JP3088983B2 - 上皮細胞に特異的な成長因子をコードするｄｎａ - Google Patents

上皮細胞に特異的な成長因子をコードするｄｎａ

Info

Publication number
JP3088983B2
JP3088983B2 JP09290175A JP29017597A JP3088983B2 JP 3088983 B2 JP3088983 B2 JP 3088983B2 JP 09290175 A JP09290175 A JP 09290175A JP 29017597 A JP29017597 A JP 29017597A JP 3088983 B2 JP3088983 B2 JP 3088983B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
kgf
cells
dna
sequence
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP09290175A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH10243800A (ja
Inventor
ジェフェリー・エス・ルビン
ポール・ダブリュ・フィンチ
スチュアート・エー・アーロンソン
Original Assignee
ジェフェリー・エス・ルビン
ポール・ダブリュ・フィンチ
スチュアート・エー・アーロンソン
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=23175833&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP3088983(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by ジェフェリー・エス・ルビン, ポール・ダブリュ・フィンチ, スチュアート・エー・アーロンソン filed Critical ジェフェリー・エス・ルビン
Publication of JPH10243800A publication Critical patent/JPH10243800A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3088983B2 publication Critical patent/JP3088983B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • C07K14/501—Fibroblast growth factor [FGF] acidic FGF [aFGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は成長因子に関し、特に公
知の繊維芽細胞成長因子（FGFs）を含む因子ファミリー
に類似したポリペプチド成長因子の単離に関する。ま
た、本発明は新規な成長因子をコードするメッセンジャ
ーＲＮＡ（mRNA）からの、相補型ＤＮＡ（cDNA）セグメ
ントの構築に関する。更に、本発明はこのようなＤＮＡ
セグメントの生成物を組換え細胞によって合成すること
に関しする。また、この成長因子をコードするＤＮＡの
同定およびクローニングによって可能になった、ある種
の他の新規な生産物の製造および使用に関する。
【０００２】なお、本明細書を通して下記の略号が用い
られる。 ａＦＧＦ； 酸性繊維芽細胞成長因子 ｂＦＧＦ； 塩基性繊維芽細胞成長因子 ＥＧＦ ； 上皮成長因子 ＨＳＡＣ； ヘパリン- セファロース・アフィニティー クロマトグラフィー ｋｂ ； キロ塩基 ｋＤａ ； キロダルトン ＫＧＦ ； ケラチン細胞成長因子 ＮａＤｏｄＳＯ4 ／ＰＡＧＥ ； ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）／ポリアクリルアミド・ ゲル電気泳動 ＲＰ- ＨＰＬＣ ； 逆相高速液体クロマトグラフィー ＴＧＦα；トランスフォーミング成長因子
【０００３】
【発明の背景】成長因子は細胞間情報伝達の重要な媒体
である。これら大きな影響力を有する分子は、一般に一
つの細胞型から放出され、他の細胞型の増殖に影響する
ように作用する（後述する実験セクションＩ中の参照文
献Ｉ−１を参照のこと）。成長因子における興味は、そ
れが新形成中に含まれていることが示されたこと（後述
の実験セクションII中の参照文献II−２）によって高ま
っている。シミアン肉種ウイルス(simian sarcoma viru
s)のＶ-sisトランスフォーミング遺伝子は、血小板由来
成長因子のＢ鎖に対して相同性を有するタンパクをコー
ドする（Ｉ−１，Ｉ−２）。更に、多数のオンコジェン
が、成長因子レセプタをコードする遺伝子の相同性を有
している。こうして、成長因子およびそのレセプタ- 媒
介された信号形質導入経路に関する理解が進むことによ
って、正常細胞および腫瘍細胞の両方の成長メカニズム
に対する洞察が容易に提供される。
【０００４】結合組織細胞に影響する成長因子の公知の
ファミリーの一つには、酸性繊維芽細胞成長因子（aFG
F）、塩基性繊維芽細胞成長因子（bFGF）、並びにｈst
及びint-2 オンコジェンが含まれる。
【０００５】更に、以下のものを含む幾つかの成長因子
はヘパリン結合特性を有している：即ち、ａＦＧＦ（Ｉ
−２０，Ｉ−２１）；ｂＦＧＦ（Ｉ−１９，Ｉ−２
０）；顆粒細胞／マクロファージ・コロニー刺激因子
（Ｉ−１）；およびインターロイキン３（Ｉ−１）であ
る。これら夫々のポリペプチド因子はストローマル細胞
(stromal cells) によって産生される。このような因子
は、細胞外マトリックス中またはストローマル細胞の表
面を被覆するプロテオグリカン上に蓄積されるようであ
る（Ｉ−１，Ｉ−２５）。それらの蓄積、放出および特
定の標的細胞との接触は、この相互作用によって調節さ
れるものと仮定されている（Ｉ−２５，Ｉ−２８）。
【０００６】しかしながら、ヒト腫瘍の大部分は上皮細
胞から誘導されることが広く認識されている。間充織組
織から誘導される上皮細胞増殖のエフェクターは知られ
ているが（Ｉ−１，Ｉ−２，Ｉ−３）、それらの分子同
定および構造は未だ解明されていない。
【０００７】上皮細胞に影響を及ぼすこのような間充織
成長因子に関する知識不足の観点から、上皮細胞増殖の
調節メカニズムに関する改善された知識及び分析を提供
する方法、検定試薬(composition) 組成物およびバイオ
アッセイが必要であること、並びに究極的にはそれらの
中に含まれる因子に基づく新規な診断及び治療が必要で
あることが明らかである。
【０００８】本発明はこのような必要性を満たし、また
他の方法では製造され得ず、且つ上皮細胞増殖プロセス
に関係すると思われる間充織起源タンパク因子を製造す
る手段を開発するために、タンパクの単離法および組換
えＤＮＡ技術の適用を企画した。また、本発明はこれら
上皮細胞成長プロセスに関係する因子の分子メカニズム
の適用を企画した。
【０００９】
【発明の概要】本発明はタンパクの単離および組換えＤ
ＮＡ技術の開発に関し、その中には、上皮細胞に影響を
与え且つ他のペプチド因子の混入がない新規な成長因子
タンパクの製造が含まれる。また、新規なＤＮＡセグメ
ントおよびバイオアッセイの方法も含まれる。
【００１０】特に、本発明は酸性繊維芽細胞成長因子
（aFGF）、塩基性繊維芽細胞成長因子（bFGF）、並びに
ｈst及びint-2 オンコジェンの関連生成物を含む公知の
成長因子ファミリーの構造的および／または機能的特徴
を有する新規なタンパクに関する。このＦＧＦポリペプ
チドファミリーの新メンバーは、ＦＧＦ類のヘパリン結
合特性を保持しているが、独特の標的細胞特異性を有す
るに至っている。この成長因子は上皮細胞に特異的で、
しかもケラチン細胞に対して特に活性であるように思え
る。従って、この新規な因子は「ケラチン細胞成長因子
（ＫＧＦ）」と称する。ＫＧＦは繊維芽細胞に対する活
性が欠如しているにもかかわらず、見出だされたＦＧＦ
ポリポプチドファミリーの６番目のメンバーであるた
め、ＫＧＦはＦＧＦ−６とも称される。
【００１１】従って、一部において、本発明は精製され
たＫＧＦまたはＫＧＦ様タンパク、並びにこれらタンパ
クの製造方法に関する。このような精製因子は、天然に
これらタンパクを分泌するヒト細胞を培養し、本発明に
従う単離方法を実施することによって製造され得る。こ
れらタンパクは、例えばＫＧＦまたはＫＧＦ様ポリペプ
チドをコードするＤＮＡセグメントの単離を導く生化学
的または生物学的研究に用いることができる。
【００１２】また、本発明はＫＧＦまたはＫＧＦ様タン
パクをコードするこのようなＤＮＡセグメントに関す
る。主要な態様において、本発明は以下に挙げる群から
なるＫＧＦ関連生成物をコードするＤＮＡセグメントに
関する：ヒト胎児肺繊維芽細胞系Ｍ426 から抽出された
ポリアデニル化ＲＮＡ由来の、ヒトｃＤＮＡクローン32
または42；これらクローンの組換え体または突然変異
体；および上記ヒトＤＮＡセグメントの何れかにハイブ
リダイズさせることによって検出され得る関連ＤＮＡセ
グメントであって、ＫＧＦ様タンパクまたはその一部を
コードするもの。
【００１３】本発明の一態様の実施において、本発明の
ＤＮＡセグメントは適切な宿主細胞の中で発現され得、
これによってＫＧＦまたはＫＧＦ様タンパクを製造す
る。本発明はまた、本発明のＤＮＡセグメントのセンス
・ストランドの転写の結果として産生されたｍＲＮＡに
関する。
【００１４】他の態様において、本発明はベクターおよ
び本発明のＤＮＡを具備した組換えＤＮＡ分子に関す
る。これらの組換分子は、ＫＧＦ・ｃＤＮＡおよび以下
の何れかのベクターＤＮＡを具備した分子によって例示
される：即ち、バクテリオファージλクローニングベク
ター（λｐＣＥＶ９によって例示される）；ＤＮＡ配列
プラスミドベクター（例えば、ｐＵＣ変種）；バクテリ
ア遺伝子発現ベクター（例えばｐＫＫ233-2 ）；または
哺乳類遺伝子発現ベクター（ｐＭＭＴのようなもの）で
ある。
【００１５】更に別の態様において、本発明は、本発明
のＤＮＡで形質転換された細胞、好ましくは哺乳類細胞
を包含する。更に、本発明は、本発明のＤＮＡで形質転
換された昆虫細胞、酵母細胞、並びに Escherichia col
i 及び B.subtilis のようなバクテリア細胞を含む細胞
を包含する。本発明のこの側面における他の態様に従え
ば、上記形質転換ＤＮＡは細胞内で発現され得、これに
より細胞内において、該ＤＮＡによってコードされるＫ
ＧＦまたはＫＧＦ様タンパクを増大させる。
【００１６】そのｃＤＮＡ配列から予測される一次ＫＧ
Ｆ翻訳生成物には、分泌のためのシグナル配列として働
き、且つ成熟ＫＧＦ分子には存在しないＮ末端疎水性領
域が含まれる。本発明の遺伝子発現に係る側面での最も
好ましい態様においては、本発明のＤＮＡによって形質
転換された細胞は、該ＤＮＡによってコードされるタン
パクを、ヒト胎児肺繊維芽細胞によって分泌される形態
（先端を切断された形）で分泌する。
【００１７】更に、本発明は本発明のＤＮＡの発現によ
って、或いは本発明のＲＮＡの翻訳によって産生される
ＫＧＦまたはＫＧＦ様タンパクを意図している。好まし
くは、これらのタンパクは分泌された形（即ち、明瞭な
シグナル配列が欠如したもの）であろう。これらのタン
パク因子は機能的研究に用いることができ、また定性的
及び定量的レセプター結合アッセイのような更なる構造
的および機能的分析のために精製することができる。
【００１８】更に、組換え技術でこの新規な成長因子を
大量に製造できることは、上皮細胞の成長の特異的刺激
が特に重要な状況において、その臨床適用の試験を可能
にするであろう。従って、本発明は例えば火傷の傷の治
療または移植された角膜組織の刺激を含むかかる症状の
治療に用いるための、ＫＧＦまたはＫＧＦ様ポリペプチ
ドを含有した調剤組成物を包含する。
【００１９】本発明のこの態様に従えば、新規なＫＧＦ
様タンパクは、本発明の「未修飾の」ＤＮＡ及びＲＮＡ
によるタンパク生産物、または修飾された若しくは遺伝
子工学的に加工されたタンパク生産物であろう。ＤＮＡ
配列中における工学的変異の結果、修飾されたＫＧＦ様
タンパクは、天然に存在する対応の「天然型の」タンパ
クと比較して、アミノ酸配列中に一以上の相違を有する
であろう。本発明におけるこの側面に従えば、該修飾さ
れたＫＧＦ様タンパクには、ＫＧＦのアミノ酸配列およ
びＦＧＦペプチドファミリーの少なくとも一つの他のメ
ンバーのアミノ酸配列を具備した「キメラ」分子が含ま
れるであろう。
【００２０】結局、同様の性質を有する他のペプチド因
子に関する類似の成功した研究の結果からすれば、この
ようなキメラＫＧＦ様ポリペプチドの開発によって、臨
床目的のＫＧＦ様ペプチドの優れた第二世代の形態が導
かれると思われる。これら修飾されたＫＧＦ様生産物
は、例えばより小さく、より安定、より強力、および／
または生産がより容易もしくは低コストであり得る。
【００２１】本発明は更に、本発明のＤＮＡセグメント
関連遺伝子から産生された、ｍＲＮＡのヒト細胞中での
発現およびタンパクを測定するための新規なバイオアッ
セイ法を包含する。このような態様の一つに従えば、本
発明のＤＮＡは、関連ｍＲＮＡ誘導の定常状態レベルま
たは速度論を測定するためのプローブとして用い得る。
ＫＧＦ関連ｃＤＮＡクローンの入手が可能になることに
よって、この成長因子の異常発現が、形成異常および新
形成（例えば乾癬または悪性もしくは良性の上皮腫瘍）
を含む、上皮細胞の過剰成長に特徴付けられる臨床症状
中に含まれるか否かを決定することが可能になる。
【００２２】本発明はまた、本発明のＤＮＡセグメント
によってコードされるペプチドに対して製造される新規
な抗体をも意図している。本発明のこの態様では、該抗
体はその起源においてモノクローナルまたはポリクロー
ナルであり、天然のＫＧＦ関連ポリペプチド、組換ＫＧ
Ｆ関連ポリペプチド、または化学合成によるＫＧＦ関連
ポリペプチドを用いて生成される。
【００２３】本発明の抗体は、ＫＧＦまたはこのような
ペプチドを含むＫＧＦ様タンパクに対して、好ましくは
該タンパクがその天然の（生物学的に活性な）形態であ
るときに、特異的に結合する。これらの抗体はＫＧＦの
検出もしくは精製に用いることができ、或いはＫＧＦも
しくはＫＧＦ様タンパク因子の検出もしくは精製のため
に用いることができる。本発明のこの側面における最も
好ましい態様においては、該抗体はＫＧＦの成長促進活
性を中和し、これによってメカニズム研究を可能にする
と共に、最終的にはＫＧＦの過剰レベルを含む臨床症状
の治療を可能にするであろう。
【００２４】〔個々の実施例の説明〕本発明は、一部
は、精製されたＫＧＦまたはＫＧＦ様タンパクと、これ
らタンパクの調製方法に関する。本発明のこの側面にお
ける主要な態様は、約28 kd の見掛けの分子量によって
特徴付けられる均質ＫＧＦに関する。この見掛けの分子
量は、ＮａＤｏｄＳＯ4 ／ＰＡＧＥ中でのマイグレーシ
ョン、逆相高速液体クロマトグラフィー上での単一バン
ドとしての移動、および少なくとも約 3.4×１０4 q 位
／mg、好ましくは少なくとも約 3.2×１０5 単位／mgの
比活性に基づいている。ここで、１単位の活性は、以下
に概説する標準的なアッセイ条件下において、所定の上
皮細胞（ケラチン細胞）中での可能な最大のＤＮＡ合成
刺激の半分の刺激を生じるような量として定義される。
【００２５】上皮細胞型に特異的な新規な成長因子を同
定するために、このような因子を検出するためのインデ
ィケータ細胞として、BALB／MK（Ｉ−６）と称されるク
ローンBALB／ｃマウスケラチン細胞系を用いた。これら
細胞は、血清を含む培地中においてさえ、その成長を外
来の上皮細胞マイトジェン源に依存している。これら細
胞のための化学的に定義された培地の開発によって、BA
LB／MKの増殖に必要な二つの主要なマイトジェン経路を
示すことが可能になっている。一つはインスリン様の成
長因子Ｉ（または高濃度のインスリン）を含み、他方は
表皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因
子α（ＴＧＦα）、酸性繊維芽細胞成長因子（ａＦＧ
Ｆ）または塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）によ
って満足される（Ｉ−７）。
【００２６】原型上皮細胞系としてBALB／MKを、またこ
れに対する繊維芽細胞として NIH／3T3 を夫々用い、新
規上皮細胞特異性マイトジェンについて、種々のヒト細
胞系からの馴らし培地のアッセイを行った。これら本発
明のバイオアッセイによって、ヒト胎児肺繊維芽細胞系
から放出されたこのような新規成長因子の一つ（ここで
はケラチン細胞成長因子（ＫＧＦ）という）を均質に精
製することが可能になった。
【００２７】簡単に説明すると、標準条件下でのＫＧＦ
様活性のバイオアッセイは、以下のステップを具備して
いる： (i) マウスケラチン細胞（BALB／MK細胞）を集密するま
で培養成長させ、次いで血清フリーの培地中で24-72 時
間維持する； (ii)試験サンプルの添加に続き、酸沈殿可能なＤＮＡ中
への 3Ｈ−チミジンの取り込みによって、ＤＮＡの合成
刺激を測定する。
【００２８】マイトジェン成長因子の標的細胞特異性を
測定するために、ＤＮＡの合成刺激（試験サンプルを添
加しないときのチミジン取り込みのバックグラウンドに
対する合成刺激の比で表わしたもの）を、同じアッセイ
条件下においてケラチン細胞以外の細胞で観察された類
似の刺激と比較すればよい。このような比較において、
ＫＧＦマイトジェン活性は、繊維芽細胞に対するのとは
反対にケラチン細胞に対する顕著な特異性（少なくとも
約500 倍の刺激）を示す。また、他の典型的な上皮細胞
