" es un termino generico para las proteinas liberadas por una poblacion de celulas que actuan sobre otra celula como mediadores intercelulares. Los ejemplos de dichas citocinas son linfocinas, monocinas y hormonas polipeptidicas tradicionales. Entre las citocinas, se incluyen hormonas de crecimiento tales como la hormona del crecimiento humano, hormona del crecimiento humano N-metionilo y la hormona de crecimiento bovina; la hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormonas de glicoprotemas tales como hormona estimulante del foliculo (FSH), hormona estimulante del tiroides (TSH) y hormona luteinizante (LH); factor de crecimiento epidermico; factor de crecimiento hepatico; factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactogeno placentario; factor de necrosis tumoral alfa y beta; sustancia inhibidora de Muller; peptido asociado a la gonadotropina de raton; inhibina; activina; factor de crecimiento vascular endotelial; integrina; tlirombopoyetina (TPO); factores de crecimiento nervioso tales como NGF-alfa; factor de crecimiento de plaquetas; factores de crecimiento transformante (TGF) tales como TGF-alfa y TGF-beta; factor de crecimiento similar a la insulina I y II; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductores; interferones tales como interferon alfa, beta y gamma, factores estimulantes de colonias (CSF) tales como CSF de macrofagos (M-CSF); CSF de granulocitos y macrofagos (GM- CSF); y CSF de granulocitos (G-CSF); interleucinas (IL) tales como IL-1, IL-1 alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL- 8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; un factor de necrosis tumoral tal como TNF alfa o TNF beta; y otros factores de polipeptidos que incluyen LIF y ligando kit (KL). Como se usa en el presente documento, el termino citocina incluye proteinas de fuentes naturales o de cultivo celular recombinante y equivalentes biologicamente activos de las citocinas de secuencia nativa.
El termino " 'profarmaco", como se usa en la presente solicitud, se refiere a un precursor o forma derivada de una sustancia farmaceuticamente activa que es menos citotoxico para las celulas tumorales que el farmaco precursor y que es capaz de ser activado o convertido enzimaticamente en la forma precursora mas activa. Vease, por ejemplo, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pag. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) y Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pag. 247-267, Humana Press (1985). Los profarmacos de la presente invention incluyen, pero sin limitation, profarmacos que contienen fosfatos, profarmacos que contienen tiofosfatos, profarmacos que contienen sulfatos, profarmacos que contienen peptidos, profarmacos modificados con D-aminoacidos, profarmacos glicosilados, profarmacos que contienen p-lactama, profarmacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida o profarmacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, 5-fluorocitosina y otros profarmacos de 5-fluorouridina que pueden convertirse en el farmaco libre citotoxico mas activo. Los ejemplos de farmacos
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citotoxicos que pueden derivatizarse en una forma de profarmaco para su uso en la presente invencion incluyen, pero sin limitacion, los agentes quimioterapeuticos descritos anteriormente.
Por "radioterapia" se entiende el uso de rayos gamma o rayos beta dirigidos para inducir dano suficiente en una celula con el fin de limitar su capacidad para funcionar normalmente o para destruir la celula por completo. Se apreciara que habra muchas maneras conocidas en la tecnica para determinar la dosis y la duracion del tratamiento. Los tratamientos tipicos se dan como una administration de una vez y las dosis tipicas varian de 10 a 200 unidades (Grays) al dia.
Por "reducir o inhibir" se entiende la capacidad de causar una reduction global, preferentemente del 20 % o superior, mas preferentemente de 50 % o superior, y lo mas preferentemente del 75 %, 85 %, 90 %, 95 % o superior. Reducir o inhibir se puede referir a los sintomas del trastorno que se esta tratando, la presencia o el tamano de las metastasis o micrometastasis, el tamano del tumor primario, la presencia o el tamano del tumor latente, o el tamano del numero de los vasos sanguineos en los trastornos angiogenicos.
Por "oligomero de nucleobases antisentido" se entiende un oligomero de nucleobases, independientemente de la longitud, que es complementario a al menos una parte de la cadena codificante o ARNm de un gen.
Por un "oligomero de nucleobases" se entiende un compuesto que incluye una cadena de al menos ocho nucleobases, preferentemente de al menos doce, y lo mas preferentemente de al menos dieciseis bases, unidas entre si por grupos de enlace. Se incluyen en esta definition oligonucleotidos naturales y no naturales, tanto modificados como no modificados, asi como los mimeticos de oligonucleotidos tales como acidos nucleicos proteicos, acidos nucleicos bloqueados y acidos arabinonucleicos. Se pueden emplear numerosas nucleobases y grupos de enlace en los oligomeros de nucleobases de la invencion, incluyendo los descritos en las publicaciones de patente de EE.UU. n.° 20030114412 (veanse, por ejemplo, los parrafos 27-45 de la publication) y 20030114407 (veanse, por ejemplo, los parrafos 35-52 de la publicacion). El oligomero de nucleobases tambien se puede dirigir a los sitios de inicio y de detention de la traduction. En ciertas realizaciones, el oligomero de nucleobases antisentido comprende de aproximadamente 8 a 30 nucleotidos. El oligomero de nucleobases antisentido tambien puede contener al menos 40, 60, 85, 120 o mas nucleotidos consecutivos que sean complementarios al ARNm o ADN del VEGF, y puede ser tan largo como el ARNm de longitud completa o el gen.
Por "ARN pequeno" se entiende cualquier molecula de ARN, ya sea monocatenaria o bicatenaria, que sea de al menos 15 nucleotidos, preferentemente, de 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 o 35, nucleotidos de longitud, e incluso hasta de 50 o 100 nucleotidos de longitud (incluidos todos los numeros enteros intermedios). En ciertas realizaciones, el ARN pequeno es capaz de mediar el ARNi. Como se usa en el presente documento, la expresion "mediar el ARNi" se refiere a la capacidad de distinguir que ARN han de ser degradados por la maquinaria o proceso de ARNi. Se incluyen en la expresion de ARN pequeno "los RNA de interferencia pequenos" y los "microARN". En general, los microARN (miARN) son ARN pequenos (por ejemplo, de 17-26 nucleotidos), no codificantes monocatenarios que son procesados a partir de ARN horquillados precursores de aproximadamente 70 nucleotidos por Dicer. Los ARN interferentes pequenos (ARNip) son de un tamano similar y tampoco son codificantes. Sin embargo, los ARNip se procesan a partir de ARNbc largos y suelen ser bicatenarios. Los ARNip tambien pueden incluir ARN horquillados cortos en los que ambas cadenas de un duplex de ARNip se incluyen dentro de una sola molecula de ARN. Los ARN pequenos se pueden usar para describir los dos tipos de RNA. Estos terminos incluyen ARN bicatenario, ARN monocatenario, ARN aislado (ARN parcialmente purificado, ARN esencialmente puro, ARN sintetico, ARN producido de manera recombinante), asi como ARN alterado que difiere del ARN de origen natural en la adicion, deletion, sustitucion y/o alteration de uno o mas nucleotidos. Dichas alteraciones pueden incluir la adicion de material no nucleotido, tal como en el/los extremo/s del ARN pequeno o internamente (en uno o mas nucleotidos del ARN). Los nucleotidos en las moleculas de ARN tambien pueden comprender nucleotidos no convencionales, incluyendo nucleotidos o desoxirribonucleotidos de origen no natural. Vease el apartado de "oligomeros de nucleobases" anterior para consultar modificaciones adicionales en la molecula de acido nucleico. En una realization, las moleculas de ARN contienen un grupo hidroxilo de 3'.
La expresion "infusion intravenosa" se refiere a la introduction de un farmaco en la vena de un animal o paciente humano durante un periodo de tiempo superior a aproximadamente 5 minutos, preferentemente entre aproximadamente 30 y 90 minutos, aunque, de acuerdo con la invencion, la infusion intravenosa se administra como alternativa durante 10 horas o menos.
La expresion "bolo intravenoso" o "impulso intravenoso" se refiere a la administracion del farmaco en una vena de un animal o ser humano de manera que el cuerpo reciba el farmaco en aproximadamente 15 minutos o menos, preferentemente en 5 minutos o menos.
La expresion "administracion subcutanea" se refiere a la introduccion de un farmaco bajo la piel de un animal o paciente humano, preferentemente, dentro de un bolsillo entre la piel y el tejido subyacente, mediante el suministro relativamente lento y sostenido desde un receptaculo de farmacos. El bolsillo se puede crear pellizcando o estirando de la piel hacia arriba, separandola del tejido subyacente.
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La expresion "infusion subcutanea" se refiere a la introduccion de un farmaco bajo la piel de un animal o paciente humano, preferentemente dentro de un bolsillo entre la piel y el tejido subyacente, mediante el suministro relativamente lento y sostenido de un receptaculo de farmacos durante un periodo de tiempo que incluye, pero sin limitacion, 30 minutos o menos, o 90 minutos o menos. Opcionalmente, la infusion se puede realizar por implantacion subcutanea de una bomba de suministro de farmacos implantada bajo la piel del animal o del paciente humano, en la que la bomba suministra una cantidad predeterminada de farmaco durante un periodo predeterminado de tiempo, tal como 30 minutos, 90 minutos o un periodo de tiempo que abarca la duracion del regimen de tratamiento.
La expresion "bolo subcutaneo" se refiere a la administracion del farmaco bajo la piel de un animal o paciente humano, donde la administracion del farmaco en bolo dura preferentemente menos de aproximadamente 15 minutos, mas preferentemente menos de 5 minutos y lo mas preferentemente menos de 60 segundos. La administracion se realiza preferentemente dentro de un bolsillo entre la piel y el tejido subyacente, donde se crea el bolsillo, por ejemplo, pellizcando o estirando de la piel hacia arriba, separandola del tejido subyacente.
El termino "marcador" cuando se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto o a una composicion detectable que se conjuga directa o indirectamente al polipeptido. El marcador puede ser detectable en si (por ejemplo, marcadores de radioisotopos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimatico, puede catalizar la alteracion quimica de un compuesto o de una composicion sustrato que sea detectable.
II. Uso de antagonistas especificos del VEGF para el tratamiento de tumores en fase temprana, y terapia adyuvante y neoadyuvante
Como se define en las reivindicaciones, la invencion se caracteriza por el uso de antagonistas especificos del VEGF para el tratamiento de un sujeto con riesgo de desarrollar cancer. Por medio de los antecedentes, usando dos enfoques independientes para inhibir VEGF, en concreto, la monoterapia con un anticuerpo monoclonal (mAb) dirigido a VEGF-A y la eliminacion genetica de VEGF-A, los presentes inventores han demostrado que, usando el modelo de raton Apcmin/+ de formacion temprana de adenomas intestinales, la inhibicion de la senalizacion de VEGF es suficiente para que cese el crecimiento del tumor y conferir una mayor supervivencia a largo plazo en un modelo de adenoma intestinal. Tambien se ha demostrado, usando un anticuerpo monoclonal (mAb) dirigido a VEGF-A, que la inhibicion de VEGF-A fue suficiente para inhibir el crecimiento de adenomas hipofisarios y reducir el exceso de secrecion hormonal en un modelo de raton de neoplasia endocrina multiple de tipo 1 (MEN1). Por otra parte, se ha demostrado, usando un modelo de tumor de islote pancreatico de raton (RIP-TpAg) y un anticuerpo monoclonal (mAb) dirigido a VEGF-A, que la inhibicion de VEGF provoca una reduction espectacular de la angiogenesis del tumor y, cuando se usa como terapia tras la citorreduccion usando cirugia o agentes quimioterapeuticos, suprime el rebrote de los tumores. La divulgation tambien incluye el uso de antagonistas del VEGF en el tratamiento neoadyuvante y adyuvante.
MI. Antagonistas especificos del VEGF
Un antagonista especifico del VEGF se refiere a una molecula (peptidica o no peptidica) capaz de unirse a VEGF, reduciendo los niveles de expresion de VEGF, o neutralizando, bloqueando, inhibiendo, derogando, reduciendo o interfiriendo con las actividades biologicas de VEGF, incluyendo la union de VEGF a uno o mas receptores de VEGF y la angiogenesis mediada por VEGF, y la supervivencia o la proliferation de las celulas endoteliales. Preferentemente, el antagonista especifico del VEGF reduce o inhibe, en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o mas, el nivel de expresion o actividad biologica de VEGF. Preferentemente, el VEGF inhibido por el antagonista especifico del VEGF es una isoforma de VEGF o multiples isoformas de VEGF, por ejemplo, VEGF (8-109), VEGF (1-109), VEGF165, VEGF121, VEGF145, VEGF189 o VEGF206.
Los antagonistas especificos del VEGF incluyen compuestos peptidicos o no peptidicos que se unen especificamente a VEGF tales como anticuerpos anti-VEGF y fragmentos de union al antigeno de los mismos, variantes de antagonistas de polipeptidos VEGF, o fragmentos de los mismos que se unen especificamente a VEGF, y moleculas de receptores y derivados que se unen especificamente a VEGF, secuestrando de ese modo su union a uno o mas receptores (por ejemplo, proteinas receptoras de VEGF solubles, o fragmentos de union a VEGF de las mismas, o las proteinas quimericas receptoras de VEGF), proteinas de fusion (por ejemplo, VEGF-Trap (Regeneron)), y VEGFi2i-gelonina (Peregrine). Los antagonistas especificos del VEGF tambien incluyen oligomeros nucleobasicos antisentido complementarios a al menos un fragmento de una molecula de acido nucleico que codifica un polipeptido VEGF; ARN pequenos complementarios a al menos un fragmento de una molecula de acido nucleico que codifica un polipeptido VEGF; ribozimas que se dirigen a VEGF; pepticuerpos contra VEGF; y aptameros de VEGF.
A. Anticuerpos anti-VEGF
Los anticuerpos anti-VEGF de la invencion incluyen cualquier anticuerpo, o fragmento de union al antigeno del mismo, segun lo definido en las reivindicaciones, que se unen con la suficiente afinidad y especificidad a VEGF y puede reducir o inhibir la actividad biologica de VEGF. Un anticuerpo anti-VEGF normalmente no se unira a otros
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homologos de VEGF tales como VEGF-B o VEGF-C, ni a otros factores de crecimiento tales como PIGF, PDGF o bFGF
En ciertas realizaciones de la invencion, los anticuerpos anti-VEGF incluyen, pero sin limitacion, un anticuerpo monoclonal que se une al mismo epitopo que el anticuerpo anti-VEGF monoclonal A4.6.1 producido por el hibridoma ATCC HB 10709; un anticuerpo monoclonal anti-VEGF humanizado recombinante generado de acuerdo con Presta et al. (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599, incluyendo, pero sin limitacion, el anticuerpo conocido como bevacizumab (BV; Avastin®). Bevacizumab incluye regiones marco conservadas de IgG1 humana mutadas y regiones determinantes de la complementariedad de union al antigeno del anticuerpo monoclonal anti-hVEGF murino A.4.6.1 que bloquea la union del VEGF humano a sus receptores. Aproximadamente el 93 % de la secuencia de aminoacidos de bevacizumab, incluyendo la mayoria de las regiones marco conservadas, proceden de la IgG 1 humana, y aproximadamente el 7 % de la secuencia procede del anticuerpo murino A4.6.1. Bevacizumab tiene una masa molecular de aproximadamente 149.000 Daltons y esta glicosilado. Bevacizumab y otros anticuerpos anti- VEGF humanizados se describen mas detalladamente en la patente de EE.UU. n.° 6.884.879, expedida el 26 de febrero 26 de 2005. Los ejemplos adicionales de anticuerpos incluyen, pero sin limitacion, los anticuerpos de la serie G6 o B20 (por ejemplo, G6-31 B20-4.1), descritos en la publicacion de solicitud PCT n.° WO2005/012359. Para los anticuerpos adicionales, veanse las patentes de EE.UU. n.° 7.060.269, 6.582.959, 6.703.020; 6.342.219; 6.054.297; WO98/45332; WO96/30046; WO94/10202; EP 0666868B1; la publicacion de solicitud de patente de EE.UU. n.° 2006009360, 20050186208, 20030206899, 20030190317, 20030203409 y 20050112126; y Popkov et al., Journal of Immunological Methods, 288:149-164 (2004). Otros ejemplos de anticuerpos que se pueden usar en la invencion incluyen aquellos que se unen a un epitopo funcional sobre VEGF humano que comprende los restos F17, M18, D19, Y21, Y25, Q89, I91, K101, E103 y C104 o, como alternativa, que comprende los restos F17, Y21, Q22, Y25, D63, I83 y Q89.
Un anticuerpo de serie G6 de acuerdo con la presente invencion es un anticuerpo anti-VEGF que se obtiene de una secuencia de un anticuerpo G6 o anticuerpo derivado de G6 de acuerdo con una cualquiera de las Figuras 7, 24-26, y 34-35 de la publicacion de la solicitud PCT n.° WO2005/012359. En una realization, el anticuerpo de serie G6 se une a un epitopo funcional sobre VEGF humano que comprende los restos F17, Y21, Q22, Y25, D63, I83 y Q89.
Un anticuerpo de serie B20 de acuerdo con la presente invencion es un anticuerpo anti-VEGF que se obtiene de una secuencia del anticuerpo B20 o un anticuerpo derivado de B20 de acuerdo con una cualquiera de las Figuras 27-29 de la publicacion de solicitud PCT n.° WO2005/012359. En una realizacion, el anticuerpo de serie B20 se une a un epitopo funcional sobre el VEGF humano que comprende los restos F17, M18, D19, Y21, Y25, Q89, I91, K101, E103 y C104.
Un "epitopo funcional" de acuerdo con la presente invencion se refiere a restos de aminoacidos de un antigeno que contribuyen con energia a la union de un anticuerpo. La mutation de uno cualquiera de los restos que contribuyen con energia del antigeno (por ejemplo, la mutacion de VEGF de tipo silvestre por alanina o una mutacion homologa) interrumpira la union del anticuerpo de modo que la relation de afinidad relativa (CI50 de VEGF mutante/Cl50 de VEGF de tipo silvestre) del anticuerpo sera superior a 5 (vease el Ejemplo 2 del documento WO2005/012359). En una realizacion, la relacion de afinidad relativa se determina mediante ELISA de presentation en fagos de union en solution. En resumen, se recubren inmunoplacas de 96 pocillos Maxisorp (NUNC) durante la noche a 4 °C con una forma Fab del anticuerpo que se va a ensayar a una concentration de 2 ug/ml en PBS, y se bloquean con PBS, BSA al 0,5 % y Tween 20 al 0,05 % (PBT) durante 2 h a temperatura ambiente. En primer lugar, se incuban diluciones en serie de mutantes puntuales de alanina de hVEGF presentados en fagos (forma de 8-109 restos) o hVEGF de tipo silvestre (8-109) en PBT en las placas recubiertas con Fab durante 15 min a temperatura ambiente, y se lavan las placas con PBS, Tween 20 al 0,05 % (PBST). El fago unido se detecta con un conjugado de anticuerpo monoclonal anti-M13 y peroxidasa de rabano picante (Amersham Pharmacia) diluido 1:5.000 en PBT, desarrollado con sustrato de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (tMb, Kirkegaard & Perry Labs, Gaithersburg, MD ) durante aproximadamente 5 min, se inactiva con H3PO4 1,0 M y se lee espectrofotometricamente a 450 nm. La relacion de los valores de CI50 (CI50, Ala/Cl50, tipo silvestre) representa las veces de reduction de la afinidad de union (afinidad de union relativa).
B. Moleculas de receptor de VEGF
Los dos receptores de VEGF mejor caracterizados son VEGFR1 (tambien conocido como Flt-1) y VEGFR2 (tambien conocido como KDR y FLK-1 para el homologo murino). La especificidad de cada receptor hacia cada miembro de la familia VEGF varia, pero VEGF-A se une tanto a Flt-I como a KDR. El receptor Flt-1 de longitud completa incluye un dominio extracelular que tiene siete dominios de Ig, un dominio transmembrana y un dominio intracelular con actividad tirosina quinasa. El dominio extracelular participa en la union de VEGF y el dominio intracelular participa en la transduction de senales.
Las moleculas receptoras de VEGF, o los fragmentos de las mismas, que se unen especificamente a VEGF se pueden usar para unirse a y secuestrar la proteina VEGF, evitando asi que realice la senalizacion. En ciertas realizaciones, la molecula receptora de VEGF, o el fragmento de union a VEGF de la misma, es una forma soluble, tal como sFlt-1. Una forma soluble del receptor ejerce un efecto inhibidor sobre la actividad biologica de la proteina VEGF mediante la union a VEGF, evitando de ese modo que se una a sus receptores naturales presentes en la
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superficie de las celulas diana. Tambien se incluyen las protemas de fusion de receptor de VEGF, cuyos ejemplos se describen a continuacion.
Una proteina quimerica receptora de VEGF es una molecula receptora que tiene secuencias de aminoacidos derivadas de al menos dos protemas diferentes, siendo al menos una de las ellas una proteina receptora del VEGF (por ejemplo, el receptor Flt-1 o KDR), que es capaz de unirse e inhibir la actividad biologica de VEGF. En ciertas realizaciones, las protemas receptoras de VEGF quimericas consisten en secuencias de aminoacidos derivadas de unicamente dos moleculas receptoras de VEGF diferentes. Sin embargo, las secuencias de aminoacidos que comprenden uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o los siete dominios similares a Ig de la region de union al ligando extracelular del receptor flt-1 y/o del receptor KDR se pueden ligar a secuencias de aminoacidos de otras protemas no relacionadas, por ejemplo, secuencias de inmunoglobulina. Otras secuencias de aminoacidos con las que se combinan los dominios similares a Ig seran facilmente evidentes para los expertos habituales en la materia. Los ejemplos de protemas receptoras de VEGF quimericas incluyen, por ejemplo, Flt-I/Fc soluble, KDR/Fc o Flt-I/KDR/Fc (tambien conocido como VEGF Trap). (Vease, por ejemplo, la publication de solicitud PCT n.° WO97/44453).
Una proteina receptora de VEGF soluble o proteina receptora de VEGF quimerica incluye protemas receptoras de VEGF que no se fijan a la superficie de las celulas a traves de un dominio transmembrana. Como tales, las formas solubles del receptor VEGF, incluyendo las protemas receptoras quimericas, aunque son capaces de unirse a e inactivar el VEGF, no comprenden un dominio transmembrana y, por lo tanto, en general, no se asocian con la membrana celular de las celulas en las que se expresa la molecula.
C. Ribozimas
Las ribozimas son moleculas de ARN enzimaticas capaces de catalizar la escision especifica del ARN. Las ribozimas actuan mediante la hibridacion especifica de la secuencia al ARN diana complementario, seguida de la escision endonucleolitica. Los sitios especificos de escision de ribozimas de una posible diana de ARN se pueden identificar mediante tecnicas conocidas. Para mas detalles, vease, por ejemplo, Rossi, Current Biology, 4: 469-471 (1994) y la publicacion de solicitud PCT n.° WO 97/33551. Una ribozima ilustrativa que dirige la expresion de VEGF es Angiozyme™. (Vease, por ejemplo, la publicacion de solicitud de patente de EE.UU. n° 20060035278).
D. Aptameros
Los aptameros son moleculas de acido nucleico que forman estructuras terciarias que se unen especificamente a una molecula diana, tal como un polipeptido VEGF. La generation y el uso terapeutico de los aptameros estan bien establecidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, la patente de EE.Uu. n.° 5.475.096. Un aptamero de VEGF es un oligonucleotido modificado pegilado, que adopta la conformation tridimensional que le permite unirse al VEGF extracelular. Un ejemplo de un aptamero terapeuticamente eficaz que se dirige a VEGF para el tratamiento de la degeneration macular relacionada con la edad es pegaptanib (Macugen™, Eyetech, Nueva York). Se puede encontrar information adicional sobre los aptameros en la publicacion de solicitud de patente de EE.UU. n.° 20060148748.
E. Pepticuerpos
Un pepticuerpo es una secuencia peptidica unida a una secuencia de aminoacidos que codifica un fragmento o una parte de una molecula de inmunoglobulina. Los polipeptidos se pueden obtener de secuencias al azar seleccionadas mediante cualquier metodo de union especifica, incluyendo, pero sin limitation, la tecnologia de presentation en fagos. En una realization, el polipeptido seleccionado se puede enlazar a una secuencia de aminoacidos que codifique la portion Fc de una inmunoglobulina. Los pepticuerpos que se unen especificamente a y antagonizan VEGF tambien son utiles en los metodos de la divulgation.
F. Moleculas de acidos nucleicos antagonistas espeaficos del VEGF
Los metodos de la divulgacion tambien presentan el uso de moleculas de acidos nucleicos antagonistas especificos del VEGF incluyendo oligomeros de nucleobases antisentido y ARN pequenos.
En una realizacion, la divulgacion presenta el uso de oligomeros de nucleobases antisentido dirigidos a ARN de VEGF. Mediante la union a la secuencia de acido nucleico complementaria (la cadena sentido o codificante), los oligomeros de nucleobases antisentido son capaces de inhibir la expresion de la proteina presumiblemente a traves de la escision enzimatica de la cadena de ARN por la RNasa H.
Un ejemplo de un oligomero de nucleobases antisentido es un oligomero de morfolino. Los morfolinos se usan para bloquear el acceso de otras moleculas a secuencias especificas dentro de las moleculas de acido nucleico. Pueden bloquear el acceso de otras moleculas a regiones pequenas (~25 bases) de acido ribonucleico (ARN). Los morfolinos a veces se denominan PMO, un acronimo de oligomeros de morfolino fosforodiamidato.
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Los morfolinos se usan para desactivar la funcion genica evitando que las celulas formen una protema dirigida o modificando el corte y empalme del pre-ARNm. Los morfolinos son moleculas sinteticas que se unen a secuencias complementarias de ARN por apareamiento de bases de acido nucleico convencionales. Aunque los morfolinos tienen bases de acido nucleico convencionales, esas bases se unen a anillos de morfolina en lugar de a los anillos de desoxirribosa y se enlazan a traves de grupos fosforodiamidato en vez de fosfatos. La sustitucion de fosfatos anionicos con los grupos fosforodiamidato sin carga elimina la ionizacion en el intervalo habitual de pH fisiologico, pues los morfolinos en organismos o celulas son moleculas sin carga.
Los morfolinos actuan mediante el "bloqueo esterico" o la union a una secuencia diana dentro de un ARN y el bloqueo de moleculas que, de otro modo, podrian interactuar con el ARN. Debido a sus cadenas principales completamente artificiales, los morfolinos no son reconocidos por las proteinas celulares. Las nucleasas no degradan morfolinos, y los morfolinos no activan los receptores de tipo Toll, por lo que no activan las respuestas inmunes innatas tales como el sistema del interferon o la respuesta inflamatoria mediada por NF-kB. Que se sepa, los morfolinos tampoco modifican la metilacion del ADN. Por lo tanto, los morfolinos dirigidos a cualquier parte de VEGF que pueda reducir o inhibir los niveles de expresion o la actividad biologica de VEGF son especialmente utiles en los metodos y en las composiciones de la divulgacion.
