HU221343B1 - Use of anti-vegf antibodies for the treatment of cancer - Google Patents

Abstract

A találmány olyan hVEGF-antagonista alkalmazását ismerteti, amely egyanti-VEGF antitest, és ez az alkalmazás gyógyszerek előállításátjelenti rák kezelésére. Az antagonista gátolja a hVEGF mitogén,angiogén és további bioló- giai aktivitásait, ennek megfelelőenalkalmas olyan betegségek vagy rendellenességek kezelésére, amelyeketa fölösleges, nem kívánatos neovaszkularizáció jellemez, a betegségekközé értve a daganatokat, elsősorban a rosszindulatú, szilárddaganatokat. A VEGF-antagonisták kívánt esetben konjugálva vannakvalamely citotoxikus résszel. ŕ

Description

A jelen találmány tárgyköre a véredénybelhártyasejtnövekedési faktor (vascular endothelial cell growth factor; VEGF) antagonistákkal, az antagonistákat tartalmazó terápiás készítményekkel, valamint az antagonisták diagnosztikai és terápis célokra történő felhasználásával összefüggő eljárásokkal kapcsolatos.

Az érrendszer két legfőbb sejtkomponense az endotél (belhártyasejt) és a simaizomsejt. Az endotélsejtek alkotják valamennyi véredény belső felszínének a bevonatát és nem trombogén érintkező felületet képeznek a vér és a szövet között. Mindezeken túl az endotélsejtek fontos komponensei az új kapillárisok és véredények kialakulásának. így endotélsejtek burjánzanak az érképződés (angiogenezis) vagy neovaszkularizáció során, amely a tumor növekedéséhez és a metasztázishoz, továbbá számos nem daganatos jellegű betegséghez vagy rendellenességhez társul.

Különféle, a természetben is előforduló polipeptidről leírták, hogy kiváltja az endotélsejtek burjánzását. Az ezen tulajdonsággal rendelkező polipeptidek közé tartoznak a bázikus és savas fibroblaszt növekedési faktorok (FGF; fibroblast growth factor) [Burgess and Maciag, Annual Rév. Biochem. 55:575 (1989], trombocitákból származó érfalbelhártyasejt-növekedési faktor (PD-ECGF; platelet-derived endothelial growth factor) [Ishikawa, et al.. Natúré 335:557 (1989)], és a vaszkuláris endotélnövekedési faktor (VEGF) [Leung, etal., Science 246'. 1306 (1989); Ferrara & Henzel, Biochem. Biophys. Rés. Commun. 767:851 (1989); Tisher, et al., Biochem. Biophys. Rés. Commun. 765:1198 (1989); Ferrara, eí al., PCT Pat. Pub. No. WO 90/13649 (a nyilvánosságra hozatal időpontja: 1990. november 15.)].

A VEGF-et először szarvasmarha-agyalapimirigy (hipofízis) follikulláris vagy follikulosztelláris sejtekkel kondicionált tápközegekben azonosították. Biokémiai elemzések arra utalnak, hogy a szarvasmarhaVEGF dimer fehérje, amelynek látszólagos molekulatömege megközelítőleg 45 000 dalton és amely nyilvánvaló mitogén specifitással rendelkezik a vaszkuláris endotélsejtekre. Szarvasmarha-VEGF-et kódoló DNS-t izoláltak ilyen sejtekből készített cDNS-könyvtár átvizsgálásával olyan oligonukleotidokat alkalmazva hibridizáló szondaként, amelyek a fehérje aminoterminális aminosavszekvenciáján alapulnak.

Humán VEGF-et először úgy nyertek, hogy humán sejtekből készített cDNS-könyvtárat vizsgáltak át szarvasmarha-VEGF cDNS-t használva hibridizáló szondaként. Az így azonosított egyik cDNS egy olyan 165 aminosavas fehéqét kódol, amely 95%-nál nagyobb homológiát mutat a szarvasmarha-VEGF-fel, e fehérjét humán VEGF-nek (hVEGF) nevezik. A humán VEGF mitogén aktivitását úgy erősítették meg, hogy a humán VEGF cDNS-t emlős gazdasejtekben fejezték ki. A humán VEGF cDNS-sel transzfektált sejtek által kondicionált tápközegek kedveztek a kapilláris endotélsejtek burjánzásának, ezzel szemben a kontrollsejtek nem kedveztek annak [Leung, et al., Science 246:1306 (1989)].

Számos további cDNS-t azonosítottak olyan humán cDNS-könyvtárakban, amelyek a hVEGF 121-, 189- és

206-aminosavas izoformáit kódolják (ezeket együttesen szokás hVEGF-rokon fehéijéknek nevezni). A 121-aminosavas fehéije eltér a hVEGF-től, amennyiben törölve van all6. és 159. gyökök közti 44 aminosav a hVEGFben. A 189-aminosavas fehérje eltér a hVEGF-től, amennyiben be van illesztve 24 aminosav a 116. gyöknél a hVEGF-be, és minden jel szerint megegyezik a humán vaszkuláris permeabilitási faktorral (hVPF). A 206aminosavas fehérje eltér a hVEGF-től, amennyiben be van illesztve 41 aminosav a 116. gyöknél a hVEGF-be [Houck, et al., Mól. Endocrin. 5:1806 (1991); Ferrara, et al., Endocrine Reviews 73:18 (1992); Keck, et al., Science 246:1309 (1989); Conolly, et al., J. Bioi. Chem. 264:20017 (1989); Keck, et al., EPO Pat. Pub. No. 0 370 989 (a nyilvánosságra hozatal időpontja: 1990. május 30.)].

A VEGF nemcsak a vaszkuláris endotélsejt burjánzását segíti elő, hanem fokozza a vaszkuláris permeabilitást és az angiogenezist is. Az angiogenezis, amely új véredények kialakulását jelenti a már korábban is létező endotéliumból, fontos komponense betegségek és rendellenességek széles skálájának, ideértve a daganatnövekedést és a daganatos áttételek kialakulását, a reumatoid artritiszt, pikkelysömört, ateroszklerózist, a diabéteszes retinopátiát, retrolentális fibropláziát, a neovaszkuláris glaukómát, a hemangiomákat, a transzplantált szaruhártyaszövet és más szövetek immunológiai összeférhetetlenségén alapuló kilökődését, valamint a krónikus gyulladásokat.

A daganatok növekedése esetében az angiogenezis döntő fontosságúnak látszik a hiperpláziából a neopláziába való átmenet szempontjából, valamint a növekvő tömör daganat részére táplálék biztosítása szempontjából [Folkman, et al., Natúré 339:58 (1989)]. Az angiogenezis azt is lehetővé teszi a daganatoknak, hogy kontaktusban legyenek a gazdaszervezet érrendszerével, ami a tumorsejtek metasztázisához nyithat utat. Az angiogenezisnek a tumormetasztázisban betöltött szerepére bizonyítékként szolgálnak például olyan tanulmányok, amelyek korrelációt mutatnak ki az invazív humán emlőrák kórszövettani metszeteiben levő mikroerek száma és sűrűsége és távoli metasztázisok tényleges jelenléte között [Weidner, et al., New Engl. J. Med. 324:1 (1991)].

A vaszkuláris endotélsejt-növekedés és az angiogenezis szerepére, továbbá e folyamatoknak számos betegségben és rendellenességben betöltött szerepére való tekintettel kívánatos egy olyan módszerrel rendelkezni, amelynek segítségével csökkenteni vagy meggátolni lehet a VEGF egy vagy több biológiai hatását. Kívánatos továbbá olyan módszerrel rendelkezni, amelynek segítségével ki lehet mutatni VEGF jelenlétét normális és kóros állapotokban, különösen rákban.

Az alábbiakban röviden összefoglaljuk a találmányt.

Első szempontja szerint a találmány egy hVEGF-antagonista, amely egy anti-VEGF antitest, alkalmazását nyújtja gyógyszerek készítéséhez rák kezelésére. Az antagonisták gátolják a hVEGF mitogén, angiogén és más biológiai aktivitásait, és így hasznosak olyan betegségek és rendellenességek kezelésére, amelyeket nem kí2

HU 221 343 Bl vánatos, fölösleges neovaszkularizáció jellemez; ilyenek például a daganatok, különösen a tömör, rosszindulatú daganatok.

Egy további szempontja szerint a VEGF-antagonisták konjugálva vannak valamely citotoxikus résszel. Az alábbiakban röviden ismertetjük az ábrákat.

Az 1. ábra bemutatja a hVEGF-ellenes monoklonális antitestek (A4.6.1 vagy B2.6.2), illetve egy irreleváns májsejtinhibitor-növekedési faktor ellen képződött (anti-HGF = anti-hepatocyte growth factor antibody) antitest hatását az anti-hVEGF monoklonális antitestek kötődése a hVEGF-hez.

A 2. ábra azokat a hatásokat szemlélteti, amelyeket az anti-hVEGF monoklonális antitestek (A4.6.1 vagy B.2.6.2), vagy egy irreleváns anti-HGF antitest fejt ki a hVEGF biológiai aktivitására szarvasmarhamellékvesekéreg kapilláris endotél (ACE=adrenal cortex capillary endothel) sejtek tenyészetében.

A 3. ábra azt mutatja be, hogy miképpen hatnak az anti-hVEGF monoklonális antitestek (A4.6.1, B2.6.2 vagy A2.6.1) a hVEGF kötődésére szarvasmarha-ACE sejtekhez.

A 4. ábra bemutatja az anti-hVEGF monoklonális antitestek (A4.6.1, B2.6.2 vagy A2.6.1) hatását az NEG55 daganatok növekedési sebességére egerekben.

Az 5. ábra bemutatja az A4.6.1 anti-hVEGF monoklonális antitestkezelés hatását az NEG55 daganatok méretére egerekben 5 hetes kezelés után.

A 6. ábra bemutatja az A4.6.1 anti-hVEGF monoklonális antitest (VEGF Ab) kezelés hatását SK-LMS1 daganatok növekedésére egerekben.

A 7. ábra bemutatja az A4.6.1 anti-hVEGF monoklonális antitest (VEGF Ab) kezelés különböző dózisainak hatását A673 daganatok növekedésére egerekben.

A 8. ábra bemutatja az A4.6.1 anti-hVEGF monoklonális antitest hatását az NEG55(G55) glioblasztómasejtek növekedésére és túlélésére egerekben.

A 9. ábra bemutatja az A4.6.1 anti-hVEGF monoklonális antitest hatását az A673 rabdomioszarkómasejtek növekedésére és túlélésére tenyészetben.

A 10. ábra bemutatja az A4.6.1 anti-hVEGF monoklonális antitest hatását humán endotélsejtek szinoviális folyadékkal indukált kemotaxisára.

Az alábbiakban részletesen leírjuk a találmányt.

A „hVEGF” elnevezés alkalmazása a jelen leírásban a 165 aminosavból álló emberi véredénybelhártyasejtnövekedési faktorra, illetve az ezzel rokon 121,189, valamint 206 aminosavas véredénybelhártyasejtnövekedési faktorokra utal, ahogyan azt Leung, et al., Mo. Endocrin. 5:1806 (1991) leírták, továbbá a szóban forgó növekedési faktorok természetben is előforduló alléi-, illetve feldolgozott formáira.

