JP3802329B2 - 上皮細胞に特異的な成長因子をコードするｄｎａ - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は成長因子に関し、特に公知の繊維芽細胞成長因子（FGFs）を含む因子ファミリーに類似したポリペプチド成長因子の単離に関する。また、本発明は新規な成長因子をコードするメッセンジャーＲＮＡ（mRNA）からの、相補型ＤＮＡ（cDNA）セグメントの構築に関する。更に、本発明はこのようなＤＮＡセグメントの生成物を組換え細胞によって合成することに関しする。また、この成長因子をコードするＤＮＡの同定およびクローニングによって可能になった、ある種の他の新規な生産物の製造および使用に関する。
【０００２】
なお、本明細書を通して下記の略号が用いられる。
【０００３】
【０００４】
【発明の背景】
成長因子は細胞間情報伝達の重要な媒体である。これら大きな影響力を有する分子は、一般に一つの細胞型から放出され、他の細胞型の増殖に影響するように作用する（後述する実験セクションＩ中の参照文献Ｉ−１を参照のこと）。成長因子における興味は、それが新形成中に含まれていることが示されたこと（後述の実験セクションII中の参照文献II−２）によって高まっている。シミアン肉種ウイルス(simian sarcoma virus)のＶ-sisトランスフォーミング遺伝子は、血小板由来成長因子のＢ鎖に対して相同性を有するタンパクをコードする（Ｉ−１，Ｉ−２）。更に、多数のオンコジェンが、成長因子レセプタをコードする遺伝子の相同性を有している。こうして、成長因子およびそのレセプタ- 媒介された信号形質導入経路に関する理解が進むことによって、正常細胞および腫瘍細胞の両方の成長メカニズムに対する洞察が容易に提供される。
【０００５】
結合組織細胞に影響する成長因子の公知のファミリーの一つには、酸性繊維芽細胞成長因子（aFGF）、塩基性繊維芽細胞成長因子（bFGF）、並びにｈst及びint-2 オンコジェンが含まれる。
【０００６】
更に、以下のものを含む幾つかの成長因子はヘパリン結合特性を有している：即ち、ａＦＧＦ（Ｉ−２０，Ｉ−２１）；ｂＦＧＦ（Ｉ−１９，Ｉ−２０）；顆粒細胞／マクロファージ・コロニー刺激因子（Ｉ−１）；およびインターロイキン３（Ｉ−１）である。これら夫々のポリペプチド因子はストローマル細胞(stromal cells) によって産生される。このような因子は、細胞外マトリックス中またはストローマル細胞の表面を被覆するプロテオグリカン上に蓄積されるようである（Ｉ−１，Ｉ−２５）。それらの蓄積、放出および特定の標的細胞との接触は、この相互作用によって調節されるものと仮定されている（Ｉ−２５，Ｉ−２８）。
【０００７】
しかしながら、ヒト腫瘍の大部分は上皮細胞から誘導されることが広く認識されている。間充織組織から誘導される上皮細胞増殖のエフェクターは知られているが（Ｉ−１，Ｉ−２，Ｉ−３）、それらの分子同定および構造は未だ解明されていない。
【０００８】
上皮細胞に影響を及ぼすこのような間充織成長因子に関する知識不足の観点から、上皮細胞増殖の調節メカニズムに関する改善された知識及び分析を提供する方法、検定試薬(composition) 組成物およびバイオアッセイが必要であること、並びに究極的にはそれらの中に含まれる因子に基づく新規な診断及び治療が必要であることが明らかである。
【０００９】
本発明はこのような必要性を満たし、また他の方法では製造され得ず、且つ上皮細胞増殖プロセスに関係すると思われる間充織起源タンパク因子を製造する手段を開発するために、タンパクの単離法および組換えＤＮＡ技術の適用を企画した。また、本発明はこれら上皮細胞成長プロセスに関係する因子の分子メカニズムの適用を企画した。
【００１０】
【発明の概要】
本発明はタンパクの単離および組換えＤＮＡ技術の開発に関し、その中には、上皮細胞に影響を与え且つ他のペプチド因子の混入がない新規な成長因子タンパクの製造が含まれる。また、新規なＤＮＡセグメントおよびバイオアッセイの方法も含まれる。
【００１１】
特に、本発明は酸性繊維芽細胞成長因子（aFGF）、塩基性繊維芽細胞成長因子（bFGF）、並びにｈst及びint-2 オンコジェンの関連生成物を含む公知の成長因子ファミリーの構造的および／または機能的特徴を有する新規なタンパクに関する。このＦＧＦポリペプチドファミリーの新メンバーは、ＦＧＦ類のヘパリン結合特性を保持しているが、独特の標的細胞特異性を有するに至っている。この成長因子は上皮細胞に特異的で、しかもケラチン細胞に対して特に活性であるように思える。従って、この新規な因子は「ケラチン細胞成長因子（ＫＧＦ）」と称する。ＫＧＦは繊維芽細胞に対する活性が欠如しているにもかかわらず、見出だされたＦＧＦポリポプチドファミリーの６番目のメンバーであるため、ＫＧＦはＦＧＦ−６とも称される。
【００１２】
従って、一部において、本発明は精製されたＫＧＦまたはＫＧＦ様タンパク、並びにこれらタンパクの製造方法に関する。このような精製因子は、天然にこれらタンパクを分泌するヒト細胞を培養し、本発明に従う単離方法を実施することによって製造され得る。これらタンパクは、例えばＫＧＦまたはＫＧＦ様ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントの単離を導く生化学的または生物学的研究に用いることができる。
【００１３】
また、本発明はＫＧＦまたはＫＧＦ様タンパクをコードするこのようなＤＮＡセグメントに関する。主要な態様において、本発明は以下に挙げる群からなるＫＧＦ関連生成物をコードするＤＮＡセグメントに関する：ヒト胎児肺繊維芽細胞系Ｍ426 から抽出されたポリアデニル化ＲＮＡ由来の、ヒトｃＤＮＡクローン32または42；これらクローンの組換え体または突然変異体；および上記ヒトＤＮＡセグメントの何れかにハイブリダイズさせることによって検出され得る関連ＤＮＡセグメントであって、ＫＧＦ様タンパクまたはその一部をコードするもの。
【００１４】
本発明の一態様の実施において、本発明のＤＮＡセグメントは適切な宿主細胞の中で発現され得、これによってＫＧＦまたはＫＧＦ様タンパクを製造する。本発明はまた、本発明のＤＮＡセグメントのセンス・ストランドの転写の結果として産生されたｍＲＮＡに関する。
【００１５】
他の態様において、本発明はベクターおよび本発明のＤＮＡを具備した組換えＤＮＡ分子に関する。これらの組換分子は、ＫＧＦ・ｃＤＮＡおよび以下の何れかのベクターＤＮＡを具備した分子によって例示される：即ち、バクテリオファージλクローニングベクター（λｐＣＥＶ９によって例示される）；ＤＮＡ配列プラスミドベクター（例えば、ｐＵＣ変種）；バクテリア遺伝子発現ベクター（例えばｐＫＫ233-2 ）；または哺乳類遺伝子発現ベクター（ｐＭＭＴのようなもの）である。
【００１６】
更に別の態様において、本発明は、本発明のＤＮＡで形質転換された細胞、好ましくは哺乳類細胞を包含する。更に、本発明は、本発明のＤＮＡで形質転換された昆虫細胞、酵母細胞、並びに Escherichia coli 及び B.subtilis のようなバクテリア細胞を含む細胞を包含する。本発明のこの側面における他の態様に従えば、上記形質転換ＤＮＡは細胞内で発現され得、これにより細胞内において、該ＤＮＡによってコードされるＫＧＦまたはＫＧＦ様タンパクを増大させる。
【００１７】
そのｃＤＮＡ配列から予測される一次ＫＧＦ翻訳生成物には、分泌のためのシグナル配列として働き、且つ成熟ＫＧＦ分子には存在しないＮ末端疎水性領域が含まれる。本発明の遺伝子発現に係る側面での最も好ましい態様においては、本発明のＤＮＡによって形質転換された細胞は、該ＤＮＡによってコードされるタンパクを、ヒト胎児肺繊維芽細胞によって分泌される形態（先端を切断された形）で分泌する。
【００１８】
更に、本発明は本発明のＤＮＡの発現によって、或いは本発明のＲＮＡの翻訳によって産生されるＫＧＦまたはＫＧＦ様タンパクを意図している。好ましくは、これらのタンパクは分泌された形（即ち、明瞭なシグナル配列が欠如したもの）であろう。これらのタンパク因子は機能的研究に用いることができ、また定性的及び定量的レセプター結合アッセイのような更なる構造的および機能的分析のために精製することができる。
【００１９】
更に、組換え技術でこの新規な成長因子を大量に製造できることは、上皮細胞の成長の特異的刺激が特に重要な状況において、その臨床適用の試験を可能にするであろう。従って、本発明は例えば火傷の傷の治療または移植された角膜組織の刺激を含むかかる症状の治療に用いるための、ＫＧＦまたはＫＧＦ様ポリペプチドを含有した調剤組成物を包含する。
【００２０】
本発明のこの態様に従えば、新規なＫＧＦ様タンパクは、本発明の「未修飾の」ＤＮＡ及びＲＮＡによるタンパク生産物、または修飾された若しくは遺伝子工学的に加工されたタンパク生産物であろう。ＤＮＡ配列中における工学的変異の結果、修飾されたＫＧＦ様タンパクは、天然に存在する対応の「天然型の」タンパクと比較して、アミノ酸配列中に一以上の相違を有するであろう。本発明におけるこの側面に従えば、該修飾されたＫＧＦ様タンパクには、ＫＧＦのアミノ酸配列およびＦＧＦペプチドファミリーの少なくとも一つの他のメンバーのアミノ酸配列を具備した「キメラ」分子が含まれるであろう。
【００２１】
結局、同様の性質を有する他のペプチド因子に関する類似の成功した研究の結果からすれば、このようなキメラＫＧＦ様ポリペプチドの開発によって、臨床目的のＫＧＦ様ペプチドの優れた第二世代の形態が導かれると思われる。これら修飾されたＫＧＦ様生産物は、例えばより小さく、より安定、より強力、および／または生産がより容易もしくは低コストであり得る。
【００２２】
本発明は更に、本発明のＤＮＡセグメント関連遺伝子から産生された、ｍＲＮＡのヒト細胞中での発現およびタンパクを測定するための新規なバイオアッセイ法を包含する。このような態様の一つに従えば、本発明のＤＮＡは、関連ｍＲＮＡ誘導の定常状態レベルまたは速度論を測定するためのプローブとして用い得る。ＫＧＦ関連ｃＤＮＡクローンの入手が可能になることによって、この成長因子の異常発現が、形成異常および新形成（例えば乾癬または悪性もしくは良性の上皮腫瘍）を含む、上皮細胞の過剰成長に特徴付けられる臨床症状中に含まれるか否かを決定することが可能になる。
【００２３】
本発明はまた、本発明のＤＮＡセグメントによってコードされるペプチドに対して製造される新規な抗体をも意図している。本発明のこの態様では、該抗体はその起源においてモノクローナルまたはポリクローナルであり、天然のＫＧＦ関連ポリペプチド、組換ＫＧＦ関連ポリペプチド、または化学合成によるＫＧＦ関連ポリペプチドを用いて生成される。
【００２４】
本発明の抗体は、ＫＧＦまたはこのようなペプチドを含むＫＧＦ様タンパクに対して、好ましくは該タンパクがその天然の（生物学的に活性な）形態であるときに、特異的に結合する。これらの抗体はＫＧＦの検出もしくは精製に用いることができ、或いはＫＧＦもしくはＫＧＦ様タンパク因子の検出もしくは精製のために用いることができる。本発明のこの側面における最も好ましい態様においては、該抗体はＫＧＦの成長促進活性を中和し、これによってメカニズム研究を可能にすると共に、最終的にはＫＧＦの過剰レベルを含む臨床症状の治療を可能にするであろう。
【００２５】
〔個々の実施例の説明〕
本発明は、一部は、精製されたＫＧＦまたはＫＧＦ様タンパクと、これらタンパクの調製方法に関する。本発明のこの側面における主要な態様は、約28 kd の見掛けの分子量によって特徴付けられる均質ＫＧＦに関する。この見掛けの分子量は、ＮａＤｏｄＳＯ４ ／ＰＡＧＥ中でのマイグレーション、逆相高速液体クロマトグラフィー上での単一バンドとしての移動、および少なくとも約 3.4×１０４ 単位／mg、好ましくは少なくとも約 3.2×１０５ 単位／mgの比活性に基づいている。ここで、１単位の活性は、以下に概説する標準的なアッセイ条件下において、所定の上皮細胞（ケラチン細胞）中での可能な最大のＤＮＡ合成刺激の半分の刺激を生じるような量として定義される。
【００２６】
上皮細胞型に特異的な新規な成長因子を同定するために、このような因子を検出するためのインディケータ細胞として、BALB／MK（Ｉ−６）と称されるクローンBALB／ｃマウスケラチン細胞系を用いた。これら細胞は、血清を含む培地中においてさえ、その成長を外来の上皮細胞マイトジェン源に依存している。これら細胞のための化学的に定義された培地の開発によって、BALB／MKの増殖に必要な二つの主要なマイトジェン経路を示すことが可能になっている。一つはインスリン様の成長因子Ｉ（または高濃度のインスリン）を含み、他方は表皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦα）、酸性繊維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）または塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）によって満足される（Ｉ−７）。
【００２７】
原型上皮細胞系としてBALB／MKを、またこれに対する繊維芽細胞として NIH／3T3 を夫々用い、新規上皮細胞特異性マイトジェンについて、種々のヒト細胞系からの馴らし培地のアッセイを行った。これら本発明のバイオアッセイによって、ヒト胎児肺繊維芽細胞系から放出されたこのような新規成長因子の一つ（ここではケラチン細胞成長因子（ＫＧＦ）という）を均質に精製することが可能になった。
【００２８】
簡単に説明すると、標準条件下でのＫＧＦ様活性のバイオアッセイは、以下のステップを具備している：
(i) マウスケラチン細胞（BALB／MK細胞）を集密するまで培養成長させ、次いで血清フリーの培地中で24-72 時間維持する；
(ii)試験サンプルの添加に続き、酸沈殿可能なＤＮＡ中への ３Ｈ−チミジンの取り込みによって、ＤＮＡの合成刺激を測定する。
【００２９】
マイトジェン成長因子の標的細胞特異性を測定するために、ＤＮＡの合成刺激（試験サンプルを添加しないときのチミジン取り込みのバックグラウンドに対する合成刺激の比で表わしたもの）を、同じアッセイ条件下においてケラチン細胞以外の細胞で観察された類似の刺激と比較すればよい。このような比較において、ＫＧＦマイトジェン活性は、繊維芽細胞に対するのとは反対にケラチン細胞に対する顕著な特異性（少なくとも約500 倍の刺激）を示す。また、他の典型的な上皮細胞型に対するよりもケラチン細胞に対してより大きな活性を示し、これは上記の場合より小さいが（少なくとも約50倍）、重要なものである（より詳しいデータについては後述の表Ｉ−２を、またバイオアッセイ標準条件の詳細については実験セクションＩの材料および方法を参照のこと）。
【００３０】
本発明に従って、細胞の培養およびマイトジェン活性の単離を含むＫＧＦの製造方法を用いることによって、この分子の物理的および生物学的性質を詳細に特徴付けるために十分な量が単離される。なお、この方法は限外濾過、ヘパリン- セファロース・アフィニティーカラムクロマトグラフィー （HSAC）、並びに吸着逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC ）または分子篩HPLC（TSK-HPLC）を具備している。
【００３１】
要約すると、Ｍ426 ヒト胎児繊維芽細胞（Ｉ−８）のような産生細胞からＫＧＦを製造する方法は、例えば以下のステップを具備している：
(i) 血清含有培地から血清フリーの培地まで循環される単層培養を用いた馴らし培地の調製と、その血清フリーの産物を使用するまで-70 ℃で貯蔵すること；
(ii)中間での緩衝液による稀釈（低分子量物質の除去を容易にするため）を伴った幾つかの連続ステップで、１０ kDaのカットオフ分子量を有する膜を用いた限外濾過により濃縮し、続いて任意に-70 ℃で保存すること；
(iii) ＮａＣｌ濃度を徐々に増大させた溶出液を用いて行う、ポリマー支持体（例えばセファロース）に結合されたヘパリン上でのアフィニティークロマトグラフィー；
(iv)１０ kDaのカットオフ分子量をもった小スケール限外濾過装置（例えばアミコン社から入手可能な Centricon-10 ミクロ濃縮器）で、少なくとも10〜12倍に濃縮し、-70 ℃で保存すること；
精製プロセスの次のステップは、下記のステップ(v) またはステップ(vi)の何れかを具備している。
【００３２】
(v) 有機溶媒系での、先のHSACで得られた活性画分（0.6 M NaClプール）の逆相HPLC；
または
(vi)生理学的ｐＨの緩衝水溶液中（例えば、Tris-HCl、pH 6.8/0.5M NaCl）において、分子篩HPLC（例えばＬＫＢから入手可能なTSK-G3000 SWガラスパックカラム）を行ない、続いて-70 ℃で保存する。
【００３３】
銀- 染色ＮａＤｏｄＳＯ４ ／ＰＡＧＥ（データは省略）から判断すると、上記ＴＳＫステップ(vi)で調製された試料はRP-HPLCrで得られたものと殆ど同じ純度である；しかし、ＴＳＫによると遥かに良好な活性回収が得られる（後述の表Ｉ−１）。更に、TSK-精製されたものは、RP-HPLC で精製されたものよりも高い比活性を有している。上記 TSKプロセスで調製されたＫＧＦは、ナノモル以下の濃度で上皮細胞中のＤＮＡ合成を刺激した。しかし、同程度もしくはより高濃度（５mM）において、繊維芽細胞または上皮細胞のＤＮＡ中へのチミジン取り込みは全く誘導しなかった。該活性はRP-HPLC ステップで用いられる酸、熱および溶媒に敏感であった（感受性および製造法の詳細については、実験セクションＩを参照のこと）。
【００３４】
当該技術分野で公知の標準的方法論を用いて、精製ＫＧＦのアミノ末端から2-13位について、曖昧さのないアミノ酸配列を以下のように決定した：Asn-Asp-Met-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Thr-Asn-Val （実験セクションＩ参照）。
【００３５】
また、本発明にはＫＧＦおよびＫＧＦ様ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントが含まれる。本発明のＤＮＡは以下に挙げるＤＮＡによって例示される：ヒト胎児肺繊維芽細胞系Ｍ426 から抽出したポリアデニル化ＲＮＡから誘導されたヒトｃＤＮＡクローン32及び49；これらクローンの組換え体または突然変異体；これらＤＮＡセグメントに対してハイブリダイズすることによって検出され得る関連ＤＮＡセグメント。
【００３６】
実験セクションIIに記載したように、ＫＧＦアミノ酸配列の既知の部分に対応するｃＤＮＡクローンを探査するために、Asn-Asp-Met-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala の９アミノ酸配列をコードする可能な全てのヌクレオチド配列に基づいて、オリゴヌクレオチドプローブの二つのプールを作成した。ヒト胎児肺繊維芽細胞系Ｍ426 から抽出された一次成長因子源であるポリアデニル化ＲＮＡを用い、ｃＤＮＡライブラリーをｃＤＮＡクローニングベクター（λｐＣＥＶ９）中に構築した。３２Ｐでラベルしたオリゴヌクレオチドを用いた該ライブラリー（９×１０５ プラーク）のスクリーニングによって、両方のプローブにハイブリダイズする８８個のプラークが同定された。
【００３７】
分析されプラーク精製された１０個のクローンのうち、一つのクローン（クローン49という）は3.5 kbのｃＤＮＡ挿入を有していたが、他のクローンは1.8 kb〜2.1 kbに亘る挿入を有していた。小さい方のクローンの分析によって、幾つかの共通の制限酵素部位が明らかになり、また代表的な小クローン（クローン32およびクローン49）の配列によって、それらのｃＤＮＡが重なっていることが示された（図８）。この二つのｃＤＮＡの配列によって、完全なＫＧＦをコードする配列を含む 3.85 kbの連続配列が確立された。全長に亘る合成ＫＧＦｃＤＮＡの配列についての、センス・ストランドのＤＮＡヌクレオチド配列、およびコードされる一次タンパクの予想配列を図９〜図１１に示した。
【００３８】
これらＤＮＡ、ｃＤＮＡクローン32，49は、完全なＫＧＦをコードする配列を具備したこれらセグメントの組換え形と同様に、本発明の最も好ましいＤＮＡ類である。
【００３９】
他の種々のタンパクにおけるこのような配列との類似性に基づくと、このｃＤＮＡ配列から、一次ＫＧＦおよび hst翻訳生成物はシグナル配列として作用する疎水性Ｎ末端領域を含んでいることが明らかである。従って、このＮ末端ドメインは、ヒト胎児繊維芽細胞によって分泌される精製された成熟ＫＧＦ分子中には存在しない。
【００４０】
更に、ＫＧＦは、予想ＫＧＦ中のアミノ酸配列65-156及び162-189 の二つの主要な相同領域を、ＦＧＦファミリーの他の全てのメンバーと共有する。これらは、異なるファミリーメンバーにおいて、短く且つ種々の長さの非相同アミノ酸配列によって分離されている。精製された形のＫＧＦの配列には五つのシステイン残基が含まれ、その二つはＦＧＦ関連タンパクファミリーに共通して保持される。塩基性残基の五つの対は、ＫＧＦ配列の全てに亘って現れる。これと同じパターンは、他のＦＧＦファミリー中にも認められる。
【００４１】
ハイブリダイゼーション法（例えば、ヒトゲノムＤＮＡのサザンブロット分析）において本発明のＤＮＡおよびＲＮＡ、特に最も好ましくは上記に列挙したＤＮＡを用いることにより、過度の実験を行うことなく、ゲノムｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして本発明の範囲に入る他のＫＧＦ様ＤＮＡを見出だすことが可能であることが、当業者には明らかである。更に、本発明のＤＮＡをこのように用いることによって、制限酵素長さの多形性（RFLPs ）のようなＫＧＦ遺伝子、並びにこの遺伝子または他の近隣遺伝子を含む遺伝病に関連した遺伝子マーカーを同定し得る。
【００４２】
また、本発明にはＫＧＦ・ＤＮＡの修飾型も含まれる。本発明のこの側面における主要な態様に従えば、このような修飾ＤＮＡは、ＫＧＦおよび他のＧＦＧペプチドファミリーの少なくとも一つのアミノ酸配列セグメントを含むＫＧＦ様タンパクをコードする。こうして、例えばＫＧＦの分泌型と他のＦＧＦ関連タンパクの類似位置との間には何等顕著なＮ末端相同性がないから、新規な構造的及び機能的性質を有するポリペプチドは、ＦＧＦファミリーにおける他のポリペプチドの異なったＮ末端セグメントをコードするＤＮＡセグメントを、その通常のＮＨ２ - 末端配列の代りにＫＧＦ・ＤＮＡにグラフトすることにより生成され得る。
【００４３】
このような修飾ＤＮＡによるポリペプチドキメラは、ＫＧＦ・ＮＨ２ - 末端ドメインが、その独特の標的細胞特異性を説明するに十分であるか否かを決定するために有用である。また、キメラの研究は、どのドメインがその生物学的活性に対するヘパリンの異なった影響に寄与するかに関する洞察を提供するに違いない。
【００４４】
実際、この研究法の有用性は、成功した分泌型ＫＧＦの加工および発現の成功によって既に確かめられている。この分泌型ＫＧＦにおいて、ＮＨ２ 末端から約40アミノ酸（図II−１で番号３２を付した成熟型ＫＧＦのアミノ末端 cys残基で始まり、ＫＧＦ残基７８の argで終わる）は、ａＦＧＦのＣＯ３ 末端コアの約140 アミノ酸（残基39の argで始まり、ａＦＧＦコーディング配列のＣ末端に続く）に連結される。このキメラ生成物はＫＧＦのようにケラチン細胞に対する細胞選択性を有するが、ヘパリンに対する感受性に欠け、この特徴はＫＧＦよりもむしろａＦＧＦの特徴に類似する。この新規なＫＧＦ様成長因子は、抗凝固剤として通常用いられるヘパリンの存在下に、上皮細胞特異性の成長因子の投与が望まれる臨床適用において利点を有するであろう。このキメラ分子の更に詳細な構成および該ポリペプチドの性質は、実験セクションIIで説明される。
【００４５】
本発明の他のＤＮＡには、ＫＧＦ・ｃＤＮＡ及び下記に例示するの何れかのベクターＤＮＡを含む組換ＤＮＡ分子が含まれる：バクテリオファージλクローニングベクター（λpCEV9 ）；ＤＮＡ配列プラスミドベクター（pUC 変種）；バクテリア発現ベクター（pKK233-2）；または哺乳類発現ベクター（pMMT/neo）。このような組換えＤＮＡは、実験セクションに詳細に記載した構成によって例示される。
【００４６】
最も好ましい組換え分子には以下のものが含まれる：即ち、分泌型ＫＧＦのためのコーディング配列およびバクテリア発現ベクター（例えばpKK233-2）有する分子、または全体の一次翻訳生成物（ＮＨ２ 末端シグナルペプチドを含む）および挿入されたＤＮＡを哺乳類細胞（例えば NIH/3T3）中で発現可能な哺乳類発現ベクター（pMMTによって例示されるもの）を有する分子である。
【００４７】
ＫＧＦ・ＤＮＡ及びバクテリア発現ベクターを含む組換えＤＮＡの構築は、実験セクションIIに記載される。簡単にいえば、ＫＧＦ・ｃＤＮＡは、そのコーディング配列をプラスミド発現ベクター pKK233-2 （II−３１）内でハイブリッド trkプロモータの制御下に置くことによって、E.coli中で発現されてポリペプチドを生成した。
【００４８】
ＫＧＦ・ＤＮＡと、挿入されたＤＭＡをヒトまたは動物の培養細胞中で発現可能な哺乳類ベクターとを具備する組換えＤＮＡの構築は、このような比較的単純なポリペプチドを発現させる公知の方法を用いた、標準的な遺伝子発現技術によって行うことができる。本発明のこの側面におけるＤＮＡ （哺乳類ベクター pMMT を含む）の一つの特別の態様は、本発明の組換え細胞の下に、このセクションにおいて、以下で更に詳細に説明する。
【００４９】
本発明のＤＮＡおよびセンスストランドＲＮＡは、本発明のタンパク製造方法に関連して、多量の実質的に純粋なＫＧＦまたはＫＧＦ様タンパクを造るために使用され得る。こうして製造された実質的に純粋なＫＧＦは、公知の技術を用いて、種々の体液および組織サンプル中における当該タンパクのためのレセプタの存在を決定するための臨床検査に用いることができる。
