JPH03500529A - 増殖因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 増　殖　因　子 本発明は哺乳類の増殖因子、さらに詳しくはヘパリン結合増殖因子に関する。

１　および　′ ヘパリン結合増殖因子は、脳、下垂体および他の間葉、神経外胚葉および上皮由 来の組織中に見つかるポリペプチド系分裂促進因子であり、生体外および生体内 での細胞の増殖を誘導する。

これらの因子は、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−１）、酸性繊維芽細胞増 殖因子、並びに形質転換増殖因子αおよびβを包含する。これらの分子の多くが 血管形成活性を有し、そしてこれはＦｏｌｋｍａｎおよびＫｌａｇｓｂｒｕｎ（ Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３５＋４４２−４４７＋１９８７）による概論中に要約され ている。

血管形成性を有する間葉山来の増殖因子であるヘパリン結合増殖因子−β（ＨＢ ＧＦ−β）は、幾つかの種（例えばウシ、ブタ、ヒト、ラット）からの組織抽出 物または血清から均質に精製されている。ウシの脳から単離されたヘパリン結合 増殖因子（）ＩＢＧＦ−β１）の形は、ウシの繊維芽細胞増殖因子−β（ＦＧＦ −β１−１４６）と同一のアミノ酸配列を有することが示され、従ってこれら両 者は同義であるとみなされる。ｂＨＢＧＦ−β１について確立された全アミノ酸 配列は、アミノ末端残基Ｐｒｏ　’で始まる次のものである。

Ｐｒｏ’　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ’　八ｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅ ｒ　Ｇｌｙ”Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ”　Ｈｉｓ　Ｐｈｅ　Ｌ ｙｓ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ”Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ”　Ｌｙｓ　 Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ”Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｈｉｓ” 　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｖａ１４０Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ａｒ ｇ　Ｇｌｕ４ｓＬｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ５０１ｉｅ　Ｌｙｓ　 Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ”　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ＡｒｇｈｏＧｌ ｙ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ”　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ａ ｌａ”Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ”　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　 Ａｓｐ　Ｇｌｙ”八ｒｇ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｓｅｒ”　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ 　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ”Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ”　Ｇｌ ｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ”’Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｔｙｅ　Ａｓｎ　Ｔ ｈｒ”’　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ”’Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅ ｒ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ”’　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ”’Ｔｈｒ 　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ”’　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｔ ｈｒ＋３’Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓｌ″５Ａｌａ　ｌｉｅ　Ｌ ｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ”’Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｙｓ”５Ｓｅｒ ””このアミノ酸配列は、Ｅｓｃｈ、Ｆ、ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。

（ＵＳＡ）　（１９８５）蔓、　６５０７−６５１１に記載されたウシ下垂体由 来の塩基性ＦＧＦ−βの成熟形１４６残基についての完全配列と一致する。この ）ＩＢＧＦ−β形の特徴付けおよび生物学的性質は、Ｇｏｓ−ｐｏｄａｒｏｗｉ ｃｚ、Ｄら、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｅｎｄｏｃｒ、（１９８６）４６．１８７−２ ０４およびＦｉｄｄｅｓ、Ｊ、Ｃ，ら、国際特許出願公開ＷＯ３７１０１７２８ により最近概説されている。関連する生物活性を有するがＨＢＧＦ−βとは異な る一次構造を有する他の増殖因子、例えば上皮細胞増殖因子、腫瘍血管形成誘導 因子、および酸性繊維芽細胞増殖因子は、既に特徴付けられている〔例えば、Ｌ ｏｂｂ、Ｒ，Ｒ，ら、Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８４）　２３．６２９ ５−６２９９；Ｍａｃｉａｇ、Ｔ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ（１９８４）２２５．９ ３２−９３５；Ｋｌａｇｓｂｒｕｎら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ　ｔ　１．　Ａｃａｄ 　、　Ｓｃ　ｉ　、ＵＳＡ　（１９８５）８２、８０５−８０９；Ｂｏｈｌｅｎ 、　Ｐ、ら、ＥｌＩＢＯＪ、（１９８５）　４．１９５１−１９５６；Ｇｉ−ｍ ｅｎｅｚ−Ｇａｌ　ｉｅｇｏ＋　Ｇ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２３０． １３８５−１３８８；Ｅｓｃｈ。

Ｐ、　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂ　１ｏｐｈｙｓ　、Ｒｅｓ　、Ｃｏｍｍ、　（ １９８５）　１３３＋　５５４−５６２　；Ｔｈｏｍａｓ　B Ｋ、Ａ、ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ（１９８４）８１ ．３５７−３６１；米国特許第４，４４４．７６０号を参照のこと〕。それらの 他の増殖因子は、ＨＢＧＦ−βと異なるアミノ酸−次配列を示し、異なる遺伝子 から誘導され、そして異なる生物学的効果および能力を示すことが知られている 。

不純な形の成熟ＨＢ５Ｆ−βは、心筋梗塞の処置（Ｓｖｅｔ−Ｍｏｌｄａ−ｖｓ ｋｙ、Ｇ、　ら、Ｌａｎｃｅｔ　１９７７．１９１３；米国特許第４２９６１０ ０号、第４３７８３４７号〕を含む、外傷を受けた組織の創傷治癒において（［ １ａｖｉｄｓｏｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９ ８５）　１００．１２１９−１２２７；Ｔｈｏｍａｓ、に、Ａ、ら、前掲〕、ラ ット胎児の海馬ニューロンにおけるニューロン生存において（Ｗａｌｉｃｋｅ、 Ｐ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ　、Ｓｃｉ　、　（ＬＩＳＡ）　（１９８６）　８３．３０１２−３０ １６；　５ｃｈｕｂｅｒ　ｔ、　Ｄ、ら、Ｊ、Ｃ，Ｂ。

（１９８７）１０４．６３５−６４３）および血管形成において［０，Ａ＋５ｏ ｒｅら、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｐｈｙｓｉｃｏｌ、（１９８７）　４９＋４５３−４ ６４；Ｆｏｌｋｍａｎ、Ｐｅｒｓｐ、Ｂｉｏｌ。

Ｍｅｄ、　（１９８５）２９．１ｌ−３３）効果的であることが主張されている 。

本発明者らの精製および特徴付けの過程の際中に、今までに記載されていない別 の形のＨＢＧＦ−βが発見された。これらの新規形態は、完全なタンパク質と同 様にして広範な細胞のタイプの細胞増殖および成長を刺激する際に効果的である 、先端を切り取った新規類似体を意味する。

本発明者らは、１つのヘパリン結合増殖因子の新しい形を単離しそして十分に特 徴付ける。関連するが異なるポリペプチドは以前に記載されている（Ｅｓｃｈ、 Ｐ、ら（１９８５）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ　８２．６５０７）。

しかしながら、それらの新規ポリペプチド構造の生合成に関与する生物学的機構 は、初期の研究では明確でなかった。

驚くべきことに本発明者らが単離しそして十分に特徴付けたポリペプチド分裂促 進因子（マイトジェン）は、今までに記載されていない先端が切り取られた新規 の変異体を表わす。

それらは大きい形の断片であるとみなされ得るが、断片化の部位は、いずれの以 前記載された研究からも自明でない。

本発明者らが単離しそして特徴付けたポリペプチド分裂促進因子は、生物学的に 活性であり、血管形成を促進する能力を含む、生体外および生体内の様々な系に おいてＨＢＧＦ−βの活性を有する。従って、それらの変異形今ポリペプチドは 、組織特異的翻訳後プロセシングから生じる一般の中胚葉細胞／組織増殖因子で あることができるが、他の発現および合成の様式も除外することはできない、そ れらは、生体外細胞培養アッセイ系に依存してに、　１０−”〜１０−　”モル の間で最大に活性である。

これらのＨＢＧＦ−β変異体は、別の形態的および物理的に離れた起源から誘導 された外因性成分に比べて、自己分泌因子としての増加された生物学的能力の基 礎となる。であろう組織特異的プロセシング能力を表わすと思われるので、本発 明の目的は、従来技術に関連する１もしくは複数の問題を解決するかまたは少な くとも軽減することであり、そしてこれらのＨＢＧＦ−β変異体を特定のおよび 一般の生物学的用途において使用する機会を提供することである。

特に、組織特異的形のＨＢＧＦ−β変異体または化学的もしくは遺伝学的操作に より作製された誘導体を高純度で適切な量において入手可能にし、そして局所ま たは内部の輸送形式に適する徐放性治療物質としての利用に適合できる形で提供 することが望ましいであろう。

１肌ｍ 本発明の第１の観点によれば、アミノ末端配列から１〜１２のアミノ酸残基が欠 けている哺乳類のヘパリン結合増殖因子（ＨＢＧＦ−β）のペプチド類似体が提 供される。

好ましくは、該ポリペプチド類似体は、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマまたは ラットのＨＢＧＦ−β類似体である。

より好ましくは、該ポリペプチド類似体は、次の配列から選択されるアミノ末端 配列を有する： Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　 Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｐｒ。

Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ａｌｐ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　 Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　”＝、；Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　 Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　ＧｌｙＨｉｓ　Ｐｈｅ　Ｌ ｙｓ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　”＝　：Ｐ ｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｐ ｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　ＨｉｓＰｈｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ａｒ ｇ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　−−；Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ 　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　ＰｈｅＬｙｓ　 Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　＝　；Ｇａｙ　Ｇ ａｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｐ ｈｅ　Ｌｙｓ　ＡｓｐＰｒｏ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　・・ ・−；Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｈｌｓ　Ｐ ｈｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　ＬｙｓＡｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　・” ・＝　；Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　 Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔｒｙ　Ｃｙｓ本発明の第２の観点によれば、哺乳類 起源からの先端が切り取られた形のＨＢＧＰ−βの単離方法が提供され、該方法 は、先端が切り取られた形のＢＢＧＦ−βを含有する試料を硫酸アンモニウム分 画にかけ、ＨＢＧＦ−β活性を有する両分を単離しそしてプールし、そしてプー ルされた両分をカチオン交換クロマトグラフィー、トリアジン色素アフィニティ ークロマトグラフィーまたヘパリンアフィニティークロマトグラフィーおよび所 望により逆相クロマトグラフィーの連続段階にかけることを含んで成る。

もしトリアジン色素アフィニティークロマトグラフィーとヘパリンアフィニティ ークロマトグラフィーの両者を使用するのであれば、好ましくはトリアジン色素 アフィニティークロマトグラフィ一段階はカチオン交換クロマトグラフィ一段階 の直後である。

好ましくはカチオン交換クロマトグラフィ一段階は、カルボキシメチルまたはス ルホン酸基で誘導化された硬質の多孔性で単分散の高分子クロマトグラフィー担 体、例えばファルマシアＦａｓｔ　Ｆｌｏｗ　ＳまたはＡｃｃａｌｌ　Ｓを含む 。

好ましくはトリアジン色素アフィニティークロマトグラフィーは、次のものから 選択された単一のまたは継列のアフィニティークロマトグラフィー系を包合する ：ブロシオン（Ｐｒｏ−ｃｉｏｎ）のトリアジン色素　黄色ＭＸ４１？、黄色Ｍ Ｘ３Ｒ１黄色ＭＸＧＲ。

黄色ＭＸ８Ｇ、青色ＭＸＧ、青色ＭＸ４ＧＤ　、青色ＭＸ３Ｇ、青色ＭＸ７ＲＸ 　。

または青緑色ＭＸＧ　、茶色Ｈχ５ＢＲ、赤色ＭＸ５Ｂ、　ルビー色ＭＸＢ、ま たはＩＣＩ　、チバーガイギーもしくは他の製造業者から得られる等価のもしく は類似のトリアジン色素。

ヘパリンアフィニティークロマトグラフィ一段階は、好ましくは種々の多孔度お よび粒径において得られるＦｒａｃｔｏｇｅｌＨＷ６５．　Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ 　ＧＷ３０００＋　５ｕｐｅｒｏｓｅ　１２またはグリシジルプロポキシルシリ カのようなカルボニルジシイミダゾール（ＣＤＩ）活性化ヒドロキシルマトリッ クスに固定化されたヘパリンを必要とする。

逆相クロマトグラフィーは、シリカ粒子を篩分けるのに使われる分粒方法に依存 して、０．７〜６０ｊ！ｒａの範囲の粒径を有し±１％〜±３０％のサイズ分布 を有する単分散の非孔質または多孔質のシリカ粒子に化学的に結合されたブチル −、オクチル−またはオクタデシル−基を包合する。

端が切り取られた形のＨＢＧＦ−βの入手源は、好ましくは組織のホモジネート 、血漿、組織または細胞培養物、細胞または組織培養順化培地、および腫瘍細胞 から選択される。

本発明の第３の観点によれば、哺乳類ＨＢＧＦ−βのポリペプチド類似体の調製 方法が提供され、該方法は、感受性の細菌、酵母、バクロウィルス、昆虫または 哺乳類の細胞を、先端が切り取られたＨＢＧＦ−β類似体の発現を指図すること のできるＤＮＡ配列を用いて形質転換することを含んで成る。該ＤＮＡ配列は、 組換えの、合成の、染色体の断片、ｃＤＮＡまたはそれらの組合せであることが でき、そしてプラスミドのような適当なりローニングベヒクル中に組み込むこと ができる。挿入されたコード配列は、先端が切り取られた類似体（例えばデステ トラペプチド−ＨＢＧＦ−βおよび関連ポリペプチド）と完全な化合物との相違 の原因となる欠失または省略を組み込んでいてもよい。

更に、該ポリペプチド類似体は、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸 、または生体内もしくは生体外でＨＢＧＦ　−β類似体の化学的もしくは生物学 的認識に関与する結合または輸送タンパク質または物質により認識される生物学 的部位を含む、アミノ−またはカルボキシ−末端の延長を有してもよい。

あるいは、生来のまたは組換え物質の下流のプロセシングまたは修飾の一部とし て、ＨＢＧＦ−βの完全なポリペプチド鎖を開裂せしめ、本発明に係わる先端が 切り取られた変異体を生ぜしめてもよい。

本発明の更なる観点においては、Ｎ−末端から１〜１２のアミノ酸残基が欠けて いる哺乳類ＨＢＧＦ−βのペプチド類似体の調製方法が提供され、該方法は、 （ａ　）　Ｐｒｏ−ａｌａ−１ｅｕ−ｐｒｏ−ｇｌｕ−ａｓｐ−ｇｌｙ−ｇｌｙ −ｓｅｒ−ｇｌｙ−ａｌａ−ｐｈｅ−ｐｒｏ−ｐｒｏ−ｇｌｙ−ｈ　１ｓ−ｐｈ ｅ−１ｙｓ−ａｓｐ−ｐｒｏ−１ｙｓ　−ａｒｇ−１ｅｕ−ｔｙｒ−ｃｙｓ−− のＮ−末端構造を有するペプチド類似体を用意する段階；および （ｂ）前記ペプチド類（置体を１または複数のＮ−末端アミノ酸開裂段階にかけ る段階； を含んで成る。

は半合成的方法に対する適当な改良により製造することができる。これらの改良 は当業者にとって容易に明らかであろう。

特定的には、デスペプチドＨＢＧＦ−βは、アミノ酸連結の最後の゛１〜１２サ イクルが削除されたＨＢＧＦ−βに適する方法を使って化学的に合成され得る０ 合成デスペプチドおよび別の哺乳動物種に特異的な関連ペプチドは、それらのペ プチドについてのアミノ酸配列情報を使ってウシＨＢＧＦ−βに用いられるのと 同様な技術により製造することができる。

本発明の第４の観点によれば、本発明に係わるペプチド類似体に特異的な抗体が 提供される。

本発明の第５の観点によればヘパリン結合増殖因子のイムノアッセイ方法が提供 され、該方法は、適当なマーカーと結合された本発明に係わるポリペプチド類憤 体かまたはそれに特異的な抗体のどちらかを使用する段階を含んで成る。

本発明の第６の観点によれば、本発明に係わるペプチド類似体かまたはそれに特 異的な抗体のどちらかを使用する段階を含んで成る、哺乳動物における病気の診 断および治療方法が提供される。

より詳しくは、ＨＢＧＦ−β変異体および関連ペプチド類似体は、単独で、また は所望する投与の方法および部位に適する医薬上許容される希釈剤、担体、もし くは賦形側と一緒に投与することができる。

デスペプチドＨＢＧＦ−βの投与に要する時間および投与量は、本発明の増加さ れた効力に従って、完全な）ＩＢＧＦ−βよりも比較的低いレベルに設定され得 る。約１〜１０００マイクログラム／キログラム／日の投与量が使用され得る。

約１０〜１００マイクログラム／キログラム／日の投与量が好ましい。

本発明の１つの好ましい実施態様において、内部または外部創傷の治癒を増強す ることを必要とする哺乳動物においてそのような創傷治癒を増強するための組成 物が提供され、該組成物は、生理的に適合できる担体材料上に吸着されているか またはその中に封入されている上記で定義されたＨＢＧＦ−βのペプチド類似体 を含んで成り、それにより療法的有効量の該ペプチドが損傷部位に提供される。

好ましくは、該担体材料は、合成または天然の有機ポリマーおよび化学的に修飾 された無機分子から選択される。より好ましくは、該担体はセルロースまたは他 の多糖である。

好ましくは、ペプチドの量は１〜１０００ｇ／ｋｇ哺乳動物体重、より好ましく は１〜１００．ｇ／ｋｇ体重である。

本発明の第７の観点によれば、本発明に係わるポリペプチド類似体を含んで成る 細胞または組織培養培地が提供される。

好ましくは、該培地は既知組成培地である。

最大活性をもたらす欠失の数は種物異的であり、そしである程度は組織特異的で もある。ラットではデスペンタペプチド形が最も活性であり、一方ウシではデス トリーまたはデステトラペプチドが最大活性を有する。