A jelen találmány olyan, a hVEGF-ellenes antagonistákat bocsát rendelkezésre, amelyek képesek gátolni a hVEGF egy vagy több biológiai hatását, például mitogén vagy angiogén jellegű tevékenységet. A hVEGF-antagonisták úgy működnek, hogy megzavarják a hVEGF kötődését egy sejtfelszíni receptorhoz, így működésképtelenné teszik, vagy akár el is pusztítják azokat a sejteket, amelyek hVEGF-fel voltak aktiválva, vagy pedig miután a hVEGF kötődött a sejtfelszíni receptorhoz, ellene hatnak a vaszkuláris endotélsejtek aktiválódásának. A találmány céljait tekintve a hVEGF-antagonisták minden ilyesfajta, az előzőekben említett támadáspontját egyenértékűnek lehet minősíteni. Ennek értelmében a találmány oltalmi köre magában foglalja az olyan antitesteket, előnyösen monoklonális antitesteket, illetve azokból származó töredék részeket, amelyek kötődnek a hVEGF-hez, a hVEGF-receptorához, vagy egy, a hVEGF-receptorával összekapcsolódott hVEGF-ből álló komplexumhoz.

A „hVEGF-receptor”, illetve a „hVEGF” elnevezés a jelen leírásban a hVEGF celluláris receptorára, rendszerint az erek belhártyáját alkotó sejteken elhelyezkedő sejtfelületi receptorra vonatkozik, továbbá ezek olyan változataira, amelyek továbbra is rendelkeznek a hVEGF megkötésének képességével. Típusosnak mondható esetben a hVEGF-receptorok és ezeknek olyan változatai, amelyek hVEGF antagonista tulajdonsággal rendelkeznek, elsősorban inkább izolált formában fordulnak elő, semmint beépülve a sejtmembránba, vagy egy adott sejt felszínéhez rögzülve, amint ez a természetes körülmények között a helyzet szokott lenni. A hVEGF-receptorra egyik példa az /m.v-szerű tirozin kináz (fit), amely a tirozin kinázok családjába tartozó transzmembrán receptor [DeVries, et al., Science 255:989 (1992); Shibuya, et al., Oncogene 5:519 (1990)]. Az flt receptor egy extracelluláris tartományból, egy transzmembrántartományból, valamint egy tirozin kináz aktivitással rendelkező intracelluláris tartományból áll. A sejtmembrán külső oldalán elhelyezkedő tartomány a hVEGF megkötése terén játszik szerepet, míg a sejthártya belső felületén elhelyezkedő tartomány a jeltovábbítás folyamatában vesz részt.

Egy másik példa a hVEGF-receptorra az flk-1 receptor (ugyancsak ismeretes KDR elnevezéssel is) [Matthews, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 58:9026 (1991); Termán, et al., Oncogene 6:1677 (1991); Termán, et al., Biochem. Biophys. Rés. Commun. 187:1579 (1992)].

A hVEGF kötődése az ///receptorhoz legalább két nagy molekulatömegű komplexum képződését eredményezi, melyek látszólagos molekulatömege egyrészt 205 000, másrészt 300 000 dalton. A 300 000 dalton molekulatömegű komplexumról feltételezik, hogy ez tulajdonképpen egy két receptormolekulából álló dimer, melyhez egyetlen hVEGF-molekula van hozzákötve.

A hVEGF-receptor extracellulárisan elhelyezkedő tartománya akár önmagában véve, akár egy immunglobulin polipeptid vagy egyéb hordozó (carrier) immoglobulin polipeptiddel fuzionálva különlegesen alkalmas arra, hogy hVEGF-ellenes antagonista szerepet töltsön be, köszönhetően ezt annak a képességének, hogy képes a gazdaszervezetben lévő hVEGF eltávolítására, ugyanakkor viszont nem kötődik a sejtek felszínén elhelyezkedő hVEGFr-ekhez.

A hVEGFr és változatai ugyancsak használhatók olyan szűrővizsgálatok céljaira, melyeknek célja a hVEGF agonistáinak és antagonistáinak azonosítása. Például a hVEGFr-t kódoló DNS-sel (például flt vagy

HU 221 343 Bl flk-1) transzfektált gazdasejtek túlexpresszálják a receptor polipeptidet a sejt felszínén, ideálissá téve az ilyen rekombináns gazdasejteket egy tesztvegyület (példaképpen lehetne említeni egy kisméretű molekulát, egy lineáris vagy ciklikus peptidet, vagy egy polipeptidet) azon képességének elemzésére, hogy milyen mértékben képes kötődni a hVEGFr-hez. A hVEGFr és hVEGFr fúziós fehérjék, mint amilyen példának okáért egy hVEGFr-IgG fúziós fehérje, ehhez hasonló módon ugyancsak felhasználhatók. Például a fúziós fehérje kötve van egy immobilizált hordozóhoz és meg lehet határozni azt, hogy a vizsgálati anyag milyen mértékben képes leszorítani a radioaktív úton jelzett hVEGFmolekulát a fúziós fehérje hVEGFr-tartományáról.

A hVEGF, hVEGF-receptor, monoklonális antitestek, illetve egyéb fehérjék fogalmával kapcsolatosan használt „rekombináns” szakkifejezés olyan fehérjékre utal, amelyek rekombináns DNS segítségével képződnek valamely gazdasejtben. A gazdasejt lehet akár prokarióta (például egy olyan baktériumsejt mint az E. coli), akár eukarióta (például egy élesztősejt, vagy egy emlősből származó sejt).

Antagonista monoklonális antitestek

A „monoklonális antitest” szakkifejezés olyan antitestet jelöl, amelyet lényegében homogén antitestek egy adott populációjából nyerünk, azaz a populációt alkotó egyedi antitestek mind specificitásukat, mind affinitásukat tekintve teljesen megegyeznek egymással, kivéve azokat a természetben esetlegesen előforduló mutációkat, amelyek jelenléte elhanyagolhatóan csekély mennyiségben nem zárható ki. Fel kell hívni a figyelmet arra, hogy az ilyen természetben előforduló mutációk és hasonlók révén egy találmány szerinti monoklonális antitest kompozíció, amely túlnyomórészt hVEGF, a hVEGFr vagy egy, a hVEGF és a hVEGFr összekapcsolódásából létrejött komplexum („hVEGF-hVEGFr komplexum”) fajlagos megkötésére képes antitesteket tartalmaz, ugyancsak tartalmazhat elenyésző mennyiségben egyéb antitesteket is.

így a „monoklonális” módosító jelző az antitest karakterére utal, ahogyan ezt egy homogén antitest populációból kinyerték, és nem úgy alkalmazzuk, mintha meg lenne követelve, hogy az antitest termelése egy bizonyos módszerrel legyen végrehajtva. Például a találmányban szereplő monoklonális antitestek előállíthatok az először Kohler & Milstein [Natúré 256:495 (1975)] által leírt hibridómamódszerrel is, vagy pedig előállíthatok rekombináns DNS-technikát alkalmazó eljárásokkal is [Cabilly et al., U. S. Pat. No. 4,816,567],

A hibridómamódszer során egeret, vagy erre a célra alkalmas más gazdaállatot szubkután, intraperitoneális vagy intramuszkuláris beadási móddal antigénnel immunizálunk, hogy ez ezáltal olyan limfociták képződését váltsa ki, amelyek az immunizációhoz alkalmazott fehérjé(k)hez specifikusan kötődő antitesteket termelnek, vagy rendelkeznek az ilyen ellenanyagok termelésére vonatkozó képességgel. Egy más úton a limfociták immunizálhatok in vitro is. Ezek után a limfocitákat egy az adott célnak megfelelő fúziós közeg (mint amilyen például a polietilénglikol) segítségével mielómasejtekkel fúzionáltatjuk, amely folyamat eredményeképpen hibridómasejt jön létre [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practices, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)].

Az antigén lehet hVEGF, hVEGFr, illetve hVEGF-hVEGFr komplexum. Az antigén megválasztható olyan módon, hogy akár a hVEGF, akár a hVEGFr valamely azzal a tulajdonsággal jellemezhető töredéke vagy részlete legyen, amely tartalmaz egy vagy több, a hVEGF valamely receptorának egyikéhez történő kötődésében szerepet játszó aminosavgyököt. Példának okáért egy hVEGFr extracelluláris tartományával (azaz egy olyan módon megcsonkult hVEGFr-polipeptid, amelyből hiányzik mind a transzmembrán, mind az intracelluláris tartomány) történő immunizálás különösen alkalmas lehet a hVEGF-fel szembeni antagonista tulajdonsággal rendelkező antitestek előállítására, mivel az extracelluláris tartomány az, amely szerepet játszik a hVEGF kötődésében.

A hVEGF-hVEGFr komplexum megkötésére képes monoklonális antitestek igen jól használhatók különösen akkor, ha egyúttal viszont nem mutatnak kötődést a nem asszociált (nem komplex formájú) hVEGF, illetve hVEGFr irányában. Az ilyen antitestek így csakis azokhoz a sejtekhez kötődnek, amelyek a hVEGF által létrehozott azonnali aktiváláson esnek át és következésképpen a szabad hVEGF vagy hVEGFr által nem tűnnek el, ahogyan ez emlősökben normálisan található. Az ilyen antitestek típusosán egy olyan epitóphoz kötődnek, amely egy vagy több, a receptor és a hVEGF közötti érintkezési ponton ível át. Ilyenfajta antitesteket már készítettek más ligand-receptor komplexumokhoz, és ezeket itt ugyanilyen módon állíthatjuk elő. Ezeket az antitesteket nem szükséges és nem is kell semlegesíteni, vagy a nem asszociált hVEGF vagy hVEGFr biológiai aktivitását gátolni, akár képesek az antitestek a nem asszociált hVEGF-hez vagy hVEGFr-hez kötődni, akár nem.

Az ilyen módon előkészített hibridómasejteket egy olyan alkalmas tápközegre oltjuk, és olyan tápközegen szaporítjuk, amely előnyösen tartalmaz egy vagy több olyan anyagot, amelyik gátolja a nem füzionált, szülői mielómasejtek növekedését vagy túlélését. Például, amennyiben a szülői mielómasejtekben nincsen jelen a hipoxantin-guanin-foszforibozil transzferáz (HGPRT vagy HPRT) enzim, akkor a hibridómákhoz szolgáló tenyésztő tápközeg típusos esetben tartalmazni fog hipoxantint, aminopterint és timidint (HAT tápközeg), mivel ezek a vegyületek megakadályozzák a HGPRThiányos sejtek növekedését.

