HU219883B - Heparinkötő proteinek, ezeket kódoló DNS és a proteineket tartalmazó gyógyszerkészítmények, valamint eljárás ezek előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány olyan heparinkötő proteinekre vonatkozik, amelyekneklátszólagos molekulatömege glikozilezett állapotban – redukálókörülmények között végzett SDS–PAGE útján meghatározva – 28 kD körüliérték, és amelyek in vivo körülmények között angiogéntulajdonságokatés monocitákkal szemben kemotaktikus tulajdonságokat mutatnak. Aproteineket a találmány értelmében emlőstrombocitákból extraháljákvagy rekom- bináns úton állítják elő. A találmány tárgykörébetartoznak a proteineket kódoló DNS-molekulák, továbbá a pro- teinekettartalmazó gyógyszerkészítmények is. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás új heparinkötő fehérjék és ezek biológiai ekvivalensei, továbbá ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények és eljárás ezek előállítására. A találmány szerinti új fehérjék felgyorsítják az angiogenezist, valamint állati modellekben a sebekben a granulációs szövetképződést. A találmány szerinti, az emberi szervezetben a szövetregenerálódás stimulálására képes ezen fehérjéket tartalmazó gyógyászati készítmények főleg külső sebekre lokálisan alkalmazhatók. Normálállapotban a találmány szerinti fehérjék glikoproteinek.

A szövetek normál regenerálódása sejtes és biokémiai folyamatok rendezett sorozata folyamán megy végbe, amit a sérülés indukál, és új szövet képződése követ.

A sérülés szélén elhelyezkedő fibroblasztok osztódnak, az avaszkuláris sérülés területe felé vándorolnak és kollagént termelnek. Az új kapillárisok a már létező vénákból és kapillárisokból jönnek létre, és a sérülés széle felé vándorolnak. Ezek a folyamatok addig folytatódnak, amíg a gyógyuló seb szélei összeérnek, a sérült területet vaszkularizált kollagén frbroblaszthálóval töltve fel (granulációs szövet). Végül az epiteliális sejtek osztódnak, a granulációs szövetet beborítják, és a helyreállítási folyamat befejeződik.

A vérlemezkék az első fontos elemei egy seb gyógyulási folyamata első huszonnégy órájának. A gyógyulási folyamatot ezután a neutrofil granulociták folytatják, ezt követik a makrofágok és a limfociták, amelyek a szövetsérülés utáni második-harmadik napon rendezett sorrendben vándorolnak a sebbe. Ezek azok a gyulladásos folyamatban szereplő sejtek, amelyek végül a megfelelő gyógyulást biztosítják a parakrin növekedési faktorok gondosan szabályozott felszabadulásával. Az utóbbi években összegyűlt némi ismeret ezen növekedési faktoroknak [nevük vérlemezke eredetű növekedési faktor (PDGF)] a sebgyógyulási folyamatban való működési mechanizmusáról. Ilyen az a-transzformáló növekedési faktor (TGFa), valamint a β-transzformáló növekedési faktor (TGFp). A PDGF először a vérlemezkék α-granulumaiból szabadul fel, amikor a vérlemezkék a friss seb széleihez tapadnak, és erős kemotaxissal rendelkeznek a fibroblasztok irányába [Grotendorst, G. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 3669-3672 (1981)], emellett erős mitogén hatással rendelkeznek ugyanazokra a sejtekre akár TGFa, akár az epidermális növekedési faktor (EGF) jelenlétében [Deuel, T. F. et al., Cancer Surv., 4, 633-653 (1985)].

A PDGF aktiválja a fibroblasztokat, hogy koilagenázt bocsássanak ki [Bauer, E. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4132-4136 (1985)], ezzel hozzájárul ahhoz, hogy a hordozó újraalakuljon, ami egy lényeges eleme a sebgyógyulásnak.

A TGFfl-t viszonylag magas koncentrációban találták a vérlemezkékben, és azt is kimutatták, hogy a vérrög képződése közben az α-granulumokból szabadul ki. Ez a növekedési faktor fontos szerepet játszik a hordozó képződésében a sebekben, és azt is megfigyelték, hogy szabályozó hatása van számos más növekedési faktorra, például a PDGF-re, EGF-re és a TGFa-ra.

A TGFp erős kemotaxis aktivitással rendelkezik a monociták felé. Ezáltal közvetlenül a sebesülés után a vérlemezkékből kezdetben kiszabaduló növekedési faktorok is fontos szerepet játszanak azzal, hogy a gyulladásos sejteknek a sebhez való vándorlását stimulálják. A TGFp monocitákat gyűjthet a keringésből, és ezt követően aktiválja őket szekréciós fenotípusúvá [Wiseman, D. M. et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 157, 793-800 (1988)].

Ha egyszer a monociták elnyerték ezt a fenotípust, és már helyesebb makrofágoknak nevezni őket, akkor kimutatható róluk, hogy ugyanazokat a faktorokat szekretálják, mint amelyek a vérlemezkékben találhatók, ezenkívül számos mást, amely nagy fontossággal bír a helyreállítási folyamatban.

Tehát a monociták/makrofágok növekedést szabályozó faktorokat, például vérlemezke eredetű növekedési faktort (PDGF), β-transzformáló növekedési faktort (ΤΰΡβ), α-transzformáló növekedési faktort (TGFa), bázikus növekedési faktort (BFGF), egyes inzulinszerű növekedési faktort (IGF-1), Bombesint, granulocitastimuláló faktort (GSF), granulocita-makrofág kolóniastimuláló faktort (GM-CSF), monocitastimuláló faktort (MCSF) és interleukin-l-et (IL-1) választanak ki. A kiválasztott termékek lehetnek még proteázok, komplement fehérjék, monocita eredetű neutrofil aktiválófaktor, arachidonátok és az α-tumomekrózis-faktor (TNFa) [Rom, W. N. et al., J. Clin. Invest., 82, 1685-1693 (1988), Rappolee D. A. et al., Science, 241, 708-712 (1988), összefoglaló munka: Unanue E. R. et al., Science, 236, 551-557 (1987)].

Az összes ilyen makrofág eredetű parakrin növekedési faktor részt vesz a gyógyulási folyamatban, de az ezen faktorok közötti mechanizmus, valamint komplex kölcsönhatás számos részlete még kevéssé ismert.

A gyógyulási folyamat során meghatározó fontossága van annak, hogy a növekedő szövetet megfelelően ellássuk oxigénnel és tápanyagokkal. Ezt az angiogenezis nevű bonyolult folyamattal lehet biztosítani, ami új véredények kialakulásához vezet helyben. Ez a folyamat magában foglalja a vaszkuláris sejtek rendezett vándorlását, szaporodását és differenciálódását [Folkman, M. et al., Science, 235, 442 (1987)]. Az endoteliális sejtszaporodással végbemenő angiogenezis iniciálásáért feltételezhetően két mitogén polipeptid felelős: az I. típusú heparinkötő növekedési faktor (HBGF-I), amely savas fibroblaszt növekedési faktor néven is ismert, valamint a II. típusú heparinkötő növekedési faktor, (HBGF-II) vagy fibroblaszt növekedési faktor (bFGF) [Thomas, K. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 6409 (1985); Esch, F„ Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 6507 (1985)]. Ezek a faktorok nem találhatók meg a vérlemezkékben, de a bázikus FGF szekretálódik az aktivált monocitákból/makrofágokból, amint azt az előzőekben említettük, és kimutatták róluk, hogy az angiogenezist in vivő indukálják.

Tehát az világos, hogy a vérlemezke-kibocsátás kezdeti hirtelen megindulása a sebesüléssel kapcsolatban nem vesz igénybe direkt angiogénfaktorokat. Azonban a vérlemezke-extraktumokról kimutatták, hogy in vivő kísérletekben angiogének, és ez kimutathatóan, a monocitaaktiválás eredménye, ami egyben a fentiekben

HU 219 883 Β említett megfelelő faktorok szekréciójához vezet. Számos kísérlet történt a vérlemezkékben levő nem mitogén angiogénfaktor izolálására és jellemzésére, de ennek a faktornak a természetét nem közölték a szakirodalomban [Knighton, D. R. et al., Ann. Surg., 204, 323-331 (1986)].

Az angiogenezis előfordulásának szükséges feltétele a heparin jelenléte a sérülés területén, és azt is igazolták, hogy a heparin eltávolítása (például protaminnal) teljesen eltörli az angiogenezist.

Ennélfogva bármely olyan faktornak, amely képes a keringésből monocitákat gyűjteni a sérült területre, majd ezt követően aktiválni őket, amellett, hogy heparinkötő tulajdonságokkal rendelkezik, különleges fontossággal kell rendelkeznie az angiogenezisben, valamint a teljes helyreállítási folyamatban is.

A találmány tehát ez idáig ismeretlen olyan fehérjék (az emberből, illetve sertésből származó típusokat a továbbiakban hHBP, illetve pHBP jelzéssel látjuk el) előállítására vonatkozik, amelyek egyedülállóan alkalmasak arra, hogy az angiogenezist és a szövetek regenerálódását stimulálják a következő okok miatt:

a) felszabadulnak a vérlemezkékből, ha ezek a sejtek aktiválódnak, amint az a roncsolt szövetek esetében előfordul;

b) a heparinhoz kötődnek;

c) kemotaxissal rendelkeznek a monociták felé;

d) morfológiailag aktiválják a monocitákat a szekréciós fenotípus felé;

e) tenyészetben aktiválják a monocitákat a fibroblasztok mitogénjeinek kiválasztására;

f) alkalmazása angiogenezist eredményez tyúktojás korioallantoin membránmodellben;

g) megnövelik az epitelizáció sebességét, ha patkánykísérleti modellekben sebkamrákra alkalmazzuk, amint azt makroszkopikus és hisztológiai vizsgálatok alapján meg lehet ítélni;

h) megnövelik a granulációs szövetképződést a sebkamramodellben, amint azt makroszkopikus és hisztológiai vizsgálatok alapján meg lehet ítélni,

i) megnövelik a véredényképződést a sebkamramodellben, amint azt makroszkopikus vizsgálatok alapján meg lehet ítélni.

Az ez idáig ismeretlen fehérjék két specifikus képviselője sertés-, valamint emberi vérlemezkékből származik, a sertésből származó fehéije aminosavszekvenciáját teljesen felderítettük. A humán fehéije erősen homológ a sertésből származó fehérje aminosavszekvenciájával.

A szöveti regenerálódással kapcsolatban egy fontos tulajdonság a fehérjék heparinkötő képessége. Röviddel a szövetkárosodás után megfigyelhető, hogy a kötőszöveti hízósejtek, a gyulladásban fontos szerepet játszó számos más komponens mellett, nagy mennyiségű heparint bocsátanak ki [Qureshi, R. et al., The Journal of Immunology, 141, 2090-2096 (1988)].