La divulgacion tambien presenta el uso de ARN de interferencia (ARNi) para inhibir la expresion de VEGF. El ARNi es una forma de silenciamiento genico posterior a la transcripcion iniciada mediante la introduction de ARN bicatenario (ARNbc). Los ARN bicatenarios cortos, de 15 a 32 nucleotidos, conocidos, en general, como "ARNip", "ARN pequenos" o "microARN" son eficaces en la regulation por disminucion de la expresion genica en los nematodos (Zamor et al., Cell 101: 25-33) y en lineas celulares de cultivos tisulares de mamiferos (Elbashir et al., Nature 411:494-498, 2001). La eficacia terapeutica adicional de este enfoque en los mamiferos fue demostrada in vivo por McCaffrey et al. (Nature 418:38-39, 2002). Los ARN pequenos son de al menos 15 nucleotidos, preferentemente de 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 nucleotidos de longitud e incluso de hasta 50 o 100 nucleotidos de longitud (incluyendo todos los numeros enteros intermedios). Dichos ARN pequenos que son esencialmente identicos o complementarios a cualquier region del VEGF, se incluyen como antagonistas especificos del VEGF.
Los requisitos y las modificaciones especificos de los ARN pequenos son conocidos en la tecnica, y se describen, por ejemplo, en la publication de la solicitud PCT n.° WO01/75164 y en las publicaciones de la solicitud de EE.UU. n.° 200601347877, 20050153918, 20050058982, 20050037988 y 20040203145. En realizaciones particulares, se pueden sintetizar o generar ARNip mediante el procesamiento de ARN bicatenarios mas largos, por ejemplo, en presencia de la enzima Dicer en condiciones en las que el ARNbc se procesa en moleculas de ARN de aproximadamente 17 a aproximadamente 26 nucleotidos. Los ARNip tambien se pueden generar mediante la expresion del fragmento de ADN correspondiente (por ejemplo, una construction de aDn horquillado). En general, el ARNip tiene los caracteristicos extremos salientes 3' de 2 a 3 nucleotidos, siendo preferentemente (2'- desoxi)timidina o uracilo. Los ARNip normalmente comprenden un grupo hidroxilo 3'. En algunas realizaciones, se usan ARNip monocatenarios o ARNbc de extremos romos. Para mejorar aun mas la estabilidad del ARN, los salientes 3' se estabilizan contra la degradacion. En una realizacion, el ARN se estabiliza mediante la inclusion de nucleotidos de purina, tales como adenosina o guanosina. Como alternativa, la sustitucion de los nucleotidos de pirimidina con analogos modificados, por ejemplo, la sustitucion de salientes de 2 nucleotidos de uridina por (2'- desoxi)timidina es tolerada y no afecta a la eficacia del ARNi. La ausencia de un grupo hidroxilo 2' mejora significativamente la resistencia del saliente en medio de cultivo tisular.
Las moleculas de ARNip se pueden obtener a traves de varios protocolos, incluyendo la sintesis quimica o la production recombinante usando un sistema de Drosophila in vitro. Se pueden obtener en el mercado de companias tales como Dharmacon Research Inc. o Xeragon Inc., o se pueden sintetizar usando kits disponibles en el mercado, tales como el kit de construccion de ARNip SilencerrM de Ambion (numero de catalogo 1620) o el kit de transcripcion de ARNi HiScribeTM de New England Biolabs (numero de catalogo E2000S).
Como alternativa, el ARNip se puede preparar usando procedimientos convencionales para la transcripcion in vitro del ARN y procedimientos de hibridacion de ARNbc, tales como los descritos en Elbashir et al. (Genes & Dev. 15:188-200,2001), Girard et al. (Nature 442:199-202 (2006)), Aravin et al. (Nature 442:203-207 (2006)), Grivna et al. (Genes Dev. 20:1709-1714 (2006))) y Lau et al. (Science 313:363-367 (2006)).
Tambien se pueden usar ARN horquillados cortos (ARNhc), descritos en Yu et al. (Proc. Natl. Acad. Sci EE.UU., 99:6047-6052, 2002) o Paddison et al. (Genes & Dev, 16:948-958, 2002). Los ARNhc estan disenados de manera que se incluyen cadenas tanto sentido como antisentido dentro de una sola molecula de ARN y se conectan por un bucle de nucleotidos (3 o mas). Los ARNhc puede sintetizarse y purificarse usando la sintesis de transcripcion de T7 in vitro convencional como se ha descrito anteriormente y en Yu et al., supra. Los ARNhc tambien pueden subclonarse en un vector de expresion que tenga las secuencias del promotor U6 de raton, que luego puede transfectarse a celulas y usarse para la expresion in vivo del ARNhc.
Hay varios metodos disponible para la transfection o introduccion de ARNbc en celulas de mamifero. Por ejemplo, hay varios reactivos de transfeccion disponibles en el mercado que son utiles para la transfeccion a base de lipidos
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de ARNip incluyendo, pero sin limitacion, TranslT-TKO™ (Mirus, n.° de catalogo MIR 2150), Transmessenger™ (Qiagen, n.° de catalogo 301525), Oligo-fectamine™ y Lipofectamine™ (Invitrogen, n.° de catalogo MIR 12252-011 y n.° de catalogo 13778-075), siPORT™ (Ambion, n.° de catalogo 1631), DharmaFECT™ (Fisher Scientific, n.° de catalogo T-2001-01). Tambien hay agentes disponibles en el mercado para los metodos basados en la electroporacion para la transfeccion de ARNip, tales como siPORTer™ (Ambion Inc. n.° de catalogo 1629). Tambien se pueden usar tecnicas de microinyeccion. El ARN pequeno tambien puede transcribirse a partir de una construccion de expresion introducida en las celulas, donde la construccion de expresion incluye una secuencia de codificacion para transcribir el ARN pequeno, unida operativamente a una o mas secuencias reguladoras de la transcripcion. Cuando se desee, tambien se pueden usar plasmidos, vectores o vectores virales para la administracion de ARNbc o ARNip, y dichos vectores son conocidos en la tecnica. Los protocolos para cada reactivo de transfeccion estan disponibles desde el fabricante.
IV. Usos terapeuticos
A pesar de la amplia informacion sobre el papel del VEGF en la angiogenesis, se sabe relativamente poco sobre el papel de VEGF en los canceres benignos, precancerosos o no metastasicos, o en el entorno adyuvante o neoadyuvante. Los presentes inventores han descubierto que los antagonistas especificos del VEGF se pueden usar para el tratamiento de canceres benignos, precancerosos o no metastasicos; para el tratamiento de tumores latentes o micrometastasis; para la prevencion de la reaparicion o del rebrote de tumores; o para el tratamiento o la prevencion del cancer en un sujeto en riesgo de desarrollar cancer. Los antagonistas especificos del VEGF tambien se pueden usar para la terapia adyuvante para el tratamiento de un sujeto con cancer no metastasico, despues de la cirugia definitiva o para la terapia neoadyuvante para el tratamiento de un sujeto con un cancer operable que se presta el tratamiento antes de la extirpacion quirurgica de cancer operable en el sujeto. Aunque las aplicaciones terapeuticas se separan a continuacion en tratamiento, prevencion, terapia neoadyuvante y terapia adyuvante, el experto en la materia apreciara que estas categorias no son necesariamente excluyentes entre si.
A. Clasificacion de los tumores
El termino cancer engloba un conjunto de trastornos proliferativos, incluyendo, pero sin limitacion, crecimientos precancerosos, tumores benignos, tumores malignos y tumores latentes. Los tumores benignos permanecen localizados en el lugar de origen y no tienen la capacidad de infiltrarse, invadir ni hacer metastasis en sitios distantes. Los tumores malignos invadiran y danaran otros tejidos que los rodean. Tambien pueden adquirir la capacidad de desprenderse del sitio original y propagarse a otras partes del cuerpo (metastasis), en general, a traves del torrente sanguineo o del sistema linfatico, en el que se encuentran los ganglios linfaticos. Los tumores latentes son tumores en reposo en los que las celulas tumorales estan presentes, pero la progresion del tumor no es clinicamente evidente.
Los tumores primarios se clasifican segun el tipo de tejido del que proceden; los tumores metastasicos se clasifican segun el tipo de tejido del que derivan las celulas cancerosas. Con el tiempo, las celulas de un tumor maligno se vuelven mas anormales y se parecen menos a las celulas normales. Este cambio de aspecto de las celulas cancerosas se denomina grado tumoral, y las celulas cancerosas se describen como bien diferenciadas (de grado bajo), moderadamente diferenciadas, mal diferenciadas o indiferenciadas (alto grado). Las celulas bien diferenciadas tienen un aspecto bastante normal y se asemejan a las celulas normales de las cuales se originaron. Las celulas indiferenciadas son celulas que se han vuelto tan anomalas que ya no es posible determinar su origen.
Los sistemas de determinacion de la fase del cancer describen cuanto se ha diseminado el cancer anatomicamente, e intentan poner a los pacientes con pronostico y tratamiento similares en el mismo grupo de determinacion de fase. Se pueden realizar diversos ensayos para ayudar a determinar la fase del cancer, incluyendo la biopsia y ciertos ensayos de generacion de imagenes tales como radiografia de torax, mamografia, gammagrafia osea, tomografia computarizada y resonancia magnetica. Los analisis de sangre y una evaluation clinica tambien se usan para evaluar el estado de salud general del paciente y detectar si el cancer se ha propagado a ciertos organos.
Para determinar la fase del cancer, el Comite Conjunto sobre el Cancer de EE.UU. situa en primer lugar el cancer, en particular, los tumores solidos, en una categoria de letra usando el sistema de clasificacion TNM. Los canceres se designan con la letra T (tamano del tumor), N (nodulos linfaticos palpables) y/o M (metastasis). T1, T2, T3 y T4 describen el aumento de tamano de la lesion primaria; N0, N1, N2, N3 indican la implication de los ganglios en avance progresivo; y M0 y M1 reflejan la ausencia o la presencia de metastasis a distancia.
En el segundo metodo de determinacion de la fase, tambien conocido como agrupacion general de fases o determinacion en numeros romanos, los canceres se dividen en las fases 0 a IV, incorporando el tamano de las lesiones primarias, asi como la presencia de diseminacion ganglionar y de metastasis a distancia. En este sistema, los casos se agrupan en cuatro fases indicadas por los numeros romanos del I al IV, o se clasifican como "recurrentes". Para algunos tipos de cancer, la fase 0 se denomina "in situ" o "Tis", tal como el carcinoma ductal in situ o el carcinoma lobular in situ para los canceres de mama. Los adenomas de alto grado tambien se pueden clasificar como fase 0. En general, los canceres en fase I son canceres pequenos localizados que suelen ser curables, mientras que la fase IV suele representar un cancer inoperable o metastasico. Los canceres en fase II y III
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suelen estar avanzados a nivel local y/o presentar la participacion de los ganglios linfaticos locales. En general, las fases de numeros mas altos indican una enfermedad mas extendida, incluyendo un mayor tamano del tumor y/o propagation del cancer a los ganglios linfaticos cercanos y/o a los organos adyacentes al tumor primario. Estas fases estan definidas con precision, pero la definition es diferente para cada tipo de cancer, como el experto en la materia sabe.
Muchos registros del cancer, tales como el programa de vigilancia, epidemiologia y resultados finales (SEER) del NCI, usan la determination de la fase del sumario. Este sistema se usa para todo tipo de cancer. Agrupa los casos de cancer en cinco categorias principales:
In situ es cancer temprano que solo esta presente en la capa de celulas en la que comienza.
Localizado es cancer que se limita al organo en el que comenzo, sin evidencia de diseminacion.
Regional es el cancer que se ha diseminado mas alla del sitio original (primario) a los ganglios linfaticos u
organos y tejidos cercanos.
Distante es el cancer que se ha diseminado desde el sitio primario a organos distantes o a los ganglios linfaticos
distantes.
Desconocido se usa para describir los casos para los que no hay suficiente information para indicar una fase.
Ademas, es comun que el cancer vuelva en meses o en anos de haberse extirpado el tumor primario. El cancer que se repite una vez erradicado todo el tumor visible se denomina enfermedad recurrente. La enfermedad que se repite en la zona del tumor primario es localmente recurrente, y la enfermedad que se repite como metastasis se denomina reaparicion distante. Un tumor latente es un tumor que existe en un estado de reposo, en el que las celulas tumorales estan presentes, pero la progresion del tumor no es clinicamente evidente. Las micrometastasis son una pequena metastasis o una serie de celulas que se han extendido desde el tumor primario a otras partes del cuerpo. Las micrometastasis se pueden detectar o no en un ensayo de detection o de diagnostico. Los metodos de la divulgation son utiles para la prevention de la aparicion de tumores latentes o micrometastasis, o de la reaparicion del tumor, por ejemplo, en un entorno en el que haya un tumor latente o micrometastasis, pero que se pueda o no detectar clinicamente.
Los metodos de la divulgacion tambien son utiles para el tratamiento de canceres tempranos, incluyendo pero sin limitation, tumores benignos, precancerosos o no metastasicos. Esto incluye cualquier tumor en fase 0, I o II; cualquier tumor no metastasico en fase II; cualquier afeccion que normalmente precede o se desarrolla en un cancer, incluyendo, pero sin limitacion, la displasia; y cualquier tumor que permanece localizado en el lugar de origen y no se ha infiltrado, invadido o formado metastasis en sitios distantes. Los ejemplos de tumores benignos, precancerosos o no metastasicos incluyen un polipo, adenoma, fibroma, lipoma, gastrinoma, insulinoma, condroma, osteoma, hemangioma, linfangioma, meningioma, leiomioma, rabdomioma, papiloma de celulas escamosas, neuromas acusticos, neurofibromas, cistanoma de las vias biliares, leiomiomas, mesoteliomas, teratomas, mixomas, tracomas, granulomas, hamartoma, papiloma de celulas transicionales, adenoma pleyomorfico de la glandula salival, tumores desmoides, cisipapiloma dermoide, cistadenoma, hiperplasia nodular focal e hiperplasia nodular regenerativa.
Dado que la angiogenesis participa tanto en el crecimiento del tumor primario como en la metastasis, el tratamiento antiangiogenico proporcionado por la invention es capaz de inhibir el crecimiento neoplasico del tumor en el sitio principal, asi como de prevenir la metastasis de los tumores en los sitios secundarios, permitiendo asi el ataque de los tumores por otros productos terapeuticos. Los ejemplos de cancer que se van a tratar en el presente documento incluyen tanto los tumores solidos como los no solidos o de tejidos blandos. Los ejemplos incluyen, pero sin limitacion, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Mas ejemplos particulares de dichos canceres incluyen cancer de celulas escamosas; cancer de pulmon (incluyendo cancer de pulmon microcitico, cancer de pulmon no microcitico, adenocarcinoma de pulmon y carcinoma escamoso del pulmon); cancer del peritoneo, cancer hepatocelular, cancer gastrico o de estomago (incluyendo cancer gastrointestinal); cancer de pancreas; glioblastoma; cancer de cuello uterino; cancer de ovario; cancer de higado; cancer de vejiga; hepatoma; cancer de mama; cancer de colon; cancer colorrectal; carcinoma de endometrio o de utero; carcinoma de glandulas salivares; cancer de rinon o renal; cancer de higado; cancer de prostata; cancer de vulva; cancer de tiroides; carcinoma hepatico; y varios tipos de cancer de cabeza y cuello, asi como linfoma de linfocitos B (incluyendo linfoma no Hodgkin folicular (LNH)/de bajo grado; LNH linfocitico pequeno; LNH folicular/grado intermedio; LNH difuso de grado intermedio; LNH inmunoblastico de alto grado; LNH linfoblastico de alto grado; LNH de celulas pequenas no escindidas de alto grado LNH; LNH de enfermedad voluminosa; linfoma de celulas del manto; linfoma relacionado con el SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom); leucemia linfocitica cronica (LLC); leucemia linfoblastica aguda (LLA); leucemia de celulas vellosas; leucemia mieloblastica cronica; y trastorno linfoproliferativo post-trasplante (PTLD), asi como la proliferation vascular anormal asociada con la facomatosis, edema (tal como el asociado con tumores cerebrales) y sindrome de Meigs. Mas concretamente, los canceres que son susceptibles al tratamiento mediante los antagonistas especificos del VEGF de la invencion incluyen cancer de mama, cancer colorrectal, cancer rectal, cancer de pulmon no microcitico, linfoma no de Hodgkin (LNH), cancer de celulas renales, cancer de prostata, cancer de higado, cancer pancreatico, sarcoma de tejidos blandos, sarcoma de Kaposi, carcinoma carcinoide, cancer de cabeza y cuello, tumores cerebrales, gliomas (por ejemplo, astrocitoma anaplasico, oligoastrocitoma anaplasico, oligodendroglioma anaplasico, glioblastoma multiforme), melanoma, cancer de ovario,
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mesotelioma y mieloma multiple. Mas preferentemente, la invencion es para su uso en el tratamiento del cancer colorrectal en un paciente humano.
B. Adenomas
En una realizacion, la invencion se refiere al tratamiento de un tumor de celulas epiteliales benigno conocido como adenoma. Un adenoma es un tumor benigno que tiene un origen glandular. Los adenomas normalmente se originan a partir de celulas epiteliales usadas para la secrecion. Las celulas epiteliales se encuentran en todo el organismo, pero solo un subconjunto de dichas celulas se usa para la secrecion. Las celulas epiteliales que se usan para la secrecion constituyen partes especificas del organismo conocidas como glandulas. Las glandulas tienen la tarea de formar una serie de sustancias en el organismo incluyendo, pero sin limitation, el sudor, la saliva, la leche materna, mucosidades y hormonas. Un adenoma se puede formar a partir de la mayoria de las celulas glandulares del organismo.
Un adenoma se puede formar de una manera similar a un tumor maligno o canceroso. Los adenomas son benignos y, por lo tanto, no hacen metastasis ni se extienden a otros organos o tejidos. Aunque la mayoria de los adenomas permanecen benignos, algunos adenomas pueden convertirse en tumores malignos y, si esto ocurre, el adenoma maligno recien formado se denomina adenocarcinoma. Por ejemplo, los canceres de colon y de recto pueden comenzar como adenomas o polipos y convertirse mas tarde en adenocarcinomas; los adenomas bronquiales pueden convertirse en cancer de pulmon.
Con frecuencia, los adenomas tienen un efecto notable en los organos o en el tejido glandular en los que se desarrollan. A menudo, los adenomas secretan niveles excesivos de hormonas. Cuando esto ocurre, los efectos pueden ser bastante incomodos para la persona afectada. En ciertas situaciones, los efectos pueden ser potencialmente mortales. Sin embargo, algunos adenomas se desarrollan sin efectos demostrables.
Hay ciertos tipos de adenomas que son mas comunes en las mujeres, tales como los adenomas del higado. Otros, tales como los adenomas de colon, son mas comunes en los adultos de edad avanzada, por ejemplo, de mas de cincuenta anos. Ademas, hay factores que predisponen a un paciente al desarrollo de un adenoma. Por ejemplo, las mujeres que toman anticonceptivos orales pueden estar en mayor riesgo de desarrollar adenomas hepaticos. Ciertos tipos de adenomas, por ejemplo, los adenomas de colon, pueden ser hereditarios.
Los sintomas relacionados con los adenomas varian ampliamente. Por ejemplo, un adenoma de mama, denominado fibroadenoma, normalmente no causa sintomas y puede ser tan pequeno que la persona afectada sea incapaz de detectarlo. Otros adenomas de mama, sin embargo, pueden ser lo suficientemente grandes como para ser perceptibles al tacto. Por el contrario, un adenoma de pulmon puede causar escalofrios febriles, falta de aliento y tos con sangre.
Los adenomas se diagnostican usando varias tecnicas, incluyendo la recogida de muestras de sangre y de orina, ecografia, tomografia computarizada (TC) y resonancia magnetica (MRI). Las biopsias se emplean normalmente para determinar si el tumor es benigno o maligno. La invencion es particularmente util para la prevention de los adenomas en un sujeto segun lo definido en las reivindicaciones, que tenga cualquiera de los factores de riesgo asociados con los adenomas.
C. Tumores gastrointestinales
En otra realizacion, la invencion se usa para el tratamiento de un tumor gastrointestinal benigno, precanceroso o no metastasico. Esto incluye cualquier tumor en fase 0, I o II; cualquier tumor o afeccion que normalmente precede o se convierte en un cancer gastrointestinal; y cualquier tumor gastrointestinal que permanece localizado en el lugar de origen y no se ha infiltrado, invadido ni hecho metastasis en sitios distantes. Se incluyen en los tumores gastrointestinales cualquier polipo, adenoma, tumor o cancer del sistema digestivo, especificamente del esofago, estomago, higado, vias biliares (conductos biliares de la vesicula biliar, ampolla de Vater), intestinos, pancreas, colon, recto y ano. Estos se describen en detalle a continuation.
(i) Cancer anal
El cancer anal es un tumor maligno ya sea del canal anal o del borde anal. Con frecuencia, el cancer anal comienza como displasia anal. La displasia anal se compone de celulas del ano que tienen cambios anomalos, pero que no muestran evidencia de invasion en el tejido circundante. La forma mas grave de displasia anal se denomina carcinoma in situ, en el que las celulas aparecen como celulas cancerosas, pero no han invadido mas alla de donde se encuentran las celulas normales. Con el tiempo, la displasia anal finalmente cambia hasta el punto en que las celulas se vuelven invasivas y adquieren la capacidad de hacer metastasis, o de desprenderse a otras partes del organismo. La displasia anal a veces se denomina neoplasia intraepitelial anal (NIA). Cuando el cancer anal se propaga, por lo general, es a traves de la invasion directa del tejido circundante o a traves del sistema linfatico. La propagation del cancer anal a traves de la sangre es menos comun, aunque puede ocurrir.
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Se han asociado varios factores con el cancer anal. Lo mas importante, la infeccion con el virus del papiloma humano (VPH) ha demostrado estar relacionada con los canceres anales y se ha asociado con otros varios tipos de cancer incluyendo el cancer de cuello uterino, y los canceres de cabeza y cuello. Otro virus de transmision sexual, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), se ha relacionado con los canceres de ano, y los individuos infectados con el VIH tienen un mayor riesgo de infeccion con el VPH. Dado que el cancer anal parece iniciarse primero como displasia anal antes de progresar a cancer anal, los pacientes con antecedentes de NIA estan en mayor riesgo de desarrollar cancer anal. Ademas, parece que hay una mayor tasa de cancer anal en pacientes que sufren enfermedades anales benignas tales como fistulas anales, fisuras anales, abscesos perianales o hemorroides.
La invencion es particularmente util para la prevencion del cancer anal en un sujeto, segun lo definido en las reivindicaciones, que tenga cualquiera de los factores de riesgo asociados con el cancer anal.
(II) Canceres colorrectales y rectales
El colon es la parte mas larga del intestino grueso. El cancer de colon es el tercer tipo mas comun de cancer, tanto en varones como en mujeres, en el mundo occidental. La incidencia es mayor en los afroamericanos, que tambien son mas propensos a morir de la enfermedad. El riesgo del cancer de colon aumenta sustancialmente despues de los 50 anos de edad, pero cada ano hay numerosos casos informados de personas mas jovenes. En general, los canceres de colon y recto se agrupan, y tienen los mismos factores de riesgo asociados. Las personas con antecedentes personales o familiares de cancer de colon, polipos o sindromes de cancer de colon hereditario (por ejemplo, PAF y HNPCC), asi como los pacientes con colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn, estan en mayor riesgo y pueden requerir un reconocimiento a una edad mas temprana que la poblacion general. Una persona con un pariente de primer grado (padre, hermano o hijo) con cancer de colon tiene de 2 a 3 veces mas probabilidades de desarrollar el cancer que una persona que no tenga un familiar afectado.
Los canceres de colon se pueden diagnosticar usando varias tecnicas conocidas para el clinico. Las pruebas de deteccion son el metodo mas eficaz para diagnosticar el cancer de colon en las fases tempranas (por ejemplo, polipos o adenomas), ya que estas fases no suelen estar asociadas con ningun sintoma. En general, es cuando el polipo crece hasta convertirse en un tumor cuando puede sangrar u obstruir el colon causando sintomas. Estos sintomas incluyen el sangrado por el recto, sangre en las heces o en el inodoro despues de una deposicion, un cambio en la forma de las heces (es decir, adelgazamiento), dolor por calambres en el abdomen y sensacion de necesidad de ir al bano cuando no es necesario. Para los tumores y polipos que pueden sangrar de forma intermitente, la sangre se puede detectar en muestras de heces mediante una prueba denominada prueba de sangre oculta en heces (FOBT). Por si misma, la FOBT solo encuentra aproximadamente el 24 % de los canceres. Tambien se puede usar una sigmoidoscopia flexible o una colonoscopia para diagnosticar el cancer colorrectal.
En general, el cancer colorrectal se clasifica de la siguiente forma:
Fase 0 (tambien denominada carcinoma in situ) - el cancer esta confinado a la parte mas exterior de la pared del colon.
Fase I - el cancer se ha diseminado a la segunda y tercera capa de la pared del colon, pero no a la pared del colon exterior ni mas alla. Esto tambien se denomina cancer de colon A de Dukes.
Fase II - el cancer se ha diseminado a traves de la pared del colon, pero no ha invadido los ganglios linfaticos (se trata de estructuras pequenas que ayudan en la lucha contra la infeccion y la enfermedad). Esto tambien se denomina cancer de colon B de Dukes.
Fase III - el cancer se ha diseminado a traves de la pared del colon y en los ganglios linfaticos, pero no se ha propagado a otras zonas del organismo. Esto tambien se denomina cancer de colon C de Dukes.
Fase IV - el cancer se ha diseminado a otras zonas del organismo (es decir, higado y pulmones). Esto tambien se denomina cancer de colon D de Dukes.
La invencion es particularmente util para la prevencion del cancer colorrectal en un sujeto, segun lo definido en las reivindicaciones, que tenga cualquiera de los factores de riesgo de cancer colorrectal, tales como los descritos anteriormente.
(iii) Cancer de esofago
El esofago es un tubo muscular que conecta la garganta con el estomago. La gran mayoria de los canceres de esofago se desarrollan a partir del revestimiento interno (mucosa) del esofago y no de las celulas musculares o de cartilago que componen el resto del esofago. El revestimiento del esofago es algo unico, ya que cambia a medida que va avanzando desde la garganta hasta el estomago. En la parte superior del esofago (proximal), el revestimiento del esofago se asemeja al revestimiento de la garganta, compuesto de celulas escamosas. Por lo tanto, cuando se desarrollan canceres en esta region, por lo general, son carcinomas de celulas escamosas. En la parte inferior del esofago (distal), el tipo mas comun de cancer es el adenocarcinoma.
Ademas de los canceres invasivos, los pacientes a veces son diagnosticados con lesiones precancerosas, denominadas carcinoma in situ. Estas lesiones precancerosas se pueden ver antes del desarrollo de cualquier
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carcinoma de celulas escamosas o adenocarcinoma. El carcinoma in situ se produce cuando el revestimiento del esofago sufre cambios similares a los cambios cancerosos sin invasion en los tejidos mas profundos. Por lo tanto, aunque las propias celulas tienen cualidades similares al cancer, no hay riesgo de propagacion, pues no se ha producido invasion. Otro tipo de lesion que se considera precursora del cancer en si se denomina esofago de Barrett, que se explica en profundidad a continuacion.