Azok az előnyös mielómasejtek, amelyek magas hatékonysággal fúzionálnak, stabilan magas szinten tartják fenn a kiválasztott antitesttermelő sejtek antitest-expressziójának mértékét, továbbá érzékenyek az olyanfajta tápközegek irányában, mint amilyen a HAT-táptalaj. Ezek közül legelőnyösebb mielómasejtvonalak az egérmielóma-sejtvonalak, mint például a Salk Institute Cell Distribution Centeméi (San Diego, Kalifornia, USA) rendelkezésére álló MOPC-21 és MPC-11 egérdaganatokból származó sejtvonalak, az American Type

HU 221 343 Bl

Culture Collection (Rockville, Maryland, USA)-tól beszerezhető SP-2 sejtek, illetve azok a P3X63Ag8U. 1 sejtek, amelyeket Yelton et al., [Curr. Top. Microbiol. Immunoi. 81:1 (1978)] írtak le. Emberi monoklonális antitestek előállítására ugyancsak leírtak humán mielómaés egér-humán heteromielóma-sejtvonalakat is [Kozbor, J. Immunoi. 733:3001 (1984); Brodeur, et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)].

Tenyészközeget, amelyben hibridómasejtek nőnek, megvizsgálunk az antigén ellen irányuló monoklonális antitestek termelése szempontjából. A hibridómasejtek által termelt monoklonális antitestek kötési specificitását előnyösen immunprecipitációval, vagy egy olyan in vitro kötési vizsgálat segítségével határozzuk meg, mint amilyen a radioimmunelemzés (RIA), vagy enzimhez kapcsolt immmunabszorbens elemzés (ELISA; enzyme-linked immunoabsorbent assay). A találmányban szereplő monoklonális antitestek olyanok, amelyek elsősorban a hVEGF, a hVEGFr vagy a hVEGF-hVEGFr komplexum immunprecipitációjára hajlamosak, vagy pedig előnyösen kötődnek ezen antigének legalább egyikéhez, továbbá amelyek képesek gátolni a hVEGF biológiai aktivitását.

Miután sikerült azonosítani azokat a hibridómasejteket, amelyek a kívánt specificitással, affinitással, illetve aktivitással képesek antagonista hatású antitesteket termelni, a kiónokat alklónozni lehet korlátozott hígításos eljárásokkal, és a szabványos módszerekkel lehet növekedésre késztetni őket [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-104 (Academic Press, 1986)]. Az erre a célra megfelelő tenyésztő tápközegek közé tartozik például Dulbecco módosított Eagle’s médiuma vagy az RPMI1640 tápközeg. Ezen túlmenően a hibridómasejteket lehet in vivő is növeszteni aszcitesz tumorok formájában állatokban.

Az alklónok által kiválasztott monoklonális antitestek megfelelőképpen elválaszthatók a tenyésztő tápközegtől, az aszcitesz folyadéktól vagy a szérumtól olyan hagyományos immunglobulin-tisztítási eljárások segítségével, mint amilyen például a protein A-Sepharose, a hidroxilapatit-kromatográfia, gélelektroforézis, dialízis- vagy affinitáskromatográfia.

A találmányban szereplő monoklonális antitesteket kódoló DNS hagyományos eljárások alkalmazása segítségével viszonylag zökkenőmentesen izolálható és szekvenciájuk meghatározható (például olyan oligonukleotidszondák alkalmazásával, amelyek specifikusan képesek kötődni az egérből származó antitestek nehéz és rövid láncait kódoló génekhez). A találmány szerinti hibridómasejtek az ilyen DNS előnyös forrását képezik. Az izolálás után a DNS-t expressziós vektorokba lehet belehelyezni, amelyeket azután transzfektálunk olyan gazdasejtekbe, mint amilyenek a majom COSsejtek, a kínaihörcsög-petefészek (CHO = Chinese Hamster Ovary) sejtek vagy pedig olyan mielómasejtek, amelyek egyébként nem termelnek immunglobin típusú fehéijéket. Ilyen módon lehet elérni monoklonális antitestek szintézisét a rekombináns gazdasejtben.

A DNS szükség szerint módosítható, hogy az expressziója által termelődött immunglobulin jellemzőit meg lehessen változtatni. Például az egérantitestek humanizált formáit úgy lehet előállítani, hogy az egérantitest variábilis tartományának komplementaritást meghatározó régióját (CDR: complementarity determining region) helyettesítjük a humán antitest megfelelő régiójával. Bizonyos megvalósítási módozatokban az egérantitest kiválasztott keretrégió (FR; framework region) aminosavgyökeit ugyancsak helyettesítjük az emberi antitestben található megfelelő aminosavgyökökkel [Carter, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 39:4285 (1992); Carter, et al., BioTechnology 70:163 (1992)]. Az egérantitestek kiméra formáit ugyancsak úgy lehet előállítani, hogy a kiválasztott emberi nehéz és könnyű konstanslánc-tartományok kódolószekvenciáit helyettesítjük be a homológ egérszekvenciák helyére [Cabilly, et al., U. S. Pat. No. 4,816,567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 37:6851 (1984)].

A találmány oltalmi körébe tartozó antitestek magukban foglalnak olyan variáns antitesteket, mint amilyenek a kiméra (beleértve a „humanizált”) antitestek és az olyan immunglobinláncokat tartalmazó hibrid antitestek, amelyek képesek megkötni a hVEGF-et, hVEGFr-et vagy a hVEGF-hVEGFr komplexumot és egy nem-hVEGF epitópot.

Az itt szereplő antitestek magukban foglalnak minden eredetű fajtát és immunglobulinosztályt (például IgA, IgD, IgE, IgG, illetve IgM) és -alosztályt csakúgy, mint antitesttöredékeket (például Fab, F(ab’)₂ és FV), amennyiben ezek képesek megkötni a hVEGFet, hVEGFr-et vagy a hVEGF-hVEGFr komplexumot, és képesek antagonizálni a hVEGF biológiai aktivitását.

A találmány egy előnyös megvalósítási formájában a monoklonális antitestnek legalább mintegy 10⁹ liter/mólos affinitása van az immunizáló antigénhez, ahogyan azt meghatározta például Scatchard-analízis segítségével Munson & Pollard [Anal. Biochem. 707:220 (1980)]. A monoklonális antitest továbbá típusos esetben legalább mintegy 50%-kal, de előnyösen több mint 80%-kal és legelőnyösebben a 90%-ot is meghaladó arányban gátolja a hVEGF mitogén vagy angiogén aktivitását, ahogyan azt például egy in vitro sejttúlélési vagy proliferációs vizsgálatban meghatározzuk, mint például ahogyan ez a 2. példában le van írva.

Bizonyos terápiás és diagnosztikai alkalmazások szempontjából kívánatos lehet, hogy a monoklonális antitest a hVEGF nem minden különböző molekuláris formájával reagáljon. Például kívánatosnak bizonyulhat, hogy olyan monoklonális antitesttel rendelkezzünk, amelyik specifikusan képes kötődni a hVEGF 195-aminosavas formájával, ellenben a hVEGF-polipeptidek 121- vagy 189-aminosavas változatával nem. Az ilyen antitestek könnyen azonosíthatók a különböző hVEGFpolipeptidek összehasonlító ELISA-elemzésével vagy összehasonlító immunprecipitációjával.

HU 221 343 Β1

Konjugátumok citotoxikus részekkel

Bizonyos megvalósítási formákban kívánatos annak biztosítása, hogy egy citotoxikus molekularész konjugációs kapcsolatra lépjen egy hVEGF-specifikus monoklonális antittesttel vagy hVEGFr-rel. Ezekben a megvalósítási formákban a citotoxin arra szolgál, hogy működésképtelenné tegye vagy elpusztítsa azokat a sejteket, amelyek expresszálják vagy megkötik a hVEGF-et vagy ennek receptorát. A konjugátumot az a tartomány vezeti rá a sejtre, amely képes megkötni a hVEGF-et, a hVEGFret vagy a hVEGF-hVEGFr komplexumot. Ilyen módon a hVEGF, hVEGFr vagy hVEGF-hVEGFr komplexum megkötésére képes monoklonális antitestek konjugálódnak a citotoxinokhoz. Hasonlóképpen a hVEGFr konjugálódik egy citotoxinhoz. Amíg a monoklonális antitestek optimálisan képesek semlegesíteni önmagában levő (citotoxin nélküli) hVEGF aktivitását, addig ebben a megvalósítási formában nincsen szükség annál többre, minthogy a monoklonális antitest vagy receptor képes legyen hozzákötődni a hVEGF-hez, a hVEGFr-hez vagy a hVEGF-hVEGFr komplexumhoz.

Tipikus esetben a citotoxin valamilyen fehérjecitotoxin, például diftéria, ricin vagy Pseudomonas toxin, jóllehet az immunglobulinok bizonyos osztályai esetében a monoklonális antitest Fc-tartománya önmaga is képes arra, hogy citotoxinként szolgáljon (például az IgG2-antitestek esetében, amelyek képesek fixálni a komplementet és részt venni az antitestfüggő celluláris citotoxicitásban (ADCC; antibody-dependent cellular citotoxicity). Ugyanakkor azonban nem feltétlenül szükségszerű, hogy a citotoxin fehérjetermészetű legyen és ide értendők olyan kemoterápiás szerek is, amelyeket eddig példának okáért daganatok kezelésére használtak.

A citotoxin típusos esetben egy monoklonális antitesthez vagy annak töredékéhez az antitest Fctartományán belül levő (vagy egy részét vagy egészét helyettesítő) amid gerinckötéssel kapcsolódik. Ahol a célzott fünkciót a hVEGFr látja el, a citotoxikus rész a receptor bármely olyan tartományába helyettesíthető, amely nem vesz részt a hVEGF-kötődésekben; a molekularész előnyösen a receptor transzmembrán és/vagy citoplazmatikus tartományának helyébe vagy arra szubsztituálódik. A szubsztitúció optimális helye rutinkísérletezéssel határozható meg és ez a szakember köteles tudásán belül van.

A fehérjefüzióból származó konjugátumok minden különösebb nehézség nélkül előállíthatok rekombináns sejttenyészetben a konjugátumot kódoló gén expressziója által. Alternatív megoldásképpen a konjugátumok a citotoxikus molekularész kovalens keresztkötésével készíthetők el az antitest vagy a receptor egy aminosavgyök oldalláncához vagy C-terminálisán elhelyezkedő karboxilcsoportjához olyan önmagában ismert eljárások alkalmazásával, mint amilyen a diszulfidcsoportok cseréje, diszulfidcsoportok létesítése tioészter kötésen át, például imino-tiolátot és metil4-merkapto-butirimadátot alkalmazva.

