FI101626B - Menetelmä hepariinia sitovan proteiinin valmistamiseksi - Google Patents

Description

101626

Menetelmä hepariinia sitovan proteiinin valmistamiseksi 5

Keksintö koskee menetelmää tähän saakka tuntemattomien he-pariinia sitovien proteiinien tai niiden vastaavien muunnelmien valmistamiseksi, jotka synnyttävät angiogenesistä 10 ja parantavat jyväskudoksen muodostusta eläinmallien haavoissa. Proteiinit ovat tavanomaisissa olosuhteissa glykoproteiineja.

Tavanomainen kudosten uusiutuminen noudattaa tiettyä solu-15 ja biokemiallisten tapahtumien sarjaa, jonka vaurioituminen aloittaa ja joka päättyy uuden kudoksen muodostumiseen.

Levossa olevat sidekudosemosolut haavan reunoilla jakautuvat, kulkeutuvat kohti verisuonetonta haavan kohtaa ja 20 muodostavat kollageenia. Uudet hiusverisuonet muodostuvat olemassa olevista pikkulaskimoista ja hiusverisuonista ja kulkeutuvat kohti haavan reunaa. Nämä prosessit jatkuvat kunnes parantuvan haavan reunat yhtyvät toisiinsa, jolloin haavan tila täyttyy verisuonittuneella kollageenisideku-v 25 dosemosoluverkolla (jyväskudoksella). Lopulta epiteelisolut jakautuvat ja peittävät jyväskudoksen, jolloin korjautumis-prosessi on valmis.

Verihiutaleet ovat ensimmäiset tärkeät solun aineosat, 30 joilla on merkitystä äkillisen haavan paranemisen kannalta . ensimmäisen 24 tunnin aikana. Sen jälkeen paranemisproses- seja alkavat hoitaa neutrofiilit jyvässolut ja sen jälkeen makrofagit ja imusolut, joiden kaikkien on todettu kulkeutuvan haavaan säännönmukaisessa järjestyksessä seuraavien 35 2-3 päivän aikana vaurion synnystä. Tarkoin säädelty erityshäiriöisten kasvutekijöiden vapautuminen varmistaa tulehtuneiden solujen kunnollisen paranemisen.

2 101626

Viime vuosina on alettu ymmärtää mekanismeja, joilla nämä kasvutekijät vaikuttavat haavan paranemisprosessissa, joita tekijöitä nimitetään verihiutaleista johtuneiksi 5 kasvutekijöiksi (PDGF «Platelet Derived Growth Factor) , muuntava kasvutekijä alfa (TGFa = Transforming Growth Factor) ja muuntava kasvutekijä beeta (TGFP). PDGF:ää vapautuu aluksi verihiutaleiden α-granuleista, kun verihiutaleet kiinnittyvät tuoreen haavan reunoihin ja 10 niillä on suuri kemiallinen vetovoima sidekudosemosoluihin (Grotendorst, G. R., et ai., Troc. Natl. Acad. Sei. USA, 78 (1981) 3669-3672) ja ne ovat myös mitogeenisiä samojen solujen kanssa joko TGF:n tai ihokasvutekijän (EGF) läsnäollessa (Deuel, T. F. et ai., Cancer Surv. 4 (1985) 633-15 653.

PDGF aktivoi sidekudosemosoluja vapauttamaan kollagenaasia (Bauer, E. A. et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82 (1985) 4132-4136) ja edesauttaa siten matriisin uudelleen muotou-20 tumista, mikä on olennainen osa haavan paranemista.

TGFP:aa tavataan melko suurina konsentraatioina verihiutaleista ja sitä vapautuu myös a-jyväsistä hyytymän muodostuksessa. Tällä kasvutekijällä on tärkeä osa haavan 25 matriisin muodostuksessa ja sillä on myös todettu olevan säätelevä vaikutus joukkoon muita kasvutekijöitä, kuten PDGF:ään, EGF:ään ja TGF:aan.

TGFP:lla on voimakas kemiallinen vetovoima monosyytteihin.

30 Siten kasvutekijöillä, joita aluksi vapautuu verihiutaleista heti haavan syntymisen jälkeen, on myös tärkeä merkitys niiden stimuloidessa tulehtuneiden solujen kulkeutumista haavaan. TGFP voi kerätä verenkierrosta monosyyt-tejä ja sen jälkeen aktivoida ne erittäviksi fenotyypeiksi 35 (Wiseman, D. M. et ai., Biochemical and Biophysical Research Communications 157 (1988) 793-800.

3 101626

Kun monosyytit ovat saaneet tämän ilmiasun ja niitä kutsutaan paremmalla nimellä makrofagit, niiden voidaan osoittaa erittävän samoja tekijöitä kuin mitä on todettu verihiu-5 taleissa sekä useita muita korjautumisprosessille hyvin tärkeitä tekijöitä.

Siten monosyytit/makrofagit erittävät kasvua sääteleviä tekijöitä, kuten verihiutaleista peräisin olevaa kasvutekijää 10 (PDGF), muuntavaa kasvutekijää beeta (TGFp), muuntavaa kasvutekijää alfa (TGFa), emäksistä sidekudosemosolukasvuteki-jää (BFGF), insuliinin kaltaista kasvutekijä-1:tä (IGF-l) bombesiinia, jyvässolua stimuloivaa tekijää (GSF), jyväs-solu-makrofagikasvupesäkettä stimuloivaa tekijää (GM-CSF), 15 monosyyttiä stimuloivaa tekijää (M-CSF) ja interleukiini- l:tä (IL-1). Eritystuotteet sisältävät myös proteaaseja, komplementtiproteiineja, monosyyttiperäistä neutrofiilia aktivoivaa tekijää, arakidonaatteja ja kasvainkuoliotekijää alfa (TNFa). (Rom, W. N. et ai., J. Clin. Invest. 82 (1988) 20 1685-1693), Rappolee, D. A. et ai., Science, 241 (1988) 708-712), (ks. Unanue, E. R. et ai., Science 236 (1987) 551-557).

Kaikki nämä makrofagiperäiset erityshäiriöiset kasvutekijät ..'25 osallistuvat paranemisprosessiin, mutta suuri osa mekanismiin liittyvistä yksityiskohdista ja näiden tekijöiden monimutkaisesta vuorovaikutuksesta tunnetaan vielä huonosti.

Paranemisprosessissa on ratkaisevan tärkeää, että muodostu-30 va kudos saa riittävästi happea ja ravinteita. Tämä varmistetaan monimutkaisella prosessilla, joka tunnetaan nimellä angiogeneesi (verisuonten muodostuminen) joka johtaa uusien verisuonten muodostumiseen in situ. Tämä prosessi käsittää verisuonisolujen säännönmukaisen kulkeutumisen, uudiskasvun 4 101626 ja eriytymisen (Folkman, M, et ai., 235 (1987) 442). Angio-geneesin käynnistymisen endoteelisolujen vapautumisen suoralla stimuloinnilla uskotaan johtuvan kahdesta polypepti-5 dimitoosista: lajin I hepariinia sitovasta kasvutekijästä (GBGF-1), joka tunnetaan myös happamana sidekudosemosolu-kasvutekijänä, ja lajin II hepariinia sitovasta kasvutekijästä (GBGF-II) tai emäksisestä sidekudosemosolukasvuteki-jästä (bFGF).

10 (Thomas, K. A., Proc. Natl. Acad. Sei. 82 (1985) 6409),

Esch, F., Ibid. (1985) 6507). Näitä tekijöitä ei esiinny verihiutaleissa, mutta emäksistä FGFrää erittyy aktivoiduista monosyytti/makrofageista kuten edellä mainittiin, 15 ja niiden on osoitettu aiheuttavan angiogeneesiä eläimissä in vivo.

Siten on selvää, että ensimmäinen verihiutaleiden vapautumis "ryöppy" haavan muodostumisen yhteydessä ei suoraan 20 koske angiogeenisia tekijöitä. Verihiutaleuutteiden on kuitenkin todettu olevan angiogeenisiä kokeissa in vivo, ja tämän voidaan osoittaa johtuvan monosyyttien aktivoitumisesta, joka puolestaan johtaa edellä mainittujen asiaa koskevien tekijöiden erittymiseeen. On tehty useita yrityk-#<"'25 siä eristää ja karakterisoida verihiutaleitten ei-mitoosi-syntyistä angiogeenistä tekijää, mutta tämän tekijän luonnetta ei ole esitetty alan kirjallisuudessa (Knighton, D.

R. et ai., Ann. Surg. 204 (1986) 323-331).

30 Välttämätön edellytys angiogeneesin tapahtumiselle on hepa-riinin esiintyminen haavan alueella, ja on osoitettu, että hepariinin poisto esim. protamiinilla hävittää täydellisesti angiogeneesin.

5 101626

Siten sellaiset tekijät, jotka pystyvät kokoamaan monosyyt-tejä verenkierrosta haavan alueelle ja sen jälkeen aktivoimaan ne ja joilla on lisäksi hepariinia sitovia ominaisuuk-5 siä, ovat äärimmäisen tärkeitä angiogeneesille ja koko paranemisprosessille.

Keksintö tarjoaa tähän saakka tuntemattomia proteiineja (sekä ihmis- että sikatyypin, joita tämän jälkeen kutsutaan 10 hHBP:ksi ja pHBP:ksi), jotka sopivat erityisesti stimuloimaan angiogeneesia ja kudosten paranemista seuraavista syistä: a) Proteiinit vapautuvat verihiutaleista näiden solujen 15 aktivoituessa, kuten tapahtuu vaurioituneessa kudoksessa.

b) Proteiinit sitoutuvat hepariiniin.

c) Proiineilla on kemiallista vetovoimaa monosyytteihin.

