JP2846385B2 - ヘパリン結合タンパク、それらをコードするｄｎａ、それらの製造方法およびそれらを含有する治療用調製品 - Google Patents

ヘパリン結合タンパク、それらをコードするｄｎａ、それらの製造方法およびそれらを含有する治療用調製品

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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 この発明は、動物モデルにおいて傷口に脈管形成およ
び改良された肉芽形成を供する、従来知られていなかっ
たヘパリン結合タンパク、または同等の修飾物に関す
る。また、この発明は、前記タンパクの製造方法、およ
びヒトにおける組織修復の刺激、特に外傷に対する局所
適用に適した、前記タンパクを含有する医薬調製品の製
造方法に関する。さらに、このタンパクは、正常状態に
おいて糖タンパクであることを特徴とする。
背景技術 負傷によって始まる正常な組織修復は、細胞のイベン
トおよび生化学的イベントの秩序だった列の結果として
起こるものであり、結果として新しい組織を形成する。
傷口の端部に静止する繊維芽細胞が、分裂し、無血管
の傷口空間（wound space）に向かって移動し、かつコ
ラーゲンを産生する。新しい毛細血管が先在する細静脈
および毛細血管から発芽し、傷口の端部に向かって移動
する。これらのプロセスは、治癒している傷口が融合
し、傷口空間が血管新生コラーゲン繊維芽細胞網（肉
芽）で満たされるまで続く。最後に、上皮細胞が分裂し
て肉芽を覆い、修復プロセスが終了する。
血小板は、最初の24時間以内では、鋭利な傷の治癒に
対する最初の重要な細胞要素である。その後、治癒プロ
セスは中性好性顆粒球、続いてマクロファージおよびリ
ンパ球によって引き継がれる。これらの全てが、組織損
傷の後２ないし３日の間に、秩序だった列をなして傷口
に移動するのを見ることができる。注意深く適合させた
パラ分泌性成長因子の放出によって、最後に適切な治癒
を保証するのはこれらの炎症細胞である。近年、この損
傷治癒における、血小板由来成長因子（PDGF）、変換成
長因子α（Transforming growth factor alpha;TGF
α）、および変換成長因子β（Transforming growth fa
ctor β;TGFβ）と呼ばれるこれらの成長因子について
の作用の機構に関する多少の知識が蓄積されてきた。PD
GFは、血小板が新鮮な傷口の端部に付着したときに血小
板のα−顆粒から最初に放出され、かつ繊維芽細胞に対
する強い走化性を有している（Grotendorst、G.R.et a
l.（1981）、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、78:3669−367
2）。これに加えて、PDGFは、TGFαまたは表皮性成長因
子（epidermal growth factor;EGF）の存在下におい
て、同様の細胞に対して分裂誘発性である（Deuel、T.
F.et al.、（1985） Cancer Surv.4:633−653）。
PDGFは繊維芽細胞を活性化してコラーゲンを放出させ
（Bauer,E.A.et al、（1985） Proc.Natl.Acad.Sci.US
A、82:4132−4136）、これにより創傷の治癒における必
須要素である細胞間質の再編に貢献する。
TGFβは血小板中に比較的高い濃度で見出され、血餅
形成の間α顆粒から放出されることも示される。この成
長因子は傷口における細胞間質消形成に重要な役割を果
たしており、PDGF、EGF、およびTGFαのような他の種々
の成長因子に対する調整作用を有することも見出されて
いる。
TGFβは、単球に対する強い走化性活性を示す。この
ため、負傷直後に血小板から最初に放出されるこの成長
因子も、炎症細胞の傷口への移動を刺激することにより
重要な役割を果たす。TGFβは、循環系（circulation）
から単球を補充し、続いてそれらを活性化して分泌型
（secretory phenotype）にする（Wiseman,D.M.et al、
（1988） Biochemical and Biophysical Ressearch Com
munications 157、793−800）。
単球がこの表現型を獲得し、多くの場合マクロファー
ジと呼ばれるようになると、血小板に見出されるものと
同じ因子および修復プロセスに非常に重要な他のいくつ
かを分泌することが示され得る。
このように、単球／マクロファージは、血小板由来成
長因子（PDGF）、変換成長因子β（TGFβ）、変換成長
因子α（TGFα）、塩基性繊維芽細胞成長因子（BFGF）
等の成長調節因子を排出する。インシュリン様成長因子
−１（IGF−１）ボンベシン、顆粒球−刺激因子（GS
F）、顆粒球−マクロファージ・コロニー刺激因子（GM
−CSF）、単球刺激因子（Ｍ−CSF）およびインターロイ
キン−１（IL−１）。この分泌生成物には、プロテアー
ゼ、補体タンパク質、単球由来好中球刺激因子、アラキ
ドネートおよび腫瘍壊死因子α（TNFα）が含まれる（R
om,W.N. et al、（1988）、J.Clion.Invest.82、1685−
1693 : Rappolee D.A.et al（1988） Science 241、708
−712 :参考のために、Unanue,E.R. et al （1978） Sc
ience 236、551−557を参照）。
これらのマクロファージ由来パラ分泌性成長因子は全
て治癒プロセスに関与するが、機構およびこれらの因子
間の複雑な相互作用に関する詳細の多くは未だにほとん
ど理解されていない。
治癒プロセスの間、酸素および栄養で、成長する組織
が十分に得られるということは決定的に重要なことであ
る。これは、その場での新しい血管の形成を導く、脈管
形成として知られる複雑なプロセスによって保証され
る。このプロセスは、秩序だった移動、血管細胞の増殖
および分化を含む（Folkman,M. et al. （1987）、Scie
nce 235、 442）。内皮細胞増殖の直接刺激による脈管
形成の開始は、２つのポリペプチドマイトジェンの仮定
上の責任である。２つのポリペプチドマイトジェンと
は、酸性繊維芽細胞成長因子としても知られるクラスＩ
ヘパリン結合成長因子（HBGF−Ｉ）、およびクラスIIヘ
パリン結合成長因子（HBGF−II）すなわち塩基性繊維芽
細胞成長因子（bFGF）である（Thomas,K.A. （1985）、
Proc.Natl.Acad.Sci. 82、6409: Esch,F.（1985）ibi
d、6507）。これらの因子は血小板中には見られない
が、塩基性FGFは、上述のように、活性化単球／マクロ
ファージから分泌され、、動物モデルにおいてイン・ビ
ボで脈管形成を誘発することが示されている。
したがって、負傷に関連する血小板放出の初期の「突
発（burst）」には、直接の脈管形成因子は含まれな
い。しかしながら、血小板抽出物は脈管形成性であるこ
とがイン・ビボ実験において示され、これが、上述の関
