DE69232539T3

DE69232539T3 - Verwendung von anti-VEGF Antikörpern zur Behandlung von Krebs

Info

Publication number: DE69232539T3
Application number: DE69232539T
Authority: DE
Inventors: Napoleone Ferrara; Jin Kyung Kim
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1992-10-28
Filing date: 1992-10-28
Publication date: 2007-01-04
Anticipated expiration: 2012-10-29
Also published as: ATE399181T1; CA2145985C; NO321825B1; AU2928992A; ES2278663T3; ES2173873T5; DK0666868T4; HUT70810A; FI951987L; KR950704355A; DK1975181T3; AU687727B2; SK55195A3; EP1975181B1; EP0666868B1; SK285035B6; EP1167384A1; HU225646B1; EP1975181A1; EP0666868B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Vaskular-Endothelzellen-Wachstumsfaktor- (VEGF-) Antagonisten, auf diese Antagonisten umfassende therapeutische Zusammensetzungen und auf Verfahren zur Verwendung der Antagonisten zu diagnostischen und therapeutischen Zwecken.
Hintergrund der Erfindung
Die zwei Hauptkomponenten der Zellen des Gefäßsystems sind Endothel- und Glattmuskelzellen. Die Endothelzellen bilden die Auskleidung der Innenflächen aller Blutgefäße und stellen eine nicht-thrombogene Schnittstelle zwischen Blut und Gewebe dar. Zusätzlich sind Endothelzellen eine wichtige Komponente für die Entwicklung neuer Kapillar- und Blutgefäße. Aus diesem Grund vermehren sich Endothelzellen während der Angiogenese oder Gefäßneubildung, die mit Tumorwachstum und Metastasen in Zusammenhang stehen, sowie einer Vielzahl von nicht-neoplastischen Krankheiten oder Störungen.
Verschiedene in der Natur vorkommende Polypeptide induzieren bekannterweise das Endothelwachstum. Unter diese Polypeptiden finden sich die basischen und sauren Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGF), Burgess und Maciag, Annual Rev. Biochem. 58, 575 (1989), der von Blutplättchen stammende Endothelzellen-Wachstumsfaktor ("platelet derived endothelial cell growth, factor"; PD-ECGF), Ishikawa et al., Nature 338, 557 (1989), und der Vaskular- oder Gefäßendothelzellen-Wachstumsfaktor (VEGF), Leung et al., Science 246, 1306 (1989); Ferrara & Henzel, Biochem. Biophys. Res. Commun. 161, 851 (1989); Tischer et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 165, 1198 (1989); Ferrara et al., PCT Pat. Pub. Nr. WO 90/13649 (veröffentlicht am 15. November 1990).
VEGF wurde das erste Mal in Medien identifiziert, die durch follikulläre oder folliculostellate Rinder-Hypophysenzellen konditioniert wurden. Biochemische Analysen zeigen, dass der Rinder-VEGF ein dimeres Protein mit einem scheinbaren Molekularge wicht von etwa 45.000 Dalton und mit einer offensichtlichen Spezifizität für vaskuläre Endothelzellen ist. Für Rinder-VEGF DNA kodierende DNA wurde isoliert, indem eine cDNA-Bank, die von solchen Zellen hergestellt wurde, unter Verwendung von Oligonucleotiden auf Basis der aminoterminalen Aminosäuresequenz des Proteins als Hybridisierungssonden gescreent wurde.
Human-VEGF wurde erhalten, indem zuerst eine aus menschlichen Zellen angefertigte cDNA-Bank unter Verwendung von VEGF-cDNA von Rindern als Hybridisierungssonde Screening unterzogen wurde. Eine dadurch identifizierte cDNA kodiert für ein 165-Aminosäuren-Protein mit mehr als 95 % Homologie zu Rinder-VEGF, welches Protein als Human-VEGF (hVEGF) bezeichnet wird. Die mitogene Aktivität von Human-VEGF wurde durch die Expression von Human-VEGF-cDNA in Säugetier-Wirtszellen bestätigt. Medien, die durch mit der Human-VEGF-cDNA transfizierten Zellen konditioniert wurden, förderten das Wachstum von Kapillar-Endothelzellen, während Vergleichsproben dies nicht taten. Leung et al., Science 246, 1306 (1989).
Einige zusätzliche cDNAs wurden in Human-cDNA-Banken nachgewiesen, die für 121-, 189- und 206-Aminosäuren-Isoformen des hVEGF (kollektiv auch als hVEGF-bezogene Proteine bezeichnet) kodieren. Das 121-Aminosäuren-Protein unterscheidet sich von hVEGF durch die Deletion der 44 Aminosäuren zwischen den Resten 116 und 159 in hVEGF. Das 189-Aminosäuren-Protein unterscheidet sich von hVEGF durch Insertion von 24 Aminosäuren an Rest 116 in hVEGF und ist offensichtlich identisch mit menschlichem Vaskularpermeabilitätsfaktor (hVPF). Das 206-Aminosäuren-Protein unterscheidet sich von hVEGF durch eine Insertion von 41 Aminosäuren an Rest 116 in hVEGF. Houck et al., Mol. Endocrin. 5, 1806 (1991); Ferrara et al., J. Cell. Biochem. 47, 211 (1991); Ferrara et al., Endocrine Reviews 13, 18 (1992); Keck et al., Science 246, 1309 (1989); Connolly et al., J. Biol. Chem. 264, 20017 (1989); Keck et al., EP-A-0.370.898 (veröffentlicht am 30. Mai 1990).
VEGF stimuliert nicht nur das Wachstum der Gefäßendothelzellen sondern induziert auch Vaskularpermeabilität und Angiogenese. Die Angiogenese, die die Bildung von neuen Blutgefäßen aus bereits existierendem Endothel umfasst, ist eine wichtige Komponente einer Vielzahl von Krankheiten und Störungen, umfassend Tumorwachstum und Metastasen, rheumatische Arthritis, Psoriasis, Atherosklerose, diabetische Retinopathie, retrolentale Fibroplasie, neovaskuläres Glaukom, Hämangiom, Immunabstoßung von transplantiertem Hornhautgewebe und anderen Geweben sowie chronischen Entzündungen.
Im Fall von Tumorwachstum scheint die Angiogenese von großer Wichtigkeit für den Übergang von Hyperplasie zu Neoplasie zu sein, sowie für die Bereitstellung von Nahrung für den wachsenden massiven Tumor. Folkman et al., Nature 339, 58 (1989). Die Angiogenese erlaubt Tumoren auch, in Kontakt mit dem Gefäßbett des Wirts zu treten, was eine Route für die Metastasenbildung von Tumorzellen bilden kann. Beweise für die Rolle der Angiogenese in Tumormetastasen wird z.B. durch Studien geliefert, die eine Korrelation zwischen der Anzahl und Dichte von Mikroblutgefäßen in histologischen Schnitten invasiver Brustkarzinome und tatsächlichem Vorliegen von entfernten Metastasen zeigt. Weidner et al., New Engl. J. Med. 324, 1 (1991).
Hinsichtlich der Rolle von Endothelwachstum und Angiogenese sowie der Rolle dieser Prozesse in vielen Krankheiten und Störungen wird gewünscht, ein Mittel zur Reduzierung oder Hemmung einer oder mehrerer biologischer Effekte von VEGF zur Verfügung zu haben. Es ist auch wünschenswert, über eine Analyse betreffend die Gegenwart von VEGF unter normalen und pathologischen Bedingungen, und im Speziellen bei Krebs, zu verfügen.
Zusammenfassung der Erfindung
In einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung wie in den Ansprüchen definiert die Verwendung eines hVEGF-Antagonisten, der ein Anti-VEGF-Antikörper ist, zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Krebs bereit. Die Antagonisten hemmen die mitogene biologische Aktivität von hVEGF und sind somit für die Behandlung von Krebs zweckdienlich, umfassend z.B. Tumoren, und im Speziellen massive bösartige Tumoren.
In einem weiteren Aspekt sind die VEGF-Antagonisten mit einer zytotoxischen Einheit verbunden.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Wirkung von monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörpern (A4.6.1 oder B2.6.2) oder eines irrelevanten Anti-Hepatozyten-Wachstumsfaktor-Antikörpers (Anti-HGF) auf die Bindung der monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörper an hVEGF.
2 zeigt die Wirkung von monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörpern (A4.6.1 oder B2.6.2) oder eines irrelevanten Anti-HGF-Antikörpers auf die biologische Aktivität von hVEGF in Kulturen von Kapillarendothelzellen der Adrenalcortex (ACE) von Rindern.
3 zeigt die Wirkung von monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörpern (A4.6.1, B2.6.2 oder A2.6.1) auf die Bindung von hVEGF an ACE-Zellen von Rindern.
4 zeigt die Wirkung einer Behandlung mit monoklonalen A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörpern auf die Wachstumsrate von NEG55-Tumoren in Mäusen.
5 zeigt die Wirkung einer Behandlung mit monoklonalen A4.6.1 Anti-hVEGF-Antikörpern auf die Größe von NEG55-Tumoren in Mäusen nach einer fünfwöchigen Behandlung.