例えばＥｓｃｈら（１９８５）により記載されたウシ繊維芽細胞増殖因子（ＦＧ Ｆ−１）の式を有するがＮ−末端領域がらＰｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕのアミノ酸残 基を欠いているウシのデストリペプチドＨＢＧＦ　−β化合物は、完全なウシＨ ＢＧＦ−βに要するものよりも１０〜５０倍低い濃度において、タンパク質合成 およびＤＮＡ合成の両方を刺激すること並びに細胞増殖を促進することにおいて 効果的である。

同様に、ウシ、ヒト、ブタおよびラット起源の組織抽出物から現在までにまだ記 載されていないかまたは特徴付けられておらず、他の種からの対応するＨＢＧＦ −βに関連するデストリペプチド−デスドデカペプチド構造を示す、先端が切り 取られたＨＢＧＦ−βの他の変異体形もまた、生体外および生体内の細胞アッセ イにおいてタンパク質およびＤＮＡの新規合成を含む効力の増加を示す。

先端の切り取りの部位は、完全なウシＨＢＧＦ−βのアミノ酸配列から予想でき ない。

本発明を次の非限定例および図面を参照しながら詳細に記載する。

辺ｌｊ」Ｉ幻ｌ直吸 第１図は、ＣＭ−セファデックスＧ５０上でクロマトグラフィーを行った組織ホ モジネートの溶出プロフィールを示す。

第２図は、異なる起源からの部分精製されたＨＢＧＦ−βデスペプチドのヘパリ ン−セファロース上での溶出プロフィールを示す。

第３図は、 （ａ）ヒツジＨＢＧＦ−βデストリペプチドに応答したウシ卵巣顆粒層細胞およ びマウス３Ｔ３繊維芽細胞：（ｂ）マウス３Ｔ３繊維芽細胞； （Ｃ）ウシ肺上皮細胞；および （ｄ）ウシＨＢＧＦ−βデステトラペプチドに応答したウシ卵巣顆粒層細胞； による〔３Ｈ〕−チミジンの取込みを示す。

第４図は、本発明に係わるラジオイムノアッセイを使ったウシＨＢＧＦ−βデス トリペプチドに対するウサギ抗血清の滴定の結果を示す。

第５図は、（ａ）ウシ脳（ｂ）ブタ脳並びに（Ｃ）ウシ肺、ラット脳およびラッ ト軟骨肉腫から精製されたＨＢＧＦ−βによる抗体からの１！！ｉＩ−デステト ラペプチドＨＢＧＦ−βの消失を示す。

第６図は、（ａ）ウシ肺およびヒツジ下垂体の抽出物（ｂ）ラット血清並びにラ ット脳および下垂体抽出物においてラジオイムノアッセイにより検出されたデス テトラペプチドＨＢＧＦ−βのレベルを示す。

第７図は、培養されたウシ卵巣膜細胞のデステトラペプチドＨＢＧＦ−β含量に おける種々のホルモンおよび増殖因子の効果を示し； （ａ）黄体形成ホルモン（ＬＨ）の効果；（ｂ）黄体形成ホルモン（ＬＨ）、上 皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−Ｉ）および形質転換 増殖因子−β（ＴＧＦ−β）の効果を示す。

第８図は、培養されたウシ卵巣顆粒層細胞によるプロゲステロン生産におけるデ ステトラペプチドＨＢＧＦ−βの効果を示す。

主所少豆皿 本発明者らは、種々の哺乳類組織から単離されたヘパリン結合増殖因子（ＨＢＧ Ｆ−β）が相当なＮ−末端アミノ酸配列不均質性を示すことを発見した。幾つか の証拠の傾向は、先端の切取りが特異的増殖応答を可能にしそして該応答と一般 化された細胞分裂促進応答とを識別するユニークな生物学的メカニズムを意味す るように、各組織における組織特異的翻訳後プロセシングが、近隣の細胞体に関 して最適な生物活性を承り即ち卓越的に自己分泌因子として機能するユニークな 形のＨＢＧＦ−βの生産のための重要なメカニズムを意味することを示唆してい る。この結論のための証拠は、次の知見に基づいている： （１）先端が切り取られた特定の形の存在度は、それが単離される組織のタイプ に特有である； （２）先端が切り取られた形は、精製のあいだ高濃度のプロテアーゼ阻害剤が存 在した時の組織抽出物から単離され得る； （３）先端の切り取りのための開裂部位は、補乳類細胞抽出物が微生物で汚染さ れていてもいなくても、該細胞抽出物中に見つかる現在認知されるタンパク質分 解酵素と正規に関係があるものではない；そして （４）先端が切り取られた形の比活性（効力）の相違が、細胞／組織起源に応じ た最大応答活性で認められる。

存在度が大きいために、本発明者らはウシとブタの先端が切り取られたＨＢＧＦ −β変異体、特にデストリペプチドおよびデステトラペプチド−ＨＢＧＦ−βに 注目した。しかしながら、それらの形は例示的なものにすぎず、本発明がそれに 限定されないことは明らかに理解されよう。

本発明者らは、次のものに関する実験を行った：（ｉ　）　ＨＧＢＦ−βのＮ− 末端部分から１２以下のアミノ酸残基を欠いているデストリペプチド／デステト ラペプチド、デスペンタペプチドおよび他のデスペプチド形の、ウシ、ラットお よびブタの脳、下垂体、肺、卵巣、血漿および黄体から（それぞれｂＨＢＧＦ− β、ｒＨＢＧＦ−βおよびｐＨＢＧＦ−βと称する）およびヒト血漿から（ｈＨ ＢＧＦ−βと称する）の精製；（ｉｉ　）それら変異体のアミノ酸配列の特徴付 け；（ｍ）それらのＢＢＧＦ−β変異体に関連するポリペプチド類似体の化学合 成； （ｉｖ）それらのＨＢＧＦ−β変異体に対するポリクローナル抗体の生産並びに それら因子の生物学的機能および濃縮をモニターする診断方法を確立することに おける該ポリクローナル抗体の利用； （ｖ）生体外での繊維芽細胞、内皮細胞、顆粒石細胞並びに他の間葉細胞、神経 外胚葉細胞および上皮細胞の増殖、成長および可動化を増強するため、そして血 管形成誘導因子または血管新生誘導因子として生体内での上皮細胞の自然増殖を 増強するための該ポリペプチド類似体の利用。

■上　か゛の一゛スベプチ゛　の　′■デストリペプチドＨＢＧＦ−β、デステ トラペプチドＨＢＧＦ−β、デスペンタペプチドＨＢＧＦ−βおよび他のデスペ プチド形のＨＢＧＦ−βの単離は、ウシ、ブタおよびラットの脳、肺、下垂体、 卵巣、黄体および血漿から、並びにヒトの血漿およびラットの軟骨肉腫腫瘍細胞 系から達成された。

これらのポリペプチドを、組織ホモジネートまたは血漿から、プロテアーゼ阻害 剤［１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）　、２＋ｎＭの フェニルメチルスルホニルフルオライド、２．５　ｍｇ／　Ｒのロイペプチン、 ２．５ｍｇ、＃のペプスタチン、および２．５−５．０■／２のベンズアミジン ］の存在下においてリン酸塩緩衝液（０，ＩＭＮａＣｌを含む０．１　Ｍ　Ｎａ ＨｚＰＯ４）を用いてｐＨ３，５−４，５にて可溶化することにより均質まで精 製し、そして硫酸アンモニウム分画を使い、次いでカチオン交換クロマトグラフ ィー、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグ ラフィーの逐次使用によって部分的に分画する。カチオン交換クロマトグラフィ 一段階の直後にトリアジン色素アフィニティークロマトグラフィーの段階の更な る追加は、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィ一段階の分解能を高め、そ してアフィニティーカラムの寿命を延長する更なる利点を有する。

トリアジン色素アフィニティークロマトグラフィーおよびヘパリンアフィニティ ークロマトグラフィーは、二者択一の方法として使用され得る。大スケールの精 製には、トリアジン色素カラムのほうがより安価であり、この理由でより好まし い、所望により最終精製のために逆相クロマトグラフィ一段階を使用しても良い 。

この精製手順は、研究される全ての種からの試料に使用し、そして一般的に適用 可能であると思われる。マウス３Ｔ３繊維芽細胞による１３旧−チミジンの取込 みを刺激する能力について両分をテストすることにより精製をモニターした。活 性画分を、卵巣顆粒層細胞および大動脈内皮細胞を使って更にテストした（下記 参照）。

精製操作に適当であると思われるクロマトグラフィー媒体を第１表に要約する。

他の適当な媒体は、当業者には明らかＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０および ヘパリン−５ｅｐｈａｒｏｓｅにおける典型的な溶出プロフィールを第１図およ び第２図に示す。バーはＨＢＧＦ活性を有する両分を示す。カチオン交換カラム からの溶出は、試料に応じて、段階的溶出および勾配を使って行われ得る。試料 は、それらのヘモグロビン、脂質および組織破片の含量の点でかなり異なり、こ れは条件の選択に影響を与えた。