連因子を次々と導く単球活性化の結果であることが示さ
れ得る。血小板における非分裂促進性脈管形成性因子を
単離し、および特徴付けるいくつかの試みがなされてい
るが、この因子の性質はこの技術においては開示されて
いない（knighton,D.R. et al.、1986、Ann.Surg.204、
323−331）。
脈管の形成に欠かすことのできない必要条件は、負傷
領域におけるヘパリンの存在であり、例えばプロタミン
を用いたヘパリンの除去は脈管形成を完全に放棄するこ
とであることが示されている。
したがって、ヘパリン結合特性に加えて、循環系から
負傷領域へ単球を補充する能力および続いてそれらを活
性化する能力を有する因子は、脈管形成に対して、およ
びさらにその上に全修復プロセスに対して非常に重要な
ものであるに違いない。
発明の開示 この発明は、以下に示す理由により脈管形成および組
織修復の刺激に非常に適した、従来知られていなかった
タンパク質（以下、ヒトおよびブタ型をhHBPおよびpHBP
と呼ぶ）を提供する。
ａ）このタンパクは、損傷を受けた組織内で起こるよう
に血小板が活性化されたときに、これらの細胞から放出
される。
ｂ）このタンパクはヘパリンと結合する。
ｃ）このタンパクは、単球に対して走化性である。
ｄ）このタンパクは、単球を、分泌型に向けて形態学的
に活性化する。
ｅ）このタンパクは、培養下の単球を活性化して、培養
下で繊維芽細胞に対するマイトジェンを排出させる。
ｆ）このタンパクの適用は、めんどりの卵の漿尿膜モデ
ルにおいて脈管形成を生じる。
ｇ）このタンパクは、巨視的かつ組織学的検査から判断
されたラットにおける実験モデルの傷口チャンバー（wo
und−chamber）に適用した際に、上皮形成速度を増加さ
せる。
ｈ）このタンパクは、巨視的かつ組織学的検査から判断
された同様の傷口チャンバーモデルにおいて、肉芽組織
形成を増加させる。
ｉ）このタンパクは、巨視的検査から判断された同様の
ラット傷口チャンバーモデルにおいて、血管形成を増加
させる。
ブタおよびヒトの血小板から、従来知られていないタ
ンパク質の２つの特別な例が誘導される。ブタ型のアミ
ノ酸配列は十分に解明されており、請求の範囲第４項に
よってカバーされている。ヒト型は、請求の範囲第４項
に開示されたブタ型のアミノ酸配列を請求の範囲第10項
に開示されたヒト型のアミノ酸配列と比較することによ
り明らかなよように、ブタ型と高い相同性を有してい
る。
組織修復に関する重要な特徴は、タンパクの強いヘパ
リン結合特性である。組織損傷のすぐ後に、炎症に重要
ないくつかの成分の中で結合組織肥満細胞もまた大量の
ヘパリンを放出することが観察できる（Qureshi,R. et
al、（1988）、The Journal of Immunology 141、2090
−2096）。
放出されたヘパリンはコラーゲンと結合することが知
られており、一度これが確立されると、このゆえに、こ
の発明に記載されているヘパリン結合タンパク（HBP）
は固定化される。これは、固定された勾配（gradient）
を形成することを可能とし、グスタフソン（Gustafso
n）らが理論的立場から示唆し、カーター（Cater）が実
験的に示しているように、細胞は増加する基質付着の勾
配を上げる傾向にある。カーターは、この現象は「ハプ
トタキシス（Haptotaxis）」（ギリシャ語：ハプテイン
（haptein）、結び付ける；タキシス、配列）と呼ばれ
るべきであると示唆している。これに基づいて、形態発
生に係わる細胞移動、炎症、創傷の治癒、腫瘍の浸潤お
よび実際の全ての組織の細胞移動は、関与する細胞によ
るハプトタキシス的応答の結果であると考えられる（Gu
st afson,T. et al、 （1963） Intern.Rev.Cytol.、1
5、139、Cater,S.B.（1965）、Nature 208、1183−118
7）。
これに基づいて、ここで言うヘパリン結合タンパク
は、循環系からの損傷組織領域への単球の補充に非常に
適している。続く分泌表現型への活性化はその場で行な
う。すなわち、単球／マクロファージ由来サイトカイン
の完全なカクテルは、傷口における損傷した細胞の近傍
に放出し、治癒を容易にする。
ここに、ヘパリン結合タンパクは、特にヒトの慢性創
傷治癒の刺激に適していることが予見される。慢性脚部
潰瘍（leg ulcers）および高齢患者の床ずれに最も重要
な病因学的因子は、血管新生（脈管形成）の欠如である
と一般に信じられている。
ヘパリン結合タンパクについて言及した特性を基にし
て、慢性創傷へのこのタンパク（好ましくはヒト型）の
外用は、治癒を促進することが予見される。マクロファ
ージの除去は、創傷治癒の応答を遅らせる（Leibovich,
S.J.et al、 （1975）、Am.J.Pathol、78、71）。ヒト
の診察において、そのようなマクロファージの枯渇はい
くつかの疾病を伴うものであり、それはしばしば治療の
結果である。したがって、化学療法または放射線療法で
治療している癌患者に重度の白血球減少が観察される。
そのような患者には、外科的治療の後のゆっくりした治
癒および慢性潰瘍の発生がしばしば見られる。ヘパリン
結合タンパクが示す特別な特性は、そのような患者群に
おける治療学的利益である。
HBPは、重度の火傷の治療に用いることもできる。血
管新生の欠如は、治癒の遅れおよび損傷した組織が感染
症にかかりやすくなる結果を招く。したがって、単球活
性特性を有する成分は非常に有益である。活性化した単
球、すなわち「マクロファージ」はスカベンジャーとし
て作用し、かつそれらは貪食作用によって損傷組織の残
骸を除去する。これは、火傷に関連して最も本質的な機
能である。
最近、腫瘍成長に関連して、マクロファージの成長調
節機能が大きな注目を浴びている。
高濃度の活性化したマクロファージは腫瘍性細胞に対
して細胞増殖抑制性であり、この効果は腫瘍性標的細胞
に対して選択的に向けられる。これに関連して、マクロ
ファージからの推定分泌生成物はTNFαであると信じら
れている（Diegelmann.R.F.et al、1981、Plastic and
Reconstructive Surgery 1968、107−113）。
ここでいうヘパリン結合タンパクは、腫瘍治療におけ
る治療学的な可能性を有している。固体腫瘍（solid tu
mors）に注入されたHBPは循環している単球を腫瘍領域
に補充することができ、続く活性化によって細胞毒性効
果を仲介する。
上で示唆したように、診療所において、この発明に使
用される医薬組成物には、クリーム、軟膏、ゲル、ファ
ーム、包帯材料、バッチ、パッド、人口皮膚、ガーゼ包
帯を浸漬するための水性担体、乾燥賦形粉末（dry swel
lable powders）または縫合系コーティングへのヒトHBP
の組み込みが含まれる。
HBPの閉じ込めに使用し得る処方は、凍結乾燥パッド
または親水コロイド吸蔵包帯（hydrocolloid occlusive
dressing）である。HBPの調節された放出を供給する医
用包帯を使用することが好ましい。
使用可能なゲルは、アルキルセルロース、ヒドロキシ
アルキルセルロースおよびアルキルヒドロキシアルキル