6 zeigt die Wirkung einer Behandlung mit monoklonalen A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörpern (VEGF-Ab) auf das Wachstum von SK-LMS1-Tumoren in Mäusen.
7 zeigt die Wirkung unterschiedlicher Dosierungen einer Behandlung mit monoklonalen A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörpern (VEGF-Ab) auf das Wachstum von A673-Tumoren in Mäusen.
8 zeigt die Wirkung von monoklonalen A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörpern auf Wachstum und Überleben von NEG55- (G55-) Glioblastom-Zellen in Kultur.
9 zeigt die Wirkung von monoklonalen A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörpern auf Wachstum und Überleben von A673-Rhabdomyosarkom-Zellen in Kultur.
10 zeigt die Wirkung von monoklonalen A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörpern auf Human-Synovialflüssigkeit-induzierte Chemotaxis menschlicher Endothelzellen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Der Terminus "hVEGF", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf den menschlichen, aus 165 Aminosäuren bestehenden Vaskularendothelzellen-Wachstumsfaktor und auf verwandte menschliche 121, 189. und 206 Aminosäuren umfassende Vaskularendothelzellen-Wachstumsfaktoren, wie sie von Leung et al., Science 246, 1306 (1989); und Houck et al., Mol. Endocrin. 5, 1806 (1991), beschrieben wurden, gemeinsam mit den in der Natur vorkommende Allel- und verarbeitete Formen dieser Wachstumsfaktoren.
Die vorliegende Erfindung stellt hVEGF-Antagonisten bereit, die zur Hemmung der mitogenen biologischen Aktivität von hVEGF fähig sind. Somit liegt im Umfang dieser Erfindung die Verwendung von monoklonalen Antikörpern oder Fragmenten davon, die sich an hVEGF oder einen Komplex, der hVEGF in Verbindung mit einem hVEGF-Rezeptor umfasst, binden.
Der Terminus "hVEGF-Rezeptor" oder "hVEGFr", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf einen Zellrezeptor für hVEGF, gewöhnlicherweise einen Zelloberflächen-Rezeptor auf Vaskularendothelzellen sowie Varianten davon, die die Fähigkeit der hVEGF-Bindung beibehalten. Typischerweise findet man hVEGF-Rezeptoren und Varianten davon, die hVEGF-Antagonisten sind, in isolierter Form und nicht in eine Zellmembran integriert oder an eine Zelloberfläche gebunden, wie dies in der Natur der Fall ist. Ein Beispiel für einen hVEGF-Rezeptor ist die fms-ähnliche Tyrosin-Kinase (flt), ein Transmembran-Rezeptor der Familie der Tyrosin-Kinasen. De-Vries et al., Science 255, 989 (1992); Shibuya et al., Oncogene 5, 519 (1990). Der flt-Rezeptor umfasst eine extrazelluläre Domäne, eine Transmembran-Domäne und eine intrazelluläre Domäne mit Tyrosin-Kinase-Aktvität. Die extrazelluläre Domäne spielt bei der Bindung des hVEGF eine Rolle, während die intrazelluläre Domäne für die Signalumwandlung verantwortlich zeichnet.
Ein weiteres Beispiel für einen hVEGF-Rezeptor ist der flk-1-Rezeptor (auch als KDR bezeichnet). Matthews et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 88, 9026 (1991); Terman et al., Oncogene 6, 1677 (1991); Terman et al., Biophys. Res. Commun. 187, 1579 (1992).
Die Bindung von hVEGF an den flt-Rezeptor führt zur Bildung von zumindest zwei Komplexen mit hohem Molekulargewicht, welche ein scheinbares Molekulargewicht von 205.000 und 300.000 Dalton aufweisen. Man nimmt an, dass der Komplex mit 300.000 Dalton ein Dimer ist, das zwei Rezeptormoleküle, die an einzelnes hVEGF-Molekül gebunden sind, umfasst.
hVEGFr und Varianten davon sind auch für Screening-Untersuchungen zur Identifizierung von Agonisten und Antagonisten von hVEGF nützlich. So überexprimieren z.B. Wirtszellen, die mit für hVEGFr (z.B. flt oder flk1) kodierender DNA transfiziert wurden, das Rezeptor-Polypeptid auf der Zelloberfläche, wodurch solche rekombinanten Wirtszellen für die Analyse der Fähigkeit einer Testverbindung (z.B. kleiner Moleküle, linearer oder zyklischer Peptide oder Polypeptide), an hVEGFr zu binden, besonders gut geeignet sind. hVEGFr und hVEGFr-Fusionsproteine, wie z.B. ein hVEGFr-IgG-Fusionsprotein, können in ähnlicher Weise verwendet werden. So wird z.B. das Fusionsprotein an einen immobilisierten Träger gebunden, und die Fähigkeit einer Testverbindung, einen radiomarkierten hVEGF von der hVEGFr-Domäne des Fusionsproteins zu verdrängen, wird bestimmt.
Der Terminus "rekombinant", bezogen auf hVEGF, hVEGF-Rezeptor, monoklonale Antikörper oder andere Proteine verwendet, bezieht sich auf Proteine, die durch rekombinante DNA-Expression in einer Wirtszelle produziert werden. Die Wirtszelle kann prokaryotisch (z.B. eine Bakterienzelle wie etwa E. coli) oder eukaryotisch (z.B. ein Hefepilz oder eine Säugetier-Zelle) sein.
Monoklonale Antagonist-Antikörper
Der hierin verwendete Begriff "monoklonaler Antikörper" bezieht sich auf einen Antikörper, der aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern erhalten wird, d.h. die individuellen Antikörper, die die Population umfasst, sind in Spezifität und Affinität identisch, mit Ausnahme von natürlich auftretenden Mutationen, die in geringem Ausmaß vorhanden sein können. Es versteht sich, dass als Resultat solcher natürlich auftretender Mutationen und dergleichen eine monoklonale Antikörperzusammensetzung der Erfindung, die vorherrschend Antikörper enthält, die zu spezifischer Bindung an hVEGF oder einen mit hVEGFr assoziierten hVEGF-Komplex ("hVEGF-hVEGFr-Komplex") fähig sind, weiters auch geringe Mengen anderer Antikörper enthalten können.
Somit bezeichnet das Adjektiv "monoklonal" den Charakter des Antikörpers, der aus einer im Wesentlichen homogenen Population von Antikörpern erhalten wird, und ist nicht so zu verstehen, dass dies die Produktion von Antikörpern nach einem bestimmten Verfahren erfordert. So können beispielsweise monoklonale Antikörper der Erfindung unter Verwendung des Hybridom-Verfahrens, das erstmals von Kohler & Milstein, Nature 256, 495 (1975) beschrieben wurde, oder durch DNA-Rekombinations-Verfahren hergestellt werden. Cabilly et al., US-Patent Nr. 4.816.567.
Im Hybridom-Verfahren wird eine Maus oder ein anderer geeigneter Wirt mit Antigen subkutan, intraperitoneal oder intramuskulär immunisiert, um Lymphozyten zu induzieren, die Antikörper produzieren oder produzieren können, die sich spezifisch an das/die zur Immunisierung verwendete(n) Proteine) binden. Alternativ dazu können Lymphozyten in vitro immunisiert werden. Lymphozyten werden daraufhin mit Mye lom-Zellen fusioniert, indem ein geeignetes Fusionsmittel, wie z.B. Polyethylenglykol, verwendet wird, um eine Hybridom-Zelle zu bilden. Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice", 59-103 (Academic Press, 1986).
Das Antigen kann ein hVEGF oder ein hVEGF-hVEGFr-Komplex sein. Das Antigen ist gegebenenfalls ein Fragment oder ein Teil eines hVEGF, wobei ein oder mehrere Aminosäuren-Reste an der Bindung von hVEGF an einen seiner Rezeptoren beteiligt sind.
Monoklonale Antikörper, die zur Bindung eines hVEGF-hVEGFr-Komplexes fähig sind, sind zweckdienlich.
Die auf diese Weise hergestellten Hybridom-Zellen werden in einem geeigneten Kulturmedium gesät und gezüchtet, das vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum und Überleben der nicht fusionierten Myelom-Stammzellen hemmen. Wenn der Myelom-Stammzelle beispielsweise das Enzym Hypoxanthinguanin-phosphoribosyl-Transferase (HGPRT oder HPRT) fehlt, umfasst das Kulturmedium für die Hybridome typischerweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT-Medium), welche Substanzen das Wachstum jener Zellen verhindern, denen HGPRT fehlt.