型に対するよりもケラチン細胞に対してより大きな活性
を示し、これは上記の場合より小さいが（少なくとも約
50倍）、重要なものである（より詳しいデータについて
は後述の表Ｉ−２を、またバイオアッセイ標準条件の詳
細については実験セクションＩの材料および方法を参照
のこと）。
【００２９】本発明に従って、細胞の培養およびマイト
ジェン活性の単離を含むＫＧＦの製造方法を用いること
によって、この分子の物理的および生物学的性質を詳細
に特徴付けるために十分な量が単離される。なお、この
方法は限外濾過、ヘパリン-セファロース・アフィニテ
ィーカラムクロマトグラフィー （HSAC）、並びに吸着
逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC ）または分
子篩HPLC（TSK-HPLC）を具備している。
【００３０】要約すると、Ｍ426 ヒト胎児繊維芽細胞
（Ｉ−８）のような産生細胞からＫＧＦを製造する方法
は、例えば以下のステップを具備している： (i) 血清含有培地から血清フリーの培地まで循環される
単層培養を用いた馴らし培地の調製と、その血清フリー
の産物を使用するまで-70 ℃で貯蔵すること； (ii)中間での緩衝液による稀釈（低分子量物質の除去を
容易にするため）を伴った幾つかの連続ステップで、１
０ kDaのカットオフ分子量を有する膜を用いた限外濾過
により濃縮し、続いて任意に-70 ℃で保存すること； (iii) ＮａＣｌ濃度を徐々に増大させた溶出液を用いて
行う、ポリマー支持体（例えばセファロース）に結合さ
れたヘパリン上でのアフィニティークロマトグラフィ
ー； (iv)１０ kDaのカットオフ分子量をもった小スケール限
外濾過装置（例えばアミコン社から入手可能な Centric
on-10 ミクロ濃縮器）で、少なくとも10〜12倍に濃縮
し、-70 ℃で保存すること； 精製プロセスの次のステップは、下記のステップ(v) ま
たはステップ(vi)の何れかを具備している。 (v) 有機溶媒系での、先のHSACで得られた活性画分（0.
6 M NaClプール）の逆相HPLC；または (Vi)生理学的ｐＨの緩衝水溶液中（例えば、Tris-HCl、
pH 6.8/0.5M NaCl）において、分子篩HPLC（例えばＬＫ
Ｂから入手可能なTSK-G3000 SWガラスパックカラム）を
行ない、続いて-70 ℃で保存する。
【００３１】銀- 染色ＮａＤｏｄＳＯ4 ／ＰＡＧＥ（デ
ータは省略）から判断すると、上記ＴＳＫステップ(vi)
で調製された試料はRP-HPLCrで得られたものと殆ど同じ
純度である；しかし、ＴＳＫによると遥かに良好な活性
回収が得られる（後述の表Ｉ−１）。更に、TSK-精製さ
れたものは、RP-HPLC で精製されたものよりも高い比活
性を有している。上記 TSKプロセスで調製されたＫＧＦ
は、ナノモル以下の濃度で上皮細胞中のＤＮＡ合成を刺
激した。しかし、同程度もしくはより高濃度（５mM）に
おいて、繊維芽細胞または上皮細胞のＤＮＡ中へのチミ
ジン取り込みは全く誘導しなかった。該活性はRP-HPLC
ステップで用いられる酸、熱および溶媒に敏感であった
（感受性および製造法の詳細については、実験セクショ
ンＩを参照のこと）。
【００３２】当該技術分野で公知の標準的方法論を用い
て、精製ＫＧＦのアミノ末端から2-13位について、曖昧
さのないアミノ酸配列を以下のように決定した：Asn-As
p-Met-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Thr-Asn-Val （実験セ
クションＩ参照）。
【００３３】また、本発明にはＫＧＦおよびＫＧＦ様ポ
リペプチドをコードするＤＮＡセグメントが含まれる。
本発明のＤＮＡは以下に挙げるＤＮＡによって例示され
る：ヒト胎児肺繊維芽細胞系Ｍ426 から抽出したポリア
デニル化ＲＮＡから誘導されたヒトｃＤＮＡクローン32
及び49；これらクローンの組換え体または突然変異体；
これらＤＮＡセグメントに対してハイブリダイズするこ
とによって検出され得る関連ＤＮＡセグメント。
【００３４】実験セクションIIに記載したように、ＫＧ
Ｆアミノ酸配列の既知の部分に対応するｃＤＮＡクロー
ンを探査するために、Asn-Asp-Met-Thr-Pro-Glu-Gln-Me
t-Ala の９アミノ酸配列をコードする可能な全てのヌク
レオチド配列に基づいて、オリゴヌクレオチドプローブ
の二つのプールを作成した。ヒト胎児肺繊維芽細胞系Ｍ
426 から抽出された一次成長因子源であるポリアデニル
化ＲＮＡを用い、ｃＤＮＡライブラリーをｃＤＮＡクロ
ーニングベクター（λｐＣＥＶ９）中に構築した。32Ｐ
でラベルしたオリゴヌクレオチドを用いた該ライブラリ
ー（９×１０5プラーク）のスクリーニングによって、
両方のプローブにハイブリダイズする８８個のプラーク
が同定された。
【００３５】分析されプラーク精製された１０個のクロ
ーンのうち、一つのクローン（クローン49という）は3.
5 kbのｃＤＮＡ挿入を有していたが、他のクローンは1.
8 kb〜2.1 kbに亘る挿入を有していた。小さい方のクロ
ーンの分析によって、幾つかの共通の制限酵素部位が明
らかになり、また代表的な小クローン（クローン32およ
びクローン49）の配列によって、それらのｃＤＮＡが重
なっていることが示された（図８）。この二つのｃＤＮ
Ａの配列によって、完全なＫＧＦをコードする配列を含
む 3.85 kbの連続配列が確立された。全長に亘る合成Ｋ
ＧＦｃＤＮＡの配列についての、センス・ストランドの
ＤＮＡヌクレオチド配列、およびコードされる一次タン
パクの予想配列を図９〜図１１に示した。
【００３６】これらＤＮＡ、ｃＤＮＡクローン32，49
は、完全なＫＧＦをコードする配列を具備したこれらセ
グメントの組換え形と同様に、本発明の最も好ましいＤ
ＮＡ類である。
【００３７】他の種々のタンパクにおけるこのような配
列との類似性に基づくと、このｃＤＮＡ配列から、一次
ＫＧＦおよび hst翻訳生成物はシグナル配列として作用
する疎水性Ｎ末端領域を含んでいることが明らかであ
る。従って、このＮ末端ドメインは、ヒト胎児繊維芽細
胞によって分泌される精製された成熟ＫＧＦ分子中には
存在しない。
【００３８】更に、ＫＧＦは、予想ＫＧＦ中のアミノ酸
配列65-156及び162-189 の二つの主要な相同領域を、Ｆ
ＧＦファミリーの他の全てのメンバーと共有する。これ
らは、異なるファミリーメンバーにおいて、短く且つ種
々の長さの非相同アミノ酸配列によって分離されてい
る。精製された形のＫＧＦの配列には五つのシステイン
残基が含まれ、その二つはＦＧＦ関連タンパクファミリ
ーに共通して保持される。塩基性残基の五つの対は、Ｋ
ＧＦ配列の全てに亘って現れる。これと同じパターン
は、他のＦＧＦファミリー中にも認められる。
【００３９】ハイブリダイゼーション法（例えば、ヒト
ゲノムＤＮＡのサザンブロット分析）において本発明の
ＤＮＡおよびＲＮＡ、特に最も好ましくは上記に列挙し
たＤＮＡを用いることにより、過度の実験を行うことな
く、ゲノムｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして
本発明の範囲に入る他のＫＧＦ様ＤＮＡを見出だすこと
が可能であることが、当業者には明らかである。更に、
本発明のＤＮＡをこのように用いることによって、制限
酵素長さの多形性（RFLPs ）のようなＫＧＦ遺伝子、並
びにこの遺伝子または他の近隣遺伝子を含む遺伝病に関
連した遺伝子マーカーを同定し得る。
【００４０】また、本発明にはＫＧＦ・ＤＮＡの修飾型
も含まれる。本発明のこの側面における主要な態様に従
えば、このような修飾ＤＮＡは、ＫＧＦおよび他のＧＦ
Ｇペプチドファミリーの少なくとも一つのアミノ酸配列
セグメントを含むＫＧＦ様タンパクをコードする。こう
して、例えばＫＧＦの分泌型と他のＦＧＦ関連タンパク
の類似位置との間には何等顕著なＮ末端相同性がないか
ら、新規な構造的及び機能的性質を有するポリペプチド
は、ＦＧＦファミリーにおける他のポリペプチドの異な
ったＮ末端セグメントをコードするＤＮＡセグメント
を、その通常のＮＨ2 - 末端配列の代りにＫＧＦ・ＤＮ
Ａにグラフトすることにより生成され得る。
【００４１】このような修飾ＤＮＡによるポリペプチド
キメラは、ＫＧＦ・ＮＨ2 - 末端ドメインが、その独特
の標的細胞特異性を説明するに十分であるか否かを決定
するために有用である。また、キメラの研究は、どのド
メインがその生物学的活性に対するヘパリンの異なった
影響に寄与するかに関する洞察を提供するに違いない。
【００４２】実際、この研究法の有用性は、成功した分
泌型ＫＧＦの加工および発現の成功によって既に確かめ
られている。この分泌型ＫＧＦにおいて、ＮＨ2 末端か
ら約40アミノ酸（図II−１で番号３２を付した成熟型Ｋ
ＧＦのアミノ末端 cys残基で始まり、ＫＧＦ残基７８の
argで終わる）は、ａＦＧＦのＣＯ3 末端コアの約140
アミノ酸（残基39の argで始まり、ａＦＧＦコーディン
グ配列のＣ末端に続く）に連結される。このキメラ生成
物はＫＧＦのようにケラチン細胞に対する細胞選択性を
有するが、ヘパリンに対する感受性に欠け、この特徴は
ＫＧＦよりもむしろａＦＧＦの特徴に類似する。この新
規なＫＧＦ様成長因子は、抗凝固剤として通常用いられ
るヘパリンの存在下に、上皮細胞特異性の成長因子の投
与が望まれる臨床適用において利点を有するであろう。
このキメラ分子の更に詳細な構成および該ポリペプチド
の性質は、実験セクションIIで説明される。
【００４３】本発明の他のＤＮＡには、ＫＧＦ・ｃＤＮ
Ａ及び下記に例示するの何れかのベクターＤＮＡを含む
組換ＤＮＡ分子が含まれる：バクテリオファージλクロ
ーニングベクター（λpCEV9 ）；ＤＮＡ配列プラスミド
ベクター（pUC 変種）；バクテリア発現ベクター（pKK2
33-2）；または哺乳類発現ベクター（pMMT/neo）。この
ような組換えＤＮＡは、実験セクションに詳細に記載し
た構成によって例示される。
【００４４】最も好ましい組換え分子には以下のものが
含まれる：即ち、分泌型ＫＧＦのためのコーディング配
列およびバクテリア発現ベクター（例えばpKK233-2）有
する分子、または全体の一次翻訳生成物（ＮＨ2 末端シ
グナルペプチドを含む）および挿入されたＤＮＡを哺乳
類細胞（例えば NIH/3T3）中で発現可能な哺乳類発現ベ
クター（pMMTによって例示されるもの）を有する分子で
ある。
【００４５】ＫＧＦ・ＤＮＡ及びバクテリア発現ベクタ
ーを含む組換えＤＮＡの構築は、実験セクションIIに記
載される。簡単にいえば、ＫＧＦ・ｃＤＮＡは、そのコ
ーディング配列をプラスミド発現ベクター pKK233-2
（II−３１）内でハイブリッドtrkプロモータの制御下
に置くことによって、E.coli中で発現されてポリペプチ
ドを生成した。
【００４６】ＫＧＦ・ＤＮＡと、挿入されたＤＭＡをヒ
トまたは動物の培養細胞中で発現可能な哺乳類ベクター
とを具備する組換えＤＮＡの構築は、このような比較的
単純なポリペプチドを発現させる公知の方法を用いた、
標準的な遺伝子発現技術によって行うことができる。本
発明のこの側面におけるＤＮＡ （哺乳類ベクター pMM
T を含む）の一つの特別の態様は、本発明の組換え細胞
の下に、このセクションにおいて、以下で更に詳細に説
明する。
【００４７】本発明のＤＮＡおよびセンスストランドＲ
ＮＡは、本発明のタンパク製造方法に関連して、多量の
実質的に純粋なＫＧＦまたはＫＧＦ様タンパクを造るた
めに使用され得る。こうして製造された実質的に純粋な
ＫＧＦは、公知の技術を用いて、種々の体液および組織
サンプル中における当該タンパクのためのレセプタの存
在を決定するための臨床検査に用いることができる。
【００４８】従って、この発明は本発明のＤＮＡ（発現
可能なトランスフォーミングＤＮＡ）で形質転換された
細胞、好ましくはバクテリアまたは哺乳類細胞を包含す
る。本発明のこの側面での好ましい態様において、本発
明のＤＮＡによって形質転換された細胞は、完全にマイ
トジェン様の形でＫＧＦタンパクを産生する。最も好ま
しくは、これらのタンパクは分泌形 （即ち、見掛けの
シグナル配列を欠いたもの）であろう。これらのタンパ
ク因子は機能的研究に使用でき、また定性的および定量
的レセプタ結合検定のような、更なる生化学的および機
能的分析のために精製され得る。
【００４９】ＫＧＦの製造のために、組換え E.coli 細
胞が、実験セクションIIで詳述するように、バクテリア
発現ベクター pKK233-2 を用いて構築された。要約する
と、通常の小スケール法によって、幾つかの組換えバク
テリアクローンのタンパク産生が試験された。試験され
た全ての組換え体が、アミノ末端ＫＧＦペプチドに対す
る抗体によって認識されるタンパクを合成した（以下を
参照のこと）。一つの組換え体が１リットル培養の中で
成長され、該組換え体はBALB／MKケラチン細胞のＤＮＡ
中へのチミジン取り込みを効率的に刺激するが、 NIH／
3T3 繊維芽細胞に対しては最低の活性しか示さない組換
えＫＧＦを産生した。標準ケラチン細胞バイオアッセイ
におけるBALB／MK細胞の半上限刺激（half-maximal sti
mulation）が、 2〜5 ng／mlの濃度で達成された。これ
に対して、M426細胞から精製されたＫＧＦの場合は10〜
15ng／mlである。
【００５０】１リットルのバクテリア細胞は、略５０μ
ｇの Mono-S 精製組換えＫＧＦを生成した。遺伝子発現
の分野における当業者には、この初期収率が、過度の実
験を行なうことなく、公知の組換えＤＮＡ技術を適用す
ることによって改善され得ることが明らかであろう。
【００５１】また、組換え哺乳類細胞（NIH/3T3 マウ
ス）は、Ｎ末端シグナル配列を含む配列をコードする全
ＫＧＦ・ｃＤＮＡと、マウス・メタロチオニン（ＭＭ
Ｔ）プロモータおよびネオマイシン耐性のための選択的
マーカー遺伝子を有するベクターpMMT/neo を用いて構
築された。この細胞は、本発明のバイオアッセイを用い
て、ＫＧＦ、特にヒト繊維芽細胞によって産生される成
熟型（シグナルペプチドが欠如したもの）の製造につい
て評価されている。高レベルの血小板由来成長因子（PD
GF）のＡ鎖およびＢ鎖を含む他の幾つかの同様な組換え
ポリペプチドを首尾よく発現させるために、これと同じ
ベクターと宿主細胞の組合わせが用いられている（II−
３２）。従って、上記の組換えＤＮＡおよび本発明の形
質転換細胞を用いることにより、この方法で組換えＫＧ
Ｆの高収率が達成され得ることが当業者に認識されるで
あろう。
【００５２】最後に、上皮細胞成長の特異的刺激を必要
とする条件での臨床試験を可能にするために、大規模製
造が使用され得る。ポリペプチドを局部投与（例えば、
皮膚または目の角膜に対して）または全身投与するため
の薬剤組成物を調製するための材料および方法は、この
技術分野で良く知られており、また過度の実験を行なわ
なくとも容易にＫＧＦおよびＫＧＦ様ポリペプチドの投
与に適用し得る。
【００５３】本発明はまた、本発明のＤＮＡセグメント
でコードされるペプチドに対して作られる新規な抗体を
包含する。本発明のこの態様は、ＫＧＦを認識する幾つ
かの種類の抗体によって例示される。実験セクションII
に概説したように、これらは実験免疫学の分野でよく知
られた標準的な方法論を用いて調製されている。これら
の抗体には次のものが含まれる：即ち、マウスにおい
て、ヒト繊維芽細胞由来の完全かつ精製されたタンパク
に対して生成されたモノクローナル抗体；ＫＧＦ・ｃＤ
ＮＡ配列から予想されるアミノ酸配列に基づく配列をも
った合成ペプチド［例えば、ＫＧＦ残基32-45 の配列、
即ち NDMTPEQMATNVR（アミノ酸配列のための標準的な一
文字コードを用いた；図II−１参照）をもったペプチ
ド］に対して、兎において生成されたポリクローナル抗
体；ヒト繊維芽細胞から天然に分泌されたＫＧＦおよび
E.coli（上記参照）中で産生された組換えＫＧＦの両者
に対して、兎において生成されたポリクローナル抗体で
ある。
【００５４】試験された全ての抗体は、固相検定（ELIS
A ）および／またはウエスタンブロットにおいて、天然
に存在するＫＧＦと同様に組換えＫＧＦを認識する。幾
つかの例示抗体（これらは本発明の好ましい抗体であ
る）は、BALB／MKバイオアッセイにおいて、ＫＧＦのマ
イトジェン活性を中和するように思える。
【００５５】ＦabまたはＦ(ab)′フラグメントのような
本発明の抗体のフラグメント（抗原結合活性を保持し、
且つ当該技術分野で公知の方法により調製される）もま
た、本発明の範囲内である。更に本発明は、本発明の抗
体またはその活性フラグメントの薬剤組成物をも包含す
る。この薬剤組成物は、ポリペプチド投与のための薬剤
組成物を調製するために当該分野で良く知られた材料お
よび方法を用いて調製することができ、また過度の実験
を行うことなく、ＫＧＦおよびＫＧＦ様ペプチドの投与
に容易に適用することが可能である。
【００５６】これら抗体およびその活性フラグメント
は、例えばバイオアッセイにおけるＫＧＦの検出、また
はタンパク因子の精製のために用いることができる。ま
た、これらは当該技術分野で知られた方法で、ＫＧＦレ
セプタの単離に用いることができる。これらは、実験セ
クションIIに記載したように、公知の他の全ての成長因
子のそれとは明確に異なるようにみえる。
【００５７】ＫＧＦの上皮細胞に対するマイトジェン活
性を中和するこれらの好ましい抗体、並びにそのフラグ
メント及び薬剤組成物は、BALB／MKアッセイによって示
されるように、例えば上皮細胞の過剰成長で特徴付けら
れる臨床症状の治療に用いることができる。この臨床症
状には、形成異常および新形成 （例えば乾癬、または
悪性もしくは両性の上皮腫瘍）が含まれる。
【００５８】更に本発明には、本発明のＤＮＡに関連し