Konjugátumok más molekulákkal

A hVEGF-antagonista tulajdonságokkal rendelkező monoklonális antitesteket, illetve a hVEGFr-t ugyancsak összekapcsolhatjuk olyan anyagokkal, amelyeket pusztán önmaguk jellemző tulajdonságai alapján nem lehet egyértelműen a citotoxinok osztályába besorolni, amelyek azonban nagymértékben fokozhatják az itt szereplő kompozíciók aktivitásának szintjét. Például a hVEGF, a hVEGFr vagy hVEGF-hVEGFr komplexum kötésére képes monoklonális antitestek vagy hVEGFr fuzionálhatok olyan heterológ polipeptidekkel, mint amilyen például bizonyos virális szekvenciák, továbbá celluláris receptorokkal, olyan citokinekkel, mint amilyen példának okáért a TNF (tumor nekrózis faktor), az interferonok vagy az interleukinok, illetve prokaoguláns aktivitással rendelkező polipeptidekkel, valamint más egyéb biológiai vagy immunológiai szempontból aktív polipeptidekkel. Az ilyenfajta fúziók rekombináns módszerek alkalmazása segítségével minden különösebb nehézség nélkül végrehajthatók. Tipikus esetben az ilyen nem immunglobulin természetű polipeptideket egy anti-hVEGF vagy antihVEGF-hVEGFr komplex antitest konstans tartományával vagy tartományaival helyettesítjük, vagy pedig egy hVEGFr transzmembrán és/vagy intracelluláris tartományával. Alternatív megközelítési módként ezek helyettesíthetők egy, a fentiekben leírt anti-hVEGF antitest egy antigén kötőhelyének változó tartományával.

Előnyös megvalósítási módokban az ilyen nem immunglobulin polipeptideket egy imént tárgyalt antitest konstans tartományaihoz csatlakoztatjuk, vagy pedig annak helyére helyettesítjük be [Bennett, et al., J. Bioi. Chem. 266:23060-23067 (1991)]. Alternatív megoldás gyanánt ezek helyettesíthetők egy ugyancsak itt tárgyalt antitest Fv-jével, amely által egy olyan kiméra polivalens antitest képződik, amely legalább egy, a hVEGF-re, hVEGFr-re vagy egy hVEGF-hVEGFr komplexumra specificitással rendelkező maradék antigén kötőhelyet tartalmaz, és egy olyan helyettesítő jellegű antigén kötőhelyet, amelynek a funkciója vagy a specificitása különbözik attól, ami a kiindulópontként használt antitest esetében figyelhető meg.

Heterospecifikus ellenanyagok

A hVEGF-hez, hVEGFr-hez vagy hVEGF-hVEGFr komplexumhoz kötődni képes monoklonális antitesteknek csak egyetlen kötőhelyet kell tartalmazniuk az imént felsorolt epitópok vonatkozásában, típusos esetben egy egyedi nehézlánc-könnyűlánc komplexumot vagy annak töredékét. Mindazonáltal az ilyen ellenanyagok kívánt esetben ugyancsak hordoznak olyan antigénkötő tartományokat, amelyek kötődni képesek a hVEGF, hVEGFr vagy hVEGF-hVEGFr komplexum egyikében sem található epitóphoz. Például egy natív hVEGF ellen, hVEGFr ellen vagy hVEGF-hVEGFr komplexum ellen képződött antitest megfelelő aminosavszekvenciájának vagy aminosavgyökeinek helyettesítése egy, a hVEGF-től, hVEGFr-től vagy a hVEGF-hVEGFr komplexumtól különböző antigén iránt specificitást mutató antitestkomplementaritást meghatározó elemeivel és ha szükséges, keretgyökeivel egy olyan polispecifikus antitestet alakít ki, amely egyrészt tartalmaz egy, a hVEGF, a hVEGFr vagy hVEGF-hVEGFr komplexumra specificitással rendelke6

HU 221 343 Β1 ző antigén kötőhelyet, másrészt pedig egy másik antigén kötőhelyet, amelynek specificitása a nem-hVEGF, nemhVEGFr vagy nem-hVEGF-hVEGFr komplexum antigének irányában mutatkozik meg. Ezek az antitestek legalábbis bivalens jellegűek, de lehetnek polivalensek is annak függvényében, hogy a kiválasztott antitestosztály milyen számú antigén kötőhellyel rendelkezik. Példának okáért az IgM osztályába tartozó antitestek polivalensek lesznek.

A találmány egyik előnyös kiviteli formájában az ilyen antitestek képesek kötődni egy hVEGF- vagy hVEGFr-epitóphoz, valamint vagy (a) egy olyan, a véralvadás területén aktív polipeptidhez, mint amilyen például a C-fehérje vagy a szöveti faktor, vagy (b) egy olyan citotoxikus fehérjéhez, mint amilyen a tumor nekrózis faktor (TNF), vagy (c) az olyan nem-hVEGFr sejtfelületi receptorhoz, mint amilyen például a CD4 vagy a HER-2 receptor [Maddon, et al., Cell 42:93 (1985); Coussens, et al., Science 230:1137 (1985)]. Heterospecifikus, multivalens antitesteket könnyen elő lehet állítani a gazdasejtek egy, mindkét antitest nehéz láncát és könnyű láncát kódoló DNS-sel végzett együtttranszformálásával, majd ezek után immunaffinitásos kromatográfia vagy más ehhez hasonló eljárás segítségével történő kinyerésével, így állítható elő az az expresszált antitestrész, amely rendelkezik a kívánt antigénkötő tulajdonságokkal. Alternatív megközelítési módként szolgálhat, amennyiben az ilyen antitesteket monospecifikus antitestek in vitro rekombinációja útján állítjuk elő.

Monovalens ellenanyagok

A hVEGFr-hez vagy a hVEGF-hVEGFr komplexumhoz kötődni képes monovalens ellenanyagok különösen jól hasznosíthatók hVEGF-antagonista szerepkörben. Anélkül, hogy a találmányt leszűkítenénk bármilyen speciális biológiai aktivitási mechanizmusra, azt lehet gondolni, hogy a celluláris hVEGF-receptorok aktiválása egy olyan mechanizmus segítségével folyik le, amelynek során a hVEGF kötődése a celluláris hVEGFreceptorhoz a receptorok aggregációját indukálja, ez viszont a maga részéről aktiválja az intracelluláris receptor kináz aktivitást. Mivel a monovalens anti-hVEGF-receptor antitestek nem képesek indukálni ilyen aggregációt, és ennek következtében nem képesek az említett mechanizmus útján aktiválni a hVEGF-receptort, ezért ezek a hVEGF ideális antagonistáinak tekinthetők.

Mindazonáltal meg kell jegyezni azt is, hogy ezeket az antitesteket a receptor-hVEGF kötőhelye ellen kell irányítani, vagy pedig ezeknek valamilyen más módon kell képeseknek lenniük akadályozni a hVEGF kötődését a hVEGF-receptorhoz, példának okáért sztérikus módon gátolva a hVEGF hozzáférését a receptorhoz. Ahogyan ezt ebben az összefüggésben más helyütt tárgyaltuk, a hVEGF kötődésével interferálni nem képes hVEGFr ellen képződött antitestek azonban hasznosíthatók lehetnek olyan esetekben, amikor konjugáljuk ezeket olyan nem immunglobulin típusú molekularészekkel, mint amilyenek például a citotoxinok.

A monovalens antitestek előállítására szolgáló módszerek a területen jól ismertek. Például az egyik ilyen módszer lényege abban áll, hogy immunglobulin könnyű lánc és módosított nehéz lánc rekombináns expressziójára kerül sor. Általában a nehéz láncot az Fc-régió valamelyik pontján csonkolhatjuk, hogy ezen a módon elkerülhető legyen a nehézlánc-keresztkötések kialakulása. Egy alternatív megközelítési mód szerint az ide vonatkozó ciszteingyököket más aminosavmaradékokkal helyettesíthetjük, vagy pedig eltávolíthatjuk, ugyancsak a keresztkötések kialakulásának megelőzése céljából. In vitro módszerek ugyancsak alkalmasak lehetnek monovalens antitestek előállítására. Például Fab fragmentumokat elő lehet állítani intakt antitestek enzimatikus úton végzett hasításával.

Diagnosztikai alkalmazások

Diagnosztikai alkalmazások céljaira a találmányban szereplő antitesteket vagy hVEGFr-t típusos esetben valamilyen kimutatható molekularésszel meg kell jelölni. A kimutatható molekularész olyan természetű lehet, amely képes valamilyen fajta akár közvetlenül, akár közvetett módon felismerhető jel kibocsátására. Például a felismerhető rész lehet egy olyanféle radioaktív izotóp, mint a ³H, a ¹⁴C, a ³²P, a ³⁵S vagy a ¹²⁵I, egy fluoreszcens vagy kemoluminiszcens anyag, mint a fluoreszcein izotiocianát, a rodamin vagy a luciferin; radioaktív izotópos jelzőanyagok, mint például a ¹²⁵I, a ³²P, a ^l4C vagy a ³H, vagy valamilyen olyan enzim, mint amilyen az alkalikus foszfatáz, a béta-galaktkozidáz vagy a torma peroxidáz.

A szakterületen az antitestnek vagy a hVEGFr-nek a felismerhető molekularésszel történő elkülönült konjugációjára szolgáló bármely ismert módszer használható, beleértve azokat az eljárásokat, amelyeknek leírása a következő irodalmi hivatkozásokban található meg: Hunter etal., Natúré 744:945 (1962); Dávid etal., Biochemistry 73:1014 (1974); Pain et al., J. Immunoi. Meth. 40:219 (1981); valamint Nygren, J. et al., J. Histochem. and Cytochem. 30.407 (1982).

A jelen találmányban szereplő antitestek és receptorok alkalmazhatók minden ismert elemzési módszerben, ideértve a kompetitív kötési elemzéseket, a direkt és indirekt szendvicselemezéseket, továbbá az immunprecipitációs elemzéseket [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987)].

A kompetitív kötési elemzések egy jelzett standard (amely lehet hVEGF vagy annak egy immunológiailag aktív részlete) azon a képességen alapulnak, hogy egy korlátozott mennyiségben jelen lévő antitest megkötéséért versenyezni képes a vizsgálati minta analittal (hVEGF). A vizsgálati mintában található hVEGF mennyisége fordított arányban áll az antitestekhez vagy receptorokhoz kötődött standard mennyiségével. A kötötté váló standard mennyisége meghatározásának elősegítése céljából a versengés előtt vagy azt követően az antitesteket vagy a receptorokat általában inszolubilizáljuk úgy, hogy az antitestekhez vagy a receptorokhoz kötött standardok és analitok könnyen elkülöníthetők legyenek a nem megkötött állapotban maradt analitoktól és standardoktól.

A szendvicselemzések során két olyan antitestet vagy receptort használunk, amelyek mindegyike a ki7

HU 221 343 Β1 mutatni kívánt fehérje más-más immunogén részletéhez, vagy epitópjához képes kötődni. Egy szendvicsvizsgálatban a vizsgálati analit egy első antitesthez vagy receptorhoz kötődik, amely egy szilárd hordozón van immobilizálva, majd ezek után egy második antitest kötődik az analithez, egy három részből összetevődő oldhatatlan komplexumot hozva ilyen módon létre (Dávid & Greene, U. S. Pat. No. 4,376,110). Magát a második antitestet vagy receptort is jelölni lehet egy felismerhető molekularésszel (direkt szendvicselemzések), vagy pedig meghatározására egy felismerhető molekularésszel jelzett anit-immunglobulin antitest segítségével kerül sor (indirekt szendvicselemzés). Példának okából a szendvicselemzés egyik típusa egy ELISAelemzés, amelynek esetében a felismerhető molekularész egy enzim.