【００５０】
従って、この発明は本発明のＤＮＡ（発現可能なトランスフォーミングＤＮＡ）で形質転換された細胞、好ましくはバクテリアまたは哺乳類細胞を包含する。本発明のこの側面での好ましい態様において、本発明のＤＮＡによって形質転換された細胞は、完全にマイトジェン様の形でＫＧＦタンパクを産生する。最も好ましくは、これらのタンパクは分泌形 （即ち、見掛けのシグナル配列を欠いたもの）であろう。これらのタンパク因子は機能的研究に使用でき、また定性的および定量的レセプタ結合検定のような、更なる生化学的および機能的分析のために精製され得る。
【００５１】
ＫＧＦの製造のために、組換え E.coli 細胞が、実験セクションIIで詳述するように、バクテリア発現ベクター pKK233-2 を用いて構築された。要約すると、通常の小スケール法によって、幾つかの組換えバクテリアクローンのタンパク産生が試験された。試験された全ての組換え体が、アミノ末端ＫＧＦペプチドに対する抗体によって認識されるタンパクを合成した（以下を参照のこと）。一つの組換え体が１リットル培養の中で成長され、該組換え体はBALB／MKケラチン細胞のＤＮＡ中へのチミジン取り込みを効率的に刺激するが、 NIH／3T3 繊維芽細胞に対しては最低の活性しか示さない組換えＫＧＦを産生した。標準ケラチン細胞バイオアッセイにおけるBALB／MK細胞の半上限刺激（half-maximal stimulation）が、 2〜5 ng／mlの濃度で達成された。これに対して、M426細胞から精製されたＫＧＦの場合は10〜15ng／mlである。
【００５２】
１リットルのバクテリア細胞は、略５０μｇの Mono-S 精製組換えＫＧＦを生成した。遺伝子発現の分野における当業者には、この初期収率が、過度の実験を行なうことなく、公知の組換えＤＮＡ技術を適用することによって改善され得ることが明らかであろう。
【００５３】
また、組換え哺乳類細胞（NIH/3T3 マウス）は、Ｎ末端シグナル配列を含む配列をコードする全ＫＧＦ・ｃＤＮＡと、マウス・メタロチオニン（ＭＭＴ）プロモータおよびネオマイシン耐性のための選択的マーカー遺伝子を有するベクター pMMT/neo を用いて構築された。この細胞は、本発明のバイオアッセイを用いて、ＫＧＦ、特にヒト繊維芽細胞によって産生される成熟型（シグナルペプチドが欠如したもの）の製造について評価されている。高レベルの血小板由来成長因子（PDGF）のＡ鎖およびＢ鎖を含む他の幾つかの同様な組換えポリペプチドを首尾よく発現させるために、これと同じベクターと宿主細胞の組合わせが用いられている（II−３２）。従って、上記の組換えＤＮＡおよび本発明の形質転換細胞を用いることにより、この方法で組換えＫＧＦの高収率が達成され得ることが当業者に認識されるであろう。
【００５４】
最後に、上皮細胞成長の特異的刺激を必要とする条件での臨床試験を可能にするために、大規模製造が使用され得る。ポリペプチドを局部投与（例えば、皮膚または目の角膜に対して）または全身投与するための薬剤組成物を調製するための材料および方法は、この技術分野で良く知られており、また過度の実験を行なわなくとも容易にＫＧＦおよびＫＧＦ様ポリペプチドの投与に適用し得る。
【００５５】
本発明はまた、本発明のＤＮＡセグメントでコードされるペプチドに対して作られる新規な抗体を包含する。本発明のこの態様は、ＫＧＦを認識する幾つかの種類の抗体によって例示される。実験セクションIIに概説したように、これらは実験免疫学の分野でよく知られた標準的な方法論を用いて調製されている。これらの抗体には次のものが含まれる：即ち、マウスにおいて、ヒト繊維芽細胞由来の完全かつ精製されたタンパクに対して生成されたモノクローナル抗体；ＫＧＦ・ｃＤＮＡ配列から予想されるアミノ酸配列に基づく配列をもった合成ペプチド［例えば、ＫＧＦ残基32-45 の配列、即ち NDMTPEQMATNVR（アミノ酸配列のための標準的な一文字コードを用いた；図II−１参照）をもったペプチド］に対して、兎において生成されたポリクローナル抗体；ヒト繊維芽細胞から天然に分泌されたＫＧＦおよびE.coli（上記参照）中で産生された組換えＫＧＦの両者に対して、兎において生成されたポリクローナル抗体である。
【００５６】
試験された全ての抗体は、固相検定（ELISA ）および／またはウエスタンブロットにおいて、天然に存在するＫＧＦと同様に組換えＫＧＦを認識する。幾つかの例示抗体（これらは本発明の好ましい抗体である）は、BALB／MKバイオアッセイにおいて、ＫＧＦのマイトジェン活性を中和するように思える。
【００５７】
ＦabまたはＦ(ab)′フラグメントのような本発明の抗体のフラグメント（抗原結合活性を保持し、且つ当該技術分野で公知の方法により調製される）もまた、本発明の範囲内である。更に本発明は、本発明の抗体またはその活性フラグメントの薬剤組成物をも包含する。この薬剤組成物は、ポリペプチド投与のための薬剤組成物を調製するために当該分野で良く知られた材料および方法を用いて調製することができ、また過度の実験を行うことなく、ＫＧＦおよびＫＧＦ様ペプチドの投与に容易に適用することが可能である。
【００５８】
これら抗体およびその活性フラグメントは、例えばバイオアッセイにおけるＫＧＦの検出、またはタンパク因子の精製のために用いることができる。また、これらは当該技術分野で知られた方法で、ＫＧＦレセプタの単離に用いることができる。これらは、実験セクションIIに記載したように、公知の他の全ての成長因子のそれとは明確に異なるようにみえる。
【００５９】
ＫＧＦの上皮細胞に対するマイトジェン活性を中和するこれらの好ましい抗体、並びにそのフラグメント及び薬剤組成物は、BALB／MKアッセイによって示されるように、例えば上皮細胞の過剰成長で特徴付けられる臨床症状の治療に用いることができる。この臨床症状には、形成異常および新形成 （例えば乾癬、または悪性もしくは両性の上皮腫瘍）が含まれる。
【００６０】
更に本発明には、本発明のＤＮＡに関連した遺伝子の発現を検出するための新規なバイオアッセイ方法が包含される。幾つかの例示的態様において、本発明のＤＮＡは関連ｍＲＮＡの定常状態レベルを測定するためのプローブとして用いられた。ＫＧＦ・ＤＮＡを用いた本発明のこれらのバイオアッセイ方法、および標準ノーザンブロッティング法は、実験セクションIIにおいて詳細に説明される。
【００６１】
当業者は、過度の実験を行うことなく、単離細胞または種々の組織において、この様な方法がＫＧＦ様タンパクの遺伝子発現分析に容易に適用され得ることを認識するであろう。このようなバイオアッセイは、例えば上皮細胞成長プロセスにおける種々のクラスの腫瘍細胞または遺伝子欠損を同定するために有用である。
【００６２】
更なる労力を要することなく、当業者は、既述の説明を用い、また以下の実験セクションに記載した方法に従って、本発明の全範囲を利用できるものと確信する。実験セクション中に開示された材料は、他に指示がない限り例示の目的で開示されており、従ってどのような意味でも請求範囲を限定するものと解釈されてはならない。
【００６３】
〔実験セクションＩ〕
上皮細胞に特異的な新規成長因子の同定および
特性表示
このセクションでは、ヒト胎児肺繊維芽細胞系の馴らし培地中において、上皮細胞に特異的な成長因子の同定に導く実験を説明する。この因子は、ケラチン細胞に対する優勢な活性のために、先にケラチン細胞成長因子（ＫＧＦ）の用語で表わされたものであり、本発明に従って限外濾過、ヘパリン- セファロース・アフィニティークロマトグラフィー及びＣ４ 逆相HPLCカラム上での疎水性クロマトグラフィーの組合わせにより均一になるまで精製された。ＫＧＦは酸および熱に不安定であり、略28,000のダルトン見掛けの分子量を有する単一のポリペプチド鎖からなることが見出だされた。精製されたＫＧＦは上皮細胞に対する強力なマイトジェンであり、0.1nM および最大1.0nM において検出可能な活性で、非活動BALB／MK上皮ケラチン細胞におけるＤＮＡ合成を 500倍以上も刺激することが可能であった。繊維芽細胞または上皮細胞の何れかに対するマイトジェン活性の欠如は、ＫＧＦが従来特徴付けられた何れの成長因子とも異なった標的細胞特異性を有していることを示している。ミクロシーケンシングによって、公知の何れのタンパクとも有意な相同性をもたない、アミノ末端配列が明らかになった。ヒト胎児繊維芽細胞によるこの新規成長因子の放出は、正常な上皮細胞増殖の間充織刺激において重要な役割を果たすことを示している。
【００６４】
［方法および材料］
＜馴らし培地の調製＞
M426ヒト胎児繊維芽細胞（Ｉ−８）の初期継代を、175 cm２ のＴ- フラスコ上に撒き、10％子牛血清（GIBCO ）を補充したダルベッコ修飾イーグル培地（DMEM；GIBCO ）の中で10-14 日に亘って集密状態にまで増殖させた。集密状態になったら、その単層を１週毎に血清含有培地から血清フリー培地（DMEMのみからなる）へ交互に変えた。20mlのDMEMを添加するに先立って、この細胞を５mlの燐酸緩衝生理食塩水で２回洗浄した。72時間後、培養液を回収し、35mlの血清含有培地で置き換えた。この馴らし培地は、使用するまで -70℃で保存した。
【００６５】
＜限外濾過＞
略10リットルの馴らし培地を解凍し、0.50ミクロンのフィルター（ミリポア社の HAWP 142 50）を通して予備濾過し、ペリコンカセット装置（ミリポア社の XX42 00K 60）および10kDa の分子量カットオフを有するカセット（ミリポア社のPTGC 000 05 ）を用いて200ml にまで濃縮した。濃縮の後のサンプルに、20mM Tris-HCl,pH7.5/0.3M NaCl の１リットルを用いた連続した２回の稀釈ラウンドを施し、夫々につき、続いてペリコン装置を用いて他の限外濾過ステップを行う。リテンテート（残渣）中に回収された活性画分は、ヘパリン- セファロース樹脂に直接適用され、または -70℃で保存される。
【００６６】
＜ヘパリン- セファロース・アフィニティークロマトグラフィー（HSAC）＞
限外濾過で回収されたリテンテートは、20mM Tris-HCl,pH7.5/0.3M NaCl 中で平衡化されたヘパリン- セファロース樹脂（ファルマシア社）に負荷された。該樹脂は、光学密度がベースラインに戻るまで徹底して洗浄され、次いでNaCl濃度が徐々に増大するリニア- ステップ勾配にかけられた。画分からチミジン取込みバイオアッセイのための部分を除いた後、選択された画分をセントリコン-10 ミクロ濃縮器(Centricon-10 microconcentrator; Amicon 社) を用いて10〜20倍に濃縮し、 -70℃で保存した。
【００６７】
＜逆相HPLC（RP-HPLC ）＞
HSACからの活性画分（0.6 M NaClプール）を解凍し、プールし、更にセントリコン-10 で 200μｌの最終容量に濃縮した。該サンプルを、 0.1％トリフルオロ酢酸（TFA,Fluka ）／20％アセトニトリル（ベーカー社、HPLC級）中で平衡化されたＶydacＣ４ HPLCカラム（分離群、Hesperia,CA ）上に負荷し、アセトニトリル濃度が徐々に増大する線形勾配で溶出させた。バイオアッセイのための一部を、直ちに10倍量の50μｇ／ml／20mM Tris-HCl,pH7.5 中で稀釈した。残りのサンプルは、構造分析のための調製において、Speed-Vac(Svant)中で乾燥された。
【００６８】
＜分子篩HPLC＞
略50μｌの２倍濃縮されたヘパリン- セファロース画分が、20mM Tris-HCl,pH6.8/0.5M NaCl 中で平衡化されたTSK-G3000SW Glas-Pacカラム（LKB ）上に負荷された。該サンプルは、この緩衝液中において 0.4ml／min.の流速で溶出された。バイオアッセイのための一部を除いた後、該画分を -70℃で保存した。
【００６９】
＜NaDodSO４ - ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（NaDodSO４ ／PAGE）＞
Laemmli の方法（Ｉ−９）に従って、ポリアクリルアミドゲルが NaDodSO４ と共に調製された。サンプルを、 2.5％の2-メルカプトエタノール（vol/vol ）の存在下で３分間煮沸した。該ゲルは、BioRadからの試薬およびプロトコールを用いて、固定および銀染色された（Ｉ−１０）。分子量マーカーは、ファルマシア社から入手したものである。
【００７０】
＜ＤＮＡ合成刺激＞
BALB／MK細胞を接種するに先立って、96ウエルの微小滴定プレート（Falcon No.3596）を、１μg ／cm２ のヒト・フィブロネクチン（Collaborative Research社）で予備コートした。集密に達したら、細胞を５μg ／mlのトランスフェリン（Collaborative Research社）および 30nM のＮａ２ ＳｅＯ３ （ベーカー社）を含む血清フリーの培地中で24-72 時間維持した。ＤＮＡ中への ３Ｈ- チミジンの取込み（最終濃度５μCi／ml,NEN）は、サンプル添加の16時間後から始まって６時間のあいだ測定された。このアッセイは、細胞を氷冷燐酸緩衝生理食塩水で１回、また５％トリクロロ酢酸で２回洗浄することによって終了された。その沈殿物を0.25M NaOH中に再溶解し、液体シンチレーション液（Biofluor社、NEN ）中に移してカウントした。
【００７１】
BALB／MKについて上述したのと同様にして、種々の他の細胞系に関してＤＮＡの合成刺激がモニターされた。NIH/3T3 繊維芽細胞（Ｉ−１１）はナショナル・インスティチュート・オブ・ヘルスから入手した。一方、CCL208アカゲザル気管支上皮細胞（Ｉ−１２）はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手された。（Ｉ−１３）に記載されたようにして調製されたB5／589 ヒト乳房上皮細胞系は、マーサ・スタンファー（カルホルニア大学、バークレー）から入手した。該乳房細胞は、10％子牛胎児血清および４ng／mlのＦＧＦを補充したRPMI中で成長された。血清フリーの条件に維持されるとき、基礎培地はDMEMである。ヒト伏在静脈上皮細胞の一次培養は、他の文献（Ｉ−１４）に記載されたようにして調製され、維持された。上皮成長因子およびインスリンは、コラボラティブ・リサーチ社（Collaborative Research）からのものである。酸性ＦＧＦおよびｂＦＧＦは、カルホルニア・バイオテクノロジー社から得たものである。組換えＴＧＦαはジェネンテック社から入手した。培地および血清は、GIBCO 、Biofluids 社または NIH培地ユニットから入手したものである。
【００７２】
＜増殖アッセイ＞
３５mmの培養皿を、ポリ- Ｄ- リシン（20μg ／cm２ ；シグマ社）およびヒト・フィブロネクチンで順次予備コートし、次いで略2.5 ×10４ 個のBALB／MK細胞を接種した。基礎培地は、５μg のトランスフェリン、30nMのＮａ２ ＳｅＯ３ および0.2mM のエタノールアミン（シグマ社）を補充した、イーグルの低Ca２＋ミネラルエッセンシャル培地およびハムのＦ-12 培地の１：１混合培地である。培地は２日または３日毎に交換した。１０日後に、細胞はホルマリン（フィッシャー・サイエンティフィック社）で固定され、ギムザ（フィッシャー・サイエンティフィック社）で染色された。
【００７３】
＜タンパクのミクロシーケンシング＞
Ｃ４ カラムの活性画分から得た略４μg （150 pmol）のタンパクを50％ＴＦＡ中に再溶解し、アプライド・バイオシステムズ社の気相タンパクシーケンサーにかけた。20回のエドマン分解が行われ、自動オンラインHPLC（モデル120A；アプライド・バイオシステムズ社）でアミノ酸誘導体の同定が行われた。
【００７４】
［結 果］
この実験セクションの結果は、図１〜図７に纏められている。これらの図に示したデータおよび／またはそれらに関する実験を簡単に説明すれば次の通りである。
【００７５】
図１； Ｍ４２６ヒト胎児線維芽細胞による馴らし培地のヘパリン−セファロース・アフィニティクロマトグラフィーである。数リットルのＭ４２６馴らし培地からの限外ろ過リテンテイト約１５０ｍｌを、１時間でヘパリン−セファロースカラム（ベッド容積６ｍｌ）にかけた。このカラムを、平衡緩衝液１５０ｍｌ、トリス−ＨＣ１２０ｍＭ、ｐＨ７．５／０．３Ｍ ＮａＣｌを用いて洗浄した後、増加するＮａＣｌ濃度の変形線形勾配を用いて保持される蛋白質（リテンテイト中の蛋白質の合計の＜５％）を溶出した。画分の量は３．８ｍｌであり、勾配溶出の間の流速は１０８ｍｌ／時であった。示された画分の２μｌを、方法の項で説明したＢＡＬＢ／ＭＫ細胞における ３Ｈ−チミジン取込みの検定のための、０．２ｍｌの最終容量を有するマイクロタイターウェルに移した。
【００７６】
図２； ＢＡＬＢ／ＭＫマイトジェン活性の逆相Ｃ４ ＨＰＬＣである。０−６ＭのＮａＣｌを用いてヘパリン−セファロースから溶出させた活性画分を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０で処理し、０．１％トリフルオロ酢酸／２０％アセトニトリル（ＡＣＮ）で平衡にしたＣ４ Ｖｙｄａｃカラム（４．６×２５０ｍｍ）に直接かけた。このカラムを平衡緩衝液４ｍｌで洗浄した後、試料を増加％ＡＣＮの変形線形勾配で溶出した。画分の量は０．２ｍｌであり、流速は０．５ｍｌ／分であった。ＢＡＬＢ／ＭＫ細胞における ３Ｈ−チミジン取込みの検定のためのアリコートを、５０μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン／２０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、で直ちに１０倍に希釈し、最終希釈２００倍で試験した。
【００７７】
図３； パネルＡに示されるＣ４ クロマトグラフィからの選択された画分のＮａＤｏｄＳＯ４／ＰＡＧＥ分析である。各画分の半分を乾燥し、ＮａＤｏｄＳＯ４ ／２−メルカプトエタノールに再溶解し、熱変性して、実質的に銀で染色された１４％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。各分子量マーカー（ＫDaでの質量）の位置は矢印で示される。
【００７８】
図４； パネルＢで分析された画分によって引き起こされるＢＡＬＢ／ＭＫ細胞におけるＤＮＡ合成である。活性は、バックグランド（１００ｃｐｍ）に対して何倍の刺激であるかで表わされる。
【００７９】
図５； ＢＡＬＢ／ＭＫマイトジェン活性の分子ふるいＨＰＬＣ（ＴＳＫ３０００ＳＷ）クロマトグラフィーである。約５０μｌのＣｅｎｔｒｉｃｏｎで処理した、ＨＳＡＣからの０．６Ｍ ＮａＣｌプールを、予め２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８／０．５Ｍ ＮａＣｌで平衡化されたＬＫＢ ＧｌａｓＰａｃ ＴＳＫ ３０００ＳＷカラム（８×３００ｍｍ）にかけ、流速０．４ｍｌ／分で０．２ｍｌの画分として溶出させた。アリコート２μｌを、ＢＡＬＢ／ＭＫ細胞における ３Ｈ−チミジン取込みの検定のための、０．２ｍｌの最終容積を有するマイクロタイターウェルに移した。分子量マーカー（ＫDa）の溶出位置は、矢印で示される。
【００８０】
図６； ＴＳＫ−精製マイトジェンおよび他の成長因子に応じたＢＡＬＢ／ＭＫ ＤＮＡ合成の比較である。バックグランドに対して何倍の刺激であるかで表わされる、トリクロロ酢酸不溶ＤＮＡへの ３Ｈ−チミジンの取込みを、示される成長因子の濃度の関数として測定した。試料無添加である場合のバックグランド値は１５０ｃｐｍであった。この結果は、２つの独立した実験の平均値を示す。各実験における反復試験は、平均値の１０％以内であった。黒丸はＴＳＫ−精製マイトジェン、三角はＥＦＧ、四角はａＦＧＦ、白丸はｂＦＧＦである。
【００８１】
図７； 成長因子の異なる組合せに応じて化学的に規定された培地におけるＢＡＬＢ／ＭＫ細胞の成長比較である。培養物は、トランスフェリン、Ｎａ２ ＳｅＯ３、エタノールアミンおよび以下に示す成長因子を補足した、イーグル最小必須培地およびハムＦ１２培地の１：１混合物中のポリ−Ｄ−リシン／フィブロネクチンで予備被覆された３５ｍｍシャーレ上に、シャーレ当り２．５×１０４ 細胞の密度で塗布された。１０日後、このプレートを固定し、ギムザで染色した。キー：ａ）成長因子なし；ｂ）ＥＧＦ単独；ｃ）インシュリン単独；ｄ）ＫＧＦ単独；ｅ）ＥＧＦ＋インシュリン。成長因子の最終濃度は：ＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌ；インシュリン、１０μｇ／ｍｌ；およびＫＧＦ、４０ｎｇ／ｍｌであった。
【００８２】
以下、夫々の結果について詳細に説明する。
【００８３】
＜成長因子の検出および単離＞
種々の細胞系から得られた馴らし培地の予備スクリーニングによって、或る繊維芽細胞系はBALB／MK及び NIH／3T3 細胞の両方について検出され得るマイトジェン活性を含んでいることが示された。煮沸するとBALB／MKに対する活性は破壊されたが、 NIH／3T3 に対するマイトジェン活性はそのまま残存した。ＥＧＦ（Ｉ−１５）及びＴＧＦα（Ｉ−１６）の公知の熱安定性に基づけば、BALB／MKマイトジェン活性は、これら公知の上皮成長因子とは異なった要因に起因するものと思われる。
【００８４】
推定される成長因子を精製するために、この活性物質の最も生産的な供給源として、M426ヒト胎児肺繊維芽細胞系が選択された。ペリコン装置による限外濾過は、サンプル容量を、その後のクロマトグラフィーに適したレベルに減少するための便利な方法を提供する。精製スキームの開発において、篩、イオン交換および等電点電気泳動クロマトグラフィーの種々の組合わせが試みられたが、これらは全て不満足な低収率しか与えなかった。一方、他の成長因子の精製に用いられているヘパリン- セファロース・アフィニティークロマトグラフィー（HSAC）（Ｉ−１７〜Ｉ−２２）は、本発明における初期精製ステップとして有用であることが証明された。この段階では、他の因子が存在するかもしれないため回収された特定の活性の評価は不確かであるが、活性の見掛けの収率は50〜70％であり、略1000倍の富化に対応する。
【００８５】
図１に示したように、BALB／MKマイトジェン活性の90％を越える量が、0.6M NaCl でHSACカラムから溶出したこの活性ピークは、NIH/3T3 に対する何れの活性とも関係がなかった（データは示していない）。BALB／MKマイトジェン活性のもっと小さいピークが、0.8 〜1.2M NaCl に一致して出現した。
【００８６】
HPLCパターンの再現性に起因して、活性画分は、勾配の傾斜および光学密度プロファイルに基づいて推定的に同定され得る。セントリコン-10 で10〜20倍に迅速に濃縮することは、続いて -70℃で数ケ月保持され得る安定性にとって不可欠であることが分かった。
【００８７】
最終的な精製は、アミノ酸配列分析に適した調製法である、Ｃ４ Ｖｙｄａｃ カラムを用いたRP-HPLC （これはアミノ酸配列分析に適した調製法である）によって達成された。Ｃ４ ステップでの活性物質の収率は通常数パーセントにしか過ぎないが、このロスは使用した溶媒に起因するものであろう。他の実験において、室温で１時間、0.1%ＴＦＡ／50% アセトニトリルに曝すことにより、調製品のマイトジェン活性は98％減少した。にもかかわらず、図２〜図４に示したように、光学密度プロファイルにおける異なったピークに対応した、BALB／MK刺激活性の単一ピークが得られた。このピーク画分は、ＮａＤｏｄＳＯ４ ／ＰＡＧＥおよび該ゲルの銀着色に際して単一のバンドを生成し、また試験された夫々の画分の相対的なマイトジェン活性（図４）は、活性プロファイルを横切るバンドの強度に良好に対応していた。
【００８８】
生理的ｐＨに近い水溶液中におけるTSK G3000SW GlasPac カラムランでの分子篩クロマトグラフィーを用いた、HPLC技術に代わる別の精製ステップは、BALB／MKバイオアッセイにおいて主要な活性ピークを与えた（図５）。この調製品は、銀着色されたＮａＤｏｄＳＯ４ ／ＰＡＧＥ（データは示していない）から判断すると、RP-HPLC で得られた物と同様に殆ど純粋であったが、活性の回収は遥かに良好であった（下記の表Ｉ−１）。このTSK-精製物はより高い比活性を有しているため、生物学的研究ではルーチンに用いられた。
【００８９】
両方のタイプの精製された調製品（即ち、HPLC精製品および分子篩精製品）は、この二つの調製品においては区別できないように見えたが、これらのマイトジェン活性のプロファイルはＮａＤｏｄＳＯ４ ／ＰＡＧＥ上の異なったバンドに関連していた。
【００９０】
【表１】
回収率は、出発物質における全てのマイトジェン活性が分離された因子によるものと仮定することにより算出した。表中の脚注は下記の通りである。
【００９１】
※ 活性１ユニットは、ＢＡＬＢ／ＭＫバイオアッセイにおいてＴＳＫ精製因子により誘発されるチミジン取り込みの最大刺激の半分と定義され、ここでは約３ｎｇのＴＳＫ精製陰性が活性１ユニットを刺激する。
【００９２】
ａ 蛋白質は、BioRad から購入した Bradford 試薬を用いることにより評価した。
【００９３】
ｂ 蛋白質は、Ａ２１４ （１％）＝１４０を用いることにより評価した。
【００９４】
上記のように、表Ｉ−１には種々の精製ステップの結果が纏められており、活性の回収は、吸着RP-HPLC よりも分子篩クロマトグラフィーの方が遥かに良好であることを立証している。
【００９５】
＜成長因子の物理的および生物学的特徴付け＞