た遺伝子の発現を検出するための新規なバイオアッセイ
方法が包含される。幾つかの例示的態様において、本発
明のＤＮＡは関連ｍＲＮＡの定常状態レベルを測定する
ためのプローブとして用いられた。ＫＧＦ・ＤＮＡを用
いた本発明のこれらのバイオアッセイ方法、および標準
ノーザンブロッティング法は、実験セクションIIにおい
て詳細に説明される。
【００５９】当業者は、過度の実験を行うことなく、単
離細胞または種々の組織において、この様な方法がＫＧ
Ｆ様タンパクの遺伝子発現分析に容易に適用され得るこ
とを認識するであろう。このようなバイオアッセイは、
例えば上皮細胞成長プロセスにおける種々のクラスの腫
瘍細胞または遺伝子欠損を同定するために有用である。
【００６０】更なる労力を要することなく、当業者は、
既述の説明を用い、また以下の実験セクションに記載し
た方法に従って、本発明の全範囲を利用できるものと確
信する。実験セクション中に開示された材料は、他に指
示がない限り例示の目的で開示されており、従ってどの
ような意味でも請求範囲を限定するものと解釈されては
ならない。
【００６１】〔実験セクションＩ〕 上皮細胞に特異的な新規成長因子の同定および特性表示 このセクションでは、ヒト胎児肺繊維芽細胞系の馴らし
培地中において、上皮細胞に特異的な成長因子の同定に
導く実験を説明する。この因子は、ケラチン細胞に対す
る優勢な活性のために、先にケラチン細胞成長因子（Ｋ
ＧＦ）の用語で表わされたものであり、本発明に従って
限外濾過、ヘパリン- セファロース・アフィニティーク
ロマトグラフィー及びＣ4 逆相HPLCカラム上での疎水性
クロマトグラフィーの組合わせにより均一になるまで精
製された。ＫＧＦは酸および熱に不安定であり、略28,0
00のダルトン見掛けの分子量を有する単一のポリペプチ
ド鎖からなることが見出だされた。精製されたＫＧＦは
上皮細胞に対する強力なマイトジェンであり、0.1nM お
よび最大1.0nM において検出可能な活性で、非活動BALB
／MK上皮ケラチン細胞におけるＤＮＡ合成を 500倍以上
も刺激することが可能であった。繊維芽細胞または上皮
細胞の何れかに対するマイトジェン活性の欠如は、ＫＧ
Ｆが従来特徴付けられた何れの成長因子とも異なった標
的細胞特異性を有していることを示している。ミクロシ
ーケンシングによって、公知の何れのタンパクとも有意
な相同性をもたない、アミノ末端配列が明らかになっ
た。ヒト胎児繊維芽細胞によるこの新規成長因子の放出
は、正常な上皮細胞増殖の間充織刺激において重要な役
割を果たすことを示している。
【００６２】［方法および材料］ ＜馴らし培地の調製＞M426ヒト胎児繊維芽細胞（Ｉ−
８）の初期継代を、175 cm2 のＴ- フラスコ上に撒き、
10％子牛血清（GIBCO ）を補充したダルベッコ修飾イー
グル培地（DMEM；GIBCO ）の中で10-14 日に亘って集密
状態にまで増殖させた。集密状態になったら、その単層
を１週毎に血清含有培地から血清フリー培地（DMEMのみ
からなる）へ交互に変えた。20mlのDMEMを添加するに先
立って、この細胞を５mlの燐酸緩衝生理食塩水で２回洗
浄した。72時間後、培養液を回収し、35mlの血清含有培
地で置き換えた。この馴らし培地は、使用するまで -70
℃で保存した。
【００６３】＜限外濾過＞略10リットルの馴らし培地を
解凍し、0.50ミクロンのフィルター（ミリポア社の HAW
P 142 50）を通して予備濾過し、ペリコンカセット装置
（ミリポア社のXX42 00K 60）および10kDa の分子量カ
ットオフを有するカセット（ミリポア社のPTGC 000 05
）を用いて200ml にまで濃縮した。濃縮の後のサンプ
ルに、20mMTris-HCl,pH7.5/0.3M NaCl の１リットルを
用いた連続した２回の稀釈ラウンドを施し、夫々につ
き、続いてペリコン装置を用いて他の限外濾過ステップ
を行う。リテンテート（残渣）中に回収された活性画分
は、ヘパリン- セファロース樹脂に直接適用され、また
は -70℃で保存される。
【００６４】＜ヘパリン- セファロース・アフィニティ
ークロマトグラフィー（HSAC）＞限外濾過で回収された
リテンテートは、20mM Tris-HCl,pH7.5/0.3M NaCl 中で
平衡化されたヘパリン- セファロース樹脂（ファルマシ
ア社）に負荷された。該樹脂は、光学密度がベースライ
ンに戻るまで徹底して洗浄され、次いでNaCl濃度が徐々
に増大するリニア- ステップ勾配にかけられた。画分か
らチミジン取込みバイオアッセイのための部分を除いた
後、選択された画分をセントリコン-10ミクロ濃縮器(Ce
ntricon-10 microconcentrator; Amicon 社) を用いて1
0〜20倍に濃縮し、 -70℃で保存した。
【００６５】＜逆相HPLC（RP-HPLC ）＞HSACからの活性
画分（0.6 M NaClプール）を解凍し、プールし、更にセ
ントリコン-10 で 200μｌの最終容量に濃縮した。該サ
ンプルを、 0.1％トリフルオロ酢酸（TFA,Fluka ）／20
％アセトニトリル（ベーカー社、HPLC級）中で平衡化さ
れたＶydacＣ4 HPLCカラム（分離群、Hesperia,CA ）上
に負荷し、アセトニトリル濃度が徐々に増大する線形勾
配で溶出させた。バイオアッセイのための一部を、直ち
に10倍量の50μｇ／ml／20mM Tris-HCl,pH7.5 中で稀釈
した。残りのサンプルは、構造分析のための調製におい
て、Speed-Vac(Svant)中で乾燥された。
【００６６】＜分子篩HPLC＞略50μｌの２倍濃縮された
ヘパリン- セファロース画分が、20mM Tris-HCl,pH6.8/
0.5M NaCl 中で平衡化されたTSK-G3000SW Glas-Pacカラ
ム（LKB ）上に負荷された。該サンプルは、この緩衝液
中において 0.4ml／min.の流速で溶出された。バイオア
ッセイのための一部を除いた後、該画分を -70℃で保存
した。
【００６７】＜NaDodSO 4 - ポリアクリルアミド・ゲル
電気泳動（NaDodSO 4 ／PAGE）＞Laemmli の方法（Ｉ−
９）に従って、ポリアクリルアミドゲルが NaDodSO4と
共に調製された。サンプルを、 2.5％の2-メルカプトエ
タノール（vol/vol ）の存在下で３分間煮沸した。該ゲ
ルは、BioRadからの試薬およびプロトコールを用いて、
固定および銀染色された（Ｉ−１０）。分子量マーカー
は、ファルマシア社から入手したものである。
【００６８】＜ＤＮＡ合成刺激＞BALB／MK細胞を接種す
るに先立って、96ウエルの微小滴定プレート（FalconN
o.3596）を、１μg ／cm2 のヒト・フィブロネクチン
（Collaborative Research社）で予備コートした。集密
に達したら、細胞を５μg ／mlのトランスフェリン（Co
llaborative Research社）および 30nM のＮａ2 ＳｅＯ
3 （ベーカー社）を含む血清フリーの培地中で24-72 時
間維持した。ＤＮＡ中への 3Ｈ- チミジンの取込み（最
終濃度５μCi／ml,NEN）は、サンプル添加の16時間後か
ら始まって６時間のあいだ測定された。このアッセイ
は、細胞を氷冷燐酸緩衝生理食塩水で１回、また５％ト
リクロロ酢酸で２回洗浄することによって終了された。
その沈殿物を0.25M NaOH中に再溶解し、液体シンチレー
ション液（Biofluor社、NEN ）中に移してカウントし
た。
【００６９】BALB／MKについて上述したのと同様にし
て、種々の他の細胞系に関してＤＮＡの合成刺激がモニ
ターされた。NIH/3T3 繊維芽細胞（Ｉ−１１）はナショ
ナル・インスティチュート・オブ・ヘルスから入手し
た。一方、CCL208アカゲザル気管支上皮細胞（Ｉ−１
２）はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
から入手された。（Ｉ−１３）に記載されたようにして
調製されたB5／589 ヒト乳房上皮細胞系は、マーサ・ス
タンファー（カルホルニア大学、バークレー）から入手
した。該乳房細胞は、10％子牛胎児血清および４ng／ml
のＦＧＦを補充したRPMI中で成長された。血清フリーの
条件に維持されるとき、基礎培地はDMEMである。ヒト伏
在静脈上皮細胞の一次培養は、他の文献（Ｉ−１４）に
記載されたようにして調製され、維持された。上皮成長
因子およびインスリンは、コラボラティブ・リサーチ社
（Collaborative Research）からのものである。酸性Ｆ
ＧＦおよびｂＦＧＦは、カルホルニア・バイオテクノロ
ジー社から得たものである。組換えＴＧＦαはジェネン
テック社から入手した。培地および血清は、GIBCO 、Bi
ofluids 社または NIH培地ユニットから入手したもので
ある。
【００７０】＜増殖アッセイ＞３５mmの培養皿を、ポリ
- Ｄ- リシン（20μg ／cm2 ；シグマ社）およびヒト・
フィブロネクチンで順次予備コートし、次いで略2.5 ×
104 個のBALB／MK細胞を接種した。基礎培地は、５μg
のトランスフェリン、30nMのＮａ2 ＳｅＯ3および0.2mM
のエタノールアミン（シグマ社）を補充した、イーグ
ルの低Ca2+ミネラルエッセンシャル培地およびハムのＦ
-12 培地の１：１混合培地である。培地は２日または３
日毎に交換した。１０日後に、細胞はホルマリン（フィ
ッシャー・サイエンティフィック社）で固定され、ギム
ザ（フィッシャー・サイエンティフィック社）で染色さ
れた。
【００７１】＜タンパクのミクロシーケンシング＞Ｃ4
カラムの活性画分から得た略４μg （150 pmol）のタン
パクを50％ＴＦＡ中に再溶解し、アプライド・バイオシ
ステムズ社の気相タンパクシーケンサーにかけた。20回
のエドマン分解が行われ、自動オンラインHPLC（モデル
120A；アプライド・バイオシステムズ社）でアミノ酸誘
導体の同定が行われた。
【００７２】［結 果］この実験セクションの結果は、
図１〜図７に纏められている。これらの図に示したデー
タおよび／またはそれらに関する実験を簡単に説明すれ
ば次の通りである。
【００７３】図１； Ｍ４２６ヒト胎児線維芽細胞によ
る馴らし培地のヘパリン−セファロース・アフィニティ
クロマトグラフィーである。数リットルのＭ４２６馴ら
し培地からの限外ろ過リテンテイト約１５０ｍｌを、１
時間でヘパリン−セファロースカラム（ベッド容積６ｍ
ｌ）にかけた。このカラムを、平衡緩衝液１５０ｍｌ、
トリス−ＨＣ１２０ｍＭ、ｐＨ７．５／０．３Ｍ Ｎａ
Ｃｌを用いて洗浄した後、増加するＮａＣｌ濃度の変形
線形勾配を用いて保持される蛋白質（リテンテイト中の
蛋白質の合計の＜５％）を溶出した。画分の量は３．８
ｍｌであり、勾配溶出の間の流速は１０８ｍｌ／時であ
った。示された画分の２μｌを、方法の項で説明したＢ
ＡＬＢ／ＭＫ細胞における 3Ｈ−チミジン取込みの検定
のための、０．２ｍｌの最終容量を有するマイクロタイ
ターウェルに移した。
【００７４】図２； ＢＡＬＢ／ＭＫマイトジェン活性
の逆相Ｃ4 ＨＰＬＣである。０−６ＭのＮａＣｌを用い
てヘパリン−セファロースから溶出させた活性画分を、
Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０で処理し、０．１％トリフル
オロ酢酸／２０％アセトニトリル（ＡＣＮ）で平衡にし
たＣ4 Ｖｙｄａｃカラム（４．６×２５０ｍｍ）に直接
かけた。このカラムを平衡緩衝液４ｍｌで洗浄した後、
試料を増加％ＡＣＮの変形線形勾配で溶出した。画分の
量は０．２ｍｌであり、流速は０．５ｍｌ／分であっ
た。ＢＡＬＢ／ＭＫ細胞における 3Ｈ−チミジン取込み
の検定のためのアリコートを、５０μｇ／ｍｌウシ血清
アルブミン／２０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、で直
ちに１０倍に希釈し、最終希釈２００倍で試験した。
【００７５】図３； パネルＡに示されるＣ4 クロマト
グラフィからの選択された画分のＮａＤｏｄＳＯ4 ／Ｐ
ＡＧＥ分析である。各画分の半分を乾燥し、ＮａＤｏｄ
ＳＯ4 ／２−メルカプトエタノールに再溶解し、熱変性
して、実質的に銀で染色された１４％ポリアクリルアミ
ドゲルで電気泳動した。各分子量マーカー（ＫDaでの質
量）の位置は矢印で示される。
【００７６】図４； パネルＢで分析された画分によっ
て引き起こされるＢＡＬＢ／ＭＫ細胞におけるＤＮＡ合
成である。活性は、バックグランド（１００ｃｐｍ）に
対して何倍の刺激であるかで表わされる。
【００７７】図５； ＢＡＬＢ／ＭＫマイトジェン活性
の分子ふるいＨＰＬＣ（ＴＳＫ３０００ＳＷ）クロマト
グラフィーである。約５０μｌのＣｅｎｔｒｉｃｏｎで
処理した、ＨＳＡＣからの０．６Ｍ ＮａＣｌプール
を、予め２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８／０．５
Ｍ ＮａＣｌで平衡化されたＬＫＢ ＧｌａｓＰａｃＴ
ＳＫ ３０００ＳＷカラム（８×３００ｍｍ）にかけ、
流速０．４ｍｌ／分で０．２ｍｌの画分として溶出させ
た。アリコート２μｌを、ＢＡＬＢ／ＭＫ細胞における
3Ｈ−チミジン取込みの検定のための、０．２ｍｌの最
終容積を有するマイクロタイターウェルに移した。分子
量マーカー（ＫDa）の溶出位置は、矢印で示される。
【００７８】図６； ＴＳＫ−精製マイトジェンおよび
他の成長因子に応じたＢＡＬＢ／ＭＫ ＤＮＡ合成の比
較である。バックグランドに対して何倍の刺激であるか
で表わされる、トリクロロ酢酸不溶ＤＮＡへの 3Ｈ−チ
ミジンの取込みを、示される成長因子の濃度の関数とし
て測定した。試料無添加である場合のバックグランド値
は１５０ｃｐｍであった。この結果は、２つの独立した
実験の平均値を示す。各実験における反復試験は、平均
値の１０％以内であった。黒丸はＴＳＫ−精製マイトジ
ェン、三角はＥＦＧ、四角はａＦＧＦ、白丸はｂＦＧＦ
である。
【００７９】図７； 成長因子の異なる組合せに応じて
化学的に規定された培地におけるＢＡＬＢ／ＭＫ細胞の
成長比較である。培養物は、トランスフェリン、Ｎａ2
ＳｅＯ3 、エタノールアミンおよび以下に示す成長因子
を補足した、イーグル最小必須培地およびハムＦ１２培
地の１：１混合物中のポリ−Ｄ−リシン／フィブロネク
チンで予備被覆された３５ｍｍシャーレ上に、シャーレ
当り２．５×１０4 細胞の密度で塗布された。１０日
後、このプレートを固定し、ギムザで染色した。キー：
ａ）成長因子なし；ｂ）ＥＧＦ単独；ｃ）インシュリン
単独；ｄ）ＫＧＦ単独；ｅ）ＥＧＦ＋インシュリン。成
長因子の最終濃度は：ＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌ；インシ
ュリン、１０μｇ／ｍｌ；およびＫＧＦ、４０ｎｇ／ｍ
ｌであった。
【００８０】以下、夫々の結果について詳細に説明す
る。
【００８１】＜成長因子の検出および単離＞種々の細胞
系から得られた馴らし培地の予備スクリーニングによっ
て、或る繊維芽細胞系はBALB／MK及び NIH／3T3 細胞の
両方について検出され得るマイトジェン活性を含んでい
ることが示された。煮沸するとBALB／MKに対する活性は
破壊されたが、 NIH／3T3 に対するマイトジェン活性は
そのまま残存した。ＥＧＦ（Ｉ−１５）及びＴＧＦα
（Ｉ−１６）の公知の熱安定性に基づけば、BALB／MKマ
イトジェン活性は、これら公知の上皮成長因子とは異な
った要因に起因するものと思われる。
【００８２】推定される成長因子を精製するために、こ
の活性物質の最も生産的な供給源として、M426ヒト胎児
肺繊維芽細胞系が選択された。ペリコン装置による限外
濾過は、サンプル容量を、その後のクロマトグラフィー
に適したレベルに減少するための便利な方法を提供す
る。精製スキームの開発において、篩、イオン交換およ
び等電点電気泳動クロマトグラフィーの種々の組合わせ
が試みられたが、これらは全て不満足な低収率しか与え
なかった。一方、他の成長因子の精製に用いられている
ヘパリン- セファロース・アフィニティークロマトグラ
フィー（HSAC）（Ｉ−１７〜Ｉ−２２）は、本発明にお
ける初期精製ステップとして有用であることが証明され
た。この段階では、他の因子が存在するかもしれないた
め回収された特定の活性の評価は不確かであるが、活性
の見掛けの収率は50〜70％であり、略1000倍の富化に対
応する。
【００８３】図１に示したように、BALB／MKマイトジェ
ン活性の90％を越える量が、0.6M NaCl でHSACカラムか
ら溶出したこの活性ピークは、NIH/3T3 に対する何れの
活性とも関係がなかった（データは示していない）。BA
LB／MKマイトジェン活性のもっと小さいピークが、0.8
〜1.2M NaCl に一致して出現した。
【００８４】HPLCパターンの再現性に起因して、活性画
分は、勾配の傾斜および光学密度プロファイルに基づい
て推定的に同定され得る。セントリコン-10 で10〜20倍
に迅速に濃縮することは、続いて -70℃で数ケ月保持さ
れ得る安定性にとって不可欠であることが分かった。
【００８５】最終的な精製は、アミノ酸配列分析に適し
た調製法である、Ｃ4 Vydac カラムを用いたRP-HPLC
（これはアミノ酸配列分析に適した調製法である）によ
って達成された。Ｃ4 ステップでの活性物質の収率は通
常数パーセントにしか過ぎないが、このロスは使用した
溶媒に起因するものであろう。他の実験において、室温
で１時間、0.1%ＴＦＡ／50% アセトニトリルに曝すこと
により、調製品のマイトジェン活性は98％減少した。に
もかかわらず、図２〜図４に示したように、光学密度プ
ロファイルにおける異なったピークに対応した、BALB／
MK刺激活性の単一ピークが得られた。このピーク画分
は、ＮａＤｏｄＳＯ4 ／ＰＡＧＥおよび該ゲルの銀着色