El cancer de esofago se produce en aproximadamente 13.500 estadounidenses al ano, causando aproximadamente 12.500 muertes. La mayoria de los pacientes son diagnosticados con 50 o 60 anos, con aproximadamente cuatro veces mas hombres diagnosticados que mujeres. En el pasado, la gran mayoria (85 %) de los canceres de esofago diagnosticados fueron canceres de celulas escamosas producidos en la parte superior del esofago. Los factores de riesgo para este tipo de cancer incluyen el consumo de alcohol y de tabaco. Aunque se cree que son factores de riesgo independientes (siendo el tabaquismo peor), parece que hay un efecto sinergico entre los dos para el desarrollo del cancer de esofago. Otros posibles agentes carcinogenos para el desarrollo del carcinoma de celulas escamosas del esofago son las nitrosaminas, las fibras de asbesto y los productos derivados del petroleo.
Esto contrasta con el grupo de pacientes en riesgo de adenocarcinoma, normalmente, de la parte inferior del esofago. El adenocarcinoma antes era una enfermedad menos frecuente en comparacion con el carcinoma de celulas escamosas. Sin embargo, ultimamente, se ha hecho aun mas frecuente que el carcinoma de celulas escamosas. Se cree que el adenocarcinoma, en general, surge en el contexto del esofago de Barrett, que es una afeccion en la que el revestimiento normal del esofago se reemplaza por un revestimiento que se asemeja al estomago. El esofago de Barrett se diagnostica mediante endoscopia, en la que se usa una camara de fibra optica para observar el esofago en sentido descendente y la biopsia de cualquier area sospechosa. Se cree que el esofago de Barrett esta causado por la exposicion cronica de la parte inferior del esofago al acido gastrico. Esta exposicion ocurre en pacientes con enfermedad por reflujo gastroesofagico (ERGE), que provoca sintomas en los pacientes de ardor de estomago, hinchazon, perdida de apetito o dolor de estomago con alimentos o por la noche mientras se duerme. Los pacientes con ERGE cronica estan en riesgo de desarrollar esofago de Barrett y, por lo tanto, estan en riesgo de desarrollar adenocarcinoma de esofago.
Aunque el esofago de Barrett, por definicion, se produce cuando el revestimiento del esofago es anormal, puede haber diferentes grados de las anomalias. Se clasifican en terminos de displasia, que se usa para determinar la probabilidad de que el esofago de Barrett progrese a un cancer. Los pacientes con esofago de Barrett que tienen displasia de alto grado deben recibir un seguimiento por endoscopia cada 3 meses o incluso recibir tratamiento, ya que se consideran cambios premalignos que tienen una alta probabilidad de progresar a cancer. La prueba mas sensible para documentar el cancer de esofago local o la displasia es la endoscopia. Con la endoscopia, se puede observar el area de interes del esofago directamente con la camara de fibra optica, y se pueden visualizar la ubicacion de la anomalia, la presencia o ausencia de sangrado y la cantidad de obstruccion. La realizacion de una laringoscopia (observacion de la garganta) o una broncoscopia (observacion de la traquea y las vias respiratorias) tambien puede ser necesaria dependiendo de la ubicacion y de la extension del cancer de esofago. El nivel de atencion hoy en dia tambien incluye la realizacion de una ecografia durante la endoscopia, denominada ecografia endoscopica (EUS). Por lo general, se realizan una tomografia computarizada, una prueba de ingesta de bario, una radiografia y otras pruebas adicionales de rutina, incluyendo analisis de sangre, para el diagnostico y la determinacion correcta de la fase del cancer.
La invention es particularmente util para la prevention del cancer de esofago en un sujeto, segun lo definido en las reivindicaciones, que tiene cualquiera de los factores de riesgo asociados con el cancer de esofago, tales como los descritos anteriormente.
(iv) Cancer de la vescula biliar
La vesicula biliar es un pequeno organo en forma de pera que almacena y concentra la bilis. La vesicula biliar y el higado estan conectados por el conducto hepatico. El cancer primario de la vesicula biliar afecta a aproximadamente 6.000 adultos en EE.UU. al ano. La mayoria de estos canceres son adenocarcinomas, con subtipos tales como papilar, nodular y tubular, dependiendo del aspecto de las celulas tumorales en el microscopio. Los subtipos menos comunes incluyen de celulas escamosas, de celulas en anillo de sello y adenoescamoso (adenoacantoma).
El cancer de vesicula biliar se observa con mayor frecuencia en pacientes de mayor edad, con una edad media al diagnostico de 62-66 anos. Es mas frecuente en las mujeres, con una proportion de mujeres con respecto a varones de aproximadamente 3:1.
La causa del cancer de vesicula biliar es desconocida, aunque se ha asociado con los calculos biliares, niveles altos de estrogeno, tabaquismo, alcohol, obesidad y el genero femenino. Ademas, los pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal (colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn) son 10 veces mas propensos a desarrollar cancer del tracto biliar extrahepatico.
En general, el cancer de la vesicula biliar se diagnostica a partir del historial clinico y examen fisico, y de labores de laboratorio que incluyen paneles de quimica metabolica y funcion hepatica en busca de niveles anomalos de
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diversas sustancias en la sangre que sean indicativos de la enfermedad hepatobiliar general. Normalmente, se hace un analisis de orina para evaluar los niveles en orina de algunas de estas sustancias. Tambien se pueden usar otras tecnicas tales como la ecografia, resonancia magnetica, colangiografia y tomografias computarizadas.
La invencion es particularmente util para la prevencion del cancer de la vesicula biliar en una sujeto, segun lo definido en las reivindicaciones, que tiene cualquiera de los factores de riesgo asociados con el cancer de la vesicula biliar, tales como los descritos anteriormente.
(v) Cancer gastrico
El cancer gastrico es el cancer del estomago. En Estados Unidos, el cancer gastrico se situa ahora como el decimocuarto cancer mas comun. Es raro encontrarse con un cancer gastrico antes de los 40 anos de edad, y su incidencia aumenta con la edad a partir de entonces.
Mas del 90 % de los canceres gastricos aparecen en el revestimiento del estomago. Dado que este revestimiento tiene glandulas, el cancer que procede del mismo se denomina adenoma o, para las formas mas avanzadas, adenocarcinoma. Aunque hay otros tipos de cancer que pueden surgir en el estomago (linfomas a partir del tejido linfatico, leiomiosarcoma a partir del tejido muscular, carcinoma de celulas escamosas a partir del revestimiento sin glandulas), la gran mayoria son adenocarcinomas.
Los estudios tambien han relacionado la infeccion con Helicobacter pylori con el cancer gastrico. H. pylori se asocia con la ulcera gastrica y la gastritis atrofica cronica, lo que puede explicar la alta incidencia del cancer gastrico en pacientes infectados con H. pylori. Sin embargo, la funcion exacta de H. pylori en el desarrollo del cancer gastrico sigue siendo poco clara.
Se usa varias pruebas para identificar con precision el cancer gastrico, incluyendo radiografias de bario de doble contraste (denominadas "IG superiores" o "tragos de bario") y endoscopias superiores. Para el diagnostico del cancer gastrico, se usan otros procedimientos que incluyen la tomografia computerizada, el PET y la laparoscopia.
La invencion es particularmente util para la prevencion del cancer gastrico en un sujeto, segun lo definido en las reivindicaciones, que tenga cualquiera de los factores de riesgo asociados con el cancer gastrico, tales como los descritos anteriormente.
(vi) Cancer de h^gado
Hay una serie de tumores hepaticos benignos. Los hemangiomas son los tumores benignos mas frecuentes del higado, y se producen cuando se forma un tumor, lleno de sangre, benigno en el higado. Otros tumores benignos incluyen adenomas e hiperplasia nodular focal. Aunque estos tumores no invaden los tejidos circundantes ni hacen metastasis, suele ser dificil distinguir entre los tumores benignos y malignos en las imagenes radiograficas.
El carcinoma hepatocelular (CHC), un tipo de cancer que surge de los hepatocitos, es el tipo mas comun de cancer primario de higado, y representa alrededor del 70 % de todos los canceres de higado. Los canceres que surgen de los conductos biliares del higado se conocen como colangiocarcinomas, y representan el 10-20 % de todos los canceres de higado. Estos canceres pueden surgir de los conductos biliares del interior del higado (conocidos como colangiocarcinomas intrahepaticos) o del interior de los conductos biliares, ya que parten del higado (conocidos como colangiocarcinomas extrahepaticos). Otros tipos de canceres raros pueden producirse dentro del higado. Estos incluyen hemangiosarcomas (tumores malignos llenos de sangre) y hepatoblastomas (un cancer raro que se desarrolla en los ninos muy pequenos).
Hay una serie de factores de riesgo asociados con el cancer de higado. En Estados Unidos, el factor de riesgo mas comun para el cancer de higado es la cirrosis hepatica. La infeccion cronica con el virus de la hepatitis C (VHC) tambien es una causa comun de cancer de higado en Estados Unidos. A nivel mundial, otros factores de riesgo, tales como la infeccion cronica por el virus de la hepatitis B (VHB) y la contamination alimentaria con la aflatoxina B1 son mas comunes.
Hay varias pruebas de detection que se usan para detectar el cancer de higado. Una posible prueba de detection implica la deteccion de los niveles en sangre de alfa-fetoproteina (AFP). La AFP es una proteina que se encuentra en altos niveles en la sangre fetal, pero normalmente desaparece despues del nacimiento. Los niveles de AFP aumentan en presencia del CHC, y pueden ser un marcador del desarrollo del cancer de higado. Aunque algunos pacientes que estan en alto riesgo de desarrollar cancer de higado se someten rutinariamente a ensayos de determination de los niveles de AFP, no todos los canceres de higado producen altos niveles de AFP en sangre, y para el momento en que la mayoria de los pacientes resultan tener niveles elevados de AFP, el tumor ya se encuentra en una fase avanzada. Hay otras proteinas de la sangre que se pueden usar como herramientas de deteccion del cancer de higado. Varios estudios han demostrado que tambien se pueden usar proteinas tales como la des-gamma-carboxi protrombina (DCP) y la fraction reactiva con la aglutinina Lens culinaris (AFP-L3) como marcadores de la formation del cancer de higado. Sin embargo, en la practica, estas se usan con poca frecuencia.
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Ademas, cuando se sospecha de la presencia de cancer de tngado, se realizan ecografias, tomografias computarizadas, resonancias magneticas, angiografias, tomografias por emision de positrones-fluorodesoxiglucosa (FDG-PET), biopsias y laparotomias exploratoria para diagnosticar y determinar la fase del cancer de higado.
La invention es particularmente util para la prevention del cancer de higado en un sujeto, segun lo definido en las reivindicaciones, que tenga cualquiera de los factores de riesgo asociados con el cancer de higado, tales como los descritos anteriormente.
(vii) Cancer de pancreas
El pancreas es una glandula en forma de pera, de poco mas de quince cenfimetros de longitud, que se encuentra profundamente dentro del abdomen, entre el estomago y la columna vertebral. Se divide en tres partes: la parte mas ancha se denomina la cabeza, la section media es el cuerpo, y el extremo delgado se denomina cola. El pancreas es responsable de fabricar hormonas, incluyendo la insulina, que ayudan a regular los niveles de azucar en sangre, y enzimas, que son usadas por el intestino para la digestion de los alimentos. Estas enzimas se transportan a traves de conductos dentro del pancreas, que se vacian en el conducto biliar comun, portando las enzimas al intestino. La incidencia del cancer de pancreas es mas alta entre los 60 y 80 anos de edad, y solo se observa rara vez en personas menores de 40 anos. Se da casi por igual en varones y en mujeres, aunque las tasas de las mujeres han aumentado en los ultimos anos, lo que puede deberse a mayores tasas de consumo de tabaco en las mujeres. Los fumadores tienen de dos a tres veces mas probabilidades de desarrollar cancer de pancreas. El riesgo de una persona se triplica si la madre, el padre o los hermanos han tenido la enfermedad. Los antecedentes familiares de cancer de mama o de colon tambien aumenta el riesgo. Este aumento del riesgo se debe a mutaciones heredadas en los genes causantes del cancer. Se desconoce la causa real de esta enfermedad, pero se cree que es el resultado de una combination de cambios geneticos hereditarios y de cambios causados por la exposition ambiental.
Cuando un medico sospecha que un paciente puede tener cancer de pancreas, se usan la ecografia, tomografia computarizada y endoscopia para diagnosticar la fase del cancer. Algunos pacientes con cancer de pancreas pueden tener un nivel elevado de anfigeno carbohidrato 19-9 (CA 19-9). En los pacientes que tienen un nivel elevado, resulta util en la confirmation del diagnostico en combinacion con otras pruebas y para monitorizar la enfermedad durante el tratamiento. El nivel se puede comprobar periodicamente durante el tratamiento para ver si el cancer es estable o ha empeorado.
La invencion es particularmente util para la prevencion del cancer de pancreas en un sujeto, segun lo definido en las reivindicaciones, que tenga cualquiera de los factores de riesgo asociados con el cancer de pancreas, tales como los descritos anteriormente.
(viii) Cancer de intestino delgado
El intestino delgado es la parte del tracto digestivo que conecta el estomago y el intestino grueso, tambien denominado colon. El intestino delgado se divide en tres partes: 1) el duodeno, 2) el yeyuno y 3) el ileon. Sorprendentemente, a pesar de la increiblemente larga longitud del intestino delgado en comparacion con el resto del tracto digestivo, el cancer del intestino delgado es muy raro. Incluye bien los canceres que comienzan en el intestino o los canceres que se extienden desde ahi a otro parte del organismo. En concreto, el cancer de intestino delgado representa menos del 5 % de todos los canceres intestinales y aproximadamente el 0,5 % de todos los canceres diagnosticados en EE.UU.
Se desconoce la causa de la mayoria de los canceres del intestino delgado. Hay, sin embargo, algunos posibles factores de riesgo que pueden aumentar la probabilidad de desarrollar cancer de intestino delgado. Algunos ejemplos incluyen la enfermedad de Crohn, enfermedad celiaca, sindrome de Peutz-Jegher y poliposis intestinal.
Existen cuatro tipos principales de cancer de intestino delgado, dependiendo del aspecto bajo el microscopio y de la celula de origen. El adenocarcinoma es el tipo mas comun. Por lo general, se inicia en el revestimiento o en la capa interior del intestino y, normalmente, se produce en el duodeno. Otro tipo es el sarcoma, y el subtipo fipico es el leiomiosarcoma, que comienza en la pared muscular del intestino delgado y, normalmente, se produce en el Neon. El tercer tipo es carcinoide, que comienza en las celulas productoras de hormonas especiales del intestino delgado y, normalmente, se produce en el Neon, a veces en el apendice (que es la primera parte del intestino grueso). El cuarto tipo es el linfoma, que comienza en el tejido linfatico del intestino delgado y, normalmente, se produce en el yeyuno. El subtipo mas fipico de linfoma es el linfoma no Hodgkin. Un subtipo poco frecuente de cancer de intestino delgado es el tumor del estroma gastrointestinal, que puede producirse en cualquiera de las tres partes del intestino delgado.
El cancer del intestino delgado normalmente se diagnostica mediante el historial medico completo, un examen fisico y una muestra de heces, endoscopia o colonoscopia, rayos C con bario, tomografia computarizada, ecografia u otras radiografias.
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La invencion es particularmente util para la prevencion del cancer de intestino delgado en un sujeto, segun lo definido en las reivindicaciones, que tenga cualquiera de los factores de riesgo asociados con el cancer de intestino delgado, tales como los descritos anteriormente.
V. Prevencion
En un aspecto adicional de la divulgacion, los presentes inventores han descubierto que los antagonistas especificos del VEGF se pueden usar para el tratamiento de los canceres benignos, precancerosos o en fase temprana, o para el tratamiento o la prevencion de la reaparicion de tumores. Los metodos se pueden usar para tratar el propio cancer o para prevenir la progresion del cancer a una fase metastasica o invasiva, o a un grado o a una fase superior. Por ejemplo, los metodos se pueden usar para tratar un sujeto con cancer en fase 0 o polipos con el fin de prevenir la progresion a un tumor en fase I o superior. Del mismo modo, en un paciente que tenga cancer en fase II, los metodos se pueden usar para evitar la progresion del cancer a un cancer en fase III o IV.
Los antagonistas especificos del VEGF se pueden usar tambien para prevenir la reaparicion de un tumor. Por ejemplo, si se ha identificado y tratado un tumor (por ejemplo, con quimioterapia o extirpandolo quirurgicamente), los antagonistas especificos del VEGF se pueden usar para prevenir la reaparicion del tumor colorrectal bien en una zona o la metastasis del tumor colorrectal. Para la prevencion de la reaparicion del tumor, los antagonistas especificos del VEGF se pueden usar, por ejemplo, para tratar un tumor latente o micrometastasis, o para prevenir el crecimiento o rebrote de un tumor latente o micrometastasis, que puede ser o no clinicamente detectable.
De acuerdo con la invencion, tambien se ha descubierto que los antagonistas especificos del VEGF se pueden usar para la prevencion del cancer en un sujeto que nunca haya tenido cancer o que este en riesgo de desarrollar un cancer. Hay varios factores de riesgo conocidos por estar asociados con el cancer, y muchos de ellos se han descrito anteriormente. Los factores de riesgo ilustrativos incluyen la edad avanzada (es decir, por encima de los cincuenta anos), un historial familiar de cancer, infeccion viral con el VPH, VIH, VHB y VHC, uso de anticonceptivos orales, cirrosis, colitis ulcerosa, esofago de Barrett, infeccion por H. pylori y la presencia de polipos o displasia. Ademas, un sujeto que se sepa que tiene un sindrome de cancer hereditario se considera en riesgo de desarrollar un cancer. Los ejemplos no limitantes de dichos sindromes incluyen APC HNPCC, el sindrome de Gardner y MEN1. Se pueden determinar otros factores de riesgo para el desarrollo de los canceres tras una evaluacion clinica, e incluyen los niveles altos de hormonas o proteinas de la sangre, tales como PSA (cancer de prostata), CA-125 (cancer de ovario), AFP (cancer de higado), DCP (cancer de higado) y CA 19-9 (cancer de pancreas).
VI. Terapia neoadyuvante
La divulgacion proporciona un metodo de terapia neoadyuvante previa a la extirpacion quirurgica del cancer operable en un sujeto, por ejemplo, un paciente humano, que comprende administrar al paciente (por ejemplo, cuando el paciente ha sido diagnosticado con un tumor y/o cancer) una cantidad eficaz de un antagonista especifico del VEGF, por ejemplo, un anticuerpo VEGF. Opcionalmente, el antagonista especifico del VEGF se administra en combinacion con al menos un agente quimioterapeutico. La etapa adicional de administrar al sujeto una cantidad eficaz de un antagonista especifico del VEGF despues de la cirugia para prevenir la reaparicion del cancer tambien se puede emplear con las terapias neoadyuvantes descritas en el presente documento. Para los metodos que incluyen la etapa adicional de administrar al sujeto una cantidad eficaz de un antagonista especifico del VEGF despues de la cirugia, se puede usar cualquiera de los metodos adyuvantes descritos en el presente documento.
Por ejemplo, un metodo incluye tratar el cancer en un sujeto que comprende las siguientes etapas: a) una primera fase que comprende una pluralidad de ciclos de tratamiento en la que cada ciclo comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un antagonista especifico del VEGF, por ejemplo, bevacizumab y, opcionalmente, al menos un agente quimioterapeutico a un intervalo predeterminado; b) una cirugia definitiva mediante la que se elimina el cancer; y, opcionalmente, c) una segunda fase que comprende una pluralidad de ciclos de mantenimiento en la que cada ciclo comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un antagonista especifico del VEGF, por ejemplo, bevacizumab, con o sin cualquier agente quimioterapeutico a un intervalo predeterminado.
Para la terapia neoadyuvante, el antagonista especifico del VEGF se puede administrar en una cantidad o durante un tiempo (por ejemplo, para un determinado regimen terapeutico a lo largo del tiempo) para reducir (por ejemplo, un 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 % , 70 %, 80 %, 90 %, 100 % o mas) el numero de celulas cancerosas del tumor; para reducir el tamano del tumor (por ejemplo, para permitir la reseccion); para reducir la carga tumoral; para inhibir (es decir, para disminuir en cierta medida y/o detener) la infiltracion de celulas cancerosas en organos perifericos; para reducir la densidad de los vasos del tumor; para inhibir la metastasis tumoral; para reducir o inhibir el crecimiento tumoral o la proliferacion de celulas tumorales; para reducir o prevenir el crecimiento de un tumor latente; para reducir o prevenir el crecimiento o la proliferacion de una micrometastasis; para aumentar o prolongar la SLE o la SG de un sujeto susceptible de padecer o de ser diagnosticado con un tumor benigno, precanceroso o no metastasico; y/o para aliviar en cierta medida uno o mas de los sintomas asociados con el cancer.
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En un ejemplo, la terapia neoadyuvante se administra para prolongar la SLE o la SG, en la que la SLE o la SG se evaluan aproximadamente de 2 a 5 anos despues de una administracion inicial del anticuerpo. En ciertas realizaciones, la SLE o la SG del sujeto se evaluan aproximadamente de 3 a 5 anos, aproximadamente de 4 a 5 anos o al menos aproximadamente 4, o al menos aproximadamente 5 anos despues de iniciarse el tratamiento o despues del diagnostico inicial. Por lo general, el antagonista espedfico del VEGF es un anticuerpo VEGF tal como bevacizumab.
En otro ejemplo, la administracion del anticuerpo y/o la quimioterapia puede disminuir la reaparicion de la enfermedad (reaparicion del cancer en el organo primario y/o reaparicion distante), en una poblacion de sujetos en aproximadamente un 50 % a los 3 anos (donde "aproximadamente un 50 %" en el presente documento, incluye un intervalo del aproximadamente 45 % al aproximadamente 70 %), por ejemplo disminuye la reaparicion en el organo primario en aproximadamente un 52 % a los 3 anos y/o disminuye la reaparicion distante en aproximadamente un 53 % a los 3 anos, en comparacion con los sujetos tratados con quimioterapia (por ejemplo, taxoides, tales como paclitaxel) solo.
El antagonista espedfico del VEGF, por ejemplo, un anticuerpo VEGF, se administra a un sujeto, por ejemplo, un paciente humano, de acuerdo con procedimientos conocidos tales como administracion intravenosa, por ejemplo, como un bolo o por infusion continua durante un periodo de tiempo, por via intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutanea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, topica o por inhalacion. Se prefiere la administracion intravenosa del anticuerpo.
Aunque el antagonista espedfico del VEGF, por ejemplo, un anticuerpo VEGF, se puede administrar como un solo agente, el paciente se trata, opcionalmente, con una combinacion de anticuerpo VEGF, y uno o mas agentes quimioterapeuticos. En una realizacion, al menos uno de los agentes quimioterapeuticos es un taxoide. La administracion combinada incluye la coadministracion o la administracion simultanea, usando formulaciones separadas o una sola formulacion farmaceutica, y la administracion consecutiva en cualquier orden, en la que, preferentemente, hay un periodo de tiempo en el que ambos (o todos) los agentes activos ejercen al mismo tiempo sus actividades biologicas. Por lo tanto, el agente quimioterapeutico puede administrarse antes o despues de la administracion del antagonista espedfico del VEGF, por ejemplo, anticuerpo VEGF. En esta realizacion, el tiempo entre al menos una administracion del agente quimioterapeutico y al menos una administracion del antagonista espedfico del VEGF, por ejemplo, un anticuerpo VEGF, es preferentemente de aproximadamente 1 mes o menos, y lo mas preferentemente, de aproximadamente 2 semanas o menos. Como alternativa, el agente quimioterapeutico y el antagonista espedfico del VEGF, por ejemplo, un anticuerpo VEGF se administran simultaneamente al paciente, en una sola formulacion o en formulaciones separadas. El tratamiento con la combinacion del agente quimioterapeutico (por ejemplo, taxoide) y el anticuerpo VEGF (por ejemplo, bevacizumab) puede dar lugar a un beneficio sinergico o un beneficio terapeutico mas que aditivo al paciente.
El agente quimioterapeutico, si se administra, normalmente se administra a dosis conocidas para el mismo, u opcionalmente reducidas debido a la accion combinada de los farmacos o a los efectos secundarios negativos atribuibles a la administracion del agente quimioterapeutico antimetabolito. Se pueden usar los programas de preparacion y dosificacion para dichos agentes quimioterapeuticos de acuerdo con las instrucciones del fabricante o de acuerdo con lo determinado empiricamente por el medico experto. Cuando el agente quimioterapeutico es paclitaxel, preferentemente, se administra cada semana (por ejemplo, a 80 mg/m2) o cada 3 semanas (por ejemplo, a 175 mg/m2 o 135 mg/m2). Las dosis de docetaxel adecuadas incluyen 60 mg/m2, 70 mg/m2, 75 mg/m2, 100 mg/m2 (cada 3 semanas); o 35 mg/m2 o 40 mg/m2 (cada semana).
Se han desvelado anteriormente varios agentes quimioterapeuticos que se pueden combinar. En ciertas realizaciones de la invencion, los agentes quimioterapeuticos que se combinaran con el antagonista espedfico del VEGF, por ejemplo, un anticuerpo VEGF, incluyen, pero sin limitacion, por ejemplo, un taxoide (incluyendo docetaxel y paclitaxel), vinca (por ejemplo, vinorelbina o vinblastina), compuesto de platino (tal como carboplatino o cisplatino), inhibidor de la aromatasa (por ejemplo, letrozol, anastrozol o exemestano), antiestrogenos (por ejemplo, fulvestrant o tamoxifeno), etoposido, tiotepa, ciclofosfamida, metotrexato, doxorrubicina liposomal, doxorrubicina liposomal pegilada, capecitabina, gemcitabina, inhibidor de COX-2 (por ejemplo, celecoxib) o un inhibidor de proteosoma (por ejemplo, PS342).
Cuando se administra una antraciclina (por ejemplo, doxorubicina o epirubicina) al sujeto, preferentemente esta se administra antes y/o despues de la administracion del antagonista espedfico del VEGF, por ejemplo, bevacizumab. Sin embargo, una antraciclina modificada, tal como doxorrubicina liposomal (TLC D-99 (MYOCET®), doxorubicina liposomal pegilada (CAELYX®) o epirrubicina, con toxicidad cardiaca reducida, se puede combinar con el antagonista espedfico del VEGF, por ejemplo, bevacizumab.
En una realizacion de un programa de administracion, la terapia neoadyuvante comprende una primera etapa en la que un antagonista espedfico del VEGF, por ejemplo, bevacizumab, y uno o mas agentes quimioterapeuticos se administran a los pacientes en una pluralidad de ciclos neoadyuvantes, seguida de una cirugia para extirpar definitivamente el tumor. Cada ciclo neoadyuvante consiste en una a tres semanas, dependiendo del plan de tratamiento en particular. Por ejemplo, un ciclo del tratamiento puede ser de tres semanas, lo que significa que los
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pacientes reciben una dosis de quimioterapia y una dosis de bevacizumab cada tres semanas. Un ciclo de tratamiento tambien puede ser de dos semanas, lo que significa que los pacientes reciben una dosis de quimioterapia y una dosis de bevacizumab cada dos semanas. Toda la primera fase del tratamiento neoadyuvante puede durar aproximadamente 4-8 ciclos. En ciertas realizaciones, la terapia neoadyuvante dura menos de un ano, en una realization, menos de seis meses antes de la cirugia. Dependiendo del tipo y de la gravedad de la enfermedad, las dosis preferidas para el antagonista especifico del VEGF, por ejemplo, bevacizumab, estan en el intervalo de aproximadamente 1 jg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, lo mas preferentemente de aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 15 mg/kg, incluyendo, pero sin limitation, 7,5 mg/kg o 10 mg/kg. En algunos aspectos, el regimen quimioterapeutico consiste en la administration intermitente tradicional de dosis altas. En algunos otros aspectos, los agentes quimioterapeuticos se administran usando dosis mas pequenas y mas frecuentes, y sin pausas programadas ("quimioterapia metronomica"). El progreso de la terapia de la invention se monitoriza facilmente mediante tecnicas y ensayos convencionales.