Az itt tárgyalt antitestek vagy receptorok mindezeken túlmenően in vivő képalkotó eljárások céljaira is felhasználhatóak, amelyek folyamán egy felismerhető molekularésszel jelzett antitestet vagy hVEGF-t adunk be a betegnek, előnyösen közvetlenül a vérkeringésbe, és a beteg szervezetében a jelzett antitest vagy receptor jelenlétét vagy elhelyezkedését észleljük. Ez a képalkotási technika felhasználható lehet például rosszindulatú daganatok előrehaladottságának megállapításaira, gyógykezeléseire. Az antitest, vagy a hVEGF jelölése minden olyan molekularésszel elvégezhető, amely emlősben felismerhető, legyen szó bár mágneses magrezonancián alapuló, radiológiai vagy bármely más, a szakmában ismert kimutatási eljárásról.

Terápiás alkalmazások

Terápiás alkalmazások céljából a találmányban szereplő antagonistákat gyógyszerészetileg elfogadható adagolási formában adjuk be emlősöknek, elsősorban embernek. Ezek közé az adagolási formák közé tartoznak az intravénás bejuttatás emberbe akár bóluszként, akár egy bizonyos időtartamot felölelő folyamatos infúzió formájában, valamint az intramuszkuláris, intraperitoneális, intracerebrospinális, szubkután, intraartikuláris, intraszinoviális, intratekális, orális, helyi vagy inhalációs bejuttatási módok. Az antagonisták ugyancsak megfelelőképpen alkalmasak intratumorális, peritumorális, intralézionális vagy perilézionális beadási módokkal történő bevezetésre olyan célból, hogy akár lokális, akár szisztémás terápiás hatásokat lehessen elérni segítségükkel. Az előzetes várakozások szerint az intraperitoneális bejuttatási mód különösen hasznosnak bizonyulhat például a petefészek daganatainak kezelése terén.

Az ilyen adagolási formák kiterjednek olyan gyógyszerészetileg elfogadható vivőanyagok alkalmazására is, amelyek önmagukban sem toxikus, sem terápiás hatásokkal nem rendelkeznek. Az ilyen vivőanyagok közé tartoznak az ioncserélők, a timföld, az alumíniumsztearát, a lecitin, a különféle szérumfehérjék, mint például a humánszérum-albumin, az olyan pufferanyagok, mint amilyenek a foszfátok, a glicin, a szorbinsav, a kálium-szorbát, a telített növényi zsírsavakból készült részleges glicerid keverékek, a víz, a különféle sók vagy olyan elektrolitok, mint például a protamin-szulfát, a dinátrium-hidrogén-foszfát, a kálium-hidrogénfoszfát, a nátrium-klorid, a cinksók, a kolloid állapotban levő kovasav, a magnézium-triszilikát, a polivinilpirrolidon, a cellulóz alapú anyagok, valamint a polietiénglikol. Az antagonista topikális vagy gélalapú formáinak vivőanyagai közé tartoznak az olyan poliszacharidok, mint például a nátrium-karboxi-metil-cellulóz vagy a metil-cellulóz, a polivinil-pirrolidon, a poliakrilátok, a polioxi-etilén-polioxi-propilén tömbpolimerek, a polietilénglikol, és a faviasz alkoholok. Minden beadáshoz a hagyományos depót formák megfelelőképpen használhatók. Az ilyen formák közé tartoznak például a mikrokapszulák, a nano-kapszulák, a liposzómák, a tapaszok, az inhalációs formák, az orrsprayk, a szublingvális tabletták és késleltetett felszívódású készítmények. Az ilyenfajta vivőanyagokhoz az antagonistát tipikus esetekben mintegy 0,1 milligramm/millilitertől 100 milligramm/milliliterig terjedő koncentrációban adják hozzá.

A késleltetett felszívódású készítményekre alkalmas példák közé tartoznak az antagonistát tartalmazó szilárd hidrofób polimerekből álló szemipermeábilis (félig áteresztő) mátrixok, amely mátrixok olyan kialakítású kiszerelési formákban fordulhatnak elő, mint például filmek vagy mikrokapszulák. A késleltetett felszívódású mátrixokkal kapcsolatos példák közé tartoznak a poliészterek, a hidrogélek (például a poli(2-hidroxietil-metakrilát), ahogy leírták Langer et al. [J Biomed. Mater. Rés. 75:167 (1981) és Langer [Chem. Tech. 72. 98-105 (1982)], vagy poli(vinil-alkohol) polilaktidok (U. S. Pat. No. 3,773,919), az L-glutaminsav és a gamma etil-L-glutamát kopolimerjei [Sidman et al., Biopolymers 22:547 (1983)], nem degradálódó etilén-vinil-acetát (Langer et al., mint a fentebbiekben), degradálódó tejsav-glikolsav-kopolimerek, mint például a Lupron Depot™ (injektálható mikroszférák, amelyek tejsav-glikolsav-kopolimerekből és leuprolid acetátból állnak), és poli-D-(-)-hidroxi-vajsav. Míg az olyan polimerek, mint amilyen például az etilén-vinilacetát és a tejsav-glikolsav, több mint száz napos időtartamra teszik lehetővé a molekulák felszabadulását, bizonyos hidrogélek rövidebb időszakokra szabadítják fel a fehérjéket. Ha a kapszulába zárt polipeptid antagonisták hosszabb ideig maradnak a szervezetben, a 37 °Cos nedves közegnek kitéve denaturálódhatnak vagy aggregálódhatnak, amelynek eredményeképpen elveszíthetik biológiai aktivitásukat és fennáll annak a lehetősége is, hogy immunogenitásuk terén bizonyos változások következhetnek be. Az adott mechanizmustól függően a stabilizáció céljait szolgáló racionális stratégiák alakíthatók ki. Például, ha az derül ki, hogy az aggregáció mechanizmusa a tio-diszulfid-kicserélődés útján létrejövő intramolekuláris S-S kötés kialakulására vezethető vissza, akkor a stabilizáció a szulfhidrilmaradékok módosításával érhető el savas vegyhatású oldatokból történő liofilizálással, a nedvességtartalom ellenőrzésével, megfelelő adalék anyagok használatával, illetve specifikus polimer-mátrix összetételek kifejlesztésével.

A késleltetett kibocsátású hVEGF-antagonista összetételek közé ugyancsak beletartoznak a liposzomálisan becsomagolt antagonista antitestek. Az

HU 221 343 BI antagonistákat tartalmazó liposzómák a szakmában ismert olyan módszerekkel állíthatók elő, mint például ahogyan az a következő közleményekben van leírva: Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); U. S. Patent No. 4,485,045; U.

S. Patent No. 4,544,545. Rendszerint a liposzómák kicsiny (mintegy 200-800 angströmnyi) unilamelláris típusúak, amelyek lipidtartalma meghaladja a körülbelül 30 mólszázalék koleszterint, és a megválasztott arány az optimális HRG-terápia szempontjához igazodik. A fokozott keringési idővel rendelkező liposzómákra vonatkozó információk megtalálhatók a következő szabadalmi leírásban: U. S. Patent No. 5,013,556.

A jelen találmány egy másik felhasználási módja magában foglalja egy hVEGF-antagonista beépítését formázott termékbe (formed article). Az ilyen formázott termék felhasználható lehet az endoteliális sejtnövekedés és angiogenezis módosítása terén. Ezen túlmenően a daganatos invázió és áttétképzés is módosítható ezekkel a készítményekkel.

Betegségek megelőzése vagy kezelése céljából az antagonista megfelelő adagolása függ a kezelni kívánt betegség típusától, amint az fentebb meghatározásra került, a betegség súlyossági fokától és lefolyásától, attól a körülménytől, hogy az antitestek adagolása preventív vagy terápiás célzattal történik, az előzőleg végzett kezeléstől, a beteg klinikai anamnézisétől és az antagonistával kapcsolatos reakciójától, illetve a kezelőorvos belátásától. Az antagonista a beteg számára megfelelőképpen alkalmazható egyszeri beadás vagy sorozatos kezelések formájában.

A hVEGF-antagonisták hasznosak lehetnek különféle neopláziás és nem neopláziás jellegű betegségek és rendellenességek kezelése terén. A kezelés szempontjából számításba jöhető daganatos folyamatok és azzal összefüggésben álló kóros állapotok közé tartoznak az emlő rosszindulatú daganatai, a tüdő rosszindulatú daganatai, a gyomor rosszindulatú daganatai, a nyelőcső rosszindulatú daganatai, a vastagbél és a végbél rosszindulatú daganatai, a petefészek rosszindulatú daganatai, tekómák, arrenoblasztomák, a méhnyak rosszindulatú daganatai, az endometriális karcinóma, az endometriális hiperplázia, az endometriózis, a különféle fibroszarkómák, a koriokarcinóma, a fej- és nyak rosszindulatú daganatai, a nazofaringeális karcinóma, a gége rosszindulatú daganatai, a hepatoblasztóma, a Kaposi-szarkóma, a melanóma, a bőr rosszindulatú daganatai, a hemangióma, a kavemás hemangióma, a hemangioblasztóma, a hasnyálmirigy rosszindulatú daganatai, a retinoblasztóma, az asztrocitóma, a glioblasztóma, a Schwannoma, az oligodendroglióma, a medulloblasztóma, a különféle neuroblasztómák, rabdomioszarkóma, az oszteogén szarkóma, a leiomioszarkómák, a húgyutak rosszindulatú daganatai, a pajzsmirigy rosszindulatú daganatai, a Wilm-tumor, a vesesejtek rosszindulatú daganatai, a prosztatarák, a fakomatózisokkal kapcsolatos abnormális vaszkuláris proliferáció, az ödéma (mint például ami az agydaganatokhoz társul) és a Meig-szindróma.

A betegség típusától és súlyossági fokától függően az antagonista mintegy 1 pg/kg-tól 15 mg/kg-ig terjedő dózisai tekinthetőek kezdeti dózisjelöltnek, ebben szerepet játszik, hogy például egyszeri vagy többszöri elkülönített adagolásról van-e szó vagy folyamatos infúzió alkalmazásáról. A tipikus napi dózistartomány körülbelül 1 pg/kg-tól 100 mg/kg-ig vagy még feljebb terjedhet, a fentebb említett tényezők függvényében. Néhány napon át vagy még hosszabb ideig tartó ismételt alkalmazás esetén a beteg állapotától függően a kezelés addig ismételhető, amíg a betegség tüneteinek kívánt visszaszorítása be nem következik. Mindazonáltal más adagolási előírások is hasznosaknak bizonyulhatnak. A terápia előrehaladása könnyen figyelemmel kísérhető az olyan hagyományos technikák és elemzések segítségével, mint amilyen például a daganatok radiográfiás leképezése.