Bevorzugte Myelom-Zellen sind jene, die effizient fusionieren, stabile, starke Expression des Antikörpers durch die ausgewählten Antikörper-produzierenden Zellen unterstützen und gegenüber einem Medium, wie z.B. dem HAT-Medium, empfindlich sind. Bevorzugte Myelom-Zelllinien davon sind Murin-Myelom-Linien, wie z.B. jene, die von MOPC-21- und MPC-11-Mäusetumoren stammen, welche vom Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornien, USA, erhältlich sind, SP-2-Zellen, die von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, erhältlich sind, und P3X63Ag8U.1-Zellen, die von Yelton et al. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81, 1 (1978), beschrieben wurden. Menschliche Myelom-Zelllinien und Mäuse-Mensch-Heteromyelom-Zelllinien wurden auch für die Herstellung von menschlichen monoklonalen Antikörpern beschrieben. Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984). Bro deur et al., "Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications", 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987).
Ein Kulturmedium, in welchem sich Hybridom-Zellen vermehren, wird für die Produktion von monoklonalen Antikörpern, die gegen das Antigen gerichtet sind, getestet. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifizität von durch Hybridom-Zellen produzierten monoklonalen Antikörpern mittels Immunfällung oder durch einen in-vitro-Bindungstest, wie z.B. einen Radioimmunotest (RIA) oder enzymgebundenen Immunosorptionstest (ELISA), bestimmt. Die monoklonalen Antikörper der Erfindung sind jene, die vorzugsweise hVEGF oder einen hVEGF-hVEGFr-Komplex immunfällen und welche die mitogene Aktivität von hVEGF hemmen.
Nachdem Hybridom-Zellen, die Antagonist-Antikörper der gewünschten Spezifität, Affinität und Aktivität produzieren, identifiziert wurden, können die Klone mittels Grenzverdünnungsverfahren subkloniert und in Standardverfahren gezüchtet werden. Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice", 59-104 (Academic Press, 1986). Geeignete Kulturmedien für diese Zwecke umfassen z.B. Dulbecco's Modified Eagle Medium oder das RPMI-1640-Medium. Weiters können die Hybridom-Zellen auch in vivo als Asziten-Tumoren in Tieren gezüchtet werden.
Die monoklonalen Antikörper, die von den Subklonen abgesondert werden, werden geeigneterweise mittels konventioneller Immunglobulin-Reinigungsverfahren, wie z.B. Protein-A-Sepharose, Hydroxylapatit-Chromatographie, Gel-Elektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie, aus Kulturmedium, Aszites-Flüssigkeit oder Serum abgetrennt.
DNA, die für die monoklonalen Antikörper der Erfindung kodiert, wird leicht in konventionellen Verfahren (z.B. durch die Verwendung von Oligonucleotid-Sonden, die fähig sind, spezifisch an Gene zu binden, die für die schweren und leichten Ketten der Murin-Antikörper kodieren) isoliert und sequenziert. Die Hybridom-Zellen der Erfindung dienen als bevorzugte Quelle solcher DNA. Ist sie isoliert, kann die DNA in Expressionsvektoren eingesetzt werden, welche danach in Wirtszellen, wie z.B. Si mian-COS-Zellen, Zellen aus Eierstöcken chinesischer Hamster (CHO-Zellen) oder Myelom-Zellen, die sonst kein Immunglobulin-Protein produzieren, transfiziert werden, um die Synthese von monoklonalen Antikörpern in den rekombinanten Wirtszellen zu bewirken.
Die DNA kann gegebenenfalls modifiziert werden, um die Eigenschaften des durch Expression erzeugten Immunglobulins zu ändern. So werden z.B. humanisierte Formen von Murin-Antikörpern produziert, indem eine Komplementarität-bestimmende Domäne (CDR) der variablen Domäne des Murin-Antikörpers durch die entsprechende Domäne eines menschlichen Antikörpers ersetzt wird. In einigen Ausführungsformen werden auch ausgewählte Rahmendomänen- (FR-) Aminosäurenreste des Murin-Antikörpers ebenfalls durch entsprechende Aminosäurenreste im menschlichen Antikörper ersetzt. Carter et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 89, 4285 (1992); Carter et al., BioTechnology 10, 163 (1992). Chimäre Formen von Murin-Antikörpern werden auch produziert, indem in den Kodierungssequenzen ausgewählte, menschliche, schwere und leichte Konstantkettendomänen anstelle der homologen Murin-Sequenzen ersetzt werden. Cabilly et al., US-Pat. Nr. 4.816.567; Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81, 6851 (1984).
Die im Schutzumfang der Erfindung liegenden Antikörper umfassen verschiedene Antikörper, wie z.B. chimäre (einschließlich "humanisierte") Antikörper und Hybrid-Antikörper, umfassend Immunglobulin-Ketten, die zur Bindung von hVEGF oder hVEGF-hVEGFr-Komplexen und einem nicht-hVEGF-Epitop fähig sind.
Die Antikörper hierin umfassen alle ursprünglichen Arten von Ursprüngen und Immunglobulin-Klassen (z.B. IgA, IgD, IgE und IgM) und -Subklassen sowie Antikörperfragmente (z.B. Fab, F(ab')₂ und Fv), solange diese hVEGF oder einen hVEGF-hVEGFr-Komplex binden und die mitogene biologische Aktivität des hVEGF antagonisieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist der monoklonale Antikörper Affinität für das zu immunisierende Antigen von zumindest etwa 10⁹ Liter/Mol auf, wie dies z.B. durch die Scatchard-Analyse von Munson & Polland, Anal. Biochem. 107, 220 (1980), bestimmt wird. Auch hemmt der monoklonale Antikörper typischerweise die mitogene Aktivität von hVEGF zu zumindest etwa 50 %, vorzugsweise mehr als 80 % und insbesondere mehr als 90 %, wie dies z.B. durch einen Überlebens- oder Wachstumstest von Zellen in vitro, wie in Beispiel 2 beschrieben, bestimmt wird.
Konjugate mit zytotoxischen Einheiten
In einigen Ausführungsformen ist es wünschenswert, eine zytotoxische Einheit, die mit einem hVEGF-spezifischen monoklonalen Antikörper konjugiert ist, bereitzustellen. In diesen Ausführungsformen dient das Zytotoxin dazu, Zellen, die hVEGF exprimieren oder binden, zu inaktivieren oder abzutöten. Das Konjugat wird durch die Domäne, welche zur Bindung an hVEGF oder einen hVEGF-hVEGFr-Komplex fähig ist, auf die Zelle abgezielt. Somit werden monoklonale Antikörper, die zur Bindung von hVEGF oder des hVEGF-hVEGFr-Komplexes fähig sind, mit Zytotoxinen konjugiert.
Typischerweise ist das Zytotoxin ein Protein-Zytotoxin, d.h. ein Diphtherie-, Rhizin- oder Pseudomonas-Toxin, obwohl im Fall gewisser Klassen von Immunglobulinen die Fc-Domäne des monoklonalen Antikörpers selbst dazu dienen kann, das Zytotoxin (z.B. im Fall von IgG2-Antikörpern, welche zur Komplement-Fixierung fähig sind und an der Antikörper-abhängigen Zellzytotoxizität (ADCC) beteiligt sind), bereitzustellen. Jedoch muss das Zytotoxin nicht proteinartig sein und kann auch chemotherapeutische Mittel umfassen, die z.B. für die Behandlung von Tumoren angewendet werden.
Das Zytotoxin ist typischerweise mit einem monoklonalen Antikörper oder einem Fragment davon durch eine Hauptketten-Amidbindung innerhalb der (oder anstelle eines Teils der oder anstelle der gesamten) Fc-Domäne des Antikörpers verbunden.
Konjugate, die Proteinfusionen sind, können leicht in rekombinanten Zellkulturen durch Expression eines für das Konjugat kodierten Gens hergestellt werden. Alternativ dazu werden Konjugate durch kovalente Vernetzung der zytotoxischen Einheit mit einer Aminosäurerest-Seitenkette oder mit einem C-terminalen Carboxyl des Antikörpers oder des Rezeptors hergestellt, wobei Verfahren, die etwa als Disulfid-Austausch oder Anbindung über eine Thioester-Bindung bekannt sind, angewandt werden, indem z.B. Iminothiolat und Methyl-4-mercaptobutyrimadat verwendet werden.
Konjugate mit anderen Einheiten
Die monoklonalen Antikörper, die Antagonisten der mitogenen Aktivität von hVEGF sind, werden auch mit Substanzen konjugiert, die als solche nicht unbedingt sofort als Zytotoxine zu klassifizieren sind, welche aber die Aktivität der Zusammensetzungen darin erhöhen können. So werden beispielsweise monoklonale Antikörper, die zur Bindung an hVEGF oder den hVEGF-hVEGFr-Komplex fähig sind, mit heterologen Polypeptiden, wie z.B. Virussequenzen, mit Zellrezeptoren, mit Zytokinen, wie z.B. TNF, Interferonen oder Interleukinen, mit Polypeptiden mit prokoagulierender Aktivität und mit anderen biologisch oder immunologisch aktiven Polypeptiden fusioniert. Solche Fusionen sind leicht durch Rekombinationsverfahren herzustellen. Typischerweise werden solche Nicht-Immunglobulin-Polypeptide anstelle der konstanten Domäne(n) eines Anti-hVEGF- oder Anti-hVEGF-hVEGFr-Komplex-Antikörpers ersetzt. Alternativ dazu werden sie für eine variable Domäne einer Antigen-binden- den Stelle eines Anti-hVEGF-Antikörpers, wie hierin beschrieben, getauscht.