20 d) Proteiinit aktivoivat monosyyttejä morfologisesti kohti erittävää fenotyyppiä.

e) Proteiinit aktivoivat viljelmän monosyyttejä erittämään .. 25 mitooseja viljelmän sidekudosemosoluille.

f) Proteiinien lisääminen kasvattaa angiogeneesiä kananmunan suonikalvoalkion rakkokalvomembraanimallissa.

30 g) Proteiinit kasvattavat epiteelin muodostumisnopeutta, kun niitä lisätään rottakoemallien haavaonteloihin ja arvostelu tehdään makroskooppisin ja histologisin tarkasteluin.

6 101626 h) Proteiinit kasvattavat jyväskudoksen muodostusta samassa haavaontelomallissa arvosteltuna makroskooppisin ja histologisin tarkasteluin.

5 i) Proteiinit parantavat verisuonten muodostumista samalla rotan haavaontelomallissa makroskooppisesti arvioituna.

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetyt oheisissa 10 patenttivaatimuksissa.

Kaksi erityisesimerkkiä tähän saakka tuntemattomista proteiineista on peräisin sian ja ihmisen verihiutaleista, ja sikatyypin aminohapposekvenssi on selvitetty täysin. Ihmis-15 tyyppi on vahvasti homologinen sikatyypin kanssa, mikä käy ilmi verrattaessa sikatyypin aminohapposekvenssiä ihmistyypin aminohapposekvenssiin.

Tärkeä kudoksen korjautumiseen liittynä piirre on proteii-20 nien voimakkaat hepariinia sitovat ominaisuudet. Pian kudoksen vaurioitumisen jälkeen voidaan todeta, että yhdistävät kudossyöttösolut, jotka ovat monien tulehdukselle tärkeiden komponenttien joukossa, vapauttavat myös suuria määriä hepariinia. (Qureshi, R. et ai., The Journal 25 of Immunology 141 (1988) 2090-2096).

Vapautuneen hepariinin tiedetään sitoutuvan kollageeniin ja sen jälkeen kun tämä on tapahtunut, tässä kuvatut hepariinia sitovat proteiinit (HBP) muuttuvat samalla liikkumatto-30 miksi. Tämä voi muodostaa kiinteä gradientin, ja kuten

Gustafson et ai. ovat ehdottaneet teoreettisin perustein, ja Carter on osoittanut kokeellisesti, soluilla on taipumus liikkua pitkin kasvavaa substraattiadheesiogradienttia. Carter on ehdottanut, että tätä ilmiötä voitaisiin kutsua 7 101626 "Haptotaxikseksi" (kreikkaa: hapteiini, kiinnittää; taxis, järjestyminen). Tällä perusteella solujen kulkeutumista, joka liittyy morfogeneesiin, tulehdukseen, haavan paranemi -5 seen, kasvaimen tunkeutumiseeen ja itse asiassa kaikkiin kudossolujen liikkeisiin, pidetään seurauksena näihin liittyvien solujen haptotaktisista vasteista (Gustafson, T. et ai. Intern. Rev. Cytol. 15 (1963) 139), Carter, S. B. ,

Nature 208 (1965) 1183-1187).

10 Tällä perusteella tässä mainitut hepariinia sitovat proteiinit sopivat ainutlaatuisesti monosyyttien hankkimiseen verenkierrosta vahingoittuneen kudoksen alueelle. Sen jälkeinen aktivoituminen erittäväksi fenotyypiksi tapahtuu in 15 situ, so. koko monosyytti/makrofagipohjaisten sytokiinien cocktail vapautuu haavan vahingoittuneiden solujen läheisyydessä ja edistää paranemista.

Tässä esitettyjen hepariinia sitovien proteiinien oletetaan 20 sopivan erityisesti stimuloimaan ihmisen kroonisten haavojen paranemista. Yleisesti uskotaan, että tärkein tautia aiheuttava tekijä vanhojen potilaiden kroonisissa raajojen haavoissa ja makuuhaavoissa on suonten uudistumisen puute (angiogeneesi).

25

Niiden ominaisuuksien perusteella, joita on esitetty hepariinia sitoville proteiineille, voidaan olettaa, että proteiinien (edullisesti ihmistyypin) anto ulkoisesti kroonisiin haavoihin kiihdyttää paranemista. Makrofagien irtoami-30 nen hidastaa haavan paranemisreaktiota (Leibovich, S. J. et ai., Am. J. Pathol. 78 (1975) 71). Ihmisen sairauden ku vauksessa tällainen makrofagivaje liittyy useisiin sairauksiin, ja se on usein seurausta hoidosta. Siten syöpäpotilaissa, joita on hoidettu kemoterapialla tai säteilyttämäl-35 la, tavataan vakavaa valkosolujen puutetta. Tällaisilla 8 101626 potilailla esiintyy usein hidasta paranemista kirurgisen leikkauksen jälkeen ja kroonisia haavoja. Hepariinia sitovien proteiinien erityisominaisuuksista voi olla hyötyä 5 tällaisten potilasryhmien hoidossa.

HBP:tä voidaan käyttää myös pahojen palovammojen hoidossa. Suonten uudistumisen puute johtaa huonoon paranemiseen, ja vahingoittunut kudos on altis tulehduksille. Tästä syystä 10 voi aineesta, jolla on monosyyttiä aktivoivia ominaisuuksia, olla suurta hyötyä. Aktivoituneet monosyytit tai "mak-rofagit" toimivat puhdistavina aineina, ja ne poistavat syöjäsolutoiminnan avulla vahingoittuneita kudosjätteitä, mikä on mitä oleellisin tapahtuma palovammojen yhteydessä.

15

Viime aikoina on makrofagien kasvun säätelijärooli kasvaimien kasvun yhteydessä saanut huomattavaa huomiota.

Tässä mainituilla hepariinia sitovilla proteiineilla voi 20 olla mahdollisuuksia hoitoaineina kasvaimien hoidossa. HBP injektoituna kiinteisiin kasvaimiin voi kerätä verenkierron monosyyttejä kasvaimen alueelle ja sen jälkeen aktivoidut-tuaan välittää solumyrkkyvaikutusta.

25 Keksinnön mukaisella menetelmällä saatujen aineiden käyttö kliinisinä lääkekoostumuksina käsittää ihmisen HBP:n sisällyttämisen kreameihin, voiteisiin, geeleihin, vaahtoihin, kääremateriaaleihin, laastareihin, tuppoihin, keinotekoisiin ihoihin, vesipitoisiin välitysaineisiin mittalaittei-30 den upotuksessa, kuiviin turpoaviin jauheisiin tai ompelei-* den päällyksiin.

Muodot, joihin HBP voidaan sitoa, ovat pakastekuivattu tuppo tai hydrokolloidi sulkusidos. On edullista käyttää lää-35 kesidosta, josta vapautuu HBP:tä säännellysti.

Mahdollisesti käytettävä geeli sisältää vesipohjan, joka 101626 9 on tehty hyvin viskoosiksi lisäämällä siihen vesiliukoisia eetteröityjä selluloosajohdannaisia, kuten alkyylisellu-loosaa, hydroksialkyyliselluloosaa ja alkyylihydroksialkyy-liselluloosia, esim. metyyliselluloosaa, hydroksietyylisel-5 luloosaa, karfc>oksimetyyliselluloosaa, hydroksipropyylime-tyyliselluloosaa ja hydroksipropyyliselluloosaa. Hydrok-sialkyyliselluloosajohdannaiset, kuten hydroksipropyylisel-luloosa, hydroksietyyliselluloosa ja hydroksipropyylimetyy-liselluloosa ovat edullisia. Tavallisesti HBP liuotetaan 10 vesifaasiin ennen geeliaineen lisäämistä.

Pakastekuivattu tuppo voi sisältää hydroksikolloidin, jolla on yhtenäinen kuiturakenne, joka on saatu aikaan kylmäkuivaamalla geeli. Hydrokolloidi voi olla edellä 15 mainittu vesiliukoinen eetteröity selluloosajohdannainen.

Tavallisesti HBP sidotaan tuppoihin ennen pakastekuivausta.

Lääkesidos voi olla kiinnittyvä sulkusidos, johon on 20 sisällytetty HBPrtä. Sidos käsittää eristävän aineen, tartunta-aineen jatkuvana faasina ja epäjatkuvan faasin, joka on sekoitettu jatkuvan faasin joukkoon, ja joka käsittää yhden tai useamman vesiliukoisen tai vedessä turpoavan yhdisteen, kuten esimerkiksi edellä mainitun 25 eetteröidyn selluloosajohdannaisen. Epäjatkuvan faasin kyky turvota vedessä tekee mahdolliseksi vapauttaa asteittain edellä mainittua fysikaalisesti sidottua HBP:tä. HBP voidaan antaa myös nestemuodossa ihonalaisesti, lihakseen tai suonensisäisenä injektiona. HBP voidaan 30 lisäksi antaa nenän, posken, peräsuolen tai vatsaontelon kautta.