A kibocsátott heparinról ismert, hogy a kollagénhez kötődik, és miután ez egyszer lejátszódott, a jelen találmányban ismertetett heparinkötő fehérjék immobilizálódnak. Ezek egy rögzített gradienst hoznak létre, és amint azt Gustafson, valamint munkatársai elméleti alapokon feltételezték, emellett Carter kísérletesen kimutatta, a sejtek hajlanak arra, hogy a növekvő szubsztráttapadás gradiensének irányában felfelé mozogjanak. Carter azt javasolta, hogy ezt a jelenséget nevezzék el „Haptotaxis”- nak [görögül: haptein, jelentése megerősíteni; taxis, jelentése elrendezés]. Ezen az alapon a morfogenezisben, gyulladásos folyamatban, sebgyógyulásban, tumorinvázióban, valamint valójában az összes sejtmozgásban részt vevő sejtvándorlásról feltételezik, hogy azok a folyamatban szereplő sejtek haptotaktikus válasza eredményének tekinthetők [Gustafson, T. et al., Intem. Rév. Cytol, 15, 139 (1963); Carter, S. B. Natúré, 208, 1183-1187 (1965)].

Ezen az alapon az említett heparinkötő fehérjék egyedülállóan alkalmasak arra, hogy a keringésből monocitákat gyűjtsenek a roncsolt szövetterületre. Az ezt követő aktiválás a szekréciós fenotípus irányába in situ játszódik le, azaz a monocita/makrofág eredetű citokinek komplett elegye kibocsátódik a roncsolt sejtek szomszédságába a sejtben, és megkönnyíti a gyógyulást.

A találmány szerinti heparinkötő fehérjékről előre látható, hogy különösen alkalmasak krónikus emberi sebek gyógyulásának stimulálására. Általános vélemény, hogy idős betegekben a legfontosabb patogén faktor a krónikus lábfekély és felfekvés esetében a neovaszkularizáció (angiogenezis) hiánya.

A heparinkötő fehérjék említett tulajdonságai alapján a fehérjék (előnyösen a humán fehérjék) külsődleges alkalmazása krónikus sérülésekre előreláthatóan felgyorsítja a gyógyulást. A makrofágok eltávolítása lelassítja a sebgyógyulási választ [Leibovich, S. J. et al., Am. J. Pathol., 78, 71 (1975)]. A humán klinikai gyakorlatban a makrofágoknak ez az említett hiánya számos betegség kísérőfolyamata, és gyakran a terápia következménye. így például súlyos leukocitopénia figyelhető meg kemoterápiásán vagy besugárzással kezelt rákos betegeknél. A sebészeti beavatkozás utáni lassú gyógyulás, valamint krónikus fekélyek gyakran láthatók az ilyen betegeknél. A heparinkötő fehérjék által mutatott speciális tulajdonságok terápiásán hasznosak lehetnek az ilyen betegek esetén.

A HBP használható súlyos égések gyógyításában is. A neovaszkularizáció hiánya lassú gyógyulást okoz, ezért a roncsolt szövet érzékennyé válik a fertőzésekre. Tehát egy olyan komponens, amely monocitaaktiváló tulajdonságokkal rendelkezik, nagyon előnyös lehet. Az aktivált monociták vagy „makrofágok” tisztogatóként működnek, fagocitózissal eltávolítják a roncsolt szöveti törmeléket, ami egy nagyon fontos funkció az égésekkel kapcsolatban.

Újabban jelentős figyelmet fordítanak a makrofágok növekedésszabályozó szerepére a tumomövekedéssel kapcsolatban.

Az aktivált makrofágok magas koncentrációja citosztatikus hatású a neoplasztikus sejtekre, és ez a hatás szelektíven a neoplasztikus célsejtek ellen irányul. Ebben az összefüggésben a makrofágokból származó feltételezett szekréciós termék a TNFa [Diegelmann, R. F. et al., Plastic and Reconstructive Surgery 1968, 107-113 (1981)].

HU 219 883 Β

Az említett heparinkötő fehérjéknek terápiás hatásuk lehet a tumorterápiában. A szilárd tumorokba injektált HBP keringő monocitákat gyűjthet a tumor területére, majd az ezt követő aktiválás befolyásolja a citotoxikus hatást.

A találmány szerinti, a humán HBP-t tartalmazó klinikai használatra alkalmas gyógyászati készítmények lehetnek krémek, kenőcsök, gélek, habok, kötszerek, tapaszok, flastromok, mesterséges bőrök, vizes hordozók gézkötések átitatására, száraz duzzadó porok vagy varratborítók.

A HBP megkötésére alkalmas készítmény lehet fagyasztva szárított flastrom vagy hidrokolloid elnyelésére alkalmas kötözőanyag. Előnyös, ha a kötözőanyag a HBP szabályozott leadását biztosítja.

A használható gél tartalmaz egy vizes alapot, amelyet erősen viszkózussá teszünk vízben oldható éterezett cellulózszármazékok, például alkil-cellulóz, hidroxi-alkil-cellulóz és alkil-hidroxi-alkil-cellulózok, például metil-cellulóz, hidroxi-etil-cellulóz, karboxi-metilcellulóz, hidroxi-propil-metil-cellulóz és hidroxi-propil-cellulóz hozzáadásával. A hidroxi-alkil-cellulózszármazékok, például a hidroxi-propil-cellulóz, hidroxi-etil-cellulóz és a hidroxi-propil-metil-cellulóz az előnyös. A HBP-t általában a vizes fázisban oldjuk, mielőtt a gélképző anyagot hozzáadjuk.

Egy fagyasztva szárított kötés tartalmazhat egy koherens szálas szerkezetű kolloidot, amelyet a gél liofílezésével alakítunk ki. A hidrokolloid lehet vízben oldható éterezett cellulózszármazék, a fentiek szerint. A HBP-t általában a fagyasztva szárítás előtt itatjuk fel a kötésbe.

A kötözőanyag lehet egy tapadó-, elnyelőképességgel rendelkező pólya, amely tartalmazza a HBP-t. A kötözőanyag tartalmaz egy tömítőanyagot, egy ragasztóanyagot folytonos fázisként, és egy diszkontinuus fázist, amely a folytonos fázisban van diszpergálva; a folytonos fázis tartalmaz egy vagy több vízben oldódó vagy vízben duzzadó anyagot, úgymint az előzőekben említett éterezett cellulózszármazékokat. A diszkontinuus fázisnak az a képessége, hogy vízben megduzzad, biztosítja azt a lehetőséget, hogy a korábban fizikailag megkötött HBP-t fokozatosan leadja. A HBP-t adagolhatjuk folyadékkészítményekben is szubkután, intramuszkuláris vagy intravénás injekciókban. A HBP adagolását az említettek mellett végezhetjük intranazálisan, szájüregen át, intraperitoneálisan vagy rektálisan.

A találmány szerinti eljárás értelmében a HBP-t sertés- vagy emberi vérből kinyert vérlemezkékből lehet előállítani. Pontosabban a fehérjét a vérlemezke-extraktum frakcionálásával lehet előállítani. A Heparin-Sepharose-t alkalmazó oszlopkromatográfia hasznos erre a célra. Egy ilyen kromatográfiás módszer során gradienselúciót végzünk 0,5-3 mol/l-es nátrium-kloriddal egy olyan oszlopon, amelyen előzőleg keresztülfolyattunk egy vérlemezke-extraktumot, ennek eredményeként két csúcs eluálódik. Az első csúcs 1,2 mol/1 NaClkoncentráció körül jelentkezik, ezt 280 nm-en egy széles fehérjecsúcs formájában mérhetjük, ez az ismert (PF4) vérlemezkefaktor. 1,8 mol/1 NaCl-koncentráció környékén a fehéijemennyiség a használt rendszer kimutatási határa alatt van, de az itt lejövő frakcióknak angiogénhatásuk van. Az aktív frakciókat továbbtisztítjuk mikroporózus fordított fázisú HPLC-vel C4 oszlopon, majd 214 nm-nél egy teljesen tiszta fehéijecsúcsot mutathatunk ki, és ez a fehéije azonos a találmány szerinti HBP-kel, akár sertés, akár humán típusú, az alkalmazott vérlemezke típusától függően.

A HBP-ket rekombináns technikával is elő lehet állítani. Baktériumok, élesztők, gombák és emlőssejtvonalak használhatók gazdaszervezetként a HBP előállítására. A gazdasejtet egy megfelelő, a szükséges transzkripciós és transzlációs szignálokat, valamint a HBP-t kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó vektorral transzformálva érhetjük el a HBP termelődését.

Megválaszthatjuk, hogy a terméket sejten belül állítjuk elő, vagy a táptalajba szekretálva. Számos szekréciós szignál ismert. A 4 336 336 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban egy nem citoplazmatikus, a sejtfelszínen kívülre kiválasztott fehérje úgynevezett „leader”-szekvenciáját használják prokariótáknál, ennek eredménye a fúziós fehéije transzportja a periplazmatikus térbe. Az élesztőknél Kurjan & Herskowitz [Cell, 30, 933-943 (1982)] írnak le egy feltételezett α-faktor prekurzort, amely négy egymás utáni kópiát tartalmaz az érett α-faktorból, leírják a szekvenciáját, és egy processzálási mechanizmust állapítanak meg. Ezt a szignálszekvenciát használják számos polipeptid Saccharomyces cerevisiaeből történő expresszálására, amióta csak ezt a szignálszekvenciát felfedezték [Brake és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 4642-4646 (1984)].

A baktériumok nem képesek sem a fehérjék glikozilezésére, sem a legtöbb esetben a humán eredetű polipeptidek helyes diszulfidkötéseinek a kialakítására. Az élesztő azonban képes megfelelő diszulfidkötések kialakítására, viszont nem glikozilezi a fehéijéket a magasabb rendű eukariótákkal azonos módon. Olyan élesztőmutánsokat izoláltak, amelyek az emlőssejtvonalakhoz hasonló módon glikozileznek, ezáltal az élesztőt a glikozilezett fehéijék hasznos jövőbeli gazdaszervezetévé tették.

A találmány szerinti HBP-ket a továbbiakban még az is jellemzi, hogy SDS-PAGE módszenei egyetlen csíkként vándorolnak redukáló körülmények között (lásd 1. és 2. ábra), molekulatömegük körülbelül 28 kD.