セルロース、例えばメチルセルロース、ヒドロキシエチ
ルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキ
シプロピルメチルセルロースおよびヒドロキシプロピル
セルロース等の水溶性エーテル化セルロース誘導体を添
加することによって高粘度にされた水性ベースからな
る。ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチル
セルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロース
のようなヒドロキシアルキルセルロース誘導体が好まし
い。通常、ゲル化剤を添加する前に、HBPを水相に溶解
する。
凍結乾燥パッドは、ゲルの凍結乾燥によって形成され
た合着繊維構造を有する親水コロイドからなることも可
能である。この親水コロイドは、上述の水溶性エーテル
化セルロース誘導体であってもよい。通常、HBPは凍結
乾燥の前にパッドに閉じ込められている。
医用包帯は、その内部にHBPを有する粘着性吸蔵包帯
であってもよい。この包帯は、シーリング材料、連続相
としての粘着付与剤、および上述のエーテル化セルロー
ス誘導体のような水溶性または水膨潤性化合物の１種以
上を有する連続相に分散した不連続相を含む。この不連
続相の水中で膨潤する能力は、前もって物理的に閉じ込
められたHBPを徐々に放出する可能性を与える。HBPは、
液体処方の形態で、皮下、筋肉内または静脈内注射によ
って投与することもできる。さらに、HBPの投与は、
鼻、口腔、直腸または腹腔経路によって行なうこともで
きる。
この発明によると、HBPは、血小板から製造すること
が可能であり、ブタまたはヒトの血液から得ることがで
きる。より詳細には、このタンパクは、血小板抽出物の
分画によって得ることができる。ヘパリン−セファロー
スを用いるカラムクロマトグラフィは、この目的に都合
がよい。そのようなクロマトグラフィによる方法には、
最初に血小板抽出物が注がれるカラムからの0.5Mから3M
までのNaClを用いた勾配溶出が含まれ、結果として２つ
のピークが溶出される。1.2M NaCl周辺の第１のピーク
は、280nmで巨大タンパクピークとして測定することが
でき、それ自体公知の血小板因子（PF4）である。1.8M
NaCl周辺では、タンパク量は使用するシステムの検出限
界を下回っているが、この領域の分画は脈間形成活性を
有している。この活性分画を、さらにC4カラムを用いた
微孔逆相HPLC（microbore reverse phase HPLC）によっ
て精製する。完全に純粋なタンパクピークを214nmで検
出することができ、このタンパクは、使用する血小板の
種類によって、この発明のブタまたはヒト型のいずれか
のHBPと同一である。
HBPは組換え技術によっても製造することができる。
細菌、酵母、真菌または哺乳動物細胞系を、HBP製造の
ための宿主として使用することができる。HBPをコード
するDNA配列の他に、必要な転写または翻訳シグナルを
含有する適切なベクターを用いた宿主細胞の形質転換に
より、HBPの製造を達成することができる。
生成物が細胞内に産生されるのか、または増殖培地に
に分泌されるのかを選択することが可能である。多くの
分泌シグナルが知られている。米国特許4,336,336は、
原核生物に対する、非細胞質タンパクをコードするリー
ダー配列の使用を開示している。この非細胞質タンパク
は、通常、細胞表面へ、もしくは細胞表面をこえて移送
され、その結果として融合タンパク（fused protein）
がペリプラスム間隙に移送される。酵母に対しては、Ku
rjan＆ Herskowitz、Cell（1982）、30、933−943が、
成熟α因子の４つのタンデムコピーを有し、配列を記述
し、および処理機構（processing mechanism）を前提と
する推定α因子前駆体を開示している。このシグナル配
列は、このシグナル配列の発見の後ずっと、酵母サッカ
ロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）
からの多種のポリペプチドの分泌に使用されている。Br
ake et al、PNAS USA、81、（1984） 4642−4646は、そ
の一例を提供している。
細菌には、タンパク質の糖付加または、最も多くの場
合、ヒト起源のポリペプチドに正確なジスルフィド架橋
を形成することのいずれかが不可能である。しかしなが
ら、酵母には、正確なジスルフィド架橋を形成すること
ができる。しかし、高度の真核細胞（higher eucaryote
s）が行なうのと同様の方法ではタンパク質の糖付加を
行なわない。哺乳動物の細胞系と同様の方法で糖付加を
行ない、このため、将来、酵母を糖附加したタンパク質
に対する有用な宿主にする酵母突然変異体が単離されて
いる。
さらに、この発明のHBPは、還元条件下のSDS−PAGEに
おいて単一帯として移動し（第１図および第２図に記
載）、約28kDaのMrを有することを特徴とする。
ブタ血小板から精製されるヘパリン結合タンパクは、
下記のアミノ酸配列を有する。
ヒト血小板から精製されるヘパリン結合タンパクは、
下記の配列を有する。
Ｎ−末端から このタンパクは、さらに、糖付加されていることを特
徴とする。
GENETIC COMPUTER GROUP、ウィスコンシン大学からの
プログラムを用いた、タンパク質データバンクに対する
両ヘパリン結合タンパクのコンピュータ検索では、この
発明のタンパクは従来知られていないことが示された。
この発明を下記の例によって説明する。
図面の簡単な説明 第１図 ブタ型ヘパリン結合タンパクの還元条件下にお
けるSDS−PAGEである。
レーン1:Mrマーカー レーン2:pHBP 第２図 ヒト型ヘパリン結合タンパクの還元条件下（例
２参照）におけるSDS−PAGEである。
レーン1:Mrマーカー レーン2:hHBP 第３図 ニワトリ胚漿尿膜を用いたHBPに対する脈管形
成の試験。説明のために例５を参照。
第４、５および６図 これらの写真には、HBPで処理した単球（8ng/ml）
（第４図）、エンドトキシン処理した単球（100ng/ml）
（第５図）およびPBS処理単球（コントロール細胞）
（第６図）が示されている。説明のために例６を参照。
例１ 豚の血液からの血小板500gをPBS1.5l中に懸濁し、液
体窒素（N2）により３回冷凍・解凍した（以下、冷凍／
解凍物と呼ぶ）。この冷凍／解凍物を40,000×ｇで30分
間遠心分離し、得られた上澄みを300,000×ｇで60分間
超遠心分離にかけた。得られた上澄みを10Mmリン酸緩衝
液（0.5M NaCl,pH7.4）20容量に48時間透析した。この
透析物を5cm（I.D.）×10cmヘパリン−セファロース
（登録商標:Heparin− Sepha−rose）C1−4Bカラム上
に、120ml/時の流速で汲み上げた。前記試料を透析した
のと同じ緩衝液（緩衝液Ａ）でこれ以上蛋白質が溶出し
なくなるまで、カラムを洗浄した。次いで、カラムを緩
衝液Ａから緩衝液Ｂ（10mMリン酸緩衝液,3M NaCl,pH7.