ヘパリン−５ｅｐｈａｒｏｓｅカラムでは、３Ｔ３繊維芽細胞による［３Ｈ］− チミジンの取込みの刺激によりアッセイされるＨＢＧＦ活性（第２ｂ、ｃ図の上 のパネル）と２８Ｏｎ１ｍでの吸光度によりアッセイされるタンパク質含量（下 のパネル）との間に明らかな相関関係はなかった。

！ＬＬｕ散付亘 精製された端が切取られた形のＨＢＧＰ−βを、次により更に特徴付けた： （ｉ）自然および還元条件下でのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）　；単離されたバンドを次のために使用した ； （ｉｉ）ニトロセルロースまたはＺｅ　ｔａ−プローブ膜と特異的ポリクローナ ル抗血清とを使ったエレクトロトランスファーおよびイムノプロット操作； （ｉｊ）アミノ酸組成分析； （ｉｖ　）サイズ排除クロマトグラフィーによる明確な分子量の測定； （Ｖ）完全なデスペプチド−）ＩＢＧＦ−βのＮ−末端配列決定並びに該デスペ プチド−〇ＢＧＦ−βの還元、アルキル化および酵素消化から誘導されたペプチ ド断片の配列決定。

１４．３００〜６８．０ＯＯｋＤの常用の分子量標準を使った５ＯＳ−ＰＡＧＥ 分析の典型的な結果は、先端が切取られた形のＨＢＧＦ−βが１７．０００〜１ ８．０００の範囲の分子量を有することを示した。

アミノ酸組成分析およびアミノ末端配列決定のために、精製されたＨＢＧＦ−β 画分をプールしそしてＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０微量濃縮器を使って脱塩した。

アミノ酸組成分析用には、試料を蒸発乾固するかまたは４容のＡＲ級のメタノー ルで沈澱させ、次いで遠心し、メタノール中に再懸濁させ、そして加水分解管に 移した。その試料を、１．２５ナノモル（ｎｍｏｌ）のノルロイシン標準および ０．１％フェノールを含有する５Ｍ塩酸で１１０°Ｃにて２４時間加水分解した 。アミノ酸分析は、叶ｕ＋＋ｕｎ　Ｄ−５００または−ａｔｅｒｓ　Ｐｉｃｏ− Ｔａｇアミノ酸アナライザー系で行った。

酵素消化されたＨＢＧＦ−β断片のアミノ末端−一己列および内部配列決定は、 Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｍｏｄｅｌ　４７０Ａシークエンサー を使って行った。アミノ酸のフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）誘導体は、Ｚ ｉｍｍｅｒｏ＋ａｎ、　Ｃ，Ｌ、ら、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍ、　（１９７７）４ ７゜４５−５１の方法の変法を使った逆相ＨＰＬＣにより分析した。

ＨＢＧＦ−βモル当りの個々のアミノ酸のモルに換算したＨＢＧＦ−β断片のア ミノ酸組成分析の結果は、アミノ酸配列決定から推測されるアミノ酸組成値と完 全に一致した。

貫主　二■孟血 （ｉ）培養された細胞および単離された組織Ｂａ１ｂ／ｃ　３Ｔ３マウス繊維芽 細胞、ウシおよびヒツジ顆粒層細胞並びにウシ内皮細胞の単層培養物をブタトリ プシン２（Ｅ、Ｃ，３゜４．４．４）を使って分散させ、５％ウシ胎児血清（Ｆ ｅ２）を含むダルベツコの最少必須培地（ＤＭＥ？Ｉ）中で酸素中５％ＣＯ２下 において３７°Ｃにて２日間増殖させた。０．００２５％のプロナーゼを含有す るｐＨ７，２のＥＤＴＡ塩−リン酸塩緩衝液（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｓ）で培地を置 換えることにより細胞を回収し、３％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で洗浄および懸濁 し、そして３Ｘ１０”細胞数／　１００ｊＪ！にて継代培養した。アッセイの５ 時間前に培地をｒ″Ｈ］−チミジンを含む無血清培地で置換し、そして種々の処 理をしながら細胞を２日間培養した。処理期間の終わりに細胞を１％ＳＤＳで破 壊し、そして［３Ｈ］−チミジンの取込みから分裂促進活性を測定した。トリク ロロ酢酸沈澱性タンパク質物質へのｐ　５ｓｌ−メチオニンおよび［＋　４ｃｌ −ロイシンの取込みについても同様なプロトコールを使用した。

ウシ大動脈弓内皮細胞を、５％ウシ胎児血清を含むＲＰＭ１１６４０組織培養培 地中に１．５Ｘ１０’細胞数／Ｉｄの濃度で接種した。

３７°Ｃにて２４時間培養後、単離された増殖因子のアリコート、組織抽出物お よび対照物を細胞に添加した。！気細胞計数器（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｅ１ｅｃｔｒ ｏｎｉｃｓ＋Ｉｎｃ、）を使って、細胞増殖を連続希釈試料について毎日定量し た。

ウシ肺内皮細胞の培養プロトコールは、ＪａｃｏｂｓｏｎおよびＲｙａｎの微小 担体（Ｔｉｓｓｕｅ　ａｎｄ　Ｃｅ１１．１４．６９−８３．１９８２）を使っ たＲｙａｎおよびＷｈｉｔｅの方法（Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｍｅｔｈ ｏｄｓ、１０（１）、９−１３、１９８６）の変法に基づいた。

筋芽細胞Ｌ６細胞系、並びにコラ−ゲナーゼで分散されたラットの肝細胞、軟骨 細胞および軟骨肉腫細胞での細胞増殖活性および内因性活性は、次の手順を使っ て測定した：筋芽細胞Ｌ６細胞系の培養は、培地１１当り３．６ｇのグルコース 、４．０ｇのヘベス、３．７ｇの炭酸水素ナトリウム、２００■のグルタミン、 １ｏｏｏｏｕのペニシリン、１００００■のストレプトマイシンおよび２５０ｎ のアンホテリシンが補足され富化されたダルベツコの最少必須培地（Ｄ？ｌＥＭ ）中で行った。５−７日後にコンフルエント細胞を継代培養し、そしてリン酸塩 緩衝化塩類溶液（ＰＢＳ）で２回洗浄し、そして３分間トリプシン処理し、次い でアッセイの直前にＤＭＥＭで希釈し約１０５細胞数／ｄのアリコートに分けた 。肝細胞および他の細胞系についても同様な培養方法を使った。ラット軟骨細胞 の培養は、次の手順を含んだ、無菌条件下でラットから胸骨および肋骨を取出し た。

付着している結合組織を除去した後、胸骨および肋骨を切刻み、そしてハムのＦ １２培地中０．２５％（Ｗ／Ｖ）　）リブシン１０ｊｄで３７°Ｃにて３０分間 消化した。上清を注意深く吸引し、残りの軟骨セグメントにハムのＦ１２中の０ ．２％（Ｗ／Ｖ）コラ−ゲナーゼ１０Ｊｄを添加した。３７°Ｃにて１時間消化 を続け、次いで遊離された軟骨細胞を含む上清を取出した。遠心により細胞をペ レット化し、１０％ＦＣＳを含むハムのＦ１２中に再懸濁しそして増殖させた。

３Ｔ３−繊維芽細胞系、ウシ肺内皮細胞、並びにウシの大および小濾胞からの顆 粒層細胞における生体外増殖およびＤＮＡ合成の代表的データは第３図に示され る。第３　ｂ−ｄ図に示されるものと同等な結果がウシＨＢＧＦ−βデストリペ プチドでも得られた。

ＪＬＬｉスペプチ゛ＨＢＧＦ−に・−るポ１クロー　ル　ゞ■製造 一搬体のメスおよびオスのニューシーラント白ウサギを、Ｍａｒｃｏｌ　５２− Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ　８８８中に乳濁化されたデストリペプチドＨＢＧＦ−β・ ・・・・・デスドデカペプチドＨＢＧＦ−β（９：１）の筋肉内または皮下投与 により免疫処置した。該デスペプチドは単独で、または常法によりオボアルブミ ンもしくはチオガイヘモシアニンに連結されて与えられた。担体タンパク質に連 結された免疫処置用ポリペプチドは、５ｔｅｖｅｎｓ、Ｖ、Ｃ，ら、Ｉ＋ｕｅｕ ｎｏｌ　。

Ｌｅｔｔｓ、　（１９８６）　１２．１１−１８において本質的に記載されたよ うな二価性試薬６−マレイミドカプロン酸−アシル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイ ミドエステルを使った。トレハロースジミコレートおよびモノホスホリル脂質Ａ を含む補助剤で乳濁化した後、混合物を免疫処置当り０．５■の接合体の用量で ３回筋肉内注射した。その後の免疫処置は、免疫処置当り０．１〜０．５■の接 合体を含んでいた。その後のブースター免疫処置は、３週間の間隔で適用された 。二重抗体法を使って、１０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ　ＮａＣ１、１（ｌｅＭ 　ＥＤＴＡ　、　０．１％血清アルブミン（ｐＨ７，２）中でインキュベートし 、放射性ヨウ素化された因子を結合する能力について血清を調べた。有意な抗体 価を得るためにはタンパク質担体への連結が必要であることがわかった。

