JPH09154588A - Ｖｅｇｆ結合性ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 固形ガンその他の血管新生を伴う疾病の治療
に利用可能な、低分子のＶＥＧＦ阻害剤を提供すること
を課題とする。 【解決手段】 ＶＥＧＦレセプターＦＬＴの細胞外領域
の第１イムノグロブリン様ドメイン及び第２イムノグロ
ブリン様ドメインを含み、かつ第６イムノグロブリン様
ドメイン及び第７イムノグロブリン様ドメインを含まな
いポリペプチドが、ＶＥＧＦ阻害活性を有することを見
い出した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、血管新生阻害剤と
して有用なポリペプチド、およびその製造方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】幾つかの疾病では、その症状や病因と密
接に関連した病理的血管新生を伴うことが知られてい
る。中でも代表的な疾病は固形ガンで、ガン組織が直径
１〜２ｍｍを越えて増殖するためには、既存血管から新
生血管が延びてガン組織まで到達することが必要であり
（J. Folkman, J.Natl. Cancer Inst., 82:4 (199
0)）、また血管がガン組織に到達するとガン組織の増殖
が爆発的に加速される。また、糖尿病性網膜症では網膜
に病理的血管新生を伴い、それが原因でしばしば失明す
ることがある。更に慢性関節リューマチ、乾癬、血管
腫、強皮症、血管新生緑内障などの疾病においても病理
的血管新生を伴い、それが主な症状の一つとなっている
（J. Folkman, N. Engle. J. Med., 320:1211 (198
9)）。従って血管新生を阻害する物質はガンや前述の疾
病の治療に利用できる可能性がある。

【０００３】血管内皮細胞は血管の最も内側の層を形成
している細胞である。血管新生は血管内皮細胞が成長因
子や生理活性物質または機械的損傷などの刺激を受け
て、増殖することによって行われる。直接または間接的
に血管内皮細胞の増殖を刺激する成長因子として、ｂＦ
ＧＦ（basic Fibroblast Growth Factor）、ａＦＧＦ
（acidic Fibroblast Growth Factor）、ＶＥＧＦ（Vas
cular Endothelial cell Growth Factor）、ＰＤ−ＥＣ
ＧＦ（Platelet-Derived Endothelial Cell GrowthFact
or）、ＴＮＦ−α（Tumour Necrosis Factor-α）、Ｐ
ＤＧＦ（Platelet Derived Growth Factor）、ＥＧＦ
（Epidermal Growth Factor）、ＴＧＦ−α （Transfor
ming Growth Factor-α）、ＴＧＦ−β（Transforming
Growth Factor-β）、ＨＧＦ（Hepatocyte Growth Fact
or）が知られている（L. Diaz-Flores et al., Histol.
Histopath., 9:807 (1994)）。特にＶＥＧＦは、血管内
皮細胞に極めて特異的に作用する点で他の成長因子と区
別できる。言い換えれば、ＶＥＧＦのレセプターは、血
管内皮細胞以外ではごく限られた細胞でしか発現してい
ない。

【０００４】ＶＥＧＦは分子量４万〜４万５千の糖タン
パク質で２量体として存在する（P.W. Leung et al., S
cience 246:1306 (1989)、P. J. Keck et al., Scienc
e:246:1319(1989)）。ＶＥＧＦはＶＥＧＦレセプターに
結合することによって作用し、細胞の増殖を促進し、ま
た膜透過性を促進する。

【０００５】ＶＥＧＦとガンとの関係を示唆する以下の
ような報告がある。多くのガン細胞はＶＥＧＦを分泌す
る（S. Kondo et al., Bichem. Biophys. Res. Commu
n., 194:1234(1993)）。ガン組織切片を抗ＶＥＧＦ抗体
で染色するとガン組織およびその周辺の新生血管が強く
染色される（H. F. Dvorak et al., J. Exp. Med. 174:
1275(1991).、L. F. Brown at al., Cancer Res., 53:4
727 (1993)）。ＶＥＧＦレセプターの一つが遺伝的に不
活化されたマウスでは移植されたガンの増殖が抑制され
る（B. Millauer et al., Nature, 367:576 (1994)）。
抗ＶＥＧＦ中和抗体が担ガンマウスに対して抗腫瘍活性
を示す（K. J. Kim et al., Nature, 362:841 (1993)、
S. Kondo et al., Bichem. Biophys. Res. Commun., 19
4:1234(1993)）。以上の事実から、ガン細胞が分泌する
ＶＥＧＦが腫瘍血管新生において主要な役割を果してい
ると考えられる。

【０００６】ＶＥＧＦのレセプターは、ヒトではＦＬＴ
（M. Shibuya, et al., Oncogene,5:519 (1990)）とＫ
ＤＲ（B. I. Terman et al., Bichem. Biophys. Res. C
ommun., 187:1579 (1992)）の２種類が知られている。
ＦＬＴの細胞外領域は、図１に示されるような７つのイ
ムノグロブリン様ドメインからなる構造を有している
（C. DeVries et al., Science, 255:989 (1992)）。Ｆ
ＬＴに関しては、可溶性型レセプターのｃＤＮＡがクロ
ーニングされている（R. L. Kendal and K. A. Thomas,
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90:10705 (199
3)）。このｃＤＮＡによりコードされるポリペプチド
は、ＦＬＴの細胞外領域の７つあるイムノグロブリン様
ドメインのうち、第１〜第６イムノグロブリン様ドメイ
ンと対応しており、本来のＦＬＴと同程度の親和性でＶ
ＥＧＦと結合しＶＥＧＦ活性を阻害した。また、ＫＤＲ
についても遺伝子工学的に発現させた細胞外領域の第１
〜第６ドメインがＶＥＧＦに結合することが知られてい
る（R. L. Kendal et al., Bichem. Biophys. Res. Com
mun., 201:326 (1994)）。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】マウスの抗ＶＥＧＦ中
和モノクローナル抗体は抗腫瘍性を示すことから、抗ガ
ン剤として利用可能であると期待できる。しかしなが
ら、マウスの抗体を人に投与するとマウス抗体に対する
ヒト抗体が産生され、中和されたりアナフィラキシーシ
ョックを引き起こしたりする場合がある。このようなこ
とを回避するためには、マウス抗体のキメラ化（S. L.
Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. A., 8
1:6851 (1989)）やヒト化を行い、中和能を損なわない
ようにしながらマウス抗体のアミノ酸配列をヒト抗体の
アミノ酸配列に近づける必要がある。そのためには高度
の技術と知識、経験、労力が必要であり、成果はケース
バイケースで必ずしも成功するとは限らない。またこの
方法でも１００％はヒト化できない。他の方法としては
ヒト抗体そのものを産生するトランスジェニックマウス
を用いて免疫する方法があるが（S. Wagner et al., Nu
cleic Acid Res., 22:1389(1994)）、やはり高度の専門
的な技術が必要である。

【０００８】前述のように、ＶＥＧＦレセプターの細胞
外領域は、ＶＥＧＦに対し特異的に高親和性で結合しＶ
ＥＧＦ活性を阻害できるので、血管新生阻害剤として利
用することが考えられる。しかも元々ヒト由来のポリペ
プチドであるために人に投与しても抗体出現率は低いこ
とが期待できる。しかしながら本来体内に多量に存在し
ないポリペプチドを投与すると極めて速やかに代謝され
てしまうことが報告されている。例えば、ＨＩＶのレセ
プターであるＣＤ４の可溶性型の血中半減期は１５分で
あり（D. J. Capon et al., Nature, 337:525 (198
9)）、インターフェロンγの場合は血中半減期は３０分
であった（I. Rutenfranz and H. Kirchner,J. Interfe
ron Res., 8:573 (1988)）。

【０００９】血中半減期を延長する方法として、抗体分
子のような血中半減期の長い分子との融合ポリペプチド
を遺伝子工学的に作成し利用する方法が知られている。
ＣＤ４の例では抗体ＩｇＧ１のＦｃ領域とのキメラにし
た場合に血中半減期が１５分から４８時間に延長された
（D. J. Capon et al., Nature, 337:525 (1989)）。ま
た抗体のＦｃ領域との融合ポリペプチドにすることによ
って抗体が持っているエフェクター機能、即ち捕体依存
性細胞障害活性（D. B. Amos et al., Transplantatio
n, 7:220 (1969)）および抗体依存性細胞障害活性（A.
Y. Liu et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 84:
3439 (1987)）を誘導できる効果も期待できる。更にＦ
ｃ領域を介して２量体化されるので、１分子が２箇所で
リガンドに結合できるようになるため、膜表面や細胞外
マトリクスなどの固相上のリガンドに結合する場合には
親和性が見かけ上、格段に向上する効果も期待できる。

【００１０】抗体との融合ポリペプチドを利用する場合
には、融合により分子量が大きくなるので、元のポリペ
プチドは分子量が小さいことが望ましい。何故なら、分
子量が大きいと遺伝子操作で融合ポリペプチドを生産す
る組換え宿主を作成する際に、扱うＤＮＡの分子量が大
きくなるからである。一般に導入するＤＮＡの分子量が
大きい程、宿主への導入効率が悪くなり、組換え体が得
られる頻度が低下する。また一般に生産させようとする
組換えポリペプチドの分子量が大きい程、産生量が低く
なる傾向がある。更に固形ガンの治療に利用する場合に
は、分子量の大きいポリペプチドは患部への浸潤性が悪
いことが報告されている（D. M. Lane et al., Br. J.
Cancer, 70:521 (1994)）。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＶＥＧＦ
を特異的に阻害することにより血管新生を阻害できるポ
リペプチド、特にＶＥＧＦレセプターの細胞外領域に関
するポリペプチドのうち分子量が小さいポリペプチドを
見いだすことを目的として鋭意努力した。その結果、Ｆ
ＬＴの細胞外領域の第１イムノグロブリン様ドメインお
よび第２イムノグロブリン様ドメインを含むポリペプチ
ドがＶＥＧＦに特異的かつ高親和性で結合し、ＶＥＧＦ
活性を阻害できることを見いだした。なお、本明細書に
おいて「ポリペプチド」とは、アミノ酸同士がペプチド
結合によって共有結合しているもの一般を指し、長さの
制限はないものとする。

【００１２】本発明のポリペプチドには、ＦＬＴの細胞
外領域の第１イムノグロブリン様ドメインおよび第２イ
ムノグロブリン様ドメインのみからなるものの他に、他
のドメインを含んでいるものも含まれる。例えば、第１
イムノグロブリン様ドメイン〜第４イムノグロブリン様
ドメインの全てを含むポリペプチド、第１イムノグロブ
リン様ドメイン〜第５イムノグロブリン様ドメインの全
てを含むポリペプチドも本発明のポリペプチドに含まれ
る。なお、第１イムノグロブリン様ドメイン〜第６イム
ノグロブリン様ドメインの全てを含むポリペプチドまた
は第１イムノグロブリン様ドメイン〜第７イムノグロブ
リン様ドメインの全てを含むポリペプチドは、分子量が
大きすぎるので「組換えＤＮＡ技術による発現が行い易
く、患部への浸潤も速やかである」という本願発明の効
果を充分に奏し得ないものであると考えられ、本願発明
のポリペプチドからは除外される。なお、ＦＬＴの各ド
メインの境界は明確に区別されるものではないが、本明
細書においては各ドメインは、それぞれ、以下の残基番
号のアミノ酸配列を含むドメインと定義される。［な
お、残基番号は、配列番号：１のものと同じである。即
ち、成熟ＦＬＴのＮ末端（配列番号１の１位の「Ｓｅ
ｒ」）から数えた残基番号を示す。］ 第１イムノグロブリンドメイン １〜１１０ 第２イムノグロブリンドメイン １１１〜２０８ 第３イムノグロブリンドメイン ２０９〜３１１ 第４イムノグロブリンドメイン ３１２〜４０７ 第５イムノグロブリンドメイン ４０８〜５３５ 第６イムノグロブリンドメイン ５３６〜６４０ 第７イムノグロブリンドメイン ６４１〜７３６ 更に本発明は、上記ＦＬＴの細胞外領域と他のタンパク
質（例えば、イムノグロブリンのＦｃ領域）とが融合し
たポリペプチドも含む。

【００１３】

【発明の実施の形態】これらのペプチドは次のような手
順を経て生産することができる。ヒト血管内皮細胞、例
えばヒト臍帯由来血管内皮細胞（岩城硝子、森永乳業、
クラボウなどから販売）を培養し酸性フェノール法（P.
Chomzynski and N. Sacchi, Anal. Biochem., 162:156
(1987)）により全ＲＮＡを抽出し、オリゴｄＴセルロ
ースによってポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを調製する。これを鋳
型として逆転写酵素とオリゴｄＴ（１２〜１６）プライ
マーを用いて１本鎖ｃＤＮＡまたは２本鎖ｃＤＮＡを合
成する。ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡの調製法、ｃＤＮＡの調製
法については「J. Sambrook et al.,”Molecular Clon
ing”,Cold Spring Harbor Laboratly Press, 1989」に
従って行うことができる。また市販のポリ（Ａ）⁺ＲＮ
Ａ調製試薬（Oligotex-dT30、宝酒造製）やｃＤＮＡ合
成キット（ファルマシアバイオシステム社 製）を用い
ても行うことができる。既にｃＤＮＡライブラリーから
クローニングされたｆｌｔｃＤＮＡがある場合は、直
接、発現させようとする領域のＤＮＡを適当な制限酵素
で切り出し、発現ベクターに導入してもよい。