Aparte del anticuerpo VEGF y del agente quimioterapeutico, se pueden combinar otros regimenes terapeuticos con los mismos. Por ejemplo, se puede administrar un segundo (tercer, cuarto, etc.) agente quimioterapeutico, en el que el segundo agente quimioterapeutico es bien otro agente quimioterapeutico taxoide diferente o un agente quimioterapeutico que no es un taxoide. Por ejemplo, el segundo agente quimioterapeutico puede ser un taxoide (tal como paclitaxel o docetaxel), una vinca (tal como vinorelbina), un compuesto de platino (por ejemplo, cisplatino o carboplatino), un agente antihormonal (tal como un inhibidor de la aromatasa o antiestrogeno), gemcitabina, capecitabina, etc. Los ejemplos de combinaciones incluyen taxoide/compuesto de platino, gemcitabina/taxoide, gemcitabina/vinorelbina, vinorelbina/taxoide, capecitabina/taxoide, etc. Se pueden administrar "cocteles" de diferentes agentes quimioterapeuticos.
Otros agentes terapeuticos que pueden combinarse con el anticuerpo VEGF incluyen uno cualquiera o mas de: otro antagonista de VEGF o un antagonista del receptor de VEGF, tal como un segundo anticuerpo anti-VEGF, variantes de VEGF, fragmentos de receptor de VEGF solubles, aptameros capaces de bloquear el VEGF o VEGFR, anticuerpos anti-VEGFR neutralizantes, inhibidores de tirosina quinasas de VEGFR y cualquier combination de los mismos. Otros agentes terapeuticos utiles para la terapia tumoral de combinacion con el anticuerpo incluyen antagonistas de otros factores que participan en el crecimiento del tumor, tales como EGFR, ErbB2 (tambien conocido como Her2), ErbB3, ErbB4 o TNF. En una realizacion ilustrativa, la composition para el antagonista especifico del VEGF no incluye un anticuerpo anti-ErbB2, o fragmento o derivado del mismo (por ejemplo, el anticuerpo Herceptin®). En ciertas realizaciones de la invencion, el anticuerpo anti-VEGF se puede usar en combinacion con inhibidores de tirosina quinasas receptoras (RTKI) de bajo peso molecular que se dirigen a una o mas tirosina quinasas receptoras tales como los receptores de VEGF, receptores de FGF, receptores de EGF y receptores de PDGF. En la tecnica, se conocen muchos RTKI de bajo peso molecular terapeuticos, incluyendo, pero sin limitacion, vatalanib (PTK787), erlotinib (TARCEVA®), OSI-7904, ZD6474 (ZACTIMA®), ZD6126 (ANG453), ZD1839, sunitinib (SUTENT®), semaxanib (SU5416), AMG706, AGO13736, Imatinib (GLEEVEC®), MLN-518, CEP- 701, PKC-412, lapatinib (GSK572016), VELCADE®, AZD2171, sorafenib (NEXAVAR®), XL880 y CHIR-265.
Las dosis adecuadas para cualquiera de los agentes coadministrados anteriores son las que se usan actualmente, y pueden disminuirse debido a la action combinada (sinergia) del agente y del anticuerpo VEGF.
Ademas de los regimenes terapeuticos anteriores, el paciente se puede someter a radioterapia.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo VEGF administrado es un anticuerpo intacto, desnudo. Sin embargo, el anticuerpo VEGF puede estar conjugado con un agente citotoxico. En ciertas realizaciones, el anticuerpo conjugado y/o el antigeno al que esta unido es/son interiorizado/s por la celula, generando una mayor eficacia terapeutica del conjugado en la destruction de la celula cancerosa a la que se une. En una realizacion, el agente citotoxico se dirige o interfiere con el acido nucleico en la celula cancerosa. Los ejemplos de dichos agentes citotoxicos incluyen maitansinoides, calicheamicinas, ribonucleasas y endonucleasas de ADN.
VII. Terapia adyuvante
La divulgation proporciona un metodo de terapia adyuvante que comprende la administracion de un antagonista especifico del VEGF, por ejemplo, un anticuerpo VEGF, a un sujeto con cancer no metastasico, despues de la cirugia definitiva.
Por ejemplo, un metodo puede incluir las siguientes etapas: a) una primera fase que comprende una pluralidad de ciclos de tratamiento, en la que cada ciclo comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un antagonista especifico del VEGF, por ejemplo, bevacizumab y, opcionalmente, al menos un agente quimioterapeutico a un intervalo predeterminado; y b) una segunda fase que comprende una pluralidad de ciclos de mantenimiento, en la que cada ciclo comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un antagonista especifico del VEGF, por ejemplo, bevacizumab, sin ningun tipo de agente quimioterapeutico a un intervalo predeterminado; en el que la primera y segunda fase combinadas duran al menos un ano despues del tratamiento postoperatorio inicial. En una realizacion, la primera fase comprende una primera pluralidad de ciclos de tratamiento, en la que se administran un antagonista especifico del VEGF, por ejemplo, bevacizumab, y un primer regimen quimioterapeutico, seguidos de
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una segunda pluralidad de ciclos de tratamiento, en la que se administran un antagonista espedfico del VEGF, por ejemplo, bevacizumab, y un segundo regimen quimioterapeutico.
Para la terapia adyuvante, el antagonista espedfico del VEGF se puede administrar en una cantidad o durante un tiempo (por ejemplo, para un determinado regimen terapeutico a lo largo del tiempo) para reducir (por ejemplo, un 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 % , 70 %, 80 %, 90 %, 100 % o mas) el numero de celulas cancerosas del tumor; para reducir el tamano del tumor; para reducir la carga tumoral; para inhibir (es decir, para disminuir en cierta medida y/o detener) la infiltracion de celulas cancerosas en organos perifericos; para reducir la densidad de los vasos del tumor; para inhibir la metastasis tumoral; para reducir o inhibir el crecimiento tumoral o la proliferacion de celulas tumorales; para reducir o prevenir el crecimiento de un tumor latente; para reducir o prevenir el crecimiento o la proliferacion de una micrometastasis; para reducir o prevenir el rebrote de un tumor tras el tratamiento o la extirpacion; y/o para aliviar en cierta medida uno o mas de los sintomas asociados con el cancer. En algunas realizaciones adicionales, el antagonista espedfico del VEGF se puede usar para prevenir la aparicion o reaparicion de cancer en el sujeto. En un ejemplo, la prevencion de la reaparicion del cancer se evalua en una poblacion de sujetos despues de aproximadamente cuatro anos para confirmar que no se ha producido la reaparicion de la enfermedad en al menos aproximadamente el 80 % de la poblacion. En otro ejemplo, la prevencion de la reaparicion de la enfermedad se evalua en aproximadamente 3 anos, en la que la reaparicion de la enfermedad se reduce en al menos aproximadamente el 50 % en comparacion con los sujetos tratados solo con quimioterapia.
El antagonista espedfico del VEGF se administra, en general, despues de un periodo de tiempo en el que el sujeto se ha recuperado de la cirugia. Este periodo de tiempo puede incluir el tiempo necesario para la cicatrizacion de la herida o la cicatrizacion de la incision quirurgica, el periodo de tiempo necesario para reducir el riesgo de dehiscencia de la herida o el periodo de tiempo que el sujeto necesita para volver a un nivel de salud esencialmente similar a o mejor que el nivel de salud previo a la cirugia. El periodo comprendido entre la finalizacion de la cirugia definitiva y la primera administracion del antagonista espedfico del VEGF tambien puede incluir el tiempo necesario para un descanso de los farmacos, en el que el sujeto requiere o solicita un periodo de tiempo entre los regimenes terapeuticos. En general, el periodo de tiempo entre la finalizacion de la cirugia definitiva y el inicio de la terapia con antagonista espedfico del VEGF puede incluir menos de una semana, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas (28 dias), 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 1 ano, 2 anos, 3 anos o mas. En una realizacion, el periodo de tiempo entre la cirugia definitiva y la administracion del antagonista espedfico del VEGF es superior a 2 semanas e inferior a 1 ano.
En un ejemplo, el antagonista espedfico del VEGF, por ejemplo, el anticuerpo VEGF, se administra en una cantidad eficaz para prolongar la supervivencia libre de enfermedad (SLE) o la supervivencia global (SG), en la que la SLE o la SG se evaluan aproximadamente de 2 a 5 anos despues de una administracion inicial del anticuerpo. En ciertas realizaciones, la SLE o la SG del sujeto se evaluan aproximadamente de 3 a 5 anos, aproximadamente de 4 a 5 anos o al menos aproximadamente 4, o al menos aproximadamente 5 anos despues de iniciarse el tratamiento o despues del diagnostico inicial.
El antagonista espedfico del VEGF, por ejemplo, un anticuerpo VEGF, se administra a un sujeto, por ejemplo, un paciente humano, de acuerdo con procedimientos conocidos tales como la administracion intravenosa, por ejemplo, como un bolo o por infusion continua durante un periodo de tiempo, por via intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutanea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, topica o por inhalacion. Se prefiere la administracion intravenosa del anticuerpo.
El antagonista espedfico del VEGF se puede administrar como un solo agente. En otras realizaciones, el paciente se trata con una combinacion de antagonista espedfico del VEGF, y uno o mas agentes quimioterapeuticos. En algunas realizaciones, al menos uno de los agentes quimioterapeuticos es un taxoide. La administracion combinada incluye la coadministracion o la administracion simultanea, usando formulaciones separadas o una sola formulacion farmaceutica, y la administracion consecutiva en cualquier orden, en la que, opcionalmente, hay un periodo de tiempo en el que ambos (o todos) los agentes activos ejercen al mismo tiempo sus actividades biologicas. Por lo tanto, el agente quimioterapeutico puede administrarse antes o despues de la administracion del antagonista espedfico del VEGF, por ejemplo, de un anticuerpo VEGF. En esta realizacion, el tiempo entre al menos una administracion del agente quimioterapeutico y al menos una administracion del antagonista espedfico del VEGF, por ejemplo, un anticuerpo VEGF, es preferentemente de aproximadamente 1 mes o menos, y lo mas preferentemente, de aproximadamente 2 semanas o menos. Como alternativa, el agente quimioterapeutico y el anticuerpo VEGF se administran simultaneamente al paciente, en una sola formulacion o en formulaciones separadas. El tratamiento con la combinacion del agente quimioterapeutico (por ejemplo, taxoide) y el anticuerpo VEGF (por ejemplo, bevacizumab) puede dar lugar a un beneficio terapeutico sinergico o mas que aditivo al paciente.
El agente quimioterapeutico, si se administra, normalmente se administra a dosis conocidas para el mismo, u opcionalmente reducidas debido a la accion combinada de los farmacos o a los efectos secundarios negativos atribuibles a la administracion del agente quimioterapeutico antimetabolito. Se pueden usar los programas de preparacion y dosificacion para dichos agentes quimioterapeuticos de acuerdo con las instrucciones del fabricante o de acuerdo con lo determinado empiricamente por el medico experto. Cuando el agente quimioterapeutico es
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paclitaxel, preferentemente, se administra cada semana (por ejemplo, a 80 mg/m2) o cada 3 semanas (por ejemplo, a 175 mg/m2 o 135 mg/m2). Las dosis de docetaxel adecuadas incluyen 60 mg/m2, 70 mg/m2, 75 mg/m2, 100 mg/m2 (cada 3 semanas); o 35 mg/m2 o 40 mg/m2 (cada semana).
Se han desvelado anteriormente varios agentes quimioterapeuticos que se pueden combinar. Los ejemplos de agentes quimioterapeuticos que se combinaran con el anticuerpo VEGF incluyen, pero sin limitacion, por ejemplo, un taxoide (incluyendo docetaxel y paclitaxel), vinca (por ejemplo, vinorelbina o vinblastina), compuesto de platino (tal como carboplatino o cisplatino), inhibidor de la aromatasa (por ejemplo, letrozol, anastrozol o exemestano), antiestrogenos (por ejemplo, fulvestrant o tamoxifeno), etoposido, tiotepa, ciclofosfamida, metotrexato, doxorrubicina liposomal, doxorrubicina liposomal pegilada, capecitabina, gemcitabina, inhibidor de COX-2 (por ejemplo, celecoxib) o un inhibidor de proteosoma (por ejemplo, PS342).
Cuando se administra una antraciclina (por ejemplo, doxorubicina o epirubicina) al sujeto, preferentemente esta se administra antes y/o despues de la administracion del anticuerpo VEGF, tal como en los protocolos desvelados en el ejemplo de abajo, en el que se administra una combination de antraciclina/ciclofosfamida al sujeto despues de la cirugia, pero antes de la administracion del anticuerpo VEGF y el taxoide. Sin embargo, una antraciclina modificada, tal como doxorrubicina liposomal (TLC D-99 (MYOCET®), doxorubicina liposomal pegilada (CAELYX®) o epirrubicina, con toxicidad cardiaca reducida, se puede combinar con el anticuerpo VEGF.
En un programa de administracion, la terapia adyuvante comprende una primera fase en la que un antagonista especifico del VEGF, por ejemplo, un anticuerpo VEGF, y uno o mas agentes quimioterapeuticos se administran a los pacientes en una pluralidad de ciclos de tratamiento; y una segunda fase, en la que se usa un antagonista especifico del VEGF, por ejemplo, un anticuerpo VEGF, como agente unico en una pluralidad de ciclos de mantenimiento. Cada ciclo de tratamiento consiste en de una a tres semanas, dependiendo del plan de tratamiento en particular. Por ejemplo, un ciclo de tratamiento puede incluir bevacizumab como el antagonista especifico del VEGF y puede ser de tres semanas, lo que significa que los pacientes reciben una dosis de quimioterapia y una dosis de bevacizumab cada tres semanas. Un ciclo de tratamiento tambien puede ser de dos semanas, lo que significa que los pacientes reciben una dosis de quimioterapia y una dosis de bevacizumab cada dos semanas. Toda la primera fase del tratamiento puede durar aproximadamente 4-8 ciclos. Durante la segunda fase de mantenimiento, el bevacizumab se administra bisemanal o trisemanalmente, dependiendo de la duration del ciclo en particular, y durante un total de aproximadamente 30-50 ciclos. En ciertas realizaciones, la terapia adyuvante dura al menos de un ano desde el inicio del tratamiento, y se hara un seguimiento del progreso del sujeto tras ese tiempo. Dependiendo del tipo y de la gravedad de la enfermedad, las dosis preferidas para el anticuerpo VEGF estan en el intervalo de aproximadamente 1 |jg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, lo mas preferentemente de aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 15 mg/kg, incluyendo, pero sin limitacion, 7,5 mg/kg o 10 mg/kg. En algunos aspectos, el regimen quimioterapeutico consiste en la administracion intermitente tradicional de dosis altas. En algunos otros aspectos, los agentes quimioterapeuticos se administran usando dosis mas pequenas y mas frecuentes, y sin pausas programadas ("quimioterapia metronomica"). El progreso de la terapia se monitoriza facilmente mediante tecnicas y ensayos convencionales.
La administracion del anticuerpo y la quimioterapia pueden disminuir la probabilidad de reaparicion de la enfermedad (reaparicion del cancer en el organo primario y/o reaparicion distante), en una poblacion de sujetos en aproximadamente un 50 % a los 3 anos (donde "aproximadamente el 50 %" en el presente documento, incluye un intervalo del aproximadamente 45 % al aproximadamente 70 %), por ejemplo, disminuye la reaparicion en el organo primario en aproximadamente un 52 % a los 3 anos y/o disminuye la reaparicion distante en aproximadamente un 53 % a los 3 anos, en comparacion con sujetos tratados con quimioterapia (por ejemplo, taxoide, tal como paclitaxel) solo.
La divulgation del presente documento proporciona un metodo para curar el cancer no metastasico en una poblacion de sujetos humanos con cancer no metastasico, que comprende administrar una cantidad eficaz de un antagonista especifico del VEGF, por ejemplo, de un anticuerpo VEGf, y al menos un agente quimioterapeutico a los sujetos despues de la cirugia definitiva, y la evaluation de los sujetos despues de cuatro o mas anos para confirmar no se ha producido la reaparicion de la enfermedad despues de aproximadamente 4 anos en al menos aproximadamente el 80 % (preferentemente, al menos aproximadamente el 85 %) de los sujetos. La poblacion puede comprender 3.000 o mas sujetos humanos.
La divulgacion se refiere ademas a un metodo para disminuir la probabilidad de reaparicion de la enfermedad en una poblacion de sujetos humanos con cancer no metastasico, que comprende administrar una cantidad eficaz de bevacizumab y al menos un agente quimioterapeutico a los sujetos despues de la cirugia definitiva, en el que la probabilidad de reaparicion de la enfermedad disminuye en al menos aproximadamente el 50 % a los 3 anos en comparacion con los sujetos tratados solo con taxoide.
Aparte del anticuerpo VEGF y del agente quimioterapeutico, se pueden combinar otros regimenes terapeuticos con los mismos. Por ejemplo, se puede administrar un segundo (tercer, cuarto, etc.) agente quimioterapeutico, en el que el segundo agente quimioterapeutico es bien otro agente quimioterapeutico taxoide diferente o un agente quimioterapeutico que no es un taxoide. Por ejemplo, el segundo agente quimioterapeutico puede ser un taxoide (tal
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como paclitaxel o docetaxel), una vinca (tal como vinorelbina), un compuesto de platino (por ejemplo, cisplatino o carboplatino), un agente antihormonal (tal como un inhibidor de la aromatasa o antiestrogeno), gemcitabina, capecitabina, etc. Los ejemplos de combinaciones incluyen taxoide/compuesto de platino, gemcitabina/taxoide, gemcitabina/vinorelbina, vinorelbina/taxoide, capecitabina/taxoide, etc. Se pueden administrar "cocteles" de diferentes agentes quimioterapeuticos.
Otros agentes terapeuticos que pueden combinarse con el anticuerpo VEGF incluyen uno cualquiera o mas de: otro antagonista de VEGF o un antagonista del receptor de VEGF, tal como un segundo anticuerpo anti-VEGF, variantes de VEGF, fragmentos de receptor de VEGF solubles, aptameros capaces de bloquear el VEGF o VEGFR, anticuerpos anti-VEGFR neutralizantes, inhibidores de tirosina quinasas de VEGFR y cualquier combinacion de los mismos. Otros agentes terapeuticos utiles para la terapia tumoral de combinacion con el anticuerpo incluyen antagonistas de otros factores que participan en el crecimiento del tumor, tales como EGFR, ErbB2 (tambien conocido como Her2), ErbB3, ErbB4 o TNF. En una realizacion ilustrativa, la composicion para el antagonista especifico del VEGF no incluye un anticuerpo anti-ErbB2, o fragmento o derivado del mismo (por ejemplo, el anticuerpo Herceptin®). En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-VEGF se puede usar en combinacion con inhibidores de tirosina quinasas receptoras (RTKI) de bajo peso molecular que se dirigen a una o mas tirosina quinasas receptoras tales como los receptores de VEGF, receptores de FGF, receptores de EGF y receptores de PDGF. En la tecnica, se conocen muchos RTKI de bajo peso molecular terapeuticos, incluyendo, pero sin limitacion, vatalanib (PTK787), erlotinib (TARCEVA®), OSI-7904, ZD6474 (ZACTIMA®), ZD6126 (ANG453), ZD1839, sunitinib (SUTENT®), semaxanib (SU5416), AMG706, AG013736, Imatinib (GLEEVEC®), MLN-518, CEP-701, PKC-412, Lapatinib (GSK572016), VELCADE®, AZD2171, sorafenib (NEXAVAR®), XL880 y CHIR-265.
Las dosis adecuadas para cualquiera de los agentes coadministrados anteriores son las que se usan actualmente, y pueden disminuirse debido a la accion combinada (sinergia) del agente y del anticuerpo VEGF.
Ademas de los regimenes terapeuticos anteriores, el paciente se puede someter a radioterapia.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo VEGF administrado es un anticuerpo intacto, desnudo. Sin embargo, el anticuerpo VEGF puede estar conjugado con un agente citotoxico. En ciertas realizaciones, el anticuerpo conjugado y/o el antigeno al que esta unido es/son interiorizado/s por la celula, generando una mayor eficacia terapeutica del conjugado en la destruccion de la celula cancerosa a la que se une. En una realizacion, el agente citotoxico se dirige o interfiere con el acido nucleico en la celula cancerosa. Los ejemplos de dichos agentes citotoxicos incluyen maitansinoides, calicheamicinas, ribonucleasas y endonucleasas de ADN.
VIII. Dosis, formulaciones y duracion
La composicion de antagonista especifico del VEGF se formulara, dosificara y administrara de una manera acorde a la buena practica medica. Los factores que se han de considerar en este contexto incluyen el trastorno que se este tratando en particular, el sujeto que se este tratando en particular, el estado clinico de cada paciente, la causa del trastorno, el sitio de administracion del agente, el metodo de administracion, la programacion de la administracion y otros factores conocidos por los medicos. La "cantidad terapeuticamente eficaz" del antagonista especifico del VEGF que se va a administrar se regira por dichas consideraciones, y es la cantidad minima necesaria para prevenir, mejorar o tratar, o estabilizar, un tumor benigno, precanceroso o en fase temprana; o para tratar o prevenir la aparicion o reaparicion de un tumor, un tumor latente o una micrometastasis, por ejemplo, en el entorno neoadyuvante o adyuvante. No es necesario, sino opcional, formular el antagonista especifico del VEGF con uno o mas agentes usados actualmente para prevenir o tratar el cancer o un riesgo de desarrollar un cancer. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de antagonista especifico del VEGF presente en la formulacion, del tipo de trastorno o tratamiento, y de otros factores descritos anteriormente. Estos se usan, en general, a las mismas dosis y con vias de administracion usadas anteriormente en el presente documento o aproximadamente con del 1 al 99 % de las dosis empleadas hasta ahora.
Dependiendo del tipo y de la gravedad de la enfermedad, de aproximadamente 1 jg/kg a 100 mg/kg (por ejemplo, 0,1 a 20 mg/kg) de antagonista especifico del VEGF es una dosis candidata inicial para la administracion al paciente, ya sea, por ejemplo, mediante una o mas administraciones separadas, o mediante infusion continua. Una dosis diaria tipica puede variar de aproximadamente 1 jg/kg a aproximadamente 100 mg/kg o mas, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Las dosis particularmente deseables incluyen, por ejemplo, 7,5 mg/kg, 10 mg/kg y 15 mg/kg. Para las administraciones repetidas durante varios dias o mas, dependiendo de la afeccion, el tratamiento se mantiene hasta que el cancer se trata, medido mediante los metodos descritos anteriormente o conocidos en la tecnica. Sin embargo, pueden ser utiles otras pautas posologicas. En un ejemplo, el anticuerpo de la invention se administra una vez cada semana, cada dos semanas o cada tres semanas, en un intervalo de dosis de aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 15 mg/kg, incluyendo, pero sin limitacion, 7,5 mg/kg o 10 mg/kg. El progreso de la terapia de la invencion se monitoriza facilmente mediante tecnicas y ensayos convencionales.
En un ejemplo, bevacizumab es el antagonista especifico del VEGF. Bevacizumab se suministra para usos terapeuticos en viales de un solo uso, sin conservantes, de 100 mg y 400 mg, para administrar 4 ml o 16 ml de bevacizumab (25 mg/ml). El producto de 100 mg se formula en 240 mg de a,a-trehalosa deshidratada, 23,2 mg de
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fosfato de sodio (monobasico, monohidrato), 4,8 mg de fosfato de sodio (dibasico, anhidro), 1,6 mg de polisorbato 20 y agua para inyeccion, USP. El producto de 400 mg se formula en 960 mg de a,a-trehalosa deshidratada, 92,8 mg de fosfato de sodio (monobasico, monohidrato), 19,2 mg de fosfato de sodio (dibasico, anhidro), 6,4 mg de polisorbato 20 y agua para inyeccion, USP.
La duracion del tratamiento continuara durante tanto tiempo como este medicamente indicado o hasta que se obtenga un efecto terapeutico deseado (por ejemplo, los descritos en el presente documento). En ciertas realizaciones, el tratamiento con antagonistas especificos del VEGF se continua durante 2 meses, 4 meses, 6 meses, 8 meses, 10 meses, 1 ano, 2 anos, 3 anos, 4 anos, 5 anos, o durante un periodo de anos hasta todo el tiempo de vida del sujeto.
En general, el alivio o el tratamiento de un tumor benigno, precanceroso o en fase temprana, o la terapia adyuvante o neoadyuvante de un cancer (benigno o maligno) implican la disminucion de uno o mas sintomas o problemas medicos asociados con el cancer. La cantidad terapeuticamente eficaz del farmaco puede lograr uno o una combinacion de los siguientes para reducir (por ejemplo, un 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % o mas) el numero de celulas cancerosas del tumor; para reducir el tamano del tumor; para reducir la carga tumoral; para inhibir (es decir, para disminuir en cierta medida y/o detener) la infiltracion de celulas cancerosas en los organos perifericos; para reducir la densidad de los vasos del tumor; para inhibir la metastasis tumoral; para reducir o inhibir el crecimiento tumoral o la proliferacion de celulas tumorales; para reducir o prevenir el crecimiento de un tumor latente; para reducir o prevenir el crecimiento o la proliferacion de una micrometastasis; para reducir o prevenir el rebrote de un tumor despues del tratamiento o de la eliminacion (por ejemplo, en la terapia adyuvante); para aumentar o prolongar la SLE o la SG de un sujeto susceptible de padecer o diagnosticado con un tumor benigno, precanceroso o no metastasico o un tumor maligno; para reducir el tamano de un tumor para permitir la cirugia (por ejemplo, en la terapia neoadyuvante); y/o para aliviar en cierta medida uno o mas de los sintomas asociados con el cancer. En algunas realizaciones adicionales, el antagonista especifico del VEGF se puede usar para prevenir la aparicion o reaparicion de cancer en el sujeto. En un ejemplo, la prevencion de la reaparicion del cancer se evalua en una poblacion de sujetos despues de aproximadamente cuatro anos para confirmar que no se ha producido la reaparicion de la enfermedad en al menos aproximadamente el 80 % de la poblacion. En otro ejemplo, la prevencion de la reaparicion de la enfermedad se evalua en aproximadamente 3 anos, reduciendose la reaparicion de la enfermedad en al menos aproximadamente un 50 % en comparacion con los sujetos tratados solo con quimioterapia.