In bevorzugten Ausführungsformen werden solche Nicht-Immunglobulin-Polypeptide mit der konstanten Domäne des hierin beschriebenen Antikörpers verbunden oder ersetzen diese. Bennett et al., J. Biol. Chem. 266, 23060-23067 (1991). Als Alternative werden sie anstelle des Fv eines hierin angeführten Antikörpers ersetzt, um einen chimären mehrwertigen Antikörper zu produzieren, der zumindest eine verbleibende Antigen-bindende Stelle mit einer Spezifizität für hVEGF oder einen hVEGF-hVEGFr-Komplex umfasst, sowie eine Bindungsstelle für das Surrogat-Antigen mit einer Funktion oder Spezifizität, die deutlich von jener des Ausgangsantikörpers unterscheidbar ist.
Heterospezifische Antikörper
Monoklonale Antikörper, die fähig sind, hVEGF oder einen hVEGF-hVEGFr-Komplex zu binden, brauchen nur eine einzige Bindungsstelle für spezifizierte Epitope zu enthalten, typischerweise einen einzelnen Komplex aus schwerer und leichter Kette oder ein Fragment davon. Solche Antikörper können gegebenenfalls auch Antigenbindende Domänen tragen, die zur Bindung eines Epitops fähig sind, das in hVEGF oder dem hVEGF-hVEGFr-Komplex nicht vorkommt. So erzeugt beispielsweise das Austauschen der entsprechenden Aminosäuresequenz oder der Aminosäurereste eines nativen Anti-hVEGF- oder Anti-hVEGF-hVEGFr-Komplex-Antikörpers mit den Komplementaritäts-bestimmenden und – falls erforderlich – Rahmen-Resten eines Antikörpers mit einer anderen Spezifizität als für hVEGF oder den hVEGF-hVEGFr-Komplex einen polyspezifischen Antikörper, welcher eine Antigen-bindende Stelle mit Spezifizität für das hVEGF- oder hVEGF-hVEGFr-Komplex-Antigen umfasst sowie eine andere Antigen-bindende Stelle für das Nicht-hVEGF- oder -hVEGF-hVEGFr-Komplex-Antigen. Diese Antikörper sind zumindest zweiwertig, können aber auch mehrwertig sein, was von der Anzahl an Antigen-bindenden Stellen abhängt, die die jeweilige Antikörperklasse besitzt. So sind z.B. Antikörper der IgM-Klasse mehrwertig.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung sind solche Antikörper fähig, ein hVEGF-Epitop und entweder (a) ein Polypeptid, das in der Blutgerinnung aktiv ist, wie z.B. Protein C oder Gewebefaktor, (b) ein zytotoxisches Protein, wie z.B. Tumornekrosefaktor (TNF), oder (c) einen Nicht-hVEGFr-Zelloberflächen-Rezeptor, wie z.B. den CD4- oder HER2-Rezeptor (Maddon et al., Cell 42, 93 (1985); Coussens et al., Science 230, 1137 (1985)) binden. Heterospezifische mehrwertige Antikörper werden zweckdienlicherweise durch Co-Transformation einer Wirtszelle mit DNA, die für die schweren und leichten Ketten beider Antikörper kodiert, und durch nachfolgende Regenerierung mittels Immunoaffinität-Chromatographie oder dergleichen des Anteils der exprimierten Antikörper, der die gewünschten Antigen-bindenden Eigenschaften aufweist, hergestellt. Als Alternative können solche Antikörper auch durch in vitro-Rekombination von monospezifischen Antikörpern hergestellt werden.
Einwertige Antikörper
Einwertige Antikörper, die zur Bindung an den hVEGF-hVEGFr-Komplexes fähig sind, sind als Antagonisten von hVEGF besonders nützlich. Ohne die Erfindung auf einen bestimmten Mechanismus einer biologischen Aktivität zu beschränken, nimmt man an, das die Aktivierung von hVEGF-Zellrezeptoren über einen Mechanismus abläuft, in welchem die Bindung von hVEGF an hVEGF-Zellrezeptoren die Aggregation von Rezeptoren induziert und ihrerseits die intrazelluläre Rezeptor-Kinaseaktivität aktiviert.
Verfahren zur Herstellung von einwertigen Antikörpern sind auf dem Gebiet allgemein bekannt. So umfasst beispielsweise ein Verfahren die rekombinante Expression einer leichten Immunglobulin-Kette und einer modifizierten schweren Kette. Die schwere Kette wird im Allgemeinen an einer beliebigen Stelle in der Fc-Domäne so trunkiert, dass eine Vernetzung der schweren Kette verhindert wird. Alternativ dazu werden die relevanten Cystein-Reste durch andere Aminosäurenreste ausgetauscht oder werden deletiert, um auf diese Weise eine Vernetzung zu verhindern. In vitro-Verfahren sind ebenfalls zur Herstellung einwertiger Antikörper geeignet. So werden z.B. Fab-Fragmente durch enzymatische Spaltung intakter Antikörper erzeugt.
Therapeutische Anwendungen
Für therapeutische Anwendungen werden die Antagonisten der Erfindung einem Säugetier, vorzugsweise einem Menschen, in einer pharmazeutisch annehmbaren Dosierungsform verabreicht, umfassend jene, welche einem Menschen intravenös als Bolus oder durch kontinuierliche Infusion über eine Zeitspanne intramuskulär, intraperitoneal, intra-cerebrospinal, subkutan, intraartikulär, intrasynovial, intrathekal, oral, topisch oder durch Inhalation verabreicht werden. Die Antagonisten können geeigneterweise auch intratumoral, peritumoral, intralesional oder perilesional verabreicht werden, so dass sowohl örtliche wie auch systemische Therapieeffekte erzielt werden. Eine intraperitoneale Verabreichung ist erwartungsgemäß beispielsweise besonders bei der Behandlung von Eierstocktumoren nützlich.
Solche Dosierungsformen umfassen pharmazeutisch annehmbare Träger, die also solche nicht-toxisch und nicht-therapeutisch sind. Beispiele für solche Träger umfassen Ionenaustauscher, Aluminiumoxid, Aluminiumstearat, Lecithin, Serumproteine, wie z.B. Human-Serumalbumin, Puffersubstanzen, wie z.B. Phosphate, Glycin, Sorbinsäure, Kaliumsorbat, Gemische partieller Glyceride von gesättigten pflanzlichen Fettsäuren, Wasser, Salze oder Elektrolyte, wie z.B. Protaminsulfat, Dinatriumhydrogenphosphat, Kaliumhydrogenphosphat, Natriumchlorid, Zinksalze, kolloidale Kieselsäure, Magnesiumtrisilikat, Polyvinylpyrrolidon, Substanzen auf Cellulosebasis und Polyethylenglykol. Träger für topische oder auf Gel basierende Formen von Antagonisten umfassen Polysaccharide, wie z.B. Natriumcarboxymethylcellulose oder Methylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Polyacrylate, Polymere mit Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blöcken, Polyethylenglykol und Holzwachsalkohole. Für alle Verabreichungen werden geeigneterweise konventionelle Depotformen verwendet. Solche Formen umfassen z.B. Mikrokapseln, Nanokapseln, Liposome, Pflaster, Inhalationsformen, Nasensprays, sublinguale Tabletten und Medikamente mit Langzeitwirkung. Der Antagonist ist typischerweise in solchen Arzneiträgern in einer Konzentration von etwa 0,1 mg/ml bis 100 mg/ml formuliert.
Geeignete Beispiele für Retard-Präparate umfassen semipermeable Matrizen aus festen, hydrophoben Polymeren, die den Antagonisten enthalten, wobei die Matrizen in Form von geformten Produkten, wie z.B. Filmen oder Mikrokapseln, ausgebildet sind. Beispiele für Retard-Matrizen umfassen Polyester, Hydrogele (z.B. Poly(2-hydroxyethylmethacrylat)), wie von Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15, 167 (1981); und Langer, Chem. Tech. 12, 98-105 (1982), beschrieben, oder Poly(vinylalkohol), Polylactide (US-Patent Nr. 3.773.919), Copolymere von L-Glutaminsäure mit γ-Ethyl-L-glutamat (Sidman et al., Biopolymers 22, 547 (1983)), nicht-abbaubares Ethylenvinylacetat (Langer et al., s.o.), abbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere, wie z.B. Lupron Depot^TM (injizierbare Mikrokügelchen, die sich aus Milchsäure-Glykolsäure-Copolymeren und Leuprolidacetat zusammensetzen), und Poly-D-(-)-3-hydroxybuttersäure. Während Polymere wie Ethylen-Vinylacetat und Milchsäure-Glykolsäure die Freisetzung von Molekülen für mehr als 100 Tage ermöglichen, setzen gewisse Hydrogele Proteine in kürzerer Zeit frei. Wenn verkapselte Polypeptid-Antagonisten für längere Zeit im Körper verbleiben, können sie als ein Resultat dessen, dass sie bei 37 °C Feuchtigkeit ausgesetzt sind, denaturieren oder aggregieren, was zu einem Verlust biologischer Aktivität und möglichen Änderungen in der Immunitätsbildung führt. Rationale Strategien zur Stabilisierung können abhängig vom beteiligten Mechanismus ausgearbeitet werden. Wenn beispielsweise entdeckt wird, dass der Aggregationsmechanismus die Bildung einer intermolekularen S-S-Bindung durch Thio-Disulfid-Austausch ist, kann eine Stabilisierung dadurch erzielt werden, dass Sulfhydryl-Reste modifiziert, aus sauren Lösungen gefriertrocknet, der Feuchtigkeitsgehalt gesteuert, geeignete Additive verwendet und spezifische Polymermatrix-Zusammensetzungen entwickelt werden.