当該精製因子は、還元条件下（図２〜図４）および非還元条件下（データは示していない）でのＮａＤｏｄＳＯ４ ／ＰＡＧＥに基づいて、約28kDa の推定分子量を有していた。この値は、本来のコンホメーションを維持すると期待される溶媒中での異なった二つの寸法のカラムラン(columns run) （TSK-G3000-SW，図５；および superose-12, データは示していない）における、その溶出位置と良く一致していた。これらのデータから、該マイトジェンは分子量 25-30 kDaの単一のポリペプチド鎖からなっていると思われる。
【００９６】
当該マイトジェン活性の熱および酸に対する不安定性は、BALB／MKマイトジェネシス・バイオアッセイにを用いることにより示された。活性は、50℃での10分間のインキュベーションでは影響を受けなかったが、60℃で10分後には68％減少し、また 100℃で10分後には検出できなかった。室温において60分間、0.5Mの酢酸に曝すと、活性は対照の14％にまで減衰した。これに比較して、公知の成長因子（ＥＧＦ）のマイトジェン活性は、これら何れの処理によっても減少しなかった。
【００９７】
図６に図示された精製成長因子についての投与量応答曲線は、0.1 nMの少量で、検出可能なＤＮＡ合成刺激を導くことを示している。従って、活性範囲は、今日までに分析されている他の成長因子のそれと比肩し得るものであった。濃度範囲 0.1〜1.0 nMにおいて直線的な関係が観察され、1.0 nMでは 600倍の最大刺激が観察された。BALB／MKケラチン細胞において、この新規な因子はＥＧＦ、ａＧＦＧまたはｂＧＦＧよりも高い最大チミジン取り込みを確実に誘導する（図６）。
【００９８】
この因子の特殊な標的細胞特異性は、種々の細胞型に対するその活性を、上皮細胞マイトジェン活性を有することが知られた他の成長因子のそれと比較することによって示される。下記の表Ｉ−２に示されるように、新しく単離された因子はBALB／MKに対して強いマイトジェン性効果を示し、また試験された他の上皮細胞のＤＮＡ中への明確なチミジン取り込みを誘導した。これとは全く対照的に、当該因子はマウス（またはヒト，データは示していない）繊維芽細胞またはヒト伏在静脈上皮細胞に対して検出可能なマイトジェン効果をもたなかった。
【００９９】
【表２】
種々の細胞株における、ＫＧＦおよび他の成長因子によって刺激された最大チミジン取り込みの比較。この取り込みは、バックグラウンドに対して何倍の刺激であるかを表している。このデータは、４つの異なる実験を纏めて示している。
表中の脚注は下記の通りである。
【０１００】
※ ａＦＧＦに夜最大刺激は、ヘパリン（シグマ社）20μｇ／ｍｌの存在を必要とする。
【０１０１】
nd ＝測定
上記のように、表Ｉ−２には種々の成長因子の標的細胞特異性に関するデータが要約されており、新たに単離された因子がケラチン細胞（BALB／MK）に対して強いマイトジェン効果を示すこと、並びに繊維芽細胞またはヒト伏在静脈上皮細胞に対しては認め得る効果をもたないことを示している。
【０１０２】
これに比較して、他の公知の成長因子は何れもケラチン細胞を選択的に刺激するようには見えない。ＴＧＦαおよびＥＧＦは繊維芽細胞に対する強い活性を示す一方で、ＦＧＦは繊維芽細胞と共に上皮細胞に対してマイトジェン性であった。その上皮細胞特異性、就中ケラチン細胞感受性のために、この新規なマイトジェンは暫定的にケラチン細胞成長因子（ＫＧＦ）と称された。
【０１０３】
ＫＧＦがＤＮＡ合成を刺激するのみならず、持続した細胞成長を支持することを確立するために、完全に定義され且つこの成長因子が補充された血清フリーの培地中で成長し得るBALB／MK細胞の能力が明らかにされた。図７に示したように、この化学的に定義された培地において、ＫＧＦは、ＥＧＦの優れた代替え品として作用したが、インスリン（またはインスリン用成長因子Ｉ）の代替え品としては作用しなかった。従って、BALB／MK細胞の増殖に関して、ＫＧＦはＥＧＦ，ａＧＦＧ及びｂＧＦＧによって共有される主な信号伝達経路を通して作用するように思える。
【０１０４】
＜ミクロシーケンシングはＫＧＦの独特な
Ｎ- 末端アミノ酸配列を明らかにする＞
当該成長因子を更に特徴付けするために、略150 pmolのＣ４ 精製された材料をアミノ酸配列分析にかけた。2-13サイクルについて、曖昧でない次のような指定を伴う単一の配列が検出された：即ち、X-Asn-Asp-Met-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Thr-Asn-Val である。最初のポジションの指定には高いバックグラウンドノイズが含まれており、そのためにＸで示されている。
【０１０５】
FASTP プログラム（Ｉ−２４）を用いたコンピュータ調査によって、ＫＧＦのＮ末端アミノ酸配列はナショナル・バイオケミカル・リサーチ・ファウンデーション・データ・バンクの何れのタンパクとも顕著な相同性を示さないことが明らかになり、従ってこの成長因子の新規性が支持された。
【０１０６】
［考 察］
この実験セクションに記載された研究によって、上皮細胞に対して独特の特異性をもったヒト成長因子が同定された。本発明に従って、限外濾過、HSACおよびRP-HPLC または TSK分子篩クロマトグラフィーを用いることにより、この分子の物理的および生物学的性質の詳細な特徴付けを行うために充分な量が単離された。
【０１０７】
RP-HPLC から得られた活性画分中に、約28,000の分子量に対応する単一の銀着色バンドが検出され、該バンドの強度はこれら画分中のマイトジェン活性のレベルに比例していた。TSK クロマトグラフィーから得られた活性画分中には、RP-HPLC によって得られたものと区別できないバンドがみられた。この精製されたタンパクはナノモル以下の濃度で上皮細胞中でのＤＮＡ合成を刺激したが、繊維芽細胞または上皮細胞中においては、比肩し得る以上の如何なるチミジン取り込みをも誘導しなかった。この特徴的な標的細胞特異性は、精製分子から決定された単一の新規なＮ末端アミノ酸配列と相俟って、ＫＧＦが新規な成長因子であるとの結論を導く。
【０１０８】
化学的に定義された培地中において、当該精製された因子はインスリン様成長因子Ｉ／BALB/MK 細胞のインスリン成長要求を補足することができ、従って、ＥＧＦＧ，ＴＧＦα及びＧＦＧと共通の信号形質導入経路を通して作用するに違いない。更に、当該新規因子は、BALB／MK細胞におけるチミジン取込みの刺激において、公知の上皮細胞マイトジェンのどれよりも強い。予備的な証拠は、この因子がヒト・ケラチン細胞の二次培養の増殖をも支持できることを示している（データは示していない）。
【０１０９】
ＫＧＦの取扱いおよび保存は、その精製に際して問題である。これは、熱および酸に対して本来的に不安定性である外、凍結乾燥および透析に対しても不安定である。担体タンパク、ヘパリン、プロテアーゼ阻害剤、シリコン化管(siliconized tubes) 、または 4℃若しくは-20 ℃での保存を用いたにもかかわらず、HSAC後の24時間以内に活性は完全に喪失した。この段階でサンプルを濃縮することによってのみ、その活性が維持され得る。
【０１１０】
更に、乾燥および精製された因子を移送するためには強酸または湿潤剤を利用する必要があり、これは吸着され易くまたは不溶性であることに一致している。従って、活性保持のために、この精製された因子は高濃度溶液の形で-70 ℃に維持された。この場合、数か月は安定である。
【０１１１】
ＫＧＦのヘパリン結合能力は、in vivo で機能を有するこの因子の基本的な性質を示している。ヘパリン結合特性を有する成長因子には、ａＦＧＦ（Ｉ−２０〜Ｉ−２２）、ｂＦＧＦ（Ｉ−１９，Ｉ−２２）、顆粒細胞／マクロファージ・コロニー刺激因子およびインターロイキン３（Ｉ−２５）が含まれる。これらの夫々は、間質細胞によって産生される （Ｉ−２５〜Ｉ−２７）。これら因子は細胞外マトリックス中、または間質細胞表面を被覆するプロテオグリカン上に蓄積されるように思える。その保存、放出および特定の標的細胞との接触は、この相互作用によって調節されるものと仮定される（Ｉ−２５，Ｉ−２８）。上皮細胞増殖の間充織由来エフェクタも既に記載されているが（Ｉ−２９〜Ｉ−３１）、その同定はまだ明らかにされていない。そのヘパリン結合特性（ヒト胎児繊維芽間質細胞によって放出される）および上皮細胞屈性は、ＫＧＦに対して、正常な上皮細胞成長のこのようなパラクリン媒体に期待される全ての特性を与える。
【０１１２】
この新規な成長因子について決定された一部のアミノ酸配列は、そのコーディング配列の分子クローニングを可能にし、また後述の実験セクションIIに記載されたような、公知の成長因子ファミリーに対するその構造的関係の決定を可能にする。
【０１１３】
【参考文献Ｉ】
〔実験セクションII〕
新規な上皮細胞特異性成長因子の
ｃＤＮＡ配列は、ＦＧファミリーの
新しいメンンバーを定義する
先に述べた実験セクションＩでの仕事によって、ケラチン細胞成長因子（ＫＧＦ）と称される新規なヘパリン結合性成長因子が定義された。これはケラチン細胞に対して特に活性であり、上皮細胞に対して特異的であるように思える。この第二の実験セクションでは、実験的に決定されたＮＨ２ 末端アミノ酸配列に基づき、合成オリゴムクレオチドをハイブリダイゼーション・プローブとして用いた、ＫＧＦをコードするｃＤＮＡの単離および特徴付けが説明される。ヌクレオチド配列分析によって、194-アミノ酸ポリペプチドをコードする582-bpの読み取り枠(open reading frame)が同定された。この194-アミノ酸ポリペプチドは、41％〜33％の範囲で、ヘパリン結合性の酸性および塩基性繊維芽細胞成長因子、並びに hsi及び int-2オンコジェンの関連生産物と一致した。該ＫＧＦ遺伝子のＲＮＡ転写は、胎児および成体起源の正常な繊維芽細胞中で発現されるが、上皮細胞、内皮細胞またはグリア細胞中では発現されない。従って、ＫＧＦは間充織によって正常に発現され、これは上皮細胞増殖の制御に役割を果していると思われる。
【０１１４】
［材料および方法］
＜ｃＤＮＡの単離＞
ＫＧＦの精製及びＮ末端配列については、先に既述した通りである（上記の実験セクションＩ、およびII−３参照）。結果に関して述べたデオキシオリゴヌクレオチドのプール （50 pmole）は、83モルのγ- ３２Ｐ-ATP（3000Ｃｉ／mmole ，Amersham社）および10単位のＴ4 ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、５′末端をラベルされた。ｃＤＮＡクローンを有する組換えファージは、ニトロセルロース・フィルター上にレプリカ載置され、20％ホルムアミド、10％硫酸デキストラン、10mMのTris-HCl(pH 7.5)、 8 X SSC、5X Denhardt's 及び50μｇ／mlの変性サーモン精子ＤＮＡの中において42℃で一晩、32Ｐ- ラベルされたデオキシオリゴヌクレオチドでハイブリダイズされた。フィルターを、0.5X SSC、0.1 ％ＳＤＳ中で50℃において洗浄し、Kodac X-Omt ARフィルムに対して露出した。
【０１１５】
＜ＤＮＡ配列＞
ＫＧＦ・ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、オーバラッピング制限フラグメントのジデオキシ鎖末端法（II−２６）によって決定され、ｐＵＣベクター（II２７）中にサブクローンされた。
【０１１６】
＜ＫＧＦ・ｃＤＮＡのバクテリア発現ベクターの構築＞
成熟した分泌型のポリペプチドをコードするＫＧＦ・ｃＤＮＡは、次のようにしてプラスミド発現ベクター pKK233-2 （II−３１）中のハイブリッド trkプロモータの制御下に置かれた。これを達成するために、成熟ＫＧＦ分子（即ち、そのシグナルペプチドを含まないもの）をコードする情報を含んだ特定長さのＫＧＦ・ｃＤＮＡが、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）技術を（II−３２）用いて増幅された。このフラグメントは、当該ベクターの二つの部位（即ち、Ｓ1 ヌクレアーゼ消化により平滑末端化されたＮcoI 部位とHindIII）との間に方向付けして挿入された。ＰＣＲ法によって製造されたＫＧＦ・ｃＤＮＡの末端は、次の通りであった：５′末端は平滑で、ATG コドンで始まり、成熟型ＫＧＦのアミノ末端残基（図II−１参照）である33番のcys 残基のための TGCコドンが続くき、そして全ＫＧＦコーディング配列が続く。停止コドンである TAAおよび直接これに続く四つの塩基TTGCはもまた、ｃＤＮＡの３′末端に含まれていた。ｃＤＮＡの３′末端の望ましい位置にＤＮＡ合成を指示するためにＰＣＲ法で用いられたプライマーには、増幅されたｃＤＮＡをベクターＤＮＡ中に挿入するためのHindIII部位が含まれていた。
【０１１７】
＜ＫＧＦおよびＫＧＦ関連ペプチドに対する抗体の製造＞
ヒト繊維芽細胞由来の完全かつ精製されたタンパクに対して、マウス内で、５回以上の皮下注射を用いることによりモノクーナル抗体が生産された。試験血液は、ヒト上皮細胞からの高度に精製されたＫＧＦを抗原に用い、固相（ELISA ）検定でスクリーニングされた。ハイブリドーマはルーチンの方法により製造され、またＫＧＦ関連抗体を検出するために、上澄み液はELISA 検定でスクリーニングされた。陽性クローンは通常の方法により連続的にサブクローン化され、また大量の抗体を製造するために、選択されたサブクローンがマウス中で腹水腫瘍として成長された。抗体は、標準的な技術 （例えばヒドロキシアパタイト又は免疫アフィニティー樹脂）を用いることにより精製された。
【０１１８】
合成ペプチドに対するポリクローナル抗体は、兎中において、標準的な方法を用いることにより次のようにして生成された。ポリペプチドは固相技術によって製造され、グルタルアルデヒドとの反応によってチログロブリンに結合された。連続的に皮下注射が行われ、試験血液はウエスタンブロト分析およびマイトジェネシス・バイオアッセイを含む他の方法並びにELISA によってスクリーニングされた。IgＧ免疫グロブリンは、固相化タンパクＧを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって単離された。
【０１１９】
ポリクローナル抗体は、ヒト繊維芽細胞から天然に分泌されたＫＧＦおよび E.coli 中で産生された組換えＫＧＦの両者に対して、以下のプロトコールを用いることにより、兎中において生成された：
i) 最初の注射および第一の追加免疫は、鼠径部のリンパ節に投与された。
【０１２０】
ii) その後の追加免疫は筋肉内へ行われた。
【０１２１】
試験血液のスクリーニングには、ウエスタンブロット分析およびマイトジェネシス・バイオアッセイ並びにELISA が含まれ、また合成ペプチドに対する抗体について上述したと同様にしてIgＧを精製した。
【０１２２】
［結 果］
この実験セクションの結果は、図８〜図１４に纏められている。これらの図に示したデータおよび／またはそれらに関する実験を簡単に説明すれば次の通りである。
【０１２３】
図８； ヒトＫＧＦ ｃＤＮＡクローンの模式的な表現である。配列決定に用いられる重複ｐＣＥＶ９クローン３２および４９は、未翻訳領域を線で記し、かつコード配列をボックスで示す完全な構造図の上部に示される。ハッチ領域はシグナルペプチドの配列を示し、白抜きの領域は成熟蛋白質を示す。選択された制限部位を示す。
【０１２４】
図９〜図１１； ＫＧＦ・ｃＤＮＡ塩基配列および予想されるアミノ酸配列である。塩基は右側に番号付けされており、アミノ酸は全体を通して番号付けされている。精製ＫＧＦ由来のＮ−末端ペプチド配列には下線を付してある。疎水性Ｎ−末端ドメインはイタリック体で示す。潜在的なアスパラギン結合グリコシレーション部位はオーバーライン表示されている。このＲＮＡの３′末端に近い異なるポリアデニール化部位、ＡＡＴＴＡＡおよびＡＡＴＡＣＡはボックスとして示す。
【０１２５】
図１２； ノーザンブロット分析によるＫＧＦ・ｍＲＮＡの同定である。レーンａおよびｃはポリ（Ａ）−選択Ｍ４２６ＲＮＡ、レーンｄは全細胞Ｍ４２６ＲＮＡを表わす。フィルターは、レーンａおよびｂがクローン３２（プローブＡ、図８）からの３２Ｐ−標識６９５ｂｐ・ＢａｍＨＩ／ＢｃｌＩ断片で、またレーンｃおよびｄがクローン４９（プローブＢ、図II−１Ａ）からの５４１ｂｐ・ＡｐａＩ／ＥｃｏＲＩ断片でハイブリダイズされている。
【０１２６】
図１３； 関連する分子のＦＧＦファミリーの位相的比較である。高い相同性を共有する２つのタンパクドメインを黒塗りのボックスで示す。線影をつけたボックスは、推定シグナルペプチド配列を示す。２つの保護されたシステイン残基（Ｃ）の位置を示す。
【０１２７】
図１４； 正常ヒト細胞株および組織におけるＫＧＦ・ｍＲＮＡのノーザンブロット分析、および上皮細胞に対する既知の活性を有する他の成長因子のｍＲＮＡ発現との比較である。全細胞ＲＮＡを、セシウム・トリフルオロ酢酸勾配遠心により単離した。ＲＮＡ１０μｇを変性し、１％ホルムアルデヒドゲル中で電気泳動した。穏やかなアルカリ変性（５０ｍＭ ＮａＯＨで３０分間）の後、１Ｍ酢酸アンモニウムをコンベクタント（ｃｏｎｖｅｃｔａｎｔ）としてＲＮＡをニトロセルロースフィルターに移した。フィルターは、ＫＧＦコード配列（Ａ）の５′末端からの６４７ｂｐ Ｅｃｏ ＲＩ断片を含有する３２Ｐ−標識ｃＤＮＡプローブもしくは他の成長因子ＤＮＡからの類似のプローブとハイブリダイズした。下記タイプのヒト細胞が用いられた。扁平上皮癌（Ａ２５３、Ａ３８８およびＡ４３１）；乳房の上皮細胞（Ｓ６およびＲ１）；Ａｄ１２−ＳＶ４０で不死化されたケラチン細胞；主要ヒトケラチン細胞；新生児包皮線維芽細胞、ＡＧ１５２３；成人皮膚線維芽細胞（５０１Ｔ）；および胚性肺線維芽細胞（ＷＩ−３８およびＭ４２６）。
【０１２８】
＜新規成長因子をコードするｃＤＮＡクローンの単離＞
ＫＧＦコーディング配列に対応したｃＤＮＡクローンを研究するために、９個のアミノ酸配列、即ち精製ＫＧＦのミクロシーケンシング（実験セクションＩ、および参考文献II−３参照）によって決定されたように、 Asn-Asp-Met-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Alaに基づいて、26塩基の長さをもったオリゴヌクレオチドの二つのプールが作成された。一方のオリゴヌクレオチドプールは、９アミノ酸のための 256の可能な全てのコーディング配列の混合物を含んでおり、他方はThr 及びPro のためのコドンの縮退第三位置(the degenarate third position) にイノシン残基を含んでいた。
【０１２９】
この後者のデザインは、プール中の可能なコーディング配列の数を16に減少させる。ｔＲＮＡアンチコドン中のイノシンは、Ａ、ＣまたはＵと水素結合を形成できる（II−４）。また、デオキシイノシンを含むオリゴヌクレオチドは、対応するｃＤＮＡと効率良くハイブリダイズすることが示されている（II−５）。
【０１３０】
ｃＤＮＡライブラリーは、成長因子の初期供給源であるヒト胎児肺繊維芽細胞系 M426（II−７）から抽出されたポリアデニル化ＲＮＡを用いて、ｃＤＮＡクローニングベクターであるｐCEV9中に構築された。３２Ｐ- ラベルされた26量体オリゴヌクレオチドを用いた該ライブラリー（9 ×10５ プラーク）のスクリーニングによって、オリゴヌクレオチド・プローブの両方のプールとハイブリダイズする88のプラークが同定された。
【０１３１】
＜選択されたｃＤＮＡクローンの特徴付け及びシーケンシング＞
分析された10個のプラーク精製クローンのうちの一つ （クローン49）は、3.5 kbのｃＤＮＡ挿入を有していた。一方、残りのクローンは1.8 kb〜2.1 kbに亘る挿入を有していた。
【０１３２】
小さいほうのクローンの分析によって、幾つかの共通の制限部位が明らかになった。小さいほうの代表的なクローン （クローン32とクローン49）のシーケンシングによって、それらが重複部分を有するｃＤＮＡであることが明らかになった（図８）。クローン49はメッセージのポリ（Ａ）テールにプライムされていたが、クローン32は、ＫＧＦ・ｍＲＮＡの３′非コード領域中のＡ- リッチな配列に対するオリゴ（ｄＴ）プライマーのハイブリダイゼーションによって、ライブラリーの構築の際に生じていた。
【０１３３】
＜ＫＧＦポリペプチドをコードする配列の説明＞
二つのｃＤＮＡ（クローン32及び49）のアラインメントによって、完全なＫＧＦコーディング配列を含む3.85 kb の連続配列が確立された（図９〜図１１）。開始コドンと思われるATG がヌクレオチド位置446 に位置しており、1030位置のTAA 停止コドンで終端する582 塩基対の読み取り枠が確立された。この読み取り枠は22,512の算出分子量を有する194-アミノ酸ポリペプチドをコードするであろう。
【０１３４】
ATG コドンに隣接する配列は、真核生物リボソームによる最適の開始（II−８）のためのコンセンサス配列として提案された配列の GCC(G/A)CCATGG には適合しないが、ATG コドンの３ヌクレオチド上流にＡが存在する。この位置におけるＡは、前記コンセンサス配列において最も高い確率で維持されているヌクレオチドである。同じ読み取り枠において、このATG コドンの85ヌクレオチド上流には、TAG 停止コドンが先行している。
【０１３５】
精製ＫＧＦの実験的に決定されたＮＨ２ 末端に対して相同性を有する実験的に決定された19アミノ酸配列は、提案された開始コドン下流の第32アミノ酸で始まる。予期された配列と実験的に決定されたアミノ酸配列とは完全に一致しており、曖昧さのないアサインメントが可能であった。
【０１３６】
ＫＧＦと公知のタンパクとの間の相同性を研究するために、リップマン及びパーソンのFASTP プログラムを用いて、ナショナル・バイオメディカル・リサーチ・ファウンデーション・データベースのコンピュータ調査を行った（II−９）。この研究によって、ＫＧＦについて予期された一次構造と、酸性および塩基性ＦＧＦ並びに関連hst およびint-2-にコードされたタンパクの一次構造との間に驚くべき関係が明らかになった。
【０１３７】
＜ヒト細胞におけるＫＧＦ遺伝子のｍＲＮＡ転写の発現＞
ヒト細胞内でのＫＧＦ・ｍＲＮＡの発現を確かめるための予備試験において、ＫＧＦコーディング配列の大部分に亘るプローブ（プローブＡ、図８）は、全M426ＲＮＡのノーザンブロット分析によって、単一の2.4kb 転写を検出した（図１２）。これは、コンポジットｃＤＮＡ配列の長さ（3.85kb）よりも遥かに短かった。
【０１３８】
しかしながら、ポリ（Ａ）- 選択された M426 ＲＮＡのスクリーニングに際しては、略５kbの追加の転写が検出された。更に、クローン49の翻訳されなかった領域、即ち３′〜クローン32の端までに由来するプローブ（プローブＢ、図８）は、より大きいメッセージに対してのみハイブリダイズした（図１２）。従って、ＫＧＦ遺伝子はＲＮＡを替えるようにして転写されるように思える。ＦＧＦファミリーの他の二つのメンバー、即ちｂＦＧＦ（II−２９）および int-2（II−３０）もまた複数のＲＮＡを発現し、その重要性は決定されるべく残されている。
【０１３９】
ＫＧＦの正常な機能的役割を研究するために、種々のヒト細胞系および組織におけるその発現が試験された。図１４に示すように、胎児、新生児および成人の上皮組織に由来する幾つかの繊維芽細胞系の夫々において、優勢な 2.4 kb ＫＧＦ転写が検出された。しかし、正常起源の上皮細胞系からは検出されなかった。また、該転写は、正常な成人の腎および胃腸管器官から抽出されたＲＮＡ中でも検出されたが、肺または脳からは検出されなかった。ＫＧＦ・ＲＮＡ発現が、上皮組織に比べて間質細胞中で驚くほど特異的であることは、この因子が、上皮細胞成長の間充織刺激において正常な機能を果たすことを示した。
【０１４０】
比較のために、上皮細胞に対する活性が知られている他の成長因子のｍＲＮＡについても、上記に挙げたと同じ組織内で分析した。分析された上皮細胞系および間質細胞系の中には、ａＦＧＦまたはｂＦＧＦ転写の発現に一致するパターンなかった（図１４）。該ＥＧＦ転写は、同じ細胞系の何れにおいても発現せず、また種々の組織のうち腎でのみ観察された。最後に、ＴＧＦαメッセージは何れの間質繊維芽細胞系でも検出されず、また上皮細胞系の夫々において種々のレベルで発現された。また、試験された組織のうち、腎において、低レベルで検出された（図１４）。
【０１４１】
図１４からは、ヒト胎児肺繊維芽細胞および皮膚成熟繊維芽細胞由来のＲＮＡ中には、単一の2.4 kb転写が存在している一方で、（B5/589）上皮細胞系および（HA83）グリア細胞系、或いはヒト伏在静脈上皮細胞の一次培養中には何等の転写も検出されなかったことが明らかである。
【０１４２】
＜ヘパリンによるＫＧＦマイトジェン活性の阻害＞
ヘパリンは、種々の培養中の標的細胞に対するａＦＧＦのマイトジェン活性を実質的に増大させ、またこれを熱による不活性化に対して安定化させることが示されている（II−２１，II−２２）。ｂＦＧＦに密に結合するにもかかわらず、ヘパリンは、そのマイトジェン活性に対して最小限の影響しかもたない。ＫＧＦのＦＧＦに対する関係の観点から、ＫＧＦマイトジェン活性に対するヘパリンの影響が調べられた。下記の表II−１に示したように、培地中にヘパリンが含まれているとき、ＫＧＦに応答したBALB／MKによるチミジン取り込みは16倍阻害された。対照的に、ａＦＧＦおよびｂＦＧＦの両者の活性は同一の処理によって増大した。
【０１４３】
【表３】
なお、この実験においては、細胞をマイクロタイタープレートに塗布し、血清含有培地中で成長させて集団を形成させ、その後、試料添加前に血清非含有培地に２４−７２時間置いた。既述の通りに有糸分裂誘発検定を行なった（実験部分Ｉ上部およびII−３参照）。示される場所においては、培養培地中に最終濃度２０μｇ／ｍｌでヘパリンが含有されている。全ての成長因子の濃度は、５０ｎｇ／ｍｌであった。表中の結果は、ヘパリンの存在下（＋）もしくは非存在下（−）での指示された検定細胞において、 ３Ｈ−チミジン取込みの何倍の刺激であるかを表わす。各々の値は、各点が順々に重複分析の平均値を表わす２つの独立した実験からの平均結果を示す。