En un ejemplo, el antagonista especifico del VEGF, por ejemplo, un anticuerpo VEGF, se administra en una cantidad eficaz para prolongar la SLE o la SG, evaluandose la SLE o la SG aproximadamente de 2 a 5 anos despues de una administracion inicial del anticuerpo. En ciertas realizaciones, la SLE o la SG del sujeto se evalua aproximadamente de 3 a 5 anos, aproximadamente 4 anos o al menos aproximadamente 4 o al menos aproximadamente 5 anos despues del inicio del tratamiento o despues del diagnostico inicial.
En una realizacion, la invencion se puede usar para aumentar la duracion de la supervivencia de un sujeto susceptible de padecer un tumor benigno, precanceroso o no metastasico. La duracion de la supervivencia se define como el tiempo desde la primera administracion del farmaco hasta la muerte. La duracion de la supervivencia tambien se puede medir mediante la relacion de riesgo estratificada (HR) del grupo de tratamiento frente al grupo de control, que representa el riesgo de muerte de un paciente durante el tratamiento.
En otra realizacion mas, el tratamiento de la invencion aumenta significativamente la tasa de respuesta en un grupo de sujetos, por ejemplo, de pacientes humanos, susceptibles de padecer un cancer que se tratan con diversas terapias contra el cancer. La tasa de respuesta se define como el porcentaje de pacientes tratados que respondieron al tratamiento. En un aspecto, el tratamiento de combinacion de la invencion usando un antagonista especifico del VEGF y cirugia, radioterapia, o uno o mas agentes quimioterapeuticos aumenta significativamente la tasa de respuesta en el grupo de pacientes tratados en comparacion con el grupo tratado con cirugia, radioterapia o quimioterapia solo, teniendo el aumento un valor de p de Chi cuadrado inferior a 0,005.
El tratamiento o la prevencion de la aparicion o de la reaparicion de un tumor, un tumor latente o una micrometastasis implican la prevencion de la formacion del tumor o de la metastasis, por lo general, despues del tratamiento inicial o de la eliminacion de un tumor (por ejemplo, usando una terapia contra el cancer tal como cirugia, quimioterapia o radioterapia). La cirugia puede dejar atras celulas tumorales residuales o nodulos micrometastasicos latentes, que tengan el potencial de reactivar el "programa angiogenico" y de facilitar el crecimiento mas exponencial del tumor. Aunque la presencia de un tumor latente o micrometastasis no es necesariamente detectable usando mediciones clinicas o exploraciones, una cantidad terapeuticamente eficaz es aquella que es suficiente para prevenir o reducir la deteccion de la reaparicion del tumor latente, de la micrometastasis, de la metastasis o del tumor usando tecnicas conocidas para el experto. En un ejemplo, un sujeto que se trata de un tumor mediante la extirpacion quirurgica del tumor, se trata luego con un antagonista especifico del VEGF y se monitoriza a lo largo del tiempo para detectar la reaparicion de un tumor latente, de micrometastasis o del tumor. El antagonista especifico del VEGF se puede administrar en combinacion con otro tratamiento contra el cancer (por ejemplo, antes de, con o despues del antagonista especifico del VEGF), pudiendose continuar con una o ambas terapias como tratamiento de mantenimiento.
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En la publicacion de solicitud de patente de EE.UU. n.° 20050186208, se describen mediciones adicionales de la eficacia terapeutica en el tratamiento del cancer.
Las formulaciones terapeuticas se preparan usando metodos convencionales conocidos en la tecnica mezclando el principio activo que tiene el grado deseado de pureza con vehiculos, excipientes o estabilizantes fisiologicamente aceptables (“Remington's Pharmaceutical Sciences" (20a edicion), ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Filadelfia, PA). Los vehiculos aceptables incluyen solucion salina o tampones tales como fosfato, citrato y otros acidos organicos; antioxidantes incluyendo el acido ascorbico; polipeptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 restos); proteinas tales como albumina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polimeros hidrofilos tales como polivinilpirrolidona, aminoacidos tales como glicina, glutamina, asparaginas, arginina o lisina; monosacaridos, disacaridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azucar tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; y/o tensioactivos no ionicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o PEG.
Opcionalmente, pero preferentemente, la formulacion contiene una sal farmaceuticamente aceptable, normalmente, por ejemplo, cloruro de sodio, y preferentemente a concentraciones aproximadamente fisiologicas. Opcionalmente, las formulaciones pueden contener un conservante farmaceuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la concentracion de conservante varia del 0,1 a 2,0 %, normalmente en v/v. Los conservantes adecuados incluyen los conocidos en las tecnicas farmaceuticas. El alcohol bencilico, fenol, m-cresol, metilparabeno y propilparabeno son ejemplos de conservantes. Opcionalmente, las formulaciones pueden incluir un tensioactivo farmaceuticamente aceptable a una concentracion del 0,005 al 0,02 %.
La formulacion del presente documento tambien puede contener mas de un compuesto activo segun sea necesario para la indicacion que se este tratando en concreto, preferentemente aquellas con actividades complementarias que no se afectan de manera adversa entre si. Lo adecuado es que dichas moleculas esten presentes en combinacion en cantidades que sean eficaces para el fin pretendido.
Los principios activos tambien pueden atraparse en microcapsulas preparadas, por ejemplo, mediante tecnicas de coacervacion o mediante polimerizacion interfacial, por ejemplo, microcapsulas de hidroximetilcelulosa o de gelatina y microcapsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de liberacion de farmacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albumina, microemulsiones, nanoparticulas y nanocapsulas o en macroemulsiones. Dichas tecnicas se desvelan en “Remington's Pharmaceutical Sciences", supra.
Se pueden preparar preparados de liberacion sostenida. Los ejemplos adecuados de preparados de liberacion sostenida incluyen matrices semipermeables de polimeros hidrofobos solidos que contienen el anticuerpo, matrices que estan en forma de articulos conformados, por ejemplo, peliculas o microcapsulas. Los ejemplos de matrices de liberacion sostenida incluyen poliesteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) o poli(alcohol vimlico)), polilactidas (patente de EE.UU. n.° 3.773.919), copolimeros de acido L-glutamico y Y-etil-L-glutamato, acetato de etilenvinilo no degradable, copolimeros degradables de acido lactico-acido glicolico tales como el LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolimero de acido lactico-acido glicolico y acetato de leuprolide) y acido poli-D-(-)-3-hidroxibutmco. Mientras que los polimeros tales como el acetato de etilen-vinilo y el acido lactico-acido glicolico permiten la liberacion de moleculas durante mas de 100 dias, ciertos hidrogeles liberan proteinas durante periodos de tiempo mas cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el organismo durante un largo periodo de tiempo, se pueden desnaturalizar o agregar como resultado de la exposicion a la humedad a 37 °C, generando una perdida de actividad biologica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se pueden crear estrategias racionales para la estabilizacion dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregacion es la formacion de enlaces S-S intermoleculares a traves del intercambio tio-disulfuro, la estabilizacion puede conseguirse modificando los restos sulfhidrilo, liofilizando en soluciones acidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos apropiados y desarrollando composiciones de matriz polimerica especificas.
El anticuerpo antagonista especifico del VEGF de la invention se administra mediante cualquier medio adecuado, incluyendo la administration parenteral, subcutanea, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal y, si se desea, para el tratamiento inmunosupresor local, la administracion intralesional. Las infusiones parenterales incluyen la administracion intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutanea. Ademas, el anticuerpo se administra de forma adecuada por infusion de pulsos, particularmente con dosis decrecientes del anticuerpo. Preferentemente, la dosis se administra mediante inyecciones, lo mas preferentemente inyecciones intravenosas o subcutaneas, dependiendo en parte de si la administracion es breve o cronica.
IX. Terapias de combinacion
La invencion tambien presenta el uso de una combinacion de dos o mas anticuerpos antagonistas especificos del VEGF de la invencion o la combinacion de al menos un anticuerpo antagonista especifico del VEGF con una o mas terapias contra el cancer. Los ejemplos de terapias contra el cancer incluyen, sin limitation, cirugia, terapia de radiation (radioterapia), bioterapia, inmunoterapia, quimioterapia o una combinacion de estas terapias. Ademas, se pueden usar agentes citotoxicos, agentes antiangiogenicos y antiproliferativos en combinacion con el antagonista
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espedfico del VEGF.
En un ejemplo, la invention presenta el uso de un anticuerpo antagonista espedfico del VEGF con uno o mas agentes quimioterapeuticos (por ejemplo, un coctel). Los ejemplos no limitantes de agentes quimioterapeuticos incluyen irinotecan, fluorouracilo, leucovorina o cualquier combination de los mismos. La administration combinada incluye la administracion simultanea, usando formulaciones separadas o una sola formulation farmaceutica, y la administracion consecutiva en cualquier orden, en la que preferentemente hay un periodo de tiempo en el que ambos (o todos) los agentes activos ejercen al mismo tiempo sus actividades biologicas. Se pueden usar programas de preparation y de dosificacion para dichos agentes quimioterapeuticos de acuerdo con las instrucciones del fabricante o segun lo determinado empiricamente por el medico experto. Tambien se describen programas de preparacion y de dosificacion para la quimioterapia en Chemotherapy Service Ed., M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md. (1992). El agente quimioterapeutico puede preceder, o seguir a la administracion del antagonista espedfico del VEGF o se puede administrar de forma simultanea con el mismo.
La formulacion del presente documento tambien puede contener mas de un compuesto activo segun sea necesario para la indication que se este tratando en particular, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no afectan de manera adversa entre si. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar ademas anticuerpos que se unen a EGFR, VEGF (por ejemplo, un anticuerpo que se una a un epitopo diferente en VEGF), VEGFR o ErbB2 (por ejemplo, Herceptin®) en la formulacion. En una realization ilustrativa, la composition para el antagonista espedfico del VEGF no incluye un anticuerpo anti-ErbB2, o fragmento o derivado del mismo, (por ejemplo, el anticuerpo Herceptin®). Como alternativa, o ademas, la composicion puede comprender un agente citotoxico, citocina, agente inhibidor del crecimiento y/o un antagonista de VEGFR de bajo peso molecular. Dichas moleculas estan presentes adecuadamente en combinacion en cantidades que son eficaces para el fin previsto.
Para la prevention de la enfermedad, la dosis apropiada de anticuerpo antagonista espedfico del VEGF dependera del tipo de enfermedad que se vaya a tratar, como se ha definido anteriormente, de la gravedad y del curso de la enfermedad, de la terapia previa, del historial clinico del paciente y de la respuesta al antagonista espedfico del VEGF, asi como del criterio del medico tratante. El anticuerpo antagonista espedfico del VEGF se administra convenientemente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. En un regimen de terapia de combinacion, el anticuerpo antagonista espedfico del VEGF y el uno o mas agentes terapeuticos contra el cancer de la invencion se administran en una cantidad terapeuticamente eficaz o sinergica. Como se usa en el presente documento, una cantidad terapeuticamente eficaz es aquella que la administracion conjunta de un anticuerpo antagonista espedfico del VEGF y uno o mas de otros agentes terapeuticos, o la administracion de una composicion de la invencion, produce la reduction o la inhibition del cancer como se ha descrito anteriormente. Una cantidad terapeuticamente sinergica es la cantidad de un anticuerpo antagonista espedfico del VEGF y uno o mas otros agentes terapeuticos necesarios para reducir o eliminar sinergica o significativamente las afecciones o los sintomas asociados con una determinada enfermedad.
El anticuerpo antagonista espedfico del VEGF y el uno o mas de otros agentes terapeuticos se pueden administrar simultanea o secuencialmente en una cantidad y durante un tiempo suficientes para reducir o eliminar la aparicion de un tumor, un tumor latente o una micrometastasis.
Anticuerpo
El antagonista espedfico del VEGF se puede envasar solo o en combinacion con otros compuestos terapeuticos contra el cancer como un kit. El kit puede incluir componentes opcionales que ayuden en la administracion de la dosis unitaria a pacientes, tales como viales para la reconstitution de formas en polvo, jeringas para inyeccion, sistemas de administracion IV a medida, inhaladores, etc. Ademas, el kit de dosis unitaria puede contener instrucciones para la preparacion y la administracion de las composiciones. El kit se puede fabricar como una dosis unitaria de un solo uso para un paciente, multiples usos para un paciente en particular (a una dosis constante o en las que los compuestos individuales pueden variar en potencia a medida que avanza el tratamiento); o el kit puede contener multiples dosis adecuadas para la administracion a multiples pacientes ("envase a granel"). Los componentes del kit pueden estar montados en cajas de carton, envases de ampollas, frascos, tubos y similares.
X. Articulos de fabrication
En otra realizacion de la invencion, se desvela un articulo de fabricacion que contiene materiales utiles para el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente. El articulo de fabricacion comprende un recipiente, una etiqueta y un prospecto. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringas, etc. Los recipientes pueden estar formados de varios materiales tales como vidrio o plastico. El recipiente contiene una composicion que es eficaz para tratar la afeccion y puede tener un puerto de acceso esteril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solution intravenosa o un vial que tiene un tapon perforable por una aguja de inyeccion hipodermica). Al menos un agente activo de la composicion es un anticuerpo anti-VEGF. La etiqueta del, o asociada con, el recipiente indica que la composicion se usa para tratar la afeccion de election. El articulo de fabricacion puede comprender ademas un segundo recipiente que comprende un tampon farmaceuticamente aceptable, tal como solucion salina tamponada con fosfato, solucion de Ringer y solucion de dextrosa. Puede incluir
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ademas otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas. Ademas, el articulo de fabricacion comprende un prospecto con instrucciones de uso, incluyendo, por ejemplo, un aviso de que la composicion no es para su uso en combinacion con otra composition, o instruir al usuario de la composicion sobre la administration de la composicion de anticuerpo anti- VEGF solo o en combinacion con una composicion contra el cancer a un paciente. La expresion "instrucciones de uso" significa proporcionar indicaciones para la terapia aplicable, la medication, el tratamiento, los regimenes de tratamiento y similares, por cualquier medio, por ejemplo, por escrito, tal como en forma de prospectos o cualquier otro material promocional por escrito.
X. Deposito de materiales
La siguiente linea celular de hibridoma se ha depositado en virtud de las disposiciones del Tratado de Budapest con la coleccion americana de cultivos tipo (ATCC), Manassas, VA, EE.UU.
N.° ATCC de designacion del anticuerpo
Fecha del deposito
A4.6.1 ATCC HB-10709, 29 de marzo de 1991.
Ejemplos
Referencia
Ejemplo 1. La inhibicion de VEGF-A produce la detencion del crecimiento de adenomas intestinales y la supervivencia a largo plazo de ratones Apcmin,+
El sindrome de poliposis adenomatosa familiar (PAF) y la mayoria de los canceres colorrectales esporadicos estan causados por mutaciones en el gen APC. Los pacientes con PAF desarrollan de cientos a miles de polipos adenomatosos en el tracto gastrointestinal (GI) inferior, ademas de tumores extracolonicos, que incluyen tumores desmoides y tumores en el tracto gastrointestinal superior. Los ratones Apcmin/+ con un alelo de truncamiento heterocigotico en el codon 850 imitan algunas caracteristicas de la poliposis de los pacientes con PAF con la mutation de la linea germinal APC (Moser et al., Science 247:322-324 (1990), Su et al., Science 256:668-670 (1992)). El inicio de la formation de tumores en los ratones Apcmin/+ se produce en la edad adulta temprana, y los animales normalmente desarrollan de 60 a 150 polipos intestinales en un fondo genetico C57BL/6. El desarrollo de los tumores compromete gravemente la longevidad de los ratones, provocando, en general, la muerte por anemia y/o hipoproteinemia (Moser et al., Science 247:322-324 (1990)) en torno a la edad de cinco meses. Mientras que los seres humanos con PAF suelen desarrollar adenomas de colon, los ratones Apcmin/+, por razones que no se comprenden del todo, desarrollan la gran mayoria de los polipos en el intestino delgado. Estos polipos alcanzan un tamano de 1-2 mm de diametro, mientras que los polipos de mayor tamano (de hasta 4 mm de diametro) se presentan con una frecuencia inferior. Solo se observan ocasionales adenomas de colon, comunmente de 0 a 3 por animal.
Se ha informado que Apc participa en los procesos celulares incluyendo la proliferation, la apoptosis, la migration celular, la adhesion celular, el ensamblaje de los microtubulos, la transduction de senales y la segregation de cromosomas (revisado en Nathke, Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 20:337-366 (2004)). La funcion mejor estudiada de Ape es su papel como regulador de la beta-catenina en la via de serialization de Wnt (revisado en Nathke, Mol. Pathol. 52:169-173 (1999))). En resumen, en ausencia de la senalizacion de Wnt, Apc se une a la axina y a GSK- 3beta quinasa para formar un complejo de destruction para la beta-catenina citoplasmica, lo que impide su translocation nuclear y la posterior activation de la familia de factores de transcription del factor de linfocitos T/factor potenciador linfoide (TCF/LEF). Las dianas transcripcionales de TCF/LEF incluyen moleculas implicadas en las vias celulares mencionadas anteriormente.
La investigation de los mecanismos del crecimiento tumoral en xenoinjertos tiene algunas limitaciones, ya que estos modelos no recapitulan el desarrollo de los tumores en un entorno natural. Para examinar los efectos de la terapia antiangiogenica en un modelo de tumor no maligno de predisposition genetica, de origen natural, se ha estudiado el modelo Apcmin/+ de adenomatosis intestinal. En el siguiente ejemplo, se analizo el fenotipo tumoral de los ratones Apcmin/+ despues del tratamiento a corto y a largo plazo con el antagonista especifico del VEGF a modo de ejemplo, mAb anti-VEGF-A, asi como despues de una deletion genetica de VEGF-A mediante la tecnologia de Cre-LoxP en las celulas epiteliales intestinales.
Para los experimentos descritos a continuation, se obtuvieron ratones Apcmin/+ (numero de reserva 002020, 5) y ratones 12.4KbVilCre (numero de reserva 004586, de aqui en adelante, VillinCre, Madison et al., J. Biol. Chem. 277:33275-33283 (2002)) del laboratorio Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Los ratones VEGFlox/lox (de aqui en adelante, VEGFlox) se han publicado previamente (Gerber et al., “Development" 126:1149-1159 (1999)). Se alojaron los animales en jaulas de microaislamiento en una instalacion de barrera y es alimentaron a voluntad. El
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mantenimiento de los animales y los protocolos experimental se realizaron siguiendo las regulaciones federales y aprobadas por el comite institucional de cuidado y uso de animales.
Expresion de VEGF-A en adenomas intestinales Apcmin/+
Para investigar el patron de expresion de VEGF-A en los tumores intestinales de ratones Apcmin/+, se realizo la hibridacion in situ en adenomas de ratones de 14 semanas. Para estos experimentos, la hibridacion in situ se realizo como se ha descrito previamente (Ferrara et al., Am. J. Pathol. 162:1881-1893 (2003)). En resumen, se desparafinaron cortes de tejido intestinal embebidos en parafina, deshidratados y fijados en formalina tamponada neutra, y se hidrataron antes de la desproteinizacion en 20 |jg/ml de proteinasa K durante 15 minutos a 37 °C. Se hibridaron ribosondas sentido y antisentido marcadas con [33P]UTP a 55 °C durante la noche, seguido de un lavado de alta rigurosidad en 55 °C en 0,1 x citrato en solucion salina convencional durante 2 horas. Se expusieron los portaobjetos de vidrio secos durante 3 dias a temperatura ambiente a una pelicula autorradiografica Kodak BioMax MR (Eastman Kodak Co., Rochester, NY), seguido de la inmersion en emulsion de pista nuclear NTB2 (Eastman Kodak Co.), la exposicion de las cajas de portaobjetos de plastico selladas que contenian desecante durante 28 dias a 4 °C, el revelado y la contratincion con H&E (hematoxilina-eosina). La sonda de VEGF-A se preparo como se ha descrito previamente (Ferrara et al., Am. J. Pathol. 162:1881-1893 (2003)). La longitud de la sonda de VEGF-A era de 349 nucleotidos correspondientes a los nucleotidos 297-645 de NM_031836. La secuencia del cebador superior fue 5'-CAA CGT CAC TAT GCA GAT CAT GCG (SEQ ID NO: 1); y la secuencia del cebador inferior fue 5'-GGT CTA GTT CCC GAA ACC CTG AG (SEQ ID NO: 2).
En estos experimentos de hibridacion in situ, se observo la expresion de VEGF-A en las celulas epiteliales con intensidad variable en comparacion con el epitelio normal de las vellosidades intestinales, mientras que se observo una senal focalmente destacada en las celulas del estroma de los adenomas, asi como en el estroma de la vellosidades normalidad (Fig. 1A-F).
La inhibicion de VEGF-A reduce la carga tumoral de ratones Apcmin/+
Para determinar si la terapia con anti-VEGF-A seria eficaz en la reduccion de la carga tumoral de los tumores intestinales benignos en el raton, se trataron ratones Apcmin/+ con el mAb anti-VEGF-A G6-31 en un formato quimerico de raton-ser humano, para reducir la posibilidad de provocar una respuesta inmune. El mAb anti-VEGF-A G6-31 se obtuvo de bibliotecas de fagos de Fab humanos como se describe (Liang et al., J. Biol. Chem. 281:951961 (2006)). Para generar un anticuerpo adecuado para la administracion a largo plazo en ratones, se injertaron los dominios variables en el dominio constante de IgG2a murina. Se administraron mAb G6-31 (Liang et al., J. Biol. Chem. 281:951-961 (2006)) o IgG2a murina de control del mismo isotipo (anti-GP120), ambos a la dosis de 5 mg/kg, por via intraperitoneal una vez a la semana en un volumen de 90 a 140 jl en PBS. Los tratamientos se continuaron durante 3 semanas, 6 semanas, hasta un ano o hasta que los ratones se encontraron moribundos. El tratamiento de 5 a 14 ratones por cada grupo se inicio a los 91 ± 3 dias de edad.
Se selecciono el mAb G6-31 debido a su capacidad para bloquear de forma potente el VEGF-A tanto de raton como de ser humano (Liang et al., J. Biol. Chem. 281:951-961 (2006)). Esto se diferencia del mAb anti-VEGF bien diferenciado A.4.6.1, que inhibe el VEGF-A humano, pero no de raton (Gerber et al., Cancer Res. 60:6253-6258 (2000), Liang et al., J. Biol. Chem. 281:951-961 (2006)). Para evaluar el efecto a corto plazo del mAb G6-31 en la carga tumoral, se inicio el tratamiento de diez ratones por cohorte a las trece semanas de vida, y se continuo durante 3 o 6 semanas. Para determinar el fenotipo de los tumores a la edad de inicio del tratamiento, se analizo un grupo de control no tratado de doce ratones a las trece semanas de vida (dia 0).
El tratamiento con mAb anti-VEGF-A, ya sea durante 3 o 6 semanas redujo significativamente la carga tumoral global en los ratones Apcmin/+. En el dia 0, la carga tumoral media de los ratones Apcmin/+ era de 39,3 mm3 (variando de 12,3 mm3 a 97,0 mm3) (Fig. 2A). La carga tumoral media de los ratones tratados con IgG de control durante tres semanas era de 96,8 mm3 (47,1-299,9 mm3), mientras que la carga tumoral media de los ratones tratados durante 3 semanas con mAb G6-31 era de 23,5 mm3 (4,5 -58,2 mm3). Esta fue una reduccion estadisticamente significativa del 76 % de, o de 4 veces, de la carga tumoral media tras el tratamiento con el mAb G6-31, con un p < 0,008. Tras seis semanas de la administracion con IgG de control, la carga tumoral alcanzo una media de 198,6 mm3 (40,5-315,7 mm3), mientras que la carga tumoral en los ratones tratados con mAb G6-31 se mantuvo baja, a 28,4 mm3 (3,2-75,9 mm3), presentando una reduccion significativa del 86 %, o de 7 veces, en la carga tumoral media con un valor de p < 5,3 x 10-5 (Fig. 2A).
La notable reduccion de la carga tumoral tras tres y seis semanas de tratamiento con mAb G6-31 se debio a una reduccion del tamano de los adenomas, en oposicion a una disminucion del numero de adenomas. Despues de tres semanas de tratamiento con IgG de control, el numero medio de tumores resulto ser de 116 ± 9 (± ETM), mientras que despues de la administracion del mAb G6-31, el numero medio de tumores resulto ser de 107 ± 11 (p < 0,28). Despues de seis semanas de tratamiento con IgG de control, el numero medio de tumores resulto ser de 120 ± 11, mientras que despues de la administracion del mAb G6-31 resulto ser de 100 ± 10 (p < 0,09). El dia 0, los ratones tenian una media de 100 ± 9 tumores.
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Para el analisis del tamano y del numero de los tumores, se abrio longitudinalmente el tracto intestinal desde el estomago glandular hasta el recto, se lavo y se extendio sobre una superficie de papel de filtro. Despues de la fijacion durante la noche con fijador Notox Histo (Scientific Design Laboratory Inc., Des Plaines, IL) y la tincion con una solucion acuosa de azul de metileno al 0,1 %, una observador individual, cegado al tratamiento, clasifico el numero, la ubicacion y el diametro de cada adenoma intestinal del intestino delgado y grueso en una escala ocular a una ampliacion de 20 aumentos en un microscopio de diseccion Leica. Mediante este metodo, se registraron de forma fiable los polipos con un diametro de 0,3 mm o superior. Los volumenes tumorales se calcularon como hemisferios. La carga tumoral para cada raton se calculo como la suma de sus volumenes tumorales. Los valores de p se han calculado con la prueba t de Student de dos colas. Se analizo un grupo no tratado de ratones (dia 0) a la edad de inicio del tratamiento (13 semanas) como control para los ratones tratados con anticuerpos.
No hubo pruebas de que el crecimiento de los adenomas se escapara del tratamiento con anti-VEGF-A durante 3 o 6 semanas de tratamiento: los tumores de los ratones tratados con mAb G6-31 resultaron tener una distribucion de tamano mas compacta (Fig. 2B, grafica media e inferior) en comparacion con la distribucion de tamanos mas amplia de los tumores de los ratones tratados con IgG de control (Fig. 2B, graficas segunda y cuarta de la parte superior). El diametro medio de los polipos de los ratones que recibieron durante tres semanas IgG de control fue de 1,28 mm, y mAb G6-31, de 0,85 mm (p < 9,2 x 10-117), mientras que el diametro medio de los polipos de los ratones que recibieron durante seis semanas la IgG de control fue de 1,64 mm, y mAb G6-31, de 0,86 mm (p < 2,7 x 10-214). El diametro medio de los tumores el dia 0 fue de 0,97 mm.
Curiosamente, el tratamiento con anti-VEGF-A parecio inhibir el crecimiento de los tumores de todos los tamanos. Despues de un tratamiento de 3 semana con mAb G6-31, la frecuencia de los tumores pequenos, de 0,3 a 1,0 mm de diametro (para el tratamiento de 6 semanas, de 0,3 a 1,2 mm) fue mayor que en el grupo tratado con control, mientras que la frecuencia de los tumores con diametro superior a 1,0 mm (durante 6 semanas > 1,2 mm) se redujo (Fig. 2C, grafica superior y media). Una comparacion de la distribucion de los tamanos tumorales el dia 0 (Fig. 2C, grafica inferior) sugirio que el crecimiento de los adenomas se habia detenido esencialmente tras iniciarse la administracion de mAb G6-31.