Retard-Zusammensetzungen von hVEGF-Antagonisten mit Langzeitwirkung umfassen auch in Liposomen eingeschlossene Antagonist-Antikörper. Liposome, die die Antagonisten enthalten, werden nach Verfahren hergestellt, die in der Technik allgemein bekannt sind und etwa von Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030 (1980); US-Patent Nr. 4.485.045; und US-Patent Nr. 4.544.545 beschrieben wurden. Gewöhnlich sind Liposome klein (etwa 200-800 Ångström) und unilamellar, wobei der Lipidgehalt über etwa 30 Mol- % Cholesterol liegt und der ausgewählte Abschnitt für die optimale HRG-Therapie angepasst wird. Liposome mit einer verbesserten Zirkulationszeit werden im US-Patent Nr. 5.013.556 offenbart.
Eine weitere Anwendung der vorliegenden Erfindung umfasst die Miteinbeziehung eines hVEGF-Antagonisten in geformte Produkte. Solche Produkte können zur Modulierung der Vermehrung und der Angiogenese von Endothelzellen verwendet wer den. Zusätzlich können Tumorinvasion und Metastasen mit diesen Produkten moduliert werden.
Bei der Behandlung von Krebs hängt die geeignete Dosierung des Antagonisten von der Art der zu behandelnden Krankheit, wie oben definiert, der Schwere und dem Verlauf der Krankheit, davon, ob die Antikörper für therapeutische Zwecke verabreicht werden, von der vorangegangenen Therapie, der Krankengeschichte und der Reaktion des Patienten auf den Antagonisten, sowie vom Ermessen des behandelnden Arztes ab. Der Antagonist wird geeigneterweise dem Patienten auf einmal oder über eine Reihe von Behandlungen verabreicht.
Die hVEGF-Antagonisten sind in der Behandlung von verschiedenen neoplastischen und Krankheiten und Störungen nützlich. Neoplasmen und verwandte Zustände, die für eine Behandlung zugänglich sind, umfassen Brustkarzinome, Lungenkarzinome, Magenkarzinome, Speisenröhrenkarzinome, Kolorektalkarzinome, Leberkarzinome, Eierstockkarzinome, Thekazellentumore, Arrhenoblastom, Gebärmutterhalskarzinome, endometriale Karzinome, endometriale Hyperplasie, Endometriose, Fibrosarkome, Chorionepitheliom, Kopf- und Halskrebs, Nasenkarzinome, Kehlkopfkarzinome, Hepatoblastom, Kaposi-Sarkom, Melanome, Hautkarzinome, Hämangiom, Hämangioblastom, Bauchspeicheldrüsenkarzinome, Retinoblastom, Astrozytom, Glioblastom, Schwannom, Oligodendroglia, Medulloblastom, Neuroblastom, Rhabdomyosarkom, osteogenes Sarkom, Leiomyosarkom, Harnleiterkarzinome, Schilddrüsenkarzinome, Wilms-Tumor, Renalzellenkarzinome, Prostatakarzinome, abnormale vaskuläre Vermehrung in Zusammenhang mit Phakomatose, Ödeme (solche, die in Zusammenhang mit Gehirntumoren stehen) und das Meigs-Syndrom.
Je nach Art und Schwere der Krankheit werden etwa 1 μg/kg bis 15 mg/kg des Antagonisten in einer anfänglichen Dosierung dem Patienten verabreicht, entweder z.B. durch eine oder mehrere getrennte Verabreichungen oder durch eine kontinuierliche Infusion. Eine typische Tagesdosis kann im Bereich von etwa 1 μg/kg bis 100 mg/kg oder darüber liegen, abhängig von den oben erwähnten Faktoren. Für eine wiederholte Verabreichung über einen Zeitraum von mehreren Tagen oder länger, abhän gig von der Affektion, wird die Behandlung wiederholt, bis die gewünschte Unterdrü- ckung der Krankheitssymptome auftritt. Alerdings können auch andere Dosierungsformen zweckdienlich sein. Der Fortschritt dieser Therapie kann leicht durch konventionelle Techniken und Tests überwacht werden, darunter z.B. durch die radiographische Tumorabbildung.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann die Wirksamkeit des Antagonisten bei der Behandlung von Krebs verbessert werden, indem der Antagonist seriell oder in- Kombination mit einem anderen Mittel, das für diesen Zweck wirksam ist, verabreicht wird, wie z.B. einem Tumornekrosefaktor (TNF), einem Antikörper, der zur Hemmung oder Neutralisierung der Angiogenese-Aktivität des sauren oder basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors (FGF) oder des Hepatozyten-Wachstumsfaktors (HGF) fähig ist, einem Antikörper, der zur Hemmung oder Neutralisierung von Koagulationsaktivität von Gewebefaktor, Protein C oder Protein S (siehe Esmon et al., PCT-Patentveröffentlichung WO 91/01753, veröffentlicht am 21. Februar 1991) fähig ist, oder einem oder mehreren therapeutischen Mitteln, wie z.B. Alkylierungsmitteln, Folsäure-Antagonisten, Anti-Metaboliten des Nukleinsäuremetabolismus, Antibiotika, Pyrimidin-Analogen, 5-Fluoruracil, Purinnukleoside, Aminen, Aminosäuren, Triazolnukleosiden oder Corticosteroiden. Solche anderen Mittel können in der zu verabreichenden Zusammensetzung enthalten sein, oder sie können getrennt davon verabreicht werden. Auch wird der Antagonist geeigneterweise seriell oder in Kombination mit radiologischen Behandlungen verabreicht, entweder in Zusammenhang mit Bestrahlungen oder durch die Verabreichung von radioaktiven Substanzen.
In einer Ausführungsform wird die Angiogenese von Tumoren in einer Kombinationstherapie angegriffen. Ein oder mehrere hVEGF-Antagonisten werden einem Tumortragenden Patienten in therapeutisch wirksamen Dosierungen verabreicht, welche z.B. durch Beobachtung der Nekrose des Tumors oder seiner, falls vorhandenen, Metastasenherde bestimmt werden können. Diese Therapie wird fortgesetzt, bis keine weitere vorteilhafte Wirkung mehr zu beobachten ist oder die klinische Untersuchung keine Spur des Tumors oder der Metastasenherde mehr zeigt. Danach wird TNF verabreicht, allein oder in Kombination mit einem Hilfsmittel, wie z.B. α-, β- oder γ-Interferon, Anti-HER2-Antikörper, Heregulin, Anti-Heregulin-Antikörper, D-Faktor, Interleukin-1 (IL-1), Interleukin-2 (IL-2), Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF), oder Mitteln, die die mikrovaskuläre Blutgerinnung in Tumoren fördern, wie z.B. Anti-Protein C-Antikörper, Anti-Protein S-Antikörper oder C4B-bindendem Protein (siehe Esmon et al., PCT-Patentveröffentlichung WO 91/01753, veröffentlicht am 21. Februar 1991) oder Hitze oder Bestrahlung.
Da die Hilfsmittel in ihrer Wirksamkeit unterschiedlich sind, ist es erwünscht, ihre Auswirkungen auf den Tumor mittels Matrix-Screening in konventioneller Weise zu vergleichen. Die Verabreichung von hVEGF-Antagonisten und TNF wird wiederholt, bis der gewünschte klinische Effekt erzielt wurde. Alternativ dazu wird/werden der/die hVEGF-Antagonisten) gemeinsam mit TNF und gegebenenfalls anderen Hilfsmitteln verabreicht. In Fällen, bei denen massive Tumoren in Gliedmaßen oder anderen Stellen, die anfällig für eine Isolierung von der allgemeinen Blutzirkulierung sein können, auftreten, werden die hierin beschriebenen therapeutischen Mittel dem isolierten Tumor oder Organ direkt verabreicht. In anderen Ausführungsformen werden ein FGF oder ein Antagonist des von Blutplättchen abgeleiteten Wachstumsfaktors (PDGF), wie z.B. ein Anti-FGF- oder ein neutralisierender Anti-PDGF-Antikörper, dem Patienten gemeinsam mit dem hVEGF-Antagonisten verabreicht. Die Behandlung mit hVEGF-Antagonisten kann über den Zeitraum, in dem Wundheilung oder eine gewünschte Gefäßneubildung erfolgen, ausgesetzt werden.