【００１４】次に得られたｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ
法（「”PCR Protocols”, Academic Press Inc., 199
0」参照）により目的部分のＤＮＡを増幅することがで
きる。例えば、以下のようなプライマーを使用すればよ
い。プライマーＤＮＡはＤＮＡ合成機（アプライドバイ
オシステムズ製、日本ミリポアリミテッド製など）で合
成するか、カスタムＤＮＡを注文することができる（サ
ワディテクノロジー社）。例えば第１イムノグロブリン
様ドメイン〜第４イムノグロブリン様ドメインをコード
するｃＤＮＡを得る場合は、 上流プライマー：5'-Ｎ(3〜5)Ｘ(6)CGTCGCGCTCACCATGGT
CAG-3'（配列番号：２） 下流プライマー：5'-Ｎ(3〜5)Ｙ(6)TTATTCGTAAATCTGGGG
TTTCAC-3'（配列番号：３）を用いればよい。

【００１５】配列中、ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの何れか、Ｘ
またはＹは制限酵素認識配列、括弧内の数字は塩基数を
表す。具体的には、Ｎ(3〜5)はＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの何れか
が３〜５個存在することを示し、Ｘ(6)またはＹ(6)は、
６塩基を認識する制限酵素の認識部位を示す。これらの
制限酵素認識配列は、増幅しようとするＤＮＡ断片およ
びそれを挿入しようとするベクターには存在しない配列
にすることが望ましい。配列番号：１に記載の塩基配列
を参考にして適宜下流プライマーを設計し、所望のＣ末
端をコードするＤＮＡ断片を増幅することができる。ま
た発現ベクターに組み込まれた時には、ポリペプチドの
コーディング配列はプロモーターに対して順方向に配置
していなければならない。プライマー配列中、ｆｌｔＤ
ＮＡ配列と対応する部分は必ずしも２１塩基に限定する
必要はなく１７〜２５塩基程度でもよい。ＰＣＲの条件
は前述の「PCR Protocols」記載の標準的条件でよい
が、鋳 型の量やプライマー配列によって反応の進み方
が異なるので、効率よく行うために、各パラメーター
（例えばＭｇ⁺⁺濃度、アニーリング温度、延長反応時
間、サイクル数など）を適宜変更し、至適化することが
できる。ＰＣＲに使用するＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａ
ｑポリメラーゼよりプルーフリーディング（３’エクソ
ヌクレアーゼ）活性のあるＰｆｕポリメラーゼ（Strata
gene社）かＴａｑポリメラーゼにＰｆｕポリメラーゼを
添加したものを用いた方が、ＰＣＲ増幅時の信頼性（Fi
derity）が増す（W. M. Barnes, Proc. Natl. Acad. Sc
i. U. S. A.,91:2216 (1994)）。

【００１６】この場合のＰＣＲで増幅しようとするＤＮ
Ａ断片は配列が既知なので、増幅後アガロースゲル電気
泳動でサイズを確認し、またゲルより回収して、適当な
制限酵素で消化し、その電気泳動パターンを調べること
により目的のＤＮＡ断片が得られたかどうか判断するこ
とができる。アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡ断片のゲ
ルからの回収、制限酵素による切断は前述の「Molecula
r Cloning」に従って行うことができる。またＤＮＡの
ゲルからの回収には市販のグラスビーズを利用したキッ
ト（例えばPrep-A-Gene、バイオラッド社）を使用する
ことができる。

【００１７】回収したＤＮＡ断片は、Ｘ(6)およびＹ(6)
を切断できる制限酵素で断片の両端を消化し、フェノー
ル処理により除タンパクを行い、エタノール沈澱し、適
当なバッファー、例えばＴＥ（10mM Tris-HCl(pH7.5)/1
mM EDTA）に溶かす。同様にして適当な発現ベクターの
クローニング用部位を、Ｘ(6)およびＹ(6)を切断できる
制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動を行い、ベ
クターＤＮＡを回収する。このようにすることによって
Ｘ(6)およびＹ(6)切断部位間の小さな断片を除くことが
できる。これらの挿入しようとするＤＮＡ断片および切
断したベクターＤＮＡを例えば、ベクターＤＮＡ：挿入
ＤＮＡ断片の比が１：５〜１：１０になるように加え、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーション反応を行
う。ライゲーション産物を大腸菌コンピテント細胞に加
え、形質転換を行い、ベクターにコードされた選択マー
カー（例えば、アンピシリン耐性、カナマイシン耐性な
ど）に対応する抗生物質を含む培地でまず抗生物質耐性
の形質転換体を選択する。

【００１８】発現ベクターにＤＮＡ断片が挿入された組
換え体は、抗生物質耐性の各形質転換体が持つプラスミ
ドの制限酵素切断パターンを調べて選択する。または各
形質転換体を菌体ごと鋳型として、挿入しようとするＤ
ＮＡ断片を増幅したプライマーを用いてＰＣＲすること
により、目的とするＤＮＡ断片が増幅されるか否かで組
換え体かどうか調べることができる。これらの大腸菌の
組換え体を得る一連の操作は前述の「Molecular Clonin
g」に従って行うことができる。

【００１９】本発明のポリペプチドを生産させるために
様々な宿主を利用することができる。例えばEscherichi
a coli、Pseudomonos属細菌、Bacillus subtilis、 Bac
illus brevis、Bacillus liqueniformis、Bacillus thu
ringensisなどのグラム陰性またはグラム陽性細菌、Pic
hia pastoris、Schizosaccharomyces pombe、Saccharom
ises cerevisiaeなどのような酵母、Aspergillus属のよ
うな真菌類、Sf9（Spodoptera frugiperda由来）、Sf2
1、TN5（Trichoplusia ni由来）、BN4（Bombyxmoli由
来）などのような昆虫細胞、CHO（cninese hamster ova
ry由来）、Ｃ ＯＳ細胞（サル腎臓由来）などのような
ほ乳類細胞が利用できる。ベクターは宿主の種によって
それぞれ適したベクターを利用すればよい。最終的な形
質転換細胞を得る前に、本発明のポリペプチドを生産し
ようとする宿主と大腸菌とのシャトルベクターを用い、
一度大腸菌で組換えＤＮＡを得るのがより容易であろ
う。本発明のポリペプチドを生産する組換え宿主を得る
ための形質転換方法は、大腸菌ではコンピテント細胞、
Bacillus属ではコンピテント細胞法（K. Bott and G.
A. Willson, J. Bacteriol., 94:562 (1967)）、プロト
プラスト法（M. Mandel and A. Higa, J. Mol. Biol.,
53:159(1970)）、酵母ではプロトプラスト法（M.Broker
et al., BioTechniques, 5:516 (1987)）、昆虫細胞お
よびほ乳類細胞ではリポフェクチン法（R. W. Malone e
t al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 86:6077 (1
989)）、リン酸カルシウム法（F. L. Graham and A. J.
van der Eb, Virology, 52:456 (1973)）により行うこ
とができる。またエレクトロポレーション法（BIORAD社
パンフレット等参照）は前述の全ての細胞に応用可能で
ある。

【００２０】基本的には使用する宿主内で複製可能なプ
ラスミドまたはウイルスＤＮＡを用い、発現させたい部
分をコードするＤＮＡをその宿主内で機能する強力なプ
ロモーターの下流に組入れればよい。発現させようとす
る遺伝子に翻訳開始コドンがない場合にはこれを付加す
る必要がある。また原核細胞を宿主に用いる場合はリボ
ソーム結合配列が（J. R. MacLaughlin et al., J. Bio
l. Chem., 256:11283(1981)）必要である。宿主染色体
ＤＮＡの一部を有し、宿主内で複製できないベクターを
用いて宿主染色体と相同組換えを起こさせ、宿主染色体
内にベクターごと組込む方法も利用することができる
（特開平４−２７８０９２号公報、D. J.King et al.,
Biochem. J., 281:317 (1992)）。また培養細胞ではな
く、動物または植物固体を宿主とする方法も利用可能で
ある。例えばカイコのウイルスであるBmNPVの組換えウ
イルスを作成しカイコに接種することにより、培養細胞
を宿主とする場合に比べ、より高い生産性でカイコ体液
からポリペプチドが得られるであろう（河合秀樹、下群
洋一郎、バイオインダストリー、8:39 (1991) ）。pSV
系ベクターの組換え体で形質転換したマウスミエローマ
細胞をSCIDマウスやヌードマウスの腹腔に移植し腹水か
ら、組換えポリペプチドを回収することも可能であろ
う。本発明のＤＮＡを用いたトランスジェニック動物
（G. Wright at al., Bio/Technology, 9:830 (1991)）
またはトランスジェニック植物（M. Owen etal., Bio/T
echnology, 10:790 (1992)）を宿主として利用すること
も可能であろう。

【００２１】本発明のポリペプチドを細胞外に分泌させ
るには、真核細胞を宿主に用いる場合はＦＬＴのシグナ
ルペプチドコーディング部分をそのまま使用すればよ
い。細菌では使用する宿主の分泌ポリペプチドのシグナ
ルペプチドをコードするＤＮＡを利用することができる
であろう。例えば、大腸菌では外膜タンパク質であるOm
pA、OmpF、フォスファターゼであるPhoA、マルトース結
合タンパク質であるMalB、Bacillus属では塩基配列が既
知のアミラーゼ、アルカリフォスファターゼ、セリンプ
ロテアーゼなどのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ
を利用することができる。また細胞内に発現させる場合
には開始コドン以外のシグナルペプチドコーディング部
分を除いて利用すればよい。細菌の細胞内で外来性のポ
リペプチドを高発現させた場合にはしばしば封入体の形
成が起こるが、その場合は８Ｍ尿素で可溶化後、数μｇ
／ｍｌのポリペプチド濃度まで希釈し透析により徐々に
尿素を除くことで活性の何割かが回収できるであろう。
また、大腸菌内で、大腸菌チオレドキシンを同時に高発
現させることにより、封入体を生じさせにくくさせるこ
とも可能である。

【００２２】前述のような方法で得られた本発明のポリ
ペプチドは、一般的な生化学的方法により精製すること
ができる。例えば硫酸アンモニウム沈澱、イオン交換ク
ロマトグラフィー、ゲル濾過、疎水性クロマトグラフィ
ーなどを利用することができる。本発明のポリペプチド
はヘパリン親和性を有するので、ヘパリン樹脂によるア
フィニティクロマトグラフィーを利用することができ
る。他のポリペプチドとの融合ポリペプチドの場合は、
相手のポリペプチドが有する特性を利用して精製するこ
とが可能である（M. Uhlen et al., Methods Enzymol.,
185:129 (1990)）。例えば融合ポリペプチドの相手が抗
体のＦｃ領域である場合にはプロテインＡセファロース
またはプロテインＧセファロース（E. Harlow and D. L
ane, "Antibodies", Cold Spring Harbor Laboratoly P
ress,1988）、グルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳ
Ｔ）である場合にはグルタチオンセファロース（D. B.
Smith and F. S. Johnson, Gene, 67:31 (1988)）、ク
ロラムフェニコールトラン スフェラーゼである場合に
はクロラムフェニコールセファロース、ヒスチジンオリ
ゴマーである場合にはNi⁺⁺-NTA(nitryltriacetic acid)
アガロースを用いたアフィニティクロマトグラフィー
（F. H. Arnold, Bio/Tecnology, 9:151 (1991) ）を利
用することができる。

【００２３】本発明のポリペプチドを含む画分は本ポリ
ペプチドに反応する抗体を用いたＥＩＡまたはウェスタ
ン解析によって検出することができる。本発明のポリペ
プチドと反応する抗体は、Ｎ末端より２４番目〜３０番
目にアミノ酸配列に対応するオリゴペプチドを合成し、
牛血清アルブミンまたはＫＬＨ(keyhole lymphet hemoc
yanine)などのキャリアータンパク質とのコンジュゲイ
トを作成しウサギなどに標準的な方法で免疫することで
得られる（E. Harlow anr D. Lane, "Antibodies", Col
d Spring Harbor Press,1988）。また本発明ポリペプチ
ドと他のポリペプチドとの融合ポリペプチドを大腸菌で
生産し、前述のように融合相手のポリペプチドの特性を
利用して精製して免疫原として用いても本発明のポリペ
プチドに反応する抗体は得られる。

【００２４】本発明のポリペプチドはＶＥＧＦに結合す
るので、その活性を指標として精製することもできる。
例えばＥＩＡ用に抗体固相化プレートを調製するのと同
様の要領で、精製前の本発明のポリペプチドを含む溶液
を適当に希釈し、９６穴のポリスチレン製マイクロタイ
タープレートをコートしてブロッキング処理したプレー
トを作成する。このプレートはＶＥＧＦを特異的に結合
するので、¹²⁵Ｉ標識ＶＥＧＦを使用すればウェルに残
る放射活性から結合が確認できる。本発明のポリペプチ
ドを精製するために行ったクロマトグラフィーの画分と
¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦをプレインキュベートしてからこのプ
レートのウェルに移し、残る放射活性を測定する。その
画分に本発明のポリペプチドが存在すればプレインキュ
ベーション中にＶＥＧＦに結合し、プレート上の本発明
のポリペプチドと拮抗してプレートに結合しにくくなる
ことで存在が確認できる。

【００２５】本発明のポリペプチドはＶＥＧＦに高い親
和性（Kd=5x10^-11程度）で結合してＶＥＧＦがＶＥＧＦ
レセプターに結合することを阻害する。従って本発明の
ポリペプチドは低濃度でＶＥＧＦ活性を阻害することが
できる。本発明のポリペプチドはＶＥＧＦ活性を阻害す
るのでＶＥＧＦ刺激による血管内皮細胞の増殖を阻害す
る。また、本発明のポリペプチドはＶＥＧＦによる血管
透過性促進を阻害する。更に、本発明のポリペプチドは
インビボでＶＥＧＦによる血管新生を阻害し、本腫瘍の
増殖を阻害する。