に際して単一のバンドを生成し、また試験された夫々の
画分の相対的なマイトジェン活性（図４）は、活性プロ
ファイルを横切るバンドの強度に良好に対応していた。
【００８６】生理的ｐＨに近い水溶液中におけるTSK G3
000SW GlasPac カラムランでの分子篩クロマトグラフィ
ーを用いた、HPLC技術に代わる別の精製ステップは、BA
LB／MKバイオアッセイにおいて主要な活性ピークを与え
た（図５）。この調製品は、銀着色されたＮａＤｏｄＳ
Ｏ4 ／ＰＡＧＥ（データは示していない）から判断する
と、RP-HPLC で得られた物と同様に殆ど純粋であった
が、活性の回収は遥かに良好であった（下記の表Ｉ−
１）。このTSK-精製物はより高い比活性を有しているた
め、生物学的研究ではルーチンに用いられた。
【００８７】両方のタイプの精製された調製品（即ち、
HPLC精製品および分子篩精製品）は、この二つの調製品
においては区別できないように見えたが、これらのマイ
トジェン活性のプロファイルはＮａＤｏｄＳＯ4 ／ＰＡ
ＧＥ上の異なったバンドに関連していた。
【００８８】
【表１】 回収率は、出発物質における全てのマイトジェン活性が
分離された因子によるものと仮定することにより算出し
た。表中の脚注は下記の通りである。 ＊ 活性１ユニットは、ＢＡＬＢ／ＭＫバイオアッセイ
においてＴＳＫ精製因子により誘発されるチミジン取り
込みの最大刺激の半分と定義され、ここでは約３ｎｇの
ＴＳＫ精製陰性が活性１ユニットを刺激する。 ａ 蛋白質は、BioRad から購入した Bradford 試薬を
用いることにより評価した。 ｂ 蛋白質は、Ａ214 （１％）＝１４０を用いることに
より評価した。
【００８９】上記のように、表Ｉ−１には種々の精製ス
テップの結果が纏められており、活性の回収は、吸着RP
-HPLC よりも分子篩クロマトグラフィーの方が遥かに良
好であることを立証している。
【００９０】＜成長因子の物理的および生物学的特徴付
け＞当該精製因子は、還元条件下（図２〜図４）および
非還元条件下（データは示していない）でのＮａＤｏｄ
ＳＯ4 ／ＰＡＧＥに基づいて、約28kDa の推定分子量を
有していた。この値は、本来のコンホメーションを維持
すると期待される溶媒中での異なった二つの寸法のカラ
ムラン(columns run) （TSK-G3000-SW，図５；および s
uperose-12, データは示していない）における、その溶
出位置と良く一致していた。これらのデータから、該マ
イトジェンは分子量 25-30 kDaの単一のポリペプチド鎖
からなっていると思われる。
【００９１】当該マイトジェン活性の熱および酸に対す
る不安定性は、BALB／MKマイトジェネシス・バイオアッ
セイにを用いることにより示された。活性は、50℃での
10分間のインキュベーションでは影響を受けなかった
が、60℃で10分後には68％減少し、また 100℃で10分後
には検出できなかった。室温において60分間、0.5Mの酢
酸に曝すと、活性は対照の14％にまで減衰した。これに
比較して、公知の成長因子（ＥＧＦ）のマイトジェン活
性は、これら何れの処理によっても減少しなかった。
【００９２】図６に図示された精製成長因子についての
投与量応答曲線は、0.1 nMの少量で、検出可能なＤＮＡ
合成刺激を導くことを示している。従って、活性範囲
は、今日までに分析されている他の成長因子のそれと比
肩し得るものであった。濃度範囲 0.1〜1.0 nMにおいて
直線的な関係が観察され、1.0 nMでは 600倍の最大刺激
が観察された。BALB／MKケラチン細胞において、この新
規な因子はＥＧＦ、ａＧＦＧまたはｂＧＦＧよりも高い
最大チミジン取り込みを確実に誘導する（図６）。
【００９３】この因子の特殊な標的細胞特異性は、種々
の細胞型に対するその活性を、上皮細胞マイトジェン活
性を有することが知られた他の成長因子のそれと比較す
ることによって示される。下記の表Ｉ−２に示されるよ
うに、新しく単離された因子はBALB／MKに対して強いマ
イトジェン性効果を示し、また試験された他の上皮細胞
のＤＮＡ中への明確なチミジン取り込みを誘導した。こ
れとは全く対照的に、当該因子はマウス（またはヒト，
データは示していない）繊維芽細胞またはヒト伏在静脈
上皮細胞に対して検出可能なマイトジェン効果をもたな
かった。
【００９４】
【表２】 種々の細胞株における、ＫＧＦおよび他の成長因子によ
って刺激された最大チミジン取り込みの比較。この取り
込みは、バックグラウンドに対して何倍の刺激であるか
を表している。このデータは、４つの異なる実験を纏め
て示している。表中の脚注は下記の通りである。 ＊ ａＦＧＦに夜最大刺激は、ヘパリン（シグマ社）20
μｇ／ｍｌの存在を必要とする。 nd ＝測定
【００９５】上記のように、表Ｉ−２には種々の成長因
子の標的細胞特異性に関するデータが要約されており、
新たに単離された因子がケラチン細胞（BALB／MK）に対
して強いマイトジェン効果を示すこと、並びに繊維芽細
胞またはヒト伏在静脈上皮細胞に対しては認め得る効果
をもたないことを示している。
【００９６】これに比較して、他の公知の成長因子は何
れもケラチン細胞を選択的に刺激するようには見えな
い。ＴＧＦαおよびＥＧＦは繊維芽細胞に対する強い活
性を示す一方で、ＦＧＦは繊維芽細胞と共に上皮細胞に
対してマイトジェン性であった。その上皮細胞特異性、
就中ケラチン細胞感受性のために、この新規なマイトジ
ェンは暫定的にケラチン細胞成長因子（ＫＧＦ）と称さ
れた。
【００９７】ＫＧＦがＤＮＡ合成を刺激するのみなら
ず、持続した細胞成長を支持することを確立するため
に、完全に定義され且つこの成長因子が補充された血清
フリーの培地中で成長し得るBALB／MK細胞の能力が明ら
かにされた。図７に示したように、この化学的に定義さ
れた培地において、ＫＧＦは、ＥＧＦの優れた代替え品
として作用したが、インスリン（またはインスリン用成
長因子Ｉ）の代替え品としては作用しなかった。従っ
て、BALB／MK細胞の増殖に関して、ＫＧＦはＥＧＦ，ａ
ＧＦＧ及びｂＧＦＧによって共有される主な信号伝達経
路を通して作用するように思える。
【００９８】＜ミクロシーケンシングはＫＧＦの独特な
Ｎ- 末端アミノ酸配列を明らかにする＞当該成長因子を
更に特徴付けするために、略150 pmolのＣ4 精製された
材料をアミノ酸配列分析にかけた。2-13サイクルについ
て、曖昧でない次のような指定を伴う単一の配列が検出
された：即ち、X-Asn-Asp-Met-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Al
a-Thr-Asn-Val である。最初のポジションの指定には高
いバックグラウンドノイズが含まれており、そのために
Ｘで示されている。
【００９９】FASTP プログラム（Ｉ−２４）を用いたコ
ンピュータ調査によって、ＫＧＦのＮ末端アミノ酸配列
はナショナル・バイオケミカル・リサーチ・ファウンデ
ーション・データ・バンクの何れのタンパクとも顕著な
相同性を示さないことが明らかになり、従ってこの成長
因子の新規性が支持された。
【０１００】［考 察］この実験セクションに記載され
た研究によって、上皮細胞に対して独特の特異性をもっ
たヒト成長因子が同定された。本発明に従って、限外濾
過、HSACおよびRP-HPLC または TSK分子篩クロマトグラ
フィーを用いることにより、この分子の物理的および生
物学的性質の詳細な特徴付けを行うために充分な量が単
離された。
【０１０１】RP-HPLC から得られた活性画分中に、約2
8,000の分子量に対応する単一の銀着色バンドが検出さ
れ、該バンドの強度はこれら画分中のマイトジェン活性
のレベルに比例していた。TSK クロマトグラフィーから
得られた活性画分中には、RP-HPLC によって得られたも
のと区別できないバンドがみられた。この精製されたタ
ンパクはナノモル以下の濃度で上皮細胞中でのＤＮＡ合
成を刺激したが、繊維芽細胞または上皮細胞中において
は、比肩し得る以上の如何なるチミジン取り込みをも誘
導しなかった。この特徴的な標的細胞特異性は、精製分
子から決定された単一の新規なＮ末端アミノ酸配列と相
俟って、ＫＧＦが新規な成長因子であるとの結論を導
く。
【０１０２】化学的に定義された培地中において、当該
精製された因子はインスリン様成長因子Ｉ／BALB/MK 細
胞のインスリン成長要求を補足することができ、従っ
て、ＥＧＦＧ，ＴＧＦα及びＧＦＧと共通の信号形質導
入経路を通して作用するに違いない。更に、当該新規因
子は、BALB／MK細胞におけるチミジン取込みの刺激にお
いて、公知の上皮細胞マイトジェンのどれよりも強い。
予備的な証拠は、この因子がヒト・ケラチン細胞の二次
培養の増殖をも支持できることを示している（データは
示していない）。
【０１０３】ＫＧＦの取扱いおよび保存は、その精製に
際して問題である。これは、熱および酸に対して本来的
に不安定性である外、凍結乾燥および透析に対しても不
安定である。担体タンパク、ヘパリン、プロテアーゼ阻
害剤、シリコン化管(siliconized tubes) 、または 4℃
若しくは-20 ℃での保存を用いたにもかかわらず、HSAC
後の24時間以内に活性は完全に喪失した。この段階でサ
ンプルを濃縮することによってのみ、その活性が維持さ
れ得る。
【０１０４】更に、乾燥および精製された因子を移送す
るためには強酸または湿潤剤を利用する必要があり、こ
れは吸着され易くまたは不溶性であることに一致してい
る。従って、活性保持のために、この精製された因子は
高濃度溶液の形で-70 ℃に維持された。この場合、数か
月は安定である。
【０１０５】ＫＧＦのヘパリン結合能力は、in vivo で
機能を有するこの因子の基本的な性質を示している。ヘ
パリン結合特性を有する成長因子には、ａＦＧＦ（Ｉ−
２０〜Ｉ−２２）、ｂＦＧＦ（Ｉ−１９，Ｉ−２２）、
顆粒細胞／マクロファージ・コロニー刺激因子およびイ
ンターロイキン３（Ｉ−２５）が含まれる。これらの夫
々は、間質細胞によって産生される （Ｉ−２５〜Ｉ−
２７）。これら因子は細胞外マトリックス中、または間
質細胞表面を被覆するプロテオグリカン上に蓄積される
ように思える。その保存、放出および特定の標的細胞と
の接触は、この相互作用によって調節されるものと仮定
される（Ｉ−２５，Ｉ−２８）。上皮細胞増殖の間充織
由来エフェクタも既に記載されているが（Ｉ−２９〜Ｉ
−３１）、その同定はまだ明らかにされていない。その
ヘパリン結合特性（ヒト胎児繊維芽間質細胞によって放
出される）および上皮細胞屈性は、ＫＧＦに対して、正
常な上皮細胞成長のこのようなパラクリン媒体に期待さ
れる全ての特性を与える。
【０１０６】この新規な成長因子について決定された一
部のアミノ酸配列は、そのコーディング配列の分子クロ
ーニングを可能にし、また後述の実験セクションIIに記
載されたような、公知の成長因子ファミリーに対するそ
の構造的関係の決定を可能にする。
【０１０７】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【０１０８】〔実験セクションII〕 新規な上皮細胞特異性成長因子のｃＤＮＡ配列は、ＦＧ
ファミリーの新しいメンンバーを定義する 先に述べた実験セクションＩでの仕事によって、ケラチ
ン細胞成長因子（ＫＧＦ）と称される新規なヘパリン結
合性成長因子が定義された。これはケラチン細胞に対し
て特に活性であり、上皮細胞に対して特異的であるよう
に思える。この第二の実験セクションでは、実験的に決
定されたＮＨ2 末端アミノ酸配列に基づき、合成オリゴ
ムクレオチドをハイブリダイゼーション・プローブとし
て用いた、ＫＧＦをコードするｃＤＮＡの単離および特
徴付けが説明される。ヌクレオチド配列分析によって、
194-アミノ酸ポリペプチドをコードする582-bpの読み取
り枠(open reading frame)が同定された。この194-アミ
ノ酸ポリペプチドは、41％〜33％の範囲で、ヘパリン結
合性の酸性および塩基性繊維芽細胞成長因子、並びに h
si及び int-2オンコジェンの関連生産物と一致した。該
ＫＧＦ遺伝子のＲＮＡ転写は、胎児および成体起源の正
常な繊維芽細胞中で発現されるが、上皮細胞、内皮細胞
またはグリア細胞中では発現されない。従って、ＫＧＦ
は間充織によって正常に発現され、これは上皮細胞増殖
の制御に役割を果していると思われる。
【０１０９】［材料および方法］ ＜ｃＤＮＡの単離＞ＫＧＦの精製及びＮ末端配列につい
ては、先に既述した通りである（上記の実験セクション
Ｉ、およびII−３参照）。結果に関して述べたデオキシ
オリゴヌクレオチドのプール （50 pmole）は、83モル
のγ- 32Ｐ-ATP（3000Ｃｉ／mmole ，Amersham社）およ
び10単位のＴ4 ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、
５′末端をラベルされた。ｃＤＮＡクローンを有する組
換えファージは、ニトロセルロース・フィルター上にレ
プリカ載置され、20％ホルムアミド、10％硫酸デキスト
ラン、10mMのTris-HCl(pH 7.5)、 8 X SSC、5X Denhard
t's 及び50μｇ／mlの変性サーモン精子ＤＮＡの中にお
いて42℃で一晩、32Ｐ- ラベルされたデオキシオリゴヌ
クレオチドでハイブリダイズされた。フィルターを、0.
5X SSC、0.1 ％ＳＤＳ中で50℃において洗浄し、Kodac
X-Omt ARフィルムに対して露出した。
【０１１０】＜ＤＮＡ配列＞ＫＧＦ・ｃＤＮＡのヌクレ
オチド配列は、オーバラッピング制限フラグメントのジ
デオキシ鎖末端法（II−２６）によって決定され、ｐＵ
Ｃベクター（II２７）中にサブクローンされた。
【０１１１】＜ＫＧＦ・ｃＤＮＡのバクテリア発現ベク
ターの構築＞成熟した分泌型のポリペプチドをコードす
るＫＧＦ・ｃＤＮＡは、次のようにしてプラスミド発現
ベクター pKK233-2 （II−３１）中のハイブリッド trk
プロモータの制御下に置かれた。これを達成するため
に、成熟ＫＧＦ分子（即ち、そのシグナルペプチドを含
まないもの）をコードする情報を含んだ特定長さのＫＧ
Ｆ・ｃＤＮＡが、ポリメラーゼ・チェイン・リアクショ
ン（ＰＣＲ）技術を（II−３２）用いて増幅された。こ
のフラグメントは、当該ベクターの二つの部位（即ち、
Ｓ1 ヌクレアーゼ消化により平滑末端化されたＮcoI 部
位とHindIII）との間に方向付けして挿入された。ＰＣ
Ｒ法によって製造されたＫＧＦ・ｃＤＮＡの末端は、次
の通りであった：５′末端は平滑で、ATG コドンで始ま
り、成熟型ＫＧＦのアミノ末端残基（図II−１参照）で
ある33番のcys 残基のための TGCコドンが続くき、そし
て全ＫＧＦコーディング配列が続く。停止コドンである
TAAおよび直接これに続く四つの塩基TTGCはもまた、ｃ
ＤＮＡの３′末端に含まれていた。ｃＤＮＡの３′末端
の望ましい位置にＤＮＡ合成を指示するためにＰＣＲ法
で用いられたプライマーには、増幅されたｃＤＮＡをベ
クターＤＮＡ中に挿入するためのHindIII部位が含まれ
ていた。
【０１１２】＜ＫＧＦおよびＫＧＦ関連ペプチドに対す
る抗体の製造＞ヒト繊維芽細胞由来の完全かつ精製され
たタンパクに対して、マウス内で、５回以上の皮下注射
を用いることによりモノクーナル抗体が生産された。試
験血液は、ヒト上皮細胞からの高度に精製されたＫＧＦ
を抗原に用い、固相（ELISA）検定でスクリーニングさ
れた。ハイブリドーマはルーチンの方法により製造さ
れ、またＫＧＦ関連抗体を検出するために、上澄み液は
ELISA 検定でスクリーニングされた。陽性クローンは通
常の方法により連続的にサブクローン化され、また大量
の抗体を製造するために、選択されたサブクローンがマ
ウス中で腹水腫瘍として成長された。抗体は、標準的な
技術 （例えばヒドロキシアパタイト又は免疫アフィニ
ティー樹脂）を用いることにより精製された。
【０１１３】合成ペプチドに対するポリクローナル抗体
は、兎中において、標準的な方法を用いることにより次
のようにして生成された。ポリペプチドは固相技術によ
って製造され、グルタルアルデヒドとの反応によってチ
ログロブリンに結合された。連続的に皮下注射が行わ
れ、試験血液はウエスタンブロト分析およびマイトジェ
ネシス・バイオアッセイを含む他の方法並びにELISA に
よってスクリーニングされた。IgＧ免疫グロブリンは、
固相化タンパクＧを用いたアフィニティークロマトグラ
フィーによって単離された。
【０１１４】ポリクローナル抗体は、ヒト繊維芽細胞か
ら天然に分泌されたＫＧＦおよび E.coli 中で産生され
た組換えＫＧＦの両者に対して、以下のプロトコールを
用いることにより、兎中において生成された： i) 最初の注射および第一の追加免疫は、鼠径部のリン
パ節に投与された。 ii) その後の追加免疫は筋肉内へ行われた。
【０１１５】試験血液のスクリーニングには、ウエスタ
ンブロット分析およびマイトジェネシス・バイオアッセ
イ並びにELISA が含まれ、また合成ペプチドに対する抗
体について上述したと同様にしてIgＧを精製した。
【０１１６】［結 果］この実験セクションの結果は、
図８〜図１４に纏められている。これらの図に示したデ
ータおよび／またはそれらに関する実験を簡単に説明す
れば次の通りである。
【０１１７】図８； ヒトＫＧＦ ｃＤＮＡクローンの
模式的な表現である。配列決定に用いられる重複ｐＣＥ
Ｖ９クローン３２および４９は、未翻訳領域を線で記
し、かつコード配列をボックスで示す完全な構造図の上
部に示される。ハッチ領域はシグナルペプチドの配列を
示し、白抜きの領域は成熟蛋白質を示す。選択された制
限部位を示す。
【０１１８】図９〜図１１； ＫＧＦ・ｃＤＮＡ塩基配
列および予想されるアミノ酸配列である。塩基は右側に
番号付けされており、アミノ酸は全体を通して番号付け