Por otra parte, el mAb anti-VEGF-A G6-31 fue eficaz en suprimir el crecimiento de los adenomas en todas las zonas del intestino delgado. Se observo un diametro medio del tumor significativamente inferior despues del tratamiento con mAb G6-31 en comparacion con el tratamiento con IgG de control tras tres y seis semanas de tratamiento (Fig. 2D). Ademas, el diametro medio de los adenomas en el primer cuarto intestinal de los ratones tratados con mAb G6- 31 se redujo significativamente con respecto al observado en los ratones el dia 0 (doble asterisco en la Fig. 2D). La reduccion del diametro medio tumoral de los adenomas de colon no alcanzo significacion estadistica (Fig. 2D). El diametro medio de los polipos del intestino grueso en ratones tratados con mAb G6-31 durante tres semanas fue de 1,3 ± 0,3 mm (± ETM), mientras que el diametro medio en los ratones tratados con IgG de control fue de 2,5 ± 0,4 mm, con un valor de p < 0,064. El diametro medio de los tumores del intestino grueso despues de seis semanas de tratamiento con mAb G6-31 fue de 2,2 ± 0,3 mm y de 2,6 ± 0,3 mm tras la administracion con IgG de control, con un valor de p < 0,37.
La eliminacion de VEGF-A en celulas epiteliales intestinales reduce el diametro medio tumoral
A continuacion, se intento analizar la contribution de VEGF-A de origen epitelial intestinal en el desarrollo de adenomas en el modelo Apcmin/+. Con este fin, se evaluaron el diametro y el numero de los tumores, como se ha descrito anteriormente, en ratones Apcmin/+ de 13 semanas de edad, que se cruzaron con ratones en los que VEGF-A se habia suprimido condicionalmente en las celulas epiteliales intestinales con la tecnologia Cre/loxP (VEGFlox; ratones Villin-Cre). Se analizaron ratones Apcmin/+; Villin-Cre y Apcmin/+; VEGFlox; Villin-Cre a las trece semanas de vida.
La expresion de Villin, una proteina de union a la actina y un componente estructural importante del borde en cepillo de las celulas absorbentes especializadas, comienza durante la embriogenesis en el endodermo del intestino posterior, y mas tarde se extiende a lo largo del endodermo del intestino delgado y grueso (Braunstein et al., Dev. Dyn. 224:90-102 (2002), Ezzell et al., Development 106:407-419 (1989), Maunoury et al., EMBO J. 7:3321-3329 (1988), y Maunoury et al., Development 115:717-728 (1992)). En el adulto, la distribucion de Villin se vuelve difusa con polarization apical moderada en las celulas proliferativas inmaduras de las criptas, y potente polarization en los bordes en cepillo de las celulas completamente diferenciadas que recubren las vellosidades del intestino delgado (Robine et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82:8488-8492 (1985)). La expresion de la recombinasa Cre impulsada por el promotor Viil (Villin-Cre) se ha caracterizado previamente recapitulando el patron expresion del gen Villin en cada celula del epitelio intestinal desde la cripta a la punta de las vellosidades y el duodeno a traves de colon (Madison et al., J. Biol. Chem. 277:33275-33283 (2002)).
El analisis fenotipico revelo que el diametro tumoral medio de ratones Apcmin/+; Villin-Cre de control fue de 1,02 ± 0,3 mm (± ETM), mientras que el diametro tumoral medio de ratones Apcmin/+;VEGFlox;Villin-Cre fue de 0,82 ± 0,3 mm (Fig. 2E), lo que demuestra una reduccion del 19,8 % (p < 7,2 x 10-5). El numero de tumores no fue significativamente diferente entre los dos grupos. Mientras que los ratones Apcmin/+;Villin-Cre tenian 137 ± 11 adenomas intestinales, los ratones Apcmin/+;VEGFlox;Villin-Cre tenian 150 ± 17 adenomas (p < 0,27).
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Estos datos indican que la supresion de VEGF-A de todas las celulas epiteliales intestinales desde el duodeno al colon, y la cripta a la punta de las vellosidades produjo una inhibicion significativa del crecimiento tumoral, aunque de un grado reducido en comparacion con la que resulta de la administracion sistemica de anticuerpo anti-VEGF. Por lo tanto, estos datos sugieren que las fuentes extra-epiteliales de VEGF-A contribuyen al crecimiento de los adenomas intestinales de ratones Apcmin/+.
La inhibicion de VEGF-A prolonga la supervivencia media de los ratones Apcmin/+
Dada la eficacia del tratamiento con anti-VEGF-A en la inhibicion del crecimiento tumoral, los presentes inventores quisieron investigar si el tratamiento con mAb G6-31 podria producir beneficios a largo plazo para los ratones Apcmin/+. Con este fin, se continuo la administracion con mAb G6-31 o IgG de control hasta 52 semanas o hasta que se observo que los ratones estaban moribundos. Curiosamente, el tratamiento con mAb G6-31 aumento la supervivencia media de 24,0 semanas con IgG de control a 33,6 semanas con mAb G6-31 con valor de p en rango logaritmico < 2,4 x 10-3 (Fig. 2F).
Se analizo el fenotipo tumoral de cuatro ratones tratados con mAb G6-31 tras practicarles la eutanasia a las 32, 51, 64 o 66 semanas de vida (tras 19, 38, 51 o 53 semanas de tratamiento con mAb G6-31, respectivamente). Como se muestra en la Tabla 1, el diametro tumoral medio se mantuvo en un nivel cercano al observado en ratones de diecinueve semanas vida (1,64 mm en los ratones tratados con IgG de control durante seis semanas). Del mismo modo, el numero de tumores permanecio comparable al de los ratones de trece semanas de vida (los ratones del grupo del dia 0 tenian de 59 a 161 adenomas intestinales con una media de 100). Tres (uno de cada raton 2, 3 y 4 de la Tabla 1) de los quince adenomas de colon (numero total identificado en los ratones 1-4) que fueron capturados en el plano de seccion en el analisis histologico no mostraron ninguna transformacion maligna.
Tabla 1. Datos tumorales de los ratones en el tratamiento con G6-31 prolongado
.. , ,, . semanas con 0 . . diametro medio tumoral . , , 3,
raton edad (semanas) G6 31 n.° de tumores (mm) carga tumoral (mm3)
1
32 19 55 0,65 6,3
2
51 38 133 1,72 263,5
3*
64 51 85 2,21 341,1
4*
66 53 150 1,63 282,2
*animal sano sacrificado en el punto final del estudio
En resumen, el tratamiento con anti-VEGF-A a largo plazo, en general, fue bien tolerado y produjo un aumento de la supervivencia de los ratones Apcmin/+. Por otra parte, el numero de tumores y el diametro tumoral medio en los ratones tratados con mAb G6-31 a largo plazo permanecio sorprendentemente bajo en vista de la edad de los ratones, en consonancia con una inhibicion de la formation de nuevos adenomas y el crecimiento de adenomas.
Niveles totales de protema, albumina y trigliceridos en suero normales y reduccion de la hematopoyesis extramedular esplenica en ratones Apcmin/+ tratados con anticuerpos anti-VEGF-A
Como observation general, los ratones Apcmin/+ tratados con mAb G6-31 parecieron considerablemente mas alerta y receptivos que los ratones tratados con IgG de control. Por otro lado, se observaron patas palidas, que sugieren anemia progresiva inicialmente informada por Moser et al. (Moser et al., Science 247:322-324 (1990)), regularmente en los animales tratados con IgG de control, pero no en los animales tratados con mAb G6-31. En linea con esta observacion, la proteina total y la albumina medias en suero se redujo en los ratones Apcmin/+ que recibieron IgG de control, mientras que los niveles de proteina total y de albumina resultaron estar dentro del intervalo normal en los ratones tratados con mAb G6-31 (Tabla 2 ).
Tabla 2. Quimica del suero.
grupo proteina total (g/dl)* Albumina (g/dl)** Trigliceridos (mg/dl)***

IgG de control, 3 semanas (n = 10) 3,7 ± 0,2 1,9 ± 0,1 268,9 ± 82,5

G6-31, 3 semanas (n = 10) 4,9 ± 0,2 2,6 ± 0,1 75,5 ± 4,9

IgG de control, 6 semanas (n = 10) 3,0 ± 0,3 1,6 ± 0,2 591,1 ± 81,3

G6-31,6 semanas (n = 10)_______________4,9 ± 0,1___________2,7 ± 0,1_______________71,1 ± 4,3
*valor de referencia de 3,9-5,5 g/dl **valor de referencia de 2,3-3,2 g/dl ***valor de referencia de 35-244 mg/dl ± Error tipico de la media (ETM)
Como se informo para los ratones Apcmin/+ (Moser et al., Science 247:322-324 (1990)), y en consonancia con la hipoproteinemia, el nivel medio de trigliceridos fue elevado en los animales tratados con IgG de control, a pesar de
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que se redujo hasta una nivel comparable con el valor de referencia tras el tratamiento con mAb G6-31 (Tabla 2).
Si bien no hubo diferencias relacionadas con el tratamiento en las masas corporales despues de tres o seis semanas de tratamiento, las masas medias del bazo aumentaron significativamente (p < 2,3 x 10-3) en los ratones tratados con IgG de control. Despues de tres semanas de la administracion de IgG de control, los ratones resultaron tener una masa media del bazo de 0,26 g, o del 1,17 % de la masa corporal, mientras que la masa media del bazo resulto ser de 0,11 g (0,49 % de la masa corporal) en los ratones tratados con mAb G6-3l durante tres semanas. El aumento de la masa media del bazo en los ratones tratados con IgG de control coincide con la hematopoyesis extramedular (EMH, eritropoyesis compensatoria, en este caso secundaria a la hemorragia intestinal), que se confirmo mediante el examen histologico de los bazos. Diez de los diez ratones tratados durante 6 semanas con IgG de control mostraron una notable EMH, mientras que dos ratones tratados con mAb G6-31 resultaron tener EMH moderada, cinco resultaron tener EMH leve y tres de ellos no tuvieron ningun cambio de diagnostico en el bazo. Cuatro de los cinco ratones tratados con mAb G6-31 durante 18-53 semanas fueron diagnosticados con EMH leve a extensa en el bazo.
El menor grado de EMH en el bazo de los ratones tratados con mAb G6-31 a corto plazo sugiere que la terapia con anti-VEGF-A tiene un efecto beneficioso en la reduccion del sangrado intestinal.
Cambios renales tras el tratamiento a largo plazo con mAb G6-31
Para investigar la posible toxicidad relacionada con la administracion de mAb anti-VEGF-A G6-31 de alta afinidad, se analizaron histologicamente el pancreas, el higado y los rinones tras el tratamiento a corto plazo (3-6 semanas) y a largo plazo (18-53 semanas). Para el analisis histologico, se deshidrato tejido intestinal fijado con Notox y se introdujo en parafina, se corto y se tino con H&E para realizar el analisis histologico siguiendo protocolos convencionales.
No se observo una toxicidad significativa en los animales tratados durante 3-6 semanas. Despues del tratamiento a largo plazo con mAb G6-31, cinco de los cinco ratones mostraron glomeruloesclerosis global difusa variable (de leve a grave) y edema estromal moderado del pancreas (lo que reflejaba hipoproteinemia). Estas observaciones coinciden con la toxicidad observada anteriormente como resultado de la administracion a largo plazo de mAb G6- 31. Es importante destacar que los efectos adversos fueron compensados por la mejora general de la salud reflejada en el aumento de la mediana de la supervivencia.
La alteracion de la morfologfa tumoral tras el tratamiento con mAb G6-31 no se vio acompanada de un cambio en el mdice de proliferacion
Para caracterizar adicionalmente los polipos intestinales en ratones Apcmin/+ despues del tratamiento con mAb anti- VEGF-A G6-31, se realizaron analisis macroscopicos e histologicos como se ha descrito anteriormente. La morfologia macroscopica de los polipos tratados con mAb G6-31 resulto diferir notablemente de la de los polipos tratados con la IgG de control (Fig. 3A-B). Mientras que los tumores de los ratones que habian recibido IgG de control resultaron tener, en general, una superficie relativamente uniforme, lisa, los tumores de los animales tratados con mAb G6-31 resultaron tener invaginaciones profundas en su superficie. El analisis histologico revelo que los tumores de los ratones tratados con mAb G6-31 e IgG de control eran adenomas tubulares (Fig. 3C-F). Los adenomas de los ratones tratados con IgG de control resultaron tener una notable proliferacion epitelial entre las vellosidades, con expansion vertical y lateral, y, por lo general, se ampliaron mas del doble desde su base hasta la superficie luminal. Habia estroma fibroso minirno. Los adenomas de los ratones tratados con mAb G6-31 resultaron tener caracteristicamente menos celulas epiteliales entre las vellosidades, resultaron ser menos anchos en la superficie luminal, mas superficiales y abarcaron menos vellosidades adyacentes. El analisis histologico de los polipos de colon en ambos grupos de tratamiento mostro adenomas tubulares pedunculados con abundante estroma fibrovascular y una cantidad variable (hasta 100 %) del epitelio displasico.
Para evaluar el grado de proliferacion en el tejido tumoral y en la mucosa normal, se realizo una tincion inmunohistoquimica indirecta con anticuerpo Ki-67 (Fig. 3G-J). Para estos experimentos, se desparafinaron cortes de tejido intestinal introducidos en parafina, deshidratados y fijados con Notox, y se hidrataron antes de la incubacion en Target Retrieval (DAKO, Glostrup, Dinamarca) a 99 °C seguida de la inactivacion de la actividad de la peroxidasa endogena y el bloqueo de la avidina y la biotina (Vector, Burlingame, CA). Se bloquearon los cortes adicionalmente durante 30 minutos con suero de bloqueo al 10 % en PBS con albumina de suero bovino al 3 %. Se incubaron los cortes de tejido con anticuerpos primarios diluidos en el suero de bloqueo durante 60 minutos, se lavaron con tampon de TBST (DAKO) y se incubaron con anticuerpos secundarios durante 30 minutos, se lavaron con TBST y se incubaron en reactivo ABC Elite (Vector) durante 30 minutos seguido de una incubacion en Metal Enhanced DAB (Pierce, Rockford, IL) y la contratincion con hematoxilina de Mayer. El anticuerpo primario usado fue anticuerpo policlonal de conejo contra Ki-67 (SP6, 1:200, Lab Vision, Fremont, CA). El anticuerpo secundario usado fue anticuerpo biotinilado de cabra anti-conejo (7,5 jg/ml, Vector). Todas las etapas se realizaron a temperatura ambiente.
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El analisis cuantitativo revelo cantidades similares de celulas positivas en Ki-67 en los tumores de los ratones tratados bien con IgG de control o con mAb G6-31. Del mismo modo, el mdice de proliferacion de la mucosa adyacente normal fue comparable entre ambos tratamientos (Fig. 3K). El mdice de proliferacion se cuantifico a partir de imagenes de cortes de 5 |jm de tejido tumoral y mucosa normal en parafina adquiridos con un sistema de microscopio de barrido de portaobjetos Ariol SL50 (Applied Imaging, Inc., San Jose, CA) utilizando el ensayo de Kisight (Ariol Review (v2.6)). Se identificaron de forma manual las regiones de tejido tumoral y de mucosa normal, y se rodearon por parte de un examinador con ocultacion. Se cuantifico el indice de proliferacion, medido como el porcentaje de nucleos positivos en Ki-67 en relacion con los nucleos totales, de una manera semiautomatizada basada en el color de los nucleos siguiendo la definicion de un umbral positivo. Las mediciones del indice de proliferacion incluyeron el analisis de 29 tumores del grupo de tratamiento con mAb G6-31 (n = 3) y 44 tumores del grupo de IgG de control (n = 3), todos tratados durante seis semanas.
Para ensayar si la inhibicion del crecimiento por mAb G6-31 estaba acompanada de cambios en el nivel de expresion de parte de las moleculas de las principales vias de transduccion de senales, se realizo un analisis de transferencia Western. Se recogieron adenomas yeyunales y la mucosa adyacente normal de los ratones tratados con mAb G6-31 y anticuerpo de control con un escalpelo, y se homogenizaron mecanicamente con el homogeneizador OMNI TH115 en tampon de lisis RIPA. Los anticuerpos primarios usados fueron policlonales de conejo contra p38 MAPK, p38 MApK fosforilada, p42/p44 MAPK, p42/p44 MAPK fosforilada, PTEN, Akt, Akt fosforilada y GSK3alfa/beta fosforilada (todos a 1:1000, Cell Signaling, Danvers, MA). El anticuerpo secundario usado fue anticuerpo anti-conejo conjugado con peroxidasa de rabano picante (1:5000, Chemicon).
Mientras que el nivel de expresion de muchas de las moleculas ensayadas se mantuvo sin cambios tras el tratamiento con mAb G6-31, se observo un modesto restablecimiento de los niveles de MAPK-p38 fosforilada en tres de cuatro muestras de tumor hacia los que se encuentran en la mucosa normal (Fig. 3L; p-p38, comparese T5-T8 con N5-N8).
Reduccion de la densidad vascular en tumores tratados con mAb G6-31
Dado que se sabe que VEGF-A es un mitogeno para las celulas endoteliales vasculares a traves de la senalizacion de VEGFR-2, se examinaron las redes vasculares tumorales en ratones tratados con Mab G6-31 e IgG de control mediante tincion inmunohistoquimica de cortes gruesos de tejido con anticuerpo anti-CD31 (Fig. 4A-B). Con el fin de generar imagenes con un microscopio confocal, los ratones recibieron perfusiones fijadas con paraformaldehido al 1 % (PFA) en PBS bajo anestesia con isofluorano, se extendio el tracto intestinal sobre una superficie de papel de filtro, se fijaron posteriormente con PFA al 4 % y se sumergieron en sacarosa al 30 % en PBS durante la noche a 4 °C antes de introducirlos en O.C.T. y congelarlos en hielo seco. Se recortaron los cortes congelados en trozos de 80 jm, se fijaron en PFA al 4 % durante 10 minutos, se permeabilizaron con Triton-X-100 al 0,2 % en PBS, y se bloquearon durante 30 min con suero normal de cabra al 5 % en PBS con Triton-X -100 al 0,2 %. Se incubaron los anticuerpos primarios en tampon de bloqueo durante la noche, anticuerpos secundarios durante 5-6 horas, se lavaron con PBS y se contrastaron con Hoechst 33342 (0,5 mg/ml; Sigma, St. Louis, MO). Los anticuerpos primarios usados fueron anticuerpo monoclonal de hamster contra CD31 (1:500, Chemicon, Temecula, CA), anticuerpo monoclonal de rata contra cadherina E (1:2500, Zymed, South San Francisco, CA) y anticuerpo monoclonal de raton conjugado con Cy3 contra actina de musculo liso (1:1000, Sigma). Los anticuerpos secundarios usados fueron anticuerpo de hamster anti-armenio conjugado con Cy5 (1:500, Jackson Immunoresearch, Cambridgeshire, RU) y anticuerpo anti-rata conjugado con Alexa 488 (1:500, Molecular Probes, Eugene, OR).
Se cuantifico la densidad de los vasos de los tumores de los ratones Apcmin/+ a partir de imagenes digitales adquiridas con una camara CCD en un microscopio de fluorescencia Zeiss Axioplan2 (Thomwood, NY). Cada uno de los cuatro grupos (ratones tratados durante 3 o 6 semanas con IgG de control o mAb G6-31) consistio en dos ratones, y se analizaron 11-22 tumores de cada grupo. Se calculo la superficie de los vasos de los cortes tumorales de 80 jm a traves de una segmentacion basada en umbrales de fluorescencia positiva en CD31 usando ImageJ v.1.36 (
http://rsb.info.nih.gov/ij/). A continuacion, se calculo la densidad de los vasos como la proporcion de los pixeles positivos en CD31 con respecto a la superficie total del tumor. Se calculo la media de los valores de todos los tumores de cada grupo, proporcionando un valor medio para el grupo.
La cuantificacion de la densidad de los vasos indico que el componente vascular de los tumores de los ratones tratados con mAb G6-31 se redujo en comparacion con el observado en los ratones tratados con IgG de control (Fig. 4C). Tras tres semanas de administracion de la IgG de control, la densidad superficial media de los vasos tumorales resulto ser del 23,2 %, mientras que se redujo hasta el 18,6 % tras la administracion con mAb G6-31. La superficie media de los vasos de los tumores tratados con IgG de control durante seis semanas fue del 25,5 %, mientras que la densidad superficial media de los vasos de los tumores de los ratones tratados con mAb G6-31 fue del 19,7 %.
Discusion
Se usaron ratones Apcmin/+ para investigar el papel de VEGF-A en la tumorigenesis intestinal benigna. En la primera parte, los experimentos se disenaron para medir los efectos del tratamiento a corto y a largo plazo de anti-VEGF-A de adenomas intestinales sometidos a un gran crecimiento. Se ha demostrado que el tratamiento con mAb anti-
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VEGF-A G6-31 redujo significativamente la carga tumoral y prolongo la supervivencia de los ratones Apcmin/+.
Se han realizado varios estudios sobre el efecto de los agentes dieteticos y quimiopreventivos, incluyendo los farmacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), en la carga tumoral de los ratones Apcmin/+ (revisado en Corpet et al., Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev. 12:391-400 (2003)), de los cuales existe una lista actualizada en
http://corpet.net/min. Muchos de estos estudios informan de una reduction significativa en el numero de tumores. Los AINE tales como piroxicam y sulindac, que se dirigen tanto a COX-1 como a COX-2, han estado entre los agentes mas potentes para suprimir la formation de tumores en ratones Apcmin/+ (Boolbol et al., Cancer Res. 56:2556-2560 (1996), Chiu et al., Cancer Res. 57:4267-4273 (1997), Hansen-Petrik et al., Cancer Lett. 175:157-163 5 (2002), Ritland et al., Carcinogenesis 20:51-58 (1999)), ademas de los inhibidores selectivos de COX-2 tales como celecoxib (Jacoby et al., Cancer Res. 60:5040-5044 (2000)) y A-285969 (Wagenaar-Miller et al., Br. J. Cancer 88:1445-1452 (2003)). Las terapias de combination tambien se han usado con exito para reducir el numero de tumores. Torrance et al. utilizaron un inhibidor especifico del receptor del factor de crecimiento epidermico, EKI-785, en combinacion con sulindac, y demostraron una elimination casi total del numero de tumores (Torrance et al., Nat. Med. 6:1024-1028 (2000)). Del mismo modo, el efecto combinado de los agentes quimioterapeuticos raltitrexed (RTX) y 5-fluorouracilo (FU) produjo una reduccion significativa (37 %) de los numeros de tumores Apcmin/+ (Murphy et al., Cancer Biol. Ther. 3:1169-1176 (2004)). Recientemente, la administration a corto plazo del inhibidor del receptor tirosina quinasa (RTK) AZD2171 demostro una reduccion de la carga tumoral en el modelo de Apcmin/+ (Goodlad et al., Carcinogenesis 27:2133-2139 (2006)). Observaron que el inicio temprano del tratamiento (a las 6 semanas) con AZD2171 fue capaz de reducir el numero de tumores, mientras que la intervention tardia (a las 10 semanas) solo redujo el tamano de los tumores (Goodlad et al., supra). Sin embargo, el tratamiento no tuvo efecto sobre la densidad vascular (Goodlad et al., supra). AZD2171 inhibe varios RTK incluyendo, pero sin limitation, VEGFR-1, -2 y -3 (Wedge et al., Cancer Res. 65:4389-4400 (2005)).
Los presentes inventores han observado que el Mab anti-VEGF-A G6-31 administrado a las 13 semanas no redujo el numero de tumores existentes, a pesar de que disminuyo el tamano de los tumores y parecio inhibir la formacion de nuevos adenomas. Estos resultados se correlacionaron con el aumento observado de la supervivencia. Sin embargo, se cree que es posible que un enfoque de prevention de tumores especifico de anti-VEGF (con un inicio del tratamiento temprano) sea mas eficaz para reducir el numero de tumores que el enfoque de intervencion de los tumores (con un inicio del tratamiento tardio) que se uso en el estudio de los presentes inventores. Independientemente, la inhibition especifica de anti-VEGF fue eficaz en todas las fases de crecimiento de los tumores.
El presente estudio demuestra de manera concluyente que la orientation de VEGF-A es suficiente para lograr profundos efectos terapeuticos en el modelo de Apcmin/+. La comparacion de la inhibicion sistemica de VEGF-A con Mab G6-31 con una deletion genetica de VEGF-A en el compartimiento epitelial intestinal solo en ratones Apcmin/+; VEGFlox; Villin-Cre sugiere que, ademas de las celulas epiteliales, otro fuentes celulares de VEGF-A desempenan un papel importante en el crecimiento de los adenomas Apcmin/+. Estas fuentes adicionales de VEGF-A incluyen potencialmente celulas mononucleares (Sunayama et al., Carcinogenesis 23:1351-1359 (2002)) y fibroblastos del estroma (Seno et al., Cancer Res. 62:506-511 (2002), (Williams et al., J. Clin. Invest. 105:1589-1594 (2000)). El analisis in situ de los presentes inventores indica expresion de VEGF-A extra-epitelial dentro de los adenomas y de las vellosidades normales, lo que apoya la observation.
Basandose en un amplio conjunto de datos, es concebible que gran parte de los efectos antitumorales observados de mAb G6-31 esta mediada por la supresion de la angiogenesis (Wise et al., Proc. Natl. Acad Sci EE.UU. 96:30713076 (1999), Zachary et al., Cardiovasc Res. 49:568-581 (2001)). De hecho, se ha observado un suministro vascular reducido en respuesta al anticuerpo monoclonal anti-VEGF-A en estudios de xenoinjertos tumorales (Borgstrom et al., Prostate 35:1-10 (1998)). De acuerdo con esto, se observo una reduccion de la densidad superficial de los vasos de los adenomas intestinales Apcmin/+ despues de tres y seis semanas de administrar mAb G6-31, en comparacion con los tumores de los ratones tratados con IgG de control.
La acumulacion significativa observada de adenomas inferiores a 1 mm tras la inhibicion de VEGF-A sugiere que, en los adenomas intestinales de los ratones Apcmin/+, se puede producir un cambio angiogenico antes de lo que en general se cree para el desarrollo de tumores, como se ha visto en el modelo de Apcdelta716 (Seno et al., Cancer Res. 62:506-511 2002)).
Una conclusion importante e inesperada del estudio de los presentes inventores es que la monoterapia antiangiogenica, dirigida a un unico factor angiogenico, puede ser muy eficaz en la supresion del crecimiento tumoral y puede producir un beneficio en la supervivencia. Esto parece contrastar con el punto de vista, adoptado principalmente a partir de la investigation de tumores malignos, de que el principal beneficio de una terapia de este tipo es "normalizar" los vasos sanguineos del tumor con el fin de facilitar la administracion de la quimioterapia (Jain et al., Nat. Med. 7:987-989 (2001)). Es concebible que una menor propension de los tumores benignos a adquirir mutaciones, que pueden conducir a la resistencia al tratamiento, puede explicar, al menos en parte, la diferencia. Por lo tanto, los datos de los presentes inventores sugieren la posibilidad de un tratamiento no quirurgico para los tumores benignos, sin la necesidad de agentes quimioterapeuticos.