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung und sollen die Erfindung keineswegs einschränken.
Beispiel 1
Herstellung von monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörpern
Um ein hVEGF-Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin- (KLH-) Konjugat für die Immunisierung zu erhalten, wurde rekombinanter hVEGF (165 Aminosäuren), Leung et al., Science 246, 1306 (1989), mit KLH in einem Verhältnis von 4:1 in Gegenwart von 0,05 % Glutaraldehyd vermischt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 3 Stunden lang unter leichtem Rühren inkubiert. Das Gemisch wurde daraufhin gegen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei 4 °C über Nacht dialysiert.
Balb/c-Mäuse wurden vier Mal alle zwei Wochen durch intraperitoneale Injektionen mit 5 μg hVEGF, das an 20 μg KLH konjugiert war, immunisiert und mit derselben Dosis des hVEGF-KLH-Konjugats vier Tage vor Zellinfusion aktiviert.
Milzzellen von den immunisierten Mäusen wurden mit P3X63Ag8U.1-Myelomzellen fusioniert, Yelton et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81, 1 (1978), wobei 35 % Polyethylenglykol (PEG), wie zuvor beschrieben, verwendet wurden. Yarmush et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 77, 2899 (1980). Hybridome wurden in HAT-Medium selektiert.
Überstände von Hybridom-Zellkulturen wurde auf die Produktion von Anti-hVEGF-Antikörpern mittels ELISA-Test unter Verwendung von hVEGF-beschichteten Mikrotiterplatten gescreent. Antikörper, die in jedem der Näpfe an hVEGF gebunden waren, wurden bestimmt, indem an alkalische Phosphatase konjugiertes Ziege-Anti-Mäuse-IgG-Immunglobulin und das chromogene Substrat p-Nitrophenylphosphat verwendet wurden. Harlow & Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual", 597 (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Hybridom-Zellen, die auf diese Weise dazu bestimmt waren, Anti-hVEGF-Antikörper zu produzieren, wurden durch Grenzverdünnung subkloniert, und zwei dieser Klone, als A4.6.1 und B2.6.2 bezeichnet, wurden für weitere Studien ausgewählt.
Beispiel 2
Charakterisieruna von monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörpern
A. Antigen-Spezifizität
Die Bindungsspezifizitäten der von den A4.6.1- und B2.6.2-Hybridomen produzierten monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörper wurden mittels ELISA bestimmt. Die monoklo nalen Antikörper wurden den Näpfen von Mikrotiterplatten, die zuvor mit hVEGF, FGF, HGF oder Epidermiswachstumsfaktor (EGF) beschichtet worden waren, zugesetzt. Gebundener Antikörper wurde mit an Peroxidase konjugierten Ziegen-Anti-Mäuse-IgG-Immunglobulinen nachgewiesen. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen lieferten die Bestätigung, dass die von den A4.6.1- und B2.6.2-Hybridomen produzierten monoklonalen Antikörper sich an hVEGF, aber nicht nachweisbar an die anderen Protein-Wachstumsfaktoren binden.
B. Epitop-Kartierung
Ein kompetitiver Bindungs-ELISA wurde verwendet, um zu bestimmen, ob die von den A4.6.1- und B2.6.2-Hybridomen produzierten monoklonalen Antikörper sich an dieselben oder an verschiedene Epitope (Stellen) innerhalb von hVEGF binden: Kim et al., Infect. Immun. 57, 944 (1989). Individuelle, nicht-markierte, monoklonale Anti-hVEGF-Antikörper (A4.6.1 oder B2.6.2) oder irrelevante Anti-HGF-Antikörper (IgG1-Isotyp) wurden in die Näpfe von Mikrotiterplatten gefüllt, die zuvor mit hVEGF beschichtet worden waren. Daraufhin wurden biotinylierte monoklonale Anti-hVEGF-Antikörper (BIO-A4.6.1 oder BIO-B2.6.2) zugegeben. Das Verhältnis der biotinylierten Antikörper zu den nicht-markierten Antikörpern betrug 1:1000. Bindung der biotinylierten Antikörper wurde durch Zugabe von an Avidin konjugierter Peroxidase, gefolgt von o-Phenylendiamindihydrochlorid und Wasserstoffperoxid sichtbar gemacht.
Die Farbreaktion, die die Menge an Bindung von biotinyliertem Antikörper zeigt, wurde durch Messung der optischen Dichte (O.D) bei einer Wellenlänge von 495 nm gemessen.
Wie in 1 gezeigt wurde in jedem Fall die Bindung des biotinylierten Anti-hVEGF-Antikörpers durch den entsprechenden nicht-markierten Antikörper gehemmt, jedoch nicht durch den nicht-markierten Anti-hVEGF-Antikörper oder den Anti-HGF-Antikörper. Diese Resultate zeigen, dass die von den A4.6.1- und B2.6.2-Hybridomen produzierten monoklonalen Antikörper sich an verschiedene Epitope innerhalb von hVEGF binden.
C. Isotypen-Bestimmung
Die Isotypen der von den A4.6.1- und B2.6.2-Hybridomen produzierten monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörper wurden mittels ELISA bestimmt. Proben des Kulturmediums (Überstand), in dem die Hybridome jeweils gezogen wurden, wurden den Näpfen von Mikrotiterplatten, die zuvor mit hVEGF beschichtet worden waren, zugegeben. Die eingefangenen monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörper wurde mit verschiedenen Isotyp-spezifischen, an alkalische Phosphatase konjugierten Ziege-Anti-Mäuse-Immunglobulinen inkubiert, und die Bindung der konjugierten Antikörper an die monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörper wurde durch Zugabe von p-Nitrophenylphosphat bestimmt. Die Farbreaktion wurde bei 405 nm mit einem ELISA-Platten-Lesegerät gemessen.
Durch dieses Verfahren wurde der Isotyp der von den A4.6.1- und B2.6.2-Hybridomen produzierten monoklonalen Antikörper mit IgG1 bestimmt.
D. Bindungsaffinität
Die Affinitäten der von den A4.6.1- und B2.6.2-Hybridomen produzierten monoklonalen Antikörper für hVEGF wurden durch kompetitive Bindungstests bestimmt. Eine vorbestimmte suboptimale Konzentration an monoklonalen Antikörpern wurde Proben, die 20.000 bis 40.000 cpm ¹²⁶I-hVEGF (1-2 ng) und verschiedene bekannte Mengen an nicht-markiertem hVEGF (1-1000 ng) enthielten, zugegeben. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur wurden 100 μl Ziegen-Anti-Mäuse-Ig-Antiseren (Pel-Freez, Rogers, AR USA) zugegeben, und das Gemisch wurde eine weitere Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Komplexe aus Antikörpern und gebundenen Proteinen (Immunkomplexe) wurden durch Zugabe von 500 μl an 6 % Polyethylenglykol (PEG, MG: 8000) bei 4 °C gefällt, gefolgt von 20-minütigem Zentrifugieren bei 2000 × g und 4 °C. Die Menge an ¹²⁶I-hVEGF, die in jeder Probe an die monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörper gebunden war, wurde bestimmt, indem das pelletierte Material in einem Gammazähler gezählt wurde.
Die Affinitätskonstanten wurden aus den mittels Scatchard-Analyse gewonnenen Daten berechnet. Die Affinität des vom A4.6.1-Hybridom produzierten monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörpers wurde mit 1,2 × 10⁹ Liter/Mol ermittelt. Die Affinität des vom B2.6.2-Hybridom produzierten monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörpers wurde mit 2,54 × 10⁹ Liter/Mol ermittelt.
E. Hemmung der mitogenen Aktivität von hVEGF
Kapillarendothelzellen der Nebennierenrinde (ACE-Zellen) von Rindern, Ferrara et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 84, 5773 (1987), wurden in einer Dichte von 10⁴ Zellen/ml in 12 Mehrfachnapf-Platten ausgesät, und 2,5 ng/ml hVEGF wurden jedem Napf in Gegenwart oder Abwesenheit verschiedener Konzentrationen der von den A4.6.1- oder B2.6.2-Hybridomen produzierten monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörpern oder eines irrelevanten monoklonalen Anti-HGF-Antikörpers zugegeben. Nach 5-tägiger Kultivierung wurden die Zellen in jedem Napf in einem Coulter-Zählgerät gezählt. Als Vergleichsprobe wurden ACE-Zellen ohne zugegebenen hVEGF kultiviert.
Wie in 2 gezeigt hemmten beide der monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörper die Fähigkeit des zugesetzten hVEGF, die Vermehrung oder das Überleben der ACE-Zellen von Rindern zu fördern. Die vom A4.6.1-Hybridom produzierten monoklonalen Antikörper hemmten die mitogene Aktivität von hVEGF vollständig (mehr als etwa 90 % Hemmung), während die vom B2.6.2-Hybridom produzierten monoklonalen Antikörper die mitogene Aktivität von hVEGF nur teilweise hemmten.