4）への線状の勾配によって、20時間、1.7ml/分の流速
で溶出した。200個の分画（夫々 ６分間）を採取し
て、脈管形成効果を試験した。前記勾配のうち1.8M NaC
l分画のあたりに対称的に分布した50個の分画が活性を
示した。これらの分画を合わせ、0.5mg/mlの濃度になる
までオベ−アルブミン（ove−albuminn）と混合した。
合わせた分画を20容量の緩衝液Ａに透析し、次いで、0.
6mlヘパリン−セファロース（登録商標）C1−4Bカラム
上に6ml/時の流速で汲み上げた。カラムを、10時間、線
状の勾配によって0.04ml/分の流速で溶出した。夫々200
mlの分画120個を採取して脈管形成効果を試験し、次い
でこれらを合わせた。さらに、合わせた分画を逆相C4カ
ラム（0.1ml容量）上で、0.1％トリフルオロ酢酸（TF
A）を含有する０％から80％のアセトニトリルへの線状
の勾配により30分間、0.025ml/分の流速でクロマトグラ
フにかけた。脈管形成効果は、26分間の保持時間を有す
るベースラインから離れた頂点に検出された。
還元条件下でのSDS−PAGEは、そのピークが、Mrが28k
Daのある成分（HBP）を含有することを示す（第１図参
照）。同じピークの蛋白質は請求の範囲第４項にある配
列を有する。
例２ ヒト血小板からのHBPの製造 健康な血液供与者から新しく提供された血小板（thro
mbocyte）濃縮物100部を混合し、前記血小板を1700gで1
5分間、25℃で遠心沈降させた。 遠心沈降された血小
板をPBS3容量に懸濁させ、この懸濁物を液体N2で６回冷
凍・解凍した。次いで、この懸濁物を40,000gで60分間
遠心分離した。これらの上澄みを２日間、10mMリン酸緩
衝液（0.5M NaCl,pH7.4）20容量に透析した。この透析
物を、5cm（I.D.）x10cmヘパリン−セファロース（登録
商標）C1−4Bカラム上に、50ml/時の流速で汲み上げ
た。前記試料を透析したのと同じ緩衝液（緩衝液Ａ）
で、これ以上蛋白質が溶出しなくなるまでカラムを洗浄
した。このカラムを緩衝液Ａから緩衝液Ｂ（10mMリン酸
緩衝液、3M NaCl,pH7.4）への線状の勾配によって、20
時間、0.90ml/分の流速で溶出して、200個の分画（夫々
６分間）を採取した。前記分画を微孔逆相（Microbor
e Reversed Phase）C4カラム（アクアポール・ブチル
（Aquapore Butyl）100×2.1mm,7μｍブラウンリー・ラ
ブス（Brownlee Labs））により、次のような勾配で試
験した。： この装置は、アプライド・バイオシステムス（Applie
d Biosystems） 134A分析装置であり、前記蛋白質を214
nmで監視した。20分間の保持時間を有するピークを採取
した。乾燥後、前記試料を0.1Mトリス−C1 （Tris−C
l）、1mM EDTA、2.5％ SDS、0.01％プロモフェニルブル
ー、５％２−メルカプトエタノール（pH8.0）で稀釈し
た。95℃で５分間後、この試料をSDSフェーストゲル（S
DS Phast Gel）（８〜25％）のゲルおよびSDS緩衝液ス
トリップス（SDS buffer strips）を有するファルマシ
ア・フェースト・ゲル（Pharmacia Phast Gel）装置に
よりSDS PAGEにかけた。
前記試料を250V,10mA,15℃、60Vhで試験した（13）。
70〜120の分画はMr 28,000を有するバンドを示した。こ
れらの分画を合わせて、緩衝液Ａの20容量に透析した。
この透析物を1mlヘパリン−セファロース（登録商標）C
1−4Bカラム上に汲み上げ、カラムを、緩衝液Ａから緩
衝液Ｂへの勾配によって、10時間、0.04mL/分の流速で
溶出して、200μｌの分画（120）を採取した。
例３ ヒト組織からのHBP製造 この目的のために、ヒト細胞系（K562）を使用した。
慢性骨髄性白血病（leucemia）患者に由来するこの細胞
系は、12−０−テトラデカノイルホルボール−14−アセ
テート（TPA）により循環する血小板の前駆体である巨
核芽球への分化を引き起こされ得る。アリタロ（Alital
o）ら（12）は、TPAによって処理されると、これらの細
胞の中にPDGFのための遺伝子が誘導されることを示して
いる。
K562細胞を、175cm3ヌクローン瓶（Nuclone bottle）
中、10％胎児血清アルブミンおよび抗菌剤で補ったRPMI
1640培地で培養した。細胞の濃度は、1mlあたり〜300,
000細胞に調節し、DMSOに溶解したTPA（シグマ（sigm
a））を3nMの濃度まで加えた。３日後、細胞を500×ｇ
での遠心分離によって沈降させた後、10容量のPBSで１
回洗浄し、続いて再沈降を行った。
この方法で回収された細胞10gを、３容量のPBSと混合
し、その懸濁物を液体N2で６回冷凍・解凍した。この懸
濁物を300,000×ｇで60分間超遠心分離し、次いで懸濁
物を、0.5M NaClを含有する10mMリン酸緩衝液（pH7.4）
で300mlに稀釈した。稀釈した試料を0.5mlヘパリン−セ
ファロース（登録商標）C1−6B上に72時間で汲み上げ
た。次いで、カラムを、使用している緩衝液（緩衝液
Ａ）から緩衝液Ｂ（3M NaClを含有する10mM Na−リン酸
緩衝液（pH7.4））への勾配によって10時間で溶出させ
た。
４つの分画（1.8M NaClのあたりに相対称である）
を、30分間で、0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）が混合さ
れた０％から80％のアセトニトリルへの勾配によって25
μlml/分の流速で、微孔逆相C4カラム（アクアポール・
プチル100×2.1mm,7μｍブラウンリー・ラブス）のクロ
マトグラフに別個にかけた。
26分間の保持時間を有する蛋白質のピークは、豚のHB
Pの保持時間と同一である。
例４ HBPの脈管形成特性の検出 約240gの体重を有し、且つ80日齢のウィスター・ファ