A sertésvérlemezkékből tisztított heparinkötő fehérjék aminosavszekvenciája az alábbi:

15

I1eVa1G1yGlyAr gArgAlaGlnPr oGlnGluPhe Pr oPheLeu

AlaSerIleGlnLysGlnGlyAr gPr oPheCy sAlaGlyAlaLeu 45

HU 219 883 Β

ValHi s Pr oArgPheVa1LeuThrAlaAlaSe rCy sPheAr gGly 60

LysAsnSerGlySerAlaSerValValLeuGlyAlaTyrAspLeu 75

Ar gGlnGlnGluGlnSe rArgGlnThr Phe Se rI1eAr gSe r11e 90

Se rGl nAsnGlyTyrAspPr oArgGlnAsnLeuAsnAspVa1Leu 105

LeuLeuGlnLeuAspArgGluAlaArgLeuThrProSerVa 1A1 a 120

LeuVa 1ProLeuProProGlnAsnAlaThrValGluAlaGlyThr 135

AsnCy sGlnVa1AlaGlyTr pGlyTh rGlnAr gLeuAr gAr gLeu 150

PheSerArgPheProArgValLeuArgVaIThrValThrSerAsn 165

Pr oCy sLeuPr oArgAspMe tCy s11eGlyVa1PheSe rArgArg 180

GlyArg11eSe rGlnGlyAs pArgGlyTh r Pr oLeuVa1CysAsn 195

Gl yLeuAlaGlnGlyVa1AlaSe rPheLeuAr gAr gAr gPheXxx

196 210

XxxSe rSe rGlyPhePheThrArgVa1A1aLeuPheArgAsnTrp 217

11eAspSe rVa1LeuAsnXxx ahol a 195. és 196. helyen Xxx jelentése tetszőleges A humán vérlemezkékből izolált heparinkötő fehérjék aminosavak, és a 217. helyen Xxx jelentése egy vagy szekvenciája az alábbi: két tetszőleges aminosav. az N-terminálistól

15

11eVa1G1yGlyAr gLy sAlaArg Pr oAr gGlnPheProPheLeu

Al aSe r 11eGl nAsnGlnGlyArgHi s PheCysGlyGlyAlaLeu 45

I1eHi sAlaArgPheVa ÍMe tThrAlaAlaSe rCysPheGlnSe r 60

Gl nAsnPr oGlyVa1 Se rThrVa1Va1LeuGlyAlaTyrAspLeu 75

Ar gAr gAr gGluArgGlnSerArgGlnThrPheSer I1eUuuUuu 85

Me t Se rGluAsnGlyTyrAspPr oGlnGln(·············· ·····) LeuGlnLeuAs pAr gGluAlaXxxLeuThr Se rXxxVa1

Thr I JeLeuProLeuPro(················)G1uAl aGl y

Th r ArgCysGlnVa1AlaGlyTr pGlySe rGlnAr g(········ ··)LeuSe rArgPhePr oArgPheValXxxVaIThrValThrPro Gl uAspGlnCy sArgPr oAsnAsnVaICy sThrGlyVa1LeuTh r Ar gUuuGl yGly11eCy sAsnGlyAs pGlyUuuThr Pr oVa1Leu n - 29 (••••••••••••••••••••••••••••)SerLeuGlyPr oCy s

Gl yAr gGl yProAspPhePheThrArgVa1A1aLeuPheArgAsp n

Tr ρ11eAs pGlyVa1 LeuAsnAsnPr oGly ahol Uuu ismeretlen aminosavat jelöl; Xxx pedig a lehetséges glikozilezési helyet jelöli, előnyösen Asn; n az aminosavszámot jelenti.

Mindkét heparinkötő fehéqének a szekvenciáját számítógépes kereséssel vizsgáltuk egy fehéqeadatbankban, a GENETIC COMPUTER GROUP-tól (University of Wisconsin) származó programot alkalmazva, és azt ta pasztái tűk, hogy a találmány szerinti fehéqék ez idáig még ismeretlenek.

A találmány jobb megértését az alábbi ábrák és példák segítik:

Az ábrák magyarázata:

HU 219 883 Β

1. ábra:

A sertés-heparinkötő fehéije redukáló körülmények között készített SDS-PAGE képe

1. csík: Molekulatömeg-standardok

2. csík: pHBP

2. ábra:

A humán heparinkötő fehérje redukáló körülmények között (lásd 2. példa) készített SDS-PAGE képe

1. csík: Molekulatömeg-standardok

2. csík: hHBP

3. ábra:

A HBP angiogenezis vizsgálata a csirkeembrió korioallantoin membránjának felhasználásával. A magyarázathoz lásd az 5. példát.

4., 5. és 6. ábra

Ezeken a képeken HBP-vel kezelt monociták (8 ng/ml,

4. ábra), endotoxinnal kezelt monociták (100 ng/ml,

5. ábra) és PBS-sel kezelt monociták (kontrollsejtek,

6. ábra) láthatók. A magyarázathoz lásd a 6. példát.

7-1. és 7-2. ábra: a találmány szerinti eljárással rekombináns úton előállított humán HBP aminosavszekvenciája és azt kódoló DNS-szekvencia.

1. példa

500 g sertésvérből izolált vérlemezkét szuszpendálunk 1,5 liter PBS-ben, majd folyékony nitrogénnel (N₂) háromszor megfagyasztjuk és felolvasztjuk, ezt az eljárást hívjuk a továbbiakban fagyasztott/olvasztott preparátumnak. A fagyasztott/olvasztott preparátumot 30 percig 40000xg-vei centrifugáljuk, majd a kapott felülúszót 300 000 χ g-vel ultracentrifúgáljuk 60 percig. A kapott felülúszót 48 órán át dializáljuk 20 térfogat 10 mmol/1 foszfátpuffer, 0,5 mol/l NaCl (pH=7,4) összetételű oldattal szemben. A dializátumot egy 5 cm (I. D.)xl0 cm-es Heparin-Sepharose C1-4B oszlopra szivattyúzzuk 120 ml/óra áramlási sebességgel. Az oszlopot ugyanazzal a pufferrel mossuk, mint amellyel szemben a mintát dializáltuk (A puffer), egészen addig, ameddig több fehéije nem eluálódik. Az oszlopot ezután az A puffer és a B puffer (10 mmol/1 foszfátpuffer, 3 mol/l NaCl pH=7,4) közötti lineáris gradienssel eluáljuk 20 órán át 1,7 ml/perc áramlási sebességgel. 200 frakciót szedünk (mindegyiket 6 percig szedjük), majd az angiogénhatásukat vizsgáljuk. A gradiensben az 1,8 mólos NaCl-frakció körül szimmetrikusan megoszló 50 frakció mutat aktivitást. Ezeket a frakciókat egyesítjük, majd 0,5 mg/ml koncentráció eléréséig ovalbuminnal elegyítjük. Az egyesített frakciókat 20 térfogat A pufferrel szemben dializáljuk, majd egy 0,6 ml térfogatú Heparin-Sepharose C1-4B oszlopra (laboratóriumi vegyszereket forgalmazó cégektől beszerezhető) szivattyúzzuk 6 ml/óra áramlási sebességgel. Az oszlopot 10 órán át eluáljuk egy lineáris gradienssel, áramlási sebesség 0,04 ml/perc. 120 200 μΐ-es frakciót szedünk, vizsgáljuk angiogénhatásukat, majd egyesítjük. Az egyesített frakciókat ezután 0,1 ml térfogatú, fordított fázisú C4 oszlopon kromatografáljuk 0,1% trifluor-ecetsavat (TFA) tartalmazó 0-80%-os acetonitril-gradienssel 30 percig, 0,025 ml/perc áramlási sebesség mellett. Az angiogénaktivitást egy alapvonallal elválasztott, 26 perces retenciós idővel rendelkező csúcsban találjuk meg. A redukáló körülmények között végzett SDS-PAGE (lásd 1. ábra) azt mutatja, hogy a csúcs egyetlen komponenst tartalmaz (HBP), molekulatömege 20 kD.

2. példa

HBP előállítása humán vérlemezkékből

100 rész, egészséges donorok véréből frissen előállított trombocitakoncentrátumot összekeverünk, majd a trombocitákat 25 °C-on 15 percig 1700 χ g-vel centrifugáljuk.

A lecentrifúgált trombocitákat 3 térfogat PBS-ben szuszpendáljuk, majd hatszor lefagyasztjuk és felolvasztjuk cseppfolyós nitrogénben. A szuszpenziót ezután 60 percig 40 000 χ g-vel centrifugáljuk. Az ebből származó felülúszókat 2 napig dializáljuk 20 térfogat 10 mmol/1 foszfátpuffer, 0,5 mol/l, NaCl (pH=7,4) összetételű oldattal szemben. A dializátumot egy 5 cm (I. D.)x 10 cm Heparin-Sepharose C1-4B oszlopra szivattyúzzuk 50 ml/óra áramlási sebességgel. Az oszlopot ugyanazzal a pufferrel mossuk, mint amellyel szemben a mintát dializáltuk (A puffer), egészen addig, amíg már nem eluálódik fehéije. Az oszlopot ezután az A puffer és a B puffer (10 mmol/1 foszfátpuffer, 3 mol/l NaCl pH=7,4) közötti lineáris gadienssel eluáljuk 20 órán át 0,8 ml/ /perc áramlási sebességgel. 200, 6 percig gyűjtött frakciót szedünk. A frakciókat Microbore Reverse Phase C4 oszlopon (Aquapore Butyl 100x2,1 mm, 7 pm Brownlee Labs) vizsgáljuk egy gradiensen az alábbiak szerint:

Idő A puffer	B puffer	Áramlási
1%TFA	70% CH3CN 0,085% TFA	sebesség
0-5 perc 60%	40%	200 μΐ/perc
0-40 perc 30%	70%	200 pl/perc

A használt beerendezés egy Applied Biosystems 130 A Analyzer, a fehérjét 214 nm-en mérjük. A 20 perces retenciós idővel jelentkező csúcsokat gyűjtjük öszsze. Szárítás után a mintákat 0,1 mol/l TRIS-HC1, 1 mmol/1 EDTA, 2,5% SDS, 0,01% brómfenolkék, 5% 2-merkapto-etanol (pH=8,0) összetételű oldattal hígítjuk. Ezután 5 percig 95 °C-on tartjuk a mintákat és SDS-PAGE módszenei vizsgáljuk a Pharmacia Phast Gél berendezésével, SDS Phast Gél (8—25%)-t és SDS puffercsíkokat alkalmazva.

A mintákat 250 V, 10 mA mellett futtatjuk 15 °C-on 60 Vh-n [Henheshoven J. D. R., Elektrophoresis 6, 103-112 (1985)]. A 70-120-as frakciókban egy Ms=28->000-es csík látható. Ezeket a frakciókat egyesítjük, majd 20 térfogat A pufferrel szemben dializáljuk. A dializátumot egy 1 ml-es Heparin-Sepharose C1-4B oszlopra szivattyúzzuk, majd az oszlopot egy A puffer és B puffer közötti lineáris gradienssel eluáljuk 0,04 ml/perc áramlási sebességgel. 120 darab 200 pl-es frakciót szedünk.

3. példa

HBP előállítása humán forrásból

Erre a célra a K.562 humán sejtvonalat használjuk. Ezt a sejtvonalat, amely egy krónikus mieloid leuké6

HU 219 883 Β miás betegből származik, 12-O-tetradekanoil-forbol14-acetáttal (TPA) rá lehet bírni, hogy megakarioblaszt irányba differenciálódjon, amely a keringő vérlemezkék prekurzora. Alitalo és munkatársai kimutatták, hogy a PDGF gén indukálódik ezekben a sejtekben, ha TPA-val kezelik őket [Induction of platelet-derived growth factor gene expression during megacaryblastic and monocytic differentiation of humán leukémia cell lines, The EMBO Journal 6(5), 1213-1218 (1987)].

A K.562 sejteket 175 cm³ térfogatú Nuclone palackokban tenyésztjük 10% borjúmagzatszérummal és antibiotikumokkal kiegészített RPMI 1640 táptalajban. A sejtsűrűséget »300 000 sejt/ml koncentrációra állítjuk be, majd DMSO-ban oldott TPA-t (Sigma) adunk hozzá addig, amíg koncentrációja 3 nmol/1 lesz. Három nap elteltével a sejteket centrifúgálással ülepítjük (500 xg), majd egyszer mossuk 10 térfogat PBS-ben, majd újra ülepítjük.

g ily módon összegyűjtött sejtet 3 térfogat PBSsel keverünk el, majd a szuszpenziót hatszor egymás után lefagyasztjuk és felolvasztjuk cseppfolyós nitrogénben. A szuszpenziót 300OOOxg-vel ultracentrifugáljuk 60 percig, majd a felülúszót 300 ml-re hígítjuk 0,5 mól NaCl-t tartalmazó 10 mmólos Na-foszfát-pufferrel (pH=7,4). A hígított mintát 0,5 ml térfogatú Heparin-Sepharose C1-6B oszlopra szivattyúzzuk 72 óra alatt. Az oszlopot ezután 10 órán át a fel vivő puffer (A puffer) és a B puffer (10 mmol/1 nátrium-foszfát pH=7,4, 3 mol/1 NaCl) közötti lineáris gradienssel eluáljuk, majd 120 darab 200 μΐ-es frakciót szedünk.