Keksinnön mukaisesti HBP:tä voidaan tuottaa verihiutaleista, jotka on saatu sian tai ihmisen verestä. Erityisesti 35 proteiini tuotetaan fraktioimalla vesihiutaleuute. Tähän tarkoitukseen sopii kolonnikromatografia, jossa käytetään 10 101626 hepariini-Sepharosea. Tällä kromatografisella menetelmällä, joka käsittää gradienttieluoinnin NaClrlla konsentraatiovä-lillä 0,5 M - 3 M kolonnin läpi, johon verihiutaleuute on ensin kaadettu, saadaan eluoitumaan kaksi piikkiä. Ensim-5 mäinen piikki noin 1,2 H NaClrn kohdalla voidaan mitata 280 nm:ssa suurena proteiinipiikkinä, ja se on s isänsä tunnettu verihiutaletekijä (PF4). Noin 1,8 M NaCl:n kohdalla on proteiinipitoisuus on käytetyssä systeemissä alle havaitse-misrajan, mutta tämän alueen fraktioilla juuri on an-10 giogeenistä vaikutusta. Aktiiviset fraktiot puhdistetaan lisäksi pienihalkaisijäisessä käänteisfaasi-C4~ HPLC-kolonnissa, ja 214 nm:ssä voidaan todeta täysin puhdas proteiinipiikki, ja tämä proteiini on identtinen tässä esitetyn joko sika- tai ihmistyypin HBP:n kanssa riippuen 15 käytettyjen verihiutaleiden laadusta.

HBPrtä voidaan tuottaa myös yhdistelmätekniikalla. Bakteereja, hiivoja, sieniä tai nisäkkäiden soluketjuja voidaan käyttää isäntinä HBP:n tuotannossa. Transformoimalla 20 isäntäsolu sopivalla vektorilla, joka sisältää tarpeelliset transkribointi- ja muuntosignaalit sekä HBPrtä koodaavan DNA-sekvenssin, voidaan tuottaa HBPrtä.

Tuotteen tuottamisessa voidaan valita, tuotetaanko se 25 solunsisäisesti vai eritetäänkö se kasvatusaineeseen.

Monia erityssignaaleja tunnetaan. Amerikkalaisessa patenttijulkaisussa US - 4 336 336 kuvataan prokaryooteille johtosekvenssi, joka koodaa ei-solulimaproteiinia, joka normaalisti kulkeutuu joko solun pinnalle tai sen taakse, 30 ja sen seurauksena yhteen liittynyt proteiini siirtyy solulimatilaan. Kurjan & Herskowitz, Cell 30 (1982) 933-943, kuvaa hiivoille putatiivisen o(-tekijän prekursorin, joka sisältää neljä kypsän o( -tekijän kaksoiskopiota, joka kuvaa sekvenssiä ja määrittelee käsittelymekanismin. 35 Tätä signaalisekvenssiä on käytetty suuren joukon polypep-tidejä erittämiseen Saccharomyces cerevisiae -hiivasta 11 101626 aina signaalisekvenssin keksimisestä lähtien. Brake et ai., PNAS USA 81 (1984) 4642-4646 -julkaisussa on tästä esimerkki.

5 Bakteerit eivät pysty glykosyloimaan proteiineja, eivätkä useimmissa tapauksissa muodostamaan ihmisestä peräisin oleviin polypeptideihin oikeita disulfidisiltoja.

Hiiva pystyy kuitenkin muodostamaan oikeita disulfidisilto-10 ja, mutta se ei glykosyloi proteiineja samalla tavoin kuin korkeammat eukaryootit. Sellaisia hiivamutantteja on eristetty, jotka glykosyloituvat samalla tavalla kuin nisäkkäiden soluketjut, jolloin hiivasta tulee tulevaisuudessa käyttökelpoinen isäntä glykosyloituneille proteii-15 neille.

Keksinnön HBP:ille on lisäksi tunnusomaista, että ne kulkevat yksinkertaisina ketjuina SDS-PAGE:ssa pelkistävissä olosuhteissa, (kuvattu kuvissa 1 ja 2) ja niiden Mr on 20 noin 28 kDa.

Hepariinia sitovalla proteiinilla, joka on puhdistettu sian veren verihiutaleista, on seuraava aminohapposekvenssi : 25 1 15

IleValGlyGlyArgArgAlaGlnProGlnGluPheProPheLeu 30

AlaSerlleGlnLysGlnGlyArgProPheCysAlaGlyAlaLeu 45 30 Va1H isProArgPheValLeuThrAlaAlaSerCysPheArgG1y / 60

LysAsnSerGlySerAlaSerValValLeuGlyAlaTyrAspLeu 75

ArgGlnGlnGluGlnSerArgGlnThrPheSerlleArgSerlle 35 90

SerGlnAsnGlyTyrAspProArgGlnAsnLeuAsnAspValLeu 105 12 101626

LeuLeuGlnLeuAspArgGluAlaArgLeuThrProSerValAla 120

LeuValProLeuProProGlnAsnAlaThrValGluAlaGlyThr 5 135

AsnCysGlnValAlaGlyTrpGlyThrGlnArgLeuArgArgLeu 150

PheSerArgPheProArgValLeuArgValThrValThrSerAsn 165 10 ProCysLeuProArgAspMetCysIleGlyValPheSerArgArg 180

GlyArglleSerGlnGlyAspArgGlyThrProLeuValCysAsn 195

GlyLeuAlaGlnGlyValAlaSerPheLeuArgArgArgPheXxx 15 210

XxxSerSerGlyPhePheThrArgValAlaLeuPheArgAsnTrp 217

IleAspSerValLeuAsnXxx.

20 Hepariinia sitovalla proteiinilla, joka on puhdistettu ihmisveren verihiutaleista, jon seuraava aminohapposekvenssi : 1 15

IleValGlyGlyArgLysAlaArgProArgGlnPheProPheLeu 25 30

AlaSerlleGlnAsnGlnGlyArgHisPheCysGlyGlyAlaLeu 45

IleHisAlaArgPheValMetThrAlaAlaSerCysPheGlnSer 60 30 GlnAsnProGlyValSErThrValValLeuGlyAlaTyrAspLeu 75

ArgArgArgGluArgGlnSerArgGlnThrPheSerlleUuuUuu 85

MetSerGluAsnGlyTyrAspProGlnGln(..............

35 )LeuGlnLeuAspArgGluAlaXxxLeuThrSerXxxVal

ThrIleLeuProLeuPro(................)GluAlaGly 13 101626

ThrArgCysGlnValAlaGlyTrpGlySerGlnArg(........

..)LeuSerArgPheProArgPheValXxxValThrValThrPro GluAspGlnCysArgProAsnAsnValCysThrGlyValLeuThr ArgUuuGlyGlylleCysAsnGlyAspGlyUuuThrProValLeu 5 n-29 (............................) SerLeuGlyProCys

GlyArgGlyProAspPhePheThrArgValAlaLeuPheArgAsp n

TrpIleAspGlyValLeuAsnAsnProGly.

10

Proteiineille on edelleen luonteenomaista, että ne on glykosyloitu.

Tietokonehaku proteiinitietopankista GENETIC COMPUTER 15 GROUPiin, ohjelmalla, Wisconsinin yliopistosta, koskien mo lempia hepariinia sitovia proteiineja osoittaa, että tässä esitetyt proteiinit ovat tähän saakka tuntemattomia.

Seuraavat esimerkit selittävät keksintöä: 20

Kuvien selitykset

Kuva 1. Sikatyyppisen hepariinia sitovan proteiinin SDS-PAGE pelkistävissä olosuhteissa.

25 Kaista l: Mr-markkerit

Kaista 2: pHBP

Kuva 2. Ihmistyyppisen hepariinia sitovan proteiinin SDS-PAGE pelkistävissä olosuhteissa (katso esimerkki 30 2) .

Kaista 1: Mr -markkerit Kaista 2: hHBP

Kuva 3. HBP:n angiogeneesikoe käyttäen kananpojan alkion 35 suonikalvo-alkiorakkulakalvomembraania. Katso selitys esimerkistä 5.

14 101626

Kuvat 4, 5 ja 6.

Näissä kuvissa on esitetty HBP:llä käsitellyt monosyytit (8 ng/ml) (kuva 4), endotoksiinilla käsitellyt monosyytit (100 ng/ml) (kuva 5) ja 5 PBSrllä käsitellyt monosyytit (kontrollisolut) (kuva 6). Katso selitys esimerkistä 6.

Esimerkki 1 10 500 g sian verestä peräisin olevia verihiutaleita suspen-doitiin 1,5 Iraan PBS, jäädytettiin ja sulatettiin kolme kertaa nestetypen (N2) avulla, mistä saatua tuotetta kutsutaan jatkossa jäädytys/sulatteeksi. Jäädytys/sulate 15 sentrifugoitiin 40 000 grssä 30 minuuttia, ja saatua pintakerrosta ultrasentrifugoitiin 300 000 grssä 60 min. Tästä saatua pintakerrosta dialysoitiin 48 tuntia 20 tilavuudella 10 mM foafaattipuskuria, 0,5 M NaClrllä, pH 7,4rssä. Dialysaatti pumpattiin 5 cm (I.D.) x 10 cm 20 Heparin-SepharoseR C1-4B -kolonnin läpi virtausnopeudella 120 ml/h. Kolonni pestiin samalla puskurilla kuin millä näyte dialysoitiin (puskuri A), kunnnes proteiineja ei enää eluoitunut. Sen jälkeen kolonnia eluoitiin lineaarisella gradientilla alkaen puskurista A ja päätyen puskuriin • 25 B = 10 mM fosfaattipuskuri, 3 M NaCl, pH 7,4rssä 20 tuntia virtausnopeudella 1,7 ml/min. 200 fraktiota (kukin 6 min) kerättiin, ja niiden angiogeeniaktiivisuus testattiin. 50 fraktioita, jotka jakautuivat symmetrisesti 1,8 M NaCl-fraktion ympärille, osoittivat aktiivisuutta. Nämä fraktiot 30 yhdistettiin ja sekoitettiin ove-albumiinin kanssa, kunnes konsentraatioksi tuli 0,5 mg/ml. Yhdistetyt fraktiot dialysoitiin 20 tilavuudella puskuria A, ja pumpattiin sen jälkeen 0,6 mlrn Heparin-SepharoseR C1-4B -kolonnin läpi virtausnopeudella 6 ml/h. Kolonnia eluoitiin lineaari-35 sella gradientilla 10 tuntia käyttäen virtausnopeutta 0,04 ml/min. 120 fraktiota, kukin kooltaan 200 pl kerättiin . t 15 101626 ja niiden angiogeeniaktiivisuus testattiin, ja fraktiot yhdistettiin. Yhdistetyt fraktiot kromatografoitiin käänteisfaasi-Cij-kolonnissa (0,1 ml:n tilavuus) lineaarisella gradientilla 0 - 80 % asetonitriiliä, joka sisälsi 5 0,1 % trifluorietikkahappoa (TFA) 30 minuutin ajan käyttäen virtausnopeutta 0,025 ml/min. Angiogeenistä aktiivisuutta todettiiin pohjaviivasta erottuneesta huipusta retentioajan 26 min kohdalla.