【０１４４】
上記のように、表II−１は、ヘパリンのＫＧＦマイトジェン活性に対する影響と他の成長因子に対する影響との比較を纏めて示しており、ＫＧＦに応答したBALB／MK細胞によるＤＮＡ中へのチミジン取り込みがヘパリンによって阻害される一方、これとは対照的に、ａＦＧＦおよびｂＦＧＦの活性に応答したときは何れの場合も同じ処理によって増大することを示している。
【０１４５】
＜抗ＫＧＦ抗体の製造＞
実験免疫学の分野で良く知られ、かつ上記の方法セクションに要約した標準的な方法論を用いて、ＫＧＦまたはＫＧＦ様ポリペプチドを認識する幾種類かの抗体が調製された。これらには次のものが含まれる：ヒト繊維芽細胞由来の完全かつ精製されたタンパクに対して、マウス内で生成されたモノクローナル抗体；ＫＧＦ・ｃＤＮＡから予測されるアミノ酸配列に基づいた配列を有する合成ペプチドに対して、兎内で生成されたポリクローナル抗体；ヒト繊維芽細胞から天然に分泌されたＫＧＦおよび E.coli 中で産生された組換えＫＧＦ（次のセクション参照）の両方に対して、兎内で生成されたポリクローナル抗体。
【０１４６】
三つの異なったハイブリドーマから得られたモノクローナル抗体が精製された。この三つの全てが、固相（ELISA ）検定において、天然に生じたＫＧＦと同様に組換え体を認識した。何れも変性条件下でＫＧＦと交差反応せず（ウエスタンブロット）、またBALB／MKバイオアッセイにおいてＫＧＦのマイトジェン活性を中和しない。
【０１４７】
アミノ酸配列 NDMTPEQMATNVRを有する合成ペプチドを用いて、ポリクローナル抗体が生成された。このアミノ酸配列は、ＫＧＦの32番から44番までの残基（図II−１参照）にたいして、ｃＤＮＡによって45位置に実際にコードされる asp残基の代りにＲ（arg ）残基を加えたものに対応する。天然ＫＧＦポリペプチドにおいて、このasp 残基は多分グリコシル化されており、従って、当該ポリペプチドから直接に得られたアミノ酸配列データ中では argであるように思える（以下の考察の項を参照のこと）。この合成ペプチドで生成されたポリクローナル抗体は、ELISA およびウエスタンブロット分析において、少なくとも10 ng の微量のタンパクを検出できるレベルの感度で、天然に生じたＫＧＦおよび組換えＫＧＦの両方を認識する。しかし、これら抗体はBALB/MK におけるＫＧＦのマイトジェン活性を中和しない。
【０１４８】
完全な中性ＫＧＦタンパクに対するポリクローナル抗血清は、ELISA およびウエスタンブロット検定の両者において、ＫＧＦを認識する。また、BALB／MKバイオアッセイにおいて、このような抗体はＫＧＦのマイトジェン活性を阻害するように思える。
【０１４９】
＜E.coliでのＫＧＦ・ｃＤＮＡの発現＞
E.coli中でポリペプチドを製造するために、ＫＧＦ・ｃＤＮＡは、そのコーディング配列をプラスミド pKK233-2 （II−３１）内でハイブリッドtrk プロモータ（trp およびlac プロモータの要素からなる）の制御下に置くことによって発現された。これを達成するために、成熟ＫＧＦ分子（即ち、そのシグナルペプチドを伴わないもの）をコードする情報を含んだ特定の長さのＫＧＦ・ｃＤＮＡが、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション技術（II−３２）を用いて増幅された。このフラグメントは、標準的組換えＤＮＡの方法論を用いて、ベクターの二つの部位、即ち、S1ヌクレアーゼ消化によって平滑化されたNcoI部位とHindIII 部位との間に方向付けして挿入された。選択された組換え体は、ATG 開始コドンがtrk プロモータ調節要素と正しく並んでいることを確かめるために、そのｃＤＮＡ５′末端でシーケンスされた。
【０１５０】
小スケール法によって、幾つかの組換え体がタンパク製造について試験された。要約すると、クローンは中間指数相（ＯＤ５９５ -0.5）まで成長され、１mMのイソプロピルβ- Ｄ- チオガラクトピラノース（IPTG）で90分間処理され、ウエスタンブロットのために、細胞抽出物がＳＤＳ- ポリアクリルアミドゲルにかけられた。試験された全ての組換え体が、アミノ末端ＫＧＦペプチドに対して生成した抗体によって認識されるタンパクを合成した。IPTGから最も大きい誘導を示した一つの組換え体が選択された。50μｇ／mlのアンピシリン及び12.5μｇ／mlのテトラサイクリンを含むＮＺＹブロス中で、１リットルのバクテリアがＯＤ５９５ -0.5まで成長され、IPTGで90分間処理された。遠心により細胞を回収し、50mM燐酸ナトリウム（pH 7.3）、0.2M NaCl 中に再懸濁させ、音波破砕により溶解させた。遠心分離により細胞破片(cell debris) を除去し、溶解物を直接ヘパリン- セファロース・アフィニティーカラムにかけた。
【０１５１】
ウエスタンブロット分析およびケラチン細胞でのマイトジェン活性によって測定されたように、組換えＫＧＦは 0.6〜0.6 M NaCl中で溶出する。Mono-S(FPLC)カラム（ファルマシア）を用いて引続き行った HSAC の精製により、ＳＤＳ- ポリアクリルアミドゲル及び銀着色を用いた電気泳動分析により判断して、純度90％以上と推定されるＫＧＦ調製物が得られた。
【０１５２】
組換えＫＧＦは、BALB／MKケラチン細胞へのチミジンの取り込みを効率良く刺激したが、 NIH／3T3 繊維芽細胞に対しては最低限の活性しか示さなかった。標準的なケラチン細胞バイオアッセイにおけるBALB／MK細胞の半上限刺激は、２〜５ng／mlの濃度で達成されたが、これに比較して、M426細胞から精製されたＫＧＦについては10〜15ng／mlの濃度であった。
【０１５３】
＜ＫＧＦ配列およびａＦＧＦ配列を含むキメラの構築＞
上記に示した研究によって、ＫＧＦは二つの異なった特徴を有することが示された。これらの特徴は、他の多機能ポリペプチドのコーディング配列中に生じることが良く知られているように、ポリペプチドの異なった部分またはドメインによってコードされるものであろう。この可能性を試験するために、ａＦＧＦのＣ末端コアに接合されたＫＧＦのＮＨ２ 末端配列をコードするキメラＤＮＡセグメントを、以下のように構築した。ＫＧＦ・ｃＤＮＡの５′末端での Sau3AI 制限酵素部位（GATC）が切断され、ａＦＧＦ・ｃＤＮＡにおける相同部位に結合された。上記の Sau3AI 制限酵素部位は、残基78及び79（夫々 arg 及びile ；図II−１）のためのコドン内にある。また、上記ａＦＧＦ・ｃＤＮＡの相同部位は、アミノ酸39(arg) 及び40のためのコドン内にある。このキメラＤＮＡの３′および５′末端が、分泌型のポリペプチドをコードするＫＧＦ・ｃＤＮＡの挿入に用いたと同じ方法（上記の方法を参照のこと）によって、プラスミド pKK233-2 のベクターＤＮＡに結合された。
【０１５４】
該キメラを有するベクタを用いて組換え E.coli を構築し、また成熟ＫＧＦについて上記で説明したようにして発現試験を行ったとき、ＫＧＦおよびａＦＧＦの両方の性質を有する新規生成物が産生された。このペプチドは、ヘパリン- セファロース・クロマトグラフィーによって富化され、またＫＧＦと同様、ケラチン細胞に対して標的細胞選択性を有するが、繊維芽細胞（NIH/3T3 ）に対しては最小限の活性しかもたないことが分かった。しかし、このキメラのマイトジェン活性はヘパリンによる阻害に対して感受性を欠いており、この特徴はＫＧＦよりもａＦＧＦに類似している。事実、ケラチン細胞に対するマイトジェン活性は、ａＦＧＦの場合と同様に、ヘパリンによって実際に増大した。こうして、本発明に従えば、細胞標的特異性およびヘパリン感受性の原因であるペプチドドメインはＫＧＦ中において明確に区別され、また容易に分離可能である。
【０１５５】
［考 察」
このセクションで説明した実験は、本発明の幾つかの主要な態様を例示している。これらには、ＫＧＦをコードするｃＤＮＡの単離、このようなｃＤＮＡの組換え細胞中での発現、ＫＧＦと反応する種々の抗体の製造、並びにＫＧＦおよびａＦＧＦの両者のアミノ酸配列および関連機能を具備した新規成長因子をコードするキメラｃＤＮＡの構築および発現が含まれる。また、これら態様に関連した以下のポイントは、本発明の理解を高めるために留意されるべきであろう。ＫＧＦ・ｃＤＮＡから予測される配列は、ヒト繊維芽細胞から分泌された精製ＫＧＦから決定されたアミノ酸配列と一致した。更に、この配列は、直接のアミノ酸配列によっては決定的なアミノ酸の特定ができない位置について、有力な説明を与えた。残基32および46は、ｃＤＮＡ配列からシステインであると予測される。また、非修飾システイン残基の加水分解された誘導体は、エドマン分解に従っては検出できない。また、予測されたＫＧＦアミノ酸配列は、残基45〜47に一つの可能なＮ- リンクしたグリコシル化部位（ Asn-X-Ser／Thr ）を含んでいた。もし Asn 45 がグリコシル化されると、それはここで用いたアミノ酸シーケンシング法によっては検出されないであろう。事実、ＮａＤｏｄＳＯ４ ／ＰＡＧＥ上において、ＫＧＦは精製されたタンパクについて予測されるよりも高い分子量で、広いバンドとして移動する。これはグリコシル化によって説明され得る。
【０１５６】
ＦＧＦは、広い標的細胞特異性をもったヘパリン結合性マイトジェンである（II−１０）。hst 遺伝子はヒト胃癌（II−１１）、隣接正常胃組織（II−１２）および Kaposi 肉種（II−１３）から、標準 NHI／3T3 感染アッセイによりトランスフォーミング遺伝子として同定された。int-2 遺伝子の産物は、正常にはマウスの胚形成の最中に（II−１４）、また異常にはマウス乳癌ウイルスのプロウイルス的組込み(proviral integration)の後に（II−１５）発現される。
【０１５７】
ＫＧＦは同定された繊維芽細胞ファミリーの６番目のメンバーである（II−２８）。繊維芽細胞に対する活性が欠如しているからＦＧＦ−６の名称は適切ではないように思えるが、ＦＧＦファミリーに対する構造的関連を示すために、この成長因子について当該命名を用いてもよい。従来特徴付けされた全ての成長因子は、標的として上皮細胞を排除するか、或いは感受性標的細胞のメンバーの中に上皮細胞をんでいるかの何れかであるから、ＫＧＦマイトジェン活性の上皮細胞に対する高度の特異的性質、特にケラチン細胞の感受性は独特のものである。
【０１５８】
今日までの研究において、ＫＧＦ転写の発現は上皮組織由来の間質細胞に特異的であるように思え、これはその正常な上皮細胞増殖における機能を示唆する。ＫＧＦ・ｃＤＮＡクローンの入手可能性によって、この成長因子の異常発現が、上皮細胞の形成異常および／または新形成に特徴付けられる臨床状態に関連するか否かを決定することが可能になる。更に、この新規な因子を組換え技術で大量に製造できることによって、上皮細胞の特異的成長が特に重要であるような状況における、その臨床適用の試験が可能になるに違いない。
【０１５９】
ＫＧＦ配列と、ＦＧＦファミリーの五つの他のタンパクとを並べて比較することによって、二つの主な領域の相同性が明らかになる。この領域は、予測されたＫＧＦ配列におけるアミノ酸65〜156 および 162〜186 に亘っており、両者は該ファミリーの異なったメンバーで長さが異なる短い非相同的なアミノ酸鎖で分離されている（図１３）。int-2 の場合、この配列の長さは17残基であるが、hst では二つの相同領域が隣接している。ＫＧＦにおいて、この介在配列は５個のアミノ酸からなっている。
【０１６０】
この整列された領域において、ＫＧＦアミノ酸配列の約44％が int-2（マウス）と同一であり、39％がｂＦＧＦ（ヒト）と同一であり、37％がａＦＧＦ（ヒト）と同一であり、33％が hst（ヒト）と同一である。この同じ領域において、６種類の全てのタンパクは残基の19％が同一であり、保存的置換(conservative substitution) が加納であり、28％の相同性を示した。
【０１６１】
図１３に示したように、これら関連タンパクのアミノ末端は非相同性であり、長さも種々である。ＫＧＦおよびhst の一次翻訳生成物は、シグナル配列として働くと思われる疎水性Ｎ末端領域を含んでいる（II−１６）。これは、当該Ｎ末端ドメインが成熟ＫＧＦ分子中に存在しない事実によって更に支持される。これとは対照的に、ＦＧＦは一見してシグナルペプチドを伴わないで合成される（II−１０）。int-2 タンパクは、不規則なＮ末端疎水性残基の領域を含んでいるが（II−１７）、このタンパクが分泌されるかどうかは分かっていない。更に、他のファミリーメンバーに比較すると、int-2 タンパクは長いＣ末端延長部を含んでいる。
【０１６２】
精製されたＫＧＦは５個のシステイン残基を含んでおり、そのうちの二つはＦＧＦ関連タンパクのファミリーに亘って保持される（図１３）。また、ＫＧＦ配列を通して５個の塩基性残基対が存在する。この同じパターンは、他のＦＧＦファミリーメンバーにも見出だされており、それらとヘパリンとの相互作用に含まれるかもしれない（II−１８）。また、二塩基部位もタンパク分解プロセッシングの共通の標的であり、このようなプロセッシングによって、幾つかのＫＧＦ調製物に見られる微細不均一性(microheterogeneity)を説明できるであろう。
【０１６３】
ＫＧＦ・ｃＤＮＡ配列はその全長に亘ってＡＴリッチであるが、特に３′非翻訳領域においてそうである。該領域でのＡＴ含量は70％で、推定コーディング配列における60％および５′非翻訳領域における63％と比較して明らかに高かった。３′非翻訳領域には多数の ATTTA配列を含まれてた。これは、一時的に発現された不安定なＲＮＡの選択的分解に含まれることが提案されている。古典的な AATAAA ポリアデニル化シグナルは存在しないが、二つの変形配列、即ち AATTAA および AATACA （II−２０）が、ｃＤＮＡの３′末端におけるポリ（Ａ）配列の夫々24ヌクレオチド及び19ヌクレオチド上流に検出された。
【０１６４】
酸性ＦＧＦに対するヘパリンの影響は、該成長因子の活性コンホメーションの安定化、或いは酸性ＦＧＦ及びそのレセプタとの三元コンプレックス形成の何れかに起因することが示唆されている（II−２１，II−２２）。もしそうであるならば、ヘパリンはＫＧＦの遊離分子として活性でないコンホメーションを安定化し、またはそのレセプタと効果的に相互作用できない密なコンプレックスを形成するのであろう。
【０１６５】
そのヘパリン結合能はＫＧＦとＦＧＦとの構造的類似性を反映しているのに対して、これら関連マイトジェンの間の標的細胞特異性は顕著に相違している。ＦＧＦは、胎児の中胚葉および神経外胚葉を起源とする最後まで分化していない細胞の分割を誘導する。繊維芽細胞および血管内皮組織に加えて、培養された中胚葉由来の標的細胞には、筋芽細胞、軟骨細胞および骨芽細胞が含まれる（II−２３）。ＦＧＦはまた、グリア星状細胞および神経芽細胞に対してもマイトジェン的である（II−２４）。また、Kaposo肉種から単離されたオンコジェンの産物（これはhst と同一である）も、NIH/3T3 及び毛細血管内皮細胞の増殖を刺激する（II−２５）。今日まで、ＫＧＦ誘導マイトジェネシスは上皮細胞においてのみ観察されており、繊維芽細胞または内皮細胞においては検出可能な何等の活性もないことが示されている（既述の実験セクションＩおよびII−３参照）。従って、ＫＧＦはＦＧＦとは異なった細胞表面レセプタを介して作用すると思われる。
【０１６６】
ＫＧＦと他のＦＧＦ関連タンパクとの間には、顕著なＮ末端相同性は全く存在しない。従って、ＫＧＦのＮ末端ドメインがその独特の標的細胞特異性を説明するに十分なものであるかどうかを決定するために、ＫＧＦと基本型ＦＧＦとの間のキメラ分子の構築が企画された。このような第一の組換えポリペプチド配列に関する結果は、ＫＧＦのこのＮ末端ドメインは本質的にケラチン細胞に対する細胞選択性をコードし、ＫＧＦのヘパリンに対する感受性は、ａＦＧＦの配列によって置換されたＣ末端コア領域の何処かにコードされることを示した。この新規ＫＧＦ様成長因子は、通常使用される抗凝固剤であるヘパリンの存在下で上皮細胞に特異的な成長因子の投与が望ましいような臨床的適用において有利であろう。また、キメラに関する追加の研究は、Ｃ末端コアの何れの特異的ドメインが、それらの生物学的活性に対するヘパリンの異なった効果に寄与するかに関する洞察をも提供するに違いない。
【０１６７】
背景技術および本発明の説明を補完する目的で、この明細書中で今まで指摘した刊行物、特許および特許出願は、ここに参照として明細書中に組み込まれる。
【０１６８】
明確化および理解の目的で、先の発明を幾らか詳細に説明した。また、本発明の範囲を逸脱することなく、その形式および詳細において種々の組み合わせを行い得ることは明らかであろう。
【０１６９】
【参考文献ＩＩ】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ヒト胎児繊維芽細胞Ｍ426 由来の馴らし培地のヘパリン- セファロース・アフィニティーカラムクロマトグラフィーの結果を描いたもので、マウスケラチン細胞（BALB／MK）のためのマイトジェン活性の90％以上が 0.6M ＮａＣｌで溶出されたことを示している。
【図２】図２は、吸着マトリックスを具備したHPLCを用いて、ヒト繊維芽細胞からのマイトジェンを更に精製した結果のうち、BALB／MKマイトジェン活性の逆相（Ｃ４ ）HPLC上のプロファイルを示している。
【図３】図３は、図２に示されたＣ４ クロマトグラフィーから選択された画分の電気泳動分析（ＮａＤｏｄＳＯ４ ／ＰＡＧＥ）を示しており、ピークＨＰＬＣ画分が銀染色ゲル上の単一バンドを含むことを示している。
【図４】図４は、図３で分析された分画によってトリガーされたBALB／MK細胞内におけるＤＮＡ合成の棒グラフであり、活性プロファイルを横切るタンパクバンドの強度と良く相関した相対的マイトジェン活性を示している。
【図５】図５は、生理的ｐＨにおける（TSK G3000SW GlasPac ）カラムランでの分子篩クロマトグラフィーを用いた、RP-HPLC に代わる別の精製ステップを示しており、ここではBALB／MKバイオアッセイにおけるマイトジェン活性の主要ピークが現れている。
【図６】図６は、ＴＳＫ精製マイトジェンに応答したBALB／MKのＤＮＡ合成と、他の成長因子に応答したBALB／MKのＤＮＡ合成との間の比較を示している。
【図７】図７は、成長因子の異なった組合わせに応答した、化学的に限定された培地中におけるBALB／MK細胞の成長の比較を示している。
【図８】図８は、ヒトＫＧＦ・ｃＤＮＡクローンの概略的模式図を示している。
【図９】図９は、ＫＧＦ・ｃＤＮＡヌクレオチオ及び予想されるアミノ酸配列を示している。
【図１０】図１０は、ＫＧＦ・ｃＤＮＡヌクレオチオ及び予想されるアミノ酸配列を示している。
【図１１】図１１は、ＫＧＦ・ｃＤＮＡヌクレオチオ及び予想されるアミノ酸配列を示している。
【図１２】図１２は、ＫＧＦ遺伝子から転写されたＲＮＡのノーザンブロット分析による同定を示している。
【図１３】図１３は、高い相同性を有する二つのタンパクドメイン、推定シグナル配列および二つの保存されたシステイン残基を強調して、ＫＧＦを含むＦＧＦファミリー関連分子間のトポロジ−比較を示している。
【図１４】図１４は、選択されたヒト正常細胞系および組織におけるＫＧＦ関連ｍＲＮＡの（ノーザンブトット）分析を示す電気泳動写真である。
【発明の属する技術分野】
本発明は成長因子に関し、特に公知の繊維芽細胞成長因子（FGFs）を含む因子ファミリーに類似したポリペプチド成長因子の単離に関する。また、本発明は新規な成長因子をコードするメッセンジャーＲＮＡ（mRNA）からの、相補型ＤＮＡ（cDNA）セグメントの構築に関する。更に、本発明はこのようなＤＮＡセグメントの生成物を組換え細胞によって合成することに関しする。また、この成長因子をコードするＤＮＡの同定およびクローニングによって可能になった、ある種の他の新規な生産物の製造および使用に関する。
【０００２】
なお、本明細書を通して下記の略号が用いられる。
【０００３】
【発明の背景】
成長因子は細胞間情報伝達の重要な媒体である。これら大きな影響力を有する分子は、一般に一つの細胞型から放出され、他の細胞型の増殖に影響するように作用する（後述する実験セクションＩ中の参照文献Ｉ−１を参照のこと）。成長因子における興味は、それが新形成中に含まれていることが示されたこと（後述の実験セクションII中の参照文献II−２）によって高まっている。シミアン肉種ウイルス(simian sarcoma virus)のＶ-sisトランスフォーミング遺伝子は、血小板由来成長因子のＢ鎖に対して相同性を有するタンパクをコードする（Ｉ−１，Ｉ−２）。更に、多数のオンコジェンが、成長因子レセプタをコードする遺伝子の相同性を有している。こうして、成長因子およびそのレセプタ- 媒介された信号形質導入経路に関する理解が進むことによって、正常細胞および腫瘍細胞の両方の成長メカニズムに対する洞察が容易に提供される。
【０００５】
結合組織細胞に影響する成長因子の公知のファミリーの一つには、酸性繊維芽細胞成長因子（aFGF）、塩基性繊維芽細胞成長因子（bFGF）、並びにｈst及びint-2 オンコジェンが含まれる。
【０００６】
更に、以下のものを含む幾つかの成長因子はヘパリン結合特性を有している：即ち、ａＦＧＦ（Ｉ−２０，Ｉ−２１）；ｂＦＧＦ（Ｉ−１９，Ｉ−２０）；顆粒細胞／マクロファージ・コロニー刺激因子（Ｉ−１）；およびインターロイキン３（Ｉ−１）である。これら夫々のポリペプチド因子はストローマル細胞(stromal cells) によって産生される。このような因子は、細胞外マトリックス中またはストローマル細胞の表面を被覆するプロテオグリカン上に蓄積されるようである（Ｉ−１，Ｉ−２５）。それらの蓄積、放出および特定の標的細胞との接触は、この相互作用によって調節されるものと仮定されている（Ｉ−２５，Ｉ−２８）。
【０００７】
しかしながら、ヒト腫瘍の大部分は上皮細胞から誘導されることが広く認識されている。間充織組織から誘導される上皮細胞増殖のエフェクターは知られているが（Ｉ−１，Ｉ−２，Ｉ−３）、それらの分子同定および構造は未だ解明されていない。
【０００８】
上皮細胞に影響を及ぼすこのような間充織成長因子に関する知識不足の観点から、上皮細胞増殖の調節メカニズムに関する改善された知識及び分析を提供する方法、検定試薬(composition) 組成物およびバイオアッセイが必要であること、並びに究極的にはそれらの中に含まれる因子に基づく新規な診断及び治療が必要であることが明らかである。
【０００９】
本発明はこのような必要性を満たし、また他の方法では製造され得ず、且つ上皮細胞増殖プロセスに関係すると思われる間充織起源タンパク因子を製造する手段を開発するために、タンパクの単離法および組換えＤＮＡ技術の適用を企画した。また、本発明はこれら上皮細胞成長プロセスに関係する因子の分子メカニズムの適用を企画した。
【００１０】
【発明の概要】
本発明はタンパクの単離および組換えＤＮＡ技術の開発に関し、その中には、上皮細胞に影響を与え且つ他のペプチド因子の混入がない新規な成長因子タンパクの製造が含まれる。また、新規なＤＮＡセグメントおよびバイオアッセイの方法も含まれる。
【００１１】
特に、本発明は酸性繊維芽細胞成長因子（aFGF）、塩基性繊維芽細胞成長因子（bFGF）、並びにｈst及びint-2 オンコジェンの関連生成物を含む公知の成長因子ファミリーの構造的および／または機能的特徴を有する新規なタンパクに関する。このＦＧＦポリペプチドファミリーの新メンバーは、ＦＧＦ類のヘパリン結合特性を保持しているが、独特の標的細胞特異性を有するに至っている。この成長因子は上皮細胞に特異的で、しかもケラチン細胞に対して特に活性であるように思える。従って、この新規な因子は「ケラチン細胞成長因子（ＫＧＦ）」と称する。ＫＧＦは繊維芽細胞に対する活性が欠如しているにもかかわらず、見出だされたＦＧＦポリポプチドファミリーの６番目のメンバーであるため、ＫＧＦはＦＧＦ−６とも称される。
【００１２】
従って、一部において、本発明は精製されたＫＧＦまたはＫＧＦ様タンパク、並びにこれらタンパクの製造方法に関する。このような精製因子は、天然にこれらタンパクを分泌するヒト細胞を培養し、本発明に従う単離方法を実施することによって製造され得る。これらタンパクは、例えばＫＧＦまたはＫＧＦ様ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントの単離を導く生化学的または生物学的研究に用いることができる。
【００１３】
また、本発明はＫＧＦまたはＫＧＦ様タンパクをコードするこのようなＤＮＡセグメントに関する。主要な態様において、本発明は以下に挙げる群からなるＫＧＦ関連生成物をコードするＤＮＡセグメントに関する：ヒト胎児肺繊維芽細胞系Ｍ426 から抽出されたポリアデニル化ＲＮＡ由来の、ヒトｃＤＮＡクローン32または42；これらクローンの組換え体または突然変異体；および上記ヒトＤＮＡセグメントの何れかにハイブリダイズさせることによって検出され得る関連ＤＮＡセグメントであって、ＫＧＦ様タンパクまたはその一部をコードするもの。
【００１４】
本発明の一態様の実施において、本発明のＤＮＡセグメントは適切な宿主細胞の中で発現され得、これによってＫＧＦまたはＫＧＦ様タンパクを製造する。本発明はまた、本発明のＤＮＡセグメントのセンス・ストランドの転写の結果として産生されたｍＲＮＡに関する。
【００１５】