F. Hemmung der hVEGF-Bindung
ACE-Zellen von Rindern wurde in einer Dichte von 2,5 × 10⁴ Zellen/0,5 ml/Napf in Mikrotiterplatten mit 24 Näpfen in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), das 10 % Kälberserum, 2 mM Glutamin und 1 ng/ml basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor enthielt, ausgesät. Nach Kultivierung über Nacht wurden die Zellen einmal in Bindungspuffer (gleiche Volumina an DMEM und F12-Medium plus 25 mM HEPES und 1 % Rinderserum-Albumin) bei 4 °C gewaschen.
12.000 cpm 126l-hVEGF (etwa 5 × 10⁴ cpm/ng/ml) wurden 30 Minuten lang mit 5 μg des von den A4.6.1-, B2.6.2- oder A2.6.1-Hybridomen produzierten monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörper (Gesamtvolumen: 250 μl) vorinkubiert, danach wurden diese Gemische den ACE-Zellen von Rindern in den Mikrotiterplatten zugesetzt. Nachdem die Zellen 3 Stunden lang bei 4 °C inkubiert worden waren, wurden die Zellen 3 Mal mit Bindungspuffer bei 4 °C gewaschen und durch Zugabe von 0,5 ml 0,2 n NaOH solubilisiert, anschließend wurden sie in einem Gamma-Zähler gezählt.
Wie in 3 (oben) gezeigt hemmten die von den A4.6.1- und B2.6.2-Hybridomen produzierten monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörper die Bindung von hVEGF an die Rinder-ACE-Zellen. Im Gegensatz dazu zeigte der vom A2.6.1-Hybridom produzierte monoklonale -Anti-hVEGF-Antikörper keine augenscheinliche Wirkung auf die Bindung von hVEGF an die Rinder-ACE-Zellen. In Einklang mit den durch den oben beschriebenen Test der Zellvermehrung hemmte der vom A4.6.1-Hybridom produzierte monoklonale Antikörper die Bindung von hVEGF in einem stärkeren Ausmaß als der vom B2.6.2-Hybridom produzierte monoklonale Antikörper.
Wie in 3 (unten) gezeigt hemmte der vom A4.6.1-Hybridom produzierte monoklonale Antikörper die Bindung von hVEGF an die Rinder-ACE-Zellen in einem Molverhältnis von 1:250 von hVEGF zu Antikörper.
G. Kreuzreaktivität mit anderen VEGF-Isoformen
Um zu bestimmen, ob der vom A4.6.1-Hybridom produzierte monoklonale Anti-hVEGF-Antikörper mit den 121- und 189-Aminosäuren-Formen von hVEGF reaktiv ist, wurde der Antikörper auf seine Fähigkeit zur Immunfällung dieser Polypeptide untersucht.
Menschliche 293-Zellen wurde mit Vektoren transfiziert, die Nukleotide enthalten, die für die Sequenz der 121- und 189-Aminosäuren-hVEGF-Polypeptide, wie bereits beschrieben, kodieren. Leung et al., Science 246, 1306 (1989). Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen in ein Medium, das kein Cystein und Methionin enthielt, transferiert. Die Zellen wurden 30 Minuten lang in diesem Medium inkubiert, danach wurden jeweils 100 μCi/ml ³⁶S-Methionin und ³⁶S-Cystein dem Medium zugesetzt, und die Zellen wurde für zwei weitere Stunden inkubiert. Die Markierung wurde verfolgt, indem die Zellen in ein Serum-freies Medium transferiert und drei Stunden inkubiert wurden. Die Zellkulturmedien wurden gesammelt und die Zellen lysiert, indem sie 30 Minuten lang in Lysepuffer (150 mM NaCl, 1 % NP40, 0,5 % Desoxycholat, 0,1 % Natriumdodecylsulfat (SDS), 50 mM Tris, pH 8,0) inkubiert wurden. Zellbruchstücke wurden aus den Lysaten mittels Zentrifugieren bei 200 × g über 30 Minuten entfernt.
500-μl-Proben der Zellkulturmedien und Zelllysate wurden mit 2 μl A4.6.1-Hybridom-Antikörper (2,4 mg/ml) 1 Stunde lang bei 4 °C und danach mit 5 μl Hasen-Anti-Mäuse-IgG-Immunglobulin 1 Stunde lang bei 4 °C inkubiert. Immunkomplexe des 26S-markierten hVEGF- und des monoklonalen Anti-hVEGF-Antikörpers wurden mit Protein-A-Sepharose (Pharmacia) gefällt und danach einer SDS-12%-Polyacrylamidgel-Elektrophorese unter reduzierenden Bedingungen unterzogen. Mit dem Gel wurde ein Röntgenfilm zur Analyse der immungefällten radiomarkierten Proteine mittels Autoradiographie belichtet.
Die Ergebnisse dieser Analyse zeigten, dass der vom A4.6.1-Hybridom produzierte monoklonale Anti-hVEGF-Antikörper mit sowohl der 121- als auch der 189-Aminosäuren-Form des hVEGF kreuzreaktiv war.
Beispiel 3
Herstellung eines hVEGF-Rezeptor-IgG-Fusionsproteins
Die Nukleotid- und Aminosäure-Kodierungssequenzen des flt-hVEGF-Rezeptors werden von Shibuya et al., Oncogene 5, 519-524 (1990), offenbart. Die Kodierungssequenzen der extrazellulären Domäne des flt-hVEGF-Rezeptors wurden mit den Kodierungssequenzen der menschlichen schweren IgG1-Kette in zwei Verfahrensschritten fusioniert.
Ortsgerichtete Mutagenese wurde verwendet, um eine BstBI-Restriktion in die für flt kodierende DNA an einer Stelle 5' zum Codon für Aminosäure 759 von flt einzuführen, und um die einzige BstBI-Restriktionsstelle im Plasmid pBSSK^-FC, Bennet et al., J. Biol. Chem. 266, 23060-23067 (1991), in eine BstBI-Stelle umzuwandeln. Das modifizierte Plasmid wurde mit EcoRI und BstBI gespalten, und das resultierende große Fragment von Plasmid-DNA wurde zusammen mit einem EcoRI-BstBI-Fragment der flt-DNA, die für die extrazelluläre Domäne (Aminosäuren 1-758) des flt-hVEGF-Rezeptors kodiert, ligiert.
Das daraus resultierende Konstrukt wurde mit ClaI und NotI verdaut, um ein etwa 3,3 kb großes Fragment zu erzeugen, welches daraufhin in die Mehrfachklonierungsstelle des Säugetier-Expressionsvektors pHEBO2 (Leung et al., Neuron 8, 1045 (1992)) durch Ligation insertiert wurde. Die Enden des 3,3 kb-Fragments wurden modifiziert, z.B. durch Addition von Linkern, um eine Insertion des Fragments in den Vektor in der korrekten Ausrichtung zur Expression zu erzielen.
Säugetier-Wirtszellen (z.B. CEN4-Zellen (Leung et al., s.o.)) werden mit dem pHE-BO2-Plasmid, das das flt-Insert enthält, mittels Elektroporation transfiziert. Transfizierte Zellen werden in einem Medium, das etwa 10 % Rinderföten-Serum, 2 mM Glutamin und Antibiotika enthält, kultiviert, und diese werden bei etwa 75 % Konfluenz in ein Serum-freies Medium transferiert. Das Medium wird für 3-4 Tage vor der Gewinnung konditioniert, und das flt-IgG-Fusionsprotein wird aus dem konditionierten Medium mittels Chromatographie auf einer Protein-A-Affinitätsmatrix im Wesentlichen wie von Bennett et al., J. Biol. Chem. 266, 23060-23067 (1991), beschrieben gereinigt.
Beispiel 4
Hemmung von Tumorwachstum mit hVEGF-Antagonisten
Verschiedene menschliche Tumorzelllinien, die in Kultur gezüchtet wurden, wurden bezüglich der Produktion von hVEGF mittels ELISA untersucht. Es wurde herausgefunden, dass Eierstock-, Lungen-, Kolon-, Magendarm-, Brust- und Hirntumorzelllinien hVEGF produzierten. Drei Zelllinien, die hVEGF produzieren, nämlich NEG 55 (auch als G55 bezeichnet) (menschliche Gliomzelllinie, erhalten von Dr. M. West phal, Abteilung für Neurochirurgie, Universitätsklinik Eppendor, Hamburg, auch als G55 bezeichnet), A-673 (menschliche Rhabdomyosarkom-Zelllinie, erhalten von der American Type Culture Collection (ATTC), Rockville, Maryland, USA 20852 mit der Zellliniennummer CRL 1598) sowie SK-LMS-1 (Leiomyosarkom-Zelllinie, erhalten von der ATTC mit der Zellliniennummer HTB 88) wurden für weitere Studien verwendet.