Az 1,8 mol/1 NaCl körül szimmetrikusan elhelyezkedő 4 frakciót egymástól függetlenül Microbore Reverse Phase C4 oszlopon (Aquapore Butyl 100x2,1 mm, 7 pm Brownlee Labs) kromatografáljuk 0,1% trifluorecetsavat (TFA) tartalmazó lineáris 0-80% acetonitrilgradienssel, 25 μΐ/perc áramlási sebesség mellett.

Egy 26 perces retenciós idővel rendelkező fehérjecsúcs azonos a retenciós idő alapján a sertés-HBP retenciós idejével.

4. példa

A HBP angiogéntulajdonságainak kimutatása

Körülbelül 240 g testtömegű és 80 napos, a Wistar családba tartozó CRL:(W1)BR hím patkányokat használunk. A patkányokat felhasználás előtt 6 napig aklimatizáljuk 21±1 °C-on, 60±10% relatív páratartalom mellett, óránkénti tízszeres levegőcserével, reggel fél héttől délután fél hétig tartó megvilágítási ciklust alkalmazva. A patkányokat műanyag ketrecekben tartjuk, amelyeknek az alján fűrészpor van. Az állatokat igényük szerint etetjük Altromin táppal, és szabadon hozzáférnek az ivóvízhez is.

A patkányokat 50 mg/testtömegkilogramm dózisban pentobarbitállal elaltatjuk, intraperitoneális injekciót alkalmazva. A patkányokat megborotváljuk a hátukon, majd fertőtlenítjük. Egy körülbelül 3 cm-es dorzális vágáson keresztül a bal vesét feltárjuk, majd HBP-t, amelyet előre abszorbeáltunk 10 pl Affí/Gel Blue-ban [100-200 mesh-es (nedves), azaz 75-150 μοβ, Bio-Rad gyártmány] és 3 χ 3 mm-es abszorbeálható (Gélfrlm Upjohn gyártmány) zselatinfrlmre szárítottunk, egy kis bevágással a vese rostos kapszulája alá helyezünk. A felületi sebet 5 selyemöltéssel lezárjuk, majd Temgesic nevű készítményt (Reckitt & Colman gyártmánya) adunk az operáció után, három napon át naponta kétszer 0,1 ml-es dózisban. Az operáció után öt nappal a patkányokat ismét elaltatjuk pentobarbitállal, majd a bal vesét feltárjuk. A beültetés körüli régió új erek képződését mutatja a makroszkopikus értékelés alapján.

5. példa

A sertés és humán eredetű HBP vizsgálata angiogenezisre csirkeembrió korioallantoin membrán alkalmazásával

A megtermékenyítés utáni első napon a tyúktojásokat nedvesített, 37 °C-os inkubátorba helyezzük. A 7. napon egy lyukat készítünk a tojás tompa végén egy 25GS/8 0,5x06 tűvel, majd folytatjuk az inkubálást. A 9. napon egy lxl cm-es „ablakot” vágunk a tojások jelölt végén a burkolaton keresztül, majd az ablakokat Tegaderm nevű készítménnyel (Pharmacia gyártmánya) borítjuk. Továbbfolytatjuk az inkubálást, majd all. napon 5-30 ng HBP-t, amelyet előre abszorbeáltunk 10 μΐ Affi/Gel Blue-ban [100-200 mesh-es (nedves), azaz 75-150 μ-os Bio-Rad gyártmány] és 3x3 mm-es abszorbeálható zselatinfilmre (Gelfilm, Upjohn gyártmány) szárítottunk lamináris áramlással, helyezünk a korioallantoin membránra, az affigélt helyezve a membrán irányába, majd az ablakot visszazáijuk Tegaderm nevű készítmény (Pharmacia gyártmány) segítségével. Ötnapos 37 °C-os inkubálás után a válaszokat mikroszkóposán értékeljük.

Mind a 30, mind az 5 ng HBP a mikrovaszkuláris ágy sűrűségének erős növekedését indukálta az affigél régiójában, a nagyobb erek és a tipikus kapillárislabdaképződmények látható visszafejlődésével együtt (lásd

3. ábra).

6. példa

A humán monociták aktiválása

A monocitákat egészséges véradók citráttal kezelt vére „buffy coat”-jaiból izoláljuk.

A mononukleáris sejteket a következők szerint izoláljuk: a „buffy coat”-okat 1 térfogat hideg RPMI 1640-nel hígítjuk, majd 15 ml Ficoll-Paque-ra rétegezzük 50 ml-es Falcon-csövekben. Kilendülőfejes rotorban 30 percig 400xg-vel végzett centrifugálás után a Ficoll-Paque és az RPMI 1640 plazma közötti réteget (amely mononukleáris sejteket és vérlemezkéket tartalmaz) eltávolítjuk, és a vérlemezkéket háromszor lOOxg-vel (10-10 perc) végzett mosással távolítjuk el. A mononukleáris sejteket Percoll-gradiensen frakcionáljuk: 10 χ MEM-et és RPMI 1640-et adunk Percoll-törzsoldathoz (sűrűsége: 1,13 g/ml) olyan mennyiségben, hogy 1,066 g/ml sűrűséggel tegyük izotóniássá. Egy Percoll-gradienst hozunk létre 15 perces, 3000xg-vei végzett centrifúgálással egy Hereaus gyártmányú centrifugában (medifúgában) 35°-os szögrotorban. Ennek a gradiensnek a tetejére rétegezzük a mononukleáris sejte7

HU 219 883 Β két, majd 20 percig 2700 χ g-vel centrifugáljuk egy kilendülőfejes rotorban. A felső csíkban 90%-nál nagyobb tisztaságban találhatók a monocíták, amint azt az aspecifikus észterázfestéssel meg lehet határozni. A monocitákat 1x106 sejt/ml sűrűségben tenyésztjük 24 nagy lyukat tartalmazó lemezen penicillint/steptomicint tartalmazó RPMI 1640 táptalajban. A táptalaj 6 pg/ml-nél kisebb mennyiségben tartalmaz endotoxint.

MRC-5 humán tüdő-embriófibroblasztokat tenyésztünk 96 lyukas mikrotiterlemezen MEM-ben, amely 2% FCS-t tartalmaz, 1 χ 104 sejt/ml kiindulási sűrűségben 4 napig, mielőtt megvizsgáljuk a mitogénaktivitást a monocita tenyészfolyadékban. A mitogénaktivitást 100 pl monocita tenyészlében úgy határozzuk meg, hogy az MRC-5 sejteket pulzusszerűen jelezzük ³Htimidinnel (1 pCi/ml) 24-42 órával a monocita táptalaj hozzáadása után.

Ha a monocitákat 5 ng HBP-vel inkubáljuk, akkor morfológiai változások figyelhetők meg az inkubálás első vagy második napján. A monocíták megnyúlnak (4. ábra), hasonlóan ahhoz, mint amikor 1 mg/ml BSA-t (szarvasmarha-szérumalbumin) tartalmazó, 100 ng/ml koncentrációjú endotoxinnal inkubáljuk a monocitákat (5. ábra). A kontrollsejtek nem rendelkeznek aktivált morfológiával, hiszen a legtöbb sejt még egyöntetűen kerek formájú (6. ábra). A monocíták morfológiai változásai akkor figyelhetők meg legtisztábban, ha HBP-t csöppentünk és szárítunk a lyuk aljára, mielőtt a monocitákat hozzáadjuk. Ez azt jelezheti, hogy az immobilizált HBP sokkal jobban aktiválja a monocitákat a nem immobilizált HBP-vel összehasonlítva.

Ha a monocitákból származó tápfolyadéknak az MRC-5 humán fibroblasztokra gyakorolt mitogénaktivitását vizsgáljuk, akkor a fentiek szerint két napig HBP-vel inkubált monocitáknál azt találjuk, hogy körülbelül kétszer annyi mitogénaktivitást szekretálnak, mint a kontrollmonociták. 100 ng/ml LPS-sel és 21 ng/ml BSA-val inkubált monocíták körülbelül ötször akkora mitogénaktivitást mutatnak mint a kontrollmonociták.

7. példa

Topikális HBP készítmény

A HBP topikális alkalmazására a következő összetételű készítményt állítjuk elő:

Adalékanyagok tömeg%

Desztillált víz 92,98

Hidroxi-etil-cellulóz 4,0

Nátrium-klorid 0,41

Dinátrium-hidrogén-foszfát 2 hidrát 0,83 Kálium-dihidrogén-foszfát 0,28

Hidrolizált zselatin 0,5

Benzil-alkohol 1,0 a fenti összetételű elegy 10 g-jához adunk 250 ng HBP-t.

8. példa

A HBP parenterális adagolására alkalmas injektálható készítmények tartalmaznak stabilizálószereket, sókat, puffereket, konzerválószereket és ezek keverékét. Egy egyszerű összetételű készítmény, amely elegendő mértékben stabilizálja a HBP-t ahhoz, hogy megtartsa biológiai aktivitását, injekciózható szubkután, intramuszkulárisan vagy intravénásán.

Injekciózható készítmény

A HBP parenterális beadására alkalmas készítmény összetétele a következő:

Adalékanyagok tömeg%

Glicin 0,15

Dinátrium-hidrogén-foszfát 0,026

Nátrium-dihidrogén-foszfát 0,026

Mannitol 0,74

Desztillált víz 100-ig

A készítmény tartalmazhat még 0,9 térfogat% benzilalkoholt is konzerválószerként. A fenti készítmény 1 ml-éhez 25 ng HBP-t adunk.

9. példa

A sertés-HBP hatása patkányok sebeinek gyógyulására, a seb lokális kezelése után.

Egy sebgyógyulási kísérletben huszonöt patkány négy csoportján hozunk létre sebfelületet oly módon, hogy a nyakszirtjükön eltávolítjuk a bőrt egészen az izomkötegekig egy 15 mm átmérőjű felületen. A csoportokat lokálisan kezeljük heparinkötő fehérjével (HBP) 12,5 ng, 2,5 ng, 0,5 ng vagy palcebodózisban, naponta kétszer, nyolc napon keresztül. Placebóként és oldószerként 0,1% patkányalbumin 0,9%-os sóoldatban készült oldatát használjuk, és mindegyik dózist 100 μΐ térfogatban adjuk be. A két legmagasabb dózisszinten a HBP szignifikánsan meggyorsítja a sebgyógyulást, az epitelializáció alapján megítélve. A legnagyobb dózisnál a sebek gazdagon vaszkularizáltak voltak.