されている。精製ＫＧＦ由来のＮ−末端ペプチド配列に
は下線を付してある。疎水性Ｎ−末端ドメインはイタリ
ック体で示す。潜在的なアスパラギン結合グリコシレー
ション部位はオーバーライン表示されている。このＲＮ
Ａの３′末端に近い異なるポリアデニール化部位、ＡＡ
ＴＴＡＡおよびＡＡＴＡＣＡはボックスとして示す。
【０１１９】図１２； ノーザンブロット分析によるＫ
ＧＦ・ｍＲＮＡの同定である。レーンａおよびｃはポリ
（Ａ）−選択Ｍ４２６ＲＮＡ、レーンｄは全細胞Ｍ４２
６ＲＮＡを表わす。フィルターは、レーンａおよびｂが
クローン３２（プローブＡ、図８）からの32Ｐ−標識６
９５ｂｐ・ＢａｍＨＩ／ＢｃｌＩ断片で、またレーンｃ
およびｄがクローン４９（プローブＢ、図II−１Ａ）か
らの５４１ｂｐ・ＡｐａＩ／ＥｃｏＲＩ断片でハイブリ
ダイズされている。
【０１２０】図１３； 関連する分子のＦＧＦファミリ
ーの位相的比較である。高い相同性を共有する２つのタ
ンパクドメインを黒塗りのボックスで示す。線影をつけ
たボックスは、推定シグナルペプチド配列を示す。２つ
の保護されたシステイン残基（Ｃ）の位置を示す。
【０１２１】図１４； 正常ヒト細胞株および組織にお
けるＫＧＦ・ｍＲＮＡのノーザンブロット分析、および
上皮細胞に対する既知の活性を有する他の成長因子のｍ
ＲＮＡ発現との比較である。全細胞ＲＮＡを、セシウム
・トリフルオロ酢酸勾配遠心により単離した。ＲＮＡ１
０μｇを変性し、１％ホルムアルデヒドゲル中で電気泳
動した。穏やかなアルカリ変性（５０ｍＭ ＮａＯＨで
３０分間）の後、１Ｍ酢酸アンモニウムをコンベクタン
ト（ｃｏｎｖｅｃｔａｎｔ）としてＲＮＡをニトロセル
ロースフィルターに移した。フィルターは、ＫＧＦコー
ド配列（Ａ）の５′末端からの６４７ｂｐ Ｅｃｏ Ｒ
Ｉ断片を含有する32Ｐ−標識ｃＤＮＡプローブもしくは
他の成長因子ＤＮＡからの類似のプローブとハイブリダ
イズした。下記タイプのヒト細胞が用いられた。扁平上
皮癌（Ａ２５３、Ａ３８８およびＡ４３１）；乳房の上
皮細胞（Ｓ６およびＲ１）；Ａｄ１２−ＳＶ４０で不死
化されたケラチン細胞；主要ヒトケラチン細胞；新生児
包皮線維芽細胞、ＡＧ１５２３；成人皮膚線維芽細胞
（５０１Ｔ）；および胚性肺線維芽細胞（ＷＩ−３８お
よびＭ４２６）。
【０１２２】＜新規成長因子をコードするｃＤＮＡクロ
ーンの単離＞ＫＧＦコーディング配列に対応したｃＤＮ
Ａクローンを研究するために、９個のアミノ酸配列、即
ち精製ＫＧＦのミクロシーケンシング（実験セクション
Ｉ、および参考文献II−３参照）によって決定されたよ
うに、 Asn-Asp-Met-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Alaに基づい
て、26塩基の長さをもったオリゴヌクレオチドの二つの
プールが作成された。一方のオリゴヌクレオチドプール
は、９アミノ酸のための 256の可能な全てのコーディン
グ配列の混合物を含んでおり、他方はThr 及びPro のた
めのコドンの縮退第三位置(the degenarate third posi
tion) にイノシン残基を含んでいた。
【０１２３】この後者のデザインは、プール中の可能な
コーディング配列の数を16に減少させる。ｔＲＮＡアン
チコドン中のイノシンは、Ａ、ＣまたはＵと水素結合を
形成できる（II−４）。また、デオキシイノシンを含む
オリゴヌクレオチドは、対応するｃＤＮＡと効率良くハ
イブリダイズすることが示されている（II−５）。
【０１２４】ｃＤＮＡライブラリーは、成長因子の初期
供給源であるヒト胎児肺繊維芽細胞系 M426 （II−７）
から抽出されたポリアデニル化ＲＮＡを用いて、ｃＤＮ
ＡクローニングベクターであるｐCEV9中に構築された。
32Ｐ- ラベルされた26量体オリゴヌクレオチドを用いた
該ライブラリー（9 ×105 プラーク）のスクリーニング
によって、オリゴヌクレオチド・プローブの両方のプー
ルとハイブリダイズする88のプラークが同定された。
【０１２５】＜選択されたｃＤＮＡクローンの特徴付け
及びシーケンシング＞分析された10個のプラーク精製ク
ローンのうちの一つ （クローン49）は、3.5 kbのｃＤ
ＮＡ挿入を有していた。一方、残りのクローンは1.8 kb
〜2.1 kbに亘る挿入を有していた。
【０１２６】小さいほうのクローンの分析によって、幾
つかの共通の制限部位が明らかになった。小さいほうの
代表的なクローン （クローン32とクローン49）のシー
ケンシングによって、それらが重複部分を有するｃＤＮ
Ａであることが明らかになった（図８）。クローン49は
メッセージのポリ（Ａ）テールにプライムされていた
が、クローン32は、ＫＧＦ・ｍＲＮＡの３′非コード領
域中のＡ- リッチな配列に対するオリゴ（ｄＴ）プライ
マーのハイブリダイゼーションによって、ライブラリー
の構築の際に生じていた。
【０１２７】＜ＫＧＦポリペプチドをコードする配列の
説明＞二つのｃＤＮＡ（クローン32及び49）のアライン
メントによって、完全なＫＧＦコーディング配列を含む
3.85 kb の連続配列が確立された（図９〜図１１）。開
始コドンと思われるATG がヌクレオチド位置446 に位置
しており、1030位置のTAA 停止コドンで終端する582 塩
基対の読み取り枠が確立された。この読み取り枠は22,5
12の算出分子量を有する194-アミノ酸ポリペプチドをコ
ードするであろう。
【０１２８】ATG コドンに隣接する配列は、真核生物リ
ボソームによる最適の開始（II−８）のためのコンセン
サス配列として提案された配列の GCC(G/A)CCATGG には
適合しないが、ATG コドンの３ヌクレオチド上流にＡが
存在する。この位置におけるＡは、前記コンセンサス配
列において最も高い確率で維持されているヌクレオチド
である。同じ読み取り枠において、このATG コドンの85
ヌクレオチド上流には、TAG 停止コドンが先行してい
る。
【０１２９】精製ＫＧＦの実験的に決定されたＮＨ2 末
端に対して相同性を有する実験的に決定された19アミノ
酸配列は、提案された開始コドン下流の第32アミノ酸で
始まる。予期された配列と実験的に決定されたアミノ酸
配列とは完全に一致しており、曖昧さのないアサインメ
ントが可能であった。
【０１３０】ＫＧＦと公知のタンパクとの間の相同性を
研究するために、リップマン及びパーソンのFASTP プロ
グラムを用いて、ナショナル・バイオメディカル・リサ
ーチ・ファウンデーション・データベースのコンピュー
タ調査を行った（II−９）。この研究によって、ＫＧＦ
について予期された一次構造と、酸性および塩基性ＦＧ
Ｆ並びに関連hst およびint-2-にコードされたタンパク
の一次構造との間に驚くべき関係が明らかになった。
【０１３１】＜ヒト細胞におけるＫＧＦ遺伝子のｍＲＮ
Ａ転写の発現＞ヒト細胞内でのＫＧＦ・ｍＲＮＡの発現
を確かめるための予備試験において、ＫＧＦコーディン
グ配列の大部分に亘るプローブ（プローブＡ、図８）
は、全M426ＲＮＡのノーザンブロット分析によって、単
一の2.4kb 転写を検出した（図１２）。これは、コンポ
ジットｃＤＮＡ配列の長さ（3.85kb）よりも遥かに短か
った。
【０１３２】しかしながら、ポリ（Ａ）- 選択された M
426 ＲＮＡのスクリーニングに際しては、略５kbの追加
の転写が検出された。更に、クローン49の翻訳されなか
った領域、即ち３′〜クローン32の端までに由来するプ
ローブ（プローブＢ、図８）は、より大きいメッセージ
に対してのみハイブリダイズした（図１２）。従って、
ＫＧＦ遺伝子はＲＮＡを替えるようにして転写されるよ
うに思える。ＦＧＦファミリーの他の二つのメンバー、
即ちｂＦＧＦ（II−２９）および int-2（II−３０）も
また複数のＲＮＡを発現し、その重要性は決定されるべ
く残されている。
【０１３３】ＫＧＦの正常な機能的役割を研究するため
に、種々のヒト細胞系および組織におけるその発現が試
験された。図１４に示すように、胎児、新生児および成
人の上皮組織に由来する幾つかの繊維芽細胞系の夫々に
おいて、優勢な 2.4 kb ＫＧＦ転写が検出された。しか
し、正常起源の上皮細胞系からは検出されなかった。ま
た、該転写は、正常な成人の腎および胃腸管器官から抽
出されたＲＮＡ中でも検出されたが、肺または脳からは
検出されなかった。ＫＧＦ・ＲＮＡ発現が、上皮組織に
比べて間質細胞中で驚くほど特異的であることは、この
因子が、上皮細胞成長の間充織刺激において正常な機能
を果たすことを示した。
【０１３４】比較のために、上皮細胞に対する活性が知
られている他の成長因子のｍＲＮＡについても、上記に
挙げたと同じ組織内で分析した。分析された上皮細胞系
および間質細胞系の中には、ａＦＧＦまたはｂＦＧＦ転
写の発現に一致するパターンなかった（図１４）。該Ｅ
ＧＦ転写は、同じ細胞系の何れにおいても発現せず、ま
た種々の組織のうち腎でのみ観察された。最後に、ＴＧ
Ｆαメッセージは何れの間質繊維芽細胞系でも検出され
ず、また上皮細胞系の夫々において種々のレベルで発現
された。また、試験された組織のうち、腎において、低
レベルで検出された（図１４）。
【０１３５】図１４からは、ヒト胎児肺繊維芽細胞およ
び皮膚成熟繊維芽細胞由来のＲＮＡ中には、単一の2.4
kb転写が存在している一方で、（B5/589）上皮細胞系お
よび（HA83）グリア細胞系、或いはヒト伏在静脈上皮細
胞の一次培養中には何等の転写も検出されなかったこと
が明らかである。
【０１３６】＜ヘパリンによるＫＧＦマイトジェン活性
の阻害＞ヘパリンは、種々の培養中の標的細胞に対する
ａＦＧＦのマイトジェン活性を実質的に増大させ、また
これを熱による不活性化に対して安定化させることが示
されている（II−２１，II−２２）。ｂＦＧＦに密に結
合するにもかかわらず、ヘパリンは、そのマイトジェン
活性に対して最小限の影響しかもたない。ＫＧＦのＦＧ
Ｆに対する関係の観点から、ＫＧＦマイトジェン活性に
対するヘパリンの影響が調べられた。下記の表II−１に
示したように、培地中にヘパリンが含まれているとき、
ＫＧＦに応答したBALB／MKによるチミジン取り込みは16
倍阻害された。対照的に、ａＦＧＦおよびｂＦＧＦの両
者の活性は同一の処理によって増大した。
【０１３７】
【表７】
【０１３８】なお、この実験においては、細胞をマイク
ロタイタープレートに塗布し、血清含有培地中で成長さ
せて集団を形成させ、その後、試料添加前に血清非含有
培地に２４−７２時間置いた。既述の通りに有糸分裂誘
発検定を行なった（実験部分Ｉ上部およびII−３参
照）。示される場所においては、培養培地中に最終濃度
２０μｇ／ｍｌでヘパリンが含有されている。全ての成
長因子の濃度は、５０ｎｇ／ｍｌであった。表中の結果
は、ヘパリンの存在下（＋）もしくは非存在下（−）で
の指示された検定細胞において、 3Ｈ−チミジン取込み
の何倍の刺激であるかを表わす。各々の値は、各点が順
々に重複分析の平均値を表わす２つの独立した実験から
の平均結果を示す。
【０１３９】上記のように、表II−１は、ヘパリンのＫ
ＧＦマイトジェン活性に対する影響と他の成長因子に対
する影響との比較を纏めて示しており、ＫＧＦに応答し
たBALB／MK細胞によるＤＮＡ中へのチミジン取り込みが
ヘパリンによって阻害される一方、これとは対照的に、
ａＦＧＦおよびｂＦＧＦの活性に応答したときは何れの
場合も同じ処理によって増大することを示している。
【０１４０】＜抗ＫＧＦ抗体の製造＞実験免疫学の分野
で良く知られ、かつ上記の方法セクションに要約した標
準的な方法論を用いて、ＫＧＦまたはＫＧＦ様ポリペプ
チドを認識する幾種類かの抗体が調製された。これらに
は次のものが含まれる：ヒト繊維芽細胞由来の完全かつ
精製されたタンパクに対して、マウス内で生成されたモ
ノクローナル抗体；ＫＧＦ・ｃＤＮＡから予測されるア
ミノ酸配列に基づいた配列を有する合成ペプチドに対し
て、兎内で生成されたポリクローナル抗体；ヒト繊維芽
細胞から天然に分泌されたＫＧＦおよび E.coli 中で産
生された組換えＫＧＦ（次のセクション参照）の両方に
対して、兎内で生成されたポリクローナル抗体。
【０１４１】三つの異なったハイブリドーマから得られ
たモノクローナル抗体が精製された。この三つの全て
が、固相（ELISA ）検定において、天然に生じたＫＧＦ
と同様に組換え体を認識した。何れも変性条件下でＫＧ
Ｆと交差反応せず（ウエスタンブロット）、またBALB／
MKバイオアッセイにおいてＫＧＦのマイトジェン活性を
中和しない。
【０１４２】アミノ酸配列 NDMTPEQMATNVRを有する合成
ペプチドを用いて、ポリクローナル抗体が生成された。
このアミノ酸配列は、ＫＧＦの32番から44番までの残基
（図II−１参照）にたいして、ｃＤＮＡによって45位置
に実際にコードされる asp残基の代りにＲ（arg ）残基
を加えたものに対応する。天然ＫＧＦポリペプチドにお
いて、このasp 残基は多分グリコシル化されており、従
って、当該ポリペプチドから直接に得られたアミノ酸配
列データ中では argであるように思える（以下の考察の
項を参照のこと）。この合成ペプチドで生成されたポリ
クローナル抗体は、ELISA およびウエスタンブロット分
析において、少なくとも10 ng の微量のタンパクを検出
できるレベルの感度で、天然に生じたＫＧＦおよび組換
えＫＧＦの両方を認識する。しかし、これら抗体はBALB
/MK におけるＫＧＦのマイトジェン活性を中和しない。
【０１４３】完全な中性ＫＧＦタンパクに対するポリク
ローナル抗血清は、ELISA およびウエスタンブロット検
定の両者において、ＫＧＦを認識する。また、BALB／MK
バイオアッセイにおいて、このような抗体はＫＧＦのマ
イトジェン活性を阻害するように思える。
【０１４４】＜E.coliでのＫＧＦ・ｃＤＮＡの発現＞E.
coli中でポリペプチドを製造するために、ＫＧＦ・ｃＤ
ＮＡは、そのコーディング配列をプラスミド pKK233-2
（II−３１）内でハイブリッドtrk プロモータ（trp お
よびlac プロモータの要素からなる）の制御下に置くこ
とによって発現された。これを達成するために、成熟Ｋ
ＧＦ分子（即ち、そのシグナルペプチドを伴わないも
の）をコードする情報を含んだ特定の長さのＫＧＦ・ｃ
ＤＮＡが、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション技術
（II−３２）を用いて増幅された。このフラグメント
は、標準的組換えＤＮＡの方法論を用いて、ベクターの
二つの部位、即ち、S1ヌクレアーゼ消化によって平滑化
されたNcoI部位とHindIII部位との間に方向付けして挿
入された。選択された組換え体は、ATG 開始コドンがtr
k プロモータ調節要素と正しく並んでいることを確かめ
るために、そのｃＤＮＡ５′末端でシーケンスされた。
【０１４５】小スケール法によって、幾つかの組換え体
がタンパク製造について試験された。要約すると、クロ
ーンは中間指数相（ＯＤ595 -0.5）まで成長され、１mM
のイソプロピルβ- Ｄ- チオガラクトピラノース（IPT
G）で90分間処理され、ウエスタンブロットのために、
細胞抽出物がＳＤＳ- ポリアクリルアミドゲルにかけら
れた。試験された全ての組換え体が、アミノ末端ＫＧＦ
ペプチドに対して生成した抗体によって認識されるタン
パクを合成した。IPTGから最も大きい誘導を示した一つ
の組換え体が選択された。50μｇ／mlのアンピシリン及
び12.5μｇ／mlのテトラサイクリンを含むＮＺＹブロス
中で、１リットルのバクテリアがＯＤ595-0.5まで成長
され、IPTGで90分間処理された。遠心により細胞を回収
し、50mM燐酸ナトリウム（pH 7.3）、0.2M NaCl 中に再
懸濁させ、音波破砕により溶解させた。遠心分離により
細胞破片(cell debris) を除去し、溶解物を直接ヘパリ
ン-セファロース・アフィニティーカラムにかけた。
【０１４６】ウエスタンブロット分析およびケラチン細
胞でのマイトジェン活性によって測定されたように、組
換えＫＧＦは 0.6〜0.6 M NaCl中で溶出する。Mono-S(F
PLC)カラム（ファルマシア）を用いて引続き行った HSA
C の精製により、ＳＤＳ- ポリアクリルアミドゲル及び
銀着色を用いた電気泳動分析により判断して、純度90％
以上と推定されるＫＧＦ調製物が得られた。
【０１４７】組換えＫＧＦは、BALB／MKケラチン細胞へ
のチミジンの取り込みを効率良く刺激したが、 NIH／3T
3 繊維芽細胞に対しては最低限の活性しか示さなかっ
た。標準的なケラチン細胞バイオアッセイにおけるBALB
／MK細胞の半上限刺激は、２〜５ng／mlの濃度で達成さ
れたが、これに比較して、M426細胞から精製されたＫＧ
Ｆについては10〜15ng／mlの濃度であった。
【０１４８】＜ＫＧＦ配列およびａＦＧＦ配列を含むキ
メラの構築＞上記に示した研究によって、ＫＧＦは二つ
の異なった特徴を有することが示された。これらの特徴
は、他の多機能ポリペプチドのコーディング配列中に生
じることが良く知られているように、ポリペプチドの異
なった部分またはドメインによってコードされるもので
あろう。この可能性を試験するために、ａＦＧＦのＣ末
端コアに接合されたＫＧＦのＮＨ2 末端配列をコードす
るキメラＤＮＡセグメントを、以下のように構築した。
ＫＧＦ・ｃＤＮＡの５′末端での Sau3AI 制限酵素部位
（GATC）が切断され、ａＦＧＦ・ｃＤＮＡにおける相同
部位に結合された。上記の Sau3AI 制限酵素部位は、残
基78及び79（夫々 arg 及びile ；図II−１）のための
コドン内にある。また、上記ａＦＧＦ・ｃＤＮＡの相同
部位は、アミノ酸39(arg) 及び40のためのコドン内にあ
る。このキメラＤＮＡの３′および５′末端が、分泌型
のポリペプチドをコードするＫＧＦ・ｃＤＮＡの挿入に