10 SDS-PAGE pelkistävissä olosuhteissa (katso kuva 1) osoittaa, että piikki sisältää yhden komponentin (HBP), jonka Mr on 28 kDa. Piikin sisältämällä proteiinilla on patenttivaatimuksessa 4 määritelty aminohappoketju.

15

Esimerkki 2 HBP:n valmistaminen ihmisen verihiutaleista 20 100 annosta terveiden verenluovuttajien verihiutalekonsent- raattia sekoitettiin, ja verihiutaleita sentrifugoitiin 1700 g:ssä ja 25°C:ssa 15 min.

Verihiutaleet sentrifugoitiin ja suspendoitiin 3 tilavuu-25 teen PBS:ää, ja se jäädytettiin ja sulatettiin kuusi kertaa nestetypen (N2) avulla. Sitten suspensiota sentrifugoitiin 40 000 g:ssä 60 minuuttia. Tästä saatua pinteker-rosta dialysoitiin 48 tuntia 20 tilavuudella 10 mM foafaat-tipuskuria, 0,5 M NaCl:llä, pH 7,4:ssä. Dialysaatti 30 pumpattiin 5 cm (I.D.) x 10 cm Heparin-SepharoseR C1-4B-kolonnin läpi virtausnopeudella 50 ml/h. Kolonni pestiin samalla puskurilla kuin millä näyte dialysoitiin (puskuri A), kunnnes proteiineja ei enää eluoitunut. Sen jälkeen kolonnia eluoitiin lineaarisella gradientilla alkaen 35 puskurista A ja päätyen puskuriin B = 10 mM fosfaattipuskuri, 3 M NaCl, pH 7,4:ssä 20 tuntia virtausnopeudella 0,9 16 101626 ml/min. 200 fraktiota (kukin 6 min) kerättiin. Fraktiot tutkittiin pienihalkaisijäisellä käänteisfaasi-C4-kolonnil-la (Aquapore Butyl 100 x 2,1 mm, 7 um Brownlee Labs) käyttäen gradienttia: 5

Aika Puskuri A Puskuri B Virtausnop.

0,1 % TFA 70 % CH3CN 0,085 % TFA

10 0-5 min 60 % 40 % 200 pl/min 0-40 min 30 % 70 % 200 pl/min Käytetty laite oli Applied Biosystems 130 A Analyzer, ja 15 proteiineja seurattiin 214 nm:ssä. Piikit, joiden retentio-aika oli 20 min, kerättiin. Kuivauksen jälkeen näytteet laimennettiin liuoksella 0,1 M Tris-C1, 1 mM EDTA 2,5 % SDS, 0,01 % bromifenyylisininen, 5 % 2-merkaptoetanoli, pH 8,0:ssa. 5 minuutin kuluttua 95°C:ssa näytteille tehtiin 20 SDS PAGE käyttäen Pharmacia Phast Gel -laitteistoa, jossa oli SDS Phast Gel -geelit (8-25 %) ja SDS -puskurinauhat.

Näytteet ajettiin 250 V:ssa 10 mA:lla 15°C:ssa 60 Vh (13). Fraktiot 70 - 120:sta toivat esiin bändin, jonka Mr 25 oli 28 000. Nämä fraktiot yhdistettiin ja dialysoitiin 20 tilavuudella puskuria A. Dialysaatti pumapttiin 1 ml:n Heparin-SepharoseR-C1-4B -kolonniin, ja kolonnia eluoitiin lineaarisella gradientilla puskurista A puskuriin B 10 tunnin ajan virtausnopeudella 0,04 ml/min. 200 ui:n 30 fraktiot (120 kpl) kerättiin.

35 17 101626

Esimerkki 3 HBP:n valmistus ihmispohjaisesta materiaalista.

5 Tähän tarkoitukseen käytettiin ihmisen soluketjua K562. Tämä soluketju, joka on peräisin kroonista verisolusyöpää potevan potilaasta, voidaan eriyttää luuytimen jättisolu-maiseen suuntaan, joka on kiertävien verihiutaleiden prekursori ja sisältää 12-0-tetradekanoyyliforboli-14-10 asetaatin (TPA). Alitalo et ai. (12) ovat osoittaneet, että näihin soluihin indusoituu geeni PDGF, kun soluja käsitellään TPA:11a.

K562 -soluja kasvatettiin 175 cm^:n Nukloni-pulloissa 15 RPMI 1640 -väliaineessa, johon oli lisätty 10 % vasikan sikiöseerumia ja antibiootteja. Solutiheys säädettiin noin 300 000/ml:ksi, ja dimetyylisulfoksidiin (DMSO) liuotettua TPA:ta (Sigma) lisättiin, kunnes saavutettiin konsentraatio 3 nM. Kolmen päivän kuluttua solut sedimen-20 toitiin sentrifugoimalla 500 g:ssä, ja pestiin sen jälkeen kerran 10 tilavuudella PBS:ää ja sedimentoitiin uudestaan. 1 35 g tällä tavalla kerättyjä soluja sekoitettiin 3 tilavuuteen PBS:ää, ja suspensio jäädytettiin ja sulatettiin 6 25 kertaa nestäisellä typellä N2· Suspensiota ultrasentrifu-goitiin 300 000 g:ssä 60 minuuttia, ja pintakerros laimennettiin sen jälkeen 300 ml:11a 10 mM Na-fosfaattipuskuria pH 7,4, joka oli 0,5 M NaClrn suhteen. Laimennettu näyte pumpattiin 0,5 ml:n Hepariini-Sepharose Cl-6B:iin 72 30 tunnin aikana. Sen jälkeen kolonnia eluoitiin lineaarisella • 4 . gradientilla 10 tunnin ajan, joka gradientti alkoi lisäys- puskurista (puskuri A) ja päätyi puskuriin B = 10 mM Na-fosf aattipuskuria pH 7,4 sisältäen 3 M NaCl, ja 120 kooltaan 200 ui:n fraktiota kerättiin.

18 101626 4 fraktiota, jotka esiintyivät symmetrisesti 1,8 M NaCl:n ympärillä kromatografoitiin erikseen Microbore -käänteis-faasi-C4~kolonnissa (Aquabore Butyl 30 x 2,1 mm, 7 um, Brownlee Labs) lineaarisella gradientilla 0 - 80 % ase-5 tonitriiliä, johon oli sekoitettu 0,1 % trifluorietikkahap-poa (TFA), 30 minuutin ajan ja virtausnopeudella 25 ul/min.

Retentioajalla 26 minuuttia saatu proteiinipaikki on identtinen sian HBP:n retentioajan kanssa.

10

Esimerkki 4 HBP:n angiogeenisten ominaisuuksien toteaminen.

15

Kokeessa käytettiin urospuolisia rottia Wistar -kannasta CRL:(W1)BR, painoltaan 240 g ja iältään 80 päivää. Rotat sopeutettiin ilmasto-olosuhteisiin 6 päivän ajan ennen käyttöä. Olosuhteet olivat 21 +- 1°C, 60 +- 10 %:n suhteel-20 linen kosteus, ilmanvaihtuvuus 10 kertaa tunnissa ja valoisa aika klo 6.30:stä klo 18.30:een. Rottia pidettiin muovihäkeissä, missä oli sahanpurua pohjalla. Niitä syötettiin mieltymysten mukaan Altromiini-dieetillä 1324 ja ne saivat juoda vapaasti vettä.

25

Rotat nukutettiin pentobarbitaalilla 50 mg/kg:n annoksella ruumiin painoa kohti käyttäen injektiota vatsaonteloon. Rottien selästä ajettiin karvat ja ne desinfioitiin. Selän puolelle tehtiin avanne, vasen munuainen paljastet-30 tiin, ja HBPrtä, joka oli etukäteen absorboitu 10 ui:aan ♦ · .. Affi/Gel Blue 100-200 mesh (märkä) 75-150 u Bio-Rad:ia, joka oli kuivattu 3 x 3 mm Gelfilm -absorboivalla gelatiinilla, Upjohn, laitettiin munuaisen sidekudoskotelon alle käyttäen pientä aukaisutoimenpidettä. Pintahaava 35 suljettiin 5 silkkiompeleella, ja leikkauksen jälkeen annettiin Temgesiciä 0,1 ml annoksina kahdesti päivässä 19 101626 kolmen päivän ajan. Viisi päivää leikkauksesta rotat nukutettiin uudestaan pentobarbitaalilla, ja vasen munuainen palkastettiin. Siirrännäisen ympäristössä oli havaittavissa selvää uuisen verisuonten muodostusta makroskooppi-5 sesti arvioitaessa.