100 nőstény Wistar-patkányt [CRL:(W1)BR1 törzs] használunk, melyeknek testtömege körülbelül 240 g volt, és 80 naposak. A patkányok a Charles River, BRD cégtől vásárolhatók, és felhasználás előtt hat napon át aklimatizáljuk őket 21 ±1 °C-on, 60± 10% relatív páratartalom mellett, óránkénti tízszeres légcserével, a megvilágítás naponta reggel fél héttől este fél hétig tart. A patkányokat külön tartjuk szögletes Orth műanyag ketrecekben, fenyőfaforgács almon. Tetszés szerint tápláljuk őket Altromin táppal, és szabadon hozzáférnek az ivóvízhez. Operáció

A patkányokat pentobarbitállal (50 mg/testtömegkilogramm) intraperitoneálisan érzéstelenítjük, megborotváljuk a nyakszirtjükön, majd az operáció területét (50 mm átmérőben) lemossuk, fertőtlenítjük, majd ragadós anyaggal áttöröljük, hogy a kis részecskéket és a szőröket eltávolítsuk. Tapadós anyagban levő belső műanyag gyűrűből és nejlonhálóból álló sebkamrát helyezünk a bőrre. A sebkamrák belső átmérője 16 mm, teljes átmérőjük 45 mm. A nejlonhálót még fixáljuk a bőrhöz 12 selyemöltéssel, majd a belső gyűrűben levő bőrt egészen az izomkötegek mélységéig eltávolítjuk. A sebeket poliuretánfedővel borítjuk, amelyeket cinktapasszal tapasztunk a kamrákhoz.

Az operáció után a patkányoknak Temgesic nevű készítményt (Reckitt & Colman gyártmány) adunk, 0,1 ml-es dózisban, naponta kétszer, három napon át.

A pHBP-t naponta kétszer adjuk be 100 μΐ térfogatú, 0,1% patkányalbumint (Sigma A 4538) tartalmazó

HU 219 883 Β

0,9%-os NaCl-oldatban. Az oldószert használjuk placeboként.

Operáció után a patkányokat négy huszonötös csoportba osztjuk szét véletlenszerűen, amelyek a következő dózisokat kapják (az operáció napján, azaz az első 5 napon egyszer, a 2-8. napon kétszer):

I. csoport: 12,5 ng pHBP

II. csoport: 0,5 ng pHBP

III. csoport: 2,5 ng pHBP

IV. csoport: palcebo 10

A dózisokat lokálisan alkalmazzuk, éppen a sebkamrák fedője alatt. A kanülöket a poliuretánfedőkön keresztülszúrjuk.

A patkányok testtömegét az 1., 3., 5., 7. és 9. napon megmérjük. A 9. napon pentobarbitál-érzéstelenítés 15 mellett eltávolítjuk a sebkamrákat. A sebeket makroszkopikusan értékeljük és lefényképezzük. Az operációs helyet, valamint a körülötte levő területet kivágjuk, és foszfáttal puffereit semleges 4%-os formaldehidben fixáljuk a későbbi hisztológiai vizsgálatok céljából. Vé- 20 gül az állatokat elpusztítjuk, a hasi aortán keresztül elvéreztetve őket. A vérből mintát veszünk a szérum IGF-I-, PIIINP- és hialuronsavtartalmának meghatározása céljából.

Az I. táblázatban látható a négy patkánycsoport cső- 25 portos átlagtesttömege. Mindegyik patkány veszített a testtömegéből az operáció után, a legalacsonyabb testtömeget az 5. napon jegyeztük fel. A csoportok között nincs megfigyelhető különbség a testtömegben.

A sebek makroszkopikus vizsgálatának eredménye- 30 képpen a 9. napon a sebek területét és az új epitéliummal borított területeket a következőképpen határozzuk meg: A két átmérőt lemérjük koponya-farok, valamint bal-jobb irányban, és az átlagátmérőt (D_totai) használjuk a teljes sebterület kiszámítására: 35 x 3J4 = teljes terület

D„

Az újonnan képződött epitéliumot a szélektől mérjük azon a két helyen, ahol a legszélesebb és a legkeskenyebb. A két eredményt összeadjuk és kivonjuk a D_total-ból, így kapjuk a D_open-t a nyílt sebfelületre.

A nyílt sebfelületet a következőképpen számítjuk ki: ,2

D, x334 majd kivonjuk a teljes területből, így kapjuk az új epitéliummal borított összterületet. Ezt a területet azután százalékosan a teljes területre vonatkoztatjuk. Három, 12,5 ngx2 HBP dózist kapó patkánynál a nyitott sebterületen az epitelializált félszigetek szokatlan képződése figyelhető meg.

A mérések és a számított területek eredményei a mellékelt adatlapokon találhatók. Az eredmények áttekintése látható a II. táblázatban.

Számos olyan patkányban, amely a legmagasabb HBP dózist (12,5 ng) kapta, egy vörös haemorrágiás zóna figyelhető meg közvetlenül az epitélium szélénél és az egész területen, valamint a sebek gazdagon vaszkularizáltnak tűnnek. Az epitelializációnak egy lényegesen magasabb szintje figyelhető meg ebben a dóziscsoportban és a közbenső dóziscsoportban (2,5 ng). A különböző csoportoknál a teljes sebfelület nem volt lényegesen eltérő attól, amit a palcebocsoportban lehetett megfigyelni.

Mivel a sebeket borító fibrint eltávolítjuk a sebkamra borítójával együtt, ezért a borítót és a fibrint együtt fixáljuk a szövetekkel együtt a hisztológiai vizsgálatokhoz. KÖVETKEZTETÉS

A sebek makroszkopikus vizsgálata alapján megállapítható, hogy a HBP, naponta kétszer 12,5, illetve 2,5 ngos dózisban adagolva lényegesen meggyorsítja a sebgyógyulást, ami az epitelializáció fokából ítélhető meg. A magas dóziscsoportban a sebek vaszkularizációjának magas foka a HBP angiogén hatásának következménye. SEBGYÓGYULÁS PATKÁNYOKBAN

I. táblázat

Csoportos átlagtesttömeg sebkamrás nőstény patkányoknál, amelyek pHBP-t vagy placebót kaptak. A patkányokat az 1. napon operáltuk.

Preparátum és dózis A patkányok Testtömeg, csoport, átlag±S. Ε. M.

száma -

	1. nap	3. nap	5. nap	7. nap	9. nap
pHBP, 12,5 ng	23	249	240	233	238	242
naponta kettő		±2	±3	±3	±3	±3
pHBP, 0,5 ng	24	245	238	228	234	239
naponta kettő		±2	±2	±2	±2	±3
pHBP, 2,5 ng	24	245	243	232	237	240
naponta kettő		±2	±3	±3	±3	±3
Placebo
(0,9%-os sóoldat	23	245	240	228	233	241
0,1% patkányalbuminnal)		±2	±2	±2	±2	±2

HU 219 883 Β

SEBGYÓGYULÁS PATKÁNYOKBAN

II. táblázat pHBP-vel kapott makroszkopikus adatok

Kísérlet	Placebo	Naponta kétszer beadott pHBP dózis	Összterület (mm2) átlag ±S. E.M.	Epitelializált sebterület
mm2 átlag ±S. E. M.	összterület %-a átlag ±S. E. M.
VII.	0,9%-OS	12,5 ng	118,3	52,2*	46,3**
	sóoldat		6,3	4,1	3,6
	0,1%	2,5 ng	144,3	53,3*	39,6
	patkány-	7,8	4,2	3,0

0,5 ng	130,2 7,4	44,5 3,8	35,8 3,1
-(placebo)	125,1	38,5	31,6
	6,2	4,2	3,4

	Sebterület mm2	Nyílt seb területe mm2	Epitelializált seb területe az összterület
mm2	%-a
1.	132,73	92,10	40,63	30,61
2.	165,13	103,87	61,26	37,10
3.	143,14	61,88	81,26	56,77
4.	153,94	50,27	103,67	67,35
5.	86,59	33,18	53,41	61,68
6.	165,13	122,72	42,41	25,68
7.	elpusztult
8.	153,94	86,59	67,35	43,75
9.	95,03	50,27	44,76	47,10
10.	95,03	44,18	50,85	53,51
11.	113,10	70,88	42,22	37,33
12.	78,54	50,27	28,27	35,99
13.	143,14	122,72	20,42	14,27
14.	78,54	28,27	50,27	64,01
15.	132,73	103,87	28,86	21,74
16.	122,72	95,03	27,69	22,56
17.	122,72	63,62	59,10	48,16
18.	95,03	28,27	66,76	70,25
19.	103,87	40,18	63,69	61,32
20.	56,75	12,57	44,18	77,85
21.	143,14	103,87	39,27	27,44
22.	95,03	50,27	44,76	47,10
23.	elpusztult
24.	113,10	50,27	62,83	55,55
25.	132,73	56,75	75,98	57,24
X	118,34		52,17*	46,24**
S. E. M.	6,26		4,05	3,63
26.	201,06	165,13	35,93	17,87

HU 219 883 Β

II. táblázat (folytatás)

	Sebterület mm2	Nyílt seb területe mm2	Epitelializált seb területe az összterület
mm2	%-a
27.	132,73	86,59	46,14	34,76
28.	113,10	86,59	26,51	23,44
29.	188,69	113,10	75,59	40,06
30.	132,73	95,03	37,70	28,40
31.	103,87	70,88	32,99	31,76
32.	143,14	70,88	72,26	50,48
33.	103,87	44,18	59,69	57,47
34.	122,72	50,27	72,45	59,04
35.	50,27	28,27	22,00	43,76
36.	132,73	65,75	75,98	57,24
37.	103,87	78,54	25,33	24,39
38.	95,03	56,75	38,28	40,28
39.	95,03	63,62	31,41	33,05
40.	86,59	28,27	58,32	67,35
41.	153,94	113,10	40,84	26,53
42.	113,10	70,88	42,22	37,33
43.	176,71	153,94	22,77	12,89
44.	103,87	86,59	17,28	16,64
45.	143,14	78,54	64,60	45,13
46.	143,14	95,03	48,11	33,61
47.	143,14	103,87	39,27	27,44
48.	elpusztult
49.	153,94	95,03	58,91	38,27
50.	188,69	165,13	23,56	12,49
X	130,21		44,51	35,82
S. Ε. M.	7,37		3,79	3,06
51.	132,73	95,03	37,70	28,40
52.	63,62	44,18	19,44	30,56
53.	201,06	122,72	78,34	38,96
54.	132,73	56,75	75,98	57,24
55.	103,87	44,18	59,69	57,47
56.	153,94	70,88	63,06	53,96
57.	165,13	70,88	94,75	57,08
58.	153,94	78,54	75,40	48,98
59.	132,73	78,54	54,19	40,83
60.	86,59	38,48	48,11	55,56
61.	113,10	50,27	62,83	55,55
62.	226,98	188,69	38,29	16,87
63.	122,72	78,54	44,18	36,00
64.	132,73	113,10	19,63	14,79

HU 219 883 Β

II. táblázat (folytatás)

	Sebterület mm2	Nyílt seb területe mm2	Epitelializált seb területe az összterület
mm2	%-a
65.	122,72	70,88	51,84	42,24
66.	176,71	143,14	33,57	19,00
67.	153,94	78,54	75,40	48,98
68.	153,94	95,03	58,91	38,27
69.	201,06	132,73	68,33	33,98
70.	113,10	63,62	49,48	43,75
71.	176,71	153,94	22,77	12,89
72.	176,71	132,73	43,98	24,98
73.	113,10	78,54	34,56	30,56
74.	elpusztult
75.	153,94	103,87	50,07	32,53
X	144,33		53,33*	39,56
S. E. M.	7,75		4,20	3,03
76.	elpusztult
77.	103,87	70,88	32,99	31,76
78.	95,03	56,75	38,28	40,28
79.	95,03	38,48	56,55	59,51
80.	70,88	50,27	70,61	29,08
81.	132,73	56,75	75,98	57,24
82.	86,59	63,62	22,97	26,53
83.	113,10	95,03	18,07	15,98
84.	176,71	153,94	22,77	12,89
85.	113,10	78,54	34,56	30,56
86.	elpusztult
87.	113,10	63,62	49,48	43,75
88.	122,72	44,18	78,54	64,00
89.	132,72	63,52	69,11	52,07
90.	103,87	70,88	32,99	31,76
91.	153,94	132,73	21,21	13,78
92.	153,94	113,10	40,84	26,53
93.	153,94	132,73	21,21	13,78
94.	113,10	95,03	18,07	15,98
95.	176,71	153,94	22,77	12,89
96.	113,10	95,03	18,07	15,98
97.	153,94	78,54	75,40	48,98
98.	132,73	103,87	28,86	21,74
99.	176,71	132,73	43,98	24,89
100.	113,10	70,88	42,22	37,33
X	126,12		38,50	31,62
S. E. M.	6,20		4,19	3,37