【００２６】

【実施例】Ｉ．第１〜第４イムノグロブリン様ドメインおよび第１
〜第５イムノグロブリン様ドメインからなるポリペプチ
ドに関する実施例 ［実施例１］ ＦＬＴ細胞外領域を発現する組換えバキ
ュロウイルスの作成 １）ＦＬＴの第１〜第４イムノグロブリン様ドメインを
発現する組換えウイルスの作成 基本的にはサンブルック（J. Sambrook）らの「Molecul
ar Cloning」に記載された方法に従い図２に示す手順で
ベクターの構築を行った。ＦＬＴの第１〜第４イムノグ
ロブリン様ドメインを発現する組換えウイルスを得るた
めに、プラスミドｐｆｌｔ３−７（M. Shibuya et al.,
Oncogene, 5:519 (1990)）のＤＮＡを制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩおよびＮｄｅＩで消化し、アガロースゲル電気泳動
により分離した約１．６ｋｂｐのＥｃｏＲＩ-ＮｄｅＩ
ＤＮＡ断片を調製した。一方プラスミドｐＭＥ１８ＳＮ
ｅｏのＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消
化し、アガロースゲル電気泳動により分離した約５．５
ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩＤＮＡ断片を調製した。
ＮｄｅＩ末端をＸｈｏＩ末端に変換するためにアダプタ
ーとして、「5'TATTAATGATCTAGATGAC 3'」（配列番号：
４）と「5'TCGAGTCATTCTAGATCATTAA 3'」（配列番号：
５）のオリゴヌクレオチドを室温で混合し、更に前記
「１．６ｋｂｐのＥｃｏＲＩ-ＮｄｅＩＤＮＡ断片」と
「５．５ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ ＤＮＡ断片」
とを混合してＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応を行
い、大腸菌に導入した。得られた組換えプラスミドＤＮ
ＡをＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化し、得られた１．
６ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ｐＶＬ１３９３（Phar
Mingen社）のＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ部位に導入した。こ
のプラスミドＤＮＡを精製し、ポヘドリンコード領域を
欠失したバキュロウイルスＤＮＡであるBaculoGold（Ph
arMingen社）を用いてマニュアルに従って組換えウイル
スを得た。この組換えバキュロウイルスを「Ｂ４Ｎ」と
名付けた。組換えバキュロウイルス「Ｂ４Ｎ」をＳｆ９
細胞を用いてマニュアルに従って増幅し、以降の実験に
使用した。なお、「Ｂ４Ｎ」はＦＬＴのＮ末端から４５
７残基までのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含んで
いる。

【００２７】２）ＦＬＴの第１〜第５イムノグロブリン
様ドメインを発現する組換えウイルスの作成 基本的にはサンブルック（J. Sambrook）らの「Molecul
ar Cloning」に記載された方法に従い図３に示す手順で
ベクターの構築を行った。プラスミドｐｆｌｔ３−７Ｄ
ＮＡをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIIIで切断し、１．９
ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIIIＤＮＡ断片を調製し
た。ＨｉｎｄIII末端をＸｈｏＩに変換するためにアダ
プターとして、オリゴヌクレオチド「5'AGCTTTTAATGATC
TAGAATGAC3'」（配列番号：６）と「5'TCGAGTCATTCTAGA
TCATTAAA 3'」（配列番号：７）とを混合して加え、前
述のプラスミドｐＭＥ１８ＳＮｅｏの５．５ｋｂｐのＥ
ｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ ＤＮＡ断片と連結し、これを用い
て大腸菌を形質転換し、組換えプラスミドを得た。得ら
れた組換えプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＮｏｔ
Ｉで消化し、得られた１．９ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収
し、ｐＶＬ１３９３（PharMingen社）のＥｃｏＲＩ／Ｎ
ｏｔＩ部位に導入した。このプラスミドＤＮＡを精製
し、ポヘドリンコード領域を欠失したバキュロウイルス
ＤＮＡであるBaculoGold（PharMingen社）を用いてマニ
ュアルに従って組換えウイルスを得た。この組換えバキ
ュロウイルスを「Ｂ５Ｎ」と名付けた。組換えバキュロ
ウイルス「Ｂ５Ｎ」をＳｆ９細胞を用いてマニュアルに
従って増幅し、以降の実験に使用した。なお、「Ｂ５
Ｎ」はＦＬＴのＮ末端から５６０残基までのアミノ酸配
列をコードするＤＮＡを含んでいる。

【００２８】［実施例２］ 発現産物の免疫化学的解析 昆虫細胞ＨｉＦｉｖｅ（Invitrogen Corp.製）をＥｘＣ
ｅｌｌ４００培地（岩城硝子社製）で培養し、組換えバ
キュロウイルス「Ｂ４Ｎ」または「Ｂ５Ｎ」を感染させ
培養上清を回収した。このサンプルをＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動しウェスタンブロッティングを
行った。１次抗体にウサギ抗ＦＬＴ細胞外領域ポリクロ
ーナル抗体を用い、２次抗体としてアルカリフォスファ
ターゼ標識抗ウサギＩｇＧ使用し、ＮＴＢ(Nitroblue t
etazolium chrolide)／ＢＣＩ Ｐ(5-Bromo-4-chrolo-3-
indolylphosphate p-toluidine salt)（Gibco BRL製）
で発色させた。その結果この抗体との特異的な反応性が
確認された（図４）。レーン１はＢ４Ｎ感染細胞培養上
清２μｌ、レーン２はＢ４Ｎ感染細胞抽出液１０μｌ、
レーン３はＢ５Ｎ感染細胞培養上清２μｌ、レーン４は
Ｂ５Ｎ感染細胞抽出液１０μｌを泳動したものである。
免疫化学的に反応したバンドの移動度は予想される分子
量と一致した。以後これらの産物を「４Ｎ−ＦＬＴ」お
よび「５Ｎ−ＦＬＴ」と称する。また培養上清サンプル
中におよそ２μｇ／ｍｌの「４Ｎ−ＦＬＴ」または「５
Ｎ−ＦＬＴ」が含まれていると判定された。

【００２９】［実施例３］ 発現産物のＶＥＧＦとの親
和性 ＨｉＦｉｖｅ細胞に組換えウイルス「Ｂ４Ｎ」または
「Ｂ５Ｎ」を感染させ、得られた培養上清をＰＢＳで４
倍に希釈しマイクロタイタープレート（「イムロン２」
ダイナテック社製）のウェルに１００μl入れ４℃で一
夜置き、ウエルから除去した。ウェルをＰＢＳ−０．１
％ＢＳＡで３回洗浄し、次にＰＢＳ−１％ＢＳＡを２５
０μl入れ、室温で２時間放置しブロッキングした。ウ
ェルの中の液を捨て、１００μl中に比活性66,000cpm/n
gの¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅（ＶＥＧＦのＮ末端から１６５
番目までの残基からなるペプチド／アマシャム社製）20
280cpmに非標識のＶＥＧＦ₁₆₅を0〜15000pg混合した溶
液を入れ室温で３時間放置した。ウェルの中の液を捨て
ＰＢＳ−０．１％ＢＳＡで３回洗浄し、各ウェルに残っ
た放射活性ををγカウンターで測定しスカッチャード解
析を行った（図５）。図５Ａ、Ｂはそれぞれ「Ｂ４Ｎ」
「Ｂ５Ｎ」発現培養上清をコートしたプレートを用いた
結果である。この時にコントロールウイルス感染Ｓｆ９
細胞の培養上清でコートしたプレートには¹²⁵Ｉ−ＶＥ
ＧＦ₁₆₅はほとんど結合しないので、結合放射活性は挿
入遺伝子からの発現産物への¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅の結合
であると考えられる。「Ｂ４Ｎ」または「Ｂ５Ｎ」感染
細胞の培養上清中の発現産物のＶＥＧＦ₁₆₅に対する親
和性は共にＫｄ（解離定数）がおよそ３〜４．５×１０
^-11でありＦＬＴ（J. Waltenberger, et al., J. Biol.
Chem., 269:26988 (1994)）または可溶性型ＦＬＴ（R.
L. Kendal and K. A. Thomas, Proc. Natl., Acad.Sc
i., U. S. A., 90:10705 (1993)）について報告されて
いる値に近かった。

【００３０】［実施例４］ 発現産物によるＶＥＧＦの
生物活性の阻害 １）ＶＥＧＦの透過性促進活性の阻害 ＶＥＧＦの透過性促進活性に対する「４Ｎ−ＦＬＴ」ま
たは「５Ｎ−ＦＬＴ」の阻害効果を調べた。モルモット
の心臓内に０．５ｍｌの１％エバンスブルー色素液を注
入し、３０分後にＶＥＧＦと共に０．２ｍｌの「４Ｎ−
ＦＬＴ」または「５Ｎ−ＦＬＴ」発現培養上清を剃毛し
た皮下に注入し、更に３０分後に色素の漏出を観察した
（表１）。この結果から「４Ｎ−ＦＬＴ」および「５Ｎ
−ＦＬＴ」はＶＥＧＦの透過性促進活性を阻害すること
が明らかになった。

【００３１】

【表１】 ４Ｎ−ＦＬＴおよび５Ｎ−ＦＬＴのＶＥＧＦ透過性促進活性対する阻害効果 サンプル 色素漏出（相対値） ───────────────────────────────── ＰＢＳ ０ ％ 10 ng VEGF/0.2 ml １００ ％ 10 ng VEGF+Ca.400 ng 4N-FLT/0.2 ml ５％ 10 ng VEGF+Ca.400 ng 5N-FLT/0.2 ml ＜５％ ────────────────────────────────── ２）ラット類洞壁内皮細胞のＶＥＧＦ依存性増殖の阻害 ＶＥＧＦ依存性の増殖に対する「４Ｎ−ＦＬＴ」または
「５Ｎ−ＦＬＴ」の阻害効果を調べた。ラットの肝臓よ
り記載の方法で類洞壁内皮細胞を調製し、２４穴プレー
トに１０⁴／ウェルで撒き、表２に示したサンプル存在
下で４日間培 養し、ウェル内の細胞数を測定した。表
２の細胞数の欄の数値は撒いた直後の細胞数を１００と
表した時の相対値である。「４Ｎ−ＦＬＴ」「５Ｎ−Ｆ
ＬＴ」のサンプルはそれぞれの組換えウイルス感染Ｈｉ
Ｆｉｖｅ培養上清を使用し、含有量はウェスタン解析の
結果を元に算出した。この結果から「４Ｎ−ＦＬＴ」お
よび「５Ｎ−ＦＬＴ」はＶＥＧＦの内皮細胞増殖活性を
投与量依存的に阻害することがわかる。

【００３２】

【表２】 「４Ｎ−ＦＬＴ」および「５Ｎ−ＦＬＴ」のラット肝類洞壁内皮細胞の ＶＥＧＦ依存性増殖阻害活性 ＶＥＧＦ濃度 ４Ｎ−ＦＬＴ濃度 ５Ｎ−ＦＬＴ濃度 細胞数 （ｎｇ／ｍｌ） （ｎｇ／ｍｌ） （ｎｇ／ｍｌ） ──────────────────────────────── ０ ０ ０ ０ １ ０ ０ ２６０ １ ４０ ０ ４０ １ １００ ０ ４４ １ ０ ４０ ２７ １ ０ １００ ２８ ３ ０ ０ ３００ ３ ４０ ０ １９１ ３ １００ ０ ６９ ３ ０ ４０ ２２１ ３ ０ １００ ８３ ───────────────────────────────── ＩＩ．第１〜第２イムノグロブリン様ドメインからなる
ポリペプチドに関する実施例 ［実施例５］ＦＬＴ細胞外領域（ＥＤＦ）と反応するポ
リクローナル抗体の作成 １）ヒト臍帯由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）ｃＤＮＡ
の調製 ＨＵＶＥＣ（クラボウ製）約１×１０⁷個の細胞に１ｍ
ｌのＩＳＯＧＥＮ（和光純薬工業製）を加えペッスルで
細胞を破砕し更に９ｍｌのＩＳＯＧＥＮを加え５分間振
とうした。この溶液に１ｍｌのクロロフォルムを添加し
１分間振とうし、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心
し、上清液を回収し、１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム
（ｐＨ５．２）を添加して混合し更に２．５容のエタノ
ールを添加した。遠心して沈澱を回収し、７５％エタノ
ールで沈澱を洗浄し乾燥して１００μｌの加熱滅菌した
純水に溶解した。１０２μｇのＲＮＡが得られた。この
溶液に１０％ＳＤＳを１μｌ添加し１００μｌの「Olig
otex-dT30（宝酒造製）」を添加し６５℃で５分間保温
した後、氷中にて急冷した。この溶液に２０μｌの５Ｍ
塩化ナトリウムを混合し３７℃で１０分間保温した。こ
の懸濁液を１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、沈澱
を１００μｌの加熱滅菌した純水に懸濁し６５℃で５分
間保温した。この懸濁液を１５，０００ｒｐｍで１５分
間遠心した上清を回収してエタノール沈澱を行った。乾
燥した沈澱を２０μｌの加熱滅菌した純水に溶解し、Ｈ
ＵＶＥＣポリ（Ａ）⁺ＲＮＡとした。以下この溶液を用
いファルマシアのｃＤＮＡ合成キットを用い、マニュア
ルに従ってオリゴｄＴでプライミングされたＨＵＶＥＣ
２重鎖ｃＤＮＡ溶液１００μｌを得た。