ミリー（Wistar family）CRL:（W1）BRの雄ラットを使
用した。このラットを、使用前６日間、21±１℃，相対
湿度60±10％に、１時間あたり10回換気し、午前６時30
分から午後６時30分まで光をあてて環境馴化させた。ラ
ットを、底におがくずがあるプラスチックケースに入れ
ておいた。これらのラットに、アルトロミン規定食1324
（Altromin diet 1324）を不断給餌し、飲料水を自由に
飲ませた。
ラットを、ペントバルビタール50mg/kg体重を腹腔内
注射して麻酔をかけた。ラットの背中を剃り消毒した。
3cmの背部の切り口を介して左の腎臓を露出させ、HBP
［3x3mmゲルファーム（登録商標,Gelfirm）吸収性ゼラ
チン（アップジョン（Upjohn））上に乾燥されたアッフ
ィ／ゲル（登録商標,Affi/Gel）ブルー100−200メッシ
ュ（mash）（湿潤状態）（75−150μ）10μｌに予め吸
収させたもの］を、小さい切り口を通して腎臓の繊維性
被膜の下に埋設した。この表面を、５つの絹の縫合によ
って塞ぎ、術後、テムゲシック（登録商標;Temgesic）
を毎日２回0.1mlの投与量で３日間与えた。術後５日、
ラットを再びペントバルビタールで麻酔にかけ、左の腎
臓を露出させた。移植物の周辺の領域は、肉眼的評価に
よって明らかに新しい血管形成を示した。
例５ ニワトリの胚の漿尿膜を使用した豚及びヒトHBPによる
血管形成試験 妊娠の第１日の受精したニワトリの卵を、加湿された
37℃ふ卵器内に放置した。第７日に卵の鈍端に25GS/80.
8×16針を使用して穴をあけて、引き続きふ卵した。第
９日に1cm×1cmの“窓”を、卵の尖端に殻を通してあ
け、この窓をテガダーム（登録商標、Tegaderm）で覆っ
た。ふ卵を続け、第11日にHBP（５〜30ng）［3x3mmステ
リル・ゲルファーム（登録商標,sterile Gelfirm）吸収
性ゼラチン（アップジョン）上に乾燥されたアッフィ／
ゲル（登録商標）ブルー100〜200メッシュ（湿潤）（75
−150μ）３μｌに予め吸収させたもの］を、胚の漿尿
膜の上にアフィゲルを該膜に向けて埋設し、前記窓を再
びテガダームを使って覆った。37℃で５日間ふ卵した
後、反応を肉眼で評価した。
30および5ngのHBPの両方とも、より大きな血管の明ら
かな退化及び典型的な毛細管球（cappillary−ball）の
形成を伴って、前記アフィゲルの領域での微小血管床の
密度の大きな増加を誘引した（図参照）。
例６ ヒトの単核球の活性化 単核球を、健康な血液供与者からのクエン酸塩添加血
液（citrated blood）の“バフィーコート（buffy coa
t）”から単離した。
単核細胞を、次のようにして単離した。：“バフィー
コート”を冷却されたRPMI 1640 1容量で稀釈し、50ml
ファルコン（Falcon）試験管内のフィコール−パキュ
（Ficoll−Paque）15mlの頂部に積層した。スイングア
ウトローターで400×g30分間遠心分離後、フィコール−
パキュとRPMI 1640−血漿の間の層（単核細胞69及び血
小板を含有する）を取り除いた。100×ｇで３回洗浄し
て血小板を取り除いた。単核細胞を、パーコール勾配
（Percoll gradient）で分画した。:10×MEMおよびRPMI
1640をパーコールの備蓄溶液（濃度:1.13g/ml）に添加
し、1.066g/mlの濃度を有する等張液にした。パーコー
ル勾配を、35°に固定された角度のローターを有するヘ
レアウス・メディフューグ（Hereaus medifuge）によっ
て3000×ｇで15分間遠心分離して実行した。この勾配の
頂部に、単核細胞を積層し、スウィングアウトローター
で20分間、2,700×ｇで遠心分離した。一番上のバンド
に、単核球が非特徴的エステラーゼ染色によって決定さ
れた90％以上の純度で検出された。単核球を、ペニシリ
ン／ストレプトマイシンを含有するRPMI 1640中で24ウ
エルのマクロウエル・デッシュにおいて１×106細胞/ml
の濃度に培養した。この培養液は、6pq/ml以上のエンド
トキシンは含有しなかった。
単核球の培養液における分裂誘発活性を試験する前
に、MRC−５ヒトの肺の胚繊維芽細胞を、２％ FCSを有
するMEM中で96ウエルのミクロウエルにおいて、１×104
細胞/mlの開始濃度で４日間培養した。単核球の培養液1
00μｌにおける分裂誘発活性は、単核球の培養液を添加
した24−42時間後、MRX−５細胞を3H−チミジン（１μC
i/ml）でパルス標識することによって決定した。
結果： 単核球をHBP 5ngと共に培養した場合、培養後１日及
び２日間で形態学的変化が観察される。前記単核球は、
1mg/mlのBSA（ウシ血清アルブミン）を含有するエンド
トキシン（endotoxinin）100ng/mlと共に培養された単
核球（第５図）と同様に伸長された（第４図）。コント
ロールの細胞は、活性化された形態をもたず、ほとんど
の細胞は均一な球形のままである。（第６図）。単核球
を添加する前に、ウエルの底にHBPをスポット付けして
乾燥した場合に、単核球の形態学的変化が最も明確に観
察された。このことは、固定化されたHBPが、固定化さ
れていないHBPに比べて単核球をより活性化するのに優
れていることを示し得る。
単核球からの培養液をMRC−５ヒト繊維芽細胞に対す
る分裂誘発活性について試験した場合、前述のHBPと共
に２日間培養した単核球が、コントロール単核球の約２
倍量の分裂誘発活性を分泌することがわかった。LPS 10
0ng及びBSA 21mg/mlと共に培養した単核球は、コントロ
ールの単核球を培養した場合の約５倍の分裂誘発活性を
示した。
例７ HBPの局所的処方 HBPは局所投与のために次のような組成で処方された。
成分 ％W/W 蒸留水 92.98 ヒドロキシエチルセルロース 4.0 塩化ナトリウム 0.41 リン酸水素二ナトリウム二水和物 0.83 リン酸二水素カリウム 0.28 加水分解ゼラチン（hydolyzed gelatine） 0.5 ベンジルアルコール 1.0 上述の組成物10gに、HBP 250ngを添加した。