A találmány egy másik megvalósulási módja szerint az antagonistának betegségek megelőzése vagy kezelése terén mutatott hatékonysága fokozható magának az antagonistának a sorozatos adásával vagy pedig egyéb, az olyan, a kitűzött célok szempontjából hatékony szerekkel kombinációban adva, mint amilyen például a tumor nekrózis faktor (TNF), egy a savanyú vagy bázikus fibroblaszt növekedési faktor (FGF) vagy a hepatocita növekedési faktor (HGE) angiogén aktivitását gátolni vagy semlegesíteni képes antitest, egy, a szöveti faktor, a C-fehérje, vagy az S-fehérje koagulációs aktivitását gátolni vagy semlegesíteni képes antitest (lásd Esmon, et al., PCT Patent Publication No. WO 91/01753, megjelent 1991. február 21-én), vagy egy, illetve több olyan hagyományos terápiás készítmény, mint amilyenek példának okáért az alkilezőszerek, a folsav antagonisták, a nukleinsav anyagcsere antimetabolitjai, a különféle antibiotikumok, a pirimidinanalógok, az 5-fluor-uracil, a purin nukleozidok, a különféle aminok, aminosavak, triazol-nukleozidok vagy kortikoszteroidok. Az ilyen egyéb szerek részei lehetnek az adagolásra kerülő kompozíciónak, vagy pedig beadásuk külön is történhet. Ugyancsak az antagonista megfelelőképpen adagolható kúraszerűen vagy radiológiai típusú kezelésekkel kombinációban alkalmazva, legyen az besugárzás vagy radioaktív anyagok beadása.

Egy megvalósulási formában a daganatok vaszkularizációja kombinációs terápia formájában támadható meg. Ilyen esetekben a daganatos betegnek egy vagy több hVEGF-antagonistát adagolunk terápiásán hatékony dózisokban, amelyek megállapítása például a daganat, illetve, ha vannak ilyenek, akkor a metasztatikus gócok elhalást ütemének figyelemmel kísérése útján történhet. Ezt a terápiát addig folytatjuk, amíg további jótékony hatás nem figyelhető meg, vagy a klinikai vizsgálat nem mutatja a daganat vagy áttétes góc nyomait sem. Ekkor TNF-adagolásra kerül sor akár önmagában, akár olyan kiegészítő szerekkel kombinációban, mint amilyenek például az alfa-, béta- vagy a gamma-interferon, az anti-HER2 antitest, a heregulin, a heregulinellenes antitest, a D-faktor, az interleukin-1 (IL—1), az interleukin-2 (IL-2), a granulocita-makrofág telepstimuláló faktor (GM-CFS), vagy az olyan szerek, amelyek elősegítik a mikrovaszkuláris koagulációt a daganatokban,

HU 221 343 Bl mint amilyen például az anti-C fehéqe antitest, az anti-S fehéqe antitest vagy a C4b kötő fehérje (lásd Esmond et al., PCT Patent Publication No. WO 91/017053, a nyilvánosságra hozatal időpontja: 1991. február 21.), illetve a hőkezelés vagy a besugárzás.

Mivel a kiegészítő készítmények hatékonysága bizonyos változékonyságot mutat, ezért kívánatos dolog hagyományos módon végrehajtott mátrixátvizsgálás segítségével összehasonlítani a daganatra gyakorolt hatásukat. A hVEGF-antagonista és a TNF bevezetését addig kell ismételni, amíg a kívánt klinikai hatás elérésére sor nem kerül. Alternatív módon a hVEGF-antagonistá(ka)t együtt alkalmazzuk a TNF-fel és kívánt esetben kiegészítő szerrel vagy szerekkel. Bizonyos olyan esetekben, ahol szilárd tumorok fordulnak elő a végtagok területén vagy más olyan helyeken, amely hajlamos az általános keringéstől való elkülönülésére, a fentiekben leírt terápiás szereket az izolált daganatba vagy szervbe adjuk be. Más megvalósítási módokban az FGF- vagy trombocita-eredetű növekedési faktor (PDGF) antagonistát adunk a betegnek a hVEGF antagonistával együtt. A hVEGF antagonistáival történő kezelés optimális esetben felfüggeszthető a sebgyógyulás vagy a kívánatos revaszkularizáció időszakai folyamán.

Egyéb felhasználási területek

A találmány tárgyát képező anti-hVEGF antitestek ugyancsak használhatók affinitásos tisztítószerként. Ebben az eljárásban a hVEGF-ellenes antitestek olyan megfelelő hordozón vannak immobilizálva, mint amilyen egy Sephadex gyanta vagy szűrőpapír, a szakmában ismert eljárások alkalmazásával. Az immobilizált antitest azután érintkezésbe kerül egy, a tisztítandó hVEGF-et tartalmazó mintával és ezután a hordozót átmossuk egy, a célnak megfelelő oldószerrel, amely lényegében minden, a mintában levő anyagot a hVEGF kivételével eltávolít, amely viszont hozzá van kötődve az immobilizált antitesthez. Végül a hordozót átmossuk egy másik megfelelő oldattal, mint például egy pH 5,0 értékű glicinpufferrel, amelyik leválasztja a hVEGF-et az antitestről.

A következő példák csak az illusztráció célját szolgálják, és nem arra vannak szánva, hogy a találmány oltalmi körét bármely módon lehatárolják.

1. példa

Anti-h VEGF monoklonális antitestek előállítása

Abból a célból, hogy az immunizáláshoz keyhole limpet (kulcslyuk kagyló) hemocianinhoz (KLH) konjugált hVEGF kapjunk, rekombináns hVEGF-et (165 aminosav) [Leung et al., Science 246: 1306 (1989)] összekeverünk KLH-val 4:1 arányban 0,05% glutáraldehid jelenlétében és a keveréket három óra hosszat inkubáljuk szobahőmérsékleten finoman végzett kevertetés mellett. A keveréket ezután foszfáttal pufferolt élettani konyhasóoldattal (PBS; phosphate buffered saline) szemben dializáljuk 4 °C hőmérsékleten egy éjszakán át.

Balb/c egereket kéthetente összesen 4 darab, 5 pg hVEGF és 20 pg KLH konjugátumából álló intraperitoneális injekcióval immunizálunk és a KLH-val konjugált hVEGF ugyanazon dózisával emlékeztető oltást adunk be 4 nappal a sejtinfüzió előtt.

Az immunizált egerekből származó lépsejteket P3X63Ag8U.l mielómasejtekkel fuzionáljuk [Yalton et al., Curr. Top. Microbiol. Immunoi. 81:1 (1978)], 35%os polietilénglikol (PEG) alkalmazásával, ahogyan az a következő közleményben szerepel: Yarmush et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 77:2899 (1980). A hibridómákat HAT-tápközegben szelektáljuk.

A hibridómasejt-tenyészetekből származó felülúszót anti-hVEGF antitesttermelés szempontjából ELISA-vizsgálat segítségével vizsgáljuk át, amelynek során hVEGF-fel burkolt mikrotitráló lemezeket használunk. Az egyes mélyedésekben található hVEGF-hez kötődött antitesteket alkalikus foszfatázzal konjugált kecske anti-egér IgG immunglobulin és a p-nitrofenilfoszfát kromogén szubsztrát alkalmazásával határozzuk meg [Harlow & Lane, Antobodies: A Laboratory Manual, p. 597 (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)]. Az ilyen módon meghatározott, anti-hVEGF antitestek termelésére szánt hibridómasejteket korlátozó hígítással szubklónozzuk és az így nyert kiónok közül további vizsgálatok céljaira kettőt választunk ki, amelyeket A4.6.1 és B2.6.2 megjelöléssel látunk el.

2. példa

Anti-h VEGF monoklonális antitestek jellemzése

A. Antigén specificitás

Az A4.6.1 és B2.6.2 hibridómák által termelt antihVEGF monoklonális antitestek kötési specificitását ELISA segítségével határozzuk meg. A monoklonális antitesteket az előzetesen hVEGF-fel, FGF-fel, HGF-fel vagy epidermális növekedési faktorral (EGF; epidermal growth factor) bevont mikrotitráló lemezek mélyedéseihez adjuk hozzá. A megkötött antitesteket peroxidázzal konjugált kecske anti-egér IgG immunglobulinok segítségével ismerjük fel. Ezeknek a vizsgálatoknak az eredményei megerősítették azt, hogy az A4.6.1 és a B2.6.2 hibridómák által termelt monoklonális antitestek kötődnek a hVEGF-hez, viszont az egyéb fehéqe növekedési faktorokhoz kimutatható mértékű kötődést nem lehetett észlelni.

B. Epitóp térképezés

Egy kompetitív kötést alkalmazó ELISA-vizsgálatot használunk annak a kérdésnek az eldöntésére, hogy vajon az A4.6.1 és B2.6.2 hibridómák által termelt monoklonális antitestek a hVEGF-en belül ugyanahhoz vagy különböző epitópokhoz (helyekhez) kötődnek-e [Kim et al., Infect Immun. 57:944 (1989)]. Az előzőleg hVEGFfel burkolt mikrotitráló lemezek mélyedéseihez egyedi jelzetlen anti-hVEGF monoklonális antitesteket (A4.6.1 vagy B2.6.2) vagy irreleváns anti-hVEGF antitesteket (IgGl izotípus) adunk. Ezután biotinilezett anti-hVEGF monoklonális antitestek (BIO-A4.6.1 vagy BIO-B2.6.2) hozzáadására kerül sor. A biotinilezett antitest aránya a jelzetlen antitesthez viszonyítva 1:100. A biotinilezett ellenanyagok kötődését avidinnel konjugált peroxidáz hozzáadásával tesszük láthatóvá, amelyet O-fenilén-diamin-dihidroklorid és hidrogén-peroxid hozzáadása követ. A biotinilezett antitestkötés mennyiségi viszonyait jelző színreakciót a 495 nm hullámhosszon mért optikai sűrűség (O. D.) mérésével határozzuk meg.

HU 221 343 Bl

Ahogyan az 1. ábrán is látszik, minden egyes esetben a biotinilezett anti-hVEGF antitest kötődését a megfelelő jelöletlen antitest gátolja, ezzel szemben az egyéb jelöletlen anti-hVEGF antitestek vagy anti-HGF antitestek ilyen gátló hatást nem fejtenek ki. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy az A4.6.1 és a B2.6.2 hibridómák által termelt monoklonális antitestek a hVEGF-en belül különböző epitópokhoz kötődnek.

C. Izotipizálás

Az A4.6.1 és B2.6.2 hibridómák által termelt antihVEGF monoklonális antitestek izotípusait ELISA segítségével határozzuk meg. Az előzőleg hVEGF-fel bevont mikrotitráló lemezek mélyedéseihez az egyes hibridómák tenyésztéséhez használt tenyésztő tápközegek (felülúszó) mintáit adjuk hozzá. A megkötött antihVEGF monoklonális antitesteket különböző izotípusokra specifikus alkálikus foszfatázzal konjugált kecske anti-egér immunglobulinokkal inkubáljuk és a konjugált antitestek kötődését az anti-hVEGF monoklonális antitestekhez p-nitrofenil-foszfát hozzáadásával határozzuk meg. A színreakciót 405 nanométeren mérjük egy ELISA lemezleolvasóval.

Ezzel a módszerrel mind az A4.6.1, mind pedig a B2.6.2 hibridómák által termelt monoklonális antitestek izotípusairól megállapítjuk, hogy az IgGl immunglobulin csoportba tartoznak.