【００３３】２）ＦＬＴ細胞外領域（ＥＤＦ）コーディ
ングＤＮＡのクローニング １）で得たＨＵＶＥＣ由来ｃＤＮＡを鋳型として、以下
の条件でＰＣＲを行った。

【００３４】

【表３】 反応液組成（１００μｌ中） ＰＣＲの反応条件 10 μｌTaq buffer（Promega社製） 1) ９５℃、１分を１サイクル 2.5 mM MgCl₂ 2) ９４℃、１分、５６℃、１分、 4μl HUVEC cDNA ７２℃、２．５分を３４サイクル 各0.1 mM dNTPs 3) ７２℃、７分を１サイクル 200 nM プライマー1 200 nM プライマー2 2.5 U Taq ポリメラーゼ（Promega社製） プライマー配列は、以下の通りである。 プライマー1: 5'-CTCGGATCCGGATCTAGTTCAGGTTCAAAA-3'
（配列番号：８） プライマー2: 5'-CTCGAATTCACTCCAGATTAGACTTGTCCGA-3'
（配列番号：９） 「プライマー１」の下線部は成熟ＦＬＴのＮ末端コーデ
ィング配列に、「プライマー２」の下線部は、ＦＬＴ細
胞外領域Ｃ末端コーディング配列に対応する。

【００３５】反応液２００μｌをミネラルオイルを除く
ために等量のクロロフォルムで処理し、水層を回収し、
１０％ＳＤＳを４μｌ添加し、６０℃で５分間保温し
た。この溶液を等量のＴＥ飽和フェノールで処理した水
層を回収し、エタノール沈澱しＤＮＡ断片を回収した。
乾燥した沈澱を３０μｌのＴＥに溶解し、アガロースゲ
ル電気泳動にかけた。およそ２．２ｋｂｐのＤＮＡ断片
を切り出し、「Prep-A-Gene」（BIORAD製）を使用しマ
ニュアルに従いＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡ断片
をHincII、HindIII、HhaIまたはPstIで消化し、切断パ
ターンがＦＬＴ細胞外領域コーディングＤＮＡの塩基配
列から予想されるパターンと一致することを確認した。
次にこのＤＮＡ断片をEcoRIおよびBamHIで消化し、その
反応液を等量のＴＥ飽和フェノールで処理し、水層から
「Prep-A-Gene」を用いてEcoRI、BamHI消化ＤＮＡ断片
を回収した。同様にプラスミドベクターｐＧＥＸ２Ｔ
（ファルマシアバイオシステム製）１μｇをEcoRIおよ
びBamHIで消化し、その反応液を等量のＴＥ飽和フェノ
ールで処理し、その水層から「Prep-A-Gene」を用いてE
coRI、BamHI消化ｐＧＥＸ２ＴＤＮＡを回収した。

【００３６】このようにして得られたＤＮＡ断片とプラ
スミドＤＮＡを１０：１のモル比で混合し、ライゲーシ
ョン（ライゲーションキット、宝酒造製）を行った。こ
のライゲーション溶液を用いて大腸菌ＪＭ１０９のコン
ピテントセル（宝酒造製）を形質転換し、７５μｇ／ｍ
ｌのアンピシリンを含む２×ＴＹ培地（１ｌ中１６ｇト
リプトン、１０ｇ酵母エキス、５ｇ塩化ナトリウム、
１．５ｇ寒天）にプレーティングし３７℃で一夜培養し
た。出現するアンピシリン耐性コロニーを爪楊枝で突
き、前述のＰＣＲ反応液から鋳型を除いた溶液１５μｌ
に移し、サイクル数を３０回にして前述と同様にＰＣＲ
を行った。ＰＣＲ後の反応液をアガロースゲル電気泳動
し、２．２ｋｂｐのバンドを与えるコロニーから更にシ
ングルコロニーを単離し、少量の培養液からプラスミド
ＤＮＡを調製した。（「J. Sambrook,et al.,"Molecula
r Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory Press,19
89」の方法に従った。）これらのプラスミドＤＮＡをBa
mHIおよびEcoRIで消化し、２．２ｋｂｐのＤＮＡ断片が
生じることを確認した。これらのプラスミドＤＮＡの一
つを前記「primer1」または「primer2」を用いて配列決
定を行い（「J. Sambrook,et al.,"Molecular Clonin
g", Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989」の方
法に従った）、上流および下流から約１５０塩基の配列
を調べたところ、ＦＬＴ細胞外領域（ＥＤＦ）コーディ
ングＤＮＡの塩基配列と一致した。

【００３７】３）ＧＳＴ−ＥＤＦ融合ポリペプチドの調
製 前述の塩基配列の一部を確認したプラスミドを有する大
腸菌クローンを５００ｍｌの５０μｇ／ｍｌアンピシリ
ンを含む２×ＴＹ培地で、３０℃で振とう培養を行い、
波長６００ｎｍの吸光度が１．０に達した時にＩＰＴＧ
を０．１ｍＭとなるように添加し、更に２０時間培養し
た。遠心して細胞を回収し、グルタチオンセファロース
（ファルマシアバイオシステム）を用いてマニュアルに
記載された方法に従って、純度６０％程度のＧＳＴ−Ｅ
ＤＦ融合ポリペプチドを約７．１ｍｇ調製した。レムリ
法でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動した結
果、この融合ポリペプチドは分子量６０，０００であ
り、ＧＳＴの分子量２８，０００を差し引くと融合ポリ
ペプチドの相手の分子量は３２，０００程度である。グ
ルタチオンセファロースに結合することからＧＳＴ部分
はほとんど分解していないと考えられるので、ＥＤＦの
Ｎ末端側が分子量３２，０００程度残り、ＥＤＦの後半
部が欠失していると考えられた。

【００３８】４）ＧＳＴ−ＥＤＦ融合ポリペプチドに対
する抗体の調製 上記３）で調製したＧＳＴ−ＥＤＦ融合ポリペプチドを
フロイントコンプリートアジュバントと混合し、ウサギ
１羽につきＧＳＴ−ＥＤＦ融合ポリペプチドを初回２０
０μｇ、以後２週間ごとに１００μｇずつ、７回皮下に
免疫した。抗原をコートしたプレートによって力価測定
を行った結果、血清を６４，０００倍以上希釈しても十
分な免疫反応があった。ウサギ２羽の血清から「E. Har
low andD. Lane」の「Antibodies」に記載された方法に
従い、１５０ｍｇのＩｇＧ画分を得た。

【００３９】［実施例６］ＥＤＦおよびその部分断片を
発現する組換えバキュロウイルスの作成 １）ＥＤＦおよびその部分断片を発現する組換えバキュ
ロウイルスの作成用組換えトランスファーベクターの構
築 プラスミドｐｆｌｔ３−７（M. Shibuya et al., Oncog
ene, 5:519 (1990)）を鋳型として以下の条件でＰＣＲ
を行った。

【００４０】

【表４】 反応液組成（１００μｌ中）： 反応条件 10μl Pfu buffer#1 （Stratagene社製） 1) ９５℃ １分 ３サイクル 1 μg pflt3-7 ５５℃ １分 0.1 mM dNTPs ７５℃ ２．５分 200 nM プライマー3 2) ９４℃ １分 ３０サイクル 200 nM プライマー4 ５５℃ １分 5 U Pfu polymerase （Stratagene社製） ７５℃ ２．５分 3) ７５℃ ５分 １サイクル 上記反応に用いたプライマー配列は、以下の通りであ
る。 プライマー3:5'-TTTCTCGGATCCTATAAATATGGTCAGCTACTGGG
ACACC-3'（配列番号：１０） プライマー4:5'-GTGGTGGTGGTGGTGGTGACGCTCCAGATTAGACT
TGTCCGA-3'（配列番号：１１） 「プライマー３」の下線部は成熟ＦＬＴのＮ末端コーデ
ィング配列に、「プライマー４」の下線部は、ＦＬＴ細
胞外領域Ｃ末端コーディング配列に対応する。

【００４１】またポリアデニレーションシグナルを含む
ＤＮＡ断片を得るために、プラスミドｐＲｃ／ＲＳＶ
（Invitrogen corp.製）を鋳型として牛成長ホルモン遺
伝子由来のポリアデニレーションシグナルを含むＤＮＡ
（０．３ｋｂｐ）を得るために以下の条件でＰＣＲを行
った。

【００４２】

【表５】 反応液組成（１００μｌ中）： 反応条件 10μl Pfu buffer#1(Stratagene) 1) ９５℃ １分 ３サイクル 1 μg pRc/RSV ５５℃ １分 0.1 mM dNTPs ７５℃ ０．５分 200 nM プライマー5 2) ９４℃ １分 ３０サイクル 200 nM プライマー6 ５５℃ １分 5 U Pfu polymerase (Stratagene) ７５℃ ０．５分 3) ７５℃ ５分 １サイクル 上記反応に用いたプライマー配列は、以下の通りであ
る。 プライマー5:5'-CACCACCACCACCACCACTAACTAGAGCTCGCTGA
TC-3'（配列番号：１２） プライマー6:5'-TTCTCGAATTCTCCCCAGCATGCCTGC-3'（配
列番号：１３） 「プライマー５」「プライマー６」の下線部は、pRc/RS
Vのウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリアデニレーショ
ンシグナルの前後に対応する。

【００４３】得られた各々の反応液 200μlを等量のク
ロロフォルムで処理し、水層を回収し、0.5％SDS、0.1M
Tris-HCl(pH6.8)、5 mM EDTA、200μg/mlプロテネース
Ｋ（proteinase K）となるように各試薬を添加し、３７
℃で３０分間保温した。これらの溶液をＴＥ飽和フェノ
ールで処理し、水層をエタノール沈澱し、ＥＤＦをコー
ドするＤＮＡ断片およびポリアデニレーションシグナル
を含むＤＮＡをＴＥに溶解した。これらのＤＮＡ溶液を
アガロースゲル電気泳動にかけ、各々から２．２ｋｂ
ｐ、０．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収し、各々５０μl
のＴＥ溶液とした。次にこれらのＤＮＡ断片をＰＣＲに
より融合させる（R. Higuchi, "PCR Protocols", Acade
mic Press Inc.,177 (1990)参照）ために以下の条件で
ＰＣＲを行った。

【００４４】

【表６】 反応液組成（１００μｌ中）： 反応条件 10μl Pfu buffer #1 (Stratagene) 1) ９５℃ １分 ３サイクル 4μl EDF coding DNA ５８℃ １分 0.25 μl poly A signal DNA ７５℃ ０．５分 0.1 mM dNTPs 2) ９４℃ １分 ３０サイクル 200 nM プライマー3 ５５℃ １分 200 nM プライマー6 ７５℃ ０．５分 １サイクル 5 U Pfu polymerase (Stratagene) 3) ７５℃ ５分 得られた反応液 200μlを等量のクロロフォルムで処理
し、水層を回収し、0.5％SDS、0.1M Tris-HCl(pH6.8)、5
mM EDTA、200μg/mlプロテネースＫとなるように各試
薬を添加し、３７℃で３０分間保温した。この溶液をＴ
Ｅ飽和フェノールで処理し、水層をエタノール沈澱し、
ＤＮＡをＴＥに溶解した。このＤＮＡ溶液をアガロース
ゲル電気泳動にかけ、ＥＤＦをコードするＤＮＡ断片と
ポリアデニレーションシグナルを含むＤＮＡ断片が融合
したと考えられる２．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収し５
０μlのＴＥ溶液として調製した。このＤＮＡ断片の両
端をBamHIおよびEcoRIで消化したＤＮＡ断片を調製し
た。一方組換えバキュロウイルス用トランスファーベク
ターであるプラスミドｐＶＬ１３９３（PharMingen社）
の１μｇをBamHIおよびEcoRIで切断したものを実施例５
の２）に記載したのと同様の方法で調製した。このプラ
スミドＤＮＡとプラスミドｐｆｌｔ３−７からＰＣＲに
より増幅したＥＤＦをコードするＤＮＡ断片をBamHIお
よびEcoRIで消化したＤＮＡ断片をモル比およそ１：５
で混合し、ライゲーションキット（宝酒造製）で処理
し、大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセルに形質転換
し、実施例５の２）に記載したのと同様の方法で組換え
プラスミドを有するクローンを６種選択した。各クロー
ンの３ｍｌの培養液からアルカリ法でプラスミドＤＮＡ
を調製し、塩基配列の決定を行い、挿入断片の上流約３
００塩基と下流約５００塩基を調べたところ正しい配列
は２種類のクローン由来のプラスミドであった。これら
のプラスミドを「ｐＥＤＦＨ１０」および「ｐＥＤＦＨ
１１」と名付けた。これらのプラスミドを持つ大腸菌を
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌの２×
ＴＹ培地で３７℃で１夜培養し、回収した菌体からアル
カリ法（「J. Sambrook,et al.,"Molecular Cloning",
Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989」の記載に
従う）でプラスミドＤＮＡを抽出し、マニュアルに従っ
てイオン交換カラム（Diagen GimbH、QIAGEN社製）で精
製し、各々２００μlのＴＥに溶解した約 １００μgの
プラスミドＤＮＡを得た。