用いたと同じ方法（上記の方法を参照のこと）によっ
て、プラスミド pKK233-2のベクターＤＮＡに結合され
た。
【０１４９】該キメラを有するベクタを用いて組換え
E.coli を構築し、また成熟ＫＧＦについて上記で説明
したようにして発現試験を行ったとき、ＫＧＦおよびａ
ＦＧＦの両方の性質を有する新規生成物が産生された。
このペプチドは、ヘパリン- セファロース・クロマトグ
ラフィーによって富化され、またＫＧＦと同様、ケラチ
ン細胞に対して標的細胞選択性を有するが、繊維芽細胞
（NIH/3T3 ）に対しては最小限の活性しかもたないこと
が分かった。しかし、このキメラのマイトジェン活性は
ヘパリンによる阻害に対して感受性を欠いており、この
特徴はＫＧＦよりもａＦＧＦに類似している。事実、ケ
ラチン細胞に対するマイトジェン活性は、ａＦＧＦの場
合と同様に、ヘパリンによって実際に増大した。こうし
て、本発明に従えば、細胞標的特異性およびヘパリン感
受性の原因であるペプチドドメインはＫＧＦ中において
明確に区別され、また容易に分離可能である。
【０１５０】［考 察」このセクションで説明した実験
は、本発明の幾つかの主要な態様を例示している。これ
らには、ＫＧＦをコードするｃＤＮＡの単離、このよう
なｃＤＮＡの組換え細胞中での発現、ＫＧＦと反応する
種々の抗体の製造、並びにＫＧＦおよびａＦＧＦの両者
のアミノ酸配列および関連機能を具備した新規成長因子
をコードするキメラｃＤＮＡの構築および発現が含まれ
る。また、これら態様に関連した以下のポイントは、本
発明の理解を高めるために留意されるべきであろう。Ｋ
ＧＦ・ｃＤＮＡから予測される配列は、ヒト繊維芽細胞
から分泌された精製ＫＧＦから決定されたアミノ酸配列
と一致した。更に、この配列は、直接のアミノ酸配列に
よっては決定的なアミノ酸の特定ができない位置につい
て、有力な説明を与えた。残基32および46は、ｃＤＮＡ
配列からシステインであると予測される。また、非修飾
システイン残基の加水分解された誘導体は、エドマン分
解に従っては検出できない。また、予測されたＫＧＦア
ミノ酸配列は、残基45〜47に一つの可能なＮ- リンクし
たグリコシル化部位（ Asn-X-Ser／Thr ）を含んでい
た。もしAsn 45 がグリコシル化されると、それはここ
で用いたアミノ酸シーケンシング法によっては検出され
ないであろう。事実、ＮａＤｏｄＳＯ4 ／ＰＡＧＥ上に
おいて、ＫＧＦは精製されたタンパクについて予測され
るよりも高い分子量で、広いバンドとして移動する。こ
れはグリコシル化によって説明され得る。
【０１５１】ＦＧＦは、広い標的細胞特異性をもったヘ
パリン結合性マイトジェンである（II−１０）。hst 遺
伝子はヒト胃癌（II−１１）、隣接正常胃組織（II−１
２）および Kaposi 肉種（II−１３）から、標準 NHI／
3T3 感染アッセイによりトランスフォーミング遺伝子と
して同定された。int-2 遺伝子の産物は、正常にはマウ
スの胚形成の最中に（II−１４）、また異常にはマウス
乳癌ウイルスのプロウイルス的組込み(proviral integr
ation)の後に（II−１５）発現される。
【０１５２】ＫＧＦは同定された繊維芽細胞ファミリー
の６番目のメンバーである（II−２８）。繊維芽細胞に
対する活性が欠如しているからＦＧＦ−６の名称は適切
ではないように思えるが、ＦＧＦファミリーに対する構
造的関連を示すために、この成長因子について当該命名
を用いてもよい。従来特徴付けされた全ての成長因子
は、標的として上皮細胞を排除するか、或いは感受性標
的細胞のメンバーの中に上皮細胞をんでいるかの何れか
であるから、ＫＧＦマイトジェン活性の上皮細胞に対す
る高度の特異的性質、特にケラチン細胞の感受性は独特
のものである。
【０１５３】今日までの研究において、ＫＧＦ転写の発
現は上皮組織由来の間質細胞に特異的であるように思
え、これはその正常な上皮細胞増殖における機能を示唆
する。ＫＧＦ・ｃＤＮＡクローンの入手可能性によっ
て、この成長因子の異常発現が、上皮細胞の形成異常お
よび／または新形成に特徴付けられる臨床状態に関連す
るか否かを決定することが可能になる。更に、この新規
な因子を組換え技術で大量に製造できることによって、
上皮細胞の特異的成長が特に重要であるような状況にお
ける、その臨床適用の試験が可能になるに違いない。
【０１５４】ＫＧＦ配列と、ＦＧＦファミリーの五つの
他のタンパクとを並べて比較することによって、二つの
主な領域の相同性が明らかになる。この領域は、予測さ
れたＫＧＦ配列におけるアミノ酸65〜156 および 162〜
186 に亘っており、両者は該ファミリーの異なったメン
バーで長さが異なる短い非相同的なアミノ酸鎖で分離さ
れている（図１３）。int-2 の場合、この配列の長さは
17残基であるが、hstでは二つの相同領域が隣接してい
る。ＫＧＦにおいて、この介在配列は５個のアミノ酸か
らなっている。
【０１５５】この整列された領域において、ＫＧＦアミ
ノ酸配列の約44％が int-2（マウス）と同一であり、39
％がｂＦＧＦ（ヒト）と同一であり、37％がａＦＧＦ
（ヒト）と同一であり、33％が hst（ヒト）と同一であ
る。この同じ領域において、６種類の全てのタンパクは
残基の19％が同一であり、保存的置換(conservative su
bstitution) が加納であり、28％の相同性を示した。
【０１５６】図１３に示したように、これら関連タンパ
クのアミノ末端は非相同性であり、長さも種々である。
ＫＧＦおよびhst の一次翻訳生成物は、シグナル配列と
して働くと思われる疎水性Ｎ末端領域を含んでいる（II
−１６）。これは、当該Ｎ末端ドメインが成熟ＫＧＦ分
子中に存在しない事実によって更に支持される。これと
は対照的に、ＦＧＦは一見してシグナルペプチドを伴わ
ないで合成される（II−１０）。int-2 タンパクは、不
規則なＮ末端疎水性残基の領域を含んでいるが（II−１
７）、このタンパクが分泌されるかどうかは分かってい
ない。更に、他のファミリーメンバーに比較すると、in
t-2 タンパクは長いＣ末端延長部を含んでいる。
【０１５７】精製されたＫＧＦは５個のシステイン残基
を含んでおり、そのうちの二つはＦＧＦ関連タンパクの
ファミリーに亘って保持される（図１３）。また、ＫＧ
Ｆ配列を通して５個の塩基性残基対が存在する。この同
じパターンは、他のＦＧＦファミリーメンバーにも見出
だされており、それらとヘパリンとの相互作用に含まれ
るかもしれない（II−１８）。また、二塩基部位もタン
パク分解プロセッシングの共通の標的であり、このよう
なプロセッシングによって、幾つかのＫＧＦ調製物に見
られる微細不均一性(microheterogeneity)を説明できる
であろう。
【０１５８】ＫＧＦ・ｃＤＮＡ配列はその全長に亘って
ＡＴリッチであるが、特に３′非翻訳領域においてそう
である。該領域でのＡＴ含量は70％で、推定コーディン
グ配列における60％および５′非翻訳領域における63％
と比較して明らかに高かった。３′非翻訳領域には多数
の ATTTA配列を含まれてた。これは、一時的に発現され
た不安定なＲＮＡの選択的分解に含まれることが提案さ
れている。古典的な AATAAA ポリアデニル化シグナルは
存在しないが、二つの変形配列、即ち AATTAAおよび AA
TACA （II−２０）が、ｃＤＮＡの３′末端におけるポ
リ（Ａ）配列の夫々24ヌクレオチド及び19ヌクレオチド
上流に検出された。
【０１５９】酸性ＦＧＦに対するヘパリンの影響は、該
成長因子の活性コンホメーションの安定化、或いは酸性
ＦＧＦ及びそのレセプタとの三元コンプレックス形成の
何れかに起因することが示唆されている（II−２１，II
−２２）。もしそうであるならば、ヘパリンはＫＧＦの
遊離分子として活性でないコンホメーションを安定化
し、またはそのレセプタと効果的に相互作用できない密
なコンプレックスを形成するのであろう。
【０１６０】そのヘパリン結合能はＫＧＦとＦＧＦとの
構造的類似性を反映しているのに対して、これら関連マ
イトジェンの間の標的細胞特異性は顕著に相違してい
る。ＦＧＦは、胎児の中胚葉および神経外胚葉を起源と
する最後まで分化していない細胞の分割を誘導する。繊
維芽細胞および血管内皮組織に加えて、培養された中胚
葉由来の標的細胞には、筋芽細胞、軟骨細胞および骨芽
細胞が含まれる（II−２３）。ＦＧＦはまた、グリア星
状細胞および神経芽細胞に対してもマイトジェン的であ
る（II−２４）。また、Kaposo肉種から単離されたオン
コジェンの産物（これはhst と同一である）も、NIH/3T
3 及び毛細血管内皮細胞の増殖を刺激する（II−２
５）。今日まで、ＫＧＦ誘導マイトジェネシスは上皮細
胞においてのみ観察されており、繊維芽細胞または内皮
細胞においては検出可能な何等の活性もないことが示さ
れている（既述の実験セクションＩおよびII−３参
照）。従って、ＫＧＦはＦＧＦとは異なった細胞表面レ
セプタを介して作用すると思われる。
【０１６１】ＫＧＦと他のＦＧＦ関連タンパクとの間に
は、顕著なＮ末端相同性は全く存在しない。従って、Ｋ
ＧＦのＮ末端ドメインがその独特の標的細胞特異性を説
明するに十分なものであるかどうかを決定するために、
ＫＧＦと基本型ＦＧＦとの間のキメラ分子の構築が企画
された。このような第一の組換えポリペプチド配列に関
する結果は、ＫＧＦのこのＮ末端ドメインは本質的にケ
ラチン細胞に対する細胞選択性をコードし、ＫＧＦのヘ
パリンに対する感受性は、ａＦＧＦの配列によって置換
されたＣ末端コア領域の何処かにコードされることを示
した。この新規ＫＧＦ様成長因子は、通常使用される抗
凝固剤であるヘパリンの存在下で上皮細胞に特異的な成
長因子の投与が望ましいような臨床的適用において有利
であろう。また、キメラに関する追加の研究は、Ｃ末端
コアの何れの特異的ドメインが、それらの生物学的活性
に対するヘパリンの異なった効果に寄与するかに関する
洞察をも提供するに違いない。
【０１６２】背景技術および本発明の説明を補完する目
的で、この明細書中で今まで指摘した刊行物、特許およ
び特許出願は、ここに参照として明細書中に組み込まれ
る。
【０１６３】明確化および理解の目的で、先の発明を幾
らか詳細に説明した。また、本発明の範囲を逸脱するこ
となく、その形式および詳細において種々の組み合わせ
を行い得ることは明らかであろう。
【０１６４】
【表８】
【表９】
【表１０】
【表１１】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ヒト胎児繊維芽細胞Ｍ426 由来の馴ら
し培地のヘパリン- セファロース・アフィニティーカラ
ムクロマトグラフィーの結果を描いたもので、マウスケ
ラチン細胞（BALB／MK）のためのマイトジェン活性の90
％以上が 0.6M ＮａＣｌで溶出されたことを示してい
る。
【図２】図２は、吸着マトリックスを具備したHPLCを用
いて、ヒト繊維芽細胞からのマイトジェンを更に精製し
た結果のうち、BALB／MKマイトジェン活性の逆相
（Ｃ4）HPLC上のプロファイルを示している。
【図３】図３は、図２に示されたＣ4 クロマトグラフィ
ーから選択された画分の電気泳動分析（ＮａＤｏｄＳＯ
4 ／ＰＡＧＥ）を示しており、ピークＨＰＬＣ画分が銀
染色ゲル上の単一バンドを含むことを示している。
【図４】図４は、図３で分析された分画によってトリガ
ーされたBALB／MK細胞内におけるＤＮＡ合成の棒グラフ
であり、活性プロファイルを横切るタンパクバンドの強
度と良く相関した相対的マイトジェン活性を示してい
る。
【図５】図５は、生理的ｐＨにおける（TSK G3000SW Gl
asPac ）カラムランでの分子篩クロマトグラフィーを用
いた、RP-HPLC に代わる別の精製ステップを示してお
り、ここではBALB／MKバイオアッセイにおけるマイトジ
ェン活性の主要ピークが現れている。
【図６】図６は、ＴＳＫ精製マイトジェンに応答したBA
LB／MKのＤＮＡ合成と、他の成長因子に応答したBALB／
MKのＤＮＡ合成との間の比較を示している。
【図７】図７は、成長因子の異なった組合わせに応答し
た、化学的に限定された培地中におけるBALB／MK細胞の
成長の比較を示している。
【図８】図８は、ヒトＫＧＦ・ｃＤＮＡクローンの概略
的模式図を示している。
【図９】図９は、ＫＧＦ・ｃＤＮＡヌクレオチオ及び予
想されるアミノ酸配列を示している。
【図１０】図１０は、ＫＧＦ・ｃＤＮＡヌクレオチオ及
び予想されるアミノ酸配列を示している。
【図１１】図１１は、ＫＧＦ・ｃＤＮＡヌクレオチオ及
び予想されるアミノ酸配列を示している。
【図１２】図１２は、ＫＧＦ遺伝子から転写されたＲＮ
Ａのノーザンブロット分析による同定を示している。
【図１３】図１３は、高い相同性を有する二つのタンパ
クドメイン、推定シグナル配列および二つの保存された
システイン残基を強調して、ＫＧＦを含むＦＧＦファミ
リー関連分子間のトポロジ−比較を示している。
【図１４】図１４は、選択されたヒト正常細胞系および
組織におけるＫＧＦ関連ｍＲＮＡの（ノーザンブトッ
ト）分析を示す電気泳動写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） (73)特許権者 596000903 スチュアート・エー・アーロンソン アメリカ合衆国、バージニア州 22066、 グレイト・フォールズ、ハリーマン・ス トリート 1006 (72)発明者 ジェフェリー・エス・ルビン アメリカ合衆国、メリーランド州 20851、ロックビル、アパートメント・ ケー − 44、バルチモア・ロード 2020 (72)発明者 ポール・ダブリュ・フィンチ アメリカ合衆国、メリーランド州 20814、ベゼスダ、ホーランド・アビニ ュー 9306 (72)発明者 スチュアート・エー・アーロンソン アメリカ合衆国、バージニア州 22066、 グレイト・フォルーズ、ハリーマン・ス トリート 1006 (56)参考文献 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌ ａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，120, 1984，ｐ337−383 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌ ａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，117, 1983，ｐ235−240 Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎ ｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔ ｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．90，Ｎｏ．１，Ｊ ａｎ 1988，ｐ．２−７ Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎ ｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔ ｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．90，Ｎｏ．５，Ｍ ａｙ 1988，ｐ．767−769 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12N 15/09 G01N 33/53 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (2)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 被検サンプル中におけるケラチン細胞の
    マイトジェン活性を試験するためのバイオアッセイ方法
    であって、 ｉ）ＫＧＦ中和抗体の存在下において、前記被検サンプ
    ルの一部を、周密状態に増殖され且つ血清を含まない培
    地中に維持されたケラチン細胞の培養体に露出させて、
    前記ケラチン細胞におけるＤＮＡ合成の刺激レベルを測
    定することと、 ｉｉ）ＫＧＦ中和抗体の不存在下において、前記被検サ
    ンプルの他の一部を、周密状態に増殖され且つ血清を含
    まない培地中に維持されたケラチン細胞の培養体に露出
    させて、前記ケラチン細胞におけるＤＮＡ合成の刺激レ
    ベルを測定することとを具備し、 上記工程（ｉ）におけるＤＮＡ合成の刺激レベルが、上
    記工程（ｉｉ）におけるＤＮＡ合成の刺激レベルに比較
    して低いことにより、前記被検サンプル中におけるＫＧ
    Ｆの存在が示される方法。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載のバイオアッセイ方法で
    あって、前記ＫＧＦ中和抗体は、下記のアミノ酸配列を
    含むタンパクに対して特異的である方法。 ＣＮＤＭＴＰＥＱＭＡＴＮＶＮＣＳ ＳＰＥＲＨＴＲＳＹＤＹＭＥＧＧＤＩＲＶＲＲＬＦ ＣＲＴＱＷＹＬＲＩＤＫＲＧＫＶＫＧＴＱＥＭＫＮ ＮＹＮＩＭＥＩＲＴＶＡＶＧＩＶＡＩＫＧＶＥＳＥＦ ＹＬＡＭＮＫＥＧＫＬＹＡＫＫＥＣＮＥＤＣＮＦＫ ＥＬＩＬＥＮＨＹＮＴＹＡＳＡＫＷＴＨＮＧＧＥＭ ＦＶＡＬＮＱＫＧＩＰＶＲＧＫＫＴＫＫＥＱＫＴＡ ＨＦＬＰＭＡＩＴ
JP09290175A 1989-01-31 1997-10-22 上皮細胞に特異的な成長因子をコードするｄｎａ Expired - Lifetime JP3088983B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US30428189A 1989-01-31 1989-01-31
US304281 1989-01-31