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Referencia
Ejemplo 2. El anticuerpo monoclonal anti-VEGF inhibe el crecimiento de adenomas hipofisarios y reduce el nivel de prolactina y de hormona del crecimiento en suero en un modelo murino de neoplasia endocrina multiple
La neoplasia endocrina multiple (MEN) es un trastorno caracterizado por la incidencia de tumores que afectan a dos o mas glandulas endocrinas. Un paciente se clasifica con MEN de tipo 1 (MEN1) cuando se identifica una aparicion combinada de los tumores en las glandulas paratiroides, las celulas de los islotes pancreaticos y la hipofisis anterior. Se descubrieron las mutaciones en el gen MEN1 como subyacentes al trastorno, lo que comunmente genera el truncamiento o la ausencia de la proteina menina (revisado en Pannett et al., Endocr. Relat. Cancer 6:449-473 (1999)). Con el hallazgo adicional de una perdida frecuente del alelo restante en los tumores, (Bystrom et al., Proc. Natl. Acad. Sci EE.UU. 87:1968-1972 (1990; Debelenko et al., Cancer Res. 57:2238-2243 (1997), Larsson et al., Nature 332:85-87 (1988)), MEN1 se ha clasificado como un gen supresor de tumores. Aunque MEN1 se hereda en gran medida como un trastorno autosomico dominante, las mutaciones de novo del gen MEN1 se han identificado como la causa de los casos esporadicos de MEN1.
La funcion de la menina sigue siendo desconocida. Se ha sugerido que la proteina de 610 aminoacidos predominantemente nuclear de expresion ubicua participa en la regulacion de la transcripcion, el procesamiento y la reparacion del ADN, y la organization del citoesqueleto a traves de sus interacciones in vitro con parte de las proteinas de las vias anteriormente mencionadas (revisado en Agarwal et al., Horm. Metab. Res. 37:369-374 (2005)). Sin embargo, ninguna de las interacciones de las proteinas identificadas hasta el momento proporciona una explication a la tumorigenicidad de MEN1.
El patron actual de tratamiento para los tumores de pancreas - mas del 50 % de los cuales son gastrinomas y del 10 al 30 % son insulinomas - es la reduction de la production de acido basal en el caso de los gastrinomas, mientras que la cirugia se considera el tratamiento optimo para los insulinomas. El tratamiento para los tumores hipofisarios consiste en una cirugia selectiva con diferentes terapias medicas en funcion del perfil hormonal, mientras que el tratamiento definitivo para los tumores paratiroides es una extirpation quirurgica de la glandula hiperactiva. Sin embargo, hay una variabilidad en el grado y en la sincronizacion de la paratiroidectomia (revisado en Brandi et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 86:5658-5671 (2001)). Los ultimos avances en la generation de nuevos enfoques para el diagnostico y el tratamiento de MEN1 se han revisado recientemente (Viola et al., Curr. Opin. Oncol. 17:24-27 (2005)).
A traves de la recombination homologa, los exones 3-8 del gen Men1 de raton han sido objeto de deletion (Crabtree et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 98:1118-1123 (2001)). A los nueve meses de vida, se informo de ratones heterocigoticos para Men1 que desarrollaron lesiones en los islotes pancreaticos con observaciones adicionales frecuentes de adenomas paratiroides. Se observaron mas tumores y de mayor tamano en los islotes pancreaticos, paratiroides, tiroides, corteza suprarrenal e hipofisarios a los 16 meses de edad (Crabtree et al., Proc. Natl. Acad. Sci EE.UU. 98:1118-1123 (2001)), de manera notablemente similar al trastorno humano.
Existen numerosas pruebas que indican que el bloqueo de la angiogenesis mediada por VEGF-A produce la supresion de los tumores (Gerber et al., Cancer Res. 60:6253-6258 (2000), Holash et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 99:11393-11398 (2002), Millauer et al., Nature 367:576-579 (1994), Prewett et al., Cancer Res. 59:52095218 (1999), Wood et al., Cancer Res. 60:2178-2189 (2000)), y se ha usado como enfoque anti-VEGF-A en el tratamiento de diversos modelos preclinicos derivados de lineas celulares de cancer maligno humano (revisado en Geber et al., Cancer Res. 60:2178-2189 (2000)). Sin embargo, los xenoinjertos tumorales resumen mal el desarrollo de tumores en un entorno natural. Ademas, hasta la fecha, no se ha probado el tratamiento con anticuerpos anti- VEGF-A en la inhibition del crecimiento de los tumores benignos o los tumores de origen endocrino. Para investigar el papel de VEGF-A en el desarrollo de adenomas especificos de tejidos endocrinos, se examinaron los efectos de la terapia antiangiogenica en un modelo de tumor no maligno natural, el modelo de raton de Men1+/- de MEN1. Se analizo el volumen tumoral de adenomas hipofisarios en ratones Men1+/-, asi como los trasplantes de tumores hipofisarios subcutaneos en ratones Balb/c desnudos despues de un tratamiento a corto plazo con el antagonista especifico del VEGF a modo de ejemplo, anticuerpo monoclonal (mAb) anti-VEGF-A. Ademas, se investigo la posibilidad de la reduccion de los niveles elevados de la hormona asociados con MEN1 con mAb anti-VEGF-A.
Para los experimentos descritos a continuation, se adquirieron ratones Men1+/- (numero de reserva 004066) en el Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) y ratones Balb/c desnudos en Charles River Laboratories Inc. (Wilmington, MA). Se obtuvieron ratones hembra Men1+/- experimentales de antecedentes 129-FVB mixtos mediante el entrecruzamiento de machos y hembras Men1+/-.Se alojaron los animales en jaulas de microaislamiento en una instalacion de barrera alimentaron a voluntad. Los protocolos de mantenimiento de los animales y experimentales se realizaron siguiendo las regulaciones federales y aprobadas por el comite institucional de cuidado y uso de animales.
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El tratamiento con mAb G6-31 inhibe el crecimiento de adenomas hipofisarios Men1+/-
Para investigar si la terapia anti-VEGF-A seria eficaz en la inhibicion del crecimiento de adenomas hipofisarios, se sometieron 125 ratones hembra Men1+/- de 11 a 13 meses de vida a MRI para identificar los ratones con tumores hipofisarios. Se sometieron los ratones portadores de tumores a generacion de imagenes de nuevo 14 y 28 dias mas tarde para establecer la tasa de crecimiento de los adenomas. Una cohorte de nueve ratones con un 12,4 % de crecimiento tumoral medio al dia y 15,58 ± 4,0 mm3 (± ETM) de volumen tumoral medio al inicio del estudio recibieron IgG de control, y una cohorte de ocho ratones con el 10,2 % de crecimiento tumoral medio al dia y 16,70 ± 5,7 mm3 de volumen tumoral medio al inicio del estudio recibieron un mAb anti-VEGF-A G6-31 durante 67 dias o hasta que los ratones se encontraron moribundos. Para el tratamiento con mAb G6-31 y anticuerpos IgG de control, se administro una inyeccion intraperitoneal a 5 mg/kg de mAb anti-VEGF G6-31 (Liang et al., J. Biol. Chem. 281:951961 (2005)) o IgG de control del mismo isotipo (anti-GP120) una vez a la semana en un volumen de 100-200 |jl en PBS. La administration de ocho (mAb G6-31) o nueve (IgG de control) ratones Men1+/- con adenoma hipofisario in situ se inicio a los 13,5-14,5 meses de edad y se continuo durante 67 dias o hasta que los ratones se encontraron moribundos. El tratamiento de 23 (IgG de control) o 35 (mAb G6-31) ratones Balb/c desnudos con un trasplante de adenoma hipofisario subcutaneo se inicio cuatro meses despues del injerto, y continuo durante 35 dias o hasta que los ratones se encontraron moribundos o el volumen tumoral hubo alcanzado los 3.000 mm3.
Se sometieron los animales a MRI cada dos semanas durante el seguimiento del crecimiento de los adenomas hipofisarios in vivo. Se adquirieron imagenes de MRI en un iman de taladro horizontal 9.4T (Oxford Instruments Ltd., Oxford, RU) y se controlaron mediante una consola Varian Inova (Varian, Inc., Palo Alto, CA) usando una bobina de 3 cm de volumen para la transmision y la reception (Varian, Inc.). Se empleo una secuencia de imagenes de eco de espin rapido con un tiempo de repetition de 4 segundos, longitud de los trenes de eco de 8, espaciado del eco de 12 ms, tiempo de eco eficaz de 48 ms y seis medias. La matriz de la imagen era 1282, con un campo de vision (20 mm)2 y un espesor del portaobjetos de 0,5 mm. Se forzaron los ratones a mantenerse en position pronadora con isoflurano al 2 % en aire medico, y se monitorizo la temperatura corporal con una sonda rectal y se mantuvo a 37 °C con aire caliente durante la adquisicion de imagenes de 15 minutos. Tras la generacion de imagenes, se dejo que los animales se recuperaran en una superficie caliente, tas lo que se devolvieron a la instalacion de alojamiento. Se calcularon los volumenes de los tumores hipofisarios primarios a partir de datos de MRI usando las regiones tridimensionales de interes dibujadas en el software Analize (AnalyzeDirect, Inc., Lenexa, KS).
A los treinta y nueve dias de tratamiento, se observo una disminucion estadisticamente significativa del volumen medio de los tumores hipofisarios en el grupo tratado con mAb G6-31 en comparacion con el grupo tratado con IgG de control (Fig. 5A). En el punto final del estudio (67 dias), se habia producido una reduction estadisticamente significativa del 72 %, o de 3,7 veces, en el volumen tumoral medio tras el tratamiento con mAb G6-31, con un valor de p inferior a 0,016. Mientras que la mayoria (6 de los 9) de los tumores Men11+- tratados con IgG de control siguio creciendo vigorosamente durante todo el periodo de tratamiento, el crecimiento de 7 de los 8 adenomas hipofisarios tratados con mAb G6-31 se ralentizo considerablemente (Fig. 5B). Se sacrificaron cuatro animales tratados con IgG de control y tres ratones tratados mAb G6-31 antes del punto final del estudio debido a problemas de salud, incluyendo un raton tratado con IgG de control antes de exponerlo al tratamiento el dia 25. La supervivencia sin duplication del tumor fue significativamente mayor en el grupo tratado con mAb G6-31 con un valor de p en rango logaritmico < 0,019 (Fig. 5C), lo que sugiere que la inhibicion del crecimiento de los tumores hipofisarios mejoro la salud de los ratones, en comparacion con los ratones tratados con IgG de control. El volumen tumoral de dos ratones del grupo de tratamiento con mAb G6-31 no se habia duplicado hacia dia 67 de tratamiento.
El anticuerpo anti-VEGF-A inhibe el crecimiento de transplantes de adenomas hipofisarios subcutaneos
Para ensayar la eficacia del tratamiento con anticuerpos anti-VEGF-A en un modelo de trasplante de adenoma hipofisario Men1+/-, se establecieron tumores subcutaneos en el costado de ratones hembra Balb/c desnudos de 6-8 semanas de vida de acuerdo con el siguiente procedimiento. Para estos experimentos, se extrajo un solo adenoma hipofisario in situ de un raton Men1+/- y se pico en trozos de aproximadamente 1 mm3, se mezclaron con membrana basal de matriz BD Matrigel (BD, Bedford, MA) y se inocularon por via subcutanea en un volumen de 200 jl en el costado dorsal de ratones Balb/c desnudos. Cuatro meses despues, se extrajo un solo tumor subcutaneo (volumen aproximado de 900 mm3), se pico, se mezclo con Matrigel y se inoculo como se ha descrito anteriormente para establecer una cohorte de ratones con trasplantes de adenomas hipofisarios.
Se midio el tamano tumoral de los trasplantes de adenomas hipofisarios subcutaneos con una herramienta de calibration (Fred V. Fowler Co. Inc., Newton, MA) cogiendo el diametro mayor del tumor y el diametro perpendicular al mismo. Se calculo el volumen tumoral usando la siguiente formula: V = nab2/6 (a = diametro mayor del tumor, b = diametro perpendicular).
Una cohorte de 35 ratones con un volumen tumoral medio de 515 ± 42 mm3 al inicio del tratamiento recibio mAb G6- 31 y una cohorte de 23 ratones con un volumen tumoral medio de 527 ± 64 mm3 al inicio del estudio recibio la IgG de control durante 35 dias usando los metodos descritos anteriormente. En el punto final del estudio, los tumores tratados con IgG de control casi habian cuadruplicado sus volumenes, a una media de 2.071 ± 152 mm3, mientras que el crecimiento de los tumores de los ratones tratados con mAb G6-31 se habia detenido esencialmente; siendo
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volumen tumoral medio de 556 ± 89 mm3 en el dia 35 (Fig. 5D). Se produjo una reduccion estad^sticamente significativa del 73 %, o de 3,7 veces, del volumen tumoral medio tras el tratamiento con mAb G6-31, con un valor de p < 1,9 x 10-12.
Estos datos establecen que el mAb anti-VEGF-A G6-31 es eficaz en la inhibicion del crecimiento de adenomas hipofisarios y de transplantes de adenomas hipofisarios subcutaneos por igual, predispuestos por la heterocigosidad de Men1.
Expresion de VEGF-A, VEGFR-1 y VEGFR-2 en hipofisis normal y tejido tumoral hipofisario
Para investigar el nivel de expresion de VEGF-A, VEGFR-1 y VEGFR-2 en el tejido hipofisario, y para examinar si su nivel de expresion se veia afectado por el tratamiento con mAb G6-31, se comparo la expresion relativa media de VEGF-A, VEGFR-1 y VEGFR-2 en cinco adenomas hipofisarios in situ tratados con IgG de control (volumen medio de 96,2 ± 8,7 mm3) y cinco adenomas hipofisarios in situ tratados con mAb G6-31 (35,2 ± 4,0 mm3), junto con cinco adenomas hipofisarios pequenos no tratados de la misma edad (9,7 ± 2,9 mm3), cuatro hipofisis normales de la misma edad de ratones Men1+/- y ocho muestras de hipofisis de tipo silvestre de la misma edad. Tambien se examino la expresion de VEGF-A, VEGFR-1 y VEGFR-2 en cinco trasplantes de adenoma hipofisario tratados con IgG de control (volumen medio de 2.063 ± 205 mm3) y cinco trasplantes de adenoma hipofisario tratados con mAb G6-31 (577 ± 45 mm3).
Para estos experimentos, se preparo ARN exento de ADN total a partir de adenomas hipofisarios ultracongelados o hipofisis normales con el kit RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se realizo una RT-PCR cuantitativa de una sola etapa en un volumen total de 50 |jl con el kit qRT-PCR de una etapa Superscript III Platinum (Invitrogen, Carlsbad, CA), 100 ng de ARN total, 45 nM de cada cebador de PCR y sonda Taqman 12,5 nM. Para detectar la expresion de los genes de interes, se usaron las siguientes mezclas de cebadores y sondas del ensayo de expresion de genes TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA): VEGF-A (ID del ensayo: Mm00437304_ml), VeGfR-1 (ID del ensayo: Mm00438980_ml) y VEGFR-2 (ID del ensayo: Mm00440099_ml). Se detecto la expresion de GAPDH usando los cebadores y la sonda Taqman sintetizados internamente (Secuencia del cebador directo: ATGTTCCAGT ATGACTCCAC TcAcG (SEQ ID NO: 3); Secuencia del cebador directo inverso: GAAGACACCA GTAGACTCCA CGACA (SEQ ID NO: 4); secuencia de la sonda Taqman: AAGCCCATCA CCATCTTCCA GGAGCGAGA (SEQ ID NO: 5))
Las reacciones se llevaron a cabo usando el sistema de PCR en tiempo real 7500 de Applied Biosystems, con las siguientes condiciones: una etapa de transcripcion inversa (15 minutos a 48 °C), seguida de una etapa de desnaturalizacion (2 minutos a 95 °C) y 40 ciclos de 15 segundos a 95 °C y 1 minuto a 60 °C. Los niveles de expresion genica en cada muestra se determinaron con el metodo de cuantificacion relativa (metodo de ddCt), usando el gen GAPDH como control endogeno, y ARN total de placenta de raton (Clontech, Mountain View, CA) como referencia.
En particular, la expresion relativa media de VEGF-A se elevo significativamente en los adenomas in situ tratados con mAb G6-31 en comparacion con los tumores hipofisarios tratados con IgG de control, los tumores pequenos no tratados y las hipofisis normales de tipo silvestre o ratones Men1+/- (Fig. 6). La expresion de VEGF-A fue comparativamente alta en ambas muestras de trasplantes de tumores subcutaneos. El alto nivel observado de transcripcion de VEGF-A en los tumores tratados con mAb G6-31 puede ser el resultado de un mecanismo compensatorio para el secuestro sistemico de VEGF-A por parte de mAb G6-31. Sin embargo, parece que los niveles elevados de VEGF-A no fueron suficientes para impulsar el crecimiento del tumor.
Aunque la expresion relativa media de VEGFR-1 parecio razonablemente invariable en las diferentes muestras de tejido, la expresion relativa media de VEGFR-2 parecio menor en las muestras de tumores in situ tratados con IgG de control o mAb G6-31 en comparacion con la encontrada en los trasplantes tumorales, en los tumores pequenos no tratados o en las hipofisis normales de tipo silvestre y ratones Men1+/- (Fig. 6).
La MRI permite el seguimiento in vivo del crecimiento tumoral
Se uso la MRI como se ha descrito anteriormente para el seguimiento del crecimiento de los adenomas hipofisarios in situ durante todo el periodo de tratamiento sometiendo a los animales a la obtencion de imagenes cada dos semanas. En la Figura 7, se muestran las graficas de un corte coronal del cerebro con un adenoma representativo de un raton Men1+/- tratado con IgG de control y de un raton Men1+/- tratado con mAb G6-31, tomado a los dias 9, 39 y 67 dias de iniciarse el tratamiento.
Histologia de los tumores hipofisarios y pancreaticos
Los adenomas hipofisarios Men1+/- resultaron ser histologicamente similares en los ratones tratados con mAb G6-31 y con IgG de control (Fig. 8A-B). Para estos experimentos, se deshidrato tejido fijado con formalina y se introdujo en parafina, se corto y se tino con hematoxilina-eosina (H&E) para el analisis histologico siguiendo los protocolos convencionales. Por lo general, las celulas tumorales eran pequenas (~10 micrometros de diametro), con una alta
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proporcion de nucleo/citoplasma, a menudo mitoticamente activas, con un maximo de 40 figuras mitoticas por cada diez campos de 625 micrometros de diametro. Los tumores eran variablemente solidos o quisticos, con multiples vasos revestidos de celulas endoteliales, zonas agudamente hemorragicas (globulos rojos intactos en espacios no revestidos por endotelio, ausencia de fibrina u organizacion celular), y macrofagos cargados de hemosiderina dispersos, en consonancia con la hemorragia anterior. HaWa necrosis monocelular variable y fibrosis minima. Los vasos tumorales estaban espaciados irregularmente, normalmente de 5-10 micrometros de diametro sin embargo, rara vez, tan grandes como de 50 micrometros, con pocas celulas del estroma perivascular no tumorales.
Se observo el patron vascular entre los tumores tratados con IgG de control y mAb G6-31 mediante tincion inmunohistoquimica indirecta con un anticuerpo marcador de celulas panendoteliales MECA-32 (Fig. 8C-D). Para estos experimentos, se desparafinaron cortes de tejidos fijados con formalina e introducidos en parafina antes de la inactivacion de la actividad de la peroxidasa endogena y del bloqueo de avidina y biotina (Vector, Burlingame, CA). Se bloquearon los cortes durante 30 minutos con suero de conejo normal al 10 % en PBS con BSA al 3 %. A continuacion, se incubaron los cortes de tejido con anticuerpos primarios durante 60 minutos, anticuerpos secundarios biotinilados durante 30 minutos, y se incubaron en reactivo ABC (Vector, Burlingame, CA) durante 30 minutos, seguido de una incubacion de 5 minutos en DAB Metal Enhanced (Pierce, Rockford, IL). Se contrastaron los cortes con hematoxilina de Mayer. Los anticuerpos primarios usados eran anticuerpos de cabra anti-prolactina de raton a 0,1 |jg/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN) y antigeno de celulas panendoteliales anti-raton de rata, el clon MECA32, a 2 jg/ml (BD Biosciences, San Jose, CA). Los anticuerpos secundarios usados eran anticuerpos biotinilados de conejo anti-cabra a 7,5 jg/ml (Vector, Burlingame, CA) y anticuerpos biotinilados de conejo anti-rata a 2,5 jg/ml (Vector, Burlingame, CA). La tincion de antigeno de celulas panendoteliales requirio un tratamiento previo con Target Retrieval (Dako, Carpenteria, CA) a 99 °C durante 20 minutos. Todas las demas etapas se realizaron a temperatura ambiente.
La densidad de los vasos se redujo significativamente mediante el tratamiento con mAb G6-31 hasta el 46 % de la de los tumores tratados con IgG de control (valor de p = 0,009; Fig. 8I). En ambos grupos de tratamiento, la vascularizacion tumoral fue menor que en la hipofisis anterior adyacente normal. Para la cuantificacion de la densidad vascular, se analizaron cortes tenidos con MECA-32 con una plataforma de exploracion de diapositivas Ariol SL-50 (Applied Imaging, San Jose, CA), usando un objetivo de 10 aumentos. Se identificaron las regiones del tumor hipofisario y se senalaron de forma manual. Se definieron los colores de los pixeles correspondientes a la tincion con MECA-32, y se midio correspondientemente la superficie vascular. Se identificaron los nucleos de las celulas tumorales por el color del pixel y la forma del objeto. Entonces, se normalizo la superficie vascular con respecto al numero de celulas tumorales hipofisarias. Los islotes pancreaticos se analizaron de manera similar, excepto que la superficie tenida con MECA-32 se normalizo con respecto a la superficie de los tumores de los islotes.
Ademas de tumores hipofisarios, se identificaron con frecuencia tumores de los islotes pancreaticos en los ratones Men1+/- tratados, y se analizaron histologicamente en el punto final del estudio. Los tumores de los islotes (definidos como de un tamano superior a 105 jm2 en el plano de corte), por lo general, eran solidos, sin hemorragia ni necrosis significativas. Los tumores de los seis animales tratados con Mab anti-VEGF-A G6-31 (n = 32 tumores) promediaron solo el 39 % de la superficie de los de los cinco animales tratados con IgG de control (n = 45 tumores; valor de p = 0,026). Los adenomas pancreaticos (Fig. 8E-F) tratados con IgG de control parecian, en general, mas grandes (hasta 7,0 mm en el plano de corte) y mas vasculares que los adenomas tratados con mAb G6-31 (diametro del tumor de hasta 5,0 mm en el plano de la seccion). En cuatro de los siete ratones tratados con IgG de control, los tumores pancreaticos contenian espacios revestidos por endotelio, de pared fina, rellenos de sangre y dilatados de hasta 300 jm de diametro, mientras que los adenomas pancreaticos de los ratones tratados con mAb G6-31, con frecuencia, carecian de vascularizacion prominente (Fig. 8G-H). Los tumores pancreaticos de uno de los ocho ratones tratados con mAb G6-31 presentaron vasos dilatados. Se encontraron intermitentemente macrofagos cargados de hemosiderina en tumores pancreaticos con cualquiera de los tratamientos, que sugieren hemorragia en los islotes.
La densidad vascular en los tumores de los islotes se redujo significativamente mediante el tratamiento con G6-31 hasta el 56 % de la de los tumores de los islotes tratados con IgG de control (valor de p = 2 x 10-7). Tambien, los islotes "normales" (menos de 105 j2 en el plano de corte) de los ratones tratados con Mab G6-31 tenian una densidad vascular reducida, en menor magnitud, hasta el 76 % de la de los animales tratados con IgG de control (valor de p = 4 x 10-7; vease la Figura 8J). Un solo animal macho, tratado con IgG de control, resulto tener un tumor solitario en la corteza suprerrenal de 12 mm de diametro, un tipo de tumor reconocido en las glandulas del sindrome MEN1.
La histologia de los trasplantes de adenomas hipofisarios subcutaneos fue comparable a la de los tumores hipofisarios in situ, lo que indica una recapitulacion exitosa del crecimiento del tumor endocrino en locus distantes.
Adenomas hipofisarios y prolactinomas Men1
Aproximadamente el sesenta por ciento de los adenomas hipofisarios en pacientes MEN1 secretaron prolactina (PRL), menos de 25 %, hormona de crecimiento (GH), y el 5 %, hormona adrenocorticotropica (ACTH, Trump et al.,
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QJM 89:653-669 (1996)). Para examinar si los adenomas hipofisarios de ratones Men1+/- secretan PRL, se realizo la tincion inmunohistoqmmica con anticuerpos anti-PRL en adenomas hipofisarios in situ tratados con IgG de control y mAb G6-31, as^ como en trasplantes de tumores hipofisarios. Seis de los seis adenomas hipofisarios tratados con IgG de control y cinco de los cinco tratados con mAb G6-31 mostraron tincion positiva espedfica para la prolactina en aproximadamente el 50-95 % de las celulas que se establecieron como prolactinomas (Fig. 9A-9B). De acuerdo con este resultado, Crabtree et al. informaron que tumores hipofisarios Men1TSM/+ fueron positivos para PRL en una tincion inmunohistoqmmica (Crabtree et al., Proc. Natl. Sci EE.UU. 98:1118-1123 (2001)). La tincion con prolactina tambien fue positiva en los trasplantes de adenomas hipofisarios con cualquiera de los tratamientos (Fig. 9C 9D). Coincidiendo con la secrecion funcional de prolactina de estos tumores, el tejido mamario de ratones hembra portadores de adenomas hipofisarios transplantados mostro invariablemente un cambio de moderado a notable en la lactancia, en los animales tratados tanto con IgG de control como con anti-VEGF-A (Fig. 9 E, F).
Segun la evaluacion mediante tincion inmunohistoqmmica, 6 de los 11 tumores hipofisarios primarios no tratados fueron focal y debilmente positivos en la hormona de crecimiento (Fig. 14A), mientras que solo uno de los cuatro tumores hipofisarios trasplantados mostraron tincion debil focal (Fig. 14B). La expresion de la hormona del crecimiento estuvo presente en los tumores hipofisarios in situ tratados tanto con G6-31 como con IgG de control (Fig. 6C, D). La hipofisis anterior normal mostro una potente reactividad en ~20-30 % de las celulas. (Fig. 14A).
Los niveles de prolactina en suero se correlacionan con el volumen de los tumores hipofisarios en los ratones no tratados y tratados con IgG de control y se reduce mediante el tratamiento con mAb G6-31
Dado que todos los adenomas hipofisarios tratados con IgG de control y mAb G6-31 examinados de ratones Men1+/- fueron positivos en prolactina mediante analisis inmunohistoquimico, se investigo si los niveles de PRL en suero eran elevados en los ratones portadores de adenomas hipofisarios Men1+/-. Con este fin, se analizaron inicialmente 46 ratones hembra Men1+/- no tratados para determinar el estado de sus tumores hipofisarios y el nivel de PRL en suero, y cinco controles de hembras de la misma camada de tipo silvestre para el nivel de PRL en suero. Las cantidades de prolactina en suero se analizaron mediante el Programa Nacional de Hormonas y Peptidos de Harbor UCLA (Torrance, CA).