特定の担体タンパク質を使った吸着により、回収された抗血清から担体タンパク 質に対する抗体を除去した。

ｆｉｉ　）ＩＢＧＦ−の−ジオイムノア・セイヘパリンー５ｅｐｈａｒｏｓｅ精 製されたウシ下垂体デストリペプチド）ＩＢＧＦ−βまたはデステトラペプチド ＨＢＧＦ−βを標準として使用しそして精製されヨウ素化されたウシ下垂体ＦＧ Ｆをトレーサーとして使用する特異的ラジオイムノアッセイを開発しそして特徴 づけた。該アッセイは、例４のようにして調製されたポリクローナル抗体を使用 した。当業界で周知の方法により調製されたモノクローナル抗体の使用、および 他の周知のタイプのイムノアッセイ、例えばエンザイムリンクドイムノアッセイ （ＥＬＩＳＡ）および蛍光イムノアッセイの使用は本発明の範囲内であることは 、認識されるであろう。

ラクトペルオキシダーゼ法（Ｔｈｏｒｅｌｌ、Ｊ、１．およびＢ、Ｆ、Ｊｏｈａ ｎ−ｓｏｎ　［１９７１］：Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　２５ １　＋６３）によりトレーサーをｌ　！ＳＪで標識した。該トレーサーは、１０ ｍＭ　ＮａＨｚＰＯ４−１０ｏ＋ＭＥＤＴＡ−１５０＋＋＋ＭＮａＣ１−０，２ ％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００−０，１％ヒト血清アルブミンを含む緩衝液（ｐＨ ７，４）巾約１０．　ＯＯＯｃｐｍ／１００ｉ１！において使用した。試料およ び標準は、１０＋＋＋Ｍ　ＮａＨｔＰＯ４−１０ｍＭ　ＥＤＴＡ−１５０ｍＭ　 ＮａＣ１−０，１％ヒト血清アルブミンを含む緩衝液、ｐＨ７，４（アッセイ緩 衝液）中に溶解した。

アッセイ用に、２００ＩＪ１のアッセイ緩衝液、１００Ｉの標準、試料または対 照、Ｌｏｏｍのトレーサーおよび１００Ｉの抗−〇ＢＧＦ−β（１：　７００の 正常ウサギ血清を含む緩衝液中１　：　１０００）を混合しそして４°Ｃにて２ 日間インキュベートし、次いで１ｄのポリエチレングリコール６００（０，９％ ＮａＣ１中４％）を添加しそして４℃にてさらに３０分間インキュベートした。

次に該試料を遠心し、上清をデカンテーションし、そして沈澱物中の放射−をガ ンマカウンターでカウントした。

典型的なアッセイの結果を第４図に示す。トレーサーは”’Ｉ−ｂＨＢＧＦ−β デストリペプチドであり、そして抗血清はｂＨＢＧＦ−βデストリペプチドに向 けられた。１：５０００の抗血清の最終希釈度は、３６％の結合を生じた。抗血 清結合曲線から誘導したスキャッチャードプロフトおよびロジットプロットは直 線であり、該抗血清が単一特異的であることを示した。

■工　の−゛スペプチドＨＢＧＦ−の ラジオイムノアッセイを使って、次のような様々な試料において先端が切り取ら れた形の関連ＨＢＧＦ−βの存在量を測定した。

ａ）組織ホモジネート□ウシ卵巣胞膜 うット脳、下垂体 ヒツジ下垂体 ｂ）精製された組織抽出物 □ウシ脳、下垂体、肺 ブタ脳 ラット脳、軟骨肉腫 Ｃ）血　清　□ウシ、ヒツジ、ヒト、ラットｄ）順化された細胞培養培地 □ウシ卵巣脂膜細胞 ラット下垂体細胞 ウシ、ブタおよびラットの脳、ウシの肺およびラットの軟骨肉腫による抗体から の＋ｚｓＩ−デステトラペプチド）ＩＢＧＦ−βの消失についての結果を第５図 に示す。

該アッセイがラットの軟骨肉腫、即ち腫瘍細胞系の抽出物中にＨＢＧＦ−βを検 出できたことは特に着目される。

■旦　パの　にお番る一゛スペプチドＨＢＧＦ−〇″卵巣中のＨＢＧＦ−β変異 体の役割に関する研究から、卵胞形成、胚盤胞の発達、胚盤胞の着床および胎盤 の血管新生における該因子の重要性を確証するデータが得られた。該因子の作用 の自己分泌メカニズムを、 （１）ウシ卵巣脂膜細胞および （２）卵巣顆粒層細胞 を使った培養研究から更に実証した。この研究は、該因子が順化培地中に分泌さ れるのではなく細胞内容物として見つかることを証明した。大きい濾胞からの脂 膜細胞では、小さい濾胞から誘導された脂膜細胞で認められた含量の２．５倍の 含量であった。これは、黄体期の前の濾胞の発達および成熟のための予想される 役割と矛盾しない（第７ａ図）。加えて、単独でまたは他の増殖因子（ＥＧＦ、 　ＩＧＦ−１またはＴＧＦ−β）と協同した黄体形成ホルモンにより、該濾胞因 子の合成において約１．５倍の効果が誘導された（第７ａ　、７ｂ図）。

特定のＨＢＧＰ−β形の卵巣内調節の役割は、高濃度の該因子を使って培養中の 顆粒層細胞の外因性刺激を行った時の応答のダウンレギュレーションを通して実 証された（第８図）。

顆粒層細胞によるプロゲステロン生産は、培養物ｌＩｎ１あたり１１００ｐより 多いデステトラペプチドＨＢＧＦ−βの投用量により有意に減少した。この効果 は、培養の２，４および６日目に観察された。

ｔ７多　にお番るー゛スペプチドＢＧＦ−〇六それらのＨＢＧＦ−βポリペプチ ドの血管形成役割の機能的結果は、 （１）ヒトプラスミノーゲン／ストレプトキナーゼ／５２２５１色素形成物質の 糸を使って、ヒトの黒色腫細胞系からのｔＰＡ標準に対する４０５ｎｍでの吸光 度の変化から活性をモニターすることによる、内皮細胞および顆粒層細胞溶解物 における組織プラスミノーゲン（ｔＰＡ）活性化因子活性；（２）　Ｂｏｙｄｅ ｎの方法（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、月５．４５３−４６３．１９６２）およびＢ ａｎｄａ　らの方法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、７９．７７７３ −７７７７．１９８２）を使った内皮細胞の走化性； における用量依存効果の測定により評価される。

このデータは、先端が切り取られたＨＢＧＦ−βポリペプチドが血管形成アッセ イにおいて約０．１　ｆＭ　（即ち約２０ｐｇ／ｄ培養液のＥＤ、。）で最大活 性を有することを証明した。

劃」−戸″′　のＢ　への ヘパリンおよび他の硫酸化した支持担体、例えばヘパラン硫酸プロテオグリカン およびＳＰ−セルロース、ＳＰ−アガロースまたはＳＰ−誘導化ポリメタクリレ ートコポリマー等と強力に結合するＨＢＧＦ−β変異体の性質（これは、ＨＢＧ Ｆ−β変異体の単離において使用した精製ルートの基礎であった）を考慮して、 負傷用包帯における局所使用のために、誘導化された担体粒子、膜またはシート 上への該因子の固定化方法を開発した。この方法は、ヘパリンまたはヘパラン硫 酸プロテオグリカンを予備活性化されたセルロースと連結させ、次の段階で該因 子を吸着的に結合させることに基づく。好ましい予備活性化方法は、カルボニル ジイミダゾールの使用を含む（Ｈｅａ−ｒｎ、？１ｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍ、、１９ ８７．Ｌ詞１０２−１３１）。外因性因子または対照物質が含浸されたＳｃｈｉ ｌｌｉｎｇ　Ｈｕｎｔポリビニルスポンジ挿入を基にしたラットの移植系を使っ て外部創傷での評価を確立した。追加の外因性因子活性が創傷液並びに濾胞液中 に認められ、該因子により媒介される口内炎細胞の増殖速度の２．５倍の増加が 観察された。