D. Kötési affinitás

Az A4.6.1 és B2.6.2 hibridómák által termelt antihVEGF monoklonális antitesteknek a hVEGF irányában mutatott affinitásait kompetitív kötési vizsgálatok segítségével határozzuk meg. A monoklonális antitesteket egy előre meghatározott szuboptimális koncentrációban adjuk hozzá a 20 000-40 000 cpm ¹²⁵I-hVEGF (1-2 ng) tartalmú mintákhoz, illetve ismert mennyiségű jelöletlen hVEGF-et (1-1000 ng) tartalmazó mintákhoz. Szobahőmérsékleten tárolva 1 óra elteltével 100 μΐ kecske anti-egér lg antiszérumot (Pel-Freez, Rogers, AR, USA) adunk hozzá, majd az ilyen módon kapott keveréket még további egy órán keresztül inkubáljuk szobahőmérsékleten. Az antitestből és megkötött fehérjékből álló komplexumokat (immunkomplexumokat) 500 pl 6%-os polietilénglikol (PEG; molekulatömeg: 8000) hozzáadásával kicsapjuk 4 °C-os hőmérsékleten. Ezt húsz percen keresztül tartó 2000xg centrifugálás követi 4 °C-on. Az anti-hVEGF monoklonális antitestekhez kötött ¹²⁵I-hVEGF mennyiségét minden egyes mintában az üledékbe vitt anyag aktivitásának gammaszámlálóval mért beütésszáma alapján határozzuk meg.

Az affinitást konstansokat a nyert adatokból Scatchard-analízissel számítjuk ki. Az A4.6.1 hibridóma által termelt anti-hVEGF monoklonális antitestek affinitására a számítás szerint 1,2xlO⁹ liter/mol értéket kapunk. A számítások szerint a B2.6.2 hibridóma által termelt monoklonális antitestek affinitása 2,5 xlO⁹ liter/mólnak adódott.

E. A h VEGF mitogén aktivitás gátlása

Szarvasmarha mellékvesekéreg kapilláris endotél (ACE) sejteket [Ferrara et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84-.5ΊΊ3 (1987)] oltunk 10⁴ sejt/ml sűrűségben 12 többmélyedéses lemezre, és mindegyik mélyedéshez

2,5 ng/ml hVEGF-et adunk az A4.6.1 vagy B2.6.2 hibridómák által termelt anti-hVEGF monoklonális antitestek, illetve egy irreleváns anti-HGF monoklonális antitestek, illetve egy irreleváns anti-HGF monoklonális antitest különféle koncentrációinak jelenlétében vagy azok hiányában. Ötnapi tenyésztés után minden egyes mélyedésben egy Coulter-számláló segítségével meghatározzuk a jelenlévő sejtek számát. Kontrollként ACE-sejteket tenyésztünk hozzáadott hVEGF nélkül.

Ahogyan ez a 2. ábrán látszik, mindkét fajta antihVEGF monoklonális antitest gátolja a hozzáadott hVEGF azon képességét, hogy elősegítse a szarvasmarha ACE-sejtek növekedését vagy túlélését. Az A4.6.1 hibridóma által termelt monoklonális antitest teljesen legátolja a hVEGF mitogén aktivitását (mintegy 90%-osnál nagyobb mértékű gátlás), miközben a B2.6.2 hibridóma által előállított monoklonális antitest csupán részleges gátló hatást fejt ki a hVEGF mitogén aktivitására.

F. A hVEGF-kötésgátlása

Szarvasmarha ACE-sejteket oltunk mélyedésenként 2,5 χ 10⁴ sejt/0,5/ml/mélyedés sűrűségben 24 mélyedés mikrotitráló lemezekre 10%-os borjúszérumot, 2 mmol/liter glutamint és 1 ng/ml bázikus fibroblaszt növekedési faktort tartalmazó Dulbecco-féle módosított Eagle tápközegben (DMEM; Dulbecco’s Modified Eagle’s Médium). Egy éjszakán át tartó tenyésztés után a sejteket egyszer átmossuk kötő pufferrel (egyenlő térfogatú DMEM és F12 tápközeg plusz 25 mmol/1 HEPES és 1% szarvasmarhaszérum-albumin) 4 °C-on.

000 cpm mennyiségű ¹²⁵I-hVEGF-t (körülbelül 5χ10⁴ cpm/ng/ml) előzetes inkubálásnak vetünk alá 30 percen keresztül 5 pg anti-hVEGF monoklonális antitesttel, amelyet az A4.6.1, B2.6.2 vagy

A2.6.1 hibridómákkal hozunk létre (250 pl teljes térfogattal), és ezt követően a keveréket hozzáadjuk a mikrotitráló lemezeken lévő szarvasmarha ACE-sejtekhez. Miután a sejteket 4 °C-on három órán keresztül inkubáltuk, ugyancsak 4 °C-on három alkalommal átmossuk kötő pufferrel, azután 0,5 ml 0,2 n NaOH hozzáadásával oldatba visszük, és egy gammaszámláló segítségével mérjük a beütésszámot.

Ahogyan ezt a 3. ábra (felső) mutatja, az A4.6.1 és B2.6.2 hibridómák által termelt anti-hVEGF monoklonális antitestek gátolják a hVEGF kötődését a szarvasmarha ACE-sejtekhez. Ezzel szemben az A2.6.1 hibridóma által termelt hibridóma nem rendelkezik semmilyen érzékelhető hatással a hVEGF szarvasmarha ACE-sejtekhez való kötődésének vonatkozásában. A fentebb leírt sejtproliferációs vizsgálat során nyert eredményekkel összhangban az A4.6.1 hibridóma által előállított monoklonális antitest nagyobb mértékben gátolja a hVEGF kötődését, mint a B2.6.2 hibridóma.

Ahogyan az a 3. (alsó) ábrán látszik, az A4.6.1 hibridóma által termelt monoklonális antitest a hVEGF szarvasmarha ACE-sejtekhez való kötődését teljes mértékben gátolja a hVEGF-nek az antitesthez viszonyított 1:250 moláris aránya mellett.

G. Keresztreaktivitás egyéb VEGF izoformákkal

Annak érdekében, hogy meghatározhassuk, hogy az

A4.6.1 hibridóma által termelt anti-hVEGF monokloná11

HU 221 343 Β1 lis antitest reagál-e a hVEGF 121-aminosavas és 189aminosavas formáival, az antitestet megvizsgáljuk arra, hogy mennyire képes immunprecipitálni ezeket a polipeptideket.

Humán 293-sejteket a 121-aminosavas és a 189aminosavas hVEGF-polipeptidek szekvenciáit kódoló nukleotidot tartalmazó vektorokkal transzfektálunk, ahogyan az le van írva a következő közleményben: Leung et al., Science 246:1306 (1989). Két nappal a transzfekciót követően a sejteket átvisszük egy olyan tápközegbe, amely nem tartalmaz ciszteint és metionint. A sejteket 30 percen keresztül inkubáljuk ebben a tápközegben, azután mind ³⁵S-metioninból, mind ³⁵Sciszteinből hozzáadunk 100 pCi/ml-t, és a sejteket tovább inkubáljuk két órán keresztül. A jelzést olyan módon követjük nyomon, hogy a sejteket áthelyezzük szérummentes tápközegbe és három órán keresztül inkubáljuk. A sejttenyésztő tápközegeket összegyűjtjük és a sejteket egy lízispufferben [150 mmol/1 nátrium-klorid, 1% NP40, 0,5% dezoxikolsav, 0,1% nátrium-dodecilszulfát (SDS), 50 mmol/1 Tris (pH 8,0)] 30 perces inkubálással lizáljuk. A sejttörmeléket 30 percen keresztül tartó 200 xg centrifugálás segítségével távolítjuk el a lizátumokból.

A sejttenyésztő tápközegből és a sejtlizátumokból származó 500 mikroliteres mintákat 2 mikroliter A4.6.1 hibridóma antitesttel (2,4 mg/ml) 1 órán keresztül 4 °C-on, azután ugyancsak 1 órán keresztül 4 °C-on inkubáljuk 5 mikroliter nyúl anti-egér IgG immunglobulinnal. A ³⁶S izotóppal jelzett hVEGF és az anti-hVEGF monoklonális antitest immunkomplexeit A-fehérje Sepharose (Pharmacia) segítségével kicsapjuk, azután SDS 12% poliakrilamid gélelektroforézisnek vetjük alá redukáló körülmények között. A gélt röntgenfilmre exponáljuk az immunprecipitált, radioaktív jelzéssel ellátott fehérjék autoradiográfiás analízise céljából.

Ennek az elemzésnek az eredményei azt mutatják, hogy az A4.6.1 hibridóma által termelt anti-hVEGF monoklonális antitestek keresztreaktívak mind a 121-aminosavas, mint a 189-aminosavas hVEGF-változat vonatkozásában.

3. példa

A h VEGF-receptor-IgG fúziós protein előállítása

Az fit hVEGF-receptor nukleotid- és aminosavkódoló szekvenciáinak feltárása megtalálható a következő közleményben: Shibuya et al., Oncogene 5:519-524 (1990). Az flt hVEGF-receptor extracelluláris tartományának kódolószekvenciáját az emberi IgGl nehézlánc-kódoló szekvenciájához fuzionáljuk egy kétlépcsős folyamat során.

Helyre irányuló mutagenezist használunk BstBI restrikciós hely bevezetésére az flt-t kódoló DNS-ben az fit 759. aminosava kodonjának 5’ helyén, és a pBSSKFC plazmid egyedi BstEII restrikciós helyének konvertálására egy BstBI hellyé, ahogyan azt a következő közlemény írja le: Benett et al., J. Bioi. Chem. 266:23060-23067 (1991). A módosított plazmidot EcoRI és BstBI segítségével végzett emésztésnek vetjük alá, és a plazmid-DNS ennek eredményeképpen keletkezett nagyméretű fragmentumát összekapcsoljuk az fit hVEGF-receptor extracelluláris tartományát (1-758-as aminosavak) kódoló fit DNS EcoRI-BstBI fragmentumával.

Az ez által a folyamat által eredményezett konstrukciót Clal-gyel és Notl-gyel emésztjük abból a célból, hogy egy megközelítőleg 3,3 kb-os fragmentumot hozzunk létre, amelyet azután ligálás segítségével beillesztünk a pHEBO2 emlősexpressziós-vektor többszörös klónozási helyére (Leung et al., Neuron 5:1045 (1992). A 3,3 kb-os fragmentum végeit például linkerek hozzáadásával módosítjuk abból a célból, hogy olyan módon illesszük be a fragmentumot a vektorba, hogy annak orientációja megfelelő legyen az expresszió vonatkozásában.

Az emlős gazdasejteket [például a CEN4 sejtek (Leung et al., lásd fentebb)] elektroporáció segítségével transzfektáljuk az fit inzertet tartalmazó pHEBO2plazmiddal. A transzfektált sejteket egy olyan tápközegben tenyésztjük, amelyik mintegy 10% fetális szarvasmarhaszérumot, 2 mmol/1 glutamint, valamint antibiotikumokat tartalmaz, és mintegy 75%-os összefolyásnál áthelyezzük azt szérummentes tápközegbe. A tápközeget a begyűjtést megelőzőleg 3-4 napon keresztül kondicionáljuk, és az flt-lgG fúziós fehérje tisztítása a kondicionált tápközegből egy A-fehérje affinitás mátrixon végrehajtott kromatográfiás eljárás segítségével történik, lényegében a következő közleményben leírt módon: Bennett eí al., J. Bioi. Chem. 266:23060-23067 (1991).