El intervalo de edades de estos ratones fue de 15,6 a 10,5 meses, con una edad media de 13,3 meses. El nivel medio de PRL en suero de los ratones de tipo silvestre fue de 43,8 ± 25,3 (± ETM) ng/ml. Veintisiete de los 46 ratones Men1+/- no tenian tumor hipofisario detectable mediante analisis de MRI. El nivel medio de PRL en suero de estos ratones fue de 69,0 ± 24,6 ng/ml. Un grupo de diez ratones tuvo un tumor hipofisario pequeno con un volumen medio de 1,7 ± 0,6 mm3. El nivel de PRL en suero de estos ratones se elevo hasta una media de 188,7 ± 61,9 ng/ml. Nueve ratones que tenian un tumor hipofisario de gran tamano (volumen medio 83,1 ± 23,8 mm3), tuvieron un nivel medio de PRL en suero de 13.239,8 ± 3.466,5 ng/ml. Estos datos establecen que existe una correlacion positiva entre los niveles de PRL en suero y el volumen del tumor hipofisario en ratones Men1+/- (Fig. 10A) con un coeficiente de correlacion de Pearson R = 0,94, lo que sugiere que el nivel de PRL en suero podria ser util como herramienta de diagnostico en el establecimiento de una estimation del estado del tumor hipofisario.
Para examinar si el tratamiento con anti-VEGF-A tuvo un efecto sobre los niveles de PRL en suero, se analizo el suero de siete ratones Men1+/- tratados con IgG de control y con mAb G6-31 con un adenoma hipofisario in situ en el de punto final del estudio (dia 67). En los ratones de tratados con IgG de control, el nivel medio de PRL en suero se elevo hasta 12.566,7 ± 3.047,4 ng/ml y, por lo general, aumento con un volumen tumoral creciente (media de 116,2 ± 18,5 mm3) con R = 0,80 (p < 0,03). En los ratones Men1+/- tratados con mAb G6-31 analizados, el nivel de PRL en suero se mantuvo por debajo, en 5.163,7 ± 1.608.9 ng/ml. Sin embargo, no hubo ninguna correlacion estadistica evidente con el volumen tumoral (volumen tumoral medio de 35,3 ± 6,5 mm3), R = 0,12 con p < 0,80 (Fig. 10B). No obstante, estos datos indican que aunque el mAb G6-31 inhibe el crecimiento del adenoma hipofisario, tambien conduce a una reduction del nivel medio de PRL en suero, en comparacion con los ratones tratados con IgG de control con p <0,053.
El tratamiento con anti-VEGF-A reduce los niveles de PRL en suero en ratones con transplantes de tumores hipofisarios subcutaneos
Aunque los datos anteriores indican que el tratamiento con anticuerpos anti-VEGF-A reduce el nivel de PRL en suero en ratones Men1+/- portadores de tumores, se siguio investigando esto en el contexto de los trasplantes de adenomas hipofisarios subcutaneos en ratones Balb/c desnudos. Se midio la PRL en suero en muestras procedentes de 23 ratones tratados con IgG de control y 35 ratones tratados con mAb G6-31, extraidos en el inicio del tratamiento (dia 1) y en el punto final del estudio (dia 35). Aunque la PRL media en suero del dia 1 fue comparable entre los dos tratamientos, el tratamiento con mAb G6-31 del dia 35 tuvo niveles significativamente reducidos de PRL en suero (Fig. 10C y D, respectivamente).
Como el tratamiento actual de los prolactinomas MEN1 incluye terapia medica o hipofisectomia selectiva seguida de radioterapia, los presentes datos que indican que el tratamiento con mAb G6-31 conduce a un menor nivel de PRL en suero con una inhibition destacada del crecimiento del tumor ofrecen un posible nuevo enfoque terapeutico para los pacientes MEN1.
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Los niveles de insulina en suero estan elevados en ratones Men1+/-
Para examinar si los niveles de insulina en suero estaban elevados en ratones Men1+/-, se analizaron muestras de suero de seis ratones no en ayunas tratados con IgG de control, y de seis ratones no en ayunas tratados con mAb G6-31, todos ellos identificados con lesiones pancreaticas en el analisis histologico. Tambien se analizaron los niveles de insulina en suero de cinco ratones de tipo silvestre no en ayunas de la misma edad usando un kit de ELISA de insulina ultrasensible de raton de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Mercodia, Uppsala, Suecia). No se observo correlacion con el tratamiento, pero la insulina media en suero se elevo notablemente en los ratones Men1+/- (IgG de control, 3,8 ± 2,6 ng/ml; mAb G6-31, 3,7 ± 2,4 ng/ml) en comparacion con los ratones de tipo silvestre (1,4 ± 0,7 ng/ml (± ETM)).
Discusion
Los presentes datos indican que se requiere VEGF-A para el crecimiento de adenomas hipofisarios benignos en el modelo de raton de MEN1, pues la terapia con un anticuerpo monoclonal contra VEGF-A ha demostrado ser suficiente para la inhibicion del crecimiento tumoral.
Basandose en la bibliografia disponible, es posible que gran parte de los efectos antitumorales observados de mAb G6-31 esten mediados por la supresion de la angiogenesis dependiente de VEGFR-2 (Wise et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 96:3071-3076 (1999) y Zachary et al., Cardiovasc. Res. 49:568-581 (2001)). Mientras que la expresion media relativa del ARNm de VEGFR-2 en grandes adenomas hipofisarios no se vio afectada significativamente por el tratamiento con anti-VEGF-A (Fig. 6), la tincion inmunohistoquimica con MECA-32 mostro reducciones altamente significativas en la vascularizacion (reduction del aproximadamente 50 %) en tumores hipofisarios y tumores de pancreas tratados con Mab G6-31. Se observo una reduccion correspondiente en el crecimiento tumoral tratado con anti-VEGF-A tanto en adenomas hipofisarios como pancreaticos. La densidad vascular en los islotes pancreaticos normales tambien se redujo significativamente mediante el tratamiento con anti-VEGF-A, aunque la magnitud del cambio (reduccion del 25 % del tratado con IgG de control) fue inferior a la observada en los adenomas pancreaticos.
El alto nivel observado de transcription de VEGF-A en los tumores tratados con Mab G6-31 es potencialmente el resultado de un mecanismo de compensation para el secuestro sistemico de VEGF-A por parte de Mab G6-31. Sin embargo, parece que un nivel tan elevado de VEGF-A no fue suficiente para impulsar el crecimiento del tumor.
Ademas de demostrar que una monoterapia con tratamiento de anti-VEGF-A y mAb G6-31 redujo significativamente la carga tumoral de los ratones Men1+/- mediante la inhibicion eficaz del crecimiento de los adenomas, se ha demostrado que el nivel de prolactina en suero tambien se redujo. Por lo tanto, los presentes datos sugieren la posibilidad de un tratamiento no quirurgico de los tumores benignos endocrinos, con un cese de la progresion de la enfermedad sin el uso de agentes quimioterapeuticos. Como alternativa, dicho bloqueo de VEGF-A se puede combinar con un agente farmacologico. Por ejemplo, para los adenomas secretores de prolactina, un antagonista de VEGF-A se puede combinar con un agonista de dopamina.
Ejemplo 3. Eficacia de la intervencion de anti-VEGF y eficacia de la regresion/supervivencia en el modelo RIP-TpAg de carcinogenesis en multiples fases
Para comprender mejor el papel de las terapias anti-VEGF en las diversas fases de crecimiento de los tumores, se recurrio a una serie de modelos de tumores preclinicos, incluyendo el RIP-TpAg. RIP-TpAg (Exelixis, Inc.) es una version condicional de un modelo de tumor de islotes pancreaticos de raton impulsado por la expresion transgenica del antigeno T grande de SV40 (TAg (dirigido a la celula p pancreatica, donde TAg funciona como un potente oncogen mediante la union tanto a p53 como a Rb). RIP-TpAg es fenotipicamente similar al modelo RIP-TAG que se ha descrito previamente (Hanahan, Nature 315:115-122 (1985); Bergers et al, Science 284 (808-811), 1999). Los presentes inventores han encontrado que este modelo progresa a traves de una serie de fases cada vez mas agresivas, incluyendo el activador de la senalizacion de VEGF y un "cambio angiogenico" (es decir, la initiation del proceso de formation de nuevos vasos sanguineos) en aproximadamente 5 semanas. Los tumores pequenos se forman en 10 semanas, coincidiendo con el inicio de su conversion maligna. Los carcinomas grandes invasivos se forman en 12 semanas. Por lo tanto, antes de las 10 semanas de edad, los crecimientos de celulas en los ratones no se consideran malignos ni metastasicos. El periodo entre 10-12 semanas de edad, en general, incluye la formacion de un cancer invasivo.
Para estos experimentos, se alojaron ratones RIP-TpAg y se trataron de acuerdo con las recomendaciones convencionales de la IACUC, los ratones recibieron comida alta en azucar y agua con sacarosa al 5 % para aliviar los sintomas de hiperinsulinemia causados por el aumento de celulas beta secretoras de insulina en el pancreas. A las 9-9,5 u 11-12 semanas de edad, los ratones se trataron dos veces a la semana con una inyeccion intraperitoneal de 5 mg/kg de anticuerpo anti-VEGF o anticuerpo monoclonal de control anti-ambrosia del mismo isotipo en solution salina tamponada con fosfato esteril. En el "ensayo de intervencion'', los ratones de 9-9,5 semanas de edad se trataron durante 14 dias y luego se examinaron. En el "ensayo de regresion", los ratones de 11-12 semanas de edad se examinaron despues de 7, 14 y 21 dias de tratamiento. Para examinar la supervivencia, se trato otra cohorte de
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ratones hasta que los ratones mostraron morbilidad o mortalidad. En cada punto de tiempo definido en los ensayos de intervencion y de regresion, se extirpo el pancreas y el bazo de cada raton, y se fotografiaron. El numero de tumores del pancreas se determino por diseccion de cada tumor esferico y realizando el recuento. Se determino la carga tumoral midiendo los dos diametros mayores de cada tumor, y calculando el volumen mediante el calculo del volumen esferoide (multiplicando x 2 entre y) multiplicado por 0,52. Se sumo el volumen de todos los tumores del pancreas de un raton para determinar la carga tumoral total. Se calcularon las medias y las desviaciones tipicas, y los datos se representaron graficamente usando Microsoft Excel v11.3.3 (Microsoft, Inc.). Las comparaciones estadisticas entre el numero de tumores y la carga tumoral de los diferentes grupos se llevaron a cabo usando la prueba t de Student. Las curvas de Kaplan-Meier para el analisis de la supervivencia se generaron usando JMP 6.0 (SAS Institute, Inc.) y las comparaciones estadisticas llevadas a cabo mediante un analisis de rango logaritmico.
El tratamiento de los animales de 9 semanas de vida (el ensayo de "intervencion") con anticuerpos anti-VEGF dio como resultado una reduccion espectacular de la angiogenesis tumoral (FIGURA 11). El tratamiento de los animales de 11 semanas de vida (el "ensayo de regresion") dio lugar a una disminucion de la vascularizacion y la proliferacion tumoral (FIGURA 12A). Sin embargo, en contraste con el ensayo de intervencion, solo se detecto una reduccion transitoria en el crecimiento tumoral y no hubo efecto sobre la supervivencia (FIGURA 12B). Estos estudios demostraron que estos tumores tempranos son mas sensibles a los agentes terapeuticos dirigidos anti-VEGF en comparacion con los tumores avanzados.
Ejemplo 4. Anti-VEGF y la quimioterapia son eficaces en los modelos preclinicos
La cirugia puede dejar celulas tumorales residuales o nodulos micrometastasicos latentes que tengan el potencial para volver a activar el "programa angiogenico" y facilitar el crecimiento tumoral mas exponencial.
Los presentes inventores han usado tumores geneticos de raton y xenoinjertos humanos para modelizar la latencia de los tumores mediante el uso de potentes regimenes de quimioterapia para "citorreducir" el tumor simultaneamente a o secuencialmente con terapias anti-VEGF, seguidas de terapia de mantenimiento con anticuerpos monoclonales anti-VEGF. Por lo tanto, se esta tratando al raton para prevenir la reaparicion de un tumor, en lugar de perseguir un tumor una vez formado o vuelto a formar, incluyendo, en algunos casos, un tumor que sea refractario, de recaida o resistente a mas tratamientos, incluyendo las terapias anti-VEGF dirigidas. La Figura 13 muestra la observacion de que el docetaxel es muy eficaz en la reduccion de la carga tumoral, pero las celulas latentes vuelven a crecer despues de aproximadamente 2 meses. Sin embargo, el tratamiento concurrente con anti- VEGF suprime el rebrote del tumor, a pesar de que tiene poco impacto por si mismo sobre el crecimiento de los tumores mas grandes y mas establecidos. Datos adicionales demuestran que la terapia anti-VEGF prolongada tambien suprime el rebrote de tumores despues de la citorreduccion con taxanos o gemcitabina. Estos resultados demuestran que se puede usar anti-VEG para bloquear de manera eficaz el crecimiento o rebrote de tumores o micrometastasis latentes. Estos resultados concuerdan con el hecho de que la neovascularizacion es un requisito previo para la expansion clonal rapida asociada con la formacion de tumores macroscopicos, y apoyan el uso de antagonistas especificos del VEGF (por ejemplo, anticuerpos anti-VEGF, incluyendo, pero sin limitacion, los anticuerpos de la serie G6 o B20) en el mantenimiento de la latencia de los tumores y la supresion del rebrote de los tumores despues del tratamiento inicial de los mismos y antes de la formacion de nuevos tumores, de la reactivacion de los tumores latentes, tumores malignos o micrometastasis.
Ejemplo 5. Terapia neoadyuvante con el uso de bevacizumab
El presente ejemplo ilustra el uso de bevacizumab en una terapia neoadyuvante de pacientes con cancer de mama palpable y operable.
La quimioterapia neoadyuvante se ha usado ampliamente en el tratamiento de canceres de mama de gran tamano localmente avanzados o potencialmente operables. Los ensayos aleatorizados han demostrado que la quimioterapia neoadyuvante reduce la necesidad de mastectomia (preservando, por tanto, la mama), con tasas de supervivencia global similares a la quimioterapia adyuvante. Powles et al., J. Clin. Oncol. 13:547-52 (1995); Fisher et al., J. Clin. Oncol. 16:2672-85 (1998).
Los objetivos principales de la presente terapia son proporcionar mejores beneficios clinicos mediante la adicion de bevacizumab a la quimioterapia en pacientes con cancer de mama palpable y operable. En concreto, una de las mediciones principales de la eficacia clinica de la terapia neoadyuvante puede ser las tasas de respuesta completa patologica (pCR). Otras mediciones incluyen las tasas de respuesta global (OR), las tasas de respuesta clinica completa (cCR), la supervivencia libre de enfermedad (SLE) y la supervivencia global (OS). Ademas, se pueden monitorizar los efectos secundarios del tratamiento mediante, por ejemplo, las tasas de complicaciones quirurgicas, la toxicidad y los efectos adversos sobre la funcion cardiaca. La expresion de ciertos genes u otras actividades de biomarcadores tambien se pueden usar como marcadores de la respuesta al tratamiento.
La respuesta completa patologica (pCR) se ha usado como un marcador de pronostico de la eficacia del tratamiento. La pCR se refiere a la falta de evidencia histologica residual de tumor despues de la terapia neoadyuvante en el momento de la cirugia. Los estudios han sugerido que los pacientes que alcanzaron la pCR tienen una
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supervivencia significativamente mejor. Sin embargo, no existe un metodo convencional para la clasificacion de la respuesta patologica, y sigue siendo controvertido el uso de la pCR como marcador de la eficacia.
Los pacientes adecuados para la terapia neoadyuvante con antagonistas especificos del VEGF se seleccionan basandose en criterios y en directrices predeterminadas, que varian dependiendo del tipo de cancer en particular que este en tratamiento. Por ejemplo, los pacientes se pueden seleccionar basandose en su esperanza de vida, edad, histologia del cancer, funciones hematologica/hepatica y cardiaca, historial del tratamiento, estado y planes reproductivos, y los estados psiquiatricos o adictivos; y lo que es mas importante, el tumor primario debe ser medible y/u operable.
Los regimenes de tratamiento incluyen quimioterapia mas antagonista especifico del VEGF, por ejemplo, bevacizumab. Opcionalmente, tambien se pueden usar uno o mas agentes terapeuticos adicionales en el regimen. Por lo general, el regimen de quimioterapia comunmente usado para el tipo de cancer en particular (por ejemplo, regimen terapeutico convencional) se usa en combinacion con bevacizumab. Por ejemplo, para el tratamiento del cancer de mama de manera neoadyuvante, se puede usar un regimen de docetaxel, paclitaxel o doxorubicina/ciclofosfamida (AC) en combinacion con bevacizumab. Como alternativa, el regimen basado en docetaxel o basado en paclitaxel y de AC se puede usar de forma secuencial como quimioterapia combinada con bevacizumab. Para el tratamiento del cancer de pulmon no microcitico, se puede usar cisplatino (ya sea solo o en combinacion con otros agentes quimioterapeuticos tales como gemcitabina, docetaxel o vinorelbina) como agente quimioterapeutico principal en combinacion con bevacizumab. Por otra parte, para el tratamiento del cancer colorrectal, se pueden usar regimenes basados en 5-FU (tales como FOLFOX) en combinacion con bevacizumab.
Los agentes quimioterapeuticos y el antagonista especifico de VEGF, por ejemplo, bevacizumab, se administran a los pacientes a dosis e intervalos indicados, para un numero de ciclos. Por ejemplo, bevacizumab se puede dar a 15 mg/kg cada 3 semanas durante 4 ciclos, o a 10 mg/kg cada dos semanas durante 6 ciclos. En otro ejemplo, el antagonista especifico del VEGF, por ejemplo, bevacizumab, se administra a 7,5 mg/kg una vez cada dos o tres semanas. Los pacientes son monitorizados para determinar la respuesta durante el tratamiento. Tras la finalizacion de la terapia neoadyuvante, los pacientes se someten a cirugia para extirpar el tumor primario, que bien ya era operable antes de la terapia neoadyuvante o se vuelve operable en respuesta a la terapia neoadyuvante. Despues de la cirugia, los pacientes continuan con el tratamiento con antagonista especifico de VEGF, por ejemplo, bevacizumab, con o sin quimioterapia, dependiendo del estado en particular del paciente. Opcionalmente, los pacientes tambien pueden someterse a radioterapia. El progreso del paciente es monitorizado durante todo el tratamiento y despues del tratamiento.
Los acontecimientos adversos (AE) asociados con el tratamiento anti-VEGF tambien se deben monitorizar de cerca y tratar. Los principales AE conocidos a partir de estudios anteriores incluyen hipertension, proteinuria, hemorragia, episodios tromboembolicos, perforacion gastrointestinal/fistula y complicaciones en la cicatrizacion de la herida. Ciertos AE tales como la hipertension pueden controlarse con medicamentos. Si los AE son graves y dificiles de tratar, se debe interrumpir el tratamiento.
Referencia
Ejemplo 6. Terapia adyuvante con el uso de bevacizumab A
El presente ejemplo ilustra el uso de bevacizumab en combinacion con quimioterapia en el tratamiento adyuvante de pacientes con cancer resecado.
Los pacientes adecuados para la terapia adyuvante con bevacizumab se seleccionan basandose en criterios y directrices predeterminadas, que varian dependiendo del tipo de cancer en particular sometido a tratamiento. Por ejemplo, los pacientes se pueden seleccionar basandose en su esperanza de vida, edad, histologia del cancer, funciones hematologica/hepatica y cardiaca, estilo de vida, historial del tratamiento, estado y planes reproductivos, y los estados psiquiatricos o adictivos; y lo que es mas importante, los pacientes deben haber sido sometidos a una reseccion completa de su cancer antes del tratamiento adyuvante. Los tipos aceptados de reseccion dependen de los tipos concretos de los tumores. Tambien, debe haber suficiente material patologico representativo del cancer del paciente disponible para el analisis de la fase inicial y para la determinacion de la eficacia. En el momento del tratamiento, la cirugia debe ser bastante reciente, pero el paciente debe estar completamente recuperado de la cirugia. Por ejemplo, los pacientes deben comenzar el tratamiento adyuvante no menos de 3-6 semanas y no mas de 8-12 semanas despues de la cirugia.
Los regimenes de tratamiento incluyen quimioterapia mas bevacizumab. Opcionalmente, tambien se pueden usar uno o mas agentes terapeuticos adicionales en el regimen. Por lo general, los agentes quimioterapeuticos en combinacion con bevacizumab se usan durante la primera fase del tratamiento, seguidos de bevacizumab como tratamiento de mantenimiento de agente unico para la fase restante. Por ejemplo, los pacientes se tratan con agentes quimioterapeuticos y bevacizumab durante aproximadamente 4 a 12 ciclos, despues solo con bevacizumab hasta de 1 a 2 anos. La duracion de cada ciclo de tratamiento quimioterapeutico + bevacizumab depende de los agentes y de las dosis que se usen en concreto. Por ejemplo, el bevacizumab se puede dar a 15 mg/kg cada 3
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semanas como un ciclo, o a 5 mg/kg cada dos semanas como un ciclo. En otro ejemplo, el bevacizumab se puede dar a 7,5 mg/kg o a 10 mg/kg cada dos o cada tres semanas.
El regimen de quimioterapia comunmente usado para el tipo de cancer en particular (por ejemplo, regimen terapeutico convencional) se usa en combinacion con bevacizumab. Por ejemplo, para la terapia adyuvante del cancer de mama, se puede usar un regimen de docetaxel, paclitaxel o doxorubicina/ciclofosfamida (AC) en combinacion con bevacizumab. Como alternativa, el regimen basado en docetaxel o basado en paclitaxel y de AC se puede usar de forma secuencial como quimioterapia combinada con bevacizumab. Para el tratamiento del cancer de pulmon no microcitico, se puede usar cisplatino (ya sea solo o en combinacion con otros agentes quimioterapeuticos tales como gemcitabina, docetaxel o vinorelbina) como agente quimioterapeutico principal en combinacion con bevacizumab. Por otra parte, para el tratamiento del cancer colorrectal, se pueden usar regimenes basados en 5-FU (tales como FOLFOX) en combinacion con bevacizumab
El objetivo del tratamiento adyuvante con bevacizumab es mejorar la supervivencia del paciente, preferentemente la supervivencia libre de enfermedad. Entretanto, los acontecimientos adversos asociados con bevacizumab se deben monitorizar de cerca, sobre todo porque el tratamiento adyuvante es a largo plazo. La supervivencia se puede estimar mediante el metodo de Kaplan-Meier, y cualquier diferencia en la supervivencia se calcula usando la prueba estratificada de rango logaritmico. Se usa el analisis multivariable usando el modelo de riesgos proporcionales de Cox para estimar los efectos simultaneos de los factores de pronostico sobre la supervivencia. Las interacciones con los factores de pronostico se examinan con el modelo de riesgos proporcionales de Cox. El paquete de software estadistico SAS se usa para todos los calculos. Los datos se consideran estadisticamente significativos cuando el valor de P es de 0,05 o inferior. Todos los ensayos estadisticos son de dos aspectos.
Los acontecimientos adversos (AE) asociados con el tratamiento anti-VEGF se deben monitorizar de cerca y tratar. Los principales AE conocidos a partir de estudios anteriores incluyen hipertension, proteinuria, hemorragia, episodios tromboembolicos, perforacion gastrointestinal/fistula y complicaciones en la cicatrizacion de la herida. Ciertos AE tales como la hipertension pueden controlarse con medicamentos. Si los AE son graves y dificiles de tratar, se debe interrumpir el tratamiento
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Genentech, Inc. et al.
<120> Antagonistas especificos del VEGF para terapia adyuvante y neoadyuvante, y el tratamiento de tumores en fase temprana
<130> 50474/014WO6
<150> US 60/989.397 <151>
<150> US 60/958.384 <151>
<150> US 60/919.638 <151>
<150> US 60/877.267 <151>
<150> US 60/870.745 <151>
<150> US 60/870.741 <151>
<160>5
<170> PatentIn version 3.3
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Claims (12)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un anticuerpo anti-VEGF, o un fragmento de union al antigeno del mismo, para su uso en un metodo de tratamiento, en donde:
    (1) el anticuerpo anti-VEGF o el fragmento de union al antigeno del mismo bloquean la union de VEGF a mas de un receptor de VEGF; y
    (2) el uso es en la reduccion o la prevencion de la aparicion de un cancer benigno, precanceroso o no metastasico en un sujeto con antecedentes familiares de cancer, polipos o sindrome canceroso heredado, en donde el sujeto nunca ha tenido un cancer clinicamente detectable.
  2. 2. El anticuerpo anti-VEGF o el fragmento de union al antigeno del mismo para el uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dicho uso es una monoterapia.
  3. 3. El anticuerpo anti-VEGF o el fragmento de union al antigeno del mismo para el uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el sujeto se monitoriza ademas para determinar la aparicion de dicho cancer.
  4. 4. El anticuerpo anti-VEGF o el fragmento de union al antigeno del mismo para el uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el cancer es un cancer gastrointestinal, colorrectal, de mama, de ovario, de pulmon, glioblastoma o renal.
  5. 5. El anticuerpo anti-VEGF o el fragmento de union al antigeno del mismo para el uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dicho uso comprende ademas el uso de una terapia contra el cancer adicional, en donde la terapia contra el cancer adicional es, opcionalmente, quimioterapia.
  6. 6. El anticuerpo anti-VEGF o el fragmento de union al antigeno del mismo para el uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dicho anticuerpo anti-VEGF es un anticuerpo monoclonal.
  7. 7. El anticuerpo anti-VEGF o el fragmento de union al antigeno del mismo para el uso de acuerdo con la reivindicacion 6, en donde el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo quimerico, humanizado o completamente humano.
  8. 8. El anticuerpo anti-VEGF o el fragmento de union al antigeno del mismo para el uso de acuerdo con la reivindicacion 6, en donde el anticuerpo monoclonal es bevacizumab.
  9. 9. El anticuerpo anti-VEGF o el fragmento de union al antigeno del mismo para el uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dicho anticuerpo anti-VEGF, o un fragmento de union al antigeno del mismo, se unen al mismo epitopo que el anticuerpo monoclonal anti-VEGF A4.6.1.
  10. 10. El anticuerpo anti-VEGF o el fragmento de union al antigeno del mismo para el uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dicho anticuerpo anti-VEGF, o un fragmento de union al antigeno del mismo, se unen a un epitopo funcional en el VEGF humano que comprende los restos F17, M18, D19, Y21, Y25, Q89, 191, K101, E103 y C104 del VEGF humano.
  11. 11. El anticuerpo anti-VEGF o el fragmento de union al antigeno del mismo para el uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dicho anticuerpo anti-VEGF, o un fragmento de union al antigeno del mismo, se unen a un epitopo funcional en el VEGF humano que comprende los restos F17, Y21, Q22, Y25, D63, I83 y Q89 del VEGF humano.
  12. 12. Uso de un anticuerpo anti-VEGF o un fragmento de union al antigeno del mismo en la fabricacion de un medicamento para su uso en un metodo de tratamiento, en donde el anticuerpo o el fragmento de union al antigeno del mismo y el tratamiento son como se han definido en cualquier reivindicacion anterior.
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