Esimerkki 5 10 Sian ja ihmisen HBP:n angiogeneesi käyttäen kananpojan alkiorakkulakalvoa.

Ensimmäistä päivää hedelmöittyneenä olleet kananmunat laitettiin kosteaan, 37°C:seen inkubaattoriin. Seitsemänte-15 nä päivänä munan tylppään päähän tehtiin reikä käyttäen 25GS/8 0,5 x 16 neulaa, ja inkubaatiota jatkettiin.

Yhdeksäntenä päivänä munankuoren terävään päähän tehtiin 1 cm x 1 cm:n "ikkuna" ja ikkunat peitettiin Tegadermillä. Inkubointia jatkettiin ja 11. päivänä HBPrtä (5-30 ng), 20 joka oli etykäteen absorboitu 3 ui:aan Affi-Gel Blue 100-200 mesh (märkä) 75-150 u Bio-Radiin, joka oli kuivattu laminaarisessa ilmavirrassa 3x3 mm:n steriilillä Gelfile absorboivalla gelatiinilevyllä, Upjohn, laitettiin al-kiorakkulakalvoile affigeeli kohti membraania, ja ikkuna 25 suljettiin uudestaan Tegadermillä. 5 päivän kuluttua inkuboinnista 37°C:ssa arvioitiin vasteet makroskooppisesti .

Sekä 30 että 5 ng HBP:tä indusoivat voimakkaan mikrove-30 risuonipatjän tiheyden kasvun affigeelin alueelle, aiheut taen samalla ilmeistä suurempien verisuonten taantumista ja tyypillisiä kapillaaripallomuodostelmia (katso kuvaa).

35 20 101626

Esimerkki 6

Ihmisen monosvvttien aktivointi 5 Monisyytit eristettiin terveiden verenluovuttajien sitraa-tilla käsitellyn veren "buffy coatseista".

Yksitumaiset solut eritstettiin seuraavasti: "buffy coatsit" laimennettiin yhdellä tilavuudella kulmää RPMI 10 1640:aa ja kerrostettiin 15 ml:n Ficoll-Paquen päälle 50 ml:n Falcon-putkissa. 30 minuutin sentrifugoinnin jälkeen 400 g:ssä kiertoroottorissa erotettiin Ficoll-Paquen ja RPMI 1640-plasman välissä oleva kerros (joka sisälsi yksitumaisia soluja ja verihiutaleita), ja verihiutaleet 15 poistettiin pesemällä kolmasti (10 min) 100 g:ssä.

Yksitumaiset solut fraktioitiin Percoll-gradientilla: 10 x MEM, ja RPMI 1640:aa lisättiin Percollin perusliuokseen (tiheys: 1,13 g/ml) liuoksen tekemiseksi isotooniseksi 20 tiheydelle 1,066 g/ml. Percoll-gradientti tehtiin sentrifu-goimalla 3000 g:ssä 15 min Hereauksen medifugissa 35°:n kiinteäkulmaroottoria käyttäen. Yksitumaiset solut kerättiin tämän gradientin pinnalta ja sentrifugoitiin 2700 g:ssä 20 min käyttäen kiertoroottoria. Ylemmässä vyöhyk-25 keessä monosyytit esiintyivät yli 90 %:n puhtaudella määritettynä ei-spesifisellä esteraasivärjäyksellä. Monosyytit viljeltiin tiheydellä 1 x 10® solua/ml 24 syvennyksen makroallasalustalla RPMI 1640:ssa, joka sisälsi penisilliini/Streptomysiiniä. Väliaine sisälsi vähemmän 30 kuin 6 pg/ml endotoksiinia.

MRC-5 ihmisen keuhkoalkiosidekudosemosolua viljeltiin 96 syvennyksen mikroallasalustoilla MEM:ssä, joka sisälsi 2 % FCS:ää, ja missä lähtötiheys oli 1 x 10^ solua/ml 4 35 päivän ajan ennen mitoosiaktiivisuuden testausta monosyyt-tielatusaineessa. Mitoosiaktiivisuus 100 ul:ssa monosyyt- 21 101626 tielatusainetta määritettiin pulssimerkitsemällä MRX-5-solut ^H-tymidiinillä (1 jiC±/ml) 24 - 42 tuntia monosyyt-tielatusaineen lisäämisen jälkeen.

5 Tulokset:

Inkuboitaessa monosyyttejä 5 ngrlla HBP:tä havaitaan morfologinen muutos yhden ja kahden päivän kuluttua

inkuboinnista. Monosyytit ovat muuttuneet pidentyneiksi 10 (kuva 4) samalla tavalla kuin monosyytit, joita on inkuboi-tu 100 ng/ml:lla endotoksiinia, joka sisältää 1 mg/ml BSA (naudan seerumialbumiinia) (kuva 5). Vertailusolujen morfologia ei ole aktivoitunut, koska useimmat solut ovat edelleen tasaisen pyöreitä muodoltaan (kuva 6). Monosyyt-15 tien morfologiset muutokset nähdään selvimmin, jos HBP

laitetaan täplinä ja kuivataan syvennyksen pohjalle enne monosyyttien lisäämistä. Tämä voi osoittaa, että immobi-lisoitu HBP on parempi aktivoimaan monosyyttejä kuin ei-immobilisoitu HBP.

20

Testattaessa monosyyttien elatusaineen mitoosiaktiivisuutta ihmisen MRC-5 sidekudosemosoluja käyttäen, on HBP:llä edellä kuvatulla tavalla kaksi päivää inkuboitujen monosyyttien todettu erittävän noin kaksi kertaa niin suuren 25 määrän mitoosiaktiivisuutta kuin vertailumonosyytit.

Monosyyttien, joita on inkuboitu 100 ng/ml:lla LPS:ää ja 21 mg/ml:11a BSA:ta, mitoosiaktiivisuus on noin 5-kertainen vertailumonosyytteihin verrattuna.

30

Esimerkki 7

Paikallisesti annettava HBP-muoto 35 HBP valmistettiin paikallista antotapaa varten seuraavaksi koostumukseksi: 22 101626

Aineosat % paino/paino tislattu vesi 92,98 5 hydroksietyyliselluloosa 4,0 natriumkloridi 0,41 di-natriumvetyfosfaatti-2-hydraatti 0,83 kaliumvetyfosfaatti 0,28 gelatiini, hydrolysoitu 0,5 10 bentsyylialkoholi 1,0 10 g:aan edellä mainittua koostumusta lisätään 250 ng HBP:tä.

15

Esimerkki 8

Injektoitavat koostumukset, jotka sopivat HBP:n ruoansulatuskanavan ulkopuoliseksi antotavaksi, sisältävät stabi-20 lointiaineita, suoloja, puskureita, säilöntäaineita ja näiden seoksia. Yksinkertainen koostumus, joka stabiloi HBP:tä riittävästi jotta sen biologinen aktiivisuus säilyy, voidaan injektoida ihon alle, lihakseen tai suoneen.

25 Injektoitava koostumus

Koostumus HBP:n antamiseksi ruoansulatuskanavan ulkopuolisesta valmistettiin seuraavasti: 30 Aineosat % paino/tilavuus « glysiini 0,15 di-natriumvetyfosfaatti 0,026 natriumdivetyfosfaatti 0,026 35 mannitoli 0,74 tislattu vesi 100 23 101626

Koostumus voi sisältää myös 0,9 % (tilav/tilav) bentsyy-lialkoholia säilöntäaineena. 1 ml:aan edellä mainittua koostumusta lisätään 25 ng HBP:tä.

5

Esimerkki 9

Sian HBP:n vaikutus rottien haavojen paranemiseen annetta-10 essa sitä paikallisesti haavaonteloihin yhteenveto

Haavojen paranemiskokeessa tehtiin neljälle 25 rotan 15 ryhmälle haavaontelot sen jälkeen kun niiden niskakuopasta lihaskalvoon saakka oli poistettu nahka, alalta, jonka halkaisija oli noin 15 mm. Ryhmille annettiin paikallisesti hepariinia sitovan proteiinin (HBP) annokset 12,5 ng, 2,5 ng, 0,5 ng tai plaseboa, kahdesti päivässä kahdeksan 20 päivän ajan. Liuosta, jossa oli 0,9 % suolavettä ja 0,4 % rotan albumiinia, käytettiin plasebona ja liuotusaineena, ja kaikki annokset annettiin 100 ui:n tilavuuksina. Kahta suurinta annosmäärää käytettäessä oli HBP:llä selvästi haavan paranemista kiihdyttävä vaikutus, arvioituna 25 epiteelin muodostumisasteen perusteella. Suurimmilla annoksilla käsitellyissä haavoissa oli runsaasti uusien verisuonten muodostumista.

30 Materiaalit ia menetelmät Koe-eläimet 100 naaras-Wistar-rottaa, kanta CRL: (W1)BR, ruumiin 35 paino noin 240 g, ja ikä 80 päivää, käytettiin. Rotat hankittiin Charles Riveristä, BRD, ja niitä pidettiin 24 101626 ilmastoiduissa olosuhteissa: 21 +- 1°C, 60 +-10 %:n suhteellinen kosteus, ilman vaihto 10 kertaa tunnissa ja päivänvalo klo 6.30:sta klo 18.30:een, 6 päivää ennen käyttöä. Rottia, pidettiin yksittäin suorakulmaisissa 5 Orthin muovihäkeissä, joissa oli mäntypohja. Ne saivat syödä mielihalujensa mukaan Altromin-dieettiä 1324 ja saivat vapaasti juoda vettä.