例８ HBPの非経口投与に適した注射可能な組成物は、安定
化剤、塩、緩衝液、防腐剤及びそれらの混合物を含有す
る。HBPをその生物学的活性を維持するに足りるだけ安
定化する簡単な組成物は、皮下、筋肉内、または静脈内
に注射することができる。
注射可能な組成物 成分 ％W/V グリシン 0.15 リン酸水素二ナトリウム 0.026 リン酸二水素カリウム 0.026 マンニトール 0.74 蒸留水 100 この処方に、防腐剤である0.9％（v/v）ベンジルアル
コールを含有させることもできる。上述の組成物1ml
に、HBP25ngを添加する。
例９ ラットにおける傷口チャンバ中へ局所投与後の傷口治
癒に関する豚HBPの効果 概要 傷口治癒試験において、25匹のラットの４つの群に、
ラットの首すじの皮膚を筋膜（muscular fascia）に至
るまで除去した後、直径約15mmの領域に傷口チャンバを
つけた。これらの群にヘパリン結合タンパク（HBP）12.
5ng、2.5ng、0.5ngまたは偽薬を、８日間毎日２回、局
部的に投与した。0.1％ラットアルブミンを有する0.9％
生理食塩水の溶液を偽薬及び溶解培地として使用し、す
べての投与量を100μｌ容量で投与した。２つの最も高
い投与量レベルでは、HBPは傷口治癒について十分な促
進効果を有していた。この促進効果は、上皮形成の度合
いに基づいて判断した。一番高い投与量の群の傷口は、
には豊富な血管新生が見られた。
物質及び方法 実験動物 100匹の雌のウイスター・ラット（Wister rat）（系
統CRL:（W1）BR,体重（b.t.）約240g、日齢80日）を使
用した。このラットをチャールズ・リバー（Charles Ri
ver,BRD）から購入し、使用前６日間、21±１℃、相対
湿度60±10％、１時間あたり10回の換気及び６時30分か
ら18時30分の日光で環境馴化させた。ラットは、松の床
がある正長方形のプラスチックケースに入れておいた。
これらのラットに、アルトロミン規定食1324を不断給餌
し、飲料水を自由に飲ませた。
手術 前記ラットをペントバルビタール（50mg/kg体重）を
腹腔内注射して麻酔にかけた。ラットの首すじを剃り、
直径50mmの手術領域を洗浄・消毒して、付着物質をはぎ
取って小さい粒子や毛を除去した。プラスチック内部リ
ング及び付着物質の中のナイロンメッシュからなる傷口
チャンバは、皮膚の上に張り付けた。傷口チャンバの内
径は16mmであり、総直径は45mmであった。更に、前記ナ
イロンメッシュを皮膚に12か所の絹の縫合で固定した。
プラスチック内部リングの内側の皮膚を、筋膜に至るま
で除去した。この傷口をポリウレタンの蓋で覆い、亜鉛
硬膏で前記傷口チャンバに張り付けた。
術後、ラットにテムゲシック（登録商標）を0.1mlの
投与量で３日間毎日２回与えた。
投薬 pHBPを、毎日２回、0.1％ラットアルブミン（シグマA
4538）を含む0.9NaCl溶液100μｌにより投与した。この
溶解液を偽薬として使用した。
術後、ラットを、25匹のラットからなる４つの群に無
作為抽出し、それらの群に、手術の日（第１日）には１
回、第２日〜第８日には１日２回次のように投薬を行っ
た。
第Ｉ群 12.5ng pHBP 第II群 0.5ng pHBP 第III群 2.5ng pHBP 第IV群 偽薬 これらの投与量を、傷口チャンバの蓋のちょうど下に
局所的に投与した。カニューレをポリウレタンの蓋を通
して挿入した。
観察 ラットを、第１日、第３日、第５日、第７日及び第９
日に体重測定した。第９日に、ペントバタルビタールで
麻酔をかけながら傷口チャンバを取り除いた。傷口を肉
眼及び写真で評価した。後の組織学的試験のために、手
術部位及びその周囲の領域を切開し、リン緩衝中性４％
ホルムアルデヒド中に固定した。最後に、ラットは、腹
部大動脈からの出血によって致死された。この血液は、
IGF−I,PIIINP及びヒアルロン酸の分析のための血清と
してサンプリッグされた。
結果 表Ｉは、４つのラットの群についての群平均体重（gr
uop mean body weight）を示す。すべてのラットは、術
後体重が減少し、第５日に、最も減少した体重が記録さ
れた。体重について、群相互間に著しい違いは見られな
かった。
傷口の肉眼による試験の結果、第９日に新しい上皮で
覆われた傷口及びその周囲の領域を次のようにして計算
した。：頭蓋−尾、左−右の２つの直径を測定し、平均
直径（Dtotal）を使用して傷口の総面積を計算した。
新しく形成された上皮を、最も広い箇所及び最も狭い
箇所について両縁間を夫々計測した。２つの結果を加算
し、Dtotalから減じて、開いている傷口についてDopen
を得た。
開いている傷口の面積を計算した、： 総面積から開いている傷口の面積を減じて新しい上皮
で覆われた面積を得た。この面積を、さらに総面積に対
する百分率として計算した。１日２回、HBP 12.5ng（1
2.5ng×2HBP）を投薬した３匹のラットにおいて、開い
ている傷口の領域内に上皮化された半島（epithelializ
ed peninsulas）の通常でない形式を観察した。
測定値及び計算された面積の結果を、同封のデータ・
シートに示した。これらの結果の概観を表IIに提供し
た。
最も高い投与量でHBPを投与した多くのラットにおい
て、上皮の縁の直ぐ内側及びその全体に赤い出血領域を
観察し、その傷口には豊富な血管新生が生じているよう
に見えた。この投与量の群及び中間の投与量の群（2.5n
g）において、十分に高い度合いの上皮化が観察され
た。種々の群における傷口の総面積については、偽薬を
投与した群の面積とあまり著しい違いはなかった。
フィブリンで覆われた傷口を、傷口チャンバの蓋の大
部分と共に取り除いたので、蓋＋フィブリンを組織学的
試験のための組織と一緒に固定した。
結論 傷口の肉眼的試験に基づいて、HBP（毎日２回12.5ng