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP50341390A Division JP3298874B2 (ja) 1989-01-31 1990-01-30 上皮細胞に特異的な成長因子をコードするｄｎａ

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH10243800A JPH10243800A (ja) 1998-09-14
JP3088983B2 true JP3088983B2 (ja) 2000-09-18

Family

ID=23175833

Family Applications (6)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP50341390A Expired - Lifetime JP3298874B2 (ja) 1989-01-31 1990-01-30 上皮細胞に特異的な成長因子をコードするｄｎａ
JP7341890A Expired - Lifetime JP2716416B2 (ja) 1989-01-31 1995-12-27 上皮細胞に特異的な成長因子をコードするｄｎａ
JP09290175A Expired - Lifetime JP3088983B2 (ja) 1989-01-31 1997-10-22 上皮細胞に特異的な成長因子をコードするｄｎａ
JP28551799A Expired - Lifetime JP3802292B2 (ja) 1989-01-31 1999-10-06 上皮細胞に特異的な成長因子をコードするｄｎａ
JP2000311208A Expired - Lifetime JP3802329B2 (ja) 1989-01-31 2000-10-11 上皮細胞に特異的な成長因子をコードするｄｎａ
JP2006060217A Withdrawn JP2006149407A (ja) 1989-01-31 2006-03-06 上皮細胞に特異的な成長因子をコードするｄｎａ