Käsittely 10

Rotat nukutettiin antamalla vastaonteloon pentobarbitaalia, 50 mg/kg ruumiin painoa kohti. Karvat ajeltiin niskakuopas-ta, ja toiminta-alue, halkaisija 50 mm, pestiin, desinfioitiin ja siitä poistettiin tartunta-aineella pienet partik-15 kelit ja karvat. Haavakammiot, jotka sisälsivät sisäpuolisen muovirenkaan ja nailonverkon liima-aineessa, liisteröi-tiin ihoon. Haavakammioiden sisähalkaisija oli 16 mm ja kokonaishalkaisija 45 mm. Nailonverkko kiinnitettiin edelleen ihoon 12 silkkiompeleella, ja sisäpuolisen 20 muovirenkaan sisäpuolella oleva iho poistettiin aina lihaskalvoon saakka. Haavat peitettiin polyuretaanikansil-la, jotka liisteröitiin kammioihin sinkkipastalla.

Leikkauksen jälkeen rotille annettiin Temgesiciä 0,1 ml:n 25 annoksina kahdesti päivässä kolmen päivän ajan.

Annostus pHBP:tä annettiin kahdesti päivässä 100 ul:n liuostilavuuk-30 sinä, jotka sisälsivät 0,9 % NaCl ja 0,1 % rotan albumiinia ·* (Sigma A 4538). Liuotusainetta käytettiin plasebona.

Leikkauksen jälkeen rotat jaettiin umpimähkäisesti neljäksi 25 rotan ryhmäksi, joille annettiin seuraavat annokset, 35 yksi annos leikkauspäivänä (1. päivä) ja kahdesti päivässä 2. - 8. päivinä: 25 101626

Ryhmä I: 12,5 ng pHBP

Ryhmä II: 0,5 ng pHBP

Ryhmä III: 2,5 ng pHBP

5 Ryhmä IV: plasebo

Annokset annettiin paikallisesti aivan haavakammioiden kansien alle. Kanyylit laitettiin polyuretaanikansien läpi.

10 Havainnot

Rotat punnittiin päivinä 1, 3, 5, 7 ja 9. 9.tenä päivänä haavakammiot poistettiin pentobarbitaalianestesiassa. Haavoja tarkasteltiin makroskooppisesti ja ne valokuvat-15 tiin. Käsittelykohdan ja sen ympäristön alue leikattiin pois ja se säilöttiin fosfaatilla puskuroituun neutraaliin 4 % formaldehydiin myöhempää histologista tarkastelua varten. Lopuksi rotat tapettiin poistamalla niiden veri vatsavaltimon kautta. Verestä otettiin näyte 20 seerumin IGF-I, PIIINP ja hyaluronihappoanalyyseja varten.

Tulokset

Taulukosta I nähdään neljän rottaryhmän keskimääräiset 25 ruumiin painot. Kaikkien rottien paino laski leikkauksen jälkeen, ja alimmat painot kirjattiin viidentenä päivänä. Ryhmien välillä ei todettu merkittäviä painoeroja.

Haavojen makroskooppisen tarkastelun tuloksena laskettiin 30 haavojen pinta-alat ja uudella epiteelillä peittyneiden alueiden pinta-alat 9. päivänä seuraavalla tavalla: kaksi halkaisijaa mitattiin, päästä perään päin ja vasemmalta oikealle, ja keskihalkaisijaa (°kokonais^ käytettiin haavan kokonaispinta-alan laskemiseksi: 35 26 101626 / Dkokonais \ 2 I --------- J x 3,14 = kokonaispinta-ala 5 Uusi muodostunut epiteeli mitattiin reunoilta kahdesta paikasta, siitä, missä se oli levein ja siitä missä kapein. Nämä kaksi tulosta laskettiin yhteen ja vähennettiin Dkokonais:sta' jolloin saatiin Davoin avoimelle haavalle.

10 Avoimen haavan pinta-ala laskettiin: f Davoin λ 2 [—) 15 ja vähennettiin kokonaispinta-alasta, jolloin saatiin uudella epiteelillä peittynyt pinta-ala. Tämän pinta-alan prosenttiosuus kokonaispinta-alasta laskettiin edelleen. Kolmella rotalla, joihin oli annosteltu 12,5 ng x 2 HBPrtä, 20 todettiin epätavalliset epiteeliä muodostaneet niemekkeet avoimen haavan alueella.

Mittausten tulokset ja lasketut pinta-alat ovat mukana seuraavissa tuloslehtisissä. Tulosten tarkastelu on 25 taulukossa 11.

Monilla rotilla, joille oli annettu suurin HBP-annos (12,5 ng) havaittiin punainen verta vuotava vyöhyke juuri epiteelireunan sisäpuolella, ja kaiken kaikkiaan haavoihin 30 näytti muodostuneen runsaasti verisuonia. Epiteelin muodostusaste oli tällä annosryhmällä huomattavasti suurempi kuin ryhmällä, joka sai keskikokoisen annoksen (2,5 ng). Eri ryhmille mitattu haavan pinta-ala ei oleellisesti eronnut plaseboryhmän haavan pinta-alasta.

35

Kun haavoja peittävä fibriini poistettiin suuren osan 27 101626 haavakammiota peittävää kantta kanssa, kiinnitettiin kannet + fibriini yhteen kudosten kanssa histologiaa varten.

5 Johtopäätökset

Haavojen makroskooppisen tarkastelun perusteella voidaan päätellä, että HBP, 12,5 ja 2,5 ng, annettuna kahdesti päivävässä, kiihdyttivät haavojen paranemista huomattavas-10 ti, kun arviointi tehtiin epiteelin muodostuksen perusteel la. Haavojen korkea verisuonten muodostuneisuusaste suurella annostuksella johtuu HBP: n angiogeenisestä vaikutuksesta.

28 101626

Rottien haavojen paraneminen Taulukko I

5 Naarasrottien, joiden haavaonteloon annosteltiin pHBP:tä tai plaseboa, keskimääräinen ruumiin paino. Rotat käsiteltiin ensimmäisenä päivänä.

Praparointi Rottien Ruumiin paino, g keskiarvo +- SEM 10 ja annos lkm pvä 1 pvä 3 pvä 5 pvä 7 pvä 9 pHBP, 12,5 ng 23 249 240 233 238 242 15 kahdesti pvässä +-2 +-3 +-3 +-3 +-3 pBHP, 0,5 ng 24 245 238 228 234 239 kahdesti pvässä +-2 +-2 +-2 +-2 +-3 20 pHBP, 2,5 ng 24 245 243 232 237 240 kahdesti pvässä +-2 +-3 +-3 +-3 +-3

Plasebo (0,9 % suolal. 23 245 240 228 233 241 • 25 + 0,1 % rotan +-2 +-2 +-2 +-2 +-2 albumiinia) 29 101626

Rottien haavojen paraneminen

Taulukko II

5 pHBPrllä saadut makroskooppiset tiedot

Koe Plasebo Kahdesti pvässä Kok.pa Epiteeliä muodosta-annettu pHBP- (mm^) nut haavan pa. annos ka.+- mm^ ka. % kok.pa: s ta 10 S.E.M. +-SEM ka. +- S.E.M.

VII 0,9 % 12,5 ng 118,3 52,2* 46,3** suola- 6,3 4,1 3,6 liuos + 2,5 ng 144,3 53,3* 3976 15 0,1 % 7,8 4,2 3,0 rotan 0,5 ng 130,2 44,5 35,8 album. 7,4 3,8 3,1 - plasebo T25TT 3875 3ΪΤ6 6,2 4,2 3,4 20 3σ

HAAVAN PARANTUMINEN VII Ryhmä I

101626

Haavan pinta-ala Avoimen osan pa. Epiteeliä muodostanut pinta-ala 2 2 2 (kokonais) mm_DSD_Dm_% pinta-alasta (tot.) 1 132.73 92.10 40.63 30.61 2 165.13 103.87 61.26 37.10 3 143.14 61.88 81.26 56.77 4 153.94 50.27 103.67 67.35 5 86.59 33.18 53.41 61.68 6 165.13 122.72 42.41 25.68 7 Kuollut 8 153.94 86.59 67.35 43.75 9 95.03 50.27 44.76 47.10 10 95.03 44.18 50.85 53.51 11 113.10 70.88 42.22 37.33 12 78.54 50.27 28.27 35.99 13 143.14 122.72 20.42 14.27 14 78.54 28.27 50.27 64.01 15 132.73 103.87 28.86 21.74 16 122.72 95.03 27.69 22.56 17 122.72 63.62 59.10 48.16 18 95.03 28.27 66.76 70.25 19 103.87 40.18 63.69 61.32 20 56.75 12.57 . 44.18 77.85 21 143.14 103.87 39.27 27.44 22 95.03 50.27 44.76 47.10 23 Kuollut 24 113.10 50.27 62.83 55.55 25 132.73 56.75 75.98 57.24 X 118.34 52.17* ' 46.24** S.E.M. 6.26 4.05 3.63 Z1 101626 _HAAVAN PARANEMINEN VII_Ryhmä II_

Epiteeliä muodostanut haavan pa. Haavan pinta-ala Avoin haavan i kokonais- 2 2 2 _(kokonais) mm pinta-ala (mm )_mm_pinta-alasta 26 201.06 165.13 35.93 17.87 27 132.73 86.59 46.14 34.76 28 113.10 86.59 26.51 23.44 29 188.69 113.10 75.59 40.06 30 132.73 95.03 37.70 28.40 31 103.87 70.88 32.99 31.76 32 143.14 70.88 72.26 50.48 33 103.87 44.18 59.69 57.47 34 122.72 50.27 72.45 59.04 35 50.27 28.27 22.00 43.76 36 132.73 65.75 75.98 57.24 37 103.87 78.54 25.33 24.39 38 95.03 56.75 38.28 40.28 39 95.03 63.62 31.41 33.05 40 86.59 28.27 58.32 67.35 41 153.94 113.10 40.84 26.53 42 113.10 70.88 42.22 37.33 • 43 176.71 153.94 22.77 12.89 44 103.87 86.59 17.28 16.64 45 143.14 78.54 64.60 45.13 46 143.14 95.03 48.11 33.61 47 143.14 103.87 39.27 27.44 48 Kuollut 49 153.94 95.03 58.91 38.27 50 188.69 165.13 23.56 12.49 X 130.21 44.51 35.82 S.E.M. 7.37 3.79 3.06

HAAVAN HARANEMINEN VII Ryhmä III

32.