【００４５】２）ＥＤＦおよびその部分断片を発現する
組換えバキュロウイルスの作成 ＴＭＮ−ＦＨ培地（PharMingen社製）で培養した８０％
コンフルエンシーの状態のＳｆ９細胞（Invitrogen Cor
p.社製）をピペッティングで剥し、２ｘ１０⁶個の細胞
を直径６０ｍｍのディッシュに撒き３０分放置して表面
に吸着させた後、培地を無血清培地であるＥｘ−Ｃｅｌ
ｌ４００（岩城硝子製）２ｍｌに置換した。「ｐＥＤＦ
Ｈ１０」または「ｐＥＤＦＨ１１」を８μl（４μg）、
欠失バキュロウイルスＤＮＡ（BaculoGold、PharMingen
社製）２μl（４０ｎｇ）を１６μl中に混合した溶液
と、リポフェクチンを滅菌純水で２倍希釈した溶液１６
μlとを混合し１５分放置した後、全量３２μlを前述の
ディッシュに添加し混合した。このディッシュを湿潤箱
に入れ２７℃で６時間３０ｒｐｍで振とう培養した後、
培地を２．５ｍｌのＴＭＮ−ＦＨに置換し２７℃で５日
間静置培養した。培地を回収し遠心した上清をオリジナ
ルウイルスストック（それぞれ「ＢＥＤＦＨ１０」、
「ＢＥＤＦＨ１１」と称する）とした。「Invitrogen c
orp.」のマニュアルに従いプラークアッセイを行った結
果、これらのウイルスタイターは共におよそ３×１０⁶
であった。各々のウイルスについて２クローンずつ
（「ＢＥＤＦＨ １０」からは「ＢＥＤＦＨ１０１」
「ＢＥＤＦＨ１０２」、「ＢＥＤＦＨ１１」からは「Ｂ
ＥＤＦＨ１１１」「ＢＥＤＦＨ１１２」）プラーク単離
を行い、Invitrogen corp. のマニュアルに従って４段
階に増幅したウイルス溶液約２００ｍｌ（タイターはお
よそ５×１０⁷／ｍｌ）を得た。

【００４６】［実施例７］組換えウイルス感染Ｓｆ９細
胞発現産物の解析 １）¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₂₁との共有結合架橋産物 上記の組換えウイルスをm.o.i.０．３（m.o.i.とはウイ
ルス粒子：細胞数の比のこと）で感染させたＳｆ９細胞
２×１０⁵に、¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₂₁（150,000cpm/ng）を
１８０，０００ｃｐｍ添加し、１００μｌのＰＢＳ−
０．１％ＢＳＡ中で室温で１時間置いた。遠心により２
回、同バッファーで洗浄し、再度１００μｌのＰＢＳ−
０．１％ＢＳＡに懸濁した。この溶液に５０ｍＭジサク
シニルスベレート(disuccinylsuberate)／ジメチルスル
ホキシド(dimethylsulfoxide)を１／１０容混合し室温
で４０分間置いた後、1M Tris-HCl(pH6.8)を１／１０容
混合した。このサンプルをレムリ法で還元条件でＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後、オート
ラジオグラフィによりシグナルを検出した（図７）。プ
ラスミド「ｐＥＤＦＨ１０」を用いて作成した組換えウ
イルスである「ＢＥＤＦＨ１０」から分離した２クロー
ンの感染細胞では、分子量１３０，０００の共有結合架
橋産物が検出できた（図７Ａ、レーン１、２）のに対し
て、プラスミド「ｐＥＤＦＨ１１」を用いて作成した組
換えウイルスである「ＢＥＤＦＨ１１」から分離した２
クローンの感染細胞では分子量５０，０００の共有結合
架橋産物が観察された（図７Ａ、レーン３、４）。一
方、ＥＤＦをコードするＤＮＡをプロモーターとは逆向
きに挿入した組換えトランスファーベクターを用いて作
成したコントロールウイルス感染細胞では共有結合架橋
産物は検出できなかった。図７Ｂのレーン１はコントロ
ールウイルス感染細胞を使用し、レーン２は「ＢＥＤＦ
Ｈ１１」感染細胞を使用し、レーン３はレーン２の反応
に２１４倍の非標識ＶＥＧＦを添加したサンプルであ
る。ＶＥＧＦ₁₂₁モノマーの分子量が２０，０００であ
るので、それぞれの共有結合架橋産物の分子量から差し
引くと、１１０，０００と３０，０００である。このこ
とから「ＢＥＤＦＨ１０」感染細胞はＥＤＦの全長を生
産しており「ＢＥＤＦＨ１１」感染細胞はＥＤＦの断片
を発現していると考えられた。「ＢＥＤＦＨ１１」から
発現されるＥＤＦの断片を「ＥＤＦΔ１１」と名付け
た。

【００４７】２）ＶＥＧＦとの親和性 Ｓｆ９細胞に組換えウイルス「ＢＥＤＦＨ１０」または
「ＢＥＤＦＨ１１」をm.o.i.５で感染させ、７日間培養
した培養上清をマイクロタイタープレート（イムロン
２、ダイナテック社製）のウェルに１００μl入れ４℃
で一夜置いた。 その後ウェルの中の液を捨て、ＰＢＳ
−０．１％ＢＳＡで３回洗浄し、次にＰＢＳ−１％ＢＳ
Ａを２５０μl入れ、室温で２時間放置しブロッキング
した。ウェルの中の液を捨て、１００μl中に比活性78,
000cpm/ngの¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅（アマシャム社製）１
１３００ｃｐｍに非標識のＶＥＧＦ₁₆₅を０〜１２５０
０ｐｇ混合した溶液を入れ室温で３時間放置した。ウェ
ルの中の液を捨てＰＢＳ−０．１％ＢＳＡで３回洗浄
し、各ウェルに残った放射活性をγカウンターで測定し
スカッチャード解析を行った（図８）。図８Ａ、Ｂはそ
れぞれＥＤＦまたは「ＥＤＦΔ１１」の発現培養上清を
コートしたプレートを用いた結果である。この時にコン
トロールウイルス感染Ｓｆ９細胞の培養上清でコートし
たプレートには¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅ほとんど結合しない
ので、結合放射活性は挿入遺伝子からの発現産物への
¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅の結合であると考えられる。「ＢＥ
ＤＦＨ１０」または「ＢＥＤＦＨ１１」感染細胞の培養
上清中の発現産物のＶＥＧＦ₁₆₅に対する親和性は共に
Ｋｄ（解離定数）がおよそ５×１０^-11でありＦＬＴ
（J. Waltenberger, et al., J. Biol. Chem., 269:269
88 (1994)）または可溶性型ＦＬＴ（R. L. Kendal and
K. A. Thomas, Proc. Natl., Acad. Sci., U. S. A., 9
0:10705 (1993)）について報告されている値に近かっ
た。

【００４８】３）組換えトランスファーベクターへの挿
入ＤＮＡの塩基配列解析 プラスミド「ｐＥＤＦＨ１０」および「ｐＥＤＦＨ１
１」にクローニングしたＤＮＡの塩基配列を確認するた
めに塩基配列の決定を行った結果、「ｐＥＤＦＨ１０」
の挿入ＤＮＡのＦＬＴ細胞外領域と対応する領域の塩基
配列はＦＬＴと完全に一致していた。「ｐＥＤＦＨ１
１」の挿入ＤＮＡのＦＬＴ細胞外領域と対応する領域の
塩基配列はＦＬＴと比較して、配列番号：１で１０５３
番目のＣが欠失していた。その結果、オープンリーディ
ングフレームが配列番号：１のＦＬＴアミノ酸配列のー
２２番から２４６番までに対応するようになっていた。
この部分はＦＬＴの第一ドメインと第二ドメインを含ん
でいる。

【００４９】４）発現産物の精製 １００ｍｌの三角フラスコに３０ｍｌＴＭＮ−ＦＨを入
れ２７℃、７０ｒｐｍで培養したＳｆ９細胞９０ｍｌ
（１．５×１０⁶／ｍｌ）に組換えウイルス「ＢＥＤＦ
Ｈ１０」または「ＢＥＤＦＨ１１」をm.o.i.５で感染さ
せ、２０時間後に遠心して培地を６０ｍｌ（３０ｍｌ×
２）のＥｘ−ｃｅｌｌ４０５（岩城硝子製）に置換して
４８時間培養し、１／１００容の３３０ｍＭフェニルメ
チルスルフォニルフルオライド(phenylmethylsulfonyl
fluoride)／エタノールと１／１０００容の100μg／ml
アンチパイン(antipain)、200μg／mlアプロチニン(apr
otinin)、200μg／mlロイペプチン(leupeptin)を添加し
上清を回収した。「ＢＥＤＦＨ１０」感染細胞の培養上
清は「Immercible CX-10」（日本ミリポアリミテッド
製）で８倍濃縮し、20 mM Tris-HCl(pH7.8)／50 mM KCl
／0.1％ ノニデット(Nonidet)P-40／1 mM イミダゾール
-塩酸(pH7.8)で平衡化したNi⁺⁺-NTA（QIAGEN、Diagen G
imbH）を添加して４℃で１時間混合した。１０，０００
ｒｐｍで遠心して沈澱に３０ｍｌの150 mM KCl／0.1％
ノニデット P-40/40 mM イミダゾール-塩酸(pH7.8)を添
加し４℃で１５分間混合し、遠心して沈澱を回収し、更
に２回同バ ッファーで洗浄した。沈澱に０．２ｍｌの2
50 mM イミダゾール-塩酸(pH7.8)を 添加し室温で１５
分間混合し遠心して上清を回収した。再度沈澱に０．２
ｍｌの250 mMイミダゾール-塩酸(pH7.8)を添加し同様に
して上清を回収し、前回の上清と併せて精製ＥＤＦサン
プルとした。「ＢＥＤＦＨ１１」感染細胞の培養上清は
０．３ＭになるようＮａＣｌを添加してＦＰＬＣ（ファ
ルマシアバイオシステム製）でヘパリンカラム（ファル
マシアバイオシステム製）を用いて分画した。サンプル
負荷のあと０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）−
０．３Ｍ ＮａＣｌで２８０ｎｍの吸光度が十分下がる
まで洗浄し、０．３−１．０Ｍ ＮａＣｌのリニアグラ
ディエントで溶出した。２８０ｎｍの吸収がある画分を
回収しＶＥＧＦアフィニティクロマトグラフィーを行っ
た。ＰＢＳでサンプルを２倍に希釈して、１．４ｍｇの
ＶＥＧＦをセファロース４Ｂに共有結合したカラム０．
４ｍｌに負荷した。２０ｍｌのＰＢＳ−０．５Ｍ Ｎａ
Ｃｌでカラムを洗浄し、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ
４．０）で、０．０５ｍｌの２Ｍ Tris-HCl(pH8.0)を入
れたチューブに０．５ｍｌ／チューブで溶出した。各フ
ラクションをレムリ法でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動後、銀染色した（図９Ａ、レーン番号はフラ
クション番号と一致）。また各フラクションをＰＢＳ−
０．１％ＢＳＡで１０倍希釈して、等容の¹²⁵Ｉ−ＶＥ
ＧＦ₁₆₅と混合し、１時間後に１００μlの混合液を実施
例３の２）で使用したマイクロタイタープレートでＶＥ
ＧＦの 結合を調べた。その結果、電気泳動で共有結合
架橋実験での予想とほぼ一致する分子量３５，０００バ
ンドが観察されたフラクションにＶＥＧＦの結合阻害が
見られた（図９Ｂ）。

【００５０】５）免疫化学的解析 ＥＤＦまたは「ＥＤＦΔ１１」をＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動し、「E. Harlow and D. Lane」の
「Antibodies」に記載の方法に従ってウェス タンブロ
ティングを行った。１次抗体として実施例１の４）の抗
体を２μg/mlで使用し、２次抗体としてアルカリフォス
ファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ（E. Y. Laboratories）
を５０００倍希釈して使用し、ＮＴＢ(Nitroblue tetaz
olium chrolide)／ＢＣＩＰ(5-Bromo-4-chrolo-3-indol
ylphosphste p-toluidine salt)（Gibco BRL社製）で発
色させた。その結果、約３５ｋｄの単一バンドが観察さ
れ、この抗体との特異的な反応性が確認された（図１０
Ｂ）。以上のことから「ＥＤＦΔ１１」はＦＬＴのＮ末
端２６７に相当するポリペプチドであることがわかっ
た。図１０Ａにおいてレーン１はヘパリンカラム後のサ
ンプル、レーン２はＶＥＧＦアフィニティクロマトグラ
フィー後のサンプルを電気泳動して銀染色したものであ
る。図１０Ｂは、図１０Ａと同じサンプルでウェスタン
ブロットを行った図である。

【００５１】６）ＶＥＧＦの生物活性の阻害 ＶＥＧＦによるヒト臍帯由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥ
Ｃ）のチミジン取り込み促進に対する「ＥＤＦ」発現培
養上清、「４Ｎ−ＦＬＴ」発現培養上清または「ＥＤＦ
Δ１１」発現培養上清による阻害を調べた。ＨＵＶＥＣ
（クラボウ社製）を９６穴コラーゲンコートプレート
（岩城硝子製）に３０００個／ウェル／１００μl（Ｅ
ＧＭ−ＵＶ培地、クラボウ製）で撒き、３７℃、５％Ｃ
Ｏ₂で２４時間培養する。ＰＢＳで２回洗浄し、２０ｎ
ｇ／ｍｌのＶＥＧＦ₁₆₅を５０μlとサンプル５０μlを
ウェルに添加して４日間培養した。５０μＣｉ／２ｎｍ
ｏｌｅｓ／ｍｌの³Ｈ−チミジンを１０μlウェルに添加
して更に２４時間培養した。ＰＢＳで２回洗浄した後、
トリプシン／ＥＤＴＡで細胞を剥し、セルハーベスター
（Cambridge Technology Inc.製）でグラスフィルター
に回収し液体シンチレーションカウンターで放射活性を
測定した（図６）。対照として用いた野生株（wt）ウイ
ルス感染培養上清をサンプルとして添加した場合に比
べ、組換えウイルスを用いた「ＥＤＦ」「４Ｎ−ＦＬ
Ｔ」「ＥＤＦΔ１１」発現培養上清を添加した場合は、
有意にＶＥＧＦ依存性チミジン取り込みが阻害された。
この結果から「ＥＤＦ」「４Ｎ−ＦＬＴ」または「ＥＤ
ＦΔ１１」は、ＶＥＧＦによるＨＵＶＥＣのチミジン取
り込みの促進、即ちＤＮＡ合成の促進を阻害することが
明らかになった。