ＨＢＧＦ−β変異体は、例えばε−アミノカプロイルで誘導化されたセルロース 、アガロース、γ−グリシドキシルプロピルシリカ、ヒドロキシメチル化された ポリメタクリレート、誘導化されたポリビニルアルコール（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ）のトリス−アクリルアミドコポリマー（Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ）から、本質的に はＦｉｎｌａｙらＡｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１０９（１９８０）３５４　； ５ｃｈｕｔｙｓｅｒ　らＡｆｆｉ−ｎｉｔｙ　Ｃｈｒｏｏ＋ａｔｏｇｒａｐｈｙ 　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｔ、Ｃ，Ｇｒｉｂｎａｎ＋ Ｊ、ＶｉｓｓｅｒおよびＲ，Ｊ、Ｆ、Ｎ１ｖａｒｄｌｌＨ）Ｅｌｓｅｖｔｅｒ　 Ｓｃｉ、Ｐｕｂｌ、１９８２゜ｐｐ　１４３３−１５３；　Ｐ、Ｃｕａｔｒｅｃ ａｓａｓ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２４５（１９７５）３０５９；並びにＭ 、Ｈｅａｒｎ、Ｍｅｔｈｏｄ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、、１３５（１９８７）１０２の 方法に従って調製されたヘパリン誘導化ポリマーにバッチ吸着される。

バッチ吸着のための条件は、担体として血清アルブミンを含むかまたは含まない ｐＨ７，４の等張ＰＢ５を包含する。典型的な吸着容量はｉｎＭ／ｇ担体である が、担体のリガンド密度のためにより高い値、即ち１ｍ−１０ｄ／ｇが潜在的に 達成され得る。　１５〜２０μｍｏｌ／ｇ担体までを支持体系に適用することが できる０等張条件下でそのように適用されたＨＢＧＦ−βデスペプチドは、血管 形成および創傷治癒の刺激のための徐放系としての用途に適する。

ｌ　および　の−゛スペプチドＢＧＦ−の　の太及■■広 ウェスタン、サザンおよびノーザンプロット分析、ＨＢＧＦ　−β構造に特異的 なポリアデニル化ｍＲＮＡとのオリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーシ ョン、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ／”Ｐ−ＡＴＰを使った５′−ラベル化ま たはホスホヌクレオチジルトランスフエラーゼ／”　Ｓ　−ＡＴＰを使った３′ −ラベル化、並びに細胞または組織試料片を使ったｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイ ゼーシヨンを用いて、異なる哺乳動物種からの種々の組織における）ＩＢＧＦ− β変異体の存在をモニターしそして定量することができる０例えばＣＧＧＴＴＴ ＧＣＡＣＡＣＡＣＴＣＣ。

ＧＡＣＡＣＡＡＣＣＣＣＴＣＴＣＴＣＴＴＣＴ６ＣＴＴＧおよびＣＴＡＧＴＡＡ ＴＣＴＴＣＣＡＴＣＴＴＣＴＴＴＣＡＴＡＧ　、のような配列を有するオリゴヌ クレオチドプローブは、ホスホヌクレオチジルトランスフエラーゼと”５−ＡＴ Ｐを使って高比活性にラベル化すると、ｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーシヨン 技術、ドツトプロット法またはアガロースゲルプローブ方法を使って、正常細胞 および形質転換細胞、例えば軟骨細胞、軟骨肉腫、肝ガンおよび結腸直腸ガン検 体中のＨＢＧＦ−βに相当するｍＲＮＡのレベルの検出および定量が可能である 。

この方法により、ＨＢＧＦ−βデスペプチドが肝ガン検体中および結腸直腸ガン 検体中に発見された。

五エ　第１ゴヌ　レオ　゛の人 ＨＢＧＦ−βに相当するオリゴヌクレオチドプローブをホスホロアミダイト化学 を使って３８０Ａ型ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ−ｓｙｓｔｅｍｓ　 Ｉｎｃ、）上で合成し、そしてＤｕｐｏｎｔのＺｏｒｂａｘ　Ｂｉｏ　５ｅ−ｒ ｉｅｓ　Ｏ１ｉｇｏカラム（８ｃｔａ　Ｘ　６．２１１ｍ　）を使って精製し次 いでＧ−２５カラム（２，８ｃｍＸ９■）で脱塩した。このオリゴヌクレオチド を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼと”Ｐ−ＡＴＰを使って５′−末端をラベル 化するかまたはホスホヌクレオチジルトランスフェラーゼと”５−ＡＴＰを使っ て３′−末端をラベル化した。全てのプローブは、５Ｘ１０”〜８〜１０’ｄｐ ｍ／ｘの最終比活性を有していた。

■刊　ｉｎ　５ｉｔｕハイプリ　゛イゼーション顕微鏡用スライドを焼成し、ポ リーＬ−リジンでコーティングし、０．１％ジエチルピロカルボネートで処理し 、そして風乾した。培地中の単分散細胞をＣｙｔｏｓｐｉｎを使ってスライドグ ラス上にひろげた（１０’−３ｘ　１０’細胞数／スライド）　、　ＯＣＴ包埋 された組織から５−１０Ｊｎａの横断切片を一２０’Ｃのクリオスグツト上で切 り取り、そして顕微鏡用スライド上にのせた。

細胞と組織切片を共にドライアイス埋土に２０分間置き、次いで４％グルタルア ルデヒド、１１００Ｉ　ＮａＨｚＰＯａ　、２０％エチレングリコール（ｐＨ７ ，３）中で１０分間固定した。固定後、幾つかの切片をリボヌクレアーゼ（１５ ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ／！、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　５０ａ＋Ｍ　ＮａＣ１、 ｐＨ１，５、中２５ｎｇ／ｄ）またはプロテイナーゼＫ（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ− ＨＣｊｌ！、２ｍＭ　ＣａＣ４２ｚ　、ｐＨ７，４、中１　’ｎｇ／　Ｍｌ）の いずれか一方と共に３７°Ｃにて１時間インキュベートした０次に５　Ｘ５ＳＣ （Ｉ　Ｘ５ＳＣ＝　０．１５Ｍ　ＮａＣ１，０，０１５Ｍクエン酸ナトリウム） 　、５０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４，０，２％ＢＳＡ、０．２％ポリビニルプロリド ン、０．２％Ｆｉｃｏｌｌ、　０．２％変性ニシン精子ＤＮＡ、０．４％変性酵 母＋ＲＮＡ　、５０％ギ酸および１０ａ＋Ｍβ−メルカプトエタノールを含有す るハイブリダイゼーション緩衝液中に入れ、”５−ＡＴＰ標識標識ジグヌクレオ チド用するつもりであれば、２０°Ｃにて２０分間、３７°Ｃにて２０分間およ び３７°Ｃにて６０分間インキュベートした。各スライドにハイブリダイゼーシ ョン緩衝液中の標識プローブ（２５００００−５０００００ｄｐａ）　１２Ｉ１ １を適用しそして湿潤容器中で３７°Ｃにて２４時間ハイブリダイズさせた０次 にスライドを４ＸＳＳＣ中で１０分間、２ＸＳＳＣ中で１０分間、Ｉｘｓｓｃ中 で３０分間（全て１０１Ｍβ−メルカプトエタノールを含む）、そして最後にエ タノール中で５分間洗浄した。風乾したスライドを０５核型用乳剤中に浸し、そ して光不貫通性ボックス中−７０°Ｃにて１〜４週間露出し、次いでＫｏｄａｋ 　０１９中で５分間現像し、１％酢酸で１分間すすぎ、２５％チオ硫酸ナトリウ ム中で定着し、そして水道水で繰り返し洗浄した。スライドを風乾し、ヘマトキ シリンとエオシンで染色し、そして標本にした。

この方法を使って、ＨＢＧＦ−βはラット軟骨細胞、ラット軟骨肉腫、ウシ大動 脈および肺内皮細胞、ラット神経節ニューロン、並びにヒト肝ガンおよび直腸結 腸ガン細胞中に検出さベンズヒドリルアミン／ジビニルベンゼン樹脂上での固相 法により、デステトラペプチドＨＢＧＦ−βの内部配列に相当する合成ペプチド を合成した。このペプチドＬｅｕ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　ＨｉｓＰｒｏ　Ａｓｐ　Ｇ ａｙ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｇｌｙの合成が該方法の代表的なものである。

Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相ペプチド合成法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｒ，Ｄ、 らＪ、Ａ＋ｎｅｒ。

Ｃｈｅｗ、Ｓｏｃ、、　１９６３，８５：２１３９−２１４５）の変法を使った 。まず全てのアミノ酸側鎖の基が保護されたアルファ／直鎖型においてペプチド を合成した。　ｔＢＯｃ合成アプローチについては、添加するアミノ酸のα−ア ミノ官能基を第三ブチルオキシカルボニル（ｔＢＯｃ）基で保護し、カップリン グの後にジクロロメタン中のトリフルオロ酢酸で脱保護した。Ｆｍｏｃ（９−フ ルオレニルメチルカルボニル基）保護を使った同様な合成計画もまた適当である 。ベンジルヒドリルアミン樹脂への最初のカップリングは、Ｎ、Ｎ’−ジメチル ホルムアミド（Ｄ？ＩＰ）中に溶解された３倍過剰量の所望の側鎖保護アミノ酸 を使った。その後のカップリングには、ＤＭＦ中の２倍過剰量の側鎖保護アミノ 酸を使った。　ＤＭＦ中のｔ−ブタノールおよびジシクロへキシルカルボジイミ ドを使ってアミノ酸を順次活性化し、そして反応体を室温にて５−１０分間撹拌 した。濾過によりアシル尿素を除去し、そして非対称無水物を樹脂に添加した。