101626

Epiteeliä mudostanut haavan pinta-a.

Haavan pinta-ala Haavan avoin S» kokonais- 2 2 2.

_(kokonais) mm_pinta-ala mm_mm_pinta-alasta 51 132.73 95.03 37.70 28.40 52 63.62 44.18 19.44 30.56 53 201.06 122.72 78.34 38.96 54 132.73 56.75 75.98 57.24 55 103.87 44.18 59.69 57.47 56 153.94 70.88 63.06 53.96 57 165.13 70.88 94.75 57.08 58 153.94 78.54 75.40 48.98 59 132.73 78.54 54.19 40.83 60 86.59 38.48 48.11 55.56 61 113.10 50.27 62.83 55.55 62 226.98 188.69 38.29 16.87 63 122.72 78.54 44.18 36.00 64 132.73 113.10 19.63 14.79 65 122.72 70.88 51.84 42.24 66 176.71 143.14 33.57 19.00 67 153.94 78.54 75.40 48.98 68 153.94 95.03 58.91 38.27 69 201.06 132.73 68.33 33.98 70 113.10 63.62 49.48 43.75 71 176.71 153.94 22.77 12.89 72 176.71 132.73 43.98 24.98 73 113.10 78.54 34.56 30.56 74 Kuollut 75 153.94 103.87 50.07 ' 32.53 X 144.33 53.33* 39.56 S.E.M. 7.75 4.20 3.03

HAAVAN PARANTUMINEN VII Ryhmä IV

33 101626

Epiteeliä muodostanut haavan pinta-a. Haavan pinta-ala Avoimen haavan % kokonais- 2 2 2 _(kokonais) mm pinta-ala mm_mm_pinta-alasta 76 Kuollut 77 103.87 70.88 32.99 31.76 78 95.03 56.75 38.28 40.28 79 95.03 38.48 56.55 59.51 80 70.88 50.27 70.61 29.08 81 132.73 56.75 75.98 57.24 82 86.59 63.62 22.97 26.53 83 113.10 95.03 18.07 15.98 84 176.71 153.94 22.77 12.89 85 113.10 78.54 34.56 30.56 86 Kuollut 87 113.10 63.62 49.48 43.75 88 122.72 44.18 78.54 64.00 89 132.72 63.52 69.11 52.07 90 103.87 70.88 32.99 31.76 91 153.94 132.73 21.21 13.78 92 153.94 113.10 40.84 26.53 .'· 93 153.94 132.73 21.21 13.78 94 113.10 95.03 18.07 15.98 95 176.71 153.94 22.77 12.89 96 113.10 95.03 18.07 15.98 97 153.94 78.54 75.40 48.98 * - - — - _ 98 132.73 103.87 28.86 21.74 99 176.71 132.73 43.98 24.89 100 113.10 70.88 42.22 37.33 X 126.12 38.50 31.62 S.E.M. 6.20 4.19 3.37 ^ 101626 c 1= ε § ro E ~ g g > ^ ε ro g m oj

JS .® X X

1-1 Π ΓΜ c (Λ X 1 1 (U -I— r~— >— ero· r in i/i ιΛ »o in in «n in in in in m O»—········· -

> <Ό CN rH CT» CD VO OJ OCOr^CnaOOiVOrH^H^lOr-^TrHCO CO CO

fH H »H rH rH rH rH

gin minminmininm m m

(\J O H H H H o O*—lOOOO*-HOOO·—I OJ O ·—II—I O r-H

fO

c => zs —I Oi

LlJ S- l··— oo c C ·!- ^ r— cc: <u ^ <D m in m H- 4-* · · · _ ‘T '— ocvicninmrvj mojmojr-ioro^H^Hfo^TOJTrr-HOJ -c* m z o.

LU Ui z Ο Λ Ο

O

^ in in tn in in in in in in in CO * . .....

O , m m ττ O «»t •CMOmocnniCM*—»^-icomr-4 cn m

^ I rH rH rH rH H H rH rH rH rH H rH rH rH rH «—H «—H «—H rH rH r*H r*H

«a: s: ^ z

UJ rO

. Z Ό t-H »r- ς: ιΛ ^ (N Tr t\ ’T o HXr-HONOO^rOcnconjO^-HCTN^Tr-H fN n

*—4 rH i—4 rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH *—H rH rH rH rH

=D i—

fO -C

z c c > <o < > <£ ro

Ζ fO

zc ee m in rH m HyrHcn^rOrnororNirnojoJoomrH rsim 4-> +-> =5 . 3 —

g - O

e § ^ ro ^ 4«^ O O'-^mrnrr^nv^r^cDcr'OrHrsir^i^rin OC —. rv* r-> ^r n vD r- ro cr» *—· ,—· rH ,—» r-4 .——ιγμγμγν r\j n-t r\i | 3ίΓ 101626 *

ro iQ

^ in in tn «n id tn in tn tn m ia tn fO *r- ' * * * * ' ro ΐΛ^οοηί^ΦσνΓ'βνΟίΟΟΟοΟ'ΦΓΜσίνοο*-*»-* >h

.C *1“ «-H »-^ «—“» i~-t r—4 Ψ—* r—4 »—I «-H r-H ,—4 rH

<o c •n- ι-

Ο fO

> _c c ε m m tn to tn «n m tn m tn m tn tn tn tn ” ^O'-tOO^-tOrMCMOOCMOOOCJOOOOf-tOO o o to c 3

CU

i- c r* r— ►*—» d) l_ Φ m tn tn tn tn in tn in m tn 2 -P · · · · .....

m *f— ,— HfH^nr^H(NCNVHOiHOlHCNHrJOH(N(MM m o

O CL t—I LU

;> ex:

<C

LU

2 tn tn tn tn m tn m mtntnin tn Q- vorocNinro^-tmi-HOJCom^-i*—if—lO^rfNtn^-tmmm m O- |X H r—4 H *~H »H H *H H H H ·—» »H H H H »H i—H «—« »H »H ^

O

o en ^

o E

qc e e 21 ro ·*-> 1 ,r~ * ‘ tn vD^rrsiinmcMmcM»—«comot-Hm^-^fMinrMcsjrnm m tn ^ ^ ^ »—4 r-< r—4 r*·^ iH rH ^4 rH «—4 «—* »—4 »—4 r—4 «H »—4 O ro C r- > <0 C -e <c a: e

iO

> Π3 «3 vDrMnjto^noa-^r^-i^comm^orMTrrMin*—»tn^cr^T into r—« *—* /*· »—4 «—* f* »—4 »—4 »—4 *—4 »—4 «—4 »—4 »—4 »—H «—* »—4 «—4 r—t r—4 >—4 »—4

-P

♦ 3 O r— C Γ— e § (O ^ 4-> q VO r ^ CO CP» O *—♦ AJ TT in \£> f-^ CO O ^ ΓΜ ro lO tO CO <7N o

QirMrNirvirsjr^rnrnronmr'-vnror^'cT^rTTiT'^r^-^rl^-tr^rt/i 101626 m ί?'0 in ιλ m ι/i in i/i νη ιλ m m > Ό ·*···. · . , * ίβ 'ΐΛ <—ir'00oor-cn<T'Oor^a3ino(NO\no>-'ro{T>'«Troo — *** f— >r. pH «h r-H h H H Μ H H r-H *-H |H ·—* <0 c O ¢0 > sz < m m m in in in m in in m

· · · · · · · * ♦ * E ^hO»-*»-H»-I*-H«-*OOOOOOOOOCN«-Ii-h.-HOO I O

E c\J

to c 3 <u s.

c tn m in in m m ^ · « · · * · ^ ^ _ r-ii-irororMcoxrrofOco^r.-iog^ro.-iojcNiMcNO.-i i rg _l ·*->

LlJ -r-

I— Cl 00 LU

<C

o£ <£ m in m mm H“ · · · · ·

, fno^vomf-iTr^^rrooojr^cMincMin^r^inoiinintN

' »“H H H iH H H H H H H H H r“H H pH H H H »—H H rH rH

LU

Z

1—4 a.

a.