【００５２】III．第１〜第２イムノグロブリン様ドメ
インとヒトＩｇＧ₁−Ｆｃ領域との融合タンパク質に関
する実施例 ［実施例８］ １）ヒトＩｇＧ₁−Ｆｃ ｃＤＮＡの単離 ＩｇＧ生産株であるヒトリンフォブラストーマ、ＩＭ９
（大日本製薬）をRPMI1640培地で培養した上清を、Huma
n IgG subclass profile kit(Zymed)を用いて調べたと
ころ、ヒトＩｇＧ₁を生産していることがわかった。４
ｘ１０⁷個のＩＭ９細胞から、ＩＩの［実施例５］
（１）記載と同様の方法でｃＤＮＡ溶液を調製した。こ
のｃＤＮＡから、表７に示す条件で２段階のＰＣＲによ
りヒトＩｇＧ₁−Ｆｃ ｃＤＮＡ断片を増幅した。

【００５３】

【表７】 反応液組成（１００μｌ中） ＰＣＲ反応条件 10 μｌLA-PCR buffer（宝酒造） １）９５℃、１分を１サイクル 各 0.1 mM dNTPs ２）９４℃、１分、５６℃、１分 2 μｌ ｃＤＮＡ溶液 ７２℃、１分を２０サイクル 200 nM プライマー７ ３）プライマー９、１０を200μM 200 nM プライマー８ 添加し、９４℃、１分、５６ 5.0 U ExTaq ポリメラーゼ（宝酒造） ℃、１分、７２℃、１分を １５サイクル ４）７２℃、７分を１サイクル プライマー配列は、以下の通りである。 プライマー７：5'-TCTTGTGACAAAACTCACACATGC-3'（配列番号：１４） プライマー８：5'-CGGAGACAGGGAGAGGCTCTTCTG-3'（配列番号：１５） プライマー９：5'-GAGCCCAAATCTTGTGACAAAA-3'（配列番号：１６） プライマー10：5'-TTCTCGGATCCTTATTTACCCGGAGACAGGGA-3'（配列番号：１７） Bam STP hIgG1-Fc term プライマー10の「Bam」は制限酵素BamHI認識配列、「ST
P」は終止コドン、「hIgG1-Fc term」はヒトＩｇＧ₁−
Ｆｃコーディング領域のＣ末端部分を意味する。ただし
プライマー８とプライマー10はアンチセンス鎖である。
ヒトＩｇＧ₁−Ｆｃコーディング領域とプライマー位置
の対応を図１１に示した。ＰＣＲ反応液をＩＩの［実施
例５］（２）の記載と同様の方法で処理し、アガロース
ゲル電気泳動にかけ、約７００ｂｐのＤＮＡ断片を切り
出し、フィルターチューブSUPEREC-01（宝酒造）で遠心
しＤＮＡを回収した。このＤＮＡ断片の AvaI、HpaII、
RsaI、SmaIの各制限酵素切断パターン（表８）を調べ、
既報のヒトＩｇＧ₁−ＦｃｃＤＮＡ配列（J.W. Ellison,
B. J. Berson and L. E. Hood, Nucleic Acid Res., 1
0:4071 (1982)）と合致することを確認した。

【００５４】

【表８】 ──────────────────────────────── 生じたＤＮＡ断片のサイズ（ｂｐ） ──────────────────────────────── Ｉｎｔａｃｔ ７００ ＡｖａＩ ３８０，２８０ ＨｐａＩＩ ３００，１９０，１１０，１１０ ＲｓａＩ ３００，２００，７５，７５ ＳｍａＩ ４８０，２８０ ──────────────────────────────── ［実施例９］第１〜第２イムノグロブリン様ドメインと
ヒトＩｇＧ₁−Ｆｃ領域との融合タンパク質の発現系の
構築 １）大腸菌外膜タンパク質 OmpA のシグナルペプチドコ
ーディングＤＮＡの単離 大腸菌株ＨＢ１０１を３ｍｌの２ｘＴＹ培地で３７℃、
一夜培養し、遠心して菌体を回収し、０．５ｍｌのＴＥ
バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）／１ｍＭＥＤＴＡ）に懸濁した。２０ｍｇ／ｍｌの
卵白リゾチームを２５μｌ加えて室温に１５分置き、溶
菌させた後、５０μｌの１０％ＳＤＳと０．５ｍｌＴＥ
飽和フェノールを加え、５分間激しく振とうし、遠心し
て水層を回収し、当量のクロロホルムで処理し、フェノ
ールを除いた。２容のエタノールを加えＤＮＡを沈澱さ
せ、７０％エタノールで洗浄し、乾燥後、沈澱を２００
μｌの２０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡ溶液に溶解し、大
腸菌ゲノムＤＮＡ溶液とした。これを鋳型として表９の
条件でＰＣＲを行い、OmpA のシグナルペプチドコーデ
ィングＤＮＡを増幅した。

【００５５】

【表９】 反応液組成（１００μｌ中） ＰＣＲ反応条件 10 μｌLA-PCR buffer（宝酒造） １）９５℃、１分を１サイクル 各 0.1 mM dNTPs ２）９４℃、１分、５６℃、１分 2 μｌ大腸菌ゲノムＤＮＡ ７２℃、１分を３５サイクル 200 nM プライマー11 ３）７２℃、７分を１サイクル 200 nM プライマー12 5.0 U ExTaq ポリメラーゼ（宝酒造） プライマー配列は、以下の通りである。 プライマー11：5'-TAACCTGGCGATAACGAGGCGCAAATAATGAAAAAG -3'（配列番号：18 ） trx term SD omp init プライマー12：5'-CTGAACTAGATTTCGGAGCGGCCTGCGCTA-3'（配列番号：１９） mflt omp SP term プライマー11の「trx term」は大腸菌チオレドキシン遺
伝子（trxA）コーディング末端部分、「SD」は、omp A
のリボソーム結合配列、「omp init」は、omp Aの開始
コドン周辺を意味する。プライマー12の「mflt」は成熟
ＦＬＴのＮ末端コーディング領域、「omp SP term」
は、Omp Aシグナルペプチドコーディング領域末端部分
を意味する。ただし、プライマー12はアンチセンス鎖で
ある。なおチオレドキシン遺伝子に関する配列は、「B.
J. Wallace and S. R. Kushner, Gene32:399 (1984)」
を、omp Aに関する配列は「E. Beck and E. Bremmer, N
ucleicAcid Res., 8:3011(1980)」を参考とした。この
ＰＣＲ反応液を前述と同様に処理し、得られたＤＮＡ断
片をOmp AシグナルペプチドＤＮＡとした（図１２、図
１４）。

【００５６】（２）大腸菌チオレドキシン遺伝子の増幅
と単離 前述のように、大腸菌で外来性タンパク質を高発現させ
ると不溶性の封入体となり易いことが知られている。封
入体を変性・可溶化・再活性化するのは回収率が悪く労
力を要する。このような場合に大腸菌内で、大腸菌チオ
レドキシンを同時に高発現させると、外来性タンパク質
が正常なフォールディング構造をとることができ、封入
体が生じにくくなることが報告されている（T. Yasukaw
a et al., J. Biol. Chem. 270:25328(1995)）。そこで
チオレドキシンを同時に高発現させるために遺伝子を単
離した。

【００５７】以下の条件でＰＣＲを行い、大腸菌チオレ
ドキシン遺伝子を増幅した。

【００５８】

【表１０】 反応液組成（１００μｌ中） ＰＣＲ反応条件 10 μｌLA-PCR buffer（宝酒造） １）９５℃、１分を１サイクル 各 0.1 mM dNTPs ２）９４℃、１分、５６℃、１分 2 μｌ大腸菌ゲノムＤＮＡ ７２℃、１分を３５サイクル 200 nM プライマー13 ３）７２℃、７分を１サイクル 200 nM プライマー14 5.0 U ExTaq ポリメラーゼ（宝酒造） プライマー配列は、以下の通りである。 プライマー13：5'-TTCTCGAATTCCCTGTGGAGTTATATATGAGC-3'（配列番号：２０） Eco SD trx init プライマー14：5'-GCCTCGTTATCGCCAGGTTAGCGTCGAGGA-3'（配列番号：２１） ompSD trx term プライマー13の「Eco」は制限酵素 EcoRI の認識切断部
位、「SD」は、大腸菌チオレドキシン遺伝子のリボソー
ム結合配列、「trx init」は、trxAの開始コドン周辺を
意味する。プライマー14の「ompSD」は、omp Aのリボソ
ーム結合配列を意味する。プライマー14はアンチセンス
鎖である。このＰＣＲ反応液を前述と同様に処理し、得
られたＤＮＡ断片をチオレドキシンＤＮＡとした（図１
２、図１４）。

【００５９】（３）ＦＬＴ第１〜第２イムノグロブリン
様ドメインコーディングＤＮＡとヒトＩｇＧ₁−Ｆｃ領
域コーディングＤＮＡの融合 ＥＤＦΔ１１バキュロ発現ベクターｐＥＤＦＨ１１を鋳
型として表１１の条件でＰＣＲを行い、ＦＬＴ第１〜第
２イムノグロブリン様ドメインコーディングＤＮＡを増
幅し、前述と同様にして精製し、ＥＤＦ１２ ＤＮＡと
した（図１３）。

【００６０】

【表１１】 反応液組成（１００μｌ中） ＰＣＲ反応条件 10 μｌLA-PCR buffer（宝酒造） １）９５℃、１分を１サイクル 各 0.1 mM dNTPs ２）９４℃、１分、５６℃、１分 0.8 μg pEDFH10 DNA ７２℃、１分を２０サイクル 200 nM プライマー15 ３）７２℃、７分を１サイクル 200 nM プライマー16 5.0 U ExTaq ポリメラーゼ（宝酒造） プライマー配列は、以下の通りである。 プライマー15：5'-CGCTCCGAAA TCTAGTTCAGGTTCAAAATT-3'（配列番号：２２） ompSP term mFLT プライマー16：5'-TTTgTCACAAgATTTgggCTCT gTgCTTATTTggACATCTAT-3' hIgG-Fc hinge 214-FLT-208 （配列番号：２３） プライマー16の「hIgG-Fc hinge」はヒトＩｇＧ₁のヒン
ジコーディングＤＮＡ、「214-FLT-208」はＦＬＴの２
０８位〜２１４位のアミノ酸コーディングＤＮＡを意味
する。プライマー16はアンチセンス鎖である。

【００６１】このようにして得たＦＬＴ第１〜第２イム
ノグロブリン様ドメインコーディングＤＮＡ（EDF12 DN
A）と［実施例８］の（１）で得られたＩｇＧ₁−Ｆｃ
ｃＤＮＡを鋳型として用い、表１２の条件で組換えＰＣ
Ｒ（R. Higuchi, In "PCR Protocols", ed. by M. A. I
nnis et al., Academic Press Inc. (1990)）を行い、
両ＤＮＡ断片を融合・増幅し、これまでと同様に精製
し、ＥＤＦ１２Ｆｃ ＤＮＡとした（図１３、図１
４）。

【００６２】

【表１２】 反応液組成（１００μｌ中） ＰＣＲ反応条件 10 μｌLA-PCR buffer（宝酒造） １）９５℃、１分を１サイクル 各 0.1 mM dNTPs ２）９４℃、１分、５６℃、１分 0.1 μg EDF12 DNA ７２℃、１分を２５サイクル 0.1 μg hIgG Fc cDNAFc DNA ３）７２℃、７分を１サイクル 200 nM プライマー15 200 nM プライマー10 5.0 U ExTaq ポリメラーゼ（宝酒造） （４）発現ベクターの作製 ［実施例９］の（１）のOmp AシグナルペプチドＤＮＡ
と［実施例９］の（２）のチオレドキシンＤＮＡと［実
施例９］の（３）のＥＤＦ１２Ｆｃ ＤＮＡを鋳型とし
て用い、表１３の条件で組換えＰＣＲを行い、３つのＤ
ＮＡ断片を融合・増幅し精製した（図１３、図１４）。
図１３においてレーンＭ、１、２、３はそれぞれ、分子
量スタンダード、ＥＤＦ１２ ＤＮＡ、ＩｇＧ₁ Ｆｃ Ｄ
ＮＡ、ＥＤＦ１２Ｆｃ ＤＮＡである。図１４の「E
c」、「Bm」はそれぞれ、制限酵素EcoRI、BamHIの認識
配列の存在箇所を表す。

【００６３】

【表１３】 反応液組成（１００μｌ中） ＰＣＲ反応条件 10 μｌLA-PCR buffer（宝酒造） １）９５℃、１分を１サイクル 各 0.1 mM dNTPs ２）９５℃、１分、１５分間か 0.1 μg Omp A シグナルペプチド DNA けて５５℃まで下げ、更に 0.1 μg チオレドキシン DNA ５５℃、２分、７２℃、 0.1 μg EDF12Fc DNA ２．５分を３サイクル 200 nM プライマー13 ３）９４℃、１分、５６℃、１分 200 nM プライマー10 ７２℃、２．５分を 5.0 U ExTaq ポリメラーゼ（宝酒造） ２２サイクル ４）７２℃、７分を１サイクル このようにして得られた約１．７ＫｂｐのＤＮＡ断片
は、プライマー10とプライマー13に含められた EcoRI
と BamHI 認識切断配列を末端に持つ。この１．７Ｋｂ
ｐの融合ＤＮＡ断片をEcoRIとBamHIで消化した。一方、
大腸菌発現ベクターｐＴＴＱ１８（（株）アマシャムジ
ャパン製）をEcoRIとBamHIで消化した。これらの制限酵
素消化反応液を［実施例５］の（２）と同様の方法で処
理し、ＤＮＡを回収した。ライゲーションキット（宝酒
造製）を用い、ベクター：インサートのモル比３：１で
連結反応を行った。この反応液と大腸菌JM109のコンピ
テントセル（宝酒造製）を用いて形質転換を行い、アン
ピシリン含有寒天培地にて生育する形質転換体を選択し
た。更にこの中から［実施例５］の（２）と同様の方法
で、１．７Ｋｂｐの挿入ＤＮＡを持つ組換え体が数クロ
ーン得られ、その一つをJM109(pEDF12Fc)とした。