Sechs bis zehn Wochen alten weiblichen beigefarbenen/nackten Mäusen (Charles River Laborstory, Wilmington, Massachusetts, USA) wurden subkutan 1 – 5 × 10⁸ Tumorzellen in 100-200 μl PBS injiziert. Zu verschiedenen Zeitpunkten, nachdem Tumorwachstum festgestellt worden war, wurden den Mäusen intraperitoneal ein- oder zweimal pro Woche verschiedene Dosen eines monoklonalen A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörpers, eines irrelevanten monoklonalen Anti-gp120-Antikörpers (5B6) oder PBS injiziert. Die Tumorgröße wurde jede Woche gemessen, und am Ende der Studie wurden die Tumoren herausgeschnitten und gewogen.
Die Auswirkungen von verschiedenen Mengen an monoklonalem A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper auf das Wachstum der NEG 55-Tumoren in Mäusen wird in den 4 und 5 gezeigt. 4 zeigt, dass Mäuse, die mit 25 μg oder 100 μg monoklonalem A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper beginnend eine Woche nach Animpfung mit NEG 55-Zellen behandelt wurden, eine im Wesentlichen reduzierte Wachstumsrate des Tumors aufwiesen, im Vergleich zu Mäusen, die entweder mit dem irrelevanten Antikörper oder mit PBS behandelt wurden. 5 zeigt, dass fünf Wochen nach der Animpfung der NEG 55-Zellen, die Tumorgröße der Mäuse, die mit A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper behandelt wurden, um etwa 50 % (im Fall von Mäusen, die mit 25 μg Dosen des Antikörper behandelt wurden) bis 85 % (im Fall von Mäusen, die mit 100 μg Dosen des Antikörpers behandelt wurden) geringer war als die Tumorgröße von Mäusen, die einer Behandlung mit irrelevantem Antikörper oder PBS unterzogen wurden.
Die Auswirkungen einer Behandlung mit monoklonalen A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörpern auf das Wachstum von SK-LMS-1-Tumoren in Mäusen wird in 6 ge zeigt. Fünf Wochen nach der Animpfung der SK-LMS-1-Zellen, betrug die durchschnittliche Tumorgröße von Mäusen, die mit dem A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper behandelt wurden, um etwa 75 % weniger als die Tumorgröße von Mäusen, die einer Behandlung mit irrelevantem Antikörper oder PBS unterzogen wurden.
Die Auswirkungen einer Behandlung mit monoklonalen A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörpern auf das Wachstum von A673-Tumoren in Mäusen wird in 7 gezeigt. Vier Wochen nach der Animpfung der A673-Zellen betrug die durchschnittliche Tumorgröße von Mäusen, die mit dem A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper behandelt wurden, um etwa 60 % (im Fall von Mäusen, die mit 10 μg Dosen des Antikörper behandelt wurden) bis mehr als 90 % (im Fall von Mäusen, die mit 50-400 μg Dosen des Antikörpers behandelt wurden) weniger als die Tumorgröße von Mäusen, die einer Behandlung mit irrelevantem Antikörper oder PBS unterzogen wurden.
Beispiel 5
Analyse der direkten Wirkung von Anti-hVEGF-Antikörper auf in Kultur gezüchtete Tumorzellen
Menschliche Glioblastomzellen NEG55 oder Rhabdomyosarkomzellen A673 wurden in einer Dichte von 7 × 10³ Zellen/Napf in Mehrfachnapfplatten (12 Näpfe/Platte) in einem Fig.12/DMEM-Medium ausgesät, das 10 % Kälberfötenserum, 2 mM Glutamin und Antibiotika enthielt. A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper wurde den Zellkulturen daraufhin in einer Endkonzentration von 0 bis 20,0 μg Antikörper/ml zugegeben. Nach fünf Tagen wurden die sich in den Näpfen vermehrenden Zellen abgetrennt, indem sie Trypsin ausgesetzt wurden, und sie wurden in einem Coulter-Zähler gezählt.
Die 8 und 9 geben die Ergebnisse dieser Studien wieder. Wie klar ersichtlich ist, zeigte der A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper keine nennenswerte Wirkung auf das Wachstum der NEG55- oder A673-Zellen in der Kultur. Diese Resultate zeigen, dass der A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper nicht zytotoxisch ist, was ziemlich deutlich vermu ten lässt, dass die beobachtete Anti-Tumor-Wirkung des Antikörpers seiner Hemmung von VEGF-vermittelter Gefäßneubildung zuzuschreiben sind.
Beispiei 6
Wirkung von Anti-hVEGF-Antikörper auf Endothelzellen-Chemotaxis
Die Chemotaxen von Endothel- und anderen Zellen, einschließlich Monozyten und Lymphozyten, spielt in der Pathogenese von rheumatischer Arthritis eine wichtige Rolle. Migration und Vermehrung von Endothelzellen sind Begleiterscheinungen der Angiogenese, die in der rheumatischen Gelenksauskleidung auftreten. Vaskuläres Gewebe (Pannus) befällt die Gelenksknorpel und zerstört diese.
Um festzustellen, ob hVEGF-Antagonisten in diesen Prozess hindernd eingreifen, haben die Erfinder die Wirkung von A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörpern auf Endothelzellen-Chemotaxis, die durch die Synovialflüssigkeit von Patienten mit rheumatischer Arthritis stimuliert wurde, untersucht. Als Vergleich dazu haben sie auch die Wirkung von A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörpern auf Endothelzellen-Chemotaxis, die durch die Synovialflüssigkeit von Patienten mit Osteoarthritis (die Angiogenese, die in rheumatischer Arthritis auftritt, erfolgt in der Osteoarthritis nicht) stimuliert wurde, untersucht.
Die Endothelzellen-Chemotaxis wurde unter Verwendung von modifiziertem Boyden-Kammern gemäß bekannten Verfahren untersucht. Thompson et al., Cancer Res. 51, 2670 (1991); Phillips et al., Proc. Exp. Biol. Med. 197, 458 (1991). Etwa 104 menschliche Endothelzellen der Nabelvene wurden an mit Gelatine beschichtete Filter (0,8 μm Porengröße) in Mehrfachnapf-Mikrokammern mit 48 Näpfen in einem Kulturmedium, das 0,1 % Rinderfötenserum enthielt, binden gelassen. Nach etwa 2 Stunden wurden die Kammern umgedreht, und die Testproben (Synovialflüssigkeit von rheumatischer Arthritis, Synovialflüssigkeit von Osteoarthritis, basischer FGF (bFGF) (in einer Endkonzentration von 1 μg/ml) oder PBS) und A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper (in einer Endkonzentration von 10 μg/ml) wurden den Näpfen zugegeben.
Nach zwei bis vier Stunden wurden die Zellen, die migriert waren, gefärbt und gezählt.
10 zeigt die Bemittelten Ergebnisse dieser Untersuchungen. Die in der als "Syn. Flüss." bezeichneten Spalte und am unteren Ende der Seite für die Vergleichsproben gezeigten Ergebnisse geben die durchschnittliche Anzahl von Endothelzellen wieder, die in Gegenwart von Synovialflüssigkeit, bFGF oder PBS allein migriert waren. Die Werte, die sich in der mit "Syn.Flüss. + mAB VEGF" bezeichneten Spalte befinden, geben die durchschnittliche Anzahl der Endothelzellen wieder, die in Gegenwart von Synovialflüssigkeit plus zugegebenem A4.6.1-Anti-hVEGF-Antikörper migriert waren. Die Werte in der mit "% Unterdrückung" bezeichneten Spalte zeigen die prozentuelle Reduktion der durch Synovialflüssigkeit induzierten Endothelzellenmigration, die aus der Zugabe von Anti-hVEGF-Antikörper resultierte. Wie gezeigt wird, hemmte der Anti-hVEGF-Antikörper die Fähigkeit der Synovialflüssigkeit bei rheumatischer Arthritis (53,40 % durchschnittliche Hemmung), nicht aber die Fähigkeit der Synovialflüssigkeit von Osteoarthritis (13,64 % durchschnittliche Hemmung), die Migration von Endothelzellen zu induzieren.

Claims

Verwendung eines hVEGF-Antagonisten, der ein Anti-VEGF-Antikörper ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Krebsbehandlung, worin der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist und worin der Antagonist die mitogene Wirkung von hVEGF inhibiert.
Verwendung nach Anspruch 1, worin der Antikörper ein Anti-hVEGF-Antikörper ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin der Antikörper humanisiert ist.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der Antikörper in einer Menge eingesetzt wird, die ausreicht, um die Größe eines Tumors zu verringern.
Verwendung nach Anspruch 6, worin der Tumor ein massiver bösartiger Tumor ist.
Verwendung nach Anspruch 4 oder 5, worin der Antikörper die Tumorgröße durch Hemmung von VEGF-vermittelter Gefäßneubildung verringert.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der Antikörper an eine zytotoxische Einheit gebunden ist.
Verwendung nach Anspruch 7, worin die zytotoxische Einheit ein Protein-Cytotoxin oder eine Fc-Domäne des monoklonalen Antikörpers ist.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Medikament so formuliert ist, dass seine Verabreichung seriell oder in Kombination mit einem anderen Mittel zur Krebsbehandlung möglich ist.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Medikament so formuliert ist, dass seine Verabreichung seriell oder in Kombination mit radiologischen Behandlungen möglich ist.