他の態様において、本発明はベクターおよび本発明のＤＮＡを具備した組換えＤＮＡ分子に関する。これらの組換分子は、ＫＧＦ・ｃＤＮＡおよび以下の何れかのベクターＤＮＡを具備した分子によって例示される：即ち、バクテリオファージλクローニングベクター（λｐＣＥＶ９によって例示される）；ＤＮＡ配列プラスミドベクター（例えば、ｐＵＣ変種）；バクテリア遺伝子発現ベクター（例えばｐＫＫ233-2 ）；または哺乳類遺伝子発現ベクター（ｐＭＭＴのようなもの）である。
【００１６】
更に別の態様において、本発明は、本発明のＤＮＡで形質転換された細胞、好ましくは哺乳類細胞を包含する。更に、本発明は、本発明のＤＮＡで形質転換された昆虫細胞、酵母細胞、並びに Escherichia coli 及び B.subtilis のようなバクテリア細胞を含む細胞を包含する。本発明のこの側面における他の態様に従えば、上記形質転換ＤＮＡは細胞内で発現され得、これにより細胞内において、該ＤＮＡによってコードされるＫＧＦまたはＫＧＦ様タンパクを増大させる。
【００１７】
そのｃＤＮＡ配列から予測される一次ＫＧＦ翻訳生成物には、分泌のためのシグナル配列として働き、且つ成熟ＫＧＦ分子には存在しないＮ末端疎水性領域が含まれる。本発明の遺伝子発現に係る側面での最も好ましい態様においては、本発明のＤＮＡによって形質転換された細胞は、該ＤＮＡによってコードされるタンパクを、ヒト胎児肺繊維芽細胞によって分泌される形態（先端を切断された形）で分泌する。
【００１８】
更に、本発明は本発明のＤＮＡの発現によって、或いは本発明のＲＮＡの翻訳によって産生されるＫＧＦまたはＫＧＦ様タンパクを意図している。好ましくは、これらのタンパクは分泌された形（即ち、明瞭なシグナル配列が欠如したもの）であろう。これらのタンパク因子は機能的研究に用いることができ、また定性的及び定量的レセプター結合アッセイのような更なる構造的および機能的分析のために精製することができる。
【００１９】
更に、組換え技術でこの新規な成長因子を大量に製造できることは、上皮細胞の成長の特異的刺激が特に重要な状況において、その臨床適用の試験を可能にするであろう。従って、本発明は例えば火傷の傷の治療または移植された角膜組織の刺激を含むかかる症状の治療に用いるための、ＫＧＦまたはＫＧＦ様ポリペプチドを含有した調剤組成物を包含する。
【００２０】
本発明のこの態様に従えば、新規なＫＧＦ様タンパクは、本発明の「未修飾の」ＤＮＡ及びＲＮＡによるタンパク生産物、または修飾された若しくは遺伝子工学的に加工されたタンパク生産物であろう。ＤＮＡ配列中における工学的変異の結果、修飾されたＫＧＦ様タンパクは、天然に存在する対応の「天然型の」タンパクと比較して、アミノ酸配列中に一以上の相違を有するであろう。本発明におけるこの側面に従えば、該修飾されたＫＧＦ様タンパクには、ＫＧＦのアミノ酸配列およびＦＧＦペプチドファミリーの少なくとも一つの他のメンバーのアミノ酸配列を具備した「キメラ」分子が含まれるであろう。
【００２１】
結局、同様の性質を有する他のペプチド因子に関する類似の成功した研究の結果からすれば、このようなキメラＫＧＦ様ポリペプチドの開発によって、臨床目的のＫＧＦ様ペプチドの優れた第二世代の形態が導かれると思われる。これら修飾されたＫＧＦ様生産物は、例えばより小さく、より安定、より強力、および／または生産がより容易もしくは低コストであり得る。
【００２２】
本発明は更に、本発明のＤＮＡセグメント関連遺伝子から産生された、ｍＲＮＡのヒト細胞中での発現およびタンパクを測定するための新規なバイオアッセイ法を包含する。このような態様の一つに従えば、本発明のＤＮＡは、関連ｍＲＮＡ誘導の定常状態レベルまたは速度論を測定するためのプローブとして用い得る。ＫＧＦ関連ｃＤＮＡクローンの入手が可能になることによって、この成長因子の異常発現が、形成異常および新形成（例えば乾癬または悪性もしくは良性の上皮腫瘍）を含む、上皮細胞の過剰成長に特徴付けられる臨床症状中に含まれるか否かを決定することが可能になる。
【００２３】
本発明はまた、本発明のＤＮＡセグメントによってコードされるペプチドに対して製造される新規な抗体をも意図している。本発明のこの態様では、該抗体はその起源においてモノクローナルまたはポリクローナルであり、天然のＫＧＦ関連ポリペプチド、組換ＫＧＦ関連ポリペプチド、または化学合成によるＫＧＦ関連ポリペプチドを用いて生成される。
【００２４】
本発明の抗体は、ＫＧＦまたはこのようなペプチドを含むＫＧＦ様タンパクに対して、好ましくは該タンパクがその天然の（生物学的に活性な）形態であるときに、特異的に結合する。これらの抗体はＫＧＦの検出もしくは精製に用いることができ、或いはＫＧＦもしくはＫＧＦ様タンパク因子の検出もしくは精製のために用いることができる。本発明のこの側面における最も好ましい態様においては、該抗体はＫＧＦの成長促進活性を中和し、これによってメカニズム研究を可能にすると共に、最終的にはＫＧＦの過剰レベルを含む臨床症状の治療を可能にするであろう。
【００２５】
〔個々の実施例の説明〕
本発明は、一部は、精製されたＫＧＦまたはＫＧＦ様タンパクと、これらタンパクの調製方法に関する。本発明のこの側面における主要な態様は、約28 kd の見掛けの分子量によって特徴付けられる均質ＫＧＦに関する。この見掛けの分子量は、ＮａＤｏｄＳＯ４ ／ＰＡＧＥ中でのマイグレーション、逆相高速液体クロマトグラフィー上での単一バンドとしての移動、および少なくとも約 3.4×１０４ 単位／mg、好ましくは少なくとも約 3.2×１０５ 単位／mgの比活性に基づいている。ここで、１単位の活性は、以下に概説する標準的なアッセイ条件下において、所定の上皮細胞（ケラチン細胞）中での可能な最大のＤＮＡ合成刺激の半分の刺激を生じるような量として定義される。
【００２６】
上皮細胞型に特異的な新規な成長因子を同定するために、このような因子を検出するためのインディケータ細胞として、BALB／MK（Ｉ−６）と称されるクローンBALB／ｃマウスケラチン細胞系を用いた。これら細胞は、血清を含む培地中においてさえ、その成長を外来の上皮細胞マイトジェン源に依存している。これら細胞のための化学的に定義された培地の開発によって、BALB／MKの増殖に必要な二つの主要なマイトジェン経路を示すことが可能になっている。一つはインスリン様の成長因子Ｉ（または高濃度のインスリン）を含み、他方は表皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦα）、酸性繊維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）または塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）によって満足される（Ｉ−７）。
【００２７】
原型上皮細胞系としてBALB／MKを、またこれに対する繊維芽細胞として NIH／3T3 を夫々用い、新規上皮細胞特異性マイトジェンについて、種々のヒト細胞系からの馴らし培地のアッセイを行った。これら本発明のバイオアッセイによって、ヒト胎児肺繊維芽細胞系から放出されたこのような新規成長因子の一つ（ここではケラチン細胞成長因子（ＫＧＦ）という）を均質に精製することが可能になった。
【００２８】
簡単に説明すると、標準条件下でのＫＧＦ様活性のバイオアッセイは、以下のステップを具備している：
(i) マウスケラチン細胞（BALB／MK細胞）を集密するまで培養成長させ、次いで血清フリーの培地中で24-72 時間維持する；
(ii)試験サンプルの添加に続き、酸沈殿可能なＤＮＡ中への ３Ｈ−チミジンの取り込みによって、ＤＮＡの合成刺激を測定する。
【００２９】
マイトジェン成長因子の標的細胞特異性を測定するために、ＤＮＡの合成刺激（試験サンプルを添加しないときのチミジン取り込みのバックグラウンドに対する合成刺激の比で表わしたもの）を、同じアッセイ条件下においてケラチン細胞以外の細胞で観察された類似の刺激と比較すればよい。このような比較において、ＫＧＦマイトジェン活性は、繊維芽細胞に対するのとは反対にケラチン細胞に対する顕著な特異性（少なくとも約500 倍の刺激）を示す。また、他の典型的な上皮細胞型に対するよりもケラチン細胞に対してより大きな活性を示し、これは上記の場合より小さいが（少なくとも約50倍）、重要なものである（より詳しいデータについては後述の表Ｉ−２を、またバイオアッセイ標準条件の詳細については実験セクションＩの材料および方法を参照のこと）。
【００３０】
本発明に従って、細胞の培養およびマイトジェン活性の単離を含むＫＧＦの製造方法を用いることによって、この分子の物理的および生物学的性質を詳細に特徴付けるために十分な量が単離される。なお、この方法は限外濾過、ヘパリン- セファロース・アフィニティーカラムクロマトグラフィー （HSAC）、並びに吸着逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC ）または分子篩HPLC（TSK-HPLC）を具備している。
【００３１】
要約すると、Ｍ426 ヒト胎児繊維芽細胞（Ｉ−８）のような産生細胞からＫＧＦを製造する方法は、例えば以下のステップを具備している：
(i) 血清含有培地から血清フリーの培地まで循環される単層培養を用いた馴らし培地の調製と、その血清フリーの産物を使用するまで-70 ℃で貯蔵すること；
(ii)中間での緩衝液による稀釈（低分子量物質の除去を容易にするため）を伴った幾つかの連続ステップで、１０ kDaのカットオフ分子量を有する膜を用いた限外濾過により濃縮し、続いて任意に-70 ℃で保存すること；
(iii) ＮａＣｌ濃度を徐々に増大させた溶出液を用いて行う、ポリマー支持体（例えばセファロース）に結合されたヘパリン上でのアフィニティークロマトグラフィー；
(iv)１０ kDaのカットオフ分子量をもった小スケール限外濾過装置（例えばアミコン社から入手可能な Centricon-10 ミクロ濃縮器）で、少なくとも10〜12倍に濃縮し、-70 ℃で保存すること；
精製プロセスの次のステップは、下記のステップ(v) またはステップ(vi)の何れかを具備している。
【００３２】
(v) 有機溶媒系での、先のHSACで得られた活性画分（0.6 M NaClプール）の逆相HPLC；
または
(vi)生理学的ｐＨの緩衝水溶液中（例えば、Tris-HCl、pH 6.8/0.5M NaCl）において、分子篩HPLC（例えばＬＫＢから入手可能なTSK-G3000 SWガラスパックカラム）を行ない、続いて-70 ℃で保存する。
【００３３】
銀- 染色ＮａＤｏｄＳＯ４ ／ＰＡＧＥ（データは省略）から判断すると、上記ＴＳＫステップ(vi)で調製された試料はRP-HPLCrで得られたものと殆ど同じ純度である；しかし、ＴＳＫによると遥かに良好な活性回収が得られる（後述の表Ｉ−１）。更に、TSK-精製されたものは、RP-HPLC で精製されたものよりも高い比活性を有している。上記 TSKプロセスで調製されたＫＧＦは、ナノモル以下の濃度で上皮細胞中のＤＮＡ合成を刺激した。しかし、同程度もしくはより高濃度（５mM）において、繊維芽細胞または上皮細胞のＤＮＡ中へのチミジン取り込みは全く誘導しなかった。該活性はRP-HPLC ステップで用いられる酸、熱および溶媒に敏感であった（感受性および製造法の詳細については、実験セクションＩを参照のこと）。
【００３４】
当該技術分野で公知の標準的方法論を用いて、精製ＫＧＦのアミノ末端から2-13位について、曖昧さのないアミノ酸配列を以下のように決定した：Asn-Asp-Met-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Thr-Asn-Val （実験セクションＩ参照）。
【００３５】
また、本発明にはＫＧＦおよびＫＧＦ様ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントが含まれる。本発明のＤＮＡは以下に挙げるＤＮＡによって例示される：ヒト胎児肺繊維芽細胞系Ｍ426 から抽出したポリアデニル化ＲＮＡから誘導されたヒトｃＤＮＡクローン32及び49；これらクローンの組換え体または突然変異体；これらＤＮＡセグメントに対してハイブリダイズすることによって検出され得る関連ＤＮＡセグメント。
【００３６】
実験セクションIIに記載したように、ＫＧＦアミノ酸配列の既知の部分に対応するｃＤＮＡクローンを探査するために、Asn-Asp-Met-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala の９アミノ酸配列をコードする可能な全てのヌクレオチド配列に基づいて、オリゴヌクレオチドプローブの二つのプールを作成した。ヒト胎児肺繊維芽細胞系Ｍ426 から抽出された一次成長因子源であるポリアデニル化ＲＮＡを用い、ｃＤＮＡライブラリーをｃＤＮＡクローニングベクター（λｐＣＥＶ９）中に構築した。３２Ｐでラベルしたオリゴヌクレオチドを用いた該ライブラリー（９×１０５ プラーク）のスクリーニングによって、両方のプローブにハイブリダイズする８８個のプラークが同定された。
【００３７】
分析されプラーク精製された１０個のクローンのうち、一つのクローン（クローン49という）は3.5 kbのｃＤＮＡ挿入を有していたが、他のクローンは1.8 kb〜2.1 kbに亘る挿入を有していた。小さい方のクローンの分析によって、幾つかの共通の制限酵素部位が明らかになり、また代表的な小クローン（クローン32およびクローン49）の配列によって、それらのｃＤＮＡが重なっていることが示された（図８）。この二つのｃＤＮＡの配列によって、完全なＫＧＦをコードする配列を含む 3.85 kbの連続配列が確立された。全長に亘る合成ＫＧＦｃＤＮＡの配列についての、センス・ストランドのＤＮＡヌクレオチド配列、およびコードされる一次タンパクの予想配列を図９〜図１１に示した。
【００３８】
これらＤＮＡ、ｃＤＮＡクローン32，49は、完全なＫＧＦをコードする配列を具備したこれらセグメントの組換え形と同様に、本発明の最も好ましいＤＮＡ類である。
【００３９】
他の種々のタンパクにおけるこのような配列との類似性に基づくと、このｃＤＮＡ配列から、一次ＫＧＦおよび hst翻訳生成物はシグナル配列として作用する疎水性Ｎ末端領域を含んでいることが明らかである。従って、このＮ末端ドメインは、ヒト胎児繊維芽細胞によって分泌される精製された成熟ＫＧＦ分子中には存在しない。
【００４０】
更に、ＫＧＦは、予想ＫＧＦ中のアミノ酸配列65-156及び162-189 の二つの主要な相同領域を、ＦＧＦファミリーの他の全てのメンバーと共有する。これらは、異なるファミリーメンバーにおいて、短く且つ種々の長さの非相同アミノ酸配列によって分離されている。精製された形のＫＧＦの配列には五つのシステイン残基が含まれ、その二つはＦＧＦ関連タンパクファミリーに共通して保持される。塩基性残基の五つの対は、ＫＧＦ配列の全てに亘って現れる。これと同じパターンは、他のＦＧＦファミリー中にも認められる。
【００４１】
ハイブリダイゼーション法（例えば、ヒトゲノムＤＮＡのサザンブロット分析）において本発明のＤＮＡおよびＲＮＡ、特に最も好ましくは上記に列挙したＤＮＡを用いることにより、過度の実験を行うことなく、ゲノムｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして本発明の範囲に入る他のＫＧＦ様ＤＮＡを見出だすことが可能であることが、当業者には明らかである。更に、本発明のＤＮＡをこのように用いることによって、制限酵素長さの多形性（RFLPs ）のようなＫＧＦ遺伝子、並びにこの遺伝子または他の近隣遺伝子を含む遺伝病に関連した遺伝子マーカーを同定し得る。
【００４２】
また、本発明にはＫＧＦ・ＤＮＡの修飾型も含まれる。本発明のこの側面における主要な態様に従えば、このような修飾ＤＮＡは、ＫＧＦおよび他のＧＦＧペプチドファミリーの少なくとも一つのアミノ酸配列セグメントを含むＫＧＦ様タンパクをコードする。こうして、例えばＫＧＦの分泌型と他のＦＧＦ関連タンパクの類似位置との間には何等顕著なＮ末端相同性がないから、新規な構造的及び機能的性質を有するポリペプチドは、ＦＧＦファミリーにおける他のポリペプチドの異なったＮ末端セグメントをコードするＤＮＡセグメントを、その通常のＮＨ２ - 末端配列の代りにＫＧＦ・ＤＮＡにグラフトすることにより生成され得る。
【００４３】
このような修飾ＤＮＡによるポリペプチドキメラは、ＫＧＦ・ＮＨ２ - 末端ドメインが、その独特の標的細胞特異性を説明するに十分であるか否かを決定するために有用である。また、キメラの研究は、どのドメインがその生物学的活性に対するヘパリンの異なった影響に寄与するかに関する洞察を提供するに違いない。
【００４４】
実際、この研究法の有用性は、成功した分泌型ＫＧＦの加工および発現の成功によって既に確かめられている。この分泌型ＫＧＦにおいて、ＮＨ２ 末端から約40アミノ酸（図II−１で番号３２を付した成熟型ＫＧＦのアミノ末端 cys残基で始まり、ＫＧＦ残基７８の argで終わる）は、ａＦＧＦのＣＯ３ 末端コアの約140 アミノ酸（残基39の argで始まり、ａＦＧＦコーディング配列のＣ末端に続く）に連結される。このキメラ生成物はＫＧＦのようにケラチン細胞に対する細胞選択性を有するが、ヘパリンに対する感受性に欠け、この特徴はＫＧＦよりもむしろａＦＧＦの特徴に類似する。この新規なＫＧＦ様成長因子は、抗凝固剤として通常用いられるヘパリンの存在下に、上皮細胞特異性の成長因子の投与が望まれる臨床適用において利点を有するであろう。このキメラ分子の更に詳細な構成および該ポリペプチドの性質は、実験セクションIIで説明される。
【００４５】
本発明の他のＤＮＡには、ＫＧＦ・ｃＤＮＡ及び下記に例示するの何れかのベクターＤＮＡを含む組換ＤＮＡ分子が含まれる：バクテリオファージλクローニングベクター（λpCEV9 ）；ＤＮＡ配列プラスミドベクター（pUC 変種）；バクテリア発現ベクター（pKK233-2）；または哺乳類発現ベクター（pMMT/neo）。このような組換えＤＮＡは、実験セクションに詳細に記載した構成によって例示される。
【００４６】
最も好ましい組換え分子には以下のものが含まれる：即ち、分泌型ＫＧＦのためのコーディング配列およびバクテリア発現ベクター（例えばpKK233-2）有する分子、または全体の一次翻訳生成物（ＮＨ２ 末端シグナルペプチドを含む）および挿入されたＤＮＡを哺乳類細胞（例えば NIH/3T3）中で発現可能な哺乳類発現ベクター（pMMTによって例示されるもの）を有する分子である。
【００４７】
ＫＧＦ・ＤＮＡ及びバクテリア発現ベクターを含む組換えＤＮＡの構築は、実験セクションIIに記載される。簡単にいえば、ＫＧＦ・ｃＤＮＡは、そのコーディング配列をプラスミド発現ベクター pKK233-2 （II−３１）内でハイブリッド trkプロモータの制御下に置くことによって、E.coli中で発現されてポリペプチドを生成した。
【００４８】
ＫＧＦ・ＤＮＡと、挿入されたＤＭＡをヒトまたは動物の培養細胞中で発現可能な哺乳類ベクターとを具備する組換えＤＮＡの構築は、このような比較的単純なポリペプチドを発現させる公知の方法を用いた、標準的な遺伝子発現技術によって行うことができる。本発明のこの側面におけるＤＮＡ （哺乳類ベクター pMMT を含む）の一つの特別の態様は、本発明の組換え細胞の下に、このセクションにおいて、以下で更に詳細に説明する。
【００４９】
本発明のＤＮＡおよびセンスストランドＲＮＡは、本発明のタンパク製造方法に関連して、多量の実質的に純粋なＫＧＦまたはＫＧＦ様タンパクを造るために使用され得る。こうして製造された実質的に純粋なＫＧＦは、公知の技術を用いて、種々の体液および組織サンプル中における当該タンパクのためのレセプタの存在を決定するための臨床検査に用いることができる。
【００５０】
従って、この発明は本発明のＤＮＡ（発現可能なトランスフォーミングＤＮＡ）で形質転換された細胞、好ましくはバクテリアまたは哺乳類細胞を包含する。本発明のこの側面での好ましい態様において、本発明のＤＮＡによって形質転換された細胞は、完全にマイトジェン様の形でＫＧＦタンパクを産生する。最も好ましくは、これらのタンパクは分泌形 （即ち、見掛けのシグナル配列を欠いたもの）であろう。これらのタンパク因子は機能的研究に使用でき、また定性的および定量的レセプタ結合検定のような、更なる生化学的および機能的分析のために精製され得る。
【００５１】
ＫＧＦの製造のために、組換え E.coli 細胞が、実験セクションIIで詳述するように、バクテリア発現ベクター pKK233-2 を用いて構築された。要約すると、通常の小スケール法によって、幾つかの組換えバクテリアクローンのタンパク産生が試験された。試験された全ての組換え体が、アミノ末端ＫＧＦペプチドに対する抗体によって認識されるタンパクを合成した（以下を参照のこと）。一つの組換え体が１リットル培養の中で成長され、該組換え体はBALB／MKケラチン細胞のＤＮＡ中へのチミジン取り込みを効率的に刺激するが、 NIH／3T3 繊維芽細胞に対しては最低の活性しか示さない組換えＫＧＦを産生した。標準ケラチン細胞バイオアッセイにおけるBALB／MK細胞の半上限刺激（half-maximal stimulation）が、 2〜5 ng／mlの濃度で達成された。これに対して、M426細胞から精製されたＫＧＦの場合は10〜15ng／mlである。
【００５２】
１リットルのバクテリア細胞は、略５０μｇの Mono-S 精製組換えＫＧＦを生成した。遺伝子発現の分野における当業者には、この初期収率が、過度の実験を行なうことなく、公知の組換えＤＮＡ技術を適用することによって改善され得ることが明らかであろう。
【００５３】
また、組換え哺乳類細胞（NIH/3T3 マウス）は、Ｎ末端シグナル配列を含む配列をコードする全ＫＧＦ・ｃＤＮＡと、マウス・メタロチオニン（ＭＭＴ）プロモータおよびネオマイシン耐性のための選択的マーカー遺伝子を有するベクター pMMT/neo を用いて構築された。この細胞は、本発明のバイオアッセイを用いて、ＫＧＦ、特にヒト繊維芽細胞によって産生される成熟型（シグナルペプチドが欠如したもの）の製造について評価されている。高レベルの血小板由来成長因子（PDGF）のＡ鎖およびＢ鎖を含む他の幾つかの同様な組換えポリペプチドを首尾よく発現させるために、これと同じベクターと宿主細胞の組合わせが用いられている（II−３２）。従って、上記の組換えＤＮＡおよび本発明の形質転換細胞を用いることにより、この方法で組換えＫＧＦの高収率が達成され得ることが当業者に認識されるであろう。
【００５４】
最後に、上皮細胞成長の特異的刺激を必要とする条件での臨床試験を可能にするために、大規模製造が使用され得る。ポリペプチドを局部投与（例えば、皮膚または目の角膜に対して）または全身投与するための薬剤組成物を調製するための材料および方法は、この技術分野で良く知られており、また過度の実験を行なわなくとも容易にＫＧＦおよびＫＧＦ様ポリペプチドの投与に適用し得る。
【００５５】
本発明はまた、本発明のＤＮＡセグメントでコードされるペプチドに対して作られる新規な抗体を包含する。本発明のこの態様は、ＫＧＦを認識する幾つかの種類の抗体によって例示される。実験セクションIIに概説したように、これらは実験免疫学の分野でよく知られた標準的な方法論を用いて調製されている。これらの抗体には次のものが含まれる：即ち、マウスにおいて、ヒト繊維芽細胞由来の完全かつ精製されたタンパクに対して生成されたモノクローナル抗体；ＫＧＦ・ｃＤＮＡ配列から予想されるアミノ酸配列に基づく配列をもった合成ペプチド［例えば、ＫＧＦ残基32-45 の配列、即ち NDMTPEQMATNVR（アミノ酸配列のための標準的な一文字コードを用いた；図II−１参照）をもったペプチド］に対して、兎において生成されたポリクローナル抗体；ヒト繊維芽細胞から天然に分泌されたＫＧＦおよびE.coli（上記参照）中で産生された組換えＫＧＦの両者に対して、兎において生成されたポリクローナル抗体である。
【００５６】
試験された全ての抗体は、固相検定（ELISA ）および／またはウエスタンブロットにおいて、天然に存在するＫＧＦと同様に組換えＫＧＦを認識する。幾つかの例示抗体（これらは本発明の好ましい抗体である）は、BALB／MKバイオアッセイにおいて、ＫＧＦのマイトジェン活性を中和するように思える。
【００５７】
ＦabまたはＦ(ab)′フラグメントのような本発明の抗体のフラグメント（抗原結合活性を保持し、且つ当該技術分野で公知の方法により調製される）もまた、本発明の範囲内である。更に本発明は、本発明の抗体またはその活性フラグメントの薬剤組成物をも包含する。この薬剤組成物は、ポリペプチド投与のための薬剤組成物を調製するために当該分野で良く知られた材料および方法を用いて調製することができ、また過度の実験を行うことなく、ＫＧＦおよびＫＧＦ様ペプチドの投与に容易に適用することが可能である。
【００５８】
これら抗体およびその活性フラグメントは、例えばバイオアッセイにおけるＫＧＦの検出、またはタンパク因子の精製のために用いることができる。また、これらは当該技術分野で知られた方法で、ＫＧＦレセプタの単離に用いることができる。これらは、実験セクションIIに記載したように、公知の他の全ての成長因子のそれとは明確に異なるようにみえる。
【００５９】
ＫＧＦの上皮細胞に対するマイトジェン活性を中和するこれらの好ましい抗体、並びにそのフラグメント及び薬剤組成物は、BALB／MKアッセイによって示されるように、例えば上皮細胞の過剰成長で特徴付けられる臨床症状の治療に用いることができる。この臨床症状には、形成異常および新形成 （例えば乾癬、または悪性もしくは両性の上皮腫瘍）が含まれる。
【００６０】
更に本発明には、本発明のＤＮＡに関連した遺伝子の発現を検出するための新規なバイオアッセイ方法が包含される。幾つかの例示的態様において、本発明のＤＮＡは関連ｍＲＮＡの定常状態レベルを測定するためのプローブとして用いられた。ＫＧＦ・ＤＮＡを用いた本発明のこれらのバイオアッセイ方法、および標準ノーザンブロッティング法は、実験セクションIIにおいて詳細に説明される。