o o ^

^ E

tn E

o — cc .J® (NiONvocgr-i^^mroofNr^cg^^Hin^rmvooain^rrM ro ^ ^ «»H rH pH pH «—H rH r—4 rH rH r-H pH ^ H rH ^ r-H rH pH pH *-H H r^

CO

I *r— to * Ui o «— ro

C _C

> c c

<t fO

zc >

iO

^ ««xCTNVDTrfM^ininro^HiNr^mfM^in^rroiDcsiinvnni m T~ , r*H ^H i-H rH ^H ρ«Η «-H ^H ^H ^H i 4 r-H rH rH ^H ^H ^H r-H «—H r-H r—< 4-> ^ 3 O H”

C O

S ^ 4-> q t—t oh I Γθ^·ιηΐ£>Γ~*αοσ>ο·“ΗηίΓ·ο^τιηνθΓ^·οοοΓιθ»—‘OHm^r in cc tn tn| tnmtntnintnin\DvDvDvoviicDcDi£)iDtr>r^r-r^r-r- r»» ** 101626 'ε'

E

rO <0 > ,f_5 <13 ·»— ^ ς/> mm -m m m mm .e ·»- · · ro <j\ co r*· co co σ\ «—« ^ o i ^ «h o ·— m σ>

C ^ H rH rH H fH H »H rH rH

O rO

> -C

< C4 m m m m m m mmm ε ♦ ··· ·« «··

3^c\J OOCMO.HOOOO ·—iC^r-iOOOOOOi—**-HOOO

<0 c 3 ω S-

ID C

-J «r- |±! m in mmm en O) · * · · · C 4J , oi(N<NrHrOr-»«-iOCSi ΓΜΓΟΠ<>ί^ΗΓΜΟ«Ηθ«~»ΓΟ·-Ι»-·ΓΜ -r-

Cd CL·

<C LU

h-

Z

LlJ

2 m m m m m Q_ * · · * *

o_ jx ^-4»-*»-«dmo<MmrM ojiNm^H^TTrrrcNmm^rromrsJ

O rH H rH ^ rH rH «—H »H r"< H H H H rH rH *H H «H cH

O

tn

o -cd E

^ E

<C ·—- Σ

(O

I •“J

• » ·|— 111 </) cn*—<ojQNmo>«-HmcNi «h m m «—i^^^ovor^^fnvom

O *1“ CsJ rH rH H rH »H rH rH rH H rH H H rH rH rH «H H H rH rH rH

ro C -*£ > r— C ro

C -C

e <0 > ro ro m rHrHOorncsimmrsj mpsimrM'T^r^rTrrrrnTrm’^r*—<

f”” rH rH rH rH «H »H rH »H rH «H *H rH rH «H rH «H rH rH rH H H H ^H

4-> • 3 O r— C i—

O

C 3 ro ^

+> O

O vor-ao<T\OrHCMm^mv3r,,*cD<y»o^H<Nro*Tmv£>r--co<y'0

Od r^r-r-r-coooaocoooooaDooaDGO(T»cTiaNON(TkC7>cr><ri<T»air-< 38 101626

Histoloainen arviointi Materiaalit: 5 5 um:n paksuinen viipale leikataan keskeltä (pää-peräsuun- taisesti) paraffiinillä käsiteltyä haavaa.

Viipale värjätään hematoksyliini-kosiinilla ja arvioidaan valomikroskooppisesti.

10

Tulokset:

Haavojen mikroskooppitarkastelun tuloksena laskettiin 9. päivän uusi epiteeli seuraavalla tavalla: 15

Koko haavan halkaisija mitattiin, avoimen haavan halkaisija mitattiin ja vähennettiin edellisestä:

Koko haava - Avoin haava 20 ------------------------- uusi epiteeli 2

Seuraavalla tavalla saatua arviointiasteikkoa käytettiin yhdistämään rottien haavan paranemisen kvantitatiivinen . 25 ja kvalitatiivinen histologinen arviointi: uusi + ίjyväs- + jätti- \ + jyväs- + epiteelin epitee- f kudoksen solut kudoksen arviointi ti (mm) I arviointi (0—4) korkeus (0—4) 30 y (0 — 4) J (mm) 4 = arvosteluluku 35

Haavojen pinta-alat ja haavoihin 9. päivänä muodostuneen 39 * Γ f' · f*·· .**

* U i L i. O

uuden epiteelin pinta-alat laskettiin seuraavasti: /haavan kok. halkaisija \ ^

Kokonais-pa = / ------------------------] x 3,14 5 \ 2 /

Uuden epiteelin pinta-ala = /avoimen haavan halkaisija \ ^ 10 Kokonaispinta-ala = f-------------------------j x 3,14 ja uusi epiteeli laskettiin edelleen prosentteina kokonaispinta-alasta.

15

Mittausten tulokset ja saadut arvosteluluvut ja pinta-alat näkyvät taulukoista.

Johtopäätökset 20

Haavojen mikroskooppitarkastelun perusteella ja saatujen arvosteluasteikon lukujen perusteella voidaan päätellä, että p-HBP -annoksilla 12,5 ng ja 0,5 ng on vaikutusta haavan paranemiseen.

25

Vaikutus nähdään jyväskudoksissa, jotka ovat korkeita ryhmissä 1 ja 2, annoksilla 12,5 ng ja 0,5 ng pHBP:tä (taulukko II). Ryhmässä 1, annoksella 12,5 ng pHBP, jyväskudokset ovat kehittyneempiä kuin plasebo-ryhmässä 30 (taulukko II). Pinta-alalaskujen perusteella ei epiteelin . muodostumisen määrässä ole havaittavissa selviä eroja eri ryhmien välillä.

35 40 101626 HAAVAN PARANEMISKOE VII Taulukko 1 5 pHBP:llä saadut makroskooppiset tiedot

Ryhmä Arvosteluasteikko keskiarvo +- S.E.M.

10 1 12.5 ng 2,53 *** p-HBP 0,06 2 15 0,5 ng 2,35 * p-HBP 0,07 3 2.5 ng 2,26 20 p-HBP 0,07 1

Plasebo 2,10 0,09 : 25 ------------------------------------------------------- *** p < 0,001 tasot, joissa ero plaseboon verrattuna oli merkittävä ** p < 0,01 * p < 0,05 30 M 101626 * * S * * g tO < Γ" VD fNJ 00 *—< Π o VD (N| --' Ovi l_Pl r-H «—♦ tO «—H CO tjO *—* Γ* in r-t c ... . . . - - . . . .

dl ΙΛ (NOO (NOO #—< o o ·—« o o

I tn 3 to ^ 0J

:λ3 o >*o i- >> 3 O Ό J* C ·»- •r- +-> CT ooo ooo ooo ooo

SoT ooo ooo ooo ooo 4-> -r- O * * * * *.......

*r~ > >— «r o o ^roo o o rr o o o. i.

UJ «T3 c •f— 'o „—. co n n \o (N m m m ro ro rr co O» ra E r^* γ-h cnj <r cn oj m »-< <n co ro cn 4J c E ............

#r“ 3 ' (N h o (N h o rg i—i o (N h o O. <1> LU S.

(-H -M

t-H ►—< 3 > *—· I— * ·¥ o -—- oo ω m oo vd (N n oo vo σν o <—i LUO tn ^ vr o (N in o (N o (N r-j mmm O -iC T- I ... ...

\/ \C i 1 r—i

^ j „ O rH O O f-"V l I f V * * O i*H r—* O

*—ii— :ro s: 3 o

Lul (O

Z I— cc <z n.

z <c > I * co co -— :« o «t vo h »r oo o o n av o oi^o . >oi av (n o en m ι-t vo vt h p. »cr ,—* >,30 ... ... ... ...

O --- CNOO (NOO (NOO (NOO

* e to '—^ (N σν co oo m co vt vo n av κι av t- > E kv h <r cd ro m o vt co oo co O (Ο ε ... ... ... ...

^ J2 ' CO (N O VD (N O VD (N O KV e o (0 -tr * S jS 'cz co —i o n vo co conn (Ninr~

... οίοε (NOV'S· CO CO CO co rH VT CM CO (N

2C D --- ... ... ... ...

CJVr-lO av rl O CO CM O CO I—I o X X) Σ X Ό Σ X Ό 2 ΧΌ 2 ιλ u to ω w ω cow

CO to CO CO

en e en en o :i :i -o. :i s * .e _c •o.cn^.LOinj

>, >, C'J W . I -I

CC CC r~> —. x (NOO. CO CM Q. »ra.

Claims (4)

101626

1. Menetelmä hepariinia sitovan proteiinin valmistamiseksi, jolla glykosyloidussa tilassa on näennäinen mole- 5 kyylipaino noin 28 kDa määritettynä SDS-PAGE:lla pelkistävissä olosuhteissa ja jolla on angiogeenisiä ominaisuuksia in vivo ja kemotaktisia ominaisuuksia monosyyttejä vastaan, tunnettu siitä, että nisäkkään verihiutaleita uutetaan liuottimena, minkä jälkeen uute kromatografoidaan 10 hepariini-sefaroosia ja käänteisfaasi-HPLC:tä käyttäen hepariinia sitovan proteiinin erottamiseksi puhtaana.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että uuttoon käytetyt verihiutaleet ovat sikatyyp- 15 piä.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että uutossa käytetyt verihiutaleet ovat ihmistyyppiä. 20

4. Patenttivaatimuksen 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että solu-uutteet lisätään hepariini-sefa-roosiin noin 0,5-molaarisessa NaCl-liuoksessa, jonka pH on säädetty välille 7,2 - 7,6, edullisesti 7,4:ään. 25 101626