【００６４】図１２レーンＭ、１、２、３、４、５、６
はそれぞれ、分子量スタンダード、チオレドキシンＤＮ
Ａ、Omp A シグナルペプチドＤＮＡ、ＥＤＦ１２Ｆｃ
ＤＮＡ、チオレドキシンＤＮＡ−Omp A シグナルペプチ
ドＤＮＡ-ＥＤＦ１２Ｆｃ ＤＮＡ融合断片、pEDF12Fc D
NAのEcoRI＋BamHI消化、pTTQ18 DNAのEcoRI＋BamHI消化
である。（丸印は未消化プラスミドである。） ［実施例１０］発現した融合タンパク質の解析 （１）粗抽出液の調製 JM109(pEDF12Fc)を７０ｍｌの１００μｇ／ｍｌのアン
ピシリンを含む２ｘＴＹ培地で、３７℃で振とう培養を
おこない、波長６００ｎｍの吸光度が１．０に達した時
にＩＰＴＧを０．５ｍＭ添加し、更に１２時間培養し
た。培養終了後、培養液を急冷し、培養液にプロテアー
ゼインヒビターとして、３３μＭ ｐＡＰＭＳＦ（和光
純薬工業）を７０μｌを添加し、遠心して菌体を回収し
た。菌体を５ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）／３３ｎＭ ｐＡＰＭＳＦに懸濁し、ソニケー
ターを用いて菌体の９５％以上を超音波破砕した。これ
を１０，０００ｘｇで２０分遠心し、沈澱を５ｍｌの
０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／１Ｍ Ｋ
Ｃｌ／３３ｎＭ ｐＡＰＭＳＦ／５ｍＭ ＥＤＴＡ／１
％ＴｒｉｔｏｎＸ１００／０．１％Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ
４０に溶解し、２０，０００ｘｇで遠心して不溶成分を
除いた上清を粗抽出液として以下の解析に用いた。同時
に対照としてベクター部分のみを持つJM109(pTTQ18)か
ら同様にして粗抽出液を調製した。

【００６５】（２）ＥＩＡによる融合タンパク質発現の
確認 ＶＥＧＦと抗ヒトＩｇＧ抗体を用いたサンドイッチＥＩ
Ａによって確認した。ＶＥＧＦコートプレートを作成す
るために、ＶＥＧＦ₁₆₅（Ｒ＆Ｄ社製）を５０ｎｇ／ｍ
ｌになるようにＰＢＳで希釈し、イムロン２マイクロタ
イタープレートに１ウェル当たり１００μｌ分注し、４
℃で一夜置いた後、［実施例７］の（２）と同様にして
ブロッキングした。JM109(pTTQ18)およびJM109(pEDF12F
c)の粗抽出液をＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで２０倍希釈し
た溶液１００μｌを、ウェルに加え室温で１時間置いた
後、ウェルをＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで６回洗浄した。
次にＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで１０００倍希釈したペル
オキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（ＭＢＬ製＃ＩＭ−
０８３７）を１００μｌ、ウェルに加え室温で１時間放
置し、上述のようにウェルを６回洗浄した。この後、ペ
ルオキシダーゼ基質溶液（２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐ
Ｈ５．２）、０．０１％過酸化水素、オルトフェニレン
ジアミンタブレット（和光純薬製）１錠／２０ｍｌ）１
００μｌをウェルに加え、室温で３０分呈色反応を行
い、更に１００μｌの２Ｎ硫酸を加えて反応を停止し、
４９２ｎｍの吸光度を測定した。その結果、組換え体JM
109(pEDF12Fc)抽出液は対照と比較して強く発色した
（表１４）。これはＶＥＧＦと抗ヒトＩｇＧ抗体とのサ
ンドイッチＥＩＡであるので、この結果から組換え体抽
出液中に、ＶＥＧＦに結合し、かつ抗ヒトＩｇＧ抗体と
結合する分子が含まれることが示唆された。

【００６６】

【表１４】 ──────────────────────────────── ２０倍希釈粗抽出液 JM109(pTTQ18) JM109(pEDF12Fc) ──────────────────────────────── 吸光度（４９２ｎｍ） ０．１１８ １．０５６ ──────────────────────────────── （３）組換えタンパク質の分子量の確認 組換えタンパク質の分子量を調べるため、［実施例７］
の（５）と同様の方法で粗抽出液をウェスタンブロット
にかけた。粗抽出液をレムリ法でＳＤＳ−ポリアクリル
アミド電気泳動し、ＰＤＶＦ膜にエレクトロブロット
し、ブロッキングした後、１次抗体として、抗ヒトＩｇ
Ｇ₁−Ｆｃモノクローナル抗体（ＭＢＬ＃ＩＭ−０２８
０）０．４μｇ／ｍｌで、２次抗体としてアルカリフォ
スファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｚｙｍｅｄ製）を４
０００倍希釈して使用した。その結果、JM109(pEDF12F
c)粗抽出液のレーンにのみ、還元条件でおよそ分子量６
０００の免疫化学的に反応するバンドが検出された（図
１５）。図１５においてレーン１、２のサンプルはそれ
ぞれ、JM109(pTTQ18)粗抽出液、JM109(pEDF12Fc)粗抽出
液である。予想される組換え体は４４６アミノ酸残基で
あるので、妥当なサイズである。

【００６７】（４）¹²⁵ＶＥＧＦ₁₆₅との共有結合架橋産
物の解析 組換えタンパク質とＶＥＧＦとの結合複合体の分子量を
調べるため、各粗抽出液１００μｌと¹²⁵ＶＥＧＦ₁₆₅
１４０，０００ｃｐｍを混合し、２時間室温で置いた
後、サンブルックらの「Molecular Cloning」記載の方
法で、プロテインＡセファロース（ファルマシア製）を
用いて免疫沈降し、［実施例７］の（１）と同様の方法
で架橋反応を行った。沈澱物をＳＤＳ−ポリアクリルア
ミド電気泳動し、オートラジオグラフィーによりシグナ
ルを検出した（図１６）。その結果、対照抽出液ではＶ
ＥＧＦの弱いシグナルのみが検出される（レーン２）の
に対し、組換え体JM109(pEDF12Fc)の抽出液では、還元
条件で分子量がおよそ１５２万の架橋産物が検出された
（レーン１）。この結果から、組換えタンパク質はＶＥ
ＧＦに結合し安定な複合体を形成でき、プロテインＡと
も結合することがわかる。

【００６８】（５）組換えタンパク質のＶＥＧＦ親和性
の測定 組換えタンパク質のＶＥＧＦに対する結合親和性を知る
ために［実施例７］の（１）と同様の方法でスカッチャ
ード解析（Ｎ＝３）を行った（図１７Ａ、Ｂ）。イムロ
ン２にプロテインＡ（カッペル製）２０μｇ／ｍｌを１
ウェル当たり１５０μｌでコートし、ブロッキングした
後、粗抽出液を１ウェル当たり１５０μｌ加え、室温で
１時間置いた。ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ／０．２５％ジェラチン／０．１％Ｎｏｎｉｄｅｔ
−Ｐ４０で３回洗浄した。¹²⁵ＶＥＧＦ₁₆₅を洗浄する時
も同じバッファーで洗浄した。その結果、組換えタンパ
ク質はＥＤＦと同程度のＶＥＧＦ親和性を有しているこ
とが示された。

【００６９】以上の結果から本実施例の組換えタンパク
質であるＦＬＴ第１〜第２イムノグロブリン様ドメイン
−ヒトＩｇＧ₁ Ｆｃ融合タンパク質は、ＥＤＦと同程度
に高親和的にＶＥＧＦと結合し、ヒトＩｇＧ₁ Ｆｃ特異
的なモノクローナル抗体によって認識され、またプロテ
インＡとも結合するというヒトＩｇＧ₁ Ｆｃの生化学的
特性を有していることが示された。また本融合タンパク
質は、ＥＤＦのＶＥＧＦ親和性という生化学的特性が、
融合によっても損なわれていないことから、ＥＤＦと同
様にＶＥＧＦに結合し、ＶＥＧＦの活性を阻害できると
考えられる。

【００７０】

【発明の効果】本発明のポリペプチドはＶＥＧＦ刺激に
よる血管新生を阻害することができるので固形ガンその
他の病理的血管新生を伴う疾病の治療に利用できる。ま
た、ヒト由来のアミノ酸からなるのでヒトに長期投与し
ても抗体ができにくい。更に、従来のポリペプチド（R.
L. Kendal and K. A. Thomas, Proc. Natl., Acad. Sc
i., U. S. A., 90:10705 (1993)）より分子量が小さい
ので組換えＤＮＡによる発現が行い易く、患部への浸潤
も速やかである。