【００６１】
当業者は、過度の実験を行うことなく、単離細胞または種々の組織において、この様な方法がＫＧＦ様タンパクの遺伝子発現分析に容易に適用され得ることを認識するであろう。このようなバイオアッセイは、例えば上皮細胞成長プロセスにおける種々のクラスの腫瘍細胞または遺伝子欠損を同定するために有用である。
【００６２】
更なる労力を要することなく、当業者は、既述の説明を用い、また以下の実験セクションに記載した方法に従って、本発明の全範囲を利用できるものと確信する。実験セクション中に開示された材料は、他に指示がない限り例示の目的で開示されており、従ってどのような意味でも請求範囲を限定するものと解釈されてはならない。
【００６３】
〔実験セクションＩ〕
上皮細胞に特異的な新規成長因子の同定および
特性表示
このセクションでは、ヒト胎児肺繊維芽細胞系の馴らし培地中において、上皮細胞に特異的な成長因子の同定に導く実験を説明する。この因子は、ケラチン細胞に対する優勢な活性のために、先にケラチン細胞成長因子（ＫＧＦ）の用語で表わされたものであり、本発明に従って限外濾過、ヘパリン- セファロース・アフィニティークロマトグラフィー及びＣ４ 逆相HPLCカラム上での疎水性クロマトグラフィーの組合わせにより均一になるまで精製された。ＫＧＦは酸および熱に不安定であり、略28,000のダルトン見掛けの分子量を有する単一のポリペプチド鎖からなることが見出だされた。精製されたＫＧＦは上皮細胞に対する強力なマイトジェンであり、0.1nM および最大1.0nM において検出可能な活性で、非活動BALB／MK上皮ケラチン細胞におけるＤＮＡ合成を 500倍以上も刺激することが可能であった。繊維芽細胞または上皮細胞の何れかに対するマイトジェン活性の欠如は、ＫＧＦが従来特徴付けられた何れの成長因子とも異なった標的細胞特異性を有していることを示している。ミクロシーケンシングによって、公知の何れのタンパクとも有意な相同性をもたない、アミノ末端配列が明らかになった。ヒト胎児繊維芽細胞によるこの新規成長因子の放出は、正常な上皮細胞増殖の間充織刺激において重要な役割を果たすことを示している。
【００６４】
［方法および材料］
＜馴らし培地の調製＞
M426ヒト胎児繊維芽細胞（Ｉ−８）の初期継代を、175 cm２ のＴ- フラスコ上に撒き、10％子牛血清（GIBCO ）を補充したダルベッコ修飾イーグル培地（DMEM；GIBCO ）の中で10-14 日に亘って集密状態にまで増殖させた。集密状態になったら、その単層を１週毎に血清含有培地から血清フリー培地（DMEMのみからなる）へ交互に変えた。20mlのDMEMを添加するに先立って、この細胞を５mlの燐酸緩衝生理食塩水で２回洗浄した。72時間後、培養液を回収し、35mlの血清含有培地で置き換えた。この馴らし培地は、使用するまで -70℃で保存した。
【００６５】
＜限外濾過＞
略10リットルの馴らし培地を解凍し、0.50ミクロンのフィルター（ミリポア社の HAWP 142 50）を通して予備濾過し、ペリコンカセット装置（ミリポア社の XX42 00K 60）および10kDa の分子量カットオフを有するカセット（ミリポア社のPTGC 000 05 ）を用いて200ml にまで濃縮した。濃縮の後のサンプルに、20mM Tris-HCl,pH7.5/0.3M NaCl の１リットルを用いた連続した２回の稀釈ラウンドを施し、夫々につき、続いてペリコン装置を用いて他の限外濾過ステップを行う。リテンテート（残渣）中に回収された活性画分は、ヘパリン- セファロース樹脂に直接適用され、または -70℃で保存される。
【００６６】
＜ヘパリン- セファロース・アフィニティークロマトグラフィー（HSAC）＞
限外濾過で回収されたリテンテートは、20mM Tris-HCl,pH7.5/0.3M NaCl 中で平衡化されたヘパリン- セファロース樹脂（ファルマシア社）に負荷された。該樹脂は、光学密度がベースラインに戻るまで徹底して洗浄され、次いでNaCl濃度が徐々に増大するリニア- ステップ勾配にかけられた。画分からチミジン取込みバイオアッセイのための部分を除いた後、選択された画分をセントリコン-10 ミクロ濃縮器(Centricon-10 microconcentrator; Amicon 社) を用いて10〜20倍に濃縮し、 -70℃で保存した。
【００６７】
＜逆相HPLC（RP-HPLC ）＞
HSACからの活性画分（0.6 M NaClプール）を解凍し、プールし、更にセントリコン-10 で 200μｌの最終容量に濃縮した。該サンプルを、 0.1％トリフルオロ酢酸（TFA,Fluka ）／20％アセトニトリル（ベーカー社、HPLC級）中で平衡化されたＶydacＣ４ HPLCカラム（分離群、Hesperia,CA ）上に負荷し、アセトニトリル濃度が徐々に増大する線形勾配で溶出させた。バイオアッセイのための一部を、直ちに10倍量の50μｇ／ml／20mM Tris-HCl,pH7.5 中で稀釈した。残りのサンプルは、構造分析のための調製において、Speed-Vac(Svant)中で乾燥された。
【００６８】
＜分子篩HPLC＞
略50μｌの２倍濃縮されたヘパリン- セファロース画分が、20mM Tris-HCl,pH6.8/0.5M NaCl 中で平衡化されたTSK-G3000SW Glas-Pacカラム（LKB ）上に負荷された。該サンプルは、この緩衝液中において 0.4ml／min.の流速で溶出された。バイオアッセイのための一部を除いた後、該画分を -70℃で保存した。
【００６９】
＜NaDodSO４ - ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（NaDodSO４ ／PAGE）＞
Laemmli の方法（Ｉ−９）に従って、ポリアクリルアミドゲルが NaDodSO４ と共に調製された。サンプルを、 2.5％の2-メルカプトエタノール（vol/vol ）の存在下で３分間煮沸した。該ゲルは、BioRadからの試薬およびプロトコールを用いて、固定および銀染色された（Ｉ−１０）。分子量マーカーは、ファルマシア社から入手したものである。
【００７０】
＜ＤＮＡ合成刺激＞
BALB／MK細胞を接種するに先立って、96ウエルの微小滴定プレート（Falcon No.3596）を、１μg ／cm２ のヒト・フィブロネクチン（Collaborative Research社）で予備コートした。集密に達したら、細胞を５μg ／mlのトランスフェリン（Collaborative Research社）および 30nM のＮａ２ ＳｅＯ３ （ベーカー社）を含む血清フリーの培地中で24-72 時間維持した。ＤＮＡ中への ３Ｈ- チミジンの取込み（最終濃度５μCi／ml,NEN）は、サンプル添加の16時間後から始まって６時間のあいだ測定された。このアッセイは、細胞を氷冷燐酸緩衝生理食塩水で１回、また５％トリクロロ酢酸で２回洗浄することによって終了された。その沈殿物を0.25M NaOH中に再溶解し、液体シンチレーション液（Biofluor社、NEN ）中に移してカウントした。
【００７１】
BALB／MKについて上述したのと同様にして、種々の他の細胞系に関してＤＮＡの合成刺激がモニターされた。NIH/3T3 繊維芽細胞（Ｉ−１１）はナショナル・インスティチュート・オブ・ヘルスから入手した。一方、CCL208アカゲザル気管支上皮細胞（Ｉ−１２）はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手された。（Ｉ−１３）に記載されたようにして調製されたB5／589 ヒト乳房上皮細胞系は、マーサ・スタンファー（カルホルニア大学、バークレー）から入手した。該乳房細胞は、10％子牛胎児血清および４ng／mlのＦＧＦを補充したRPMI中で成長された。血清フリーの条件に維持されるとき、基礎培地はDMEMである。ヒト伏在静脈上皮細胞の一次培養は、他の文献（Ｉ−１４）に記載されたようにして調製され、維持された。上皮成長因子およびインスリンは、コラボラティブ・リサーチ社（Collaborative Research）からのものである。酸性ＦＧＦおよびｂＦＧＦは、カルホルニア・バイオテクノロジー社から得たものである。組換えＴＧＦαはジェネンテック社から入手した。培地および血清は、GIBCO 、Biofluids 社または NIH培地ユニットから入手したものである。
【００７２】
＜増殖アッセイ＞
３５mmの培養皿を、ポリ- Ｄ- リシン（20μg ／cm２ ；シグマ社）およびヒト・フィブロネクチンで順次予備コートし、次いで略2.5 ×10４ 個のBALB／MK細胞を接種した。基礎培地は、５μg のトランスフェリン、30nMのＮａ２ ＳｅＯ３ および0.2mM のエタノールアミン（シグマ社）を補充した、イーグルの低Ca２＋ミネラルエッセンシャル培地およびハムのＦ-12 培地の１：１混合培地である。培地は２日または３日毎に交換した。１０日後に、細胞はホルマリン（フィッシャー・サイエンティフィック社）で固定され、ギムザ（フィッシャー・サイエンティフィック社）で染色された。
【００７３】
＜タンパクのミクロシーケンシング＞
Ｃ４ カラムの活性画分から得た略４μg （150 pmol）のタンパクを50％ＴＦＡ中に再溶解し、アプライド・バイオシステムズ社の気相タンパクシーケンサーにかけた。20回のエドマン分解が行われ、自動オンラインHPLC（モデル120A；アプライド・バイオシステムズ社）でアミノ酸誘導体の同定が行われた。
【００７４】
［結 果］
この実験セクションの結果は、図１〜図７に纏められている。これらの図に示したデータおよび／またはそれらに関する実験を簡単に説明すれば次の通りである。
【００７５】
図１； Ｍ４２６ヒト胎児線維芽細胞による馴らし培地のヘパリン−セファロース・アフィニティクロマトグラフィーである。数リットルのＭ４２６馴らし培地からの限外ろ過リテンテイト約１５０ｍｌを、１時間でヘパリン−セファロースカラム（ベッド容積６ｍｌ）にかけた。このカラムを、平衡緩衝液１５０ｍｌ、トリス−ＨＣ１２０ｍＭ、ｐＨ７．５／０．３Ｍ ＮａＣｌを用いて洗浄した後、増加するＮａＣｌ濃度の変形線形勾配を用いて保持される蛋白質（リテンテイト中の蛋白質の合計の＜５％）を溶出した。画分の量は３．８ｍｌであり、勾配溶出の間の流速は１０８ｍｌ／時であった。示された画分の２μｌを、方法の項で説明したＢＡＬＢ／ＭＫ細胞における ３Ｈ−チミジン取込みの検定のための、０．２ｍｌの最終容量を有するマイクロタイターウェルに移した。
【００７６】
図２； ＢＡＬＢ／ＭＫマイトジェン活性の逆相Ｃ４ ＨＰＬＣである。０−６ＭのＮａＣｌを用いてヘパリン−セファロースから溶出させた活性画分を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０で処理し、０．１％トリフルオロ酢酸／２０％アセトニトリル（ＡＣＮ）で平衡にしたＣ４ Ｖｙｄａｃカラム（４．６×２５０ｍｍ）に直接かけた。このカラムを平衡緩衝液４ｍｌで洗浄した後、試料を増加％ＡＣＮの変形線形勾配で溶出した。画分の量は０．２ｍｌであり、流速は０．５ｍｌ／分であった。ＢＡＬＢ／ＭＫ細胞における ３Ｈ−チミジン取込みの検定のためのアリコートを、５０μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン／２０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、で直ちに１０倍に希釈し、最終希釈２００倍で試験した。
【００７７】
図３； パネルＡに示されるＣ４ クロマトグラフィからの選択された画分のＮａＤｏｄＳＯ４／ＰＡＧＥ分析である。各画分の半分を乾燥し、ＮａＤｏｄＳＯ４ ／２−メルカプトエタノールに再溶解し、熱変性して、実質的に銀で染色された１４％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。各分子量マーカー（ＫDaでの質量）の位置は矢印で示される。
【００７８】
図４； パネルＢで分析された画分によって引き起こされるＢＡＬＢ／ＭＫ細胞におけるＤＮＡ合成である。活性は、バックグランド（１００ｃｐｍ）に対して何倍の刺激であるかで表わされる。
【００７９】
図５； ＢＡＬＢ／ＭＫマイトジェン活性の分子ふるいＨＰＬＣ（ＴＳＫ３０００ＳＷ）クロマトグラフィーである。約５０μｌのＣｅｎｔｒｉｃｏｎで処理した、ＨＳＡＣからの０．６Ｍ ＮａＣｌプールを、予め２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８／０．５Ｍ ＮａＣｌで平衡化されたＬＫＢ ＧｌａｓＰａｃ ＴＳＫ ３０００ＳＷカラム（８×３００ｍｍ）にかけ、流速０．４ｍｌ／分で０．２ｍｌの画分として溶出させた。アリコート２μｌを、ＢＡＬＢ／ＭＫ細胞における ３Ｈ−チミジン取込みの検定のための、０．２ｍｌの最終容積を有するマイクロタイターウェルに移した。分子量マーカー（ＫDa）の溶出位置は、矢印で示される。
【００８０】
図６； ＴＳＫ−精製マイトジェンおよび他の成長因子に応じたＢＡＬＢ／ＭＫ ＤＮＡ合成の比較である。バックグランドに対して何倍の刺激であるかで表わされる、トリクロロ酢酸不溶ＤＮＡへの ３Ｈ−チミジンの取込みを、示される成長因子の濃度の関数として測定した。試料無添加である場合のバックグランド値は１５０ｃｐｍであった。この結果は、２つの独立した実験の平均値を示す。各実験における反復試験は、平均値の１０％以内であった。黒丸はＴＳＫ−精製マイトジェン、三角はＥＦＧ、四角はａＦＧＦ、白丸はｂＦＧＦである。
【００８１】
図７； 成長因子の異なる組合せに応じて化学的に規定された培地におけるＢＡＬＢ／ＭＫ細胞の成長比較である。培養物は、トランスフェリン、Ｎａ２ ＳｅＯ３、エタノールアミンおよび以下に示す成長因子を補足した、イーグル最小必須培地およびハムＦ１２培地の１：１混合物中のポリ−Ｄ−リシン／フィブロネクチンで予備被覆された３５ｍｍシャーレ上に、シャーレ当り２．５×１０４ 細胞の密度で塗布された。１０日後、このプレートを固定し、ギムザで染色した。キー：ａ）成長因子なし；ｂ）ＥＧＦ単独；ｃ）インシュリン単独；ｄ）ＫＧＦ単独；ｅ）ＥＧＦ＋インシュリン。成長因子の最終濃度は：ＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌ；インシュリン、１０μｇ／ｍｌ；およびＫＧＦ、４０ｎｇ／ｍｌであった。
【００８２】
以下、夫々の結果について詳細に説明する。
【００８３】
＜成長因子の検出および単離＞
種々の細胞系から得られた馴らし培地の予備スクリーニングによって、或る繊維芽細胞系はBALB／MK及び NIH／3T3 細胞の両方について検出され得るマイトジェン活性を含んでいることが示された。煮沸するとBALB／MKに対する活性は破壊されたが、 NIH／3T3 に対するマイトジェン活性はそのまま残存した。ＥＧＦ（Ｉ−１５）及びＴＧＦα（Ｉ−１６）の公知の熱安定性に基づけば、BALB／MKマイトジェン活性は、これら公知の上皮成長因子とは異なった要因に起因するものと思われる。
【００８４】
推定される成長因子を精製するために、この活性物質の最も生産的な供給源として、M426ヒト胎児肺繊維芽細胞系が選択された。ペリコン装置による限外濾過は、サンプル容量を、その後のクロマトグラフィーに適したレベルに減少するための便利な方法を提供する。精製スキームの開発において、篩、イオン交換および等電点電気泳動クロマトグラフィーの種々の組合わせが試みられたが、これらは全て不満足な低収率しか与えなかった。一方、他の成長因子の精製に用いられているヘパリン- セファロース・アフィニティークロマトグラフィー（HSAC）（Ｉ−１７〜Ｉ−２２）は、本発明における初期精製ステップとして有用であることが証明された。この段階では、他の因子が存在するかもしれないため回収された特定の活性の評価は不確かであるが、活性の見掛けの収率は50〜70％であり、略1000倍の富化に対応する。
【００８５】
図１に示したように、BALB／MKマイトジェン活性の90％を越える量が、0.6M NaCl でHSACカラムから溶出したこの活性ピークは、NIH/3T3 に対する何れの活性とも関係がなかった（データは示していない）。BALB／MKマイトジェン活性のもっと小さいピークが、0.8 〜1.2M NaCl に一致して出現した。
【００８６】
HPLCパターンの再現性に起因して、活性画分は、勾配の傾斜および光学密度プロファイルに基づいて推定的に同定され得る。セントリコン-10 で10〜20倍に迅速に濃縮することは、続いて -70℃で数ケ月保持され得る安定性にとって不可欠であることが分かった。
【００８７】
最終的な精製は、アミノ酸配列分析に適した調製法である、Ｃ４ Ｖｙｄａｃ カラムを用いたRP-HPLC （これはアミノ酸配列分析に適した調製法である）によって達成された。Ｃ４ ステップでの活性物質の収率は通常数パーセントにしか過ぎないが、このロスは使用した溶媒に起因するものであろう。他の実験において、室温で１時間、0.1%ＴＦＡ／50% アセトニトリルに曝すことにより、調製品のマイトジェン活性は98％減少した。にもかかわらず、図２〜図４に示したように、光学密度プロファイルにおける異なったピークに対応した、BALB／MK刺激活性の単一ピークが得られた。このピーク画分は、ＮａＤｏｄＳＯ４ ／ＰＡＧＥおよび該ゲルの銀着色に際して単一のバンドを生成し、また試験された夫々の画分の相対的なマイトジェン活性（図４）は、活性プロファイルを横切るバンドの強度に良好に対応していた。
【００８８】
生理的ｐＨに近い水溶液中におけるTSK G3000SW GlasPac カラムランでの分子篩クロマトグラフィーを用いた、HPLC技術に代わる別の精製ステップは、BALB／MKバイオアッセイにおいて主要な活性ピークを与えた（図５）。この調製品は、銀着色されたＮａＤｏｄＳＯ４ ／ＰＡＧＥ（データは示していない）から判断すると、RP-HPLC で得られた物と同様に殆ど純粋であったが、活性の回収は遥かに良好であった（下記の表Ｉ−１）。このTSK-精製物はより高い比活性を有しているため、生物学的研究ではルーチンに用いられた。
【００８９】
両方のタイプの精製された調製品（即ち、HPLC精製品および分子篩精製品）は、この二つの調製品においては区別できないように見えたが、これらのマイトジェン活性のプロファイルはＮａＤｏｄＳＯ４ ／ＰＡＧＥ上の異なったバンドに関連していた。
【００９０】
【表１】
【００９１】
※ 活性１ユニットは、ＢＡＬＢ／ＭＫバイオアッセイにおいてＴＳＫ精製因子により誘発されるチミジン取り込みの最大刺激の半分と定義され、ここでは約３ｎｇのＴＳＫ精製陰性が活性１ユニットを刺激する。
【００９２】
ａ 蛋白質は、BioRad から購入した Bradford 試薬を用いることにより評価した。
【００９３】
ｂ 蛋白質は、Ａ２１４ （１％）＝１４０を用いることにより評価した。
【００９４】
上記のように、表Ｉ−１には種々の精製ステップの結果が纏められており、活性の回収は、吸着RP-HPLC よりも分子篩クロマトグラフィーの方が遥かに良好であることを立証している。
【００９５】
＜成長因子の物理的および生物学的特徴付け＞
当該精製因子は、還元条件下（図２〜図４）および非還元条件下（データは示していない）でのＮａＤｏｄＳＯ４ ／ＰＡＧＥに基づいて、約28kDa の推定分子量を有していた。この値は、本来のコンホメーションを維持すると期待される溶媒中での異なった二つの寸法のカラムラン(columns run) （TSK-G3000-SW，図５；および superose-12, データは示していない）における、その溶出位置と良く一致していた。これらのデータから、該マイトジェンは分子量 25-30 kDaの単一のポリペプチド鎖からなっていると思われる。
【００９６】
当該マイトジェン活性の熱および酸に対する不安定性は、BALB／MKマイトジェネシス・バイオアッセイにを用いることにより示された。活性は、50℃での10分間のインキュベーションでは影響を受けなかったが、60℃で10分後には68％減少し、また 100℃で10分後には検出できなかった。室温において60分間、0.5Mの酢酸に曝すと、活性は対照の14％にまで減衰した。これに比較して、公知の成長因子（ＥＧＦ）のマイトジェン活性は、これら何れの処理によっても減少しなかった。
【００９７】
図６に図示された精製成長因子についての投与量応答曲線は、0.1 nMの少量で、検出可能なＤＮＡ合成刺激を導くことを示している。従って、活性範囲は、今日までに分析されている他の成長因子のそれと比肩し得るものであった。濃度範囲 0.1〜1.0 nMにおいて直線的な関係が観察され、1.0 nMでは 600倍の最大刺激が観察された。BALB／MKケラチン細胞において、この新規な因子はＥＧＦ、ａＧＦＧまたはｂＧＦＧよりも高い最大チミジン取り込みを確実に誘導する（図６）。
【００９８】
この因子の特殊な標的細胞特異性は、種々の細胞型に対するその活性を、上皮細胞マイトジェン活性を有することが知られた他の成長因子のそれと比較することによって示される。下記の表Ｉ−２に示されるように、新しく単離された因子はBALB／MKに対して強いマイトジェン性効果を示し、また試験された他の上皮細胞のＤＮＡ中への明確なチミジン取り込みを誘導した。これとは全く対照的に、当該因子はマウス（またはヒト，データは示していない）繊維芽細胞またはヒト伏在静脈上皮細胞に対して検出可能なマイトジェン効果をもたなかった。
【００９９】
【表２】
表中の脚注は下記の通りである。
【０１００】
※ ａＦＧＦに夜最大刺激は、ヘパリン（シグマ社）20μｇ／ｍｌの存在を必要とする。
【０１０１】
nd ＝測定
上記のように、表Ｉ−２には種々の成長因子の標的細胞特異性に関するデータが要約されており、新たに単離された因子がケラチン細胞（BALB／MK）に対して強いマイトジェン効果を示すこと、並びに繊維芽細胞またはヒト伏在静脈上皮細胞に対しては認め得る効果をもたないことを示している。
【０１０２】
これに比較して、他の公知の成長因子は何れもケラチン細胞を選択的に刺激するようには見えない。ＴＧＦαおよびＥＧＦは繊維芽細胞に対する強い活性を示す一方で、ＦＧＦは繊維芽細胞と共に上皮細胞に対してマイトジェン性であった。その上皮細胞特異性、就中ケラチン細胞感受性のために、この新規なマイトジェンは暫定的にケラチン細胞成長因子（ＫＧＦ）と称された。
【０１０３】
ＫＧＦがＤＮＡ合成を刺激するのみならず、持続した細胞成長を支持することを確立するために、完全に定義され且つこの成長因子が補充された血清フリーの培地中で成長し得るBALB／MK細胞の能力が明らかにされた。図７に示したように、この化学的に定義された培地において、ＫＧＦは、ＥＧＦの優れた代替え品として作用したが、インスリン（またはインスリン用成長因子Ｉ）の代替え品としては作用しなかった。従って、BALB／MK細胞の増殖に関して、ＫＧＦはＥＧＦ，ａＧＦＧ及びｂＧＦＧによって共有される主な信号伝達経路を通して作用するように思える。
【０１０４】
＜ミクロシーケンシングはＫＧＦの独特な
Ｎ- 末端アミノ酸配列を明らかにする＞
当該成長因子を更に特徴付けするために、略150 pmolのＣ４ 精製された材料をアミノ酸配列分析にかけた。2-13サイクルについて、曖昧でない次のような指定を伴う単一の配列が検出された：即ち、X-Asn-Asp-Met-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Thr-Asn-Val である。最初のポジションの指定には高いバックグラウンドノイズが含まれており、そのためにＸで示されている。
【０１０５】
FASTP プログラム（Ｉ−２４）を用いたコンピュータ調査によって、ＫＧＦのＮ末端アミノ酸配列はナショナル・バイオケミカル・リサーチ・ファウンデーション・データ・バンクの何れのタンパクとも顕著な相同性を示さないことが明らかになり、従ってこの成長因子の新規性が支持された。
【０１０６】
［考 察］
この実験セクションに記載された研究によって、上皮細胞に対して独特の特異性をもったヒト成長因子が同定された。本発明に従って、限外濾過、HSACおよびRP-HPLC または TSK分子篩クロマトグラフィーを用いることにより、この分子の物理的および生物学的性質の詳細な特徴付けを行うために充分な量が単離された。
【０１０７】
RP-HPLC から得られた活性画分中に、約28,000の分子量に対応する単一の銀着色バンドが検出され、該バンドの強度はこれら画分中のマイトジェン活性のレベルに比例していた。TSK クロマトグラフィーから得られた活性画分中には、RP-HPLC によって得られたものと区別できないバンドがみられた。この精製されたタンパクはナノモル以下の濃度で上皮細胞中でのＤＮＡ合成を刺激したが、繊維芽細胞または上皮細胞中においては、比肩し得る以上の如何なるチミジン取り込みをも誘導しなかった。この特徴的な標的細胞特異性は、精製分子から決定された単一の新規なＮ末端アミノ酸配列と相俟って、ＫＧＦが新規な成長因子であるとの結論を導く。
【０１０８】
化学的に定義された培地中において、当該精製された因子はインスリン様成長因子Ｉ／BALB/MK 細胞のインスリン成長要求を補足することができ、従って、ＥＧＦＧ，ＴＧＦα及びＧＦＧと共通の信号形質導入経路を通して作用するに違いない。更に、当該新規因子は、BALB／MK細胞におけるチミジン取込みの刺激において、公知の上皮細胞マイトジェンのどれよりも強い。予備的な証拠は、この因子がヒト・ケラチン細胞の二次培養の増殖をも支持できることを示している（データは示していない）。
【０１０９】
ＫＧＦの取扱いおよび保存は、その精製に際して問題である。これは、熱および酸に対して本来的に不安定性である外、凍結乾燥および透析に対しても不安定である。担体タンパク、ヘパリン、プロテアーゼ阻害剤、シリコン化管(siliconized tubes) 、または 4℃若しくは-20 ℃での保存を用いたにもかかわらず、HSAC後の24時間以内に活性は完全に喪失した。この段階でサンプルを濃縮することによってのみ、その活性が維持され得る。