及び2.5ngを投与したもの）が、上皮化の度合いから判
断して、傷口治癒を十分に促進したと結論を下すことが
できる。最も高い投与量の群における傷口の血管新生の
高い度合いは、HBPの脈管形成効果によるものである。
ラットにおける傷口治癒 組織学的評価 物質 厚さ５μｍの切片を、パラフィンに埋設した傷口から
中央（頭蓋−尾方向）で切り出した。
該スライスをヘマトキシリシン−エオジン（cosin）
で染色し、光学顕微鏡で観察した。
結果 顕微鏡による評価の結果、第９日における新しい上皮
を次の方法で計算した。： 全傷口の直径を測定し、開いている傷口の直径を測定
して減じた。： 等級尺度を、ラットにおける傷口治癒の定量的な組織
学的評価と組み合せて使用した。
第９日での傷口の面積および新しい上皮に覆われた面
積を、次の方法で計算した。
さらに、新しい上皮の面積を総面積に対する百分率と
して計算した。
測定結果並びに算出した等級及び面積を表に示す。
結論 傷口の顕微鏡による試験及び等級尺度についてのデー
タの評価に基づいて、ｐ−HBP（投与量12.5ng及び0.5n
g）は傷口治癒効果を有していると結論を下すことがで
きる。
前記効果は、第Ｉ群及び第II群（pHBPの投与量12.5ng
および0.5ng）における高い顆粒化組織によって生じる
（表II）。第Ｉ群（pHBP投与量12.5ng）において、顆粒
化組織は偽薬の群と比較してよりも成熟している。前記
面積計算より、上皮化の度合いは各群の間に著しい違い
がないことを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 9/64 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ (72)発明者 トムセン、ヨハンス デンマーク国 デイ・ケイ―2980コッケ ダル、ファサンバンゲット 506 (72)発明者 バイン、ステェフェン デンマーク国 デイ・ケイ―4000 ロス キルデ、テューン、パイルヴェジ 16 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 9/64 ＢＩＯＳＩＳ（ＰＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) Ｇｅｕｓｅｑ

Claims (22)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記のアミノ酸配列： を有するブタ型ヘパリン結合タンパク（但し、X195及び
    X196は任意のアミノ酸であり、X217は一つまたは二つの
    任意のアミノ酸である）。
  2. 【請求項２】請求項１に記載のブタ型ヘパリン結合タン
    パクであって、該タンパクが分子間ジスルフィド結合を
    含むと共に、還元条件下でのSDS−PAGEにより測定され
    た約28kDaのみかけの分子量を有し、更にイン・ビボに
    おいて脈管形成特性を示し、且つ単核細胞に対する走化
    性を示すことを特徴とするブタ型ヘパリン結合タンパ
    ク。
  3. 【請求項３】請求項２に記載のブタ型ヘパリン結合タン
    パクであって、Asn113の位置でグリコシル化されている
    ことを特徴とするブタ型ヘパリン結合タンパク。
  4. 【請求項４】下記アミノ酸配列を有する請求項１に記載
    のブタ型ヘパリン結合タンパク。
  5. 【請求項５】X217がAsnProの配列で示される二つのアミ
    ノ酸であることを特徴とする、請求項１〜３の何れか１
    項に記載のブタ型ヘパリン結合タンパク。
  6. 【請求項６】下記のアミノ酸配列： Ｎ末端から Ｃ末端から （但し、ｎは当該タンパクにおけるアミノ酸の全数を表
    す。） を有し、該タンパクが分子間ジスルフィド結合を含むと
    共に、還元条件下でのSDS−PAGEにより測定された約28k
    Daのみかけの分子量を有し、更にイン・ビボにおいて脈
    管形成特性を示し、且つ単核細胞に対する走化性を示す
    ヒト型ヘパリン結合タンパクであって、 以下のステップ： （ａ）ヒト血小板またはその前駆細胞を等張の緩衝液中
    に懸濁することと、 （ｂ）前ステップで調製した懸濁液を数回凍結・融解す
    ることと、 （ｃ）前ステップで調製したサンプルを遠心して、可溶
    性タンパク質を含有する上清画分を得ることと、 （ｄ）該上清画分を、ヘパリン結合タンパクを特異的に
    結合し得るヘパリンカラムにかけて、ヘパリン結合タン
    パクを得ることと、 （ｅ）該ヘパリン結合タンパクを逆相カラムにかけて、
    約28kDaの見かけの分子量を有するタンパク質を単離す
    ることと を具備する方法によって得られることを特徴とするヒト
    型ヘパリン結合タンパク。
  7. 【請求項７】下記のアミノ酸配列： Ｎ末端から Ｃ末端から （但し、ｎは請求項６に定義したのと同じ意味を有す
    る。） を有し、該タンパクが分子間ジスルフィド結合を含むと
    共に、還元条件下でのSDS−PAGEにより測定された約28k
    Daのみかけの分子量を有し、更にイン・ビボにおいて脈
    管形成特性を示し、且つ単核細胞に対する走化性を示す
    ヒト型ヘパリン結合タンパクであって、 以下のステップ： （ａ）ヒト血小板またはその前駆細胞を等張の緩衝液中
    に懸濁することと、 （ｂ）前ステップで調製した懸濁液を数回凍結・融解す
    ることと、 （ｃ）前ステップで調製したサンプルを遠心して、可溶
    性タンパク質を含有する上清画分を得ることと、 （ｄ）該上清画分を、ヘパリン結合タンパクを特異的に
    結合し得るヘパリンカラムにかけて、ヘパリン結合タン
    パクを得ることと、 （ｅ）該ヘパリン結合タンパクを逆相カラムにかけて、
    約28kDaの見かけの分子量を有するタンパク質を単離す
    ること を具備する方法によって得られることを特徴とするヒト