懸濁された樹脂を室温にて１２０分の反応時間の間撹拌した。各カップリングを 、２．４．６−）リニトロベンゼンスルホン酸を使って未反応のアミノ基につい てモニターした。保護アミノ酸対称無水物またはペンタクロロフェニルエステル を使った同様な計画でも同一生成物の調製をもたらした。最終カップリングが完 了した後、完全に保護された樹脂結合ペプチドをトリフルオロ酢酸で脱保護し、 そして脱保護されたペプチドを、酸として液体フッ化水素およびスカベンジ＋− としてジメチルスルフィド／ｐ−クレゾールもしくはチオアニソールを使って、 またはペプチド化学に経験のある研究者に精通している他の切断方法を使って、 樹脂から切断した。脱保護され切断されたペプチドをトリフルオロ酢酸、水、次 いで水／アセトニトリル混合物で洗浄することにより樹脂から取り出した。洗浄 液を合わせそして凍結乾燥した。粗生成物をＷｈａｔｓ＋ａｎ　ＤＥ５２上での アニオン交換によりクロマトグラフィーを行い次いでＢｉｏｇｅｌ　ｐ２ゲルで 脱塩した。固定相としてオクタデシルシリカ（または他のｎ−アルキルシリカ） を使いそして移動相として水性−有機溶媒グラジェント、例えば〇−７５％水− ア七ト二トリルー０．１％トリフルオロ酢酸または〇−７５％水−ア七トニトリ ルー１００ＩＩＩＭ炭酸水素アンモニウムを使った逆相肝ＬＣにより更に精製を 行った０合成ペプチドは、アミノ酸組成分析、幾つかの溶出系を使った分析的逆 相ＨＰＬＣ２高速原子衝撃−質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）、ＦＴＩＲ−赤外スペク トル分析、および濾紙電気泳動により特徴付けた。ポリクローナルおよびモノク ローナル抗体の生産のためには、前記のようにして、抗原として使用するために ペプチドを担体、タンパク質に接合させた。

データは次のことを示している： （ａ）数種の今までに未知の形のＨＢＧＦ−βが均質に精製されそして一次配列 構造が確認された。

（ｂ）繊維芽細胞生体外アッセイ系へのそれらデスペプチド形の添加が細胞成長 および増殖の用量依存性増加をもたらし、これはＥｓｃｈら（１９８５）により 報告されている構造のウシ繊維芽細胞増殖因子−１よりも１０〜５０倍大きい効 力であった。

（Ｃ）顆粒層および内皮細胞生体外アッセイ系へのそれらデスペプチド形の添加 は、細胞の酵素パラメーター、例えばアロマターゼおよびプロコラ−ゲナーゼ活 性における用量依存性効果と対応する、タンパク質およびＤＮＡ生産並びに細胞 増殖および数の用量依存性効果をもたらした。

（ｄ）それらのデスペプチドＨＢＧＦの作用は、他の増殖因子、例えば上皮増殖 因子（ＥＧＦ）　、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換増殖因子αもし くはβ（ＴＧＦ−αもしくはβ）または繊維芽細胞増殖因子−α（ＦＧＦ−α） のものと区別され、細胞増殖について異なる時間経過プロフィールを示しそして 最大刺激について異なるモル応答性を示す。

（ｅ）それらのデスペプチド−ＨＢＧＦ−βを基にした特異的ラジオイムノアッ セイは、効力、組織特異性、および自己分泌細胞刺激とパラ分泌誘導性組織増殖 の両方を促進する能力（内皮細胞の毛細血管化を伴う新生血管体の侵入を含む） の点からユニークな生物学的作用を表わすそれらの類似体と矛盾しないような、 それら因子の選択的組織特異的プロセシングが起こることを示す。

ｌ泗ｊｉｌ「吐１性 生体外での小毛細血管内皮細胞に対する潜在的血管形成活性および生体内での血 管新生を誘導する能力のために、ヘパリン結合増殖因子は、おそらく創傷の治癒 において並びに角膜細胞、平滑筋およびダリア細胞を含む組織の正常および病的 な血管新生の維持において重要な増殖因子のクラスを意味する吟であろう、ヘパ リン結合増殖因子により示される血管形成活性の広域スペクトルを考慮すれば、 それらは正常な細胞増殖および組織修復の間または腫瘍細胞のような形質転換細 胞の増殖の間に自己分泌／パラ分泌機構を経て複数の細胞のタイプの血管形成を 刺激および同調させるらしい。本発明者らは、固形腫瘍においてヘパリン結合増 殖因子様活性を検出した。従ってＨＢＧＦ−βのペプチド系アンタゴニストの使 用またはそうでなければＨＢＧＰ−βの免疫抑制は、多くが手術、化学療法また は放射線療法に反応しない固形腫瘍の成長を止めるかまたは逆転させる可能性を 有する。

（ａ）増加および維持された細胞増殖、ＤＮＡポリメラーゼ活性並びに新規のＤ ＮＡおよびタンパク質生合成は全て、肺もしくは小毛細管中の内皮細胞、または 卵胞中の顆粒層細胞といった中胚葉細胞の増殖および自然成長の指標であり、そ してそのような機能が血管新生または血管形成および濾胞発達の指標である限り において、デスペプチド−〇ＢＧＦ−βの存在は濾胞形成および胎盤組織の血管 新生を促進するので、胚盤胞移植において必要とされるかもしれない。

（ｂ）持続および増加された内皮細胞活性が生体内の血管形成の指標である限り 、そしてデスペプチド−ＨＢＧＦ−βの生物学的性質がそのような活性において 用量依存性増加を誘導する限りにおいて、それらの因子は血管形成因子であり、 従って血管新生および創傷治癒を促進するのに有用であろう。

（Ｃ）持続および増加された内皮／上皮細胞活性が組織修復および創傷治癒の指 標である限り、そしてそれらデスペプチド−ＨＢＧＦ−βの生物学的性質がその ような活性において用量依存性増加を誘導する限りにおいて、それらデスペプチ ド−ＨＢＧＦ−βは組織修復および創傷治癒を促進することができる。

（ｄ）減少された血管新生および腫瘍からの血液供給の撤退が固形腫瘍の成長を 妨害するかまたは後退を導くことが知られる限りにおいて、局所投与される巨丸 剤または固定され架橋された抗体デボ−製剤のいずれかとしての該因子に対する 抗体の使用は、血管新生の減少を促進するであろう、これは、その多くが手術、 化学療法および放射線療法に反応しない固形腫瘍、例えば軟骨肉腫、肝ガン、直 腸結腸ガンおよび卵巣腫の成長の調節において適用を有するであろう、他の可能 性のある適用には、糖尿病性網膜症および後水晶体繊維増殖症のような状態を予 防するための血管新生の阻害が含まれる。

（ｅ）デスペプチドＨＢＧＦ−βは、中枢および末梢神経組織におけるニューロ ンの成長の調節並びに筋肉のような特殊化された組織の分化の制御に関係するか もしれない。

（ｆ）類推により、該デスペプチド−ＨＢＧＦ−βに関連する合成ペプチドの使 用は、同様に細胞の増殖および成長を増大させ、従って選択的な組織修復、再生 または増殖の方法を提供すると思われる。

（ｇ）類推により、該デスペプチド−ＨＢＧＦ−βに関連する合成ペプチドに対 する抗体は、細胞の増殖および成長を阻害すると思われ、従って上記（ｄ）のよ うな可能性ある利用法を使って、血管形成を阻害する方法を提供すると思われる 。

異なる種から単離された）ＩＢＧＦ−βの構造の比較は、アミノ酸配列がわずか １または２個のアミノ酸の相違を伴って高度に保存されていることを示している 。この相違は、おそらく単一のヌクレオチド置換の結果であろう。この置換の部 位によりウシとヒトのデスペプチド）ＩＢＧＦ−βは残基１１２と１２８におい てのみ相違を示す。同様にヒツジにおいては、残基１０のｇｌｙがｓｅｒに置き 換えられている。

これは、ウシＨＢＧＦ−β類似体がヒトにおいては免疫原性でないこと、および ヒツジＨＢＧＦ−β類似体がわずかに免疫原生であるかまたはヒトのペプチドと は異なる効力を有するであろうことを示唆する。このことは、ＨＢＧＦ−β変異 体の成る種の形のアミノ酸配列から作製されたオリゴヌクレオチドプローブが他 の種の組織から単離された対応するａ＋ＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズす る能力を通して確認される。

本発明者らは、内因性の先端が切りとられた形のｆｌＢＧＦ−βに関してはある 程度の組織特異性があるけれども、これは外因的に投与されたデスペプチドＨＢ ＧＦ−βの与えられた部位での効力に関すること以外の活性には影響を与えない ことを発見した。外因性特異性の重要性は、外傷のような刺激に対する局所応答 を開始する能力にある。例えばｉｎ　５ｉｔｕでの更なるプロセシング段階によ る機能的な増幅が存在し得る。