【０１１０】
更に、乾燥および精製された因子を移送するためには強酸または湿潤剤を利用する必要があり、これは吸着され易くまたは不溶性であることに一致している。従って、活性保持のために、この精製された因子は高濃度溶液の形で-70 ℃に維持された。この場合、数か月は安定である。
【０１１１】
ＫＧＦのヘパリン結合能力は、in vivo で機能を有するこの因子の基本的な性質を示している。ヘパリン結合特性を有する成長因子には、ａＦＧＦ（Ｉ−２０〜Ｉ−２２）、ｂＦＧＦ（Ｉ−１９，Ｉ−２２）、顆粒細胞／マクロファージ・コロニー刺激因子およびインターロイキン３（Ｉ−２５）が含まれる。これらの夫々は、間質細胞によって産生される （Ｉ−２５〜Ｉ−２７）。これら因子は細胞外マトリックス中、または間質細胞表面を被覆するプロテオグリカン上に蓄積されるように思える。その保存、放出および特定の標的細胞との接触は、この相互作用によって調節されるものと仮定される（Ｉ−２５，Ｉ−２８）。上皮細胞増殖の間充織由来エフェクタも既に記載されているが（Ｉ−２９〜Ｉ−３１）、その同定はまだ明らかにされていない。そのヘパリン結合特性（ヒト胎児繊維芽間質細胞によって放出される）および上皮細胞屈性は、ＫＧＦに対して、正常な上皮細胞成長のこのようなパラクリン媒体に期待される全ての特性を与える。
【０１１２】
この新規な成長因子について決定された一部のアミノ酸配列は、そのコーディング配列の分子クローニングを可能にし、また後述の実験セクションIIに記載されたような、公知の成長因子ファミリーに対するその構造的関係の決定を可能にする。
【０１１３】
【参考文献Ｉ】
新規な上皮細胞特異性成長因子の
ｃＤＮＡ配列は、ＦＧファミリーの
新しいメンンバーを定義する
先に述べた実験セクションＩでの仕事によって、ケラチン細胞成長因子（ＫＧＦ）と称される新規なヘパリン結合性成長因子が定義された。これはケラチン細胞に対して特に活性であり、上皮細胞に対して特異的であるように思える。この第二の実験セクションでは、実験的に決定されたＮＨ２ 末端アミノ酸配列に基づき、合成オリゴムクレオチドをハイブリダイゼーション・プローブとして用いた、ＫＧＦをコードするｃＤＮＡの単離および特徴付けが説明される。ヌクレオチド配列分析によって、194-アミノ酸ポリペプチドをコードする582-bpの読み取り枠(open reading frame)が同定された。この194-アミノ酸ポリペプチドは、41％〜33％の範囲で、ヘパリン結合性の酸性および塩基性繊維芽細胞成長因子、並びに hsi及び int-2オンコジェンの関連生産物と一致した。該ＫＧＦ遺伝子のＲＮＡ転写は、胎児および成体起源の正常な繊維芽細胞中で発現されるが、上皮細胞、内皮細胞またはグリア細胞中では発現されない。従って、ＫＧＦは間充織によって正常に発現され、これは上皮細胞増殖の制御に役割を果していると思われる。
【０１１４】
［材料および方法］
＜ｃＤＮＡの単離＞
ＫＧＦの精製及びＮ末端配列については、先に既述した通りである（上記の実験セクションＩ、およびII−３参照）。結果に関して述べたデオキシオリゴヌクレオチドのプール （50 pmole）は、83モルのγ- ３２Ｐ-ATP（3000Ｃｉ／mmole ，Amersham社）および10単位のＴ4 ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、５′末端をラベルされた。ｃＤＮＡクローンを有する組換えファージは、ニトロセルロース・フィルター上にレプリカ載置され、20％ホルムアミド、10％硫酸デキストラン、10mMのTris-HCl(pH 7.5)、 8 X SSC、5X Denhardt's 及び50μｇ／mlの変性サーモン精子ＤＮＡの中において42℃で一晩、32Ｐ- ラベルされたデオキシオリゴヌクレオチドでハイブリダイズされた。フィルターを、0.5X SSC、0.1 ％ＳＤＳ中で50℃において洗浄し、Kodac X-Omt ARフィルムに対して露出した。
【０１１５】
＜ＤＮＡ配列＞
ＫＧＦ・ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、オーバラッピング制限フラグメントのジデオキシ鎖末端法（II−２６）によって決定され、ｐＵＣベクター（II２７）中にサブクローンされた。
【０１１６】
＜ＫＧＦ・ｃＤＮＡのバクテリア発現ベクターの構築＞
成熟した分泌型のポリペプチドをコードするＫＧＦ・ｃＤＮＡは、次のようにしてプラスミド発現ベクター pKK233-2 （II−３１）中のハイブリッド trkプロモータの制御下に置かれた。これを達成するために、成熟ＫＧＦ分子（即ち、そのシグナルペプチドを含まないもの）をコードする情報を含んだ特定長さのＫＧＦ・ｃＤＮＡが、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）技術を（II−３２）用いて増幅された。このフラグメントは、当該ベクターの二つの部位（即ち、Ｓ1 ヌクレアーゼ消化により平滑末端化されたＮcoI 部位とHindIII）との間に方向付けして挿入された。ＰＣＲ法によって製造されたＫＧＦ・ｃＤＮＡの末端は、次の通りであった：５′末端は平滑で、ATG コドンで始まり、成熟型ＫＧＦのアミノ末端残基（図II−１参照）である33番のcys 残基のための TGCコドンが続くき、そして全ＫＧＦコーディング配列が続く。停止コドンである TAAおよび直接これに続く四つの塩基TTGCはもまた、ｃＤＮＡの３′末端に含まれていた。ｃＤＮＡの３′末端の望ましい位置にＤＮＡ合成を指示するためにＰＣＲ法で用いられたプライマーには、増幅されたｃＤＮＡをベクターＤＮＡ中に挿入するためのHindIII部位が含まれていた。
【０１１７】
＜ＫＧＦおよびＫＧＦ関連ペプチドに対する抗体の製造＞
ヒト繊維芽細胞由来の完全かつ精製されたタンパクに対して、マウス内で、５回以上の皮下注射を用いることによりモノクーナル抗体が生産された。試験血液は、ヒト上皮細胞からの高度に精製されたＫＧＦを抗原に用い、固相（ELISA ）検定でスクリーニングされた。ハイブリドーマはルーチンの方法により製造され、またＫＧＦ関連抗体を検出するために、上澄み液はELISA 検定でスクリーニングされた。陽性クローンは通常の方法により連続的にサブクローン化され、また大量の抗体を製造するために、選択されたサブクローンがマウス中で腹水腫瘍として成長された。抗体は、標準的な技術 （例えばヒドロキシアパタイト又は免疫アフィニティー樹脂）を用いることにより精製された。
【０１１８】
合成ペプチドに対するポリクローナル抗体は、兎中において、標準的な方法を用いることにより次のようにして生成された。ポリペプチドは固相技術によって製造され、グルタルアルデヒドとの反応によってチログロブリンに結合された。連続的に皮下注射が行われ、試験血液はウエスタンブロト分析およびマイトジェネシス・バイオアッセイを含む他の方法並びにELISA によってスクリーニングされた。IgＧ免疫グロブリンは、固相化タンパクＧを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって単離された。
【０１１９】
ポリクローナル抗体は、ヒト繊維芽細胞から天然に分泌されたＫＧＦおよび E.coli 中で産生された組換えＫＧＦの両者に対して、以下のプロトコールを用いることにより、兎中において生成された：
i) 最初の注射および第一の追加免疫は、鼠径部のリンパ節に投与された。
【０１２０】
ii) その後の追加免疫は筋肉内へ行われた。
【０１２１】
試験血液のスクリーニングには、ウエスタンブロット分析およびマイトジェネシス・バイオアッセイ並びにELISA が含まれ、また合成ペプチドに対する抗体について上述したと同様にしてIgＧを精製した。
【０１２２】
［結 果］
この実験セクションの結果は、図８〜図１４に纏められている。これらの図に示したデータおよび／またはそれらに関する実験を簡単に説明すれば次の通りである。
【０１２３】
図８； ヒトＫＧＦ ｃＤＮＡクローンの模式的な表現である。配列決定に用いられる重複ｐＣＥＶ９クローン３２および４９は、未翻訳領域を線で記し、かつコード配列をボックスで示す完全な構造図の上部に示される。ハッチ領域はシグナルペプチドの配列を示し、白抜きの領域は成熟蛋白質を示す。選択された制限部位を示す。
【０１２４】
図９〜図１１； ＫＧＦ・ｃＤＮＡ塩基配列および予想されるアミノ酸配列である。塩基は右側に番号付けされており、アミノ酸は全体を通して番号付けされている。精製ＫＧＦ由来のＮ−末端ペプチド配列には下線を付してある。疎水性Ｎ−末端ドメインはイタリック体で示す。潜在的なアスパラギン結合グリコシレーション部位はオーバーライン表示されている。このＲＮＡの３′末端に近い異なるポリアデニール化部位、ＡＡＴＴＡＡおよびＡＡＴＡＣＡはボックスとして示す。
【０１２５】
図１２； ノーザンブロット分析によるＫＧＦ・ｍＲＮＡの同定である。レーンａおよびｃはポリ（Ａ）−選択Ｍ４２６ＲＮＡ、レーンｄは全細胞Ｍ４２６ＲＮＡを表わす。フィルターは、レーンａおよびｂがクローン３２（プローブＡ、図８）からの３２Ｐ−標識６９５ｂｐ・ＢａｍＨＩ／ＢｃｌＩ断片で、またレーンｃおよびｄがクローン４９（プローブＢ、図II−１Ａ）からの５４１ｂｐ・ＡｐａＩ／ＥｃｏＲＩ断片でハイブリダイズされている。
【０１２６】
図１３； 関連する分子のＦＧＦファミリーの位相的比較である。高い相同性を共有する２つのタンパクドメインを黒塗りのボックスで示す。線影をつけたボックスは、推定シグナルペプチド配列を示す。２つの保護されたシステイン残基（Ｃ）の位置を示す。
【０１２７】
図１４； 正常ヒト細胞株および組織におけるＫＧＦ・ｍＲＮＡのノーザンブロット分析、および上皮細胞に対する既知の活性を有する他の成長因子のｍＲＮＡ発現との比較である。全細胞ＲＮＡを、セシウム・トリフルオロ酢酸勾配遠心により単離した。ＲＮＡ１０μｇを変性し、１％ホルムアルデヒドゲル中で電気泳動した。穏やかなアルカリ変性（５０ｍＭ ＮａＯＨで３０分間）の後、１Ｍ酢酸アンモニウムをコンベクタント（ｃｏｎｖｅｃｔａｎｔ）としてＲＮＡをニトロセルロースフィルターに移した。フィルターは、ＫＧＦコード配列（Ａ）の５′末端からの６４７ｂｐ Ｅｃｏ ＲＩ断片を含有する３２Ｐ−標識ｃＤＮＡプローブもしくは他の成長因子ＤＮＡからの類似のプローブとハイブリダイズした。下記タイプのヒト細胞が用いられた。扁平上皮癌（Ａ２５３、Ａ３８８およびＡ４３１）；乳房の上皮細胞（Ｓ６およびＲ１）；Ａｄ１２−ＳＶ４０で不死化されたケラチン細胞；主要ヒトケラチン細胞；新生児包皮線維芽細胞、ＡＧ１５２３；成人皮膚線維芽細胞（５０１Ｔ）；および胚性肺線維芽細胞（ＷＩ−３８およびＭ４２６）。
【０１２８】
＜新規成長因子をコードするｃＤＮＡクローンの単離＞
ＫＧＦコーディング配列に対応したｃＤＮＡクローンを研究するために、９個のアミノ酸配列、即ち精製ＫＧＦのミクロシーケンシング（実験セクションＩ、および参考文献II−３参照）によって決定されたように、 Asn-Asp-Met-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Alaに基づいて、26塩基の長さをもったオリゴヌクレオチドの二つのプールが作成された。一方のオリゴヌクレオチドプールは、９アミノ酸のための 256の可能な全てのコーディング配列の混合物を含んでおり、他方はThr 及びPro のためのコドンの縮退第三位置(the degenarate third position) にイノシン残基を含んでいた。
【０１２９】
この後者のデザインは、プール中の可能なコーディング配列の数を16に減少させる。ｔＲＮＡアンチコドン中のイノシンは、Ａ、ＣまたはＵと水素結合を形成できる（II−４）。また、デオキシイノシンを含むオリゴヌクレオチドは、対応するｃＤＮＡと効率良くハイブリダイズすることが示されている（II−５）。
【０１３０】
ｃＤＮＡライブラリーは、成長因子の初期供給源であるヒト胎児肺繊維芽細胞系 M426（II−７）から抽出されたポリアデニル化ＲＮＡを用いて、ｃＤＮＡクローニングベクターであるｐCEV9中に構築された。３２Ｐ- ラベルされた26量体オリゴヌクレオチドを用いた該ライブラリー（9 ×10５ プラーク）のスクリーニングによって、オリゴヌクレオチド・プローブの両方のプールとハイブリダイズする88のプラークが同定された。
【０１３１】
＜選択されたｃＤＮＡクローンの特徴付け及びシーケンシング＞
分析された10個のプラーク精製クローンのうちの一つ （クローン49）は、3.5 kbのｃＤＮＡ挿入を有していた。一方、残りのクローンは1.8 kb〜2.1 kbに亘る挿入を有していた。
【０１３２】
小さいほうのクローンの分析によって、幾つかの共通の制限部位が明らかになった。小さいほうの代表的なクローン （クローン32とクローン49）のシーケンシングによって、それらが重複部分を有するｃＤＮＡであることが明らかになった（図８）。クローン49はメッセージのポリ（Ａ）テールにプライムされていたが、クローン32は、ＫＧＦ・ｍＲＮＡの３′非コード領域中のＡ- リッチな配列に対するオリゴ（ｄＴ）プライマーのハイブリダイゼーションによって、ライブラリーの構築の際に生じていた。
【０１３３】
＜ＫＧＦポリペプチドをコードする配列の説明＞
二つのｃＤＮＡ（クローン32及び49）のアラインメントによって、完全なＫＧＦコーディング配列を含む3.85 kb の連続配列が確立された（図９〜図１１）。開始コドンと思われるATG がヌクレオチド位置446 に位置しており、1030位置のTAA 停止コドンで終端する582 塩基対の読み取り枠が確立された。この読み取り枠は22,512の算出分子量を有する194-アミノ酸ポリペプチドをコードするであろう。
【０１３４】
ATG コドンに隣接する配列は、真核生物リボソームによる最適の開始（II−８）のためのコンセンサス配列として提案された配列の GCC(G/A)CCATGG には適合しないが、ATG コドンの３ヌクレオチド上流にＡが存在する。この位置におけるＡは、前記コンセンサス配列において最も高い確率で維持されているヌクレオチドである。同じ読み取り枠において、このATG コドンの85ヌクレオチド上流には、TAG 停止コドンが先行している。
【０１３５】
精製ＫＧＦの実験的に決定されたＮＨ２ 末端に対して相同性を有する実験的に決定された19アミノ酸配列は、提案された開始コドン下流の第32アミノ酸で始まる。予期された配列と実験的に決定されたアミノ酸配列とは完全に一致しており、曖昧さのないアサインメントが可能であった。
【０１３６】
ＫＧＦと公知のタンパクとの間の相同性を研究するために、リップマン及びパーソンのFASTP プログラムを用いて、ナショナル・バイオメディカル・リサーチ・ファウンデーション・データベースのコンピュータ調査を行った（II−９）。この研究によって、ＫＧＦについて予期された一次構造と、酸性および塩基性ＦＧＦ並びに関連hst およびint-2-にコードされたタンパクの一次構造との間に驚くべき関係が明らかになった。
【０１３７】
＜ヒト細胞におけるＫＧＦ遺伝子のｍＲＮＡ転写の発現＞
ヒト細胞内でのＫＧＦ・ｍＲＮＡの発現を確かめるための予備試験において、ＫＧＦコーディング配列の大部分に亘るプローブ（プローブＡ、図８）は、全M426ＲＮＡのノーザンブロット分析によって、単一の2.4kb 転写を検出した（図１２）。これは、コンポジットｃＤＮＡ配列の長さ（3.85kb）よりも遥かに短かった。
【０１３８】
しかしながら、ポリ（Ａ）- 選択された M426 ＲＮＡのスクリーニングに際しては、略５kbの追加の転写が検出された。更に、クローン49の翻訳されなかった領域、即ち３′〜クローン32の端までに由来するプローブ（プローブＢ、図８）は、より大きいメッセージに対してのみハイブリダイズした（図１２）。従って、ＫＧＦ遺伝子はＲＮＡを替えるようにして転写されるように思える。ＦＧＦファミリーの他の二つのメンバー、即ちｂＦＧＦ（II−２９）および int-2（II−３０）もまた複数のＲＮＡを発現し、その重要性は決定されるべく残されている。
【０１３９】
ＫＧＦの正常な機能的役割を研究するために、種々のヒト細胞系および組織におけるその発現が試験された。図１４に示すように、胎児、新生児および成人の上皮組織に由来する幾つかの繊維芽細胞系の夫々において、優勢な 2.4 kb ＫＧＦ転写が検出された。しかし、正常起源の上皮細胞系からは検出されなかった。また、該転写は、正常な成人の腎および胃腸管器官から抽出されたＲＮＡ中でも検出されたが、肺または脳からは検出されなかった。ＫＧＦ・ＲＮＡ発現が、上皮組織に比べて間質細胞中で驚くほど特異的であることは、この因子が、上皮細胞成長の間充織刺激において正常な機能を果たすことを示した。
【０１４０】
比較のために、上皮細胞に対する活性が知られている他の成長因子のｍＲＮＡについても、上記に挙げたと同じ組織内で分析した。分析された上皮細胞系および間質細胞系の中には、ａＦＧＦまたはｂＦＧＦ転写の発現に一致するパターンなかった（図１４）。該ＥＧＦ転写は、同じ細胞系の何れにおいても発現せず、また種々の組織のうち腎でのみ観察された。最後に、ＴＧＦαメッセージは何れの間質繊維芽細胞系でも検出されず、また上皮細胞系の夫々において種々のレベルで発現された。また、試験された組織のうち、腎において、低レベルで検出された（図１４）。
【０１４１】
図１４からは、ヒト胎児肺繊維芽細胞および皮膚成熟繊維芽細胞由来のＲＮＡ中には、単一の2.4 kb転写が存在している一方で、（B5/589）上皮細胞系および（HA83）グリア細胞系、或いはヒト伏在静脈上皮細胞の一次培養中には何等の転写も検出されなかったことが明らかである。
【０１４２】
＜ヘパリンによるＫＧＦマイトジェン活性の阻害＞
ヘパリンは、種々の培養中の標的細胞に対するａＦＧＦのマイトジェン活性を実質的に増大させ、またこれを熱による不活性化に対して安定化させることが示されている（II−２１，II−２２）。ｂＦＧＦに密に結合するにもかかわらず、ヘパリンは、そのマイトジェン活性に対して最小限の影響しかもたない。ＫＧＦのＦＧＦに対する関係の観点から、ＫＧＦマイトジェン活性に対するヘパリンの影響が調べられた。下記の表II−１に示したように、培地中にヘパリンが含まれているとき、ＫＧＦに応答したBALB／MKによるチミジン取り込みは16倍阻害された。対照的に、ａＦＧＦおよびｂＦＧＦの両者の活性は同一の処理によって増大した。
【０１４３】
【表３】
【０１４４】
上記のように、表II−１は、ヘパリンのＫＧＦマイトジェン活性に対する影響と他の成長因子に対する影響との比較を纏めて示しており、ＫＧＦに応答したBALB／MK細胞によるＤＮＡ中へのチミジン取り込みがヘパリンによって阻害される一方、これとは対照的に、ａＦＧＦおよびｂＦＧＦの活性に応答したときは何れの場合も同じ処理によって増大することを示している。
【０１４５】
＜抗ＫＧＦ抗体の製造＞
実験免疫学の分野で良く知られ、かつ上記の方法セクションに要約した標準的な方法論を用いて、ＫＧＦまたはＫＧＦ様ポリペプチドを認識する幾種類かの抗体が調製された。これらには次のものが含まれる：ヒト繊維芽細胞由来の完全かつ精製されたタンパクに対して、マウス内で生成されたモノクローナル抗体；ＫＧＦ・ｃＤＮＡから予測されるアミノ酸配列に基づいた配列を有する合成ペプチドに対して、兎内で生成されたポリクローナル抗体；ヒト繊維芽細胞から天然に分泌されたＫＧＦおよび E.coli 中で産生された組換えＫＧＦ（次のセクション参照）の両方に対して、兎内で生成されたポリクローナル抗体。
【０１４６】
三つの異なったハイブリドーマから得られたモノクローナル抗体が精製された。この三つの全てが、固相（ELISA ）検定において、天然に生じたＫＧＦと同様に組換え体を認識した。何れも変性条件下でＫＧＦと交差反応せず（ウエスタンブロット）、またBALB／MKバイオアッセイにおいてＫＧＦのマイトジェン活性を中和しない。
【０１４７】
アミノ酸配列 NDMTPEQMATNVRを有する合成ペプチドを用いて、ポリクローナル抗体が生成された。このアミノ酸配列は、ＫＧＦの32番から44番までの残基（図II−１参照）にたいして、ｃＤＮＡによって45位置に実際にコードされる asp残基の代りにＲ（arg ）残基を加えたものに対応する。天然ＫＧＦポリペプチドにおいて、このasp 残基は多分グリコシル化されており、従って、当該ポリペプチドから直接に得られたアミノ酸配列データ中では argであるように思える（以下の考察の項を参照のこと）。この合成ペプチドで生成されたポリクローナル抗体は、ELISA およびウエスタンブロット分析において、少なくとも10 ng の微量のタンパクを検出できるレベルの感度で、天然に生じたＫＧＦおよび組換えＫＧＦの両方を認識する。しかし、これら抗体はBALB/MK におけるＫＧＦのマイトジェン活性を中和しない。
【０１４８】
完全な中性ＫＧＦタンパクに対するポリクローナル抗血清は、ELISA およびウエスタンブロット検定の両者において、ＫＧＦを認識する。また、BALB／MKバイオアッセイにおいて、このような抗体はＫＧＦのマイトジェン活性を阻害するように思える。
【０１４９】
＜E.coliでのＫＧＦ・ｃＤＮＡの発現＞
E.coli中でポリペプチドを製造するために、ＫＧＦ・ｃＤＮＡは、そのコーディング配列をプラスミド pKK233-2 （II−３１）内でハイブリッドtrk プロモータ（trp およびlac プロモータの要素からなる）の制御下に置くことによって発現された。これを達成するために、成熟ＫＧＦ分子（即ち、そのシグナルペプチドを伴わないもの）をコードする情報を含んだ特定の長さのＫＧＦ・ｃＤＮＡが、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション技術（II−３２）を用いて増幅された。このフラグメントは、標準的組換えＤＮＡの方法論を用いて、ベクターの二つの部位、即ち、S1ヌクレアーゼ消化によって平滑化されたNcoI部位とHindIII 部位との間に方向付けして挿入された。選択された組換え体は、ATG 開始コドンがtrk プロモータ調節要素と正しく並んでいることを確かめるために、そのｃＤＮＡ５′末端でシーケンスされた。
【０１５０】
小スケール法によって、幾つかの組換え体がタンパク製造について試験された。要約すると、クローンは中間指数相（ＯＤ５９５ -0.5）まで成長され、１mMのイソプロピルβ- Ｄ- チオガラクトピラノース（IPTG）で90分間処理され、ウエスタンブロットのために、細胞抽出物がＳＤＳ- ポリアクリルアミドゲルにかけられた。試験された全ての組換え体が、アミノ末端ＫＧＦペプチドに対して生成した抗体によって認識されるタンパクを合成した。IPTGから最も大きい誘導を示した一つの組換え体が選択された。50μｇ／mlのアンピシリン及び12.5μｇ／mlのテトラサイクリンを含むＮＺＹブロス中で、１リットルのバクテリアがＯＤ５９５ -0.5まで成長され、IPTGで90分間処理された。遠心により細胞を回収し、50mM燐酸ナトリウム（pH 7.3）、0.2M NaCl 中に再懸濁させ、音波破砕により溶解させた。遠心分離により細胞破片(cell debris) を除去し、溶解物を直接ヘパリン- セファロース・アフィニティーカラムにかけた。
【０１５１】
ウエスタンブロット分析およびケラチン細胞でのマイトジェン活性によって測定されたように、組換えＫＧＦは 0.6〜0.6 M NaCl中で溶出する。Mono-S(FPLC)カラム（ファルマシア）を用いて引続き行った HSAC の精製により、ＳＤＳ- ポリアクリルアミドゲル及び銀着色を用いた電気泳動分析により判断して、純度90％以上と推定されるＫＧＦ調製物が得られた。
【０１５２】
組換えＫＧＦは、BALB／MKケラチン細胞へのチミジンの取り込みを効率良く刺激したが、 NIH／3T3 繊維芽細胞に対しては最低限の活性しか示さなかった。標準的なケラチン細胞バイオアッセイにおけるBALB／MK細胞の半上限刺激は、２〜５ng／mlの濃度で達成されたが、これに比較して、M426細胞から精製されたＫＧＦについては10〜15ng／mlの濃度であった。
【０１５３】
＜ＫＧＦ配列およびａＦＧＦ配列を含むキメラの構築＞
上記に示した研究によって、ＫＧＦは二つの異なった特徴を有することが示された。これらの特徴は、他の多機能ポリペプチドのコーディング配列中に生じることが良く知られているように、ポリペプチドの異なった部分またはドメインによってコードされるものであろう。この可能性を試験するために、ａＦＧＦのＣ末端コアに接合されたＫＧＦのＮＨ２ 末端配列をコードするキメラＤＮＡセグメントを、以下のように構築した。ＫＧＦ・ｃＤＮＡの５′末端での Sau3AI 制限酵素部位（GATC）が切断され、ａＦＧＦ・ｃＤＮＡにおける相同部位に結合された。上記の Sau3AI 制限酵素部位は、残基78及び79（夫々 arg 及びile ；図II−１）のためのコドン内にある。また、上記ａＦＧＦ・ｃＤＮＡの相同部位は、アミノ酸39(arg) 及び40のためのコドン内にある。このキメラＤＮＡの３′および５′末端が、分泌型のポリペプチドをコードするＫＧＦ・ｃＤＮＡの挿入に用いたと同じ方法（上記の方法を参照のこと）によって、プラスミド pKK233-2 のベクターＤＮＡに結合された。
【０１５４】