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP50341390A Expired - Lifetime JP3298874B2 (ja) 1989-01-31 1990-01-30 上皮細胞に特異的な成長因子をコードするｄｎａ
JP7341890A Expired - Lifetime JP2716416B2 (ja) 1989-01-31 1995-12-27 上皮細胞に特異的な成長因子をコードするｄｎａ

Family Applications After (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP28551799A Expired - Lifetime JP3802292B2 (ja) 1989-01-31 1999-10-06 上皮細胞に特異的な成長因子をコードするｄｎａ
JP2000311208A Expired - Lifetime JP3802329B2 (ja) 1989-01-31 2000-10-11 上皮細胞に特異的な成長因子をコードするｄｎａ
JP2006060217A Withdrawn JP2006149407A (ja) 1989-01-31 2006-03-06 上皮細胞に特異的な成長因子をコードするｄｎａ

Country Status (22)

Country Link
US (8) US5654405A (ja)
EP (2) EP0555205B1 (ja)
JP (6) JP3298874B2 (ja)
KR (1) KR950012805B1 (ja)
AT (1) ATE197800T1 (ja)
AU (2) AU647732B2 (ja)
CA (2) CA2038398C (ja)
DE (2) DE69033668T2 (ja)
DK (1) DK0555205T3 (ja)
ES (1) ES2153816T3 (ja)
FI (1) FI114711B (ja)
GE (1) GEP20022681B (ja)
HU (1) HU218090B (ja)
IE (1) IE20020188A1 (ja)
LT (1) LT3472B (ja)
LU (1) LU91237I2 (ja)
LV (1) LV10284B (ja)
NL (1) NL300230I2 (ja)
NO (2) NO308312B1 (ja)
RU (1) RU2250213C2 (ja)
SG (1) SG46699A1 (ja)
WO (1) WO1990008771A1 (ja)

Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HU218090B (hu) 1989-01-31 2000-05-28 Stuart A. Aaronson Eljárás hámsejtekre specifikus növekedési faktor és az ezt kódoló DNS, az ez ellen termelődött antitestek valamint a növekedési faktort vagy az antitestet tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
GB9203533D0 (en) * 1992-02-19 1992-04-08 Erba Carlo Spa Use of the conjugate between a fibroblast growth factor and a saporin in treating ocular pathologies
US5814605A (en) * 1993-03-26 1998-09-29 Amgen Inc. Therapeutic uses of keratinocyte growth factor
IL137581A (en) * 1993-03-26 2009-09-01 Biovitrum Ab Publ Pharmaceutical compositions comprising keratinocyte growth factor products and a non-aqueous carrier
US7084119B2 (en) 1993-06-29 2006-08-01 Chiron Corporation Truncated keratinocyte growth factor (KGF) having increased biological activity
JP3570516B2 (ja) * 1993-06-29 2004-09-29 カイロン コーポレイション 増加した生物学的活性を有する短縮型ケラチノサイト増殖因子（ｋｇｆ）
US6268212B1 (en) 1993-10-18 2001-07-31 Amgen Inc. Tissue specific transgene expression
ES2196082T3 (es) * 1994-10-13 2003-12-16 Amgen Inc Analagos del factor de crecimiento de queratinocitos.
SI0785950T1 (en) * 1994-10-13 2003-08-31 Amgen Inc. Keratinocyte growth factor analogs
US6008328A (en) * 1994-10-13 1999-12-28 Amgen Inc. Method for purifying keratinocyte growth factors
JP3877226B2 (ja) * 1994-10-13 2007-02-07 アムジエン・インコーポレーテツド ケラチノサイト成長因子の精製法
US6818439B1 (en) 1994-12-30 2004-11-16 Chiron Corporation Methods for administration of recombinant gene delivery vehicles for treatment of hemophilia and other disorders
US6030613A (en) 1995-01-17 2000-02-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US6693077B1 (en) 1995-02-14 2004-02-17 Human Genome Sciences, Inc. Keratinocyte growth factor-2
US7232667B2 (en) 1995-02-14 2007-06-19 Human Genome Sciences, Inc. Keratinocyte growth factor-2 polynucleotides
US6077692A (en) 1995-02-14 2000-06-20 Human Genome Sciences, Inc. Keratinocyte growth factor-2
EP1486565B1 (en) 1995-10-11 2007-11-21 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Combination of PDGF, KGF, IGF, and IGFBP for wound healing
US6692961B1 (en) 1996-10-11 2004-02-17 Invitrogen Corporation Defined systems for epithelial cell culture and use thereof
US6743422B1 (en) 1996-10-15 2004-06-01 Amgen, Inc. Keratinocyte growth factor-2 products
US20030144202A1 (en) * 1996-10-15 2003-07-31 Amgen Inc. Uses of keratinocyte growth factor-2
DE19716098A1 (de) * 1997-04-17 1998-10-22 Univ Ludwigs Albert Fibroblasten mit einem Fremdgen enthaltende Zusammensetzung zur Behandlung von Wunden
US6228839B1 (en) 1997-12-19 2001-05-08 Emory University Use of keratinocyte growth factor to improve oxidative status
US6869927B1 (en) 1997-12-22 2005-03-22 Human Genome Sciences, Inc. Keratinocyte growth factor-2 formulations
WO1999032135A1 (en) 1997-12-22 1999-07-01 Human Genome Sciences, Inc. Keratinocyte growth factor-2 formulations
CA2320515A1 (en) * 1998-02-13 1999-08-19 Human Genome Sciences, Inc. Therapeutic uses of keratinocyte growth factor-2
US6335317B1 (en) 1998-04-10 2002-01-01 Emory University Use of gut-trophic growth factors to improve oxidative status
US7022683B1 (en) 1998-05-13 2006-04-04 Carrington Laboratories, Inc. Pharmacological compositions comprising pectins having high molecular weights and low degrees of methoxylation
US6313103B1 (en) 1998-05-13 2001-11-06 Carrington Laboratories, Inc. Pectic substance as a growth factor stabilizer
US5929051A (en) * 1998-05-13 1999-07-27 Carrington Laboratories, Inc. Aloe pectins
US6372494B1 (en) * 1999-05-14 2002-04-16 Advanced Tissue Sciences, Inc. Methods of making conditioned cell culture medium compositions
US6371984B1 (en) * 1999-09-13 2002-04-16 Keraplast Technologies, Ltd. Implantable prosthetic or tissue expanding device
US6783546B2 (en) 1999-09-13 2004-08-31 Keraplast Technologies, Ltd. Implantable prosthetic or tissue expanding device
US6376112B1 (en) 2000-02-11 2002-04-23 General Motors Corporation Controlled shutdown of a fuel cell
US6395414B1 (en) 2000-02-11 2002-05-28 General Motors Corporation Staged venting of fuel cell system during rapid shutdown
US6413662B1 (en) 2000-02-22 2002-07-02 General Motors Corporation Fuel cell system shutdown with anode pressure control
JP2001302691A (ja) * 2000-04-17 2001-10-31 Nichirei Corp ヒトｋｇｆに対する抗体
US20030186904A1 (en) * 2001-01-08 2003-10-02 Human Genome Sciences, Inc. Keratinocyte growth factor-2
JP4279554B2 (ja) 2001-02-19 2009-06-17 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング Ｔ細胞エピトープの識別方法および低減された免疫原性を有する分子の製造方法
US7494669B2 (en) 2001-02-28 2009-02-24 Carrington Laboratories, Inc. Delivery of physiological agents with in-situ gels comprising anionic polysaccharides
JP2005500390A (ja) * 2001-08-21 2005-01-06 カイロン コーポレイション Ｋｇｆポリペプチド組成物
US7202066B2 (en) * 2002-01-29 2007-04-10 Carrington Laboratories, Inc. Combination of a growth factor and a protease enzyme
GB0206309D0 (en) * 2002-03-16 2002-05-01 Axordia Ltd Isolated cells
US20050074773A1 (en) * 2002-08-20 2005-04-07 Shimkets Richard A. Methods for diagnosing and treatment of conditions that alter phosphate transport in mammals
AU2005317166B2 (en) 2004-12-15 2009-09-10 Biovitrum Ab (Publ) Therapeutic formulations of keratinocyte growth factor
US20080119433A1 (en) * 2006-07-06 2008-05-22 Aaron Thomas Tabor Compositions and Methods for Genetic Modification of Cells Having Cosmetic Function to Enhance Cosmetic Appearance
BRPI0720874C1 (pt) * 2007-01-05 2021-05-25 Helix Biomedix Inc composições compreendendo peptídeos bioativos curtos para modulação celular e imunológica
BR112012000865A2 (pt) 2009-07-17 2019-09-24 T Tabor Aaron "composição e método para a modificação genética cosmética de células substancialmente intactas"
WO2013149258A2 (en) 2012-03-30 2013-10-03 Charles Drew University of Medicine and Science Compositions and methods for treating or preventing metabolic syndrome disorders
KR102277147B1 (ko) * 2017-12-13 2021-07-13 건국대학교 산학협력단 섬유아 성장인자 유래 펩타이드의 골 또는 연골 분화 촉진 용도

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5096825A (en) * 1983-01-12 1992-03-17 Chiron Corporation Gene for human epidermal growth factor and synthesis and expression thereof
US4444760A (en) * 1983-06-17 1984-04-24 Merck & Co., Inc. Purification and characterization of a protein fibroblast growth factor
US4473679A (en) 1983-12-12 1984-09-25 Borg-Warner Chemicals, Inc. Thermoplastic acrylic elastomers
US4743679A (en) * 1986-02-24 1988-05-10 Creative Biomolecules, Inc. Process for producing human epidermal growth factor and analogs thereof
US4868113A (en) 1986-03-03 1989-09-19 Rorer Biotechnology, Inc. Recombinant DNA vector encoding human endothelial cell growth factor
US4983679A (en) 1986-05-29 1991-01-08 E. I. Dupont De Nemours And Company β-(keto or sulfonyl)esters from reaction of silylketene acetal and acyl or sulfonyl compound
JP2846385B2 (ja) 1988-03-17 1999-01-13 ノボ・ノルデイスク エー／エス ヘパリン結合タンパク、それらをコードするｄｎａ、それらの製造方法およびそれらを含有する治療用調製品
HU218090B (hu) 1989-01-31 2000-05-28 Stuart A. Aaronson Eljárás hámsejtekre specifikus növekedési faktor és az ezt kódoló DNS, az ez ellen termelődött antitestek valamint a növekedési faktort vagy az antitestet tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
JP3570516B2 (ja) * 1993-06-29 2004-09-29 カイロン コーポレイション 増加した生物学的活性を有する短縮型ケラチノサイト増殖因子（ｋｇｆ）
ES2196082T3 (es) 1994-10-13 2003-12-16 Amgen Inc Analagos del factor de crecimiento de queratinocitos.

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１１７，１９８３，ｐ２３５−２４０
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１２０，１９８４，ｐ３３７−３８３
Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．９０，Ｎｏ．１，Ｊａｎ １９８８，ｐ．２−７
Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．９０，Ｎｏ．５，Ｍａｙ １９８８，ｐ．７６７−７６９

Also Published As

Publication number Publication date
JPH10243800A (ja) 1998-09-14
JP2716416B2 (ja) 1998-02-18
LU91237I2 (fr) 2007-02-22
IE20020188A1 (en) 2002-06-26
NO972259L (no) 1997-05-16
CA2349875C (en) 2010-02-09
ATE197800T1 (de) 2000-12-15
FI913637A0 (fi) 1991-07-30
WO1990008771A1 (en) 1990-08-09
NO972617D0 (no) 1997-06-06
EP1016716A2 (en) 2000-07-05
KR910700257A (ko) 1991-03-14
DK0555205T3 (da) 2001-03-05
US6420531B1 (en) 2002-07-16
KR950012805B1 (en) 1995-10-21
US5707805A (en) 1998-01-13
DE69033668D1 (de) 2001-01-04
JP3802329B2 (ja) 2006-07-26
RU2250213C2 (ru) 2005-04-20
JP3802292B2 (ja) 2006-07-26
NO972617L (no) 1997-06-06
HUT58759A (en) 1992-03-30
DE122006000021I1 (de) 2006-07-13
ES2153816T3 (es) 2001-03-16
AU684278B2 (en) 1997-12-11
US5731170A (en) 1998-03-24
CA2038398C (en) 2002-01-22
NL300230I1 (nl) 2006-07-03
NL300230I2 (nl) 2006-09-01
US5665870A (en) 1997-09-09
JP3298874B2 (ja) 2002-07-08
LV10284B (en) 1995-04-20
SG46699A1 (en) 1998-02-20
AU5049690A (en) 1990-08-24
JP2000102396A (ja) 2000-04-11
JPH08277227A (ja) 1996-10-22
AU647732B2 (en) 1994-03-31
GEP20022681B (en) 2002-04-25
LV10284A (lv) 1994-10-20
US5654405A (en) 1997-08-05
CA2349875A1 (en) 1992-09-16
FI114711B (fi) 2004-12-15
NO308310B1 (no) 2000-08-28
US5741642A (en) 1998-04-21
CA2038398A1 (en) 1992-09-16
DE69033668T2 (de) 2001-04-12
AU6598694A (en) 1994-09-08
LT3472B (en) 1995-10-25
NO972259D0 (no) 1997-05-16
JP2006149407A (ja) 2006-06-15
US6709842B1 (en) 2004-03-23
LTIP667A (en) 1995-01-31
JPH04504415A (ja) 1992-08-06
US6833132B1 (en) 2004-12-21
EP0555205A4 (en) 1992-06-02
EP0555205A1 (en) 1993-08-18
EP0555205B1 (en) 2000-11-29
JP2001157594A (ja) 2001-06-12
HU218090B (hu) 2000-05-28
NO308312B1 (no) 2000-08-28
EP1016716A3 (en) 2000-07-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3088983B2 (ja) 上皮細胞に特異的な成長因子をコードするｄｎａ
US10392430B2 (en) Methods of making nucleic acid molecules encoding modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties
RU2265661C2 (ru) Слитый полипептид, способный связываться с полипептидом vegf, и кодирующая его молекула нуклеиновой кислоты, их получение и применение
NL8900178A (nl) Groei regulerende clycoproteinen.
JPH0763378B2 (ja) ＴＧＦ−βをコードしているＤＮＡ
HUT52550A (en) Process for production of a new, tgf-betha 1/betha 2 chimera betha transformating increasing factor
JPH05509320A (ja) 組織誘導型腫瘍成長抑制物質、その調製及び使用方法
US7026291B1 (en) Epithelial cell specific growth factor, keratinocyte growth factor (KGF)
Kramer Epidermal growth factor signalling studied by EGF/TGF-a chimeric proteins: rational design for the development of EGF-receptor antagonists
IE83398B1 (en) DNA encoding a growth factor specific for epithelial cells
JPH09255700A (ja) Ｖｅｇｆ結合性ポリペプチド

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080714

Year of fee payment: 8

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080714

Year of fee payment: 8

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090714

Year of fee payment: 9

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100714

Year of fee payment: 10

EXPY Cancellation because of completion of term
FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100714

Year of fee payment: 10