本発明は一般的観点において、上記に言及した特定の項目に限定されないことは 明白に理解されよう。

上記で使用した次の用語は商標である：へｃｃｅ１１．Ｂｉｏｇｅ１．Ｃｅｎｔ ｒｉｃｏｎ、Ｃ１ｂａｃｒｏｎ、Ｃｙｔｏｓｐｉｎ、Ｆａｓｔ−Ｆｌｏｗ　ｓｌ Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ、Ｍｏｎｏ　Ｓ、Ｐｉｃｏ−Ｔａｇ＋５ｅｐｈａｄｅｘ、５ ｅｐｈａｒｏｓｅ、５ｕｐｅｒｏｓｅ。

Ｍａｒｃｏｌ、　Ｍｏｎ　ｔａｎ　ｉｄｅ、　Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ、　Ｚｅ　ｔ ａ−ｐｒｏｂｅ、　Ｚｏｒｂａｘ。

浄書（内容に変更なし） ラット脳調製物 ＣＭ−セファデックスＧ５０ 画分番号 ブタ脳調製物 ＣＭ−セファデックスＧ５０ 画分番号 Ｆｉｇ　、Ｉ　Ｃ 画分番号 ブタ脳調製物 ピークのヘパリン−セファロースクロマトグラフィーラット軟骨肉腫調製物 ＣＭ−セファデックスＧ５０がらのピークのヘパリン−セファロースクロマトグ ラフィー〔３Ｈ〕−チミジン取込み（ｄｐｍ） ６′６〔μＲＫ％）　Ｆｌ’Ｑ　、６ｂＦｉｇ　、７ｂ プロゲステロン（ｎｇ／ｌ○５細胞） 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 ＰＣＴ／ＡＵ８８１００１９１ ２６　発明の名称 増殖因子 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　モナシュ　ユニバーシティ ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号５、補正命令の日付 ６、補正の対象 （１）特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の「特許出願人の代表者」 の欄および←奢弁嘗昔司′発明者の住所」の欄 （２）委任状 （３）明細書の翻訳文 （４）請求の範囲の翻訳文 （５）図面の翻訳文 ７、補正の内容 （１）　（２）　別紙の通り （３）明細書の翻訳文の浄書（内容に変更なし）（４）　請求の範囲の翻訳文の 浄書（内容に変更なし） （５）図面の翻訳文の浄書（内容に変更なし）８、添附書類の目録 （１）訂正した特許法第１８４条の５ 第１項の規定による書面　１通 （２）委任状及びその翻訳文　各１通 （３）明細書の翻訳文　１通 （４）請求の範囲の翻訳文　１通 （５）　図面の翻訳文　各１通 国際調査報告 ＡＮＥＫ　’ＩＯ’ｗ　ｍｍ　５ＥＡＲＯＩ　ＲＥＰＯＲＴ　ｃｗｙシ賜貫ＧＱ ｆ、　ＷＣＡＴｆｏｌ　Ｎｏ、　ＫＴ　ＡＵ　８８１００１９１

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．アミノ末端配列から１〜１２個のアミノ酸が欠けている、哺乳類のヘパリン −結合増殖因子（ＨＢＧＦ−β）のペプチド類似体。
2. ２．ヒト、ウシ、プタ、ヒツジ、ウマまたはラットＨＢＧＦ−βの類似体である 、請求項１に記載のペプチド類似体。
3. ３．前記アミノ末端配列が、 （ａ）【配列があります】……； （ｂ）【配列があります】……； （ｃ）【配列があります】……； （ｄ）【配列があります】……； （ｅ）【配列があります】……； （ｆ）【配列があります】……； （ｇ）【配列があります】……； から選択される、請求項１に記載のペプチド類似体。
4. ４．生物額的に純粋な形である、請求項１、請求項２または請求項３に記載のペ プチド類似体。
5. ５．哺乳類起源からＨＢＧＦ−βの先端が切取られた形の単離方法であって、 ＨＢＧＦ−βの先端が切取られた形を含む試料を硫酸アンモニウム分画にかけ、 ＨＢＧＦ−β活性を有する画分を単離およびプールし、そしてプールされた画分 を次の連続段階： （ｉ）カチオン交換クロマトグラフィー；（ｉｉ）トリアジン色素アフィニティ ークロマトグラフィーまたはヘパリンアフィニティークロマトグラフィー；およ び（ｉｉｉ）サイズ排除クロマトグラフィーにかけることを含んで成る方法。
6. ６．トリアジン色素アフィニティークロマトグラフィー段階の後にヘパリンアフ ィニティークロマトグラフィー段階を行う、請求項５に記載の方法。
7. ７．逆相クロマトグラフィー段階をさらに含んで成る、請求項６に記載の方法。
8. ８．先端が切取られた形のＨＢＧＦ−βの起源が、組織ホモジネート、血漿、組 織または細胞培養物、組織または細胞順化培地、および腫瘍細胞から選択される 、請求項５、請求項６または請求項７に記載の方法。
9. ９．請求項１、請求項２、請求項３または請求項４に記載のペプチド類似体の調 製方法であって、アミノ末端配列から１〜１２個のアミノ酸が欠けておりＨＢＧ Ｆ−βの活性を有するペプチドの発現を指図することができるＤＮＡ配列を用い てバクロウイルス、細菌、酵母、昆虫または哺乳類細胞宿主を形質転換せしめ、 該宿主を栄養培地中で培養し、そして該ペプチド類似体を回収する段階を含んで 成る方法。
10. １０．請求項１、請求項２、請求項３または請求項４に記載のペプチド類似体の 調製方法であって、次の段階；（ａ）【配列があります】… のアミノ末端配列を有するＨＢＧＦ−βペプチドを用意し、そして （ｂ）該ペプチド類似体を１〜１２アミノ末端アミノ酸開裂段階にかける； を含んで成る方法。
11. １１．請求項１、請求項２、請求項３または請求項４に記載のペプチド類似体に 対して向けられる抗体。
12. １２．モノクローナル抗体である、請求項１１に記載の抗体。
13. １３．請求項１、請求項２、請求項３または請求項４に記載のペプチド類似体に 対して特異的な抗体の調製方法であって、次の段階： （ａ）該ペプチド類似体をタンパク質担体に連結して接合体を形成せしめ； （ｂ）補助剤を使って該接合体のエマルションを形成せしめ； （ｃ）該エマルションで動物を免疫処置し；（ｄ）該動物から抗血清を回収する ； を含んで成る方法。
14. １４．生理的に許容される希釈剤、担体または賦形剤と一緒に、療法的有効量の 請求項１、請求項２、請求項３または請求項４に記載のペプチド類似体を含んで 成る医薬または獣医学組成物。
15. １５．生理的に許容される希釈剤、担体または賦形剤と一緒に、請求項１１また は請求項１２に記載の抗体を含んで成る医薬または獣医学用組成物。
16. １６．内部または外部創傷の治癒を必要とする哺乳類においてそのような治癒を 増強するための組成物であって、生理的に適合できる担体材料中に封入された請 求項１、請求項２、請求項３または請求項４に記載のペプチド類似体を含んで成 り、それにより療法的有効量の該ペプチドが創傷部位に供給れる、前記組成物。
17. １７．前記担体材料が、合成または天然の有機ポリマーおよび化学的に修飾され た無機粒子から選択される、請求項１６に記載の組成物。
18. １８．前記ペプチドの量が１〜１００ｍｇ／ｋｇ哺乳類の体重である、請求項１ ６または請求項１７に記載の組成物。
19. １９．哺乳類における病気の診断方法であって、請求項１〜４のいずれか一項に 記載のペプチド類似体かまたはそれに対する請求項１１もしくは請求項１２に記 載の抗体のいずれか一方を使用することを含んで成る方法。
20. ２０．創傷治癒、血管形成、組織成長、組織修復および卵巣機能から選択された 活性を刺激する処置を必要とする哺乳類においてそのような活性を刺激する方法 であって、有効量の請求項１、請求項２、請求項３または請求項４に記載のペプ チド類似体を前記哺乳類に投与する段階を含んで成る方法。
21. ２１．血管形成を阻害する処置を必要とする哺乳類において血管形成を阻害する 方法であって、有効量の請求項１１または請求項１２に記載の抗体を前記動物に 投与することを含んで成る方法。
22. ２２．ＨＢＧＦ−β因子のイムノアッセイ方法であって、適当なマーカーと結合 された請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド類似体かまたはそれに特異 的な請求項１１もしくは請求項１２に記載の抗体のいずれか一方を使用する段階 を含んで成る方法。
23. ２３．請求項１、請求項２、請求項３または請求項４に記載のペプチド類似体を 含んで成る細胞または組織培養培地。
24. ２４．既知組成培地である、請求項２３に記載の培地。
25. ２５．化学的方法により合成される、請求項１、請求項２、請求項３または請求 項４に記載のペプチド類似体。