HU 219 883 Β

Sebkísérlet - makroszkopikus kiértékelés

Pat. No.	Sebátmérő (mn)	X	Epitéliumszél (mm) 1	2	Nyíltseb átmérő (mm)
1	2
1.	14	12	13	0,5	0,5	12 (-7x3 mm)
2.	15	14	14,5	2	1	11,5
3.	15	12	13,5	3	1	9,5 (-3x3 mm)
4.	14	14	14	5	1	8
5.	11	10	10,5	3	1	6,5
6.	15	14	14,5	2	0	12,5
7.	elpusztult
8.	14	14	14	3	0,5	10,5
9.	11	11	11	2	1	8
10.	13	9	11	3	0,5	7,5
11.	14	10	12	2	0,5	9,5
12.	10	10	10	1,5	0,5	8
13.	13	14	13,5	0,5	0,5	12,5
14.	10	10	10	3	1	6
15.	13	13	13	1	0,5	11,5
16.	12	13	12,5	1	0,5	11
17.	13	12	12,5	3	0,5	9
18.	12	10	11	4	1	6
19.	12	11	11,5	2	2	7,5 (-2x2 mm)
20.	8	9	8,5	4	0,5	4
21.	13	14	13,5	1	1	11,5
22.	11	11	11	2	1	8
23.	elpusztult
24.	12	12	12	4	0	8
25.	13	13	13	3	1,5	8,5
26.	16	16	16	1	0,5	14,5
27.	12	14	13	1,5	1	10,5
28.	12	12	12	1	0,5	10,5
29.	16	15	15,5	3	0,5	12
30.	13	13	13	1	1	11
31.	12	12	11,5	1,5	0,5	9,5
32.	14	13	13,5	2	2	9,5
33.	11	12	11,5	2	2	7,5
34.	14	11	12,5	4	0,5	8
35.	8	8	8	1,5	0,5	6
36.	13	13	13	2,5	3	8,5
37.	13	10	11,5	1	0,5	10
38.	11	11	11	2	0,5	8,5
39.	10	12	11	1,5	0,5	9
40.	12	9	10,5	2	2,5	6
41.	14	14	14	1,5	0,5	12
42.	12	12	12	2,5	0,5	9,5
43.	15	15	15	0,5	0,5	14
44.	11	12	11,5	1	0	10,5
45.	15	12	13,5	2,5	1	10

HU 219 883 Β

Sebkisérlet - makroszkopikus kiértékelés (folytatás)

Pat. No.	Sebátmérő (mm) 1 2	X	Epitéliumszél (mm) 1	2	Nyíltseb átmérő (mm)
46.	14	13	13,5	2	0,5	11
47.	14	13	13,5	2	0	11,5
48.	elpusztult
49	15	13	14	3	0	11
50.	16	15	15,5	0,5	0,5	14,5
51.	14	12	13	1	1	11
52.	9	9	9	1	0,5	7,5
53.	16	16	16	3	1	8,5
54.	14	12	13	3,5	1	8,5
55.	12	11	11,5	2,5	1,5	7,5
56.	14	14	14	3,5	1	9,5
57.	15	14	14,5	4	1	9,5
58.	15	13	14	3,5	0,5	10
59.	13	13	13	3	0	10
60.	11	10	10,5	3	0,5	7
61.	12	12	12	4	0	8
62.	17	17	17	1	0,5	15,5
63.	13	12	12,5	2	0,5	10
64.	12	14	13	1	0	12
65.	14	11	12,5	3	0	9,5
66.	15	15	15	1	0,5	13,5
67.	14	14	14	2	2	10
68.	13	15	14	2	1	11
69.	16	16	15	2	1	13
70.	12	12	12	2	1	9
71.	15	15	15	0,5	0,5	14
72.	16	14	15	1,5	0,5	13
73.	12	12	12	-	-	10
74.	elpusztult
75.	15	13	14	2	0,5	11,5
76.	elpusztult				1
77.	11	12	11,5	2	0	9,5
78.	11	11	11	2	0,5	8,5
79.	10	12	11	2	2	7
80.	10	9	9,5	1,5	0	8
81.	13	13	13	3	1,5	8,5
82.	12	9	10,5	1	0,5	9
83.	13	11	12	1	0	11
84.	15	15	15	0,5	0,5	14
85.	12	12	12	2	0	10
86.	elpusztult
87.	13	11	12	2	1	9
88.	12	13	12,5	3	2	7,5
89.	13	13	13	3	1	9
90.	12	11	11,5	2	0	9,5

HU 219 883 Β

Sebkísérlet - makroszkopikus kiértékelés (folytatás)

Pat. No.	Sebátmérő (mm)	X	Epitéliumszél (mm) 1	2	Nyíltseb átmérő (mm)
1	2
91.	14	14	14	1	0	13
92.	14	14	14	2	0	12
93.	14	14	14	0,5	0,5	13
94.	14	10	12	1	0	11
95.	14	16	15	0,5	0,5	14
96.	13	13	13	1	1	11
97.	14	14	14	3	1	10
98.	13	13	13	1	0,5	11,5
99.	14	16	15	1,5	0,5	13
100.	11	13	12	2	0,5	9,5

Hisztológiai kiértékelés

Egy 5 μιη vastag szeletet vágunk ki a paraffinba ágyazott sejt közepén (koponya-farok irány).

A szeletet hematoxilin-eosinnal festjük, majd fénymikroszkóp alatt kiértékeljük.

A sebek mikroszkópos vizsgálata eredményekép- 25 pen a 9. napon az új epitéliumot a következőképpen számítjuk ki:

Megmérjük a teljes seb átmérőjét, valamint a nyílt sebét is, majd a kettőt kivonjuk egymásból:

teljes seb-nyílt seb ---=új epitélium

Egy értékelőskálát használunk a patkányban való sebgyógyulás kvantitatív és kvalitatív értékelésének kombinálására:

új epitélium' , (mm) ,

+

'a granulációs szövet' értékelése (0-4)

fóriás sejtek' \ (0-4) J

í a granulációs szövet' ( vastagsága (mm)

' az epitélium ' (értékelése (0-4)

A sebek területét, valamint az új epitéliummal borított területeket a 9. napon a következőképpen számítjuk ki:

í teljes seb átmérője V ... összterület = I —---— I χ 3 J 4

Az új epitélium területe:

összterület ,ί*¹¹ _x 3,4 emellett az új epitélium területét az összterület százalékában is kifejezzük.

A mérések eredményét, valamint a számított értéke- 45 két és területeket a táblázatokban mutatjuk be.

A sebek mikroszkópos vizsgálata, valamint az adatoknak az értékskála szerinti kiértékelése alapján azt a következtetést lehet levonni, hogy a p-HBP 12,5 és 0,5 ng dózisokban hatással van a sebek gyógyulására. 50

A hatás a granulációs szöveteken látható, amelyek magasak az 1-es és 2-es csoportban (12,5 ng, valamint 0,5 ng pHBP, II. táblázat). Az I. csoportban (12,5 ng pHBP dózis) a granulációs szövetek sokkal érettebbek a palcebocsoporttal összehasonlítva (II. táblázat). A te- 55 rületszámítás alapján az epitelializáció nem mutat lényeges különbséget a csoportok között.

VII. Sebgyógyulási kísérlet

I. táblázat

A pHBP-vel kapott mikroszkópos adatok

Csoport	Minősítési skála átlag±S. E. M.
1
12,5 ng	2,53***
p-HBP	0,06
2
0,5 ng	2,35*
p-HBP	0,07
3
2,5 ng	2,26
p-HBP	0,07
4
Placebo	2,10 0,09

*** p<0,001 szintű szignifikáns eltérés a placebótól, ** p<0,01, * p<0,05.

HU 219 883 Β

II. táblázat

VII. Sebgyógyulási kísérlet

Csoport	Teljes seb mm	Nyílt seb mm	Granulációs szövet 0-4	Óriási sejtek 0-4	Epitclium széle mm	Epitélium értékelése 0-4	Granulációs szöveg magassága (mm)
1	X	9,26*	6,52	2,96*	0,48*	2,78	4,00	2,26**
12,5 ng	Sd	1,91	2,19	0,21	1,08	1,13	0,00	0,54
HBP	SEM	0,40	0,46	0,04	0,23	0,23	0,00	0,11
2	X	9,33*	6,88*	2,58	0,58*	2,46	4,00	2,17**
0,5 ng	Sd	1,86	2,33	0,50	1,06	1,22	0,00	0,56
p-HBP	SEM	0,38	0,48	0,10	0,22	0,25	0,00	0,12
3	X	8,88	6,54	2,63	0,63	2,33	4,00	1,88
2,5 ng	Sd	2,11	2,06	0,49	1,28	1,13	0,00	0,61
p-HBP	SEM	0,43	0,42	0,10	0,26	0,23	0,00	0,13
4	X	8,22	5,39	2,70	1,39	2,83	4,00	1,70
Placebo	Sd	1,35	1,85	0,47	1,50	1,34	0,00	0,56
	SEM	0,27	0,39	0,10	0,31	0,28	0,00	0,12

*** p<0,001 a placebótól való szignifikáns eltérés szintje, ** p<0,01, * p<0,05.

10. példa

Sertés-HBP rekombináns úton történő előállítása Sertés-HBP expressziója eukarióta sejtekben

Kimetszett sertésbordából nyert csontvelősejtekből cDNS-könyvtárat készítünk a következő módon: teljes celluláris RNS-t izolálunk ismert módon [Chirgwin J. M. et al., Isolation of biologically active ribonucleic acid írom sources enriched in ribonuclease. Biochemistry, 18, 5294-5299 (1979)], és az mRNS-t Aviv és munkatársai módszerével tisztítjuk [Purification of biologically active globin messenger RNA by chromatography on oligothymidylic acid-celulose. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 1408-1412 (1072)]. A cDNS-könyvtárat E. coliban konstruáljuk [Okayama H. et al., High-efficiency cloning of full-length cDNA. Mól. Cell. Bioi. 2, 161-170 (1982); Okayama H. et al., A cDNA cloning vector that permits expression of cDNA inserts in mammalian cells. Mól. Cell. Bioi. 3, 280-289 (1983)], és ³²P-foszfonlezett HBP-re specifikus szintetikus oligonukleotidok elegyével vizsgáljuk át ismert módon [például a Sambrook és munkatársai Molecular Cloning. A Laboratoiy Manual. New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) irodalmi helyen ismertetett módszerrel]. Egy oligonukleotid-elegy specifikusnak bizonyul a HBP mRNS-re nézve a 10-15. aminosavakat (Gln-Glu-Phe-Pro-Phe-Leu) kódoló területen. Az elegy szekvenciája:

5’-CA(AG) GA(AG) TT(TC) CC(ACGT) TT(CT) (CT)T-3’ ahol (XY) azt a helyet jelöli, ahol ezek a zárójelben álló nukleotidok bármelyike beépíthető. A HBP karboxiterminális részéhez egy további oligonukleotid-elegy rendelhető a 156-161. aminosavakat (Asp-Met-CysIle-Gly-Val) kódoló területben. Ennek az elegynek a szekvenciája:

5’-GA(CT) ATG TG(CT) AT(ACT) GG(ACGT) GT-3’

Az oligonukleotid-elegyeket nagy specifikus aktivitással ³²P-ATP-vel és polinukleotidkinázzal jelöljük [Boel et al., Molecular cloning of humán gastric cDNA: evidence fór evolution of gastrín by gene duplication. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 2866-2869 (1983)].