該キメラを有するベクタを用いて組換え E.coli を構築し、また成熟ＫＧＦについて上記で説明したようにして発現試験を行ったとき、ＫＧＦおよびａＦＧＦの両方の性質を有する新規生成物が産生された。このペプチドは、ヘパリン- セファロース・クロマトグラフィーによって富化され、またＫＧＦと同様、ケラチン細胞に対して標的細胞選択性を有するが、繊維芽細胞（NIH/3T3 ）に対しては最小限の活性しかもたないことが分かった。しかし、このキメラのマイトジェン活性はヘパリンによる阻害に対して感受性を欠いており、この特徴はＫＧＦよりもａＦＧＦに類似している。事実、ケラチン細胞に対するマイトジェン活性は、ａＦＧＦの場合と同様に、ヘパリンによって実際に増大した。こうして、本発明に従えば、細胞標的特異性およびヘパリン感受性の原因であるペプチドドメインはＫＧＦ中において明確に区別され、また容易に分離可能である。
【０１５５】
［考 察」
このセクションで説明した実験は、本発明の幾つかの主要な態様を例示している。これらには、ＫＧＦをコードするｃＤＮＡの単離、このようなｃＤＮＡの組換え細胞中での発現、ＫＧＦと反応する種々の抗体の製造、並びにＫＧＦおよびａＦＧＦの両者のアミノ酸配列および関連機能を具備した新規成長因子をコードするキメラｃＤＮＡの構築および発現が含まれる。また、これら態様に関連した以下のポイントは、本発明の理解を高めるために留意されるべきであろう。ＫＧＦ・ｃＤＮＡから予測される配列は、ヒト繊維芽細胞から分泌された精製ＫＧＦから決定されたアミノ酸配列と一致した。更に、この配列は、直接のアミノ酸配列によっては決定的なアミノ酸の特定ができない位置について、有力な説明を与えた。残基32および46は、ｃＤＮＡ配列からシステインであると予測される。また、非修飾システイン残基の加水分解された誘導体は、エドマン分解に従っては検出できない。また、予測されたＫＧＦアミノ酸配列は、残基45〜47に一つの可能なＮ- リンクしたグリコシル化部位（ Asn-X-Ser／Thr ）を含んでいた。もし Asn 45 がグリコシル化されると、それはここで用いたアミノ酸シーケンシング法によっては検出されないであろう。事実、ＮａＤｏｄＳＯ４ ／ＰＡＧＥ上において、ＫＧＦは精製されたタンパクについて予測されるよりも高い分子量で、広いバンドとして移動する。これはグリコシル化によって説明され得る。
【０１５６】
ＦＧＦは、広い標的細胞特異性をもったヘパリン結合性マイトジェンである（II−１０）。hst 遺伝子はヒト胃癌（II−１１）、隣接正常胃組織（II−１２）および Kaposi 肉種（II−１３）から、標準 NHI／3T3 感染アッセイによりトランスフォーミング遺伝子として同定された。int-2 遺伝子の産物は、正常にはマウスの胚形成の最中に（II−１４）、また異常にはマウス乳癌ウイルスのプロウイルス的組込み(proviral integration)の後に（II−１５）発現される。
【０１５７】
ＫＧＦは同定された繊維芽細胞ファミリーの６番目のメンバーである（II−２８）。繊維芽細胞に対する活性が欠如しているからＦＧＦ−６の名称は適切ではないように思えるが、ＦＧＦファミリーに対する構造的関連を示すために、この成長因子について当該命名を用いてもよい。従来特徴付けされた全ての成長因子は、標的として上皮細胞を排除するか、或いは感受性標的細胞のメンバーの中に上皮細胞をんでいるかの何れかであるから、ＫＧＦマイトジェン活性の上皮細胞に対する高度の特異的性質、特にケラチン細胞の感受性は独特のものである。
【０１５８】
今日までの研究において、ＫＧＦ転写の発現は上皮組織由来の間質細胞に特異的であるように思え、これはその正常な上皮細胞増殖における機能を示唆する。ＫＧＦ・ｃＤＮＡクローンの入手可能性によって、この成長因子の異常発現が、上皮細胞の形成異常および／または新形成に特徴付けられる臨床状態に関連するか否かを決定することが可能になる。更に、この新規な因子を組換え技術で大量に製造できることによって、上皮細胞の特異的成長が特に重要であるような状況における、その臨床適用の試験が可能になるに違いない。
【０１５９】
ＫＧＦ配列と、ＦＧＦファミリーの五つの他のタンパクとを並べて比較することによって、二つの主な領域の相同性が明らかになる。この領域は、予測されたＫＧＦ配列におけるアミノ酸65〜156 および 162〜186 に亘っており、両者は該ファミリーの異なったメンバーで長さが異なる短い非相同的なアミノ酸鎖で分離されている（図１３）。int-2 の場合、この配列の長さは17残基であるが、hst では二つの相同領域が隣接している。ＫＧＦにおいて、この介在配列は５個のアミノ酸からなっている。
【０１６０】
この整列された領域において、ＫＧＦアミノ酸配列の約44％が int-2（マウス）と同一であり、39％がｂＦＧＦ（ヒト）と同一であり、37％がａＦＧＦ（ヒト）と同一であり、33％が hst（ヒト）と同一である。この同じ領域において、６種類の全てのタンパクは残基の19％が同一であり、保存的置換(conservative substitution) が加納であり、28％の相同性を示した。
【０１６１】
図１３に示したように、これら関連タンパクのアミノ末端は非相同性であり、長さも種々である。ＫＧＦおよびhst の一次翻訳生成物は、シグナル配列として働くと思われる疎水性Ｎ末端領域を含んでいる（II−１６）。これは、当該Ｎ末端ドメインが成熟ＫＧＦ分子中に存在しない事実によって更に支持される。これとは対照的に、ＦＧＦは一見してシグナルペプチドを伴わないで合成される（II−１０）。int-2 タンパクは、不規則なＮ末端疎水性残基の領域を含んでいるが（II−１７）、このタンパクが分泌されるかどうかは分かっていない。更に、他のファミリーメンバーに比較すると、int-2 タンパクは長いＣ末端延長部を含んでいる。
【０１６２】
精製されたＫＧＦは５個のシステイン残基を含んでおり、そのうちの二つはＦＧＦ関連タンパクのファミリーに亘って保持される（図１３）。また、ＫＧＦ配列を通して５個の塩基性残基対が存在する。この同じパターンは、他のＦＧＦファミリーメンバーにも見出だされており、それらとヘパリンとの相互作用に含まれるかもしれない（II−１８）。また、二塩基部位もタンパク分解プロセッシングの共通の標的であり、このようなプロセッシングによって、幾つかのＫＧＦ調製物に見られる微細不均一性(microheterogeneity)を説明できるであろう。
【０１６３】
ＫＧＦ・ｃＤＮＡ配列はその全長に亘ってＡＴリッチであるが、特に３′非翻訳領域においてそうである。該領域でのＡＴ含量は70％で、推定コーディング配列における60％および５′非翻訳領域における63％と比較して明らかに高かった。３′非翻訳領域には多数の ATTTA配列を含まれてた。これは、一時的に発現された不安定なＲＮＡの選択的分解に含まれることが提案されている。古典的な AATAAA ポリアデニル化シグナルは存在しないが、二つの変形配列、即ち AATTAA および AATACA （II−２０）が、ｃＤＮＡの３′末端におけるポリ（Ａ）配列の夫々24ヌクレオチド及び19ヌクレオチド上流に検出された。
【０１６４】
酸性ＦＧＦに対するヘパリンの影響は、該成長因子の活性コンホメーションの安定化、或いは酸性ＦＧＦ及びそのレセプタとの三元コンプレックス形成の何れかに起因することが示唆されている（II−２１，II−２２）。もしそうであるならば、ヘパリンはＫＧＦの遊離分子として活性でないコンホメーションを安定化し、またはそのレセプタと効果的に相互作用できない密なコンプレックスを形成するのであろう。
【０１６５】
そのヘパリン結合能はＫＧＦとＦＧＦとの構造的類似性を反映しているのに対して、これら関連マイトジェンの間の標的細胞特異性は顕著に相違している。ＦＧＦは、胎児の中胚葉および神経外胚葉を起源とする最後まで分化していない細胞の分割を誘導する。繊維芽細胞および血管内皮組織に加えて、培養された中胚葉由来の標的細胞には、筋芽細胞、軟骨細胞および骨芽細胞が含まれる（II−２３）。ＦＧＦはまた、グリア星状細胞および神経芽細胞に対してもマイトジェン的である（II−２４）。また、Kaposo肉種から単離されたオンコジェンの産物（これはhst と同一である）も、NIH/3T3 及び毛細血管内皮細胞の増殖を刺激する（II−２５）。今日まで、ＫＧＦ誘導マイトジェネシスは上皮細胞においてのみ観察されており、繊維芽細胞または内皮細胞においては検出可能な何等の活性もないことが示されている（既述の実験セクションＩおよびII−３参照）。従って、ＫＧＦはＦＧＦとは異なった細胞表面レセプタを介して作用すると思われる。
【０１６６】
ＫＧＦと他のＦＧＦ関連タンパクとの間には、顕著なＮ末端相同性は全く存在しない。従って、ＫＧＦのＮ末端ドメインがその独特の標的細胞特異性を説明するに十分なものであるかどうかを決定するために、ＫＧＦと基本型ＦＧＦとの間のキメラ分子の構築が企画された。このような第一の組換えポリペプチド配列に関する結果は、ＫＧＦのこのＮ末端ドメインは本質的にケラチン細胞に対する細胞選択性をコードし、ＫＧＦのヘパリンに対する感受性は、ａＦＧＦの配列によって置換されたＣ末端コア領域の何処かにコードされることを示した。この新規ＫＧＦ様成長因子は、通常使用される抗凝固剤であるヘパリンの存在下で上皮細胞に特異的な成長因子の投与が望ましいような臨床的適用において有利であろう。また、キメラに関する追加の研究は、Ｃ末端コアの何れの特異的ドメインが、それらの生物学的活性に対するヘパリンの異なった効果に寄与するかに関する洞察をも提供するに違いない。
【０１６７】
背景技術および本発明の説明を補完する目的で、この明細書中で今まで指摘した刊行物、特許および特許出願は、ここに参照として明細書中に組み込まれる。
【０１６８】
明確化および理解の目的で、先の発明を幾らか詳細に説明した。また、本発明の範囲を逸脱することなく、その形式および詳細において種々の組み合わせを行い得ることは明らかであろう。
【０１６９】
【参考文献ＩＩ】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ヒト胎児繊維芽細胞Ｍ426 由来の馴らし培地のヘパリン- セファロース・アフィニティーカラムクロマトグラフィーの結果を描いたもので、マウスケラチン細胞（BALB／MK）のためのマイトジェン活性の90％以上が 0.6M ＮａＣｌで溶出されたことを示している。
【図２】図２は、吸着マトリックスを具備したHPLCを用いて、ヒト繊維芽細胞からのマイトジェンを更に精製した結果のうち、BALB／MKマイトジェン活性の逆相（Ｃ４ ）HPLC上のプロファイルを示している。
【図３】図３は、図２に示されたＣ４ クロマトグラフィーから選択された画分の電気泳動分析（ＮａＤｏｄＳＯ４ ／ＰＡＧＥ）を示しており、ピークＨＰＬＣ画分が銀染色ゲル上の単一バンドを含むことを示している。
【図４】図４は、図３で分析された分画によってトリガーされたBALB／MK細胞内におけるＤＮＡ合成の棒グラフであり、活性プロファイルを横切るタンパクバンドの強度と良く相関した相対的マイトジェン活性を示している。
【図５】図５は、生理的ｐＨにおける（TSK G3000SW GlasPac ）カラムランでの分子篩クロマトグラフィーを用いた、RP-HPLC に代わる別の精製ステップを示しており、ここではBALB／MKバイオアッセイにおけるマイトジェン活性の主要ピークが現れている。
【図６】図６は、ＴＳＫ精製マイトジェンに応答したBALB／MKのＤＮＡ合成と、他の成長因子に応答したBALB／MKのＤＮＡ合成との間の比較を示している。
【図７】図７は、成長因子の異なった組合わせに応答した、化学的に限定された培地中におけるBALB／MK細胞の成長の比較を示している。
【図８】図８は、ヒトＫＧＦ・ｃＤＮＡクローンの概略的模式図を示している。
【図９】図９は、ＫＧＦ・ｃＤＮＡヌクレオチオ及び予想されるアミノ酸配列を示している。
【図１０】図１０は、ＫＧＦ・ｃＤＮＡヌクレオチオ及び予想されるアミノ酸配列を示している。
【図１１】図１１は、ＫＧＦ・ｃＤＮＡヌクレオチオ及び予想されるアミノ酸配列を示している。
【図１２】図１２は、ＫＧＦ遺伝子から転写されたＲＮＡのノーザンブロット分析による同定を示している。
【図１３】図１３は、高い相同性を有する二つのタンパクドメイン、推定シグナル配列および二つの保存されたシステイン残基を強調して、ＫＧＦを含むＦＧＦファミリー関連分子間のトポロジ−比較を示している。
【図１４】図１４は、選択されたヒト正常細胞系および組織におけるＫＧＦ関連ｍＲＮＡの（ノーザンブトット）分析を示す電気泳動写真である。
Claims (44)
- 単離されたケラチン細胞成長因子（ＫＧＦ）タンパクであって、該ＫＧＦタンパクは下記配列の切片を具備しており、該切片はＢＡＬＢ／ＭＫ細胞に対するマイトジェン活性を刺激するＫＧＦタンパク。
ＣＮＤＭＴＰＥＱＭＡＴＮＶＮＣＳ
ＳＰＥＲＨＴＲＳＹＤＹＭＥＧＧＤＩＲＶＲＲＬＦ
ＣＲＴＱＷＹＬＲＩＤＫＲＧＫＶＫＧＴＱＥＭＫＮ
ＮＹＮＩＭＥＩＲＴＶＡＶＧＩＶＡＩＫＧＶＥＳＥＦ
ＹＬＡＭＮＫＥＧＫＬＹＡＫＫＥＣＮＥＤＣＮＦＫ
ＥＬＩＬＥＮＨＹＮＴＹＡＳＡＫＷＴＨＮＧＧＥＭ
ＦＶＡＬＮＱＫＧＩＰＶＲＧＫＫＴＫＫＥＱＫＴＡ
ＨＦＬＰＭＡＩＴ - 単離されたケラチン細胞成長因子（ＫＧＦ）タンパクであって、該ＫＧＦタンパクは下記配列の切片を具備しており、該切片は上皮細胞に対するマイトジェン活性を刺激するＫＧＦタンパク。
ＣＮＤＭＴＰＥＱＭＡＴＮＶＮＣＳ
ＳＰＥＲＨＴＲＳＹＤＹＭＥＧＧＤＩＲＶＲＲＬＦ
ＣＲＴＱＷＹＬＲＩＤＫＲＧＫＶＫＧＴＱＥＭＫＮ
ＮＹＮＩＭＥＩＲＴＶＡＶＧＩＶＡＩＫＧＶＥＳＥＦ
ＹＬＡＭＮＫＥＧＫＬＹＡＫＫＥＣＮＥＤＣＮＦＫ
ＥＬＩＬＥＮＨＹＮＴＹＡＳＡＫＷＴＨＮＧＧＥＭ
ＦＶＡＬＮＱＫＧＩＰＶＲＧＫＫＴＫＫＥＱＫＴＡ
ＨＦＬＰＭＡＩＴ - 単離されたケラチン細胞成長因子（ＫＧＦ）タンパクであって、該ＫＧＦタンパクは下記配列の切片を具備しており、該切片は、上記配列または上記配列の切片を有する蛋白質に対して特異的な抗体を製造するのに有用であるＫＧＦタンパク。
ＣＮＤＭＴＰＥＱＭＡＴＮＶＮＣＳ
ＳＰＥＲＨＴＲＳＹＤＹＭＥＧＧＤＩＲＶＲＲＬＦ
ＣＲＴＱＷＹＬＲＩＤＫＲＧＫＶＫＧＴＱＥＭＫＮ
ＮＹＮＩＭＥＩＲＴＶＡＶＧＩＶＡＩＫＧＶＥＳＥＦ
ＹＬＡＭＮＫＥＧＫＬＹＡＫＫＥＣＮＥＤＣＮＦＫ
ＥＬＩＬＥＮＨＹＮＴＹＡＳＡＫＷＴＨＮＧＧＥＭ
ＦＶＡＬＮＱＫＧＩＰＶＲＧＫＫＴＫＫＥＱＫＴＡ
ＨＦＬＰＭＡＩＴ - 単離されたケラチン細胞成長因子（ＫＧＦ）タンパクであって：
下記配列のアミノ酸３２〜１９４を含んだ配列を有するタンパクをコードするＤＮＡを、宿主細胞において発現させ、
ＭＨＫＷＩＬＴＷＩＬＰＴＬＬＹＲＳＣＦＨＩＩＣＬ
ＶＧＴＩＳＬＡＣＮＤＭＴＰＥＱＭＡＴＮＶＮＣＳ
ＳＰＥＲＨＴＲＳＹＤＹＭＥＧＧＤＩＲＶＲＲＬＦ
ＣＲＴＱＷＹＬＲＩＤＫＲＧＫＶＫＧＴＱＥＭＫＮ
ＮＹＮＩＭＥＩＲＴＶＡＶＧＩＶＡＩＫＧＶＥＳＥＦ
ＹＬＡＭＮＫＥＧＫＬＹＡＫＫＥＣＮＥＤＣＮＦＫ
ＥＬＩＬＥＮＨＹＮＴＹＡＳＡＫＷＴＨＮＧＧＥＭ
ＦＶＡＬＮＱＫＧＩＰＶＲＧＫＫＴＫＫＥＱＫＴＡ
ＨＦＬＰＭＡＩＴ
前記ＫＧＦタンパクを単離することによって製造されたＫＧＦタンパク。 - 請求項４に記載のＫＧＦタンパクであって、前記細胞はバクテリア細胞、真菌細胞、哺乳類細胞および昆虫細胞からなる群から選択されるＫＧＦタンパク。
- 請求項４に記載のＫＧＦタンパクであって、前記ＤＮＡは下記の配列を有する蛋白質をコードするＫＧＦタンパク。
ＭＨＫＷＩＬＴＷＩＬＰＴＬＬＹＲＳＣＦＨＩＩＣＬ
ＶＧＴＩＳＬＡＣＮＤＭＴＰＥＱＭＡＴＮＶＮＣＳ
ＳＰＥＲＨＴＲＳＹＤＹＭＥＧＧＤＩＲＶＲＲＬＦ
ＣＲＴＱＷＹＬＲＩＤＫＲＧＫＶＫＧＴＱＥＭＫＮ
ＮＹＮＩＭＥＩＲＴＶＡＶＧＩＶＡＩＫＧＶＥＳＥＦ
ＹＬＡＭＮＫＥＧＫＬＹＡＫＫＥＣＮＥＤＣＮＦＫ
ＥＬＩＬＥＮＨＹＮＴＹＡＳＡＫＷＴＨＮＧＧＥＭ
ＦＶＡＬＮＱＫＧＩＰＶＲＧＫＫＴＫＫＥＱＫＴＡ
ＨＦＬＰＭＡＩＴ - 請求項４に記載のＫＧＦタンパクであって、前記ＤＮＡは誘導性プロモータに作動可能に連結されているＫＧＦタンパク。
- 請求項１〜７の何れか１項に記載のＫＧＦタンパクであって、該ＫＧＦタンパクは更に、アミノ末端にＭｅｔを有するＫＧＦタンパク
- 請求項１〜８の何れか１項に記載のＫＧＦタンパクであって、該ＫＧＦタンパクはヘパリン結合性を有するＫＧＦタンパク。
- 請求項１〜９の何れか１項に記載のＫＧＦタンパクであって、１ｎＭの該ポリペプチドがＢＡＬＢ／ＭＫ細胞を刺激する能力を有するＫＧＦタンパク。
- 請求項１〜１０の何れか１項に記載のＫＧＦタンパクであって、ＢＡＬＢ／ＭＫケラチン細胞の最大刺激を示す前記タンパクの量は、ＮＩＨ／３Ｔ３繊維芽細胞においてはバックグラウンドの１倍未満の刺激を示し、ここでの１倍は未処理細胞で観察されるバックグラウンドＤＮＡ合成として定義されるＫＧＦタンパク。
- 請求項１〜１０の何れか１項に記載のＫＧＦタンパクであって、５ｎＭの前記タンパクは、ＮＩＨ／３Ｔ３繊維芽細胞においてはバックグラウンドの１倍未満の刺激を示すＫＧＦタンパク。
- 請求項１〜１０の何れか１項に記載のＫＧＦタンパクであって、ＢＡＬＢ／ＭＫケラチン細胞の最大刺激を示す前記タンパクの量は、ａＦＧＦまたはｂＦＧＦによって刺激されたＮＩＨ／３Ｔ３繊維芽細胞の最大チミジン取り込みの１／５０未満の取り込みを生じるＫＧＦタンパク。
- 請求項１〜１０の何れか１項に記載のＫＧＦタンパクであって、ＢＡＬＢ／ＭＫケラチン細胞の最大刺激を示す前記タンパクの量は、ＥＧＦまたはＴＧＦ−αによって刺激されたＮＩＨ／３Ｔ３繊維芽細胞の最大チミジン取り込みの１／１０未満の取り込みを生じるＫＧＦタンパク。
- 請求項１〜１０の何れか１項に記載のＫＧＦタンパクであって、０．１〜３ナノモルの濃度範囲内で得られる前記タンパクによるＢＡＬＢ／ＭＫケラチン細胞の最大刺激は、同じ濃度範囲内の塩基性ＦＧＦで得られる最大刺激の少なくとも２倍であるＫＧＦタンパク。
- 請求項１〜１５の何れか１項に記載のＫＧＦタンパクであって、該ＫＧＦタンパクはケラチン細胞に対して選択的マイトジェン活性を有するＫＧＦタンパク。
- 請求項１〜１６の何れか１項に記載のＫＧＦタンパクであって、該ＫＧＦタンパクは上皮細胞に対して選択的マイトジェン活性を有し、繊維芽細胞に対してはマイトジェン活性をもたないＫＧＦタンパク。
- 請求項１〜１７の何れか１項に記載のＫＧＦタンパクであって、該ＫＧＦタンパクは上皮細胞に対して選択的マイトジェン活性を有し、内皮細胞に対してはマイトジェン活性をもたないＫＧＦタンパク。
- 請求項１７または１８に記載のＫＧＦタンパクであって、前記内皮細胞はケラチン細胞であるＫＧＦタンパク。
- 請求項１７に記載のＫＧＦタンパクであって、前記上皮細胞はＢＡＬＢ／ＭＫ細胞であり、前記繊維芽細胞はＮＩＨ／３Ｔ３であるＫＧＦタンパク。
- 請求項１〜２０の何れか１項に記載のＫＧＦタンパクであって、タンパク１ｍｇ当り少なくとも約3.4×１０4単位の比活性を有し、ここで１単位の活性は、ＢＡＬＢ／ＭＫケラチン細胞において可能な最大ＤＮＡ合成刺激の１／２を生じる量として定義されるＫＧＦタンパク。
- 請求項項１〜２１の何れか１項に記載のＫＧＦタンパクであって、グリコシル化されたＫＧＦタンパク。
- 請求項１〜２１の何れか１項に記載のＫＧＦタンパクであって、グリコシル化されていないＫＧＦタンパク。
- 請求項１〜２３の何れか１項に記載の少なくとも一つのＫＧＦタンパクをコードするＤＮＡ分子。
- 請求項１〜２０の何れか１項に記載の少なくとも一つのＫＧＦタンパクをコードするＤＮＡ配列を含むベクター。
- 請求項１〜２３の何れか１項に記載の少なくとも一つのＫＧＦタンパクをコードする組換えＤＮＡ配列を含む宿主細胞。
- 請求項１〜２３の何れか１項に記載のＫＧＦタンパクを製造する方法であって、請求項２６の宿主細胞を、前記タンパクが産生される条件下において培地中で培養することを包含する方法。
- 請求項２７に記載の方法であって、前記宿主細胞はバクテリア細胞、真菌細胞、哺乳類細胞および昆虫細胞からなる群から選択される方法。
- 活性成分として、下記（１）〜（３）からなる群から選ばれる少なくとも一つのタンパクを含有する、ケラチン細胞に対する選択的マイトジェン活性化剤組成物：
（１）グリコシル化された又はグリコシル化されない単離されたケラチン細胞成長因子（ＫＧＦ）タンパクであって：
（ａ）下記のアミノ酸配列；
（ｂ）Ｎ末端の３１アミノ酸を含まない下記のアミノ酸配列の一部；および
（ｃ）下記のアミノ酸配列に対して１もしくは数個のアミノ酸の付加、欠失または置換を含むアミノ酸配列；
ＭＨＫＷＩＬＴＷＩＬＰＴＬＬＹＲＳＣＦＨＩＩＣＬ
ＶＧＴＩＳＬＡＣＮＤＭＴＰＥＱＭＡＴＮＶＮＣＳ
ＳＰＥＲＨＴＲＳＹＤＹＭＥＧＧＤＩＲＶＲＲＬＦ
ＣＲＴＱＷＹＬＲＩＤＫＲＧＫＶＫＧＴＱＥＭＫＮ
ＮＹＮＩＭＥＩＲＴＶＡＶＧＩＶＡＩＫＧＶＥＳＥＦ
ＹＬＡＭＮＫＥＧＫＬＹＡＫＫＥＣＮＥＤＣＮＦＫ
ＥＬＩＬＥＮＨＹＮＴＹＡＳＡＫＷＴＨＮＧＧＥＭ
ＦＶＡＬＮＱＫＧＩＰＶＲＧＫＫＴＫＫＥＱＫＴＡ
ＨＦＬＰＭＡＩＴ
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、
前記タンパクは、各細胞タイプにおける3Ｈチミジン最大取り込みのパーセントで測定したときに、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ａＦＧＦ、およびｂＦＧＦと比較して、ＮＩＨ／３Ｔ３繊維芽細胞の刺激よりも大きいＢＡＬＢ／ＭＫケラチン細胞の刺激を生じるケラチン細胞成長因子；
（２）請求項１〜２３の何れか1項に記載のタンパク；
（３）上皮起源の細胞に対する選択的なマイトジェン活性を有する、グリコシル化された又はグリコシル化されない単離されたケラチン細胞成長因子（ＫＧＦ）タンパクであって、該ＫＧＦタンパクは、
（ａ）下記に示すＤＮＡ配列を含むｃＤＮＡ（なお、この３葉に亘る配列は、ａ−ｂ線、ｃ−ｄ線で横に繋げて読まれるべきものである）；および
からなる群から選択されるＤＮＡ分子によってコードされるＫＧＦタンパク。 - 請求項２９に記載の組成物であって、前記タンパクは上皮細胞に対する選択的マイトジェン活性を有するが、繊維芽細胞に対するマイトジェン活性をもたない組成物。
- 請求項２９に記載の組成物であって、前記タンパクは上皮細胞に対する選択的マイトジェン活性を有するが、内皮細胞に対するマイトジェン活性をもたない組成物。
- 請求項３０または３１に記載の組成物であって、前記上皮細胞がケラチン細胞である組成物。
- 請求項３０に記載の組成物であって、前記上皮細胞はＢＡＬＢ／ＭＫであり、前記繊維芽細胞はＮＩＨ／３Ｔ３である組成物。
- 請求項２９に記載の組成物であって、ＢＡＬＢ／ＭＫケラチン細胞の最大刺激を示す前記タンパクの量は、ＮＩＨ／３Ｔ３繊維芽細胞においてはバックグラウンドの１倍未満の刺激を示し、ここでの１倍は未処理細胞で観察されるバックグラウンドＤＮＡ合成として定義される組成物。
- 請求項３４に記載の組成物であって、５ｎＭの前記タンパクは、ＮＩＨ／３Ｔ３繊維芽細胞においてはバックグラウンドの１倍未満の刺激を示す組成物。
- 請求項２９、３４または３５の何れか１項に記載の組成物であって、ＢＡＬＢ／ＭＫケラチン細胞の最大刺激を示す前記タンパクの量は、ａＦＧＦまたはｂＦＧＦによって刺激されたＮＩＨ／３Ｔ３繊維芽細胞の最大チミジン取り込みの１／５０未満の取り込みを生じる組成物。
- 請求項２９、３４または３５の何れか１項に記載の組成物であって、ＢＡＬＢ／ＭＫケラチン細胞の最大刺激を示す前記タンパクの量は、ＥＧＦまたはＴＧＦ−αによって刺激されたＮＩＨ／３Ｔ３繊維芽細胞の最大チミジン取り込みの１／１０未満の取り込みを生じる組成物。
- 請求項２９に記載の組成物であって、０．１〜３ナノモルの濃度範囲内で得られる前記タンパクによるＢＡＬＢ／ＭＫケラチン細胞の最大刺激は、同じ濃度範囲内の塩基性ＦＧＦで得られる最大刺激の少なくとも２倍である組成物。
- 請求項２９、３４、３５または３８の何れか１項に記載の組成物であって、少なくとも約３．４×１０４単位／ｍｇタンパクの比活性を有し、ここでの１単位の活性は、ＢＡＬＢ／ＭＫケラチン細胞におけるＤＮＡ合成の最大可能刺激の半分を生じる量として定義される組成物。
- 請求項２９〜３９の何れか１項に記載の組成物であって、前記ＫＧＦタンパクがグリコシル化されている組成物。
- 請求項２９〜３９の何れか１項に記載の組成物であって、前記ＫＧＦタンパクがグリコシル化されていない組成物。
- 請求項２９に記載の組成物であって、前記ＫＧＦタンパクは下記のアミノ酸配列を有する組成物。
ＭＨＫＷＩＬＴＷＩＬＰＴＬＬＹＲＳＣＦＨＩＩＣＬ
ＶＧＴＩＳＬＡＣＮＤＭＴＰＥＱＭＡＴＮＶＮＣＳ
ＳＰＥＲＨＴＲＳＹＤＹＭＥＧＧＤＩＲＶＲＲＬＦ
ＣＲＴＱＷＹＬＲＩＤＫＲＧＫＶＫＧＴＱＥＭＫＮ
ＮＹＮＩＭＥＩＲＴＶＡＶＧＩＶＡＩＫＧＶＥＳＥＦ
ＹＬＡＭＮＫＥＧＫＬＹＡＫＫＥＣＮＥＤＣＮＦＫ
ＥＬＩＬＥＮＨＹＮＴＹＡＳＡＫＷＴＨＮＧＧＥＭ
ＦＶＡＬＮＱＫＧＩＰＶＲＧＫＫＴＫＫＥＱＫＴＡ
ＨＦＬＰＭＡＩＴ - 請求項２９に記載の組成物であって、前記ＫＧＦタンパクは下記のアミノ酸配列を有する組成物。
ＣＮＤＭＴＰＥＱＭＡＴＮＶＮＣＳ
ＳＰＥＲＨＴＲＳＹＤＹＭＥＧＧＤＩＲＶＲＲＬＦ
ＣＲＴＱＷＹＬＲＩＤＫＲＧＫＶＫＧＴＱＥＭＫＮ
ＮＹＮＩＭＥＩＲＴＶＡＶＧＩＶＡＩＫＧＶＥＳＥＦ
ＹＬＡＭＮＫＥＧＫＬＹＡＫＫＥＣＮＥＤＣＮＦＫ
ＥＬＩＬＥＮＨＹＮＴＹＡＳＡＫＷＴＨＮＧＧＥＭ
ＦＶＡＬＮＱＫＧＩＰＶＲＧＫＫＴＫＫＥＱＫＴＡ
ＨＦＬＰＭＡＩＴ - 請求項２９に記載の組成物であって、前記ＫＧＦタンパクは下記のアミノ酸配列に対して１もしくは数個のアミノ酸の付加、欠失または置換を含むアミノ酸配列を有し、請求項２１〜２５の何れか１項に記載のマイトジェン活性を保持しているＫＧＦタンパク。
ＭＨＫＷＩＬＴＷＩＬＰＴＬＬＹＲＳＣＦＨＩＩＣＬ
ＶＧＴＩＳＬＡＣＮＤＭＴＰＥＱＭＡＴＮＶＮＣＳ
ＳＰＥＲＨＴＲＳＹＤＹＭＥＧＧＤＩＲＶＲＲＬＦ
ＣＲＴＱＷＹＬＲＩＤＫＲＧＫＶＫＧＴＱＥＭＫＮ
ＮＹＮＩＭＥＩＲＴＶＡＶＧＩＶＡＩＫＧＶＥＳＥＦ
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ＦＶＡＬＮＱＫＧＩＰＶＲＧＫＫＴＫＫＥＱＫＴＡ
ＨＦＬＰＭＡＩＴ
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