4. példa

A daganatnövekedés gátlása h VEGF-antagonistákkal

Különféle tenyészetben növekvő emberi daganat sejtvonalakat vizsgálunk ELISA-módszerrel a hVEGFtermelés vonatkozásában. Ez petefészek, tüdő, vastagbél, gyomor, emlő és agydaganat sejtvonalak esetében járt azzal az eredménnyel, miszerint hVEGF-et termelnek. A további tanulmányokhoz három hVEGF-et termelő sejtvonalat használunk, amelyek a következők: hVEGF, NEG 55 (úgy is ismert mint G55) (emberi glióma sejtvonal Dr. Westphal M. anyagából, Department of Neurosurgery, University Hospital Eppendor, Hamburg, Németország; maga a sejtvonal az előzőhöz hasonlóképpen ugyancsak olyan elnevezéssel is ismeretes mint G55), A-673 (emberi rabdomioszarkóma sejtvonal, beszerzése a The American Type Culture Collection (ATCC) anyagából történt, Rockville, Maryland, USA 20852, CRL 1598 számú sejtvonalként), és SK-LMS-1 (leiomioszarkóma sejtvonal az ATCC anyagából, HTB 88 sejtvonalként).

Hattól tízhetesig terjedő életkorú nőstény Beige/szőrtelen egereknek (Charles River Laboratory, Wilmington, Massachusetts, USA) szubkután injekció formában 1-5χ10⁶ daganatsejtet alkalmazunk 100-200 μΐ PBS-ben. A daganatnövekedés beindítása után különböző időpontokban az egereknek hetente egyszer vagy kétszer intraperitoneálisan A4.6.1 antihVEGF monoklonális antitestet, egy irreleváns anti-gp

HU 221 343 Β1

120 monoklonális antitestet (5B6), vagy PBS-t fecskendezünk be. Minden héten mérjük a daganatok méreteit, és a vizsgálat befejezésekor a daganatokat kimetsszük és tömegüket méljük.

A különböző mennyiségben adott A4.6.1 antihVEGF monoklonális antitesteknek a NEG 55 daganatokra egerek esetében gyakorolt hatása a 4. és 5. ábrán található. A 4. ábra bemutatja, hogy a NEG 55 sejtek inokulálása után 1 héttel kezdődően 25 μg vagy 100 pg A4.6.1 anti-hVEGF monoklonális antitestekkel kezelt egerek esetében a daganatnövekedés lényegesen csökkent sebességgel folyik, mint az összehasonlítás céljából akár irreleváns antitesttel, akár PBS-sel kezelt egerek esetében. Az 5. ábra bemutatja, hogy 5 héttel a NEG 55 sejtek inokulálását követően az A4.6.1 antihVEGF antitesttel kezelt egerek esetében a daganatok mérete mintegy 50%-tól (az antitest 25 pg-os dózisával kezelt egerek esetében) 85%-ig (az antitest 100 pg-os dózisával kezelt egerek esetében) terjedő nagyságrendű csökkenést mutatott, összehasonlítva az irreleváns antitesttel vagy PBS-sel kezelt egerek szervezetében megfigyelhető daganatokkal.

Az A4.6.1 anti-hVEGF monoklonális antitest kezelés SK-MLS-1 daganatok növekedésére gyakorolt hatása egerekben a 6. ábrán tanulmányozható. Öt héttel az SK-LMS-1 sejtek inokulációja után az A4.6.1 antihVEGF antitest kezelésében részesült egerek szervezetében található daganatok átlagos mérete mintegy 75 %kai volt kisebb annál, amit az irreleváns antitesttel vagy PBS-sel kezelt egerek esetében lehetett megfigyelni.

Az A4.6.1 anti-hVEGF monoklonális antitest kezelés A673 daganatok növekedésére gyakorolt hatása egerekben a 7. ábrán tanulmányozható. Négy héttel az A673 sejtek inokulálását követően az A4.6.1 antihVEGF antitesttel kezelt egerekben jelenlévő daganatok átlagos mérete mintegy 60%-tól (az antitest 10 pgos dózisaival kezelt egerek esetében) 90%-ot meghaladó (az antitest 50-400 pg-os dózisaival kezelt egerek esetében) mértékben volt kisebb, mint az irreleváns antitesttel vagy PBS-sel végzett kezelésben részesült egerek esetében.

5. példa

Az anti-hVEGF ellenanyag-tenyészetben megfigyelhető daganatsejt-növekedésre gyakorolt közvetlen hatásának elemzése

NEG 55 humán glioblasztómasejteket vagy A673 rabdomiószarkóma-sejteket oltunk 7 χ 10³ sejt/mélyedés sűrűségben többmélyedéses lemezekre (12 mélyedés/lemez) F12/DMEM tápközegben, amely 10% boíjúembrió-szérumot, 2 mmol/1 glutamint, valamint antibiotikumokat tartalmaz. Ezután olyan módon adunk anti-hVEGF ellenanyagot a sejttenyészetekhez, hogy a végső koncentráció 0-20 pg antitest/ml legyen. Öt nap elteltével a mélyedésekben növekvő sejteket tripszinnek kitéve disszociáltatjuk és egy Coulter-számláló segítségével számszerű meghatározást végzünk.

A 8. és 9. ábrán láthatók a szóban forgó vizsgálatok eredményei. Amint az nyilvánvalónak látszik, az A4.6.1 anti-hVEGF antitest nem rendelkezik semmilyen jelentősebb mértékű hatással a NEG 55 vagy A673 sejtek növekedésére a tenyészetben. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy az A4.6.1 anti-hVEGF antitest nem citotoxikus, és határozottan azt a következtetést sugallják, hogy az antitest megfigyelt daganatellenes hatásai a VEGF által közvetített neurovaszkularizációt gátló hatásra vezethetők vissza.

6. példa

Az anti-h VEGF ellenanyag hatása az endoteliális sejtek kemotaxisára

Az endoteliális sejtek és az olyan egyéb sejtek, amelyek közé tartoznak a monociták és a limfociták is, kemotaxisa jelentős szerepet tölt be a reumatoid ízületi gyulladás patogenezisében. Az endoteliális sejtek migrációja és proliferációja társul ahhoz az angiogenezishez, amelyik a reumatoid szinoviumban fordul elő. A beereződött szövet (pannus) behatol az ízületi porc állományába és pusztító hatást fejt ki.

Annak a kérdésnek az eldöntése céljából, hogy vajon a hVEGF-antagonisták képesek-e akadályt gördíteni ez elé a folyamat elé, megvizsgáljuk az A4.6.1 anti-hVEGF antitest hatását reumatoid ízületi gyulladásban szenvedő betegekből nyert ízületi folyadék által stimulált endoteliális sejtkemotaxisra. Kontrollként vizsgáljuk az A4.6.1 anti-hVEGF antitestnek az oszteoartritiszben szenvedő betegekből nyert ízületi nedv által stimulált endoteliális sejtkemotaxisra gyakorolt hatását is (a reumatoid ízületi gyulladásban előforduló angiogenezis oszteoartritiszben nem lép fel).

Az endoteliális sejtkemotaxist módosított Boydenkamrák felhasználásával vizsgáljuk az adott szakterületen elfogadott és bevált eljárásmódok szerint [Thompson et al., Cancer Rés. 57:2670 (1991); Phillips et al., Proc. Exp. Bioi. Med. 797:458 (1991)]. Mintegy 10⁴ humán köldökzsinórvénából származó endoteliális sejtet hagyunk feltapadni zselatinnal bevont szűrőkhöz (0,8 mikronos pórusméret) 48 mélyedéses többmélyedéses mikrokamrákban olyan tápközegekben, amely 0,1% borjúembrió-szérumot tartalmaz. Mintegy 2 óra elteltével a kamrákat megfordítjuk és tesztmintákat [reumatoid ízületi gyulladásban keletkezett szinoviális folyadék, oszteoartritiszben keletkezett szinoviális folyadék, bázikus FGF (bFGF) (1 pg/ml végső koncentrációban), vagy PBS] és A4.6.1 anti-hVEGF ellenanyagot (10 pg/ml végső koncentrációban) adunk a mélyedésekhez. Kettőtől négy óráig teijedő időtartam elteltével az elvándorolt sejteket megfestjük és megszámláljuk.

A 10. ábra mutatja be a szóban forgó vizsgálatok átlagolt eredményeit. A „szinoviális folyadék” jelzéssel ellátott oszlopban mutatott értékek és az oldal alján a kontrollok vonatkozásában bemutatott értékek azon endoteliális sejtek átlagos számának felelnek meg, amelyek szinoviális folyadék, bFGF vagy önmagában alkalmazott PBS jelenlétében elvándorolnak. A „szinoviális folyadék + mAB VEGF” felirattal megjelölt oszlopban szereplő értékek azon endoteliális sejtek átlagos számának felelnek meg, amelyek szinoviális folyadék + hozzáadott A4.6.1 anti-hVEGF antitest jelenlétében vándorolnak. A „% visszaszorítás” jelzéssel ellátott oszlop jel13

HU 221 343 Β1 zi az anti-hVEGF antitest hozzáadása által eredményezett százalékos csökkenést a folyadék indukálta endoteliális sejtvándorlásban. Ahogyan jelezzük, az anti-hVEGF antitest szignifikánsan gátolja a reumatoid ízületi gyulladásból származó szinoviális folyadék endoteliális sejtvándorlást kiváltó képességét (53,40 átlagos százalékos gátlás), de az oszteoartritiszes szinoviális folyadék (13, 64 átlagos százalékos gátlás) képességét nem.

Claims (11)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. A hVEGF-antagonista, amely egy anti-VEGF antitest, alkalmazása rák kezelésére szolgáló gyógyszerek készítésére.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az antitest anti-hVEGF antitest.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az antitest monoklonális antitest.
4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az antitest humanizált antitest.
5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az antitestet olyan mennyiségben alkalmazzák, amely megfelelő valamely daganat méretének csökkentésére.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a daganat rosszindulatú szilárd daganat.
7. 7. Az 5. vagy 6. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az antitest a daganat méretét a VEGF-közvetített neovaszkularizáció gátlásával csökkenti.
8. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az antitest valamely citotoxikus résszel van összekapcsolva.
9. 9. A 8. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a citotoxikus rész valamely fehérje-citotoxin vagy a monoklonális antitest Fc-tartománya.
10. 10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer olyan módon van kiszerelve, hogy lehetőség legyen sorozatos beadásra vagy más szerrel való kombinált beadásra rák kezelésére.
11. 11. Az 1 -10. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer olyan módon van kiszerelve, hogy lehetőség legyen sorozatos beadásra vagy kombinálásra radiológiai kezeléssel.