    型ヘパリン結合タンパク。
  8. 【請求項８】下記のアミノ酸配列： Ｎ末端から 但し、Uuuは未知のアミノ酸であり、Xxxは可能なグリコ
    シル化部位（多分Asnである）。 Ｃ末端から （但し、ｎは請求項６に定義したのと同じ意味を有す
    る。） を有し、該タンパクが分子間ジスルフィド結合を含むと
    共に、還元条件下でのSDS−PAGEにより測定された約28k
    Daのみかけの分子量を有し、更にイン・ビボにおいて脈
    管形成特性を示し、且つ単核細胞に対する走化性を示す
    ヒト型ヘパリン結合タンパクであって、 以下のステップ： （ａ）ヒト血小板またはその前駆細胞を等張の緩衝液中
    に懸濁することと、 （ｂ）前ステップで調製した懸濁液を数回凍結・融解す
    ることと、 （ｃ）前ステップで調製したサンプルを遠心して、可溶
    性タンパク質を含有する上清画分を得ることと、 （ｄ）該上清画分を、ヘパリン結合タンパクを特異的に
    結合し得るヘパリンカラムにかけて、ヘパリン結合タン
    パクを得ることと、 （ｅ）該ヘパリン結合タンパクを逆相カラムにかけて、
    約28kDaの見かけの分子量を有するタンパク質を単離す
    ること を具備する方法によって得られることを特徴とするヒト
    型ヘパリン結合タンパク。
  9. 【請求項９】ｎが請求項６に定義したものと同じ意味を
    有し、UuuおよびXxxが請求の請求項８に定義したものと
    同じ意味を有するものとして、下記の構造： を有し、該タンパクが分子間ジスルフィド結合を含むと
    共に、還元条件下でのSDS−PAGEにより測定された約28k
    Daのみかけの分子量を有し、更にイン・ビボにおいて脈
    管形成特性を示し、且つ単核細胞に対する走化性を示す
    ヒト型ヘパリン結合タンパクであって、 以下のステップ： （ａ）ヒト血小板またはその前駆細胞を等張の緩衝液中
    に懸濁することと、 （ｂ）前ステップで調製した懸濁液を数回凍結・融解す
    ることと、 （ｃ）前ステップで調製したサンプルを遠心して、可溶
    性タンパク質を含有する上清画分を得ることと、 （ｄ）該上清画分を、ヘパリン結合タンパクを特異的に
    結合し得るヘパリンカラムにかけて、ヘパリン結合タン
    パクを得ることと、 （ｅ）該ヘパリン結合タンパクを逆相カラムにかけて、
    約28kDaの見かけの分子量を有するタンパク質を単離す
    ること を具備する方法によって得られることを特徴とするヒト
    型ヘパリン結合タンパク。
  10. 【請求項１０】脈管形成を刺激するために用いられる治
    療用組成物であって、請求項１〜５に記載のブタ型ヘパ
    リン結合タンパクを治療的有効量含有することを特徴と
    する治療用組成物。
  11. 【請求項１１】治療のために単核細胞の活性化が必要な
    疾病を治療するために用いられる治療用組成物であっ
    て、請求項１〜５に記載のブタ型ヘパリン結合タンパク
    を治療的有効量含有することを特徴とする治療用組成
    物。
  12. 【請求項１２】腫瘍を治療するために用いられる治療用
    組成物であって、請求項１〜５に記載のブタ型ヘパリン
    結合タンパクを治療的有効量含有することを特徴とする
    治療用組成物。
  13. 【請求項１３】創傷を治癒させるために用いられる治療
    用組成物であって、請求項１〜５に記載のブタ型ヘパリ
    ン結合タンパクを治療的有効量含有することを特徴とす
    る治療用組成物。
  14. 【請求項１４】脈管形成を刺激するために用いられる治
    療用組成物であって、請求項６〜９に記載のヒト型ヘパ
    リン結合タンパクを治療的有効量含有することを特徴と
    する治療用組成物。
  15. 【請求項１５】治療のために単核細胞の活性化が必要な
    疾病を治療するために用いられる治療用組成物であっ
    て、請求項６〜９に記載のヒト型ヘパリン結合タンパク
    を治療的有効量含有することを特徴とする治療用組成
    物。
  16. 【請求項１６】腫瘍を治療するために用いられる治療用
    組成物であって、請求項６〜９に記載のヒト型ヘパリン
    結合タンパクを治療的有効量含有することを特徴とする
    治療用組成物。
  17. 【請求項１７】創傷を治癒させるために用いられる治療
    用組成物であって、請求項６〜９に記載のヒト型ヘパリ
    ン結合タンパクを治療的有効量含有することを特徴とす
    る治療用組成物。
  18. 【請求項１８】請求項１〜５の何れか１項に記載のブタ
    型ヘパリン結合タンパクの製造方法であって、ブタの血
    小板を抽出することと、ヘパリン結合タンパクを単離す
    るために、ヘパリン−セファロース上のクロマトグラフ
    ィー及び逆相HPLCによって前記抽出物を生成することと
    を特徴とする方法。
  19. 【請求項１９】請求項６〜９項の何れか１項に記載のヒ
    ト型ヘパリン結合タンパクの製造方法であって、ヒトの
    血小板を抽出することと、前記タンパクを単離するため
    に、ヘパリン−セファロース上のクロマトグラフィーお
    よび逆相HPLCによって前記抽出物を精製することとを特
    徴とする方法。
  20. 【請求項２０】前記細胞抽出物のヘパリン−セファロー
    スへの適用を、pH値が7.2〜7.6、好ましくは7.4に調節
    された0.5モルのNaCl溶液として行うことを特徴とする
    請求項18または19に記載の方法。
  21. 【請求項２１】生合成的組替え技術を用いることを特徴
    とする、請求項４に記載のヘパリン結合タンパクの製造
    方法。
  22. 【請求項２２】請求項４に記載のヘパリン結合タンパク
    をコードするDNA構造。
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