【００７１】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１８９９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：ヒト 細胞の種類：胎盤組織 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：２５０．．１８９９ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置： ２５０．．３１５ 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：３１６．．１８９９ 配列 GCGGACACTCCTCTCGGCTCCTCCCCGGCAGCGGCGGCGGCTCGGAGCGGGCTCCGGGGC 60 TCGGGTGCAGCGGCCAGCGGGCCTGGCGGCGAGGATTACCCGGGGAAGTGGTTGTCTCCT 120 GGCTGGAGCCGCGAGACGGGCGCTCAGGGCGCGGGGCCGGCGGCGGCGAACGAGAGGACG 180 GACTCTGGCGGCCGGGTCGTTGGCCGGGGGAGCGCGGGCACCGGGCGAGCAGGCCGCGTC 240 GCGCTCACCATG GTC AGC TAC TGG GAC ACC GGG GTC CTG CTG TGC GCG 288 Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala -20 -15 -10 CTG CTC AGC TGT CTG CTT CTC ACA GGA TCT AGT TCA GGT TCA AAA TTA 336 Leu Leu Ser Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Lys Leu -5 1 5 AAA GAT CCT GAA CTG AGT TTA AAA GGC ACC CAG CAC ATC ATG CAA GCA 384 Lys Asp Pro Glu Leu Ser Leu Lys Gly Thr Gln His Ile Met Gln Ala 10 15 20 GGC CAG ACA CTG CAT CTC CAA TGC AGG GGG GAA GCA GCC CAT AAA TGG 432 Gly Gln Thr Leu His Leu Gln Cys Arg Gly Glu Ala Ala His Lys Trp 25 30 35 TCT TTG CCT GAA ATG GTG AGT AAG GAA AGC GAA AGG CTG AGC ATA ACT 480 Ser Leu Pro Glu Met Val Ser Lys Glu Ser Glu Arg Leu Ser Ile Thr 40 45 50 55 AAA TCT GCC TGT GGA AGA AAT GGC AAA CAA TTC TGC AGT ACT TTA ACC 528 Lys Ser Ala Cys Gly Arg Asn Gly Lys Gln Phe Cys Ser Thr Leu Thr 60 65 70 TTG AAC ACA GCT CAA GCA AAC CAC ACT GGC TTC TAC AGC TGC AAA TAT 576 Leu Asn Thr Ala Gln Ala Asn His Thr Gly Phe Tyr Ser Cys Lys Tyr 75 80 85 CTA GCT GTA CCT ACT TCA AAG AAG AAG GAA ACA GAA TCT GCA ATC TAT 624 Leu Ala Val Pro Thr Ser Lys Lys Lys Glu Thr Glu Ser Ala Ile Tyr 90 95 100 ATA TTT ATT AGT GAT ACA GGT AGA CCT TTC GTA GAG ATG TAC AGT GAA 672 Ile Phe Ile Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu 105 110 115 ATC CCC GAA ATT ATA CAC ATG ACT GAA GGA AGG GAG CTC GTC ATT CCC 720 Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro 120 125 130 135 TGC CGG GTT ACG TCA CCT AAC ATC ACT GTT ACT TTA AAA AAG TTT CCA 768 Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro 140 145 150 CTT GAC ACT TTG ATC CCT GAT GGA AAA CGC ATA ATC TGG GAC AGT AGA 816 Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg 155 160 165 AAG GGC TTC ATC ATA TCA AAT GCA ACG TAC AAA GAA ATA GGG CTT CTG 864 Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu 170 175 180 ACC TGT GAA GCA ACA GTC AAT GGG CAT TTG TAT AAG ACA AAC TAT CTC 912 Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu 185 190 195 ACA CAT CGA CAA ACC AAT ACA ATC ATA GAT GTC CAA ATA AGC ACA CCA 960 Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Gln Ile Ser Thr Pro 200 205 210 215 CGC CCA GTC AAA TTA CTT AGA GGC CAT ACT CTT GTC CTC AAT TGT ACT 1008 Arg Pro Val Lys Leu Leu Arg Gly His Thr Leu Val Leu Asn Cys Thr 220 225 230 GCT ACC ACT CCC TTG AAC ACG AGA GTT CAA ATG ACC TGG AGT TAC CCT 1056 Ala Thr Thr Pro Leu Asn Thr Arg Val Gln Met Thr Trp Ser Tyr Pro 235 240 245 GAT GAA AAA AAT AAG AGA GCT TCC GTA AGG CGA CGA ATT GAC CAA AGC 1104 Asp Glu Lys Asn Lys Arg Ala Ser Val Arg Arg Arg Ile Asp Gln Ser 250 255 260 AAT TCC CAT GCC AAC ATA TTC TAC AGT GTT CTT ACT ATT GAC AAA ATG 1152 Asn Ser His Ala Asn Ile Phe Tyr Ser Val Leu Thr Ile Asp Lys Met 265 270 275 CAG AAC AAA GAC AAA GGA CTT TAT ACT TGT CGT GTA AGG AGT GGA CCA 1200 Gln Asn Lys Asp Lys Gly Leu Tyr Thr Cys Arg Val Arg Ser Gly Pro 280 285 290 295 TCA TTC AAA TCT GTT AAC ACC TCA GTG CAT ATA TAT GAT AAA GCA TTC 1248 Ser Phe Lys Ser Val Asn Thr Ser Val His Ile Tyr Asp Lys Ala Phe 300 305 310 ATC ACT GTG AAA CAT CGA AAA CAG CAG GTG CTT GAA ACC GTA GCT GGC 1296 Ile Thr Val Lys His Arg Lys Gln Gln Val Leu Glu Thr Val Ala Gly 315 320 325 AAG CGG TCT TAC CGG CTC TCT ATG AAA GTG AAG GCA TTT CCC TCG CCG 1344 Lys Arg Ser Tyr Arg Leu Ser Met Lys Val Lys Ala Phe Pro Ser Pro 330 335 340 GAA GTT GTA TGG TTA AAA GAT GGG TTA CCT GCG ACT GAG AAA TCT GCT 1392 Glu Val Val Trp Leu Lys Asp Gly Leu Pro Ala Thr Glu Lys Ser Ala 345 350 355 CGC TAT TTG ACT CGT GGC TAC TCG TTA ATT ATC AAG GAC GTA ACT GAA 1440 Arg Tyr Leu Thr Arg Gly Tyr Ser Leu Ile Ile Lys Asp Val Thr Glu 360 365 370 375 GAG GAT GCA GGG AAT TAT ACA ATC TTG CTG AGC ATA AAA CAG TCA AAT 1488 Glu Asp Ala Gly Asn Tyr Thr Ile Leu Leu Ser Ile Lys Gln Ser Asn 380 385 390 GTG TTT AAA AAC CTC ACT GCC ACT CTA ATT GTC AAT GTG AAA CCC CAG 1536 Val Phe Lys Asn Leu Thr Ala Thr Leu Ile Val Asn Val Lys Pro Gln 395 400 405 ATT TAC GAA AAG GCC GTG TCA TCG TTT CCA GAC CCG GCT CTC TAC CCA 1584 Ile Tyr Glu Lys Ala Val Ser Ser Phe Pro Asp Pro Ala Leu Tyr Pro 410 415 420 CTG GGC AGC AGA CAA ATC CTG ACT TGT ACC GCA TAT GGT ATC CCT CAA 1632 Leu Gly Ser Arg Gln Ile Leu Thr Cys Thr Ala Tyr Gly Ile Pro Gln 425 430 435 CCT ACA ATC AAG TGG TTC TGG CAC CCC TGT AAC CAT AAT CAT TCC GAA 1680 Pro Thr Ile Lys Trp Phe Trp His Pro Cys Asn His Asn His Ser Glu 440 445 450 455 GCA AGG TGT GAC TTT TGT TCC AAT AAT GAA GAG TCC TTT ATC CTG GAT 1728 Ala Arg Cys Asp Phe Cys Ser Asn Asn Glu Glu Ser Phe Ile Leu Asp 460 465 470 GCT GAC AGC AAC ATG GGA AAC AGA ATT GAG AGC ATC ACT CAG CGC ATG 1776 Ala Asp Ser Asn Met Gly Asn Arg Ile Glu Ser Ile Thr Gln Arg Met 475 480 485 GCA ATA ATA GAA GGA AAG AAT AAG ATG GCT AGC ACC TTG GTT GTG GCT 1824 Ala Ile Ile Glu Gly Lys Asn Lys Met Ala Ser Thr Leu Val Val Ala 490 495 500 GAC TCT AGA ATT TCT GGA ATC TAC ATT TGC ATA GCT TCC AAT AAA GTT 1872 Asp Ser Arg Ile Ser Gly Ile Tyr Ile Cys Ile Ala Ser Asn Lys Val 505 510 515 GGG ACT GTG GGA AGA AAC ATA AGC TTT TAT ATC ACA GAT GTG CCA AAT 1920 Gly Thr Val Gly Arg Asn Ile Ser Phe Tyr Ile Thr Asp Val Pro Asn 520 525 530 535 GGG TTT CAT GTT AAC TTG GAA AAA ATG CCG ACG GAA GGA GAG GAC CTG 1968 Gly Phe His Val Asn Leu Glu Lys Met Pro Thr Glu Gly Glu Asp Leu 540 545 550 AAA CTG TCT TGC ACA GTT AAC AAG TTC TTA TAC AGA GAC GTT ACT TGG 2016 Lys Leu Ser Cys Thr Val Asn Lys Phe Leu Tyr Arg Asp Val Thr Trp 555 560 565 ATT TTA CTG CGG ACA GTT AAT AAC AGA ACA ATG CAC TAC AGT ATT AGC 2064 Ile Leu Leu Arg Thr Val Asn Asn Arg Thr Met His Tyr Ser Ile Ser 570 575 580 AAG CAA AAA ATG GCC ATC ACT AAG GAG CAC TCC ATC ACT CTT AAT CTT 2112 Lys Gln Lys Met Ala Ile Thr Lys Glu His Ser Ile Thr Leu Asn Leu 585 590 595 ACC ATC ATG AAT GTT TCC CTG CAA GAT TCA GGC ACC TAT GCC TGC AGA 2160 Thr Ile Met Asn Val Ser Leu Gln Asp Ser Gly Thr Tyr Ala Cys Arg 600 605 610 615 GCC AGG AAT GTA TAC ACA GGG GAA GAA ATC CTC CAG AAG AAA GAA ATT 2208 Ala Arg Asn Val Tyr Thr Gly Glu Glu Ile Leu Gln Lys Lys Glu Ile 620 625 630 ACA ATC AGA GAT CAG GAA GCA CCA TAC CTC CTG CGA AAC CTC AGT GAT 2256 Thr Ile Arg Asp Gln Glu Ala Pro Tyr Leu Leu Arg Asn Leu Ser Asp 635 640 645 CAC ACA GTG GCC ATC AGC AGT TCC ACC ACT TTA GAC TGT CAT GCT AAT 2304 His Thr Val Ala Ile Ser Ser Ser Thr Thr Leu Asp Cys His Ala Asn 650 655 660 GGT GTC CCC GAG CCT CAG ATC ACT TGG TTT AAA AAC AAC CAC AAA ATA 2352 Gly Val Pro Glu Pro Gln Ile Thr Trp Phe Lys Asn Asn His Lys Ile 665 670 675 CAA CAA GAG CCT GGA ATT ATT TTA GGA CCA GGA AGC AGC ACG CTG TTT 2400 Gln Gln Glu Pro Gly Ile Ile Leu Gly Pro Gly Ser Ser Thr Leu Phe 680 685 690 695 ATT GAA AGA GTC ACA GAA GAG GAT GAA GGT GTC TAT CAC TGC AAA GCC 2448 Ile Glu Arg Val Thr Glu Glu Asp Glu Gly Val Tyr His Cys Lys Ala 700 705 710 ACC AAC CAG AAG GGC TCT GTG GAA AGT TCA GCA TAC CTC ACT GTT CAA 2496 Thr Asn Gln Lys Gly Ser Val Glu Ser Ser Ala Tyr Leu Thr Val Gln 715 720 725 GGA ACC TCG GAC AAG TCT AAT CTG GAG 2523 Gly Thr Ser Asp Lys Ser Asn Leu Glu 730 配列番号：２ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 CGTCGCGCTC ACCATGGTCA G 21 配列番号：３ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 TTATTCGTAA ATCTGGGGTT TCAC 24 配列番号：４ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 TATTAATGAT CTAGATGAC 19 配列番号：５ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 TCGAGTCATT CTAGATCATT AA 22 配列番号：６ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 AGCTTTTAAT GATCTAGAAT GAC 23 配列番号：７ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 TCGAGTCATT CTAGATCATT AAA 23 配列番号：８ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 CTCGGATCCG GATCTAGTTC AGGTTCAAAA 30 配列番号：９ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 CTCGAATTCA CTCCAGATTA GACTTGTCCG A 31 配列番号：１０ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 TTTCTCGGAT CCTATAAATA TGGTCAGCTA CTGGGACACC 40 配列番号：１１ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 GTGGTGGTGG TGGTGGTGAC GCTCCAGATT AGACTTGTCC GA 42 配列番号：１２ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 CACCACCACC ACCACCACTA ACTAGAGCTC GCTGATC 37 配列番号：１３ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 TTCTCGAATT CTCCCCAGCA TGCCTGC 27 配列番号：１４ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 TCTTGTGACA AAACTCACAC ATGC 24 配列番号：１５ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 CGGAGACAGG GAGAGGCTCT TCTG 24 配列番号：１６ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 GAGCCCAAAT CTTGTGACAA AA 22 配列番号：１７ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 TTCTCGGATC CTTATTTACC CGGAGACAGG GA 32 配列番号：１８ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 TAACCTGGCG ATAACGAGGC GCAAATAATG AAAAAG 36 配列番号：１９ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 CTGAACTAGA TTTCGGAGCG GCCTGCGCTA 30 配列番号：２０ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 TTCTCGAATT CCCTGTGGAG TTATATATGA GC 32 配列番号：２１ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 GCCTCGTTAT CGCCAGGTTA GCGTCGAGGA 30 配列番号：２２ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 CGCTCCGAAA TCTAGTTCAG GTTCAAAATT 30 配列番号：２３ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 TTTGTCACAA GATTTGGGCT CTGTGCTTAT TTGGACATCT AT 42

【図面の簡単な説明】

【図１】ＦＬＴ細胞外領域のドメインの構成を表す模式
図である。

【図２】４Ｎ−ＦＬＴを発現する組換えバキュロウイル
スの構築過程の概要を示す図である。

【図３】５Ｎ−ＦＬＴを発現する組換えバキュロウイル
スの構築過程の概要を示す図である。

【図４】Ｂ４ＮまたはＢ５Ｎ組換えバキュロウイルスを
感染させた細胞の培養上清および抽出液のウェスタンブ
ロットを示す図である。

【図５】４Ｎ−ＦＬＴまたは５Ｎ−ＦＬＴとＶＥＧＦ断
片との相互作用に関するスカッチャード解析を示す図で
ある。

【図６】ＨＵＶＥＣのＶＥＧＦ依存性チミジン取り込み
促進のＥＤＦ、４Ｎ−ＦＬＴまたはＥＤＦΔ１１発現培
養上清による阻害を示す図である。

【図７】ＥＤＦまたはＥＤＦΔ１１を発現する組換えバ
キュロウイルスを感染させた細胞と¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₂₁
との共有結合架橋産物の電気泳動後のオートラジオフラ
フィーを示す図である。

【図８】ＥＤＦまたはＥＤＦΔ１１とＶＥＧＦ断片との
相互作用に関するスカッチャード解析を示す図である。

【図９】ＥＤＦΔ１１の精製過程のＶＥＧＦアフィニテ
ィクロマトグラムと各フラクションの電気泳動パターン
を示す図である。

【図１０】精製ＥＤＦΔ１１の電気泳動パターンとウェ
スタン解析を示す図である。

【図１１】ヒトイムノグロブリンＩｇＧ₁のＦｃ領域の
模式図と、単離するのに用いたプライマーの位置の対応
を示す図である。

【図１２】ＰＣＲで増幅・精製したＤＮＡと制限酵素切
断した組換えプラスミドのアガロースゲル電気泳動パタ
ーンを示す図である。

【図１３】ＰＣＲで増幅・精製したＤＮＡのアガロース
ゲル電気泳動パターンを示す図である。

【図１４】各ＤＮＡ断片の単離からＦＬＴ第１〜第２−
ヒトＩｇＧ₁-Ｆｃ発現組換えプラスミド構築までの過程
の概略を示す図である。

【図１５】組換え大腸菌粗抽出液の抗ヒトＩｇＧ₁-Ｆｃ
モノクローナル抗体によるウェスタンブロットを示す図
である。

【図１６】組換え大腸菌粗抽出液と¹²⁵Ｉ−ＶＥＧＦ₁₆₅
の共有結合架橋産物のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電
気泳動パターンを示す図である。

【図１７】Ａは組換え大腸菌粗抽出液と¹²⁵Ｉ−ＶＥＧ
Ｆ₁₆₅結合曲線、Ｂはそのスカッチャード解析を示す図
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ Ｃ１２Ｐ 21/02 ＡＥＤ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 松本 友恵 茨城県つくば市大久保２番東亞合成株式会 社つくば研究所内 (72)発明者 浅野 誠 茨城県つくば市大久保２番東亞合成株式会 社つくば研究所内 (72)発明者 瀬川 俊章 茨城県つくば市大久保２番東亞合成株式会 社つくば研究所内

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＶＥＧＦに結合してＶＥＧＦの活性を阻
   害することができる、ＦＬＴの細胞外領域の第１イムノ
   グロブリン様ドメインおよび第２イムノグロブリン様ド
   メインを含み、かつ第６イムノグロブリン様ドメインお
   よび第７イムノグロブリン様ドメインを含まないポリペ
   プチド。
2. 【請求項２】 請求項１記載のポリペプチドをコードす
   るＤＮＡ。
3. 【請求項３】 請求項２に記載のＤＮＡを含むベクタ
   ー。
4. 【請求項４】 請求項３に記載のベクターを保持する形
   質転換体。
5. 【請求項５】 請求項１記載のポリペプチドからなる医
   薬。
6. 【請求項６】 請求項１記載のポリペプチドからなる分
   析試薬。