A cDNS-könyvtárból pozitív hibridizációjú kiónokat izolálunk, és a cDNS-inszertet szekvenáljuk [Tábor et al., DNS sequence analysis with modified bacteriophage T7 DNA polymerase. Proc. Natl. Acd. Sci. USA 84, 4767-4771 (1987)]. A HBP prekurzor expresszálására a teljes hosszúságú HBP prekurzort kódoló cDNS-t alkalmas DNS-linkerrel együtt eukarióta expressziós vektorba iktatjuk. Abból a célból, hogy csak olyan cDNS-területek fejeződjenek ki, amelyek a HBP-nek csak az érett szekrétumát kódolják, a cDNS mutálható [Kunkel et al., Rapid and effecient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Methods in Enzymology 154, 367-382 (1987)] úgy, hogy restrikciós endonukleázhelyeket vezetünk be, amelyek megkönnyítik a cDNS ligálását például az alkalmas génekből származó szignálpeptidekhez. A módszerek közé tartoznak például a jól ismert DNS-klónozó technikák (lásd például Sambrook et al., id. h.).

Expresszió élesztőben

A sütőélesztőben (Saccharomyces cerevisiae) történő expressziót úgy végezzük, hogy a HBP cDNS-t expressziós vektorba, például 2 μ élesztővektorba inszertáljuk [Thim et al., Secretion and processing of insulin precursors in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 6766-6770 (1986)]. Ezt Hinnen és munkatársai transzformációs módszerével végezhetjük [Transformation of yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75,

HU 219 883 Β

1929 (1978)]. Alkalmas élesztő-gazdasejtvonal például a DBY746 jelű törzs (ATCC 44773). Az élesztősejtek szekréciójának biztosítására az α-kapcsoló-faktor szignálpeptidjét és vezető szekvenciáját alkalmazzák széles körben [Kutjan J. et al., Cell 30, 933-943 (1982)].

Expresszió fonalas gombákban

Az utóbbi években számos, az Aspergillus transzformálásához alkalmazható, különféle szelekciós markert ismertettek, és kidolgozták különböző fonalas gombák integratív transzformálásának módszerét. Az Aspergillusban a DNS-felvételt protoplasztok kialakításával és polietilénglikol alkalmazásával lehet indukálni [Christensen et al., High level expression of recombinant genes in Aspergillus orysae. BIO/TECHNOLOGY 6, 1419-1422 (1988)]. Sokoldalú genetikai szelekciós markereket és alkalmas rekombináns Aspergillus gazdatörzseket ismertet például a 3 162 210 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Process fór production of protein products in Aspergillus, Boel E. et al., 1988). Az Aspergillus orysea expresszióját úgy érjük el, hogy a HBP cDNS-t az említett szabadalmi leírásban, illetve Christensen et al. (id. h.) vagy HugeJensen et al. által ismertetett expressziós vektorok valamelyikébe inszertáljuk [Huge-Jensen B. et al., Rhizomucor miehei triglyceride lipase is processed and secreted Írom transformed Aspergillus orysae. Lipids 24, 781-785 (1989)]. Az Aspergillus szekréciójának biztosítására például A. nigerből a glikoamilázgén [Boel et al., Glucoamylases Gl and G2 írom Aspergillus niger are synthesized from two different bút closely related mRNAs. EMBO J. 3, 1097-1102 (1984); Boel E. et al., Two different types of intervening sequences in the glucoamylase gene from Aspergillus niger. EMBO J. 3, 1581-1585 (1984)], Rhisomucor mieheiből az aszpartinproteináz [Boel E. et al., Primary structure of a precursor to the aspartic proteinase from Rhisomucor miehei shows that the enzyme is synthesized as a zymogen. Proteins 1, 363-369 (1986)] és Rhizomucor mieheiből a trigliceridlipáz [Boel E. et al., Rhizomucor miehei triglyceride lipase is synthesized as a precursor. Lipids 23, 701-706 (1988); Huge-Jensen B. et al., Rhizomucor miehei triglyceride lipase as processed and secreted from transformed Aspergillus orysae. Lipids 24, 781-785 (1989)] szignálpeptidjét alkalmazzuk.

Kifejezés emlőssejtekben

Az emlőssejtekben történő kifejezést úgy végezzük, hogy a HBP cDNS-t adenovírus nagy késői promotor, például pDX vagy származékai szabályozása alatt inszertáljuk a vektorokba [Boel E. et al., Expression of humán pancreatic polypeptide precursors from a dicistronic mRNA in mammalian cells. FEBS. Lett. 219, 181-188 (1987); Wulff B. S. et al., Partial processing of the neuropeptide Y precursor in transfected CHO cells. FEBS. Lett. 261, 101-105 (1990); Busby S. et al., Expression of active humán factor IX in transfected cells. Natúré 316, 271-273 (1985)]. Alkalmas emlősgazdasejtvonalak például a BHK (ATCC CRL 1632 és ATCC CCL 10), CHO (ATCC CCL 61) és a COS sejtek (ATCC CRL 1650). A cDNS alkalmas vektorba történő szubklónozásával kapott rekombináns plazmidokat ismert módszerekkel alkalmas gazdaszervezetbejuttatjuk. A transzformánsok emlőssejtekben való szelekciójához alkalmas antibiotikumokkal vagy más hatóanyagokkal kombinálva különböző genetikai markereket, például DHFR-t és neo-t használunk. A DNS emlőssejtekbe történő bejuttatásához a kalciummal való kicsapás módszerét alkalmazzuk [Graham F. L. et al., A new technique fór the assay of infectivity of humán adenovírus 5 DNA. Virology 52, 456-467 (1973)}. Emlőssejtekből történő szekréció céljára a humán szöveti típusú plazminogén-aktivátor (t-PA) szignálpeptidje használható [Pennica D. et al., Cloning and expression of humán tissue-type plasminogen activator cDNA in E. coli. Natúré 301, 214-220 (1983)].

A transzformánsok jellemzése és HBP-re történő vizsgálata

A transzformánsokból szekretált, izolált HBP proteineket a WO 89/08666 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentés 2. példájában ismertetett módon elemezzük és tisztítjuk.

11. példa

Humán HBP rekombináns úton történő előállítása Humán HBP expressziója eukarióta sejtekben

Kimetszett emberi bordából nyert csontvelősejtekből cDNS-könyvtárat készítünk a következő módon: teljes celluláris RNS-t izolálunk ismert módon (Chirgwin J. M. et al., id. h.), és az mRNS-t Aviv és munkatársai (id. h.) módszerével tisztítjuk. A cDNS-könyvtárat E. coliban konstruáljuk (Okayama H. et al., id. h.), és ³²P-foszforilezett HBP-re specifikus szintetikus oligonukleotidok elegyével vizsgáljuk az ismert módon [például a Sambrook és munkatársai Molecular Cloning. A Laboratory Manual. New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) irodalmi helyen ismertetett módszerrel]. Egy oligonukleotid-elegy specifikusnak bizonyul a HBP mRNS-re nézve a 35-40. aminosavakat (Phe-Val-Met-Thr-Ala-Ala) kódoló területen. Az elegy szekvenciája:

5’-(GCNGCNGTCATNACA/GAA)-3’ ahol N azt a helyet jelöli, ahol a négy különböző nukleotid bármelyike beépíthető. A HBP karboxiterminális részéhez egy további oligonukleotid-elegy rendelhető a 199-204. aminosavakat (Gly-Pro-Asp-Phe-Phe-Thr) kódoló területben. Ennek az elegynek a szekvenciája:

’-GTA/GAAA/GAAA/GTCNGGNCC)-3 ’.

Az oligonukleotid-elegyeket nagy specifikus aktivitással ³²P-ATP-vel és polinukleotidkinázzal jelöljük (Boel et al., id. h.).

A cDNS-könyvtárból pozitív hibridizációjú kiónokat izolálunk, és a cDNS-inszertet szekvenáljuk (Tábor et al., id. h.). A HBP prekurzor expresszálására a teljes hosszúságú HBP prekurzort kódoló cDNS-t alkalmas DNS-linkerrel együtt eukarióta expressziós vektorba iktatjuk. Abból a célból, hogy csak olyan cDNS-területek fejeződjenek ki, amelyek a HBP-nek csak az érett szekrétumát kódolják, a cDNS mutálható (Kunkel et al., id. h.) úgy, hogy restrikciós endonukleázhelyeket vezetünk be, amelyek megkönnyítik a cDNS ligálását pél17

HU 219 883 Β dául az alkalmas génekből származó szignálpeptidekhez. A módszerek közé tartoznak például a jól ismert DNS-klónozó technikák (lásd például Sambrook et al., id. h.).

Expresszió élesztőben

A sütőélesztőben (Saccharomyces cerevisiae) történő expressziót úgy végezzük, hogy a HBP cDNS-t expressziós vektorba, például 2 μ élesztővektorba inszertáljuk (Thim L. et al. id. h.). Ezt Hinnen és munkatársai transzformációs módszerével végezhetjük (id. h.). Alkalmas élesztő-gazdasejtvonal például a DBY746 jelű törzs (ATCC 44773). Az élesztősejtek szekréciójának biztosítására az α-kapcsoló-faktor szignálpeptidjét és vezető szekvenciáját alkalmazzák széles körben (Kórján J. et al. id. h.).

Expresszió fonalas gombákban

Az utóbbi években számos, az Aspergillus transzformálásához alkalmazható, különféle szelekciós markert ismertettek, és kidolgozták különböző fonalas gombák integratív transzformálásának módszerét. Az Aspergil- 20 lusban a DNS-felvételt protoplasztok kialakításával és polietilénglikol alkalmazásával lehet indukálni (Christensen et al. id. h.). Sokoldalú genetikai szelekciós markereket és alkalmas rekombináns Aspergillus gazdatörzseket ismertet például a 3 162 210 számú amerikai 25 egyesült államokbeli szabadalmi leírás. Az Aspergillus orysea expresszióját úgy étjük el, hogy a HBP cDNS-t az említett szabadalmi leírásban, illetve Christensen et al. (id. h.) vagy Huge-Jensen et al. (id. h.) által ismertetett expressziós vektorok valamelyikébe inszertáljuk. 30 Az Aspergillus szekréciójának biztosítására például A. nigerből a glikoamilázgén (Boel et al. id. h.), Rhisomucor mieheiből az aszpartinproteináz (Boel et al. id. h.) és Rhizomucor mieheiből a trigliceridlipáz (Boel E. et al. id. h.; Huge-Jensen B. et al. id. h.) szignálpeptidjét 35 alkalmazzuk.

Kifejezés emlőssejtekben

Az emlőssejtekben történő kifejezést úgy végezzük, hogy a HBP cDNS-t adenovírus nagy késői promotor, például pDX vagy származékai szabályozása alatt inszer- 40 táljuk a vektorokba (Boel E. et al. id. h.; Wulff B. S. et al. id. h.; Busby S. et al. id. h.). Alkalmas emlős-gazdasejtvonalak például a BHK (ATCC CRL 1632 és ATCC CCL 10), CHO (ATCC CCL 61) és a COS sejtek 5 (ATCC CRL 1650). A cDNS alkalmas vektorba történő szubklónozásával kapott rekombináns plazmidokat ismert módszerekkel alkalmas gazdaszervezetbe juttatjuk. A transzformánsok emlőssejtekben való szelekciójához alkalmas antibiotikumokkal vagy más hatóanyagokkal 10 kombinálva különböző genetikai markereket, például DHFR-t és neo--t használunk. A DNS emlőssejtekbe történő bejuttatásához a kalciummal való kicsapás módszerét alkalmazzuk (Graham F. L. et al. id. h.). Emlőssejtekből történő szekréció céljára a humán szöveti típusú 15 plazminogén-aktivátor (t-PA) szignálpeptidje használható (Pennica D. et al. id. h.).

A transzformánsok jellemzése és HBP-re történő vizsgálata

A transzformánsokból szekretált, izolált HBP termékeket a WO 89/08666 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentés 2. példájában ismertetett módon elemezzük és tisztítjuk.

A kapott DNS- és aminosavszekvenciát a 7-1. és a 7-2. ábrán mutatjuk be.

Claims (16)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Heparinkötő proteinek, azzal jellemezve, hogy glikozilezett állapotban a látszólagos molekulatömegük - redukáló körülmények között végzett SDS-PAGE útján meghatározva - mintegy 28 kD, továbbá in vivő körülmények között angiogéntulajdonságokat és monocitákkal szemben kemotaktikus tulajdonságokat mutatnak.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti heparinkötő proteinek, azzal jellemezve, hogy a 113 helyzetű Asn aminosavon glikozilezettek.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti, sertés-heparinkötő protein, azzal jellemezve, hogy a következő aminosavszekvenciával rendelkezik:

   1 15

   I1eVa1G1yGlyArgArgAlaGlnProGlnGluPheProPheLeu

   Al aSe r11eGlnLysGlnGlyArgProPheCysAlaGlyAlaLeu

   ValHi s Pr oAr gPheVa1LeuThrAlaAlaSe rCy sPheArgGly

   LysAsnSe rGlySe rAlaSe rVa1Va1LeuGlyAlaTyrAspLeu

   ArgGlnGlnGluGlnSe rArgGlnThrPheSerlleAr gSe rI1e

   Se rGlnAsnGlyTy rAs pPr oAr gGlnAsnLeuAsnAs pVa1Leu

   HU 219 883 Β

   105

   LeuLeuGlnLeuAspArgGluAlaArgLeuThrProSerVa1A1 a

   120

   LeuVa1ProLeuProProGlnAsnAlaThrVa1GIuAlaGlyThr

   135

   AsnCy sGlnVa1AlaGlyTr pGlyThrGlnArgLeuArgAr gLeu

   150

   PheSerArgPheProArgValLeuArgVaIThrValThrSerAsn

   165

   Pr oCy sLeuPr oArgAs pMe tCy sI1eGlyVa1Phe Se rAr gAr g

   180

   Gl yAr gI1eSe rGlnGlyAspArgGlyThr Pr oLeuVaICy sAsn

   195

   Gl yLeuAlaGlnGlyVa1AlaSerPheLeuArgArgArgPheXxx

   196 210

   XxxSe r Se rGlyPhe PheThrAr gVa1AlaLeuPheAr gAsnTrp

   217

   11eAspSe rVa1LeuAsnXxx ahol Xxx a 195. és 196. helyzetben tetszőleges aminosavat, a 217. helyzetben egy vagy két tetszőleges aminosavat jelent.
4. 4. A 3. igénypont szerinti, sertés-heparinkötő protein, azzal jellemezve, hogy a 217. helyzetben Xxx jelentése AsnPro.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti, humán heparinkötő protein, azzal jellemezve, hogy N-terminálisa

   1 15

   I1eVa1G1yGlyAr gLy sAlaAr gPr oArgGlnPheProPheLeu

   Al aSe r11eGlnAsnGlnGlyAr gHi sPheCysGlyGlyAlaLeu

   I 1 eHi sAlaArgPhe

   C-terminálisa pedig η-15 η-1 n

   Va 1 Al aLeuPheArgAspTrρI1eAspGlyVa1 LeuAsnAsnPr oGly szekvenciával rendelkezik, ahol n a protein szekvenciájának teljes aminosavszámát jelenti.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti heparinkötő protein, azzal jellemezve, hogy N-terminálisa

   1 15

   11eVa1G1yGlyArgLysAlaAr gPr oArgGlnPhe Pr oPheLeu

   AlaSe rI1eGlnAsnGlnGlyAr gHi s PheCy sGlyGlyAlaLeu

   11eHi sAlaAr gPheVa ÍMe tTh rAlaAlaSe rCy s PheGlnSe r

   HU 219 883 Β

   G1nAsnPr oGlyVa1 Se rTh rVa1Va1LeuGlyAlaTyrAspLeu

   Ar gArgArgGluArgGlnSe rAr gGlnThrPheSerI le

   C-terminálisa pedig n-29 n-15

   Se rLeuGlyPr oCysGlyAr gGlyPr oAs pPhe PheThrAr gVa1 n

   AlaLeuPheArgAspTr p11eAs pGlyVa1 LeuAsnAsnPr oGly szekvenciával rendelkezik, ahol n értéke az 5. igénypont szerinti.
7. 7. A 6. igénypont szerinti heparinkötő protein, azzal jellemezve, hogy N-terminálisa a következő aminosav szekvenciával rendelkezik.

   1 15

   11eVa1G1yGlyArgLysAlaAr gPr oArgGlnPheProPheLeu

   Al aSe rI1eGlnAsnGlnGlyArgHi sPheCysGlyGlyAlaLeu

   IleHi sAlaArgPheVa ÍMe tThrAlaAlaSerCysPheGlnSer

   G1nAsnPr oGlyValSerThrValValLeuGlyAlaTyrAspLeu

   ArgArgArgGluArgGlnSe rArgGlnThr PheSe rI1e a 69-helyzetű Gin és az η-29-helyzetű Ser között a következő aminosavszekvenciákat tartalmazza:

   GlnThrPheSer11eUuuUuuMe t Se rGluAsnGlyTyrAspPro

   GlnGln

   LeuGl nLeuAspArgGluAlaXxxLeuThr Se rXxxVa1ThrI1e

   LeuProLeuPro

   G1uAlaGlyThrArgCysGlnVa1AlaGlyTrpGlySe rGlnArg

   LeuSerArgPheProArg

   PheValXxxVaIThrVaIThrProGluAspGInCysArgProAsn AsnValCysThrGlyVa1LeuThrAr g

   UuuGl yGl y11eCysAsnGlyAs pGlyUuuThr Pr oVa1Leu

   HU 219 883 Β ahol Uuu bármilyen aminosavat jelent, és Xxx jelentése egy lehetséges glikozilezési hely, előnyösen Asn, C-terminálisa pedig n-29 n-15

   Se rLeuGlyPr oCysGlyArgGlyPr oAspPhePheTh rAr gVa1 n

   Al aLeuPheAr gAspTr p11eAspGlyVa1LeuAsnAsnPr oGly szekvenciával rendelkezik, ahol n értéke az 5. igénypont szerinti.
8. 8. A 6. igénypont szerinti heparinkötő protein, azzal jellemezve, hogy a következő aminosavszekvenciával rendelkezik:

   1 15

   I1eVa1G1yGlyArgLysAlaArgProArgGlnPheProPheLeu

   Al aSe rI1eGlnAsnGlnGlyArgHi sPheCysGlyGlyAlaLeu

   IleHi sAlaArgPheVa ÍMe tThrAlaAlaSe rCy sPheGlnSer

   Gl nAsnPr oGlyValSerThrValValLeuGlyAlaTyrAspLeu

   ArgArgArgGluArgGlnSerArgGlnThrPheSerI1eUuuUuu

   Me t Se rGl uAsnGl yTy rAspPr oGl nGl n(..............)

   .....)LeuGlnLeuAspAr gGluAlaXxxLeuThr Se rXxxVa1

   ThrIleLeuProLeuPro(................)G 1 uAl aGl y

   ThrArgCysGlnValAlaGlyTrpGlySerGlnAr g(........

   . . )LeuSerArgPheProArgPheValXxxVaIThrVaIThrPro GluAspGlnCysArgProAsnAsnValCysThrGlyValLeuThr ArgUuuGlyGlyI1eCy sAsnGlyAspGlyUuuTh r Pr oVa1Leu n-29

   (............................) Se rLeuGl yPr oCy s

   GlyArgGlyPr oAspPhePheTh rAr gVa1AlaLeuPheAr gAsp n

   Trp11eAspGlyVa1LeuAsnAsnPr oGly ahol n értéke az 5. igénypont szerinti, Uuu és Xxx jelentése a 7. igénypont szerinti.
9. 9. Gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy valamely, az 1 -4. igénypontok bármelyike szerinti, sertésheparinkötő proteint tartalmaz, a gyógyszergyártásban szokásos vivő-, hígító- és/vagy egyéb segédanyagok 55 mellett.
10. 10. Gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy valamely, az 5-8. igénypontok bármelyike szerinti, humán heparinkötő proteint tartalmaz, a gyógyszergyártásban szokásos vivő-, hígító- és/vagy egyéb segédanyagok mellett.
11. 11. Eljárás valamely, az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti, sertés-heparinkötő protein előállítására, azzal jellemezve, hogy sertéstrombocitákat extrahálunk, és az extraktumot heparin-szefarózon és fordított fázisú HPLC útján kromatográfiásan tisztítjuk.
12. 12. Eljárás valamely, a 6-8. igénypontok bármelyike szerinti, humán heparinkötő protein előállítására, azzal jellemezve, hogy humán trombocitákat extrahálunk,

    HU 219 883 Β és az extraktumot heparin-szefarózon és fordított fázisú HPLC útján kromatográfiásan tisztítjuk.
13. 13. A 11. vagy 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtkivonatokat a heparin-szefarózra mintegy 0,5 mol/1 koncentrációjú, 7,2-7,6 pHjú, előnyösen 7,4 pH-jú nátrium-klorid-oldatban viszszük fel.
14. 14. Eljárás valamely, az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti heparinkötő protein rekombináns úton történő előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a tárgyi kör szerinti heparinkötő proteint kódoló DNS-t alkalmazunk.
15. 15. DNS-szekvencia, azzal jellemezve, hogy vala5 mely, az 1 -4., 9. és 11. igénypontok bármelyike szerinti heparinkötő proteint kódol.
16. 16. cDNS-szekvencia, azzal jellemezve, hogy valamely, az 5-8., 10. és 12. igénypontok bármelyike szerinti humán heparinkötő proteint kódol.